JP7438098B2 - 細胞により発現される生物学的活性を調節する結合分子 - Google Patents
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Description
- 上記第1及び第2の細胞を含む系に、上記第1の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる可変ドメイン及び上記第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる可変ドメインを含む抗体又は上記抗体の結合特異性を維持する上記抗体の変異体を提供する工程;及び
- 上記第1又は第2の細胞が、上記抗体又はその変異体が存在しない場合に上記第1の膜タンパク質と上記第2の膜タンパク質との結合により媒介される上記生物学的活性を発現することを可能にする条件下で、上記系をインキュベートする工程
を含み、
- 上記第1の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる可変ドメインの結合は、上記第1の膜タンパク質と上記第2の膜タンパク質との結合を阻止し、及び/又は上記第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる可変ドメインの結合は、上記第1の膜タンパク質と上記第2の膜タンパク質との結合を阻止する方法を提供する。
- 上記第1及び第2の細胞を含む系に、上記第1の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる可変ドメイン及び上記第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる可変ドメインを含む抗体又は上記抗体の結合特異性を維持する上記抗体の変異体を提供する工程;及び
- 上記第1又は第2の細胞が、上記抗体又はその変異体が存在しない場合に上記第1の膜タンパク質と上記第2の膜タンパク質との結合により媒介される上記生物学的活性を発現することを可能にする条件下で、上記系をインキュベートする工程
を含み、
- 上記第1の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる可変ドメインの結合は、上記第1の膜タンパク質と上記第2の膜タンパク質との結合を阻止し、及び/又は上記第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる可変ドメインの結合は、上記第1の膜タンパク質と上記第2の膜タンパク質との結合を阻止する方法を提供する。
- 上記第1及び第2の細胞を含む系に、上記第1の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる可変ドメイン及び上記第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる可変ドメインを含む抗体又は上記抗体の結合特異性を維持する上記抗体の変異体を提供する工程;及び
- 上記第1又は第2の細胞が、上記抗体又はその変異体が存在しない場合に上記第1の膜タンパク質と上記第2の膜タンパク質との結合により媒介される上記生物学的活性を発現することを可能にする条件下で、上記系をインキュベートする工程
を含み、
- 上記第1の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる可変ドメインの結合は、上記第1の膜タンパク質と上記第2の膜タンパク質との結合を阻止せず、及び上記第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる可変ドメインの結合は、上記第1の膜タンパク質と上記第2の膜タンパク質との結合を阻止しない方法が提供される。
- CD28ファミリーのタンパク質(第1の膜タンパク質)の細胞外部分に結合することができる可変ドメイン及び
- B7ファミリーのタンパク質(第2の膜タンパク質)の細胞外部分に結合することができる可変ドメイン
を含み、上記第1及び第2の膜タンパク質は結合パートナー(つまり、リガンド及び受容体対)であり、上記第1の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる可変ドメインの結合は、上記第1の膜タンパク質と上記第2の膜タンパク質との結合を阻止し、及び/又は上記第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる可変ドメインの結合は、上記第1の膜タンパク質と上記第2の膜タンパク質との結合を阻止する、抗体又は上記抗体の結合特異性を維持する上記抗体の変異体を提供する。上記抗体又はその変異体の結合は、好ましくは、上記第1の細胞における受容体-リガンド対の結合の活性を低減する。上記結合は、好ましくは、上記第1の細胞における受容体-リガンド対の結合の阻害活性を低減する。阻害活性を示す受容体-リガンド対は、いわゆる共阻害性受容体-リガンド対である。
- PD-1、CTLA-4、BTLA、又はTMIGD2の細胞外部分に結合することができる可変ドメイン、及び
- PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、B7-H4、TNFRSF14、又はB7-H7の細胞外部分に結合することができる可変ドメイン
を含む。
- PD-1の細胞外部分に結合することができる可変ドメイン、及び
- PD-L1又はPD-L2の細胞外部分に結合することができる可変ドメイン
を含む。
- 上記第1及び第2の細胞を含む系に、上記第1の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる可変ドメイン及び上記第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる可変ドメインを含む抗体又はその変異体を提供する工程;及び
- 上記抗体又はその変異体が存在しない場合に上記生物学的活性の発現を可能にする条件下で、上記系をインキュベートする工程
を含み、
- 上記第1の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる可変ドメインの結合は、上記第1の膜タンパク質と上記第2の膜タンパク質との結合を阻止し、及び/又は上記第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる可変ドメインの結合は、上記第1の膜タンパク質と上記第2の膜タンパク質との結合を阻止する方法を提供する。一部の実施形態では、上記方法は、in vitro法である。上記方法で使用される抗体は、2つの結合パートナーに結合し、2つが互いに結合することを阻止する。上記方法では、結合パートナーを発現する2つの細胞は、互いに、近くに接近し及び/又は近くに接近したままになるが、同時に結合パートナーの結合が阻害される。これは、可変ドメインを含む2つのモノクローナル単一特異性抗体の組合せとは異なる。また、それらは、2つの結合パートナーの結合を阻止するが、細胞は近くに接近せず及び/又は近くに接近したままにはならない。本発明の抗体、特に本発明の二重特異性抗体の特殊な活性は、3つ又はそれよりも多くの異なる細胞タイプを含む複雑な環境において特に顕著である。
- 上記第1及び第2の細胞を含む系に、上記第1の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる可変ドメイン及び上記第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる可変ドメインを含む抗体又はその変異体を提供する工程;及び
- 上記抗体又はその変異体が存在しない場合に上記生物学的活性の発現を可能にする条件下で、上記系をインキュベートする工程
を含み、
- 上記第1の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる可変ドメインの結合は、上記第1の膜タンパク質と上記第2の膜タンパク質との結合を阻止せず、及び上記第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる可変ドメインの結合は、上記第1の膜タンパク質と上記第2の膜タンパク質との結合を阻止しない方法を提供する。
- 細胞膜上に第1の膜タンパク質、好ましくはCD28ファミリーのメンバーを有する免疫細胞(第1の細胞)、
- 細胞膜上に第2の膜タンパク質、好ましくはB7ファミリーのメンバー又はTNFRSF14を有する第2の細胞
を準備する工程;
- 上記第1の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる可変ドメイン及び上記第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる可変ドメインを含む抗体又はその変異体を準備する工程
を含み、上記第1の細胞及び上記第2の細胞を上記抗体と共にインキュベートし、それにより上記第1の細胞の免疫応答を誘導又は刺激する工程を更に含む方法を更に提供する。
- 細胞膜上に第1の膜タンパク質、好ましくはCD28ファミリーのメンバーを有する免疫細胞(第1の細胞)、
- 細胞膜上に第2の膜タンパク質、好ましくはB7ファミリーのメンバー又はTNFRSF14を有する第2の細胞
を準備する工程;
- 上記第1の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる可変ドメイン及び上記第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる可変ドメインを含む抗体又はその変異体(第1の抗体)を準備する工程;
- 上記第1の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる可変ドメイン及び上記第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる可変ドメインを含む更なる抗体又はその変異体(第2の抗体)を準備する工程
を含み、
上記第1及び第2の抗体は、
- 上記第1の膜タンパク質の異なるエピトープ、
- 上記第2の膜タンパク質の異なるエピトープ、又は
- 上記第1の膜タンパク質の異なるエピトープ及び
上記第1の膜タンパク質の異なるエピトープ
に結合し、
上記方法は、上記第1の細胞及び上記第2の細胞を上記第1及び第2の抗体と共にインキュベートし、それにより上記第1の細胞の免疫応答を誘導又は刺激する工程を更に含む方法を更に提供する。
- 細胞膜上にPD-1を有する免疫細胞(第1の細胞)、
- 細胞膜上にPD-L1を有する第2の細胞
を準備する工程;
- PD-1の細胞外部分に結合することができる可変ドメイン及びPD-L1の細胞外部分に結合することができる可変ドメインを含む抗体又はその変異体を準備する工程
を含み、
上記第1の細胞及び上記第2の細胞を上記記抗体と共にインキュベートし、それにより上記第1の細胞の免疫応答を誘導又は刺激する工程を更に含む方法を更に提供する。一部の実施形態では、上記方法は、in vitro法又はex vivo法である。
- 細胞膜上にPD-1を有する免疫細胞(第1の細胞)、
- 細胞膜上にPD-L1を有する第2の細胞
を準備する工程;
- PD-1の細胞外部分に結合することができる可変ドメイン及びPD-L1の細胞外部分に結合することができる可変ドメインを含む抗体又はその変異体(第1の抗体)を準備する工程;
- PD-1の細胞外部分に結合することができる可変ドメイン及びPD-L1の細胞外部分に結合することができる可変ドメインを含む更なる抗体又はその変異体(第2の抗体)を準備する工程
を含み、
上記第1及び第2の抗体は、
- PD-1の異なるエピトープ、
- PD-L1の異なるエピトープ、又は
- PD-1の異なるエピトープ及びPD-L1の異なるエピトープ
に結合し、
上記方法は、上記第1の細胞及び上記第2の細胞を上記第1及び第2の抗体と共にインキュベートし、それにより上記第1の細胞の免疫応答を誘導又は刺激する工程を更に含む方法を更に提供する。一部の実施形態では、上記方法は、in vitro法である。
上記第1及び第2の抗体は、
- 上記第1の膜タンパク質の異なるエピトープ、
- 上記第2の膜タンパク質の異なるエピトープ、又は
- 上記第1の膜タンパク質の異なるエピトープ及び
上記第2の膜タンパク質の異なるエピトープ
に結合する組成物又はキットオブパーツを更に提供する。
- 上記PD-1に結合する可変ドメインを2つ含む二価単一特異性抗体、及び
- 上記PD-L1に結合する可変ドメインを2つ含む二価単一特異性抗体の等モル混合物と比較して、より強力なCD4+T細胞活性化能力を有する抗体又はその変異体を提供する。そのより強力なCD4+T細胞活性化能力を鑑みると、こうした実施形態による抗体又は変異体は、親抗体の等モル混合物よりも好ましい。
- MF6076のVHのCDR3のアミノ酸配列又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-1結合可変ドメイン、及び
- MF5553、MF5359、MF5424、MF5561、MF5442、又はMF5382、好ましくはMF5359、MF5424、MF5561、MF5442、又はMF5382、好ましくはMF5359、MF5424、MF5561、又はMF5442、好ましくはMF5359、MF5424、又はMF5442、好ましくはMF5359又はMF5442、好ましくはMF5442のVH(図3)のCDR3のアミノ酸配列又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメイン
を含む。
- MF6076のVHのアミノ酸配列であって、MF6076のVHのアミノ酸配列に対して、最大で15個、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個、及び好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを有するVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-1結合可変ドメイン、及び
- MF5553、MF5359、MF5424、MF5561、MF5442、又はMF5382、好ましくはMF5359、MF5424、MF5561、MF5442、又はMF5382、好ましくはMF5359、MF5424、MF5561、又はMF5442、好ましくはMF5359、MF5424、又はMF5442、好ましくはMF5359又はMF5442、好ましくはMF5442のVHのアミノ酸配列であって、表記のMFのVHのアミノ酸配列(図3)に対して、最大で15個、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個、及び好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを有するVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメイン
を含む。
- MF6236のVH(図3)のCDR3のアミノ酸配列又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-1結合可変ドメイン、及び
- MF5561、MF5442、又はMF5382、好ましくはMF5561又はMF5442、好ましくはMF5442のVH(図3)のCDR3のアミノ酸配列又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメイン
を含む。
- MF6236のVHのアミノ酸配列であって、MF6236のVHのアミノ酸配列(図3)に対して、最大で15個、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個、及び好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを有するVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-1結合可変ドメイン、及び
- MF5561、MF5442、又はMF5382、好ましくはMF5561又はMF5442、好ましくはMF5442のVHのアミノ酸配列であって、表記のMFのVHのアミノ酸配列(図3)に対して、最大で15個、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個、及び好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを有するVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメイン
を含む。
- MF6974のVH(図3)のCDR3のアミノ酸配列又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-1結合可変ドメイン、及び
- MF5424、MF5561、MF5442、又はMF5382、好ましくはMF5424、MF5561、又はMF5442、好ましくはMF5424又はMF5442、好ましくはMF5442のVH(図3)のCDR3のアミノ酸配列又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメイン
を含む。
- MF6974のVHのアミノ酸配列であって、MF6974のVHのアミノ酸配列(図3)に対して、最大で15個、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個、及び好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを有するVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-1結合可変ドメイン、及び
- MF5424、MF5561、MF5442、又はMF5382、好ましくはMF5424、MF5561、又はMF5442、好ましくはMF5424又はMF5442、好ましくはMF5442のVHのアミノ酸配列であって、表記のMFのVHのアミノ酸配列(図3)に対して、最大で15個、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個、及び好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを有するVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメイン
を含む。
- MF6935のVH(図3)のCDR3のアミノ酸配列又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-1結合可変ドメイン、及び
- MF5424、MF5561、MF5442、又はMF5382、好ましくはMF5561、MF5442、又はMF5382、好ましくはMF5442又はMF5382、好ましくはMF5382のVH(図3)のCDR3のアミノ酸配列又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメイン
を含む。
- MF6935のVHのアミノ酸配列であって、MF6935のVHのアミノ酸配列(図3)に対して、最大で15個、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個、及び好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを有するVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-1結合可変ドメイン、及び
- MF5424、MF5561、MF5442、又はMF5382、好ましくはMF5561、MF5442、又はMF5382、好ましくはMF5442又はMF5382、好ましくはMF5382のVHのアミノ酸配列であって、表記のMFのVHのアミノ酸配列(図3)に対して、最大で15個、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個、及び好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを有するVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメイン
を含む。
- MF6936のVH(図3)のCDR3のアミノ酸配列又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-1結合可変ドメイン、及び
- MF5576、MF5424、MF5561、MF5557、MF5442、又はMF5382、好ましくはMF5424、MF5561、MF5557、MF5442、又はMF5382、好ましくはMF5424、MF5561、MF5442、又はMF5382、好ましくはMF5561、MF5442、又はMF5382、好ましくはMF5442又はMF5382、好ましくはMF5382のVH(図3)のCDR3のアミノ酸配列又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメイン
を含む。
- MF6936のVHのアミノ酸配列であって、MF6936のVHのアミノ酸配列(図3)に対して、最大で15個、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個、及び好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを有するVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-1結合可変ドメイン、及び
- MF5576、MF5424、MF5561、MF5557、MF5442、又はMF5382、好ましくはMF5424、MF5561、MF5557、MF5442、又はMF5382、好ましくはMF5424、MF5561、MF5442、又はMF5382、好ましくはMF5561、MF5442、又はMF5382、好ましくはMF5442、又はMF5382、好ましくはMF5382のVHのアミノ酸配列であって、表記のMFのVHのアミノ酸(図3)に対して、最大で15個、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個、及び好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを有するVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメイン
を含む。
- MF6256のVH(図3)のCDR3のアミノ酸配列又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-1結合可変ドメイン、及び
- MF5576、MF5424、MF5561、MF5557、MF5439、MF5442、又はMF5382、好ましくはMF5576、MF5424、MF5561、MF5557、MF5442、又はMF5382、好ましくはMF5576、MF5561、MF5557、MF5442、又はMF5382、好ましくはMF5576、MF5561、MF5442、又はMF5382、好ましくはMF5576、MF5442、又はMF5382、好ましくはMF5442、又はMF5382、好ましくはMF5382のVH(図3)のCDR3のアミノ酸配列又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメイン
を含む。
- MF6256のVHのアミノ酸配列であって、MF6256のVHのアミノ酸配列(図3)に対して、最大で15個、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個、及び好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを有するVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-1結合可変ドメイン、及び
- MF5576、MF5424、MF5561、MF5557、MF5439、MF5442、又はMF5382、好ましくはMF5576、MF5424、MF5561、MF5557、MF5442、又はMF5382、好ましくはMF5576、MF5561、MF5557、MF5442、又はMF5382、好ましくはMF5576、MF5561、MF5442、又はMF5382、好ましくはMF5576、MF5442、又はMF5382、好ましくはMF5442、又はMF5382、好ましくはMF5382のVHのアミノ酸配列であって、表記のMFのVHのアミノ酸(図3)に対して、最大で15個、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個、及び好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを有するVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメイン
を含む。
- MF6076のVHのCDR3のアミノ酸配列又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-1結合可変ドメイン、及び
- MF5442、MF7691、MF7690、MF7689、MF7688、MF7700、MF7701、MF7703、MF7694、MF7693、MF7692、MF7697、MF7696、又はMF7695、好ましくはMF7703又はMF7689のVH(図3及び/又は図13)のCDR3のアミノ酸配列又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメイン
を含む。
- MF6076のVHのアミノ酸配列であって、MF6076のVHのアミノ酸配列に対して、最大で15個、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個、及び好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを有するVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-1結合可変ドメイン、及び
- MF5442、MF7691、MF7690、MF7689、MF7688、MF7700、MF7701、MF7703、MF7694、MF7693、MF7692、MF7697、MF7696、又はMF7695、好ましくはMF7703又はMF7689のVHのアミノ酸配列であって、表記のMFのVHのアミノ酸配列(図3及び/又は図13)に対して、最大で15個、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個、及び好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを有するVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメイン
を含む。
- MF6974のVH(図3)のCDR3のアミノ酸配列又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-1結合可変ドメイン、及び
- MF7703又はMF7689、好ましくはMF7703又はMF7689、より好ましくはMF7689のVH(図3及び/又は図13)のCDR3のアミノ酸配列又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメイン
を含む。
- MF6974のVHのアミノ酸配列であって、MF6974のVHのアミノ酸配列(図3)に対して、最大で15個、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個、及び好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを有するVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-1結合可変ドメイン、及び
- MF7703又はMF7689、好ましくはMF7703又はMF7689、より好ましくはMF7689のVHのアミノ酸配列であって、表記のMFのVHのアミノ酸配列(図3及び/又は図13)に対して、最大で15個、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個、及び好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを有するVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメイン
を含む。
- MF7686のVH(図3)のCDR3のアミノ酸配列又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-1結合可変ドメイン、及び
- MF5359、MF5361、MF5377、MF5382、MF5424、MF5426、MF5439、MF5442、MF5553、MF5557、MF5561、MF5576、MF5594、MF5708、MF7703、又はMF7689、好ましくはMF7703又はMF7689、より好ましくはMF7703のVH(図3及び/又は図13)のCDR3のアミノ酸配列又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメイン
を含む。
- MF7686のVHのアミノ酸配列であって、MF7686のVHのアミノ酸配列(図3)に対して、最大で15個、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個、及び好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを有するVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-1結合可変ドメイン、及び
- MF5359、MF5361、MF5377、MF5382、MF5424、MF5426、MF5439、MF5442、MF5553、MF5557、MF5561、MF5576、MF5594、MF5708、MF7703、又はMF7689、好ましくはMF7703又はMF7689、より好ましくはMF7703のVHのアミノ酸配列であって、表記のMFのVHのアミノ酸配列(図3及び/又は図13)に対して、最大で15個、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個、及び好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを有するVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメイン
を含む。
- MF6974、MF6076、及びMF7686からなる群から選択される可変領域の重鎖CDR3配列と同一である重鎖CDR3配列、又は
- MF6974若しくはMF6076若しくはMF7686の重鎖CDR3配列から、3つ以下、好ましくは2つ以下、より好ましくは1つ以下のアミノ酸が異なる重鎖CDR3配列、又は
- MF6974、MF6076、及びMF7686からなる群から選択される可変領域の重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3配列と同一である重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3配列、又は
- MF6974若しくはMF6076若しくはMF7686の重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3配列から、3つ以下、好ましくは2つ以下、より好ましくは1つ以下のアミノ酸が異なる重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3配列
を含む、抗体又はその変異体を提供する。
- MF6974若しくはMF6076若しくはMF7686のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は
- MF6974若しくはMF6076若しくはMF7686のアミノ酸配列と少なくとも80%、若しくは少なくとも85%、若しくは少なくとも90%、若しくは少なくとも91%、若しくは少なくとも92%、若しくは少なくとも93%、若しくは少なくとも94%、若しくは少なくとも95%、若しくは少なくとも96%、若しくは少なくとも97%、若しくは少なくとも98%、若しくは少なくとも99%同一である配列を有する重鎖可変領域
を含む、抗体又はその変異体を提供する。
- MF7689及びMF7703からなる群から選択される可変領域の重鎖CDR3配列と同一である重鎖CDR3配列、又は
- MF7689若しくはMF7703の重鎖CDR3配列から、3つ以下、好ましくは2つ以下、より好ましくは1つ以下のアミノ酸が異なる重鎖CDR3配列、又は
- MF7689及びMF7703からなる群から選択される可変領域の重鎖CDR1及びCDR2及びCDR3配列と同一である重鎖CDR1及びCDR2及びCDR3配列、又は
- MF7689若しくはMF7703の重鎖CDR1及びCDR2及びCDR3配列から、3つ以下、好ましくは2つ以下、より好ましくは1つ以下のアミノ酸が異なる重鎖CDR1及びCDR2及びCDR3配列
を含む、抗体又はその変異体を提供する。
- MF7689若しくはMF7703のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は
- MF7689若しくはMF7703のアミノ酸配列と少なくとも80%、若しくは少なくとも85%、若しくは少なくとも90%、若しくは少なくとも91%、若しくは少なくとも92%、若しくは少なくとも93%、若しくは少なくとも94%、若しくは少なくとも95%、若しくは少なくとも96%、若しくは少なくとも97%、若しくは少なくとも98%、若しくは少なくとも99%同一である配列を有する重鎖可変領域
を含む、抗体又はその変異体を提供する。
更に含む。共通軽鎖をコードする核酸は、共通軽鎖タンパク質を発現するために使用される細胞系用にコドン最適化されてもよい。コード核酸は、生殖系核酸配列とは異なっていてもよい。
- a)PD-1の細胞外部分を特異的に認識し、第1のCH3ドメインを含むIgG重鎖をコードする第1の核酸分子、及びb)PD-L1の細胞外部分を特異的に認識し、第2のCH3ドメインを含むIgG重鎖をコードする第2の核酸分子を有する細胞を準備する工程を含み、上記核酸配列には、上記第1及び第2のCH3ドメインの優先的対合のための突然変異が提供されており、上記方法は、上記細胞を培養する工程、及び上記核酸配列の発現を可能にする工程、及び上記抗体又はその変異体を上記培養から回収する工程を更に含む方法が更に提供される。一部の好ましい実施形態では、上記細胞は、共通軽鎖、好ましくは再編成された生殖系ヒトカッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01をコードする第3の核酸配列を有する。
スを形成することが可能な2つのCH3ドメインを含み、上記方法は、上記細胞に、a)重鎖を含む第1のCH3ドメインをコードする第1の核酸分子、及びb)重鎖を含む第2のCH3ドメインをコードする第2の核酸分子を提供する工程を含み、上記核酸分子には、重鎖を含む上記第1及び第2のCH3ドメインの優先的対合のための手段が提供されており、上記方法は、上記宿主細胞を培養する工程、及び上記2つの核酸分子の発現を可能にする工程、及び上記二重特異性抗体を上記培養から回収する工程を更に含む方法を提供する。上記第1及び第2の核酸分子は、同じ核酸分子、ベクター、又は遺伝子送達媒体の一部であってもよく、宿主細胞ゲノムの同じ部位に組み込まれてもよい。或いは、上記第1及び第2の核酸分子は、上記細胞に別々に提供される。宿主細胞は、少なくとも1つの軽鎖、好ましくは共通軽鎖を含む。
- a)CD28ファミリーの膜結合メンバーの細胞外部分に結合することができる抗原結合部位を含み、第1のCH3ドメインを含む重鎖をコードする第1の核酸分子、及びb)B7ファミリーの膜結合メンバー又はTNFRSF14の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位を含み、第2のCH3ドメインを含む重鎖をコードする第2の核酸分子を有する細胞を準備する工程を含み、上記核酸分子には、上記第1及び第2のCH3ドメインの優先的対合のための手段が提供されており、
上記方法は、上記細胞を培養する工程、及び上記2つの核酸分子によりコードされるタンパク質の発現を可能にする工程、及び上記二重特異性IgG抗体を上記培養から回収する工程を更に含む方法を提供する。特に好ましい実施形態では、上記細胞は、共通軽鎖をコードする第3の核酸分子を更に有する。上記第1、第2、及び第3の核酸分子は、同じ核酸分子、ベクター、又は遺伝子送達媒体の一部であってもよく、宿主細胞ゲノムの同じ部位に組み込まれてもよい。或いは、上記第1、第2、及び第3の核酸分子は、上記細胞に別々に提供される。好ましい共通軽鎖は、O12に基づき、好ましくは、上記に記載のような、再編成された生殖系ヒトカッパ軽鎖IgVκ1 39*01/IGJκ1*01である。上記第1及び上記第2のCH3ドメイン優先的対合のための手段は、好ましくは、重鎖コード領域のCH3ドメインにおける対応する突然変異である。本質的に二重特異性抗体のみを産生するための好ましい突然変異は、第1のCH3ドメインにおけるアミノ酸置換L351K及びT366K(EU付番による付番)及び第2のCH3ドメインにおけるアミノ酸置換L351D及びL368Eであるか、又はその逆である(図2)。したがって、二重特異性抗体を産生するための本発明による方法であって、上記第1のCH3ドメインは、アミノ酸置換L351K及びL366K(EU付番による付番)を含み、上記第2のCH3ドメインは、アミノ酸置換L351D及びL368Eを含み、上記方法は、上記細胞を培養する工程、及び上記核酸分子によりコードされるタンパク質の発現を可能にする工程、及び上記二重特異性抗体を上記培養から回収する工程を更に含む方法が更に提供される。また、二重特異性抗体を産生するための本発明による方法であって、上記第1のCH3ドメインは、アミノ酸置換L351D及びL368E(EU付番による付番)を含み、上記第2のCH3ドメインは、アミノ酸置換L351K及びT366Kを含み、上記方法は、上記細胞を培養する工程、及び上記核酸分子の発現を可能にする工程、及び上記二重特異性抗体を上記培養から回収する工程を更に含む方法が提供される。こうした方法により産生することができる抗体も、本発明の一部である。CH3ヘテロ二量体化ドメインは、好ましくは、IgG1ヘテロ二量体化ドメインである。CH3ヘテロ二量体化ドメインを含む重鎖定常領域は、好ましくは、IgG1定常領域である。
選択及びスクリーニングのための物質の生成
細胞株の培養
ヒトES-2細胞(カタログ番号CRL-1978)を、ATCCから購入し、10%FBS(Lonza社)を補充したMcCoy's 5A(Gibco)において慣習的に維持した。フリースタイルの293F細胞(カタログ番号p/n51-0029)を、Invitrogen社から得て、293フリースタイル培地において慣習的に維持した。HEK293T(カタログ番号ATCC-CRL-11268)、CHO-K1(カタログ番号DSMZ ACC110)細胞株を、ATCCから購入し、L-グルタミン(Gibco)及びFBS(Lonza社)を補充したDMEM/F12(Gibco社)において慣習的に維持し、CHO-S(カタログ番号11619-012)細胞株を、Gibcoから購入し、L-グルタミンを補充したフリースタイルのCHO発現培地(Invitrogen社)において慣習的に維持した。
クローニングのための固有の制限酵素部位及び効率的な翻訳のためのコザック共通配列を含むそれぞれの標的の全長cDNAを、合成するか、又はクローニングのための固有の制限酵素部位及び効率的な翻訳のためのコザック共通配列を導入した特異的プライマーを用いて、標的cDNAを含有する、市販の発現コンストラクト上でのPCR増幅を介して得た。それぞれの標的のcDNAを、NheI/EcoRIを介してpIRES-Neo3(Clontech社;図4)又はpVAX1(Thermo Fisher Scientific社;図5)のような真核生物の発現コンストラクトにクローニングし、それぞれ、pIRES-Neo3_[TARGET_NAME]及びpVAX1_[TARGET_NAME]を得た。挿入配列を、NCBI参照アミノ酸配列との比較により検証した。pIRES-Neo3コンストラクトを、安定な細胞株の生成のため使用した。pVAX1コンストラクトを、免疫目的のため使用した。得られたコンストラクトの名称の概要については、TABLE 1(表3)を参照のこと。
MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL
その内:
MQIPQAPWPVVWAVLQLGWR:シグナルペプチド。
PGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLV:huPD-1のECD。
VGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI:予想TM領域。
CSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL:細胞内尾部。
MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLESPDRPWNAPTFSPALLLVTEGDNATFTCSFSNASESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTRLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQALVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAAQGTIEARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPAPCVPEQTEYATIVFPSGLGTSSPARRGSADGPRSPRPLRPEDGHCSWPL
その内:
MQIPQAPWPVVWAVLQLGWR:シグナルペプチド。
PGWFLESPDRPWNAPTFSPALLLVTEGDNATFTCSFSNASESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTRLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQALV:maPD-1のECD。
VGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI:予想TM領域。
CSRAAQGTIEARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPAPCVPEQTEYATIVFPSGLGTSSPARRGSADGPRSPRPLRPEDGHCSWPL:細胞内尾部。
MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET
その内:
MRIFAVFIFMTYWHLLNA:シグナルペプチド。
FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNER:huPD-L1のECD。
THLVILGAILLCLGVALTFIF:予想TM領域。
RLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET:細胞内尾部。
MRIFAVFIFTIYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECRFPVEKQLGLTSLIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSNYRQRAQLLKDQLSLGNAALRITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLLNVTSTLRINTTANEIFYCIFRRLGPEENHTAELVIPELPLALPPNERTHLVILGAIFLLLGVALTFIFYLRKGRMMDMKKSGIRVTNSKKQRDTQLEET
その内:
MRIFAVFIFTIYWHLLNA:シグナルペプチド。
FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECRFPVEKQLGLTSLIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSNYRQRAQLLKDQLSLGNAALRITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLLNVTSTLRINTTANEIFYCIFRRLGPEENHTAELVIPELPLALPPNER:maPD-L1のECD。
THLVILGAIFLLLGVALTFIF:予想TM領域。
YLRKGRMMDMKKSGIRVTNSKKQRDTQLEET:細胞内尾部。
pIRES-Neo3_[TARGET_NAME]発現コンストラクト(TABLE 1(表3))を使用して、それぞれのタンパク質を安定的に発現するCHO-S又はCHO-K1クローンを作製した。コンストラクトを、リポフェクタミントランスフェクションを使用して、又はCHO-S細胞についてはPEIトランスフェクションを使用して、CHO-K1細胞において一過性に遺伝子導入し、それぞれのタンパク質との抗体反応を使用したFACSによりスクリーニングした。発現の確認後、一過性に遺伝子導入した細胞を、限界希釈において播種し、使用した発現コンストラクトに関連する選択圧下で培養して、安定な細胞クローンを得た。選択の2~3週間後、クローンを、FACSによりスクリーニングした。選択したクローンを、連続継代により拡大し、FACSにおいて再試験し、-150℃まで凍結させた。異種性タンパク質を安定的に発現するクローンの名称は、CHO-K1_[標的_名称]細胞又はCHO-S_[標的_名称]細胞である。安定な細胞株を作製するために使用したコンストラクト及びそれらの得られた名称の概要については、TABLE 1(表3)を参照のこと。
免疫化、選択及びスクリーニング
免疫化に使用したマウス
huPD-1及びhuPD-L1へのヒト抗体結合の生成のため、ヒトVK1-39軽鎖(共通軽鎖マウス、国際公開第2009/157771号パンフレットを参照)及びヒト重鎖(HC)小型遺伝子座(ヒトV遺伝子セグメント、全てのヒトD及び全てのヒトJの選択を含む)についての遺伝子導入マウスを、以下で簡単に記載する通り、組換えタンパク質又はタンパク質をコードするDNAのいずれかで免疫した。これらのマウスを、「MeMo(登録商標)」マウスと呼ぶ。
「MeMo(登録商標)」マウスを、組換えタンパク質及びGerbuアジュバントMM(Gerbu Biotechnik社 c#3001)を用いた皮下注射により免疫した。組換えhuPD-L1-His(SinoBiological社;カタログ番号10084-H08H)及びhuPD-1-Fc(R&D社;カタログ番号1086-PD)タンパク質を、免疫のため使用した。マウスを、総体積100μlにおいてアジュバント40μlと混合したPBS中の組換えタンパク質40μgを用いて免疫した。続いて、マウスを、14及び28日目に、総体積50μlにおいてアジュバント20μlと一緒にPBS中の組換えタンパク質20μgを用いてブーストした。マウス血清を、35日目に回収して、血清タイターを決定した。低い血清タイターを有するマウスは、追加サイクルのブースター免疫及び血清解析を受けた。それぞれの解析は、PBS 50μl中の組換えタンパク質20μgを使用した2回の週1回の免疫、続いて、1週間後、タイター解析のための血清収集からなっていた。ヒトに対して高い血清タイターを示すが、マカク相同体には示さないマウスは、マカク抗原タンパク質を用いたブースター免疫を受けた。ヒト及びマカク標的に対して高い血清タイターを示すマウスは、連続する3日間、PBS 50μl中の組換えタンパク質20μgを用いた毎日の注射からなる最終ブースト免疫を受けた。最後の注射の1日後、マウスリンパ組織を回収した。
MeMo(登録商標)マウスを、マイクロ色素沈着装置を使用したDNA刺青により、免疫した。DNA刺青免疫を、標的抗原(pVAX1_[標的_名称]、Table 1(表3))をコードするプラスミドDNA 20μgを用いて行った。マウスを、ヒト標的のみ(PD-1、PD-L1)をコードするDNAを用いて免疫した。PD-L1免疫のため、Treg細胞を、抗CD25抗体PC61.5(Bioceros社)0.5mgを用いたマウスの注射による免疫の開始前4日間、枯渇させて、寛容を壊した。マウスを、0、3、6、14、17、28及び31日目に免疫した。マウス血清を35日目に回収して、血清タイターを決定した。低血清反応性を有するマウスは、追加サイクルのブースター免疫及び血清解析を受けた。それぞれのサイクルは、2回の週1回の免疫、続いて、1週間後、タイター解析のための血清収集からなっていた。ヒト及びマカク標的を発現する細胞に対する強力な血清反応性を示すマウスは、最後のブースト免疫化、続いて、3日間後、リンパ組織の収集を受けた。
血清タイターを、ヒト及びマカク標的抗原を発現する細胞株を使用したFACS解析により決定した(Table 1(表3))。
脾臓及び流入リンパ節を、有意な液性応答をそれぞれの標的タンパク質に対して観察したマウスから取り除いた。単一の細胞懸濁液を、脾臓と鼠蹊部リンパ節の両方から作製し、続いて、これらの組織をトリゾールLS試薬(Thermo Scientific社 c#10296028)において溶解し、使用まで-80℃において保存した。
作製したファージFabライブラリーを使用して、直接コーティングした組換えタンパク質上のファージディスプレイを使用して標的特異的Fabを選択した。PD-L1について、huPD-L1-His(Sinobiological社;カタログ番号10084-H08H)、huPD-L1-Fc(R&D社;カタログ番号156-B7)及びmaPD-L1-His(Sinobiological社;カタログ番号90251-C08H)を使用した。PD-1について、huPD-1-Fc(R&D者;カタログ番号1086-PD)及びhuPD-1ビオチン(BPS bioscience社;カタログ番号71109)を使用した。
標的免疫化マウスから作製したファージFabライブラリーを、それぞれの標的を発現する細胞上のファージディスプレイを使用して選択した。PD-1又はPD-L1を発言する安定な細胞株(Table 1(表3))を、1回目のラウンドの選択のため使用した。細胞を、PBS中の10% FBSを用いてブロッキングした。ブロッキング後、救出したファージを、ブロッキングした細胞とインキュベートした。細胞プラスファージを、1時間4℃においてインキュベートした。細胞の洗浄(5回)を、PBS中の10%FBS 1mlを使用して行った。結合したファージを、トリプシンを使用して20分間溶出させ、その後、トリプシンを、AEBSFトリプシン阻害剤(Sigma社)を用いて中和した。溶出液を、大腸菌TG-1に加え、ファージ感染のため37℃においてインキュベートした。続いて、ファージ感染した細菌を、アンピシリン及びグルコースを含有する寒天プレート上に播種し、37℃にて一晩インキュベートした。
単一クローンのうち、溶解性Fabを、記載(J Mol Biol.、1991年12月5日;222(3):581~97頁;J Biol Chem.、1999年6月25日;274(26):18218~30頁)の通り調製した。これらは、PBS中の4%乾燥スキムミルク(Marvel)における1:5希釈液(ブロックバッファー)であり、ELISAにおいて、選択のため使用したのと同じ抗原を用いたコーティングしたウェルへの結合について試験した。結合したFabを、ブロックバッファー中1:1000希釈した抗myc抗体(Roche社;カタログ番号11667203001)を用いた染色により、検出し、続いて、ブロックバッファー中1:5000希釈したHRPコンジュゲート抗マウスIgG抗体(Jackson Immunoresearch社;カタログ番号715-035-150)により検出した。それぞれの抗体染色後、ウェルを、PBS-T(PBS-0.05%v/v Tween20)を用いて洗浄した。結合した2次抗体を、TMB/H2O2染色により可視化し、染色を、OD450nmの測定値により定量した。OD450nmが、陰性対照Fabを用いて得たバックグラウンドのシグナルの少なくとも3倍を上回る場合、クローンは、標的に結合するとみなした。
それぞれの標的を発現する細胞上の選択した単一クローンのうち、溶解性Fabを、記載(J Mol Biol.、1991年12月5日;222(3):581~97頁;J Biol Chem.、1999年6月25日;274(26):18218~30頁)される通り調製した。これらを、FACSにおいて、FACSバッファー(PBS中の0.5% HI-FBS)中1:1000希釈した抗myc抗体(Gentaur社;カタログ番号04-CMYC-9E10)との1:5希釈したFab試料の混合液とのインキュベーションにより、ヒト及びマカク標的を発現する細胞(Table 1(表3))への結合について試験した。結合したFab/抗myc複合体を、FACSバッファー中1:500希釈したAPCコンジュゲートヤギ抗マウスIgG抗体(BD Bioscience社;カタログ番号550826)とのインキュベーションにより検出した。それぞれの抗体インキュベーション後、ウェルを、FACSバッファーを用いて3回洗浄した。染色した細胞を、FACS Accuri C6装置(Becton and Dickinson社)を使用して解析した。平均蛍光強度が、陰性対照Fabを用いて得たバックグラウンドシグナルの少なくとも3倍を上回る場合、クローンは、陽性であるとみなした。
IgGフォーマットのhuPD-L1及びhuPD-1特異的Fabクローンの特徴決定
ヒトPD-L1及びPD-1特異的FabのIgGフォーマットへの再クローニング
細胞上で発現したヒト及びマカク標的タンパク質に結合した、CDR3配列及びVH生殖系列の相異に基づく選択された固有のクローンは次に、標準化した分子生物学的技術に従い、Sfi1-BstEII消化、及び消化したcDNAのプールのライゲーションを使用して、共通軽鎖(図1)を含有する、MV1452(図7)のようなIgG発現プラスミドに再クローニングした。
二重特異性抗体の効率的なヘテロ-二量体化及び形成を確実にするための専用のCH3遺伝子操作テクノロジーを使用して、異なるVHドメインを有するIgGをコードする2つのプラスミドの一過性の同時遺伝子導入により、二重特異性抗体を作製した。重鎖を含有する両方のプラスミドに存在する共通の軽鎖をまた、同じ細胞に同時遺伝子導入する。本発明者らの同時係属出願(例えば、国際公開第2013/157954号パンフレット及び国際公開第2013/157953号パンフレット;参照により本明細書に組み込まれる)において、本発明者らは、単一の細胞から二重特異性抗体を産生する方法及び手段を開示し、これにより、単一特異性抗体の形成より二重特異性抗体の形成を好ましくする手段が提供される。これらの方法はまた、本発明において好ましく用いられ得る。具体的には、本質的には二重特異性全長IgG分子のみを産生する好ましい変異は、第1のCH3ドメイン(「KK変異体」重鎖)における351位及び366位におけるアミノ酸置換、例えば、L351K及びT366K(EUナンバリングに従ったナンバリング)及び第2のCH3ドメイン(「DE変異体」重鎖)における351位及び368位におけるアミノ酸置換、例えば、L351D及びL368Eであり、又は逆も同様である(図2)。本発明者らの同時係属出願において、負に荷電したDE変異体重鎖及び正に荷電したKK変異体重鎖が優先的には対形成して、ヘテロダイマー(いわゆる、「DEKK」二重特異性分子)を形成することを既に実証した。DE変異体重鎖(DE-DEホモダイマー)又はKK変異体重鎖(KK-KKホモダイマー)のホモダイマー形成は、同一の重鎖間でのCH3-CH3干渉における荷電した残基間の強力な反発に起因して、ほとんど生じない。
IgGの精製を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーを使用して、小スケール(<500μg)にて行った。小スケールの精製を、無菌条件下、24ウェルプレートにおいて濾過を使用して行った。まず、培地のpHを、pH8.0に調節し、続いて、IgGを含有する上清を、プロテインAセファロースCL-4Bビーズ(50%v/v)(Pierce社)と共に、2時間、25℃にて、振盪プラットフォーム上、600rpmにおいてインキュベートした。次に、ビーズを、濾過により回収した。ビーズを、PBS pH7.4を用いて2回洗浄した。次に、結合したIgGを、pH3.0において0.1Mクエン酸バッファーを用いて溶出し、溶出液を、トリスpH8.0を使用して直ちに中和した。バッファー交換を、マルチスクリーンUltracel 10マルチプレート(Millipore社)を使用して遠心分離により行った。最後に、試料を、PBS中pH7.4に回収した。IgG濃度を、オクテットを使用して測定した。タンパク質試料を、4℃にて保存した。
精製したIgGの量を決定するために、抗体の濃度を、トータルのヒトIgG(Sigma Aldrich社、カタログ番号I4506)を標準として使用したプロテインAバイオセンサー(Forte-Bio社、供給者の推奨に従い)を使用してオクテット解析により決定した。
二重特異性抗体を、FACSにおいて、関連のヒト及びマカクオルソログ(Table 1(表3))を発現する安定な細胞株及び野生型細胞への結合について試験した。それ故、細胞を回収して、FACSバッファー(PBS/0.5% BSA/0.5mM EDTA)において106個の細胞/mlに希釈した。1~2×105個の細胞を、U底96ウェルプレートにおけるそれぞれのウェルに加えた。細胞を、2分間、300gにおいて4℃にて遠心分離した。プレートを逆さにすることにより、上清を捨てた。濃度10μg/mlのそれぞれのIgG試料50μlを加え、1時間氷上でインキュベートした。細胞を1回遠心分離し、上清を取り除き、細胞をFACSバッファー150μlを用いて2回洗浄した。1:400希釈したヤギ抗ヒトIgG PE(Invitrogen社)50μlを加え、30分間、氷上で暗所にてインキュベートした。FACSバッファーを加えた後、細胞を1回遠心分離し、上清を取り除き、細胞をFACSバッファーを用いて2回洗浄した。細胞を、FACSCantoフローサイトメーター(Becton and Dickinson社)上HTS設定において解析した。抗体の細胞への結合を、染色した細胞集団の平均蛍光強度(MFI)を測定することにより、評価した。MFIが、(陰性対照)非結合抗体(テタヌス毒素に対する)を用いて染色した同じ細胞集団のものの少なくとも5倍であるとき、抗体は、それらの標的に結合するとみなした。
huPD-L1及びhuPD-1結合クローンを、PD-L1のPD-1との相互作用をブロックするそれらの能力について試験した。PD-L1 Fabアームについて、PD-L1とCD80との間の相互作用をブロックする能力も評価した。それ故、PD1-Fc(R&D systems社;カタログ番号1086-PD)又はCD80-Fc(R&D systems社;カタログ番号140-B1)を、それぞれ、1及び3μg/mlでマキシソーププレートにコーティングした。コーティングしたウェルを、PBS中の4%BSAを用いてブロックした。その後、0.55μg/mlビオチン化PD-L1(BPS bioscience社;カタログ番号71105)を、0.15~20μg/mlの範囲のIgGの存在又は非存在下で加えた。結合したビオチン化PD-L1を、ブロックバッファーにおいて1:2000希釈したHRPコンジュゲートストレプトアビジン(BD bioscience社:カタログ番号554066)を用いて検出した。それぞれのインキュベーション工程後、ELISAプレートを、PBS-T(PBS-0.05%v/v Tween20)を用いて3回洗浄した。結合したストレプトアビジンを、TMB/H2O2染色により視覚化し、染色を、OD450nm測定により定量化した。ELISAシグナルが、TT特異的競合抗体を加えた対照と比較して、IgG(PD-L1×TT又はPD-1×TT)濃度10μg/mlにおいて70%より低減したとき、クローンは、PD-1のPD-L1との相互作用をブロックするとみなした。PD-1×TT又はPD-L1×TT二重特異性分子として試験したPD-1及びPD-L1抗体パネルの代表的選択を用いて得た結果について、図10を参照。
FACSにおいてそれぞれのヒト及びマカクオルソログに結合することを示した二重特異的抗体を、FACSにおける両方のオルソログについての明らかな親和性についてランキングした。それ故、それぞれのオルソログを発現する安定な細胞株(Table 1(表3))を回収し、FACSバッファー(PBS/0.5% BSA/0.5mM EDTA)中106個の細胞/mlに希釈した。細胞を、2分間、300gにおいて4℃にて遠心分離した。プレートを逆さにすることにより、上清を捨てた。10~0.01μg/mlの範囲にある11段階の2倍連続希釈におけるそれぞれのIgG試料50μlを加え、1時間、氷上でインキュベートした。細胞を1回遠心分離し、上清を取り除き、細胞を、FACSバッファー150μlを用いて2回洗浄した。1:400希釈したヤギ抗ヒトIgG PE(Invitrogen社)50μlを加え、30分間、氷上、暗所でインキュベートした。FACSバッファーを加えた後、細胞を1回遠心分離し、上清を取り除き、細胞を、FACSバッファーを用いて2回洗浄した。細胞を、FACSCantoフローサイトメーター(Becton and Dickinson社)上、HTS設定において解析した。抗体の細胞への結合を、染色した細胞集団の平均蛍光強度(MFI)を測定することにより、評価した。MFIが、(陰性対照)非結合抗体(テタヌス毒素に対する)を用いて染色した同じ細胞集団のものの少なくとも5倍であるとき、抗体は、それらの標的に結合するとみなした。
ヒト全血を、バフィーコート(Sanquin社)から得て、PBSを用いて1:1希釈した。Leucosepチューブ(Greiner Bio-One社カタログ番号227 290)を、室温(RT)にて温めた17.5m Ficoll-Paque Plus(Amersham Biosciences社カタログ番号17-1440-02)を用いて充填した。Ficoll-Paque Plusを、30秒間、1000×gにおいてRTにてスピンダウンした。希釈した全血30mlを、上部に注いだ。チューブを、1000×gにおいて10分間、RTにてスピンし、単核PBMC界面を回収し、PBSにおいて2回洗浄し、PBS 250μlにおいて再懸濁した。PBMCをカウントし、組織培養培地(10% FCSを含むDMEM)中1×106個の細胞/mlに再調節し、等量の氷冷凍結培地(80%培養培地/20% DMSO)を加えることにより、凍結した。細胞を、更なる使用まで、1mlのアリコートで-150℃において保存した。
二重特異性抗体の機能的活性を、ブドウ球菌エンテロトキシン(Staphylococcus enterotoxin)B(SEB)により刺激したPBMCを使用することにより、決定した。SEBは、Vβ3、12、14、15、17及び20T細胞受容体鎖を発現するT細胞を特異的に活性化する。3人のドナー由来のPBMCを解凍し、洗浄し、カウントし、培養培地(RPMI1640及び10%熱不活化FBS)に濃度2×106個の細胞/mlまで再懸濁した。細胞を、平底96ウェルプレート(2×105個の細胞/ウェル)においてSEB(2000又は125ng/ml)の存在下で播種した。20μg/mlで始まる抗体の連続希釈液を加えた。それぞれのプレートは、参照対照として働く陰性(TT特異的PG1337)及び陽性対照抗体イピリムマブ(ipilumumab)、ニボルマブ(PD-1×PD-L1)、LAG3.5(LAG-3×PD-1)の連続希釈液を含有していた。抗原のサイトカイン分泌及び/又は細胞表面発現についての試験に先立ち、細胞を、3日間、37℃、5%CO2、95%相対湿度において刺激した。
ELISA:様々な回数でのT細胞又はPBMCの刺激後、プレートを遠心分離し、培地を除去した。サイトカインレベルを、製造元の指示(Perkin Elmer社)に従い、AlphaLISAにより検出した。標準曲線に基づき、濃度を計算した。
PD-1及びPD-L1の機能を阻害する抗体は、当該技術分野において公知である。モノクローナル二価抗体を、公開された情報に従い構築し、CHO-S細胞において発現させた。抗PD-1抗体ニボルマブを、CA 02607147に開示された情報に基づき作製した。抗PD-L1抗体MPDL3280Aは、WO2010077634A1、Genentech Inc社に開示の情報に基づくものであった。
Promega社が、使用したPD-1/PD-L1遮断レポーターアッセイを開発し、それは、2つの細胞系;PD-L1、及びT細胞活性化因子を発現するCHO細胞並びにPD-1を過剰発現するジャーカット/NFAT-REレポーター細胞株に基づく。PD-1/PD-L1遮断レポーターアッセイを、解凍物を使用して行い、Promegaのフォーマットを使用した。PD-L1発現細胞(カタログ番号C187103)を、細胞回復培地(10% FBSを含有するDMEM/F12)14.5mlにおいて解凍した。次に、細胞懸濁液50μlを、96ウェルハーフエリアプレート(Corning社、カタログ番号3688)の内部ウェルに加えた。プレートを、一晩、37℃、5% CO、95%相対湿度においてインキュベートした。翌日、培養培地を除去し、連続希釈(開始濃度10μg/ml)でのアッセイ培地(4% FBSを含有するRPMI1640)の試験抗体20μlを、それぞれのウェルに加えた。それぞれのプレートは、参照対照として働く陰性(TT特異的PG1337)及び陽性対照抗体(5C4として本明細書において言及される、ニボルマブに基づく1つの対照、及びMPDL3280A又はYW243.55.S70として本明細書において言及される、アテゾリズマブに基づく1つの対照)の連続希釈液を含有していた。PD-1エフェクター細胞(カタログ番号C187105)を、アッセイ培地5.9mlにおいて解凍し、細胞懸濁液20μlを、それぞれのウェルに加えた。プレートを、6時間又は一晩、37℃、5% CO、95%相対湿度においてインキュベートした。ルシフェラーゼ(Bio-Glo社ルシフェラーゼアッセイシステム、カタログ番号G794L)40μlを、翌日加え、ルシフェラーゼ活性の量を、BioTek社シナジー2マルチモードマイクロプレートリーダーを使用して測定した。効力を、陰性対照抗体との比較におけるルシフェラーゼ活性として測定した。
PD1×PD-L1抗体パネルのスクリーニング
抗体重鎖の発現の際、重鎖のヘテロ二量体化を強制し、遺伝子導入後に二重特異性抗体の生成をもたらすように、PD-1及びPD-L1抗体パネル由来のVHを、荷電した遺伝子操作したFcサイレンスベクターにクローニングした。PD-1 Fabアームを、MV1625ベクターにクローニングし、一方、PD-L1 Fabアームを、MV1624ベクターに再クローニングした。PD-1及びPD-L1抗体を、Fabアームを標的にするMF1337 TTと合わせて、一価の様式でPD-1又はPD-L1を標的にする二重特異性抗体を作製した。二重特異的抗体を、PD-1/PD-L1遮断レポーターアッセイにおいてセミログ連続タイトレーション(開始濃度10μg/ml)中で試験して、ブロッキング効力について抗体をランク付けした。一価フォーマットでのPD-L1抗体のパネルを、ランク付けすることができた一方、一価フォーマットでのPD-1抗体のパネルは、PD-1/PD-L1遮断レポーターアッセイにおいてランク付けするのに不十分なブロッキング能を示した。それ故、PD-1抗体を、二価フォーマットで産生させ、PD-1/PD-L1遮断レポーターアッセイにおいて再度試験した。
PD-1×PD-L1 Fab変異体のクローニング及び発現
合計15種のPD-1及び25種のPD-L1 Fabアームを組み合わせて、65種の二重特異性抗体を作製した。Fabアームの配列を、図3及び図13において描写する。
抗体の発現が、重鎖のヘテロ二量体化を強制し、遺伝子導入後に二重特異性抗体の生成をもたらすように、PD-L1及びPD-1 Fabパネル由来の65種のVH領域を遺伝子操作した発現ベクターに再クローニングした。PD-1 FabアームのVH領域を、ベクターMV1625にクローニングし、PD-L1 Fabアームのものを、ベクターMV1624にクローニングした。両方のベクターは、IgGタンパク質のCH2及びCH3コード領域において余分な変異を有し:MV1625とMV1624の両方は、得られた抗体のFcγ受容体及びC1q相互作用を妨げるL235G及びG236R置換を含有する。MV1625はまた、CH3ドメインにおけるアミノ酸置換L351D及びL368Eを含有する(「DE変異体」重鎖)一方、MV1624は、CH3ドメインにおけるアミノ酸置換L351K及びT366Kを含有する(「KK変異体」重鎖)。
ELISAによるPD-1及びPD-L1 Fabの抗原結合の確認
PD-1又はPD-L1についての抗原ELISAの限界
二重特異性IgGに存在するPD-1及びPD-L1 Fabの結合を確認するために、抗原タイトレーションELISAを行った。このELISAにおいて、PD-1又はPD-L1抗原の連続希釈液を、96ウェルプレートにコーティングした。次に、プレートを、試験抗体と共にインキュベートし、容易に視認できる色素に無色の基質を変換する、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)をコンジュゲートした2次マウス抗ヒト抗体を使用して検出した。陰性TT特異的対照抗体PG1337を、全てのプレート上に含めた。ベンチマーク抗huPD-1抗体5C4(ニボルマブに基づく)を、PD-1タンパク質を用いてコーティングした全てのプレート上の陽性対照として含み、ベンチマーク抗huPD-L1抗体YW243.55.S70(アテゾリズマブに基づく)は、PD-L1タンパク質を用いてコーティングした全てのプレート上の陽性対照として含んだ。
PD-1/PD-L1遮断レポーターアッセイにおける抗体の活性
作製した二重特異性PD-1×PD-L1抗体のブロッキング活性を、Promega Corporation社、米国が開発した生理的に関連するPD-1/PD-L1遮断レポーターアッセイにおいてin vitroで試験した。アッセイは、PD-L1及びT細胞受容体活性化因子を発現するCHO細胞を、PD-1を過剰発現するジャーカット/NFAT-REレポーター細胞株と共培養する、2細胞システムに基づく。ジャーカットT細胞は、NFAT(活性化T細胞の核因子)経路を通じて活性化し得るルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有する。PD-1のPD-L1との相互作用は、この経路の活性化を阻害する。しかしながら、PD-1又はPD-L1に対する抗体を用いたPD-1/PD-L1相互作用のブロッキングは、NFAT経路を活性化し得る。それ故、PD-1/PD-L1遮断の程度が高くなるほど、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性化が高くなる。このために、それぞれの抗体の連続希釈液を、PD-Ll発現CHO細胞に加え、その後、PD-1を過剰発現するジャーカット/NFAT-REレポーター細胞を加えた。
PD-1/PD-L1遮断レポーターアッセイ
使用したPD-1/PD-L1遮断レポーターアッセイは、Promega社が開発し、2つの細胞システム:PD-L1及びT細胞活性化因子を発現するCHO細胞、及びPD-1を過剰発現するジャーカット/NFAT-REレポーター細胞株に基づく。解凍物を使用して、PD-1/PD-L1遮断レポーターアッセイを行い、Promega社のフォーマットを使用する。PD-L1を発現する細胞(カタログ番号C187103)を、細胞回復培地(10% FBSを含有するDMEM/F12)14.5mLにおいて解凍した。次に、細胞懸濁液50μLを、96ウェルハーフエリアプレート(Corning社、カタログ番号3688)の内部ウェルに加えた。プレートを、一晩、37℃、5% CO2、95%相対湿度においてインキュベートした。翌日、培養培地を取り除き、連続希釈(開始濃度10μg/mL)でのアッセイ培地(4% FBSを含有するRPMI1640)中の試験抗体20μLを、それぞれのウェルに加えた。それぞれのプレートは、参照対照として働くテタヌス毒素に対する陰性抗体(PG1337)及び陽性対照抗PD-L1抗体(YW243.55.S70;アテゾリズマブに基づく)の連続希釈液を含有していた。PD-1エフェクター細胞(カタログ番号C187105)を、アッセイ培地5.9mlにおいて解凍し、細胞懸濁液20μLを、それぞれのウェルに加えた。プレートを、24時間、37℃、5% CO2、95%相対湿度においてインキュベートした。ルシフェラーゼ基質(Bio-Glo社ルシフェラーゼアッセイシステム、カタログ番号G794L)40μLを、翌日加え、ルシフェラーゼ活性の量をBioTek社シナジー2マルチモードマイクロプレートリーダーを使用して測定した。効力を、陽性対照抗体、YW243.55.S70との比較においてルシフェラーゼ活性として測定した。
24時間後の遮断の程度を、Table 6(表9)において示し、データは、抗体を加えていないウェルにおいて測定した活性と比較して、ルシフェラーゼ活性の関連する誘導を示す。パーセンテージ活性を、陽性対照抗PD-L1抗体YW243.55.S70と比べ、曲線下面積(AUC)に基づき計算した。全ての試験した二重特異性PD-1×PD-L1抗体は、明確なブロッキング活性を示した。
PD-1×PD-L1二重特異性lgGの抗原発現細胞へのFACS結合
2つのPD-1×PD-L1二重特異性抗体を、それぞれの抗原を安定的に発現するCHO細胞株上のPD-1及びPD-L1への結合について試験した。このFACSのため使用した細胞株は、CHO-huPD-L1、CHO-S-huPD-1、及び遺伝子導入していないCHO細胞(陰性細胞)であった。簡単に述べると、これらの細胞株を、増大する濃度の二重特異性IgG、親IgG又は対照IgGを用いて染色し、続いて、ヤギ抗ヒトIgG-PEを用いて検出した。陽性対照は、ベンチマーク抗huPD-1抗体5C1(ニボルマブに基づく)及びベンチマーク抗huPD-L1抗体YW243.55.S70(アテゾリズマブに基づく)であり、陰性対照は、抗テタヌス毒素抗体PG1337であった。
2つの二重特異性IgGのPD-L1及びPD-1への結合及び参照抗体のものを、図16において示す。データは、増大する濃度の二重特異性IgG又は対照IgGを用いて染色したPD-L1及びPD-1を発現するCHO細胞上のFACSにより検出したMFIを示す。これらの結果は、両方の二重特異性IgGが、CHO細胞上で発現したとき、両方の標的を認識し、結合の程度は、参照抗体のものと同様であるか、又はそれより良好であったことを示す。
PD-1×PD-L1二重特異性lgGの活性化T細胞へのFACS結合
ヒト活性化T細胞を使用したFACS結合アッセイ
2つのPD-1×PD-L1二重特異性抗体をまた、活性化T細胞上のPD-1及びPD-L1への結合について試験した。簡単に述べると、96ウェルプレートを、一晩、抗CD3抗体を用いてコーティングした。次に、1人のドナー由来の精製したT細胞を加え、3日間培養した。3日後、活性化したT細胞を回収し、プールし、FACSアッセイにおいて使用して、二重特異性IgGの結合をそれらの親単一特異性二価IgGのものと比較した。陽性対照は、ベンチマーク抗huPD-1抗体5C4、ベンチマーク抗huPD-L1抗体YW243.55.S70であり、陰性対照は、抗テタヌス毒素抗体PG1337であった。
T細胞精製
健常ドナー由来の末梢血液単核細胞(PBMC)を解凍し、9容積の培養培地(10%熱不活化(hi)FBSを含むRPMI1640)を滴下添加した。細胞を、10分間、200g、RTにて遠心分離した。細胞ペレットを、培養培地10mLにおいて再懸濁し、細胞を、一晩、37℃、5% CO2、95%相対湿度においてインキュベートすることにより、休ませた。翌日、Tリンパ球を、製造元(Stem cell Technologies社、カタログ番号19051)が記載した通り、EasySep T細胞濃縮(汎CD3)精製法を使用して単離した。EasySep法は、陰性選択を使用する。簡単に述べると、PBMCを、10分間、200g、RTにて遠心分離した。細胞ペレットを、EasySepバッファーにおいて濃度5×107個の細胞/mLにて再懸濁した。細胞容積1mL当たりEasySepヒトT細胞濃縮カクテル50μLを加え、混合し、10分間、RTにてインキュベートした。次に、細胞容積1mL当たりEasySep D磁気粒子50μLを加え、5分間、RTにてインキュベートした。総容積を、EasySepバッファーで2.5mLにし、混合後、細胞懸濁液を5mLの丸底ファルコンチューブ(BD Biosciences社、カタログ番号352235)に移した。次に、チューブを、不所望の細胞分画を磁気に結合させるのを可能にする磁石に、5分間、RTに置いた。次に、チューブを反転し、精製したT細胞分画を、培養培地7.5mLを含有する新しいチューブに注いだ。200g、RTでの10分間の遠心分離により、細胞を回収し、続いて、培養培地中1×106個の細胞/mLの濃度で再懸濁した。
アッセイの開始の1日前に、96ウェル平底プレート(Cellstar、カタログ番号655180)を、一晩、4℃にて、5μg/mL抗CD3(クローンOKT3、eBioscience社、カタログ番号16-0037-85)を用いてコーティングした。翌日、培養プレートを、PBSを用いて2回洗浄し、T細胞懸濁液100μLを、それぞれのウェルに加えた(100,000個の細胞/ウェル)。プレートを、37℃、5% CO2にて、3日間インキュベートした。次に、活性化したT細胞を、複数チャンネルのピペットを使用して数回、優しくピペットで上げ下げすることにより、回収した。細胞をプールし、混合し、1個のウェル毎に0.2~5×105個の細胞にて、U底96ウェルFACSアッセイプレート(BD社、カタログ番号353910)に移した。
FACS結合アッセイの結果を、図17において提供する。データは、増大する濃度のIgGを用いて染色したヒト活性化T細胞上でのFACSにより検出したMFIを示す。グラフは、2つの二重特異性IgG及びそれらの親IgGの結合を比較し、全ての特異的IgGが、活性化T細胞に結合したことを示す。二重特異性IgGについての最高レベルの結合は、親単一特異性二価IgGと陽性対照IgGのいずれのものより高かった。
SPRによるPD-L1についての抗PD-L1 Fabアームの親和性決定
抗PD-L1 FabアームのPD-L1についての親和性を、表面プラズモン共鳴(SPR)を使用して決定した。親和性作用を回避するために、親和性を、PD-L1に特異的な1つのアームのみを有する二重特異性IgG、すなわち、一価のフォーマットの関係において測定した。
親和性判定の結果を、Table 7(表10)において提供し、それは、全ての試験した抗PD-L1 Fabアームが良好な親和性を有することを示す。
PD-1×PD-L1抗体を介したPD-L2遮断
PD-1及びPD-L1に対する治療抗体は、がん処置において有効であることが知られている一方、抗がん免疫におけるPD-L2の役割は、現在明らかでない。PD-L1遮断は、PD-L2をアップレギュレーションすることにより、処置に対する腫瘍抵抗性を強力に促進する可能性がある。PD-L1及びPD-L2は、PD-1の広い重複領域と相互作用するので、PD-1とPD-L1との間の相互作用をブロックする抗PD-1抗体がまた、PD-1とPD-L2との間の相互作用をブロックすると予測する。それ故、幾つかのPD-1/PD-L1二重特異性抗体が、PD-1/PD-L2経路をブロックし得るかどうかを決定することに決定した。
試験した2つのPD-1×PD-L1二重特異性IgGは、PD-1とPD-L2との間の相互作用を減らすことができた(図18)。これは、PD-1/PD-L2経路を介した処置に対する腫瘍抵抗性を、これらの抗体が減殺するという利点をもたらす。
PD-1×PD-L1抗体を介したCD80遮断
免疫抑制性PD-1/PD-L1経路は、近年、広く研究されており、治療抗体ブロッキングPD-1又はPD-L1は、がんに対する有効な処置である。免疫抑制はまた、PD-1とその代替のリガンドPD-L2との間の相互作用を介して、及びCD80(B7-1)へのPD-L1結合を介して誘導されると考えられる。PD-L1上のCD80結合部位が、PD-1結合部位と重複すると思われるので、大部分の市販の抗PD-L1抗体は、PD-L1のPD-1とCD80の両方との相互作用をブロックすることを示した。しかしながら、1つの先行技術抗体(MIH3)は、PD-1:PD-L1相互作用をブロックするが、CD80:PD-L1相互作用をブロックしないように見える(Butteら、2008年)。それ故、本発明者らは、本発明者らの二重特異性抗体が、PD-L1のPD-1及びCD80との相互作用をブロックし得るかどうかを試験することを決定した。
PD-1/PD-L1競合アッセイにおいて、二重特異性抗体のPD-L1:PD-1相互作用をブロックする能力を決定することは可能でなかった(図19、左側のパネル)。しかしながら、二重特異性抗体(MF7686及びMF7703)の両方のアームは、二価IgGフォーマットで試験したとき、PD-L1:PD-1相互作用をブロックした。PD-L1親IgG PG7703は、ベンチマークPD-L1抗体(YW243.55.S70)より強力に相互作用をブロックした。抗PD-1 IgGは、相互作用をより高い程度まで阻害し、PD-1親IgG PG7686は、PD-1ベンチマークIgG(5C4)より良好に作用する。
SEBアッセイ:混合した親と比較した二重特異性
両方の親IgGの等モル混合物とのPD-1×PD-L1二重特異性IgGの機能的比較
二重特異性抗体を、それらの親IgGの混合物と比較するために、SEBアッセイを行った。末梢血液単核細胞(PBMC)を、ブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB)により刺激した。SEBは、Vβ3、12、14、15、17及び20 T細胞受容体鎖を発現するT細胞を特異的に活性化し、細胞が放出したIL-2のレベルは、T細胞活性化の指標である。
図20における結果は、試験した二重特異性抗体が、T細胞を活性化することができることを示す。注目すべきは、PBMCによるSEBにより誘導したIL-2産生は、それらの親二価単一特異性抗体の等モル混合物と共にインキュベーションする場合より、細胞を、PD-1/PD-L1二重特異性抗体とインキュベーションする場合により高い。故に、試験した二重特異性抗体のそれぞれは、それらの親二価単一特異性抗体の等モル混合物と比較して、より強いT細胞活性化能を有する。
PD-1×PD-L1 T細胞応答
前の実施例のSEBアッセイにおいて、全ての試験した二重特異性PD-1×PD-L1抗体は、親IgGのものより強い免疫応答(IL-2産生)、及び親IgGの等モルの混合物のものより強い応答さえ誘導することを見出した。これらの結果は、このアッセイにおいて、PD-1とPD-L1との両方のブロッキングが、同時に、PD-1/PD-L1経路における1つの標的のみをブロッキングするより有効であることを示唆する。続く工程は、二重特異性抗体がまた、抗原-特異的CD4+T細胞アッセイにおいて既存のPD-1又はPD-L1治療抗体より有効であるかどうかを決定することであった。
図21において説明する通り、二重特異性PD-1×PD-L1抗体は、ベンチマーク対照抗体が誘導したものより高いIL-2及びIFNγのレベルを誘導した。注目すべきは、二重特異性抗体はまた、2つのベンチマーク抗体、特に、より低い濃度の2つのベンチマーク抗体の組合せにより誘導したそれらのレベルと比較して、より高いIL-2及びIFNγレベルを誘導した。これらの結果は、二重特異性PD-1×PD-L1抗体が、CD4+T細胞による抗原由来のサイトカイン放出の増強に関して、既存のPD-1若しくはPD-L1治療抗体、又はその混合物より有効であることを示す。
PD-1×PD-L1混合リンパ球反応
二重特異的PD-1×PD-L1抗体は混合リンパ球反応においてT細胞によるIFNγ産生を増強する
混合リンパ球反応(MLR)アッセイを共通して使用して、T細胞活性化及び増殖に対する抗体の作用を理解する。かかるアッセイは、かかる化合物が、腫瘍微小環境におけるかかる応答を開始するT細胞の能力に影響するかどうかの理解を目的とする。
図22は、このアッセイの結果を示し、二価抗PD-L1抗体(YW243.55.S70)及び二価抗PD-1抗体(5C4)のものと比較して、T細胞によるIFNγ産生を増強する二重特異性PD-1×PD-L1抗体の能力を説明する。応答性におけるこの増大はまた、ベンチマーク対照抗体の存在下で見られるが、その程度はより少なかった。故に、試験した二重特異性抗体は、ベンチマーク抗体YW243.55.S70(アテゾリズマブに基づく)及び5C4(ニボルマブに基づく)と比較して、より強いT細胞活性化能力を有する。これらの結果は、二重特異性抗体が、腫瘍微小環境における免疫応答を開始するT細胞の能力を増大させること、及び二重特異性抗体の作用が、ベンチマーク抗体と比較して、より明白であることを示す。
腫瘍浸潤T細胞の増殖に対する二重特異性PD-1×PD-L1抗体の作用
腫瘍関連設定における本発明者らの二重特異性抗体を試験するために、本発明者らは、患者腫瘍材料から単離したT細胞に基づく最近開発されたex vivoアッセイの使用を作製した。Zhouらは、肝細胞癌(HCC)を有する患者から新鮮な腫瘍物質を得て、腫瘍浸潤細胞(骨髄系及びリンパ系細胞)を単離し、これにより、腫瘍浸潤T細胞の機能に対する免疫チェックポイント阻害を標的にする抗体の作用を試験する方法を提供する方法を開発した(Zhouら、2017)。ここで、本発明者らは、HCCを有する患者から材料を得て、抗PD-1×PD-L1二重特異性抗体MF7686×MF7703が、これらの患者からもたらされた腫瘍浸潤CD4+及びCD8+T細胞と反応し得るかどうかを試験した。
結果を、図23において示す。それぞれの個体ドナー由来のCD4+TIL(左のパネル)及びCD8+TIL(右のパネル)の増殖を、陰性対照抗体の存在下で増殖するT細胞(低レベルのCFSE)のパーセンテージを測定することにより、決定した。GPC発現B細胞を含有するが、抗体(GPC B細胞)及び非遺伝子導入B細胞(陰性対照B細胞)を含有しない対照ウェルも示す。値は、平均±SEMである(n=5)。
PD-1×PD-L1のin vivo有効性研究huCD34-MDA-MB-231
本発明者らの二重特異性抗体のin vivo活性を試験するために、T細胞介在性抗腫瘍応答を誘導する二重特異性抗体MF7686×MF7703の能力を、PD-L1を発現するトリプルネガティブな乳がん(TNBC)細胞株である、3×106個のMDA-MB-231腫瘍細胞(ATCC、カタログ番号HTB-26)を皮下接種した臍帯血由来のヒトCD34+造血幹細胞(19週齢;The Jackson Laboratory、バーハーバー、メイン州)を用いて再構成したメスの免疫不全NODスキッドガンマ(NSG)マウスにおいてin vivoで研究した。血清を含まないDMEM培養培地(Life technologies社、カタログ番号10566-016)及びマトリゲルメンブレンマトリックス(Fisher Scientific社、カタログ番号CB354248)の1:1懸濁液100μlにおけるこれらの3×106個の細胞を接種した。腫瘍体積が、170~180mm3に達したとき、細胞株接種の7日後に、腫瘍担持マウスの処置を開始した。次に、マウスを、0.5又は5mg/kg MF7686×MF7703二重特異性抗体を用いて5日毎に腹腔内処置した。対照マウスを、未処置のままにするか、又は5mg/kg RSV-G抗原に特異的な陰性対照抗体(Fcサイレンシング変異を有するIgG1)を用いて5日毎に処置した。腫瘍体積を、研究ログシステムを使用して1週間に2回記録した。37日目、すなわち、処置の開始の30日後の研究のin vivoフェーズの終結の際、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を、フローサイトメトリー解析により解析した。このために、腫瘍を回収し、顕微解剖し、製造元の指示に従い、腫瘍分離キット(Miltenyi Biotec社)を使用して消化した。赤血球細胞溶解後、細胞を、生存度色素及びマーカー特異的蛍光色素コンジュゲート抗体を使用したFACS解析のため染色した。細胞を、BD LSR Fortessaフローサイトメトリー解析装置を使用して走らせ、FlowJoソフトウエアパッケージを使用して解析した。生きているTILを、生存度色素陰性細胞として同定し、CD45及びCD3特異的抗体(BD Biosciences社、カタログ番号564307)について陽性染色した。続いて、T細胞分画を、CD4(BD Biosciences社、カタログ番号557852)及びCD8(BD Biosciences社、カタログ番号557834)の発現について特徴付けた。細胞を、BD LSR Fortessaフローサイトメトリー解析装置を使用して走らせ、FlowJoソフトウエアパッケージを使用して解析した。
MF7686×MF7703処置群の両方における腫瘍体積は、対照マウス群におけるものより低かったので、MF7686×MF7703二重特異性抗体は、より少ない用量の丁度0.5mg/kgにおいてでさえ、抗腫瘍応答を誘導した(図24)。フローサイトメトリー解析による、MF7686×MF7703で処置したマウス及び対照マウスにおけるTIL組成の比較は、5mg/kg MF7686×MF7703が、CD4とCD8T細胞数の両方を増す能力を有することを明らかにした(図25)。まとめると、これらのデータは、PD-L1陽性腫瘍を有するCD34+ヒト化マウスモデルにおいて、本発明者らの二重特異性抗体MF7686×MF7703が、TILの数を増す能力、並びに抗腫瘍応答を誘導する能力を有したことを示す。
PD-1×PD-L1のin vitro及びin vivo有効性研究(A549)
抗原TCR特異的シグナル伝達の関係において腫瘍細胞のT細胞仲介性細胞毒性を増強するMF7686×MF7703二重特異性抗体の能力を、A549-A2-ESO-1腫瘍細胞及びNY-ESO-1-特異的T細胞を使用してin vitroで研究した。A549-A2-ESO腫瘍細胞は、非小細胞性肺癌(NSCLC)細胞株からもたらされ、Moonら(2016)により記載される、PD-L1及びHLA-A2拘束性NY-ESO-1ペプチド抗原を発現する。NY-ESO-1-特異的T細胞を、Moonら(2016)に従い調製した。A549-A2-ESO-1腫瘍細胞(ルシフェラーゼを過剰発現する)を、10%熱不活化ウシ胎児血清(FBS)(HyClone社、カタログ番号SH30071.03)を補充したRPMI1640培地(Gibco社、カタログ番号11875-085)中のNY-ESO-1-特異的T細胞と共培養した。A549-NY-ESO-1細胞を、96ウェル平底プレートに加え、続いて、異なるエフェクター対標的(E:T)比(1:1、0.5:1、0.25:1及び0.125:1)においてNY-ESO-1特異的Ly95T細胞を加えた。細胞を、72時間、37℃にて、抗体処置あり又はなしで共培養し、これにより、MF7686×MF7703を、抗PD-1対照抗体MK-3475(ペムブロリズマブに基づく)、抗PD-L1対照抗体YW243.55.S70(アテゾリズマブに基づく)、又はMK-3475+YW243.55.S70の組合せ(10μg/mLの終濃度の全抗体)と比較した。72時間後、共培養物由来の上清を集め、製造元の指示に従い、IFNγQuantikine ELISAキット(R&D Systems社、カタログ番号DIF50)を使用して、IFNγ分泌について解析した。NY-ESO-1-特異的T細胞により誘導した細胞毒性の程度を、ルシフェラーゼアッセイシステム(Promega社、カタログ番号E1501)を使用して、SpectraMaxマルチモードプレートリーダーにおいて残りの発光を測定することにより、定量化した。
MF7686×MF7703及び対照抗体を用いて処理した共培養物の比較は、MF7686×MF7703が、低いE:T比においてでさえ、IFNγ放出における増大により影響される機能的T細胞の分画(図26)と、A549-NY-ESO-1腫瘍細胞に対するT細胞毒性の程度(図27)の両方を増強することを示した。注目すべきは、二重特異性抗体MF7686×MF7703は、全てのE:T比において、対照抗体YW243.55.S70と比較して、より高いIFNγ放出をもたらした。より低いE:T比において、MF7686×MF7703により誘導されたIFNγ放出は、比較可能であり、対照抗体MK-3475又は対照抗体YW243.55.S70とMK-3475の組合せにより誘導されたIFNγ放出と比較して高くさえあった。
図28において示す通り、MF7686×MF7703処置群における腫瘍体積が、対照マウス群におけるものより低かったので、MF7686×MF7703二重特異性抗体は、抗腫瘍応答を誘導した。注目すべきは、このMF7686×MF7703により誘導した抗腫瘍応答は、等価用量の単一の参照抗体(YW243.55.S70又はMK-347)を用いて処置したマウスにおいて観察した応答より高く、等価用量の合わせた参照抗体(YW243.55.S70+MK-3475;図28)の2倍を与えたマウスにおいて観察した応答に匹敵した。故に、二重特異性抗体MF7686×MF7703を使用したとき、腫瘍塊における同じ低減を、YW243.55.S70とMK-3475との組合せと比較して、半分のみの投薬量を用いて得た。
PD-1×PD-L1二重特異性抗体は同時刺激依存性の様式でPD-1/PD-L1シグナル伝達をブロックする
本発明者らは、2つのPD-1×PD-L1二重特異性抗体MF7686×MF7703及びMF6974×MF7689の、活性化T細胞サイトカイン産生に対するPD-L1/PD-1エンゲージメントを阻害する能力を試験した。本発明者らは、抗CD3/抗CD28刺激を使用して、T細胞を活性化し、組換えヒトPD-L1-Fcとの共培養により、同時刺激をもたらし、それが、T細胞上のPD-1とエンゲージメントする。このPD-1/PD-L1相互作用は、細胞活性化を阻害するので、PD-1又はPD-L1に対する抗体を用いたPD-1/PD-L1相互作用のブロッキングは、細胞を再活性化し、IL-2産生をもたらす。
同時刺激依存性T細胞活性化アッセイ
健常ドナー由来の末梢血液単核細胞(PBMC)を解凍し、9容量の培養培地(10%熱不活化(hi)FBSを有するRPMI1640)を滴下添加した。細胞を、10分間、200g、RTにて遠心分離した。細胞ペレットを、培養培地10mLにおいて再懸濁し、細胞を、一晩、37℃、5% CO2、95%相対湿度においてインキュベートすることにより、休ませた。翌日、Tリンパ球を、製造元(Stemcell Technologies社、カタログ番号19051)が記載した通りEasySep T細胞濃縮(汎CD3)精製法を使用して単離した。EasySep法は、陰性選択を使用する。簡単に述べると、PBMCを、10分間、200g、RTにて遠心分離した。細胞ペレットを、濃度5×107個の細胞/mLでEasySepバッファーにおいて再懸濁した。EasySepヒトT細胞濃縮細胞体積1mL当たりカクテル50μLを加え、混合し、10分間、RTにてインキュベートした。次に、細胞体積1mL当たりEasySep D磁気粒子50μLを加え、5分間、RTにてインキュベートした。総体積を、EasySepバッファーで2.5mLにし、細胞を混合した後、懸濁液を、5mLの丸底ファルコンチューブ(BD Biosciences社、カタログ番号352235)に移した。次に、チューブを、不所望の細胞分画を磁気に結合させるのを可能にする磁石に、5分間、RTにて置いた。次に、チューブを反転し、精製したT細胞分画を、培養培地7.5mLを含有する新しいチューブに注いだ。細胞を、200g、RTでの10分間の遠心分離により、細胞を回収し、続いて、培養培地中1×106個の細胞/mLの濃度で再懸濁した。
図30及び31は、抗体を含有するウェルにおいて測定したIL-2カウントの、抗体を含まないウェルにおけるものに対する比として計算した刺激指数(SI)を示す。SIは、細胞を、陰性対照抗体PG2708、又は単独(図30)及び組合せ(図31)の両方における親二価抗体と共にインキュベートした場合より、2つのPD-1×PD-L1二重特異性抗体の存在下でより高かった。注目すべきは、SIはまた、細胞を、抗PD-1ベンチマーク抗体(5C4)及び抗PD-L1ベンチマーク抗体(YW243.55.S70)単独及び組合せの両方と共にインキュベートした場合より、2つのPD-1×PD-L1二重特異性抗体の存在下でより高かった。これは、全ての試験した二重特異性抗体が、親抗体と比較して、及びベンチマーク抗体と比較して、より強い同時刺激依存性T細胞活性化活性を有することを示す。二重特異性抗体により誘導したT細胞活性化は、ベンチマーク抗体の混合物により誘導したT細胞活性化より強かった。
Claims (38)
- 抗体であって、
- 配列番号39、41、42、44~46又は50~56のいずれか1つの重鎖可変領域のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を含む、PD-1 (第1の膜タンパク質)の細胞外部分に結合することができる可変ドメイン、
- 配列番号26~31、33、34、36、58~64、又は67~70のいずれか1つの重鎖可変領域のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を含む、PD-L1 (第2の膜タンパク質)の細胞外部分に結合することができる可変ドメイン、
- CDR1配列 QSISSY、CDR2配列 AAS、及びCDR3配列 QQSYSTPPTを有する軽鎖可変領域
を含み、
前記第1及び第2の膜タンパク質は、結合パートナー(つまり、リガンド及び受容体対)であり、前記第1の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる可変ドメインの結合は、前記第1の膜タンパク質と前記第2の膜タンパク質との結合を阻止し、及び/又は前記第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる可変ドメインの結合は、前記第1の膜タンパク質と前記第2の膜タンパク質との結合を阻止する、抗体。 - 前記抗体の結合は、受容体-リガンド対の結合の阻害活性を低減する、請求項1に記載の抗体。
- スタフィロコッカスエンテロトキシンB(SEB)アッセイにおいて、
- PD-1に結合する前記可変ドメインを2つ含む二価単一特異性抗体、及び
- PD-L1に結合する前記可変ドメインを2つ含む二価単一特異性抗体
の等モル混合物と比較して、より強力なCD4+ T細胞活性化能力を有する、請求項1又は2に記載の抗体。 - 抗原特異的CD4+ T細胞アッセイにおいて、ベンチマーク抗体5C4又はベンチマーク抗体YW243.55.S70又はベンチマーク抗体5C4及びYW243.55.S70の組合せよりも強力にT細胞を活性化することができる、請求項1~3のいずれか一項に記載の抗体。
- 混合リンパ球反応(MLR)アッセイにおいて、ベンチマーク抗体5C4又はベンチマーク抗体YW243.55.S70と比較して、より強力なCD4+ T細胞活性化能力を有する、請求項1~4のいずれか一項に記載の抗体。
- PD-L1に結合する可変ドメインが、PD-L1の細胞外部分に対して、SPRにより測定して4.27nM以下、又は1.31nM以下、又は1.27nM以下の平衡解離定数(KD)の結合親和性を有する、請求項1~5のいずれか一項に記載の抗体。
- CD4+及び/又はCD8+腫瘍浸潤性T細胞の増殖を増強することが可能である、請求項1~6のいずれか一項に記載の抗体。
- ベンチマーク抗体MK-3475及びYW243.55.S70の組合せと比較して、in vivoでより強力なT細胞媒介性抗腫瘍応答を示すことが可能である、請求項1~7のいずれか一項に記載の抗体。
- PD-1の細胞外部分に結合する前記可変ドメインは、PD-1に結合する前記可変ドメインを2つ含む二価単一特異性抗体フォーマット中に存在する場合、ジャーカット細胞のT細胞受容体媒介性活性化のPD-1/PD-L1媒介性阻害を、ジャーカット細胞に対して抗体ニボルマブで得られる阻害と比較して20~150%の範囲で阻害する可変ドメインであると定義される、請求項1~8のいずれか一項に記載の抗体。
- PD-L1の細胞外部分に結合する前記可変ドメインは、無関連抗原に結合する第2の可変ドメインを有する二重特異性抗体中に存在する場合、PD-L1結合に対して0.1~14nMのKdを前記二重特異性抗体に付与する(ビアコアにより測定して)可変ドメインであると定義される、請求項1~9のいずれか一項に記載の抗体。
- PD-1の細胞外部分に結合することができる可変ドメインが、配列番号39、41、42、44~46又は50~56のいずれか1つの重鎖可変領域のアミノ酸配列であって、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列に対して、最大で15個、又は0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを有するアミノ酸配列を含み、前記挿入、欠失、又は置換が前記重鎖可変領域のCDR1、CDR2、又はCDR3中ではない、請求項1~10のいずれか一項に記載の抗体。
- PD-1の細胞外部分に結合することができる前記可変ドメインは、
- 配列番号39、44、及び53からなる群から選択される可変領域の重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3配列と同一である重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3配列
を含む、請求項1~11のいずれか一項に記載の抗体。 - PD-1の細胞外部分に結合することができる前記可変ドメインは、
- 配列番号39、44、又は53のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は
- 配列番号39、44、又は53のアミノ酸配列と少なくとも90%同一である配列を有する重鎖可変領域
を含む、請求項12に記載の抗体。 - PD-L1の細胞外部分に結合することができる可変ドメインが、配列番号26~31、33、34、36、58~64又は67~70のいずれか1つの重鎖可変領域のアミノ酸配列であって、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列に対して、最大で15個、又は0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを有するアミノ酸配列を含み、前記挿入、欠失、又は置換が前記重鎖可変領域のCDR1、CDR2、又はCDR3中ではない、請求項1~13のいずれか一項に記載の抗体。
- PD-L1の細胞外部分に結合することができる前記可変ドメインは、
- 配列番号59及び63からなる群から選択される可変領域の重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3配列と同一である重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3配列
を含む、請求項1~14のいずれか一項に記載の抗体。 - PD-L1の細胞外部分に結合することができる前記可変ドメインは、
- 配列番号59又は63のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は
- 配列番号59又は63のアミノ酸配列と少なくとも90%同一である配列を有する重鎖可変領域
を含む、請求項15に記載の抗体。 - PD-L1の細胞外部分に結合することができる前記可変ドメインが、配列番号59のアミノ酸配列であって、配列番号59のアミノ酸配列に対して、最大で15個、又は0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、前記挿入、欠失、又は置換が重鎖可変領域のCDR1、CDR2、又はCDR3中ではなく、
PD-1の細胞外部分に結合することができる前記可変ドメインが、配列番号39のアミノ酸配列であって、配列番号39のアミノ酸配列に対して、最大で15個、又は0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、前記挿入、欠失、又は置換が重鎖可変領域のCDR1、CDR2、又はCDR3中ではない、請求項1~16のいずれか一項に記載の抗体。 - PD-L1の細胞外部分に結合することができる前記可変ドメインが、配列番号59のアミノ酸配列であって、配列番号59のアミノ酸配列に対して、最大で15個、又は0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、前記挿入、欠失、又は置換が重鎖可変領域のCDR1、CDR2、又はCDR3中ではなく、
PD-1の細胞外部分に結合することができる前記可変ドメインが、配列番号53のアミノ酸配列であって、配列番号53のアミノ酸配列に対して、最大で15個、又は0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、前記挿入、欠失、又は置換が重鎖可変領域のCDR1、CDR2、又はCDR3中ではない、請求項1~16のいずれか一項に記載の抗体。 - PD-L1の細胞外部分に結合することができる前記可変ドメインが、配列番号59のアミノ酸配列であって、配列番号59のアミノ酸配列に対して、最大で15個、又は0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、前記挿入、欠失、又は置換が重鎖可変領域のCDR1、CDR2、又はCDR3中ではなく、
PD-1の細胞外部分に結合することができる前記可変ドメインが、配列番号44のアミノ酸配列であって、配列番号44のアミノ酸配列に対して、最大で15個、又は0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、前記挿入、欠失、又は置換が重鎖可変領域のCDR1、CDR2、又はCDR3中ではない、請求項1~16のいずれか一項に記載の抗体。 - PD-L1の細胞外部分に結合することができる前記可変ドメインが、配列番号63のアミノ酸配列であって、配列番号63のアミノ酸配列に対して、最大で15個、又は0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、前記挿入、欠失、又は置換が重鎖可変領域のCDR1、CDR2、又はCDR3中ではなく、
PD-1の細胞外部分に結合することができる前記可変ドメインが、配列番号39のアミノ酸配列であって、配列番号39のアミノ酸配列に対して、最大で15個、又は0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、前記挿入、欠失、又は置換が重鎖可変領域のCDR1、CDR2、又はCDR3中ではない、請求項1~16のいずれか一項に記載の抗体。 - PD-L1の細胞外部分に結合することができる前記可変ドメインが、配列番号63のアミノ酸配列であって、配列番号63のアミノ酸配列に対して、最大で15個、又は0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、前記挿入、欠失、又は置換が重鎖可変領域のCDR1、CDR2、又はCDR3中ではなく、
PD-1の細胞外部分に結合することができる前記可変ドメインが、配列番号53のアミノ酸配列であって、配列番号53のアミノ酸配列に対して、最大で15個、又は0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、前記挿入、欠失、又は置換が重鎖可変領域のCDR1、CDR2、又はCDR3中ではない、請求項1~16のいずれか一項に記載の抗体。 - PD-L1の細胞外部分に結合することができる前記可変ドメインが、配列番号63のアミノ酸配列であって、配列番号63のアミノ酸配列に対して、最大で15個、又は0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、前記挿入、欠失、又は置換が重鎖可変領域のCDR1、CDR2、又はCDR3中ではなく、
PD-1の細胞外部分に結合することができる前記可変ドメインが、配列番号44のアミノ酸配列であって、配列番号44のアミノ酸配列に対して、最大で15個、又は0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、前記挿入、欠失、又は置換が重鎖可変領域のCDR1、CDR2、又はCDR3中ではない、請求項1~16のいずれか一項に記載の抗体。 - 軽鎖可変領域が配列番号6のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であり、CDR1配列 QSISSY、CDR2配列 AAS、及びCDR3配列 QQSYSTPPTを有する、請求項1~22のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体の抗原結合部位は、PD-1の細胞外部分に結合することができる1つの免疫グロブリン可変ドメイン及びPD-L1の細胞外部分に結合することができる1つの免疫グロブリン可変ドメインからなる、請求項1~23のいずれか一項に記載の抗体。
- 全長二重特異性抗体である、請求項1~24のいずれか一項に記載の抗体。
- IgGである、請求項1~25のいずれか一項に記載の抗体。
- 第1の細胞上のPD-1 (第1の膜タンパク質)と第2の細胞上のPD-L1 (第2の膜タンパク質)との結合により媒介される第1又は第2の細胞の生物学的活性を抑制するための方法であって、前記第1及び第2の膜タンパク質は、結合パートナー(つまり、リガンド及び受容体対)であり、前記方法は、
- 前記第1及び第2の細胞を含む系に、請求項1~26のいずれか一項に記載の抗体を提供する工程;及び
- 前記第1又は第2の細胞が、前記抗体が存在しない場合に前記第1の膜タンパク質と前記第2の膜タンパク質との結合により媒介される前記生物学的活性を発現することを可能にする条件下で、前記系をインキュベートする工程
を含み、
- 前記第1の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる可変ドメインの結合は、前記第1の膜タンパク質と前記第2の膜タンパク質との結合を阻止し、及び/又は前記第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる可変ドメインの結合は、前記第1の膜タンパク質と前記第2の膜タンパク質との結合を阻止する方法。 - 請求項1~26のいずれか一項に記載の抗体を単一細胞から産生するための方法であって、前記抗体は、インターフェースを形成することが可能な2つのCH3ドメインを含み、前記方法は、
- a) PD-1の細胞外部分を特異的に認識し、第1のCH3ドメインを含むIgG重鎖をコードする第1の核酸分子、及びb) PD-L1の細胞外部分を特異的に認識し、第2のCH3ドメインを含むIgG重鎖をコードする第2の核酸配列を有する細胞を準備する工程を含み、前記核酸配列には、前記第1及び第2のCH3ドメインの優先的対合のための突然変異が提供されており、前記方法は、前記細胞を培養する工程、及び前記核酸配列の発現を可能にする工程、及び前記抗体を前記培養から回収する工程を更に含む方法。 - 前記細胞は、共通軽鎖、又は再編成された生殖系ヒトカッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01をコードする第3の核酸配列を有する、請求項28に記載の方法。
- 前記第1のCH3ドメインは、アミノ酸置換L351K及びT366K(EU付番による付番)を含み、前記第2のCH3ドメインは、アミノ酸置換L351D及びL368E(EU付番による付番)を含み、前記方法は、前記細胞を培養する工程、及び前記核酸配列の発現を可能にする工程、及び前記抗体を前記培養から回収する工程を更に含む、請求項28又は29に記載の方法。
- 薬剤として使用するための、請求項1~26のいずれか一項に記載の抗体。
- がん、又は病原体、ウイルス若しくは寄生虫による感染症を治療するための方法で使用するための、請求項1~26のいずれか一項に記載の抗体。
- 請求項1~26のいずれか一項に記載の少なくとも1つの抗体を含む組成物又はキットオブパーツ。
- 請求項1~26のいずれか一項に記載の少なくとも1つの抗体、及び薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を含む医薬組成物。
- 請求項1~26のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸分子。
- 請求項35に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項35に記載の核酸分子又は請求項36に記載のベクターを含む単離若しくは組換え細胞又は非ヒト動物。
- がん又は病原体による感染症を治療するための方法で使用するための組成物であって、請求項1~26のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項33若しくは34に記載の組成物、又は請求項35に記載の核酸分子、又は請求項36に記載のベクターの治療有効量を含む、組成物。
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