BR112020000209A2

BR112020000209A2 - moléculas de ligação que modulam uma atividade biológica expressa por uma célula

Info

Publication number: BR112020000209A2
Application number: BR112020000209-7A
Authority: BR
Inventors: Cecilia Anna Wilhelmina Geuijen; Rinse KLOOSTER; Cornelis Adriaan De Kruif; Paulus Johannes TACKEN; Mark Throsby; Ton Logtenberg
Original assignee: Merus N.V.
Priority date: 2017-07-06
Filing date: 2018-07-06
Publication date: 2020-07-21
Also published as: PH12020550011A1; JP7438098B2; WO2019009726A1; EA202090003A1; US11667714B2; JP2020532280A; AU2018296067A1; US20240034794A1; CN111094347A; TW201920264A; IL271817A; US20200325227A1; JP2023171782A; AU2018296067B2; SG11202000014UA; CA3068929A1; BR112020000209A8; KR20200037791A; EP3649154A1

Abstract

A invenção fornece meios e métodos para inibir uma atividade biológica das células. Em uma concretização, a invenção se refere a um método de inibir uma atividade biológica em uma primeira ou segunda célula mediada pela ligação de duas proteínas de membrana que são parceiras de ligação entre si. A atividade biológica mencionada é inibida fornecendo às células um anticorpo ou molécula semelhante a anticorpo que pode se ligar a cada um dos parceiros de ligação mencionados e a ligação bloqueia a ligação dos dois parceiros de ligação, inibindo, assim, a atividade biológica mencionada.

Description

MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO QUE MODULAM UMA ATIVIDADE BIOLÓGICA

EXPRESSA POR UMA CÉLULA Campo da Invenção

[001] A invenção se relaciona com o campo de moléculas de ligação. Em particular, refere-se ao campo das moléculas de ligação terapêuticas para o tratamento de doenças que envolvem as células aberrantes. Mais em particular, refere-se a moléculas de ligação que se ligam a partes extracelulares de duas ou mais diferentes proteínas associadas a membrana e, assim, modular a atividade biológica expressa por uma célula. Antecedentes da Invenção

[002] Câncer é ainda uma das principais causas de morte no mundo, apesar dos muitos progressos que foram feitos no tratamento da doença e o aumento do conhecimento dos eventos moleculares que levam ao câncer. O câncer colorretal (CRC), por exemplo, é o terceiro tipo de câncer mais comum em todo o mundo. Em 2008, 1,23 milhões de pessoas foram diagnosticadas com a doença. É o segundo tipo de câncer mais comum na Europa, com cerca de 447.000 novos casos diagnosticados em 2012 (13% do total). O câncer colorretal é a quarta causa mais comum de morte por câncer, estima-se ser responsável por 608.000 (UE 148.000) mortes por ano. Enquanto alguns novos tratamentos têm sido avançados no CRC, muitos testes clínicos falharam; CRC metastático ainda é em grande parte incurável com tratamentos convencionais. O melanoma é outro exemplo de um câncer que ocorre muito frequentemente. Quando a detecção não é suficientemente precoce, o câncer é susceptível de metástase, em que a fase é muito difícil de tratamento. Os tratamentos de intervenção imune têm sido mostrados a ser eficaz a pelo menos alguns dos pacientes com melanoma metastático. O câncer do pulmão de células não pequenas é um tipo de câncer que raramente é descoberto em um estágio bastante adiantado para a cirurgia. Também estes tipos de cânceres têm sido bem-sucedido no tratamento com tratamentos de intervenção imune.

[003] Tradicionalmente, a maior parte descoberta de fármacos de câncer tem sido centrado sobre os agentes que bloqueiam as funções essenciais da célula e as células se matam por divisão. No entanto, em casos de câncer avançado, aplicado não importa quão agressivamente, até o ponto em que os pacientes sofrem efeitos colaterais potencialmente fatais do tratamento, quimioterapia raramente resulta em uma cura completa. Na maioria dos casos, os tumores nos pacientes param de crescer ou temporariamente encolhem (referido como remissão), apenas para começar a proliferar novamente, algumas vezes mais rapidamente (referido como reincidência), e tornam-se cada vez mais difícil de tratar. Mais recentemente, o foco do desenvolvimento de fármacos para câncer afastou-se da quimioterapia citotóxica amplamente às terapias “citostáticos alvo com menor toxicidade. (o) tratamento do câncer avançado foi validado clinicamente no tratamento da leucemia e alguns outros cânceres. No entanto, na maioria dos carcinomas, abordagens direcionadas ainda estão provando não serem suficiente eficaz para abolir completamente o câncer na maioria dos pacientes.

[004] Alvejamento de cânceres tem sido alcançado utilizando uma variedade diferentes métodos, incluindo, por exemplo, pequenas moléculas dirigidas para proteínas de sinalização, em que o câncer depende para a sobrevivência e / ou crescimento; vacinas com proteínas específicas do tumor; terapias celulares com células do sistema imunológico que matam as células tumorais e ativamente anticorpos que têm como alvo moléculas citotóxicas para o tumor; interferir com a sinalização e / ou que (re) dirigir o sistema imune do hospedeiro para as células tumorais. os anticorpos monoclonais que o bloqueio CTLA-4 ou DP-l foram mostrados para induzir uma resposta clínica durável em sujeitos que tinham melanoma, NSCLC, carcinoma da célula renal e doentes com carcinoma urotelial.

[005] A presente invenção proporciona novos meios e métodos para (re) direcionamento dos componentes do sistema imunológico. A invenção também se refere a meios e métodos para a modulação de uma atividade biológica expressa por células.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] Em um aspecto, a invenção fornece um método de inibir uma atividade biológica de uma primeira ou segunda célula mediada pela ligação de uma primeira proteína de membrana sobre uma primeira célula para uma segunda proteína de membrana sobre uma segunda célula, em que as referidas proteínas de primeira e segunda membranas são parceiras de ligação (isto é, um ligante e par de receptor), o método caracterizado por compreender —- fornecer um sistema que compreende a referida primeira e segunda célula com um anticorpo ou uma variante do referido anticorpo que mantém a especificidade ligação do anticorpo compreendendo um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da referida primeira proteína membranar e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da referida segunda proteína membranar; e - incubar o referido sistema, sob condições que são permissivas para a primeira ou a segunda célula para expressar a referida atividade biológica mediada pela ligação da referida primeira proteína membranar para a referida segunda proteína membranar na ausência do referido anticorpo ou uma sua variante; - em que a ligação do domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular dos ditos blocos de primeira proteína membranar a ligação da referida primeira proteína membranar para a referida segunda proteína de membrana e / ou a ligação do domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de os referidos blocos de proteína de membrana segundo a ligação da referida primeira proteína de membrana para a referida segunda proteína de membrana.

[007] Em algumas concretizações, o referido método pode ser um método in vitro ou ex vivo.

[008] A ligação do anticorpo ou uma sua variante de preferência reduz uma atividade ligação do par receptor- ligante na referida primeira célula. A ligação reduz de um modo preferido uma atividade inibidora da ligação do par receptor-ligante na referida primeira célula. Os pares receptor-ligante da família CD28 e a família B7 que exibem atividade inibidora são também chamados pares receptor- ligante co-inibitórios.

[009] A invenção também fornece um método de inibir uma atividade biológica de uma primeira ou segunda célula mediada pela ligação de um membro da família CD28 (primeira proteína membranar) em uma primeira célula de um membro da família B7 (segunda proteína membranar) sobre uma segunda célula, em que a referida primeira e segunda proteína de membrana são pares de ligação (ou seja, um par ligante e receptor), o método caracterizado por compreender - fornecer um sistema que compreende a referida primeira e segunda célula com um anticorpo ou uma variante do referido anticorpo que mantém a especificidade ligação do anticorpo compreendendo um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da referida primeira proteína de membrana e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da referida segunda proteína membranar; e - incubar o referido sistema, sob condições que são permissivas para a primeira ou a segunda célula para expressar a referida atividade biológica mediada pela ligação da referida primeira proteína membranar para a referida segunda proteína de membrana na ausência do referido anticorpo ou uma sua variante; - em que a ligação do domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular dos ditos blocos de primeira proteína membranar a ligação da referida primeira proteína membranar para a referida segunda proteína de membrana e / ou a ligação do domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular dos referidos blocos de proteína de membrana segundo a ligação da referida primeira proteína de membrana para a referida segunda proteína de membrana.

[0010] Em algumas concretizações, o referido método é um método in vitro ou ex vivo.

[0011] A ligação do anticorpo ou uma sua variante de preferência reduz uma atividade ligação do par receptor- ligante na referida primeira célula. A ligação reduz de um modo preferido uma atividade inibidora da ligação do par receptor-ligante na referida primeira célula. Os pares receptor-ligante que exibem atividade inibidora são os chamados pares receptor-ligante co-inibitórios.

[0012] Também é fornecido um método de melhorar uma atividade biológica de uma primeira ou segunda célula mediada pela ligação de uma primeira proteína de membrana sobre uma primeira célula para uma segunda proteína de membrana sobre uma segunda célula, o método compreendendo —- fornecer um sistema que compreende a referida primeira e segunda célula com um anticorpo ou uma variante do referido anticorpo que mantém a especificidade ligação do anticorpo, que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da referida primeira proteína de membrana e um domínio variável que pode ligar-se a uma parte extracelular da referida segunda proteína membranar; e - incubar o referido sistema, sob condições que são permissivas para a primeira ou a segunda célula para expressar a referida atividade biológica mediada pela ligação da referida primeira proteína membranar para a referida segunda proteína de membrana na ausência do referido anticorpo ou uma sua variante; - em que a ligação do domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da referida primeira proteína de membrana não bloqueia a ligação da referida primeira proteína membranar para a referida segunda proteína de membrana e a ligação do domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de a referida segunda proteína membranar não bloqueia a ligação da referida primeira proteína membranar para a referida segunda proteína de membrana.

[0013] Em algumas concretizações, o referido método é um método in vitro ou ex vivo.

[0014] A primeira proteína de membrana é de preferência Proteína Celular de Morte Programada 1(PD-1); proteína 4 associada a linfócitos T citotóxicos (CTLA-4) atenuador de linfócitos T e B (BTLA); ou 2 contendo Domínio transmembrana e Imunoglobulina (TMIGD2).

[0015] A segunda proteína de membrana é de preferência proteína ligante 2 de morte celular programada 1 (PD-Ll); proteína 2 ligante 1 de morte celular programada (PD-L2); ICOSL; CD80; CD86; B7-H3; B7-H4; TNFRSF14; B7-H6 ou B7-H7. Em uma concretização preferida, a segunda proteína de membrana é PD-L1; PD-L2; CD80; CD86; B7-H4; TNFRSF14; ou B7- H7. Em uma concretização particularmente preferida a segunda proteína de membrana é PD-Ll; ou PD-L2, de preferência PD- Ll. Em uma concretização particularmente preferida da primeira proteína da membrana é de DP-1 e a segunda proteína de membrana é PD-Ll. Uma molécula da presente invenção é preferencialmente um anticorpo biespecífico capaz de bloquear a interação de DP-l1 com PD-L1 e / ou L2 e PD-PD-L1 com DP-l e / ou CD80. De preferência, uma molécula da presente invenção é capaz de bloqueio da DP-l1 eixo completo, incluindo DP-1 com PD-L1 ou PD-L2, e PD-Ll com DP-1 e CD80. Ver Figura 33.

[0016] A invenção também proporciona um anticorpo ou uma variante do referido anticorpo que mantém a especificidade ligação do anticorpo, que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de uma primeira proteína de membrana e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de uma segunda proteína de membrana, em que a referida proteína de primeira e segunda membrana são pares de ligação (ou seja, um par de ligantes e de receptores), e, em que a ligação do domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de blocos de primeira proteína membranar a ligação do referido referida primeira membrana proteína à referida segunda proteína de membrana e / ou a ligação do domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular dos ditos blocos de proteína de membrana segundo a ligação da referida primeira proteína membranar para a referida segunda proteína de membrana.

[0017] A invenção também proporciona um anticorpo ou uma variante do referido anticorpo que mantém a especificidade ligação do anticorpo, que compreende - um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de uma proteína da família CD28 (proteína primeira membrana) e - um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de uma proteína da família B7 (segunda proteína da membrana);

[0018] em que os referidos pares de primeira e segunda proteína de membrana são de ligação (ou seja, um par de ligantes e de receptores), e, em que a ligação do domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular dos referidos blocos de primeira proteína membranar a ligação da referida primeira proteína membranar para a referida segunda membrana proteínas e / ou a ligação do domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular dos ditos blocos de proteína de membrana segundo a ligação da referida primeira proteína membranar para a referida segunda proteína de membrana. A ligação do anticorpo ou uma sua variante de preferência reduz uma atividade ligação do par receptor- ligante na referida primeira célula. A ligação reduz de um modo preferido uma atividade inibidora da ligação do par receptor-ligante na referida primeira célula. pares receptor-ligante que exibem atividade inibidora são os chamados pares receptor-ligante co-inibitório.

[0019] O anticorpo ou variante do mesmo é de preferência um anticorpo biespecífico.

[0020] Em uma concretização preferida, o anticorpo ou uma variante do referido anticorpo que mantém a especificidade ligação dos anticorpos compreende - um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-l1; CTLA-4; BTLA; ou TMIGD2; e - um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-Ll1; PD-L2; CD80, CD86, B7-H4, TNFRSF14, ou B7-H7.

[0021] Em uma concretização preferida, o anticorpo ou uma variante do referido anticorpo que mantém a especificidade ligação dos anticorpos compreende - um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-1; e - um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-L1-L2 ou PD.

[0022] De preferência, a ligação de um domínio variável que pode se ligar PD-l bloqueia a ligação de DP-1l para PD-L1.

[0023] De preferência, a ligação de um domínio variável que pode ligar-se blocos de DP-l1, também a ligação de DP-1 para PD-L2.

[0024] De preferência, a ligação de um domínio variável que pode ligar-se blocos de DP-l1, também a ligação de DP-1 para PD-L1 e PD-L2.

[0025] A ligação de um domínio variável que pode se ligar PD-L1 pode bloquear a ligação de PD-L1 para DP-1.

[0026] A ligação de um domínio variável que pode se ligar PD-L1 pode bloquear a ligação de PD-L1 para CD80.

[0027] A ligação do domínio variável que pode se ligar PD-Ll pode bloquear a ligação de PD-Ll para DP-1 e pode também bloquear a ligação de PD-L1 para CD80.

[0028] Ainda proporcionada uma composição ou um kit de partes ou de uma composição farmacêutica que compreende um ou mais anticorpos ou as suas variantes da invenção.

[0029] Também é proporcionada uma molécula de ácido nucleico que codifica para uma região de pelo menos uma CDR, de preferência para uma região variável de cadeia pesada, de um anticorpo da invenção ou uma variante do referido anticorpo que mantém a especificidade ligação do anticorpo. Também é proporcionada uma molécula de ácido nucleico ou uma colecção de moléculas de ácido nucleico que codifica para um anticorpo da invenção ou uma variante do referido anticorpo que mantém a especificidade ligação do anticorpo. É ainda proporcionado um vector compreendendo uma molécula de ácido nucleico da invenção.

[0030] Também fornecida é uma célula ou um animal não-humano que compreende uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam sozinho ou em conjunto por um anticorpo ou uma variante do referido anticorpo que mantém a especificidade ligação do anticorpo, da invenção. Também são fornecidos métodos de produção de um anticorpo, ou uma variante do referido anticorpo que mantém a especificidade ligação do anticorpo, da invenção, utilizando uma célula tal como descrito, de um modo preferido em conjunto com a colheita do anticorpo ou uma sua variante a partir de uma cultura das células.

[0031] Proporciona-se um sistema de célula que compreende um anticorpo ou uma variante do referido anticorpo que mantém a especificidade ligação do anticorpo da invenção.

[0032] Também é proporcionado um método para o tratamento de um indivíduo que tem uma doença que envolve as células aberrantes, tais como o câncer ou tem uma infecção crónica, tal como com um vírus ou parasita, o método compreendendo a administração de um anticorpo da invenção ou uma variante do referido anticorpo que mantém a especificidade ligação do anticorpo da invenção ao indivíduo em necessidade do mesmo. O anticorpo ou uma sua variante pode preferencialmente se ligam a DP-l1 e DP-Ll. A variável de domínio que se liga DP-l1 de um modo preferido bloqueia a ligação de DP-l para PD-Ll. A variável de domínio que se liga PD-Ll preferivelmente bloqueia a ligação de DP-l para PD-Ll1. O anticorpo ou variante do mesmo é de preferência um anticorpo biespecífico capaz de bloquear a interação de DP- 1 com PD-L1 e / ou L2 e PD-PD-L1l com DP-1 e / ou CD80. De preferência, uma molécula da presente invenção é capaz de bloqueio da DP-l1 eixo completo, incluindo DP-1 com PD-L1 ou PD-L2, e PD-Ll1 com DP-1 e CD80.

[0033] É ainda proporcionado um anticorpo da invenção, ou uma sua variante ou uma molécula de ácido nucleico para utilização como um medicamento.

[0034] A invenção proporciona ainda um anticorpo da invenção ou uma variante do referido anticorpo que mantém a especificidade ligação do anticorpo da invenção, para utilização no tratamento de um indivíduo que tem uma doença que envolve as células aberrantes, tais como o câncer, ou que tenha uma infecção, tal como infecção com um vírus ou parasita.

[0035] Proporciona-se adicionalmente uma utilização de um anticorpo ou variante de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de câncer e / ou uma infecção, tal como infecção com um vírus ou parasita.

[0036] O parasita pode ser um parasita intracelular.

[0037] É ainda proporcionado um método para induzir e / ou estimular uma resposta imunitária num indivíduo contra uma célula aberrante no referido indivíduo, compreendendo o método proporcionar o referido indivíduo com um anticorpo ou uma variante do referido anticorpo que mantém a especificidade ligação do anticorpo da invenção. A célula aberrante é preferivelmente uma célula cancerosa, uma célula infectada com vírus, um parasita ou uma célula infectada parasita. Em uma concretização preferida, a célula é uma célula cancerosa ou uma célula neoplásica.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0038] A família CD28 de receptores desempenha um papel no controlo da resposta imunitária adaptativa. Os membros da família CD28 incluem PD-l1; CTLA-4; BTLA; TMIGD2; ICOS; CD28; e NKp30. Sempre que alguns membros desta família, tais como CD28 e ICOS induzir sinais co-estimulador por ligação ao membro correspondente da família B7 (ligante), os outros membros, de nota CTLA-4 e DP-l induzir sinais inibitórios na ligação do membro da família B7 (CD80; CD86; PD-L1 ou PD-L2).

[0039] Uma proteína de Morte Celular Programada 1 (PD-1) é um receptor da superfície da célula que pertence à família dos receptores CD28 e é expresso em células T e as células pro-B. DP-1 é presentemente conhecido por se ligarem dois ligantes, PD-L1 e PD-L2. PD-l, funcionando como um ponto de controle imunológico, desempenha um papel importante em baixo a regulação do sistema imune através da inibição da ativação de células-T, que por sua vez reduz a autoimunidade e promove a auto-tolerância. O efeito inibitório de DP-1 é pensado para ser realizada por meio de um duplo mecanismo de promoção de apoptose (morte celular programada) em células T específicas de antígeno, em gânglios linfáticos, reduzindo simultaneamente a apoptose em células T reguladoras (células T supressoras). DP-l1 é também conhecida sob um número de diferentes nomes alternativos, tais como PDCDl; Morte celular programada 1; Lúpus Eritematoso Sistémico Susceptibilidade 2; Proteína DP-l1; HPD-l; PDl; Programmed

Cell Death uma proteína; CD279 Antigen; CD279; HPD-G; HSLE1l; SLEB2; e DP-l1. Os IDs externos para a DP-l são HGNC: 8760; Gene Entrez: 5133; Ensembl: ENSGOOOOO0188389; OMIM: 600244 e UniProtKB: Q15116. Novas classes de medicamentos que bloqueiam a atividade da DP-l, o PD-l, inibidores de ativar o sistema imune para atacar tumores e, portanto, são usados com sucesso no tratamento de alguns tipos de câncer.

[0040] Proteína 4 associada a Linfócitos T citotóxicos (CTLA-4) é um receptor de proteína que funciona como um ponto de controlo imunológico. O membro da família CD28 de receptores está envolvida na regulação negativa de respostas imunes num animal. A proteína atua como um "interruptor desligar quando ligada a CD80 ou CD86 sobre a superfície de células apresentadoras de antígeno CTLA4 é conhecido sob um número de outros nomes, tais como linfócito T citotóxico Associated Protein 4;. Insulin-Dependent Diabetes Mellitus 12; celíaca doença 3; CD152; Ligante e a transmembranar emendado Linfócitos T citotóxicos Associated Antigen 4; Ao linfócito T citotóxico 4-Associated Antigen; CD152 Antigen; CELIAC3; IDDM12; ALPS5; GRD4; GSE; e CD. IDs externos para CTLA-4 são HGNC: 2505; Gene Entrez: 1493; Ensembl: ENSGOO0O000163599; OMIM: 123890; e UniProtKB: P16410.

[0041] Atenuador de linfócitos T e B (BTLA) é um outro membro da família CD28 de proteínas. Ele é induzido durante a ativação de células T. BTLA é expresso em células Thl, mas não em células Th2. BTLA é um parceiro de ligação de B7-H4. Ao contrário de outros membros desta família, BTLA pode interagir com os membros da família não-B7. BTLA mostra a inibição de células T por via da interação com receptores da família da necrose tumoral (TNF-R). BTLA é um ligante para o fator de necrose tumoral (receptor) superfamília, membro 14 (TNFRSFl4), também conhecido como mediador da entrada do vírus herpes (HVEM). Complexos BTLA-HVEM regulam negativamente as respostas imunitárias de células T. Outros nomes para BTLA são linfócitos B e T Associated Protein; CD272 Antigen; BTLAl; e CD272. Os IDs externos para BTLA são HGNC: 21087; Gene Entrez: 151888; ENSEMBL: ENSGOOO00186265; OMIM: 607925; e UmProtKB: Q7Z6A9.

[0042] Dominio Transmembranar e de imunoglobulina contendo 2 (TMIGD2) é um membro da família CD28 de proteínas. A proteína pode ser detectada em células de origens epiteliais e endoteliais, e é capaz de aumentar a angiogênese in vitro, quando super-expressa através de linhagens celulares endoteliais. TGMID2 é relatado para ser um receptor estimulador expresso em células T naive. Um ligante para o receptor é HHLA2 (B7-H7). O último é expresso em uma grande variedade células cancerosas. TMIGD2 é conhecido sob vários outros nomes, como transmembrana e Imunoglobulina de domínio contendo 2; Imunoglobulina Contendo e prolina-Rich Receptor- 1; CD28 Homólogo 2; CD28 homólogo; IGPR-l1; CD28H; e IGPR1. Os IDs externos para TMIGD2 são HGNC: 28324; Gene Entrez: 126259; Ensembl: ENSGOO0000167664; OMIM: 614715; e UniProtKB: Q96BF3.

[0043] ICOS (co-estimulador das células T induzida) ou CD278 é uma molécula co-estimuladora da família CD28 que é expresso em células T ativadas. Ele é pensado para ser importante para as células Th2, em particular. As formas de proteína homodímeros e desempenha um papel importante na sinalização célula-célula, as respostas imunitárias, e regulação da proliferação celular. Em comparação com as células T virgens do tipo selvagem, ICOS knock-out de células T ativadas com ligado a placa de anti-CD3 reduziram a proliferação e a secreção de IL-2.

[0044] os pacientes que foram tratados com ipilimumab (um anticorpo monoclonal que se liga a CTLA-4 aumentaram células ICOS + T em tecidos de tumor e no sangue. O aumento serviu como um biomarcador farmacodinâmico do tratamento anti-CTLA-4. ICOS é conhecido sob vários nomes diferentes, tais como a ativação das induzível Linfócitos Immunomediatory molécula; AILIM; Co-estimulador induzida; CD278 Antigen; CD278; e CVID1l. Os IDs externos para ICOS são HGNC: 5351; Gene Entrez: 29851; ENSEMBL: ENSGOOO00163600; OMIM: 604.558 e UniProtKB: Q9Y6W8.

[0045] CD28 (Conjunto de Diferenciação 28) é uma das proteínas expressas em células T, que proporcionam sinais estimuladores necessários para a co-ativação de células T e sobrevivência. estimulação de células T através do CD28 em adição ao receptor de células T (TCR) pode fornecer um sinal potente para a produção de várias interleucinas (IL-6, em particular). CD28 é o receptor para proteínas CD80 (B7.1) e CD86 (B7.2). Quando ativado por receptor de ligantes Toll- like, a expressão de CD80 é regulada positivamente em células apresentadoras de antígenos (APCs). A expressão de CD86 em células apresentadoras de antígeno é constitutiva (expressão é independente dos fatores ambientais). CD28 é um receptor de B7 que é constitutivamente expressa em células T naive. Associação do TCR de uma célula T ingénuos com MHC: complexo antígeno sem CD28: interação de B7 é pensado para resultar em uma célula T que é anérgicas. CD28 é conhecido sob vários nomes diferentes, tais como CD28 molécula; CD28 Antigen; Tp44; T- Cell-Specific glicoproteína de superfície; e CD28 Antigen (Tp44). IDs externos para CD28 são HGNC: 1653; Gene Entrez: 940; ENSEMBL: ENSGOOOO0178562; OMIM: 186760 e UniProtKB: P10747.

[0046] NKp30 é um membro da família CD28. Ele é um membro dos receptores de citotoxicidade naturais (NCRs) que incluem NKp30, NKp44 e NKp46. células assassinas naturais (NK) reconhecer e destruir tumores e células infectadas por vírus de uma forma independente do anticorpo. A regulação das células NK é mediada através da ativação e inibição de receptores na superfície da célula NK. Uma família de receptores de ativação é a família NCR. Os NCRs iniciar direccionamento para tumores por reconhecimento de sulfato de heparano em células cancerosas. NKp30 interage com estruturas de HS / heparina altamente carregadas. Um dos ligantes de NKp30 é B7-H6. B7-H6 é uma molécula co- estimulação. a B7-H6 não é normalmente expressa em células normais, mas pode ser altamente expressa em células tumorais. Ele também pode ser expresso em células apresentadoras de antígeno (APC) por indução. células NK pode ser ativado para a libertação de TNFa e IFNy como um resultado da interação de B7 com NKp30-H6. NKp30 é conhecido sob vários nomes diferentes, tais como citotoxicidade natural Gatilhando receptor 3 (NCR3);

[0047] Assassinas Naturais celular da proteína P30- relacionadas; Ativando assassinas naturais Receptor P30;

Linfócitos Antigen 117; NK-P30; LYl17; 1C7; A ativação NK- Al receptor; CD337 Antigen; CD337; ou MALS. Os IDs externos para NKp30 são HGNC: 19077; Gene Entrez: 259197; ENSEMBL: ENSGOO000204475; OMIM: 611550; e UniProtKB: 014.931.

[0048] A família B7 compreende um número de proteínas de superfície celular estruturalmente relacionadas, que se ligam a receptores em linfócitos que regulam as respostas imunitárias. A ativação dos linfócitos é iniciada por engate da superfície celular, os receptores de células T específicos para o antígeno ou de receptores de células-B. sinais adicionais entregue simultaneamente por ligantes B7 determinar ainda mais a resposta imune dessas células. Estes chamados 'co-estimulador' ou sinais 'co- inibitório' são entregues por membros da família B7 através da família CD28 de receptores em linfócitos. A ligação de membros da família B7-com respostas imunitárias receptores aumenta co-estimuladoras, e ligação com co-inibitório receptores atenua respostas imunes. Presentemente sete membros da família ou conhecido: B7.1 (CD80), B7.2 (CD86) ligante co-estimulador indutel (ICOS-G), programado ligante morte-l1 (PD-Ll), a morte programada de 2-ligante (PD -L2), B7-H3, e B7-H4. membros da família B7 são expressos em tecidos linfoides e não linfoides. Efeitos de membros no que regulam as respostas imunitárias são mostrados no desenvolvimento de imunodeficiência e doenças autoimunes em camundongos com mutações em genes B7-família. Manipulação dos sinais fornecidos por ligantes B7 tem mostrado potencial no tratamento de autoimunidade, doenças inflamatórias e câncer.

[0049] CD80 é uma proteína encontrada em células B ativadas e monitos, que fornece um sinal de co-estimulação necessário para a ativação de células T e sobrevivência. É o ligante para duas proteínas diferentes na superfície da célula T: CD28 e CTLA-4. Quando ligada a CD28 se associa com co-estimulação ao passo que a ligação a CTLA-4 está associada com a atenuação de uma resposta imune. CD80 funciona em conjunto com CD86 para ativar células T. CD80 é relatado para também se ligam PD-Ll. CD80 é conhecido sob um número de outros nomes, tais como CD80 molécula; CD80 Antigen; CD28 Antigen Ligante 1; B7-1 Antigen; Ativação de Linfócitos B Antigen B7; CTLA-4 Counter-Receptor B7.1; Ativação B7-1 Antigen; CD28LG1; CD28LG; LAB7; BBl; B7;

[0050] Co-estimuladora CD80 Fator; CD80 Antigen; e B7-1. Ids externos para CD80 são HGNC: 1700; Gene Entrez: 941; ENSEMBL: ENSGOOO000121594; OMIM: 112203; e UniProtKB: P33681.

[0051] CD86 é uma proteína expressa em células apresentadoras de antígeno. Pode proporcionar sinais co- estimuladores para a ativação das células T e sobrevivência. É o ligante para duas proteínas diferentes na superfície da célula T: é o ligante para duas proteínas diferentes na superfície da célula T: CD28 e CTLA-4. Quando ligada a CD28 se associa com co-estimulação ao passo que a ligação a CTLA- 4 está associada com a atenuação de uma resposta imune. CD86 funciona em conjunto com CD80 para ativar células T. Sabe- se, sob um número de nomes diferentes, tais como CD86 molécula; CD86 Antigen; CD28 Antigen ligante 2; B7-2 Antigen; CTLA-4 Counter-Receptor B7.2; CD28LG2; FUN-l1; BU63; B70;

Ativação de Linfócitos B Antígeno B7-2; B-Lymphocyte Antigen B7-2; Ativação B7-2 Antigen; CD86 Antigen; LAB72; e B7-2. IDs externos para CD86 são HGNC: 1705; Gene Entrez: 942; ENSEMBL: ENSGOOOOO0114013; OMIM: 601020; e UniProtKB: P42081.

[0052] PD-L1 é uma proteína transmembranar de tipo 1 que desempenha um papel na supressão de uma resposta imune durante eventos específicos, tais como a gravidez, aloenxertos de tecidos, doença autoimune e de outros estados de doença, tais como a hepatite. PD-L1 é expressa em vários tipos de cânceres, incluindo NSCLC, melanoma, carcinoma de células renais, câncer gástrico, hepatocelular, bem como diversas leucemias e mieloma múltiplo. PD-L1 está presente na membrana de plasma e citoplasma de células cancerosas, mas não todos os cânceres ou todas as células dentro de um tumor expressam PD-Ll. Várias células do microambiente do tumor contribuem para a supressão imune por regular positivamente a expressão de DP-L1. Este efeito é chamado de "resistência imunitária adaptativa", porque o tumor se protege por indução de PD-Ll1, em resposta ao IFN-y produzido pelas células T ativadas. PD-L1 também pode ser regulado por oncogenes, este mecanismo é conhecido como resistência imunológica inerente. Dentro do microambiente do tumor, PD- Ll também é expresso em células mielóides e células T ativadas. A expressão de DP-Ll1 é induzida por múltiplas moléculas pró-inflamatórias, incluindo os tipos I e II de IFN-y, TNF-a, LPS, GM-CSF e VEGF, assim como as citocinas IL-10 e IL-4. A ligação de PD-Ll para DP-l1 ou B7.1 (CD80) transmite um sinal inibidor que reduz a proliferação dos PD- 1 As células T que expressam. DP-l1 é pensado para ser capaz de controlar a acumulação de células T específicas de antígeno estranho através da apoptose.

[0053] PD-L1 é expressa por uma variedade células cancerosas e a sua expressão é pensado para ser pelo menos em parte responsável por um amortecimento de uma resposta imunitária contra a célula cancerosa. PD-L1 é um membro da família B7-de proteína e é conhecida sob uma variedade outros nomes, tais como CD274 molécula; CD274 Antigen; B7 Homogo 1; PDCD1 Ligante 1; PDCDILG1; PDCDIL1; B7H1; PDL1;

[0054] A morte celular programada um ligante 1; A morte programada de ligante 1; B7-Hl1; e B7-H. Os IDs externos para CD274 são HGNC; 17635; Gene Entrez: 29126; Ensembl: ENSGOO000120217; OMIM: 605402; UniProtKB: Q9NZQ7.

[0055] PD-L2 é um segundo ligante para a DP-l. Acoplamento de DP-l pelo receptor de células T inibe PD-L2 (TCR), mediada por proliferação e produção de citocinas pelas células T. Em concentrações baixas de antígeno, PD-L2 / DP- 1 ligação inibe sinais B7-CD28. Em concentrações elevadas de antígenos, PD-L2 / De ligação a DP-l reduz a produção de citoquinas. PD-expressão de Ll é super-regulada em células apresentadoras de antígeno por tratamento com interferon gama. Ela é expressa em alguns tecidos normais, e em uma variedade tumores. PD-Ll e PD-L2 são pensados para ter funções sobrepostas e regular as respostas de células T. A proteína DP-L2 é conhecido sob um número de outros nomes tais como programado celular Morte 1 2 Ligante; B7 dendríticas molécula celular; A morte programada de ligante 2; Butirofilina B7-DC; PDCDl ligante 2; PD-l Ligante 2; PDCDIL2; B7-DC; CD273; B7DC; PDL2; PD-l-Ligante 2; CD273

Antigen; BAST74F11.2; e BIDC. Os IDs externos para PD-L2 são HGNC: 18731; Gene Entrez: 80.380; ENSEMBL: ENSGOO000197646; OMIM: 605723; e UniProtKB: Q9BQ51.

[0056] Indutível T-celulares que co-estimulador Ligante (ICOSL ou CD275) é constitutivamente expressa pelas APC, bem como um certo número de tecidos não-hematológicos. Expressão pode ser regulada para baixo com a inflamação em curso. ICOSL se conhece para interagir com ICOS, CD28 e CTLA- 4 em seres humanos. ICOSL / CD28 interação parece co- estimular respostas primárias de células T humanas a antígenos alogênicos e respostas de recall de memória. ICOSL / CTLA-4 é pensado para resultar sinais co-inibitório. ICOSL também é conhecido como ICOSLG; Proteína relacionada com B7 1; B7 homólogo 2; B7-Like G150 Protein; B7 Homogo 2; B7RP- 1; B7-H2; B7TRP1; B7H2;

[0057] A proteína transmembranar B7-H2 ICOS ligante; CD275 Antigen; KIAAO653; ICOS-G; LICOS; e GL50. Os IDs externos para ICOSL são HGNC: 17087; Gene Entrez: 23308; ENSEMBL: ENSGOO000160223; OMIM: 605717; e UniProtKB:

075.144,

[0058] CD276 (ou B7-H3) expressão é aumentada em várias malignidades e distingue entre normal e células endoteliais circulantes derivado de tumor (Kraan et al, British Journal of Câncer (2014) 111, 149-156). A estimulação do receptor dirige a diferenciação das células do estroma da medula humana para os osteoblastos (Xu et al 2011 Immunobiology 216 (2011) 1311-1317). A proteína contém domínios semelhantes a Ig 4 em seres humanos enquanto que a proteína de rato parece ter duas de tais domínios. A proteína é pensado para ser o primeiro ligante identificado para o receptor de disparo expressos em células mielóides (TREM) - like transcrição 2 (TLT-2 ou TREMML2). Os últimos ligantes a proteína B7-H3 (4Ig-B7-H3) e costimulates ativação de células T CD8 (Hofmeyer et al 2009 PNAS 105; 10.277-10.278). CD276 é expressa de forma ampla. Ele atua como um co- estimulador de células T. CD276 é também conhecido sob um número de outros nomes, tais como CD276 molécula; Co- estimulação Molecule; CD276 Antigen; B7 Homogo 3; 4Ig-B7-H3; B7-H3; B7H3; e B7RP-2. Os IDs externos para CD276 são HGNC: 19137; Gene Entrez: 80.381; ENSEMBL: ENSGOOOO00103855; OMIM: 605715; e UmMProtKB: Q5ZPR3.

[0059] B7-H4 (VTCNI) RNAm parece ser amplamente expresso, mas apenas algumas células expressam activamente a proteína na membrana. A expressão da proteína da membrana e a ligação a células T ativadas resulta na inibição da função efetora de células-T através de paragem do ciclo celular, diminuição da proliferação e redução da produção de IL-2. B7-H4 é sobre-regulada na superfície das células cancerosas e macrófagos associados a tumores imunossupressores (TAMs) em uma variedade cânceres humanos. B7-H4 é um parceiro de ligação de BTLA. A sinalização através da via de ligações B7-H4 para a inibição mediada por TCR de células T CD4 + e a proliferação de células T CD8 +, a progressão do ciclo celular, e produção de IL-2. B7-H4 também é conhecida sob um número de outros nomes, tais como V- Conjunto domínio que contêm células T Ativação Inibidor 1; Co-estimulador imune proteína B7-H4; T-Cell co-estimuladora da molécula B7x; B7 Superfamília Membro 1; B7 Homogo 4;

B7h.5; B7H4; T celular co-estimuladora da molécula B7x; B7 membro da família, H4; B7Sl proteína; PROl291; VCTN1; B7S1; B7X; e H4 2. Os IDs externos para B7-H4 são HGNC: 28873; Gene Entrez: 79.679; ENSEMBL: ENSGOOO000134258; OMIM: 608.162 e UniProtKB: Q7Z7D3.

[0060] B7-H6 pertence à família B7 (ver MIM 605402) e é expresso selectivamente em células tumorais. A ligação de B7-H6 com NKp30 (NCR3; OMIM 611550) resulta em células assassinas naturais (NK) a ativação de células e citotoxicidade (Brandt et al, 2009 J Exp Med 2009 06 de julho; 206 (7):1495-503). células assassinas naturais (NK) são linfócitos do sistema imune inato que participam na eliminação de tumores. B7-H6 é uma molécula de superfície de células de tumor que se liga NKp30, um receptor humano que desencadeia antitumorais NK citotoxicidade celular e à secreção de citocina. Outros nomes para B7-H6 são NCR3LG1; A citotoxicidade celular assassina natural Receptor Ligante 3 1; B7 Homogo 6; B7H6; Putativo Ig-Like Domínio contendo proteína DKFZp686024166 / DKFZp686121167; e DKFZp686024166. Os IDs externos para B7-H6 são HGNC: 42400; Gene Entrez 374383; ENSEMBL: ENSGOOOO0188211; OMIM: 613714; e UniProtKB: Q68D85.

[0061] -H7 B7 (HHLA2) proteína foi detectada nas células trofoblásticas da placenta e do epitélio do intestino, rim, da vesícula biliar, e da mama, mas não na maior parte dos outros órgãos. proteína HHLA2 é amplamente expresso em cânceres humanos da mama, pulmão, tiroide, melanoma, pâncreas, ovário, fígado, bexiga, cólon, próstata, rim, e do esófago. expressão alta HHLA2 está associada a metástase de nulo linfocítico regional e fase (Janakiram et al Clin Cancer Res; 21 (10):. 2359-66; 15 maio de 2015). TMIGD2 é identificado como um dos receptores para HHLA2. B7- H7 é conhecido sob vários nomes diferentes, tais como HERV- H LTR-Associando 2; Proteína 2 endógena Retrovirus-H Terminal Longa humano Repita-Associando; B7H7 e B7y. Os IDs externos para B7-H7 são HGNC: 4905; Gene Entrez: 11148; Ensembl: ENSGOOOOO0114455; OMIM: 604.371 e UniProtKB: Q9UM44.

[0062] Fator de Necrose Tumoral Receptor superfamília dos membros 14 (TNFRSFlI4) é um receptor da superfície celular humana do receptor de TNF-superfamília. Esta proteína foi originalmente conhecido como entrada herpesvírus mediador A (HveA). É também conhecido como CD270 no cluster de classificação de diferenciação. TNFRSFl14 foi identificada como um mediador celular de entrada do vus herpes simplex (HSV). A ligação do HSV virai envelope da glicoproteína D (gD) a esta proteína do receptor tem sido mostrado para ser parte do mecanismo de entrada viral. A região citoplasmática de este receptor foi encontrada para se ligar a vários membros da família TRAF, o qual pode mediar a transdução de sinal

[0063] as vias que ativam a resposta imune. TNFRSF14 é conhecido sob vários nomes diferentes, tais como o Factor de Necrose Tumoral Receptor superfamília, Membro 14 (Herpesvírus mediador da entrada); Vírus Herpes entrada Mediador A; HVEA; HVEM; TR2; Factor de Necrose Tumoral Receptor-Like Gene2; Factor de Necrose Tumoral Tal como receptor-2; Herpesvírus entrada Mediador A; Mediador herpesvírus entrada; CD40-Like Protein; CD270 Antigen;

LightR; CD270; e ATAR. Os IDs externos para TNFRSFl14 são: HGNC: 11912; Gene Entrez: 8764; ENSEMBL: ENSGOOOO00157873; OMIM: 602746; e UniProtKB: 092956

[0064] Referência a identificadores de sequências é feito para identificar qual a proteína se destina. Um anticorpo ou uma sua variante, tal como uma sua variante, da presente invenção tipicamente reconhece também, pelo menos, algumas suas variantes, tais como variantes alélicas variantes de processamento e variantes mutantes dos mesmos, desde que o epítopo reconhecido pelo respectivo domínio variável não foi afetado. Alguns dos nomes alternativos podem ou não podem ter também sido usado para se referir a outras proteínas. Os nomes são dados apenas para referência. Um anticorpo ou uma sua variante, tal como uma sua variante, de se liga a invenção a proteína, tal como expresso em células. Pode também ligar-se a variantes da proteína, desde que o epítopo ao qual se liga o anticorpo está disponível. Assim, as variantes de splicing ou proteínas mutantes (se houver) vai também ser ligada por um anticorpo ou uma sua variante, desde que o epítopo está disponível. O facto do anticorpo ou uma sua variante se liga aos meios de proteínas indicou que se podem ligar à proteína como uma propriedade e não implica necessariamente que o anticorpo ou uma sua variante, é, na verdade, ligada ao alvo. Também não significa necessariamente, que o domínio variável não se pode ligar a outras proteínas.

[0065] A invenção fornece um método de inibir uma atividade biológica de uma primeira ou segunda célula mediada pela ligação de uma primeira proteína de membrana sobre uma primeira célula para uma segunda proteína de membrana sobre uma segunda célula, compreendendo o método

- fornecimento de um sistema que compreende a referida primeira e segunda célula com um anticorpo ou uma variante do mesmo, compreendendo um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da referida primeira proteína de membrana e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da referida segunda proteína membranar; e

- incubação do referido sistema, sob condições que são permissivas para a expressão da referida atividade biológica, na ausência do referido anticorpo ou uma sua variante;

- em que a ligação do domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular dos ditos blocos de primeira proteína membranar a ligação da referida primeira proteína membranar para a referida segunda proteína de membrana e / ou a ligação do domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de os referidos blocos de proteína de membrana segundo a ligação da referida primeira proteína de membrana para a referida segunda proteína de membrana.

Em algumas concretizações, o referido método é um método in vitro.

O anticorpo utilizado no método liga dois pares e bloqueia a ligação a ligação dos dois entre si.

No método das duas células que expressam os pares de ligação é apresentado e / ou mantidas juntas em estreita proximidade, mas no de ligação dos pares de ligação ao mesmo tempo, é inibida.

Isto é diferente de uma combinação de dois anticorpos monoclonais monoespecíficos que compreendem os domínios variáveis.

Estes também bloquear a ligação dos dois pares de ligação, mas as células não são apresentadas e / ou mantido em estreita proximidade. A atividade especial de um anticorpo da invenção, em particular de um anticorpo biespecífico da presente invenção é particularmente perceptível em ambientes complexos que compreendem três ou mais diferentes tipos de células.

[0066] A invenção também fornece um método de melhorar uma atividade biológica de uma primeira ou segunda célula mediada pela ligação de uma primeira proteína de membrana sobre uma primeira célula para uma segunda proteína de membrana sobre uma segunda célula, compreendendo o método - fornecimento de um sistema que compreende a referida primeira e segunda célula com um anticorpo ou uma sua variante que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da referida primeira proteína de membrana e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da referida segunda proteína membranar ; e - incubação do referido sistema, sob condições que são permissivas para as células que expressam a referida atividade biológica, na ausência do referido anticorpo ou uma sua variante; - em que a ligação do domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da referida primeira proteína de membrana não bloqueia a ligação da referida primeira proteína membranar para a referida segunda proteína de membrana e a ligação do domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de a referida proteína de membrana segundo não bloqueia a ligação da referida primeira proteína membranar para a referida segunda proteína de membrana.

[0067] Em algumas concretizações, o referido método é um método in vitro ou ex vivo.

[0068] A invenção proporciona adicionalmente um anticorpo ou uma sua variante que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de uma primeira proteína de membrana e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de uma segunda proteína de membrana, em que a referida primeira e segunda membrana proteína são pares (ou seja, os membros de um par de ligação ou um par de ligantes e receptor) de ligação e em que a ligação do domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de blocos de primeira proteína membranar a ligação da referida primeira proteína membranar referida para a referida segunda membrana proteínas e / ou a ligação do domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular dos ditos blocos de proteína de membrana segundo a ligação da referida primeira proteína membranar para a referida segunda proteína de membrana. Tal anticorpo é útil num método de inibição de uma atividade biológica mediada pela ligação da referida primeira proteína membranar e a referida segunda proteína de membrana, tal como aqui descrito.

[0069] A invenção proporciona adicionalmente um anticorpo ou uma sua variante que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de uma primeira proteína de membrana e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de uma segunda proteína de membrana, em que a referida primeira e segunda membrana proteína são pares (ou seja, os membros de um par de ligação ou um par de ligantes e receptor) de ligação e em que a ligação do domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da referida primeira proteína de membrana não bloqueia a ligação da referida primeira proteína membranar para o referido segunda proteína de membrana e a ligação do domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da referida segunda proteína membranar não bloqueia a ligação da referida primeira proteína membranar para a referida segunda proteína de membrana. Tal anticorpo é útil num método para intensificar uma atividade biológica mediada pela ligação da referida primeira proteína membranar e a referida segunda proteína de membrana.

[0070] A primeira proteína de membrana e de segunda proteína membranar são proteínas da membrana celular, que têm pelo menos uma parte extracelular. A ligação das duas pode resultar em uma atividade biológica a ser expresso na primeira célula, a segunda célula ou ambas. Num método da presente invenção, a primeira e a segunda células são de preferência células diferentes. As diferentes células podem ser do mesmo tipo de célula, mas tipicamente eles são diferentes. A atividade biológica é uma atividade expressa por uma célula que é mensurável na primeira e / ou segunda célula ou forma que as células rodeada (s), em resposta à ligação da primeira e segunda proteína de membrana. Se uma atividade biológica é expressa por células tanto a atividade pode ser a mesma, mas é tipicamente diferente. Tal ligação de uma primeira e segunda proteína é frequentemente referido como receptor-ligante de ligação. Na presente invenção, tanto o receptor e o ligante são associados com e pelo menos parcialmente acessível no lado extracelular da membrana celular das respectivas células. O termo "receptor" é normalmente usado para a proteína que induz uma atividade biológica da célula quando ligado ao ligante. O termo "ligante" é geralmente usados para a proteína que se liga ao receptor. O ligante na presente invenção é também uma proteína de membrana e a ligação do ligante ao receptor podesencadear uma atividade biológica do ligante celular compreendendo. Um exemplo não limitante de tais chamados efeitos bidirecionais é a interação do HVEM / BTLA par de ligação. A ligação de HVEM para BTLA induz uma atividade biológica na célula que expressa o HVEM e uma atividade biológica na célula que expressa BTLA. Assim, na presente invenção, o uso do termo 'ligante' não significa necessariamente que a ligação do receptor ao ligante não pode provocar uma atividade biológica na célula que compreende o ligante na membrana celular. Uma proteína é dito ser uma proteína de membrana em uma célula, se ele tem uma região transmembranar que está presente na membrana celular da célula que está ligado. A proteína pode ter outras regiões transmembranares. Em tal caso, todas as regiões de transmembrana que estão presentes em uma membrana celular estão presentes na membrana celular de uma mesma célula.

[0071] Um receptor e o ligante são pares de ligação específicos que interagem tipicamente (ligam-se) para o outro através de ligações não covalentes. A ligação é específica, em que, sob condições fisiológicas, o receptor e o ligante será normalmente apenas se ligam uns aos outros e não para outras proteínas. Alguns receptores e ligantes podem ligar especificamente a um número limitado de outros pares de ligação. Um exemplo não limitativo é o PD-l do receptor, que pode interagir com os pares de ligação PD-L1 e PD-L2.

[0072] O tipo de atividade biológica que é provocada depende dos pares de ligação. Ligação pode induzir o crescimento; alterar um estado de ativação de uma célula; desencadear ou inibem a excreção de uma ou mais citocinas; afetam a função citolólica de uma célula; etc. A atividade biológica é tipicamente medida por medição da resposta à ligação celular pelo receptor (que expressam o receptor) PD-l1 / PD-Ll1l de ligação, por exemplo, é tipicamente medida por detecção de uma atividade biológica da célula que expressa DP-l1. interação de PD-l pelos seus ligantes PD-L1 ou L2-PD induz atividades biológicas tais como inibição de proliferação de células T, a inibição da produção de citoquinas, e a inibição da função citolítica.

[0073] A atividade biológica é inibida quando a atividade biológica medida na presença do anticorpo Ou variante do mesmo é menor do que a atividade biológica medida em condições de outro modo idênticas, na ausência do anticorpo ou variante. A atividade biológica pode ser inibida por, pelo menos, 10, 20, 30, 40, 50, ou, de preferência pelo menos, 60%. A atividade biológica é preferencialmente inibida por, pelo menos, 70%, de preferência pelo menos 80%, de preferência pelo menos 90%. A atividade biológica é inibida em pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, ou 90%, quando a atividade biológica medida na presença do anticorpo ou variante do mesmo é correspondentemente 10, 20,

30, 40 , 50, 60, 70, 80, ou 90% menor do que a atividade biológica medida em condições de outro modo idênticas, na ausência do anticorpo ou variante. A atividade biológica é normalmente inibida quando um dos domínios variáveis de um anticorpo da presente invenção pode bloquear a ligação do seu alvo para um parceiro de ligação do alvo. A atividade biológica é tipicamente mais inibida quando os novos anticorpos compreende um domínio variável que se liga ao parceiro de ligação mencionada do alvo e bloqueia a ligação do parceiro de ligação para o alvo.

[0074] A atividade biológica é induzida e / ou melhorada quando a atividade biológica medida na presença do anticorpo ou variante do mesmo é mais elevada do que a atividade biológica medida em condições de outro modo idênticas, na ausência do anticorpo ou variante. A atividade biológica pode ser aumentada por, pelo menos, 10, 20, 30, 40, 50, ou, de preferência, pelo menos, 60%. A atividade biológica é de preferência, reforçada por pelo menos 70%, de preferência pelo menos 80%, de preferência pelo menos 90%. A atividade biológica é aumentada por, pelo menos, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, ou 90%, quando a atividade biológica medida na presença do anticorpo ou uma sua variante seja correspondentemente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, ou 90% superior à atividade biológica medida em condições de outro modo idênticas, na ausência do anticorpo ou variante A atividade biológica é normalmente melhorada quando ambos os domínios variáveis de um anticorpo da invenção não bloquear a ligação dos seus alvos para o outro.

[0075] Um sistema adequado é uma cultura de células em que a primeira célula e a segunda célula são fornecidas. Outro sistema adequado é um animal que compreende a primeira célula e a segunda célula. Outros sistemas adequados são sistemas ex vivo em que as células são mantidas em forma ativa, mas em que o crescimento da célula não é necessariamente facilitada. Uma primeira e segunda célula pode ser incubada em conjunto sob, por exemplo, as condições de ensaio que não necessariamente facilitar o crescimento, mas permitir que a atividade biológica a ser medido.

[0076] Incubação do referido sistema, sob condições que são permissivas para as células que expressam a referida atividade biológica mediada pela ligação da referida primeira proteína membranar e os referidos meios de proteína de membrana segundo que o sistema é mantido sob condições em que a primeira e segunda células podem exibir uma atividade biológica como resultado dos pares de ligação. In vivo de incubação não tem que envolver mais do que a passagem de tempo suficiente para permitir a atividade biológica para se tornar aparente.

[0077] Um domínio variável que "bloqueia" a ligação da referida primeira proteína membranar ao referido segundo interfere com proteína de membrana de ligação da primeira proteína da membrana para a referida segunda proteína de membrana. domínio variável Tal pode ligar-se a primeira membrana ou a segunda proteína de membrana. Uma variável de bloqueio domínio que se liga, por exemplo, uma primeira proteína de membrana pode se ligam a um epítopo na referida primeira proteína de membrana e compita com a referida segunda proteína de membrana para se ligar ao epítopo. Um tal bloqueio domínio variável e a segunda proteína de membrana também podem ligar-se a epítopos diferentes nas ditas primeira proteína de membrana. Em tais casos, a atividade bloqueio pode por exemplo ser diminuída devido à ligação da segunda proteína de membrana, o deslocamento da segunda proteína da membrana quando ela já está ligada à referida primeira proteína de membrana ou podem impedir a ligação à primeira proteína de membrana através de impedimento estérico. Todos estes e outros mecanismos pode, pelo menos parcialmente, prevenir que a referida segunda proteína de membrana pode ligar-se a referida primeira proteína membranar. Os domínios variáveis que se ligam a primeira proteína de membrana ou a segunda proteína de membrana podem bloquear a ligação dos pares de ligação.

[0078] Um domínio variável que bloqueia a ligação de um par de proteínas de membrana de ligação específico tal como descrito aqui tipicamente reduz a ligação do par quando comparado com a ligação na ausência do domínio variável. Isto é normalmente medido com um anticorpo que compreende o domínio variável. Isto é de preferência medido num ensaio in vitro. Tipicamente, isto é realizado por incubação do domínio variável com a proteína de membrana que pode ligar-se e, subsequentemente, a incubação da mistura com o outro membro do par. A ligação do par é em seguida comparada com a ligação do par na ausência do domínio variável. Um domínio variável pode evitar completamente a ligação da primeira proteína da membrana para a segunda proteína de membrana. Também pode impedir parcialmente a ligação do par. Um domínio variável que bloqueia a ligação de um determinado par de proteínas de membrana de um modo preferido reduz a ligação do par por pelo menos 50% de ligação, de preferência pelo menos 60%, de preferência pelo menos 70%, de preferência pelo menos 80%, e mais preferencialmente pelo menos 90% quando comparada com a ligação na ausência do domínio variável. O bloqueio da ligação de um domínio variável é aqui definido como o bloqueio obtido usando um anticorpo monoclonal bivalente que compreende os ditos dois dos mesmos dos referidos domínios variáveis. O domínio variável de curso também bloqueia a ligação quando presente num anticorpo compreendendo o referido domínio variável e um domínio variável que se liga a um segundo alvo, em que o segundo alvo pode ser o mesmo ou diferente do alvo ligado pelo primeiro domínio variável Domínios variáveis específicas que se podem ligar a um domínio extracelular de PDl e que bloqueiam pelo menos parcialmente a ligação de PD1 a PD-L1 são domínios variáveis que compreendem a sequência de aminoácidos da VH de MF6076; MF6236; MF6256; MF6932; MF6935; MF6936; MF6972; MF6974; MF6982; MF6929; MF7699; MF7698; MF7687; MF7686; MF7685; ou MF7684 (Figura 3 e / ou Figura 13).

[0079] Os domínios variáveis específicas que se podem ligar a um domínio extracelular de PD-Ll e que bloqueiam a ligação de PDl a PD-L1 são domínios variáveis que compreendem a sequência de aminoácidos da VH de MF5359; MF5377; MF5382; MF5424; MF5426; MF5439; MF5442; MF5553; MF5557; MF5561; MF5576; MF5594; MF5708; MF5442; MF7691; MF7690; MF7689; MF7688; MF7700; MF7701; MF7703; MF7694; MF7693; MF7692; MF7697; MF7696; ou MF7695 (Figura 3 e / ou Figura 13).

[0080] Um domínio variável que não bloqueia a ligação de um par de ligação específica de proteínas de membrana, tal como descrito aqui tipicamente não reduz a ligação do par quando comparado com a ligação na ausência do domínio variável. Isto é normalmente medido com um anticorpo que compreende o domínio variável. Isto é de preferência medido num ensaio in vitro. Tipicamente, isto é realizado por incubação do domínio variável com a proteína de membrana que pode ligar-se e, subsequentemente, a incubação da mistura com o outro membro do par. A ligação do par é em seguida comparada com a ligação do par na ausência do domínio variável.

[0081] Domínios variáveis específicas que se podem ligar a um domínio extracelular de PD-L1 e que não bloqueiam a ligação de PDl a PD-Ll são domínios variáveis que compreendem a sequência de aminoácidos da VH de MF5361 (Figura 3).

[0082] Os aspectos funcionais dos domínios variáveis na espécie não necessariamente em quantidade, tais como ligação a um antígeno, bloqueando a capacidade interação ligante de receptor, a atividade biológica de um domínio variável, etc, podem ser pode ser determinado de várias maneiras. formatos adequados são um fragmento Fab ou um anticorpo. Um formato adequado é um anticorpo monoespecífico de anticorpo bivalente que compreende dois dos domínios variáveis. Um outro formato adequado é por exemplo um anticorpo biespecífico que compreende o domínio variável a ser testado e outro domínio variável. O outro domínio variável é de preferência um domínio variável com uma especificidade neutra com respeito ao ensaio a ser realizado. Um domínio variável neutro adequado é um domínio variável que pode ligar-se o toxóide do tétano.

[0083] Um anticorpo ou variante do mesmo da presente invenção compreende preferência um domínio variável que bloqueia a ligação da sua proteína da membrana-alvo de um parceiro de ligação do mesmo. Nesta concretização preferida, um outro domínio variável do anticorpo ou variante do mesmo liga-se um parceiro de ligação da proteína da membrana alvo. O domínio variável que se liga este parceiro de ligação pode bloquear a ligação do parceiro de ligação para a proteína da membrana alvo ou que ele não bloqueia a ligação do parceiro de ligação para a proteína da membrana alvo. Em um domínio variável de concretização preferida que se liga este parceiro de ligação pode bloquear a ligação do parceiro de ligação para a proteína da membrana alvo.

[0084] Em outra concretização um anticorpo, ou uma sua variante da invenção compreende um domínio variável que não bloqueia a ligação do seu alvo de proteína de membrana um parceiro de ligação do mesmo. Nesta concretização preferida, um outro domínio variável do anticorpo ou variante do mesmo liga-se um parceiro de ligação da proteína da membrana alvo. O domínio variável que se liga este parceiro de ligação pode bloquear a ligação do parceiro de ligação para a proteína da membrana alvo ou que ele não bloqueia a ligação do parceiro de ligação para a proteína da membrana alvo. Em um domínio variável de concretização preferida que se liga este parceiro de ligação não bloqueia a ligação do parceiro de ligação para a proteína da membrana alvo.

[0085] A invenção proporciona ainda um método de induzir ou estimular uma resposta imune de uma célula imune, compreendendo o fornecimento - uma (primeira célula) das células imunes, que tem uma primeira proteína de membrana, de preferência um membro da família CD28 na membrana da célula; - uma segunda célula que tem uma segunda proteína de membrana, de preferência um membro da família B7 ou TNFRSFl14 na membrana celular; —- fornecimento de um anticorpo ou uma sua variante que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da referida primeira proteína de membrana e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da referida segunda proteína de membrana, o método compreendendo ainda incubar a referida primeira célula e a referida segunda célula em conjunto com o referido anticorpo, induzindo, assim, ou estimular uma resposta imune da referida primeira célula.

[0086] A invenção proporciona ainda um método de induzir ou estimular uma resposta imune de uma célula imune, compreendendo o fornecimento - uma (primeira célula) das células imunes, que tem uma primeira proteína de membrana, de preferência, o membro da família CD28 na membrana da célula; - uma segunda célula que tem uma segunda proteína de membrana, de preferência um membro da família B7 ou TNFRSFl14 na membrana celular; - fornecimento de um anticorpo ou de uma sua variante (primeiro anticorpo) que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da referida primeira proteína de membrana e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da referida segunda proteína membranar; - fornecimento de um anticorpo adicional ou um variante (segundo anticorpo) do mesmo, compreendendo um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da referida primeira proteína de membrana e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da referida segunda proteína membranar;

[0087] em que o primeiro e o segundo anticorpo se ligue - epítopos diferentes em que a referida primeira proteína membranar; - epítopos diferentes em que a referida segunda proteína membranar; ou - epítopos diferentes sobre a referida proteína de membrana de primeiro e epítopos diferentes na referida primeira proteína de membrana.

[0088] O método compreendendo ainda incubar a referida primeira célula e a referida segunda célula em conjunto com o referido primeiro e segundo anticorpo, induzindo, assim, ou estimular uma resposta imune da referida primeira célula.

[0089] A invenção proporciona ainda um método de induzir ou estimular uma resposta imune de uma célula imune, compreendendo o fornecimento

[0090] - uma (primeira célula) de células imunes que tem DP-1 na membrana celular;

- uma segunda celula que tem PD-Ll1 para a membrana da célula; - fornecimento de um anticorpo ou uma sua variante que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-1 e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-Ll, o método compreendendo ainda incubar a referida primeira célula e o referido segunda célula juntamente com o referido anticorpo, induzindo, assim, ou estimular uma resposta imune da referida primeira célula. Em algumas concretizações, o referido método é um método in vitro ou ex vivo.

[0091] A invenção proporciona ainda um método de induzir ou estimular uma resposta imune de uma célula imune, compreendendo o fornecimento - uma (primeira célula) de células imunes que tem DP-1 na membrana celular; - uma segunda célula que tem PD-Ll para a membrana da célula; - fornecimento de um anticorpo ou de uma sua variante (primeiro anticorpo) que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-1 e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP- L1l; - fornecimento de um anticorpo adicional ou um variante (segundo anticorpo) do mesmo, compreendendo um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-1 e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-L1;

[0092] em que o primeiro e o segundo anticorpo se ligue - epítopos diferentes em DP-1; - epítopos diferentes na PD-Ll1; ou - epítopos diferentes em DP-1 e epítopos diferentes em DP-L1; o método compreendendo ainda incubar a referida primeira célula e a referida segunda célula em conjunto com o referido primeiro e segundo anticorpo, induzindo, assim, ou estimular uma resposta imune da referida primeira célula. Em algumas concretizações, o referido método é um método in vitro.

[0093] A referida resposta imunitária pode ser o receptor de células T (TCR) mediada ou não. Em uma concretização preferida a referida resposta imunitária é mediada pelo receptor de TCR. A referida resposta imunitária é de preferência medida por medição da libertação de citocina pró-inflamatória pela célula imune. Em uma concretização preferida, a citocina é IL-2.

[0094] Alterações no nível de IL-2 quando comparado com a ausência de anticorpos indicar se a resposta imunitária é afetada pelos anticorpos. Um aumento indica que a resposta imune é estimulada. Uma mudança de total não detectável de forma detectável a IL-2 é indicativa de uma resposta imunitária induzida.

[0095] A primeira célula é de preferência uma célula imunitária. Uma célula imunitária é de preferência uma célula T ou de células NK. Em uma concretização da referida célula imune é uma célula T. A segunda célula é de preferência uma célula apresentadora de antígeno, uma célula neoplásica, uma célula infectada de vírus, ou uma célula infectada parasita intracelular. A primeira célula é uma célula que expressa a referida primeira proteína de membrana na sua membrana celular. A segunda célula é uma célula que expressa a referida segunda proteína de membrana na sua membrana celular. A membrana da célula é também conhecida como a membrana do plasma ou membrana citoplasmática e é uma membrana biológica que separa o interior de uma célula a partir do ambiente exterior.

[0096] A invenção proporciona ainda uma composição ou kit de partes que compreende dois ou mais anticorpos ou partes funcionais, derivados e / ou análogos deste compreendendo um anticorpo ou uma sua variante (primeiro anticorpo) que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de um proteína de membrana em primeiro lugar, de preferência um membro da família CD28 e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de uma segunda proteína de membrana, de preferência um membro da família B7 ou TNFRSFl4; e um anticorpo adicional ou uma sua variante (segundo anticorpo) que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da referida primeira proteína de membrana e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da referida segunda proteína de membrana, em que o primeiro e o segundo anticorpo se ligue - epítopos diferentes em que a referida primeira proteína membranar; - epítopos diferentes em que a referida segunda proteína membranar; ou - epítopos diferentes sobre a referida proteína de membrana de primeiro e diferentes epítopos em que a referida proteína de membrana segundo.

[0097] Concretizações que compreendem um método, um uso, uma composição ou kit de partes que compreende dois ou mais anticorpos ou partes funcionais, derivados e / ou seus análogos que possuem domínios variáveis que se ligam as mesmas proteínas primeira e segunda membrana são também referidas como modalidades "Oligoclonics". Exemplos de tais concretizações são concretizações Oligoclonics com o referido primeiro e segundo anticorpo. 'Oligoclonics' é uma marca registrada. Os métodos gerais para a produção desses produtos Oligoclonicsd são divulgados no documento WO 2013/157953 e documento WO2004 / 009618 e são incorporados aqui por referência.

[0098] Em concretizações de Oligoclonics, o primeiro e segundo domínios varieis de anticorpo que se ligam compreendem o mesmo membro da família CD28, por exemplo, Pd- terra do mesmo membro da família B7 ou TNFRSFl14, por exemplo PD-L1.

[0099] As membranas que compreendem um membro de uma família, tal como aqui descrito, tipicamente, compreender um número e muitas vezes um grande número de proteínas individuais do elemento sobre a membrana. Os anticorpos que possuem os domínios variáveis que se ligam a mesma de um membro da família pode ligar-se a mesma proteína individual, mas este não é necessariamente assim. Um anticorpo da invenção que se liga proteína de membrana do TNA se liga a um epítopo em que a referida proteína de membrana. Um epítopo é a parte de um antígeno, neste caso a proteína de membrana que é reconhecido pelo anticorpo. Primeiro e segundos anticorpos que se ligam a diferentes epítopos em uma proteína de membrana pode ligar-se a mesma proteína individual sobre a membrana. Para este fim, os diferentes epítopos são preferivelmente epítopos não sobrepostos. Em outras palavras, os diferentes epítopos estão suficientemente separados na proteína de membrana que dois anticorpos podem ligar-se simultaneamente à mesma proteína individual. Verificou-se, surpreendentemente, que Oligoclonics (uma combinação de um primeiro e segundo anticorpos ou mais) pode ser mais eficaz do que a mesma quantidade cada um por si só os anticorpos.

[00100] Um domínio variável do primeiro anticorpo que pode se ligar o membro da família CD28 de preferência bloqueia a ligação do membro a um parceiro de ligação do mesmo, na família B7 ou TNFRSFlI4. O domínio variável do primeiro anticorpo que pode se ligar o membro da família B7 ou TNFRSFl14 preferivelmente bloqueia a ligação do membro a um parceiro de ligação do mesmo, na família CD28. O domínio variável do segundo anticorpo que pode se ligar o membro da família CD28 de preferência bloqueia a ligação do membro ao seu parceiro de ligação na família B7 ou TNFRSFl14. O domínio variável do segundo anticorpo que pode se ligar o membro da família B7 ou TNFRSFl14 preferivelmente bloqueia a ligação do membro ao seu parceiro de ligação na família CD28. As combinações preferidas de bloqueio e não bloqueio domínios variáveis, em que o referido primeiro e segundo anticorpo são indicados aqui a seguir.

Familia B7 ou Familia B7 ou CD28 TNFRSF14 CD28 TNFRSF14 Combinação | 1 Bloqueio Bloqueio Sem sem bloqueio bloqueio 2 Bloqueio Bloqueio sem bloqueio bloqueio 3 Bloqueio Bloqueio Bloqueio sem bloqueio

[00101] As combinações acima são combinações preferidas. As combinações especificar que os domínios variáveis do primeiro anticorpo são domínios variáveis, que bloqueiam a ligação do membro da família CD28 de um parceiro de ligação do mesmo ema família B7 ou TNFRSFl4. O segundo anticorpo pode ter um ou mais domínios variáveis que não bloqueiam esta interação. Ao analisar Oligoclonics concretizações, o anticorpo que compreende dois domínios variáveis de bloqueio é atribuído a qualificação de "primeiro anticorpo". Quando os Oligoclonics compreendem dois ou mais anticorpos que têm dois domínios variáveis, em seguida, bloqueando um deles é atribuído a qualificação de "primeiro anticorpo". pares de ligação conhecidos para um membro da família CD28 ou um membro da família B7 ou TNFRSFl14 são indicados aqui acima.

[00102] A primeira proteína de membrana é de preferência um membro da família CD28.

[00103] Os membros da família CD28 tem uma variável do tipo de domínio único imunoglobulina extracelular (IgV) seguido por uma cauda citoplasmática curta. Os membros são expressos em células do sistema imune, quer constitutivamente ou induzida. Os membros da família incluem

CD28, CTLA-4, PD-l, ICOS, BTLA, NKp30 e TMIGD2. A primeira proteína de membrana é de preferência Pd-l1; CTLA-4; BTLA; ou TMIGD2, de um modo preferido Pd-1.

[00104] A segunda proteína de membrana é de preferência um membro da família B7, ou TNFRSFlI4. A frase "referido membro da família B7 ou TNFRSFl4" significa um membro selecionado a partir do grupo de proteínas que consistem das proteínas da família B7 e TNFRSFl4. Em uma concretização preferida, a segunda proteína de membrana é um membro da família B7. A família B7 é uma colecção de, proteínas de superfície celular estruturalmente relacionadas, que se ligam a proteínas em linfócitos que regulam as respostas imunitárias (membros da família CD28). membros da família B7 são tipicamente referidas como ligantes, ao passo que os membros da família CD28 são referidos como receptores.

[00105] A ativação dos linfócitos T e B é iniciada por engate da superfície celular, os receptores de células T específicos para o antígeno ou receptores das células B, mas sinais adicionais entregue simultaneamente por um ou mais ligantes B7 determinar a resposta imunitária final. Estes 'co-estimulador'"' ou sinais 'co-inibitório" são entregues por ligantes B7 através da família CD28 de receptores em linfócitos. A interação dos membros da família B7-com respostas imunitárias receptores aumenta co- estimuladoras, e interação com receptores co-inibitório diminui a resposta imune. membros preferidos da família B7- CD80 são; CD86; ICOS-G; PD-Ll1; PD-L2; B7-H3, H4-B7;

[00106] B7-H6 e B7-H7. Os ligantes B7 s expressos em tecidos linfoides e não linfoides. B7-ligantes para transmitir um sinal de co-inibidor estão correlacionados com neoplasias, célula infectada com vírus e células infectadas com parasitas intracelulares e proporcionar-lhes com uma capacidade contornar ou atenuar, pelo menos, uma resposta imune contra eles.

[00107] Manipulação dos sinais fornecidos por ligantes B7 tem mostrado atividade no tratamento de autoimunidade, doenças inflamatórias e câncer. Em uma concretização preferida, a segunda proteína de membrana é PD-L1; PD-L2; ICOSL, CD80; CD86; B7-H3; B7-H4; TNFRSF14; B7- H6 ou B7-H7. Em uma concretização preferida, a segunda proteína de membrana é PD-Ll; PD-L2; CD80; CD86; B7-HA4; TNFRSF14; ou B7-H7. Em uma concretização particularmente preferida a segunda proteína de membrana é PD-Ll; ou PD-L2, de preferência PD-L1.

[00108] Em uma concretização particularmente preferida da primeira proteína da membrana é de DP-l e a segunda proteína de membrana é PD-L1.

[00109] Quando a primeira proteína de membrana CD28 é preferido que a segunda proteína de membrana é a CD80, CD86 ou ICOSL, de um modo preferido CD80. Por conseguinte, o anticorpo ou uma sua variante é de preferência um anticorpo ou uma variante do mesmo, compreendendo um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de CD28 e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de CD80; uma parte extracelular de CD86; ou uma parte extracelular que se liga ICOSL, de preferência, uma parte extracelular de CD80. CD28 e CD80 são pares de ligação. CD28 e CD86 são pares de ligação e CD28 e ICOSL são pares de ligação.

[00110] Quando a primeira proteína de membrana é CTLA- 4, é preferível que a segunda proteína de membrana é a CD80, CD86 ou ICOSL, de um modo preferido CD80. Por conseguinte, o anticorpo ou uma sua variante é de preferência um anticorpo ou uma variante do mesmo, compreendendo um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da CTLA-4 e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de CD80 ou uma parte extra celular de CD86, de preferência uma parte extracelular de CD80. CTLA-4 e CD80 são pares de ligação. CTLA-4 e CD86 são pares de ligação e CTLA-4 e ICOSL são pares de ligação

[00111] Quando a primeira proteína de membrana é ICOS prefere-se que a segunda proteína de membrana seja ICOSL. Por conseguinte, o anticorpo ou uma sua variante seja, de preferência, um anticorpo ou uma sua variante que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de ICOS e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da ICOSL. ICOS e ICOSL são pares de ligação.

[00112] Quando a primeira proteína de membrana é BTLA prefere-se que a segunda proteína de membrana seja B7-H4 ou TNFRSFl14, de preferência. TNFRSFl4. Por conseguinte, oO anticorpo ou uma sua variante é, de preferência, um anticorpo ou uma variante do mesmo, compreendendo um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da BTLA e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de B7-H4 ou uma parte extracelular de TNFRSF14, de preferência uma parte extracelular de TNFRSFl14. BTLA e B7- H4 são ligadas a pares BTLA e TNFRSFl14 são pares de ligação.

[00113] Quando a primeira proteína de membrana é NKp30 prefere-se que a segunda proteína de membrana é B7-H6. Por conseguinte, o anticorpo ou uma sua variante é de preferência um anticorpo ou uma variante do mesmo, compreendendo um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da NKp30 e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de B7-H6. NKp3 () e B7-H6 são pares de ligação.

[00114] Quando a primeira proteína de membrana é TMIGD2 prefere-se que a segunda proteína de membrana é B7- H7 (HHLA2). Por conseguinte, o anticorpo é preferencialmente um anticorpo compreendendo um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da TMIGD2 e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de B7- H7 (HHLA2). TMIGD2 e B7-H7 são pares de ligação.

[00115] Quando a primeira proteína de membrana é PD- 1 é preferível que a segunda proteína de membrana é PD-L1 ou PD-L2, de preferência PD-Ll. PD-l e PD-Ll são pares de ligação. PD-1 e PD-L2 são pares de ligação. PD-L1 e CD80 são pares de ligação. O anticorpo ou uma variante de preferência compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-1 e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-Ll1 ou uma parte extracelular da DP-L2, de preferência uma extracelular parte de PD-Ll. A DP-1 / anticorpo PD-L1 ou uma sua variante, e o anticorpo / PD-L2-1 DP ou uma sua variante são, de preferência anticorpos ou uma sua variante que tem um domínio variável de ligação

PD-l1 que, quando fornecidos como um bivalente anticorpo monoclonal que compreende dois dos referidos domínios variáveis que se ligam a DP-1, / PD-L1 inibição mediada inibe DP-l de receptor de células T mediada por ativação de uma célula de Jurkat em uma gama de 20-150% quando em comparação com a inibição obtida com o anticorpo Nivolumab em uma célula de Jurkat. Algumas concretizações fornecemum anticorpo ou variante de acordo com a invenção, em que o referido anticorpo ou variante compreende um domínio variável de PD1- ligação que, quando presentes em um formato de anticorpo bivalente monoespecífico, neutraliza PDl / PD-Ll1 inibição mediada do receptor das células T mediada por ativação de um células de Jurkat a uma maior extensão em comparação com o anticorpo Nivolumab. O domínio variável que se liga uma parte extracelular da DP-l1 é definido como um domínio variável que, quando em um formato de anticorpo monoespecífico bivalente que compreende dois dos referidos domínios variáveis que se ligam a inibio de DP-l1, inibe a DP-1 / PD- L1 mediada receptor de células T mediada por ativação de uma célula de Jurkat em uma gama de 20-150% quando em comparação com a inibição obtida com o anticorpo Nivolumab em uma célula de Jurkat.

[00116] A inibição da DP-1 de inibição de TCR ativação mediada da célula Jurkat é de preferência na gama de 50- 150%, preferivelmente 80-150%, mais preferivelmente de 100- 150% quando em comparação com a inibição obtida com o anticorpo na referida Nivolumab de células Jurkat. Em uma concretização preferida, a inibição é pelo menos 100% quando comparada com a inibição obtida com o anticorpo Nivolumab em que a referida célula de Jurkat. PD-l de inibição de TCR ativação mediada de células Jurkat é de preferência medida por medição de uma imune efeito de DP-1 de amortecimento / ligação PD-Ll em células Jurkat que são incubados sob condições que, mas para a presença do anticorpo ou uma sua variante , ser ativada através do receptor de células-T. Um ensaio adequado para a determinação da inibição é descrito nos exemplos. Uma linha celular Jurkat adequado descrito nos exemplos.

[00117] O domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-Ll é preferencialmente um domínio variável que, quando presente num anticorpo monoclonal monovalente, se liga PD-Ll com uma K D de 0,1-14 nM como medida por ressonância plasmônica de superfície (SPR ), de preferência, tem um K D de 0,5-14 nM, de um modo preferido um K D de 1-14 nM, de um modo preferido um K D de 1- 12 nM, de um modo preferido um K D de 2-12 nM como medida por SPR. Em algumas concretizações preferidas, um anticorpo Ou variante de acordo com a invenção compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP- Ll1, em que o referido domínio variável, quando presentes em um anticorpo biespecífico que possui um segundo domínio variável que se liga a um irrelevante antígeno, tais como o toxóide tetânico, se liga PD-Ll com um K D inferior a ou igual a 4,27 nM, de preferência inferior a ou igual a 1,31 nM, de preferência inferior a ou igual a 1,27 nM, como medido por ressonância de plasmônica de superfície ( SPR). De preferência, o referido domínio variável PD-Ll1 específica, quando presente num anticorpo biespecífico que possui um segundo domínio variável que se liga a um antígeno irrelevante, tal como o toxóide tetânico, se liga PD-L1 com uma K D de 0,9-4,27 nM, de um modo preferido com uma K D de 0,94-4,27 nM, ou com um K D de 0,9-1,3l nM, de um modo preferido com uma K D de 0,94-1,3l nM. Um anticorpo ou variante, de acordo com a invenção que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-1 e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-L1 ou uma parte extracelular da DP-L2, é de preferência um anticorpo ou uma sua variante que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-l1 e bloqueia a ligação de DP-l1 para PD- L1. Prefere-se que o domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-Ll1 ou uma parte extracelular da DP-L2 é um domínio variável que bloqueia a ligação de DP-1 para PD-Ll ou PD-L2, respectivamente. Um domínio variável que pode se ligar DP-1 e que bloqueia a ligação de DP-l para PD-L1 é preferencialmente um domínio que também bloqueia a ligação de DP-1 para PD-L2. Um domínio variável da presente invenção pode ser um que pode se ligar PD-L1 e que bloqueia a ligação de PD-L1 para DP-l1 e / ou PD-Ll1 para CD80. Isto proporciona a vantagem de que estes anticorpos são também capazes de neutralizar a resistência de tumores ao tratamento através da DP-1 / via PD-L2.

[00118] Um anticorpo ou uma sua variante de acordo com a invenção reduz de um modo preferido a atividade ligação do par de ligação. A redução da atividade é tipicamente conseguida através do bloqueio da capacidade do par de ligação para ligar um ao outro. A capacidade pode ser bloqueada através do bloqueio de qualquer uma ou de preferência tanto do membro do par de ligação. Quando o par de ligação é co-inibitório a atividade inibidora ou co- inibitório é reduzida pelo bloqueio. Quando o par de ligação é corestimulador da atividade co-estimuladora é reduzida pelo bloqueio.

[00119] A preferência por um membro da família CD28 e um membro da família B7 ou TNFRSFlIA é o mesmo em concretizações Oligoclonics.

[00120] A invenção também fornece um método de engate e / ou ativação de células-T que compreende o fornecimento de um sistema que compreende uma célula T e uma célula à qual o referido T-célula é para ser engatado ou ativada, e fornecendo o referido sistema com um ou mais anticorpos que cada compreendem um domínio variável que pode ligar-se um membro da família CD28 e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de um membro da família B7 ou TNFRSF14 e incubação do referido sistema, sob condições que são permissivas para a célula T a tornar-se envolvida e / ou ativado. Em algumas concretizações, o referido método é um método in vitro. Algumas concretizações proporcionam um método de engate e / ou ativação de células-T que compreende o fornecimento de um sistema que compreende uma célula T e uma célula à qual o referido T-célula é para ser engatado ou ativada, e fornecendo o referido sistema com um ou mais anticorpos que cada compreendem um domínio variável que pode se ligar uma parte extracelular da DP-1 e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-Ll1 e incubação do referido sistema, sob condições que são permissivas para a célula T a tornar-se envolvida e / ou ativada . A célula à qual o referido T-célula é para ser engatado ou ativado é, de preferência uma célula imunitária, por exemplo, uma célula apresentadora de antígeno, um macrófago, uma célula neoplásica, uma célula infectada de vírus, ou uma célula infectada parasita intracelular. Envolvente e / ou ativação de células-T dirige as culas T para um alvo específico. Ativar uma célula T é ativar o receptor de células T da referida célula-T. Envolvendo uma célula T, tipicamente está a ativar uma célula T.

[00121] Acoplamento também pode dirigir uma célula-T já ativada para um destino especificado pelo anticorpo. Condições que são permissivas para o referido T-célula para tornar as condições de cultura que se dedicam e / ou ativados são tipicamente, mas também pode ser de incubação num animal e, assim, pode incluir, inter alia, métodos de tratamento. As condições são tipicamente de tal modo que a de células T não está envolvida na ausência do anticorpo. Se colecções de células-T são medidos alguns destes podem já ser engatado ou ativado desde que a recolha contém células T suficientes que não estão envolvidos ou ativadas.

[00122] Um anticorpo da invenção pode trazer duas células em conjunto em estreita proximidade que permite que as interações entre as células mediadas por outras do que o par receptor-ligante ligado pelo anticorpo da invenção proteínas. Uma tal interação é uma interação de um receptor de células T de uma célula e MHC na outra célula.

[00123] Um anticorpo ou uma sua variante que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-l compreende preferência uma região variável da cadeia pesada com uma região CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da região CDR3 da região variável de cadeia pesada de MF6076; MF6236; MF6256; MF6226; MF6930; MF6932; MF6935; MF6936; MF6972; MF6974; MF6982; MF6929; MF7699; MF7698; MF7687; MF7686; MF7685; ou MF7684 (Figura 3 e / ou Figura 13).

[00124] Um anticorpo ou uma sua variante que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-l compreende preferência uma região variável da cadeia pesada com uma região CDR1, CDR2 e CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de CDRl, CDR2 e CDR3 de uma região variável da cadeia pesada de um dos VH representado por MF6076; MF6236; MF6256; MF6226; MF6930; MF6932;

[00125] MF6935; MF6936; MF6972; MF6974; MF6982; MF6929; MF7699; MF7698;

[00126] MF7687; MF7686; MF7685; ou MF7684 (Figura 3 e / ou Figura 13). As sequências de CDRl, CDR2 e CDR3 são preferencialmente selecionados a partir mesma região VH.

[00127] Um anticorpo ou uma sua variante que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-l1 compreende, de preferência a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de MF6076; MF6256; MF6226; MF6930; MF6932; MF6935; MF6936; MF6972; MF6974; MF6982; MF6929; MF7699; MF7698; MF7687; MFT7686; MF7685; ou MF7684 tendo, no máximo, 15, de um modo preferido 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo O, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções,

substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito a sequência de aminoácidos da VH de MF (Figura 3 e / ou Figura 13). A inserção (s), deleção (s), substituição (s) de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos, se for o caso, de preferência, não são na sequência de aminoácidos das regiões CDR.

[00128] Um anticorpo ou uma sua variante que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-Ll compreende, preferencialmente, uma região variável da cadeia pesada com uma região CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da região de CDR3 da região da cadeia pesada variável de MF5359 ; MF5361; MF5377; MF5382; MF5424; MF5426; MF5439; MF5442; MF5553; MF5557; MF5561; MF5576; MF5594; MF5708; MF5442; MF7691; MF7690; MF7689; MF7688; MF7700; MF7701; MF7703; MF7694; MF7693; MF7692; MF7697; MF7696; ou MF7695 (Figura 3 e / ou Figura 13).

[00129] Um anticorpo ou uma sua variante que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-Ll compreende, preferencialmente, uma região variável da cadeia pesada com uma região CDR1, CDR2 e CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 de uma região variável da cadeia pesada de um dos VH representado por MF5359; MF5361; MF5377; MF5382; MF5424; MF5426; MF5439; MF5442; MF5553; MF5557; MF5561; MF5576; MF5594; MF5708; MF5442; MF7691; MF7690; MF7689; MF7688; MF7700; MF7701; MF7703; MF7694; MF7693; MF7692; MF7697; MF7696; ou MF7695 (Figura 3 e / ou Figura 13). As sequências de CDRl, CDR2 e CDR3 são preferencialmente selecionados a partir mesma região VH.

[00130] Um anticorpo ou uma sua variante que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-LI1 compreende —preferencialmente a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de MF5359; MF5361; MF5377; MF5382; MF5424; MF5426; MF5439; MF5442; MF5553; MF5557; MF5561; MF5576; MF5594; MF5708; MF5442; MFT7691; MF7690; MF7689; MF7688; MF7700; MF7701; MF7703; MF7694; MF7693; MF7692; MF7697; MF7696; ou MF7695 tendo, no máximo, 15, de um modo preferido 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito a sequência de aminoácidos do MF indicada(Figura 3 e / ou Figura 13). A inserção (s), deleção (s), substituição (s) de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos, se for o caso, de preferência, não são na sequência de aminoácidos das regiões CDR.

[00131] Um anticorpo ou variante do mesmo compreende preferência um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-l1 que bloqueia a ligação de DP-1 para PD- L1 e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-Ll1l que bloqueia a ligação de DP-l1 para PD-L1. O domínio variável que pode se ligar DP-l e que bloqueia a ligação de DP-1 para PD-Ll1 de preferência, também bloqueia a ligação de DP-l para PD-L2. O domínio variável que pode se ligar PD-Ll1 e que bloqueia a ligação de DP-1l para PD-L1 de preferência, também bloqueia a ligação de PD- Ll para CD80. Isto proporciona a vantagem de que a imunossupressão por células tumorais através de interações entre DP-1 e CD80 também pode ser contrariado.

[00132] Um anticorpo do presente invenção ou uma sua variante, por exemplo, um anticorpo biespecífico ou uma sua variante, compreende preferência um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-1 e que bloqueia a interação da DP-l1 com PD-L1 e / ou PD-L2 e compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-L1 e que bloqueia a interação de PD-L1 com DP-1 e / ou CD80. De um modo preferido, uma tal molécula da presente invenção é capaz de bloqueio da DP-1 eixo completo, incluindo DP-1 com PD-Ll1 ou PD-L2, e PD-Ll com DP-1 e CD80.

[00133] O domínio variável que se liga uma parte extracelular da DP-L1 em tais anticorpos ou as suas variantes de preferência compreende uma região VH com a sequência de aminoácidos da CDR3 ou a sequência de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 de uma das VH de MF5359 ; MF5377; MF5382; MF5424; MF5426; MF5439; MF5442; MF5553; MF5557; MF5561; MF5576; MF5594; MF5708; MF5442; MF7691; MF7690; MF7689; MF7688; MF7700; MF7701; MF7703; MF7694; MF7693; MF7692; MFT7697; MF7696; ou MF7695 (Figura 3 e / ou Figura 13). Em uma concretização preferida, o domínio variável que se liga uma parte extracelular da DP-Ll compreende uma região VH com a sequência de aminoácidos de um VH de MF5359; MF5377; MF5382; MF5424; MF5426; MF5439; MF5442; MF5553; MF5557; MF5561; MF5576; MF5594; MF5708; MF5442; MF7691; MF7690; MF7689; MF7688; MF7700; MF7701; MF7703; MF7694; MF7693; MF7692; MF7697; MF7696; ou MF7695 tendo, no máximo, 15, de um modo preferido 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 929 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções,

deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito a sequência de aminoácidos do indicado MF (Figura 3 e / ou Figura 13).

[00134] O domínio variável que se liga uma parte extracelular da DP-l1 neste anticorpo ou variante do mesmo de um modo preferido compreende uma região VH com a sequência de aminoácidos da CDR3 ou a sequência de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 de uma das VH de MF6076 ; MF6236; MF6256; MF6226; MF6930; MF6932; MF6935; MF6936; MF6972; MF6974; MF6982; MF6929; MF7699; MF7698; MF7687; MF7686; MF7685; ou MF7684 (Figura 3 e / ou Figura 13). Em uma concretização preferida, o domínio variável que se liga uma parte extracelular da DP- 1 compreende uma região VH com a sequência de aminoácidos da VH de MF6076; MF6236; MF6256; MF6226; MF6930; MF6932; MF6935; MF6936; MF6972; MF6974; MF6982; MF6929; MF7699; MF7698; MF7687; MF7686; MF7685; ou MF7684 tendo, no máximo, 15, de um modo preferido O, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito a sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos da VH do indicado MF (Figura 3 e / ou Figura 13). A inserção (s), deleção (s), substituição (s) de aminoácido ou uma combinação dos mesmos, se for o caso, não são, de preferência, na sequência de aminoácidos das regiões CDR. Uma combinação particularmente preferida neste anticorpo ou variante do mesmo é a combinação de domínios variáveis que compreendem a sequência indicada ou uma sua variante de MF5382 e MF6256.

[00135] Algumas concretizações fornecem um anticorpo ou variante de acordo com a presente invenção, que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-1 e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-Ll, em que o referido anticorpo ou variante tem um potencial de ativação das células T CD4 + mais forte em um ensaio de Staphylococcus enterotoxina B (SEB), em comparação com uma mistura equimolar de: - anticorpos monoespecíficos bivalentes que compreendem dois dos referidos domínios variáveis que se ligam a DP-1l, e - anticorpos monoespecíficos bivalentes que compreendem dois dos referidos domínios variáveis que se ligam a DP-L1. Em vista do seu potencial mais forte ativação das células T CD4 +, é preferido um anticorpo ou variante de acordo com estas concretizações através de uma mistura equimolar dos anticorpos parentais.

[00136] Algumas concretizações fornecem um anticorpo ou variante de acordo com a presente invenção, que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-1 e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-L1 e que é capaz de ativar As células T num ensaio celular específica para o antígeno T CD4 + mais fortemente do que o anticorpo de referência 5C4, ou anticorpo de referência YW243.55.S70, ou uma combinação de anticorpos de referência 5C4 e YW243.55.S70. Em vista do seu potencial de ativação das células específicas de antígeno fortes-T CD4 +, um anticorpo ou variante de acordo com esta concretização é preferido em relação ao anticorpo de referência anti-DP-l1 Nivolumab e o anticorpo de referência anti-PD-Ll1l Atezolizumab. De nota, um anticorpo ou variante de acordo com estas concretizações é ainda preferido ao longo de uma combinação de Nivolumab e Atezolizumab.

[00137] Algumas concretizações fornecem um anticorpo ou variante de acordo com a presente invenção, que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-1 e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-L1 e que tem um potencial de ativação das células T CD4 + mais forte em um ensaio de reação mista de linfócitos (MLR), em comparação com oO anticorpo de referência 5C4, que se baseia na Nivolumab, ou de referência YW243.55.S70 anticorpo, que se baseia na Atezolizumab. É de notar, em vista do seu potencial mais forte ativação das células T CD4 +, é preferido um anticorpo ou variante de acordo com estas concretizações ao longo Nivolumab e Atezolizumab.

[00138] Algumas concretizações fornecem um anticorpo ou variante de acordo com a presente invenção, que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-1 e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-L1 e que é capaz de aumentar a proliferação de células T CD4 + e / ou células T que se infiltram no tumor CD8 +. Em vista do seu potencial de ativação das células T se infiltram no tumor, um anticorpo, ou variante de acordo com estas concretizações é particularmente apropriada para induzir ou aumentar uma resposta anti-tumoral mediada por células T.

[00139] Algumas concretizações fornecem um anticorpo ou variante de acordo com a presente invenção, que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-1 e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-Ll1 e que é capaz de induzir uma mediada por resposta antitumoral mais forte de células T in vivo, em comparação com uma combinação de anticorpos de referência MK-3475, que é baseado em Pembrolizumab, e YW243.55.S70, que se baseia na Atezolizumab. Um anticorpo ou variante de acordo com estas concretizações é, portanto, particularmente adequado para induzir ou aumentar uma resposta antitumoral mediada por células T in vivo. É de notar, em vista do seu potencial de ativação das células T mais fortes, um anticorpo ou variante de acordo com estas concretizações é preferido em relação Pembrolizumab e Atezolizumab.

[00140] Como mostrado na Tabela 4, os anticorpos biespecíficos que demonstra o bloqueio de pelo menos 60% em uma PD-l repórter / PD-L1 ensaio de anticorpos biespecíficos foram formadas quando PD-l específico Fab braço 6076 foi combinado com PD-L1 específica Fab braço MF5553, MF5359 , MF5424, MF5561, MF5442 ou MF5382.

[00141] Um anticorpo ou uma sua variante tal como aqui descrito compreende preferência - um domínio variável de ligação a DP-l que compreende uma regi VH com a sequência de aminoácidos da CDR3 ou a sequência de aminoácidos de CDRl, CDR2 e CDR3 da VH de MF6076; e - um domínio variável de ligação PD-Ll que compreende uma região VH com a sequência de aminoácidos da CDR3 ou a sequência de aminoácidos de CDRl, CDR2 e CDR3 da VH de MF5553; MF5359; MF5424; MF5561; MF5442 ou MF5382, MF5359 de preferência; MF5424; MF5561; MF5442 ou MF5382, MF5359 de preferência; MF5424; MF5561 ou MF5442, MF5359 de preferência; MF5424 ou MF5442, MF5359 modo preferido ou de um modo preferido MF5442 MF5442 (Figura 3).

[00142] Um anticorpo ou uma sua variante compreende preferivelmente - um domínio variável de ligação a DP-l1 que compreende uma regi VH com a sequência de aminoácidos da VH de MF6076 tendo, no máximo, 15, de um modo preferido 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e tendo de preferência 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito a sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos da VH de MF6076 e; - se ligar a um Domínio variável PD-L1 que compreende uma região VH com a sequência de aminoácidos da VH de MF5553; MF5359; MF5424; MF5561; MF5442 ou MF5382, MF5359 de preferência; MF5424; MF5561; MF5442 ou MF5382, MF5359 de preferência; MF5424; MF5561 ou MF5442, MF5359 de preferência; MF5424 ou MF5442, de preferência MF5359 ou MF5442 preferencialmente MF5442 tendo, no máximo, 15, de um modo preferido 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos no que diz respeito à sequência de aminoácidos da VH do indicado MF (Figura 3).

[00143] Como mostrado na Tabela 4, os anticorpos biespecíficos que demonstra o bloqueio de pelo menos 60% num ensaio de repórter / PD-L1l DP-l foram formadas quando PD-1 específico Fab braço MF6236 foi combinado com PD-L1 específica Fab braço MF5561, MF5442 ou MF5382. Um anticorpo ou uma sua variante tal como aqui descrito compreende preferência - um domínio variável de ligação a DP-l1 que compreende uma regi VH com a sequência de aminoácidos da CDR3 ou a sequência de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 da VH de MF6236 (Figura 3); e - um domínio variável de ligação PD-L1l que compreende uma região VH com a sequência de aminoácidos da CDR3 ou a sequência de aminoácidos de CDRl, CDR2 e CDR3 da VH de MF5561; MF5442 ou MF5382, MF5561 preferência ou MF5442, MF5442 preferência (Figura 3).

[00144] Um anticorpo ou uma sua variante compreende preferivelmente - um domínio variável de ligação a DP-l1 que compreende uma regi VH com a sequência de aminoácidos da VH de MF6236 tendo, no máximo, 15, de um modo preferido 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e tendo de preferência 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito a sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos da VH de MF6236 (Figura 3) e; - se ligar a um Domínio variável PD-Ll que compreende uma região VH com a sequência de aminoácidos da VH de MF5561; MF5442 ou MF5382, de preferência, MF5561 ou MF5442, de preferência MF5442 tendo, no máximo, 15, de um modo preferido 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo O, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções,

substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos no que diz respeito à sequência de aminoácidos da VH do indicado MF (Figura 3).

[00145] Como mostrado na Tabela 4, os anticorpos biespecíficos que demonstra o bloqueio de pelo menos 60% num ensaio de repórter / PD-L1 DP-l foram formadas quando PD-1 específico Fab braço MF6974 foi combinado com PD-L1l específica Fab braço MF5424; MF5561; MF5442 ou MF5382. Um anticorpo ou uma sua variante tal como aqui descrito compreende preferência - um domínio variável de ligação a DP-l1 que compreende uma regi VH com a sequência de aminoácidos da CDR3 ou a sequência de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 da VH de MF6974 (Figura 3); e - um domínio variável de ligação PD-Ll que compreende uma região VH com a sequência de aminoácidos da CDR3 ou a sequência de aminoácidos de CDRl, CDR2 e CDR3 da VH de MF5424; MF5561; MF5442 ou MF5382, MF5424 de preferência; MF5561 ou MF5442, MF5424 preferência ou MF5442, MF5442 preferência (Figura 3).

[00146] Um anticorpo ou uma sua variante compreende preferivelmente - um domínio variável de ligação a DP-l1 que compreende uma regi VH com a sequência de aminoácidos da VH de MF6974 tendo, no máximo, 15, de um modo preferido 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e tendo de preferência 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito a sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos da VH de MF6974 (Figura 3) e;

- se ligar a um Domínio variável PD-Ll que compreende uma região VH com a sequência de aminoácidos da VH de MF5424; MF5561; MF5442 ou MF5382, MF5424 de preferência; MF5561 ou MF5442, MF5424 preferência ou MF5442, MF5442 preferencialmente possuindo pelo menos 15, de preferência O, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e tendo, de preferência, O, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito à sequência de aminoácidos da VH do indicado MF (Figura 3).

[00147] Como mostrado na Tabela 4, os anticorpos biespecíficos que demonstra o bloqueio de pelo menos

[00148] 60% num ensaio de repórter de DP-l1 / PD-L1 foram formadas quando PD-l específico Fab braço MF6935 foi combinado com PD-L1 específica Fab braço MF5424, MF5561, MF5442 ou MF5382. Um anticorpo ou uma sua variante tal como aqui descrito compreende preferência - um domínio variável de ligação a DP-l1 que compreende uma regi VH com a sequência de aminoácidos da CDR3 ou a sequência de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 da VH de MF6935 (Figura 3); e - um domínio variável de ligação PD-Ll que compreende uma região VH com a sequência de aminoácidos da CDR3 ou a sequência de aminoácidos da CDRL, CDR2 e CDR3 da VH de MF5424; MF5561; MF5442 ou MF5382, MF5561 de preferência; MF5442 ou MF5382, MF5442 preferência ou MF5382, MF5382 preferência (Figura 3).

[00149] Um anticorpo ou uma sua variante compreende preferivelmente - um domínio variável de ligação a DP-l que compreende uma regi VH com a sequência de aminoácidos da VH de MF6935 tendo, no máximo, 15, de um modo preferido 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e tendo de preferência 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito a sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos da VH de MF6935 (Figura 3) e; - se ligar a um Domínio variável PD-L1 que compreende uma região VH com a sequência de aminoácidos da VH de MF5424; MF5561; MF5442 ou MF5382, MF5561 de preferência; MF5442 ou MF5382, de preferência MF5442 ou MF5382, de preferência MF5382 tendo, no máximo, 15, de um modo preferido O, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo O, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos no que diz respeito à sequência de aminoácidos da VH do indicado MF (Figura 3).

[00150] Como mostrado na Tabela 4, os anticorpos biespecíficos que demonstra o bloqueio de pelo menos 60% num ensaio de repórter PD-L1I-PD 1 / foram formado quando PD-1 específico Fab braço MF6936 foi combinado com PD-L1l específica Fab braço MF5576, MF5424, MF5561, MF5557, MEF5442 ou MF5382. Um anticorpo ou uma sua variante tal como aqui descrito compreende preferência - um domínio variável de ligação a DP-l1 que compreende uma regi VH com a sequência de aminoácidos da CDR3 ou a sequência de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 da VH de MF6936 (Figura 3); e - um domínio variável de ligação PD-Ll que compreende uma região VH com a sequência de aminoácidos da CDR3 ou a sequência de aminoácidos de CDRl, CDR2 e CDR3 da VH de

MF5576; MF5424; MF5561; MF5557; MF5442 ou MF5382, MF5424 de preferência; MF5561; MF5557; MF5442 ou MF5382, MF5424 de preferência; MF5561; MF5442 ou MF5382, MF5561 de preferência; MF5442 ou MF5382, MF5442 preferência ou MF5382, MF5382 preferência (Figura 3).

[00151] Um anticorpo ou uma sua variante compreende preferivelmente - um domínio variável de ligação a DP-l que compreende uma regi VH com a sequência de aminoácidos da VH de MF6936 tendo, no máximo, 15, de um modo preferido 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e tendo de preferência 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito a sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos da VH de MF6936 (Figura 3) e; - se ligar a um Domínio variável PD-Ll que compreende uma região VH com a sequência de aminoácidos da VH de MF5576; MF5424; MF5561; MF5557; MF5442 ou MF5382, MF5424 de preferência; MF5561; MF5557; MF5442 ou MF5382, MF5424 de preferência; MF5561; MF5442 ou MF5382, MF5561 de preferência; MF5442 ou MF5382, de preferência MF5442 ou MF5382, de preferência MF5382 tendo, no máximo, 15, de um modo preferido 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos no que diz respeito à sequência de aminoácidos da VH do indicado MF (Figura 3).

[00152] Como mostrado na Tabela 4, os anticorpos biespecíficos que demonstra o bloqueio de pelo menos 60% num ensaio de repórter / PD-Ll1 DP-l foram formadas quando PD-1 específico Fab braço MF6256 foi combinado com PD-L1 específica Fab braço MF5576, MF5424, MFE5561, MF5557, MF5439, MF5442 ou MF5382. Um anticorpo ou uma sua variante tal como aqui descrito compreende preferência - um domínio variável de ligação a DP-l que compreende uma regi VH com a sequência de aminoácidos da CDR3 ou a sequência de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 da VH de MF6256 (Figura 3); e - um domínio variável de ligação PD-Ll que compreende uma região VH com a sequência de aminoácidos da CDR3 ou a sequência de aminoácidos de CDRl, CDR2 e CDR3 da VH de MF5576; MF5424; MF5561; MF5557; MF5439; MF5442 ou MF5382 MF5576 de preferência; MF5424; MF5561; MF5557; MF5442 ou MF5382, MF5576 de preferência; MF5561; MF5557; MF5442 ou MF5382, MF5576 de preferência; MF5561; MF5442 ou MF5382, MF5576 de preferência; MF5442 ou MF5382, MF5442 preferência ou MF5382, MF5382 preferência (Figura 3).

[00153] Um anticorpo ou uma sua variante compreende preferivelmente - um domínio variável de ligação a DP-l1 que compreende uma regi VH com a sequência de aminoácidos da VH de MF6256 tendo, no máximo, 15, de um modo preferido 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e tendo de preferência 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito a sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos da VH de MF6256 (Figura 3) e; - se ligar a um Domínio variável PD-Ll que compreende uma região VH com a sequência de aminoácidos da VH de MF5576; MF5424; MF5561; MF5557; MF5439; MF5442 ou MF5382, MF5576 de preferência; MF5424; MF5561; MF5557; MF5442 ou MF5382, MF5576 de preferência; MF5561; MF5557; MF5442 ou MF5382, MF5576 de preferência; MF5561; MF5442 ou MF5382, MF5576 de preferência; MF5442 ou MF5382, de preferência MF5442 ou MF5382, de preferência MF5382 tendo, no máximo, 15, de um modo preferido 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos no que diz respeito à sequência de aminoácidos da VH do indicado MF (Figura 3).

[00154] Em algumas concretizações preferidas, um anticorpo ou uma sua variante tal como aqui descrito compreende: - um domínio variável de ligação a DP-l1 que compreende uma regi VH com a sequência de aminoácidos da CDR3 ou a sequência de aminoácidos de CDRl, CDR2 e CDR3 da VH de MF6076; e - um domínio variável de ligação PD-Ll que compreende uma região VH com a sequência de aminoácidos da CDR3 ou a sequência de aminoácido da CDRl, CDR2 e CDR3 da VH de MF5442; MF7691; MF7690; MF7689; MF7688; MF7700; MF7701; MF7703; MF7694; MF7693; MF7692; MF7697; MF7696; ou MF7695, MF7703 preferência ou MF7689 (Figura 3 e / ou Figura 13).

[00155] Um anticorpo ou uma sua variante compreende preferivelmente - um domínio variável de ligação a DP-l que compreende uma regi VH com a sequência de aminoácidos da VH de MF6076 tendo, no máximo, 15, de um modo preferido 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3,

4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito a sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos de VH de MF6076 e; - se ligar a um Domínio variável PD-Ll que compreende uma região VH com a sequência de aminoácidos da VH de MF5442; MF7691; MF7690; MFT7689; MFT7688; MF7700; MF7701; MF7703; MF7694; MF7693; MF7692; MF7697; MF7696; ou MF7695, MF7703 preferencialmente MF7689 ou tendo, no máximo, 15, de um modo preferido O, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos em relação ao sequência de aminoácidos da VH do MF indicada (Figura 3 e / ou Figura 13).

[00156] Em algumas concretizações preferenciais de um anticorpo ou uma sua variante tal como aqui descrito compreende: - um domínio variável de ligação a DP-l1 que compreende uma regi VH com a sequência de aminoácidos da CDR3 ou a sequência de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 da VH de MF6974 (Figura 3); e - um domínio de ligação ao PD-L1 variável que compreende uma região VH com a sequência de aminoácidos da CDR3 ou a sequência de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 da VH de MF7703 ou MF7689, de preferência MF7703 ou MF7689, mais preferencialmente MF7689 (Figura 3 e / ou Figura 13).

[00157] Um anticorpo ou uma sua variante compreende preferencialmente: - um domínio variável de ligação a DP-l que compreende uma região VH com a sequência de aminoácidos da VH de MF6974 tendo, no máximo, 15, de um modo preferido 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e tendo de preferência 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito a sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos da VH de MF6974 (Figura 3) e; - um domínio variável de ligação ao PD-L1 que compreende uma região VH com a sequência de aminoácidos da VH de MF7703 ou MF7689, de preferência MF7703 ou MF7689, mais preferencialmente MF7689, tendo, no máximo, 15, de um modo preferido O, 1, 2, 3, 4 , 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos em relação ao sequência de aminoácidos da VH do indicada MF (Figura 3 e / ou Figura 13).

[00158] Em algumas concretizações preferidas, um anticorpo ou uma sua variante tal como aqui descrito compreende:

[00159] - um domínio variável de ligação a DP-l que compreende uma regi VH com a sequência de aminoácidos da CDR3 ou a sequência de aminoácidos de CDRl1, CDR2 e CDR3 da VH de MF7686 (Figura 13); e

[00160] - um domínio variável de ligação PD-L1 que compreende uma região VH com a sequência de aminoácidos da CDR3 ou a sequência de aminoácidos de CDRl1, CDR2 e CDR3 da VH de MF5359, MF5361, MF5377, MF5382, MF5424, MF5426, MF5439 , MF5442, MF5553, MF5557, MF5561, MF5576, MF5594, MF5708, MF7703 ou MF7689, MF7703 preferência ou MF7689, MF7703 mais preferivelmente (Figura 3 e / ou Figura 13).

[00161] Um anticorpo ou uma sua variante compreende preferencialmente:

[00162] - um domínio variável de ligação a DP-l1 que compreende uma regi VH com a sequência de aminoácidos da VH de MF7686 tendo, no máximo, 15, de um modo preferido 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e tendo de preferência 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito à sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos da VH de MF 7686 (Figura 13) e;

[00163] - se ligar a um Domínio variável PD-L1 que compreende uma região VH com a sequência de aminoácidos da VH de MF5359, MF5361, MF5377, MF5382, MF5424, MF5426, MF5439, MF5442, MF5553, MF5557, MF5561, MF5576, MF5594, MF5708 MF7703 ou MF7689, de preferência MF7703 ou MF7689, mais preferencialmente MF7703, tendo, no máximo, 15, de um modo preferido 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3 , 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos no que diz respeito à sequência de aminoácidos da VH do indicado MF (Figura 3 e / ou Figura 13).

[00164] Algumas concretizações preferidas proporcionam um anticorpo ou uma sua variante de acordo com a invenção que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-l1 e em que o referido domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-l1 compreende:

[00165] - uma sequência de CDR3 de cadeia pesada, que é idêntica à sequência de CDR3 de cadeia pesada de uma região variável selecionada do grupo consistindo de MF6974, MF6076 e MF7686; ou - uma sequência de CDR3 de cadeia pesada que se desvia em não mais do que três, de preferência não mais do que dois, mais preferivelmente não mais do que um aminoácido a partir da sequência de CDR3 de cadeia pesada de MF6974 ou MF6076 ou MF7686; Ou —- sequências de cadeia pesada CDR1, CDR2 e CDR3 que são idênticos aos da cadeia pesada CDRl, CDR2 e CDR3 de uma região variável selecionado a partir do grupo que consiste de MF6974, MF6076 e MF7686; ou - cadeia pesada CDRl1, CDR2 e CDR3 que se desviam, em não mais do que três, de preferência não mais do que dois, mais preferivelmente não mais do que um aminoácido a partir da cadeia pesada CDR1, CDR2 e CDR3 da sequência de MF6974 ou MF6076 ou MF7686.

[00166] Algumas concretizações preferidas proporcionam um anticorpo ou uma sua variante de acordo com a invenção que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-1 e em que o referido domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-l1 compreende:

[00167] - uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de MF6974 ou MF6076 ou MF7686, Ou - uma região variável da cadeia pesada tendo uma sequência que é pelo menos 80%, ou pelo menos 85%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 91%, ou pelo menos 92%, ou pelo menos 93%, ou pelo menos 94 %, ou, pelo menos, 95% », ou pelo menos 96%, ou pelo menos 97%, ou, pelo menos, 98%», ou pelo menos 99%, idêntico à sequência de aminoácidos de MF6974 ou MF6076 ou MF7686.

[00168] Algumas concretizações preferidas proporcionam um anticorpo ou uma sua variante de acordo com a invenção que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-L1 e em que o referido domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-Ll compreende: - uma sequência de CDR3 de cadeia pesada, que é idêntica à sequência de CDR3 de cadeia pesada de uma região variável selecionada do grupo consistindo de MF7689 e MF7703; ou - uma sequência de CDR3 de cadeia pesada que se desvia em não mais do que três, de preferência não mais do que dois, mais preferivelmente não mais do que um aminoácido a partir da sequência de CDR3 de cadeia pesada de MF7689 ou MF7703; ou

[00169] — CDR1 de cadeia pesada e CDR2 e CDR3 que são idênticas às regiões CDRlI e CDR2 e CDR3 de uma região variável selecionado a partir do grupo que consiste de MF7689 e MF7703; ou - CDRl de cadeia pesada e CDR2 e CDR3 que se desviam, em não mais do que três, de preferência não mais do que dois, mais preferivelmente não mais do que um aminoácido a partir da cadeia pesada CDR1 e CDR2 e CDR3 de MF7689 ou MF7703.

[00170] Algumas concretizações preferidas proporcionam um anticorpo ou uma sua variante de acordo com a invenção que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-Ll1 e em que o referido domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-Ll compreende: - uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de MF7689 ou MF7703, ou - uma região variável da cadeia pesada tendo uma sequência que é pelo menos 80%, ou pelo menos 85%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 91%, ou pelo menos 92%, ou pelo menos 93%, ou pelo menos 94 %, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 96%, ou pelo menos 97%, ou pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, idêntico à sequência de aminoácidos de MF7689 ou MF7703.

[00171] Algumas concretizações preferidas proporcionam um anticorpo ou uma sua variante de acordo com a invenção que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-1 e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-Ll1, em que o referido domínio variável que pode ligar-se a uma parte extracelular da DP-1 compreende sequências CDRl1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada que são idênticos aos da cadeia pesada CDRI1, CDR2 e CDR3 de uma região variável selecionado a partir do grupo que consiste de MF6974, MF6076 e MF7686, e, em que O referido domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-Ll compreende sequências de CDR1 e CDR2 e CDR3 da cadeia pesada que são idênticas às regiões CDR1 e CDR2 e CDR3 de uma região variável selecionado a partir do grupo que consiste de MF7689 e MF7703.

[00172] Algumas concretizações preferidas proporcionam um anticorpo ou uma sua variante de acordo com a invenção que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-1 e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-Ll1, em que o referido domínio variável que pode ligar-se a uma parte extracelular da DP-1 compreende a cadeia pesada de sequências CDR1l, CDR2 e CDR3 que são idênticos aos da cadeia pesada CDR1l, CDR2 e CDR3 de MF6974, e em que o referido domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de PD- Ll compreende sequências de CDRl e CDR2 e CDR3 da cadeia pesada que são idênticos aos da cadeia pesada CDR1 e CDR2 e CDR3 de MF7689. Como mostrado nos Exemplos, um anticorpo ou variante de acordo com esta concretização tem atividade bloqueio de PD-L1 boa DP-l1 e um forte potencial de ativação das células T.

[00173] Algumas concretizações fornecem um anticorpo ou uma sua variante de acordo com a invenção que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-1 e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-Ll1, em que o referido domínio variável que pode ligam-se a uma parte extracelular da DP-1 compreende a cadeia pesada de sequências CDRl1, CDR2 e CDR3 que são idênticos aos da cadeia pesada CDR1, CDR2 e CDR3 de MF7686, e em que o referido domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-L1 compreende sequências de CDR1 e CDR2 e CDR3 da cadeia pesada que são idênticos aos da cadeia pesada CDR1 e CDR2 e CDR3 de MF7703. Como mostrado nos Exemplos, um anticorpo ou variante de acordo com esta concretização tem a / atividade bloqueio de PD-L1 boa DP-1 e um forte potencial de ativação das células T.

[00174] Em outra concretização um anticorpo, ou uma variante da mesma compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da DP-Ll1 que não bloqueia a ligação de DP-l1 para PD-Ll. O domínio variável que se liga uma parte extracelular da DP-L1 neste anticorpo ou uma sua variante, de preferência compreende a sequência de aminoácido de CDR3 ou a sequência de aminoácidos de CDRI1, CDR2 e CDR3 da VH de MF5361 (Figura 3). Em uma concretização preferida, o domínio variável que se liga uma parte extracelular da DP-Ll compreende a sequência de aminoácidos de um VH de MF5361 tendo, no máximo, 15, de um modo preferido 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 , 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo O, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito a sequência de aminoácidos do MF indicada.

[00175] O mencionado, no máximo, 15, de preferência 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e de preferência 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições de aminoácidos no referido H, VH, L e VL regiões são substituições de preferência conservativas de aminoácidos, inserções, deleções, substituições ou uma combinação dos mesmos não são, de preferência na região CDR3 de H, VH, L ou cadeia VL, de preferência não na região de CDRl1, CDR2 ou CDR3 da VH ou cadeia VL e preferencialmente não na região de FRA4.

[00176] Um método tal como descrito aqui utiliza de preferência um anticorpo ou uma sua variante tal como aqui descrito.

[00177] Um anticorpo ou uma sua variante, por exemplo, uma parte, derivado, ou análogo da mesma de acordo com a invenção compreende preferência dois domínios variáveis, tal como descrito. Tal anticorpo é preferencialmente um anticorpo biespecífico ou uma sua variante. Dois ou mais anticorpos ou suas variantes podem ser ligados entre si. Vários métodos são conhecidos na arte. Um método adequado é a conjugação. Além disso, a tecnologia de produção de anticorpos multi-específicos progrediu para incluir também anticorpos biespecificos que possuem a mesma estrutura geral de um anticorpo mono-específico normal, mas em que os dois braços de cada um o anticorpo se ligar a um alvo diferente. O anticorpo biespecífico ou uma sua Variante possui preferencialmente duas cadeias pesadas com domínios de heterodimerização compatíveis. A cadeia leve é de preferência uma cadeia de luz comum. Algumas concretizações fornecem um anticorpo ou variante de acordo com a invenção, em que os locais do referido anticorpo ou variante de ligação ao antígeno consiste de um domínio variável de imunoglobulina que pode se ligar uma parte extracelular da DP-1 e um domínio variável de imunoglobulina que pode se ligar uma parte extracelular de PD-Ll ou PD-L2. Um anticorpo de acordo com a invenção é preferencialmente um anticorpo biespecífico de comprimento completo, que consiste de duas cadeias pesadas com domínios de heterodimerização compatíveis. Em algumas concretizações, um anticorpo de acordo com a

[00178] invenção é uma IgG, de preferência de IgGl ou IgG6G3 ou IgG4, mais preferencialmente de IgGl ou IgG4, mais preferencialmente de IgGl. Um formato IgG tipicamente proporciona a vantagem de uma meia-vida mais longa, e / ou uma imunogenicidade reduzida, quando comparada com outros formatos.

[00179] Em algumas concretizações, um anticorpo ou variante de acordo com a invenção é monovalente para a DP-1 e monovalente para a DP-L1.

[00180] A cadeia leve de um anticorpo ou variante de acordo com a invenção é de preferência uma cadeia de luz comum.

[00181] Tal como aqui utilizado, o termo "conjugado" refere-se a duas ou mais moléculas que foram unidos de modo covalente, opcionalmente, por uma região de ligação. Por exemplo, em algumas concretizações, um conjugado é uma primeira porção de proteína ou proteína não-unida a uma segunda proteína ou porção não proteico por uma região de ligação. Por exemplo, em algumas concretizações de uma molécula de ligação da invenção compreende ou é constituído por dois ou mais anticorpos que foram ligados de forma covalente. Um conjugado não se limita a uma primeira e segunda porção, mas em algumas concretizações pode também ter um terceiro, quarto ou mais porções unidas por outras regiões de ligação. Tal como descrito em outro lugar neste pedido de patente, os exemplos de porções de proteína incluem, mas não estão limitados a: um polipeptídeo, um peptidomimético, ou um anticorpo (ou parte de anticorpo, derivado ou análogo, como descrito noutro local na aplicação). Exemplos de unidades não proteicos incluem, mas não estão limitados a aptâmeros. Numerosos tipos de ligante pode ser utilizado, e o ligante vai ser selecionado para ser apropriado de acordo com os tipos de moléculas do conjugado e sobre as propriedades desejadas do ligante (comprimento, flexibilidade, resistência à atividade proteinase e outras características semelhantes). Estes ligantes podem compreender nucleotídeos, polipeptídeos, ou um material sintético adequado. Por exemplo, um ligante pode ser um ligante de peptídeo flexível. Em certas concretizações, O ligante pode ser um ligante clivável, permitindo que as partes do conjugado a ser separados um do outro. Em outras concretizações, um ligante de peptídeo pode ser um ligante helicoidal. Vários exemplos e kits para proteínas que ligam e outras moléculas são bem conhecidos na arte. Tal como aqui utilizado, o termo "proteína de fusão" refere-se a uma proteína que compreende dois ou mais polipeptídeos ou proteínas que foram unidos ao nível do DNA por recombinação e são expressos juntos como uma única

[00182] polipeptídeo. Uma proteína de fus tamb pode compreender uma região de ligação de peptídeo também codificada pelo DNA e expressa juntamente com a proteína de fusão. Um ligante peptídico que é parte de uma proteína de fusão pode ser concebida para ter características particulares, tais como a flexibilidade, a hidrofilicidade, resistência à proteinase, susceptibilidades ao corte, etc Todas estas propriedades podem ser concebidas dentro da sequência de DNA e métodos para a concepção de ligantes são bem conhecidas na arte. Por exemplo, os anticorpos podem ser ligados entre si por métodos bem conhecidos na arte, e tal como aqui descrito, para formar anticorpos biespecíficos ou multi-direcionamento. Além disso, os anticorpos biespecíficos podem ser construídos por vários métodos conhecidos na arte, por exemplo, utilizando tecnologia tal como Biclonics* (ver, por exemplo, WO2013 / 157954). Um anticorpo monoclonal biespecífico (BsMAb, BsAb) compreende,

tipicamente, os domínios de ligação de dois anticorpos monoclonais diferentes e, consequentemente, liga-se a dois epítopos diferentes. As moléculas Biclonics*, mas também outros anticorpos biespecíficos de IgG de comprimento completo tem duas especificidades de ligação ao antígeno diferentes codificadas por duas regiões variáveis diferentes de uma molécula de IgG de comprimento completo de um Fab de um scFv. Biclonics* podem ser produzidos por co-transfecção de células individuais com construções genéticas que codificam para dois anticorpos diferentes de cadeia leve comum (CLC) como detalhado aqui noutro local. engenharia CHS garante eficiente heterodimerização e à formação de anticorpos biespecíficos essencialmente puros.

[00183] Um anticorpo da presente invenção é preferencialmente um anticorpo biespecífico. Os anticorpos tipicamente ligam seu alvo através do local de ligação de chamada antígeno. Um local de ligação ao antígeno não modificado é tipicamente formada por e presente em um domínio variável do anticorpo. Um domínio variável contém o local de ligação ao antígeno. Um domínio variável que pode ligar-se um antígeno é um domínio variável que compreende um local de ligação ao antígeno que pode se ligar a um antígeno.

[00184] Um domínio variável de anticorpo compreende tipicamente uma região de cadeia pesada variável (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL). O local de ligação ao antígeno pode estar presente no domínio variável VH / VL combinados, ou em apenas a região VH ou da região VL única. Quando o local de ligação ao antígeno se encontra presente em uma das duas regiões de domínio variável, região variável homólogo pode contribuir para o enrolamento e / ou estabilidade da região variável de ligação, mas não contribui significativamente para a ligação do próprio antígeno.

[00185] Tal como aqui utilizado, de ligação ao antígeno refere-se à capacidade ligação típico de um anticorpo para o seu antígeno. A ligação de um anticorpo a um antígeno pode ser avaliada de várias maneiras. Uma maneira é a incubar o anticorpo com o antígeno (de preferência células que expressam o antígeno), remover o anticorpo não ligado (de preferência, por um passo de lavagem) e a detecção de anticorpo ligado por meio de um anticorpo marcado que se liga ao anticorpo ligado.

[00186] Ligação ao antígeno a um anticorpo é tipicamente mediada através das regiões determinantes de complementaridade (CDR) do anticorpo e a estrutura específica tridimensional de ambos o antígeno e o domínio variável permitindo que estas duas estruturas para se ligarem em conjunto com precisão (uma interação semelhante a uma fechadura e chave), em oposição a colagem aleatória, não específica de proteínas. Como um anticorpo tipicamente reconhece parte de um antígeno chamado o epítopo de um antígeno, e, como tal epítopo pode estar presente em outros compostos, bem como, anticorpos de acordo com a presente invenção pode reconhecer outras proteínas, bem como, se tais outros compostos contêm o mesmo epítopo. Assim, o termo "ligação" não exclui a ligação dos anticorpos a uma outra proteína ou proteína (s) que contêm o mesmo epítopo. Tal outra proteína (s) não é de preferência uma proteína humana.

[00187] Um anticorpo normalmente não se liga a outras proteínas do que a proteína alvo especificado na membrana de células em um post-natal, de preferência, humano adulto.

[00188] Um domínio variável de um anticorpo, ou uma variante do mesmo da invenção que pode se ligar uma parte extracelular de um membro da liga da família CD28 de membro especificado e, sob condições de outro modo idênticas, pelo menos 100 vezes mais baixa para a parte extracelular de um outro membro da família CD28 da mesma espécie. Por exemplo, um domínio variável de um anticorpo ou uma sua variante que se liga PD-l1 se liga a DP-1 e, sob condições de outro modo idênticas, pelo menos, um de 100 vezes mais baixa para o CD28, CTLA-4, ICOS, BTLA, NKp30 e TMIGD2 da mesma espécie. Claro que, quando um anticorpo ou uma sua variante destina- se a ligar-se a dois ou mais membros da família, a ligação para os dois ou mais membros pode ser essencialmente o mesmo. Na presente invenção prefere-se que os anticorpos se ligam a cada respectivas apenas um membro de um membro da família CD28. Considerando-se que o CD28-família é uma família de moléculas da superfície das células, a ligação é tipicamente avaliada em células que expressam um membro em uma superfície celular.

[00189] Um domínio variável de um anticorpo, ou uma variante do mesmo da invenção que pode se ligar uma parte extracelular de um membro da família B7 ou TNFRSFl14 liga-se a molécula especificado e, sob condições de outro modo idênticas, pelo menos 100 vezes mais baixa para a parte extracelular de um outro membro da família B7 ou TNFRSF14 das mesmas espécies. Por exemplo, um domínio variável de um anticorpo ou uma sua variante que se liga PD-Ll liga-se a

DP-L1 e, sob condições de outro modo idênticas, pelo menos, um de 100 vezes inferior ao CD80, CD86, ICOSL, PD-L2, B7 - H3, H4-B7, B7I-H6 e H7-B7 das mesmas espécies. Claro que, quando um anticorpo ou uma sua variante destina-se a ligar- se a dois ou mais membros da família, a ligação para os dois ou mais membros pode ser essencialmente o mesmo. Na presente invenção prefere-se que os anticorpos se ligam a cada respectivas apenas um membro de um membro da família B7 ou TNFRSF14. Considerando que o B7-família é uma família de moléculas da superfície das células, a ligação é tipicamente avaliada em células que expressam um membro em uma superfície celular.

[00190] Um membro da família CD28 de ligação de domínio variável de um anticorpo ou uma sua variante tal como aqui descrito e que bloqueia a ligação do membro a um ou mais dos seus pares de ligação; inibe uma atividade biológica que, de outro modo ser exibido por uma célula que compreende o membro quando ligados ao parceiro de ligação mencionada. Um anticorpo compreendendo o referido domínio variável possui a mesma atividade em tipo e não necessariamente em quantidade.

[00191] Um membro da família B7 ou TNFRSF14 ligação de domínio variável de um anticorpo ou uma sua variante tal como aqui descrito e que bloqueia a ligação do membro ou TNFRSFl14 para um ou mais dos seus pares de ligação; tipicamente inibe uma atividade biológica que, de outro modo ser exibido por uma célula que compreende o membro ou TNFRSF14 quando ligado ao parceiro de ligação mencionada. Um anticorpo compreendendo o referido domínio variável possui a mesma atividade em tipo e não necessariamente em quantidade.

[00192] Um anticorpo que compreende um domínio variável que pode se ligar uma parte extracelular de um membro da família CD28 e um domínio variável que pode ligar- se um parceiro de ligação do mesmo, selecionado a partir da família B7 ou TNFRSF14 e em que ambos os domínios variáveis não bloquear a ligação do membro da família CD28 ao referido

[00193] parceiro de ligação; tipicamente não inibe uma atividade biológica que, de outro modo ser exibido por uma célula que compreende o membro da família CD28 ou a um membro da família B7 ou TNFRSF14 quando ligados ao parceiro de ligação mencionada.

[00194] O termo "anticorpo" tal como aqui utilizado, significa uma molécula proteica, de preferência pertencentes à classe de imunoglobulinas de proteínas, contendo um ou mais domínios variáveis que se ligam a um epítopo num antígeno, em que esses domínios são derivados de ou homologia da sequência de partes com o domínio variável de um anticorpo. Os anticorpos para utilização terapêutica são preferivelmente tão próximos de anticorpos naturais do sujeito a ser tratado quanto possível (por exemplo anticorpos humanos para sujeitos humanos). A ligação do anticorpo pode ser expressa em termos de especificidade e afinidade. Os determina especificidade que o antígeno ou epítopo está especificamente ligada pelo domínio de ligação. A afinidade é uma medida para a resistência de ligação a um antígeno ou epítopo específico. Os anticorpos, tais como os anticorpos biespecíficos da presente invenção compreendem,

tipicamente, os domínios constantes (parte Fc) de um anticorpo natural, o qual pode ser manipulado como descrito aqui noutro local, por exemplo, para reduzir a ADCC e / ou atividade CDC. Um anticorpo da presente invenção é tipicamente um anticorpo de comprimento completo biespecífico, preferencialmente da subclasse de IgG humana.

[00195] Os termos 'domínio variável', 'de VH / VL par', 'de VH / VL' são aqui utilizados indiferentemente. Um domínio variável é composto de região variável de uma cadeia pesada e uma região variável de uma cadeia leve. A região variável de uma cadeia pesada é tipicamente formada por uma região VDJ rearranjada. Uma região variável de uma cadeia leve está normalmente formada por uma região VJ rearranjados. As regiões VDJ / VJ pode agora também ser produzido artificialmente utilizando por exemplo a grande quantidade informação de sequência que é disponível de anticorpos funcionais.

[00196] Um anticorpo da invenção é preferencialmente um anticorpo "de comprimento total". O termo 'comprimento total' de acordo com a invenção é definida como compreendendo um anticorpo essencialmente completa, sem um ou mais artificialmente porções adicionadas que um tamanho de maior do que 20 resíduos de aminoácido, tais como por locais de exemplo adicionais ligação de antígeno ou locais de ativação adicionais ou ligantes adicionais ou porções de ligação de ligantes adicionais. Um anticorpo comprimento calmaria, no entanto, não tem necessariamente todas funções de um anticorpo intacto. Para evitar dúvidas, um anticorpo de comprimento completo contém duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. Cada cadeia contém constante (C) e regiões variáveis (V), que pode ser dividido em domínios designados CHI, CH2, CH3, VH para a cadeia pesada, e CL, VL da cadeia leve. Os domínios das cadeias pesadas estão de preferência presentes na ordem de um anticorpo natural (VH-CH1-CH2-CH3, o que significa que o domínio VH está adjacente ao domínio CHI, seguido por um domínio CH2 e, subsequentemente, seguida por um domínio CH3) . Os domínios das cadeias leves estão também de preferência presentes no fim de um anticorpo natural (VL-CL: o que significa que o domínio VL é adjacente ao domínio CL). Um anticorpo se liga ao antígeno através dos domínios variáveis contidas na porção fragmento Fab. O anticorpo pode interagir com moléculas e células do sistema imune através dos domínios constantes, sobretudo através da parcela Fe.

[00197] Em algumas concretizações, um anticorpo da presente invenção é uma IgG, de um modo preferido uma IgG de comprimento completo. Os anticorpos IgG de comprimento total são preferidos devido à sua meia-vida tipicamente favorável e o desejo de ficar o mais perto de moléculas inteiramente autólogas (humanos), por razões de imunogenicidade. Em algumas concretizações, um anticorpo da invenção é uma IgGl de comprimento completo, um de IgG2 de comprimento completo, um comprimento total de IgG3 ou um anticorpo IgG4 de comprimento total.

[00198] Os anticorpos de comprimento completo de acordo com os anticorpos invenção abrangem, em que as mutações podem estar presentes que fornecem as características desejadas ou são apenas alternativas para os da cadeia original. Tais mutações não deve ser deleções de porções substanciais de qualquer uma das regiões. No entanto, os anticorpos em que os resíduos de ácido de um ou vários aminoácidos são inseridos, deletados, substituidos ou uma combinação dos mesmos, sem alterar essencialmente as características do anticorpo resultante de ligação estão abrangidas no termo "anticorpo inteiro" antígeno. Por exemplo, um anticorpo de IgG pode ter 1-20 amino inserções de resíduos de ácido, substituições, deleções ou uma sua combinação, na região constante.

[00199] Um anticorpo ou uma sua variante da invenção é preferencialmente um anticorpo biespecífico ou uma sua variante. Em uma concretização preferida é um anticorpo IgG biespecífico com função efetora reduzida. Em uma concretização preferida, um anticorpo da presente invenção é um anticorpo de comprimento completo biespecífico. Um anticorpo da invenção é de preferência, um anticorpo de IgG de comprimento completo biespecífico, preferencialmente, mutado na regi CH2 / inferior dobradiça para reduzir a função efetora. IgGl que é mutado na regi CH2 / inferior dobradiça para reduzir a função efetora é favorecida com base no seu tempo de meia-vida em circulação no homem. A fim de evitar qualquer imunogenicidade em seres humanos, é preferível que o anticorpo biespecífico de acordo com a invenção é um anticorpo humano.

[00200] O termo 'biespecífico' (sl) significa que uma parte do anticorpo (como definido acima) se liga a um epítopo num antígeno ao passo que uma segunda parte se liga a um epítopo diferente em ambos o mesmo antígeno, ou um antígeno diferente. os diferentes epítopos estão tipicamente presentes em diferentes antígenos.

Os diferentes epítopos podem, no entanto, também estar presentes no mesmo antígeno.

De acordo com a presente invenção, os referidos primeiro e segundo antígenos s, de facto, duas proteínas diferentes.

Um anticorpo biespecífico preferido é um anticorpo que compreende partes de dois anticorpos monoclonais diferentes e, consequentemente, pode ligar-se a dois epítopos diferentes, de preferência em dois antígenos diferentes.

Dependente do nível de expressão, (sub) a localização celular e estequiometria dos dois antígenos reconhecidos por um anticorpo biespecífico, os dois braços Fab do anticorpo pode ou não se ligarem simultaneamente seu epítopo.

Um braço do anticorpo bi-específico, tipicamente, contém o domínio variável de um anticorpo e o outro braço contém o domínio variável de um outro anticorpo (isto é, um braço do anticorpo bi-específico é formada por uma cadeia pesada emparelhada com uma cadeia leve enquanto que o outro braço é formado por uma cadeia pesada diferente emparelhada com uma cadeia leve). As regiões variáveis da cadeia pesada do anticorpo biespecífico da presente invenção são tipicamente diferentes umas das outras, ao passo que as regiões variáveis da cadeia leve são de preferência o mesmo nos anticorpos biespecíficos da invenção.

Um anticorpo biespecífico, em que as diferentes regiões variáveis de cadeia pesada estão associadas com o mesmo ou um comum, região variável de cadeia leve também é referido como um anticorpo biespecífico com uma região variável de cadeia leve comum (CLCV). Prefere-se que a região constante de cadeia leve também é o mesmo.

Tais anticorpos biespecíficos são referidos como possuindo uma cadeia leve comum (CLC). É ainda proporcionado, por conseguinte, um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção, em que ambos os braços compreendem uma cadeia leve comum.

[00201] os anticorpos biespecíficos como aqui descritas compreendem preferivelmente um domínio variável de cadeia leve comum, de um modo preferido uma cadeia de luz comum. O termo 'cadeia de luz comum de acordo com a invenção refere-se a cadeias leves que podem ser iguais ou têm algumas diferenças de sequência de aminoácido, enquanto a especificidade ligação do anticorpo de comprimento completo não é afetada. É por exemplo possível, no escopo da definição de cadeias leves comuns, tal como aqui utilizada, para preparar ou encontrar cadeias leves que não são idênticos mas ainda funcionalmente equivalente, por exemplo, por introdução e testar as alterações de aminoácidos conservativas, muda de aminoácidos em regiões que não ou só contribuem em parte para especificidade ligação quando combinado com a cadeia pesada, e assim por diante. Os termos 'cadeia comum light', 'LC comum,' cLC, 'cadeia leve único" com ou sem a adição do termo 'rearranjado' são todos utilizados aqui indiferentemente. Os termos 'região de cadeia leve variável comum', 'VL comum', 'LCV comum', 'CLCV', 'único VL' com ou sem a adição do termo 'rearranjado' são todos utilizados aqui indiferentemente. É um aspecto preferido da presente invenção, que um anticorpo biespecífico tem uma cadeia comum luz (região variável) que pode combinar-se com pelo menos dois, e de preferência uma pluralidade cadeias pesadas (regiões variáveis) de especificidade ligação diferente para formar anticorpos com funcional domínios de ligação de antígeno (documento WO2004 / 009618, WO2009 / 157771, Merchant et al., 1998 e Nissim et al., 1994). A cadeia leve comum (região variável) é de preferência uma cadeia leve humana (região variável). Uma cadeia leve comum (região variável) tem de preferência uma sequência da linha germinativa. A sequência da linha germinal preferido é uma região variável da cadeia leve que é frequentemente usado no repertório humano e tem boa estabilidade termodinâmica, rendimento e solubilidade. Uma linha germinal de cadeia leve preferida é Ol2. Uma cadeia leve comum é, de preferência a rearranjada de linha germinal humana de cadeia leve kapa IgVkl1-39 * 01 / IGJkKk1 * 01 (Figura 1A). A região variável de cadeia leve comum é, de preferência a região variável da rearranjada de linha germinal humana de cadeia leve kapa IgvVkl1-39 * 01 / * 01 IGJKkl. Uma cadeia leve comum compreende preferência uma região variável da cadeia leve, conforme ilustrado na figura 1B, 1D ou com 0-5 aminoácidos inserções, deleções, substituições, adições ou uma combinação dos mesmos. A luz comum compreende ainda, preferencialmente, uma região constante de cadeia leve, de preferência, uma região constante da cadeia leve kapa. Um ácido nucleico que codifica a cadeia leve comum pode ser cod optimizado para o sistema celular utilizado para expressar a proteína de cadeia leve comum. O ácido nucleico que codifica pode desviar-se de uma linha de gene de sequência de ácido nucleico.

[00202] Em uma concretização preferida, a cadeia leve compreende uma região de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de um segmento Ol2 / IgVkl-39 * gene 01, como representado na figura 1A com 0-10, de preferência 0-5 inserções, deleções, substituições, adições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos. A frase "Ol2 cadeia leve" será utilizado ao longo da especificação, como abreviatura de "uma cadeia leve compreendendo uma região variávelda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de um segmento O12 / IgVkl-39 * gene 01, como representado na figura 1A com 0- . 10, de preferência 0-5 aminoácidos inserções, deleções, substituições, adições ou uma combinação dos mesmos IgVkl-39 é a abreviatura de imunoglobulina variável Kappa 1-39 gene O gene também é conhecido como imunoglobulina Kapa variável 1-39;. IGKV139; IGKV1 -39; Ol2a ou O1l2.

[00203] Ids externos para o gene são HGNC: 5740; Gene Entrez: 28930; Ensembl: ENSGOO0000242371. Uma sequência de aminoácidos preferida para IgVkl-39 é dado na figura 1E. Esta relaciona a sequência da região do V-. A região V pode ser combinado com um de cinco J-regiões. A Figura 1B e 1D descrevem duas sequências preferidas para IgQgVkl-39 em combinação com um J-região. As sequências unidas são indicadas como IGKV1-39 / JKl e IGKV1I-39 / jk5; nomes alternativos são IgVkl1-39 * 01 / IGJKk1l * Ol ou IgVkl1-39 * O1 / IGJIK5 * Ol (nomenclatura de acordo com a Worldwide Web banco de dados IMGT em imgt.org).

[00204] Prefere-se que o Ol2 / IgVkl-39 * Ol compreendendo a região variável da cadeia leve é uma sequência da linha germinal. É ainda preferido que o IGJk1 * Ol ou / IGJK5 * Ol compreendendo a região variável da cadeia leve é uma sequência da linha germinal. Em uma concretização preferida, o IGKV1-39 / JK1 ou IGKV1-39 regiões / jk5 variáveis de cadeia leve são sequências de linha germinal.

[00205] Em uma concretização preferida, a região variável de cadeia leve compreende uma linha germinal O12 / Igvkl-39 * Ol. Em uma concretização preferida, a região variável de cadeia leve compreende a cadeia leve kapa IgVKl1- 39 * 01 / * 01 IGIKl ou IgvVkl1-39 * 01 / * Ol 1GJK5. Em uma concretização preferida um IgvVK1-39 * 01 / * Ol IGJKkl. A região variável de cadeia leve de preferência compreende uma linha germinal de cadeia leve kapa IgVkl1-39 * 01 / * 01 IGJKk1 ou kappa da linha germinal de cadeia leve IgVkl1-39 * 01 / IGJIK5 * 01, de preferência uma linha germinal IgVkl-39 * O1 / * 01 IGJk1l.

[00206] As células B maduras que produzem um anticorpo com uma cadeia leve de 012 frequentemente produzir uma cadeia leve que tem um ou mais sofrido mutações em relação à sequência da linha germinativa, ou seja, a sequência normal em células não linfoides do organismo. O processo que é responsável por estas mutações é muitas vezes referida como somática (hiper) mutação. A cadeia leve resultante é referida como uma afinidade maturada de cadeia leve. Tais cadeias leves, quando derivadas de uma sequência de linha germinal são 012 O12 cadeias leves derivadas. Nesta especificação, a frase "Ol12 cadeias leves" incluirá Ol2 derivados cadeias leves, as mutações que são introduzidas pela lata de mutação somática, claro, também ser introduzido artificialmente no laboratório. No laboratório, também outras mutações podem ser introduzidas, sem afetar as propriedades da cadeia leve em tipo e não necessariamente em quantidade.

A cadeia leve é, pelo menos, uma cadeia leve de 012 se por compreender uma sequência como representado na figura 1A, figura 1B; figura 1D ou figura 1E, com 0-10, preferivelmente 0-5 aminoácidos inserções, deleções, substituições, adições ou uma combinação dos mesmos.

Em uma concretização preferida, a cadeia leve 012 é uma cadeia leve compreendendo uma sequência como representado na figura 1A; 1B; 1D ou IE com 0-9, 0-8, 0-7, 0-6, 0-5, 0-4 inserções, deleções, substituições de aminoácidos, adições ou uma combinação dos mesmos.

Em uma concretização preferida, a cadeia leve 012 é uma cadeia leve compreendendo uma sequência como representado na figura 1A, figura IB; figura ID ou IE figura com 0-5, preferencialmente 0-4, mais preferencialmente 0-3 aminoácidos inserções deleções, substituições, adições ou uma combinação dos mesmos.

Em uma concretização preferida, a cadeia leve 012 é uma cadeia leve compreendendo uma sequência como representado na figura 1A, figura IB; figura 1D ou figura 1E, com 0-2, mais preferencialmente 0-1, o mais preferencialmente o aminoácido inserções, deleções, substituições, adições ou uma combinação dos mesmos.

Em uma concretização preferida, a cadeia leve 012 é uma cadeia leve compreendendo uma sequência como representado na figura 1A ou figura IB com o referido aminoácido inserções, deleções, substituições, adições ou uma combinação dos mesmos.

Em uma concretização preferida, a cadeia leve compreende a sequência da Figura 1A.

Em uma concretização preferida, a região variável de cadeia leve compreende a sequência da figura 1B.

[00207] A cadeia leve comum (região variável) pode ser uma cadeia leve lambda e este é, por conseguinte, também fornecida no contexto da invenção, no entanto, é preferida uma cadeia leve kapa. A parte constante de uma cadeia leve comum da invenção pode ser uma região constante de uma capa ou uma cadeia leve lambda. É de preferência uma região constante de uma cadeia leve capa, de preferência em que a referida cadeia leve comum é uma cadeia leve de linha germinal, de preferência, uma cadeia leve rearranjada de linha germinal kappa humana que compreende o segmento de gene IgVkl-39, mais preferencialmente a rearranjada de linha germinal humana de cadeia leve kapa IgVkl -39 * 01 / IGJkl * Ol (Figura 1). Os termos rearranjada de linha germinal humana de cadeia leve kapa IgvVkl1-39 * 01 / * 01 IGJIkl, IGKV1- 39 / 1GkJII, huVkl1-39 cadeia leve ou em curto huVk1-39, ou simplesmente 1-39 são usados alternadamente ao longo do pedido. Os peritos na arte reconhecerão que "comum" também se refere-se a equivalentes funcionais da cadeia leve do que a sequência de aminoácidos não for idêntica. Muitas variantes das ditas existir cadeia leve, em que as mutações (deleções, substituições, adições) estão presentes que não influenciam a formação de regiões de ligação funcionais.

[00208] IgvVkl1-39 é curto para Imunoglobulina Variável Kappa 1-39 Gene. O gene também é conhecido como imunoglobulina Kapa Variável 1-39; IGKV139; IGKV1-39; Ol2a ou 012. Ids externos para o gene são HGNC: 5740; Gene Entrez: 28930; ENSEMBL: ENSGOO0000242371. Uma sequência de aminoácidos preferida para IgVkl1-39 é dado na Figura 1. Esta lista a sequência da região V. A região V pode ser combinado com um de cinco J-regiões. A Figura l descreve duas sequências preferidas para IgVkl-39 em combinação com um J- região. As sequências unidas são indicados como IGKV1-39 / JKl e IGKV1-39 / jk5; nomes alternativos são IgVkl1-39 * O1 / IGJIK1 * 01 ou IgVkl1-39 * 01 / 1GJK5 * Ol (nomenclatura de acordo com a Worldwide Web banco de dados IMGT em imgt.org).

[00209] Uma região variável de cadeia leve comum é, de preferência ligada a uma região constante da cadeia leve kapa. Em uma concretização preferida, a região variável de cadeia leve compreende a cadeia leve kapa IgvVK1-39 * 01 / * 01 IGJIKl ou IgvVkl1-39 * 01 / * Ol IGJK5. Em uma concretização preferida um IgVkl1-39 * 01 / * 01 IGJk1l.

[00210] Uma célula que produz uma cadeia de luz comum pode produzir, por exemplo, da linha germinativa humana rearranjada da cadeia leve kappa IgVkl1-39 * 01 / IGJkK1 * O1 e uma cadeia leve compreendendo a região variável da cadeia leve mencionado fundido com uma região constante lambda. Sempre que seja feita referência aqui a uma sequência da linha germinativa, é preferível que a região variável é uma sequência da linha germinativa.

[00211] Os anticorpos biespecíficos ou as suas variantes, tal como descrito aqui de preferência, ter uma combinação de cadeia pesada da região variável / região variável de cadeia leve (VH / VL) que se liga uma parte extracelular de um membro da família CD28 e uma segunda combinação de VH / VL que se liga uma parte extracelular de um membro da família B7 ou TNFRSFlI4. Em uma concretização preferida, a VL na referida primeira combinação de VH / VL é semelhante ao VL na referida segunda combinação de VH / VL. Em uma concretização mais preferida, VLS nos primeiro e segundo combinações VH / VL são idênticos. Em uma concretização preferida, o anticorpo biespecífico é um anticorpo de comprimento completo que tem uma pesada / leve (H / L) combinação cadeia que liga uma parte extracelular de um membro da família CD28 e um H / L combinação cadeia que liga uma parte extracelular de um membro da família B7 ou TNFRSF14. Em uma concretização preferida, a cadeia leve, em que a referida primeira combinação H / cadeia L é semelhante ao da cadeia leve na referida segunda combinação cadeia H / L. Em uma concretização mais preferida, as cadeias leves nas primeira e segunda combinações de cadeias H / L são idênticas.

[00212] Vários métodos têm sido publicados para favorecer a produção do anticorpo biespecífico ou vice- versa, os anticorpos monoespecíficos. Na presente invenção prefere-se que a célula favorece a produção do anticorpo biespecífico através da produção dos seus respectivos anticorpos monoespecíficos. Tal é tipicamente conseguida por modificação da região constante das cadeias pesadas, tal que eles favorecem a heterodimerização (ou seja, a dimerização com a cadeia pesada da outra combinação de cadeia pesada / leve) ao longo de homodimerização. Em uma concretização preferida, o anticorpo biespecífico da presente invenção compreende duas cadeias pesadas de imunoglobulina diferentes, com domínios de heterodimerização compatíveis Vários domínios de heterodimerização compatíveis têm sido descritos na técnica. Os domínios de heterodimerização compatíveis são domínios de heterodimerização CH3 de cadeia pesada de imunoglobulina de preferência compatíveis. Quando domínios CHS tipo selvagem são usados, a co-expressão de duas cadeias pesadas diferentes (A e B) e uma cadeia leve comum vai resultar em três espécies diferentes de anticorpos AA, AB e BB. AA e BB são designações para os dois específica mono-, os anticorpos bivalentes, e AB é uma designação para o anticorpo biespecífico. Para aumentar a percentagem do produto biespecífico desejado de engenharia (AB) HSC pode ser utilizada, ou em outras palavras, pode-se usar cadeias pesadas com domínios de dimerização compatíveis, como a seguir definido.

[00213] O estado da técnica descreve várias maneiras em que podem ser alcançados, tais heterodimerização de cadeias pesadas. Uma maneira é a de gerar 'botão no furo" anticorpos biespecíficos. Veja Wo01998 / 050431 (Arathoon et al.).

[00214] 'Domínios de dimerização heterocompatíveis' O termo tal como aqui utilizado refere-se a domínios de proteínas que são modificadas de tal modo que domínio modificado A 'serão preferencialmente formar heterodímeros com engenharia domínio B' e vice-versa, homo-dimerização entre A'-A 'e B' -B' é diminuída.

[00215] No Documento US13 / 866747 (agora concedida como US 9,248,181), USl14 / 081848 (agora concedida como US 9,358,286); WO2013 / 157953 e PCT/NL2013/050294 (publicado como MWO2013/157954); aqui incorporada por referência métodos e meios são revelados para a produção de anticorpos biespecíficos utilizando domínios de heterodimerização compatíveis. Estes meios e métodos podem também ser favoravelmente empregados na presente invenção. Especificamente, um anticorpo biespecífico da presente invenção compreende, de preferência mutações para produzir moléculas de IgG de comprimento completo, essencialmente, apenas biespecíficos.

[00216] As mutações preferidas são a substituições de aminoácidos L351K e T366K (numeração UE) no primeiro domínio CH3 (a 'KK-variante' da cadeia pesada) e as substituições de aminoácidos L351D e L368E no segundo domínio (a 'DE-variante"' da cadeia pesada), ou vice-versa. Foi previamente demonstrado nas patentes US 9,248,181 e US 9,358,286, bem como no pedido de patente internacional WO2013/157954, que DE-variante e KK-variante preferencialmente emparelham para formar heterodímeros (as chamadas moléculas biespecíficas “DEKK”). Homodimerização de cadeias pesadas DE-variante (homodímeros DEDE) dificilmente ocorre devido à repulsão entre os resíduos carregados na interface do CH3-CH 3 entre as cadeias pesadas idênticas.

[00217] Os anticorpos biespecíficos podem ser gerados por (transitória) transfecção de plasmídeo que codifica uma cadeia leve e duas cadeias pesadas diferentes que são CHS manipulada para assegurar eficiente heterodimerização e à formação de anticorpos biespecíficos. A produção dessas cadeias numa única ligação celular para a formação de anticorpos biespecíficos favorecida através da formação de anticorpos monoespecíficos.

[00218] É ainda proporcionado, por conseguinte, um método para a produção de um anticorpo ou variante, de acordo com a invenção a partir de uma única célula, em que o referido anticorpo ou sua variante compreende dois domínios CHS que são capazes de formar uma interface, o referido método que compreende o fornecimento:

[00219] - uma célula tendo a) uma primeira molécula de ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de IgG que reconhece especificamente uma parte extracelular da DP-l1, e que contém um primeiro domínio CH3, e b) uma segunda sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de IgG que especificamente reconhece uma parte extracelular da DP-Ll, e que contém um segundo domínio CH3, em que as referidas sequências de ácidos nucleicos são fornecidos com mutações para emparelhamento preferencial dos referidos domínios la e 2a CH3, o referido método compreendendo ainda o passo de cultivar a referida célula e permitindo expressão das referidas sequências de ácidos nucleicos e a colheita do referido anticorpo ou uma sua variante a partir da cultura. Em algumas concretizações preferidas, a referida célula tem uma terceira sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia leve comum, de preferência a rearranjada de linha germinal humana de cadeia leve kapa IgVvVK1-39*01/*01 IGJk1l.

[00220] mutações preferidos para produzir moléculas de comprimento IgGl completa, essencialmente, apenas biespecíficos são substituições de aminoácidos nas posições 351 e 366, por exemplo, L351K e T366K (numeração de acordo com a numeração UE) no primeiro domínio CH3 (a 'KK-variante"' da cadeia pesada) e de aminoácidos substituições nas posições 351 e 368, por exemplo, L351D e L368E no segundo domínio CH3 (a 'dE-variante' da cadeia pesada), ou vice-versa. É ainda proporcionado, por conseguinte, um método de acordo com a invenção para a produção de um anticorpo ou variante de acordo com à invenção a partir de uma única célula, em que o referido primeiro domínio CH3 compreende as substituições de aminoácidos L351K e T366K (numeração de acordo com a numeração UE) e em que o referido segundo domínio CH3 compreende as substituições de aminoácidos L351D e L368E (numeração de acordo com a numeração UE), o referido método compreendendo ainda o passo de cultivar a referida célula e permitindo a expressão das referidas sequências de ácidos nucleicos e a colheita do referido anticorpo ou uma sua variante a partir da cultura.

[00221] Em uma concretização, combinação da cadeia pesada / cadeia leve que compreende o domínio variável que se liga PD-l, compreende uma variante DE da cadeia pesada. Nesta concretização combinação da cadeia pesada / cadeia leve que compreende o domínio variável que pode se ligar a um antígeno que não seja PD-l compreende uma variante de KK da cadeia pesada.

[00222] As funções efetoras medeiam da região Fc de um anticorpo, tais como citotoxicida dependente do complemento (CDC), citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP). Dependendo do anticorpo terapêutico ou aplicação proteína de fus Fc, pode ser desejado reduzir ou aumentar a função efetora ou. funções efetoras reduzidas são preferidos na presente invenção. função efetora reduzida pode ser desejado quando uma resposta imune está a ser ativado, reforçada ou estimulada como em algumas das concretizações da invenção. Os anticorpos com funções efetoras reduzidas podem ser usadas para as moléculas da superfície das células-alvo de células do sistema imunológico, entre outros.

[00223] A ligação de IgG aos FcyRs ou Cla foi verificado a necessidade resíduos localizados na região de chRNAeira e o domínio CH2. Duas regiões do domínio CH2 (Figura 2D) são relevantes para FcyRs e ligação de Cla. Substituições em IgGl humana dos resíduos nas posições 233- 236 IgG2 e IgG4 resíduos nas posições 327, 330 e 331 foi mostrado para reduzir significativamente a ADCC e CDC (Armor et ai, 1999 Eur J Immunol 29 (8):2613-24 ; Shields et al

2001. J Biol Chem 276 (9): 6591-604). Além disso, Idusogie et al. demonstraram que a substituição por alanina nas posições diferentes, incluindo K322, reduziu significativamente a ativação do complemento (Idusogie et ai, 2000. J Immunol 164 (8): 4178-84).

[00224] Devido às suas funções efetoras reduzidas, anticorpos IgG4 representam uma subclasse de IgG para bloqueio do receptor sem a depleção de células. IgG4 moléculas podem trocar meias moléculas em um processo dinâmico denominado troca Fab-braço. Este fenómeno pode ocorrer entre os anticorpos terapêuticos e IgG4 endógeno. A mutação S228P é um exemplo de uma mutação que garante a sua capacidade reduzida para troca de Fab-braço. (.. Labrijn et al, 2009. Nat Biotechnol 27 (8): 767-71).

[00225] Os anticorpos com funções efetoras reduzidas são de preferência anticorpos IgG que compreendem uma região modificada CH2 / inferior da dobradiça, por exemplo, para reduzir a interação-receptor de Fc ou para reduzir a ligação a Clq. Em algumas concretizações o anticorpo da invenção é um anticorpo de IgG com uma CH2 mutante e / ou inferior domínio chRNAeira tal que a interação do anticorpo biespecífico de IgG a um receptor de Fc-gama é reduzida. Um anticorpo que compreende uma regi CH2 mutante é de preferência um anticorpo IgGl. Talum mutante de IgGl CH2 e / ou inferior do domínio de chRNAeira compreendem, de preferência uma substituição de aminoácido na posição 235 e / ou 236 (numeração da UE), de preferência, uma substituição L235G e / ou substituição G236R (Figura 2E).

[00226] Uma variante de um anticorpo ou anticorpo biespecífico, tal como aqui descrita, pode compreender uma parte funcional, derivado e / ou análogo do anticorpo ou o anticorpo biespecífico. Uma variante normalmente mantém a especificidade ligação do anticorpo, tal como um anticorpo biespecífico. Uma variante normalmente manter a especificidade ligação do anticorpo, tal como um anticorpo biespecífico. Uma variante é de preferência uma parte funcional ou derivado de um anticorpo ou anticorpo biespecífico, tal como aqui descrito. É de preferência uma parte funcional.

[00227] A especificidade ligação é definido pela capacidade para se ligar a uma parte extracelular de um membro da família CD28 e uma parte extracelular de um membro da família B7, ou TNFRSFl14, em que os elementos são os pares de ligação (par ou seja, um receptor-ligante).

[00228] Uma parte funcional de um anticorpo, ou de preferência uma parte funcional de um anticorpo biespecífico, tal como aqui descrito é uma parte que compreende um domínio variável que se liga uma parte extracelular de um membro da família CD28, de preferência, PD-l, e um domínio variável que se liga uma parte extracelular de um membro da família B7, ou TNFRSF14, de preferência PD-Ll. Uma parte adequada é, por exemplo, um fragmento F (ab?) 2 fragmento como criado por digestão de um anticorpo biespecífico com pepsina. Outras partes que compreende os referidos domínios variáveis estão incluídos no presente invenção.

[00229] Um derivado funcional de um anticorpo, ou de preferência um derivado funcional de um anticorpo biespecífico, tal como aqui descrito é uma proteína que compreende um domínio variável que se liga uma parte extracelular de um membro da família CD28, de preferência, PD-l, e um domínio variável que se liga uma parte extracelular de um membro da família B7 ou TNFRSFl14, de preferência PD-Ll, que estão ligados por uma região de ligação. Os domínios variáveis podem ser domínios varieis como tal, ou fragmentos Fab ou domínio variável como moléculas tais como fragmentos Fv de cadeia única compreendendo um VH e um VL ligados por via de um ligante. Outros exemplos de domínio variável como moléculas são assim chamado fragmento de anticorpo de domínio único. Um fragmento de anticorpo de domínio único (sdAb) é um fragmento de anticorpo com um único monomélica

[00230] região variável do anticorpo. Como um anticorpo inteiro, ele é capaz de se ligar seletivamente a um antígeno específico. Com um peso molecular de apenas 12-

kDa, fragmentos de anticorpos de domínio único são muito menores do que os anticorpos comuns (150-160 kDa) que são compostos por duas cadeias de proteínas pesadas e duas cadeias leves, e mesmo menor do que os fragmentos Fab (- 50 kDa, uma cadeia leve e meia uma cadeia pesada) e fragmentos variáveis de cadeia simples (- 25 kDa, ambas as regiões variáveis, uma a partir de uma luz e um a partir de uma cadeia pesada). Os anticorpos de domínio único por si sós não são muito menores do que os anticorpos normais (sendo tipicamente 90-100kDa). Os fragmentos de anticorpo de domínio único são na sua maioria por engenharia de anticorpos de cadeias pesadas encontrado no camelídeos; estes são chamados fragmentos VHH (Nanocorpos *). Alguns peixes também têm de cadeia pesada apenas anticorpos (Ignar, 'imunoglobulina novo receptor de antígeno'), a partir do qual podem ser obtidos fragmentos de anticorpos de domínio único denominados fragmentos VNAR.

Uma abordagem alternativa é dividir os domínios variáveis de diméricos comum imunoglobulina G (IgG) a partir de seres humanos ou de ratos em monómeros.

Embora a maioria das pesquisas em anticorpos de domínio único baseia-se atualmente domínios variáveis da cadeia pesada, nanocorpos derivados de cadeias leves, também têm sido mostrados ligar-se especificamente a epítopos alvo.

Outros exemplos não limitativos de domínio variável semelhante a moléculas são VHH, os anticorpos humanos de domínio (dAb) e Unicorpos. partes funcionais preferidos são peças que compreendem domínios variáveis que compreendem uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve.

Exemplos de tais domínios variáveis não-

limitativos são F(ab)-fragmentos e fragmentos Fv de cadeia simples.

[00231] os formatos biespecíficos para ligação variável domínio (-like) são, por exemplo albumina de soro humano (HSA) ligado a dois scFv diferentes; biespecífico mini- anticorpos que compreendem dois scFv diferentes ligados entre si através de um motivos de dimerização ou estruturas secundárias auto-associar, tais como feixes helicoidais ou hélices enroladas para provocar a dimerização dos fragmentos scFv (Morrison (2007) Nat Biotechnol. 25: 1233-34). Exemplos de ligantes adequados HSA e método para o acoplamento de scFv para o ligante são descritos no WO2009 / 126920.

[00232] Um análogo funcional de um anticorpo, ou de preferência um análogo funcional de um anticorpo biespecífico, tal como aqui descrito é uma molécula que compreende um local de ligação para uma parte extracelular de um membro da família CD28, de preferência, PD-l, e o sítio de ligação para um extracelular parte de um membro da família B7 ou TNFRSFl4, de preferência PD-Ll. Um derivado funcional pode ser um anticorpo mimético, um polipeptídeo, um aptâmero ou uma combinação dos mesmos. Estas proteínas ou aptâmeros tipicamente ligam-se a um alvo. A proteína da presente invenção liga-se a dois ou mais alvos. É para ser entendido que qualquer combinação destes anticorpos, compostos mimicos de anticorpos, polipeptídeos e aptâmeros podem ser ligados entre si por métodos conhecidos na arte. Por exemplo, em algumas concretizações a molécula de ligação da invenção é um conjugado ou uma proteína de fusão. Para os anticorpos a tecnologia de produção de anticorpos multi-específicos progrediu para incluir também anticorpos biespecificos que possuem a mesma estrutura geral de um anticorpo mono- específico normal, mas em que os dois braços de cada um o anticorpo se ligar a um alvo diferente.

[00233] Um mimético de anticorpo é um polipeptídeo que, como os anticorpos, se pode ligar especificamente um antígeno, mas que não está estruturalmente relacionada com os anticorpos. mimicos de anticorpos são geralmente peptídeos artificiais ou proteínas com uma massa molar de cerca de 3 a 20 kDa. vantagens comuns mais anticorpos são melhor solubilidade, a penetração de tecidos, estabilidade no sentido de calor e enzimas, e os custos de produção relativamente baixos. exemplos de miméticos de anticorpos não limitativos são moléculas affibody (tipicamente com base no domínio Z da proteína A); affilins (tipicamente à base de cristalino Gamma-B ou A ubiquitina); affimeros (normalmente baseado em cistatina); affitins (tipicamente à base de Sac7d de Sulfolobus acidocaldarius); alphabodies (normalmente baseado em tripla hélice enrolada bobina); anticalins (normalmente baseado em lipocalinas); avimers (Tipicamente com base em um de vários domínios de receptores de membrana); DARPins (normalmente baseado em ankyrin repetição motivo); fynomers (tipicamente à base de domínio SH3 de Fyn 7); Os peptídeos de domínio de Kunitz (tipicamente com base em vários domínios de Kunitz de inibidores de proteínases); e monocorpos (tipicamente, com base no tipo III domínio de fibronectina).

[00234] Monocorpos são proteínas de ligação sintéticas que são construídos utilizando um domínio de fibronectina de tipo III (FN3) como um andaime molecular. Monocorpos são alternativa simples e robusto para anticorpos para a criação de proteínas de ligação ao alvo. O termo "Monocorpo" foi cunhado em 1998 pelo grupo Koide, que publicou o primeiro trabalho que demonstra o conceito MonoBcorpo usando o domínio décimo FN3 de fibronectina humana.

[00235] Monocorpos e outros mimicos de anticorpos são tipicamente geradas a partir de bibliotecas combinatórias em que porções do andaime s diversificados usando exibição molecular e tecnologias de evoluo dirigida, tais como apresentação de fagos, exibição de RNAm e apresentação de superfície de levedura. Um grande número de compostos mimicos de anticorpos possuem elevada afinidade e elevada especificidade para os seus respectivos alvos.

[00236] Os aptâmeros são moléculas de oligonucleotídicas ou de peptídeos que se ligam a uma molécula alvo específica. Aptâmeros são geralmente criados selecionando-os a partir de uma grande grupo sequência aleatória, mas aptâmeros naturais também existem em riboswitches. Aptâmeros pode ser usado tanto para fins clínicos pesquisa básica e como macromoléculas.

[00237] Tal como aqui utilizado, o termo "conjugado" refere-se a duas ou mais moléculas que foram unidos de modo covalente, opcionalmente, por uma região de ligação também referido como um ligante. Por exemplo, em algumas concretizações, um conjugado é uma primeira porção de proteína ou proteína não-unida a uma segunda proteína ou porção não proteico por uma região de ligação.

Por exemplo, em algumas concretizações de uma molécula de ligação da invenção compreende ou é constituído por dois ou mais anticorpos que foram ligados de forma covalente.

Um conjugado não se limita a uma primeira e segunda porção, mas em algumas concretizações pode também ter um terceiro, quarto ou mais porções unidas por outras regiões de ligação.

Tal como descrito em outro lugar neste pedido de patente, os exemplos de porções de proteína incluem, mas não estão limitados a: um polipeptídeo, um peptidomimético, ou um anticorpo (ou parte de anticorpo, derivado ou análogo, como descrito noutro local na aplicação). Exemplos de unidades não proteicos incluem, mas não estão limitados a aptâmeros.

Numerosos tipos de ligante pode ser utilizado, e o ligador vai ser selecionado para ser de acordo apropriado para os tipos de moléculas do conjugado e sobre as propriedades desejadas do ligante (Comprimento, flexibilidade, resistência à atividade proteínase e outras características semelhantes). Estes ligantes podem compreender nucleidos, polipeptídeos, ou um material sintético adequado.

Por exemplo, um ligante pode ser um ligante de peptídeo flexível.

Em certas concretizações, o ligante pode ser um ligante clivável, permitindo que as partes do conjugado a ser separados um do outro.

Em outras concretizações, um ligante de peptídeo pode ser um ligante helicoidal.

Vários exemplos e kits para proteínas que ligam e outras moléculas são conhecidas na arte.

Tal como aqui utilizado, o termo "proteína de fusão" refere-se a uma proteína que compreende dois ou mais polipeptídeos ou proteínas que foram unidasao nel do DNA por recombinação e são expressos em conjunto como um ico polipeptídeo.

Uma proteína de fus também pode compreender uma região de ligação de peptídeo também codificada pelo DNA e expressa juntamente com a proteína de fusão.

Um ligante peptídico que é parte de uma proteína de fusão pode ser concebida para ter características particulares, tais como a flexibilidade, a hidrofilicidade, resistência à proteínase, susceptibilidades ao corte, etc Todas estas propriedades podem ser concebidas dentro da sequência de DNA e métodos para a concepção de ligantes são bem conhecidas na arte.

Por exemplo, os anticorpos podem ser ligados entre si por métodos bem conhecidos na arte, e tal como aqui descrito, para formar anticorpos biespecíficos ou multi- direcionamento.

Além disso, os anticorpos biespecíficos podem ser construídos por vários métodos conhecidos na arte, por exemplo, utilizando tecnologia tal como BiClonicsO.

Um anticorpo monoclonal biespecífico (BsMAb, BsAb) compreende, tipicamente, os domínios de ligação de dois anticorpos monoclonais diferentes e, consequentemente, liga-se a dois epítopos diferentes. moléculas BiclonicsO, mas também outros anticorpos biespecíficos de IgG de comprimento completo tem duas especificidades de ligação ao antígeno diferentes codificadas por duas regiões variáveis diferentes de uma IgG molecide comprimento da folha de um Fab de um scFv.

Biclonics& pode ser produzido por co-transfecção de células individuais com construções genéticas que codificam para dois anticorpos diferentes de cadeia leve comum (CLC) como detalhado aqui noutro local. engenharia CH3 assegura eficiente heterodimerização e à formação de anticorpos biespecíficos essencialmente puros.

[00238] A invenção também proporciona um anticorpo ou variante de acordo com a invenção para utilização como um medicamento. É ainda proporcionado um anticorpo ou variante de acordo com a invenção para utilização num método para o tratamento de câncer ou de uma infecção com um agente patogénico, tal como um vírus ou parasita.

[00239] A invenção também fornece um método para o tratamento de um indivíduo que tem um câncer, o método compreendendo a administração de um anticorpo da invenção, tal como um anticorpo biespecífico, ou uma sua variante, tal como uma variante ao indivíduo em necessidade do mesmo. O indivíduo é de preferência um indivíduo que tem um câncer. Em algumas concretizações, o câncer é um câncer que compreende células de câncer que expressa a referida segunda proteína membranar. Em uma concretização preferida, o câncer é um câncer que compreende células de câncer que expressem um membro da família B7 ou TNFRSFl14. O câncer é de um modo preferido um adenocarcinoma. Os cânceres preferidos são o câncer colorretal; câncer de pâncreas; câncer de pulmão; câncer de mama; câncer de fígado;

[00240] câncer de próstata; câncer do ovário; câncer cervical; Câncer do endométrio; câncer da cabeça e pescoço; melanoma; câncer testicular; câncer urotelial; câncer renal; Câncer de estômago; ou câncer carcinóide. Em uma concretização preferida, o câncer é o câncer colorretal; câncer de pâncreas; câncer de pulmão; câncer de mama; câncer de fígado; câncer de próstata; câncer do ovário; câncer cervical; Câncer do endométrio; câncer da cabeça e pescoço;

ou melanoma. Em uma concretização particularmente preferida, o câncer é o câncer colorretal; câncer de pâncreas; câncer de pulmão; câncer de mama; ou câncer de fígado. Em uma concretização particularmente preferida, o câncer é um câncer gastrointestinal. Em uma concretização preferida, o câncer é o câncer colorretal. Nesta concretização, o anticorpo ou variante do mesmo é preferencialmente um anticorpo com um domínio variável que pode se ligar DP-l1 e um domínio variável que pode se ligar PD-Ll. Os domínios variáveis de um modo preferido cada um bloquear a ligação de DP-1 para PD-L1.

[00241] Proporciona-se adicionalmente um sistema ex vivo compreendendo um anticorpo ou uma sua variante de acordo com a invenção, e uma primeira célula e uma segunda célula. A primeira e segunda célula de preferência expressa respectivamente a referida primeira e a referida segunda proteína de membrana na membrana celular. O sistema é de preferência um sistema de célula adequado para a manutenção e /ouo crescimento da referida primeira célula. O sistema de célula é de preferência adequado para a manutenção e / ou o crescimento da referida segunda célula. Tal como o sistema é por exemplo adequado para aumentar e / ou células se multiplicam imunitárias que são dirigidas para as células aberrantes. Tais células imunes pode subsequentemente ser administrada a um indivíduo em necessidade do mesmo, por exemplo, um paciente com câncer. As células imunes compreendem, preferivelmente, uma célula T ou de células NK, de preferência, uma célula T citotóxica. As células imunes são de preferência autólogas para o indivíduo em necessidade do mesmo.

[00242] É ainda proporcionado um método para induzir e / ou estimular uma resposta imunitária num indivíduo contra uma célula aberrante em que o referido indivíduo, compreendendo o método proporcionar o referido indivíduo com um anticorpo ou uma sua variante da invenção. A célula aberrante é preferivelmente uma célula cancerosa, uma célula infectada com vírus, um parasita ou uma célula infectada parasita. Em uma concretização preferida, a célula é uma célula cancerosa ou uma célula neoplásica. Nesta concretização, o anticorpo ou variante do mesmo é preferencialmente um anticorpo com um domínio variável que pode se ligar DP-l1 e um domínio variável que pode se ligar PD-Ll1. Os domínios variáveis de um modo preferido cada um bloquear a ligação de DP-1 para PD-L1l.

[00243] Um neoplasma é um crescimento anormal de tecido e quando também forma uma massa é comumente referido como um tumor. Um neoplasma na presente invenção forma, tipicamente, uma massa. Uma célula neoplásica é uma célula de um neoplasma que se formou uma massa. A Organização Mundial da Saúde (OMS) classifica neoplasias em quatro grupos principais: neoplasias benignas, em neoplasias in situ, neoplasias malignas e neoplasias de comportamento incerto ou desconhecido. As neoplasias malignas são também conhecida simplesmente como cânceres.

[00244] Induzir e / ou estimular uma resposta imune engloba induzir uma resposta imunitária e aumentar uma resposta imune já existente. A resposta imunitária num indivíduo pode ser medida pela medição quando aplicável; a carga tumoral do indivíduo; a carga viral do indivíduo; a carga de parasitas do indivíduo.

[00245] A referida célula infectada com vírus é de preferência uma célula infectada com um vírus de imunodeficiência, um vírus do herpes, de preferência, um vírus do herpes simples, um varicela-zostervirus, um promotor de citomegalovus ou um vírus de Epstein-Barr, um vírus de papiloma, um vírus hepatis, de preferência uma hepatite a, B ou C vírus, um vírus do sarampo ou um adenovírus. O vírus é preferencialmente um vírus conhecido por ser capaz de persistir em um indivíduo. Infecções persistentes são caracterizadas como aqueles em que o vírus não é apagada, mas permanece em células específicas de indivíduos infectados. infecções persistentes podem envolver fases de ambos infecção silenciosa e produtivo sem matar rapidamente ou mesmo produzir danos excessivos das células hospedeiras. Persistente interação vírus-hospedeiro pode ser uma imagem latente, um crónica e / ou uma infecção lenta.

[00246] Uma célula infectada-parasita é uma célula que está infectada com um parasita intracelular. Tais parasitas são microorganismos parasitas que são capazes de crescer e reproduzir no interior das células de um hospedeiro. Alguns parasitas intracelulares também podem viver fora de uma célula. Tais parasitas são os chamados parasitas intracelulares facultativas. Exemplos não limitativos são Listeria monocytogenes, Legionella, certas espécies de mycobacterium e Cryptococcus neoformans. parasitas intracelulares preferidos são parasitas que não podem crescer as células hospedeiras de fora, os exemplos preferidos são os de Chlamydia, e espécies intimamente relacionadas, certas espécies de Mycobacterium, tais como Mycobacterium leprae, certos protozoários, incluindo: Apicomplexans (Plasmodium sPpPp, Toxoplasma gondii e Cryptosporidium parvum e tripanossomatideos.

[00247] Um anticorpo ou uma sua variante ou de um modo preferido um anticorpo biespecífico ou uma sua variante da presente invenção é de preferência utilizado em seres humanos. Para este fim um anticorpo ou variante do mesmo da presente invenção é preferencialmente um anticorpo humano ou humanizado. Tolerância de um ser humano à um polipeptídeo é governada por muitos aspectos diferentes. Imunidade, seja mediada, B-célula mediada por células T ou outro é uma das variáveis que são englobadas na tolerância do humano para um polipeptídeo. A região constante de um anticorpo biespecífico da presente invenção compreende, preferivelmente, uma região constante da cadeia pesada humana, que compreende preferência uma sequência como representado na figura 2; e uma região humana constante de cadeia leve, que compreende preferência uma sequência tal como representada na figura 1C. A região constante pode conter um ou mais, preferencialmente não mais do que 10, de preferência não mais do que 5 diferenças de ácido amino com a região constante de um anticorpo humano de ocorrência natural. Prefere-se que a parte constante é inteiramente derivado de um anticorpo humano de ocorrência natural. Vários anticorpos produzidos aqui são derivados de camundongos imunizados cadeia leve comum com o respectivo alvo, tal como descrito no WO2009 / 157771. Vários anticorpos aqui produzidos são derivados a partir de uma biblioteca de domínio variável de anticorpo humano. Como tal estes domínios variáveis são humanos. As regiões de CDR originais podem ser derivadas a partir de seres humanos, ser sintéticos ou derivados de um outro organismo. A região variável é, pelo menos, uma região variável humana quando se tem, com a excepção das regiões CDR, uma sequência de aminoácidos que é idêntica a uma sequência de aminoácidos da região variável de um anticorpo humano de ocorrência natural. Em tais concretizações, o VH de um domínio variável de um anticorpo que se liga a um membro da família CD28 ou membrana associada membro da família B7 ou TNFRSFl4, ou uma cadeia leve de um anticorpo da invenção pode conter um ou mais preferencialmente não mais do que 10, de um modo preferido não mais do que 5 diferenças de ácido amino com a região variável de um anticorpo humano de ocorrência natural, não contando possíveis diferenças na sequência de aminoácidos das regiões CDR. Tais mutações também ocorrer na natureza, no contexto de hipermutação somática.

[00248] Os anticorpos podem ser derivados de várias espécies animais, pelo menos no que diz respeito à região variável da cadeia pesada. É prática comum para humanizar tais regiões variáveis de cadeia pesada de murino, por exemplo. Existem várias maneiras pelas quais isto pode ser conseguido entre os quais há enxerto de CDR para uma região variável de cadeia pesada humana com um 3D-estrutura que coincide com a estrutura 3D da região variável da cadeia pesada de murino; de-imunização de região variável da cadeia pesada de murino, de preferência feito através da remoção conhecida ou suspeita de tipo T ou epítopos de células B- da região variável da cadeia pesada murina. A remoção é tipicamente por substituição de um ou mais dos aminoácidos no epítopo para o outro (tipicamente conservadora) aminoácido, de tal forma que a sequência do epítopo é modificado de tal modo que ele não é mais um epítopo de T ou de células-B.

[00249] regiões variáveis de cadeia pesada de murino de-imunizados são menos imunogênicos em humanos do que a região de origem murina pesada variável de cadeia. De preferência, uma região variável ou o domínio da invenção é ainda humanizados, tal como, por exemplo folheados. Ao utilizar técnicas de recobrimento, resíduos exteriores que são prontamente encontrados pelo sistema imune são seletivamente “substituídos com resíduos humanos para fornecer uma molécula híbrida que compreende quer uma superfície folheados fracamente imunogênica, ou substancialmente não imunogénicos. Um animal, tal como utilizado na invenção é preferencialmente um mamífero, mais preferivelmente um primata, com maior preferência um humano.

[00250] Um anticorpo ou anticorpo biespecífico ou uma sua variante de acordo com a invenção compreende, preferencialmente, uma região constante de um anticorpo humano. De acordo com diferenças nos seus domínios constantes de cadeia pesada, os anticorpos são agrupados em cinco classes ou isotipos: IgG, IgA, IgM, IgD e IgE. Estas classes ou isotipos de compreender pelo menos uma das referidas cadeias pesadas que é nomeado com uma letra grega correspondente. Em uma concretização preferida, a invenção proporciona um anticorpo de acordo com a invenção, em que a referida região constante é selecionada de entre o grupo de regiões constantes de IgG, isto é, selecionado de entre o grupo que consiste em IgGl, IgG2, Igoc3ê e IgG4. De preferência, a referida região constante é uma região constante de IgG4 ou de IgGl

[00251] (Figura 2), mais preferencialmente uma região constante de IgGl mutante. Alguma variação na região constante de IgGl ocorre na natureza e / ou é permitido sem alterar as propriedades imunológicas do anticorpo resultante. Tipicamente, entre cerca de 1-1l0inserções deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos são permitidos na região constante. A região constante pode ser mutada, tal como aqui indicado para permitir que a heterodimerização eficiente, para reduzir a função efetora ou por outras razões, incluindo a meia-vida, estabilidade e semelhantes.

[00252] métodos racionais evoluíram para minimizar o conteúdo de resíduos não humanos no contexto humano. Vários métodos estão disponíveis para enxertar com sucesso a propriedade ligação ao antígeno de um anticorpo para outro anticorpo. As propriedades de ligação de anticorpos podem desencadeia predominantemente na sequência exata da região do CDR3, muitas vezes suportada pela sequência das regiões CDR1 e CDR2 no domínio variável combinada com a estrutura adequada do domínio variável como um todo. Vários métodos estão presentemente disponíveis para enxertar regiões CDR num domínio variável adequado de outro anticorpo. Alguns destes métodos são revistos em JC Almagrol e J. Fransson

(2008) Frontiers in Bioscience 13, 1619-1633, que é aqui incluído por referência.

[00253] A região variável de cadeia leve de um domínio variável compreendendo uma sequência de cadeia pesada variável como representada na Figura 3 e / ou na Figura 13 é de preferência uma cadeia leve de linha germinal de ou baseado em Ol2, de preferência o rearranjada de linha germinal humana de cadeia leve kapa IgVkl1-39 * 01 / IGJkKk1 * 01l ou um fragmento ou um derivado funcional do mesmo (nomenclatura de acordo com a World Wide web no banco de dados IMGT imgt.org). Os termos rearranjada de linha germinal humana de cadeia leve kapa IgViil- 39 * 01 / * 01 IGJk1l, IGKV1-39 / IGKJl, huVkl1-39 cadeia leve ou em huVk1-39 curtos são utilizados. A cadeia leve pode ter 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou combinação dos mesmos. O mencionado 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições de aminoácidos são substituições de amino preferencialmente conservador de ácido, inserções, deleções substituições ou combinação dos mesmos não são, de preferência na região CDR3 da cadeia VL, de um modo preferido não em CDR1, CDR2 ou região CDR3 ou região FR4 da cadeia VL. Uma sequência preferida para a cadeia leve comum é representado na figura 1.

[00254] Estão disponíveis vários métodos para produzir anticorpos biespecíficos. Um método envolve a expressão de duas cadeias pesadas diferentes e duas cadeias leves diferentes em uma célula e o anticorpo recolha que é produzido pela célula. Anticorpo produzido desta maneira conterão tipicamente um conjunto de anticorpos com diferentes combinações de cadeias pesadas e leves, alguns dos quais são o anticorpo biespecífico desejado.

O anticorpo biespecífico pode posteriormente ser purificado a partir da colecção.

A proporção de biespecífico para outros anticorpos que são produzidos pela célula pode ser aumentado de diversos modos.

Em uma concretização preferida da invenção, a proporção é aumentada por não expressar duas cadeias leves diferentes, mas duas cadeias leves essencialmente idênticos na célula.

As duas cadeias leves essencialmente idênticos podem ser cadeias leves com essencialmente as mesmas regiões de cadeia leve variável e diferentes regiões constantes de cadeia leve ou, preferencialmente, duas regiões constantes da cadeia leve essencialmente idênticos.

Este conceito é na arte também referido como o método "cadeia leve comum"

Quando as cadeias leves essencialmente idênticos trabalhar em conjunto com as duas cadeias pesadas diferentes permitindo a formação de domínios variáveis com diferentes locais de ligação ao antígeno e as propriedades de ligação diferentes concomitantes, a razão de anticorpo biespecífico para outro anticorpo que é produzido pela célula é significativamente melhorado ao longo a expressão de duas cadeias leves essencialmente diferentes.

A razão de anticorpo biespecífico que é produzido pela célula pode ser ainda melhorada por estimulação do emparelhamento de duas cadeias pesadas diferentes uns com os outros através do emparelhamento de duas cadeias pesadas idênticas.

A arte descreve várias maneiras em que podem ser alcançados, tais heterodimerização de cadeias pesadas.

Um método preferido é descrito no pedido provisório dos Estados Unidos 61 / 635,935, o qual foi seguido pelo pedido US No. 13 / 866.747 e pedido PCT Nº PCT/NL2013/050294 (WO 2013/157954 Al), que são aqui incorporadas por referência.

Os métodos e meios são revelados para a produção de anticorpos biespecíficos (a partir de uma única célula), em que são proporcionados meios que favorecem a formação de anticorpos biespecificos através da formação de anticorpos monoespecíficos.

Estes métodos também podem ser favoravelmente empregues na presente invenção.

Assim, a invenção proporciona um método para a produção de um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção (a partir de uma única célula), em que o referido anticorpo biespecífico compreende dois domínios CHS que são capazes de formar uma interface, o referido método compreendendo proporcionar na referida célula a) um primeiro nucleico molécula de ácido que codifica um primeiro domínio CH3 compreendendo cadeia pesada, b) uma segunda molécula de ácido nucleico que codifica um segundo domínio CHS compreendendo cadeia pesada, em que as referidas moléculas de ácido nucleico são fornecidos com meios para emparelhamento preferencial do referido primeiro e segundo domínio CH3 que compreendem cadeias pesadas, o referido método compreendendo ainda o passo de cultivar a referida célula hospedeira e permitindo a expressão da referida duas moléculas de ácido nucleico e recolher o referido anticorpo biespecífico a partir da cultura.

As referidas primeira e segunda moléculas de ácido nucleico pode ser parte da mesma molécula de ácido, vector ou veículo de entrega de genes nucleico e pode ser integrada no mesmo local do genoma da célula hospedeira.

Alternativamente, as referidas primeira e segunda moléculas de ácido nucleico são fornecidos separadamente à referida célula. A célula hospedeira compreende, pelo menos, uma cadeia leve, e de preferência uma cadeia de luz comum.

[00255] Uma concretização preferida proporciona um método para a produção de um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção a partir de uma única célula, em que o referido anticorpo biespecífico compreende dois domínios CH3 que são capazes de formar uma interface, o referido método compreendendo o fornecimento de:

[00256] - uma célula tendo a) uma primeira molécula de ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada que compreende um local de ligação ao antígeno que pode se ligar a uma parte extracelular de um membro associado membrana da família CD28 e que contém um primeiro domínio CH3, e b) uma segunda molécula de ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada que compreende um local de ligação ao antígeno que pode se ligar a uma parte extracelular de um membro da membrana associada da família B7 ou TNFRSF14 e que contém um segundo domínio CH3, em que as referidas moléculas de ácido nucleico são fornecidos com meios para emparelhamento preferencial do referido primeiro e segundo domínios CH3,

[00257] o referido método compreendendo ainda a etapa de cultivar a referida célula e permitindo a expressão das proteínas codificadas pelas referidas duas moléculas de ácido nucleico e recolher o referido anticorpo de IgG biespecíficos a partir da cultura. Em uma concretização particularmente preferida, a referida célula tem também uma terceira molécula de ácido nucleico que codifica uma cadeia leve comum. As referidas primeira, segunda e terceira molécula de ácido nucleico pode ser parte da mesma molécula de ácido nucleico, vector ou veículo de entrega de genes e pode ser integrada no mesmo local do genoma da célula hospedeira. Em alternativa, o referido primeiro lugar, as moléculas de ácido nucleico, segundo e terceiro são fornecidos separadamente à referida célula. Uma cadeia leve comum preferida baseia-se em 012, de preferência, é a cadeia leve de linha germinal kappa humana rearranjada IgQVkl 39 * o1 / * IGJK1 01, como descrito acima. Meios para emparelhamento preferencial do referido primeiro e o referido segundo domínio CH3 são preferencialmente as mutações correspondentes no domínio CH3 da cadeia pesada de regiões de codificação. As mutações preferenciais para produzir essencialmente apenas os anticorpos biespecíficos são as substituições de aminoácidos L351K e T366K (numeração de acordo com a numeração da UE) no primeiro domínio CH3 e as substituições de aminoácidos L351D e L368E na segunda

[00258] domínio CH3, ou vice-versa (Figura 2). É ainda proporcionado, por conseguinte, um método de acordo com a invenção para a produção de um anticorpo biespecífico, em que o referido primeiro domínio CH3 compreende as substituições de aminoácidos L351K e T366K (numeração de acordo com a numeração da UE) e em que o referido segundo domínio CH3 compreende as substituições de aminoácidos L351D e L368E , o referido método compreendendo ainda o passo de cultivar a referida célula e permitindo a expressão de proteínas codificadas pelas referidas moléculas de ácido nucleico e recolher o referido anticorpo biespecífico a partir da cultura. Também é proporcionado um método de acordo com a invenção para a produção de um anticorpo biespecífico, em que o referido primeiro domínio CH3 compreende a substituições de aminoácidos L351D e L368E (numeração de acordo com à numeração da UE) e em que o referido segundo domínio CH3 compreende as substituições de aminoácidos L351K e T366K, o referido método compreendendo ainda o passo de cultivar a referida célula e permitindo a expressão das referidas moléculas de ácido nucleico e recolher o referido anticorpo biespecífico a partir da cultura. Os anticorpos que podem ser produzidos por estes métodos também são parte da presente invenção. Os domínios de dimerização hetero-CH3 são preferencialmente os domínios de dimerização hetero- IgGl. As regiões constantes da cadeia pesada compreendendo os domínios de dimerização hetero-CH3 são preferencialmente regiões constantes de IgGl.

[00259] A invenção também proporciona uma molécula de ácido nucleico que codifica pelo menos uma parte de uma região variável de cadeia pesada de anticorpo de acordo com a invenção.

[00260] aqui proporcionada uma molécula de ácido nucleico com um comprimento de pelo menos 15 nucleotídeos que codifica pelo menos uma regi CDR de um anticorpo ou variante de acordo com a invenção. É ainda proporcionado uma molécula de ácido nucleico que codifica pelo menos uma região variável de cadeia pesada de um anticorpo ou variante de acordo com a invenção.

[00261] A molécula de ácido nucleico (tipicamente in vitro, isolado ou molécula de ácido nucleico recombinante), de preferência codifica qualquer uma das regiões variáveis de cadeia pesada, como representado na Figura 3 e / ou na Figura 13, ou uma região variável da cadeia pesada como apresentado na Figura 3 e / A Figura 13 ou com 1, 2, 3, 4 ou inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou combinação dos mesmos. Algumas concretizações fornecem uma molécula de ácido nucleico que codifica um anticorpo ou uma sua variante de acordo com a invenção. A molécula de ácido nucleico de um modo preferido utiliza códons que são optimizados para expressão na célula produtora de anticorpos que é para ser usado. De preferência, o ácido nucleico que codifica uma região variável da cadeia pesada como apresentado na Figura 3 e / ou na figural3, ou uma região variável da cadeia pesada como apresentado na Figura 3 e / ou na Figura 13 que tem um, dois, três, quatro ou cinco inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou sua combinação seja códons optimizados para a expressão em uma célula humana, de um modo preferido Per .C6 "”; ou uma célula de hamster chinês, de preferência CHO. A invenção proporciona ainda uma molécula de ácido nucleico que codifica para a mencionada região variável da cadeia pesada juntamente com uma região constante de cadeia pesada da Figura 2.

[00262] Uma molécula de ácido nucleico, tal como utilizado na invenção é, tipicamente, mas não exclusivamente, um ácido ribonucleico (RNA) ou um ácido desoxirribonucleico (DNA). ácidos nucleicos alternativos, tais como por exemplo ácido nucleico bloqueado (LNA) e PNA (ANP), estão disponíveis para um técnico versado no assunto.

[00263] É ainda proporcionado um vetor compreendendo uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção.

[00264] Uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção é, por exemplo, compreendida em uma célula.

Quando a referida molécula de ácido nucleico é expressa na referida célula, a referida célula pode produzir um anticorpo, Ou variante de acordo com a invenção.

Portanto, a invenção em uma concretização proporciona uma célula que compreende um anticorpo ou uma sua variante de acordo com a invenção e / ou uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção e / ou um vector de acordo com a invenção.

Um anticorpo é produzido quando a referida célula produz uma cadeia pesada e uma cadeia leve.

Proporciona-se uma célula capaz de produzir um anticorpo da invenção.

A célula compreende, preferencialmente, uma molécula de ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada de anticorpo que, quando combinada com uma cadeia leve comum, pode ligar-se a referida primeira proteína membranar.

A referida célula compreende ainda de preferência uma molécula de ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada de anticorpo que, quando combinada com uma cadeia leve comum, pode ligar-se a referida proteína de membrana segundo.

A referida célula compreende ainda, preferencialmente, uma molécula de ácido nucleico que codifica para uma cadeia leve comum.

A referida célula é de preferência uma célula animal, mais preferencialmente uma célula de mamífero, mais preferencialmente uma célula de primata, ainda mais preferencialmente uma célula humana.

Para os fins da presente invenção em uma célula adequada é qualquer célula capaz de e compreendendo de um modo preferido de produzir um anticorpo de acordo com a invenção e / ou um ácido nucleico de acordo com a invenção.

[00265] A invenção proporciona ainda uma célula compreendendo um anticorpo de acordo com a invenção. Também é fornecida uma célula que compreende uma ou mais moléculas de ácido nucleico que por si só ou em conjunto codificam um anticorpo da invenção. A uma ou mais moléculas de ácido nucleico são moléculas de ácidos nucleicos expresseis que significa que eles contêm sinais a em cis necessárias para a transcrição e tradução de RNA de domínios de codificação de proteína. De preferência, a referida célula (normalmente uma in vitro, isolado ou recombinante de células) produz o referido anticorpo. Em uma concretização preferida, a referida célula é uma célula de hibridoma, de uma célula de ovário de hamster chinês (CHO), uma célula NSO, ou uma célula PER-C6 ", Em uma concretização particularmente preferida a referida célula é uma célula CHO. Proporciona-se uma cultura de células que compreende uma célula de acordo com a invenção. Várias instituições e empresas desenvolveram linhagens de células para a produção em grande escala de anticorpos, por exemplo, para uso clínico. exemplos de tais linhagens celulares não-limitativos são células CHO, células NSO ou células PER.C6 ". Estas células são também usadas para outros fins, tais como a produção de proteínas. As linhagens celulares desenvolvidas para a produção em escala industrial de proteínas e anticorpos são aqui a seguir referido como linhagens celulares industriais. Assim, em uma concretização preferida, a invenção proporciona a utilização de uma linha de células desenvolvidas para a produção em grande escala de anticorpo para a produção de um anticorpo da invenção. A invenção proporciona adicionalmente uma célula para a produção de um anticorpo que compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para um VH, um VL, e / ou uma cadeia pesada, como representado nas Figuras 3, 13, 1 e / ou 2. Preferencialmente, a referida molécula de ácido nucleico compreende uma sequência como representado nas Figuras 1 e 2.

[00266] A invenção proporciona ainda um método para produzir um anticorpo compreendendo o cultivo de uma célula da invenção e recolher o referido anticorpo a partir da referida cultura. Preferencialmente, a referida célula é cultivada num meio isento de soro. De preferência, a referida célula está adaptada para crescimento em suspensão. É ainda proporcionado um anticorpo obtenível através de um método para a produção de um anticorpo de acordo com a invenção. O anticorpo é de preferência purificado a partir do meio de cultura. Preferencialmente, o referido anticorpo é purificado por afinidade.

[00267] Uma célula da invenção é, por exemplo, uma linha celular de hibridoma, de uma célula de CHO, uma célula 293F, uma célula NSO ou qualquer outro tipo celular que se sabe na técnica pela sua aptidão para a produção de anticorpos para fins clínicos, em particular para a produção de anticorpos utilizada para a administração em seres humanos. Em uma concretização particularmente preferida a referida célula é uma célula humana, de preferência uma célula que é transformada por uma regi El de adenovus ou um seu equivalente funcional. Um exemplo preferido de uma tal linha celular é a linha celular PER.C6 ” ou seu equivalente. Em uma concretização particularmente preferida a referida célula é uma célula CHO ou uma sua variante, de preferência uma variante que faz uso de uma glutamina sintetase (GS) sistema de vector para expressão de um anticorpo.

[00268] Um anticorpo ou variante de acordo com a invenção também podem ser produzidos em animais não-humanos. É ainda proporcionado, por conseguinte, um animal não-humano compreendendo um anticorpo de acordo com a invenção, e / ou uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção, e / ou um vector de acordo com a invenção. Em algumas concretizações, o referido animal n humano compreende um roedor ou coelho, preferencialmente um rato ou uma ratazana.

[00269] A invenção proporciona ainda uma composição ou kit de componentes compreendendo, pelo menos, um anticorpo ou variante de acordo com a invenção. A invenção proporciona ainda uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais anticorpos ou as suas variantes de acordo com a invenção. A composição farmacêutica compreende preferência um excipiente farmaceuticamente aceitável, diluente ou veículo.

[00270] Um anticorpo ou uma sua variante da invenção pode ainda compreender uma marcador, preferivelmente uma marcador para imagiologia in vivo. Tal Marcador não é normalmente necessário para aplicações terapêuticas. Em por exemplo, uma definição de diagnóstico, um rótulo pode ser útil. Por exemplo a visualizar as células-alvo no corpo. Vários rótulos são adequados e muitos são bem conhecidos na arte. Em uma concretização preferida, o marcador é um marcador radioativo para detecção. Em outra concretização preferida, o marcador é um marcador de infravermelho. De preferência, o marcador de infravermelhos é adequado para imagiologia in vivo. Vários rótulos infravermelhos estão disponíveis para o perito na arte. marcadores infravermelhos preferidos são, por exemplo, IRDye 800; IRDye 680RD; IRDye 680LT; IRDye 750; IRDye 700DX; IRDye 800RS IRDye 650; IRDye 700 fosforamidite; IRDye 800 da fosforamidite (LI-COR EUA; 4647 Superior Street; Lincoln, Nebraska).

[00271] A quantidade anticorpo de acordo com a invenção a ser administrada a um doente é tipicamente na janela terapêutica, o que significa que uma quantidade suficiente seja utilizada para a obtenção de um efeito terapêutico, enquanto a quantidade não exceda um valor limiar que leva a um grau inaceitável de lado -Efeitos. Quanto menor for a quantidade anticorpos necessária para a obtenção de um efeito terapêutico desejado, quanto maior for a janela terapêutica será tipicamente. Um anticorpo de acordo com a invenção exercer efeitos terapêuticos suficientes em baixa dosagem é, portanto, preferido. A dosagem pode estar no intervalo do regime de dosagem de Nivolumab. A dosagem pode também ser inferior.

[00272] Um anticorpo ou variante do mesmo e, em particular, um anticorpo biespecífico ou uma sua variante de acordo com a invenção pode ter menos efeitos colaterais do que uma combinação de anticorpos monoespecíficos bivalentes com os domínios variáveis.

[00273] As combinações de anticorpos que bloqueiam a moléculas inibidoras e / ou co-estimuladoras beneficiar os pacientes que não respondem a imunoterapias existentes. No entanto, o bloqueio dos receptores de dupla imuno-moduladora (iMODs) tem sido demonstrado que o aumento de toxicidade imuno-relacionada. Um anticorpo ou variante do mesmo e, em particular, um anticorpo biespecífico ou uma sua variante de acordo com à invenção é adequado para o endereço de duplo bloqueio de iMODs, como eles podem exercer atividades funcionais que não podem ser reproduzidas por combinações de anticorpos monoclonais, e podem célula específico alvo mais seletivamente populações, o que reduz passivos de segurança em pacientes.

[00274] Os anticorpos foram produzidos anticorpos biespecíficos como por cloná-los em vectores de expressão complementares que contêm mutações na região CH3 que as unidades de heterodimerização de cadeias pesadas. Muitos anticorpos biespecíficos foram produzidos em pequena escala, e testados em ensaios funcionais em linhagens celulares de câncer de ligação e. Um anticorpo da invenção, particularmente um anticorpo biespecífico da presente invenção podem combinar perfis de toxicidade baixos, com elevada eficácia. Um anticorpo da invenção pode ser útil em vários tipos e linhagens de terapias específicas do sistema imunológico.

[00275] Um anticorpo da invenção pode ter uma maior janela terapêutica quando comparada com um anticorpo que se liga ao mesmo antígeno (s) com os dois braços.

[00276] Ainda proporcionada uma utilização de um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção ou uma variante dos mesmos, para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de células aberrantes, as células cancerosas, de um tumor e / ou a formação de metástases. O tumor a partir do qual a referida metástase origem é, de preferência um tumor que é positivo para um membro da família B7 ou TNFRSF14.

[00277] os anticorpos da invenção podem ser produzidos em níveis> 50 mg / L, após transfecção transiente em células em suspensão 293F. Os anticorpos biespecíficos podem ser purificados até mais de 98% de pureza com rendimentos> 70%. Estudos de caracterização analíticos mostram perfis de anticorpos biespecíficos 1lgGl que são comparáveis aos bivalente monoespecífico IgGl.

[00278] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico ou uma sua variante que pode se ligar a uma parte extracelular de um membro associado membrana da família CD28 e uma parte extracelular de um membro associado membrana do B7 ou TNFRSF14.

[00279] Também é proporcionado um método para o tratamento de um indivíduo que tem um câncer ou uma infecção com um agente patogénico, o método compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou variante de acordo com a invenção, ou uma composição de acordo com a invenção, ou um molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção, ou um vector de acordo com a invenção, para o indivíduo em necessidade do mesmo.

[00280] A invenção proporciona ainda uma proteína da invenção ou um anticorpo biespecífico da presente invenção, para utilização no tratamento de um indivíduo que tem câncer.

[00281] Proporciona-se um sistema de célula compreendendo um anticorpo ou um anticorpo biespecífico ou uma sua variante da invenção, e uma primeira célula que expressa uma membrana associada membro da família CD28 e uma segunda célula que expressa um membro associado membrana da família B7 ou TNFRSF14.

[00282] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-Ll, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF5708 como representado na Figura 3A tendo, no máximo, 15, de preferência 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF5708 como representado na Figura 3A. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00283] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-Ll, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF5594 como representado na Figura 3B tendo, no máximo, 15, de preferência 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF5594 como representado na Figura 3B. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00284] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-Ll, em que a cadeia VH dos domínios variável compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF5576 como representado na Figura 3C tendo, no máximo, 15, de preferência 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF5576 como representado na Figura 3C. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00285] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-Ll, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF5561 como representado na Figura 3D tendo, no máximo, 15, de um modo preferido 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF5561 como representado na Figura 3D. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00286] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-Ll, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF5557 como representado na Figura 3E ter, no máximo, 15, de preferência 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF5557 como representado na Figura 3E. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00287] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-Ll, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF5553 como representado na Figura 3F tendo, no máximo, 15, de preferência 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF5553 como representado na Figura 3F. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00288] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-Ll, em que a cadeia VH dos domínios variável compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF5442 como representado na Figura 3G tendo, no máximo, 15, de preferência 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF5442 como representado na Figura 3G. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00289] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-Ll, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF5439 como representado na Figura 3H tendo, no máximo, 15, de preferência 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF5439 como representado na Figura 3H. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00290] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-Ll, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF5426 como representado na Figura 3I tendo, no máximo, 15, de preferência 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF5426 como representado na Figura 31. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00291] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-Ll, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF5424 como representado na Figura 3J tendo, no máximo, 15, de preferência 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF5424 como representado na Figura 37. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00292] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-Ll, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF5382 como representado na Figura 3K ter, no máximo, 15, de preferência 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida a dita cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF5382 como representado na

Figura 3K. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00293] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-Ll, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF5377 como representado na Figura 3L tendo, no máximo, 15, de preferência 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF5377 como representado na Figura 3L. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00294] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-Ll, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF5359 como representado na Figura 3M que tem, no máximo, 15, de preferência 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF5359 como representado na Figura 3M. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00295] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-Ll, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF5361 como representado na Figura 3N tendo, no máximo, 15, de preferência 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF5361 como representado na Figura 3N. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00296] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-Ll, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF5442 como representado na

[00297] Figura 13 que tem, no máximo, 15, de um modo preferido O, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 929 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito a referida cadeia VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF5442 como representado na Figura 13. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00298] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-Ll, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF7691 como representado na Figura 13 que tem, no máximo, 15, de preferência 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF7691 como representado na Figura 13. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00299] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-Ll, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF7690 como representado na Figura 13 que tem, no máximo, 15, de preferência 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF7690 como representado na Figura 13. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00300] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-Ll, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF7689 como representado na Figura 13 que tem, no máximo, 15, de preferência 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF7689 como representado na Figura 13. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00301] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-Ll, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF7688 como representado na Figura 13 que tem, no máximo, 15, de preferência 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF7688 como representado na Figura 13. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00302] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-Ll, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF7700 como representado na Figura 13 que tem, no máximo, 15, de preferência 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF7700 como representado na Figura 13. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00303] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-Ll, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF7701 como representado na Figura 13 que tem, no máximo, 15, de preferência 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF7701l como representado na Figura 13. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00304] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-Ll, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF7703 como representado na Figura 13 que tem, no máximo, 15, de preferência 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida a dita cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF7703 como representado na Figura 13. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00305] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-Ll, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF7694 como representado na Figura 13 que tem, no máximo, 15, de preferência 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF7694 como representado na Figura 13. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00306] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-Ll, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF7693 como representado na Figura 13 que tem, no máximo, 15, de preferência 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF7693 como representado na Figura 13. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00307] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-Ll, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF7692 como representado na Figura 13 que tem, no máximo, 15, de preferência 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF7692 como representado na Figura 13. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00308] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-Ll, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF7697 como representado na Figura 13 que tem, no máximo, 15, de um modo preferido 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF7697 como representado na Figura 13. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00309] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-Ll, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF7696 como representado na Figura 13 que tem,

no máximo, 15, de preferência 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF7696 como representado na Figura 13. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00310] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-Ll, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF7695 como representado na Figura 13 que tem, no máximo, 15, de preferência 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF7695 como representado na Figura 13. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00311] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-l1, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF6982 como representado na Figura 30 que tem, no máximo, 15, de preferência 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF6982 como representado na Figura 30. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00312] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-l1, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF6974 como representado na Figura 3P possuindo pelo menos 15, de preferência 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF6974 como representado na Figura 3P. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00313] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-l1, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF6972 como representado na Figura 3T tendo, no máximo, 15, de preferência 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF6972 como representado na

Figura 3T. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00314] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-l1, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF6936 como representado na Figura 3R tendo, no máximo, 15, de preferência 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF6936 como representado na Figura 3R. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00315] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-l1, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF6935 como representado na Figura 3P possuindo pelo menos 15, de preferência 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF6935, como representado na Figura 3S. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00316] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-l1, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF6932 como representado na Figura 3T tendo, no máximo, 15, de preferência 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF6932 como representado na Figura 3T. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00317] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-l1, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF6076 como representado na Figura 3U tendo, no máximo, 15, de preferência 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF6076 como representado na Figura 3U. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00318] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-1, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF6236 como representado na Figura 3V tendo, no máximo, 15, de preferência 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida a dita cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF6236 como representado na Figura 3V. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00319] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-l1, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF6256 como representado na Figura 3W tendo, no máximo, 15, de preferência O, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF6256 como representado na Figura 3W. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00320] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-1, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF6226 como representado na Figura 3Y tendo, no máximo, 15, de preferência 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF6226 como representado na Figura 3W. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00321] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-l1, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF6930 como representado na Figura 3X tendo, no máximo, 15, de preferência 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF6930 como representado na Figura 3W. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00322] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-l1, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF6929 como representado na Figura 13 que tem, no máximo, 15, de um modo preferido 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF6929 como representado na Figura 13. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00323] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-l1, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF7699 como representado na Figura 13 que tem, no máximo, 15, de preferência 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF7699 como representado na Figura 13. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00324] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-l1, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF7698 como representado na Figura 13 que tem, no máximo, 15, de preferência 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF7698 como representado na Figura 13. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00325] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-l1, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF7687 como representado na Figura 13 que tem, no máximo, 15, de preferência 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF7687 como representado na Figura 13. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00326] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-1, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF7686 como representado na Figura 13 que tem, no máximo, 15, de preferência 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF7686 como representado na Figura 13. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00327] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-1, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF7685 como representado na Figura 13 que tem, no máximo, 15, de preferência 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF7685 como representado na Figura 13. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00328] A invenção também fornece um anticorpo bivalente ou uma variante deste, compreendendo domínios variáveis que se ligam a DP-1, em que a cadeia VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de VH de cadeia MF7684 como representado na Figura 13 que tem, no máximo, 15, de preferência 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, preferivelmente, possuindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito referida VH. Em uma concretização preferida, a referida cadeia VH compreende a sequência de aminoácidos de MF7684 como representado na Figura 13. Em uma concretização preferida deste anticorpo o anticorpo é monoespecífico.

[00329] Um anticorpo monoespecífico, tal como aqui utilizado é um anticorpo que pode se ligar a um único epítopo. Como resultado apenas um tipo de antígeno está ligado. Um anticorpo bivalente tal como aqui utilizado compreende dois domínios variáveis que se podem ligar ao mesmo epítopo. Um anticorpo monoespecífico bivalente é tipicamente referido como o anticorpo monoclonal. Tal anticorpo monoespecífico bivalente tem dois domínios variáveis, que cada um tem uma

[00330] região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de MF indicado e um de cadeia leve comum, tal como aqui definido.

[00331] Um anticorpo biespecífico ou uma sua variante compreende dois domínios variáveis que se ligam a diferentes epítopos. Os dois epítopos diferentes estão tipicamente presentes em dois antígenos diferentes ou proteínas. Um anticorpo biespecífico é monovalente para a capacidade se ligar a um epítopo específico. Ele é bivalente, na medida em que ele tem o potencial para duas interações de ligação.

[00332] A invenção é ainda explicada nos exemplos seguintes. Estes exemplos não limitam o escopo da invenção, mas servem meramente para clarificar a invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00333] A Figura l mostra uma cadeia leve comum utilizada em IgG mono- e biespecífico

[00334] A Figura 1A mostra a cadeia leve comum sequência de aminoácidos. A Figura 1B mostra a sequência comum luz variável da cadeia de DNA e domínio de tradução (IGKV1-39 / JK1). Figura 1C: constante da cadeia sequência de DNA da região de luz comum e tradução. Figura 1D: IGKV1- 39 / jk5 comum luz tradução de domínio variável de cadeia. Figura 1E: IGKV1-39A V-região.

[00335] Figura 2: as cadeias pesadas de IgG para a geração de moléculas biespecíficas. A Figura 2A: mostra cadeia VH é o ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de um MF representado na figura 3. A Figura 2B: região CHl. Figura 2C: região chRNAeira. Figura 2D: região CH2. Figura 2E: CH2 contendo L235G e substituições G238R silenciamento. Figura 2F: domínio contendo substituições CH3 L351K e T366K (KK). Figura 2G; domínio CH3 que contém substituições L351D e L368E (DE)

[00336] A Figura 3: Sequência de aminoácidos de regiões variáveis de cadeia pesada: A notação MF refere-se a um Fab contendo uma região variável da cadeia pesada como descrita e uma cadeia leve comum. A sequência de aminoácidos da cadeia leve está indicada na figura 1A. As sequências sublinhadas indicam por sequência de aminoácidos respectivamente, a CDR1, CDR2 e CDR3 da região.

[00337] A Figura 4 mostra um Mapa do vetor e características de pIRES-Neo3 (MV1363).

[00338] A Figura 5 mostra um Mapa do vetor e as características de pvVAX1.

[00339] A Figura 6 mostra um Mapa do vetor e características do vetor fagemídeo MV1473 utilizado para gerar bibliotecas de apresentação de fagos imunes.

[00340] A Figura 7 mostra Mapa do vetor e as características do vector de expressão de IgG MV1452, que foi usado para a expressão dos PD-Ll1 específicos de DP-1 e braços Fab da cadeia pesada KK-variante para a geração de IgG biespecífico.

[00341] A Figura 8 mostra a Sequência de aminoácidos do gene de VH, que é específica da toxina do tétano, quando combinado com a cadeia leve comum como MF1337, e que está presente na cadeia pesada DE-variante que foi utilizado para gerar moléculas PD-LIxXTT e PD-lxTT biespecífico de IgG. As sequências sublinhadas indicam por sequência de aminoácidos respectivamente, a CDR1, CDR2 e CDR3 da região.

[00342] A Figura 9: Mapa do vetor e as características do vector de expressão de IgG MV1377, que foi utilizado para a expressão do TT específico Fab braço MF1337 na cadeia pesada DE-variante para a geração de IgG biespecífico.

[00343] A Figura 10 mostra PD-l / ensaio de bloqueamento de PD-Ll. A avaliação da capacidade do anti-PD- Ll e o painel de anticorpos anti-DP-l para bloquear a interação de PD-L1 para DP-1 revestido a uma concentração de ug / ml de IgG biespecífico. Os dados são normalizados para os dados obtidos com o índice de referência bivalente PD-Ll1 anticorpo MPDL3280A a uma concentração de 10 ug / ml (100% de bloqueio). Um exemplo representativo é mostrado de (gráfico inferior) do painel de PD-L1 (gráfico de cima) e DP-l1. ligação máxima (normalizado a 0% de bloqueio) foi estabelecida pela incubação com anti-DP-1l de anticorpo / PD- L1 específica de isotipo humano. Todos DP-l e domínios variáveis de DP-L1 compreendendo sequências de MF representados na Figura 3 e não representada aqui bloquear o PD-l1 interação / PD-Ll1> 70%.

[00344] A Figura 11 mostra PD-1 / atividade funcional PD-L1 de um painel de anticorpos em uma titulação da dose no no sistema repórter DP-1 / PD-Ll-luc.

[00345] Figura 12: induzida por SEB produção de IL-2 em PBMC está reforçada por anticorpos PD-1xPD-L1 de um modo dependente da dose. PB composição está listada na Tabela 5. IL-2 produções são apresentadas como índice de estimulação em relação ao anticorpo de controlo negativo (Ctrl Ab).

[00346] A Figura 13 mostra a Sequência de aminoácidos de regiões variáveis de cadeia pesada: A notação MF refere- se a um Fab contendo uma região variável da cadeia pesada como descrita e uma cadeia leve comum. A sequência de aminoácidos da cadeia leve está indicada na figura 1A. As sequências sublinhadas indicam por sequência de aminoácidos, respectivamente, a região CDRl1, CDR2 e CDR3.

[00347] A Figura 14 mostra a Ligação a DP-l. Todas as IgG biespecíficos ligam-se a DP-1 em ELISA.

[00348] A Figura 15 mostra a Ligação a PD-Ll. Todos as IgGs biespecífico ligam a PD-L1 em ELISA

[00349] A Figura 16: FACS do ensaio confirma que se ligam ao antígeno expresso por células CHO. Painel superior, a ligação a células CHO-PD-Ll1; painel inferior direito se ligar a células CHO-PD1

[00350] A Figura 17 mostra o Ensaio de ligação FACS confirma candidato de chumbo PD-1 x PD-Ll1 biespecífico IgG para antígeno em células T ativadas.

[00351] A Figura 18 mostra PD-1l / ensaio de bloqueamento de PD-L2. Avaliação da capacidade anticorpos / PD-L1 seus anticorpos bivalentes parentais 1 anti-PD-e para bloquear a interação entre DP-L2 e DP-l1 num ensaio in vitro repórter bloqueio.

[00352] A Figura 19 mostra PD-Ll1 ensaio de bloqueio. A avaliação da capacidade um seus anticorpos parentais anti- bivalentes-PD um anticorpo biespecífico / PD-Ll e para bloquear a interação de PD-Ll1 com DP-l1 ou CD80 revestida em um ensaio de bloqueamento de PD-L1.

[00353] A Figura 20 mostra PD-anticorpos 1xPD-L1 aumentar induzida por SEB produção de IL-2 pelas PBMC em relação a uma mistura equimolar de seus anticorpos monoespecíficos bivalente parentais. Os dados representam a média de produção de 1IL-2 por PBMCs de 4 dadores independentes, na presença de concentrações crescentes de anticorpo. PG códigos de indicar os respectivos anticorpos bivalentes parentais para cada um dos dois anticorpos biespecíficos (indicado por PB). a produção de 1IL-2 é apresentado como unidades relativas de luz (RLU) medidas em AlphaLISA.

[00354] A Figura 21 mostra o melhoramento in vitro por um anticorpo biespecífico PD-lxPD-Ll da célula T específica de antígeno de IFN? / IL-2 de libertação. Os gráficos mostram os níveis de IL-2 (painel superior) ou IFNy (painel inferior) presente no sobrenadante. Todos os gráficos mostram os valores médios de poços duplicados. as linhagens tracejadas indicam os níveis de citocina na presença de antígeno (Ag). Apenas no caso das linhagens a tracejado não são mostradas, as concentrações exatas (Ag = pg / mL) estão indicados

[00355] Figura 22 mostra os Anticorpos biespecíficos PD-1xPD-L1 aumentar a capacidade resposta das células T in vitro. As barras mostram os níveis médios de IFNy presente no sobrenadante recolhido a partir de um iMLR alogénica, com barras de erro indicam SEM (n = 6). Um ANOVA de uma via com análise pós-teste Sidaks níveis médios obtidos em comparação com os anticorpos de ensaio com os obtidos com o anticorpo de controlo de isotipo (*), ou controlo de veículo (H). * P

<0,05, ** P <0,01, dk P <0,01, Hdf P <0,001, FH$t P <0,0001. A linha ponteada indica níveis de IFENy médios obtidos apenas com veículo. iMLR: imaturo reação linfocitária mista.

[00356] A Figura 23 mostra o Efeito de PD-lxPD-L1 sobre a proliferação de células CD4 + (esquerda) e células T CD8 + (direita) derivado a partir de cinco pacientes com carcinoma hepático (HCC) que se infiltram no tumor.

[00357] A Figura 24 mostra MF7686xMF7703 induz uma resposta anti-tumoral

[00358] A Figura 25 mostra MF7686xMF7703 aumenta o número de células T em tumores

[00359] A Figura 26 mostra MF7686xMF7703 aumenta a libertação de IFNy por células T específicas do tumor co- cultivados com células tumorais

[00360] A Figura 27 mostra MF7686xMF7703 aumenta a citotoxicidade células T específicas tumor-co-cultivados com células tumorais

[00361] A Figura 28 mostra MF7686xMF7703 induz uma resposta anti-tumoral

[00362] A Figura 29 mostra MF7686xMF7703 aumenta números de CD8 específico de tumores (-específica de NY-ESO- 1) + de células T em tumores

[00363] A Figura 30 mostra PD-anticorpos I1xPD-L1 bloquear o efeito inibidor de humano recombinante PD-Ll-Fc num ensaio de ativação de células T humanas primárias co- dependente de estimulação. Os dados representam a média do índice de estimulação (SI) de Duplo culturas, realizados em uma experiência com um único doador de PBMC (1,058), para concentrações crescentes de anticorpo tal como indicado (da esquerda para a direita). PG códigos de indicar os respectivos anticorpos bivalentes parental dos dois anticorpos biespecíficos.

[00364] A Figura 31 mostra Efeito de anticorpos biespecíficos PD-l1xPD-L1 bloqueio num ensaio de ativação de células T humanas primárias co-dependente de estimulação é mais elevada do que a da combinação de anticorpos parentais ou a combinação de anticorpos de referência. Os dados representam a média do índice de estimulação (SI) de Duplo culturas, realizados em uma experiência com um único doador de PBMC (1,058), para concentrações crescentes de anticorpo tal como indicado (da esquerda para a direita). PG códigos de indicar os respectivos anticorpos bivalentes parental dos dois anticorpos biespecíficos.

[00365] A Figura 32 mostra as células T no ensaio de ativação de células T humanas primárias co-dependente de estimulação expressa quantidades crescentes de DP-1 e DP-L1 após ativação com o anti-CD3 e anti-CD28. O índice de fluorescência média (IFM) representa o nível de expressão de DP-1l1 ou PD-L1 em células T colhidas após 24, 48 e 72 horas de activao com anti-CD3 e anticorpo anti-CD28.

[00366] A Figura 33 mostra um anticorpo biespecífico PDIXPDL1 capaz de bloquear completamente o eixo PDl.

EXEMPLOS

[00367] Tal como aqui utilizado "MFXXXX", em que X é, independentemente, um número 0-9, refere-se a um fragmento Fab compreendendo um domínio variável em que o VH tem a sequência de aminoácidos identificada pelos 4 dígitos. A menos que de outro modo indicado a região variável de cadeia leve do domínio variável tem tipicamente uma sequência da Figura 1A, tipicamente 1B. "MFXXXX VH" refere-se à sequência de aminoácidos da VH identificada pelos 4 dígitos. O MF compreende ainda uma região constante de uma cadeia leve e uma regi constante de uma cadeia pesada que normalmente interage com uma região constante de uma cadeia leve. PG refere-se a um anticorpo monoespecífico que compreende pesada idêntica e cadeias leves. PB refere-se a um anticorpo biespecífico com duas cadeias pesadas diferentes. A região variável das difere cadeias pesadas e, tipicamente, também a região CH3, em que uma das cadeias pesadas possui uma mutação KK do seu domínio CH3 e o outro tem o complementando a mutação DE do seu domínio CH3 (ver, por PCT referência / NL2013 / 050,294 (publicada como WO2013 / 157954). Exemplo 1 Geração de materiais para a seleção e triagem Cultura de linhagens celulares

[00368] Células humanas ES-2 (cat. no. CRL-1978) foram adquiridas de ATCC e mantidas rotineiramente em 5A de McCoy (Gibco) suplementado com 10% de FBS (Lonza). células Freestyle 293F (cat. no. P / n51-0029) foram obtidos a partir de Invitrogen e rotineiramente mantidas em meio 293 Freestyle. HEK293T (cat. No. ATCC CRL-11268-), CHO-K1 (. N. DSMZ ACC110 gato) linhagens de células foram adquiridas de ATCC e mantidas rotineiramente em DMEM / F12 (Gibco) suplementado com L-Glutamina (Gibco) e FBS (Lonza), e CHO-S (cat. N. 11619-012) linhagens de células foram adquiridos a Gibco e rotineiramente mantidas em meio Freestyle expressão CHO (Invitrogen) suplementado com L-glutamina.

[00369] Geração de vectores de expressão DP-l1 e DP- Ll1 para a imunização, e para a geração de linhagens celulares estáveis cDNA de comprimento total de cada alvo, incluindo locais de restrição únicos para clonagem e sequência de consenso de Kozak para a tradução eficiente foi sintetizado quer, ou obtido através de amplificação PGR em uma construção de expressão disponível comercialmente, contendo o DNAcC alvo, com os iniciadores específicos que introduziram sítios de restrição únicos para clonagem e sequência de consenso de Kozak para tradução eficiente. O DNAc de cada alvo foi clonada em uma construo de expressão eucariótica, tais como PIRES-Neo3 (Clontech; Figura 4) ou pVAX1l IThermo Fisher Scientific; A Figura 5), através de Nhel / EcoRI, resultando em PIRES-Neo3 [TARGET NAME] e PpVAX1 [TARGET NAME], respectivamente. As sequências de inserção foram verificadas por comparação com NCBI Referência sequências de aminoácidos. As construções de pIRES-Neo3 foram usadas para a geração de linhagens celulares estáveis. As construções de pVAX1l foram usadas para imunização fins. Ver Tabela l para uma visão geral dos nomes das construções resultantes.

[00370] Sequência de aminoácidos de comprimento completo HUPD-1 inserto (tanto em pIRES-Neo3 e pVAX1) para a expressão na superfície da célula (Idêntico ao GenBank: NP 005009.2):

MOIPOAPWPVVWAVLOLGWRPGWF LDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNT SESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGODCRFRVTOLPNGRDF HMSVVRARRNDS GTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGOFOTLVVGVVGGL LGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGOQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPE PPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL

[00371] Das quais: MOIPOAPWPVVWAVLOLGWR: peptídeo sinal.

[00372] PGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESEFVLNWYR

MSPSNOTDKLAAFPEDRSQPGODCRFRVTOLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLC GAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFOTLV: ECD of huPD-1.

[00373] VGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI: Predicted TM region.

[00374] Sequência de aminoácidos de comprimento completo macaque (Macaca fascicularis) PD-l inserto (tanto em pIRES-Neo3 e pVvVAX1) para a expressão na superfície da célula (Idêntico ao GenBank: ABR15751.1):

MQIPQAPW PVVWAVLQLGWRPGWFLESPDRPWNAPTFSPALLLVTEGDNATF TCSFSNASESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTRLPNGRD FHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAE VPTAHPSPS PRPAGQFQALVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAAQGTIEARRTGQPLKEDP SAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPAPCVPEQTEY ATIVFPSGLGTSSPARRGSA DGPRSPRPLRPEDGHCSWPL

[00375] Das quais:

[00376] MOIPOAPWPVVWAVLOLGWR: peptídeo de sinal.

PGWFLESPDRPWNAPTFSPALLLVTEGDNATFTCSFSNASESFVLNWYRMSPS NQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTRLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAI

[00377] S LAPKAQ eu KE S LRAE LRVTERRAEVPTAHPS PS PRPAGQ FQ ALV: ECD de maPD- 1.

[00378] VGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI: região TM prevista.

CSRAAQGTIEARRTGQPLKEDPSAVPVFESVDYGELDFQWREKTPEPPAPCVPEQ

[00379] TEYATIVFPSGLGISSPARRGSADGPRSPRPLRPEDGHCSWPL: cauda intracelular.

[00380] Sequência de aminoácidos de comprimento total inserção HUPD-Ll (tanto em pIRES-Neo3g e pVAXl) para a expressão na superfície da célula (Idêntico ao GenBank: AAI13735.1):

MRIFAVFIFMTY WHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALI VYWEMEDKNIHQFVYVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQ DAGVYRCMISYGGADY KRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYP KAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDP EENHTAELVIPELPLAHPPN ERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVK KCGIQDTNSKKQSDTHLEET

[00381] Das quais:

[00382] MRIFAVFIFMTYWHLLNA: peptídeo de sinal.

FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEE DLKVQHSSYRQRARLLK DQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRI TVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGY PRKAEVIWTSSDHQVLSGKTT TTNSKREEKLFENVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPP

[00383] NER: ECD de HUPD-L1.

[00384] THLVILGAILLCLGVALTFIF: região TM prevista.

[00385] RLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET: cauda intracelular.

[00386] Sequência de aminoácidos de comprimento completo macaque (Macaca mulatta) PD-Ll inserto (tanto em PIRES-Neo3 e pvVAX1) para a expressão na superfície da célula (Idêntico ao GenBank: ABO33161.1))

MRIFAVFIFTIYNWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECRFPVEKQLGLTSLIV YWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSNYRQRAQLLKDQLSLGNAALRITDVKLAD AGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPK AEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLLNVTSTLRINTTANEIFYCIFRRLGPE ENHTAELVIPELPLALPPNERTHLVILGAIFLLLGVALTFIFYLRKGRMMDMKKS GIRVTINSKKQRDTQLEET

[00387] Das quais:

[00388] MRIFAVFIFTIYWHLLNA: peptídeo de sinal.

FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECRFPVEKQLGLTSLIVYWEMEDKNIHQFVHGEE DLKVQHSNYRQRAQLLKDQLSLGNAALRITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKR ITVKVNAPY NKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGY PKAEVIWTSSDHQVLSGKT TTTNSKREEKLLNVTSTLRINTTANEIFYCIFRRLGPEENHTAELVIPELPLALPP

[00389] NER: ECD de MAPD-L1.

[00390] THLVILGAIFLLLGVALTFIF: região TM prevista.

[00391] YLRKGRMMDMKKSGIRVTINSKKQRDTQLEET: cauda intracelular. Geração de linhagens celulares estáveis expressando PD-1 ou PD-LI1

[00392] Construções de expressão PIRES-Neo3 [TARGET NAME] (Tabela 1) foram usadas para gerar clones de CHO-K1 que expressam de forma estável as proteínas respectivas GHO-S ou. As construções foram transfectadas transitoriamente em células CHO-Kl usando lipofectamina transfecção, ou utilizando PEI de transfecção para células de CHO-S e pesquisados por FACS utilizando anticorpos que reagem com as respectivas proteínas. Após confirmação da expressão, as células transitoriamente transfectadas foram semeadas em placas de diluição limitante e cultivadas sob pressão de seleção relevante para a construção de expressão usados para obter os clones de células estáveis. Após 2-3 semanas de seleção, os clones foram pesquisados por FACS. Os clones selecionados foram expandidos por passagem em série, testadas de novo em FACS e congelado a -150 º C. Os nomes dos clones que expressam estavelmente as proteínas heterólogas são CHO-Kl [TARGET NAME] células ou CHO-s . [TARGET NAME] células. Ver Tabela 1 para uma visão geral das construções utilizadas para gerar linhagens celulares estáveis e o seu nome resultante. Exemplo 2 Imunização, seleção e triagem Ratos utilizados para as imunizações

[00393] Para a geração de anticorpos humanos que se ligam a HUPD-l e HUPD-Ll, camundongos transgénicos para a cadeia leve humana VKl1-39 (camundongos cadeia leve comum, ver W02009 / 157771) e para uma cadeia humana pesada (HC) de minilocus (compreendendo uma seleção de segmentos de genes de V humanos, todos humanos Ds e todos humanos Js) foram imunizados com proteína recombinante ou de DNA que codifica as proteínas como brevemente descrito abaixo. Estes camundongos são referidos como camundongos 'MeMoO'. Imunizações de proteína

[00394] Os camundongos 'MeMoG0' foram imunizados atrav de injeces subcuteas com proteína recombinante e Gerbu adjuvante MM (Gerbu Biotechnik c * 3001). Recombinante HUPD- Ll1-His (SinoBiological; Cat.No. 10084-H08H) e HUPD-l-Fc (R & D; N º de Cat 1086-PD) de proteínas foram utilizadas para imunizações. Os camundongos foram imunizados com proteína recombinante de 40 ug em PBS misturado com 40 ul de adjuvante num volume total de 100 ul. Subsequentemente, os camundongos foram reforçados nos dias 14 e 28 com 20 ug de proteína recombinante em PBS, juntamente com 20 ul de adjuvante num volume total de 50 ul. O soro de camundongo foi recolhido no dia 35 para determinar os títulos de soro. Os camundongos com títulos baixos no soro receberam ciclos adicionais de imunizações de reforço e as análises de soro. Cada ciclo consistiu de duas imunizações semanais, utilizando 20 ug de proteína recombinante em 50 ul de PBS, seguido por uma semana mais tarde recolha de soro para análise de titulação. Os camundongos “mostrando títulos séricos elevados contra humanos mas não os homólogos recebeu imunizações de reforço com proteína de macaco macaque antígeno. Os ratos que mostram títulos elevados no soro contra o alvo humano e macaque recebeu um reforço de imunização final, que consiste em injeções diárias de 20 ug de proteína recombinante em 50 ul de PBS em três dias consecutivos. Um dia após a injeção final em tecido linfóide de camundongos foi recolhido. Imunizações de DNA

[00395] camundongos MeMoG6' foram imunizados por DNA utilizando um dispositivo de tatuagem micropigmentação. DNA imunizações tatuagem foram realizadas com DNA de plasmídeo de 20 pq que codifica o antígeno alvo (pVAX1l [TARGET NAME], QUADRO 1). Os camundongos foram imunizados com DNA que codifica somente o alvo humano (PD-l, DP-Ll). Para as imunizações PD-Ll1, células Treg foram esgotados quatro dias antes do início da imunização por injeção de camundongos com 0,5 mg de anti-CD25 anticorpo PC61.5 (Bioceros) para quebrar a tolerância. Os camundongos foram imunizados no dia O, 3, 6, 14, 17, 28 e 31. Rato soro foi recolhido no dia 35 para determinar os títulos de soro. Os camundongos com a reatividade do soro de baixo recebido ciclos adicionais de imunizações de reforço e as análises de soro. Cada ciclo consistiu de duas imunizações semanais seguidos uma semana mais tarde por recolha de soro para análise de titulação. Os ratos que mostram a reatividade do soro forte contra células que expressam o alvo humano e macaque recebeu uma imunização de reforço final seguido após 3 dias de recolha de tecido linfoide. Determinação de títulos séricos

[00396] Os títulos séricos foram determinados por análise de FACS utilizando linhagens de células que expressam os antígenos humanos e destino macaque (Tabela 1).

Geração de fagos 'imune' de Fab bibliotecas por RT-PCR a partir de tecidos de camundongos imunizados

[00397] Baço e nódulos linfáticos de drenagem foram removidos a partir de ratos para os quais foi observada uma resposta humoral significativa contra as respectivas proteínas alvo.

[00398] As suspensões de células individuais foram geradas a partir de ambos baço e nodos linfáticos inguinais e subsequentemente estes tecidos foram lisadas em Trizol LS Reagent (Thermo Scientific c * 10296028) e armazenado a -80 º C até à sua utilização.

[00399] A partir de camundongos imunizados com sucesso, os nódulos linfáticos inguinais foram utilizados para a construção de repertórios de anticorpos em fagos '' imunes. O RNA foi extraído a partir das suspensões de células únicas do tecido linfóide. 1 ug de RNA total foi usada em uma reacção de RT, utilizando um iniciador específico de IgGe-CHl. O DNAc resultante foi depois utilizado para amplificar o grupo policlonal de que codifica VH de DNAcC utilizando-em casa adaptada iniciadores específicos de VH essencialmente como descrito em Marks et al. (J Mol Biol O5 dezembro 1991; 222 (3): 581-97). O produto PGR resultante foi então clonado num vector fagemeo (Figura 6) para a exibição de fragmentos Fab em fago, como descrito em de Haard et al. (J Biol Chem 1999 25 jun; 274 (26): 18218-30) com a excepção de que a cadeia leve (Figura 1A e IB) foi a mesma para cada anticorpo e foi codificado pelo vector. Após a ligação, os fagemeos foram utilizados para transformar bactérias E. coli TG1 e as bactérias transformadas foram plaqueadas em placas de LB-agar contendo ampicilina e glucose. Todas as bibliotecas de fagos continham > 4x10 5 transformantes e tinha uma frequência de inserção de> 90%. As bactérias foram colhidas após crescimento durante a noite e usada para preparar fagos de acordo com protocolos estabelecidos (de Haard et al, J Biol Chem 1999 25 jun; 274 (26) :18218-30).

[00400] Seleção de fagos transportando os fragmentos Fab que se ligam especificamente à proteína alvo humano a partir de bibliotecas de fagos de Fab'' imunes utilizando proteínas recombinantes

[00401] As bibliotecas de fagos de Fab que foram gerados foram usadas para selecionar os Fabs específicos alvo utilizando apresentação de fagos em proteínas recombinantes revestidas diretamente. Para PD-L1,HUPD-Ll1-His (Sinobiological; Ncat 10084-H08H..), HUPD-Ll-Fc (R & D; Ncat 156-B7) e MAPD-LlI-His (Sinobiological; Ncat 90251-CO8H) foram usados. Para a DP-l1, HUPD-l-Fc (R & D; Ncat 1086-PD) e um HUIPD-biotina (BPS Bioscience; Ncat 71109) foram usadas.

[00402] Para seleções com Proteína A não biotinilada recombinante ('panning seleções'), as proteínas foram revestido nas cavidades de uma placa de ELISA, MAXISORP "”".

As placas de ELISA "” MAXISORP foram bloqueadas com 4% de leite desnatado seco (Marvel) em PBS. bibliotecas de fagos Fab também foram bloqueadas com 4% de Marvel e, quando marcado com Fc proteína recombinante foi utilizada, também com excesso de IgG humana para esgotar para ligantes região Fc antes da adição da biblioteca de fagos ao antígeno revestido.

[00403] A incubação da biblioteca de fago com a proteína de revestimento foi realizada durante 1,5 horas à temperatura ambiente e sob condições que agitam. As placas ou tubos foram, em seguida, lavou-se quinze vezes com 0,05% de Tween-20 em PBS seguido por cinco vezes a lavagem com PBS. Os fagos ligados foram eluídos por 20 minutos usando tripsina, após o que a tripsina foi neutralizada com AEBSF inibidor de tripsina (Sigma).

[00404] Para seleções com proteína biotinilada ('em solução seleções'), neutravidina foi revestida sobre o poço de uma placa de ELISA, MAXISORP "", As placas de ELISA MAXISORP foram bloqueados com caseína a 1% em PBS. Em paralelo, de proteína e de fagos de bibliotecas de Fab biotinilados foram bloqueadas durante 30 minutos em 0,5% de caseína em PBS, contendo um excesso de IgG humana, em tubos Eppendorf separados. Depois disso, os fagos bloqueados e a proteína biotinilada foram misturadas e incubadas durante 2 horas à temperatura ambiente. A mistura foi posteriormente adicionada aos poços revestidos neutravidina durante 20 minutos para capturar as partículas de fago de Fab que foram ligados a proteína biotinilada. As placas foram, em seguida, lavou-se quinze vezes com 0,05% de Tween-20 em PBS seguido por cinco vezes a lavagem com PBS. Os fagos ligados foram eluídos por 20 minutos usando tripsina, após o que a tripsina foi neutralizada com AEBSF inibidor de tripsina (Sigma).

[00405] Os eluídos de ambas as estratégias de seleção ('panning e em solução') foram adicionados a E. coli TG-l e incubadas a 37 º C durante a infecção do fago. Subsequentemente, as bactérias infectadas foram semeadas em placas de agar contendo ampicilina e glucose, e foram incubadas a 37 º C durante a noite. os clones individuais a partir das saídas de seleção foram rastreados quanto a ligação por ELISA ou FACS, dependendo do destino alvo.

[00406] Seleção de fagos transportando os fragmentos Fab que se ligam especificamente ao alvo humano de 'imunes dos fagos Fab bibliotecas usando células que expressam de forma estável a proteína alvo

[00407] Bibliotecas de fagos de Fab que foram gerados a partir de camundongos imunizados alvo foram selecionadas usando exibição em fagos em células que expressam o respectivo alvo. As linhagens de células estáveis que expressam PD-1 ou PD-L1 (Tabela 1) foram usadas para 1 st seleções redondos. As células foram bloqueadas com 10% de FBS em PBS. Após o bloqueio, o fago resgatado foram incubadas com células bloqueados. As células mais os fagos foram incubados durante 1 hora a 4 º C. Lavar as células (5 vezes foi realizada usando 1 ml de 10% de FBS em PBS. Os fagos ligados foram eluídos utilizando tripsina durante 20 minutos, após o que a tripsina foi neutralizada com AEBSF inibidor de tripsina (Sigma). O eluído foi adicionado a E. coli TG-1 e incubadas a 37 º C durante a infecção do fago.

Subsequentemente, as bactérias de fago-infectado foram plaqueadas em placas de agar contendo ampicilina e glucose, e foram incubadas a 37 º C durante a noite.

[00408] Para PD-Ll, segundo seleções redondas com células ES-2 expressando endogenamente HUPD-L1I foram realizados com o mesmo protocolo que foi usado para o l r ronda de seleção. Após seleção, os clones individuais foram rastreados quanto a ligação em FACS alvo.

[00409] Rastreio de clones Fab específicos alvo em

ELISA

[00410] De clones individuais, Fab solúveis foram preparados como descrito (J. Mol Biol. 1991 dezembro

[00411] 5; 222 (3): 581-97; JIJ Biol Chem. 1999 25 jun; 274 (26): 18218-30). Estes foram diluos 1: 5 em 4% de leite em pó desnatado (Marvel) em PBS (blockbuffer) e testados quanto ligação em ELISA com poços revestidos com o mesmo antígeno que foi usado na seleção. Fab ligados foram detectados por coloração com um anticorpo anti-myc (Roche; cat. N.

[00412] 11667203001) diluído 1: 1000 em blockbuffer, seguido por uma IgG anti-camundongo conjugado anticorpo-HRP (Jackson Immunoresearch; Ncat 715-035-150) diluído 1:.. 5000 em tampão de bloqueio. Após cada coloração do anticorpo, os poços foram lavados com PBS-T (PBS-0,05% v / v de Tween 20). Anticorpo secundário ligado foi visualizado por TMB /H2 0 2 a coloração e a coloração foi quantificada por meio de OD 450nm de medição. Os clones foram considerados para ligar o alvo quando a 450nm foi pelo menos três vezes superior ao sinal de fundo obtido com um Fab de controlo negativo.

[00413] O DNAcC que codifica VH é de todos os clones específicos TARGET foram sequenciados. Uma seleção de clones únicos com base em identidade sequência e análise de agrupamento foi então analisada emFACS, na ligação a DP-L1 expressa em células como descrito abaixo para os clones obtidos a partir das saídas de seleção celular.

Rastreio de clones Fab específicos alvo em FACS

[00414] De clones individuais, selecionados sobre células que expressam o respectivo alvo, Fab solúveis foram preparados como descrito (J. Mol Biol 1991 05 dezembro; 222 (3) : 581-97; J Biol Chem 1999 25 jun; 274 (26): 18218 -30). Estes foram testados para a ligação em FACS para células que expressam o humano e alvo macaque (Tabela 1) por incubação com uma mistura de 1: 5 amostra Fab diluída com 1: 1000 diluído anticorpo anti-myc (Gentaur; Ncat O4-c-Myc.. -9E10 em tampão FACS (0,5% de HI-FBS em PBS). Fab / complexos anti- myc ligados foram detectados por incubação com um anticorpo IgG de cabra anti-camundongo conjugado-APC (BD Bioscience; Ncat 550826) Diluído a 1:500 em tampão FACS. Depois de cada incubação do anticorpo, os poços foram lavados três vezes com tampão de SCAF.

[00415] As células coradas foram analisadas utilizando um instrumento FACS Accuri C6 (Becton e Dickinson). Os clones que foram considerados positivos quando a intensidade média de fluorescência foi pelo menos três vezes superior ao sinal de fundo obtido com um Fab de controlo negativo.

Exemplo 3 Caracterização de clones HUPD-L1 e HUPD-l específico Fab em formato IgG nova clonagem humana PD-L1 e PD-1l específico Fab para o formato IgG

[00416] Uma seleção de clones únicos, com base na sequência de CDR3 e as diferenças de linha germinal de VH, que humana ligado e proteína alvo de macaque expresso em células, foi, em seguida, re-clonado para a expressão de IgG plasmídeo tal como MV1452 (Figura 7), o qual continha a cadeia leve comum (Figura 1), utilizando a digestão Sfil- BstEII e ligadura da grupo de DNAc digerido de acordo com técnicas de biologia molecular normalizadas. Expressão de IgG biespecífico contendo um humano PD-L1 ou humana DP-1 específico Fab e uma toxina específica do tétano Fab

[00417] Os anticorpos biespecíficos foram geradas por co-transfeco transitia de dois plasmídeos que codificam IgG com diferentes domínios VH, usando uma engenharia CH3 proprietária

[00418] A tecnologia para garantir a eficiente heterodimerização e à formação de anticorpos biespecíficos. A cadeia leve comum presente em ambos os plasmídeos contendo a cadeia pesada, também é co-transfectados na mesma célula. Nos nossos pedidos co-pendentes (por exemplo, WO2013 / 157954 e WO2013 / 157953; aqui incorporados por referência) que se revelados — métodos e meios para produzir anticorpos biespecíficos a partir de uma única célula, através do qual são fornecidos meios que favorecem a formação de anticorpos biespecíficos, através da formação de anticorpos monoespecíficos. Estes métodos também podem ser favoravelmente empregues na presente invenção.

Especificamente, as mutações para produzir moléculas de IgG de comprimento completo, essencialmente, apenas biespecíficos preferidos são substituições de aminoácidos nas posições 351 e 366, por exemplo, L351K e T366K (numeração de acordo com a numeração UE) no primeiro domínio CH3 (a 'KK-variante"' da cadeia pesada) e substituições de aminoácidos nas posições 351 e 368, por exemplo, L351D e L368E no segundo domínio CH3 (a 'dE-variante' da cadeia pesada), ou vice-versa (Figura 2). Foi anteriormente demonstrado nos nossos pedidos co-pendentes de que a carga negativa da cadeia pesada DE-variante e carregado positivamente cadeia pesada variante KK- preferencialmente emparelhar para formar heterodímeros (os chamados 'DEKK moléculas biespecíficas).

[00419] Homodimerização de cadeias DE-variantes pesadas (de-de homodímeros) ou KK-variantes cadeias pesadas (homodímeros KK-KK) dificilmente ocorre devido a forte repulsão entre os resíduos carregados na interface do CH3- CH 3 entre as cadeias pesadas idênticas.

[00420] Genes de VH que codificam os anticorpos de ligação humana DP-L1 e PD-l descrito acima foram clonados no vector de expressão de IgG MV1452 que codifica o domínio CH3 carregado positivamente. A toxina do tétano (TT) anticorpo de segmentação (Figura 8) foi clonado no vector de expressão MV1377 IgG (Figura 9) que codifica para o domínio CH3 carregado negativamente. Células 293F Freestyle adaptado ao crescimento em suspensão foram cultivadas em frascos T125 num planalto agitador até uma densidade 3,0 x 10 6 células / ml. As células foram semeadas a uma densidade 0,3-0,5 x 10

6 cpelulas viáveis / ml em cada poço de uma placa de 24 poços de profundidade. As células foram transitoriamente transfectadas com uma mistura de dois plasmídeos que codificam para anticorpos diferentes, clonados no sistema de vector de propriedade. Sete dias após a transfecção, oO sobrenadante celular foi recolhido e filtrado através de um filtro de 0,22 uM (Sartorius). o sobrenadante foi esterilizado e armazenado a 4 º C até à purificação dos anticorpos. Purificação de IgG biespecífico

[00421] A purificação de IgG foi realizada em uma escala pequena (<500 ug), utilizando cromatografia de afinidade com proteína-A. purificações de pequena escala foram realizados sob condições estéreis em placas de 24 poços utilizando filtros de filtração. Primeiro, o pH do meio foi ajustado para pH 8,0 e, subsequentemente, de IgG contendo os sobrenadantes foram incubados com esferas de proteína A- Sepharose CL-4B (50% v / v) (Pierce) durante 2 horas a 25 *º Cc em uma plataforma com agitação a 600 rpm. Em seguida, as esferas foram colhidas por filtração. As esferas foram lavadas duas vezes com PBS pH 7,4. IgG ligada foi então eluida a pH 3,0 com 0,1 M de tampão de citrato e o eluído foi imediatamente neutralizado com Tris a pH 8,0. troca de tamp foi realizada por centrifugação usando multiscreen Ultracel 10 multiplacas (Millipore). As amostras foram finalmente colhidas em PBS pH 7,4. A concentração de IgG foi medida utilizando octeto. As amostras de proteína foram armazenadas a 4 º C.

[00422] IgG quantificação usando Octeto

[00423] Para determinar a quantidade IgG purificada, a concentração de anticorpo foi determinada por meio de análise Octeto utilizando biossensores proteína-A (Forte- Bio, de acordo com as recomendações do fornecedor) usando humano total de IgG (Sigma Aldrich, cat. Nr. 14506) como padrão.

Especificidade análise HUPD-LIxTT e HUPD-l1xTT biespecífica IgG

[00424] Os anticorpos biespecíficos foram testados para a ligação em FACS para as linhagens de células estáveis que expressam a ortólogos de macaco e humano relevante (Tabela 1) e as células wt. Portanto, as células foram recolhidas e diluídas para 10 6 culas / ml em tampão FACS (PBS / BSA a 0,5% / EDTA 0,5 mM). 1-2 x 10 5 culas foram adicionadas a cada poço em uma placa de 96 poços com fundo em U. As células foram centrifugadas durante 2 minutos a 300 ga4ºC. oO sobrenadante foi desprezado, invertendo a placa (s). 50 de cada amostra de IgG a uma concentração de 10 foi adicionado ug / ml e incubadas durante 1 h em gelo. As células foram centrifugadas uma vez, o sobrenadante foi removido e as células foram lavadas duas vezes com 150 ul de tampão de FACS.

[00425] 50 ul diluído a 1: 400 de cabra anti-humano e incubou-se durante 30 minutos em gelo no escuro IgG PE (Invitrogen). Após a adição de tampão de SCAF, as células foram centrifugadas uma vez, o sobrenadante foi removido e as células foram lavadas duas vezes com tampão de SCAF. As células foram analisadas num citômetro de fluxo FACS Canto (Becton e Dickinson) em uma configuração HTS. A ligação dos anticorpos às células foi avaliada medindo o

[00426] intensidade fluorescência média (IFM) da população de células coradas. os anticorpos foram considerados para ligar o seu alvo quando o MFI foi de, pelo menos, cinco vezes a da mesma população de células coradas com uma (controlo negativo) anticorpo não-ligação (dirigido para o toxóide tetânico).

[00427] Binning HUPD-LlI e HUPD-l específico Fab braços presentes na PD-LIxTT e PD-lxTT biespecífico IgG na capacidade de bloquear o ligante

[00428] HUPD-L1 e HUPD-l A ligação clones foram testados quanto à sua capacidade para bloquear a interação de PD-L1 com DP-l1. Para os braços PD-L1 de Fab, a capacidade para bloquear a interação entre DP-L1l e CD80 também foi avaliada. Portanto (sistemas R & D; Ncat 1086-PD) PDl-Fc (R & D Systems; Ncat 140-Bl) ou CD80-Fc foi revestida a uma placa Maxisorp a 1 e 3 ug / ml, respectivamente. Poços revestidas foram bloqueadas com BSA a 4% em PBS. Em seguida, 0,55 ug / ml biotinilado PD-L1 (BPS Bioscience; Ncat 71105) foi adicionado na presença ou ausência de IgG na gama de entre 0,15 e 20 ug / ml. Biotinilado ligado PD-Ll1 foi detectada com estreptavidina conjugada com HRP (BD Bioscience: Ncat 554066) diluídas 1: 2000 em tampão de bloqueio. Depois de cada passo de incubação, a placa de ELISA foi lavada três vezes com PBS-T (PBS-0,05% v / v de Tween 20). Estreptavidina ligado foi visualizado por H / TMB 2 O 2 a coloração e a coloração foram quantificada por meio de OD 450nm de medição. Os clones foram considerados para bloquear a interação da DP-l com PD-Ll quando o sinal de

ELISA foi reduzida mais do que 70% a uma concentração de 10 ug / ml de IgG (PD-LlIxTT ou PD-lxTT), em comparação com um controlo em que foi adicionado um anticorpo de competição TT específico. Ver Figura 10 para os resultados obtidos com uma seleção representativa do painel de DP-l e anticorpo PD-L1 testado como PD-lxTT ou PD-L1xTT moléculas biespecíficas. Classificação de afinidade HUPD-L1 e HUPD-1 específico Fab braços presente no PD-L1xTT e PD-lxTT IgG biespecífica

[00429] Os anticorpos biespecíficos que se ligam as respectivas ortólogos humanos e de macaco em FACS foram classificados em afinidade aparente para ambos os ortólogos em FACS. Portanto, as linhagens de células estáveis que expressam os respectivos ortólogos (Tabela 1) foram recolhidas e diluídas para 10 6 culas / ml em tampão FACS (PBS / BSA a 0,5% / EDTA 0,5 mM). As células foram centrifugadas durante 2 minutos a 300 g a 4 º C. O sobrenadante foi desprezado, invertendo a placa (s). 50 de cada amostra de IgG, em um ll1-passo, duas vezes de série de diluição variam de 10 a 0,01 pg / ml, foi adicionada e incubada durante 1 h em gelo. As células foram centrifugadas uma vez, o sobrenadante foi removido e as células foram lavadas duas vezes com 150 ul de tampão de FACS. 50 ul diluído a 1: 400 de cabra anti-humano e incubou-se durante minutos em gelo no escuro IgG PE (Invitrogen). Após a adição de tampão de SCAF, as células foram centrifugadas uma vez, o sobrenadante foi removido e as células foram lavadas duas vezes com tampão de SCAF. As células foram analisadas num citómetro de fluxo FACSCanto (Becton e Dickinson) em uma configuração HTS. A ligação dos anticorpos às células foi avaliada através da medição da intensidade fluorescência média (IFM) da população de células manchadas. Os anticorpos foram considerados para ligar o seu alvo quando o MFI foi de, pelo menos, cinco vezes a da mesma população de células coradas com uma (controlo negativo) anticorpo não-ligação (dirigido para o toxóide tetânico). Isolamento PBMC

[00430] sangue completo humano foi obtido a partir de crostas inflamatórias (Sanquin) e diluiu-se 1: 1 com PBS. tubos Leucosep (Greiner Bio-One cat. n. 227 290) foram cheios com 17,5 m de Ficoll-Paque Plus (Amersham Biosciences cat. n. 17-1440-02) aqueceu-se à temperatura ambiente (RT). Ficoll-Paque Plus foi centrifugada durante 30 segundos a 1000 xg à temperatura ambiente. 30 ml de sangue total diluído foi vertida em cima. Os tubos foram centrifugados a 1000 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente e a interface de mononucleares PBMC foram colhidas, lavadas duas vezes em PBS e ressuspensas em 250 ul de PBS. As PBMCs foram contadas e reajustado a 1 x 106 / ml em meio de cultura de tecidos (DMEM com FCS a 10%) e congelados para baixo através da adição de um volume igual de meio de congelação de gelo frio (80%) meio de cultura / DMSO a 20%). As células foram armazenadas em alíquotas de 1 mL a -150 º C até à sua utilização. Ensaio SEB

[00431] A atividade funcional dos anticorpos biespecíficos foi determinada utilizando PBMC estimulada por Staphylococcus enterotoxina B (SEB). SEB ativa especificamente células T que expressam a Vp 3, 12, 14, 15, 17 e cadeia do receptor de células 20T. PBMC a partir de 3 dadores foram descongeladas, lavadas, contadas e ressuspensas em meio de cultura (RPMI 1640 mais 10%. FBS inativado pelo calor) a uma concentração de 2x106 células / ml. As células foram semeadas em placas de fundo plano de 96 poços (2x105 células / cavidade) na presença de SEB (2000 ou 125 ng / ml). foram adicionadas diluições em série de anticorpos a partir de 20 ug / ml. Cada placa continha uma diluição em série de negativo (PG1337 específico TT) e positivaanticorpo de controlo (ipilumumab, nivolumab (PD- 1xPD-L1), LAG3.5 (LAG-3xPD-1) que serviram como controlos de referência. As células foram estimuladas durante 3 dias a 37 º C, 5% de CO2 em 95% de humidade relativa antes para ser testado para a secreção de citoquina e / ou expressão na superfície celular de antígenos.

Ensaios de citocinas

[00432] ELISA: Após a estimulação de células T ou PBMC em várias horas, as placas foram centrifugadas e o meio foi removido. Os níveis de citocinas foram detectados por AlphaLISA em conformidade com as instruções do fabricante (Perkin Elmer). As concentrações foram calculadas com base na curva padrão.

[00433] Ensaio Luminex: Um outro método utilizado para determinar a produção de citocinas in vitro foi desenvolvido usando análise multiplex por eBioscience. Os níveis de IFN-y, IL-2, e TNF-a foram medidos em sobrenadantes de cultura, seguindo as instruções do fabricante. Os resultados foram analisados por software de análise de eBioscience.

Anticorpos de referência

[00434] Os anticorpos que inibem a função de DP-1 e DP-L1 são conhecidos no estado da técnica.

[00435] anticorpos monoclonais bivalentes foram construídos de acordo com à informação publicada e expressos em células CHO-S. O anti-DP-l1 humanizado Nivolumab foi gerado com base na informação divulgada na CA 02607147. O MPDL3280A anticorpo anti-PD-Ll foi baseada na informação divulgada WO2010077634Al Genentech Inc).

[00436] Ensaio de repórter de DP-1 / DP-L1 bloqueio

[00437] A DP-l / PD-Ll ensaios repórter bloqueio utilizados foram desenvolvidos pela Promega e baseiam-se em um sistema de duas células; As células CHO que expressam PD- Ll1, e de um ativador de células T e um repórter celular Jurkat / NFAT-RE Linha super-expressando DP-l. As PD-l1 / ensaios repórter bloqueio PD-Ll1 foram realizados utilizando o formato descongelamento e utilização de Promega. PD-L1 células (cat. No. C187103) expressando foram descongeladas em 14,5 ml de recuperação celular (DMEM / F12 contendo 10% de FBS). Em seguida, 50 ul de suspensão de células foi adicionado às cavidades internas de um poço meia placa 96 área (Corning, cat. No. 3688). As placas foram incubadas durante a noite a 37 º C, 5% de CO, em 95% de humidade relativa. No dia seguinte, o meio de cultura foi removido e o anticorpo de teste 20 ul em meio de ensaio (RPMI1640 contendo 4% de FBS) em uma diluição em série (a partir de uma concentração de 10 ug / ml) foi adicionado a cada poço. Cada placa continha uma diluição em série de negativo (PG1337 específico TT) e anticorpo de controlo positivo (um controle baseado em Nivolumab, aqui referidos como 5C4, e um controlo com base na Atezolizumab, aqui referido como MPDL3280A ou YW243.55.S70) que serviram como controle de referência. PD- 1 células efetoras (Ncat. C187105) foram descongeladas em 5,9 ml de meio de ensaio e 20 ul de suspensão de células foi adicionado a cada poço. As placas foram incubadas durante 6 horas ou durante a noite a 37 º C, 5% de CO, em 95% de humidade relativa. 40 ul de lucilerase (Bio-Glo Luciferase Assay System, cat. No. G794L) foi adicionado no dia seguinte e a quantidade da atividade luciferase foi medida utilizando aBioTek Sinergia 2 Multi-Mode leitor de microplacas. A potência foi medida como a atividade luciferase em comparação com o anticorpo de controlo negativo. Exemplo 4 Rastreio do painel anticorpo a PDlIxPD-L1

[00438] VH a partir do painel da DP-1 e anticorpo PD- L1l foram novamente clonadas nos vectores de Fc-silenciadas por engenharia carregados de tal forma que após a expressão das cadeias pesadas de anticorpos hetero dimerização de cadeias pesadas é forçado resultando na geração de anticorpos biespecíficos após a transfecção. As PD-l braços Fab foram clonados no vetor MV1625, enquanto os braços PD-L1 Fab foram novamente clonadas no vector MVl1624. anticorpos de DP-1 e DP-L1 foram combinadas com um MF1337 TT segmentação braço Fab de anticorpos biespecíficos gerados segmentação DP-1 ou PD-L1 de um modo monovalente. Os anticorpos biespecíficos foram ensaiados em uma série de titulação de registo semi (concentração inicial em 10 ug / ml) no DP-1 / PD-L1 bloqueio ensaio de repórter para classificar os anticorpos para bloquear a potência. O painel de anticorpos PD-Ll1 em formato monovalente pode ser classificado, enquanto o painel de anticorpos DP-l em formato monovalente mostrou capacidade bloqueamento insuficiente para um escalão no DP-1l ensaio de repórter de bloqueio / PD-Ll. Portanto, PD-l Os anticorpos foram produzidos em um formato bivalente e novamente testados no ensaio de repórter de DP-1 / PD-L1 bloqueio.

[00439] Com base nos dados da atividade anticorpos foram selecionados a partir da DP-1 ou o painel de anticorpo PD-L1 para o PDIXPD-L1 tela biespecífico subsequente. A atividade dos candidatos selecionados no ensaio de repórter é mostrada na Tabela 2 e 3, respectivamente.

[00440] O painel de Fab PD-l foi composto por atividade funcional de variantes dentro de três grupos de anticorpos, isto é, A, Be (C, ea variante D não-funcional, enquanto o painel de PD-L1 de Fab foi composta de anticorpos derivados a partir de onze grupos de anticorpos. Tanto a DP- 1 e o painel de anticorpo PD-Ll incluído um anticorpo funcionalmente inativo.

[00441] Um total de 120 anticorpos biespecíficos PD- 1xPD-L1 compreendendo 10 diferentes PD-l braços Fab e 12 braços PD-L1 Fab diferentes foram produzidos no formato de 24 poços e de IgG purificado. Todos os anticorpos foram testados quanto à sua capacidade para induzir a express de luciferase dependente da dose em uma titulação de série no DP-l1 sistema repórter / PD-Ll-luc. Nivolumab ou MPDL3280A foram incluídos como anticorpos de referência. A Figura 11, mostra a indução de luciferase de uma seleção de anticorpos biespecíficos que mostram uma vasta variedade respostas.

[00442] A Tabela 4 mostra a atividade percentual dos anticorpos biespecíficos, em comparação com MPDL3280A. combinações PD-l1xPD-Ll1 contendo um braço Fab não-funcional, foram menos eficazes. Além disso, uma combinação dos mais potentes PD-Ll de Fab com os mais potentes de DP-l de Fab não resultou no anticorpo biespecífico mais potente PD-1xPD- Ll. Alguns braços PD-Ll1 de Fab, tal como o MF5561, MF5442 e MF5382 eram altamente potente com diversos DP-l braços Fab, enquanto que por exemplo MF5359 não foi. As PD-l braços Fab com a atividade mais elevada induzida uma potente atividade com vários braços PD-L1 de Fab.

[00443] Os anticorpos biespecíficos mais potentes de DP-1xPD-L1 foram testados em uma série de titulação num ensaio de SEB. A Figura 12, mostra uma experiência representativa de um ensaio de SEB realizados em três dadores estimulados com 2 ug / ml de SEB. Todas as concentrações de DP-1xPD-L1 testados mostraram uma indução relacionada com a dose de IL-2 e IFN-y (não mostrado). Máximos induzida por IL-2 níveis obtidos estavam na gama de 50-100 ng / ml. A maior parte dos anticorpos biespecíficos PD-l1xPD-Ll mostrou uma potência mais elevada, em comparação com nivolumab. A seguir a 10 ug / ml a maioria dos anticorpos biespecíficos PD-1xPD-L1 foram mais potentes em comparação com ipilumumab. Assim, os anticorpos PD-lxPD-Ll são muito eficazes em estimular respostas de células T.

Exemplo 5 Clonagem e expressão de DP-1xPD-L1 variantes Fab

[00444] Um total de 15 de DP-l1 e 25 braços PD-Ll1 de Fab foram combinadas, para gerar 65 anticorpos biespecíficos. As sequências dos braços Fab são representadas nas Figuras 3 e 13.

[00445] Os 65 regiões VH de PD-L1 e DP-1 do painel de Fab foram reclonados em vectores de expressão modificados de tal modo que a expressão das forças de anticorpos heterodimerização das cadeias pesadas, resultando na geração de anticorpos biespecíficos após a transfecção. As regiões VH dos PD-l braços Fab foram clonados no vector de MV1625, e aqueles dos braços PD-L1 de Fab foram clonados no vector de MV1624. Ambos os vectores de abrigar mutações adicionais nas regiões CH2 e CH3 codificantes da proteína IgG: MV1625 e MVI624 ambos contêm substituições L235G e G236R que Abrogados Fey receptor e interações Clq do anticorpo resultante. MVl625 também conter as substituições de aminoácidos L351D e L368E no domínio CH3 (a 'variante DE' da cadeia pesada), enquanto MV1624 contém as substituições de aminoácidos L351K e T366K no domínio CH3 (a 'variante de KK' da cadeia pesada).

[00446] A seguir clonagem nos vectores relevantes, sequências de DNA foram confirmadas por PCR. DNA Midiprep foi preparado para todas as construções. Diferentes pares de vectores - um vector que transporta um clone anti-DP-1 e o outro transportando um clone anti-PD-Ll - foram co- transfectados em células 293-F FreeStyle em duplicado para produzir proteínas biespecíficos (65 no total). Os IgG produzidos em cada poço das placas de 24 pos foram, em seguida, purificados e o tampão foi trocado utilizando colunas dessalinização Zeba de acordo com as instruções do fabricante; rendimento de proteína foi então quantificado por OD280 utilizando Nanodrop. Vista geral dos Números PB e sua composição MF. PD-1 arm PD-Li1 arm PB number PD-1arm PD-L1 arm PB number MF6076 MF5442 PB15527p04 MF7685 MF5424 PBI6661p01 MF6076 MF7691 PB1I6635p01 MF7686 MF5424 PBI6662p01 MF6076 MF7690 PB16679p01 MF7685 MF5424 PB1I6661p02 MF6076 MF7689 PB1I6636p01 MF7684 MF5424 PB1I6663p02 MF6076 MF7688 PB16637p01 MF7684 MF5424 PBI6663p01 MF6076 MF7688 PB16637p02 MF7687 MF7703 PBI6664p01 MF7699 MF7691 PB16639p01 MF7686 MF7703 PBI6666p02 MF7699 MF7690 PB1I6680p01 MF7685 MF7703 PBI6665p01 MF7699 MF7689 PB16640p01 MF7686 MF7703 PBI6666p01 MF7699 MF7688 PB1I6641p01 MF7685 MF7703 PBI6665p02 MF7699 MF7688 PBI6641p02 MF7684 MF7703 PB16667p02 MF7698 MF7691 PB16643p01 MF7684 MF7703 PB1I6667p01 MF7698 MF7690 PBI6681p01 MF6936 MF5442 PB1I5532p03 MF7698 MF7689 PB1I6644p01 MF6929 MF7691 PBI6688pO1l MF7698 MF7688 PB1I6645p01 MF6929 MF7690 PBI6689p01 MF7698 MF7688 PB16645p02 MF6929 MF7689 PBI6690p01 MF6076 MF5553 PB15443p03 MF6929 MF7688 PBI6691p01 MF6076 MF7702 PB1I6648p01 MF6929 MF7688 PBI16691p02 MF6076 MF7702 PBI6648p02 MF6936 MF5557 PB15500p03 MF7699 MF7702 PB1I6650p01 MF6929 MF7694 PBI16693p01 MF7699 MF7702 PB1I6650p02 MF6929 MF7693 PBI6694p02 MF7698 MF7702 PBI6652p01 MF6929 MF7692 PBIG6695p03 MF7698 MF7702 PB16652p02 MF6929 MF7694 PB16693p03 MF6256 MF5439 PB15522p03 MF6929 MF7692 PBI6695p04 MF6256 MF7700 PB1I6682p01 MF6974 MF5442 PB15529p03 MF6256 MF7701 PBI6655p02 MF6974 MF7691 PBI16671p01 MF6256 MF7701 PBI6655p01 MF6974 MF7690 PBI6698p01 MF6935 MFS5424 PB15479p03 MF6974 MF7689 PB16672p01 MF6935 MFS5424 PB15479p05 MF6974 MF7688 PB16673p01 MF6935 MF7703 PBI6659p01 MF6974 MF7688 PB16673p02 MF7687 MF5424 PBI6660p01 MF6256 MF7697 PBI6675p01 MF7686 MF5424 PB16662p02 MF6256 MF7696 PB16676p01 MF6256 MF7695 PB16677p01 EXEMPLO 6 Confirmação de ligação ao antígeno de DP-l1 e DP-L1 Fab por

ELISA Limitação de antígeno de ELISA para a DP-1 ou PD-LI1

[00447] Para confirmar a ligação do DP-1 e DP-L1 Fabs presente nas IgG biespecíficos, foram realizadas ELISASs de titulação de antígeno. Neste ELISA, uma diluição em série de

DP-1l1 ou antígeno PD-L1 foi revestido em placas de 96 poços. As placas foram, em seguida, incubadas com os anticorpos de teste, que foram detectados utilizando um anticorpo anti- humano de camundongo secundário conjugado com peroxidase de rábano (HRP) que converte um substrato incolor de um corante que é facilmente visível. O PG1337 anticorpo de controlo negativo TT específica foi incluído em todas as placas. O valor de referência anti-HUPD-1l do anticorpo 5C4 (baseado em Nivolumab) foi incluído como um controlo positivo em todas as placas revestidas com proteínas DP-l, e de referência anti-HUPD-L1 anticorpo YW243.55.S70 (baseado em Atezolizumab) foi incluído como um controlo positivo em todas as placas revestidas com proteínas DP-L1.

[00448] Para esse efeito, placas de 96 poços Nunc Maxisorp foram revestidos durante a noite a 4 º C com humano (R & D Systems, cat. N. 156-B7) PD-Ll-Fc ou humano sistemas R & D DP-l-Fc (, gato. Nenhuma. 1086-PD) em 3 vezes diluições em série 7-passo a partir de 10 ug / mL até 0,014 º g /mL em PBS em cada coluna da placa. No dia seguinte, as placas de ELISA foram lavados três vezes com 300 ul de PBST, e bloqueadas por enchimento dos poços com 2% de BSA em PBS e incubando durante 1 hora à TA. As placas foram esvaziadas e anticorpos PD-lxPD-Ll1 e os anticorpos de controlo PG1337 5C4 e YW243.55.S70 foram adicionados a 5 ug / ml em PBS-BSA a 2% (50 / po), uma coluna por anticorpo. Após incubação durante 1 h à temperatura ambiente, os poços foram lavados três vezes com 300 ul de PBST antes da adição do anticorpo secundário 50 mL sob a forma de rato HRP-conjugado IgG anti- humano diluído de 1 (BD, cat no 555,788): 2000 em PBS-BSA a

2%. Após incubação durante 1 h à temperatura ambiente, os poços foram lavados três vezes com 300 ul. de PBST antes da adição de peroxidase TMB substratos A (BD, cat. No. 51- 2506KC) e B (BD, cat. No. 51-2607KC) em uma proporção de 1: 1, 50 mL por poço. Após um máximo de 10 minutos, a reação foi interrompida pela adição de uma solução 1 Mem H 2 SO 4 a 50 / po. Um leitor de microplacas ELx808 então medida a densidade óptica (DO) a um comprimento de onda de 450 nM.

[00449] Os resultados da limitando humano específico IgG ELISA para a DP-1 são apresentados na Figura 14 e aqueles para a DP-Ll mostrado na Figura 15. Os gráficos mostram a densidade óptica (OD) a 450 nm, como medido pelo leitor de microplacas para concentrações crescentes de revestido antígeno. Todos os braços Fab testados bem ligado a DP-l1 e DP-L1 e o nível de ligação foi semelhante ao dos anticorpos de referência, fazendo com que todos os braços Fab adequado para uso em um anticorpo PD-1xPD-L1 biespecífico. Exemplo 7 Atividade de anticorpos na DP-l / ensaio de repórter de bloqueio PD-L1

[00450] A atividade bloqueio dos anticorpos PD-1xPD- L1 biespecíficos gerados foi testado in vitro num ensaio de repórter de bloqueio fisiologicamente relevante DP-1 / PD- Ll desenvolvido pela Promega Corporation, EUA. O ensaio baseia-se num sistema de duas células, em que as células CHO que expressam PD-L1 e um ativador do receptor de células T são co-cultivadas com uma linha de Jurkat / NFAT-RE célula que super-expressa o repórter DP-l. As células T de Jurkat contêm um gene repórter da luciferase que pode tornar-se ativado por meio do (fator nuclear de células T ativadas) NFAT via. Interações da DP-l com a ativação desta via PD-L1 inibe. No entanto, o bloqueio da interação de DP-1 / PD-L1 com anticorpos contra a DP-l ou PD-Ll pode ativar a via de NFAT. Portanto, quanto maior o grau de DP-1 / PD-L1 bloqueio, quanto maior for a ativação do gene repórter da luciferase. Para este fim, diluições em sie de cada um dos anticorpos foram adicionados a células CHO DP-Ll-expressam antes da adição de células repórter de Jurkat / NFAT-RE super- expressando DP-1. Métodos Ensaio de repórter de DP-1 / DP-L1 bloqueio

[00451] A DP-l / PD-Ll ensaios repórter bloqueio utilizados foram desenvolvidos pela Promega e baseiam-se em um sistema de duas células: células CHO que expressam PD-L1 e um ativador de células T, e uma PD- linha Jurkat / NFAT- RE célula que super-expressa repórter 1. As PD-l / ensaios repórter bloqueio PD-Ll foram realizados utilizando o formato descongelamento e utilização de Promega. Células PD- Ll-expressam (cat. No. C187103) foram descongeladas em 14,5 mL de recuperação celular (DMEM / F12 contendo 10% de FBS). Em seguida, 50 ul de suspensão de células foi adicionado às cavidades interiores de uma placa de 96 poços meia área (Corning, cat. No. 3688). As placas foram incubadas durante a noite a 37 º C, 5% de CO 2, em 95% de humidade relativa. No dia seguinte, o meio de cultura foi removido e 20 pL de anticorpo de teste em meio de ensaio (RPMI 1640 contendo 4%) de FBS) em uma diluição em série (a partir de uma concentração de 10 ug / mL) foi adicionada a cada poço. Cada placa continha uma diluição em série do anticorpo negativo, dirigido contra o toxóide tetânico (PG1337) e controlo positivo anti-PD-Ll anticorpo (YW243.55.S70; baseado em Atezolizumab) que serviram como controlos de referência. PD- 1 células efetoras (Ncat. C187105) foram descongeladas em 5,9 ml de Meio de Ensaio e 20 ul de suspensão de células foi adicionado a cada poço. As placas foram incubadas durante 24 horas a37 º C, 5% de CO 2, em 95% de humidade relativa. 40 ul de substreate luciferase (Bio-Glo Luciferase burro-y Sistema, cat. No. G794L) foi adicionado no dia seguinte e a quantidade da atividade luciferase foi medida utilizando uma BioTek Synergy 2 Multi-Mode leitor de microplacas. A potência foi medida como a atividade luciferase em comparação com o anticorpo de controlo positivo, YW243.55.S70 Resultados

[00452] O agarau de bloqueio depois de 24 horas é mostrado na Tabela 6, onde os dados mostram a indução da atividade da luciferase relativa em comparação com a atividade medida nos poços aos quais não se adicionou qualquer anticorpo. A atividade percentual foi calculada com base na área sob a curva (AUC) em relação ao controlo positivo anti-PD-L1 anticorpo YW243.55.S70. Todos os anticorpos biespecíficos testados PD-1xPD-L1 mostrou atividade bloqueio claro. Exemplo 8 FACS de ligação de DP-l x PD-Ll1 lgGs biespecíficos para células que expressam o antígeno

[00453] Os dois anticorpos biespecíficos PD-l x PD- L1 foram testados quanto à ligação a DP-l e DP-Ll em linhagens de células CHO que expressam estavelmente cada antígeno. As linhagens celulares utilizadas para esta FACS foram CHO-HUPD-L1, CHO-S-HUPD-1, e células CHO não transfectadas (células negativas). Resumidamente, estas linhagens de células foram coradas com concentrações crescentes de IgG biespecífico, parental IgG ou IgG de controlo, seguido por detecção com IgG de cabra-PE anti- humano. Os controlos positivos foram referência anti HUPD- l-anticorpo 5Cl (baseado em Nivolumab) e de referência anti- HUPD-L1 anticorpo YW243.55.S70 (baseado em Atezolizumab); o controlo negativo foi anti-tétano PG1337 anticorpo toxina.

[00454] Para este fim, estáveis de células CHO-HUPD- L1 (MCO866) e células CHO-S-HUPD-1 (MCO617) foram recolhidas e diluídas para 10º células / mL em tamp FACS (PBS / 0,5% BSA / EDTA 2 mM). 0.5-2 x 10º células foram adicionadas a cada poço em uma placa de 96 poços de fundo em U (BD, cat. No. 353910). As células foram centrifugadas durante 3 minutos a 300 g a 4 º C. O sobrenadante foi desprezado, invertendo a placa. As células foram lavadas por adição de 200 ul de tampão de FACS gelada. As células foram novamente centrifugadas durante 3 minutos a 300 g em 4º C e o sobrenadante é descartado como antes. 40 ul de cada amostra de IgG foi adicionado (3-dobra 9-passo de diluição em série a partir de 10 ng / ml) e as células foram incubadas durante min em gelo no escuro. As células foram então lavadas duas vezes, começando com a adição direta de 200 ul de FACS gelada tampão, seguido por centrifugação durante 3 minutos a 300 g a 4 º C e remoção do sobrenadante. coloração de anticorpo secundário foi realizada por adição de 40 ul de cabra anti-humana IgG-PE (3 ug / mL;.. Invitrogen, Ncat H10104), e incubando as placas durante 30 minutos em gelo no escuro. As células foram novamente lavadas duas vezes com 200 ul de FACS gelada tampão e ressuspensas em 50-200 ul de tampão de FACS. As células foram analisadas num citómetro de fluxo FACS Canto (Becton e Dickinson) num elevado rendimento configuração amostrador (HTS). A ligação dos anticorpos às células foi avaliada através da medição da intensidade fluorescência média (IFM) da população de células manchadas. Os anticorpos foram considerados para ligar o seu alvo quando o MFI foi de, pelo menos, cinco vezes a da mesma população de células coradas com o anticorpo de controlo negativo. Resultados

[00455] A ligação dos dois IgG biespecíficos a PD-L1 e DP-l1 e que um dos anticorpos de referência é mostrado na Figura 16 Os dados mostram MFI detectada por FACS na PD-L1 e DP-l expressando células CHO coradas com concentrações crescentes de biespecífico IgG ou IgG de controlo. Estes resultados mostram que ambos os IgG biespecíficos reconhecido ambos os alvos, quando expresso em células CHO e que o grau de ligação foi semelhante ou melhor do que a dos anticorpos de referência. Exemplo 9 FACS de ligação de DP-l1 x PD-Ll1 biespecífico IgG a células T ativadas FACS do ensaio de ligação utilizando células T humanas ativadas

[00456] anticorpos biespecíficos dois PD-l x PD-L1 foram também testados quanto à ligação a DP-l e DP-L1 em células T ativadas. Resumidamente, placas de 96 cavidades foram revestidas durante a noite com anticorpo anti-CD3. células T purificadas a partir de um único dador, em seguida, foram adicionadas e cultivadas durante 3 dias. Após 3 dias as células T ativadas foram recolhidas e reunidas e utilizadas num ensaio de FACS para comparar a ligação dos IgG biespecíficos com a dos seus IgG bivalentes monoespecífico parentais. Os controlos positivos foram referência anti-HUPD-l 5C4 anticorpo, de referência anti- HUPD-L1 anticorpo YW243.55.S70; o controlo negativo foi anti-tétano PG1337 anticorpo toxina. Métodos Purificação de células T

[00457] Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de dadores saudáveis foram descongeladas e 9 volumes de meio de cultura (RPMI 1640 com 10% (oi) de FBS inativado pelo calor) foi adicionado gota a gota. As células foram centrifugadas durante 10 minutos a 200 g à temperatura ambiente. O sedimento de células foi ressuspenso em 10 mL de meio de cultura e as células foram deixadas em repouso por incubação durante a noite a 37 º C, 5% de CO 2 , em 95% de humidade relativa. No dia seguinte, os linfócitos T foram isolados usando o enriquecimento de células T EasySep procedimento de purificação (pan CD3) como descrito pelo fabricante (Stem célula gato Technologies tt 19051). O procedimento EasySep usa seleção negativa. Resumidamente, os PBMCs foram centrifugadas durante 10 minutos a 200 g à temperatura ambiente. O sedimento celular foi ressuspenso em

[00458] Tampão EasySep a uma concentração de 5x107 células / mL. 50 ul de FasySep T humanas celular Enriquecimento cocktail foram adicionados a cada ml de volume da célula, misturada e deixada a incubar durante 10 minutos à RT. Em seguida, 50 ul de EasySep D partículas magnéticas foram adicionados a cada ml de volume de células e deixa-se incubar durante 5 minutos a RT. O volume total foi levado para 2,5 mL com tampão de EasySep, e depois de se misturar a suspensão de células foi transferida para um ml de fundo redondo de 5 tubo Falcon (BD Biosciences, cat. No. 352235). Em seguida, o tubo foi colocado o íman permitindo que a fracção celular indesejada para ser ligada ao íman durante minutos à TA. Em seguida, o tubo foi invertido e a fracção de células T purificadas foi decantado para um novo tubo contendo 7,5 ml de meio de cultura. As células foram colhidas por centrifugação a 10 minutos a 200 g à temperatura ambiente e subsequentemente ressuspenderam-se na uma concentração de 1x10 6 culas / mL em meio de cultura. Ensaio de ligação FACS

[00459] Um dia antes do início do ensaio, placas de 96 poços de fundo plano (Cellstar, cat. No. 655180) foram revestidas durante a noite a 4 º C com 5 ug / mL de anti-CD3 (OKT3 clone, eBioscience, cat. N. 16-0037-85). No dia seguinte, as placas de cultura foram lavadas duas vezes com PBS e 100 ul de suspensão de células T foi adicionado a cada poço (100 mil células / poço). As placas foram incubadas a 37º C, 5% de CO7 durante 3 dias. As células T ativadas foram colhidas pipetando suavemente para cima e para baixo algumas vezes usando uma pipeta de canais múltiplos. As células foram reunidas, misturadas e transferidas para com fundo em U de

96 poços de ensaio de FACS placas (BD, cat. No. 353910) em

0.2-5 x 10º células por po.

[00460] Para a análise FACS, as células foram centrifugadas durante 3 minutos a 300 g a 4 º C.

[00461] O sobrenadante foi desprezado, invertendo a placa. As células foram lavadas por adição de 200 ul de tampão de FACS gelada. As células foram novamente centrifugadas durante 3 minutos a 300 g a 4 º C e o sobrenadante é descartado como antes. 40 ul de cada IgG biespecífico, foi adicionado parental IgG ou IgG de controlo de amostra (8-passo semi-log de titulação a partir de 20 ug / ml) e as células foram incubadas durante 30 min em gelo no escuro. As células foram então lavadas duas vezes, começando com a adição direta de 200 ul de FACS gelada tampão, seguido por centrifugação durante 3 minutos a 300 g a 4 º Ce remoção do sobrenadante.

[00462] A coloração de anticorpo secundário foi realizada por adição de 40 ul de cabra anti-humana IgG-PE (3 ug / mL;.. Invitrogen, Ncat H10104), e incubando as placas durante 30 minutos em gelo no escuro. As células foram novamente lavadas duas vezes com 200 ul de FACS gelada tampão e ressuspensas em 50-200 ul de tampão de FACS. As células foram analisadas num citômetro de fluxo FACSCanto (Beeton Dickinson e) em um alto rendimento configuração amostrador (HTS). A ligação dos anticorpos às células foi avaliada através da medição da intensidade fluorescência média (IFM) da população de células manchadas. Os anticorpos foram considerados para ligar o seu alvo quando o MFI foi de, pelo menos, cinco vezes a da mesma população de células coradas com o anticorpo de controlo negativo. Resultados

[00463] Os resultados de FACS do ensaio de ligação são apresentados na Figura 17. Os dados mostram MFI detectada por FACS em células T ativadas humanas coradas com concentrações crescentes de IgG. Os gráficos comparar a ligação dos dois IgG biespecíficos e os IgGs parentais e mostram que todas as IgG específicos ligados a células T ativadas. O nível máximo de ligação para as IgG biespecíficos foi maior do que a de ambos os IgGs bi valentes monoespecífico parentais e as IgGs de controlo positivo. Exemplo 10 Determinação de afinidade de braços anti-PD-Ll1 de Fab para PD-Ll1 por meio de SPR

[00464] A afinidade para a DP-Ll dos braços anti-PD- L1 de Fab foi determinada utilizando ressonância de plasma de superfície (SPR). Para evitar efeitos de avidez, afinidade foi medida no contexto de uma IgG biespecífico que possui apenas um braço específico para DP-Ll, ou seja, em formato monovalente.

[00465] Para determinar a cinética de ligação dos braços anti-PD-L1l de Fab para o antígeno, foi utilizada ressonância de plasma de superfície (SPR), utilizando um BIAcore T100. Recombinante, purificado, marcado com Fc humana DP-Ll (R & D Systems, Cat. Nr. 156-B7-100) foi acoplado a célula de fluxo (FC) 2 de um chip sensor CM5 (FCl serviu como branco para subtração e foi ativada então inativado diretamente utilizando etanolamina) a um nível de cerca de 200 unidades de ressonância (RU) utilizando química de NHS / EDC a pH 5,0 (tampão de NaAc), 2 ug / ml de antígeno de concentração e 10? 1 / min velocidade fluxo. Biespecífico IgG composto por um braço anti-PD-L1 de Fab e um braço Fab irrelevante foram então correr ao longo das superfícies de FCl e 2 a diferentes concentrações (100 nM e as diluições 2 vezes em série em HBS, 6 diluições) em uma corrida cinética em 30 ul / min. O braço Fab irrelevante é específico para DP-l. A regeneração foi realizada utilizando um impulso de HCl 50 mM em água (15 i;% a um caudal de 10 ul / min). sensorgramas obtidos foram avaliados utilizando o software BIAevaluation e as constantes de velocidade dissociação e association- cinéticas foram determinadas.

[00466] Várias medidas foram realizadas em diferentes superfícies de diferentes dimensões em vários dias Diferentes medições deram resultados muito semelhantes sublinhando a sua validade. Todas as medições foram realizadas a 25 º C.

Resultados

[00467] Os resultados da determinação de afinidade são fornecidos na Tabela 7, que mostra que todos os braços testados anti-PD-L1 Fab têm uma boa afinidade.

Exemplo 11 Bloqueio PD-L2 através de anticorpos PD-L1-1xPD

[00468] Enquanto os anticorpos terapêuticos contra DP-1 e DP-L1 são conhecidos por serem eficazes no tratamento do câncer, o papel de DP-L2 em anticâncer imunidade é atualmente pouco claro. bloqueio PD-Ll1 pode potencialmente promover a resistência de tumores ao tratamento por super- regulação PD-L2. Desde PD-L1 e PD-L2 interagem com regiões da DP-l em grande parte sobrepostas, espera-se que oS anticorpos anti-DP-l que bloqueiam a interação entre DP-1 e DP-L1 também vai bloquear a interação entre DP-1 e PD-L2. Decidiu-se, portanto, para determinar se várias 1 PD- anticorpos biespecíficos / PD-Ll1 pode bloquear a DP-1 / DP- L2 via.

[00469] Esta atividade bloqueio foi testado in vitro num um PD-/ ensaio fisiologicamente relevante PD-L2 repórter bloqueio desenvolvido pela Promega com base em um sistema de duas células: células CHO que expressam PD-L2 e um ativador do receptor de células T, e um Jurkat / NFAT-RE repórter linha celular que expressa em excesso DP-1. As células T de Jurkat contêm um gene repórter da luciferase que pode tornar- se ativado por meio do NFAT (factor nuclear de culas T ativadas) via. Interações da DP-l com a activao desta via PD-L2 inibe. No entanto, o bloqueio da interação de DP-1 / DP-L2 com anticorpos contra a DP-1 ou PD-L2, mas não PD-L1 pode ativar a via de NFAT. Isto significa que quanto maior for o grau de DP-1 / DP-L2 bloqueio, quanto maior for a ativação do gene repórter da luciferase.

[00470] As PD-l / ensaios repórter bloqueio PD-L2 foram realizados utilizando o formato descongelamento e utilização da Promega. PD-L2 células (cat. No. CS187127) expressando foram descongeladas em 14,5 mL de meio de recuperação de células (DMEM / F12 contendo 10% de FBS). Em seguida, 100 ul de suspensão de células foi adicionado às cavidades interiores de duas placas de ensaio de 96 poços (Costar, cat. No. 3917). As placas foram incubadas durante a noite a 37 º C, 5% de CO;z, a 95% de humidade relativa. No dia seguinte, o meio de cultura foi removido e 40 ul de anticorpo de teste em meio de ensaio (RPMI 1640 contendo 4% FP> S) em uma diluição em série (a partir concentração de 25 ug / ml) foi adicionado a cada poço. Cada placa continha uma diluição em série do controlo negativo (G de RSV específica PG2708 anticorpo) e controlo positivo (anti-DP-1 de anticorpo terapêutico baseado em Nivolumab, aqui referidos como 5C4), que serviram como controlos de referência. PD-1l células efetoras (Ncat. CS187105) foram descongeladas em 5,9 ml de meio de ensaio e 40 ul de suspensão de células foi adicionado a cada poço.

[00471] As placas foram incubadas durante 6 horas a 37 º C, 5% de CO;,, a 95% de humidade relativa. 80 ul de Bio- Glo reagente (Bio-Glo Luciferase Assay System "”, cat. No. G7941, G7940) foi então adicionada e a quantidade atividade luciferase foi medida utilizando uma BioTek Synergy 2 Multi- Mode leitor de microplacas. Fold de indução foi calculado como a atividade luciferase depois de indução em relação ao que foi medido em poços sem anticorpo. Resultados

[00472] Os dois IgG biespecíficos PD-lxPD-Ll que foram testados foram capazes de diminuir a interação entre DP-1 e DP-L2 (Figura 18). Isto proporciona a vantagem de que a resistência de tumores ao tratamento através da DP-1 / via PD-L2 é neutralizado por estes anticorpos.

[00473] O controle negativo anti-G de RSV anticorpo PG2708 não foi capaz de evitar a interação entre DP-1 e DP- L2.

Exemplo 12 Bloqueio de CD80 através do anticorpo PD-L1-1xPD

[00474] O imunossupressor DP-1 / PD-L1 via tem sido extensivamente estudada nos últimos anos e os anticorpos terapêuticos bloqueio DP-1l1 ou PD-L1 são tratamentos eficazes contra o câncer. Imunossupressão é também pensado para ser induzida através de interações entre DP-l1 e o seu ligante alternativa PD-L2, e através de PD-L1 de ligação a CD80 (B7- 1). Como o local de ligação a CD80 em PD-L1 parece sobrepor- se ao local de ligação de PD-l, anticorpos anti-PD-L1 mais comerciais têm sido mostrados para bloquear a interação de PD-L1 com ambos DP-1 e CD80. No entanto, parece um anticorpo técnica anterior (MIH3) para bloquear o PD-l: interação PD- Ll, mas não o CD80: interação PD-L1 (Butte et al, 2008). Decidimos, portanto, para testar se os anticorpos biespecíficos foram capazes de bloquear a interação de PD- L1 com PD-1 e CD80.

[00475] No atual exemplo, a atividade bloqueio do anticorpo biespecífico MF7686xMF7703 foi testada em um PD- L1 ELISA de bloqueio que também incluía o anti-PD-Ll (IgG) PG7703 parental anti-DP-1l1 (PG7686) e, como o biespecífico

[00476] anticorpo (MF7686xMF7703) não pode ser testada diretamente, devido à sua especificidade para ambos DP-l e DP-Ll. A capacidade destes IgGs parentais para bloquear a interação de PD-L1 com DP-1 ou CD80 foi comparada com a do anticorpo anti-DP-l1 de referência 5C4 (baseado em Nivolumab) e anti-PD-Ll referência YW243.55 anticorpo .ST70 (baseado em Atezolizumab). Anti-G de RSV anticorpo PG2708 foi usado em cada placa como um controlo negativo competição.

[00477] Para este ELISA, PDl-Fc (R & D Systems;.. Ncat 1086-PD) ou a CD80-Fc (R & D systems;.. Ncat 140-Bl) foi revestida a uma placa Maxisorp a 1 e 3 ug / ml, respectivamente . poços revestidas foram bloqueadas com BSA a 4% em PBS. Em seguida, 0,55 ug / ml biotinilado PD-L1 (BPS Bioscience;. Ncat 71105.) Foi adicionado na presença Ou ausência de IgG no intervalo de 0,08 a 10 mg / ml (concentração final em placa), diluiu-se em 2% BSA em PBS. Biotinilado ligado PD-L1 foi detectada com estreptavidina conjugada com HRP (BD Bioscience:.. Ncat 554066) diluída 1:

2.000 em BSA a 2% em PBS. Depois de cada passo de incubação, a placa de ELISA foi lavada três vezes com PBS-T (PBS-0,05% v / v de Tween 20). estreptavidina ligada foi visualizado por H TMB / 2 O 2 de coloração, e a coloração foi quantificado medindo a densidade óptica (OD) a 450 nm utilizando um leitor de microplacas. Resultados

[00478] No DP-l1 / PD-Ll competição ensaio não foi possível determinar a capacidade do anticorpo biespecífico para bloquear o PD-Ll1: interação DP-1 (Figura 19, painel do lado esquerdo). No entanto, os dois braços do anticorpo biespecífico (MF7686 e MF7703) bloqueou a interação PD-LLPD- 1 quando testado em formato IgG bivalente. O PD-L1 parental IgG PG7703 bloqueou a interação mais forte do que o valor de referência PD-Ll1 anticorpo (YW243.55.S70). Os IgG anti-DP-1l inibiu a interação num grau ainda maior, com o DP-l1 parental IgG PGT7686 um desempenho melhor do que a PD-l de referência IgG (5C4).

[00479] No ensaio de competição de CD80, o anticorpo biespecífico testado (MF7686xMF7703) bloqueou a interação entre CD80 e PD-Ll. Isto proporciona a vantagem de que a imunossupressão através de interacções entre DP-1 e CD80 é contrariada por este anticorpo.

[00480] PD-l IgGs não foram capazes de inibir esta interação.

Exemplo 13 Ensaio SEB: bispecíficos em comparação com os parentais mistos Comparação funcional de IgG PD-l x PD-L1 biespecífico com mistura equimolar de ambos os IgGs parentais

[00481] Um ensaio de setembro) foi realizado a fim de comparar os anticorpos biespecíficos com uma mistura de seus IgGs parentais. células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram estimuladas por Staphylococcus enterotoxina B (SEB). SEB ativa especificamente células T que expressam a Vp 3, 12, 14, 15, 17 e 20 da cadeia de receptor de células T e os níveis de IL-2 libertadas por células são uma indicação da ativação das células T.

[00482] Nas experiências ctuais, PBMC de 2 dadores foram descongeladas, lavadas, contadas e ressuspensas em meio de cultura (RPMI 1640 mais 10% de FBS inativado pelo calor) para uma concentração de 2 x 10º células / ml. As células foram semeadas em placas de 96 poços de fundo plano (2 x 10º células / po), na presença de SEB (2000 ml), seguido pela adição de 6-passo 10 diluições em série de anticorpo, a partir de 20 ug / ml. As células foram estimuladas durante 3 dias a 37 º C, 5% de CO 2 a 95% de humidade relativa antes da recolha do sobrenadante. As placas foram centrifugadas a

350 g durante 5 min e 140 de sobrenadante recolhido para IL- 2 AlphaLISA (PerkinElmer cat. N. AL221C), que foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. Os anticorpos biespecíficos que se seguem foram testadas: PBl6666 (MF7686xMF7703) e PBl6672 (MF6974x7689). Resultados

[00483] Os resultados na Figura 20 mostram que os anticorpos biespecíficos testados são capazes de ativar as células T. De nota, induzida por SEB produção de IL-2 por PBMC é superior quando as células são incubadas com as DP-1l / PD-Ll anticorpos biespecíficos do que quando eles são incubadas com uma mistura equimolar de seus anticorpos monoespecíficos bivalente parentais. Assim, cada um dos anticorpos biespecíficos testados tem um potencial de ativação das células T mais fortes, em comparação com uma mistura equimolar de seus anticorpos —“monoespecíficos bivalente parentais. Exemplo 14 Respostas das células T PD-l1xPD-L1

[00484] No ensaio de SEB do Exemplo anterior, todos os anticorpos biespecíficos testados PD-lxPD-Ll foram encontrados para induzir uma resposta imune mais forte (produção de IL-2) do que a das IgGs parentais, e mesmo uma resposta mais forte do que a de uma mistura equimolar das IgGs parentais. Estes resultados sugerem que, neste ensaio de bloqueamento de ambos DP-l e DP-Ll, simultaneamente, é mais eficaz do que o bloqueio apenas um alvo no DP-l1 / PD- Ll via. Um passo subsequente foi o determinar se os anticorpos biespecíficos também eram mais eficazes do que os anticorpos terapêuticos existentes DP-1l1 ou PD-Ll num ensaio celular específica para o antígeno T CD4 +.

[00485] Num ensaio de SEB, as células T são fortemente ativados, através da ligação cruzada do receptor de células T e moléculas de MHC-II presentes em células apresentadoras de antígeno. No entanto, o número de células T que reconhecem especificamente um determinado antígeno é em geral muito mais baixo do que o número de células T que respondem a SEB. Para ativação mais estreitamente imitador de células específicas de antígeno, foi utilizado um ensaio de células específicas de antígeno T CD4 +. Neste ensaio de PBMC são estimuladas com uma mistura de antígenos que o sistema imune de um indivíduo doador normalmente responde a. A ativação de células T é determinada medindo a produção de IL-2 e IFNy.

[00486] Para este efeito, as PBMC a partir de 3 dadores saudáveis, foram separadas por gradiente densidade, e 2x10 5 culas por po foram cultivadas em uma placa de 96 poços e estimuladas com antígeno misturado (gripe e o toxóide do tétano), na presença ou ausência de anticorpos de teste. O sobrenadante foi colhido no dia cinco e armazenado a -80 º C até que a análise da produção de citocinas por ensaio de Luminex. Os anticorpos foram testados ao longo de uma curva de resposta à dose de quatro pontos (10, 100, 1000 e 10000 ng / mL). Para cada doador, o efeito de um biespecífico PD- lxPD-L1 anticorpo (MF7686xMF7703) foi comparada com a do anticorpo bivalente anti-PD-Ll (YW243.55.S70, com base em Atezolizumab) e bivalente anti-DP-l anticorpo ( 5C4, com base onNivolumab) ou uma mistura 1: 1 destes dois anticorpos de controlo. O controlo negativo foi-anti-G de RSV anticorpo

PG2708p217. Resultados

[00487] Tal como ilustrado na Figura 21, o anticorpo PD-1xPD-L1 biespecífico níveis de IL-2 e IFNy induziu maior do que as induzidas por os anticorpos de controlo de referência. Digno de nota, o anticorpo biespecífico também induziu maiores níveis de IL-2 e IFNy, em comparação com aqueles níveis induzidos por uma combinação dos dois anticorpos de referência, especialmente a concentrações mais baixas. Estes resultados mostram que o anticorpo PD-l1xPD-L1 biespecífico é mais eficaz do que os anticorpos terapêuticos existentes DP-l ou PD-Ll, ou suas misturas, em termos de aumentar a libertação de citocina-driven antígeno pelas células T CD4 +.

Exemplo 15 Reação linfocitária mista PD-1xPD-LI1 Anticorpos biespecíficos PD-lxPD-Ll1l aumentam a produção de IFNy por células T em uma reação linfocítica mista

[00488] Os ensaios de reação de linfócitos mistos (MLR) são comumente utilizados para compreender os efeitos de anticorpos na ativação das células T e a proliferação. Tal ajuda ensaios compreensão do facto de tais compostos irão afetar o potencial de células T para montar resposta tal no microambiente tumoral.

[00489] Aqui utilizou-se um protocolo MLR alogênica com DC imaturas para determinar a capacidade dos anticorpos PD-1xPD-L1 biespecíficos para aumentar a produção de IFNy por células T, em comparação com a de anticorpos de referência para referência. A capacidade resposta das células T foi quantificada através da medição dos níveis de IFN no sobrenadante da cultura.

[00490] Para este fim, as células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) de dadores saudáveis foram preparados a partir de crostas inflamatórias. Células dendríticas imaturas (Mo-DC) derivadas de monócitos-foram preparadas por isolamento de células CDl4 + (EasySep Stemcell, lote n. 16C69672) utilizando células magnética ativado triagem (MACS) e cultivando estas em meio de diferenciao durante sete dias. As células respondedoras T derivadas de um dador diferente do utilizado para o Mo-DC foram preparadas a partir de PBMCs criopreservadas no dia necessário, utilizando um estojo de isolamento de células T (EasySep Stemcell, lote n. 16D70573) para obter células T intactas. Seis MLR separadas foram realizadas para fornecer replicação biológica.

[00491] Para o ensaio, lx10 4 imaturo Mo-DC foram co- cultivadas com l1x10 5 células T durante 4 dias, na presença ou ausência de anticorpo de ensaio a uma concentração final de 10 ug / mL. As culturas foram realizadas em triplicado. Os sobrenadantes foram recolhidos no final do período de cultura e avaliada relativamente a IFNy por ELISA (R & D BioTechne, lote n. 342687) de acordo com as instruções do fabricante com placas lidas a 450 prazo.

Resultados

[00492] A Figura 22 mostra os resultados deste ensaio, que ilustra a capacidade dos anticorpos PD-lxPD-L1 biespecíficos para aumentar a produção de IFNy por células T em comparação com a do bivalente anti-PD-Ll anticorpo

(YW243.55.S70) e bivalente anti- DP-1 humanizado (5C4). Este aumento na capacidade resposta também foi observada na presen dos anticorpos de controlo de referência, mas em menor grau. Por conseguinte, os anticorpos biespecíficos testados têm um potencial de ativação das células T mais fortes, em comparação com o YW243.55.S70 anticorpos de referência (com base na Atezolizumab) e 5C4 (baseado em Nivolumab). Estes resultados indicam que os anticorpos biespecíficos irá aumentar o potencial de células T para montar uma resposta imune no microambiente do tumor, e que o efeito dos anticorpos biespecíficos irá ser mais pronunciada em comparação com os anticorpos de referência. Exemplo 16 Efeito de anticorpos PD-lxPD-Ll biespecíficos sobre a proliferação de células T que se infiltram no tumor

[00493] Para testar os nossos anticorpos biespecíficos em um ambiente tumoral-relacionada, que feito uso de ensaios recentemente desenvolvidos ex vivo baseados em células T isoladas a partir de material tumoral paciente. Zhou et al. desenvolveram um método de obtenção de material de tumor fresco a partir de pacientes com carcinoma hepatocelular (HCC) e isolar células infiltrantes tumorais (mielóide e de células linfocíticas), proporcionando assim uma maneira de testar os efeitos de anticorpos que os inibidores de checkpoint alvo imunológico sobre as funções de tumor- células T infiltrante (Zhou et al., 2017). Aqui nós obtido o material de pacientes com HCC Para testar se o anti-PD-l1xPD-L1 biespecífico de anticorpo MF7686xMF7703 pode reativar células CD4 + e CD8 + T infiltrantes tumorais derivadas destes pacientes.

[00494] Para este fim, o material do tumor fresco foi obtido a partir de cinco pacientes com HCC elegíveis para a ressecção cirúrgica do tumor. Nenhum dos pacientes tinha recebido quimioterapia ou tratamento imunossupressor pelo menos três meses antes da cirurgia. O método, tal como descrito por Zhou et al. (2017) foi o seguinte: células mielóides e linfocítica se infiltram no tumor foram isolados a partir de tecido fresco por corte em pequenos pedaços, seguido por digestão durante 20-30 minutos a 37 º C, em 0,5 mg / ml de colagenase IV (Sigma-Aldrich, St . Louis, MO) e 0,2 mg / mL de DNAase I (Roche, Indianapolis, IN). A suspensão de células resultante foi filtrada através de 100 mícrons filtros celulares de poro (BD Biosciences, Erembodegem, Bélgica), e leucócitos mononucleares foram obtidas por centrifugação de gradiente densidade Ficoll. A viabilidade foi determinada por exclusão azul de tripano. As células foram então marcadas com 0,l uM de um corante fluorescente carboxifluoresceína diacetato succinimidil éster (CFSE, Invitrogen) e suspensas em meio RPMI suplementado com 10% de soro AB humano, mM de L-glutamina 2 mM, tamp HEPES 50, 1% de penicilina-estreptomicina , ácidos de piruvato de sódio a 5 mM e 1% de meio essencial mínimo de aminoácidos não essenciais MEM (NEAA). l1x10 6 culas em 100? L foram então transferidas para cada poço de uma placa de 96 poços de fundo redondo.

[00495] Os linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) foram em seguida estimuladas para induzir ativação, na ausência ou na presença de anticorpo de teste por adição de

100 L do mesmo meio contendo anticorpo de teste e 10 3 blastos de células B ativadas com CD40 autogas que tinha sido expandido e subsequentemente transfectadas com RNAm que codifica o tumor de comprimento completo do antígeno glipicano-3 (GPC3). Estas células foram co-incubadas durante seis dias.

[00496] Depois de co-incubação, as células marcadas com CFSE foram recolhidas e coradas com anti-CD8, anti-CD4 e anticorpos anti-CD3. As células mortas foram excluídos usando 7-Aminoactinomycin D (7AAD; Invitrogen, Paisley UK), e proliferação de células T foi determinada com base na diluio CFSE por análise de citometria de fluxo. As células foram medidas por um citómetro de fluxo FACSCanto II (BD Biosciences, San Diego, EUA) e analisadas utilizando o software FlowJo.

[00497] o anticorpo biespecífico PD-1xPD-L1 MF7686xMF7703 foi comparado com anti-PD-Ll YW243.55.S70 anticorpo de referência (que se baseia na Atezolizumab), e controlo negativo PG2708 anticorpo contra um antígeno irrelevante, vírus sincicial respiratório ou seja L (RSV- L). As amostras sem anticorpo foram incluídas como controlos e todas as condições foram testados em duplicado, para uma concentração de IgG de 10 ug / mL. Os resultados foram apresentados como médias + SEM. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativa se P <0,05. Resultados

[00498] Os resultados são mostrados na Figura 23. Proliferação de células T CD4 + TIL (painel da esquerda) e CD8 + TIL (painel da direita) de cada dador indivíduo foi determinada através da medição da percentagem de células T em proliferação (baixos níveis de CFSE) na presença de anticorpo de controlo negativo. Os poços de controlo contendo células B que expressam GPC, mas sem anticorpo (células B GPC) e células B não-transfectadas (células NEG ctrl B) também são mostrados. Os valores são média + EPM (n = 5).

[00499] O bloqueio de o / via PD-l1 DP-L1 com o nosso anticorpo PD-lxPD-Ll biespecífico ou com YW243.55.S70 faz parecem aumentar CD4 + e CD8 + TIL proliferação. Importante, o nosso anticorpo PD-l1xPD-L1 testada activa TILS em outros doadores então YW243.55.S70. A resposta específica proliferativa-GPC3 para PD-1xPD-L1 observada nestes TILs de HCC mimetiza a situação em tumores do paciente.

[00500] Estas experiências demonstram o valor acrescentado de utilizar um 1xPD-LI-PD IgG no formato biespecífico e que um anticorpo PD-1xPD-L1 biespecífico pode aumentar a proliferação das células T CD4 + e CD8 + TIL derivadas de pacientes com carcinoma hepatocelular.

Exemplo 17 Estudo de eficácia hucD34-MDA-MB-231PD-1xPD-L1 in vivo

[00501] A fim de testar a atividade in vivo dos nossos anticorpos biespecíficos, a capacidade do anticorpo biespecífico MF7686xMF7703 para induzir uma resposta anti- tumoral mediada por células T foi estudada in vivo em camundongos imunodeficientes fêmea NOD SCID gama (NSG) camundongos reconstituído com células CD34 + humanas de células estaminais hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical (19 semanas de idade, a Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) inoculados subcutaneamente com 3x10 6 -231 MDA-

MB células tumorais (ATCC, gato não HTB-26..) , um câncer da mama triplo-negativo linha celular (TNBC) expressando PD-L1. Estes 3x10 6 células foram inoculadas em um 1: 1 de suspensão de meio de cultura DMEM isento de soro de 100 ul (Life technologies, gato não 10566-016) E matrigel membrana matriz (Fisher Scientific, gato não CB354248). O tratamento de camundongos portadores de tumor foi iniciado 7 dias após a inoculação de células de linha, quando o volume do tumor tinha atingido 170-180 mmº.

Os ratos foram então tratados por via intraperitoneal a cada 5 dias com 0,5 ou 5 mg / kg MF7686xMF7703 biespecífico de anticorpo.

Os camundongos de controlo foram deixadas sem tratamento ou tratada a cada 5 dias com 5 mg / kg de um controlo negativo de anticorpo específico para o antígeno de RSV-G (IgG 1 albergando mutações de Fc-silenciamento). O volume do tumor foi registado duas vezes por semana usando um sistema de registo de estudo.

Após a terminação da fase in vivo do estudo no dia 37, IE30O dias após o início do tratamento, os linfócitos infiltrados no tumor (TIL) foram analisados por análise de citometria de fluxo.

Para este fim, os tumores foram colhidos, micro-dissecadas e digerido usando um tumor dissociação Kit (Miltenyi Biotec), de acordo com as instruções do fabricante.

Após a lise dos glóbulos vermelhos as células foram coradas para anise de FACS utilizando corante de viabilidade e fluorocromo específico marcador anticorpos -conjugated.

As células foram executados usando um analisador de citometria de fluxo BD LSR Fortessa e analisados utilizando o pacote de software Flowjo.

TILs vivo foram identificadas como células negativas corante de viabilidade e positivamente coradas para anticorpos de CD45 e CD3 específicos (BD Biosciences, N º de Cat 564307). Subsequentemente, a fracção de células T foi caracterizado quanto à expressão de CD4 (BD Biosciences, cat. No. 557852) e CD8 (BD Biosciences, cat. No. 557834). As células foram executados usando um analisador de citometria de fluxo BD LSR Fortessa e analisados utilizando o pacote de software FlowJo. Resultados

[00502] MF7686xMF7703 anticorpo biespecífico induziu uma resposta anti-tumoral, mesmo na dose mais baixa de apenas 0,5 mg / kg (Figura 24), como o volume de tumor em ambos os grupos de tratamento MF7686xMF7703 foi menor do que nos grupos de rato de controlo. Comparação da composição de TIL nos camundongos de controlo e ratos tratados com MF7686xMF7703 por análise de citometria de fluxo revelaram que 5 mg / kg MF7686xMF7703 tinha a capacidade melhorar tanto CD4 como os números de células T CD8 + (Figura 25). No total, estes dados mostram que em uma CD34 + humanizados modelo de camundongo com um tumor positivo PD-Ll, o nosso anticorpo biespecífico MF7686xMF7703 tem a capacidade para aumentar o número de TILs, bem como para induzir uma resposta anti- tumoral. Exemplo 18 Estudo de eficácia (A549) PD-l1xPD-L1 in vitro e in vivo

[00503] A capacidade do anticorpo biespecífico MF7686xMF7703 para melhorar a citotoxicidade mediada por células T de células tumorais no contexto de sinalização específica antígeno-TCR foi estudada in vitro utilizando

AS49-A2-ESO-1 células tumorais e t-l-específico NY-ESO células. células tumorais A5S49-A2-ESO são derivados a partir de uma linha celular de carcinoma do pulmão de células não pequenas, (NSCLC) e expressar PD-L1 e o HLA-A2 restrito NY- ESO-1l peptídeo antígeno, como descrito por Moon et al (2016 ). NY-ESO-l-específicas células T foram preparadas de acordo com a Moon et al (2016). Os A549-A2-ESO-1 (células de tumor que super-expressam a luciferase) foram co-cultivadas com células-l-específicos NY-ESO T em meio RPMI 1640 (Gibco, N º de Cat 11875-085) suplementado com 10% inativado pelo calor soro fetal de bovino (FBS) (HyClone, N º de Cat SH30071.03). AS49-NY-ESO-1 células foram adicionadas a placas de 96 poços de fundo plano, seguido por células de NY-ESO-1 específicos Ly95 T em efetora diferente para alvo (E: T) as proporções (1: 1, 0,5: 1, 0,25: 1 e 0,125: 1). As células foram co- cultivadas durante 72 horas a 37 º C com ou sem tratamento com o anticorpo, em que MF7686xMF7703 foi comparado com o anticorpo anti-DP-l de controlo MK-3475 (com base na Pembrolizumab), anti-PD-Ll YW243.55 anticorpo de controlo.

S70 (com base na Atezolizumab), ou uma combinação de MK-3475 + YW243.55.S70 (todos os anticorpos a 10 concentração final ug / mL). Após 72 horas, os sobrenadantes das co-culturas foram recolhidas e analisadas para a secreção de IFNy usando um IFNy Quantikine Kit ELISA (Sistemas R & D, cat.

No.

DIF50 de acordo com as instruções do fabricante.

O grau de citotoxicidade induzida por células T específicas para o NY- ESO-1 foi quantificada medindo a luminescência remanescentes em uma placa SpectraMax multimodo Reader usando um sistema de ensaio de luciferase (Promega, cat.

No.

E1501).

Resultados

[00504] Comparação de co-culturas tratadas com MFT7686xMF7703 e anticorpos de controlo indicaram que MF7686xMF7703 aumenta tanto a fracção de células T funcionais, reflectido pelo aumento de IFNy de libertação (Figura 26), e o grau de citotoxicidade células T em relação AS49-NY-ESO-1 células de tumor (Figura 27), mesmo a baixas proporções E: T. De nota, o anticorpo biespecífico MF7686xMF7703 resultou em uma maior libertação de IFNy, como comparado com o controlo YW243.55.S70 anticorpo em todas as proporções E: T. No inferior proporções E: T, a libertação de IFNy induzida por MF7686xMF7703 era comparável ou mesmo superior em comparação com a libertação de IFNy que foi induzida por anticorpo de controlo MK-3475 ou por uma combinação de anticorpos de controlo YW243.55.S70 e MK-3475.

[00505] Em seguida, a capacidade MF7686xMF7703 para melhorar uma resposta anti-tumoral mediada por células T foi estudada in vivo em camundongos imunodeficientes NOD SCID gama (NSG) murganhos (13 semanas de idade, a Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Os camundongos foram primeiro inoculados subcutaneamente com 5x10 6 culas tumorais AS549- A2-ESO suspensas em meio de cultura isento de soro e 100 ul de matrigel membrana matriz (Corning) em volumes iguais. Após os tumores foram estabelecidos (volume de 80-100 mm 3 ), os ratos foram divididos aleatoriamente em seis grupos em que um grupo recebeu uma única intravenosa (veia da cauda) de injeção de PBS por si só, e cinco grupos foram injetados com PBS contendo 10x10 6 NY- As células T reativas ESOl-Ly95 TCR que expressam construção humana. Os cinco grupos que tinham sido submetidos a transferência adoptiva com células T Ly95 transgénicos específicos de tumores foram tratados subsequentemente intraperitonial aliado a cada cinco dias com PBS, MK-3475 (5 mag / kg), YW243.55.S70 (5 mg / kg) , MF7686xMF7703 (5 mg / kg), ou uma combinação de MK-3475 (5 mg / kg) + YW243.55.S70 (5 mg / kg). Ao longo de um período de quatro semanas, o volume do tumor foi registado duas vezes por semana usando um sistema de registo de estudo. Após a terminação da fase in vivo do estudo no dia 35, ie28 dias após o início do tratamento, os linfócitos infiltrados no tumor (TIL) foram analisados por análise de citometria de fluxo. Para este fim, os tumores foram colhidos, micro- dissecadas e digerido usando um tumor dissociação Kit (Miltenyi Biotec), de acordo com as instruções do fabricante.

[00506] Após a lise dos glóbulos vermelhos, as células foram coradas para a anise por FACS utilizando um corante de viabilidade e de anticorpos conjugados com fluorocromo especicos de marcador. As células foram medidas usando um analisador de citometria de fluxo BD LSR Fortessa e analisados utilizando o pacote de software FlowJjo. TILs vivas foram identificados como coloração negativa para o corante de viabilidade e positivo para CD45 e anticorpos específicos- CD3 (BD Biosciences, N º de Cat 564307). Subsequentemente a fracção de células T foi caracterizado quanto à expressão de CD4 (BD Biosciences, cat. No. 557852), CD8 (BD Biosciences, cat. No. 557834), e GITR (eBiosciences, cat. N. 46-5875-42), assim como da cadeia de TCR VB13.1 (Mfltenyi Biotec, cat. n. 130-108-742) para identificar as células T- l-específicos NY-ESO.

Resultados

[00507] Como mostrado na Figura 28, o anticorpo biespecífico MF7686xMF7703 induziu uma resposta antitumoral, como volume de tumor no grupo de tratamento MF7686xMF7703 foi menor do que nos grupos de rato de controlo. De nota, esta resposta antitumoral induzida MF7686xMF7703 foi maior do que a resposta observada em ratos tratados com uma dose equivalente de um anticorpo de referência único (YW243.55.S70 ou MK-347) e comparável à resposta observada em camundongos que receberam duas vezes a dose equivalente dos anticorpos de referência combinados (YW243.55.S70 + MK- 3475; Figura 28). Assim, quando o anticorpo biespecífico MF7686xMF7703 foi usado, a mesma redução na massa do tumor foi obtida com apenas metade da dose, em comparação com uma combinação de YW243.55.S70 e MK-3475.

[00508] Análise dos TILs por análise de citometria de fluxo indicou que, em relação aos grupos tratados com anticorpo de referência, MF7686xMF7703 aumenta o número total de células CDS T (Figura 29), a maioria dos quais são ativadas, tal como refletido pela alta percentagem de GITR CDS + As células T. Os tumores de ratos tratados com MF7686xMF7703 não só tinha a percentagem mais elevada de células T CDS totais, mas também a mais alta percentagem de células T CD8-positivas TILS específico para o NY-ESO-1 de camundongo. De nota, a percentagem de CD8 + TIL foi maior após o tratamento com o anticorpo biespecífico MF7686xMF7703, em comparação a um tratamento com uma combinação de PD-Ll1 YW243.55.S70 anticorpo específico de controlo e de DP-l1 de anticorpo de controlo específico MK-

3475.

[00509] Em conjunto estes dados mostram que MF7686xMF7703 aumenta a ativação de células T, resultando em citotoxicidade mediada por células T aumentada. In vivo, MF7686xMF7703 induz a números mais elevados de TILs, bem como uma resposta antitumoral que é maior do que a resposta observada para o tratamento único com os anticorpos de referência YW243.55.S70 ou MK-3475, e comparável à resposta observados para o dobro a dose equivalente dos anticorpos de referência combinados YW243.55.S70 e MK-3475, o que indica que uma dose mais baixa de MF7686xMF7703 é suficiente para alcançar uma resposta anti-tumoral comparável.

Exemplo 19 Anticorpos biespecífico PD-lxPD-Ll bloco DP-l / DP- sinalizarão de Ll de uma forma co-dependente de estimulação

[00510] Foi testada a capacidade dos dois anticorpos biespecíficos PD-Ll1-l1xPD MF7686xMF7703 e MF6974xMF7689 para inibir a DP-Ll / DP-l acoplamento sobre a produção de citocinas de células T ativadas. Utilizou-se anti-CD3 / anti- CD28 estimulação para ativar células T e a co-estimulação foi fornecida por co-cultura com humano recombinante PD-Ll1- Fc, que se engata com DP-1 sobre as células T. Uma vez que este produto PD-l / PD-Ll ativação de células inibe a interação, bloqueando a interação DP-1 / PD-Ll com anticorpos contra a DP-1 ou PD-L1 re-activa as células, resultando na produção de IL-2.

[00511] A capacidade dos anticorpos biespecíficos para bloquear a interação de PD-Ll com DP-l foi comparada com a dos anticorpos parentais anti-DP-l e anti-PD-Ll1, tanto isoladamente como em combinação, e com a de anti- PD-l de anticorpo de referência (5C4, com base em Nivolumab) e anticorpo de referência anti-PD-Ll (YW243.55.S70, com base em Atezolizumab), tanto isoladamente como em combinação. Anti-RSV anticorpo PG2708 foi usado em cada placa como um controlo negativo. Métodos Ensaio de ativação de células T co-estimulação dependente

[00512] As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de dadores saudáveis foram descongeladas e 9 volumes de meio de cultura (RPMI 1640 com 10% de calor-inativado (oi) de FBS) foi gota a gota. As células foram centrifugadas durante 10 minutos a 200 g à temperatura ambiente. O sedimento de células foi ressuspenso em 10 mL de meio de cultura e as células foram deixadas em repouso por incubação durante a noite a 37 º C, 5% de CO2, em 95% de humidade relativa. No dia seguinte, os linfócitos T foram isolados usando o enriquecimento de células T EasySep procedimento de purificação (pan CD3) como descrito pelo fabricante (Stem célula gato Technologies * 19051). O procedimento EasySep usa seleção negativa. Resumidamente, os PBMCs foram centrifugados durante 10 minutos a 200 g à temperatura ambiente. O sedimento de células foi ressuspenso em tampão de EasySep a uma concentração de 5 x 107 celulas / mL. 50 ul de EasySep T humanas celular Enriquecimento cocktail foram adicionados a cada ml de volume da célula, misturada e deixada a incubar durante 10 minutos à RT. Em seguida, 50 ul de EasySep D partículas magnéticas foram adicionadas a cada ml de volume de células e deixa-se incubar durante 5 minutos a RT. O volume total foi levado para 2,5 mL com tampão de EasySep, e depois de se misturar a suspensão de células foi transferida para um ml de fundo redondo de 5 tubo Falcon (BD Biosciences, cat. No. 352235). Em seguida, o tubo foi colocado o íman permitindo que a fracção celular indesejada para ser ligada ao íman durante 5 minutos à TA. Em seguida, o tubo foi invertido e a fracção de células T purificadas foi decantado para um novo tubo contendo 7,5 ml de meio de cultura. As células foram colhidas por centrifugação a 10 minutos a 200 g à temperatura ambiente e, subsequentemente, re-suspensas a uma concentração de lx10 6 culas / mL em meio de cultura.

[00513] Um dia antes do início do ensaio, placas de 96 poços de fundo plano (Cellstar, cat. No. 655180) foram revestidas durante a noite a 4 º C com 4 ug / mL de anticorpo anti-CD3 (clone OKT3, eBioscience, gato. Nenhuma . 16-0037- 85) e 8 pg / mL de recombinante humana DP-Ll-Fc (R & amp; D Systems, cat. n. 156-B7) em PBS, 50 mL por poço. No dia seguinte, as placas de ensaio foram lavadas duas vezes com PBS e os pos exteriores das placas de ensaio foram cheios com 100 ul de PBS. Anticorpo anti-CD28 (clone 28.2, BD, cat. No. 555725) foi adicionado à suspensão de células T a uma concentração de 2 pg / mL (concentração final 1 ug / mL). 50 ul desta suspensão de células T / anti-CD28 foi adicionado a todos os poços interiores das placas de ensaio (50000 células / poço), seguida por 50 ul de pré-preparado 5-passo diluições em série de anticorpo em meio de ensaio (RPMI 1640 + 10% hiFBS), com uma concentração de partida de 20? g / mL ou 1 pg / ml). As placas foram cobertas e incubadas durante 72 horas em uma incubadora a 37 º C, 5% de CO 2, 95% de humidade. A concentração de IL-2 no sobrenadante foi determinada por AlphaLISA (Perkin Elmer, cat. No. AL221F).

[00514] Expressão de DP-1 e DP-L1 foi determinado por citometria de fluxo em um ensaio separado na qual não se adicionou IgG. As células foram colhidas após 24, 48 e 72 horas e corados com anticorpos anti-PD-Ll anti-PDl ou. As células foram então coradas com um anticorpo secundário (IgG- PE anti-humano) e analisadas por FACS. Resultados

[00515] As Figuras 30 e 31 mostram o índice de estimulação (SI) foi calculado como a proporção de IL-2 medidos contagens nos poços contendo o anticorpo para aqueles em poços sem anticorpo. O IS foi mais elevado na presença de dois anticorpos biespecíficos PD-lxPD-Ll do que quando as células foram incubadas com o anticorpo de controlo negativo PG2708 ou com os anticorpos bivalentes parentais, tanto sozinho (Figura 30) e em combinação (Figura 31). Digno de nota, o SI foi também mais elevada na presença dos dois anticorpos biespecíficos PD-1xPD-L1 do que quando as células foram incubadas com anticorpo anti-DP-l de referência (5C4) e anticorpo de referência anti-Ll1-PD (YW243.55.S70), tanto isoladamente como em combinação. Isto demonstra que todos os anticorpos biespecíficos testados têm uma atividade ativação de células T mais fortes co-dependente de estimulação, em comparação com os anticorpos parentais e, em comparação com os anticorpos de referência. A ativação de células T induzida por anticorpos biespecíficos foi ainda mais forte do que a ativação de células T induzida por uma mistura dos anticorpos de referência.

[00516] A Figura 32 mostra o aumento da expressão de DP-1 e DP-L1 ao longo do tempo nas células T após a ativação por anti-CD3 / anti-CD28.

[00517] tabelas: Tabela 1

[00518] As construções de expressão para cada alvo que foram usados para a imunização de DNA (pVAX1l vetor base) e para a geração de linhagens celulares estáveis de CHO-K1 de CHO-S ou (vetor pIRES-Neo3 baseado ou semelhante) Alvo Vetores Linhagem cellular estável PD-1 PpVAX1 huPD-l NA PIRES-neo3 huPD-1l CHO-S huPD-1l PIRES-neo3 maPD-1 CHO-S maPD-1 PD-L1 | pvVAX1 huPD-L1 NA PpPIRES-neo3 huPD-L1 CHO-K1 huPD-L1 PIRES-neo3 maPD-L1 CHO-K1 maPD-L1 hu = humano, ma = macaco, NA = não aplicável Tabela 2

[00519] A atividade funcional da DP-1 braços Fab como medido no / ensaio de repórter de bloqueio PD-l1 DP-L1 como um anticorpo bivalente, em comparação com o controlo positivo Nivolumab. Variantes do mesmo grupo (A, B e C), que exibiu uma gama de atividade bloqueio de PD- Ll1 foram testados. % de atividade de Cluster Nivolumab

MF6974 B 46.5 Tabela 3

[00521] Tabela 4

[00522] Visão geral rastreio anticorpos PD-l1xPD-L1 no ensaio repórter DP-1 / PD-L1.

[00523] Em percentagem de atividade exibição em comparação com Ctrl MPDL-3280A. (DE) indica o lado da DE biespecífico DEKK. KK KK indica o lado do biespecífico DEKK.

A atividade bloqueio de PD-l braços individuais de Fab é indicado em -, +/-, +, ++, e +++. A atividade bloqueio do braço PD-LlFab está disposta a partir de cima para baixo com o anticorpo de cima (MF5594) sendo o bloqueador mais forte e o MF5361 ser incapazes de bloquear. combinações de anticorpos em atividade mostrou cinzento superiores a 60% e foram selecionados para testes posteriores.

Blocking activity PD-1 Fabarm (DEL ago RN Ss GQ & : e EEE EEEEEES MF5594 446 532 572 49 532 362 44 539 567 4 E MF5553 482 548 627 527 566 404 490 542 578 1 L MF5576 472 566 585 441 530 509 586 658 732 294 q | MF5359 472 594 762 40 574 335 45 523 564 N) Ni MF5424 493 601 721 547 695 404 612 661 702 N8 MF5561 526 731 700 596 657 433 622 701 710 %2 MF5557 411 553 589 408 534 425 583 659 702 M6 5 MF5708 206 367 401 197 397 94 249 341 49 42 % MF5439 400 484 542 40 532 34 522 575 605 174 9 MF5S442 421 741 767 536 701 508 694 733 78 2 MF5382 453 719 682 47 633 561 809 976 1049 317 ú MF5377 273 393 395 306 43 201 336 361 41 83 z MF5361 64 131 14 57 85 57 203 170 154 49 Tabela 5

[00524] Vista geral de números PB e sua composição MF

PB PDI1 MFID PD-LIMFID PB15443 MF6076 MF5553 PB15459 MF6936 MF5576 PB15460 MF6256 MF5576 PB15464 MF6076 MF5359 PB15474 MF6076 MF5424 PB15476 MF6974 MF5424 PB15479 MF6935 MF5424 PB15480 MF6936 MF5424 PB15481 MF6256 MF5424 PB15484 MF6236 MF5561 PB15485 MF6076 MF5561 PB15487 MF6974 MF5561 PB15490 MF6936 MF5561 PB15491 MF6256 MF5561 PB15500 MF6936 MF5557 PB15522 MF6256 MF5439 PB15527 MF6076 MF5442 PB15529 MF6974 MF5442 PB15532 MF6936 MF5442 PB15536 MF6236 MF5382 PB15537 MF6076 MF5382 PB15539 MF6974 MF5382 PB15542 MF6936 MF5382 PB15466 MF6974 MF5359 PB15465 MF6982 MF5359 PB15463 MF6236 MF5359 PB15462 MF6972 MF5359 Tabela 5 (continuação)

[00525] Vista geral de números PB e sua composição MF

PD-1arm PD-Li arm PB number PD-1 arm PD-L1 arm PB number MF6076 MF5442 PB15527p04 MF7685 MF5424 PBI6661p01 MF6076 MF7691 PB16635p01 MF7686 MF5424 PB16662p01 MF6076 MF7690 PB16679p01 MF7685 MF5424 PBI6661p02 MF6076 MF7689 PBI6636p01 MF7684 MF5424 PB16663p02 MF6076 MF7688 PB16637p01 MF7684 MF5424 PBI6663p01 MF6076 MF7688 PB16637p02 MF7687 MF7703 PBI6664p01 MF7699 MF7691 PB1I6639p01 MF7686 MF7703 PBI6666p02 MF7699 MF7690 PBI6680p01l MF7685 MF7703 PBI6665p01 MF7699 MF7689 PBI6640p01 MF7686 MF7703 PBI6666p01 MF7699 MF7688 PBI6641p01 MF7685 MF7703 PBI6665p02 MF7699 MF7688 PBI6641p02 MF7684 MF7703 PB1I6667p02 MF7698 MF7691 PB1I6643p01 MF7684 MF7703 PBI6667p01 MF7698 MF7690 PBI6681p01 MF6936 MF5442 PB15532p03 MF7698 MF7689 PBI6644p01 MF6929 MF7691 PBI668SpOl MF7698 MF7688 PB1I6645p01 MF6929 MF7690 PBI6689p01 MF7698 MF7688 PBI6645p02 MF6929 MF7689 PBI6690p01l MF6076 MF5553 PB15443p03 MF6929 MF7688 PBI6691p01 MF6256 MF5439 PB15522p03 IMF6929! |MF7688' IPB16691po2 MF6256 MF7700 PBI6682p01 MF6936 MF5557 PB15500p03 MF6256 MF7701 PBI6655p02 MF6929 MF7694 PBI6693p01 MF6256 MF7701 PBIG6655pO01 MF6929 MF7693 PB1I6694p02 MF6935 MF5424 PB15479p03 MF6929 MF7692 PBI6695p03 MF6935 MF5424 PB15479p0S5 MF6929 MF7694 PB16693p03 MF6935 MF7703 PBI6659pO01 MF6929 MF7692 PBI6695p04 MF7687 MFS424 PBIG6660p0l MF6974 MF5442 PB15529p03 MF7686 MF5424 PBI6662p02 MF6974 MF7691 PB16671p01 MF6974 MF7690 PBI6698p01 MF6974 MF7689 PB16672p01 MF6974 MF7688 PB16673p01 MF6974 MF7688 PB16673p02 MF6256 MF7697 PB1I6675p01 MF6256 MF7696 PB16676p01 MF6256 MF7695 PB16677p01 Tabela 6. Anticorpos anti-PD-l1xPD-L1 biespecíficos bloqueam a interação entre Ll e DP-l num ensaio de repórter de bloqueio in vitro.

MF1 MF2 % effectivity MF1 MF2 % effectivity MF7687 MF5424 98.4 MF6935 MF7703 735 MF7687 MF7703 95.4 MF6076 MF7690 7B4 MF7685 MF7703 94.8 MF6935 MF5424 ns MF7684 MF7703 943 MF6974 MF5442 ni MF7685 MF7703 932 MF6974 MF7688 715 MF7684 MF5424 91.5 MF7699 MF7689 72 MF6076 MF7689 85.3 MF6974 MF7691 70.8 MF7686 MF7703 84.6 MF7699 MF7690 70.4 MF6256 MF5439 84.2 MF6936 MF5442 68.9 MF7685 MF5424 83.3 MF7698 MF7688 68.2 MF6256 MF7701 811 MF6929 MF7694 68.2 MF6929 MF7691 810 MF6076 MF5442 67.9 MF6076 MF7688 80.8 MF6974 MF5442 65.9 MF7684 MF5424 808 MF6256 MF7700 65.3 MF6076 MF7691 80.3 MF6929 MF7690 65.0 MF6076 MF7688 798 MF7698 MF7689 64.9 MF7686 MF5424 789 MF6935 MF5424 63.7 MF6076 MF5553 785 MF7698 MF7688 63.5 MF6936 MF5S57 TIA MF6929 MF7688 616 MF7684 MF7703 769 MF6929 MF7689 814 MF7699 MF7688 77 MF6974 MF7689 59.7 MF7699 MF7691 755 MF7698 MF7690 58.9 MF7685 MF5424 754 MF6974 MF7688 56.7 MF7698 MF7691 752 MF6935 MF5424 55.9 MF6929 MF7688 749 MF6256 MF7701 55.8 MF7699 MF7688 746 MF6974 MF7690 55.5 MF6256 MF7697 54.9 MF6256 MF7696 45.3 MF6256 MF7695 431

[00526] Tabela 7. A afinidade ligação para os dois braços PD-Ll testados para PD-Ll tal como determinado por ressonância plasmônica de superfície (SPR). Os anticorpos foram testados no formato monovalente. Para os Ll1 anti-PD- braços Fab, as medições são mostradas a partir de três experiências separadas, koff: taxa de dissociao constante, kon: constante a taxa de associação: KD: Constante de dissociao (Koff / kon).

Antibody Date of run kon koff KD (nM) FAB7703 24/Nov/17 1.96exp6 2.4exp-3 1.25 24/Nov/17 1.76exp6 2.3exp-3 1.31 24/Nov/17 — 1.82exp6 2.3exo-3 1.25 FAB7689 24/Nov/17 6.7exp5s 2.8exp-3 4.27 24/Nov/17 7.17exp5 2.7exp-3 3.81 24/Nov/17 8.2exp5 3.1exp-3 3.76 Referências

[00527] J.C. Almagrol and “J. Fransson (2008) Frontiers in Bioscience 13, 1619-1633

[00528] Armour et al., 1999. Eur J Immunol. 29(8):2613-24; Shields et al., 2001. J Biol Chem. 276(9) :6591-604.

[00529] Butte MJ, Pehia-Cruz V, Kim MJ, Freeman GJ, Sharpe AH. Interaction of human PD-Ll1 and B7-1. Mol Immunol. 2008 Aug;45(13):3567-72. doi: 10.1016/j.molimm.2008.05.014. Epub 2008 Jun 27.

[00530] Idusogie et al., 2000. J Immunol. 164(8) :4178-84.

[00531] Labrijn. et al., 2009. Nat Biotechnol. 27(8):767-71.

[00532] Moon et al. Blockade of Programmed Death 1 Augments the Ability of Human T cells Engineered to Target NY-ESO-1 to Control Tumor Growth after Adoptive Transfer. Clinical Cancer Research 2016, 22(2): 436-447, doi:

10.1158/1078-0432.CCR-15-1070.

[00533] Zhou et al. Antibodies Against Immune Checkpoint Molecules Restore Functions of Tumor-infiltrating

T cells in Hepatocellular Carcinomas.

Gastroenterology 2017 doi: 10.1053/ j.gastro.2017.06.017.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo ou uma variante do referido anticorpo que mantém a especificidade de ligação do anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende - um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de uma proteína da família CD28 (primeira proteína de membrana) e - um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de uma proteína da família B7 (segunda proteína de membrana); em que a referida primeira e segunda proteína da membrana são parceiras de ligação (ou seja, um par ligante e receptor), e, em que a ligação do domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da referida primeira proteína da membrana bloqueia a ligação da referida primeira proteína da membrana à referida segunda membrana a proteína e /oua ligação do domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da referida segunda proteína da membrana bloqueia a ligação da referida primeira proteína da membrana à referida segunda proteína da membrana.

2. Anticorpo ou variante do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a ligação do anticorpo ou variante do mesmo reduz uma atividade inibidora da ligação do par receptor-ligante.

3. Anticorpo ou variante do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende - um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de PD-l1; CTLA-4; BTLA; ou TMIGD2; e

- um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de PD-Ll1; PD-L2; CD80; CD86; B7-H4; TNFRSF14; ou B7-H7.

4, Anticorpo ou variante do mesmo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreende - um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de PD-1; e - um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de PD-L1 ou PD-L2.

5. Anticorpo ou variante do mesmo, de acordo com a reivindicação 3 ou reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a ligação do domínio variável que liga PD-l1 bloqueia a ligação de PD-1 a PD-L1 e / ou a ligação do domínio variável que liga PD-Ll1 bloqueia a ligação de PD-L1 a PD-1l.

6. Anticorpo ou variante do mesmo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a ligação do domínio variável que se liga a PD-l bloqueia a ligação de PD-1 a PD-Ll1 e a ligação do domínio variável que se liga a PD-L1 bloqueia a ligação de PD-L1 a PD-1l.

7. Anticorpo ou variante do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações l a 6, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de PD-l, em que a ligação do referido domínio variável a PD-l bloqueia a ligação de PD- 1 a PD-L2.

8. Anticorpo ou variante do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de PD-Ll, em que a ligação do referido domínio variável a PD-Ll1l bloqueia a ligação de PD- L1 a CD80.

9. Anticorpo ou variante do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de PD-l1 e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de PD-L1 e que possui um maior potencial de ativação de células T CD4 + em um ensaio de enterotoxina B de Staphylococcus (SEB) em comparação com uma mistura equimolar de: - anticorpos monoespecíficos bivalentes que compreendem dois dos referidos domínios variáveis que se ligam a PD-1l, e - anticorpos monoespecíficos bivalentes que compreendem dois dos referidos domínios variáveis que se ligam a PD-L1.

10. Anticorpo ou variante do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de PD-l1 e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de PD-L1 e que é capaz de ativar células T em um ensaio de células T CD4 + específicas ao antígeno mais fortemente que o anticorpo de referência 5C4 ou o anticorpo de referência YW243.55.S70 ou uma combinação de anticorpos de referência 5C4 e YW243.55.S70.

11. Anticorpo ou variante do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de PD-l1 e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de PD-Ll1 e que possui um maior potencial de ativação de células T CD4 + em um ensaio de reação linfocitária mista (MLR) em comparação com o anticorpo de referência 5C4 ou com o anticorpo de referência YW243.55.S70.

12. Anticorpo ou variante do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável que possui uma afinidade de ligação para uma parte extracelular de PD-L1 com uma constante de dissociação de equilíbrio (KD) menor ou igual a 4,27 nM, preferencialmente inferior ou igual a 1,31 nM, preferencialmente inferior ou igual a 1,27 nM, conforme medido por SPR.

13. Anticorpo ou variante do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações l1 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de PD-l1 e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de PD-L1 e que é capaz de melhorar a proliferação de células T CD4 + e / ou CD8 + que infiltram tumor.

14. Anticorpo ou variante do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de PD-l1 e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de PD-L1 e que é capaz de induzir uma resposta antitumoral mediada por células T mais forte in vivo, em comparação com uma combinação de anticorpos de referência MK-3475 e YW243.55.S70.

15. Anticorpo ou variante do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 14, caracterizado pelo fato de que o domínio variável que liga uma parte extracelular de PD-l é definido como um domínio variável que, quando em um formato de anticorpo monoespecífico bivalente que compreende dois dos referidos domínios variáveis que se ligam a PD-l, inibe a inibição mediada por PD-l1 / PD-L1 da ativação mediada por receptor de células T de uma célula Jurkat na faixa de 20-150% quando comparada à inibição obtida com o anticorpo Nivolumab em uma célula Jurkat.

16. Anticorpo ou variante do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 15, caracterizado pelo fato de que o domínio variável que liga uma parte extracelular de PD-L1 é definido como um domínio variável que quando em um anticorpo biespecífico que possui um segundo domínio variável que liga um antígeno irrelevante, como o toxóide tetânico, fornece ao anticorpo biespecífico um Kd de 0,1-14 nM para a ligação a PD-Ll (conforme medido pelo biacore).

17. Anticorpo ou variante do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações l1 a 16, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de PD-l e compreende uma região variável de cadeia pesada com uma região CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de o CDR3 de uma região variável da cadeia pesada de um dos VH representados para MF6076; MF6236; MF6256; MF6226; MF6930; MF6932; MF6935; MF6936; MF6972; MF6974; MF6982; MF6929; MF7699; MF7698; MFT7687; MF7686; MF7685; ou MF7684 na figura 3 e / ou figura 13.

18. Anticorpo ou variante do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que o referido domínio variável que liga PD-l compreende uma região variável de cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada com uma região CDRI1, CDR2 e CDR3 que compreende o aminoácido sequência do CDR1, CDR2 e CDR3 de uma região variável da cadeia pesada de um dos VH representados para MF6076; MF6236; MF6256; MF6226; MF6930; MF6932; MF6935; MF6936; MF6972; MF6974; MF6982; MF6929; MF7699; MF7698; MF7687; MF7686; MF7685; ou MF7684 na figura 3 e / ou figura 13.

19. Anticorpo ou variante do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de PD-l e compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável região conforme descrito para MF6076; MF6236; MF6256; MF6226; MF6930; MF6932; MF6935; MF6936; MF6972; MF6974; MF6982; MF6929; MF7699; MF7698; MF7687; MF7686; MF7685; ou MF7684 (como representado na figura 3 e / ou figura 13) com no máximo 15, de preferência 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e de preferência com 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições ou uma combinação de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos do VH, como representado para o MF indicado.

20. Anticorpo ou variante do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de PD-L1 e que compreende uma região variável de cadeia pesada com uma região CDR3 que compreende o amino sequência ácida da região CDR3 da região variável da cadeia pesada, como representado para MF5359; MF5361; MF5377; MF5382; MF5424; MF5426; MF5439; MF5442; MF5553; MF5557; MF5561; MF5576; MF5594; MF5708; MF5442; MF7691; MF7690; MF7689; MF7688; MF7700; MF7701; MF7703; MFT7694; MF7693; MFT7692; MF7697; MEF7696; ou MF7695 da Figura 3 e / ou figura 13.

21. Anticorpo ou variante do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de PD-L1 e que compreende uma região variável de cadeia pesada com uma região CDR1, CDR2 e CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos do CDRl, CDR2 e CDR3 de uma região variável da cadeia pesada de um dos VH representados para MF5359; MF5361; MF5377; MF5382; MF5424; MF5426; MF5439; MF5442; MF5553; MF5557; MF5561; MF5576; MF5594; MF5708; MF5442; MF7691; MF7690; MF7689; MF7688; MF7700; MF7701; MF7703; MF7694; MF7693; MF7692; MF7697; MF7696; ou MF7695 da Figura 3 e / ou figura 13.

22. Anticorpo ou variante do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte celular extra de PD-Ll e compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da variável pesada região da cadeia, conforme descrito para MF5359; MF5361; MF5377; MF5382; MF5424; MF5426; MF5439; MF5442; MF5553; MF5557; MF5561; MF5576;

MF5594; MF5708; MF5442; MF7691; MF7690; MF7689; MF7688; MF7700; MF7701; MF7703; MF7694; MF7693; MF7692; MF7697; MF7696; ou MF7695 (da Figura 3 e / ou figura 13) com no máximo 15, de preferência 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e de preferência com 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições ou uma combinação dos aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos do MF indicado.

23. Anticorpo ou variante do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de PD-1 e em que o referido domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de PD-1 compreende: - uma sequência CDR3 da cadeia pesada que é idêntica à sequência CDR3 da cadeia pesada de uma região variável selecionada do grupo que consiste em MF6974, MF6076 e MF7686; ou - uma sequência de CDR3 da cadeia pesada que se desvia em não mais que três, preferencialmente, não mais que dois, mais preferencialmente, não mais que um aminoácido da sequência CDR3 da cadeia pesada de MF6974 ou MF6076 ou MF7686.

24. Anticorpo ou variante do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que e compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de PD-l1 e em que o referido domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de PD-l1 compreende: - sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada que são idênticas às sequências CDRl, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada de uma região variável selecionada do grupo que consiste em MF6974, MF6076 e MF7686; ou - sequências CDRl1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada que se desviam em não mais que três, preferencialmente não mais que duas, mais preferencialmente não mais do que um aminoácido da sequência CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada da MF6974 ou MF6076 ou MF7686.

25. Anticorpo ou variante do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de PD-1 e em que o referido domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de PD-1 compreende: - uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de MF6974 ou MF6076 ou MF7686, ou - uma região variável da cadeia pesada com uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à sequência de aminoácidos de MF6974 ou MF6076 ou MF7686.

26. Anticorpo ou variante do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações l1 a 25, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de PD-L1 e em que o referido domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de PD- Ll compreende: - uma sequência CDR3 da cadeia pesada que é idêntica à sequência CDR3 da cadeia pesada de uma região variável selecionada do grupo que consiste em MF7689 e MF7703; ou - uma sequência de CDR3 da cadeia pesada que se desvia em não mais que três, preferencialmente não mais que dois, mais preferencialmente não mais que um aminoácido da sequência CDR3 da cadeia pesada de MF7689 ou MF7703.

27. Anticorpo ou variante do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações l1 a 26, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de PD-Ll, e, em que o referido domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de PD-Ll compreende: - sequências CDR1 e CDR2 e CDR3 da cadeia pesada que são idênticas às sequências CDRl e CDR2 e CDR3 da cadeia pesada de uma região variável selecionada do grupo que consiste em MF7689 e MF7703; ou - sequências CDR1 e CDR2 e CDR3 da cadeia pesada que se desviam em não mais que três, preferencialmente, não mais que duas, mais preferencialmente, não mais do que um aminoácido das sequências CDR1 e CDR2 e CDR3 da cadeia pesada de MF7689 ou MF7703.

28. Anticorpo ou variante do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de PD-L1 e em que o referido domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular de PD- Ll compreende: - uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de MF7689 ou MF7703, ou - uma região variável da cadeia pesada com uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à sequência de aminoácidos de MF7689 ou MF7703.

29. Anticorpo ou variante do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações l1 a 28, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável da cadeia leve que possui as sequências CDRl, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia leve, como representado na Figura 1B ou sequências CDR1, CDR2 e CDR3 que se desviam em não mais do que três, preferencialmente não mais do que dois, mais preferencialmente não mais do que um aminoácido das sequências CDR1 e CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia leve representadas na Figura 1B.

30. Anticorpo ou variante do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável da cadeia leve com uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à sequência de aminoácidos, como representado na Figura 1B.

31. Anticorpo ou variante do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que os locais de ligação ao antígeno do referido anticorpo ou variante do mesmo consistem em um domínio variável da imunoglobulina que pode ligar uma parte extracelular do PD-1 e um domínio variável da imunoglobulina que pode ligue uma parte extracelular de PD-L1 ou PD-L2.

32. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações l1 a 31, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo é um anticorpo biespecífico de comprimento total.

33. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo é uma IgG.

34. Método para inibir uma atividade biológica em uma primeira ou segunda célula mediada pela ligação de um membro da família CD28 (primeira proteína de membrana) e em uma primeira célula a um membro da família B7 (segunda proteína de membrana) em uma segunda célula, caracterizado pelo fato de que a referida primeira e segunda proteína de membrana são parceiros de ligação (isto é, um par ligante e receptor), o método compreendendo

- fornecer um sistema compreendendo a referida primeira e segunda célula com um anticorpo ou uma variante do referido anticorpo que mantém a especificidade de ligação do anticorpo compreendendo um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da referida primeira proteína da membrana e um domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da referida segunda proteína de membrana; e

- incubar o referido sistema em condições permissivas para a primeira ou a segunda célula expressar a referida atividade biológica mediada pela ligação da referida primeira proteína da membrana à referida segunda proteína da membrana na ausência do referido anticorpo ou variante do mesmo;

- em que a ligação do domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular da referida primeira proteína de membrana bloqueia a ligação da referida primeira proteína de membrana à referida segunda proteína da membrana e / ou a ligação do domínio variável que pode se ligar a uma parte extracelular do a referida segunda proteína de membrana bloqueia a ligação da referida primeira proteína de membrana à referida segunda proteína de membrana.

35. Método, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a ligação do anticorpo ou sua variante reduz uma atividade inibidora da ligação do par receptor-ligante na referida primeira célula.

36. Método, de acordo com a reivindicação 34 ou reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a referida primeira proteína de membrana é a proteína de morte celular programada 1 (PD-l); proteína 4 citotóxica associada a linfócitos T (CTLA-4); Atenuador de linfócitos B e T (BTLA); ou Domínio transmembranar e imunoglobulina contendo 2 (TMIGD2).

37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 36, caracterizado pelo fato de que a referida segunda proteína de membrana é a proteína de ligação 1 da morte celular programada 1 (PD-L1); Proteína do ligação 2 da morte celular programada 1 (PD-L2); CD80; CD86; B7-H4; TNFRSFl14; ou B7-H7.

38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 37, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo ou variante do mesmo é um anticorpo ou variante do mesmo, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 33.

39. Método para produzir um anticorpo ou variante do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que a partir de uma única célula, em que o referido anticorpo ou variante do mesmo compreende dois domínios CH3 que são capazes de formar uma interface, o referido método compreendendo: - uma célula que possui a) uma primeira molécula de ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de IgG que reconhece especificamente uma parte extracelular de uma proteína da família CD28, preferencialmente PD-l, e que contém um primeiro domínio CH3 e b) um segundo ácido nucleico sequência que codifica uma cadeia pesada de IgG que reconhece especificamente uma parte extracelular de uma proteína da família B7, preferencialmente, PD-Ll, e que contém um 2º domínio CH3, em que as ditas sequências de ácidos nucleicos são fornecidas com mutações para emparelhamento preferencial das ditas 1 e 2 Domínios CH3, o referido método compreendendo ainda a etapa de cultura da referida célula e permitindo a expressão das referidas sequências de ácidos nucleicos e a colheita do referido anticorpo ou variante do mesmo da cultura.

40. Método, de acordo com a reivindicação 39 caracterizado pelo fato de que a referida célula possui uma terceira sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia leve comum, preferencialmente, a cadeia leve kappa humana rearranjada da linhagem germinativa IgVKkKl139*01/IGJIK1*01.

41. Método, de acordo com a reivindicação 39 ou 40, caracterizado pelo fato de que o referido primeiro domínio CH3 compreende as substituições de aminoácidos L351K e T366K (numeração de acordo com a numeração da UE), e, em que o referido segundo domínio CH3 compreende as substituições de aminoácidos L351D e L368E (numeração de acordo com a numeração da UE), o referido método compreendendo ainda a etapa de cultivar a referida célula e permitindo a expressão das referidas sequências de ácidos nucleicos e a colheita do referido anticorpo ou sua variante da cultura.

42. Anticorpo ou variante do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado pelo fato de que é para uso como um medicamento.

43. Anticorpo ou variante do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado pelo fato de que é para uso em um método para o tratamento de câncer ou uma infecção por um patógeno, de preferência, um vírus ou parasita.

44, Composição ou kit de partes caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um anticorpo ou variante do mesmo conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1-33.

45. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um anticorpo ou variante do mesmo, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 33, e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

46. Molécula de ácido nucleico caracterizada pelo fato de que possui um comprimento de pelo menos 15 nucleotídeos que codificam pelo menos uma região CDR de um anticorpo ou variante conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 33.

47. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que codifica pelo menos uma região variável da cadeia pesada de um anticorpo ou variante conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 33.

48. Molécula de ácido nucleico, de acordo com as reivindicações 46 ou 47, caracterizada pelo fato de que codifica uma região variável da cadeia pesada, como representado na Figura 3 e / ou 13.

49, Molécula de ácido nucleico caracterizada pelo fato de que codifica um anticorpo ou variante conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1-33.

50. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico conforme definido por qualquer uma das reivindicações 46 a 49.

51. Célula isolada ou recombinante, ou um animal não humano caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico conforme definido por qualquer uma das reivindicações 46 a 49 ou um vetor conforme definido pela reivindicação 50.

52. Método para tratar um câncer ou uma infecção por um patógeno caracterizado "pelo fato de que compreende administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo Ou variante conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 33, ou uma composição, conforme definido pela reivindicação 44 ou 45, ou uma molécula de ácido nucleico conforme definido por qualquer uma das reivindicações 46 a 49 ou um vetor conforme definido pela reivindicação 50.