JP2015157824A - Ｐｄ−１特異抗体およびその使用 - Google Patents

Abstract

【課題】ＰＤ−１アゴニストとして作用し、それによってＰＤ−１により調節される免疫応答を調整することができる抗体及び組成物の提供。【解決手段】抗体又はその抗原結合性フラグメントの組合せを含む組成物であって、ここに第１の抗体又はその抗原結合性フラグメント（第１の抗体または第１の抗体の抗原結合性フラグメント）はHPA Culture Collections（ＨＰＡ−ＣＣ）に受託番号ECACC 08090901で寄託したハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体と同じエピトープに結合し、第２の抗体又はその抗原結合性フラグメント（第２の抗体または第２の抗体の抗原結合性フラグメント）はHPA−ＣＣに受託番号ECACC 08090903で寄託したハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体と同じエピトープに結合する、組成物。【選択図】なし

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、２００８年９月１２日に出願された米国仮出願第６１／０９６，４８５号の利益を主張し、その開示内容は図、表およびアミノ酸または核酸配列の全てを含む全体を引用により本明細書の一部とする。

（発明の概要）
本開示内容の１つの態様は、ＰＤ−１のアゴニストとして作用し、それによってＰＤ−１により調節される免疫応答を調整し得る抗体を提供する。１つの実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は新規な抗原結合性フラグメントであってよい。本明細書で開示される抗ＰＤ−１抗体は、ヒトＰＤ−１に結合することができ、ＰＤ−１の活性を刺激し、それによってＰＤ−１を発現する免疫細胞の機能を抑制することができる。本開示内容において使用する例示的な抗体は、限定するものではないが、クローン１０により産生されるモノクローナル抗体が挙げられる。

本開示内容の別の態様は、ＰＤ−１特異抗体を含む組成物および免疫応答を下方制御する方法におけるそれらの使用を提供する。これらの方法は、ヒトまたは動物を含むいずれの対象にも実施することができる。特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体を用いて、Ｔ細胞の応答を低下させることにより免疫障害を処置または予防する。ＰＤ−１特異抗体を対象に投与することにより処置することができる非制限的な免疫障害には、限定するものではないが、関節リウマチ、多発性硬化症、炎症性腸疾患、クローン病、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、移植片拒絶反応、移植片対宿主病、過剰増殖性免疫異常（hyperproliferative immune disorder）、癌および感染症が挙げられる。本発明のこの態様の幾つかの実施形態では、別個の重ならないエピトープに結合する２つのＰＤ−１特異抗体を用いることができる。

本明細書中で開示される抗ＰＤ−１抗体は、本発明の他の態様では、生体試料中のＰＤ−１またはその断片を検出するために用いることができる。検出されるＰＤ−１の量は、ＰＤ−１の発現レベルと相関し、対象における免疫細胞の活性状態（例えば、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞および／または単球）と関係する。

ヒトＰＤ−１トランスフェクタントに結合する抗体の検出。ヒトＰＤ−１の細胞外領域を発現する構築物（パネルＡおよびＢ）またはクローン１９抗ＰＤ−１抗体の結合に影響を及ぼす変異型（Ｌ１６Ｒ；パネルＣ）もしくはクローン１０抗ＰＤ−１抗体の結合に影響を及ぼす変異型（Ｌ１０３Ｅ；パネルＤ）で細胞をトランスフェクトした。前記細胞を、アイソタイプ対照抗体（パネルＡ）またはクローン１９抗体（パネルＢおよびＣ）またはクローン１０抗体（パネルＤ）で標識し、続いてＡｌｅｘａ６４７標識二次抗体で標識した。トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞はｅＧＦＰ陽性（Ｘ軸）である。抗体の結合はｙ軸で示される。 ＰＤ−１エピトープ・スクリーン。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で全長のタンパク質として発現された各ＰＤ−１変異体に関するＧＦＰ^＋細胞のＡｌｅｘａ６４７蛍光強度の幾何平均を示す。 抗ＰＤ−１抗体のエピトープ。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における一残基変異のＰＤ−１の発現後の抗体の結合分析により、エピトープをマッピングした。変異させた場合にクローン２、１０および１９抗体の結合を部分的にまたは完全に抑制するヒトＰＤ−１残基に相当するマウスＰＤ−１残基を、マウスＰＤ−１結晶構造（Zhang et al. Immunity 20, 337-47 (2004)）上に、黒色で強調する。変異させた場合でも抗体の結合性に影響を及ぼさないヒトＰＤ−１残基の相当するマウス残基を、灰色に着色する。非結合性の変異体の変異させた残基の番号は、各抗体ごとに結晶構造に沿って示す。この分析結果に基づけば、クローン２とクローン１０抗体とは、ＰＤ−１と結合する際に互いに競合し得る。 ｈＰＤ−１／ｍＣＤ３ζＷＴ／ｍＣＤ２８キメラに結合する抗ＰＤ−１抗体により誘導されるＩＬ−２分泌。（図４Ａ）ヒトＰＤ−１の細胞外領域とマウス（ｍ）ＴＣＲζおよびＣＤ２８の膜貫通領域および細胞質領域とからなるキメラを、ＤＯ１１．１０細胞中で発現させた。 ｈＰＤ−１／ｍＣＤ３ζＷＴ／ｍＣＤ２８キメラに結合する抗ＰＤ−１抗体により誘導されるＩＬ−２分泌。（図４Ｂ）細胞を固定化した抗ＣＤ３（ＫＴ３）または抗ＰＤ−１抗体で処理し、放出されたＩＬ−２の量を測定した。 トシル活性化（tosyl-activated）ＤＹＮＡＬＢＥＡＤＳ上にロードされたモノクローナル抗体の定量。使用したローディングあたりの抗ヒトＣＤ３ ＯＫＴ３抗体の量（総量２．５μｇの抗体による１０^７ビーズ）をｘ軸に示す。抗体の残量は、ラビットＩｇＧまたは抗ＰＤ−１抗体（クローン１９、クローン１０、クローン２）で構成され、２．５μｇ総量であった。検出されたビーズあたりのＩｇＧ１（ラビットＩｇＧまたは抗ＰＤ−１抗体；赤棒）またはＩｇＧ２ａ（ＯＫＴ３；青棒）の分子数をｙ軸に示す。緑の矢印は、図６で示される実験に使用するために選択したビーズを示す。値は、二重試験の結果である。 トシル活性化（tosyl-activated）ＤＹＮＡＬＢＥＡＤＳに連結された抗ＰＤ−１抗体の滴定。ＰＢＬのバルク調製物を、抗ＣＤ３抗体と増加量の抗ＰＤ−１抗体（クローン１９またはクローン１０）とを有するビーズと一緒にインキュベートした。ロードされた１０^７ビーズあたりの抗ＰＤ−１抗体の量（１０^７ビーズあたり総量２．５μｇのｍＡｂ）をｘ軸に示す。増殖（ｙ軸）は、５日目にＣＦＳＥ希釈により測定した。棒は三重試験の平均値±ＳＤを表す。 ２つの抗ＰＤ−１抗体の滴定による、ＰＤ−１／ｍＣＤ２８キメラ発現ＤＯ１１．１０細胞系の刺激。ＰＤ−１／ｍＣＤ２８キメラを発現するＤＯ１１．１０細胞を抗ＰＤ−１クローン１９抗体（１００μｇ／ｍｌ〜０μｇ／ｍｌ）と抗ＰＤ−１クローン１０抗体（１００μｇ／ｍｌ〜０μｇ／ｍｌ）との滴定物と共にインキュベートした。次いで、細胞をロバ抗マウスＩｇＧ抗体（５００μｇ／ｍｌ）でコートした９６穴プレート中で４８時間インキュベートした後、組織培養上清をＥＬＩＳＡによりＩＬ−２についてアッセイした。 Ｉｇ含有量に対して定量されたビーズによるＴ細胞の活性化。ＰＢＬからプラスチック付着により単球を除去した（バルクＰＢＬ）。抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）および抗ＰＤ−１抗体（クローン１９またはクローン１０）を定量し、ビーズあたりの分子数として表現して表（左欄）に示す。増殖（ｙ軸）は、５日目にＣＦＳＥ希釈により測定した。バーは二重試験±ＳＤである。 ２つの抗体による異なるシグナル伝達の説明。クローン１９は、クローン１０よりも、ｈＰＤ−１／ｍＣＤ３ζＷＴ／ｍＣＤ２８キメラによるより強力なシグナル伝達を示す。ＰＤ−１は、ＩＴＩＭ（抑制性、青）とＩＴＳＭ（活性化、赤）チロシンベースのシグナル伝達モチーフとを有する。インビトロ（試験管内）で、クローン１９が双方のモチーフのリン酸化を引き起こすのに対し、クローン１０ライゲーションは結果的に抑制性モチーフのみをリン酸化し、より強力な抑制性のシグナル伝達をもたらすことが示される。 ｈＰＤ−１／ｍＣＤ２８キメラに結合する抗ＰＤ−１抗体により誘導されるＩＬ−２分泌。（図１０Ａ）ヒトＰＤ−１の細胞外領域とマウスＣＤ２８の膜貫通領域および細胞内領域とから成るキメラをＤＯ１１．１０細胞に発現させた。 ｈＰＤ−１／ｍＣＤ２８キメラに結合する抗ＰＤ−１抗体により誘導されるＩＬ−２分泌。（図１０Ｂ）上記細胞を、固定化した抗ＣＤ３抗体（ＫＴ３）または抗ＰＤ−１抗体により処理し、放出されるＩＬ−２の量を測定した。 単量体のシグナル伝達タンパク質に結合する抗体ペアにより誘導される強力なシグナル伝達。（図１１Ａ）二価抗体はシグナル伝達ドメインの高い局所的な密度を作り出すことができるため、ホモ二量体の受容体による強力なシグナル伝達を引き起こすことができる。 単量体のシグナル伝達タンパク質に結合する抗体ペアにより誘導される強力なシグナル伝達。（図１１Ｂ）対照的に、抗体は、単量体の受容体、例えばＰＤ−１のペアを集めることができるだけで、非常に弱い強度のシグナル伝達を導く。 単量体のシグナル伝達タンパク質に結合する抗体ペアにより誘導される強力なシグナル伝達。（図１１Ｃ）重ならない２つのエピトープに結合する抗体を用いることにより、単量体のシグナル伝達受容体のより高い密度を作りだせ、より強力なシグナル伝達を作り出せる。 表面プラズモン共鳴ベースの分析により決定されたクローン２、１０および１９抗体の解離速度。３つの抗体および陰性対照（ＯＸ−７）をバイオセンサー表面に間接的に、すなわち共有結合により連結されたラビット抗マウスＦｃ抗体を介して、結合させた。次いで、単量体の可溶性ヒトＰＤ−１を、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４の緩衝液中で、固定化した抗体に対して飽和濃度で注入した。可溶性ＰＤ−１の注入に続いて、緩衝液のみを注入し、同時に各抗体からの結合した可溶性ＰＤ−１の解離を可能にした。解離速度は、抗マウスＦｃ抗体から解離するＯＸ−７の解離速度を差し引いた後に、Ｏｒｉｇｉｎ ｖ．５．０ソフトウェア（MicroCal Software Inc, Northampton, MA）を用いてフィッティングした。 抗ＰＤ−１抗体によるＣＤ^＋４Ｔ細胞増殖の抑制。ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、ヒトＰＢＬから陰性選択により精製し、抗ＣＤ３に加えて対照（ＢＳＡまたはＭＯＰＣ２１）またはクローン１０抗体でコートしたダイナビーズと一緒にインキュベートした。増殖（ｙ軸）を６日目に^３Ｈ−チミジン取り込みにより測定した。バーは最大応答の％を表し（抗ＣＤ３／ＢＳＡ）、４つの異なるドナー培養液の平均値＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍである。

（発明の詳しい説明）
本明細書で用いられる用語「抗体」は、免疫グロブリンまたはそのフラグメントもしくは誘導体を表し、インビトロまたはインビボ（生体内）で産生されたかどうかに関わらず、抗原結合部位を含むいずれかのポリペプチドを包含する。従って、抗体には、限定するものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、変異導入抗体およびグラフト化抗体（gragted antidobies）が含まれる。

用語「抗体フラグメント」または「抗原結合性フラグメント」には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）_２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｅｄ、ｄａｂなどの抗体フラグメント、および抗原結合機能、すなわち特異的にＰＤ−１と結合する能力を保持するおよび／または本明細書中で開示されるモノクローナル抗体から生成される他の抗体フラグメントが含まれる。これらのフラグメントは、抗原結合ドメインを含み、また幾つかの実施形態においてはＰＤ−１の機能を刺激することができる。本明細書中で開示される抗体およびそのフラグメントには、親抗体（例えばクローン１０および／またはクローン１９により産生される抗体）と比較した場合に改変されたグリコシル化パターンを有する抗体が含まれる。

上記のように、本明細書中で開示されるＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１を刺激することにより、リンパ球の活性化および／または増殖をアンタゴナイズできる。用語「活性をアンタゴナイズする」とは、リンパ球の増殖または活性を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９０％超減少（または低下）を意味する。用語「アンタゴナイズ」は、用語「抑制性」および「抑制」と相互交換可能に用いられ得る。ＰＤ−１媒介性活性は、本明細書に記載されるようにＴ細胞増殖アッセイを用いて定量的に決定することができる。

用語「治療上の有効」、「治療上の有効量」、「有効な量」または「有効量で」は、ＰＤ−１の活性を刺激し、対象における症状の改善を提供するか、または所望の生物学的応答、例えば低下したＴ細胞活性等を達成するのに十分な開示抗体の用量または量を示す。

用語「単離された」は、その天然環境から実質的に独立した分子を示す。例えば、単離された抗体は、細胞性物質または細胞（例えばハイブリドーマ）もしくはそれらが誘導された他の供給源由来の他のタンパク質を実質的に含まない。用語「単離された」は、単離されたタンパク質が、医薬組成物として投与するのに十分に純粋であるか、少なくとも７０〜８０％（ｗ／ｗ）純粋、少なくとも８０〜９０％（ｗ／ｗ）純粋、９０〜９５％純粋；または少なくとも９５％、９６％，９７％、９８％、９９％、または１００％（ｗ／ｗ）純粋な調製物を示す。

本開示内容の１つの態様は、ＰＤ−１のアゴニストとして作用し、それによってＰＤ−１により調製される免疫応答を調整することができる抗体を提供する。１つの実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は新規な抗原結合性フラグメントであってよい。本明細書中で開示される抗ＰＤ−１抗体は、例えばヒトＰＤ−１と結合してＰＤ−１を刺激し、それによってＰＤ−１を発現する免疫細胞の機能を抑制することができる。幾つかの実施形態において、免疫細胞は活性化リンパ球、例えばＰＤ−１を発現するＴ細胞、Ｂ細胞および／または単球である。この開示の内容で使用する例示的な抗体は、限定するものではないが、クローン１０により産生されたモノクローナル抗体が挙げられる。本発明のこの態様の幾つかの実施形態では、別個の重ならないエピトープと結合する２つのＰＤ−１特異抗体を用いることができる。他の実施形態は、ＰＤ−１上のエピトープに結合する他の抗体と競合する抗体を提供する（例えば、クローン１０とクローン２）。

本明細書に記載される抗ＰＤ−１抗体は、別の分子／部分に連結することができる。非制限的な例には、他のペプチドまたはタンパク質（アルブミン、他の抗体等）、毒素、ラジオアイソトープ、細胞毒性薬または細胞増殖抑制薬が挙げられる。用語「連結」または「連結された」は、組換え法による他の分子／部分との化学的架橋または共有結合に関する。本明細書中で開示される抗体は、１つ以上の非タンパク質性のポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンにも連結することができる（例えば、米国特許第４，７９１，１９２号；第４，７６６，１０６号；第４，６７０，４１７号；第４，６４０，８３５号；第４，６０９，５４６号；第４，４９６，６８９号；第４，４９５，２８５号；第４，３０１，１４４号および第４，１７９，３３７号を参照のこと、各々引用により完全に本明細書の一部とする）。

抗体は、検出可能なまたは機能的な標識をタグ付けすることができる。検出可能な標識には、^９９Ｔｃなどの放射標識が挙げられ、それらは標準的な化学を用いて抗体に結合させることも可能である。検出可能な標識には、酵素標識、例えば西洋ワサビペルオキダーゼまたはアルカリホスファターゼも挙げられる。他の種類の検出可能な標識には、ビオチンなどの化学部分が挙げられ、それらは特異的なコグネート検出可能部分、例えば標識アビジンに対する結合を介して検出することができる。

本発明の他の態様は、ＰＤ−１またはＰＤ−１発現細胞を単離するために、本明細書中で開示される抗体の使用を提供する。本発明のさらなる他の態様は、特異抗原に対する寛容を誘導する方法を提供する。例えば、寛容は、本明細書中で開示される抗原と抗ＰＤ−１抗体の同時投与により誘導することができる。本発明のさらなる他の態様は、本明細書中で開示される抗ＰＤ−１抗体を投与することを含む、対象における活性化リンパ球により調整される免疫応答を低下させることに関する。本発明の他の態様では、ＰＤ−１を刺激し、免疫応答を下方制御するための（幾つかの場合には、活性化リンパ球の増殖を抑制または低下させるための）、開示抗ＰＤ−１抗体の使用を提供する。具体的な実施形態において、免疫応答はＴｃＲ／ＣＤ２８媒介型である。本明細書中で記載するように、アレルギー、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、炎症性腸疾患、クローン病、全身性エリテマトーデス、組織、皮膚および器官の移植片拒絶反応または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）は、抗ＰＤ−１抗体の投与を介して処置し得る。本発明のこの態様の幾つかの実施形態では、別個の重ならないエピトープに結合する２つのＰＤ−１特異抗体を使用することができる。

本開示内容の他の態様は、ＰＤ−１特異抗体を含む組成物および免疫応答を下方制御する（または、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞または単球細胞の増殖を低下させる）方法を提供する。これらの方法は、いずれの対象、例えばヒトまたは動物においても実施することができる。特定の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、Ｔ細胞応答を低下させることによって免疫異常を処置または予防するために用いられる。ＰＤ−１特異抗体の投与を介して処置することができる免疫異常の非制限的な例としては、限定するものではないが、関節リウマチ、多発性硬化症、炎症性腸疾患、クローン病、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、移植片拒絶反応、移植片対宿主病、過剰増殖性免疫異常、癌、および感染症が挙げられる。本発明の更なる他の態様は、炎症性病変におけるリンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞および／または単球）の活性を抑制または低下させることを提供する。本発明のこの態様の幾つかの実施形態は、別個の重ならないエピトープに結合する２つのＰＤ−１特異抗体を用いることができる（そのような抗体は、所望のインビボ活性を与えるように同等の親和性を有し得る（例えば、クローン１９およびクローン２））。

図１２で示すように、クローン１０により産生された抗体は、ＰＤ−１に対して比較的低い親和性を有する。そのような低い親和性抗体は、ＰＤ−１のリガンドと類似の様式で用いることができる。例えば、クローン１０抗体は非常に速い解離速度（ＰＤ−１の天然リガンド（すなわち、ＰＤ−Ｌ２）の解離速度と類似する解離速度）を有する。速い解離速度は、インビトロにおいてクローン１０による良好なシグナル伝達を与える。これは、複数のＰＤ−１分子の「連続的な会合（serial engagement）」を可能にし得るためである。かくして、クローン１０により産生される抗体のような抗体は、複数のＰＤ−１分子を会合させ、抑制性のシグナル伝達を引き起こすために用いることができる。

本明細書中で開示される抗ＰＤ−１抗体は、本発明の他の態様において、生体試料中のＰＤ−１またはその断片を検出するために用いることができる。検出されるＰＤ−１の量は、ＰＤ−１の発現レベルに相関し、対象における免疫細胞（例えば、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞および／または単球）の活性状態と関係する。

本発明の他の態様は、改変された結合親和性を有する抗ＰＤ−１特異モノクローナル抗体を提供する。１つの実施形態は、抗体がＰＤ−１に対して低い親和性を有する（例えば、抗体は０．１秒^−１と０．５秒^−１との間のまたは０．９０秒^−１未満の解離速度を有する）ように結合親和性を改変することを提供する。特定の実施形態は、０．１０秒^−１、０．１５秒^−１、０．２０秒^−１、０．２５秒^−１、０．３０秒^−１、０．３５秒^−１、０．４０秒^−１、０．４５秒^−１または０．５０秒^−１の解離速度（off rate）を有する抗体、あるいは０．０４秒^−１から２．０秒^−１（例えば、０．０４秒^−１、０．０５秒^−１、０．０６秒^−１、０．０７秒^−１、０．０８秒^−１、０．０９秒^−１，０．１０秒^−１、０．１５秒^−１、０．２０秒^−１、０．２５秒^−１、０．３０秒^−１、０．３５秒^−１、０．４０秒^−１、０．４５秒^−１、０．５０秒^−１、０．５５秒^−１、０．６０秒^−１、０．６５秒^−１、０．７０秒^−１、０．７５秒^−１、０．８０秒^−１、０．８５秒^−１、０．９０秒^−１、０．９５秒^−１、１．０秒^−１、１．１０秒^−１、１．２０秒^−１、１．３０秒^−１、１．４０秒^−１、１．５０秒^−１、１．６０秒^−１、１．７０秒^−１、１．８０秒^−１、１．９０秒^−１または２．００秒^−１）までの範囲の解離速度を有する抗体を提供した。そのような結合親和性を有する抗体は、いずれかの適切なプロセスで改変することができる。

かくして、抗体（例えばクローン２、クローン１０またはクローン１９により産生された抗体）の結合親和性は、当分野で公知の様々な方法を介して増強または減弱させることができる。例えば、結合特性は、定方向突然変異、親和性成熟法、ファージディスプレイ法または抗体分子をコードする核酸分子内でのチェインシャッフリング（chain shuffling）により改変することができる。別の方法で特定された抗原結合部位集団において、特定の部位の２０アミノ酸全てを調べ、結合特性／親和性を親和性成熟法（例えば、Yang et al. (1995) J. Mol. Biol. 254, 392-403；Hawkins et al. (1992) J. Mol. Bio. 226,889-896；またはLow et al. (1996) J. Mol. Biol. 250, 359-368（各々、引用によりその全部を、特に抗体の結合親和性を低下または増強する方法に関して、本明細書の一部とする）を参照のこと）により改変し得るように、個々の残基または残基の組合せをランダム化することができる。当分野で公知の方法としては、例えば、Marks et al. BioTechnology, 10, 779-783 (1992)が記載する、ＶＨおよびＶＬドメインシャッフリングによる親和性成熟；Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91, 3809-3813 (1994)；Schier et al. Gene, 169, 147-155 (1995)；Yelton et al. J. Immunol., 155, 1994-2004 (1995)；Jackson et al. J. Immunol., 154, 3310-9 (1995)；およびHawkins et al. J. Mol. Biol., 226, 889-896 (1992)により記載されるＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダム変異導入法が挙げられる。

抗体の最適化に関する方策は、時にはランダム変異導入法を用いて実施される。この場合、部位を無作為に選び出すか、または単純な基準を用いてアミノ酸変異が行われる。例えば全ての残基をアラニンに突然変異させることができ、これはアラニンスキャニングと称される。国際特許公開第９５２３８１３号（引用により全体を本明細書の一部とする）は、アラニンスキャニング変異導入法を利用して抗体の親和性を改変するインビトロ方法を教示する。アラニンスキャニング変異導入法は、例えば抗体による抗原結合残基をマップするために用いることも可能である（Kelley et al. Biochemistry 32, 6828-6835 (1993)；Vajdos et al. J. Mol. Biol. 320, 415-428 (2002)）。親和性成熟の配列ベースの方法（例えば、米国特許出願番号第２００３／０２２２４０Ａ１号および米国特許第２００２／１７７１７０Ａ１号を参照のこと、双方とも引用により全体を本明細書の一部とする）もまた、抗体の結合親和性を増強または減弱させるために用いることができる。最終的に、親和性が改変された抗体の結合親和性は、本明細書に開示するような方法を用いて決定することができる（例えば、改変された抗体の解離速度は、図１２に記載されるように、表面プラズモン共鳴ベースの分析方法により決定することができる）。Ｔ細胞は、いずれかのＴ細胞活性化化合物により活性化できる。実施例で記載するように、そのようなＴ細胞活性化化合物の１つに、ＴｃＲに結合する抗ＣＤ３抗体がある。活性化抗ＣＤ３抗体は当分野で公知である（例えば、米国特許第６，４０５，６９６号および第５，３１６，７６３号（各々、引用により全体を本明細書の一部とする）を参照のこと）。活性化ＴｃＲシグナルと陰性ＰＤ−１シグナルとの比は、当分野で公知の標準的な手法を実験的に用いて決定されるか、または実施例で記載するように決定される。

本発明の抗体または抗体組成物は、治療上の有効量で投与される。一般に、治療上の有効量は、対象の年齢、状態および性別、ならびに対象の医学的状態の重篤度により変更され得る。抗体の治療上の有効量は、体重１ｋｇあたり約０．００１〜約２５ｍｇであり、好ましくは体重１ｋｇあたり約０．０１〜約２５ｍｇであり、体重１ｋｇあたり約０．１〜２０ｍｇであり、または体重１ｋｇあたり約１〜約１０ｍｇである。この投薬量は、必要に応じて、処置の観察結果に合わせて調整され得る。適当な用量は、処置する医師により臨床的適応に応じて選択される。

他の態様において、本発明の抗体は、ＰＤ−１を発現する細胞に、他の治療薬または細胞毒性薬（例えば、毒素）の送達に標的薬剤として用いることができる。本方法は、細胞表面に発現されたＰＤ−１に対する抗体の結合を可能にする条件下で治療薬または細胞毒性薬に連結された抗ＰＤ−１抗体を投与することを含む。

本発明のさらなる他の態様は、生体試料中のＰＤ−１の存在を検出するための開示した抗体の使用を提供する。検出されるＰＤ−１の量は、ＰＤ−１の発現レベルと相関し、同様に、対象における免疫細胞の活性状態（例えば、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、および単球）と相関する。

本発明は、抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下で、ＰＤ−１またはＰＤ−１を発現する細胞を含み得る試料を抗体に接触させることを含む、ＰＤ−１ポリペプチドに抗体を結合させる方法を提供する。これらの方法は、前記抗体−抗原複合体の形成を検出する工程をさらに含む。前記複合体は、当分野で公知のいずれかの方法（例えば、蛍光活性化セルソーター、放射免疫測定、または色原体アッセイ（chromogenic assay））を用いて検出することができる。

開示内容の他の態様は、抗ＰＤ−１抗体を含む組成物を提供する。これらの組成物は、医薬上有用な組成物を製造する公知の方法に従って製剤化することができる。製剤化は、周知および当業者に容易に利用できる、多くの情報源に記載される。例えば、Remington's Pharmaceutical Science（Martin E.W., Easton Pennsylvania, Mack Publishing Company, 19^th ed., 1995）は、本発明に関連して用いることができる製剤化を記載する。投与に適した製剤は、例えば対象とする受容人の血液と等張性の製剤を与える抗酸化剤、緩衝液、細菌発育阻止および溶質を含んでいてよい水性滅菌注射液；ならびに懸濁剤および増粘剤を含有してよい水性および非水性滅菌懸濁液が挙げられる。製剤は、単位服用量または複数服用量容器、例えば密封アンプルおよびバイアルに製造されてよく、ならびに滅菌液体キャリア、例えば使用前の注射液の条件のみを要求する凍結して乾燥させた（凍結乾燥）条件で貯蔵することができる。即座の注射液および懸濁液は、滅菌粉末、顆粒、錠剤等から調製することができる。特に上記の成分に加えて、本発明の製剤は検討の製剤タイプに関する分野で慣用される他の成分を含ませることができる。

本発明の他の態様は、本明細書中で開示されるＰＤ−１特異抗体をコードする核酸を提供する。例えば、クローン１０またはクローン２により分泌される抗体をコードする核酸は、当業者に公知の方法に従って単離することができる。本発明の更なる他の態様は、クローン１０またはクローン２により分泌されるようなＰＤ−１特異抗体をコードする核酸を含むベクターおよび形質転換された宿主細胞を提供する。当業者には明らかであるように、本明細書中で開示されるネズミ抗体の定常領域は、ヒト定常領域と置換することができ、ネズミ可変領とヒト定常領域とを含むキメラ抗体を形成させることができる。幾つかの実施形態は、抗体による高いＦｃ受容体結合性を提供する、開示抗体における重鎖定常領域の置換を提供する（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ３およびネズミＩｇＧ２ａアイソタイプ、これらＦｃ受容体に強く結合するものは全て、結合特異性に影響を及ぼさずに開示抗体の可変領域に対してグラフトすることができる）。別には、本明細書中で開示するネズミ抗体由来のＣＤＲを単離し、ヒトフレームワーク領域にグラフトしてヒト化抗体を形成させることができる。最終的に、開示するＰＤ−１特異抗体を作製する方法（例えば、前述のヒト化抗体およびキメラ抗体を作製する方法）もまた本発明により提供される。

本明細書中で開示されるハイブリドーマは、２００８年９月９日にHPA Culture Collections, Health Protection Agency, Centre For Emergency Preparedness and Response, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG United Kingdomに寄託した。ハイブリドーマの受入番号は以下の通りである：
クローン ２： ０８０９０９０３；
クローン１０： ０８０９０９０２；および
クローン１９： ０８０９０９０１。

上記のように、本明細書中で開示される抗体は、全長のネズミ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、あるいはそれらのフラグメントまたは誘導体であってよい。１つの実施形態において、抗体は、クローン１０または配列番号：２、あるいはａ）配列番号：１０および配列番号：８；またはｂ）配列番号：６および配列番号：２を含むモノクローナル抗体と同じエピトープまたは実質的に同一のエピトープに結合する。他の実施形態において、抗体、例えばそのフラグメントまたは誘導体は、クローン１０（配列番号：１０および８）またはクローン２（配列番号：６および２）と同じまたは実質的に同一のＶＨおよび／またはＶｋ領域を含む。

他の実施形態において、抗体、例えばそのフラグメントまたは誘導体は、クローン１０またはクローン２のＶｋおよびＶＨ配列に見出される配列と同一または実質的に同一のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む。１つの実施形態において、抗体は、ａ）配列番号：１０および配列番号：８、またはｂ）配列番号：６および配列番号：２、ならびにネズミＩｇＧ１定常重鎖領域の配列（ジーンバンク受入番号．Ｄ７８３４４、引用により全体を本明細書の一部とする）およびネズミＩｇＧ１定常軽鎖領域（ジーンバンク受入番号．Ｖ００８７、引用により全体を本明細書の一部とする）を含む。本発明の他の態様は、開示抗体をコードする核酸配列、前記配列を含む発現ベクター、前記ベクターを含む宿主細胞、前記宿主細胞から前記抗体を製造する方法を提供する。

本発明の抗体のフラグメントおよび誘導体を、当分野で公知の技術により作製することができる。「免疫反応性フラグメント」は、完全抗体（intact antibody）の一部、概して、抗原結合部位または可変領域を包含する。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆａｂ'−ＳＨ、Ｆ（ａｂ'）_２、およびＦｖフラグメント；二重特異性抗体；連続アミノ酸残基の１つの連続配列からなる一次配列を有するポリペプチドであるいずれかの抗体フラグメント（本明細書中では「一本鎖抗体フラグメント」または「一本鎖ポリペプチド」と称する）、限定するものではないが、（１）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（２）会合する重鎖部分を含まず、１つの軽鎖可変ドメインのみを含む一本鎖ポリペプチドまたは軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含むそのフラグメント、および（３）会合する軽鎖部分を含まず、１つの重鎖可変領域のみを含む一本鎖ポリペプチドまたは重鎖の可変領域の３つのＣＤＲを含むそのフラグメント；ならびに抗体フラグメントから形成される多特異性抗体が挙げられる。例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ'）_２フラグメントは、慣用技術に従って、単離抗体のプロテアーゼ消化により作製することができる。別には、本発明の抗体を産生するハイブリドーマは、本発明のフラグメントをコードするよう、改変することができる。次いで、改変ＤＮＡを発現ベクター中に挿入し、適当な細胞を形質転換またはトランスフェクトするために用い、次いで所望のフラグメントを発現させる。

他の実施形態において、本発明の抗体を産生するハイブリドーマのＤＮＡを改変して、例えば、ヒト重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインのコード配列を相同な非ヒト配列の正しい場所に置換することによって（例えばMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, pp. 6851 (1984)）、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部もしくは一部の免疫グロブリンのコード配列に共有結合させることによって、発現ベクター中への挿入する。この様式において、元の抗体の結合特異性を有する「キメラ」抗体または「ハイブリッド」抗体を製造することができる。典型的には、そのような非免疫グロブリン・ポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインで置換されている。かくして、本発明の抗体は、所望の生物学的活性を示す限り、その重鎖および／または軽鎖の一部が元の抗体に対応する配列と同一または相同であって、前記鎖（両方の鎖）の残りの部分が他の種由来の抗体または他のクラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一または相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）であってもよい（Cabilly et al., supra; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, pp. 6851 (1984)）。

例示的な実施形態において、クローン１０またはクローン２のＶＨおよびＶｋ配列またはその誘導体もしくはバリアント由来のキメラ組換えｍＡｂが作製される。クローン１０またはクローン２のＶＨおよびＶｋ配列をコードする核酸配列（それぞれ、配列番号：１０および８または配列番号：６および２）を、ヒトまたは非ヒト抗体の軽鎖および重鎖の定常領域を含む商業的に入手可能なまたは他の公知の真核生物用の発現ベクター中に、標準的な技術を用いてクローニングする。商業的に入手可能なベクターの１つの例としては、ＡＴＣＣから入手可能なｐＡＳＫ８４（American Type Culture Collection、カタログナンバー８７０９４）がある。次いで、ＣＨＯ細胞または他の哺乳動物細胞系を、前記ベクターを用いて標準的な方法、例えば「Molecular Cloning”, Sambrook et al」に記載されるような方法によりトランスフェクトする。その結果は、目的の抗体分子、例えばクローン１９の元のＶＨおよびＶｋ領域とヒトｍＡｂ由来の定常領域とを含むクローン１０または２のキメラ型を安定して発現および分泌するトランスフェクト細胞系である。ヒトＩｇＧの定常領域をコードする完全なｃＤＮＡ配列は、以下のジーンバンク・エントリーで探し出すことができ、各々、引用により全体を本明細書の一部とする：ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域；ジーンバンク受入番号：Ｊ００２２８、ヒトＩｇＧ２重鎖定常領域；ジーンバンク受入番号：Ｊ００２３０、ヒトＩｇＧ３重鎖定常領域；ジーンバンク受入番号：Ｘ０４６４６、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域；ジーンバンク受入番号：Ｋ０１３１６、およびヒト・カッパ軽鎖定常領域；ジーンバンク受入番号：Ｊ００２４１。

別には、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント）を発現させるために、クローン１０またはクローン２のＶＨおよびＶｋ領域またはその変異体もしくは誘導体は、切断型の定常領域をコードするベクター中にクローニングすることができる。抗体のアイソタプスイッチは、同様の原理に従って作製することができる。例えば、クローン１０またはクローン２と完全に同じ特異性を有するが異なるアイソタイプの抗体は、ヒト・カッパ軽鎖定常領域とＩｇＧ１またはＩｇＧ２またはＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖定常領域から選択されるヒト重鎖定常領域とをコードするｃＤＮＡを含むプラスミドに、ＶｋおよびＶＨ配列をコードするｃＤＮＡをサブクローニングすることによって得ることができる。このように、作り出される抗体はいずれかのアイソタプを有することができ、次いで該抗体は当分野で一般的な技術を用いてアイソタイプスイッチさせることが可能である。そのような技術には、直接的な組換え技術の使用（例えば、米国特許第４，８１６，３９７号を参照のこと）、細胞−細胞融合技術（例えば、米国特許第５，９１６，７７１号を参照のこと）、および当分野で公知の適切な他の技術が含まれる。従って、本発明により提供される抗体のエフェクター機能は、様々な治療または他の使用のために、親の抗体のアイソタイプについてはアイソタイプスイッチにより、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体に「変える」ことができる。

他の実施形態に従い、本発明の抗体はヒト化される。本発明による抗体の「ヒト化」型には、ネズミ免疫グロブリンから誘導される最小の配列を含む、特異的なキメラ免疫グロブリン、その免疫グロブリン鎖またはフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）_２、または抗体の他の抗原結合部分配列）がある。大抵の場合、ヒト化抗体は、受容側の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が元の抗体（提供側の抗体）のＣＤＲ由来の残基により置換されるが、元の抗体の所望の特異性、親和性および受容力を保持する、ヒト免疫グロブリン（受容側の抗体）である。幾つかの実施形態において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基により置換されてよい。さらに、非ヒト抗体は、受容側の抗体またはインポートされたＣＤＲもしくはフレームワーク配列のいずれでも見出されない残基を含んでいてよい。これらの改変は、抗体の性能をさらに改良し、最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインを実質的に全部含み、そのＣＤＲ領域は全部または実質的に全部が元の抗体のＣＤＲ領域に対応し、また、そのＦＲ領域の全部または実質的に全部はヒト免疫グロブリン定常配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体はまた、随意に、少なくとも免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのＦｃの一部を含み得る。さらなる詳細に関しては、Jones et al., Nature, 321, pp. 522 (1986)；Reichmann et al., Nature, 332, pp. 323 (1988)；およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2, pp. 593 (1992)を参照のこと。従って、クローン１０またはクローン２のＶＨおよびＶｋのＣＤＲ領域とヒトｍＡｂ由来のフレームワーク領域とを含むクローン１０またはクローン２のヒト化型は、公知の定常およびフレームワークヒトｍＡｂ配列と当分野で確立された技術とを、本明細書に記載するように用いることで作り出すことができる。クローン２のＶＨ ＣＤＲ１ドメインを含むいずれかのヒト化抗体に関して、前記ドメインは配列番号：１８または配列番号：１８のアミノ酸６〜１０を含み得る。クローン１０のＶＨ ＣＤＲ１ドメインを取り入れるいずれかのヒト化抗体に関して、前記ドメインは配列番号：２４または配列番号：２４のアミノ酸６〜１１を含んでいてよい。

本発明の抗体をヒト化する方法は、当分野で周知である。一般に、本発明にかかるヒト化抗体は、元の抗体からヒト化抗体に導入された１つ以上の残基を有する。これらのネズミまたは他の非ヒトアミノ酸残基はしばしば、「インポート」残基と称され、それらは典型的には「インポート」可変ドメインから得られる。ヒト化は、本質的には、Winterと協力者の方法（Jones et al., Nature, 321, pp. 522 (1986); Riechmann et al., Nature, 332, pp. 323 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239, pp. 1534 (1988)）に従って実施される。従って、そのような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体であり（Cabilly et al., U.S. Pat. No. 4,816,567）、実質的に完全なヒト可変ドメインではなく、元の抗体に由来する対応配列で置換されている。実際には、本発明にかかるヒト化抗体は、典型的には、幾つかのＣＤＲ残基また可能な幾つかのＦＲ残基が元の抗体の類似部位の残基により置換されたヒト抗体である。

実施例
実施例１−抗ＰＤ−１抗体を作出する方法
１.１ ミエローマ細胞系
融合に関しては、German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ GmbH, Braunschweig)からのミエローマ細胞系ＳＰ２／０−Ａｇ１４を用いた。この細胞系は、ＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞とミエローマ細胞系Ｐ３ｘ６３Ａｇ８とのハイブリッドである。この細胞は、免疫グロブリン鎖を合成も分泌もせず、２０μｇ／ｍｌの８−アザグアニンに耐性であり、ＨＡＴ（ヒポキサチン、アミノプテリン、チミジン）培地中で生育しないと記載されている。ＳＰ２／０細胞は、組織培養フラスコ中の標準的な増殖培地（１０％のＦＣＳを含む）にて慣用的に維持される。ＨＧＰＲＴ陽性の復帰突然変異の実行を避けるために、凍結ＳＰ２／０細胞の新たな一部を２週間後に用いた。ミエローマ細胞は、全てのマイコプラズマ試験で陰性であることが示された。

１．２ 免疫化のための抗原およびスクリーニング
組換えタンパク質ＰＤ−１Ｆｃを、ＣＤ２８Ｆｃの調製に関して記載された方法（Evans et al. Nat Immunol. 6, 271-9 (2005)）を用いて作製し、０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中、５．１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。還元および非環元条件下で実施される抗原のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、タンパク質の純度が＞９５％であることを確かめた。

１．３ 免疫化
５匹のマウス（約８週齢）を、６０日に亘る免疫プロトコルを用い、腹膜腔内を介して免疫した。免疫に関し、免疫原のミョウバン沈殿物を調製した。ミョウバン沈殿物を各ブーストのために新たに調製した。マウスを５０μｇのタンパク質で免疫し、２５μｇのタンパク質でブーストした。融合体には３匹のマウスを用いた。

１．４ 細胞の一般的な取扱い
細胞は、層流空気流システム、滅菌材料および滅菌溶液を用いた滅菌条件下で取り扱った。細胞は、５％二酸化炭素を含む湿潤雰囲気下３７℃でインキュベートした。ハイブリドーマ細胞の培養では、ＤＭＥＭを含み、２−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミン、グルタマックス（GlutaMax）、ＨＴ、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、抗生物質／抗真菌溶液（供給業者が推奨する濃度）、および種々の濃度のＦＣＳ（１０％、１５％または２０％）を含有する完全培養基（ＣＧＭ）を用いた。

１．５ 脾臓細胞の調製および細胞融合
３匹の免疫マウスをＣＯ_２下で窒息させた後に、脾臓を防腐処理して取り出した。プールした脾臓の単一細胞懸濁液を調製した。脾臓細胞およびミエローマ細胞を、ＤＭＥＭで複数回洗浄し、１ｍｌの５０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ３５５０の存在下で融合させて二倍にした（脾臓細胞対ＳＰ２／０ ２．５：１および２．４：１）。作製したハイブリドーマを、２０％ＦＣＳおよびアミノプテリンを含有するＣＧＭ（ＨＡＴ培地）に懸濁した。各融合体の細胞懸濁液（１４０Ｃｌ／ウェル）を、２０％ＦＣＳを含むＣＧＭ中で１ウェルあたり１４０Ｃｌの腹膜浸出細胞をフィーダー細胞として含む９６ウェル組織培養平底プレート（Corning-Costar）８枚に撒いた。前記プレートを１０日間インキュベートした。この期間中に、細胞に２回ＨＡＴ培地を供給した。脾臓細胞調製物の一部（約８×１０^６脾臓細胞）を、２４ウェルプレートのウェル中で１０日間培養し、細胞培養上清をＥＬＩＳＡの陽性対照として供した。

１．６ スクリーニングアッセイ
細胞培養上清中のＩｇＧスクリーニングのために、ＥＬＩＳＡを用いた。０．５Ｍ 炭酸／重炭酸緩衝液、ｐＨ９．６中のＰＤ−１Ｆｃ抗原（５μｇ／ｍｌ）を１ウェルあたり５０μｌを用いて、９６ウェル平底ポリスチレンマイクロタイタープレート（Greiner, Cat. No 655061）をコートした。４℃の湿室で一晩インキュベートした後、プレートを０．０１％トライトン（Triton）Ｘ−１００を含むトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．８、５００ｍＭ 塩化ナトリウム）（洗浄緩衝液）を用いて洗浄し、ＴＢＳ中の２％ＦＣＳを１ウェルあたり２００μｌ用いて室温（ＲＴ）にて１時間、攪拌器上でブロッキングした。ウェルを洗浄緩衝液にて洗浄し、１００μｌの細胞培養上清を適当なウェルに加えた。ＳＰ２／０ミエローマ細胞からの細胞培養上清を陰性対照として用いた。陽性対照として、脾臓細胞培養からの細胞培養上清を用いた。プレートを、攪拌器上で１時間ＲＴにてインキュベートし、続いて複数回洗浄した。結合抗体の検出のために、ブロッキング緩衝液中のアルカリホスファターゼがコンジュゲートされたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）（１：５０００）を１ウェルあたり５０μｌ用いて、１時間ＲＴにて攪拌器上で、プレートをインキュベートし、続いて複数回洗浄し、そして１ウェルあたり１５０μｌの基質緩衝液（５％ジエタノールアミン＋０．５Ｍ ＭｇＣｌ_２中の２ｍＭ ４−ニトロフェニルリン酸、ｐＨ９．８）を添加した。光学密度（ＯＤ）を、１２チャネルのＤｙｎｅｘ Ｏｐｓｙｓ ＭＲマイクロプレートリーダーにて４０５ｎｍで評価した。ＯＤ４０５ｎｍの平均プレート値よりも２倍以上高いＯＤ４０５ｎｍを有するウェルを陽性として選択した。

１．７ 安定抗体産生体の選択
ＩｇＧ産生陽性の培養物由来の細胞を、４８ウェルプレートのウェルに移し、数日間（細胞の増殖特性に依存する）培養した。特異的な結合体を選択するために、ＰＤ−１Ｆｃに対するＥＬＩＳＡを予め抗原をコーティングせずに実施した。ＥＬＩＳＡ−陽性ウェルの細胞を、凍結用培地（９０％ＦＣＳ、１０％ＤＭＳＯ）中で凍結した。一部の細胞を、さらなる特徴づけのための細胞培養上清の調製のためにさらに培養した。

１．８ 限界希釈クローニング
陽性ウェルが特定されるとすぐに、ハイブリドーマ細胞を、非産生細胞の過増殖の危険を小さくするためにクローン化した（最初のクローニング）。抗体が本当にモノクローナルであることを確認するために、ハイブリドーマを再びクローン化した（第２のクローニング）。限界希釈法を両方のクローニング手順に用いた。ＩｇＧ産生細胞を、フィーダー細胞を１ウェルあたり１〜３細胞の密度で含む９６ウェルプレート１枚に分配した。８〜１０日（増殖特性に依存する）後に、全てのプレートを、単クローン増殖検出のために顕微鏡下で可視的に検査した。該ウェルからの培養上清を、上記のスクリーニングアッセイを用いて特異的な免疫グロブリン内容物をスクリーニングした。増殖特性およびＥＬＩＳＡシグナルに関して適当なクローンを選択し、２４ウェルプレートのウェルに移して数日間培養した。スクリーニングアッセイを行った。この手順を２回または３回繰返した。適当なサブクローンを第２のクローニング手順または低温保存用の培養のために別々に選択した。この手順の結果、３つの抗ＰＤ−１抗体が得られた：クローン２、クローン１０およびクローン１９。クローン２は、そのエピトープおよび結合の解離速度に関してのみ特徴付けた。

実施例２−クローン１０およびクローン１９抗体の特徴づけ
２．１ 抗体の特性を特徴づけるために用いた試薬
以下の直接標識抗体を用いた：ロバ抗マウスＩｇＧ Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲート（Molecular Probes）、抗ヒトＣＤ４ Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲート（Serotec Ltd）および抗ヒトＣＤ４ ＦＩＴＣコンジュゲート（Serotec Ltd）。ＯＸ７（ｍＩｇＧ_１培養上清；社内品）およびＭＯＰＣ２１（ｍＩｇＧ_１；Sigma-Aldrich Ltd）を、アイソタイプ対照として用いた。アイソタイプ特異的ＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ_１およびＩｇＧ_２ａ抗体（それぞれＳＴＡＲ８１ＰＥおよびＳＴＡＲ８２ＰＥ）をSerotec Ltdから入手し、他のネズミＩｇサブクラスとは＜１％の交差反応性を示した。ヨウ化プロピジウムおよびラビットＩｇＧはSigma Ltdから入手した。上記のように作製したクローン１９抗ＰＤ−１抗体を、キットを用い、製造元（Molecular Probes）の指示に従ってＡｌｅｘａ６４７にコンジュゲートした。細胞培養上清中のＩＬ−２レベルを、DuoSet Human IL-2 ELISA Kit（R&D Systems Ltd）を用いて定量した。

２．２ 抗体の調製およびアイソタイピング
ハイブリドーマ上清を調製し、アザイドを含まない滅菌ＰＢＳ中に希釈した。精製したモノクローナル抗体ストックを、IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit （Santa Cruz；ｓｃ−２４９５８）を用いてＰＢＳ中１μｇ／ｍｌでアイソタイピングした。クローン１９、クローン１０およびクローン２のアイソタイプは、ＩｇＧ_１κであった。

２．３ エピトープマッピング
ＰＤ−１のヒト細胞外領域とマウスＣＤ２８の膜貫通領域および細胞内領域とをコードする構築物を、BioSignal Packard LtdからのＧＦＰもコードするバイシストロニック性の哺乳動物発現ベクターｐＧＦＰ２−ｎ２中にクローニングした。１アミノ酸を改変した変異体構築物を、「ドラスチック」ミュータージェネシス・アプローチ（Davis et al. Proc Natl Acad Sci USA. 95, 5490-4 (1998)）を用いて調製した。Genejuiceトランスフェクション試薬（Novagen；６μｌ／ウェル)を用いて、プラスミド（２μｇ／ウェル）を６ウェルプレート中のＨＥＫ−２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。モックおよび非トランスフェクション対照を各実験に含めた。細胞を１８〜２４時間で回収し、ＰＢＳ−アザイド中１０μｇ／ｍｌの抗ＰＤ−１抗体またはアイソタイプ対照を用いて１時間４℃で染色した。細胞をＰＢＳ−アザイドにより洗浄し、１５００ｒｐｍで５分間ペレット化し、ＰＢＳ−アザイド中で、一次抗体をＡｌｅｘａ６４７コンジュゲート・ロバ抗マウスＩｇＧ（５μｇ／ｍｌ）を用いて３０分間４℃で標識した。細胞を上記のように洗浄し、２００μｌのＰＢＳ−アザイド中に再懸濁し、フローサイトメトリーで分析した。ヨウ化プロピジウム（５μｇ／ｍｌ）をすぐに添加し、死細胞を特定するために分析した。ＧＦＰ−陽性（トランスフェクトされた）可視細胞を分取し、抗ＰＤ−１抗体の結合性について分析した。変異体を、「ノックアウト」（抗ＰＤ−１抗体により結合される細胞のパーセンテージを減少させる）または「ノックダウン」（他のＰＤ−１抗体に比例して抗体染色の強度を下げる）と特定した。

トランスフェクションに続いて、フローサイトメトリーで分析した細胞は、ヨウ化プロピジウム排出により８５〜９０％生存であった。結合性分析の例を図１に示す。トランスフェクション効率は１５〜５０％（ＧＦＰ^＋）の範囲であった。アイソタイプ対照は全てのトランスフェクタントで陰性であった。Ａｌｅｘａ６４７も陽性（抗ＰＤ−１抗体結合性）であるＧＦＰ^＋細胞のパーセンテージ分析は、Ｌ１６ＲおよびＲ１１８Ｄ変異が、クローン１９の結合性を完全に失わせることを示す（図２）。Ｒ１１８Ｄ発現細胞はすべてクローン１０に結合し、これはＰＤ−１の機能的な発現を示すが、全変異体の中で最も低い強度を有し（図２）、これは低レベルの発現を示す。Ｖ１８Ｒは部分的にクローン１９の結合性を失わせる。クローン１０は、Ｎ４１ＫおよびＬ１０３Ｅ変異体を除く全ての変異体に結合するが、他のＰＤ−１抗体に対するこの抗体の結合強度は有意に低下した（図２）。かくして、この結合分析は、２つの別個のエピトープを明確にし、次いで各々少なくとも２個の残基で定義された：抗ＰＤ−１抗体クローン１０は、リガンド結合領域（Zhang et al. Immunity 20, 337-47 (2004)）と重なる膜遠位のエピトープに結合する；クローン１９は膜近傍のエピトープに結合する。結合を乱す残基を、図３においてネズミＰＤ−１結晶構造上にマップする。

実施例３−活性化細胞質ドメインを含むＰＤ−１二量体形によるクローン１０およびクローン１９誘導性シグナル伝達の分析
抗体のシグナル生成活性を直接比較するために、ＣＤ３ζの膜貫通領域に連結されたヒトＰＤ−１の細胞外（抗体−結合）領域とＣＤ２８の細胞質領域（ＩＬ−２分泌を含む「活性な」出力（readout）を持たせるために）とから成るＰＤ−１二量体形を作り出した（図４Ａ）。

３．１ Ｔ細胞ハイブリドーマにおける抗ＰＤ−１抗体誘導性活性化シグナル伝達を検出するためのＰＤ−１二量体形の構築

ｈＰＤ−１／ｍＣＤ３ζＷＴ／ｍＣＤ２８構築物を、一連の５工程で作製した。工程１では、ＢｇｌＩＩ制限部位およびラットリボソーム結合部位をコードし、続いて開始コドンおよびヒトＰＤ−１のシグナルペプチドコード配列の最初の２１塩基をコードするオリゴヌクレオチド１（左の矢印；配列５'−ＴＡＧＴＡＧＡＧＡＴＣＴＣＴＣＡＡＧＣＡＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＡＡＴＣＣＣＡＣＡＧＧＣＧＣＣＧＴＧＧ−３'、配列番号：３３）を、相補のオリゴヌクレオチド２（５'−ＴＣＡＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＣＣＡＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＴＴＧＣＴＡＧＡＴＧＧ−３'、配列番号：３４）と共に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ１）に用いた。オリゴヌクレオチド２は、ＢａｍＨ１部位を挿入するヒトＰＤ−１細胞外ドメイン（成熟ポリペプチドの１７０残基まで）の最後の９残基をコードし、続いてマウスＣＤ３ζ膜貫通ドメインのＮＨ_２末端をコードする２０塩基を含む。ＰＣＲ反応は標準的な条件下で行った。工程２では、オリゴヌクレオチド２を、マウスＣＤ３ζの膜貫通領域のＣＯＯＨ末端をコードし、続いてマウスＣＤ２８の細胞質ドメインのＮＨ_２末端をコードする最初の２１塩基を含む相補のオリゴヌクレオチド３（５'−ＡＴＣＡＣＡＧＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＡＡＴＡＧＴＡＧＡＡＧＧＡＡＴＡＧＡＣＴＣ−３'、配列番号：３５）と共に、ＰＣＲ反応（ＰＣＲ２）に用いた。工程３では、ＰＣＲ１反応産物およびＰＣＲ２反応産物を精製し、アニールし、伸張させ、次いでオリゴヌクレオチド１および相補のオリゴヌクレオチド３の存在下で増幅して、ＣＤ３ζの膜貫通領域と融合されたＰＤ−１の細胞外領域をコードするｃＤＮＡを作り出した。工程４では、オリゴヌクレオチド３を、ＣＤ２８の細胞質ドメインのＣＯＯＨ末端をコードし、続いて終止コドンおよびＸｈｏＩ制限部位をコードするオリゴヌクレオチド４（５'−ＣＴＣＧＡＧＣＴＡＣＴＡＧＧＧＧＣＧＧＴＡＣＧＣＴＧＣＡＡＡ−３'、配列番号：３６）と共に、ＰＣＲ反応（ＰＣＲ３）に用いた。工程５では、精製したＰＣＲ３産物と工程３の精製したＰＣＲ産物とをアニールさせ、アニールしたハイブリッドを伸張させ、次いでその伸張物をオリゴヌクレオチド１および４を用いて増幅することによって、ＰＣＲ３産物と工程３のＰＣＲ産物とを融合した。

ヒトＰＤ−１およびマウスＣＤ２８ｃＤＮＡは、Geneservices Ltd （Cambridge UK）から入手したＩＭＡＧＥクローンから元々構築されたｐＥＮＴＲｈＰＤ−１／ｍＣＤ２８をテンプレートとして用いて増幅した。マウスＣＤ３ζは、ＤＯ１１．１０マウスＴ細胞ハイブリドーマｃＤＮＡから増幅した。融合ＰＣＲ産物を、ｐＣＲ４（登録商標）−ＴＯＰＯ（登録商標）（Invitrogen）中にクローニングし、最終産物をジデオキシ法により配列決定した。この構築物を、ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩで切断し、レンチウイルスベクターｐＨＲ−ＳＩＮ−ＢＸ−ＩＲＥＳ−Ｅｍ中に挿入した。

３．２ ｈＰＤ−１／ｍＣＤ３ζＷＴ／ｍＣＤ２８キメラによる活性化シグナル伝達の検出
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｈＰＤ−１／ｍＣＤ３ζＷＴ／ｍＣＤ２８をコードするｐＨＲ−ＳＩＮ−ＢＸ−ＩＲＥＳ−Ｅｍでトランスフェクトし、その上清を、ＤＯ１１．１０Ｔ細胞ハイブリドーマを感染させるために用いた。感染したＤＯ１１．１０細胞を増殖させ、ＦＡＣＳによりマウスＰＤ−１およびＥＧＦＰ発現について選別し、次いで刺激アッセイ（stimulation assay）の出力としてのＩＬ−２放出を用いて抗ＰＤ−１抗体による作動性のシグナル伝達を試験した。ＩＬ−２分泌の結果は、両方の抗体がｈＰＤ−１／ｍＣＤ３ζＷＴ／ｍＣＤ２８キメラを介したシグナル伝達を誘導することができるが、膜に近接するＰＤ−１に結合するクローン１９が多量のＩＬ−２放出を誘導すること（代表的なデータは図４Ｂに示される）を示す。これは、抗体により形成される複合体のトポロジーがアゴニストにより誘導されるシグナル伝達の相対的なレベルを決定するものであるという概念を支持する。このデータは、作動性のシグナル伝達の度合いが抗体の選択により変化し得るということも示す。

実施例４−ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）におけるクローン１０およびクローン１９抗体による抑制性シグナル伝達の分析
抗体をトシル活性化ＤＹＮＡＬＢＥＡＤＳに抗ＣＤ３抗体と共に共有結合させることにより、ＴＣＲ誘導性活性化シグナル伝達を抑制するその能力について、抗体を試験した。次いで、前記ビーズを、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識したＰＢＬ培養物に加えた。増殖レベルは、フローサイトメトリー分析により決定された希釈ＣＦＳＥを含む細胞画分ごとに示された。

４．１ ＤＹＮＡＬＢＥＡＤＳへの抗体のローディングおよび定量
トシル活性化ＤＹＮＡＬＢＥＡＤＳ４．５μｍ（Ｍ４５０；Invitrogen）を、０．１Ｍの滅菌リン酸緩衝液（ｐＨ８）中で洗浄し、３×１０^７のビーズあたり２．５μｇ総量の抗体をロードし、３７℃で１８〜２４時間、反転混合し続けた。ウサギＩｇＧ（Sigma）を用いて、ビーズ−ローディング反応あたりの抗体の総量を揃えた。ビーズを少なくとも３０分間１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ中で室温にてブロッキングし、無血清ＲＰＭＩ中で３回洗浄した。幾つかの実験に関して、ビーズ結合抗体は、飽和量のアイソタイプ特異的ＰＥ標識ヤギ抗体を用いて二重試験で定量し、Quantibrite（商標）プレラベルド・クアンティフィケーション・キット(BD Biosciences Ltd.)を用いて比較した。ビーズ一重項の幾何平均蛍光ＰＥ強度（対照としての未標識ビーズの背景光を差し引いた）を用いて、標準曲線からビーズあたりにロードされた抗体の絶対量を算出した。そのような滴定の例は図５で示される。ロードしたビーズを４℃で保管した。ビーズローディングの間、添加した抗ＣＤ３抗体の量は、実験の際にほぼ同等レベルの抗ＣＤ３抗体を有するビーズの適合セットの効果を比較することができるように変更した。抗ＣＤ３ロードビーズにより与えられる刺激レベルは、低い（５日目のバルクのリンパ球の１５％増殖という結果を与える）、中程度−低い（３０％の増殖）、中程度−高い（６０％の増殖）および高い（８０％増殖）と定義した。

４．２ 増殖試験
新鮮なヘパリン添加血液をＰＢＳで１：１に希釈し、リンパ球は密度勾配分離（Ficoll Hypaque）により単離した。幾つかの実験では、アクセサリー細胞を３７℃で２時間のプラスチック吸着によってか、または特異抗体標識ＤＹＮＡＬＢＥＡＤＳ（対ＣＤ１４／１９／８／５６）を用いて除去した。細胞を、ＰＢＳおよびＲＰＭＩ中で洗浄し、無血清ＲＰＭＩ中に１ｍｌあたり１０^７細胞に再懸濁した。細胞を、室温暗所にて１０分間ＰＢＳ中の２５μＭのＣＦＳＥを用いて標識した。ＣＦＳＥは等量のＦＣＳを用いて室温で５分間不活性化した。細胞を、ＲＰＭＩを用いて３〜５回洗浄し、１０％ＦＣＳ＋ＰＳＧ＋２−ＭＥ（終濃度５×１０^−５Ｍ）を含むＲＰＭＩ中に１ｍｌあたり１０^６細胞で再懸濁した。抗体（ビーズ）、分裂促進剤または培地を、９６ウェル丸底プレートの適切なウェルに加え、１ウェルあたり１０^５細胞を分配し、３７℃で３〜５日間インキュベートした。増殖試験に関して、細胞は、４℃で１時間、直接的に標識する細胞表面抗体により染色した。細胞をＰＢＳ−アザイドを用いて洗浄し、１５００ｒｐｍ／５分でペレットにし、２００μｌのＰＢＳ−アザイドに再懸濁した。細胞を、FlowJo Flow Cytometry Analysis Softwareを用いるフローサイトメーターでＣＦＳＥおよび抗体標識化について分析した。

４．３ 抗体の効果
図６に記載の実験結果において、用いたトシル活性化ビーズは、最大２３７５ｎｇの抗ＰＤ−１クローン１０またはクローン１９抗体と、抗ＰＤ−１抗体が存在しない場合に〜２５％の増殖を誘導するのに十分な抗ＣＤ３抗体とを含む２．５μｇ総量の抗体と共にインキュベートした。増殖は、５日目にＣＦＳＥ希釈により測定した。実験１において、外観検査は、増殖の抑制が３つの抗体のすべてで見られること、クローン２および１９では最も高いレベルの抑制を与えることも示す。自動分析ソフトウェア（FlowJo）を用いて分析することができるデータに関してクローン１９による増殖抑制の量は８０％のオーダーである。実験２では、ＯＫＴ３のみが存在する場合でも増殖の程度は幾分か減少するが（〜１５％まで）、クローン２および１９は増殖を大きく抑制することは明らかであり；増殖を始める細胞は最大で増殖を１または２ラウンドしか受けない。クローン１０は実験２ではいずれの抑制効果も示さない。

クローン１０抗体をトシル活性化ＤＹＮＡＬＢＥＡＤＳに抗ＣＤ３抗体と共に共有結合させることにより、ＴＣＲ誘導性の活性化シグナル伝達を抑制するその能力について、クローン１０抗体をさらに試験した。次いで、ビーズをヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞の培養物に加え、増殖を^３Ｈ−チミジン取り込みにより測定した。

トシル活性化ＤＹＮＡＬＢＥＡＤＳ４．５μｍ（Ｍ４５０；Invitrogen）を０．１Ｍの滅菌リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で洗浄し、１×１０^７ビーズあたり２μｇの抗ヒトＣＤ３（クローンＯＫＴ３）を加え、３７℃で８時間、反転攪拌し続けた。次いで、ビーズを洗浄して、コンジュゲートしていない抗ＣＤ３を取り除いた。次いで、抗ＣＤ３コンジュゲートビーズの一部を、３μｇの抗ＰＤ−１抗体を用いて二次的にコートするか、または１×１０^７ビーズあたり対照を３７℃で１９時間、反転混合し続けた。ビーズを洗浄し、次いで０．２ＭのＴｒｉｓ／０．１％ＢＳＡ（ｐＨ８．５）中で３時間インキュベートして、フリーのトシル基を不活性化し、続いて洗浄してＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）中にビーズを再懸濁した。ビーズセットの相等の抗ＣＤ３および抗体のコーティングを、ビーズを蛍光色素標識アイソトープ特異抗体で染色することによってか、またはフローサイトメトリーによる分析によって確認した。

新鮮なヘパリン添加血液を、ＲＰＭＩを用いて１：１に希釈し、リンパ球を密度勾配分離（Ficoll Hypaque）により単離した。ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、ＭＡＣＳ（ＣＤ４^＋Ｔ細胞アイソレーションキット；Miltenyi Biotec）を用いた陰性選択によりＰＢＬ全体から精製した。１ウェルあたり１×１０^５のヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞を、９６ウェル丸底プレート中でコーティングしたビーズと一緒に１：１の比率で培養し、３７℃で６日間インキュベートした。増殖は、６日目に培養の最後の６時間に１ウェルあたり０．５μＣｉの^３Ｈ−チミジンを添加して測定した。細胞をガラス繊維ろ紙上に収集し、取り込まれた^３Ｈ−チミジンをβ−シンチレーション計数により測定した。

図１３の結果は、抗ＣＤ３に加えてクローン１０抗体または対照コートビーズの存在下で測定されたヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞による６日の増殖反応を示す。データは、最大応答（抗ＣＤ３に加えてＢＳＡ対照）のパーセンテージとして表し、４つの異なるドナーの応答の平均値である。ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖は、クローン１０の存在下で抑制され、結果的に、観察された平均増殖は最大値のわずか３７．７％であった。

クローン１９は、クローン１０よりもｈＰＤ−１／ｍＣＤ３ζＷＴ／ｍＣＤ２８によるより強力なシグナル伝達を誘導するが（図４Ｂ）、幾つかの実施形態においてクローン１９は天然のＰＤ−１によるより弱い抑制性のシグナル伝達を与える（例えば、図８を参照のこと）。これは、幾つかの実験において、クローン１０ライゲーションではなくクローン１９が、結果的にＰＤ−１のＩＴＩＭ（抑制性、青）とＩＴＳＭ（活性化、赤）チロシン−ベースのシグナル伝達モチーフ双方のリン酸化となるためである可能性がある（図９を参照のこと）。

実施例５−単量体の受容体によるシグナル伝達を増強させるための重ならないエピトープでの２つの抗体の使用。
単独で作用する別個の抗ＰＤ−１抗体、例えばクローン１０は既に抑制性であるが、抗ＰＤ−１抗体のペアを用いることによってこれらの効果を有意に増強することが可能であり得よう。抗体のシグナル伝達特性の初期の特徴づけは、ＰＤ−１がホモ二量体を形成するｈＰＤ−１／ｍＣＤ３ζＷＴ／ｍＣＤ２８キメラの形態で発現されるアッセイに依存した。これは、抗ＣＤ２８超作動性抗体との比較を容易にするために行った。それはＣＤ２８もまたホモ二量体であるからである。生じる疑問としては、「ｈＰＤ−１／ｍＣＤ３ζＷＴ／ｍＣＤ２８キメラによるシグナル伝達がその二価性に、および架橋化の結果にどの程度依存するか？」がある。これを試験するために、ＣＤ２８の細胞質領域（ＩＬ−２分泌を含む「活性な」出力を持たせるために）に連結されたヒトＰＤ−１の細胞外領域（抗体−結合）と膜貫通領域とからなる単量体で一価型のＰＤ−１であるｈＰＤ−１／ｍＣＤ２８を作り出した（図１０Ａ）。

５．１ Ｔ細胞ハイブリドーマにおける抗ＰＤ−１抗体誘導性の活性化シグナル伝達を検出するためのＰＤ−１の単量体型の構築

ｈＰＤ−１／ｍＣＤ２８構築物を、一連の３工程で作り出した。工程１において、ＢｇｌＩＩ制限部位およびラットリボソーム結合部位をコードし、続いて開始コドンおよびヒトＰＤ−１のシグナルペプチドコード配列の最初の２４塩基をコードオリゴヌクレオチド１（左の矢印；配列５'−ＴＡＧＴＡＧＡＧＡＴＣＴＣＴＣＡＡＧＣＡＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＡＡＴＣＣＣＡＣＡＧＧＣＧＣＣＧＴＧＧ−３'、配列番号：３３）を、相補のオリゴヌクレオチド２（５'−ＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＧＴＴＣＣＡＡＡＣＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴ−３'、配列番号：３７）と共に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ１）に用いた。オリゴヌクレオチド２は、ヒトＰＤ−１細胞外ドメイン（成熟ポリペプチドの１４９残基まで）の最後の２３塩基をコードし、続いてマウスＣＤ２８膜貫通領域のＮＨ_２末端配列をコードする２４塩基を含む。ＰＣＲ反応は標準的な条件下で実施した。工程２では、オリゴヌクレオチド２を、マウスＣＤ２８の細胞質ドメインのＣＯＯＨ末端をコードし、ＭｌｕＩ制限部位、続いて停止コドンおよびＸｈｏＩ制限部位をコードする相補のオリゴヌクレオチド３（５'-ＴＴＴＧＣＡＧＣＧＴＡＣＣＧＣＣＣＣＡＣＧＣＧＴＴＡＧＴＡＧＣＴＣＧＡＧ−３'、配列番号：３８）と共に、ＰＣＲ反応（ＰＣＲ２）に用いた。工程３では、精製したＰＣＲ２産物を工程１由来の精製したＰＣＲ１産物とアニールさせ、アニールしたハイブリッドを伸張させ、次いでそれをオリゴヌクレオチド１および３を用いて増幅することによって、ＰＣＲ２産物とＰＣＲ１産物とを融合させた。

マウスＣＤ２８配列は、ＤＯ１１．１０マウスＴ細胞ハイブリドーマｃＤＮＡから元々増幅されたｐＣＲ４（登録商標）−ＴＯＰＯ（登録商標）ｒＣＤ２８／ｍＣＤ２８をテンプレートとして用いて増幅した。ヒト細胞外ＰＤ−１は、MRC Human Immunology Unit, OxfordのChao Yu博士から譲り受けたpE14hPD-1Longから増幅した。融合ＰＣＲ産物を、ｐＣＲ４（登録商標）−ＴＯＰＯ（登録商標）（Invitrogen）中にクローニングし、最終産物をジデオキシ法により配列決定した。構築物をＢｇｌＩＩとＸｈｏＩで切断し、ＤＯ１１．１０細胞感染のためにレンチウイルスベクターｐＨＲ−ＳＩＮ−ＢＸ−ＩＲＥＳ−Ｅｍ中に挿入した。抗ＰＤ−１抗体によるｈＰＤ−１／ｍＣＤ２８キメラ発現ＤＯ１１．１０細胞の活性化は、出力としてのＩＬ−２分泌を用いて試験した。

５．２ ｈＰＤ−１／ｍＣＤ２８によるシグナル伝達の欠如は、作動性のシグナル伝達が、単量体受容体を重ならないエピトープに結合する２つの抗体で架橋することによって、増強され得ることを示す。
クローン１０およびクローン１９が、ＣＤ２８の膜貫通と細胞内シグナル伝達ドメインに連結されたＰＤ−１の単量体細胞外領域とからなるヒトＰＤ−１のキメラ型、すなわちｈＰＤ−１／ｍＣＤ２８に対して作動性ではなかったのは（図１０）、その同等物のＣＤ２８構築物（ラットＣＤ２８のホモ二量体の細胞外ドメインからなる）とは対照的である。これに関する最も有力な説明としては、ＰＤ−１は単量体であるがＣＤ２８がホモ二量体であるため、二価抗体の結合は「架橋された」ＣＤ２８分子の多量体配置の集合体であって非常に高密度のシグナル伝達ドメインを導くことになるが（図１１Ａ）、クローン１０またはクローン１９の結合は、ＰＤ−１分子のペアを結びつけるだけである（図１１Ｂ）、ということになる。従って、インビボではホモ二量体の受容体に結合する抗体は、単量体の受容体に結合する抗体よりも一般に強力なシグナル伝達を生成する。ＰＤ−１の場合に、ＰＤ−１分子の多量体集合体を作り出すことができれば、より強力なシグナル伝達を導くことが推定され得る（図１１Ｃ）。クローン１０（またはクローン２）のエピトープおよびクローン１９のエピトープがＰＤ−１の反対「側」にあるという位置関係（図３）は、この２つの抗体が重ならない表面に結合し得ること、すなわち各々の天然のＰＤ−１単量体が双方の抗体に結合でき得ることを意味している。これは、図１１Ｃで示されるように、この抗体のペアがインビボで天然のＰＤ−１単量体を「架橋」するために用い得ることを意味する。かくして作り出された隔てられたＰＤ−１分子の高密度配置化は、単一の抗体を用いた場合に可能であろうシグナル伝達よりもより強力なシグナル伝達を作り出せることが期待される。

５．３ 作動性シグナル伝達は、重ならないエピトープに結合する２つの抗体を用い、単量体の受容体を架橋することによって増強される。
抗体ペアを用いて天然のＰＤ−１単量体を「架橋」し、増強された作動性のシグナル伝達を誘導することができるという概念を試験するために、ｈＰＤ−１／ｍＣＤ２８キメラタンパク質を発現するＤＯ１１．１０細胞を、以下のクローン１０／クローン１９抗体刺激アッセイに用いた。９６ウェル平底プレート（Costar EIA/RIAプレート）を、コーティング緩衝液（１５ｍＭ Ｎａ_２ＣＯ_３、３５ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、ｐＨ９．６）中の５００μｇ／ｍｌのロバ抗マウスＩｇＧ（Jackson Immunoresearch）を用いて４℃で一晩コートした。細胞を加える前に、プレートを３回２００μｌの冷ＰＢＳで洗浄した。５×１０^３細胞を１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、クローン１９抗体を様々な濃度で含有する完全培地１００μｌ中に３０分間再懸濁した。次いで、細胞を洗浄し、様々な濃度のクローン１０と共にさらに３０分間インキュベートした後に、細胞をロバ抗マウスＩｇＧ抗体で予めコートした９６ウェルプレートに３重試験で撒いた。細胞を、３７℃で５％ＣＯ_２下にて４８時間インキュベートした後、細胞培養上清を取り出し、ＥＬＩＳＡによるマウス・インターロイキン−２（ＩＬ−２）に関してアッセイした。

この実験結果（図７）は、最も高い濃度、すなわち１００μｇ／ｍｌではクローン１０もクローン１９もｈＰＤ−１／ｍＣＤ２８キメラタンパク質発現ＤＯ１１．１０細胞においてシグナル伝達（ＩＬ−２産生）を開始しないことを示す。しかしながら、１０〜１００μｇ／ｍｌの抗体の一連のインキュベーションは、有意水準のＩＬ−２生成を誘導した。これは、抗体による架橋ペアが、インビボでの増強されたシグナル伝達を誘導するために用い得ることを示す。

クローン２、１０および１９抗体の配列情報
（ＣＤＲはアミノ酸配列中、下線で示す）
クローン２
ＶＫ ＤＮＡ（配列番号：１）
gacattgtgctgacacagtctcctgcttctttagctgtatctctggggcagagggccaccatctcatgcagggccagcaaaagtgtcagtacatctggctttaattatatacactggtaccaacagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctatcttgcatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggacgaggatgctgcaacctattactgtcagcacagtagggagcttccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggaaataaaa

ＶＫタンパク質（配列番号：２）
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSGFNYIHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEDEDAATYYCQHSRELPLTFGAGTKLEIK

ＶＨ ＤＮＡ（元のクローン化）（配列番号：３）
caggtccaactgcagcagcctggggctgaactggtgaagcctggggcttcagtgaagttgtcctgcaaggcttctggctacaccttcaccacctactatttgtactgggtgaggcagaggcctggacaaggccttgagtggattggggggattaatcctagcaatggtggtactaacttcaatgagaagttcaagagcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcaactcaacagcctgacatctgaggactctgcggtctattactgtacaagacgggactataggtacgacagaggctttgactactggggccaaggcacctcagtcacagtc

ＶＨ ＤＮＡ（スプライス部位を除去した変異型）（配列番号：５）
caggtccaactgcagcagcctggggctgaactggtgaagcctggggcttcagtgaagttgtcctgcaaggcttctggctacaccttcaccacctactatttgtactgggtgaggcagaggcctggacaaggccttgagtggattggggggattaatcctagcaatggtggtactaacttcaatgagaagttcaagagcaaggccacactgactgtagacaaatcctcctctacagcctacatgcaactcaacagcctgacatctgaggactctgcggtctattactgtacaagacgggactataggtacgacagaggctttgactactggggccaaggcacctcagtcacagtc

ＶＨタンパク質（配列番号：４または配列番号：６）
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTTYYLYWVRQRPGQGLEWIGGINPSNGGTNFNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCTRRDYRYDRGFDYWGQGTSVTV

クローン１０
ＶＫ ＤＮＡ（配列番号：７）
gatgttttgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctggtcagaacattgtacatagtaatggaaacacctatttagaatggtacctacagaaaccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtctccaaccgattttttggggtcccagacaggatcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctttcaaggttcacatgttccattcacgttcggctcggggacaaagctggaaataaaa

ＶＫタンパク質（配列番号：８）
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSGQNIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFFGVPDRISGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK

ＶＨ ＤＮＡ（配列番号：９）
gatgtgcagcttcaggagtcgggacctggcctggtgaaaccttctcagtctctgtccctcacctgcactgtcactggctactcaatcaccagtgattatgcctggaactggatccggcagtttccaggaaacaaactggagtggatgggctacataaactacagtggtagcactagctacaacccatctctcaaaagtcgaatctctatcactcgagacacatccaagaaccagttcttcctgcagttgaattctgtgactactgaggacacagccacatattactgtgcaagatggatcggtagtagcgcctggtacttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcacagtc

ＶＨタンパク質（配列番号：１０）
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYINYSGSTSYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARWIGSSAWYFDVWGAGTTVTV

クローン１９
ＶＫ ＤＮＡ（配列番号：１１）
gaaaatgtgctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggaaaaggtcaccatgacctgcagggccagctcaagtgtaatttccagttacttgcactggtaccagcagaagtcaggtgcctcccccaaactctggatttatagcacttccaacttggcttctggagtccctgatcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagtgtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtacaatggttacccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggaaataaaa

ＶＫタンパク質（配列番号：１２）
ENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVISSYLHWYQQKSGASPKLWIYSTSNLASGVPDRFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDAATYYCQQYNGYPLTFGAGTKLEIK

ＶＨ ＤＮＡ（配列番号：１３）
caggttcagctacagcagtctggggctgagctggtgaagcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttttggctacaccttcactacctatccaatagagtggatgaagcagaatcatgggaagagcctagagtggattggaaattttcatccttacaatgatgatactaagtacaatgaaaaattcaagggcaaggccaaattgactgtagaaaaatcctctaccacagtctacttggagctcagccgattaacatctgacgactctgctgtttattactgtgcaagggagaactacggtagtcacgggggttttgtttactggggccaagggactctggtcaccgtc

ＶＨタンパク質（配列番号：１４）
QVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKAFGYTFTTYPIEWMKQNHGKSLEWIGNFHPYNDDTKYNEKFKGKAKLTVEKSSTTVYLELSRLTSDDSAVYYCARENYGSHGGFVYWGQGTLVTV

前掲の表１および配列中、クローン２、１０および１９に関する重鎖ＣＤＲ１は、組み合せたカバット（Kabat）／コチア（Chothia）ナンバリングシステムおよびカバット・ナンバリングシステムに従って特定した。他のＣＤＲは全て、カバット・ナンバリングシステム（Kabat et al., 1987, “In sequences of proteins of immunological interest”, U.S. Dept. Health and Human Services, NIH USA）に従って特定した。カバット・ナンバリングシステムにより特定されたクローン２、１０および１９の重鎖ＣＤＲ１を、表１にて特定した（下線を付したアミノ酸）。

Claims (56)

1. ハイブリドーマ・クローン１０またはハイブリドーマ・クローン２により産生された、モノクローナル抗体。
2. ハイブリドーマ・クローン１０またはハイブリドーマ・クローン２により産生されるモノクローナル抗体と同じエピトープに結合する、モノクローナル抗体。
3. ハイブリドーマ・クローン１０またはハイブリドーマ・クローン２により産生される抗体と同じエピトープに結合する二重特異性抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体または組換え抗体。
4. クローン１０またはクローン２により産生されるモノクローナル抗体と同じエピトープに結合する抗原結合性フラグメント。
5. ０．０４秒^−１〜２．０秒^−１の解離定数を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
6. ＰＤ−１との結合に際して、配列番号：２および配列番号：４；または配列番号：８および配列番号：１０を含む抗体と競合する、単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
7. 配列番号：２および配列番号：４；または配列番号：８および配列番号：１０を含む抗体と同じＰＤ−１エピトープに結合する、請求項６に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
8. 請求項３に記載の抗体であって、配列番号：１５、１６、１７、１９、２０およびｉ）配列番号：１８；またはｉｉ）配列番号：１８のアミノ酸６〜１０のクローン２のＶｋおよびＶＨ ＣＤＲ、あるいは配列番号：２１、２２、２３、２５、２６およびｉ）配列番号：２４；または配列番号：２４のアミノ酸６〜１１のクローン１０のＣＤＲを含む、前記抗体。
9. 配列番号：２および配列番号：４；または配列番号：８および配列番号：１０を含む、単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
10. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体を含む、医薬組成物。
11. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体をコードする、１つ以上の単離された核酸。
12. 請求項１１に記載の単離された核酸であって、抗体が、配列番号：１および配列番号：３；配列番号：１および配列番号：５；または配列番号：７および配列番号：９によりコードされる、前記核酸。
13. 請求項１１〜１２に記載の１つ以上の核酸を含む、ベクター。
14. 請求項１３に記載のベクターまたは請求項１１〜１２に記載の核酸を含む、宿主細胞。
15. クローン１０の結合特異性を有する抗体を、ＰＤ−１またはＰＤ−１発現細胞と接触させることを含む、ＰＤ−１またはＰＤ−１発現細胞を単離する方法。
16. クローン１０により産生される抗体の結合特異性を有する抗ＰＤ−１特異抗体と組み合わせて、特異抗原を対象に投与することを含む、特異抗原に対する寛容を誘導する方法。
17. ハイブリドーマ・クローン１０により産生される抗体の結合特異性を有する抗ＰＤ−１特異抗体の対象への投与を含む、対象における活性化リンパ球により調整される免疫応答を低減する方法。
18. アレルギー、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、炎症性腸疾患、クローン病、全身性エリテマトーデス、組織、皮膚および器官の移植片拒絶反応または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を処置する方法であって、クローン１０により産生される抗体の結合特異性を有する抗ＰＤ−１特異抗体を、前記疾患を有する対象に投与することを含む、前記処置方法。
19. 付加的なＰＤ−１特異モノクローナル抗体をＰＤ−１またはＰＤ−１発現細胞と接触させることを含む、請求項１５に記載の方法。
20. 付加的なＰＤ−１特異モノクローナル抗体を投与することを含む、請求項１６〜１８に記載の方法。
21. 付加的なＰＤ−１特異モノクローナル抗体が、クローン１０により産生される抗体により結合されるエピトープと別個の重ならないエピトープに結合する、請求項１９または２０に記載の方法。
22. 付加的なＰＤ−１特異モノクローナル抗体が、クローン１９により産生される抗体と同じエピトープに結合する、請求項２１に記載の方法。
23. 抗体が、クローン１９により産生された抗体である、請求項２２に記載の方法。
24. 付加的なＰＤ−１特異モノクローナル抗体が、クローン２により産生される抗体と同じエピトープに結合する、請求項１９または請求項２０に記載の方法。
25. 抗体が、クローン２により産生された抗体である、請求項２４に記載の方法。
26. 抗体が、０．０４秒^−１と２．００秒^−１との間の解離定数を有する、請求項１５〜１９に記載の方法。
27. 配列番号：２、配列番号：４、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１８のアミノ酸６〜１０、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２４のアミノ酸６〜１１、配列番号：２５または配列番号：２６を含む、単離されたポリペプチド。
28. 請求項２７に記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸。
29. 請求項２７に記載のポリペプチドをコードするベクターまたは核酸を含む、単離された宿主細胞。
30. 請求項２７に記載のポリペプチドをコードする核酸を含む、ベクター。
31. クローン２の結合特異性を有する抗体を、ＰＤ−１またはＰＤ−１発現細胞と接触させる工程および前記細胞を単離する工程を含む、ＰＤ−１またはＰＤ−１発現細胞を単離する方法。
32. クローン２により産生される抗体の結合特性を有する抗ＰＤ−１特異抗体と組み合わせて、特異抗原を対象に投与することを含む、特異抗原に対する寛容を誘導する方法。
33. ハイブリドーマ・クローン２により産生される抗体の結合特異性を有する抗ＰＤ−１特異抗体の対象への投与を含む、対象における活性化リンパ球により調整される免疫応答を低減する方法。
34. アレルギー、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、炎症性腸疾患、クローン病、全身性エリテマトーデス、組織、皮膚および器官の移植片拒絶反応または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を処置する方法であって、クローン２により産生される抗体の結合特異性を有する抗ＰＤ−１特異抗体を、前記疾患を有する対象に投与することを含む、前記処置方法。
35. 付加的なＰＤ−１特異モノクローナル抗体をＰＤ−１またはＰＤ−１発現細胞と接触させることを含む、請求項３１に記載の方法。
36. 付加的なＰＤ−１特異モノクローナル抗体を投与することを含む、請求項３２〜３４に記載の方法。
37. 付加的なＰＤ−１特異モノクローナル抗体が、クローン２により産生される抗体により結合されるエピトープと別個の重ならないエピトープに結合する、請求項３５または請求項３６に記載の方法。
38. 付加的なＰＤ−１特異モノクローナル抗体が、クローン１９により産生される抗体と同じエピトープに結合する、請求項３７に記載の方法。
39. 抗体が、クローン１９により産生された抗体である、請求項３８に記載の方法。
40. 付加的なＰＤ−１特異モノクローナル抗体が、クローン１０により産生される抗体と同じエピトープに結合する、請求項３５または請求項３６に記載の方法。
41. 抗体が、クローン１０により産生された抗体である、請求項４０に記載の方法。
42. 抗体が、０．０４秒^−１と２．００秒^−１との間の解離定数を有する、請求項３１〜３４に記載の方法。
43. ａ）配列番号：１８、配列番号：１８のアミノ酸６〜１０、配列番号：１９または配列番号：２０から選択される１つ以上の重鎖ＣＤＲ配列；あるいは
    ｂ）配列番号：２４、配列番号：２４のアミノ酸６〜１１、配列番号：２５または配列番号：２６から選択された１つ以上の重鎖ＣＤＲ配列を含む、単離されたポリペプチド。
44. ａ）配列番号：１５、配列番号：１６または配列番号：１７から選択された１つ以上の軽鎖ＣＤＲ配列；あるいは
    ｂ）配列番号：２１、配列番号：２２または配列番号：２３から選択された１つ以上の軽鎖ＣＤＲ配列を含む、単離されたポリペプチド。
45. 請求項４３に記載の単離されたポリペプチドであって、
    ａ）重鎖ＣＤＲ１および配列番号：１９；重鎖ＣＤＲ１および配列番号：２０；配列番号：１９および配列番号：２０；または重鎖ＣＤＲ１、配列番号：１９および配列番号：２０であって、重鎖ＣＤＲ１は、配列番号：１８のアミノ酸６〜１０または配列番号：１８から選択される；あるいは
    ｂ）重鎖ＣＤＲ１および配列番号：２５；重鎖ＣＤＲ１および配列番号：２６；配列番号：２５および配列番号：２６；または重鎖ＣＤＲ１、配列番号：２５および配列番号：２６であって、重鎖ＣＤＲ１は、配列番号：２４のアミノ酸６〜１１または配列番号：２４から選択される、前記ポリペプチド。
46. ２つまたは３つすべての軽鎖ＣＤＲ配列を含む、請求項４４に記載の単離されたポリペプチド。
47. ａ）配列番号：１８、配列番号：１８のアミノ酸６〜１０、配列番号：１９または配列番号：２０から選択される１つ以上の重鎖ＣＤＲ配列；あるいは
    ｂ）配列番号：２４、配列番号：２４のアミノ酸６〜１１、配列番号：２５または配列番号：２６から選択される１つ以上の重鎖ＣＤＲ配列から選択される、１つ以上の重鎖ＣＤＲ配列を含む、単離された抗体。
48. ａ）配列番号：１５、配列番号：１６または配列番号：１７から選択される１つ以上の軽鎖ＣＤＲ配列；あるいは
    ｂ）配列番号：２１、配列番号：２２または配列番号：２３から選択される１つ以上の軽鎖ＣＤＲ配列から選択される１つ以上の軽鎖ＣＤＲ配列を含む、単離された抗体。
49. 請求項４７に記載の単離された抗体であって、
    ａ）重鎖ＣＤＲ１および配列番号：１９；重鎖ＣＤＲ１および配列番号：２０；配列番号：１９および配列番号：２０；または重鎖ＣＤＲ１、配列番号：１９および配列番号：２０であって、重鎖ＣＤＲ１が配列番号：１８のアミノ酸６〜１０または配列番号：１８から選択される；あるいは
    ｂ）重鎖ＣＤＲ１および配列番号：２５；重鎖ＣＤＲ１および配列番号：２６；配列番号：２５および配列番号：２６；または重鎖ＣＤＲ１、配列番号：２５および配列番号：２６であって、重鎖ＣＤＲ１が配列番号：２４のアミノ酸６〜１１または配列番号：２４から選択される、ＰＤ−１に結合する抗体を含む、前記抗体。
50. 請求項４８に記載の単離された抗体であって、２つまたは３つすべての軽鎖ＣＤＲ配列を含み、ＰＤ−１に結合する抗体である、請求項４８に記載の単離された抗体。
51. 請求項４３〜４６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸。
52. 請求項４７〜５０のいずれか一項に記載の抗体をコードする、単離された核酸。
53. 請求項５１に記載の核酸を含む、ベクター。
54. 請求項５２に記載の核酸を含む、ベクター。
55. 請求項５３に記載のベクターを含む、宿主細胞。
56. 請求項５４に記載のベクターを含む、宿主細胞。

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