JP2012501670A - Pd−1特異抗体およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2008年9月12日に出願された米国仮出願第61/096,485号の利益を主張し、その開示内容は図、表およびアミノ酸または核酸配列の全てを含む全体を引用により本明細書の一部とする。
本開示内容の1つの態様は、PD−1のアゴニストとして作用し、それによってPD−1により調節される免疫応答を調整し得る抗体を提供する。1つの実施形態において、抗PD−1抗体は新規な抗原結合性フラグメントであってよい。本明細書で開示される抗PD−1抗体は、ヒトPD−1に結合することができ、PD−1の活性を刺激し、それによってPD−1を発現する免疫細胞の機能を抑制することができる。本開示内容において使用する例示的な抗体は、限定するものではないが、クローン10により産生されるモノクローナル抗体が挙げられる。
本明細書で用いられる用語「抗体」は、免疫グロブリンまたはそのフラグメントもしくは誘導体を表し、インビトロまたはインビボ(生体内)で産生されたかどうかに関わらず、抗原結合部位を含むいずれかのポリペプチドを包含する。従って、抗体には、限定するものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、変異導入抗体およびグラフト化抗体(gragted antidobies)が含まれる。
クローン 2: 08090903;
クローン10: 08090902;および
クローン19: 08090901。
実施例1−抗PD−1抗体を作出する方法
1.1 ミエローマ細胞系
融合に関しては、German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ GmbH, Braunschweig)からのミエローマ細胞系SP2/0−Ag14を用いた。この細胞系は、BALB/c脾臓細胞とミエローマ細胞系P3x63Ag8とのハイブリッドである。この細胞は、免疫グロブリン鎖を合成も分泌もせず、20μg/mlの8−アザグアニンに耐性であり、HAT(ヒポキサチン、アミノプテリン、チミジン)培地中で生育しないと記載されている。SP2/0細胞は、組織培養フラスコ中の標準的な増殖培地(10%のFCSを含む)にて慣用的に維持される。HGPRT陽性の復帰突然変異の実行を避けるために、凍結SP2/0細胞の新たな一部を2週間後に用いた。ミエローマ細胞は、全てのマイコプラズマ試験で陰性であることが示された。
組換えタンパク質PD−1Fcを、CD28Fcの調製に関して記載された方法(Evans et al. Nat Immunol. 6, 271-9 (2005))を用いて作製し、0.01M HEPES、150mM NaCl、pH7.4中、5.1mg/mlに濃縮した。還元および非環元条件下で実施される抗原のSDS−PAGE分析により、タンパク質の純度が>95%であることを確かめた。
5匹のマウス(約8週齢)を、60日に亘る免疫プロトコルを用い、腹膜腔内を介して免疫した。免疫に関し、免疫原のミョウバン沈殿物を調製した。ミョウバン沈殿物を各ブーストのために新たに調製した。マウスを50μgのタンパク質で免疫し、25μgのタンパク質でブーストした。融合体には3匹のマウスを用いた。
細胞は、層流空気流システム、滅菌材料および滅菌溶液を用いた滅菌条件下で取り扱った。細胞は、5%二酸化炭素を含む湿潤雰囲気下37℃でインキュベートした。ハイブリドーマ細胞の培養では、DMEMを含み、2−メルカプトエタノール、L−グルタミン、グルタマックス(GlutaMax)、HT、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、抗生物質/抗真菌溶液(供給業者が推奨する濃度)、および種々の濃度のFCS(10%、15%または20%)を含有する完全培養基(CGM)を用いた。
3匹の免疫マウスをCO2下で窒息させた後に、脾臓を防腐処理して取り出した。プールした脾臓の単一細胞懸濁液を調製した。脾臓細胞およびミエローマ細胞を、DMEMで複数回洗浄し、1mlの50%(w/v)PEG3550の存在下で融合させて二倍にした(脾臓細胞対SP2/0 2.5:1および2.4:1)。作製したハイブリドーマを、20%FCSおよびアミノプテリンを含有するCGM(HAT培地)に懸濁した。各融合体の細胞懸濁液(140Cl/ウェル)を、20%FCSを含むCGM中で1ウェルあたり140Clの腹膜浸出細胞をフィーダー細胞として含む96ウェル組織培養平底プレート(Corning-Costar)8枚に撒いた。前記プレートを10日間インキュベートした。この期間中に、細胞に2回HAT培地を供給した。脾臓細胞調製物の一部(約8×106脾臓細胞)を、24ウェルプレートのウェル中で10日間培養し、細胞培養上清をELISAの陽性対照として供した。
細胞培養上清中のIgGスクリーニングのために、ELISAを用いた。0.5M 炭酸/重炭酸緩衝液、pH9.6中のPD−1Fc抗原(5μg/ml)を1ウェルあたり50μlを用いて、96ウェル平底ポリスチレンマイクロタイタープレート(Greiner, Cat. No 655061)をコートした。4℃の湿室で一晩インキュベートした後、プレートを0.01%トライトン(Triton)X−100を含むトリス緩衝食塩水(TBS、50mM Tris、pH7.8、500mM 塩化ナトリウム)(洗浄緩衝液)を用いて洗浄し、TBS中の2%FCSを1ウェルあたり200μl用いて室温(RT)にて1時間、攪拌器上でブロッキングした。ウェルを洗浄緩衝液にて洗浄し、100μlの細胞培養上清を適当なウェルに加えた。SP2/0ミエローマ細胞からの細胞培養上清を陰性対照として用いた。陽性対照として、脾臓細胞培養からの細胞培養上清を用いた。プレートを、攪拌器上で1時間RTにてインキュベートし、続いて複数回洗浄した。結合抗体の検出のために、ブロッキング緩衝液中のアルカリホスファターゼがコンジュゲートされたヤギ抗マウスIgG(Fab特異的)(1:5000)を1ウェルあたり50μl用いて、1時間RTにて攪拌器上で、プレートをインキュベートし、続いて複数回洗浄し、そして1ウェルあたり150μlの基質緩衝液(5%ジエタノールアミン+0.5M MgCl2中の2mM 4−ニトロフェニルリン酸、pH9.8)を添加した。光学密度(OD)を、12チャネルのDynex Opsys MRマイクロプレートリーダーにて405nmで評価した。OD405nmの平均プレート値よりも2倍以上高いOD405nmを有するウェルを陽性として選択した。
IgG産生陽性の培養物由来の細胞を、48ウェルプレートのウェルに移し、数日間(細胞の増殖特性に依存する)培養した。特異的な結合体を選択するために、PD−1Fcに対するELISAを予め抗原をコーティングせずに実施した。ELISA−陽性ウェルの細胞を、凍結用培地(90%FCS、10%DMSO)中で凍結した。一部の細胞を、さらなる特徴づけのための細胞培養上清の調製のためにさらに培養した。
陽性ウェルが特定されるとすぐに、ハイブリドーマ細胞を、非産生細胞の過増殖の危険を小さくするためにクローン化した(最初のクローニング)。抗体が本当にモノクローナルであることを確認するために、ハイブリドーマを再びクローン化した(第2のクローニング)。限界希釈法を両方のクローニング手順に用いた。IgG産生細胞を、フィーダー細胞を1ウェルあたり1〜3細胞の密度で含む96ウェルプレート1枚に分配した。8〜10日(増殖特性に依存する)後に、全てのプレートを、単クローン増殖検出のために顕微鏡下で可視的に検査した。該ウェルからの培養上清を、上記のスクリーニングアッセイを用いて特異的な免疫グロブリン内容物をスクリーニングした。増殖特性およびELISAシグナルに関して適当なクローンを選択し、24ウェルプレートのウェルに移して数日間培養した。スクリーニングアッセイを行った。この手順を2回または3回繰返した。適当なサブクローンを第2のクローニング手順または低温保存用の培養のために別々に選択した。この手順の結果、3つの抗PD−1抗体が得られた:クローン2、クローン10およびクローン19。クローン2は、そのエピトープおよび結合の解離速度に関してのみ特徴付けた。
2.1 抗体の特性を特徴づけるために用いた試薬
以下の直接標識抗体を用いた:ロバ抗マウスIgG Alexa647コンジュゲート(Molecular Probes)、抗ヒトCD4 Alexa647コンジュゲート(Serotec Ltd)および抗ヒトCD4 FITCコンジュゲート(Serotec Ltd)。OX7(mIgG1培養上清;社内品)およびMOPC21(mIgG1;Sigma-Aldrich Ltd)を、アイソタイプ対照として用いた。アイソタイプ特異的PE標識ヤギ抗マウスIgG1およびIgG2a抗体(それぞれSTAR81PEおよびSTAR82PE)をSerotec Ltdから入手し、他のネズミIgサブクラスとは<1%の交差反応性を示した。ヨウ化プロピジウムおよびラビットIgGはSigma Ltdから入手した。上記のように作製したクローン19抗PD−1抗体を、キットを用い、製造元(Molecular Probes)の指示に従ってAlexa647にコンジュゲートした。細胞培養上清中のIL−2レベルを、DuoSet Human IL-2 ELISA Kit(R&D Systems Ltd)を用いて定量した。
ハイブリドーマ上清を調製し、アザイドを含まない滅菌PBS中に希釈した。精製したモノクローナル抗体ストックを、IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (Santa Cruz;sc−24958)を用いてPBS中1μg/mlでアイソタイピングした。クローン19、クローン10およびクローン2のアイソタイプは、IgG1κであった。
PD−1のヒト細胞外領域とマウスCD28の膜貫通領域および細胞内領域とをコードする構築物を、BioSignal Packard LtdからのGFPもコードするバイシストロニック性の哺乳動物発現ベクターpGFP2−n2中にクローニングした。1アミノ酸を改変した変異体構築物を、「ドラスチック」ミュータージェネシス・アプローチ(Davis et al. Proc Natl Acad Sci USA. 95, 5490-4 (1998))を用いて調製した。Genejuiceトランスフェクション試薬(Novagen;6μl/ウェル)を用いて、プラスミド(2μg/ウェル)を6ウェルプレート中のHEK−293T細胞にトランスフェクトした。モックおよび非トランスフェクション対照を各実験に含めた。細胞を18〜24時間で回収し、PBS−アザイド中10μg/mlの抗PD−1抗体またはアイソタイプ対照を用いて1時間4℃で染色した。細胞をPBS−アザイドにより洗浄し、1500rpmで5分間ペレット化し、PBS−アザイド中で、一次抗体をAlexa647コンジュゲート・ロバ抗マウスIgG(5μg/ml)を用いて30分間4℃で標識した。細胞を上記のように洗浄し、200μlのPBS−アザイド中に再懸濁し、フローサイトメトリーで分析した。ヨウ化プロピジウム(5μg/ml)をすぐに添加し、死細胞を特定するために分析した。GFP−陽性(トランスフェクトされた)可視細胞を分取し、抗PD−1抗体の結合性について分析した。変異体を、「ノックアウト」(抗PD−1抗体により結合される細胞のパーセンテージを減少させる)または「ノックダウン」(他のPD−1抗体に比例して抗体染色の強度を下げる)と特定した。
抗体のシグナル生成活性を直接比較するために、CD3ζの膜貫通領域に連結されたヒトPD−1の細胞外(抗体−結合)領域とCD28の細胞質領域(IL−2分泌を含む「活性な」出力(readout)を持たせるために)とから成るPD−1二量体形を作り出した(図4A)。
hPD−1/mCD3ζWT/mCD28構築物を、一連の5工程で作製した。工程1では、BglII制限部位およびラットリボソーム結合部位をコードし、続いて開始コドンおよびヒトPD−1のシグナルペプチドコード配列の最初の21塩基をコードするオリゴヌクレオチド1(左の矢印;配列5'−TAGTAGAGATCTCTCAAGCAGGCCACCATGCAAATCCCACAGGCGCCGTGG−3'、配列番号:33)を、相補のオリゴヌクレオチド2(5'−TCAGCCGGATCCTTCCAAACCCTGGTGCTCTGCTACTTGCTAGATGG−3'、配列番号:34)と共に、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR1)に用いた。オリゴヌクレオチド2は、BamH1部位を挿入するヒトPD−1細胞外ドメイン(成熟ポリペプチドの170残基まで)の最後の9残基をコードし、続いてマウスCD3ζ膜貫通ドメインのNH2末端をコードする20塩基を含む。PCR反応は標準的な条件下で行った。工程2では、オリゴヌクレオチド2を、マウスCD3ζの膜貫通領域のCOOH末端をコードし、続いてマウスCD28の細胞質ドメインのNH2末端をコードする最初の21塩基を含む相補のオリゴヌクレオチド3(5'−ATCACAGCCCTGTACCTGAATAGTAGAAGGAATAGACTC−3'、配列番号:35)と共に、PCR反応(PCR2)に用いた。工程3では、PCR1反応産物およびPCR2反応産物を精製し、アニールし、伸張させ、次いでオリゴヌクレオチド1および相補のオリゴヌクレオチド3の存在下で増幅して、CD3ζの膜貫通領域と融合されたPD−1の細胞外領域をコードするcDNAを作り出した。工程4では、オリゴヌクレオチド3を、CD28の細胞質ドメインのCOOH末端をコードし、続いて終止コドンおよびXhoI制限部位をコードするオリゴヌクレオチド4(5'−CTCGAGCTACTAGGGGCGGTACGCTGCAAA−3'、配列番号:36)と共に、PCR反応(PCR3)に用いた。工程5では、精製したPCR3産物と工程3の精製したPCR産物とをアニールさせ、アニールしたハイブリッドを伸張させ、次いでその伸張物をオリゴヌクレオチド1および4を用いて増幅することによって、PCR3産物と工程3のPCR産物とを融合した。
HEK293T細胞を、hPD−1/mCD3ζWT/mCD28をコードするpHR−SIN−BX−IRES−Emでトランスフェクトし、その上清を、DO11.10T細胞ハイブリドーマを感染させるために用いた。感染したDO11.10細胞を増殖させ、FACSによりマウスPD−1およびEGFP発現について選別し、次いで刺激アッセイ(stimulation assay)の出力としてのIL−2放出を用いて抗PD−1抗体による作動性のシグナル伝達を試験した。IL−2分泌の結果は、両方の抗体がhPD−1/mCD3ζWT/mCD28キメラを介したシグナル伝達を誘導することができるが、膜に近接するPD−1に結合するクローン19が多量のIL−2放出を誘導すること(代表的なデータは図4Bに示される)を示す。これは、抗体により形成される複合体のトポロジーがアゴニストにより誘導されるシグナル伝達の相対的なレベルを決定するものであるという概念を支持する。このデータは、作動性のシグナル伝達の度合いが抗体の選択により変化し得るということも示す。
抗体をトシル活性化DYNALBEADSに抗CD3抗体と共に共有結合させることにより、TCR誘導性活性化シグナル伝達を抑制するその能力について、抗体を試験した。次いで、前記ビーズを、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)で標識したPBL培養物に加えた。増殖レベルは、フローサイトメトリー分析により決定された希釈CFSEを含む細胞画分ごとに示された。
トシル活性化DYNALBEADS4.5μm(M450;Invitrogen)を、0.1Mの滅菌リン酸緩衝液(pH8)中で洗浄し、3×107のビーズあたり2.5μg総量の抗体をロードし、37℃で18〜24時間、反転混合し続けた。ウサギIgG(Sigma)を用いて、ビーズ−ローディング反応あたりの抗体の総量を揃えた。ビーズを少なくとも30分間10%FCSを含むRPMI中で室温にてブロッキングし、無血清RPMI中で3回洗浄した。幾つかの実験に関して、ビーズ結合抗体は、飽和量のアイソタイプ特異的PE標識ヤギ抗体を用いて二重試験で定量し、Quantibrite(商標)プレラベルド・クアンティフィケーション・キット(BD Biosciences Ltd.)を用いて比較した。ビーズ一重項の幾何平均蛍光PE強度(対照としての未標識ビーズの背景光を差し引いた)を用いて、標準曲線からビーズあたりにロードされた抗体の絶対量を算出した。そのような滴定の例は図5で示される。ロードしたビーズを4℃で保管した。ビーズローディングの間、添加した抗CD3抗体の量は、実験の際にほぼ同等レベルの抗CD3抗体を有するビーズの適合セットの効果を比較することができるように変更した。抗CD3ロードビーズにより与えられる刺激レベルは、低い(5日目のバルクのリンパ球の15%増殖という結果を与える)、中程度−低い(30%の増殖)、中程度−高い(60%の増殖)および高い(80%増殖)と定義した。
新鮮なヘパリン添加血液をPBSで1:1に希釈し、リンパ球は密度勾配分離(Ficoll Hypaque)により単離した。幾つかの実験では、アクセサリー細胞を37℃で2時間のプラスチック吸着によってか、または特異抗体標識DYNALBEADS(対CD14/19/8/56)を用いて除去した。細胞を、PBSおよびRPMI中で洗浄し、無血清RPMI中に1mlあたり107細胞に再懸濁した。細胞を、室温暗所にて10分間PBS中の25μMのCFSEを用いて標識した。CFSEは等量のFCSを用いて室温で5分間不活性化した。細胞を、RPMIを用いて3〜5回洗浄し、10%FCS+PSG+2−ME(終濃度5×10−5M)を含むRPMI中に1mlあたり106細胞で再懸濁した。抗体(ビーズ)、分裂促進剤または培地を、96ウェル丸底プレートの適切なウェルに加え、1ウェルあたり105細胞を分配し、37℃で3〜5日間インキュベートした。増殖試験に関して、細胞は、4℃で1時間、直接的に標識する細胞表面抗体により染色した。細胞をPBS−アザイドを用いて洗浄し、1500rpm/5分でペレットにし、200μlのPBS−アザイドに再懸濁した。細胞を、FlowJo Flow Cytometry Analysis Softwareを用いるフローサイトメーターでCFSEおよび抗体標識化について分析した。
図6に記載の実験結果において、用いたトシル活性化ビーズは、最大2375ngの抗PD−1クローン10またはクローン19抗体と、抗PD−1抗体が存在しない場合に〜25%の増殖を誘導するのに十分な抗CD3抗体とを含む2.5μg総量の抗体と共にインキュベートした。増殖は、5日目にCFSE希釈により測定した。実験1において、外観検査は、増殖の抑制が3つの抗体のすべてで見られること、クローン2および19では最も高いレベルの抑制を与えることも示す。自動分析ソフトウェア(FlowJo)を用いて分析することができるデータに関してクローン19による増殖抑制の量は80%のオーダーである。実験2では、OKT3のみが存在する場合でも増殖の程度は幾分か減少するが(〜15%まで)、クローン2および19は増殖を大きく抑制することは明らかであり;増殖を始める細胞は最大で増殖を1または2ラウンドしか受けない。クローン10は実験2ではいずれの抑制効果も示さない。
単独で作用する別個の抗PD−1抗体、例えばクローン10は既に抑制性であるが、抗PD−1抗体のペアを用いることによってこれらの効果を有意に増強することが可能であり得よう。抗体のシグナル伝達特性の初期の特徴づけは、PD−1がホモ二量体を形成するhPD−1/mCD3ζWT/mCD28キメラの形態で発現されるアッセイに依存した。これは、抗CD28超作動性抗体との比較を容易にするために行った。それはCD28もまたホモ二量体であるからである。生じる疑問としては、「hPD−1/mCD3ζWT/mCD28キメラによるシグナル伝達がその二価性に、および架橋化の結果にどの程度依存するか?」がある。これを試験するために、CD28の細胞質領域(IL−2分泌を含む「活性な」出力を持たせるために)に連結されたヒトPD−1の細胞外領域(抗体−結合)と膜貫通領域とからなる単量体で一価型のPD−1であるhPD−1/mCD28を作り出した(図10A)。
hPD−1/mCD28構築物を、一連の3工程で作り出した。工程1において、BglII制限部位およびラットリボソーム結合部位をコードし、続いて開始コドンおよびヒトPD−1のシグナルペプチドコード配列の最初の24塩基をコードオリゴヌクレオチド1(左の矢印;配列5'−TAGTAGAGATCTCTCAAGCAGGCCACCATGCAAATCCCACAGGCGCCGTGG−3'、配列番号:33)を、相補のオリゴヌクレオチド2(5'−GCCCAGCCGGCCAGTTCCAAACCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGT−3'、配列番号:37)と共に、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR1)に用いた。オリゴヌクレオチド2は、ヒトPD−1細胞外ドメイン(成熟ポリペプチドの149残基まで)の最後の23塩基をコードし、続いてマウスCD28膜貫通領域のNH2末端配列をコードする24塩基を含む。PCR反応は標準的な条件下で実施した。工程2では、オリゴヌクレオチド2を、マウスCD28の細胞質ドメインのCOOH末端をコードし、MluI制限部位、続いて停止コドンおよびXhoI制限部位をコードする相補のオリゴヌクレオチド3(5'-TTTGCAGCGTACCGCCCCACGCGTTAGTAGCTCGAG−3'、配列番号:38)と共に、PCR反応(PCR2)に用いた。工程3では、精製したPCR2産物を工程1由来の精製したPCR1産物とアニールさせ、アニールしたハイブリッドを伸張させ、次いでそれをオリゴヌクレオチド1および3を用いて増幅することによって、PCR2産物とPCR1産物とを融合させた。
クローン10およびクローン19が、CD28の膜貫通と細胞内シグナル伝達ドメインに連結されたPD−1の単量体細胞外領域とからなるヒトPD−1のキメラ型、すなわちhPD−1/mCD28に対して作動性ではなかったのは(図10)、その同等物のCD28構築物(ラットCD28のホモ二量体の細胞外ドメインからなる)とは対照的である。これに関する最も有力な説明としては、PD−1は単量体であるがCD28がホモ二量体であるため、二価抗体の結合は「架橋された」CD28分子の多量体配置の集合体であって非常に高密度のシグナル伝達ドメインを導くことになるが(図11A)、クローン10またはクローン19の結合は、PD−1分子のペアを結びつけるだけである(図11B)、ということになる。従って、インビボではホモ二量体の受容体に結合する抗体は、単量体の受容体に結合する抗体よりも一般に強力なシグナル伝達を生成する。PD−1の場合に、PD−1分子の多量体集合体を作り出すことができれば、より強力なシグナル伝達を導くことが推定され得る(図11C)。クローン10(またはクローン2)のエピトープおよびクローン19のエピトープがPD−1の反対「側」にあるという位置関係(図3)は、この2つの抗体が重ならない表面に結合し得ること、すなわち各々の天然のPD−1単量体が双方の抗体に結合でき得ることを意味している。これは、図11Cで示されるように、この抗体のペアがインビボで天然のPD−1単量体を「架橋」するために用い得ることを意味する。かくして作り出された隔てられたPD−1分子の高密度配置化は、単一の抗体を用いた場合に可能であろうシグナル伝達よりもより強力なシグナル伝達を作り出せることが期待される。
抗体ペアを用いて天然のPD−1単量体を「架橋」し、増強された作動性のシグナル伝達を誘導することができるという概念を試験するために、hPD−1/mCD28キメラタンパク質を発現するDO11.10細胞を、以下のクローン10/クローン19抗体刺激アッセイに用いた。96ウェル平底プレート(Costar EIA/RIAプレート)を、コーティング緩衝液(15mM Na2CO3、35mM NaHCO3、pH9.6)中の500μg/mlのロバ抗マウスIgG(Jackson Immunoresearch)を用いて4℃で一晩コートした。細胞を加える前に、プレートを3回200μlの冷PBSで洗浄した。5×103細胞を1200rpmで3分間遠心分離し、クローン19抗体を様々な濃度で含有する完全培地100μl中に30分間再懸濁した。次いで、細胞を洗浄し、様々な濃度のクローン10と共にさらに30分間インキュベートした後に、細胞をロバ抗マウスIgG抗体で予めコートした96ウェルプレートに3重試験で撒いた。細胞を、37℃で5%CO2下にて48時間インキュベートした後、細胞培養上清を取り出し、ELISAによるマウス・インターロイキン−2(IL−2)に関してアッセイした。
(CDRはアミノ酸配列中、下線で示す)
クローン2
VK DNA(配列番号:1)
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VK DNA(配列番号:7)
gatgttttgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctggtcagaacattgtacatagtaatggaaacacctatttagaatggtacctacagaaaccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtctccaaccgattttttggggtcccagacaggatcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctttcaaggttcacatgttccattcacgttcggctcggggacaaagctggaaataaaa
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VK DNA(配列番号:11)
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Claims (56)
- ハイブリドーマ・クローン10またはハイブリドーマ・クローン2により産生された、モノクローナル抗体。
- ハイブリドーマ・クローン10またはハイブリドーマ・クローン2により産生されるモノクローナル抗体と同じエピトープに結合する、モノクローナル抗体。
- ハイブリドーマ・クローン10またはハイブリドーマ・クローン2により産生される抗体と同じエピトープに結合する二重特異性抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体または組換え抗体。
- クローン10またはクローン2により産生されるモノクローナル抗体と同じエピトープに結合する抗原結合性フラグメント。
- 0.04秒−1〜2.0秒−1の解離定数を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
- PD−1との結合に際して、配列番号:2および配列番号:4;または配列番号:8および配列番号:10を含む抗体と競合する、単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
- 配列番号:2および配列番号:4;または配列番号:8および配列番号:10を含む抗体と同じPD−1エピトープに結合する、請求項6に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
- 請求項3に記載の抗体であって、配列番号:15、16、17、19、20およびi)配列番号:18;またはii)配列番号:18のアミノ酸6〜10のクローン2のVkおよびVH CDR、あるいは配列番号:21、22、23、25、26およびi)配列番号:24;または配列番号:24のアミノ酸6〜11のクローン10のCDRを含む、前記抗体。
- 配列番号:2および配列番号:4;または配列番号:8および配列番号:10を含む、単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の抗体を含む、医薬組成物。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の抗体をコードする、1つ以上の単離された核酸。
- 請求項11に記載の単離された核酸であって、抗体が、配列番号:1および配列番号:3;配列番号:1および配列番号:5;または配列番号:7および配列番号:9によりコードされる、前記核酸。
- 請求項11〜12に記載の1つ以上の核酸を含む、ベクター。
- 請求項13に記載のベクターまたは請求項11〜12に記載の核酸を含む、宿主細胞。
- クローン10の結合特異性を有する抗体を、PD−1またはPD−1発現細胞と接触させることを含む、PD−1またはPD−1発現細胞を単離する方法。
- クローン10により産生される抗体の結合特異性を有する抗PD−1特異抗体と組み合わせて、特異抗原を対象に投与することを含む、特異抗原に対する寛容を誘導する方法。
- ハイブリドーマ・クローン10により産生される抗体の結合特異性を有する抗PD−1特異抗体の対象への投与を含む、対象における活性化リンパ球により調整される免疫応答を低減する方法。
- アレルギー、関節リウマチ、I型糖尿病、多発性硬化症、炎症性腸疾患、クローン病、全身性エリテマトーデス、組織、皮膚および器官の移植片拒絶反応または移植片対宿主病(GVHD)を処置する方法であって、クローン10により産生される抗体の結合特異性を有する抗PD−1特異抗体を、前記疾患を有する対象に投与することを含む、前記処置方法。
- 付加的なPD−1特異モノクローナル抗体をPD−1またはPD−1発現細胞と接触させることを含む、請求項15に記載の方法。
- 付加的なPD−1特異モノクローナル抗体を投与することを含む、請求項16〜18に記載の方法。
- 付加的なPD−1特異モノクローナル抗体が、クローン10により産生される抗体により結合されるエピトープと別個の重ならないエピトープに結合する、請求項19または20に記載の方法。
- 付加的なPD−1特異モノクローナル抗体が、クローン19により産生される抗体と同じエピトープに結合する、請求項21に記載の方法。
- 抗体が、クローン19により産生された抗体である、請求項22に記載の方法。
- 付加的なPD−1特異モノクローナル抗体が、クローン2により産生される抗体と同じエピトープに結合する、請求項19または請求項20に記載の方法。
- 抗体が、クローン2により産生された抗体である、請求項24に記載の方法。
- 抗体が、0.04秒−1と2.00秒−1との間の解離定数を有する、請求項15〜19に記載の方法。
- 配列番号:2、配列番号:4、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:15、配列番号:16、配列番号:17、配列番号:18、配列番号:18のアミノ酸6〜10、配列番号:19、配列番号:20、配列番号:21、配列番号:22、配列番号:23、配列番号:24、配列番号:24のアミノ酸6〜11、配列番号:25または配列番号:26を含む、単離されたポリペプチド。
- 請求項27に記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸。
- 請求項27に記載のポリペプチドをコードするベクターまたは核酸を含む、単離された宿主細胞。
- 請求項27に記載のポリペプチドをコードする核酸を含む、ベクター。
- クローン2の結合特異性を有する抗体を、PD−1またはPD−1発現細胞と接触させる工程および前記細胞を単離する工程を含む、PD−1またはPD−1発現細胞を単離する方法。
- クローン2により産生される抗体の結合特性を有する抗PD−1特異抗体と組み合わせて、特異抗原を対象に投与することを含む、特異抗原に対する寛容を誘導する方法。
- ハイブリドーマ・クローン2により産生される抗体の結合特異性を有する抗PD−1特異抗体の対象への投与を含む、対象における活性化リンパ球により調整される免疫応答を低減する方法。
- アレルギー、関節リウマチ、I型糖尿病、多発性硬化症、炎症性腸疾患、クローン病、全身性エリテマトーデス、組織、皮膚および器官の移植片拒絶反応または移植片対宿主病(GVHD)を処置する方法であって、クローン2により産生される抗体の結合特異性を有する抗PD−1特異抗体を、前記疾患を有する対象に投与することを含む、前記処置方法。
- 付加的なPD−1特異モノクローナル抗体をPD−1またはPD−1発現細胞と接触させることを含む、請求項31に記載の方法。
- 付加的なPD−1特異モノクローナル抗体を投与することを含む、請求項32〜34に記載の方法。
- 付加的なPD−1特異モノクローナル抗体が、クローン2により産生される抗体により結合されるエピトープと別個の重ならないエピトープに結合する、請求項35または請求項36に記載の方法。
- 付加的なPD−1特異モノクローナル抗体が、クローン19により産生される抗体と同じエピトープに結合する、請求項37に記載の方法。
- 抗体が、クローン19により産生された抗体である、請求項38に記載の方法。
- 付加的なPD−1特異モノクローナル抗体が、クローン10により産生される抗体と同じエピトープに結合する、請求項35または請求項36に記載の方法。
- 抗体が、クローン10により産生された抗体である、請求項40に記載の方法。
- 抗体が、0.04秒−1と2.00秒−1との間の解離定数を有する、請求項31〜34に記載の方法。
- a)配列番号:18、配列番号:18のアミノ酸6〜10、配列番号:19または配列番号:20から選択される1つ以上の重鎖CDR配列;あるいは
b)配列番号:24、配列番号:24のアミノ酸6〜11、配列番号:25または配列番号:26から選択された1つ以上の重鎖CDR配列を含む、単離されたポリペプチド。 - a)配列番号:15、配列番号:16または配列番号:17から選択された1つ以上の軽鎖CDR配列;あるいは
b)配列番号:21、配列番号:22または配列番号:23から選択された1つ以上の軽鎖CDR配列を含む、単離されたポリペプチド。 - 請求項43に記載の単離されたポリペプチドであって、
a)重鎖CDR1および配列番号:19;重鎖CDR1および配列番号:20;配列番号:19および配列番号:20;または重鎖CDR1、配列番号:19および配列番号:20であって、重鎖CDR1は、配列番号:18のアミノ酸6〜10または配列番号:18から選択される;あるいは
b)重鎖CDR1および配列番号:25;重鎖CDR1および配列番号:26;配列番号:25および配列番号:26;または重鎖CDR1、配列番号:25および配列番号:26であって、重鎖CDR1は、配列番号:24のアミノ酸6〜11または配列番号:24から選択される、前記ポリペプチド。 - 2つまたは3つすべての軽鎖CDR配列を含む、請求項44に記載の単離されたポリペプチド。
- a)配列番号:18、配列番号:18のアミノ酸6〜10、配列番号:19または配列番号:20から選択される1つ以上の重鎖CDR配列;あるいは
b)配列番号:24、配列番号:24のアミノ酸6〜11、配列番号:25または配列番号:26から選択される1つ以上の重鎖CDR配列から選択される、1つ以上の重鎖CDR配列を含む、単離された抗体。 - a)配列番号:15、配列番号:16または配列番号:17から選択される1つ以上の軽鎖CDR配列;あるいは
b)配列番号:21、配列番号:22または配列番号:23から選択される1つ以上の軽鎖CDR配列から選択される1つ以上の軽鎖CDR配列を含む、単離された抗体。 - 請求項47に記載の単離された抗体であって、
a)重鎖CDR1および配列番号:19;重鎖CDR1および配列番号:20;配列番号:19および配列番号:20;または重鎖CDR1、配列番号:19および配列番号:20であって、重鎖CDR1が配列番号:18のアミノ酸6〜10または配列番号:18から選択される;あるいは
b)重鎖CDR1および配列番号:25;重鎖CDR1および配列番号:26;配列番号:25および配列番号:26;または重鎖CDR1、配列番号:25および配列番号:26であって、重鎖CDR1が配列番号:24のアミノ酸6〜11または配列番号:24から選択される、PD−1に結合する抗体を含む、前記抗体。 - 請求項48に記載の単離された抗体であって、2つまたは3つすべての軽鎖CDR配列を含み、PD−1に結合する抗体である、請求項48に記載の単離された抗体。
- 請求項43〜46のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸。
- 請求項47〜50のいずれか一項に記載の抗体をコードする、単離された核酸。
- 請求項51に記載の核酸を含む、ベクター。
- 請求項52に記載の核酸を含む、ベクター。
- 請求項53に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項54に記載のベクターを含む、宿主細胞。
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