JP2021511793A - Lag3に結合する抗原結合部位を含む二重特異性抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)配列番号207のアミノ酸配列を含むFR1と、
(b)配列番号208のアミノ酸配列を含むFR2と、
(c)配列番号209のアミノ酸配列を含むFR3と、
(d)配列番号210のアミノ酸配列を含むFR4と
を含む重鎖可変ドメインフレームワーク
または
(a)配列番号211のアミノ酸配列を含むFR1と、
(b)配列番号208のアミノ酸配列を含むFR2と、
(c)配列番号209のアミノ酸配列を含むFR3と、
(d)配列番号210のアミノ酸配列を含むFR4と
を含む重鎖可変ドメインフレームワーク
(i)配列番号201のアミノ酸配列を含むCDR−H1と、
(ii)配列番号202のアミノ酸配列を含むCDR−H2と、
(iii)配列番号203のアミノ酸配列を含むCDR−H3と
を含むVHドメイン;および
(i)配列番号204のアミノ酸配列を含むCDR−L1と、
(ii)配列番号205のアミノ酸配列を含むCDR−L2と、
(iii)配列番号206のアミノ酸配列を含むCDR−L3と
を含むVLドメイン
を含む。
(a)配列番号192の配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号193の配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第1の軽鎖、配列番号99、配列番号101、配列番号103、配列番号105、配列番号107、配列番号109、配列番号111、配列番号113、配列番号115、配列番号117、配列番号117からなる群から選択される配列、特に、配列番号105、配列番号107、配列番号109、配列番号111からなる群から選択される配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第2の重鎖を含む。
(a)前記二重特異性または多重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで宿主細胞を形質転換するステップ、
(b)二重特異性または多重特異性抗体の発現に適した条件下で宿主細胞を培養するステップ、および任意に
(c)培養物、特に宿主細胞から二重特異性または多重特異性抗体を回収するステップ
を含む。
(i)T細胞活性の回復などの免疫応答の調節において、
(ii)免疫応答または機能の刺激において、
(iii)感染の処置において、
(iv)癌の処置において、
(v)癌の進行を遅らせることにおいて、
(vi)癌を患う患者の生存を延長することにおいて使用するための、二重特異性もしくは多重特異性抗体または医薬組成物に関する。
I.定義
他の意味であると定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野で一般的に使用されるのと同じ意味を有する。本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合にはいつでも、単数形で使用される用語は、複数形も含み、その逆に、複数形で使用される用語は、単数形も含む。
(a)アミノ酸残基26−32(L1)、50−52(L2)、91−96(L3)、26−32(H1)、53−55(H2)および96−101(H3)で生じる超可変ループ(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901−917(1987));
(b)アミノ酸残基24−34(L1)、50−56(L2)、89−97(L3)、31−35b(H1)、50−65(H2)および95−102(H3)に存在するCDR(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda,MD(1991));
(c)アミノ酸残基27c−36(L1)、46−55(L2)、89−96(L3)、30−35b(H1)、47−58(H2)および93−101(H3)で生じる抗原接触(MacCallum et al.J.Mol.Biol.262:732−745(1996));ならびに
(a)、(b)および/または(c)の組合せ、HVRアミノ酸残基46−56(L2)、47−56(L2)、48−56(L2)、49−56(L2)、26−35(H1)、26−35b(H1)、49−65(H2)、93−102(H3)および94−102(H3)を含む。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp,Glu;
(4)塩基性:His,Lys,Arg;
(5)鎖の配向に影響を与える残基:Gly,Pro;
(6)芳香族:Trp,Tyr,Phe。
aVHS
一態様では、本発明は、安定化された自律性VHドメインに部分的に基づく。特定の実施形態では、Kabat番号付けによる52aおよび71位または33および52位にシステインを含む自律性VHドメインが提供される。前記システインは、適切な条件下でジスルフィド結合を形成する。本発明の更なる態様では、Kabat番号付けによる52a、71、33および52位にシステインを含む自律性VHドメインが提供される。本発明の好ましい実施形態では、aVHは、配列番号207のアミノ酸配列によるフレームワーク領域1または配列番号208のアミノ酸配列によるフレームワーク領域2または配列番号209のアミノ酸配列によるフレームワーク領域3または配列番号210のアミノ酸配列によるフレームワーク領域4を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む。本発明の好ましい実施形態では、aVHは、配列番号207のアミノ酸配列によるフレームワーク領域1およびは配列番号208のアミノ酸配列によるフレームワーク領域2を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む。本発明の好ましい実施形態では、aVHは、配列番号209のアミノ酸配列によるフレームワーク領域1およびは配列番号210のアミノ酸配列によるフレームワーク領域3を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む。本発明の好ましい実施形態では、aVHは、配列番号207のアミノ酸配列によるフレームワーク領域1およびは配列番号210のアミノ酸配列によるフレームワーク領域4を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む。本発明の好ましい実施形態では、aVHは、配列番号207のアミノ酸配列によるフレームワーク領域1、配列番号209のアミノ酸配列によるフレームワーク領域3および配列番号210のアミノ酸配列によるフレームワーク領域4を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む。本発明の好ましい実施形態では、aVHは、配列番号207のアミノ酸配列によるフレームワーク領域1、配列番号208のアミノ酸配列によるフレームワーク領域2および配列番号209のアミノ酸配列によるフレームワーク領域3を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む。本発明の好ましい実施形態では、aVHは、配列番号207のアミノ酸配列によるフレームワーク領域1、配列番号208のアミノ酸配列によるフレームワーク領域2、配列番号209のアミノ酸配列によるフレームワーク領域3および配列番号210のアミノ酸配列によるフレームワーク領域4を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む。本発明の好ましい実施形態では、aVHは、配列番号208のアミノ酸配列によるフレームワーク領域2、配列番号209のアミノ酸配列によるフレームワーク領域3および配列番号210のアミノ酸配列によるフレームワーク領域4を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む。本発明の好ましい実施形態では、aVHは、配列番号208のアミノ酸配列によるフレームワーク領域2および配列番号209のアミノ酸配列によるフレームワーク領域3を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む。本発明の好ましい実施形態では、aVHは、配列番号208のアミノ酸配列によるフレームワーク領域2および配列番号220のアミノ酸配列によるフレームワーク領域4を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む。本発明の好ましい実施形態では、aVHは、配列番号209のアミノ酸配列によるフレームワーク領域3および配列番号210のアミノ酸配列によるフレームワーク領域4を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む。あるいは、フレームワーク領域1は、前述の実施形態において配列番号211によるものであり、フレームワーク領域1は、配列番号207により定義された。
本発明の更なる態様では、テンプレートaVHが提供される。好ましい実施形態では、自律性VHドメインは、配列番号40(テンプレート1)のアミノ酸配列を含む。配列番号40のアミノ酸配列は、P52aC位およびA71C位のシステイン変異に基づく。好ましい実施形態では、自律性VHドメインは、配列番号42(テンプレート2)のアミノ酸配列を含む。配列番号42のアミノ酸配列は、P52aC位およびA71C位のシステイン変異に基づいており、更なる変異、すなわちG26Sを含む。好ましい実施形態では、自律性VHドメインは、配列番号44(テンプレート3)のアミノ酸配列を含む。配列番号42のアミノ酸配列は、P52aC位およびA71C位のシステイン変異に基づいており、31a位にセリン挿入を含み、31位と32位の間にセリンが付加されている。好ましい実施形態では、自律性VHドメインは、配列番号46(テンプレート4)のアミノ酸配列を含む。配列番号44のアミノ酸配列は、P52aC位とA71C位のシステイン変異に基づいており、31a位と31b位に2つのセリン挿入を含み、つまり、31位と32位の間の配列に2つのセリンが付加されていた。好ましい実施形態では、自律性VHドメインは、配列番号180のアミノ酸配列(テンプレート5)を含む。配列番号180のアミノ酸配列は、Y33C位およびY52位のシステイン変異に基づく。配列番号40、42、44、46および180の配列は、更なる安定化の目的で、突然変異K94SおよびL108Tを含む。しかしながら、テンプレート1〜5は、K94Sおよび/またはL198T変異を含む必要はない。
更なる態様では、本発明は、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)に結合するaVHドメインに部分的に基づく。好ましい実施形態では、MCSPに結合するaVHドメインは、配列番号57のアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、MCSPに結合するaVHドメインは、配列番号59のアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、MCSPに結合するaVHドメインは、配列番号61のアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、MCSPに結合するaVHドメインは、配列番号63のアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、MCSPに結合するaVHドメインは、配列番号65のアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載される自律性VHドメインを含むVHライブラリーの生成のために、テンプレート配列はランダム化した。テンプレート1(配列番号40に基づく)は、3つ全てのCDRでランダム化した。テンプレート2、3および4(それぞれ、配列番号42、配列番号44、配列番号46による)は、CDR2およびCDR3でランダム化した。テンプレート5(配列番号180による)は、第1のライブラリーでは3つ全てのCDRにおいてランダム化し、第2のライブラリーではCDR2および3でのみランダム化した。
以下は、本発明の方法および組成物の例である。上に提供した一般的な記載が与えられ、種々の実施形態が実施されてもよいことが理解される。
標準的な方法を使用して、Sambrook,J.et al.,Molecular Cloning:A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989に記載されるようにDNAを操作した。分子生物学的試薬は、製造業者の指示に従って使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関連する一般的な情報は、Kabat,E.A.et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Ed.,NIH Publication No 91−3242に示されている。
必要な場合、望ましい遺伝子セグメントは、適切なテンプレートを使用してPCRにより生成したか、またはGeneart AG(レーゲンスブルク、ドイツ)で合成オリゴヌクレオチドとPCR産物から自動遺伝子合成によって合成した。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準的なクローニング/配列決定ベクターにクローニングした。プラスミドDNAを形質転換細菌から精製し、UV分光法で濃度を測定した。サブクローン化された遺伝子断片のDNA配列は、DNA配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクターへのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計した。真核細胞での分泌に使用される全てのコンストラクトを、リーダーペプチドをコードする5’末端のDNA配列で設計した。配列番号1および2は、代表的なリーダーペプチドを与える。
特異的aVHドメインの選択のために、3つの異なる抗原を生成した。
DR5−Fc−avi、モノマーTfR1−Fc−avi、ならびに一価および二価のaVH Fcコンストラクトの発現のために、EBV由来タンパク質EBNAを安定して発現するHEK 293細胞に一過性トランスフェクトした。タンパク質は、標準プロトコルを参照しつつ、ろ過した細胞培養物上清から精製した。簡単に言うと、Fcを含むタンパク質を、Protein A Sepharoseカラム(GE healthcare)にアプライし、PBSで洗浄した。溶出はpH2.8で達成され、続いて試料をすぐに中和した。凝集したタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 200、GE Healthcare)によって、PBS中、または20mM ヒスチジン、150mM NaCl(pH6.0)中に、単量体フラクションから分離した。モノマータンパク質フラクションをプールし、例えば、MILLIPORE Amicon Ultra(30 MWCO)遠心分離濃縮器を用いて濃縮し(必要な場合)、凍結させ、−20℃または−80℃で保存した。試料の一部を、例えば、SDS−PAGE、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)または質量分析法によるその後のタンパク質分析および分析による特性決定のために提供した。
汎用自律性ヒト重鎖可変ドメイン(aVH)ライブラリーの生成
汎用aVHライブラリーを、Barthelemy et al.,J.Biol.Chem.2008,283:3639−3654に掲載された自律性ヒト重鎖可変ドメインのハーセプチン由来のテンプレート(配列番号13および14)である配列B1abに基づき生成した。B1abでは、軽鎖界面がない場合に表面に露出されるようになる4つの疎水性残基が、ファージディスプレイによって同定されたより親水性の高い残基で置き換えられた。これらの変異は、VHドメインの折り畳みの構造と互換性があることがわかっている。それらは親水性を高め、ひいては足場の安定性を高め、軽鎖パートナーの非存在下で安定かつ可溶性であるaVHドメインの発現を可能にする(図1A)。
新しいライブラリーの機能をテストするために、DR5の細胞外ドメイン(ECD)に対する選択を、HEK293で発現されたタンパク質を使用して行った。パニングラウンドを、以下のパターンに従って溶液中で行った:(1)全容量1mlで0.5時間、100nMビオチン化抗原タンパク質への約1012ファージミド粒子の結合、(2)ビオチン化抗原の捕捉および5.4×107のストレプトアビジン被覆磁性ビーズの10分間の添加による特異的結合ファージの付着、(3)5×1ml PBS/Tween 20および5x1ml PBSを使用したビーズの洗浄、(4)1mlの100mMトリエチルアミン(TEA)の10分間の添加によるファージ粒子の溶出および500μlの1M Tris/HCl pH7.4の添加による中和、(5)上清のファージ粒子による対数増殖期の大腸菌TG1細胞の再感染、ヘルパーファージVCSM13による感染、その後の選択ラウンドで使用されることになるファージミド粒子のその後のPEG/NaCl沈殿。
安定化ジスルフィド架橋を含むaVHドメインの同定
aVH足場をさらに安定させるために、タンパク質鎖の柔軟性を制約する追加のジスルフィド架橋の導入をテストした。システインに変異したときにジスルフィド架橋の形成を可能にする位置は、1)構造モデリングまたは2)追加の安定化ジスルフィドを保有する自然状態のIg様V型配列を検索することによって同定した。
安定化された汎用自律性ヒト重鎖可変ドメイン(aVH)ライブラリーを生成するための新しいライブラリーテンプレート
配列番号30および37に基づいて、より安定性の高いaVHライブラリーを生成するために、新しいaVHライブラリーテンプレートを設計した。以下の任意の修飾は、テンプレート配列で行った(1)変異K94Sの導入。(2)抗体Jエレメントで頻繁に見られる配列バリアントである変異L108Tの導入。しかしながら、前述の変異は特定の効果を有していなかった。全てのライブラリーテンプレートの概要を図3に示している。
52a位と71位での追加の安定化ジスルフィド架橋に基づく新しいaVHライブラリーの生成のために、4つの新しいテンプレートを設計した(配列番号39、41、43、45)。4つのテンプレートのうち3つは、CDR1領域に追加の配列修飾を保有する(図3A)。テンプレート2(配列番号42)では、グリシン26がセリン(G26S修飾)に置き換えられ、テンプレート3および4(配列番号44および46)は、それぞれ31a位および31a/b位に1つおよび2つのセリン挿入を有する(S31aおよびS31ab修飾)。テンプレート1(配列番号40)は3つ全てのCDRでランダム化し、テンプレート2〜4(配列番号42、44および46)はCDR2およびCDR3のみでランダム化した。全てのランダム化において、3つの断片が「オーバーラップエクステンションによるスプライシング」(SOE)PCRによって組み立てられた。断片1は、フレームワーク1、CDR1、およびフレームワーク2の一部を含むaVH遺伝子の5’末端を含む。断片2は、フレームワーク2の断片1とオーバーラップし、CDR2およびフレームワーク3領域をコードする。断片3は断片2とアニーリングし、CDR3領域とaVHのC末端を保有する。
33位および52位でジスルフィド架橋により安定化されたaVHテンプレート5(図3B;DNA:配列番号179;タンパク質配列番号180)のランダム化のために、前述のものと同じPCR戦略を選択した。3つのランダム化されたCDRを有するライブラリーの生成のために、断片1はプライマーLMB3(配列番号15)およびaVH_Y33C_Y52C_H1_rev_Primer_TN(配列番号54)を使用して生成し、断片2はaVH_Y33C_Y52C_H2_for_Primer_TN(配列番号55)およびaVH_H3リバースプライマー(配列番号49)を使用して生成し、断片3はaVH_H3_4/5/6_for_Primer_TN(配列番号50〜52)およびfdseqlong(配列番号17)を使用して生成した(表6)。CDR2および3のみでランダム化されたライブラリーの生成のために、ランダム化プライマー配列番号54を、定常プライマー配列番号53で置き換えた(表7)。得られたファージライブラリーのサイズは、約5×109の形質転換体であった。
汎用ジスルフィド安定化aVHライブラリーからの抗MCSPおよび抗TfR1結合物質の選択
ライブラリーの複雑さの品質をテストし、結果として得られる結合物質をさらに特性決定するために、前述のように、組換えMCSPおよびTfR1に対する概念実証選択を溶液中で行った。両方の選択について、6つのファージライブラリー全てを個別に、前述の抗原に対する結合物質についてスクリーニングした。抗原濃度の(10−7Mからx10−8Mへの)減少を使用して選択を3ラウンド行った。ラウンド2では、ストレプトアビジンビーズの代わりにニュートラアビジンプレートを使用して抗原:ファージ複合体の捕捉を行った。特異的結合物質を、ELISAによって以下のように同定した:ウェルあたり100μlの50nMビオチン化抗原をニュートラアビジンプレートに被覆した。個々のaVHを含む細菌の上清を加え、抗Flag/HRP二次抗体を使用して結合aVHをそれらのFlagタグを介して検出した。バックグラウンドよりも有意なシグナルを示すクローンを、配列決定用にショートリストし(例示的なDNA配列は、MCSP特異的aVHの配列番号56、58、60、62および64としてリストし、TfR1特異的aVHの配列番号66、67、68、69、70、71および72としてリストした)、さらに分析した。
選択したクローンをさらに特性決定するために、ELISAポジティブaVH(MCSP特異的aVHの配列番号57、59、61、63および65としてリストされた可変ドメインの例示的なタンパク質配列)を、反応速度パラメータの正確な分析のために精製した。各クローンについて、500mlの培養物に、対応するファージミドを保有する細菌を接種し、OD6000.9で1mM IPTGを用いて誘導した。その後、培養物を25℃で一晩インキュベートし、遠心分離により回収した。再懸濁したペレットを25mlのPPB緩衝液(30mM Tris−HCl pH8、1mM EDTA、20%ショ糖)で20分間インキュベートした後、細菌を再度遠心分離し、上清を回収した。このインキュベーションステップを、25mlの5mM MgSO4溶液で1回繰り返した。両方のインキュベーションステップの上清をプールし、ろ過し、IMACカラム(His gravitrap、GE Healthcare)にロードした。続いて、カラムを40mlの洗浄緩衝液(500mM NaCl、20mMイミダゾール、20mM NaH2PO4 pH7.4)で洗浄した。溶出後(500mM NaCl、500mMイミダゾール、20mM NaH2PO4pH7.4)、PD10カラム(GE Healthcare)を使用して溶出液を再緩衝化し、続いてゲルろ過ステップを行った。精製タンパク質の収量は500〜2000μg/Lの範囲であった。
選択されたaVHクローンのアフィニティー(KD)は、25℃でProteOn XPR36装置(Biorad)を使用して、表面プラズモン共鳴により、ニュートラアビジン捕捉によってNLCチップにビオチン化MCSP抗原を固定化して測定した。組換え抗原(リガンド)の固定:抗原をPBST(10mMリン酸、150mM塩化ナトリウム pH7.4、0.005%Tween 20)で10μg/mlに希釈し、次いでさまざまな接触時間で30μl/分で注入して、垂直方向で200、400または800の応答単位(RU)の固定化レベルを達成した。分析物の注入:ワンショット反応速度測定では、注入方向を水平方向に変更し、精製されたaVHの2倍希釈系列(200〜6.25nMのさまざまな濃度範囲)を180秒の間の結合時間と800秒の解離時間で、別々のチャネル1〜5に沿って60μl/minで同時に注入した。参照用の「インライン」ブランクを提供するために、6つ目のチャネルに沿って緩衝液(PBST)を注入した。結合速度定数(kon)と解離速度定数(koff)は、ProteOn Manager v3.1ソフトウェアの単純な1:1 Langmuir binding model を使用して、結合と解離センサーグラムを同時にフィッティングすることで計算した。平衡解離定数(KD)は、koff/konの比として計算した。分析されたクローンにより、非常に広い範囲(8〜193nM)のKD値が明らかになった。全てのクローンの速度論的および熱力学的データ、凝集温度、ランダム化されたCDR、ならびに安定化ジスルフィド架橋の位置を表8にまとめている。
選択されたaVHクローンをさらに特性決定するために、全ての結合物質をFcベースのフォーマットに変換した。MCSP特異的aVH配列は、「ノブ」変異を保有するヒトIgG1 FcドメインにN末端で融合された。特に、同定されたaVH DNA配列(配列番号56、58、60、62、64)は、配列番号73のaVHをコードするテンプレート配列を置き換えた。aVH−Fc融合配列は、「ホール」変異を持つFc配列(配列番号74)と組み合わせて発現され、N末端のモノマーaVHを有するFcドメインをもたらした(図2A)。
ジスルフィド安定化MCSP特異的クローンのMV3細胞株への結合をFACSで測定した。ネガティブコントロールとして、無関係の抗体を使用した。96ウェルの丸底プレートのウェルあたり0.2mio細胞を、300μlのPBS(0.1%BSA)とモノマーのaVH−Fc融合コンストラクト(0.27、0.8、2.5、7.4、22.2、66.6、200および600nM)で4℃にて30分間インキュベートした。非結合分子は、細胞をPBS(0.1%BSA)で洗浄することにより除去した。結合分子は、FITC抱合AffiniPureヤギ抗ヒトIgG Fcガンマ断片特異的二次F(ab’)2断片(Jackson ImmunoResearch ♯109−096−098;PBS中1:20希釈標準溶液、0.1%BSA)で検出された。4℃で30分のインキュベーション後、非結合抗体を洗浄により除去し、細胞を1%PFAを使用して固定した。BD FACS CantoII(ソフトウェアBD DIVA)を使用して細胞を分析した。全てのクローンの結合(図4)が観察された。SPRによって測定されたアフィニティーと結合分析の感度は相関しており、クローン2(配列番号57)がSPR分析と細胞結合研究の両方で最良の結合物質であった。
選択および精製されたaVHをさらに特性決定するために、MCSP特異的クローンの凝集温度を前述のように決定した。興味深いことに、全てのジスルフィド安定化MCSP特異的クローンの凝集温度は59〜64℃であり、追加のジスルフィド架橋の安定化効果を明確に実証している(表8)。
TfR1特異的二価aVH−FcコンストラクトのTfR1発現細胞上のそれらのエピトープへの結合は、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)分析によって決定した。この分析では、SNAPタグ(Cisbioから購入したプラスミド)をコードするDNA配列をPCRで増幅し、完全長TfR1配列(Origene)を含む発現ベクターにライゲーションした。得られた融合タンパク質は、C末端SNAPタグを有する全長TfR1を含む。Hek293細胞に、トランスフェクション試薬としてLipofectamine 2000を使用して、10μgのDNAをトランスフェクションした。20時間のインキュベーション後、細胞をPBSで洗浄し、100nMのSNAP−Lumi4Tb(Cibsio)を含むLabMed緩衝液(Cisbio)で37℃にて1時間インキュベートし、SNAPタグの特異的標識をもたらした。その後、細胞をLabMed緩衝液で4回洗浄して、非結合色素を除去した。標識効率は、緩衝液と比較して615nmでテルビウムの発光を測定することにより決定した。次いで、細胞を−80℃で6ヶ月まで冷凍保存した。結合は、0.5〜60nMまでの範囲の濃度のTfR1特異的aVH Fc融合体を標識細胞(ウェルあたり100細胞)に加え、続いてFRETの受容体分子として抗ヒトFc−d2(Cisbio、最終濃度はウェルあたり200nMであった)を加えて測定した。RTで3時間のインキュベーション時間後、受容体色素(665nm)ならびにドナー色素(615nm)の発光を、蛍光リーダー(Victor 3、Perkin Elmer)を使用して決定した。受容体とドナー発光の比率を計算し、バックグラウンドコントロール(抗huFc−d2を含む細胞)の比率を差し引いた。GraphPad Prism5(図5)で曲線を分析し、KDを計算した(表9)。
汎用ジスルフィド安定化aVHライブラリーからの抗LAG3特異的結合物質の選択
LAG3特異的aVHの選択は、前述のように行った。この選択のために、6つ全てのファージライブラリーを個別に、上述の抗原に対する結合物質についてスクリーニングした。抗原濃度の(10−7Mからx10−8Mへの)減少を使用して選択を3ラウンド行った。ラウンド2では、ストレプトアビジンビーズの代わりにニュートラアビジンプレートを使用して抗原:ファージ複合体の捕捉を行った。特異的結合物質を、ELISAによって以下のように同定した:ウェルあたり100μlの50nMビオチン化抗原をニュートラアビジンプレートに被覆した。aVHを含む細菌の上清を加え、抗Flag/HRP二次抗体を使用して結合aVHをそれらのFlagタグを介して検出した。バックグラウンドよりも有意なシグナルを示すクローンを、配列決定用にショートリストし(配列番号76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96としてリストされるDNA配列;配列番号77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97としてリストされるタンパク質配列)、さらに分析した。
選択されたaVHクローンのアフィニティー(KD)は、25℃でProteOn XPR36装置(Biorad)を使用して、表面プラズモン共鳴により、ニュートラアビジン捕捉によってNLCチップにビオチン化LAG3−Fc抗原を固定化して測定した。組換え抗原(リガンド)の固定:抗原をPBST(10mMリン酸、150mM塩化ナトリウム pH7.4、0.005%Tween 20)で10μg/mlに希釈し、次いでさまざまな接触時間で30μl/分で注入して、垂直方向で200、400または800の応答単位(RU)の固定化レベルを達成した。LAG3結合相互作用のネガティブコントロールとして、ビオチン化Fcドメインを同じ条件で固定化した。分析物の注入:ワンショット反応速度測定では、注入方向を水平方向に変更した。精製されたaVHの2倍希釈系列(200〜6.25nMのさまざまな濃度範囲)を300秒の間の結合時間と360秒の解離時間で、別々のチャネル1〜5に沿って60μl/minで同時に注入した。参照用の「インライン」ブランクを提供するために、6つ目のチャネルに沿って緩衝液(PBST)を注入した。結合速度定数(kon)と解離速度定数(koff)は、ProteOn Manager v3.1ソフトウェアの単純な1:1 Langmuir binding model を使用して、結合と解離センサーグラムを同時にフィッティングすることで計算した。平衡解離定数(KD)は、koff/konの比として計算した。分析されたクローンにより、非常に広い範囲(5〜766nM)のKD値が明らかになった。全てのクローンの速度論的および熱力学的データ、凝集温度、ランダム化されたCDR、ならびに安定化ジスルフィド架橋の位置を表10にまとめている。
細菌で精製されたLAG3特異的aVHドメインがT細胞で発現するMHCIIへのLAG3の結合をブロックして妨げる能力を評価するために、細菌から精製されたaVHsドメインを使用して細胞ベースの結合阻害アッセイを行った。最初のステップでは、20μg/ml〜0.05μg/mlの範囲のaVHドメインの連続希釈液を、1μg/mlのビオチン化LAG3−Fcと共にPFAE緩衝液(2%FCS、0.02%アジ化ナトリウムおよび1mM EDTAを含むPBS)でインキュベートした。室温で20分後、混合物を2×105のPFAEで洗浄したA375細胞に加えた。4℃で30分後、細胞をPFAEで1回洗浄した。A375細胞で発現したMHCIIへのLAG3−Fcの結合は、Alexa 647標識ヤギ抗ヒトFcの添加により検出された。インキュベーションの30分後、細胞をPFAE緩衝液で洗浄し、FACS caliburフローサイトメーターを使用して結合分析を行った。
選択されたジスルフィド安定化aVHクローンのFcベースのフォーマットへの変換
選択されたaVHクローンをさらに特性決定するために、全ての結合物質をFcベースのフォーマットに変換した。aVHコード配列は、ヒトIgG1 Fcドメインまたは「ノブ」変異を保有するヒトIgG1 FcドメインのいずれかにN末端で融合された。両方のFcバリアントは、FcγR結合を完全に無効にするPG−LALA変異を含んでいた。P329G、L234AおよびL235A(EU番号付け)のFcドメインにおける変異に関連するPG−LALA変異は、その全体が本明細書に組み込まれるWO2012/130831に記載されている。
それらの生化学的および生物物理学的特性を特性決定して比較するために、全ての一価のaVH−Fc融合コンストラクトを詳細に分析した:
試料を3つのアリコートに分け、20mM His/His−HCl、140mM NaCl、pH6.0(His/NaCl)またはPBSにそれぞれ再緩衝化し、40℃(His/NaCl)または37℃(PBS)で2週間保存した。コントロール試料は−80℃で保存した。
見かけの疎水性は、20μgの試料を25mMリン酸ナトリウム、1.5M硫酸アンモニウム、pH 7.0で平衡化したHIC−Ether−5PW(Tosoh)カラムに注入することにより決定した。溶出は、0〜100%の緩衝液B(25mMリン酸ナトリウム、pH7.0)の直線勾配で60分以内に行った。リテンションタイムを、既知の疎水性を有するタンパク質標準と比較した。ほとんどの抗体は、0〜0.35の相対リテンションタイムを示す。
試料を、20mM His/His−HCl、140mM NaCl中、pH6.0で1mg/mLの濃度にて調製し、0.4μmフィルタープレートで遠心分離して光学384ウェルプレートに移し、パラフィンオイルで覆った。流体力学的半径は、試料を25℃〜80℃に0.05℃/minの速度で加熱している間、DynaProプレートリーダー(Wyatt)で動的光散乱によって繰り返し測定する。
FcRnは、記載されているように(Schlothauer et al.)発現、精製およびビオチン化した。カップリングのために、調製した受容体をストレプトアビジン−セファロース(GE Healthcare)に加えた。得られたFcRn−セファロースマトリックスをカラムハウジングに充填した。カラムを20mM 2−(N−モルホリン)−エタンスルホン酸(MES)、140mM NaCl、pH5.5(溶離液A)で0.5 ml/minの流速で平衡化した。30μgの抗体試料を溶離液Aで1:1の容量比で希釈し、FcRnカラムにアプライした。カラムを5カラム容量の溶離液Aで洗浄し、続いて20〜100%の直線勾配で35カラム容量の20mM Tris/HCl、140mM NaCl、pH8.8(溶離液B)で溶出した。分析は、25℃のカラムオーブンで行った。溶出プロファイルは、280nmでの吸光度を継続的に測定することでモニターした。リテンションタイムを、既知のアフィニティーを有するタンパク質標準と比較した。ほとんどの抗体は、0〜1の相対リテンションタイムを示す。
二価のaVH−Fc融合コンストラクトのin vitro特性決定
下記のインビトロ実験では、以下の試薬を使用した。全ての結果の概要を表14に見出すことができる。
Nunc maxisorpプレート(Nunc 464718)を、PBS緩衝液で希釈した25μl/ウェルの組換えヒトLAG3 Fcキメラタンパク質(R&D Systems、2319−L3)を用い、タンパク質濃度800ng/mlでコーティングし、4℃で一晩、または室温で1時間インキュベートした。洗浄した後(PBST緩衝液を用いて3x90μl/ウェル)、各ウェルを、90μlのブロッキング緩衝液(PBS+2% BSA+0.05% Tween 20)と共に、室温で1時間インキュベートした。洗浄した後(PBST緩衝液を用いて3x90μl/ウェル)、25μlの抗Lag3試料を濃度1000または3000〜0.05ng/ml(OSEP緩衝液中1:3希釈)で加え、RTで1時間インキュベートした。洗浄した後(PBST緩衝液を用いて3x90μl/ウェル)、25μl/ウェルのヤギ抗ヒトIgG F(ab’)2−HRP抱合体(Jackson,JIR109−036−006)を1:800希釈状態で加え、RTで1時間インキュベートした。洗浄した後(PBST緩衝液を用いて3x90μl/ウェル)、25μl/ウェルのTMB基質(Roche、番号11835033001)を加え、2〜10分間インキュベートした。測定をTecan Safire 2機器で、370/492nmで行った。(米国特許出願公開第2011/0150892号明細書および国際公開第2014/008218号に開示されている)コントロール抗体MDX25F7と比較して、ほとんどのaVHクローンはより高いEC50値を示した。さらに、マウスLAG3−Fc抗原(R&D Systems,3328−L3−050)を使用したそれぞれのELISA実験は、どの結合物質もマウスLAG3と交差反応しないことを明らかにした(データは示していない)。
ヒトLag3への結合からの抗Lag3 aVH Fc融合コンストラクトのオフレートを、BIACORE B4000またはT200機器(GE Healthcare)を使用した表面プラズモン共鳴により調査した。全ての実験は、ランニング緩衝液としてPBST緩衝液(pH 7.4+0.05%Tween20)を使用して25℃で行った。抗ヒトFc(JIR109−005−098,Jackson)は、Series S C1 Sensor Chip(GE Healthcare)に約240〜315RUで固定した。1または5μg/mlの抗Lag3 aVH抗体を10μl/minで60秒間捕捉した。次のステップでは、250μg/mlの濃度で10μl/minの2x120秒の注入によるヒトIgG(Jackson,JIR−009−000−003)の注入により、遊離の抗ヒトFc結合部位をブロックした。0、5および25nMのヒトLAG−3 Fcキメラタンパク質(R&D Systems,2319−L3)を、30μl/minの流速で180秒間アプライした。解離相は、ランニング緩衝液で洗浄することにより、900秒間モニターした。H3PO4(0.85%)を30μl/minの流速で70秒間注入することにより、表面を再生した。
細胞上のaVH−Fc融合コンストラクトの特性決定
以下のセクションでは、選択されたaVH−Fc融合コンストラクトをいくつかの細胞ベースのアッセイで特性決定した。下記のインビトロ実験では、以下の試薬を使用した。全ての結果の概要を表15に見出すことができる。
25μl/ウェルのLag3細胞(Lag3を発現する組換えCHO細胞、10000細胞/ウェル)を、組織培養処理された384ウェルプレート(Corning、3701)に播種し、37℃で1日間または2日間インキュベートした。培地を除去した次の日、25μlの二価の抗Lag3 aVH−Fcコンストラクト(OSEP緩衝液中1:3希釈、6μg/mlの濃度で開始)を加え、4℃で2時間インキュベートした。洗浄した後(PBST中で1x90μl)、30μl/ウェルのグルタルアルデヒドを、最終濃度0.05%(Sigmaカタログ番号G5882)に室温で10分間添加することによって細胞を固定した。洗浄した後(PBST緩衝液を用いて3x90μl/ウェル)、25μl/ウェルのヤギ抗ヒトIgG H+L−HRP抱合体(Jackson,JIR109−036−088)を1:2000希釈状態で加え、RTで1時間インキュベートした。洗浄した後(PBST緩衝液を用いて3x90μl/ウェル)、25μl/ウェルのTMB基質(Roche、番号11835033001)を加え、6〜10分間インキュベートした。測定をTecan Safire 2機器で、370/492nmで行った。要約すると、全ての試験された分子は、LAG3を組換え発現するCHO細胞に結合した。それらのEC50値は、主にナノモル未満の範囲にあり、非常に強いアビディティを介した結合を示し、ELISAで測定して強い結合が確認された(表14)。
25μl/ウェルのA375細胞(10,000細胞/ウェル)を、組織培地で処理した384ウェルプレート(Corning、3701)に播種し、37℃で一晩インキュベートした。二価の抗Lag3 aVH−Fcコンストラクトを、3μg/mlの抗体濃度で出発して、1:3の希釈率で、細胞培地中でビオチン化Lag3(250ng/ml)を用いて1時間プレインキュベートした。播種した細胞を含むウェルから培地を取り出した後、25μlのaVH−Lag3プレインキュベート混合物をウェルに移し、4℃で2時間インキュベートした。洗浄した後(PBST中で1x90μl)、30μl/ウェルのグルタルアルデヒドを、最終濃度0.05%(Sigmaカタログ番号G5882)に室温で10分間添加することによって細胞を固定した。洗浄した後(PBST緩衝液を用いて3x90μl/ウェル)、25μl/ウェルのポリ−HRP40−ストレプトアビジン(Fitzgerald、65R−S104PHRPx)を1:2000または1:8000希釈状態で加え、RTで1時間インキュベートした。洗浄した後(PBST緩衝液を用いて3x90μl/ウェル)、25μl/ウェルのTMB基質(Roche、番号11835033001)を加え、2〜10分間インキュベートした。測定をTecan Safire 2機器で、370/492nmで行った。コントロール抗体MDX25F7と比較して、いくつかのaVHクローンは、3μg/mlの濃度で同様のまたはさらに優れた阻害と、同等のIC50値を示した。
ヒトLag3を組換え発現するCHO細胞を用いた結合分析に加え、カニクイザルLag3ポジティブHEK細胞への結合も評価した。この実験のために、予めcyno LAG3で一過性トランスフェクションされ、凍結させたHEK293F細胞を解凍し、遠心分離し、PBS/2%FBSに再補充した。1.5x105個の細胞/ウェルを96ウェルプレートに播種した。二価の抗Lag3 aVH−Fc融合コンストラクトのセットを10μg/mlの正規化された最終濃度まで加えた。参照するためにコントロールとして、自己蛍光でポジティブコントロール(MDX 25F7およびMDX 26H10)ならびにアイソタイプコントロール(Sigma製huIgG1、カタログ番号♯I5154)抗体を調製し、この実験で測定した。HEK細胞を、示したaVH−Fcコンストラクトと共に氷上で45分間インキュベートし、200μlの氷冷PBS/2%FBS緩衝液で2回洗浄した後、二次抗体(APC標識されたヤギ抗ヒトIgG−カッパ、Invitrogen、カタログ番号♯MH10515)を加え(FACS緩衝液/ウェルで1:50に希釈)、さらに氷上で30分間インキュベートした。細胞を再び、200μlの氷冷PBS/2%FBS緩衝液で2回洗浄した後、試料を最終的に、150μlのFACS緩衝液に再懸濁させ、FACS CANTO−II HTS Moduleで結合を測定した。
aVH−Fc融合コンストラクトの機能特性
同種異系成熟樹状細胞と共培養されたヒトCD4 T細胞による細胞毒性グランザイムB放出およびIL−2分泌に対するPD−1およびLAG−3ブロックの効果。
以下の実験のために、国際公開第2017/055443 A1号による抗PD−1抗体(0376)を生成し、使用した。PD1−0103_01(0376)のヒト化バリアント−重鎖可変ドメインVHについては配列番号192が参照され、PD1−0103_01(0376)のヒト化バリアント−軽鎖可変ドメインVLについては配列番号193が参照される。
この実験では、活性化したカニクイザルT細胞に発現したLag3への結合を評価した。
抑制されたT細胞応答を回復する際に、Lag3 aVHクローンの中和能力を試験するために、市販のレポーターシステムを使用した。このシステムは、Lag3+NFAT Jurkatエフェクター細胞(Promega、カタログ番号♯CS194801)、MHC−II+Raji細胞(ATCC、♯CLL−86)および超抗原からなる。簡単に言うと、このレポーター系は、以下の3つのステップに基づく:(1)超抗原によって誘発されるNFAT細胞の活性化、(2)MHCII(Raji細胞)とLag3+NFAT Jurkatエフェクター細胞との相互作用によって媒介される活性化シグナルの阻害、(3)Lag3アンタゴニスト/中和aVH−Fc融合コンストラクトによるNFAT活性化シグナルの回復。
上記のNFAT Lag3レポーターアッセイの代替的なバリアントとして、SED刺激およびRaji細胞の非存在下で抗Lag3 aVHs−Fcコンストラクトの影響を評価した。このアッセイでは、Lag−3+Jurkat/NFAT−luc2エフェクターT細胞のみを培養し(=1x105細胞/ウェル)、上記のように単独で、または滴定されたコントロール抗体もしくはいくつかのVH−Fcコンストラクトの存在下で、37℃および5%CO2で20時間培養した後、発光をBioGlo基質の添加後に測定した。
二重特異性抗PD1/抗LAG3抗体様1+1コンストラクトの機能特性
二重特異性抗PD1/抗LAG3二重特異性1+1抗体様コンストラクトの同時係合の後の細胞PD1およびLAG3の二量体化。
二重特異性抗PD1/抗LAG3抗体様1+1コンストラクトを生成した(図2D)。Lag3結合部分は自律性VHドメインであった。これらのコンストラクトの生成のために、PD1軽鎖をコードするプラスミド(配列番号144のDNA配列;配列番号145のタンパク質配列)、PD1重鎖をコードするプラスミド(ホール、PG−LALA)(配列番号142のDNA配列;配列番号143のタンパク質配列)およびaVH−Fc融合体をコードするプラスミドの1つ(ノブ、PG−LALA)(結果として生じる配列番号127(21A3)、配列番号129(P9G1)、配列番号131(P10D1)、配列番号139(P19G3)によるタンパク質配列))をHEK293細胞に共トランスフェクションした。それぞれのPD1−LAG 1+1抗体コンストラクトのインキュベーションおよび精製を、上記のように実施した。コンストラクトを使用して、PD1−LAG3二重特異性コンストラクトの存在下でのPD1およびLAG3の二量体化または少なくとも局所的な共蓄積を分析した。この特異的な相互作用を測定するために、両受容体の細胞質ゾルC末端は、レポーター酵素の異種サブユニットに個々に融合する。1つの酵素サブユニットのみがレポーター活性を示さなかった。しかしながら、両受容体に対する抗PD1/抗Lag3二重特異性抗体コンストラクトの同時結合は、両受容体の局所的な細胞蓄積、2種類の異種酵素サブユニットの相補性を引き起こし、最終的に、基質を加水分解し、それによって、化学発光シグナルを生成する特異的で機能的な酵素が生成すると予想される。
CD4細胞を腫瘍細胞株ARH77と共培養し、i)抗PD1抗体(0376)単独、ii)二価の抗LAG3 aVH−FcコンストラクトもしくはLAG3抗体と組み合わせた抗PD1抗体(0376)、またはiii)二重特異性抗PD1/抗LAG3抗体様コンストラクトを含め、抗体または抗体様コンストラクトでインキュベートした。実験手順は上記(aVH−Fc融合コンストラクトの機能的特性についての説明)のように実施した。5日後、細胞を洗浄し、細胞を洗浄し、その表面を、抗ヒトCD4抗体およびLive/Dead fixable dye Aqua(Invitrogen)で染色した後、Fix/Perm緩衝液(BD Bioscience)で固定/透過処理した。その後、細胞内染色を、グランザイムB(BD Bioscience)について実施した。
本発明が提供する更なる態様では、自律性VHドメインは、Kabat番号付けによる(i)52a位および71位または(ii)33位および52位にシステインを含み、前記システインは適切な条件下でジスルフィド結合を形成する。特に、自律性VHドメインは単離された自律性VHドメインである。自律性VHドメインは安定性が向上している。
(a)配列番号207のアミノ酸配列を含むFR1と、
(b)配列番号208のアミノ酸配列を含むFR2と、
(c)配列番号209のアミノ酸配列を含むFR3と、
(d)配列番号210のアミノ酸配列を含むFR4と、
または
(a)配列番号211のアミノ酸配列を含むFR1と、
(b)配列番号208のアミノ酸配列を含むFR2と、
(c)配列番号209のアミノ酸配列を含むFR3と、
(d)配列番号210のアミノ酸配列を含むFR4と
を含む重鎖可変ドメインフレームワーク
(i)配列番号212のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号213のアミノ酸配列を含むCDR2、および配列番号214のアミノ酸配列を含むCDR3;または
(ii)配列番号215のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号216のアミノ酸配列を含むCDR2、および配列番号217のアミノ酸配列を含むCDR3;または
(iii)配列番号218のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号219のアミノ酸配列を含むCDR2、および配列番号220のアミノ酸配列を含むCDR3、または
(iv)配列番号221のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号222のアミノ酸配列を含むCDR2、および配列番号223のアミノ酸配列を含むCDR3;または
(v)配列番号224のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号225のアミノ酸配列を含むCDR2、および配列番号226のアミノ酸配列を含むCDR3。
(i)配列番号227のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号228のアミノ酸配列を含むCDR2、および配列番号229のアミノ酸配列を含むCDR3;または
(ii)配列番号230のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号231のアミノ酸配列を含むCDR2、および配列番号232のアミノ酸配列を含むCDR3;または
(iii)配列番号233のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号234のアミノ酸配列を含むCDR2、および配列番号235のアミノ酸配列を含むCDR3;または
(iv)配列番号236のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号237のアミノ酸配列を含むCDR2、および配列番号238のアミノ酸配列を含むCDR3;または
(v)配列番号239のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号240のアミノ酸配列を含むCDR2、および配列番号241のアミノ酸配列を含むCDR3;または
(vi)配列番号242のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号243のアミノ酸配列を含むCDR2、および配列番号244のアミノ酸配列を含むCDR3;または
(vii)配列番号245のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号246のアミノ酸配列を含むCDR2、および配列番号247のアミノ酸配列を含むCDR3。
Claims (35)
- LAG3に結合する第1の抗原結合部位を含む二重特異性または多重特異性抗体であって、前記第1の抗原結合部位が自律性VHドメインである、二重特異性または多重特異性抗体。
- PD1に結合する第2の抗原結合部位を含む、請求項1に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
- 前記自律性VHドメインが、Kabat番号付けによる(i)52a位および71位または(ii)33位および52位にシステインを含み、前記システインが適切な条件下でジスルフィド結合を形成する、請求項1または2に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
- LAG3に結合する前記自律性VHドメインが、
(i)配列番号146の配列を有するCDR1、配列番号147の配列を有するCDR2、および配列番号148の配列を有するCDR3;または
(ii)配列番号149の配列を有するCDR1、配列番号150の配列を有するCDR2、および配列番号151の配列を有するCDR3;または
(iii)配列番号152の配列を有するCDR1、配列番号153の配列を有するCDR2、および配列番号154の配列を有するCDR3;または
(iv)配列番号155の配列を有するCDR1、配列番号156の配列を有するCDR2、および配列番号157の配列を有するCDR3;または
(v)配列番号158の配列を有するCDR1、配列番号159の配列を有するCDR2、および配列番号160の配列を有するCDR3;または
(vi)配列番号161の配列を有するCDR1、配列番号162の配列を有するCDR2、および配列番号163の配列を有するCDR3;または
(vii)配列番号164の配列を有するCDR1、配列番号165の配列を有するCDR2、および配列番号166の配列を有するCDR3;または
(viii)配列番号167の配列を有するCDR1、配列番号168の配列を有するCDR2、および配列番号169の配列を有するCDR3;または
(ix)配列番号170の配列を有するCDR1、配列番号171の配列を有するCDR2、および配列番号172の配列を有するCDR3;または
(x)配列番号173の配列を有するCDR1、配列番号174の配列を有するCDR2、および配列番号175の配列を有するCDR3;または
(xi)配列番号176の配列を有するCDR1、配列番号177の配列を有するCDR2、および配列番号178の配列を有するCDR3
を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体。 - 前記自律性VHドメインが、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83、配列番号85、配列番号87、配列番号89、配列番号91、配列番号93、配列番号95、配列番号97からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
- 前記自律性VHドメインが、H35G、Q39R、L45EおよびW47Lからなる群から選択される置換をさらに含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
- 前記自律性VHドメインが、L45T、K94SおよびL108Tからなるリストから選択される置換をさらに含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
- 前記自律性VHドメインが、特にハーセプチン(登録商標)(トラスツズマブ)のVHフレームワークに基づく、VH3_23ヒトフレームワークを含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
- 前記PD1に結合する第2の抗原結合部位が、
(i)配列番号201のアミノ酸配列を含むCDR−H1と、
(ii)配列番号202のアミノ酸配列を含むCDR−H2と、
(iii)配列番号203のアミノ酸配列を含むCDR−H3と
を含むVHドメイン;および
(i)配列番号204のアミノ酸配列を含むCDR−L1と、
(ii)配列番号205のアミノ酸配列を含むCDR−L2と、
(iii)配列番号206のアミノ酸配列を含むCDR−L3と
を含むVLドメインを含む、請求項2から8のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体。 - 前記PD1に結合する第2の抗原結合部位が、配列番号192のアミノ酸配列を含むVHドメインおよび/または配列番号193のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む、請求項2から9のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
- 前記二重特異性または多重特異性抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項1から10のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
- 前記二重特異性または多重特異性抗体が、Fcドメインおよび前記PD1に結合する第2の抗原結合部位を含むFab断片を含む、請求項2から11のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
- 前記FcドメインがIgG、特にIgG1 FcドメインまたはIgG4 Fcドメインである、請求項12に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
- 前記Fcドメインが、Fc受容体、特にFcγ受容体に対する結合を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項12または13に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
- 前記Fcドメインが、アミノ酸変異L234A、L235AおよびP329G(Kabat EUインデックスによる番号付け)を有するヒトIgG1サブクラスのものである、請求項12から14のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
- 前記Fcドメインが、前記Fcドメインの第1および第2のサブユニットの会合を促進する修飾を含む、請求項12から15のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
- ノブ・イントゥ・ホール(knobs−into−holes)技術に従って、前記Fcドメインの前記第1のサブユニットがノブを含み、前記Fcドメインの前記第2のサブユニットがホールを含む、請求項12から16のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
- 前記Fcドメインの前記第1のサブユニットが、アミノ酸置換S354CおよびT366W(Kabat EUインデックスによる番号付け)を含み、前記Fcドメインの前記第2のサブユニットが、アミノ酸置換Y349C、T366SおよびY407V(Kabat EUインデックスによる番号付け)を含む、請求項12から17のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
- 前記Fcドメインが、前記aVHドメインのC末端に融合され、前記融合体は、配列番号99、配列番号101、配列番号103、配列番号105、配列番号107、配列番号109、配列番号111、配列番号113、配列番号115、配列番号117、配列番号117からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に、配列番号105、配列番号107、配列番号109、配列番号111からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項12から17のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
- 前記PD1に結合する抗原結合部位を含む前記Fab断片の可変ドメインVLおよびVHが互いに置き換えられている、請求項12から18のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
- 前記Fab断片の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸が、独立して、リシン(K)、アルギニン(R)またはヒスチジン(H)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、前記Fab断片の定常ドメインCH1において、147位および213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)、請求項12から19のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
- (a)配列番号192の配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号193の配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第1の軽鎖、配列番号99、配列番号101、配列番号103、配列番号105、配列番号107、配列番号109、配列番号111、配列番号113、配列番号115、配列番号117、配列番号117からなる群から選択される配列、特に、配列番号105、配列番号107、配列番号109、配列番号111からなる群から選択される配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第2の重鎖を含む、請求項1から21のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
- (a)配列番号143の配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖、または配列番号145の配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、および
(b)配列番号99、配列番号101、配列番号103、配列番号105、配列番号107、配列番号109、配列番号111、配列番号113、配列番号115、配列番号117、配列番号117からなる群から選択される配列、特に、配列番号105、配列番号107、配列番号109、配列番号111からなる群から選択される配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第2の重鎖を含む、請求項1から21のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体。 - 請求項1から23のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項24に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター、特に発現ベクター。
- 請求項24に記載のポリヌクレオチドまたは請求項25に記載のベクターを含む、宿主細胞、特に真核生物または原核生物の宿主細胞。
- 請求項1から23のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を産生するための方法であって、
(a)前記二重特異性または多重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含む少なくとも1つのベクターで宿主細胞を形質転換するステップ、
(b)前記宿主細胞を前記二重特異性または多重特異性抗体の発現に適した条件下で培養するステップ、および任意に
(c)培養物、特に宿主細胞から前記二重特異性または多重特異性抗体を回収するステップ
を含む、方法。 - 請求項1から23のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体と、少なくとも1つの医薬的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
- 医薬として使用するための、請求項1から23のいずれか一項に記載の二重特異性もしくは多重特異性抗体または請求項28に記載の医薬組成物。
- i)免疫応答の調節、例えば、T細胞活性の回復において、
ii)免疫応答または機能の刺激において、
iii)感染の処置において、
iv)癌の処置において、
v)癌の進行を遅らせることにおいて、
vi)癌を患う患者の生存を延長することにおいて
使用するための、請求項1から23のいずれか一項に記載の二重特異性もしくは多重特異性抗体または請求項28に記載の医薬組成物。 - 癌の予防または処置に使用するための、請求項1から23のいずれか一項に記載の二重特異性もしくは多重特異性抗体または請求項28に記載の医薬組成物。
- 慢性ウイルス感染の処置に使用するための、請求項1から23のいずれか一項に記載の二重特異性もしくは多重特異性抗体または請求項28に記載の医薬組成物。
- 前記二重特異性または多重特異性抗体が、癌免疫療法で使用するための化学療法剤、放射線および/または他の薬剤と組み合わせて投与される、癌の予防または処置に使用するための、請求項1から23のいずれか一項に記載の二重特異性もしくは多重特異性抗体または請求項28に記載の医薬組成物。
- 個体において腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、前記腫瘍細胞の増殖を阻害するために、有効量の請求項1から23のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体を前記個体に投与することを含む、方法。
- 本明細書で上に記載するような発明。
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