JP6997212B2 - Ｐｄ１及びｌａｇ３に特異的に結合する二重特異性抗体 - Google Patents

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Description

本発明は、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む、二重特異性抗体に関し、特に、Ｆｃ受容体、特に、Ｆｃγ受容体に対する結合を低下させる１つ以上のアミノ酸を含むＦｃドメインを更に含む二重特異性抗体に関する。本発明は更に、これらの分子を製造する方法、及びこれらを使用する方法に関する。
癌（がん）に対する防御における免疫系の重要性は、免疫系が異常細胞を検出し、破壊する能力に基づく。しかし、ある種の腫瘍細胞は、免疫抑制状態を作り出すことによって、免疫系から逃れることができる（Ｚｉｔｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６（２００６），７１５-７２７）。Ｔ細胞は、抗ウイルス性及び抗腫瘍性の免疫応答において、重要な役割をもつ。抗原特異性Ｔ細胞の適切な活性化によって、そのクローン性増殖及びエフェクター機能の獲得が起こり、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の場合には、ＣＴＬによって標的細胞を特異的に溶解することができる。Ｔ細胞は、全ての細胞内コンパートメント中のタンパク質に由来するペプチドの選択的な認識に関する能力、抗原発現細胞を直接的に認識し、死滅させる能力（細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）としても知られている、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞による）、及び多様な免疫応答を調整し（ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞による）、獲得エフェクター機構と自然エフェクター機構とを統合する能力に起因して、内因性抗腫瘍免疫を治療的に操作するための努力に主に注目されている。Ｔ細胞の機能不全は、長期にわたる抗原曝露の結果として生じる。Ｔ細胞は、抗原存在下で増殖する能力を失い、漸進的にサイトカインを産生できなくなり、標的細胞１を溶解できなくなる。機能不全のＴ細胞は、疲弊したＴ細胞と呼ばれており、増殖することができず、抗原刺激に応答して細胞毒性及びサイトカイン分泌などのエフェクター機能を発揮することができない。更なる研究は、疲弊したＴ細胞は、阻害分子ＰＤ－１（プログラム細胞死タンパク質１）の継続的な発現によって特徴付けられ、ＬＣＭＶ感染マウスにおいて、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１（ＰＤ－１リガンド）の相互作用の遮断によって、Ｔ細胞の疲弊を逆行させ、抗原特異的なＴ細胞応答を回復させることができることを特定した（Ｂａｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４３９（２００６），６８２－６８７）。しかし、ＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１経路のみを標的としても、常にＴ細胞疲弊の逆行が常に起こるわけではなく（Ｇｅｈｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １３７（２００９）、６８２－６９０）、このことは、他の分子がおそらくＴ細胞疲弊に関与していることを示している（Ｓａｋｕｉｓｈｉ、Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄ．２０７（２０１０）、２１８７－２１９４）。
リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ３又はＣＤ２２３）は、ＩＬ－２依存性ＮＫ細胞株で発現する分子を選択的に単離するように設計された実験で、最初に発見された（Ｔｒｉｅｂｅｌ Ｆ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．２３５（２００６），１４７－１５３）。ＬＡＧ３は、ＣＤ４に対して構造相同性を有し、４つの細胞外免疫グロブリンスーパーファミリー様ドメイン（Ｄ１～Ｄ４）を有する、固有の膜貫通タンパク質である。この膜の遠位にあるＩｇＧドメインは、短いアミノ酸配列（他のＩｇＧスーパーファミリータンパク質にはみられない、いわゆるエキストラループ）を含む。細胞内ドメインは、ＬＡＧ３がＴ細胞機能に対して負の影響を与えることが必要とされる固有のアミノ酸配列（ＫＩＥＥＬＥ、配列番号７５）を含む。ＬＡＧ３は、メタロプロテアーゼによって接続ペプチド（ＣＰ）で開裂され、可溶性形態を生成することができ、この形態は、血清中で検出可能である。ＣＤ４と同様に、ＬＡＧ３タンパク質は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するが、アフィニティは、より高く、ＣＤ４とは別の部位で結合する（Ｈｕａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４（１９９７）、５７４４－５７４９）。ＬＡＧ３は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及び形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）で発現し、Ｔ細胞活性化に従ってアップレギュレーションする。ＬＡＧ３は、Ｔ細胞の機能とＴ細胞のホメオスタシスを調節する。免疫不応答性であるか、又は機能不全を示す従来のＴ細胞の一部は、ＬＡＧ３を発現する。ＬＡＧ３＋Ｔ細胞は、腫瘍部位に、また、慢性ウイルス感染中に豊富に含まれる（Ｓｉｅｒｒｏ ｅｔ ａｌ Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒｇｅｔｓ １５（２０１１）、９１－１０１）。ＬＡＧ３は、ＣＤ８ Ｔ細胞の疲弊において、ある役割を果たすことが示されている（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０（２００９）、２９－３７）。従って、ＬＡＧ３の活性をアンタゴナイズし、腫瘍に対する免疫応答を生成し、回復させるために使用可能な抗体が必要とされている。
ＬＡＧ３に対するモノクローナル抗体は、例えば、ＷＯ ２００４／０７８９２８号に記載されており、ＣＤ２２３に特異的に結合する抗体と抗癌ワクチンとを含む組成物が請求されている。ＷＯ ２０１０／０１９５７０号は、ＬＡＧ３に結合するヒト抗体（例えば、抗体２５Ｆ７及び２６Ｈ１０）を開示する。ＵＳ ２０１１／０７０２３８号は、臓器移植拒絶及び自己免疫疾患の治療又は予防に有用な細胞毒性抗ＬＡＧ３抗体に関する。ＷＯ ２０１４／００８２１８号は、抗体２５Ｆ７と比較して、最適化された機能特性（すなわち、脱アミノ化部位の減少）を有するＬＡＧ３抗体を記載する。更に、ＬＡＧ３抗体は、ＷＯ ２０１５／１３８９２０号（例えば、ＢＡＰ０５０）、ＷＯ ２０１４／１４０１８０号、ＷＯ ２０１５／１１６５３９号、ＷＯ ２０１６／０２８６７２号、ＷＯ ２０１６／１２６８５８号、ＷＯ ２０１６／２００７８２号及びＷＯ ２０１７／０１５５６０号に開示される。
プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１又はＣＤ２７９）は、受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害性メンバーであり、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ及びＢＴＬＡも含まれる。ＰＤ－１は、細胞表面受容体であり、活性化されたＢ細胞、Ｔ細胞及び骨髄細胞で発現している（Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：３９１７７９－８２；Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７０：７１１－８）。ＰＤ－１の構造は、１つの免疫グロブリン可変様の細胞外ドメインと、免疫受容体阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）及び免疫受容体チロシンに基づくスイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を含む細胞質ドメインとからなるモノマー型１膜貫通タンパク質である。活性化されたＴ細胞は、一時的にＰＤ１を発現するが、ＰＤ１及びそのリガンドＰＤＬ１の持続的な超発現は、免疫の疲弊を促進し、ウイルス感染、腫瘍回避を持続させ、感染及び致死を増やす。ＰＤ１発現は、Ｔ細胞受容体による抗原認識によって誘発され、その発現は、主に、連続的なＴ細胞受容体シグナル伝達によって維持される。長期間抗原に曝露した後、ＰＤ１の遺伝子座は、再メチル化することができず、連続的な超発現を促進する。ＰＤ１経路をブロックすると、癌及び慢性ウイルス感染において、疲弊したＴ細胞の機能を回復させることができる（Ｓｈｅｒｉｄａｎ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３０（２０１２）、７２９－７３０）。ＰＤ－１に対するモノクローナル抗体は、例えば、ＷＯ ２００３／０４２４０２号、ＷＯ ２００４／００４７７１号、ＷＯ ２００４／０５６８７５号、ＷＯ ２００４／０７２２８６号、ＷＯ ２００４／０８７１９６号、ＷＯ ２００６／１２１１６８号、ＷＯ ２００６／１３３３９６号、ＷＯ ２００７／００５８７４号、ＷＯ ２００８／０８３１７４号、ＷＯ ２００８／１５６７１２号、ＷＯ ２００９／０２４５３１号、ＷＯ ２００９／０１４７０８号、ＷＯ ２００９／１０１６１１号、ＷＯ ２００９／１１４３３５号、ＷＯ ２００９／１５４３３５号、ＷＯ ２０１０／０２７８２８号、ＷＯ ２０１０／０２７４２３号、ＷＯ ２０１０／０２９４３４号、ＷＯ ２０１０／０２９４３５号、ＷＯ ２０１０／０３６９５９号、ＷＯ ２０１０／０６３０１１号、ＷＯ ２０１０／０８９４１１号、ＷＯ ２０１１／０６６３４２号、ＷＯ ２０１１／１１０６０４号、ＷＯ ２０１１／１１０６２１号、ＷＯ ２０１２／１４５４９３号、ＷＯ ２０１３／０１４６６８号、ＷＯ ２０１４／１７９６６４号、ＷＯ ２０１５／１１２９００号に記載されている。
癌又は細菌、真菌又はウイルスなどの病原体に関連する疾患の処置に使用するためのＰＤ１及びＬＡＧ３との免疫反応性を有する二重特異性Ｆｃダイアボディは、ＷＯ ２０１５／２００１１９号に記載される。しかし、ＰＤ１及びＬＡＧ３に同時に結合し、ＰＤ１及びＬＡＧ３を両方とも発現する細胞を選択的に標的化するだけではなく、ＬＡＧ３の広範囲にわたる発現パターンが与えられる他の細胞に対してＬＡＧ３のブロックを避ける新規な二重特異性抗体を提供する必要がある。本発明の二重特異性抗体は、ＰＤ１及びＬＡＧ３を過剰発現するＴ細胞に対して、ＰＤ１及びＬＡＧ３を効率的にブロックするだけではなく、これらの細胞に対して非常に選択的であり、それによって、非常に活性なＬＡＧ３抗体を投与することによる副作用が避けられるだろう。
本発明は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインと、リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ３）に特異的に結合する少なくとも１つの第２の抗原結合ドメインとを含む、二重特異性抗体に関する。これらの二重特異性抗体は、より良い選択性を与え、潜在的に、抗ＰＤ１及び抗ＬＡＧ３の組み合わせ戦略よりも有効性が高いため、有利である。これらの二重特異性抗体は、更に、シンク効果の低下（Ｔ細胞によるインターナリゼーションの低下によって示されるような）を示すことを特徴とし、これらの二重特異性抗体は、従来のＴ細胞に対して、Ｔｒｅｇに対するよりも優先的に結合し、Ｔｒｅｇ抑制からＴ細胞エフェクター機能を守ることができ、腫瘍特異的なＴ細胞エフェクター機能の増加及びｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍根絶の増加を示す。
一態様では、本発明は、二重特異性抗体であって、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ３）に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、
前記ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３とを含むＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３とを含むＶＬドメインとを含む、二重特異性抗体を提供する。
特に、二重特異性抗体であって、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ３）に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、二重特異性抗体が、ＩｇＧであるＦｃドメイン、特に、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含み、Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体に対する結合を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、二重特異性抗体が提供される。
一態様では、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインが、
（ａ）
（ｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３とを含むＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３とを含むＶＬドメインとを含むか、又は
（ｂ）
（ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３とを含むＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３とを含むＶＬドメインとを含むか、又は
（ｃ）
（ｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３とを含むＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３とを含むＶＬドメインとを含むか、又は
（ｄ）
（ｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３とを含むＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３とを含むＶＬドメインとを含むか、又は
（ｅ）
（ｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３とを含むＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３とを含むＶＬドメインとを含む、二重特異性抗体が提供される。
別の態様では、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｃ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｄ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｅ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、二重特異性抗体が提供される。
特定の態様では、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが、配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、二重特異性抗体が提供される。
更なる態様では、二重特異性抗体であって、本明細書で上に記載したような、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｃ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｄ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｅ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、二重特異性抗体が提供される。
更なる態様では、二重特異性抗体であって、本明細書で上に記載したような、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｃ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号６５のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｄ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、二重特異性抗体が提供される。
更に、二重特異性抗体であって、本明細書で上に記載したような、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、
ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが、配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含み、
ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインが、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、二重特異性抗体が提供される。
更なる態様では、二重特異性抗体であって、本明細書で上に記載したような、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、
ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが、配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含み、
ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインが、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、二重特異性抗体が提供される。
別の態様では、二重特異性抗体であって、本明細書で上に記載したような、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、
ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが、配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含み、
ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインが、配列番号５６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、二重特異性抗体が提供される。
更なる態様では、二重特異性抗体であって、本明細書で上に記載したような、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、二重特異性抗体が、ヒト化抗体又はキメラ抗体である、二重特異性抗体が提供される。特に、二重特異性抗体は、ヒト化抗体である。
特定の態様では、二重特異性抗体であって、本明細書で上に記載したような、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、二重特異性抗体が、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を有するヒトＩｇＧ１サブクラスのドメインのＦｃドメインを含む、二重特異性抗体が提供される。
更に、二重特異性抗体であって、本明細書で上に記載したような、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、二重特異性抗体が、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する改変を含むＦｃドメインを含む、二重特異性抗体が提供される。一態様では、二重特異性抗体であって、ホールにノブを入れる方法に従って、Ｆｃドメインの第１のサブユニットがノブを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットがホールを含む、二重特異性抗体が提供される。特に、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
更なる態様では、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、二重特異性抗体が、Ｆｃドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第１のＦａｂフラグメントと、ＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第２のＦａｂフラグメントとを含む、二重特異性抗体が提供される。
一態様では、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、Ｆａｂフラグメントの１つにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨは、ＶＨドメインが軽鎖の一部であり、ＶＬドメインが重鎖の一部であるように互いに置き換わっている、二重特異性抗体が提供される。特に、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第１のＦａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨは、互いに置き換わっている、二重特異性抗体が提供される。
別の態様では、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、二重特異性抗体が、Ｆａｂフラグメントを含み、定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１において、位置１４７及び２１３のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、二重特異性抗体が提供される。特に、二重特異性抗体であって、ＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第２のＦａｂフラグメントの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１において、位置１４７及び２１３のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、二重特異性抗体が提供される。
特定の態様では、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、
（ａ）配列番号９６の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号９８の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、
配列番号９７の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号９９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｂ）配列番号９６の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号９８の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、
配列番号１００の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｃ）配列番号１０２の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１０４の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、
配列番号１０３の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｄ）配列番号１０６の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１０７の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、
配列番号１０３の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む、二重特異性抗体が提供される。
より特定的には、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、配列番号９６の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号９８の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号１００の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性抗体が提供される。
別の態様では、二重特異性抗体であって、本明細書で上に記載したような、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、二重特異性抗体が、ＦｃドメインのＣ末端に融合するＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含むＦａｂフラグメントを含む、二重特異性抗体が提供される。
特に、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、配列番号９６の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号９８の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号１４４の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性抗体が提供される。
更なる態様では、二重特異性抗体であって、本明細書で上に記載したような、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、二重特異性抗体が、ＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第３のＦａｂフラグメントを含む、二重特異性抗体が提供される。一態様では、二重特異性抗体であって、それぞれＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む２つのＦａｂフラグメントが同一である、二重特異性抗体が提供される。
別の態様では、二重特異性抗体であって、本明細書で上に記載したような、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含むＦａｂフラグメントが、重鎖の１つのＣ末端にペプチドリンカーを介して融合している、二重特異性抗体が提供される。
特定の態様では、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、
（ａ）配列番号１１８の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１１５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、
配列番号１１９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む２つの第２の軽鎖、又は
（ｂ）配列番号１２０の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１１５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、
配列番号１２１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号９９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む２つの第２の軽鎖、又は
（ｃ）配列番号１２２の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１１５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、
配列番号１０３の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む２つの第２の軽鎖を含む、二重特異性抗体が提供される。
別の態様では、二重特異性抗体であって、本明細書で上に記載したような、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、ＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含むＦａｂフラグメントの１つが、重鎖の１つのＣ末端にペプチドリンカーを介して融合している、二重特異性抗体が提供される。
特定の態様では、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、配列番号９６の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号９８の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号１４５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む２つの第２の軽鎖とを含む、二重特異性抗体が提供される。
更なる態様では、二重特異性抗体であって、本明細書で上に記載したような、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、二重特異性抗体が、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第４のＦａｂフラグメントを含む、二重特異性抗体が提供される。一態様では、二重特異性抗体であって、それぞれＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む２つのＦａｂフラグメントが同一である、二重特異性抗体が提供される。
別の態様では、二重特異性抗体であって、本明細書で上に記載したような、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインをそれぞれ含む２つのＦａｂフラグメントが、それぞれ、重鎖の１つのＣ末端にペプチドリンカーを介してそれぞれ融合している、二重特異性抗体が提供される。
特定の態様では、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、
（ａ）配列番号１１４の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの重鎖と、配列番号１１５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの第１の軽鎖と、配列番号１０１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの第２の軽鎖、又は
（ｂ）配列番号１１６の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの重鎖と、配列番号１１５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの第１の軽鎖と、配列番号９９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの第２の軽鎖、又は
（ｃ）配列番号１１７の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの重鎖と、配列番号１１５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの第１の軽鎖と、配列番号１０５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む２つの第２の軽鎖を含む、二重特異性抗体が提供される。
更なる別の態様では、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、二重特異性抗体が、Ｆｃドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインをそれぞれ含む２つのＦａｂフラグメントと、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む短鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）とを含む、二重特異性抗体が提供される。特に、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含むｓｃＦａｂは、重鎖の１つのＣ末端にペプチドリンカーを介して融合している。
特定の態様では、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、
（ａ）配列番号１２３の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１１９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、又は
（ｂ）配列番号１２４の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１２１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号９９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの軽鎖、又は
（ｃ）配列番号１２５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１０３の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む、二重特異性抗体が提供される。
更なる別の態様では、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、二重特異性抗体が、Ｆｃドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインをそれぞれ含む２つのＦａｂフラグメントと、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含むＶＨ及びＶＬドメインとを含む、二重特異性抗体が提供される。一態様では、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインのＶＨドメインは、重鎖の１つのＣ末端にペプチドリンカーを介して融合しており、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインのＶＬドメインは、重鎖のもう一方のＣ末端にペプチドリンカーを介して融合している。特定の態様では、二重特異性抗体であって、配列番号１２６の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１２７の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの軽鎖を含む、二重特異性抗体が提供される。
本発明の別の態様によれば、本明細書で上に記載したような、二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドが提供される。本発明は、更に、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、特に、発現ベクターと、本発明のポリヌクレオチドと、本発明のポリヌクレオチド又はベクターを含む原核生物又は真核生物の宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、真核生物細胞、特に、哺乳動物細胞である。
別の態様では、本明細書に記載するＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体を製造する方法であって、（ａ）宿主細胞を、前記二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換する工程と、（ｂ）前記二重特異性抗体の発現に適した条件に従って、前記宿主細胞を培養する工程と、（ｃ）培養物から前記二重特異性抗体を回収する工程とを含む、方法が提供される。本発明は、本発明の方法によって製造される二重特異性抗体も包含する。
本発明は、更に、本明細書に記載するＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体と、少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物を提供する。
更に本発明に包含されるのは、医薬として使用するための、本明細書に記載するＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体、又は前記二重特異性抗体を含む医薬組成物である。
別の態様では、本発明は、本明細書で上に記載したような、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、二重特異性抗体が、ヒト化抗体又はキメラ抗体である、二重特異性抗体、又は二重特異性抗体を含む医薬組成物であって、
（ｉ）免疫応答の調節、例えば、Ｔ細胞活性の回復において、
（ｉｉ）免疫応答又は機能の刺激において、
（ｉｉｉ）感染の処置において、
（ｉｖ）癌の処置において、
（ｖ）癌の進行を遅らせることにおいて、
（ｖｉ）癌を患う患者の生存を延長することにおいて使用するための二重特異性抗体又は医薬組成物を提供する。
一態様では、必要とする個体における疾患の処置に使用するための、本明細書で記載したような、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体、又は二重特異性抗体を含む医薬組成物を提供する。具体的な態様では、本発明は、癌の処置に使用するための、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体、又は二重特異性抗体を含む医薬組成物を提供する。更なる具体的な態様では、免疫応答の調節に使用するための、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体、又は二重特異性抗体を含む医薬組成物が提供される。別の態様では、慢性ウイルス感染の処置に使用するための、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体、又は二重特異性抗体を含む医薬組成物が提供される。
本発明はまた、本発明で使用するか、又は癌の処置に使用するための、本明細書に記載するＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体、又は二重特異性抗体を含む医薬組成物も提供し、ここで、二重特異性抗体は、癌免疫療法に使用するために、化学療法剤、放射線及び／又は他の薬剤と組み合わせて投与される。特定の態様では、本発明で使用するか、又は癌の処置に使用するための、本明細書に記載するＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体、又は二重特異性抗体を含む医薬組成物が提供され、ここで、二重特異性抗体は、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて投与される。
必要とする個体における疾患の処置のための医薬を製造するための、特に、癌を治療するための医薬を製造するための、本明細書に記載するＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体の使用、及び個体において、ある疾患を治療する方法であって、前記個体に、治療有効量の本明細書に記載するＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体を医薬的に許容される形態で含む組成物を投与することを含む方法も提供される。特定の態様では、疾患は、癌である。別の特定の態様では、疾患は、慢性ウイルス感染である。別の態様では、個体において免疫応答を調節する方法であって、治療有効量の本明細書に記載するＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体を含む組成物を、医薬的に許容される形態で前記個体に投与することを含む方法が提供される。上の態様のいずれかにおいて、個体は、好ましくは哺乳動物であり、特にヒトである。
本発明はまた、本発明で使用するか、又は癌の処置に使用するための、本明細書に記載するＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体、又は二重特異性抗体を含む医薬組成物も提供し、ここで、二重特異性抗体は、癌免疫療法に使用するために、化学療法剤、放射線及び／又は他の薬剤と組み合わせて投与される。
更に、個体において腫瘍細胞の成長を阻害する方法であって、前記個体に、有効量の本明細書に記載するＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体を投与し、腫瘍細胞の成長を阻害することを含む方法が提供される。個体は、好ましくは哺乳動物であり、特にヒトである。
本明細書に記載する二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体の異なるフォーマットの模式図。図１Ａは、二重特異性１＋１フォーマットを示し、ここで、ＰＤ１結合ドメインは、ｃｒｏｓｓＦａｂ（ＶＨ／ＶＬドメインの交換）を含み、ＬＡＧ３結合ドメインは、正しい対形成を補助するために、アミノ酸変異を有するＣＨ１ドメインとＣＫドメインを含む（「帯電したバリアント」）。Ｆｃ部分は、ホールにノブを入れる変異（黒色矢印によって示される）と、ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほとんど完全に無効にする（白色領域によって示される）アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇとを含む。図１Ｂは、ＣＨ１／ＣＫに変異を含む２つの抗ＬＡＧ３結合Ｆａｂドメインと、１つの重鎖のＣ末端に融合したＰＤ１結合Ｆａｂドメインとを有する、２＋１フォーマットを示す。図１Ｃは、ＣＨ１／ＣＫに変異を含む２つの抗ＬＡＧ３結合ＦＡＢドメインを含むが、１つの重鎖のＣ末端に融合したＰＤ１結合一本鎖ｓｃＦａｂドメインを含む、同様の２＋１フォーマットを示す。図１Ｄには、２つの抗ＬＡＧ３結合Ｆａｂドメインと、重鎖のＣ末端の１つにそれぞれ融合したＰＤ１結合ＶＨ及びＶＬを含む、２＋１フォーマットが示される。図１Ｅは、図１Ｄと同様の構築物を示すが、ＶＨとＶＬとの間の操作されたジスルフィド結合を有し、図１Ｆは、フリン部位を有するバリアントが示されている。図１Ｇは、ＣＨ１／ＣＫに変異を含む２つの抗ＬＡＧ３結合Ｆａｂドメインと、各重鎖のＣ末端に融合した２つのＰＤ１結合ｃｒｏｓｓＦａｂドメインとを含む、二重特異性２＋２フォーマットを示す。図１Ｈには、二重特異性１＋１フォーマットが示され（「ｔｒａｎｓ」と呼ばれる）、ここで、ＰＤ１結合ドメインは、ｃｒｏｓｓＦａｂ（ＶＨ／ＶＬドメインの交換を含む）を含み、ＬＡＧ３結合ドメインは、Ｆｃホール鎖のＣ末端で、そのＶＨドメインと融合している。Ｌａｇ３ドメインは、正しい対形成を補助するためにアミノ酸変異を有する、ＣＨ１ドメイン及びＣＫドメインを含む（「帯電したバリアント」）。図１Ｉは、２＋１フォーマットを示し、ここで、ＰＤ１結合ドメインは、ｃｒｏｓｓＦａｂ（ＶＨ／ＶＬドメインの交換）と、正しい対形成を補助するためにアミノ酸変異を有するＣＨ１ドメイン及びＣＫドメインを含む１つのＬＡＧ３結合ドメイン（「帯電したバリアント」）とを含み、第２のＬＡＧ３結合ドメインは、Ｆｃホール鎖のＣ末端で、そのＶＨドメインと融合している。 本明細書に記載する二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体の異なるフォーマットの模式図。図１Ａは、二重特異性１＋１フォーマットを示し、ここで、ＰＤ１結合ドメインは、ｃｒｏｓｓＦａｂ（ＶＨ／ＶＬドメインの交換）を含み、ＬＡＧ３結合ドメインは、正しい対形成を補助するために、アミノ酸変異を有するＣＨ１ドメインとＣＫドメインを含む（「帯電したバリアント」）。Ｆｃ部分は、ホールにノブを入れる変異（黒色矢印によって示される）と、ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほとんど完全に無効にする（白色領域によって示される）アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇとを含む。図１Ｂは、ＣＨ１／ＣＫに変異を含む２つの抗ＬＡＧ３結合Ｆａｂドメインと、１つの重鎖のＣ末端に融合したＰＤ１結合Ｆａｂドメインとを有する、２＋１フォーマットを示す。図１Ｃは、ＣＨ１／ＣＫに変異を含む２つの抗ＬＡＧ３結合ＦＡＢドメインを含むが、１つの重鎖のＣ末端に融合したＰＤ１結合一本鎖ｓｃＦａｂドメインを含む、同様の２＋１フォーマットを示す。図１Ｄには、２つの抗ＬＡＧ３結合Ｆａｂドメインと、重鎖のＣ末端の１つにそれぞれ融合したＰＤ１結合ＶＨ及びＶＬを含む、２＋１フォーマットが示される。図１Ｅは、図１Ｄと同様の構築物を示すが、ＶＨとＶＬとの間の操作されたジスルフィド結合を有し、図１Ｆは、フリン部位を有するバリアントが示されている。図１Ｇは、ＣＨ１／ＣＫに変異を含む２つの抗ＬＡＧ３結合Ｆａｂドメインと、各重鎖のＣ末端に融合した２つのＰＤ１結合ｃｒｏｓｓＦａｂドメインとを含む、二重特異性２＋２フォーマットを示す。図１Ｈには、二重特異性１＋１フォーマットが示され（「ｔｒａｎｓ」と呼ばれる）、ここで、ＰＤ１結合ドメインは、ｃｒｏｓｓＦａｂ（ＶＨ／ＶＬドメインの交換を含む）を含み、ＬＡＧ３結合ドメインは、Ｆｃホール鎖のＣ末端で、そのＶＨドメインと融合している。Ｌａｇ３ドメインは、正しい対形成を補助するためにアミノ酸変異を有する、ＣＨ１ドメイン及びＣＫドメインを含む（「帯電したバリアント」）。図１Ｉは、２＋１フォーマットを示し、ここで、ＰＤ１結合ドメインは、ｃｒｏｓｓＦａｂ（ＶＨ／ＶＬドメインの交換）と、正しい対形成を補助するためにアミノ酸変異を有するＣＨ１ドメイン及びＣＫドメインを含む１つのＬＡＧ３結合ドメイン（「帯電したバリアント」）とを含み、第２のＬＡＧ３結合ドメインは、Ｆｃホール鎖のＣ末端で、そのＶＨドメインと融合している。 本明細書に記載する二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体の異なるフォーマットの模式図。図１Ａは、二重特異性１＋１フォーマットを示し、ここで、ＰＤ１結合ドメインは、ｃｒｏｓｓＦａｂ（ＶＨ／ＶＬドメインの交換）を含み、ＬＡＧ３結合ドメインは、正しい対形成を補助するために、アミノ酸変異を有するＣＨ１ドメインとＣＫドメインを含む（「帯電したバリアント」）。Ｆｃ部分は、ホールにノブを入れる変異（黒色矢印によって示される）と、ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほとんど完全に無効にする（白色領域によって示される）アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇとを含む。図１Ｂは、ＣＨ１／ＣＫに変異を含む２つの抗ＬＡＧ３結合Ｆａｂドメインと、１つの重鎖のＣ末端に融合したＰＤ１結合Ｆａｂドメインとを有する、２＋１フォーマットを示す。図１Ｃは、ＣＨ１／ＣＫに変異を含む２つの抗ＬＡＧ３結合ＦＡＢドメインを含むが、１つの重鎖のＣ末端に融合したＰＤ１結合一本鎖ｓｃＦａｂドメインを含む、同様の２＋１フォーマットを示す。図１Ｄには、２つの抗ＬＡＧ３結合Ｆａｂドメインと、重鎖のＣ末端の１つにそれぞれ融合したＰＤ１結合ＶＨ及びＶＬを含む、２＋１フォーマットが示される。図１Ｅは、図１Ｄと同様の構築物を示すが、ＶＨとＶＬとの間の操作されたジスルフィド結合を有し、図１Ｆは、フリン部位を有するバリアントが示されている。図１Ｇは、ＣＨ１／ＣＫに変異を含む２つの抗ＬＡＧ３結合Ｆａｂドメインと、各重鎖のＣ末端に融合した２つのＰＤ１結合ｃｒｏｓｓＦａｂドメインとを含む、二重特異性２＋２フォーマットを示す。図１Ｈには、二重特異性１＋１フォーマットが示され（「ｔｒａｎｓ」と呼ばれる）、ここで、ＰＤ１結合ドメインは、ｃｒｏｓｓＦａｂ（ＶＨ／ＶＬドメインの交換を含む）を含み、ＬＡＧ３結合ドメインは、Ｆｃホール鎖のＣ末端で、そのＶＨドメインと融合している。Ｌａｇ３ドメインは、正しい対形成を補助するためにアミノ酸変異を有する、ＣＨ１ドメイン及びＣＫドメインを含む（「帯電したバリアント」）。図１Ｉは、２＋１フォーマットを示し、ここで、ＰＤ１結合ドメインは、ｃｒｏｓｓＦａｂ（ＶＨ／ＶＬドメインの交換）と、正しい対形成を補助するためにアミノ酸変異を有するＣＨ１ドメイン及びＣＫドメインを含む１つのＬＡＧ３結合ドメイン（「帯電したバリアント」）とを含み、第２のＬＡＧ３結合ドメインは、Ｆｃホール鎖のＣ末端で、そのＶＨドメインと融合している。 本明細書に記載する二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体の異なるフォーマットの模式図。図１Ａは、二重特異性１＋１フォーマットを示し、ここで、ＰＤ１結合ドメインは、ｃｒｏｓｓＦａｂ（ＶＨ／ＶＬドメインの交換）を含み、ＬＡＧ３結合ドメインは、正しい対形成を補助するために、アミノ酸変異を有するＣＨ１ドメインとＣＫドメインを含む（「帯電したバリアント」）。Ｆｃ部分は、ホールにノブを入れる変異（黒色矢印によって示される）と、ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほとんど完全に無効にする（白色領域によって示される）アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇとを含む。図１Ｂは、ＣＨ１／ＣＫに変異を含む２つの抗ＬＡＧ３結合Ｆａｂドメインと、１つの重鎖のＣ末端に融合したＰＤ１結合Ｆａｂドメインとを有する、２＋１フォーマットを示す。図１Ｃは、ＣＨ１／ＣＫに変異を含む２つの抗ＬＡＧ３結合ＦＡＢドメインを含むが、１つの重鎖のＣ末端に融合したＰＤ１結合一本鎖ｓｃＦａｂドメインを含む、同様の２＋１フォーマットを示す。図１Ｄには、２つの抗ＬＡＧ３結合Ｆａｂドメインと、重鎖のＣ末端の１つにそれぞれ融合したＰＤ１結合ＶＨ及びＶＬを含む、２＋１フォーマットが示される。図１Ｅは、図１Ｄと同様の構築物を示すが、ＶＨとＶＬとの間の操作されたジスルフィド結合を有し、図１Ｆは、フリン部位を有するバリアントが示されている。図１Ｇは、ＣＨ１／ＣＫに変異を含む２つの抗ＬＡＧ３結合Ｆａｂドメインと、各重鎖のＣ末端に融合した２つのＰＤ１結合ｃｒｏｓｓＦａｂドメインとを含む、二重特異性２＋２フォーマットを示す。図１Ｈには、二重特異性１＋１フォーマットが示され（「ｔｒａｎｓ」と呼ばれる）、ここで、ＰＤ１結合ドメインは、ｃｒｏｓｓＦａｂ（ＶＨ／ＶＬドメインの交換を含む）を含み、ＬＡＧ３結合ドメインは、Ｆｃホール鎖のＣ末端で、そのＶＨドメインと融合している。Ｌａｇ３ドメインは、正しい対形成を補助するためにアミノ酸変異を有する、ＣＨ１ドメイン及びＣＫドメインを含む（「帯電したバリアント」）。図１Ｉは、２＋１フォーマットを示し、ここで、ＰＤ１結合ドメインは、ｃｒｏｓｓＦａｂ（ＶＨ／ＶＬドメインの交換）と、正しい対形成を補助するためにアミノ酸変異を有するＣＨ１ドメイン及びＣＫドメインを含む１つのＬＡＧ３結合ドメイン（「帯電したバリアント」）とを含み、第２のＬＡＧ３結合ドメインは、Ｆｃホール鎖のＣ末端で、そのＶＨドメインと融合している。 同種異系成熟樹状細胞と共に培養されたヒトＣＤ４ Ｔ細胞によって分泌される細胞毒性グランザイムＢ放出及びＩＬ－２分泌に対するａＬＡＧ－３抗体の効果。図２Ａでは、グランザイムＢ分泌に対する、本明細書に記載されるａＬＡＧ３抗体の効果を、図２Ｂでは、ＩＬ－２分泌に対するａＬＡＧ３抗体の効果を示す。 同種異系成熟樹状細胞と共に培養されたヒトＣＤ４ Ｔ細胞によって分泌される細胞毒性グランザイムＢ放出及びＩＬ－２分泌に対するａＬＡＧ－３抗体の効果。図２Ａでは、グランザイムＢ分泌に対する、本明細書に記載されるａＬＡＧ３抗体の効果を、図２Ｂでは、ＩＬ－２分泌に対するａＬＡＧ３抗体の効果を示す。 Ｂ細胞リンパ芽球様細胞株（ＡＲＨ７７）と共に培養されたヒトＣＤ４ Ｔ細胞による細胞毒性グランザイムＢ放出に対する、ａＰＤ１抗体（０３７６）と組み合わせたａＬＡＧ３抗体の効果。ａＰＤ１抗体（０３７６）と組み合わせた異なるａＬＡＧ３抗体と、ａＰＤ１抗体（０３７６）単独の比較が示される。 照射された同種異系ＰＢＭＣと共に培養されたヒトＣＤ４ Ｔ細胞によるグランザイムＢのＴｒｅｇ抑制及びＩＦＮ－γ放出に対する、ａＰＤ１抗体（０３７６）と組み合わせたａＬＡＧ３抗体の効果。図４Ａは、ａＰＤ１（０３７６）単独と比較したグランザイムＢ放出を示し、図４Ｂは、ａＰＤ１（０３７６）単独と比較したＩＦＮ－γ放出を示す。 組換えＰＤ１＋Ｌａｇ３＋細胞に対する二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体の結合によって生じる、同時結合及び受容体二量体化。抗体濃度に対し、化学発光（ＲＵで測定）がプロットされる。図５Ａ及び図５Ｂは、二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体及び単一特異性抗ＬＡＧ３抗体の比較を示す。二重特異性フォーマットのみが、化学発光を誘発することができた。競争実験を図５Ｃに示す。同じ二重特異性抗体が、ａＬＡＧ３抗体（０１５６、ＭＤＸ２５Ｆ７）又は抗ＰＤ１抗体（０３７６）のいずれかの存在下で与えられる場合、シグナルは、ほとんど阻害された（ＰＤ１競争の場合）か、又は少なくとも顕著に低下した（Ｌａｇ３）。更なる競争実験を図５Ｄに示す。二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体と、同じ抗ＰＤ１抗体（０３７６）及び組換えＬＡＧ３：Ｆｃタンパク質（０１６０）との競争は、ほとんど、シグナルを無効にし、一方、同じａＬＡＧ３バインダー（０１５６）の存在は、部分的な阻害しか引き起こさず、２種類の更なる抗ＬＡＧ３抗体０４１４及び０４１６は、シグナルを顕著に調整しなかった。 組換えＰＤ１＋Ｌａｇ３＋細胞に対する二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体の結合によって生じる、同時結合及び受容体二量体化。抗体濃度に対し、化学発光（ＲＵで測定）がプロットされる。図５Ａ及び図５Ｂは、二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体及び単一特異性抗ＬＡＧ３抗体の比較を示す。二重特異性フォーマットのみが、化学発光を誘発することができた。競争実験を図５Ｃに示す。同じ二重特異性抗体が、ａＬＡＧ３抗体（０１５６、ＭＤＸ２５Ｆ７）又は抗ＰＤ１抗体（０３７６）のいずれかの存在下で与えられる場合、シグナルは、ほとんど阻害された（ＰＤ１競争の場合）か、又は少なくとも顕著に低下した（Ｌａｇ３）。更なる競争実験を図５Ｄに示す。二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体と、同じ抗ＰＤ１抗体（０３７６）及び組換えＬＡＧ３：Ｆｃタンパク質（０１６０）との競争は、ほとんど、シグナルを無効にし、一方、同じａＬＡＧ３バインダー（０１５６）の存在は、部分的な阻害しか引き起こさず、２種類の更なる抗ＬＡＧ３抗体０４１４及び０４１６は、シグナルを顕著に調整しなかった。 組換えＰＤ１＋Ｌａｇ３＋細胞に対する二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体の結合によって生じる、同時結合及び受容体二量体化。抗体濃度に対し、化学発光（ＲＵで測定）がプロットされる。図５Ａ及び図５Ｂは、二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体及び単一特異性抗ＬＡＧ３抗体の比較を示す。二重特異性フォーマットのみが、化学発光を誘発することができた。競争実験を図５Ｃに示す。同じ二重特異性抗体が、ａＬＡＧ３抗体（０１５６、ＭＤＸ２５Ｆ７）又は抗ＰＤ１抗体（０３７６）のいずれかの存在下で与えられる場合、シグナルは、ほとんど阻害された（ＰＤ１競争の場合）か、又は少なくとも顕著に低下した（Ｌａｇ３）。更なる競争実験を図５Ｄに示す。二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体と、同じ抗ＰＤ１抗体（０３７６）及び組換えＬＡＧ３：Ｆｃタンパク質（０１６０）との競争は、ほとんど、シグナルを無効にし、一方、同じａＬＡＧ３バインダー（０１５６）の存在は、部分的な阻害しか引き起こさず、２種類の更なる抗ＬＡＧ３抗体０４１４及び０４１６は、シグナルを顕著に調整しなかった。 組換えＰＤ１＋Ｌａｇ３＋細胞に対する二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体の結合によって生じる、同時結合及び受容体二量体化。抗体濃度に対し、化学発光（ＲＵで測定）がプロットされる。図５Ａ及び図５Ｂは、二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体及び単一特異性抗ＬＡＧ３抗体の比較を示す。二重特異性フォーマットのみが、化学発光を誘発することができた。競争実験を図５Ｃに示す。同じ二重特異性抗体が、ａＬＡＧ３抗体（０１５６、ＭＤＸ２５Ｆ７）又は抗ＰＤ１抗体（０３７６）のいずれかの存在下で与えられる場合、シグナルは、ほとんど阻害された（ＰＤ１競争の場合）か、又は少なくとも顕著に低下した（Ｌａｇ３）。更なる競争実験を図５Ｄに示す。二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体と、同じ抗ＰＤ１抗体（０３７６）及び組換えＬＡＧ３：Ｆｃタンパク質（０１６０）との競争は、ほとんど、シグナルを無効にし、一方、同じａＬＡＧ３バインダー（０１５６）の存在は、部分的な阻害しか引き起こさず、２種類の更なる抗ＬＡＧ３抗体０４１４及び０４１６は、シグナルを顕著に調整しなかった。 異なるフォーマット（１＋１対２＋１）において、異なるａＬＡＧ３バインダーを用いた、二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体の同時結合の比較。図６Ａは、構築物０７９９（１＋１フォーマットでの抗ＰＤ１（０３７６）／抗ＬＡＧ３（０４１６））の結合曲線を示す。構築物８３１１（１＋２フォーマットでの抗ＰＤ１（０３７６）／抗ＬＡＧ３（０４１６））の結合曲線を図６Ｂに示す。図６Ｃは、構築物０９２７（１＋１フォーマットでの抗ＰＤ１（０３７６）／抗ＬＡＧ３（０４１４））の結合曲線を示す。構築物８３１０（１＋２フォーマットでの抗ＰＤ１（０３７６）／抗ＬＡＧ３（０４１４））の結合曲線を図６Ｄに示す。 異なるフォーマット（２＋１対２＋２）において、異なるａＬＡＧ３バインダーを用いた、二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体の同時結合の比較。図７Ａは、構築物８３１０（１＋２フォーマットでの抗ＰＤ１（０３７６）／抗ＬＡＧ３（０４１４））の結合曲線を示す。構築物８９７０（２＋２フォーマットでの抗ＰＤ１（０３７６）／抗ＬＡＧ３（０４１４））の結合曲線を図７Ｂに示す。図７Ｃは、構築物８３１１（１＋２フォーマットでの抗ＰＤ１（０３７６）／抗ＬＡＧ３（０４１６））の結合曲線を示す。構築物８９８４（２＋２フォーマットでの抗ＰＤ１（０３７６）／抗ＬＡＧ３（０４１６））の結合曲線を図７Ｄに示す。構築物０９２７（１＋１フォーマットの抗ＰＤ１（０３７６）／抗ＬＡＧ３（０４１４））の結合曲線と比較した、ｔｒａｎｓ １＋１フォーマットにおける構築物０７２５（抗ＰＤ１（０３７６）／抗ＬＡＧ３（０４１４））と構築物０７５０（ｔｒａｎｓ １＋２フォーマットにおける抗ＰＤ１（０３７６）／抗ＬＡＧ３（０４１４））の結合曲線は、図７Ｅに示される。これらの３構築物を、市販のＰＤ１／ＬＡＧ３コンボレポーターアッセイとも比較し、対応する結合曲線を図７Ｆに示す。 異なるフォーマット（２＋１対２＋２）において、異なるａＬＡＧ３バインダーを用いた、二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体の同時結合の比較。図７Ａは、構築物８３１０（１＋２フォーマットでの抗ＰＤ１（０３７６）／抗ＬＡＧ３（０４１４））の結合曲線を示す。構築物８９７０（２＋２フォーマットでの抗ＰＤ１（０３７６）／抗ＬＡＧ３（０４１４））の結合曲線を図７Ｂに示す。図７Ｃは、構築物８３１１（１＋２フォーマットでの抗ＰＤ１（０３７６）／抗ＬＡＧ３（０４１６））の結合曲線を示す。構築物８９８４（２＋２フォーマットでの抗ＰＤ１（０３７６）／抗ＬＡＧ３（０４１６））の結合曲線を図７Ｄに示す。構築物０９２７（１＋１フォーマットの抗ＰＤ１（０３７６）／抗ＬＡＧ３（０４１４））の結合曲線と比較した、ｔｒａｎｓ １＋１フォーマットにおける構築物０７２５（抗ＰＤ１（０３７６）／抗ＬＡＧ３（０４１４））と構築物０７５０（ｔｒａｎｓ １＋２フォーマットにおける抗ＰＤ１（０３７６）／抗ＬＡＧ３（０４１４））の結合曲線は、図７Ｅに示される。これらの３構築物を、市販のＰＤ１／ＬＡＧ３コンボレポーターアッセイとも比較し、対応する結合曲線を図７Ｆに示す。 フローサイトメトリーで測定する場合に、活性化Ｔ細胞に対する投与に対する添加から３時間後の、異なるフォーマットの二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体と親抗ＬＡＧ３抗体のインターナリゼーション。図８Ａは、実験の代表的なヒストグラムを示し、異なるフォーマットについてのインターナリゼーションの割合を図８Ｂに示す。 経時分析は、高度なインターナリゼーションを示す他のフォーマットと比較した時に、二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体（０９２７）の１＋１フォーマットの高い膜局在化を示す図９Ａは、１５分後、１時間後及び３時間後に共焦点顕微鏡によって検出されるような蛍光画像を示す。活性化したＣＤ４細胞は、黒丸で示されている。ＴＩＭ３抗体の蛍光画像は、強いインターナリゼーションの一例として示されている。画像の定量分析を図９Ｂに示す。 経時分析は、高度なインターナリゼーションを示す他のフォーマットと比較した時に、二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体（０９２７）の１＋１フォーマットの高い膜局在化を示す図９Ａは、１５分後、１時間後及び３時間後に共焦点顕微鏡によって検出されるような蛍光画像を示す。活性化したＣＤ４細胞は、黒丸で示されている。ＴＩＭ３抗体の蛍光画像は、強いインターナリゼーションの一例として示されている。画像の定量分析を図９Ｂに示す。 Ｔｒｅｇと比較した、従来のＴ細胞に対する結合図１０Ａ～１０Ｃは、従来のＴ細胞（黒色曲線）及びＴｒｅｇ（灰色領域）に対する結合を示す、１つの代表的なドナーからのデータを示す。抗ＬＡＧ３抗体 ０４１４（ｈｕ ＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ）の結合は、図１０Ａに示されており、図１０Ｂ及び図１０Ｃは、それぞれ、抗ＰＤ１抗体０３７６及び二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体（０９２７）の結合を示す。図１０Ｄにおいて、従来のＴ細胞に結合した所与の分子の幾何蛍光平均強度を、同じサンプル中のＴｒｅｇに結合した所与の分子の値と比較したΔ値を示す。結果（メジアン）は、３人の異なるドナーによる３の独立した実験から得られる。 ＰＤ１及びＴｒｅｇを同時にブロックすると、Ｔｒｅｇ抑制からＴｃｏｎｖエフェクター機能が守られる。同時培養５日後のＴｃｏｎｖによって分泌したグランザイムＢのＴｒｅｇによる抑制の割合が示される。結果（メジアン）は、１０人の異なるドナーによる１０の独立した実験から得られる。Ｐは、二元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算された。 免疫原性黒色腫抗原ペプチドプールを用いて回収した後の黒色腫患者ＰＢＭＣ由来のＣＤ４ Ｔ細胞によるグランザイムＢ及びＩＦＮ－γ分泌に対するＰＤ－１及びＬＡＧ－３ブロックの効果。図１２は、抗ＰＤ１（０３７６）単独、抗ＰＤ１（０３７６）とａＬＡＧ３（０４１４）の組み合わせ、及び１：１フォーマットの二重特異性抗体０９２７（抗ＰＤ１（０３７６）／抗ＬＡＧ３（０４１４）によって生じる、グランザイムＢ及びＩＦＮ－γ放出に対する効果の比較を示す。示されるのは、１２人の黒色腫患者ＰＢＭＣ由来のペプチドプール刺激されたＣＤ４ Ｔ細胞に対し、グランザイムＢ及びＩＦＮγ産生が何倍増加したかである。 Ｂ細胞リンパ芽球様細胞株（ＡＲＨ７７）と共に培養されたヒトＣＤ４ Ｔ細胞による細胞毒性グランザイムＢ放出に対する、ａＰＤ１／ａＬＡＧ３二重特異性抗体の効果。本明細書に記載される異なる二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体を、治療又は臨床試験の標準で使用される抗体と比較する。 膵臓腺癌ＢｘＰＣ３を用いてチャレンジ試験したヒト化マウスの有効性試験。ＣＥＡＣＡＭ ＣＤ３ ＴＣＢと組み合わせた場合、従来のＰＤ１抗体と比較すると、ａＰＤ１／ａＬＡＧ３二重特異性抗体のみが、統計的に有意な腫瘍保護を与えた。ＢｘＰＣ３細胞を用いて皮下でチャレンジ試験され、ＣＥＡＣＡＭ５－ＴＣＢと組み合わせた指定の分子で処理されたヒト化マウスにおける主要成長曲線が示されている。 ４７日間にわたる腫瘍体積の測定（ｍｍ３±ＳＥＭ）は、それぞれの個々の動物について示されており、抗腫瘍応答の均一性を示している。腫瘍成長曲線は、図１５Ａではビヒクル群について、図１５ＢではＣＥＡＣＡＭ５ ＣＤ３ ＴＣＢ単独（２．５ｍｇ／ｋｇ）について、図１５ＣではＣＥＡＣＡＭ５ ＣＤ３ ＴＣＢとニボルマブ（１．５ｍｇ／ｋｇ）との組み合わせについて、図１５ＤではＣＥＡＣＡＭ５ ＣＤ３ ＴＣＢとペンブロリズマブ（１．５ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせについて、図１５ＥではＣＥＡＣＡＭ５ ＣＤ３ ＴＣＢとＰＤ１／ＬＡＧ３ ０９２７の組み合わせについて（１．５ｍｇ／ｋｇ）、図１５Ｆでは（３ｍｇ／ｋｇの二重特異性抗体）について示されている。
定義
他の意味であると定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野で一般的に使用されるのと同じ意味を有する。本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合にはいつでも、単数形で使用される用語は、複数形も含み、その逆に、複数系で使用される用語は、単数形も含む。
本明細書で使用される場合、「抗原結合分子」との用語は、最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体、抗体フラグメント及び足場抗原結合タンパク質である。
本明細書の「抗体」との用語は、最も広い意味で使用され、種々の抗体構造を包含し、限定されないが、所望な抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体及び多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体フラグメントを含む。
「モノクローナル抗体」との用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集合から得られる抗体を指す。すなわち、集合に含まれる個々の抗体が、同一であり、及び／又は同じエピトープに結合するが、但し、例えば、天然に存在する変異又はモノクローナル抗体製剤の製造中に生じる変異を含む、可能なバリアント抗体は除く。このようなバリアントは、一般的に、少量存在する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤のそれぞれのモノクローナル抗体は、１つの抗原上の単一の決定基に対して指向する。
「単一特異性」抗体との用語は、本明細書で使用される場合、同じ抗原の同じエピトープにそれぞれ結合する１つ以上の結合部位を有する抗体を示す。「二重特異性」との用語は、抗体が、少なくとも２つの別個の抗原決定基、例えば、異なる抗原又は同じ抗原上の異なるエピトープに結合している抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）の対によってそれぞれ形成される２つの結合部位に特異的に結合することができることを意味する。このような二重特異性抗体は、１＋１フォーマットである。他の二重特異性抗体フォーマットは、２＋１フォーマット（第１の抗原又はエピトープに対する２つの結合部位と、第２の抗原又はエピトープに対する１つの結合部位とを含む）、又は２＋２フォーマット（第１の抗原又はエピトープに対する２つの結合部位と、第２の抗原又はエピトープに対する２つの結合部位とを含む）である。典型的には、二重特異性抗体は、２つの抗原結合部位を含み、それぞれが異なる抗原決定基に対して特異的である。
「価数」との用語は、本出願で使用される場合、抗原結合分子内の特定数の結合ドメインの存在を示す。この場合、「二価」、「四価」及び「六価」との用語は、抗原結合分子中のそれぞれ２個の結合ドメイン、４個の結合ドメイン及び６個の結合ドメインの存在を示す。本発明の二重特異性抗体は、少なくとも「二価」であり、「三価」又は「多価」（例えば、「四価」又は「六価」）であってもよい。特定の態様では、本発明の抗体は、２つ以上の結合部位を有し、二重特異性である。すなわち、２個より多い結合部位が存在する場合であっても（すなわち、抗体は三価又は多価である）、抗体は、二重特異性であってもよい。
「全長抗体」、「インタクト抗体」及び「全抗体」との用語は、ネイティブ抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗体を指すために、本明細書で相互に置き換え可能に用いられる。「ネイティブ抗体」は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、ネイティブＩｇＧクラス抗体は、約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質であり、ジスルフィド結合した２つの軽鎖と２つの重鎖から構成される。Ｎ末端からＣ末端まで、それぞれの重鎖は、可変ドメイン（ＶＨ）（可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる）と、その後に３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）（重鎖定常領域とも呼ばれる）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、それぞれの軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬ）（可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる）と、その後に軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）（軽鎖定常領域とも呼ばれる）を有する。抗体の重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５種類の１つに割り当てられてもよく、このいくつかは、例えば、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）などのサブタイプに更に分けられてもよい。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類の１つに割り当てられてもよい。
「抗体フラグメント」は、インタクト抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体の一部を含むインタクト抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、交差Ｆａｂフラグメント、直鎖抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、抗体フラグメントから作られる多重特異性抗体、及びシングルドメイン抗体が挙げられる。特定の抗体フラグメントの総説としては、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）を参照。ｓｃＦｖフラグメントの総説としては、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照。また、ＷＯ ９３／１６１８５号及び米国特許第５，５７１，８９４号及び第５，５８７，４５８号を参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が長くなったＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントの説明については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照。ダイアボディは、二価又は二重特異性であってもよい２つの抗原結合ドメインを含む抗体フラグメントであり、例えば、ＥＰ ４０４，０９７号；ＷＯ １９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０，６４４４－６４４８（１９９３）を参照。トリアボディ及びテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）に記載される。シングルドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体フラグメントである。特定の実施形態では、シングルドメイン抗体は、ヒトシングルドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ。例えば、米国特許第６，２４８，５１６ Ｂ１号を参照）。これに加え、抗体フラグメントは、ＶＨドメインに特徴的な（すなわち、ＶＬドメインと共に集合させることが可能な）、又はＶＬドメインに特徴的な（すなわち、機能的抗原結合部位にＶＨドメインと共に集合させることが可能な）一本鎖ポリペプチドを含み、それによって、全長抗体の抗原結合特性を与える。抗体フラグメントは、限定されないが、本明細書に記載されるように、インタクト抗体のタンパク質分解による消化、及び組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による産生を含め、種々の技術によって作られてもよい。
インタクト抗体のパパイン消化により、２つの同一の抗原結合フラグメントが得られ、これは、それぞれ重鎖及び軽鎖可変ドメインと、更に、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる。従って、本明細書で使用される場合、「Ｆａｂフラグメント」との用語は、軽鎖（ＣＬ）のＶＬドメイン及び定常ドメインを含む軽鎖フラグメントと、重鎖のＶＨドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体フラグメントを指す。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含め、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加によって、Ｆａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が有機チオール基を有するＦａｂ’フラグメントである。ペプシン処理によって、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂフラグメント）と、Ｆｃ領域の一部とを含む、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントが得られる。
「ｃｒｏｓｓ－Ｆａｂフラグメント」又は「ｘＦａｂフラグメント」又は「クロスオーバーＦａｂフラグメント」との用語は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されたＦａｂフラグメントを指す。クロスオーバーＦａｂ分子の２つの可能な鎖組成が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれる。一方、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域は、置き換わっており、すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ１）とで構成されるペプチド鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とで構成されるペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも呼ばれる。一方、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の定常領域が置き換わっている場合、クロスオーバーＦａｂ分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とで構成されるペプチド鎖と、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ１）とで構成されるペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも呼ばれる。
「一本鎖Ｆａｂフラグメント」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端への方向で、以下の順序の１つを有する。（ａ）ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、（ｂ）ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、（ｃ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１、又は（ｄ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬ。ここで、前記リンカーは、少なくとも３０アミノ酸、好ましくは３２～５０アミノ酸のポリペプチドである。前記一本鎖Ｆａｂフラグメントは、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合によって安定化される。これに加え、これらの一本鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによれば、可変重鎖の位置４４及び可変軽鎖の位置１００）による鎖間ジスルフィド結合の生成によって、更に安定化されるだろう。
「クロスオーバー一本鎖Ｆａｂフラグメント」又は「ｘ－ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端への方向で、以下の順序の１つを有する。（ａ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１及び（ｂ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬ。ここで、ＶＨとＶＬは、一緒に、ある抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインを形成し、前記リンカーは、少なくとも３０アミノ酸のポリペプチドである。これに加え、これらのｘ－ｓｃＦａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによれば、可変重鎖の位置４４及び可変軽鎖の位置１００）による鎖間ジスルフィド結合の生成によって、更に安定化されるだろう。
「一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）」は、１０～約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドを用いて接続された、抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは、通常、柔軟性のためにグリシンが豊富であり、溶解度のためにセリン又はトレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ末端と、ＶＬのＣ末端とが接続していてもよく、又は逆に接続していてもよい。このタンパク質は、定常領域が除去され、リンカーが導入されているが、元々の抗体の特異性を保持している。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３（１９９１）４６－９６）に記載されている。これに加え、抗体フラグメントは、ＶＨドメインに特徴的な（すなわち、ＶＬドメインと共に集合させることが可能な）、又はＶＬドメインに特徴的な（すなわち、機能的抗原結合部位にＶＨドメインと共に集合させることが可能な）一本鎖ポリペプチドを含み、それによって、全長抗体の抗原結合特性を与える。
「足場抗原結合タンパク質」は、当該技術分野で既知であり、例えば、フィブロネクチン及び設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、抗原結合ドメインの代替的な足場として使用されてきた。例えば、Ｇｅｂａｕｅｒ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ａｓ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １３：２４５－２５５（２００９）及びＳｔｕｍｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｄａｒｐｉｎｓ：Ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ １３：６９５－７０１（２００８）を参照。本発明の一態様では、足場抗原結合タンパク質は、ＣＴＬＡ－４（エビボディ）、リポカリン（アンチカリン）、プロテインＡ由来分子、例えば、プロテインＡのＺ－ドメイン（アフィボディ）、Ａ－ドメイン（アビマー／マキシボディ）、血清トランスフェリン（トランスボディ）；設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、抗体軽鎖又は重鎖の可変ドメイン（単一ドメイン抗体、ｓｄＡｂ）、抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ、ａＶＨ）、ＶＮＡＲフラグメント、フィブロネクチン（アドネクチン）、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン）；新規抗原受容体β－ラクタマーゼの可変ドメイン（ＶＮＡＲフラグメント）、ヒトγ－クリスタリン又はユビキチン（アフィリン分子）；ヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ型ドメイン、ミクロボディ、例えば、ノッチンファミリー由来のタンパク質、ペプチドアプタマー及びフィブロネクチン（アドネクチン）からなる群から選択される。ＣＴＬＡ－４（細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原４）は、主にＣＤ４＋Ｔ細胞で発現するＣＤ２８ファミリー受容体である。その細胞外ドメインは、可変ドメイン様のＩｇ折りたたみを有する。抗体のＣＤＲに対応するループは、異なる結合特性を与えるために、異種配列と置換されてもよい。異なる結合特異性を有するように操作されたＣＴＬＡ－４分子も、エビボディとして知られている（例えば、ＵＳ７１６６６９７Ｂ１号）。エビボディは、抗体（例えば、ドメイン抗体）の単離された可変領域とほぼ同じ大きさである。更なる詳細については、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８（１－２）、３１－４５（２００１）を参照。リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質などの小さな疎水性分子を運ぶ細胞外タンパク質のファミリーである。リポカリンは、剛性βシート二次構造を有し、円錐構造の開放端に多くのループがあり、このループは、異なる標的抗原に結合するように操作することができる。アンチカリンは、１６０～１８０アミノ酸の大きさであり、リポカリンから誘導される。更なる詳細については、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １４８２：３３７－３５０（２０００）、ＵＳ７２５０２９７Ｂ１号及びＵＳ２００７０２２４６３３号を参照。アフィボディは、抗原に結合するように操作することが可能な、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのプロテインＡに由来する足場である。ドメインは、約５８アミノ酸の３つのラセン形の束からなる。ライブラリーは、表面残基のランダム化によって作られている。更なる詳細について、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２００４，１７，４５５－４６２及びＥＰ １６４１８１８Ａ１号を参照。アビマーは、Ａドメイン足場ファミリーに由来する複数ドメインタンパク質である。約３５アミノ酸のネイティブドメインは、規定のジスルフィド結合した構造に適合する。多様性は、Ａ－ドメインのファミリーによって示される天然の変動のシャッフリングによって作られる。更なる詳細については、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３（１２）、１５５６－１５６１（２００５）及びＥｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇｓ １６（６）、９０９－９１７（２００７年６月）を参照。トランスフェリンは、モノマー血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは、許容状態の表面ループへのペプチド配列の挿入によって異なる標的抗原に結合するように操作可能である。操作されたトランスフェリン足場の例としては、トランスボディが挙げられる。更なる詳細については、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７４、２４０６６－２４０７３（１９９９）を参照。設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、細胞骨格の内在性膜タンパク質の接着に介在するタンパク質のファミリーであるアンキリンに由来する。単一のアンキリンリピートは、２つのαらせんとβターンとからなる３３残基のモチーフである。単一のアンキリンリピートは、各反復の第１のαらせん及びβターンの中の残基をランダム化することによって異なる標的抗原に結合するように操作することができる。その結合界面は、モジュールの数を増やすことによって、増加させることができる（アフィニティ成熟方法）。更なる詳細については、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２、４８９－５０３（２００３）、ＰＮＡＳ １００（４）、１７００－１７０５（２００３）及びＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６９、１０１５－１０２８（２００７）及びＵＳ２００４０１３２０２８Ａ１号を参照。
一本鎖ドメイン抗体は、一本のモノマー性可変抗体ドメインからなる抗体フラグメントである。第１の単一ドメインは、ラクダ由来の抗体重鎖の可変ドメインに由来した（ナノボディ又はＶＨＨフラグメント）。更に、単一ドメイン抗体との用語は、自律的なヒト重鎖可変ドメイン（ａＶＨ）又はサメ由来ＶＮＡＲフラグメントを含む。フィブロネクチンは、抗原に結合するように操作可能な足場である。アドネクチンは、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）の１５反復単位の１０番目のドメインの天然アミノ酸配列を有する骨格からなる。βサンドイッチの片方の端にある３つのループを、アドネクチンが目的の治療標的を特異的に認識することができるように操作することができる。更なる詳細について、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１８、４３５－４４４（２００５）、ＵＳ２００８０１３９７９１号、ＷＯ２００５０５６７６４号及びＵＳ６８１８４１８Ｂ１号を参照。ペプチドアプタマーは、定常足場タンパク質、典型的には、活性部位に挿入される拘束された可変ペプチドループを含むチオレドキシン（ＴｒｅｘＡ）からなるコンビナトリアル認識分子である。更なる詳細について、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．５、７８３－７９７（２００５）を参照。ミクロボディは、３～４のシステイン架橋を含む、２５～５０アミノ酸長の天然に存在するミクロタンパク質に由来し、ミクロタンパク質の例としては、ＫａｌａｔａＢＩ、コノトキシン及びノッチンが挙げられる。ミクロタンパク質は、ミクロタンパク質の全体的な折りたたみに影響を与えることなく、２５アミノ酸までを含むように操作することができるループを有する。操作されたノッチンドメインの更なる詳細については、ＷＯ２００８０９８７９６号を参照。
参照分子と「同じエピトープに結合する抗原結合分子」は、競争アッセイにおいて、参照分子のその抗原に対する結合を５０％以上ブロックする抗原結合分子を指し、逆に、参照分子は、競争アッセイにおいて、抗原結合分子のその抗原に対する結合を５０％以上ブロックする。
本明細書で使用される場合、「抗原結合ドメイン」又は「抗原結合部位」との用語は、抗原決定基に特異的に結合する抗原結合分子の一部を指す。より特定的には、「抗原結合ドメイン」との用語は、ある抗原の一部又は全てに特異的に結合し、ある抗原の一部又は全てに対して相補的な抗体の一部を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は、抗原の特定の部分のみに結合してもよく、この部分は、エピトープと呼ばれる。抗原結合ドメインは、例えば、１つ以上の可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）によって与えられてもよい。特に、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）とを含む。一態様では、抗原結合ドメインは、その抗原に結合し、その機能をブロックするか、又は部分的にブロックすることができる。ＰＤ１及びＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインは、本明細書で更に定義するように、抗体及びそのフラグメントを含む。これに加え、抗原結合ドメインは、足場抗原結合タンパク質、例えば、設計された反復タンパク質又は設計された反復ドメインに基づく結合ドメインを含んでいてもよい（例えば、ＷＯ ２００２／０２０５６５号を参照）。
本明細書で使用される場合、「抗原決定基」との用語は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分－抗原複合体を形成する、抗原結合部分が結合するポリペプチド高分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続伸長部又は異なる領域の非連続アミノ酸から構成される配座構成）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞表面に、ウイルス感染した細胞表面に、他の疾患細胞表面に、免疫細胞表面に、血清中に遊離状態で、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）内に見出されてもよい。本発明の抗原として有用なタンパク質は、哺乳動物、例えば、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含め、任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブ形態のタンパク質であってもよい。特定の実施形態では、抗原は、ヒトタンパク質である。本発明の特定のタンパク質について言及される場合、この用語は、「全長」の未処理のタンパク質、及び細胞の処理から得られるタンパク質の任意の形態を包含する。この用語は、タンパク質の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。
「特異的に結合する」とは、その結合が抗原選択性であり、望ましくない相互作用又は非特異的な相互作用とは判別することができることを意味する。抗原結合分子が特定の抗原（例えば、ＰＤ－１）に結合する能力は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）又は当該技術分野で知られた他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ装置で分析される）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７、３２３－３２９（２０００））、及び従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ、Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８、２１７－２２９（２００２））によって測定することができる。一実施形態では、無関係なタンパク質に対する抗原結合分子の結合度は、例えばＳＰＲによって測定される抗原に対する抗原結合分子の結合の約１０％未満である。特定の実施形態では、抗原に結合する分子は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－７Ｍ以下、例えば、１０－７Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）である。
「アフィニティ」又は「結合アフィニティ」は、分子の単一の結合部位（例えば、抗体）と、その結合対（例えば、抗原）との間の非共有結合性相互作用の合計強度を指す。特に示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合アフィニティ」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１相互作用を反映する固有の結合アフィニティを指す。分子Ｘのその結合対Ｙに対するアフィニティは、一般的に、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができ、脱離速度定数と解離速度定数（それぞれｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である。したがって、速度定数の比率が同じである限り、等価なアフィニティが、異なる速度定数を含む場合がある。アフィニティは、本明細書に記載するものを含め、当該技術分野で一般的な方法によって測定することができる。アフィニティを測定する特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
本明細書で使用される場合、ある抗体の「高アフィニティ」との用語は、標的抗原に対するＫｄが１０－９Ｍ以下、更により特定的には１０－１０Ｍ以下の抗体を指す。「低アフィニティ」の抗体は、Ｋｄが１０－８以上の抗体を指す。
「アフィニティ成熟した」抗体は、１つ以上の超可変領域（ＨＶＲ）に１つ以上の変更を有する抗体を指し、これに対して、親抗体は、このような変更を有しておらず、このような変更によって、抗原に対する抗体のアフィニティが向上する。
「ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体」、「ＰＤ１及びＬＡＧ３に特異的に結合する二重特異性抗体」、「ＰＤ１及びＬＡＧ３に特異的な二重特異性抗原結合分子」又は「抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体」は、本明細書で相互に置き換え可能に使用され、ＰＤ１及びＬＡＧ３に、抗体がＰＤ１及びＬＡＧ３を標的とする際に診断及び／又は治療薬剤として有用であるように、十分なアフィニティで結合することが可能な二重特異性抗体を指す。
「ＰＤ１」との用語は、プログラム細胞死タンパク質１としても知られ、１９９２年に最初に記述された２８８アミノ酸のＩ型膜タンパク質である（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１１（１９９２），３８８７－３８９５）。ＰＤ－１は、Ｔ細胞制御因子の伸長したＣＤ２８／ＣＴＬＡ－４ファミリーのメンバーであり、２つのリガンドＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１、ＣＤ２７４）及びＰＤ－Ｌ２（Ｂ７－ＤＣ、ＣＤ２７３）を有する。このタンパク質の構造は、細胞外ＩｇＶドメインと、その後に膜貫通領域と、細胞内尾部とを含む。細胞内尾部は、免疫受容体チロシン系阻害モチーフ及び免疫受容体チロシン系スイッチモチーフ中に位置する２つのリン酸化部位を含み、ＰＤ－１がＴＣＲシグナルを負の方向に制御することを示唆している。このことは、リガンド結合の際の、ＰＤ－１の細胞質尾部に対するＳＨＰ－１及びＳＨＰ－２ホスファターゼの結合に一致している。ＰＤ－１は、ナイーブＴ細胞では発現しないが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が介在する活性化に従ってアップレギュレーションされ、活性化したＴ細胞及び疲弊したＴ細胞の両方で観察される（Ａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８（１９９６）、７６５－７７２）。これらの疲弊したＴ細胞は、機能不全の表現型を有し、適切に応答することができない。ＰＤ－１は、比較的広い発現パターンを有するが、その最も重要な役割は、Ｔ細胞に対する共阻害受容体としての役割であろう（Ｃｈｉｎａｉ ｅｔ ａｌ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ３６（２０１５）、５８７－５９５）。したがって、現在の治療手法は、Ｔ細胞応答を向上させるために、ＰＤ－１とそのリガンドとの相互作用をブロックすることに集中している。「プログラム死１」、「プログラム細胞死１」、「タンパク質ＰＤ－１」、「ＰＤ－１」、「ＰＤ１」、「ＰＤＣＤ１」、「ｈＰＤ－１」及び「ｈＰＤ－Ｉ」との用語は、相互に置き換え可能に使用することができ、ヒトＰＤ－１のバリアント、アイソフォーム、種ホモログ、ＰＤ－１と共通の少なくとも１つのエピトープを有するアナログを含む。ヒトＰＤ１のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）寄託番号Ｑ１５１１６（配列番号１２８）に示される。
「抗ＰＤ１抗体」及び「ＰＤ１に結合する抗原結合ドメインを含む抗体」との用語は、抗体が、ＰＤ－１を標的とする際に診断及び／又は治療薬剤として有用であるように十分なアフィニティで、ＰＤ１（特に、細胞表面で発現するＰＤ１ポリペプチド）に結合することが可能な抗体を指す。一態様では、無関係な非ＰＤ１タンパク質に対する抗ＰＤ１抗体の結合度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって、又はＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサシステムを用いた表面プラズモン共鳴アッセイによって測定する場合、ＰＤ１に対する抗体の結合の約１０％未満である。特定の態様では、ヒトＰＤ１に結合する抗原結合タンパク質は、ヒトＰＤ１に結合する結合アフィニティのＫＤ値が≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）である。好ましい一実施形態では、結合アフィニティのそれぞれのＫＤ値は、ＰＤ１結合アフィニティについて、ヒトＰＤ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ＰＤ１－ＥＣＤ）を用い、表面プラズモン共鳴アッセイで決定される。「抗ＰＤ１抗体」との用語は、ＰＤ１及び第２の抗原に結合することが可能な二重特異性抗体も包含する。
「ＬＡＧ３」又は「Ｌａｇ－３」又は「リンパ球活性化遺伝子－３」又は「ＣＤ２２３」との用語は、本明細書で使用される場合、特に示されていない限り、哺乳動物、例えば、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含め、任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブＬＡＧ３を指す。この用語は、「全長」の未処理のＬＡＧ３と、細胞の処理から生じるＬＡＧ３の任意の形態を包含する。この用語は、ＬＡＧ３の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。好ましい一実施形態では、「ＬＡＧ３」との用語は、ヒトＬＡＧ３を指す。例示的に処理された（シグナル配列を含まない）ＬＡＧ３のアミノ酸配列を配列番号７３に示す。例示的な細胞外ドメイン（ＥＣＤ）ＬＡＧ３のアミノ酸配列を配列番号７４に示す。
「抗ＬＡＧ３抗体」及び「ＬＡＧ３に結合する抗体」との用語は、抗体が、ＬＡＧ３を標的とする際に診断及び／又は治療薬剤として有用であるように十分なアフィニティで、ＬＡＧ３に結合することが可能な抗体を指す。一態様では、無関係な非ＬＡＧ３タンパク質に対する抗ＬＡＧ３抗体の結合度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定されるＬＡＧ３に対する抗体の結合の約１０％未満である。特定の実施形態では、ＬＡＧ３に結合する抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）である。特定の態様では、抗ＬＡＧ３抗体は、異なる種由来のＬＡＧ３の中で保存されているＬＡＧ３のエピトープに結合する。好ましい一実施形態では、「抗ＬＡＧ３抗体」、「ヒトＬＡＧ３に特異的に結合する抗体」及び「ヒトＬＡＧ３に結合する抗体」は、結合アフィニティＫＤ値が１．０×１０－８ｍｏｌ／Ｌ以下、一実施形態では、ＫＤ値が１．０×１０－９ｍｏｌ／Ｌ以下、一実施形態では、ＫＤ値が１．０×１０－９ｍｏｌ／Ｌ～１．０×１０－１３ｍｏｌ／Ｌである、ヒトＬＡＧ３抗原又はその細胞外素メイン（ＥＣＤ）に特異的に結合する抗体を指す。この観点で、結合アフィニティは、標準的な結合アッセイ、例えば、表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を用いて、例えば、ＬＡＧ３細胞外ドメインを用いて決定される。「抗ＬＡＧ３抗体」との用語は、ＬＡＧ３及び第２の抗原に結合することが可能な二重特異性抗体も包含する。
「ブロッキング」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、これらが結合する抗原の生体活性を阻害するか、又は減らす抗体である。いくつかの実施形態では、ブロッキング抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の生体活性を実質的に、又は完全に阻害する。例えば、本発明の二重特異性抗体は、抗原刺激に対する機能不全状態から、Ｔ細胞による機能応答（例えば、増殖、サイトカイン産生、標的細胞死）を回復するように、ＰＤ－１及びＬＡＧ３によるシグナル伝達をブロックする。
「可変領域」又は「可変ドメイン」との用語は、抗原に対する抗原結合分子の結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般的に、同様の構造を有し、それぞれのドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む。例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第６版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，９１ページ（２００７）を参照。抗原結合特異性を与えるために、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分な場合がある。
「超可変領域」又は「ＨＶＲ」との用語は、本明細書で使用される場合、配列において超可変性であり、及び／又は構造的に所定のループ（「超可変ループ」）を形成する、抗体可変ドメインのそれぞれの領域を指す。一般的に、ネイティブの４本鎖抗体は、６個のＨＶＲを含み、ＶＨに３個（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、ＶＬに３個（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）含む。ＨＶＲは、一般的に、超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、ＣＤＲは、最も高い配列可変性を有し、及び／又は抗原認識に関与している。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基２６－３２（Ｌ１）、５０－５２（Ｌ２）、９１－９６（Ｌ３）、２６－３２（Ｈ１）、５３－５５（Ｈ２）及び９６－１０１（Ｈ３）で生じる。（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）。）例示的なＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基２４－３４、Ｌ２の５０－５６、Ｌ３の８９－９７、Ｈ１の３１－３５Ｂ、Ｈ２の５０－６５及びＨ３の９５－１０２に存在する。（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）。）超可変領域（ＨＶＲ）は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれ、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の一部を言及する際に、本明細書で相互に置き換え可能に用いられる。この特定の領域は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）及びＣｈｏｔｈｉａｅｔ ａｌ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）によって記載され、ここで、この定義は、互いに対して比較したときに、重複するアミノ酸残基を含むか、又はアミノ酸残基の一部を含む。それにもかかわらず、抗体又はそのバリアントのＣＤＲを指すためのいずれかの定義に対する適用は、本明細書に定義され、使用される用語の範囲内であることが意図される。上に引用した参考文献それぞれによって定義されるようなＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基は、比較として、表Ａにおいて、以下に記載している。特定のＣＤＲを包含する実際の残基の番号は、ＣＤＲの配列及び大きさに依存して変わる。当業者は、日常的に、抗体の可変領域のアミノ酸配列が与えられれば、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを決定することができる。
Figure 0006997212000001
Ｋａｂａｔｅｔ ａｌ．は、任意の抗体に適用可能な可変領域配列の番号付けシステムも定義した。当業者は、任意の可変領域配列に対し、配列自体を超える実験データに頼ることなく、「Ｋａｂａｔ番号付け」のこのシステムを明確に割り当てることができる。本明細書で使用される場合、「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）に記載される番号付けシステムを指す。特に明記されない限り、抗体可変領域中の特定のアミノ酸残基の位置の番号付けに関する言及は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従う。
ＶＨ中のＣＤＲ１を除き、ＣＤＲは、一般的に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、「特異性決定領域」、すなわち「ＳＤＲ」も含み、ＳＤＲは、抗原と接触する残基である。ＳＤＲは、省略－ＣＤＲ、すなわちａ－ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含まれる。例示的なａ－ＣＤＲ（ａ－ＣＤＲ－Ｌ１、ａ－ＣＤＲ－Ｌ２、ａ－ＣＤＲ－Ｌ３、ａ－ＣＤＲ－Ｈ１、ａ－ＣＤＲ－Ｈ２及びａ－ＣＤＲ－Ｈ３）は、Ｌ１の３１－３４、Ｌ２の５０－５５、Ｌ３の８９－９６、Ｈ１の３１－３５Ｂ、Ｈ２の５０－５８及びＨ３の９５－１０２のアミノ酸残基に存在する。（Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）を参照。）特に示されない限り、ＨＶＲ残基及び可変ドメイン中の他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に従って本明細書では番号付けされる。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の４つのＦＲドメインからなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般的に、ＶＨ（又はＶＬ）中で以下の配列で現れる。ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４。
本明細書の目的のために、「アクセプターヒトフレームワーク」は、以下に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク由来の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「由来の」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでいてもよく、又はアミノ酸配列の変更を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、アミノ酸変更の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。いくつかの実施形態では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に対して、配列が同一である。
「キメラ」抗体との用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の供給源又は種に由来する抗体を指し、一方、重鎖及び／又は軽鎖の残りは、異なる供給源又は種に由来する。
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。５種類の主要なクラスの抗体ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、更に、サブクラス（アイソタイプ）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に分けられてもよい。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基と、ヒトＦＲ由来のアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体に対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てが、ヒト抗体に対応する。ヒト化抗体は、場合により、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。ある抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。本発明に包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、特に、Ｃ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合という観点で、本発明に係る特性を作り出すために、定常領域が、元々の抗体の定常領域から更に改変されるか、又は変更されているものである。
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞によって産生されるか、又はヒト抗体のレパートリー又は他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト源から誘導される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特定的に除外する。
「モノクローナル抗体」との用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集合から得られる抗体を指す。すなわち、集合に含まれる個々の抗体が、同一であり、及び／又は同じエピトープに結合するが、但し、例えば、天然に存在する変異又はモノクローナル抗体製剤の製造中に生じる変異を含む、可能なバリアント抗体は除く。このようなバリアントは、一般的に、少量存在する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤のそれぞれのモノクローナル抗体は、１つの抗原上の単一の決定基に対して指向する。したがって、修飾詞「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集合から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするように構築されない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ方法、組換えＤＮＡ方法、ファージディスプレイ方法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法、本明細書に記載するモノクローナル抗体を作るためのこのような方法及び他の例示的な方法を含め、種々の技術によって作られてもよい。
「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」との用語は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部を含む抗体重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、ネイティブ配列Ｆｃ領域とバリアントＦｃ領域を含む。特に、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端まで延びている。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リシン（Ｌｙｓ４４７）は、存在していてもよく、又は存在していなくてもよい。重鎖のアミノ酸配列は、常に、Ｃ末端リシンを伴って存在するが、Ｃ末端リシンを含まないバリアントは、本発明に含まれる。
ＩｇＧ Ｆｃ領域は、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインと、ＩｇＧ ＣＨ３ドメインとを含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、おおよそのアミノ酸位置２３１のアミノ酸残基から、おおよそのアミノ酸位置３４０のアミノ酸残基まで延びている。一実施形態では、炭水化物鎖は、ＣＨ２ドメインに接続している。本発明のＣＨ２ドメインは、ネイティブ配列ＣＨ２ドメイン又はバリアントＣＨ２ドメインであってもよい。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域中のＣＨ２ドメインに対してＣ末端に残基の伸長部を含む（すなわち、ＩｇＧのおおよその位置３４１のアミノ酸残基から、おおよその位置４４７のアミノ酸残基まで）。本発明のＣＨ３領域は、ネイティブ配列ＣＨ３ドメイン又はバリアントＣＨ３ドメインであってもよい（例えば、その１つの鎖に導入された「突起部」（「ノブ」）を有し、その他の鎖に対応する導入された「空洞」（「ホール」）を有するＣＨ３ドメイン、本明細書に参考として明確に組み込まれる米国特許第５，８２１，３３３号を参照）。このようなバリアントＣＨ３ドメインを使用し、本明細書に記載される２つの同一ではない抗体重鎖のヘテロ二量体化を促進してもよい。本明細書で特に明記されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されるような、ＥＵ番号付けシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。
「ホールにノブを入れる（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）」技術は、例えば、ＵＳ ５，７３１，１６８号、ＵＳ ７，６９５，９３６号、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載される。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの界面にある突起（「ノブ」）と、第２のポリペプチドの界面にある空洞（「ホール」）とを導入することを含み、その結果、突起が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように空洞内に位置することができる。突起は、第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖を、もっと大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と交換することによって構築される。突起と同一又は同様の大きさの相補性空洞が、大きなアミノ酸側鎖を、より小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）と置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作られる。突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変えることによって、例えば、部位特異的変異導入法によって、又はペプチド合成によって作成することができる。具体的な実施形態では、ノブ改変は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうち１つにアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ホール改変は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうち他方の１つにアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。更に具体的な実施形態では、ノブ改変を含むＦｃドメインのサブユニットは、更に、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃを含み、ホール改変を含むＦｃドメインのサブユニットは、更に、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃを含む。これら２つのシステイン残基の導入によって、Ｆｃ領域の２つのサブユニット間にジスルフィド架橋が生成し、それにより、ダイマーをさらに安定化する（Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８，７－１５（２００１））。
「免疫グロブリンのＦｃ領域に等価な領域」は、天然に存在する免疫グロブリンのＦｃ領域の対立遺伝子バリアント及び置換、付加又は欠失を生じるが、エフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞毒性）に介在する免疫グロブリンの能力を実質的に低下させない変更を有するバリアントを含むことが意図される。例えば、１つ以上のアミノ酸は、生体機能を実質的に失うことなく、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端から欠失されていてもよい。このようなバリアントは、活性に対して最小限の影響を有するように、当該技術分野で知られた一般的な規則に従って選択することができる（例えば、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６－１０（１９９０）を参照）。
「エフェクター機能」との用語は、抗体のＦｃ領域に帰属可能な生体活性を指し、抗体アイソタイプによって変わる。抗体エフェクター機能の例としては、以下のものが挙げられる。Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、及びＢ細胞活性化。
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域による係合の後に、エフェクター機能を発揮するために受容体を含む細胞を刺激するシグナル伝達事象を誘発するＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体としては、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が挙げられる。特定の活性化Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ０８６３７，ｖｅｒｓｉｏｎ １４１を参照）。
「ペプチドリンカー」との用語は、１つ以上のアミノ酸、典型的には、約２～２０のアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは、当該技術分野で知られているか、又は本明細書に記載される。適切な非免疫原性リンカーペプチドは、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーであり、ここで、「ｎ」は、一般的に、１～１０、典型的には２～４、特に、２の数字であり、すなわち、ＧＧＧＧＳ（配列番号１２９）ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３０）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１３１）及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１３２）からなる群から選択されるペプチドであるだけではなく、配列ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号１３３）、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号１３４）、（Ｇ４Ｓ）４（配列番号１３５）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１３６）、ＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号１３７）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号１３８）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号１３９）、ＧＧＳＧ（配列番号１４０）、ＧＧＳＧＮＧＳＧ（配列番号１４１）、ＧＧＮＧＳＧＳＧ（配列番号１４２）及びＧＧＮＧＳＧ（配列番号１４３）を含む。特定の目的のペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）（配列番号１２９）、（Ｇ４Ｓ）２又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３０）、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号１３４）及び（Ｇ４Ｓ）４（配列番号１３５）、より特定的には（Ｇ４Ｓ）２又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３０）である。
「～に融合する」又は「～に接続する」とは、構成要素（例えば、抗原結合ドメイン及びＦｃドメイン）が、ペプチド結合によって直接的に、又は１つ以上のペプチドリンカーを介して連結することを意味する。
「アミノ酸」との用語は、本明細書中で使用される場合、アラニン（三文字コード：ａｌａ、一文字コード）Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リシン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシα－アミノ酸の一群を示す。
参照ポリペプチド（タンパク質）配列に対する「アミノ酸配列の同一性率（％）」は、配列をアラインメントし、最大の配列同一性率を達成するために、必要ならばギャップを導入した後、配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮せずに、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の割合であると定義される。アミノ酸配列同一性率を決定するためのアラインメントは、当該技術分野の技術の範囲内にある種々の様式で、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ．ＳＡＷＩ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを用いて達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含め、配列をアラインメントするのに適切なパラメータを決定することができる。しかし、本発明の目的のために、アミノ酸配列同一性％の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を用いて作られる。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって書かれたものであり、ソースコードは、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ Ｏｆｆｉｃｅ（ワシントンＤ．Ｃ．、２０５５９）のユーザドキュメンテーションにファイルされており、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（サウスサンフランシスコ、カリフォルニア）から公的に入手可能であるか、又はソースコードからコンパイルされてもよい。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含め、ＵＮＩＸオペレーティングシステムで使用するためにコンパイルすべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定されており、変わらない。ＡＬＩＧＮ－２がアミノ酸配列比較に使用される状況では、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又は所与のアミノ酸配列Ｂに対する所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（又は、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又は所与のアミノ酸配列Ｂに対する特定のアミノ酸配列同一性％を有するか、又は含む所与のアミノ酸配列Ａと呼ぶことができる）は、以下のように計算される。
分数Ｘ／Ｙの１００倍。
ここで、Ｘは、Ａ及びＢのこのプログラムのアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２によって同一性マッチとしてスコアリングされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の合計数である。アミノ酸配列Ａの長さが、アミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性％は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性％に等しくないことが理解されるだろう。他の意味であると具体的に述べられていない限り、本明細書で使用されるアミノ酸配列同一性％の値は全て、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを用いる直前の段落に記載されるように得られる。
特定の態様では、本明細書で提供される本発明の二重特異性抗体のアミノ酸配列バリアントが想定される。例えば、二重特異性抗体の結合アフィニティ及び／又は他の生体特性を改良することが望ましい場合がある。二重特異性抗体のアミノ酸配列バリアントは、分子をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することによって調製されてもよく、又はペプチド合成によって調製されてもよい。このような改変としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は抗体のアミノ酸配列内の残基への挿入、及び／又は抗体のアミノ酸配列内の残基の置換が挙げられる。欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせは、最終構築物が、所望の特徴（例えば、抗原結合）を有する限り、最終構築物に到達するように行うことができる。置換による突然変異生成のための目的部位としては、ＨＶＲ及びフレームワーク（ＦＲ）が挙げられる。保存的置換は、「好ましい置換」の見出しで表Ｂに与えられており、アミノ酸側鎖クラス（１）～（６）を参照しつつ、以下に更に記載される。アミノ酸置換は、目的の分子及び所望な活性（例えば、抗原結合の保持／向上、免疫原性の低下、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの向上）についてスクリーニングされた産物に導入されていてもよい。
Figure 0006997212000002
アミノ酸は、共通の側鎖特性に従ってグループ分けされてもよい。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ，Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ，Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴うだろう。
「アミノ酸配列バリアント」との用語は、親抗原結合分子（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基中にアミノ酸置換が存在する実質的なバリアントを含む。一般的に、更なる試験のために選択され、得られたバリアントは、親抗原結合分子と比較して、特定の生物学的特性の改変（例えば、改良）（例えば、アフィニティの増加、免疫原性の低下）を有し、及び／又は親抗原結合分子の特定の生物学的特性を実質的に保持しているだろう。例示的な置換バリアントは、アフィニティ成熟した抗体であり、例えば、本明細書に記載されるようなファージディスプレイに基づくアフィニティ成熟技術を用い、簡便に作成されてもよい。簡単に言うと、１つ以上のＨＶＲ残基は、変異しており、ファージディスプレイされ、特定の生体活性（例えば、結合アフィニティ）についてスクリーニングされたバリアント抗原結合分子である。特定の実施形態では、置換、挿入又は欠失は、このような変更が、抗原結合分子が抗原に結合する能力を実質的に減らさない限り、１つ以上のＨＶＲ内で起こってもよい。例えば、結合アフィニティを実質的に低下させない保存的変更（例えば、本明細書に提供される保存的置換）が、ＨＶＲ中に作られてもよい。変異を標的とし得る抗体の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１－１０８５によって記載されるように、「アラニンスキャンニング突然変異生成」と呼ばれる。この方法では、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、残基又は標的残基群（例えば、帯電した残基、例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕ）が同定され、中性又は負に帯電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）によって置き換えられる。更なる置換が、初期置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入されてもよい。これに代えて、又はこれに加えて、抗体と抗原との間の接触点を同定するための、抗原－抗原結合分子複合体の結晶構造。このような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされるか、又は除去されてもよい。バリアントは、所望な特性を有するか否かを判定するためにスクリーニングされてもよい。
アミノ酸配列挿入としては、１個の残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さ範囲を融合するアミノ末端及び／又はカルボキシル末端、及び１個又は複数のアミノ酸残基の配列な挿入が挙げられる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する二重特異性抗体が挙げられる。分子の他の挿入としては、二重特異性抗体の血清半減期を延ばすポリペプチドに対する、Ｎ末端又はＣ末端に対する融合が挙げられる。
特定の態様では、本明細書で提供される二重特異性抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるように変更される。分子のグリコシル化バリアントは、１つ以上のグリコシル化部位が作成されるか、又は除去されるようにアミノ酸配列を変えることによって、簡便に得られるだろう。例えば、Ｆｃドメインに接続する炭水化物が変更されてもよい。哺乳動物細胞によって作られるネイティブ抗体は、典型的には、一般的に、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に対するＮ結合によって接続する、分岐した二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ１５：２６－３２（１９９７）を参照。オリゴ糖は、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース及びシアル酸などの種々の炭水化物を含んでいてもよく、二分岐オリゴ糖構造の「幹」にあるＧｌｃＮＡｃに接続するフコースを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、特定の改良された特性を有するバリアントを作成するために、本発明の二重特異性抗体中のオリゴ糖改変が行われてもよい。一態様では、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）接続するフコースを欠いた炭水化物構造を有する二重特異性抗体のバリアントが提供される。このようなフコシル化バリアントは、改良されたＡＤＣＣ機能を有していてもよい。例えば、米国特許公開第ＵＳ ２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）又はＵＳ ２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照。本発明の二重特異性抗体の更なるバリアントは、二分されたオリゴ糖を有するもの、例えば、Ｆｃ領域に接続した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されているものを含む。このようなバリアントは、フコシル化の低下及び／又はＡＤＣＣ機能の向上を有していてもよく、例えば、ＷＯ ２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ－Ｍａｉｒｅｔ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）及びＵＳ ２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａｅｔ ａｌを参照のこと。Ｆｃ領域に接続したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有するバリアントも提供される。このような抗体バリアントは、改良されたＣＤＣ機能を有する場合があり、例えば、ＷＯ １９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．）、ＷＯ １９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ、Ｓ．）及びＷＯ １９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ、Ｓ．）に記載される。
特定の態様では、本発明の二重特異性抗体のシステイン操作されたバリアント、例えば、分子の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている「ｔｈｉｏＭＡｂ」を作成することが望ましい場合がある。特定的な実施形態では、置換された残基は、分子の接近可能な部位で生じる。これらの残基をシステインと置換することによって、反応性チオール基は、抗体の接近可能な部位に位置しており、これを使用し、抗体を他の部分（例えば、薬物部分又はリンカー－薬物部分）に対して抱合させ、免疫抱合体を作成してもよい。特定の実施形態では、以下の残基の任意の１つ以上が、システインで置換されていてもよい。軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）、重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）、重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン操作された抗原結合分子は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されるように作成されてもよい。
特定の態様では、本明細書で提供される二重特異性抗体は、当該技術分野で知られており、容易に入手可能な、更なる非タンパク質性部分を含むように改変されてもよい。抗体の誘導体化に適した部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーが挙げられる。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、及びこれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、その水中での安定性に起因して、製造時に利点があるだろう。このポリマーは、任意の分子量を有していてもよく、分岐していてもよく、又は分岐していなくてもよい。抗体に接続するポリマーの数は、さまざまであってもよく、１つより多いポリマーが接続する場合、ポリマーは、同じ分子であってもよく、又は異なる分子であってもよい。一般的に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、改良される抗体の特定の特性又は機能、二重特異性抗体誘導体が規定の条件下で使用されるかなどを含む限定事項に基づいて決定することができる。
別の態様では、放射線にさらされることによって選択的に加熱され得る、抗体と非タンパク質性部分の抱合体が提供される。一実施形態では、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである（Ｋａｍ，Ｎ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２（２００５）１１６００－１１６０５）。放射線は、任意の波長を有していてもよく、限定されないが、通常の細胞に有害ではないが、非タンパク質性部分を、抗体非タンパク質性部分に近位の細胞が死滅する温度まで加熱する波長を含む。
「免疫抱合体」は、限定されないが、細胞毒性薬剤を含め、１つ以上の異種分子に抱合される抗体である。
「ポリヌクレオチド」との用語は、単離された核酸分子又は構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合又は従来の結合以外の結合（例えば、アミド結合、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）中に見出されるもの）を含んでいてもよい。「核酸分子」との用語は、任意の１つ以上の核酸セグメント、例えば、ポリヌクレオチド中に存在するＤＮＡ又はＲＮＡフラグメントを指す。
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドとは、その天然環境から取り出された、核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡを意図している。例えば、ベクターに含まれるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離されたポリヌクレオチドの更なる例としては、異種宿主細胞内に維持されるか、又は溶液中で精製される（部分的に、又は実質的に）、組換えポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたポリヌクレオチドは、元々そのポリヌクレオチド分子を含む細胞に含まれているが、そのポリヌクレオチド分子が、染色体外に存在するか、又はその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在するポリヌクレオチド分子を含む。単離されたＲＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの本発明のＲＮＡ転写物、及びポジティブ及びネガティブの鎖形態、二本鎖形態を含む。本発明に係る単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、更に、合成によって作られるこのような分子を含む。これに加え、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターなどの制御要素であってもよく、又はこれらの制御要素を含んでいてもよい。
本発明の参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも、例えば９５％「同一の」ヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドとは、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチドあたり５個までの点変異を含んでいてもよいことを除けば、参照配列に対して同一であることを意図している。言い換えると、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中のヌクレオチドの５％までが、欠失していてもよく、又は別のヌクレオチドで置換されていてもよく、又は参照配列中の全ヌクレオチドの５％までが、参照配列に挿入されていてもよい。参照配列のこれらの変更は、参照ヌクレオチド配列の５’又は３’末端位置で、又はこれらの末端位置の間のどこかで起こってもよく、参照配列中の残基中で個々に散在していてもよく、又は参照配列中の１つ以上の連続した基の中に散在していてもよい。実際の様式として、任意の特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、既知のコンピュータプログラム、例えば、ポリペプチドについて上に記載したもの（例えば、ＡＬＩＧＮ－２）を用いて、従来通りに決定することができる。
「発現カセット」との用語は、組換えによって、又は合成によって作られるポリヌクレオチドを指し、標的細胞内の特定の核酸の転写が可能な特定の一連の核酸要素を含む。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス又は核酸フラグメントに組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、配列の中でも特に、転写される核酸配列とプロモーターとを含む。特定の実施形態では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド配列又はそのフラグメントを含む。
「ベクター」又は「発現ベクター」との用語は、「発現構築物」と同義語であり、細胞に作動可能に会合する特定の遺伝子の発現を導入し、指令するために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、及び導入される宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターによって、安定なｍＲＮＡを大量に転写することができる。発現ベクターが標的細胞内に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質は、細胞内転写及び／又は翻訳機構によって産生される。一実施形態では、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド配列又はそのフラグメントを含む発現カセットを含む。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」との用語は、相互に置き換え可能に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、かかる細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、これらは、継代数にかかわらず、初代の形質転換された細胞と、初代の形質転換された細胞から誘導された子孫を含む。子孫は、親細胞の核酸含有量と完全に同一でなくてもよいが、変異を含んでいてもよい。元々の形質転換された細胞についてスクリーニングされるか、又は選択されるのと同じ機能又は生体活性を有する変異体子孫が本発明に含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗体を生成するために使用可能な任意の種類の細胞系である。特に、宿主細胞は、原核生物又は真核生物の宿主細胞である。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、哺乳動物培養細胞、例えば、ほんの数例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織に含まれる細胞も含まれる。
ある薬剤の「有効量」は、その薬剤が投与される細胞又は組織において、ある生理学的変化を引き起こすのに必要な量を指す。
ある薬剤（例えば、医薬組成物）の「治療有効量」は、所望な治療結果又は予防結果を達成するのに有効な量、必要な投薬量及び必要な期間を指す。ある薬剤の治療有効量は、例えば、ある疾患の副作用をなくし、減らし、遅らせ、最低限にし、又は防ぐ。
「個体」又は「被験体」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられる。特に、個体又は被験体は、ヒトである。
「医薬組成物」との用語は、その中に含まれる有効成分の生体活性を有効にし、製剤が投与される被験体に対して受け入れられないほど毒性である更なる構成要素を含まないような形態での製剤を指す。
「医薬的に許容される賦形剤」は、医薬組成物中の成分であって、有効成分以外であり、被験体にとって毒性ではない成分を指す。医薬的に許容される賦形剤としては、限定されないが、バッファー、安定化剤又は防腐剤が挙げられる。
「パッケージ添付文書」との用語は、治療製品の市販パッケージに通常含まれる指示を指すために用いられ、このような治療製品に関する適応症、使用、投薬量、投与、併用療法、禁忌及び／又は警告に関する情報を含む。
本明細書で使用される場合、「処置」（及びその文法的な変形語、例えば、「処置する」又は「処置すること」）は、処置される個体において本来の経過を変える試みにおける臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の経過の間に行うことができる。所望な処置効果としては、限定されないが、疾患の発生又は再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病的状態、転移の予防、疾患の進行率を下げる、疾患状態の軽減又は緩和、回復又は改良された予後が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の分子を使用し、疾患の発生を遅らせるか、又は疾患の進行を遅らせる。
「癌」との用語は、本明細書で使用される場合、増殖性疾患、例えば、リンパ腫、リンパ性白血病、肺癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）癌、肺胞細胞性肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部又は頸部の癌、皮膚又は眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、消化器癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵管癌腫、子宮内膜癌腫、頸部の癌腫、膣の癌腫、陰門の癌腫、ホジキン病、食道の癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織の肉腫尿道の癌、陰茎癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓又は尿管の癌、腎細胞癌腫、腎盂癌腫、中皮腫、肝細胞癌、胆管癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形性膠芽腫、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌腫、下垂体腺腫及びユーイング肉腫（上述のいずれかの癌の難治性態様を含む）、又は上述の癌の１つ以上の組み合わせを指す。
本発明の二重特異性抗体
本発明は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ３）に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、生産性、安定性、結合アフィニティ、生体活性、特定のＴ細胞の特異的な標的化、標的化効率及び毒性の低下など、特に有利な特性を有する新規な二重特異性抗体を提供する。
特定の態様では、Ｔ細胞表面に結合する際にインターナリゼーションの低下を示す、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体が提供される。インターナリゼーションは、標的受容体がＴＣＲシグナル伝達を阻害する準備ができた細胞表面で迅速に再発現しつつ、数時間以内に分解し得る分子の重要なシンクを表す。更なる態様では、Ｔｒｅｇに対してよりも、従来のＴ細胞に対して優先的に結合する、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体が提供される。このことは、ブロッキング抗体を用いたＴｒｅｇ上のＬＡＧ－３の標的化が、その抑制機能を増加させ、最終的に他のＴ細胞に対する正のブロッキング効果を覆い隠すことによって悪化し得るため、有利である。更なる態様では、Ｔｒｅｇ抑制からＴ細胞エフェクター機能を守ることができる、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体が提供される。別の態様では、本明細書で提示されるアッセイで示されるように、腫瘍細胞株ＡＲＨ７７と共に培養すると、ＣＤ４ Ｔ細胞によるグランザイムＢ分泌を誘発することができる、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体が提供される。更なる態様では、腫瘍特異的なＴ細胞エフェクター機能の増加を示し、及び／又はＴ細胞の細胞毒性効果を高める、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体が提供される。別の態様では、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍根絶の増加を示す、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体が提供される。
Ａ．ＰＤ１及びＬＡＧ３に結合する例示的な二重特異性抗体
一態様では、本発明は、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３とを含むＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３とを含むＶＬドメインとを含む、二重特異性抗体を提供する。
一態様では、二重特異性抗体は、ＩｇＧであるＦｃドメイン、特に、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含み、Ｆｃドメインは、エフェクター機能を低下させるか、又は無効にしさえする。特に、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体に対する結合を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。
更なる態様では、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、二重特異性抗体が、ＩｇＧであるＦｃドメイン、特に、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含み、Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体に対する結合を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、二重特異性抗体が提供される。
別の態様では、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインが、
（ａ）
（ｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３とを含むＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３とを含むＶＬドメインとを含むか、又は
（ｂ）
（ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３とを含むＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３とを含むＶＬドメインとを含むか、又は
（ｃ）
（ｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３とを含むＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３とを含むＶＬドメインとを含むか、又は
（ｄ）
（ｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３とを含むＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３とを含むＶＬドメインとを含むか、又は
（ｅ）
（ｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３とを含むＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３とを含むＶＬドメインとを含む、二重特異性抗体が提供される。
更なる態様では、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｃ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｄ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｅ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、二重特異性抗体が提供される。
別の態様では、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが、
（ａ）
（ｉ）配列番号８０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号８２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３とを含むＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号８３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号８４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号８５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３とを含むＶＬドメインとを含むか、又は
（ｂ）
（ｉ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号９０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３とを含むＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号９１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号９２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３とを含むＶＬドメインとを含む、二重特異性抗体が提供される。
一態様では、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号８６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号８７のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）配列番号９４のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号９５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、二重特異性抗体が提供される。
別の態様では、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｃ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｄ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｅ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、二重特異性抗体が提供される。
別の態様では、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３とを含むＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３とを含むＶＬドメインとを含む、二重特異性抗体が提供される。
更なる態様では、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｃ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号６５のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｄ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、二重特異性抗体が提供される。
特定の態様では、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、
ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが、配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含み、
ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインが、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、二重特異性抗体が提供される。
一態様では、本発明の二重特異性抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む。
更なる態様では、本発明の二重特異性抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む。
別の態様では、本発明の二重特異性抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、配列番号６２のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む。
更なる別の態様では、本発明の二重特異性抗体は、配列番号８６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号８７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、配列番号６２のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む。
更なる別の態様では、本発明の二重特異性抗体は、配列番号９４のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号９５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、配列番号６２のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む。
更なる態様では、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である。特に、二重特異性抗体は、ヒト化抗体又はキメラ抗体である。
一態様では、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、二価である。このことは、二重特異性抗体が、ＰＤ１に特異的に結合する１個の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する１個の抗原結合ドメインとを含む（１＋１フォーマット）ことを意味する。
一態様では、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、二重特異性抗体が、Ｆｃドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第１のＦａｂフラグメントと、ＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第２のＦａｂフラグメントとを含む、二重特異性抗体が提供される。特定の態様では、Ｆａｂフラグメントの１つにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨは、ＶＨドメインが軽鎖の一部であり、ＶＬドメインが重鎖の一部であるように互いに置き換わっている。特定の態様では、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第１のＦａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨは、互いに置き換わっている。
特定の態様では、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、二重特異性抗体が、
（ａ）配列番号９６の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号９８の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、
配列番号９７の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号９９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｂ）配列番号９６の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号９８の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、
配列番号１００の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｃ）配列番号１０２の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１０４の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、
配列番号１０３の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｄ）配列番号１０６の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１０７の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、
配列番号１０３の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む、二重特異性抗体が提供される。
より特定的には、二重特異性抗体は、
（ａ）配列番号９６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号９８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、
配列番号９７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号９９のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｂ）配列番号９６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号９８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、
配列番号１００のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０１のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｃ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１０４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、
配列番号１０３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｄ）配列番号１０６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、
配列番号１０３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む。
より特定的には、二重特異性抗体は、配列番号９６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号９８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号１００のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０１のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む。
更なる態様では、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、二重特異性抗体が、Ｆｃドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第１のＦａｂフラグメントと、ＦｃドメインのＣ末端に融合するＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第２のＦａｂフラグメントとを含む、二重特異性抗体が提供される。特に、ＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含むＦａｂフラグメントは、そのＶＨドメインを介し、ＦｃドメインのＣ末端に融合している（ｔｒａｎｓ １＋１フォーマット）。
特定の態様では、二重特異性抗体は、配列番号９６の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号９８の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号１４４の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む。より特定的には、二重特異性抗体は、配列番号９６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号９８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号１４４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０１のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む。
更なる態様では、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、二重特異性抗体が、Ｆｃドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第１のＦａｂフラグメントと、ＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第２のＦａｂフラグメントと、ＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第３のＦａｂフラグメントとを含む、二重特異性抗体が提供される。特定の態様では、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含むＦａｂフラグメントは、重鎖の１つのＣ末端にペプチドリンカーを介して融合している。
この態様では、二重特異性抗体は、三価であり、ＬＡＧ３に対する二価の結合と、ＰＤ１に対する一価の結合を有する。このことは、二重特異性抗体が、ＰＤ１に特異的に結合する１個の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する２個の抗原結合ドメインとを含む（２＋１フォーマット）ことを意味する。
特定の態様では、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、二重特異性抗体が、
（ａ）配列番号１１８の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１１５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、
配列番号１１９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む２つの第２の軽鎖、又は
（ｂ）配列番号１２０の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１１５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、
配列番号１２１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号９９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む２つの第２の軽鎖、又は
（ｃ）配列番号１２２の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１１５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、
配列番号１０３の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む２つの第２の軽鎖を含む、二重特異性抗体が提供される。
より特定的には、二重特異性抗体は、
（ａ）配列番号１１８のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号１１９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０１のアミノ酸配列を含む２つの第２の軽鎖、又は
（ｂ）配列番号１２０のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号１２１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号９９のアミノ酸配列を含む２つの第２の軽鎖、又は
（ｃ）配列番号１２２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号１０３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む２つの第２の軽鎖を含む。
更なる態様では、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、二重特異性抗体が、Ｆｃドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第１のＦａｂフラグメントと、ＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第２のＦａｂフラグメントと、ＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第３のＦａｂフラグメントとを含み、ＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含むＦａｂフラグメントの１つが、重鎖の１つのＣ末端にペプチドリンカーを介して融合している（ｔｒａｎｓ ２＋１フォーマット）、二重特異性抗体が提供される。
特定の態様では、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、二重特異性抗体が、配列番号９６の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号９８の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号１４５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む２つの第２の軽鎖とを含む、二重特異性抗体が提供される。より特定的には、二重特異性抗体は、配列番号９６の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号９８の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号１４５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む２つの第２の軽鎖とを含む。
更なる態様では、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、二重特異性抗体が、Ｆｃドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインをそれぞれ含む２つのＦａｂフラグメントと、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む短鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）とを含む、二重特異性抗体が提供される。特に、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含むｓｃＦａｂは、重鎖の１つのＣ末端にペプチドリンカーを介して融合している。
特定の態様では、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、二重特異性抗体が、
（ａ）配列番号１２３の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１１９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、又は
（ｂ）配列番号１２４の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１２１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号９９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの軽鎖、又は
（ｃ）配列番号１２５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１０３の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む、二重特異性抗体が提供される。
より特定的には、二重特異性抗体は、
（ａ）配列番号１２３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１１９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０１のアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの軽鎖、又は
（ｂ）配列番号１２４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１２１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号９９のアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの軽鎖、又は
（ｃ）配列番号１２５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１０３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０５のアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの軽鎖を含む。
更なる態様では、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、二重特異性抗体が、Ｆｃドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインをそれぞれ含む２つのＦａｂフラグメントと、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含むＶＨ及びＶＬドメインとを含む、二重特異性抗体が提供される。特に、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインのＶＨドメインは、重鎖の１つのＣ末端にペプチドリンカーを介して融合しており、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインのＶＬドメインは、重鎖のもう一方のＣ末端にペプチドリンカーを介して融合している。
特定の態様では、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、二重特異性抗体が、配列番号１２６の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１２７の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの軽鎖とを含む、二重特異性抗体が提供される。より特定的には、二重特異性抗体は、配列番号１２６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１２７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０９のアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの軽鎖を含む。
更なる態様では、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、二重特異性抗体が、Ｆｃドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第１のＦａｂフラグメントと、ＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第２のＦａｂフラグメントと、ＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第３のＦａｂフラグメントと、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第４のＦａｂフラグメントとを含む、二重特異性抗体が提供される。
この態様では、二重特異性抗体は、四価であり、ＬＡＧ３に対する二価の結合と、ＰＤ１に対する二価の結合を有する。このことは、二重特異性抗体が、ＰＤ１に特異的に結合する２個の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する２個の抗原結合ドメインとを含む（２＋２フォーマット）ことを意味する。
一態様では、本発明の二重特異性抗体は、
（ａ）ＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む２つのＦａｂフラグメントを含む抗体の２つの軽鎖と２つの重鎖と、
（ｂ）ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む２つの更なるＦａｂフラグメントとを含み、前記更なるＦａｂフラグメントは、それぞれ、（ａ）の重鎖のＣ末端に対してペプチドリンカーを介して接続する。
特定の態様では、ペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）４である。別の態様では、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む２つの更なるＦａｂフラグメントは、クロスオーバーＦａｂフラグメントであり、可変ドメインＶＬ及びＶＨは、互いに置き換わっており、ＶＬ－ＣＨ鎖は、それぞれ、（ａ）の重鎖のＣ末端に対してペプチドリンカーを介して接続する。
一態様では、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインをそれぞれ含む２つのＦａｂフラグメントが、それぞれ、重鎖の１つのＣ末端にペプチドリンカーを介してそれぞれ融合している、二重特異性抗体が提供される。
特定の態様では、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、二重特異性抗体が、
（ａ）配列番号１１４の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの重鎖と、配列番号１１５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの第１の軽鎖と、配列番号１０１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの第２の軽鎖、又は
（ｂ）配列番号１１６の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの重鎖と、配列番号１１５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの第１の軽鎖と、配列番号９９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの第２の軽鎖、又は
（ｃ）配列番号１１７の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの重鎖と、配列番号１１５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの第１の軽鎖と、配列番号１０５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む２つの第２の軽鎖を含む、二重特異性抗体が提供される。
より特定的には、二重特異性抗体は、
（ａ）配列番号１１４のアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの重鎖と、配列番号１１５のアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの第１の軽鎖と、配列番号１０１のアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの第２の軽鎖、又は
（ｂ）配列番号１１６のアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの重鎖と、配列番号１１５のアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの第１の軽鎖と、配列番号９９のアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの第２の軽鎖、又は
（ｃ）配列番号１１７のアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの重鎖と、配列番号１１５のアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの第１の軽鎖と、配列番号１０５のアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの第２の軽鎖を含む。
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を下げるＦｃドメイン改変
特定の態様では、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、二重特異性抗体が、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体に対する結合を低下させ、エフェクター機能を低下させるか、又は無効にする１つ以上のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む、二重特異性抗体が提供される。
特定の態様では、１つ以上のアミノ酸改変は、本明細書で提示される抗体のＦｃ領域に導入されてもよく、それにより、Ｆｃ領域バリアントを作成する。Ｆｃ領域バリアントは、１つ以上のアミノ酸位置でアミノ酸改変（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含んでいてもよい。
以下の章は、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃドメイン改変を含む、本発明の二重特異性抗原結合分子の好ましい態様を記載する。一態様では、本発明は、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む、二重特異性抗体に関し、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体、特に、Ｆｃγ受容体に対する結合を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。特に、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を有する、ヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインである。
Ｆｃドメインは、本発明の二重特異性抗体に、標的組織への良好な蓄積に寄与する長い血清半減期、望ましい組織－血液分布比を含め、望ましい薬物動態特性を与える。しかし、同時に、好ましい抗原を含む細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞に対する本発明の二重特異性抗体の望ましくない標的化を引き起こす場合がある。したがって、特定的な実施形態では、本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインは、ネイティブＩｇＧ Ｆｃドメイン、特に、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ ドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合アフィニティの低下及び／又はエフェクター機能の低下を示す。より特定的には、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。
１つのこのような態様では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）は、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又はネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合アフィニティの５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満の結合アフィニティを示し、及び／又はネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又はネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満のエフェクター機能を示す。一態様では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合せず、及び／又はエフェクター機能を誘発しない。特定の態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一態様では、Ｆｃ受容体は、阻害性Ｆｃ受容体である。具体的な態様では、Ｆｃ受容体は、阻害性ヒトＦｃγ受容体、より特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＢである。一態様では、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びサイトカイン分泌のうち１つ以上である。特定の態様では、エフェクター機能は、ＡＤＣＣである。一態様では、Ｆｃドメインのドメインは、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対して実質的に同様の結合アフィニティを示す。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）が、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又はネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）と比較して、ＦｃＲｎに対して約７０％より大きく、特に約８０％より大きく、より特定的には約９０％より大きい結合アフィニティを示す場合に達成される。
特定の態様では、Ｆｃドメインは、操作されていないＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合アフィニティが低下し、及び／又はエフェクター機能が低下するように操作される。特定の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合アフィニティ及び／又はエフェクター機能を下げる１つ以上のアミノ酸変異を含む。典型的には、Ｆｃドメインの２つのサブユニットそれぞれに、同じ１つ以上のアミノ酸変異が存在する。一態様では、アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合アフィニティを下げる。別の態様では、アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合アフィニティを、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１、又は少なくとも１０分の１に下げる。一態様では、操作されたＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子は、操作されていないＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合アフィニティの２０％未満、特に１０％未満、より特定的には５％未満を示す。特定の態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。別の態様では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は、阻害性Ｆｃ受容体である。具体的な態様では、Ｆｃ受容体は、阻害性ヒトＦｃγ受容体、より特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＢである。いくつかの態様では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これらそれぞれの受容体に対する結合が低下する。いくつかの態様では、相補性構成要素に対する結合アフィニティ（特定的にはＣ１ｑに対する結合アフィニティ）も低下する。一態様では、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合アフィニティは、低下しない。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合（すなわち、前記受容体に対するＦｃドメインの結合アフィニティの保護）は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）が、ＦｃＲｎに対するＦｃドメインの操作されていない形態（又はＦｃのこの操作されていない形態を含む本発明の二重特異性抗原結合分子）の結合アフィニティの約７０％を超える結合アフィニティを示す場合に達成される。Ｆｃドメイン、又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子は、このようなアフィニティの約８０％より大きく、更に約９０％より大きいアフィニティを示してもよい。特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、操作されていないＦｃドメインと比較して、エフェクター機能が低下するように操作される。エフェクター機能の低下としては、限定されないが、以下の１つ以上が挙げられ得る。
補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低下、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低下、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）の低下、サイトカイン分泌の低下、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低下、ＮＫ細胞に対する結合の低下、マクロファージに対する結合の低下、単球に対する結合の低下、多形核細胞に対する結合の低下、直接的なシグナル伝達誘発性アポトーシスの低下、樹状細胞成熟の低下、又はＴ細胞プライミングの低下。
エフェクター機能が低下した抗体としては、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の１つ以上の置換を有するものが挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。このようなＦｃ変異体としては、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうち２つ以上での置換を有するＦｃ変異体が挙げられ、残基２６５及び２９７がアラニンに置換されている、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。ＦｃＲに対する結合が向上又は減少した特定の抗体バリアントが記載される。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、ＷＯ ２００４／０５６３１２号及びＳｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）６５９１－６６０４。）
本発明の一態様では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の位置にアミノ酸置換を含む。いくつかの態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（「ＬＡＬＡ」）を含む。１つのこのような実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。一態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９にアミノ酸置換を含む。より具体的な態様では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである。一実施形態では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９にアミノ酸置換を含み、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓからなる群から選択される更なるアミノ酸置換を含む。より特定的な実施形態では、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含む（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」）。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」の組み合わせは、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ ２０１２／１３０８３１ Ａ１号に記載されるように、ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体の結合をほとんど完全になくす。前記文書は、このような変異Ｆｃドメインを調製するための方法、及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能などの特性を決定するための方法も記載する。このような抗体は、変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するか、又は変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを有するＩｇＧ１である（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌのＥＵインデックスによる番号付け、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ Ｅｄ．、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１）。
一態様では、本発明の二重特異性抗体は、（ｉ）場合により変異Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有する、ヒトＩｇＧ１サブクラスのホモダイマーＦｃ領域、又は（ｉｉ）場合により変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅを有する、ヒトＩｇＧ４サブクラスのホモダイマーＦｃ領域、又は（ｉｉｉ）場合により変異Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを有するか、又は場合により変異Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを有する、ヒトＩｇＧ１サブクラスのホモダイマーＦｃ領域、又は（ｉｖ）１つのＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｗを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが、変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含むか、又は１つのＦｃ領域ポリペプチドが、変異Ｔ３６６Ｗ及びＹ３４９Ｃを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが、変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＳ３５４Ｃを含むか、又は１つのＦｃ領域ポリペプチドが、変異Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが、変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含む、ヘテロダイマーＦｃ領域、又は（ｖ）両Ｆｃ領域ポリペプチドが、変異Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含み、１つのＦｃ領域ポリペプチドが、変異Ｔ３６６Ｗを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが、変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含むか、又は１つのＦｃ領域ポリペプチドが、変異Ｔ３６６Ｗ及びＹ３４９Ｃを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが、変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＳ３５４Ｃを含むか、又は１つのＦｃ領域ポリペプチドが、変異Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが、変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含む、ヒトＩｇＧ１サブクラスのヘテロダイマーＦｃ領域を含む（全て、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる位置）。
一態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。より具体的な実施形態では、Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインである（Ｋａｂａｔ番号付け）。より具体的な実施形態では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇを含む、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。このアミノ酸置換は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＩｇＧ４抗体のＦａｂアーム交換を減らす（Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ３８，８４－９１（２０１０）を参照）。したがって、一態様では、二重特異性抗体であって、（全て、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる位置）両Ｆｃ領域ポリペプチドが、変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅを含み、１つのＦｃ領域ポリペプチドが、変異Ｔ３６６Ｗを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが、変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含むか、又は１つのＦｃ領域ポリペプチドが、変異Ｔ３６６Ｗ及びＹ３４９Ｃを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが、変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＳ３５４Ｃを含むか、又は１つのＦｃ領域ポリペプチドが、変異Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが、変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含む、ヒトＩｇＧ４サブクラスのヘテロダイマーＦｃ領域を含む二重特異性抗体が提供される。
半減期が長くなり、新生児Ｆｃ受容体に対する結合が向上した抗体は、胎児に対する成熟ＩｇＧの移動を担い（Ｇｕｙｅｒ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７（１９７６）５８７－５９３及びＫｉｍ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４（１９９４）２４２９－２４３４）、ＵＳ ２００５／００１４９３４号に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎに対するＦｃ領域の結合を向上させる１つ以上の置換を有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃバリアントとしては、以下の１つ以上のＦｃ領域残基に置換を有するバリアントが挙げられる：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換（米国特許第７，３７１，８２６号）。Ｆｃ領域バリアントの他の例に関して、Ｄｕｎｃａｎ，Ａ．Ｒ．及びＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．、Ｎａｔｕｒｅ ３２２（１９８８）７３８－７４０；ＵＳ ５，６４８，２６０号；ＵＳ ５，６２４，８２１号；及びＷＯ ９４／２９３５１号も参照。
Ｆｃ受容体に対する結合は、例えば、ＥＬＩＳＡによって、又はＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な装置と組換え発現によって得られ得るＦｃ受容体を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、容易に決定することができる。適切なこのような結合アッセイを本明細書に記載する。又は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメイン又はＦｃドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子の結合アフィニティは、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株（例えば、ＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞）を用いて評価されてもよい。Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体のエフェクター機能は、当該技術分野で既知の方法によって測定することができる。ＡＤＣＣを測定するのに適したアッセイを本明細書に記載する。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの他の例は、米国特許第５，５００，３６２号、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３，７０５９－７０６３（１９８６）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２，１４９９－１５０２（１９８５）、米国特許第５，８２１，３３７号、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６，１３５１－１３６１（１９８７）に記載される。又は、非放射性アッセイ方法を使用してもよい（例えば、フローサイトメトリー（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）のためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞毒性アッセイ、及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。これに代えて、又はこれに加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５，６５２－６５６（１９９８）に開示されるような動物モデルにおいて評価されてもよい。
以下の章は、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃドメイン改変を含む、本発明の二重特異性抗体の好ましい態様を記載する。一態様では、本発明は、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む、二重特異性抗体に関し、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体、特に、Ｆｃγ受容体に対する抗体の結合アフィニティを低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。別の態様では、本発明は、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む、二重特異性抗体に関し、Ｆｃドメインは、エフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。特定の態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を有する、ヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインである。
ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン改変
本発明の二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの片方又はもう一方に融合した異なる抗原結合ドメインを含み、そのため、Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、２つの非同一ポリペプチド鎖に含まれていてもよい。これらのポリペプチドの組換え同時発現及びその後の二量化によって、２つのポリペプチドのいくつかの可能な組み合わせが生じる。組換え産生における本発明の二重特異性抗体の収率及び純度を高めるために、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインに、所望なポリペプチドの会合を促進する改変を導入することが有利である。
したがって、特定の態様では、本発明は、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体に関し、ここで、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する改変を含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの２つのサブユニット間の最も長いタンパク質－タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内にある。したがって、一態様では、前記改変は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインの中にある。
具体的な態様では、前記改変は、いわゆる「ホールにノブを入れる」改変であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの１つに「ノブ」改変と、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの他の１つに「ホール」改変とを含む。したがって、本発明は、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性抗体に関し、ホールにノブを入れる方法に従って、Ｆｃドメインの第１のサブユニットがノブを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットがホールを含む。特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
ホールにノブを入れる技術は、例えば、ＵＳ ５，７３１，１６８号、ＵＳ ７，６９５，９３６号、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載される。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの界面にある突起（「ノブ」）と、第２のポリペプチドの界面にある空洞（「ホール」）とを導入することを含み、その結果、突起が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように空洞内に位置することができる。突起は、第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖を、もっと大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と交換することによって構築される。突起と同一又は同様の大きさの相補性空洞が、大きなアミノ酸側鎖を、より小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）と置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作られる。
したがって、一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内で位置換え可能な第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に突起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より小さな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成し、その中で、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が位置換え可能である。突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変えることによって、例えば、部位特異的変異導入法によって、又はペプチド合成によって作成することができる。具体的な態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、位置３６６のトレオニン残基が、トリプトファン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニット（のＣＨ３ドメイン）において、位置４０７のチロシン残基は、バリン残基と置き換わっている（Ｙ４０７Ｖ）。一態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、更に、位置３６６のトレオニン残基が、セリン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８のロイシン残基が、アラニン残基と置き換わっている（Ｌ３６８Ａ）。
なお更なる態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、更に、位置３５４のセリン残基が、システイン残基と置き換わっており（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、更に、位置３４９のチロシン残基が、システイン残基と置き換わっている（Ｙ３４９Ｃ）。これら２つのシステイン残基の導入によって、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間にジスルフィド架橋が生成し、ダイマーをさらに安定化する（Ｃａｒｔｅｒ（２００１），Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８，７－１５）。特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
しかし、ＥＰ １ ８７０ ４５９号に記載される他のホールにノブを入れる技術も、これに代えて、又はこれに加えて使用することができる。一実施形態では、多重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインに変異Ｒ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｅを含み、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインに変異Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一態様では、二重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＴ３６６Ｗ変異を含み、「ホール」鎖のＣＨ３ドメインに変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、更に、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインに変異Ｒ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｅを含み、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインに変異Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一態様では、二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの１つにおいて、変異Ｙ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、２つのＣＨ３ドメインの他方において、変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含むか、又は多重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの１つにおいて、変異Ｙ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、２つのＣＨ３ドメインの他方において、変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、更に、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおいて、変異Ｒ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｅを含み、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおいて、変異Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
代替的な態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する改変は、例えば、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ ２００９／０８９００４号に記載されるように、静電操縦効果に介在する改変を含む。一般的に、この方法は、２つのＦｃドメインサブユニットの界面に、ホモ二量体生成が静電的に望ましくないが、ヘテロ二量化が静電的に望ましいように、帯電したアミノ酸残基による１つ以上のアミノ酸残基の置き換えを含む。
「ホールにノブを入れる技術」の他に、ヘテロ二量体化を推進するために多重特異性抗体の重鎖のＣＨ３ドメインを改変するための他の技術は、当該技術分野で知られている。これらの技術、特に、ＷＯ ９６／２７０１１号、ＷＯ ９８／０５０４３１号、ＥＰ １８７０４５９号、ＷＯ ２００７／１１０２０５号、ＷＯ ２００７／１４７９０１号、ＷＯ ２００９／０８９００４号、ＷＯ ２０１０／１２９３０４号、ＷＯ ２０１１／９０７５４号、ＷＯ ２０１１／１４３５４５号、ＷＯ ２０１２／０５８７６８号、ＷＯ ２０１３／１５７９５４号及びＷＯ ２０１３／０９６２９１号に記載される技術は、二重特異性抗体と組み合わせて「ホールにノブを入れる」に対する代替として、本明細書で想定される。
一態様では、二重特異性抗体において、多重特異性抗体の第１の重鎖と第２の重鎖のヘテロダイマー化を補助するために、ＥＰ １８７０４５９号に記載される手法を用いる。この手法は、第１及び第２の重鎖の間のＣＨ３／ＣＨ３ドメイン界面における特定のアミノ酸位置への反対の電荷で帯電したアミノ酸の導入に基づく。
したがって、この態様では、多重特異性抗体の三次構造において、第１の重鎖のＣＨ３ドメインと第２の重鎖のＣＨ３ドメインは、それぞれの抗体ＣＨ３ドメインの間に存在する界面を形成し、第１の重鎖のＣＨ３ドメインのそれぞれのアミノ酸配列及び第２の重鎖のＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、それぞれ、抗体の三次構造中の前記界面内に位置する一連のアミノ酸を含み、界面に位置する一連のアミノ酸から、１つの重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、第１のアミノ酸が、正に帯電したアミノ酸によって置換されており、界面に位置する一連のアミノ酸から、他の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、第２のアミノ酸は、負に帯電したアミノ酸によって置換されている。この態様の二重特異性抗体は、本明細書では、「ＣＨ３（＋／－）操作された二重特異性抗体」とも呼ばれる（ここで、省略語「＋／－」は、それぞれのＣＨ３ドメインに導入されたのと反対の電荷に帯電したアミノ酸を表す）。
一態様では、ＣＨ３（＋／－）操作された二重特異性抗体において、正に帯電したアミノ酸は、Ｋ、Ｒ及びＨから選択され、負に帯電したアミノ酸は、Ｅ又はＤから選択される。
一態様では、ＣＨ３（＋／－）操作された二重特異性抗体において、正に帯電したアミノ酸は、Ｋ及びＲから選択され、負に帯電したアミノ酸は、Ｅ又はＤから選択される。
一態様では、ＣＨ３（＋／－）操作された二重特異性抗体において、正に帯電したアミノ酸は、Ｋであり、負に帯電したアミノ酸は、Ｅである。
一態様では、ＣＨ３（＋／－）操作された二重特異性抗体において、１つの重鎖のＣＨ３ドメイン中、位置４０９のアミノ酸ＲがＤによって置換されており、位置のアミノ酸ＫがＥによって置換されており、他の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置３９９のアミノ酸ＤがＫによって置換されており、位置３５７のアミノ酸ＥがＫによって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一態様では、多重特異性抗体の第１の重鎖と第２の重鎖のヘテロダイマー化を補助するために、ＷＯ ２０１３／１５７９５３号に記載される手法を用いる。一実施形態では、１つの重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置３６６のアミノ酸ＴがＫによって置換されており、他の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置３５１のアミノ酸ＬがＤによって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。別の実施形態では、１つの重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置３６６のアミノ酸ＴがＫによって置換されており、位置３５１のアミノ酸ＬがＫによって置換されており、他の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置３５１のアミノ酸ＬがＤによって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
別の態様では、１つの重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置３６６のアミノ酸ＴがＫによって置換されており、位置３５１のアミノ酸ＬがＫによって置換されており、他の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置３５１のアミノ酸ＬがＤによって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。更に、以下の置換の少なくとも１つが他の重鎖のＣＨ３ドメインに含まれる。位置３４９のアミノ酸ＹがＥによって置換されており、位置３４９のアミノ酸ＹがＤによって置換されており、位置３６８のアミノ酸ＬがＥによって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。一実施形態では、位置３６８のアミノ酸Ｌは、Ｅによって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一態様では、多重特異性抗体の第１の重鎖と第２の重鎖のヘテロダイマー化を補助するために、ＷＯ ２０１２／０５８７６８号に記載される手法を用いる。一態様では、１つの重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置３５１のアミノ酸ＬがＹによって置換されており、位置４０７のアミノ酸ＹがＡによって置換されており、他の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置３６６のアミノ酸ＴがＡによって置換されており、位置４０９のアミノ酸ＫがＦによって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。別の実施形態では、上述の置換に加え、他の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置４１１（元々はＴ）、３９９（元々はＤ）、４００（元々はＳ）、４０５（元々はＦ）、３９０（元々はＮ）及び３９２（元々はＫ）のアミノ酸の少なくとも１つが置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。好ましい置換は、以下である。
－ 位置４１１のアミノ酸Ｔを、Ｎ、Ｒ、Ｑ、Ｋ、Ｄ、Ｅ及びＷから選択されるアミノ酸で置換する（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、
－ 位置３９９のアミノ酸Ｄを、Ｒ、Ｗ、Ｙ及びＫから選択されるアミノ酸で置換する（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、
－ 位置４００のアミノ酸Ｄを、Ｅ、Ｄ、Ｒ及びＫから選択されるアミノ酸で置換する（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、
－ 位置４０５のアミノ酸Ｆを、Ｉ、Ｍ、Ｔ、Ｓ、Ｖ及びＷから選択されるアミノ酸で置換する（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、
－ 位置３９０のアミノ酸Ｎを、Ｒ、Ｋ及びＤから選択されるアミノ酸で置換する（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、
－ 位置３９２のアミノ酸Ｋを、Ｖ、Ｍ、Ｒ、Ｌ、Ｆ及びＥから選択されるアミノ酸で置換する（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
別の態様では、二重特異性抗体が、ＷＯ ２０１２／０５８７６８）号に従って操作されており、すなわち、１つの重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置３５１のアミノ酸ＬがＹによって置換されており、位置４０７のアミノ酸ＹがＡによって置換されており、他の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置３６６のアミノ酸ＴがＶによって置換されており、位置４０９のアミノ酸ＫがＦによって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。多重特異性抗体の別の実施形態では、１つの重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置４０７のアミノ酸ＹがＡによって置換されており、他の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置３６６のアミノ酸ＴがＡによって置換されており、位置４０９のアミノ酸ＫがＦによって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。後者の上述の実施形態では、他の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置３９２のアミノ酸ＫがＥによって置換されており、位置４１１のアミノ酸ＴがＥによって置換されており、位置３９９のアミノ酸ＤがＲによって置換されており、位置４００のアミノ酸ＳがＲによって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一態様では、多重特異性抗体の第１の重鎖と第２の重鎖のヘテロダイマー化を補助するために、ＷＯ ２０１１／１４３５４５号に記載される手法を用いる。一態様では、両重鎖のＣＨ３ドメイン中のアミノ酸改変は、位置３６８及び／又は４０９に導入される（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一態様では、二重特異性抗体の第１の重鎖と第２の重鎖のヘテロダイマー化を補助するために、ＷＯ ２０１１／０９０７６２号に記載される手法を用いる。ＷＯ ２０１１／０９０７６２号は、「ホールにノブを入れる」（ＫｉＨ）技術に従ったアミノ酸改変に関する。一実施形態では、１つの重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置３６６のアミノ酸ＴがＷによって置換されており、他の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置４０７のアミノ酸ＹがＡによって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。別の実施形態では、１つの重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置３６６のアミノ酸ＴがＹによって置換されており、他の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置４０７のアミノ酸ＹがＴによって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一態様では、二重特異性抗体の第１の重鎖と第２の重鎖のヘテロダイマー化を補助するために、ＷＯ ２００９／０８９００４号に記載される手法を用いる。一実施形態では、１つの重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置３９２のアミノ酸Ｋ又はＮが、負に帯電したアミノ酸によって（一実施形態では、Ｅ又はＤによって、好ましい一実施形態では、Ｄによって）置換されており、他の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置３９９のアミノ酸Ｄ、位置３５６のアミノ酸Ｅ又はＤ、又は位置３５７のアミノ酸Ｅが、正に帯電したアミノ酸によって置換されており（一実施形態では、Ｋ又はＲ、好ましい一実施形態では、Ｋによって置換されており、好ましい一実施形態では、位置３９９又は３５６のアミノ酸が、Ｋによって置換されている）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。更なる一実施形態では、上述の置換に加え、１つの重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置４０９のアミノ酸Ｋ又はＲが、負に帯電したアミノ酸によって（一実施形態では、Ｅ又はＤによって、好ましい一実施形態では、Ｄによって）置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。１つのなお更なる態様では、上述の置換に加えて、又は上述の置換に代えて、１つの重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置４３９のアミノ酸Ｋ及び／又は位置３７０のアミノ酸Ｋが、互いに独立して、負に帯電したアミノ酸によって（一実施形態では、Ｅ又はＤによって、好ましい一実施形態では、Ｄによって）置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一態様では、多重特異性抗体の第１の重鎖と第２の重鎖のヘテロダイマー化を補助するために、ＷＯ ２００７／１４７９０１号に記載される手法を用いる。一実施形態では、１つの重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置２５３のアミノ酸ＫがＥによって置換されており、位置２８２のアミノ酸ＤがＫによって置換されており、位置３２２のアミノ酸ＫがＤによって置換されており、他の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置２３９のアミノ酸ＤがＫによって置換されており、位置２４０のアミノ酸ＥがＫによって置換されており、位置２９２のアミノ酸ＫがＤによって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
本明細書に報告されるような二重特異性抗体の重鎖のＣ末端は、アミノ酸残基ＰＧＫで終わる完全なＣ末端であってもよい。重鎖のＣ末端は、Ｃ末端アミノ酸残基のうち１つ又は２つが除去された、短くなったＣ末端であってもよい。好ましい一態様では、重鎖のＣ末端は、ＰＧで終わる短くなったＣ末端である。
本明細書に報告される全ての態様のうちの１つの態様では、本明細書に明記されるＣ末端のＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む二重特異性抗体は、Ｃ末端グリシン－リシンジペプチドを含む（Ｇ４４６及びＫ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。本明細書に報告される全ての態様のうちの１つの態様では、本明細書に明記されるＣ末端のＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む二重特異性抗体は、Ｃ末端グリシン残基を含む（Ｇ４４６、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
Ｆａｂドメイン内の改変
一態様では、本発明は、ＰＤ１に特異的に結合する第１のＦａｂフラグメントと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２のＦａｂフラグメントとを含み、Ｆｃフラグメントの１つにおいて、可変ドメインＶＨとＶＨ又は定常ドメインＣＨ１とＣＬのいずれかが置き換わっている、二重特異性抗体に関する。二重特異性抗体は、Ｃｒｏｓｓｍａｂ技術に従って調製される。
１つの結合アームにドメインの置き換え／交換を有する多重特異性抗体（ＣｒｏｓｓＭａｂＶＨ－ＶＬ又はＣｒｏｓｓＭａｂＣＨ－ＣＬ）は、ＷＯ２００９／０８０２５２号、ＷＯ２００９／０８０２５３号及びＳｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．ｅｔ ａｌ、ＰＮＡＳ、１０８（２０１１）１１１８７－１１９１に記載される。これらの多重特異性抗体は、明確に、第１の抗原に対する軽鎖と、第２の抗原に対する誤った重鎖のミスマッチにより生じる副産物を減らす（このようなドメインの置き換えがない手法と比較した場合）。
特定の態様では、本発明は、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１のＦａｂフラグメントと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２のＦａｂフラグメントとを含み、Ｆａｂフラグメントの１つにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、ＶＨドメインが軽鎖の一部であり、ＶＬドメインが重鎖の一部であるように互いに置き換わっている互いに置き換わっている、二重特異性抗体に関する。特定の態様では、二重特異性抗体は、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第１のＦａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨは、互いに置き換わっている、二重特異性抗体である。
別の態様では、正しい対形成を更に向上させるために、ＰＤ１に特異的に結合する第１のＦａｂフラグメントと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２のＦａｂフラグメントとを含む二重特異性抗体は、異なる帯電したアミノ酸置換（いわゆる「帯電した残基」）を含んでいてもよい。これらの改変は、交差しているか、又は交差していないＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインに導入される。これらの改変は、例えば、ＷＯ２０１５／１５０４４７号、ＷＯ２０１６／０２０３０９号及びＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７３４０８号に記載される。
特定の態様では、本発明は、ＰＤ１に特異的に結合する第１のＦａｂフラグメントと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２のＦａｂフラグメントとを含む二重特異性抗体に関し、Ｆａｂフラグメントの１つにおいて、定常ドメインＣＬでは、位置１２４のアミノ酸が、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換され（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１では、位置１４７及び２１３のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。特定の態様では、二重特異性抗体は、ＴＩＭ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第２のＦａｂフラグメントの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１において、位置１４７及び２１３のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、二重特異性抗体である。
特定の態様では、本発明は、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１のＦａｂフラグメントと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２のＦａｂフラグメントとを含み、ＣＬドメインの１つにおいて、位置１２３のアミノ酸（ＥＵ番号付け）がアルギニン（Ｒ）と置き換わっており、位置１２４のアミノ酸（ＥＵ番号付け）がリシン（Ｋ）によって置換されており、ＣＨ１ドメインの１つにおいて、位置１４７（ＥＵ番号付け）及び位置２１３（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている、二重特異性抗体に関する。特定の態様では、二重特異性抗体は、ＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第２のＦａｂフラグメントにおいて、位置１２３のアミノ酸（ＥＵ番号付け）が、アルギニン（Ｒ）によって置き換わっており、位置１２４のアミノ酸（ＥＵ番号付け）が、リシン（Ｋ）によって置換されており、ＣＨ１ドメインの１つにおいて、位置１４７（ＥＵ番号付け）及び位置２１３（ＥＵ番号付け）のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されている、二重特異性抗体である。
更なる態様では、二重特異性抗体は、二価抗体であり、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖と第１の重鎖と、
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２の軽鎖と第２の重鎖とを含み、第２の軽鎖及び第２の重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨは、互いに置き換わっている。
（ａ）の抗体は、（ｂ）で報告されるような改変を含まず、（ａ）の重鎖及び軽鎖は、単離された鎖である。
（ｂ）の抗体では、軽鎖内で、可変軽鎖ドメインＶＬが、前記抗体の可変重鎖ドメインＶＨによって置き換わっており、重鎖内で、可変重鎖ドメインＶＨが、前記抗体の可変軽鎖ドメインＶＬによって置き換わっている。
一態様では、（ｉ）（ａ）の第１の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸（Ｋａｂａｔによる番号付け）が、正に帯電したアミノ酸によって置換されており、（ａ）の第１の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）が、負に帯電したアミノ酸によって置換されているか、又は（ｉｉ）（ｂ）の第２の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸（Ｋａｂａｔによる番号付け）が、正に帯電したアミノ酸によって置換されており、（ｂ）の第２の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）が、負に帯電したアミノ酸によって置換されている。
別の態様では、（ｉ）（ａ）の第１の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（好ましい一実施形態では、独立して、リシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって置換されており）、（ａ）の第１の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、又は（ｉｉ）（ｂ）の第２の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（好ましい一実施形態では、独立して、リシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって置換されており）、（ｂ）の第２の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一態様では、第２の重鎖の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４及び１２３のアミノ酸は、Ｋによって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一態様では、第２の重鎖の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２３のアミノ酸は、Ｒによって置換されており、位置１２４のアミノ酸は、Ｋによって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一態様では、第２の軽鎖の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７及び２１３のアミノ酸は、Ｅによって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一態様では、第１の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４及び１２３のアミノ酸がＫによって置換されており、第１の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７及び２１３のアミノ酸がＥによって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一態様では、第１の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２３のアミノ酸がＲによって置換されており、位置１２４のアミノ酸がＫによって置換されており、第１の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７及び２１３のアミノ酸が両方ともＥによって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一態様では、第２の重鎖の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４及び１２３のアミノ酸がＫによって置換されており、第２の軽鎖の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７及び２１３のアミノ酸がＥによって置換されており、第１の軽鎖の可変ドメインＶＬにおいて、位置３８のアミノ酸がＫによって置換されており、第１の重鎖の可変ドメインＶＨにおいて、位置３９のアミノ酸がＥによって置換されており、第２の重鎖の可変ドメインＶＬにおいて、位置３８のアミノ酸がＫによって置換されており、第２の軽鎖の可変ドメインＶＨにおいて、位置３９のアミノ酸がＥによって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一態様では、二重特異性抗体は、二価抗体であり、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖と第１の重鎖と、
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２の軽鎖と第２の重鎖とを含み、第２の軽鎖及び第２の重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨは、互いに置き換わっており、第２の軽鎖及び第２の重鎖の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は、互いに置き換わっている。
（ａ）の抗体は、（ｂ）で報告されるような改変を含まず、（ａ）の重鎖及び軽鎖は、単離された鎖である。（ｂ）の抗体において、軽鎖内で、可変軽鎖ドメインＶＬは、前記抗体の可変重鎖ドメインＶＨによって置き換わっており、定常軽鎖ドメインＣＬは、前記抗体の定常重鎖ドメインＣＨ１によって置き換わっており、重鎖内で、可変重鎖ドメインＶＨは、前記抗体の可変軽鎖ドメインＶＬによって置き換わっており、定常重鎖ドメインＣＨ１は、前記抗体の定常軽鎖ドメインＣＬによって置き換わっている。
一態様では、二重特異性抗体は、二価抗体であり、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖と第１の重鎖と、
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２の軽鎖と第２の重鎖とを含み、第２の軽鎖及び第２の重鎖の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は、互いに置き換わっている。
（ａ）の抗体は、（ｂ）で報告されるような改変を含まず、（ａ）の重鎖及び軽鎖は、単離された鎖である。（ｂ）の抗体において、軽鎖内で、定常軽鎖ドメインＣＬが、前記抗体の定常重鎖ドメインＣＨ１によって置き換わっており、重鎖内で、定常重鎖ドメインＣＨ１が、前記抗体の定常軽鎖ドメインＣＬによって置き換わっている。
一態様では、二重特異性抗体は、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合し、２つの抗体重鎖と２つの抗体軽鎖とからなる、全長抗体、
（ｂ）第２の抗原に対して特異的に結合する１つ、２つ、３つ又は４つの一本鎖Ｆａｂフラグメントとを含む、二重特異性抗体であり、
（ｂ）の前記一本鎖Ｆａｂフラグメントは、（ａ）の前記全長抗体に対し、ペプチドリンカーを介し、前記全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端又はＮ末端で融合する。
一態様では、第２の抗原に結合する１つ又は２つの同一の一本鎖Ｆａｂフラグメントは、全長抗体に対し、ペプチドリンカーを介し、前記全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端で融合する。
一態様では、第２の抗原に結合する１つ又は２つの同一の一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）フラグメントは、全長抗体に対し、前記全長抗体の重鎖のＣ末端で、ペプチドリンカーを介して融合している。
一態様では、第２の抗原に結合する１つ又は２つの同一の一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）フラグメントは、全長抗体に対し、前記全長抗体の軽鎖のＣ末端で、ペプチドリンカーを介して融合している。
一態様では、第２の抗原に結合する２つの同一の一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）フラグメントは、全長抗体に対し、前記全長抗体の重鎖又は軽鎖のそれぞれのＣ末端で、ペプチドリンカーを介して融合している。
一態様では、第２の抗原に結合する２つの同一の一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）フラグメントは、全長抗体に対し、前記全長抗体のそれぞれの重鎖のＣ末端で、ペプチドリンカーを介して融合している。
一態様では、第２の抗原に結合する２つの同一の一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）フラグメントは、全長抗体に対し、前記全長抗体のそれぞれの軽鎖のＣ末端で、ペプチドリンカーを介して融合している。
一態様では、二重特異性抗体は、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合し、２つの抗体重鎖と２つの抗体軽鎖とからなる、全長抗体と、
（ｂ）
（ｂａ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、又は
（ｂｂ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）からなる、第１のポリペプチドであって、
前記第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーを介し、前記全長抗体の２つの重鎖の１つのＣ末端に対し、そのＶＨドメインのＮ末端と融合している、第１のポリペプチドと、
（ｃ）
（ｃａ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、又は
（ｃｂ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）からなる第２のポリペプチドであって、
前記第２のポリペプチドは、ペプチドリンカーを介し、前記全長抗体の２つの重鎖の他方のＣ末端に対し、ＶＬドメインのＮ末端と融合している、第２のポリペプチドとを含む、三価抗体であり、
第１のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、第２のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、一緒に、第２の抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインを形成する。
一態様では、（ｂ）のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び（ｃ）のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、以下の位置の間にジスルフィド結合を導入することによって、鎖間ジスルフィド架橋を介して接続され、安定化される。
（ｉ）重鎖可変ドメインの位置４４から軽鎖可変ドメインの位置１００まで、又は
（ｉｉ）重鎖可変ドメインの位置１０５から軽鎖可変ドメインの位置４３まで、又は
（ｉｉｉ）重鎖可変ドメインの位置１０１から軽鎖可変ドメインの位置１００まで（常に、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従って番号付け）。
安定化のために非天然ジスルフィド架橋を導入するための技術は、ＷＯ ９４／０２９３５０号、Ｒａｊａｇｏｐａｌ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．（１９９７）１４５３－１４５９；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２５（１９９８）３８７－３９３、及びＳｃｈｍｉｄｔ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８（１９９９）１７１１－１７２１に記載される。一実施形態では、（ｂ）及び（ｃ）のポリペプチドの可変ドメインの間の任意要素のジスルフィド結合は、重鎖可変ドメインの位置４４と軽鎖可変ドメインの位置１００との間にある。一実施形態では、（ｂ）及び（ｃ）のポリペプチドの可変ドメインの間の任意要素のジスルフィド結合は、重鎖可変ドメインの位置１０５と軽鎖可変ドメインの位置４３との間にある（常に、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従って番号付け）。一実施形態では、一本鎖Ｆａｂフラグメントの可変ドメインＶＨとＶＬとの間に上述の任意のジスルフィド安定化を有しない三価の二重特異性抗体が好ましい。
一態様では、二重特異性抗体は、三重特異性抗体又は四重特異性抗体であり、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する全長抗体の第１の軽鎖及び第１の重鎖と、
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合し、可変ドメインＶＬとＶＨが互いに置き換わっており、及び／又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いに置き換わっている、前記抗体の第２の（改変された）軽鎖及び第２の（改変された）重鎖とを含み、
（ｃ）１つ又は２つの更なる抗原（すなわち、第３及び／又は第４の抗原）に特異的に結合する１～４個の抗原結合ドメインは、ペプチドリンカーを介し、（ａ）及び／又は（ｂ）の軽鎖又は重鎖のＣ末端又はＮ末端に融合している。
（ａ）の抗体は、（ｂ）で報告されるような改変を含まず、（ａ）の重鎖及び軽鎖は、単離された鎖である。
一態様では、三重特異性抗体又は四重特異性抗体は、（ｃ）で、１つ又は２つの更なる抗原に特異的に結合する１つ又は２つの抗原結合ドメインを含む。
一態様では、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖフラグメント及びｓｃＦａｂフラグメントからなる群から選択される。
一態様では、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖフラグメントである。
一態様では、抗原結合ドメインは、ｓｃＦａｂフラグメントである。
一態様では、抗原結合ドメインは、（ａ）及び／又は（ｂ）の重鎖のＣ末端に融合している。
一態様では、三重特異性抗体又は四重特異性抗体は、（ｃ）で、１つの更なる抗原に特異的に結合する１つ又は２つの抗原結合ドメインを含む。
一態様では、三重特異性抗体又は四重特異性抗体は、（ｃ）で、第３の抗原に特異的に結合する２つの同一の抗原結合ドメインを含む。好ましい一実施形態では、このような２つの同一の抗原結合ドメインは、（ａ）及び（ｂ）の重鎖のＣ末端に対し、同じペプチドリンカーを介して両方とも融合している。好ましい一実施形態では、２つの同一の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖフラグメント又はｓｃＦａｂフラグメントである。
一態様では、三重特異性抗体又は四重特異性抗体は、（ｃ）で、第４の抗原に特異的に結合する２つの抗原結合ドメインを含む。一実施形態では、前記２つの抗原結合ドメインは、（ａ）及び（ｂ）の重鎖のＣ末端に対し、同じペプチド接続部を介して両方とも融合している。好ましい一実施形態では、上述の２つの抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖフラグメント又はｓｃＦａｂフラグメントである。
一態様では、二重特異性抗体は、二重特異性の四価抗体であり、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖（及び２つのＦａｂフラグメントを含む）と、
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の２つの更なるＦａｂフラグメントとを含み、前記更なるＦａｂフラグメントは、両方とも、ペプチドリンカーを介し、（ａ）の重鎖のＣ末端又はＮ末端のいずれかに融合し、
Ｆａｂフラグメントにおいて、以下の改変が行われた。
（ｉ）（ａ）の両方のＦａｂフラグメントにおいて、又は（ｂ）の両方のＦａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬとＶＨが互いに置き換わっており、及び／又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いに置き換わっているか、又は
（ｉｉ）（ａ）の両方のＦａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬとＶＨが互いに置き換わっており、定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いに置き換わっており、（ｂ）の両方のＦａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬとＶＨが互いに置き換わっているか、又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いに置き換わっているか、又は
（ｉｉｉ）（ａ）の両方のＦａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬとＶＨが互いに置き換わっているか、又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いに置き換わっており、（ｂ）の両方のＦａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬとＶＨが互いに置き換わっており、定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いに置き換わっているか、又は
（ｉｖ）（ａ）の両方のＦａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬとＶＨが互いに置き換わっており、（ｂ）の両方のＦａｂフラグメントにおいて、定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いに置き換わっているか、又は
（ｖ）（ａ）の両方のＦａｂフラグメントにおいて、定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いに置き換わっており、（ｂ）の両方のＦａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっている。
一態様では、前記更なるＦａｂフラグメントは、（ａ）の重鎖のＣ末端又は（ａ）の重鎖のＮ末端のいずれかにペプチドリンカーを介して、両方とも融合している。
一態様では、前記更なるＦａｂフラグメントは、（ａ）の重鎖のＣ末端にペプチドリンカーを介して、両方とも融合している。
一態様では、前記更なるＦａｂフラグメントは、（ａ）の重鎖のＮ末端にペプチドリンカーを介して、両方とも融合している。
一態様では、Ｆａｂフラグメントにおいて、以下の改変が行われる。（ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、又は（ｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬとＶＨが互いに置き換わっており、及び／又は定常ドメインＶＬとＣＨ１が互いに置き換わっている。
一態様では、二重特異性抗体は、四価抗体であり、
（ａ）第１の抗体の（改変された）重鎖であって、第１の抗原に特異的に結合し、第１のＶＨ－ＣＨ１ドメイン対を含み、前記重鎖のＣ末端に、前記第１の抗体の第２のＶＨ－ＣＨ１ドメイン対のＮ末端が、ペプチドリンカーを介して融合している、第１の抗体の（改変された）重鎖と、
（ｂ）（ａ）の前記第１の抗体の２つの軽鎖と、
（ｃ）第２の抗体の（改変された）重鎖であって、第２の抗原に特異的に結合し、第１のＶＨ－ＣＬドメイン対を含み、前記重鎖のＣ末端に、前記第２の抗体の第２のＶＨ－ＣＬドメイン対のＮ末端が、ペプチドリンカーを介して融合している、第２の抗体の（改変された）重鎖と、
（ｄ）それぞれＣＬ－ＣＨ１ドメインを含む、（ｃ）の前記第２の抗体の２つの（改変された）軽鎖とを含む。
一態様では、二重特異性抗体は、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１の全長抗体の重鎖及び軽鎖と、
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合し、重鎖のＮ末端が、ペプチドリンカーを介して軽鎖のＣ末端に接続している、第２の全長抗体の重鎖及び軽鎖とを含む。
（ａ）の抗体は、（ｂ）で報告されるような改変を含まず、重鎖及び軽鎖は、単離された鎖である。
一態様では、二重特異性抗体は、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合し、２つの抗体重鎖と２つの抗体軽鎖とからなる、全長抗体、
（ｂ）ＶＨ２ドメインとＶＬ２ドメインとを含む第２の抗原に特異的に結合するＦｖフラグメントとを含み、両ドメインが、ジスルフィド架橋を介して互いに接続しており、
ＶＨ２ドメイン又はＶＬ２ドメインのいずれかのみが、第１の抗原に特異的に結合する全長抗体の重鎖又は軽鎖にペプチドリンカーを介して融合する。
二重特異性抗体において、（ａ）の重鎖及び軽鎖は、単離された鎖である。
一態様では、ＶＨ２ドメイン又はＶＬ２ドメインのうち他方は、第１の抗原に特異的に結合する全長抗体の重鎖又は軽鎖にペプチドリンカーを介して融合していない。
本明細書で報告される全ての態様では、第１の軽鎖は、ＶＬドメインとＣＬドメインとを含み、第１の重鎖は、ＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ヒンジ領域と、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む。
一態様では、二重特異性抗体は、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する２つのＦａｂフラグメントと、
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合し、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインが互いに置き換わっている、１つのＣｒｏｓｓＦａｂフラグメントと、
（ｃ）第１のＦｃ領域の重鎖と第２のＦｃ領域の重鎖とを含む１つのＦｃ領域を含む、三価抗体であり、
２つのＦａｂフラグメントのＣＨ１ドメインのＣ末端は、重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドのＮ末端に接続しており、ＣｒｏｓｓＦａｂフラグメントのＣＬドメインのＣ末端は、Ｆａｂフラグメントの１つのＶＨドメインのＮ末端に接続している。
一態様では、二重特異性抗体は、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する２つのＦａｂフラグメントと、
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合し、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインが互いに置き換わっている、１つのＣｒｏｓｓＦａｂフラグメントと、
（ｃ）第１のＦｃ領域の重鎖と第２のＦｃ領域の重鎖とを含む１つのＦｃ領域を含む、三価抗体であり、
第１のＦａｂフラグメントのＣＨ１ドメインのＣ末端は、重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドの１つのＮ末端に接続しており、ＣｒｏｓｓＦａｂフラグメントのＣＬドメインのＣ末端は、他の重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドのＮ末端に接続しており、第２のＦａｂフラグメントのＣＨ１ドメインのＣ末端は、第１のＦａｂフラグメントのＶＨドメインのＮ末端に、又はＣｒｏｓｓＦａｂフラグメントのＶＨドメインのＮ末端に接続している。
一態様では、二重特異性抗体は、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合し、２つの抗体重鎖と２つの抗体軽鎖とからなる、全長抗体、
（ｂ）重鎖フラグメントと軽鎖フラグメントを含むＶＨ２ドメインとＶＬ２ドメインとを含む第２の抗原に特異的に結合し、軽鎖フラグメント内で、可変軽鎖ドメインＶＬ２が、前記抗体の可変重鎖ドメインＶＨ２によって置き換わっており、重鎖フラグメント内で、可変重鎖ドメインＶＨ２が、前記抗体の可変軽鎖ドメインＶＬ２によって置き換わっている、Ｆａｂフラグメントとを含み、
重鎖Ｆａｂフラグメントは、全長抗体の重鎖の１つのＣＨ１ドメインと、全長抗体のそれぞれのＦｃ領域との間に挿入され、軽鎖ＦａｂフラグメントのＮ末端は、全長抗体の重鎖と対を形成する全長抗体の軽鎖のＣ末端に抱合され、その中に重鎖Ｆａｂフラグメントが挿入される。
一態様では、二重特異性抗体は、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合し、２つの抗体重鎖と２つの抗体軽鎖とからなる、全長抗体、
（ｂ）重鎖フラグメントと軽鎖フラグメントとを含むＶＨ２ドメインとＶＬ２ドメインとを含む第２の抗原に特異的に結合し、軽鎖フラグメント内で、可変軽鎖ドメインＶＬ２が、前記抗体の可変重鎖ドメインＶＨ２によって置き換わっており、重鎖フラグメント内で、可変重鎖ドメインＶＨ２が、前記抗体の可変軽鎖ドメインＶＬ２によって置き換わっており、Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントのＣ末端は、前記抗体の重鎖の１つのＮ末端に抱合されており、Ｆａｂフラグメントの軽鎖フラグメントのＣ末端は、全長抗体の重鎖と対を形成する全長抗体の軽鎖のＮ末端に抱合されており、これに対し、Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントが抱合されている、Ｆａｂフラグメントとを含む。
ポリヌクレオチド
本発明は更に、本明細書に記載の二重特異性抗体をコードする、単離されたポリヌクレオチド又はそのフラグメントを提供する。
「核酸分子」又は「ポリヌクレオチド」との用語は、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／又は物質を含む。各ヌクレオチドは、塩基で構成され、具体的には、プリン塩基又はピリミジン塩基（すなわち、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ））、糖（すなわち、デオキシリボース又はリボース）、及びホスフェート基で構成される。多くは、核酸分子は、塩基配列によって記述され、ここで、前記塩基は、核酸分子の一次構造（線形構造）を表す。塩基の配列は、典型的には、５’から３’へと表される。ここで、核酸分子との用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、例えば、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）及びゲノムＤＮＡ、リボ核酸（ＲＮＡ）、特に、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成形態、及びこれらの分子の２つ以上を含む混合ポリマーを包含する。核酸分子は、線形又は環状であってもよい。これに加え、核酸分子との用語は、センス鎖及びアンチセンス鎖、及び一本鎖形態及び二本鎖形態の両方を含む。更に、本明細書で記載される核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド又は天然に存在しないヌクレオチドを含んでいてもよい。誘導体化された糖又はホスフェート骨格結合又は化学修飾された残基を含む、天然に存在しないヌクレオチドの例としては、改変されたヌクレオチド塩基を含む。核酸分子は、例えば、宿主又は患者において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで本発明の抗体の直接的な発現のためのベクターとして適したＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子も包含する。このようなＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ベクターは、改変されていなくてもよく、又は改変されていてもよい。例えば、ｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏで抗体を産生するために被験体にｍＲＮＡを注入することができるように、ＲＮＡベクターの安定性及び／又はコードされた分子の発現を高めるように化学修飾されてもよい。（例えば、Ｓｔａｄｌｅｒ ｅｒｔ ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１７、２０１７年６月１２日にオンラインで公開、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４３５６又はＥＰ ２ １０１ ８２３ Ｂ１号を参照。）
「単離された」ポリヌクレオチドは、その天然環境の構成成分から分離された核酸分子を指す。単離されたポリヌクレオチドは、元々その核酸分子を含む細胞に含まれているが、その核酸分子が、染色体外に存在するか、又はその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する核酸分子を含む。
本発明の二重特異性抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドは、完全な抗原結合分子をコードする単一のポリヌクレオチドとして発現されてもよく、又は同時発現される複数の（例えば、２つ以上の）ポリヌクレオチドとして発現されてもよい。一緒に発現するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して会合し、機能的な抗原結合分子を形成してもよい。例えば、免疫グロブリンの軽鎖部分は、免疫グロブリンの重鎖部分由来の別個のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。同時発現する場合、重鎖ポリペプチドは、軽鎖ポリペプチドと会合し、免疫グロブリンを形成する。
いくつかの態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載する本発明に係る二重特異性抗体に含まれるポリペプチドをコードする。
一態様では、本発明は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ３）に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体をコードする、単離されたポリヌクレオチドであって、前記ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む、単離されたポリヌクレオチドに関する。
Ｂ．組換え方法
抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるように、組換え方法及び組成物を用いて製造されてもよい。これらの方法について、ある抗体をコードする１つ以上の単離された核酸が、提供される。
２つの核酸が必要とされるネイティブ抗体又はネイティブ抗体フラグメントの場合、１つは軽鎖又はそのフラグメントのためのものであり、１つは重鎖又はそのフラグメントのためのものである。このような核酸は、ＶＬを含むアミノ酸配列及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードする。これらの核酸は、同じ発現ベクター上、又は異なる発現ベクター上にあってもよい。４つの核酸が必要とされるヘテロダイマー重鎖を有する特定の二重特異性抗体の場合、１つは第１の軽鎖のため、１つは、ヘテロモノマーＦｃ領域ポリペプチドを含む第１の重鎖のため、１つは第２の軽鎖のため、１つは、第２のヘテロモノマーＦｃ領域ポリペプチドを含む第２の重鎖のためのものである。この４つの核酸は、１つ以上の核酸分子又は発現ベクターに含まれていてもよい。例えば、このような核酸は、第１のＶＬを含むアミノ酸配列及び／又は第１のヘテロモノマーＦｃ領域を含む第１のＶＨを含むアミノ酸配列及び／又は第２のＶＬを含むアミノ酸配列及び／又は抗体の第２のヘテロモノマーＦｃ領域（例えば、抗体の第１及び／又は第２の軽鎖及び／又は第１及び／又は第２の重鎖）を含む第２のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする。これらの核酸は、同じ発現ベクター又は異なる発現ベクターの上にあってもよく、通常、これらの核酸は、２つ又は３つの発現ベクター上に位置しており、すなわち、１つのベクターは、これらの核酸のうち、１つより多くを含んでいてもよい。これらの二重特異性抗体の例は、ＣｒｏｓｓＭａｂ及びＴ細胞二重特異性抗体である（例えば、Ｓｃｈａｅｆｅｒ、Ｗ．ｅｔ ａｌ、ＰＮＡＳ、１０８（２０１１）１１１８７－１１９１を参照）。例えば、ヘテロモノマー重鎖の１つは、いわゆる「ノブ変異」（Ｔ３６６Ｗと、場合により、Ｓ３５４Ｃ又はＹ３４９Ｃのうち１つ）を含み、他方は、いわゆる「ホール変異」（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖと、場合により、Ｙ３４９Ｃ又はＳ３５４Ｃ）を含む（例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２（１９９６）７３を参照）。
一態様では、本明細書に記載の二重特異性抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、ＰＤ１及びＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインのＶＬを含むアミノ酸配列及び／又はＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードする。更なる態様では、このような核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる態様では、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。あるこのような態様では、宿主細胞は、以下を含む（例えば、以下を用いて形質転換されている）。（１）アミノ酸配列をコードする第１の核酸対を含み、アミノ酸配列の一方が抗体の第１のＶＬを含み、他方が第１のＶＨを含む、第１のベクターと、アミノ酸配列をコードする第２の核酸対を含み、アミノ酸配列の一方が抗体の第２のＶＬを含み、他方が第のＶＨを含む、第２のベクター、又は（２）アミノ酸配列をコードする第１の核酸を含み、アミノ酸配列の一方が可変ドメイン（好ましくは軽鎖可変ドメイン）を含む第１のベクターと、アミノ酸配列をコードする核酸対を含み、アミノ酸配列の一方が軽鎖可変ドメインを含み、他方が第１の重鎖可変ドメインを含む第２のベクターと、アミノ酸配列をコードする核酸対を含み、アミノ酸配列の一方が第２のベクターとはそれぞれ他の軽鎖可変ドメインを含み、他方が第２の重鎖可変ドメインを含む第３のベクター、又は（３）アミノ酸配列をコードする核酸を含み、アミノ酸配列の一方が抗体の第１のＶＬを含む第１のベクターと、抗体の第１のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターと、抗体の第２のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第３のベクターと、抗体の第２のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第４のベクター。一態様では、宿主細胞は、真核生物、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ球細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一態様では、二重特異性抗体を製造する方法が提供され、この方法は、上に提供されるように、抗体の発現に適した条件で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することと、場合により、宿主細胞（又は宿主細胞培地）から抗体を回収することとを含む。
本明細書に記載するＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体の組換え産生のために、二重特異性抗体をコードする核酸（例えば上述のもの）が、宿主細胞中の更なるクローニング及び／又は発現のために、単離され、１つ以上のベクターに挿入される。このような核酸は、従来の手順を用い（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）、容易に単離され、配列決定されてもよい。
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適した宿主細胞は、本明細書に記載する原核生物細胞又は真核生物細胞を含む。例えば、抗体は、特に、グリコシル化及びエフェクター機能が必要とされていない場合には、細菌中で産生されてもよい。細菌中の抗体フラグメント及びポリペプチドの発現については、例えば、ＵＳ ５，６４８，２３７号、ＵＳ ５，７８９，１９９号及びＵＳ ５，８４０，５２３号を参照。（また、Ｅ，ｃｏｌｉ中の抗体フラグメントの発現を記載しているＣｈａｒｌｔｏｎ，Ｋ．Ａ．，Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８，Ｌｏ，Ｂ．Ｋ．Ｃ．（編集），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００３），ｐｐ．２４５－２５４も参照。）発現後、抗体は、適切なフラクション中の細菌細胞ペーストから単離されてもよく、更に精製されてもよい。
原核生物に加え、真核生物の微生物、例えば、糸状菌又は酵母は、抗体をコードするベクターに適切なクローニング又は発現の宿主であり、グリコシル化経路が「ヒト化」された真菌株及び酵母株を含み、部分的又は完全にヒトグリコシル化パターンを有する抗体を産生する。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｔ．Ｕ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２（２００４）１４０９－１４１４、及びＬｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４（２００６）２１０－２１５を参照。
（グリコシル化）抗体の発現に適した宿主細胞も、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。多くのバキュロウイルス株が同定されており、特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、これを昆虫細胞と組み合わせて使用してもよい。
植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、第６，０４０，４９８号、第６，４２０，５４８号、第７，１２５，９７８号及び第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術）を参照。
脊椎動物細胞も、宿主として使用されてもよい。例えば、懸濁物中で成長するように適合した哺乳動物細胞株が有用な場合がある。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ３６（１９７７）５９－７４）に記載されるような２９３細胞又は２９３細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ、Ｊ．Ｐ．、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３（１９８０）２４３－２５２）に記載されるようなＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリサル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト頸部癌腫細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３（１９８２）４４－６８、ＭＲＣ ５細胞及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７（１９８０）４２１６－４２２０）、骨髄腫細胞株、例えば、Ｙ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０が挙げられる。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞の総説としては、例えば、Ｙａｚａｋｉ，Ｐ．及びＷｕ，Ａ．Ｍ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．２４８、Ｌｏ，Ｂ．Ｋ．Ｃ．（編集）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００４）、ｐｐ．２５５－２６８を参照。
Ｃ．アッセイ
本明細書で提供されるＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、当該技術分野で既知の種々音アッセイによって、その物理／化学特性及び／又は生体活性について同定され、スクリーニングされるか、又は特性決定されてもよい。
１．アフィニティアッセイ
対応する抗原に対する、本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子、抗体及び抗体フラグメントのアフィニティは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な装置、受容体又は組換え発現によって得られ得るような標的タンパク質を用い、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって実施例に記載される方法に従って決定することができる。結合アフィニティを測定するための具体的な実例及び例示的な実施形態は、実施例２、８又は１１に記載される。一態様によれば、ＫＤは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００機（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、２５℃で表面プラズモン共鳴によって測定される。
２．結合アッセイ及び他のアッセイ
一態様では、本発明の二重特異性抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットなどの既知の方法によって、その抗原結合活性について試験される。対応する組換え抗原に、又は抗原発現細胞に対する、本明細書に提供される二重特異性抗体の結合は、実施例８及び１１に記載されるＥＬＩＳＡによって評価されてもよい。
更なる態様では、新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）は、異なる末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、例えば、単球、ＮＫ細胞及びＴ細胞に対する結合を示すために、結合アッセイに使用される。
別の態様では、２つの異なる受容体ＰＤ１及びＬＡＧ３の二量体化又は最後の結合／相互作用を示すために、細胞二量体化アッセイを使用し、これらの受容体は、両標的に対して二重特異性抗体を用いて切断するか、又は架橋する際に、酵素の２つのフラグメントと細胞質融合する。ここで、唯一１つの受容体のみが、酵素活性を示さない。この特異的な相互作用について、両受容体の細胞質ゾルＣ末端は、個々に、レポーター酵素の異種サブユニットに融合する。１つの酵素サブユニットのみがレポーター活性を示さなかった。しかし、両受容体に対する同時結合は、両受容体の局所的な細胞蓄積、２種類の異種酵素サブユニットの相補性を引き起こし、最終的に、基質を加水分解し、それによって、化学発光シグナルを生成する特異的で機能的な酵素が生成すると予想される（実施例１１）。
３．活性アッセイ
一態様では、生体活性を有する、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体を同定するためのアッセイが提供される。生体活性としては、例えば、異なる免疫細胞、特にＴ細胞の活性化及び／又は増殖、免疫調整サイトカイン、例えば、ＩＦＮγ又はＴＮＦ－αの分泌、ＰＤ１経路のブロック、ＬＡＧ３経路のブロック、腫瘍細胞の死滅を高める能力が挙げられるだろう。ｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｔｒｏでこのような生体活性を有する抗体も提供される。
特定の態様では、本発明の抗体は、このような生体活性について試験される。一態様では、１つの個体（ドナーＸ）由来のリンパ球から、別の個体（ドナーＹ）由来のリンパ球までの活性化を測定する免疫細胞アッセイが提供される。混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を使用は、リンパ球エフェクター細胞に対するＰＤ１経路をブロックする効果を示すことができる。このアッセイ中のＴ細胞は、本発明の二重特異性抗体存在下又は非存在下、活性化及びそのＩＦＮ－γ分泌について試験された。このアッセイは、実施例９に更に詳細に記載される。
Ｄ．免疫抱合体
本発明はまた、１つ以上の細胞毒性剤、例えば、化学療法薬剤又は薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質 毒素、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素的に活性な毒素、又はそのフラグメント）、又は放射性同位体に抱合される本発明の二重特異性抗体を含む免疫抱合体を提供する。
Ｅ．診断及び検出のための方法及び組成物
特定の態様では、本明細書で提供されるＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体のいずれかは、生体サンプル中のＰＤ１及びＬＡＧ３の両方の存在を検出するのに有用な場合がある。「検出する」との用語は、本明細書で使用される場合、定量的又は定性的な検出を包含する。特定の実施形態では、生体サンプルは、細胞又は組織、例えば、ＡＭＬ幹癌細胞を含む。
一態様では、診断又は検出の方法で使用するための二重特異性抗体が提供される。更なる態様では、生体サンプル中のＰＤ１及びＬＡＧ３の両方の存在を検出する方法が、提供される。特定の実施形態では、本方法は、ＰＤ１及びＬＡＧ３の両方に対する二重特異性抗体の結合について許容される条件で、生体サンプルと、本明細書に記載される二重特異性抗体とを接触させることと、二重特異性抗体と両抗原との間で複合体が生成するか否かを検出することとを含む。このような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法又はｉｎ ｖｉｖｏ法であってもよい。一実施形態では、二重特異性抗体は、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３抗体に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体を用いた治療に適した被験体を選択するために使用され、例えば、ＰＤ１及びＬＡＧ３は、患者の選択のためのバイオマーカーである。
特定の態様では、標識された二重特異性抗体が提供される。標識としては、限定されないが、直接的に検出される標識又は部分（例えば、蛍光、色素体、電子密度の高い、化学発光及び放射性標識）及び例えば、酵素反応又は分子相互作用によって間接的に検出される部分（例えば、酵素又はリガンド）が挙げられる。例示的な標識としては、限定されないが、放射性同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば、希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３－ジヒドロフタラジンジオン、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリ性ホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース－６－ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘテロ環オキシダーゼ、例えば、ウリカーゼ及び過酸化水素を使用する酵素と連結し、染料前駆体を酸化するキサンチンオキシダーゼ、例えば、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はミクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識又は安定な遊離ラジカルが挙げられる。
Ｆ．医薬組成物、製剤及び投与経路
更なる態様では、本発明は、例えば、以下の治療法のいずれかに使用するための、本明細書に提供されるＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体のいずれかを含む、医薬組成物を提供する。一実施形態では、医薬組成物は、本明細書に提示されるいずれかの二重特異性抗体と、少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤とを含む。別の実施形態では、医薬組成物は、本明細書で提供される二重特異性抗体のいずれかと、少なくとも１つの更なる治療薬剤（例えば、以下に記載するもの）とを含む。
本発明の医薬組成物は、医薬的に許容される賦形剤に溶解又は分散した治療有効量の１つ以上の二重特異性抗体を含む。「医薬的又は薬理学的に許容される」との句は、一般的に、使用する投薬量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、すなわち、適切な場合、動物（例えばヒト）に投与したときに、有害なアレルギー反応又は他の不都合な反応を引き起こさない分子部分及び組成物を指す。少なくとも１つの二重特異性抗体と、場合により更なる有効成分とを含む医薬組成物の調製は、本明細書に参考として組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０に例示されるように、本開示の観点で、当該技術分野で既知である。特に、組成物は、凍結乾燥された製剤又は水溶液である。本明細書で使用される場合、「医薬的に許容される賦形剤」としては、当業者には知られているだろうが、任意及び全ての溶媒、バッファー、分散媒体、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張性剤、塩類、安定化剤及びこれらの組み合わせが挙げられる。
非経口組成物としては、注射による（例えば、皮下、皮内、病変内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内注射による）投与のために設計されたものが挙げられる。注射のために、本発明の二重特異性抗体は、水溶液中で配合されてもよく、好ましくは、生理学的に適合するバッファー、例えば、Ｈａｎｋｓ溶液、Ｒｉｎｇｅｒ溶液又は生理食塩水バッファー中で配合されてもよい。溶液は、配合剤、例えば、懸濁剤、安定化剤及び分散剤を含有していてもよい。又は、二重特異性抗体は、適切なビヒクル、例えば、滅菌パイロジェンフリー水を用いて使用前に構築するための粉末形態であってもよい。滅菌注射可能溶液は、必要な場合には以下に列挙する種々の他の成分と共に、本発明の融合タンパク質を必要な量で、適切な溶媒に組み込むことによって調製される。滅菌性は、例えば、滅菌濾過膜による濾過によって、容易に達成され得る。一般的に、分散物は、種々の滅菌した有効成分を、塩基性分散媒体及び／又は他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液、懸濁物又は乳化物を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、既に滅菌濾過した液体媒体から有効成分と任意の更なる所望な成分の粉末が得られる減圧乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒体は、必要な場合には適切に緩衝化されているべきであり、注射する前に、十分な食塩水又はグルコースで液体希釈剤をまず等張性にする。組成物は、製造条件及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の混入作用から保護されなければならない。内毒素の混入は、安全なレベルで、例えば、０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満で最小限に維持されるべきであることが理解される。適切な医薬的に許容される賦形剤としては、限定されないが、バッファー、例えば、ホスフェート、シトレート及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルパラベン又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン；単糖類、二糖類及び他の炭水化物、グルコース、マンノース又はデキストリンを含む；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩を形成する対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘度を上げる化合物（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、デキストランなど）を含んでいてもよい。場合により、懸濁物は、適切な安定化剤、又は高度に濃縮した溶液の調製を可能にするために、化合物の溶解度を高める薬剤も含んでいてもよい。更に、活性化合物の懸濁物は、適切な油注射懸濁物として調製されてもよい。適切な親油性溶媒又はビヒクルとしては、脂肪族油（例えば、ゴマ油）、又は合成脂肪酸エステル（例えば、エチルクリート（ｅｔｈｙｌ ｃｌｅａｔ）又はトリグリセリド）又はリポソームが挙げられる。
有効成分は、例えば、コアセルベーション技術によって、又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル中に封入されてもよく（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルションに封入されてもよい。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）に開示されている。徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の適切な例としては、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、例えば、フィルム又はマイクロカプセルなどの成型物品の形態である。特定的な実施形態では、注射可能組成物の持続性吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、又はこれらの組み合わせ）の組成物での使用によってもたらされてもよい。
本発明の例示的な医薬的に許容される賦形剤は、更に、間質性薬物分散剤、例えば、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）を含む。特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、ｒＨｕＰＨ２０を含め、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８号に記載される。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰを、１つ以上の更なるグリコサミノグリカナーゼ（例えば、コンドロイチナーゼ）と合わせる。
例示的な凍結乾燥した抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載される。水性抗体製剤としては、米国特許第６，１７１，５８６号及び第ＷＯ２００６／０４４９０８号に記載されるものが挙げられ、後者の製剤は、酢酸ヒスチジンバッファーを含む。
既に記載した組成物に加え、二重特異性抗体は、デポー製剤として配合されてもよい。このような長く作用する製剤は、移植によって（例えば、皮下又は筋肉内）、又は筋肉内注射によって投与されてもよい。したがって、例えば、二重特異性抗体は、適切なポリマー又は疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルションとして）又はイオン交換樹脂を用いて、又はやや難溶性の誘導体として、例えば、やや難溶性の塩として配合されてもよい。
本発明の二重特異性抗体を含む医薬組成物は、従来の混合、溶解、乳化、カプセル化、封入又は凍結乾燥プロセスによって製造されてもよい。医薬組成物は、１つ以上の生理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤又はタンパク質を医薬として使用可能な製剤へと加工するのを容易にする補助剤を用い、従来の様式で配合されてもよい。適切な製剤は、選択する投与経路によって変わる。
二重特異性抗体は、遊離酸又は遊離塩基、中性又は塩形態で組成物に配合されてもよい。医薬的に許容される塩は、遊離酸又は遊離塩基の生体活性を実質的に保持する塩である。医薬的に許容される塩としては、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基と形成される酸付加塩、又は塩酸又はリン酸などの無機酸と形成されるか、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸又はマンデル酸などの有機酸と形成されるものが挙げられる。遊離カルボキシル基と形成される塩も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムの水酸化物又は水酸化第二鉄などの無機塩基から誘導されてもよく、又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン又はプロカインなどの有機塩基から誘導されてもよい。医薬塩は、対応する遊離塩基形態よりも、水及び他のプロトン性溶媒に溶けやすい傾向がある。
本発明の組成物は、処置される特定の徴候に必要な１種類より多い有効成分も含んでいてもよく、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含んでいてもよい。このような有効成分は、適切には、意図する目的にとって有効な量で組み合わせた状態で存在する。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、一般的に滅菌である。滅菌性は、例えば、滅菌濾過膜による濾過によって、容易に達成され得る。
Ｇ．治療方法及び組成物
本明細書で提供されるＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体のいずれかは、治療方法で使用されてもよい。
治療方法に使用するために、本明細書で既に定義された、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体を、良好な診療行為と一致する様式で配合され、投薬され、投与されてもよい。この観点で考慮する因子としては、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与計画、及び医学専門家には既知の他の因子が挙げられる。
一態様では、医薬として使用するための、本明細書に定義されるようなＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体が提供される。更なる態様では、ある疾患の処置において使用するための、特に、癌の処置において使用するための、本明細書に定義されるようなＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体が提供される。特定の実施形態では、処置方法で使用するための、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体が提供される。一実施形態では、本発明は、必要とする個体における疾患の処置に使用するための、本明細書に記載されるＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体が提供される。特定の実施形態では、本発明は、個体に治療有効量の二重特異性抗体を投与することを含む、疾患を有する個体を処置する方法で使用するための、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体を提供する。特定の実施形態では、処置される疾患は、癌である。別の態様では、治療される疾患は、感染性疾患、特に、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎）、ＨＳＶ１（ヘルペス単純ウイルス１型）、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、ＬＣＭＶ（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）又はＥＢＶ（エプスタイン・バールウイルス）などの慢性ウイルス感染である。処置が必要な被験体、患者又は個体は、典型的には、哺乳動物であり、より特定的には、ヒトである。
更なる態様では、本発明は、必要な個体において、疾患の処置のための医薬の製造又は調整において、本明細書で既に定義した、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体の使用を提供する。一実施形態では、医薬は、疾患を有する個体に、治療有効量の医薬を投与することを含む、疾患を処置する方法で使用するためのものである。
特定の態様では、処置される疾患は、増殖性障害、特に癌である。癌の例としては、膀胱癌、脳腫瘍、頭頸部癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、食道癌、結腸癌、結腸直腸癌、肛門癌、胃癌、前立腺癌、血液がん、皮膚癌、扁平細胞癌腫、骨がん及び腎臓癌が挙げられる。本発明のＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体を用いて処置可能な他の細胞増殖障害としては、限定されないが、腹部、骨、乳房、消化系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、脳下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部領域及び泌尿生殖器系に位置する新生物が挙げられる。前癌状態又は病変及び癌転移も含まれる。特定の態様では、癌は、腎細胞癌、皮膚癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、脳腫瘍、頭頸部癌からなる群から選択される。更なる態様では、癌は、癌腫、リンパ腫（例えば、ホジキン型及び非ホジキン型リンパ腫）、芽細胞腫、肉腫及び白血病から選択される。別の態様では、処置される癌は、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平癌腫、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠腫、頸部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮の癌腫、唾液腺の癌腫、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、陰門癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、白血病及び他のリンパ球増殖性障害、及び様々な種類の頭頸部癌から選択される。
更なる態様では、処置される疾患は、感染性疾患、特に、慢性ウイルス感染である。「慢性ウイルス感染」との用語は、慢性ウイルスに罹患しているか、又は感染した被験体を指す。慢性ウイルス感染の例は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス感染（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス感染（ＨＣＶ）、ヘルペス単純ウイルス１（ＨＳＶ１）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）又はエプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）である。
当業者は、多くの場合に、二重特異性抗体が、治癒を与えないが、部分的な利益のみを与える場合があることを容易に認識する。いくつかの実施形態では、いくつかの利益を有する生理学的変化も、治療利益であると考えられる。したがって、いくつかの実施形態では、生理学的変化を与える二重特異性抗体の量は、「有効量」又は「治療有効量」と考えられる。
更なる態様では、本発明は、個体において疾患を処置する方法であって、前記個体に、治療有効量の本発明のＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体を投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、組成物は、前記個体に投与され、本発明の二重特異性抗体を医薬的に許容される形態で含んでいる。特定の実施形態では、処置される疾患は、増殖性障害である。特定の実施形態では、疾患は、癌である。特定の実施形態では、この方法は、更に、個体に、治療有効量の少なくとも１つの更なる治療薬剤（例えば、処置される疾患が癌である場合、抗癌剤）を投与することを含む。別の態様では、疾患は、慢性ウイルス感染である。上のいずれかの実施形態に係る「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトであってもよい。
疾患の予防又は処置のために、本発明のＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体の適切な投薬量は、（単独で使用されるとき、又は１つ以上の他の更なる治療薬剤と組み合わせて使用される場合）、治療される疾患の種類、投与経路、患者の体重、融合タンパク質の種類、疾患の重篤度及び経過、二重特異性抗体が予防目的又は治療目的で投与されるかどうか、以前又は現在の治療介入、患者の病歴及び融合タンパク質に対する応答、及び主治医の判断によって変わる。投与の責任を担う医師は、いずれにしても、組成物中の有効成分の濃度、個々の被験体に適切な投薬量を決定する。限定されないが、種々の時間点にわたる単回又は複数回の投与、ボーラス投与、パルス注入を含む種々の投薬計画が本明細書で想定される。
本明細書に定義されるＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、一度に、又は一連の処置にわたって、患者に適切に投与される。疾患の種類及び重篤度に応じて、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）の二重特異性抗体が、例えば、１回以上の別個の投与によるか、又は連続的な注入によるかによらず、患者に投与するための初期の候補投薬量であってもよい。典型的な１日投薬量は、上述の因子に依存して、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。数日間又はさらに長く繰り返し投与する場合、状態に応じて、処置は、一般的に、疾患症状の所望な抑制が起こるまで続けられる。二重特異性抗体の１つの例示的な投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。他の例では、投薬量はまた、投与あたり、約１μｇ／ｋｇ体重、約５μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ／ｋｇ体重、約２００μｇ／ｋｇ体重、約３５０μｇ／ｋｇ体重、約５００μｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ／ｋｇ体重、約５ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約２００ｍｇ／ｋｇ体重、約３５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５００ｍｇ／ｋｇ体重から約１０００ｍｇ／ｋｇ体重まで、又はもっと多く、又はその間の誘導可能な任意の範囲を含んでいてもよい。本明細書に列挙される数から誘導可能な範囲の例では、約５ｍｇ／ｋｇ／体重～約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重～約５００ｍｇ／ｋｇ／体重などが、上述の数に基づいて投与されてもよい。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はこれらの任意の組み合わせ）の１回以上の投薬を患者に投与してもよい。このような投薬量を、断続的に、例えば、毎週、又は３週間ごとに投与してもよい（例えば、患者は、約２～約２０回、又は例えば約６回の融合タンパク質の投薬を受ける）。初期の高負荷用量の後、１回以上の低用量を投与してもよい。しかし、他の投薬レジメンが有用な場合がある。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニタリングされる。
本明細書で定義されるＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、意図した目的を達成するために有効な量で、一般的に使用されるだろう。疾患状態を処置又は予防するための使用のために、本発明の二重特異性抗体、又はその医薬組成物が、治療有効量で投与されるか、又は塗布される。治療有効量の決定は、特に、本明細書に与えられる詳細な開示の観点で、十分に当業者の能力の範囲内である。
全身投与の場合、治療有効投薬量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、例えば、細胞培養アッセイから最初に概算することができる。次いで、細胞培養物で決定されるようなＩＣ５０を含む血中濃度範囲を達成するために、投薬量を動物モデルで配合してもよい。このような情報を使用し、ヒトにおける有用な用量をさらに正確に決定することができる。
初期投薬量も、ｉｎ ｖｉｖｏデータから、例えば、動物モデルから、当該技術分野で周知の技術を用いて概算することができる。当業者は、動物データに基づき、ヒトへの投与を容易に最適化することができる。
治療効果を維持するのに十分な二重特異性抗体の血漿濃度を与えるように、投薬量及び投薬間隔は、個々に調節されてもよい。注射による投与に有用な患者投薬量は、約０．１～５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５～１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療に有効な血漿濃度は、各日に複数回投薬量を投与することによって達成されてもよい。血漿中の量は、例えば、ＨＰＬＣによって測定されてもよい。
局所投与又は選択的な取り込みの場合には、二重特異性抗体の有効な局所濃度は、血漿濃度と関係がない場合がある。当業者は、過度な実験を行うことなく、治療に有効な局所投薬量を最適化することができる。
本明細書に記載の二重特異性抗体の治療に有効な投薬量は、実質的な毒性を引き起こすことなく、一般的に治療利益を与える。融合タンパク質の毒性及び治療有効性は、細胞培養物又は実験動物における標準的な医薬手順によって決定することができる。細胞培養アッセイ及び動物実験を使用し、ＬＤ５０（集団の５０％が致死に至る用量）及びＥＤ５０（集団の５０％が治療に有効である用量）を決定することができる。毒性と治療効果との間の投薬比は、治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示す二重特異性抗体が好ましい。一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、高い治療指数を示す。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られるデータを、ヒトでの使用に適した投薬範囲を配合する際に使用することができる。投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどないか、全くない状態で、ＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にある。投薬量は、例えば、使用される投薬量、利用される投与経路、被験体の状態などの種々の因子に依存して、この範囲内で変動してもよい。実際の製剤、投与経路及び負う薬量は、患者の状態という観点で個々の医師によって選択されてもよい（例えば、その全体が本明細書に参考として組み込まれる、Ｆｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．，１９７５，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｈ．１，ｐ．１を参照。）
本発明の二重特異性抗体で処置される患者の主治医は、毒性、臓器不全などに起因して、どのように、いつ投与を中止するか、中断するか、又は調整するかを知っている。逆に、主治医は、臨床応答が十分ではない場合（毒性を生じずに）、処置をもっと高レベルにするように調整することも知っている。目的の障害の管理において投与される投薬量の大きさは、処置される状態の重篤度、投与経路などに伴って変動する。状態の重篤度は、例えば、部分的には、標準的な診断評価方法によって評価されてもよい。更に、投薬量と、おそらく投薬頻度は、個々の患者の年齢、体重及び応答によっても変わる。
他の薬剤及び処置
本明細書で上に記載したような、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、治療において、１つ以上の他の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。例えば、本発明の二重特異性抗体は、少なくとも１つの更なる治療薬剤と一緒に投与されてもよい。「治療薬剤」との用語は、このような処置が必要な個体において、症状又は疾患を処置するために投与することが可能な任意の薬剤を包含する。このような更なる治療薬剤は、処置される特定の徴候に適した任意の有効成分を含んでいてもよく、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含んでいてもよい。特定の実施形態では、更なる治療薬剤は、別の抗癌剤である。
本発明の一態様では、本発明で使用するか、又は癌の処置に使用するための、本明細書に記載するＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体、又は二重特異性抗体を含む医薬組成物も提供し、ここで、二重特異性抗体は、癌免疫療法に使用するために、化学療法剤、放射線及び／又は他の薬剤と組み合わせて投与される。
本発明の特定の態様では、本明細書に記載するＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体、又は前記二重特異性抗体を含む医薬組成物は、癌の予防又は処置に使用するためのものであり、二重特異性抗体は、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて投与される。一態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、（ａ）配列番号１５４のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号１５５のＣＤＲ－Ｈ２配列及び配列番号１５６のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号１５７のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号１５８のＣＤＲ－Ｌ２配列及び配列番号１５９のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は（ｂ）配列番号１６２のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号１６３のＣＤＲ－Ｈ２配列及び配列番号１６４のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号１６５のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号１６６のＣＤＲ－Ｌ２配列及び配列番号１６７のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、第２の抗原結合ドメインを含むＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体である。一態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含むか、又は配列番号１６８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び／又は配列番号１６９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインを含む、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体である。
更なる態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｆｃ受容体に対する結合及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。特に、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む。
特定の態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号１４６の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、配列番号１４７の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、配列番号１４８の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、及び配列番号１４９の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチドを含む。更に特定の実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号１４６のポリペプチド配列、配列番号１４７のポリペプチド配列、配列番号１４８のポリペプチド配列及び配列番号１４９のポリペプチド配列を含む（ＣＥＡ ＣＤ３ ＴＣＢ）。
更に具体的な態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号１５０の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、配列番号１５１の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、配列番号１５２の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、及び配列番号１５３の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチドを含む。更に特定の実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号１５０のポリペプチド配列、配列番号１５１のポリペプチド配列、配列番号１５２のポリペプチド配列及び配列番号１５３のポリペプチド配列を含む（ＣＥＡＣＡＭ５ ＣＤ３ ＴＣＢ）。
別の態様では、本明細書に記載される、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体、及びＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体を含む医薬組成物が提供される。特定の態様では、医薬組成物は、疾患、特に癌の処置のための併用処置、逐次処置又は同時処置に使用するためのものである。より特定的には、組成物は、固形腫瘍の処置に使用されるためのものである。
別の態様では、本発明は、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体又は抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて、本明細書に記載される、有効量のＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む、二重特異性抗体を被験体に投与することを含む、個体において癌を治療するか、又は進行を遅らせるための方法を提供する。
このような他の薬剤は、適切には、意図する目的にとって有効な量で組み合わせた状態で存在する。このような他の薬剤の有効量は、使用される融合タンパク質の量、障害又は処置の種類、上述の他の因子に依存する。二重特異性抗体は、一般的に、同じ投薬量で、本明細書に記載の投与経路で使用されるか、又は約１～９９％の本明細書に記載の投薬量で、又は経験的／臨床的に適切であると決定される任意の投薬量及び任意の経路で使用される。
上述のこのような併用療法は、組み合わせた投与（２つ以上の治療薬剤が、同じ又は別個の組成物に含まれる）、及び別個の投与を包含し、この場合、二重特異性抗体の投与は、更なる治療薬剤及び／又はアジュバントの投与前、投与と同時及び／又は投与後に行われてもよい。
Ｈ．製造物品
本発明の別の態様では、上述の障害の治療、予防及び／又は診断に有用な材料を含む製造物品が提供される。製造物品は、容器と、容器に挿入されるか、又は容器に付随するラベル又はパッケージ添付文書とを備えている。適切な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、静注溶液袋などが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの種々の材料から作られてもよい。容器は、組成物をそれ自身で、又は状態を処置し、予防し、及び／又は診断するのに有効な別の組成物と組み合わせて保持しており、滅菌アクセス口を有していてもよい（例えば、容器は、皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有する静脈用溶液袋又はバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本明細書で既に定義したように、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体である。
ラベル又はパッケージ添付文書は、その組成物が、選択した条件を処置するために使用されることを示す。更に、製造物品は、（ａ）中に組成物が入っており、組成物が、本発明の二重特異性抗体を含む、第１の容器と、（ｂ）中に組成物が入っており、組成物が、更なる細胞毒性剤又はその他の治療薬剤を含む、第２の容器とを備えていてもよい。製造物品は、本発明のこの実施形態では、その組成物を特定の状態を処置するために使用可能であることを示すパッケージ添付文書を更に備えていてもよい。
これに代えて、又はこれに加えて、製造物品は、医薬的に許容されるバッファー、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、Ｒｉｎｇｅｒ溶液及びデキストロース溶液を含む第２の（又は第３の）容器を更に備えていてもよい。他のバッファー、希釈剤、フィルター、ニードル及びシリンジを含め、商業的及びユーザの観点から望ましい他の材料を更に含んでいてもよい。
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以下の番号付けされた項は、本発明の態様を記載する。
１．二重特異性抗体であって、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ３）に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、
前記ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３とを含むＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３とを含むＶＬドメインとを含む、二重特異性抗体を提供する。
２．二重特異性抗体が、ＩｇＧであるＦｃドメイン、特に、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含み、Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体に対する結合を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、項１に記載の二重特異性抗体。
３．項１又は２に記載の二重特異性抗体であって、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインが、
（ａ）
（ｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３とを含むＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３とを含むＶＬドメインとを含むか、又は
（ｂ）
（ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３とを含むＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３とを含むＶＬドメインとを含むか、又は
（ｃ）
（ｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３とを含むＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３とを含むＶＬドメインとを含むか、又は
（ｄ）
（ｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３とを含むＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３とを含むＶＬドメインとを含むか、又は
（ｅ）
（ｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３とを含むＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３とを含むＶＬドメインとを含む、二重特異性抗体が提供される。
４．項１～３のいずれか１つに記載の二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、
（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｃ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｄ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｅ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、二重特異性抗体が提供される。
５．項１～４のいずれか１つに記載の二重特異性抗体であって、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、
（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｃ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｄ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｅ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、二重特異性抗体が提供される。
６．項１～４のいずれか１つに記載の二重特異性抗体であって、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、
（ａ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｃ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号６５のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｄ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、二重特異性抗体が提供される。
７．項１～５のいずれか１つに記載の二重特異性抗体であって、
ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが、配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含み、
ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインが、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、二重特異性抗体が提供される。
８．項１～５のいずれか１つに記載の二重特異性抗体であって、
ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが、配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含み、
ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインが、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、二重特異性抗体が提供される。
９．項１～４又は６のいずれか１つに記載の二重特異性抗体であって、
ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが、配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含み、
ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインが、配列番号５６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、二重特異性抗体が提供される。
１０．二重特異性抗体が、ヒト化抗体又はキメラ抗体である、項１～５のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
１１．二重特異性抗体が、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を有する、ヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインを含む、項１～１０のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
１２．二重特異性抗体が、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する改変を含むＦｃドメインを含む、項１～１１のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
１３．二重特異性抗体であって、ホールにノブを入れる方法に従って、Ｆｃドメインの第１のサブユニットがノブを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットがホールを含む、項１～１２のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
１４．Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、項１～１３のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
１５．二重特異性抗体が、Ｆｃドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第１のＦａｂフラグメントと、ＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第２のＦａｂフラグメントとを含む、項１～１４のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
１６．Ｆａｂフラグメントの１つにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨは、ＶＨドメインが軽鎖の一部であり、ＶＬドメインが重鎖の一部であるように互いに置き換わっている、項１～１５のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
１７．ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第１のＦａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨは、互いに置き換わっている、項１５又は１６に記載の二重特異性抗体。
１８．二重特異性抗体が、Ｆａｂフラグメントを含み、定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１において、位置１４７及び２１３のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、項１～１７のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
１９．ＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第２のＦａｂフラグメントの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１において、位置１４７及び２１３のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、項１５～１８のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
２０．項１～１９のいずれか１つに記載の二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号９６の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号９８の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、
配列番号９７の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号９９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｂ）配列番号９６の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号９８の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、
配列番号１００の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｃ）配列番号１０２の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１０４の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、
配列番号１０３の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｄ）配列番号１０６の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１０７の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、
配列番号１０３の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む、二重特異性抗体が提供される。
２１．二重特異性抗体が、ＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第３のＦａｂフラグメントを含む、項１～１９のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
２２．それぞれＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む２つのＦａｂフラグメントが同一である、項１～１９又は２１のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
２３．ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含むＦａｂフラグメントは、重鎖の１つのＣ末端にペプチドリンカーを介して融合している、項１～１９又は２１又は２２のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
２４．項１～１９又は２１～２３のいずれか１つに記載の二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１１８の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１１５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、
配列番号１１９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｂ）配列番号１２０の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１１５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、
配列番号１２１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号９９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｃ）配列番号１２２の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１１５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、
配列番号１０３の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む、二重特異性抗体が提供される。
２５．二重特異性抗体が、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第４のＦａｂフラグメントを含む、項１～１９又は２１～２３のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
２６．それぞれＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む２つのＦａｂフラグメントが同一である、項１～１９又は２１～２３又は２５のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
２７．ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインをそれぞれ含む２つのＦａｂフラグメントは、それぞれ、重鎖の１つのＣ末端にペプチドリンカーを介してそれぞれ融合している、項１～１９又は２１～２３又は２５又は２６のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
２８．項１～１９又は２１～２３又は２５～２７のいずれか１つに記載の二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１１４の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの重鎖と、配列番号１１５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの第１の軽鎖と、配列番号１０１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの第２の軽鎖、又は
（ｂ）配列番号１１６の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの重鎖と、配列番号１１５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの第１の軽鎖と、配列番号９９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの第２の軽鎖、又は
（ｃ）配列番号１１７の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの重鎖と、配列番号１１５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの第１の軽鎖と、配列番号１０５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む２つの第２の軽鎖を含む、二重特異性抗体が提供される。
２９．二重特異性抗体が、Ｆｃドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインをそれぞれ含む２つのＦａｂフラグメントと、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）とを含む、項１～１４のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
３０．ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含むｓｃＦａｂは、重鎖の１つのＣ末端にペプチドリンカーを介して融合している、項１～１４又は２９のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
３１．項１～１４又は２９又は３０のいずれか１つに記載の二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１２３の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１１９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、又は
（ｂ）配列番号１２４の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１２１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号９９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの軽鎖、又は
（ｃ）配列番号１２５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１０３の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む、二重特異性抗体が提供される。
３２．二重特異性抗体が、Ｆｃドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインをそれぞれ含む２つのＦａｂフラグメントと、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含むＶＨ及びＶＬドメインとを含む、項１～１４のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
３３．ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインのＶＨドメインは、重鎖の１つのＣ末端にペプチドリンカーを介して融合しており、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインのＶＬドメインは、重鎖のもう一方のＣ末端にペプチドリンカーを介して融合している、項１～１４又は３２のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
３４．配列番号１２６の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１２７の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの軽鎖を含む、項１～１４又は３２又は３３のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
３５．項１～３４のいずれか１つに記載の二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド。
３６．項３５に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター、特に、発現ベクター。
３７．項３５に記載のポリヌクレオチドを含む原核生物又は真核生物の宿主細胞、又は項３６に記載のベクター。
３８．二重特異性抗体の発現に適した条件で、項３７に記載の宿主細胞を培養することと、培養物から二重特異性抗体を回収することとを含む、項１～３４に記載の二重特異性抗体を製造する方法。
３９．項１～３４のいずれか１つに記載の二重特異性抗体と、少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
４０．医薬として使用するための項１～３４のいずれか１つに記載の二重特異性抗体又は項３９に記載の医薬組成物。
４１．項１～３４のいずれか１つに記載の二重特異性抗体又は項３９に記載の医薬組成物であって、
（ｉ）免疫応答の調節、例えば、Ｔ細胞活性の回復において、
（ｉｉ）Ｔ細胞応答の刺激において、
（ｉｉｉ）感染の処置において、
（ｉｖ）癌の処置において、
（ｖ）癌の進行を遅らせることにおいて、
（ｖｉ）癌を患う患者の生存を延長することにおいて使用するための二重特異性抗体又は医薬組成物を提供する。
４２．癌の予防又は処置に使用するための項１～３４のいずれか１つに記載の二重特異性抗体又は項３９に記載の医薬組成物。
４３．慢性ウイルス感染の処置に使用するための項１～３４のいずれか１つに記載の二重特異性抗体又は項３９に記載の医薬組成物。
４４．二重特異性抗体は、癌免疫療法で使用するために化学療法剤、放射線及び／又は他の薬剤と組み合わせて投与される、癌の予防又は処置に使用するための項１～３４のいずれか１つに記載の二重特異性抗体又は項３９に記載の医薬組成物。
４５．個体において腫瘍細胞の成長を阻害する方法であって、前記腫瘍細胞の成長を阻害するために、前記個体に有効量の請求項１～３４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を投与することを含む、方法。
以下は、本発明の方法及び組成物の例である。上に提供した一般的な記載が与えられ、種々の実施形態が実施されてもよいことが理解される。
材料及び一般的な方法
ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関連する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ Ｅｄ．、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）に与えられる。抗体鎖のアミノ酸は、上に定義したようなＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ ｅｄ．、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））による番号付けシステムに従って番号付けされ、参照される。
組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用し、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９に記載されるように、ＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は、製造業者の指示に従って使用した。
遺伝子合成
望ましい遺伝子セグメントは、化学合成によって作られるオリゴヌクレオチドから調製した。６００～１８００ｂｐ長の遺伝子セグメントは、単一の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位に隣接しており、ＰＣＲ増幅を含め、オリゴヌクレオチドをアニーリングし、切断することによって整列させ、その後、所定の制限部位、例えば、ＫｐｎＩ／ ＳａｃＩ又はＡｓｃＩ／ＰａｃＩを介し、ｐＰＣＲＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）由来のｐＧＡ４クローニングベクター内でクローン化した。サブクローン化された遺伝子フラグメントのＤＮＡ配列は、ＤＮＡシークエンシングによって確認された。遺伝子合成フラグメントは、Ｇｅｎｅａｒｔ（レーゲンスブルク、ドイツ）での所与の仕様に従って並べられた。
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、ＭｅｄｉＧｅｎｏｍｉｘ ＧｍｂＨ（マルティンスリート、ドイツ）又はＳｅｑｕｉｓｅｒｖｅ ＧｍｂＨ（ファターシュテッテン、ドイツ）で行われた二本鎖シークエンシングによって決定された。
ＤＮＡ及びタンパク質配列分析及び配列データ管理
ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、マディソン、ウィスコンシン）ソフトウェアパッケージバージョン１０．２及びＩｎｆｏｍａｘのＶｅｃｔｏｒ ＮＴ１ Ａｄｖａｎｃｅ ｓｕｉｔｅバージョン８．０を、配列作成、マッピング、分析、注釈及び図示のために使用した。
発現ベクター
記載される抗体の発現のために、ＣＭＶ－イントロンＡプロモーターを用い、又は用いずに、ｃＤＮＡ組織化、又はＣＭＶプロモーターを用いるゲノム組織化に基づく、細胞の一時的な発現（例えば、ＨＥＫ２９３細胞における）のための発現プラスミドのバリアントが適用された。
抗体発現カセット以外に、ベクターは、以下のものを含んでいた。
－Ｅ．Ｃｏｌｉにおいてプラスミドの複製を可能にする複製起源、
－Ｅ．Ｃｏｌｉにおいてアンピシリン耐性を与えるβ－ラクタマーゼ遺伝子、
抗体遺伝子の転写ユニットは、以下の要素で構成されていた。
－５’末端の固有の制限部位、
－ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期遺伝子及びプロモーター、
－次に、ｃＤＮＡ組織化の場合には、ントロンＡ配列、
－ヒト抗体遺伝子の５’－未翻訳領域、
－免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
－ｃＤＮＡとして、又は免疫グロブリンエクソン－イントロン組織化を伴うゲノム組織化としてのヒト抗体鎖（野生型又はドメイン置き換えを含むもの）、
－ポリアデニル化シグナル配列を有する３’未翻訳領域、
－３’末端の固有の制限部位。
以下に記載する抗体を含む融合遺伝子は、ＰＣＲ及び／又は遺伝子合成によって作成され、それぞれのベクター中の固有の制限部位を用いて、核酸セグメントにしたがって接続することによって、既知の組換え方法及び技術によってアセンブリされた。サブクローン化された核酸配列は、ＤＮＡシークエンシングによって確認された。一時的なトランスフェクションのために、大量のプラスミドが、トランスフェクションされたＥ．Ｃｏｌｉ培養物（Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ ＡＸ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）からプラスミド調製によって調製された。
細胞培養技術
標準的な細胞培養技術は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００）、Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ，Ｊ．Ｓ．、Ｄａｓｓｏ，Ｍ．、Ｈａｒｆｏｒｄ，Ｊ．Ｂ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｊ．及びＹａｍａｄａ，Ｋ．Ｍ．（編集）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に記載されているように使用した。
多重特異性抗体は、接着して成長するＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ中、又は以下に記載する懸濁物中で成長するＨＥＫ２９－Ｆ細胞中、それぞれの発現プラスミドの一時的な同時トランスフェクションによって発現された。
ＨＥＫ２９３系における一時的なトランスフェクション
全ての抗体及び二重特異性抗体は、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用い、２９３Ｆ細胞の一時的なトランスフェクションによって作成された。ここで、２９３Ｆ細胞をＦ１７培地中で培養し、２９３Ｆｒｅｅ（Ｎｏｖａｇｅｎｅ）でトランスフェクションし、ＶＰＡ ４ｍＭを用いて４時間後に供給し、１６時間後にＦｅｅｄ ７と０．６％のグルコースを供給した。更に、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用した。ここで、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞をＥｘｐｉ２９３（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ中で培養し、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用い、製造業者の指示に従って移した。ＣＨ１／ＣＬ界面に更に導入された帯電したアミノ酸対を有するＣｒｏｓｓＭＡｂＶｈ－ＶＬ二重特異性抗体の安定性及び純度の向上、凝集傾向の低下に起因して（更なる詳細については、それぞれの配列における位置を参照）、プラスミド比率の調節は使用されていない。従って、１＋１ ＣｒｏｓｓＭａｂについて、相対的なプラスミド比１：１：１：１、又は２＋２ ＣｒｏｓｓＭａｂについて１：１：１を、ＬＣ、ＨＣ、交差したＬＣ及び交差したＨＣプラスミドの同時トランスフェクションに使用した。７日後に細胞上清を集め、標準的な方法によって精製した。
タンパク質決定
精製された抗体及び誘導体のタンパク質濃度は、Ｐａｃｅ、ｅｔ ａｌ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９５、４、２４１１－１４２３に従って、アミノ酸配列に基づいて計算されるモル吸光係数を用い、２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を決定することによって決定された。
上清中の抗体濃度決定
細胞培養物上清中の抗体及び誘導体の濃度は、プロテインＡアガロースビーズ（Ｒｏｃｈｅ）を用いた免疫沈降によって概算された。６０μＬのプロテインＡアガロースビーズを、ＴＢＳ－ＮＰ４０（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ－Ｐ４０）で３回洗浄した。その後、１～１５ｍＬの細胞培養物上清を、ＴＢＳ－ＮＰ４０中であらかじめ平衡状態にしたプロテインＡアガロースビーズに適用した。室温で１時間インキュベートした後、ビーズを、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ－ＭＣ－フィルターカラム（Ａｍｉｃｏｎ）上で、０．５ｍＬ ＴＢＳ－ＮＰ４０で１回、０．５ｍＬの２ｘリン酸緩衝化生理食塩水（２ｘＰＢＳ、Ｒｏｃｈｅ）で２回洗浄し、０．５ｍＬ １００ｍＭ クエン酸Ｎａ（ｐＨ５．０）で４回、簡単に洗浄した。結合した抗体を、３５μｌのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えることによって溶出させた。サンプルの半分を、それぞれ、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｓａｍｐｌｅ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔと合わせるか、又は還元しないまま放置し、７０℃で１０分間加熱した。その結果、５～３０μｌを、４～１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用のＭＯＰＳバッファー及び還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）酸化防止剤ランニングバッファー添加剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＭＥＳバッファーに適用し、クマシンブルーで染色した。
細胞培養物上清中の抗体及び誘導体の濃度は、アフィニティＨＰＬＣクロマトグラフィーによって定量的に測定された。簡単に言うと、プロテインＡに結合する抗体及び誘導体を含有する細胞培養物上清を、２００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１００ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）中、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｏｒｏｓ Ａ／２０カラムに適用し、Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ １１００システムで、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭクエン酸（ｐＨ２．５）を用いてマトリックスから溶出させた。溶出したタンパク質をＵＶ吸光度及びピークエリア積算によって定量した。精製された標準ＩｇＧ１抗体を、標準として与えた。
又は、細胞培養物上清中の抗体及び誘導体の濃度は、サンドイッチ－ＩｇＧ－ＥＬＩＳＡによって測定された。簡単に言うと、ＳｔｒｅｐｔａＷｅｌｌ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ Ｓｔｒｅｐａｔａｖｉｄｉｎ Ａ－９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｒｏｃｈｅ）を、１００μＬ／ウェルのビオチン化抗ヒトＩｇＧ捕捉分子Ｆ（ａｂ’）２＜ｈ－Ｆｃγ＞ＢＩ（Ｄｉａｎｏｖａ）で、０．１μｇ／ｍＬで室温で１時間かけて、又は４℃で一晩かけてコーティングし、その後、２００μＬ／ウェルのＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ、Ｓｉｇｍａ）を用いて３回洗浄した。細胞培養物上清を含有するそれぞれの抗体の１００μＬ／ウェルのＰＢＳでの希釈系列をウェルに加え、室温で、マイクロタイタープレート上、１～２時間インキュベートした。ウェルを２００μＬ／ウェルのＰＢＳＴで３回洗浄し、マイクロタイタープレートで、結合した抗体を、検出抗体として０．１μ／ｍＬの１００μｌのＦ（ａｂ’）２＜ｈＦｃγ＞ＰＯＤ（Ｄｉａｎｏｖａ）で、室温で１～２時間かけて検出した。未結合の検出抗体を、２００μＬ／ウェルのＰＢＳＴを用いて３回洗浄し、結合した検出抗体は、１００μＬのＡＢＴＳ／ウェルを加えることによって検出した。吸光度の決定は、Ｔｅｃａｎ Ｆｌｕｏｒ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒで、測定波長４０５ｎｍ（参照波長４９２ｎｍ）で行った。
タンパク質精製
タンパク質は、標準プロトコルを参照しつつ、濾過した細胞培養物上清から精製した。簡単に言うと、抗体を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、ＰＢＳで洗浄した。抗体の溶出は、ｐＨ２．８で達成され、その後、サンプルをすぐに中和した。凝集したタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、ＰＢＳ中、又は２０ｍＭ ヒスチジン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中、モノマー抗体から分離された。モノマー抗体フラクションをプールし、例えば、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（３０ ＭＷＣＯ）遠心分離濃縮器を用いて濃縮し（必要な場合）、凍結させ、－２０℃又は－８０℃で保存した。サンプルの一部を、例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）又は質量分析法によるその後のタンパク質分析及び分析による特性決定のために提供した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造業者の指示に従って使用した。特に、１０％又は４～１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ－ＴＲＩＳ Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）及びＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元したゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）酸化防止剤ランニングバッファー添加剤）又はＭＯＰＳ（還元していないゲル）ランニングバッファーを使用した。
分析サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集及びオリゴマー状態を決定するためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって行われた。簡単に言うと、プロテインＡ精製抗体を、Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ １１００システム又はＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、２×ＰＢＳ中、Ｄｉｏｎｅｘ ＨＰＬＣ－Ｓｙｓｔｅｍで、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）中、Ｔｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラムに適用した。溶出したタンパク質をＵＶ吸光度及びピークエリア積算によって定量した。ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ １５１-１９０１を標準として与えた。
質量分析法
この章は、その正しいアセンブリに重点をおいて、ＶＨ／ＶＬ置き換え（ＶＨ／ＶＬ ＣｒｏｓｓＭａｂ）を有する多重特異性抗体の特性決定を記載する。予想される一次構造を、脱グリコシル化したインタクトなＣｒｏｓｓＭａｂｓ及び脱グリコシル化した／消化したプラスミン、又は脱グリコシル化した／制限されたＬｙｓＣ消化したＣｒｏｓｓＭａｂのエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ－ＭＳ）によって分析した。
ＶＨ／ＶＬ ＣｒｏｓｓＭａｂｓを、リン酸バッファー又はＴｒｉｓバッファー中、タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌで、３７℃で１７時間までの時間、Ｎ－グリコシダーゼＦを用いて脱グリコシル化した。プラスミン又は制限されたＬｙｓＣ（Ｒｏｃｈｅ）消化を、１００μｇの脱グリコシル化したＶＨ／ＶＬ ＣｒｏｓｓＭａｂを用い、Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８）中、それぞれ、室温で１２０時間、また、３７℃で４０分間行った。質量分析の前に、サンプルを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのＨＰＬＣによって脱塩した。合計質量は、ＴｒｉＶｅｒｓａ ＮａｎｏＭａｔｅ ｓｏｕｒｃｅ（Ａｄｖｉｏｎ）が取り付けられたｍａＸｉｓ ４Ｇ ＵＨＲ－ＱＴＯＦ ＭＳシステム（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ）でのＥＳＩ－ＭＳによって決定された。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（ＢＩＡＣＯＲＥ）を用い、それぞれの抗原に対する多重特異性抗体の結合及び結合アフィニティの決定。
それぞれの抗原に対する、生成した抗体の結合は、ＢＩＡＣＯＲＥ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、ウプサラ、スウェーデン）を用い、表面プラズモン共鳴によって観察された。それぞれのＢｉａｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅを、センサグラムの分析及びアフィニティデータの計算に使用する。
実施例１
抗ＰＤ－１抗体の作成
マウスの免疫付与
ＮＭＲＩマウスを、１００ｕｇのベクターＤＮＡ（プラスミド１５３００＿ｈＰＤ１－ｆｌ）の皮内適用によって、全長ヒトＰＤ－１をコードするプラスミド発現ベクターを用い、遺伝子的に免疫付与し、その後、エレクトロポレーション（１０００Ｖ／ｃｍの２スクエアパルス、持続時間０．１ｍｓ、間隔０．１２５ｓ）し、その後、４スクエアパルスの２８７．５Ｖ／ｃｍ、持続時間１０ｍｓ、間隔０．１２５ｓを行った。マウスは、０、１４、２８、４２、５６、７０、８４日に、６回の連続した免疫付与のいずれかを受けた。血液を３６、７８、９２日目に採取し、血清を調製し、これをＥＬＩＳＡによるタイター決定に使用した（以下を参照）。最大タイターを有する動物を、９６日目に５０ｕｇの組換えヒトＰＤ１ヒトＦｃキメラの静脈内注射によって促進させるために選択し、促進から３日後の骨髄腫細胞株への脾臓細胞の融合によって、モノクローナル抗体をハイブリドーマ技術によって単離した。
血清タイターの決定（ＥＬＩＳＡ）
ヒト 組換えＰＤ１ヒトＦｃキメラを、９６ウェルＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートに０．３ｕｇ／ｍｌ、ＰＢＳ中１００ｕｌ／ウェルで固定化し、その後、ＰＢＳ中の２％ Ｃｒｏｔｅｉｎ Ｃ、２００ｕｌ／ウェルでプレートをブロックし、ＰＢＳ中の０．５％ Ｃｒｏｔｅｉｎ Ｃ、１００ｕｌ／ウェルで抗血清の段階希釈を二個ずつ適用し、ＨＲＰ抱合されたヤギ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ／Ｄｉａｎｏｖａ １１５－０３６－０７１； １／１６ ０００）で検出した。全ての工程について、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。全ての工程の間に、プレートを、ＰＢＳ中の０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で３回洗浄した。ＢＭ Ｂｌｕｅ ＰＯＤ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ可溶性（Ｒｏｃｈｅ）を１００ｕｌ／ウェルで加えることによって、シグナルを現像し、１Ｍ ＨＣｌ、１００ｕｌ／ウェルを加えることによって停止させた。吸光度を、リファレンスとしての６９０ｎｍに対し、４５０ｎｍで読み取った。タイターは、最大シグナルの半分値が得られる抗血清の希釈度であると定義された。
実施例２
抗ＰＤ１抗体の特性決定／ヒトＰＤ１に対する抗ＰＤ１抗体の結合
ｈｕ ＰＤ１のＥＬＩＳＡ
Ｎｕｎｃ ｍａｘｉｓｏｒｐストレプトアビジンでコーティングしたプレート（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ番号１１９７４９９８００１）を、２５μｌ／ウェルのビオチン化ＰＤ１－ＥＣＤ－ＡｖｉＨｉｓでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌの抗ＰＤ１サンプル又は参照抗体（ヒト抗ＰＤ１；Ｒｏｃｈｅ／マウス抗ＰＤ１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号３２９９１２）を加え、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのヤギ－抗ヒトＨ＋Ｌ－ＰＯＤ（ＪＩＲ，ＪＩＲ１０９－０３６－０８８）／ヒツジ－抗マウスＰＯＤ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；ＮＡ９３１０）を、１：２０００／１：１０００希釈状態で添加し、シェーカー上で、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１１８３５０３３００１）を加え、ＯＤ２－３になるまでインキュベートした。測定を３７０／４９２ｎｍで行った。
ＥＬＩＳＡの結果は、以下のまとめた表１及び表２に、ＥＣ５０値［ｎｇ／ｍｌ］として列挙している。
ＰＤ１についての細胞ＥＬＩＳＡ
接着性ＣＨＯ－Ｋ１細胞株は、全長ヒトＰＤ１をコードするプラスミド１５３１１＿ｈＰＤ１－ｆｌ＿ｐＵＣ＿Ｎｅｏを用いて安定にトランスフェクションされ、Ｇ４１８を用いた選択（プラスミドでのネオマイシン耐性マーカー）を、３８４ウェル平底プレート中、濃度０．０１ｘ１０Ｅ６細胞／ウェルで接種し、一晩成長させた。
次の日、２５μｌ／ウェルのＰＤ１サンプル又はヒト抗ＰＤ１（Ｒｏｃｈｅ）／マウス抗ＰＤ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号：３２９９１２）参照抗体を加え、４℃で２時間インキュベートした（インターナリゼーションを避けるため）。注意深く洗浄した後（１ｘ９０μｌ／ウェル ＰＢＳＴ）、３０μｌ／ウェルの０．０５％グルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ５８８２、２５％）を１ｘＰＢＳバッファーに希釈したものを加えることによってセルを固定し、ＲＴで１０分間インキュベートした。洗浄した後（３ｘ９０μｌ／ウェル ＰＢＳＴ）、２５μｌ／ウェルの二次抗体ヤギ－抗ヒトＨ＋Ｌ－ＰＯＤ（ＪＩＲ、ＪＩＲ１０９－０３６－０８８）／ヒツジ－抗マウス－ＰＯＤ（ＧＥ ＮＡ９３１０）を検出のために加え、その後、シェーカー上で、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄した後（３ｘ９０μｌ／ウェル ＰＢＳＴ）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質溶液（Ｒｏｃｈｅ １１８３５０３３００１）を加え、ＯＤ１．０－２．０になるまでインキュベートした。プレートを３７０／４９２ｎｍで測定した。
細胞ＥＬＩＳＡの結果は、以下の表２に、「ＥＣ５０ＣＨＯ－ＰＤ１」値［ｎｇ／ｍｌ］として列挙している。
ｃｙｎｏ ＰＤ１のＥＬＩＳＡ
Ｎｕｎｃ ｍａｘｉｓｏｒｐストレプトアビジンでコーティングしたプレート（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ番号１１９７４９９８００１）を、２５μｌ／ウェルのビオチン化ｃｙｎｏＰＤ１－ＥＣＤ－Ｂｉｏｔｉｎでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌの抗ＰＤ１サンプル又は参照抗体（ヒト抗ＰＤ１；Ｒｏｃｈｅ）を加え、シェーカー上で、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのヤギ－抗ヒトＨ＋Ｌ－ＰＯＤ（ＪＩＲ，ＪＩＲ１０９－０３６－０８８）を、１：１０００希釈状態で添加し、シェーカー上で、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ、１１８３５０３３００１）を加え、ＯＤ２－３になるまでインキュベートした。測定を３７０／４９２ｎｍで行った。
ＥＬＩＳＡの結果は、以下のまとめた表１及び表２に、ＥＣ５０値［ｎｇ／ｍｌ］として列挙している。
ＰＤリガンド１交換アッセイ
Ｎｕｎｃ ｍａｘｉｓｏｒｐストレプトアビジンでコーティングしたプレート（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ番号１１９７４９９８００１）を、２５μｌ／ウェルのビオチン化ＰＤ１－ＥＣＤ－ＡｖｉＨｉｓでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌの抗ＰＤ１サンプル又は参照抗体（マウス抗ＰＤ１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号３２９９１２）を加え、シェーカー上で、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＰＤ－Ｌ１（組換えヒトＢ７－Ｈ１／ＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒａ；１５６－Ｂ７，Ｒ＆Ｄ）を加え、シェーカー上で、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのヤギ－抗ヒトＨ＋Ｌ－ＰＯＤ（ＪＩＲ，１０９－０３６－０８８）を、１：１０００希釈状態で添加し、シェーカー上で、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ、１１８３５０３３００１）を加え、ＯＤ２－３になるまでインキュベートした。測定を３７０／４９２ｎｍで行った。
ＥＬＩＳＡの結果は、以下のまとめた表１に、ＩＣ５０値［ｎｇ／ｍｌ］として列挙している。
ＰＤリガンド２交換アッセイ
Ｎｕｎｃ ｍａｘｉｓｏｒｐストレプトアビジンでコーティングしたプレート（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ番号１１９７４９９８００１）を、２５μｌ／ウェルのビオチン化ＰＤ１－ＥＣＤ－ＡｖｉＨｉｓでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌの抗ＰＤ１サンプル又は参照抗体（マウス抗ｈｕＰＤ１；Ｒｏｃｈｅ）を加え、シェーカー上で、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＰＤ－Ｌ２（組換えヒトＢ７－ＤＣ／ＰＤ－Ｌ２ Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒａ；１２２４－ＰＬ－１００，Ｒ＆Ｄ）を加え、シェーカー上で、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのヤギ－抗ヒトＨ＋Ｌ－ＰＯＤ（ＪＩＲ，１０９－０３６－０８８）を、１：２０００希釈状態で添加し、シェーカー上で、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）基質（Ｒｏｃｈｅ、１１８３５０３３００１）を加え、ＯＤ２－３になるまでインキュベートした。測定を３７０／４９２ｎｍで行った。
ＥＬＩＳＡの結果は、以下のまとめた表１に、ＩＣ５０値［ｎｇ／ｍｌ］として列挙している。
エピトープマッピングＥＬＩＳＡ／結合競争アッセイ
Ｎｕｎｃ ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ番号４６４７１８）を、２５μｌ／ウェルの捕捉抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ；ＪＩＲ；１１５－００６－０７１）でコーティングし、シェーカー上で、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、プレートを、２％ＢＳＡを含有するＰＢＳバッファーを用い、シェーカー上で、ＲＴで１時間かけてブロックした。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌのマウス抗ＰＤ１サンプルを加え、シェーカー上で、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、捕捉抗体を、３０μｌ／ウェルのマウスＩｇＧ（ＪＩＲ；０１５－０００－００３）を用い、シェーカー上で、ＲＴで１時間かけてブロックした。同時に、ビオチン化ＰＤ１－ＥＣＤ－ＡｖｉＨｉｓを、第２のサンプル抗体と共に、シェーカー上で、ＲＴで１時間、プレインキュベートした。アッセイプレートを洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、ＰＤ１抗体ミックスをアッセイプレートに移し、シェーカー上で、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのストレプトアビジンＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ、番号１１０８９１５３００１）を１：４０００希釈状態で添加し、シェーカー上で、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ、番号１１０８９１５３００１）を加え、ＯＤ１．５－２．５になるまでインキュベートした。測定を３７０／４９２ｎｍで行った。エピトープ群は、参照抗体に対する階層クラスタリングによって定義された。
Figure 0006997212000023
Figure 0006997212000024
ヒト化抗ＰＤ－１抗体のＢｉａｃｏｒｅ特性決定
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づくアッセイを使用し、いくつかのマウスＰＤ１バインダー及び市販のヒトＰＤ１結合リファレンスとの間の結合の速度論的パラメータを決定した。抗ヒトＦｃ ＩｇＧは、アミンカップリングによって、（Ｂｉａｃｏｒｅ）ＣＭ５センサチップの表面に固定された。次いで、サンプルを捕捉し、ｈｕ ＰＤ１－ＥＣＤをサンプルに結合させた。各分析サイクルの後、センサチップ表面を再生した。平衡定数及び動的速度定数は、このデータを１：１ラングミュアー相互作用モデルにフィッティングすることによって、最終的に得た。
約２０００応答単位（ＲＵ）の２０μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＃ＢＲ－１００８－３９）を、ｐＨ５．０でＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００中のＣＭ５センサチップのフローセル１及び２（又は３及び４）で、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって供給されるアミンカップリングキットを用いることによって、連結した。
サンプル及びランニングバッファーは、ＨＢＳ－ＥＰ＋（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）であった。フローセル温度を２５℃に設定し、サンプルコンパートメント温度を１２℃に設定した。このシステムを、ランニングバッファーを用いて準備した。
サンプルを濃度１０ｎＭで２０秒間注入し、第２のフローセルに結合させた。次いで、ヒトＰＤ１－ＥＣＤ濃度の完全なセット（１４４ｎＭ、４８ｎＭ、１６ｎＭ、５．３３ｎＭ、１．７８ｎＭ、０．５９ｎＭ、０．２０ｎＭ及び０ｎＭ）を、各サンプルに１２０秒間注入し、その後、３０／３００秒の解離時間と、３Ｍ ＭｇＣｌ２を用いた２つの２０秒の再生工程を行い、その中で、最後の１つは、ランニングバッファーを含む「注入後の余分の洗浄」を含んでいた。
最後に、二重リファレンスを使用したデータを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用い、１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ相互作用モデルにフィッティングした。得られたＫＤ、ｋａ及びｋｄの値を表３に示す。
Figure 0006997212000025
表３に示されるように、キメラＰＤ１－０１０３の全てのヒト化態様（実施例６を参照して作成）は、親抗体（キメラＰＤ１－０１０３）と同様の速度論的特性を示す。
速度論
ＣＭ５センサシリーズＳをＢｉａｃｏｒｅ ４０００ Ｓｙｓｔｅｍに取り付け、検出スポットを、製造業者の指示に従って、流体力学的に対処した。
ポリクローナルウサギＩｇＧ抗体＜ＩｇＧＦＣγＭ＞Ｒ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を、１００００Ｒｕで、フローセル１、２、３及び４の検出スポット１及び５に固定した。カップリングは、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学によって、製造業者の指示に従って行われた。プローセル中の残りのスポットをリファレンスとして与えた。サンプルバッファーは、１ｍｇ／ｍｌのカルボキシメチルデキストランを追加したシステムバッファーであった。
一実施形態では、アッセイを２５℃で行った。別の実施形態では、アッセイを３７℃で行った。５０ｎＭの各マウスモノクローナル抗体を、１０μｌ／分で１分間注入することによって、センサ表面で捕捉した。その後、それぞれの抗原を、４分間の解離段階の時間のために、１００ｎＭ、２×３３ｎＭ、１１ｎＭ、４ｎＭ、１ｎＭ、システムバッファー０ｎＭの濃度シリーズで、３０μ／分で注射した。更に４分間、解離をモニタリングした。１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）を３０μ／分で３分間注射し、捕捉系を再生した。関連する速度論的データを、Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアを用い、製造業者の指示に従って計算した。
エピトープマッピング
Ｂｉａｃｏｒｅ ４０００装置をＢｉａｃｏｒｅ ＣＡＰセンサに取り付け、製造業者によって推奨されるように準備した。装置バッファーは、ＨＢＳ－ＥＴ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０）であった。装置を２５℃で操作した。
全てのサンプルを、システムバッファーで希釈した。３５ｋＤａのビオチン化抗原ＰＤ１－ＥＣＤ－ＡｖｉＨｉｓを、２００ＲＵで、スポット１及び５において、フローセル１、２、３及び４における３０μｌ／分での１分間の注入によって、ＣＡＰセンサ表面で捕捉した。スポット２、３及び４をリファレンスとして与えた。別の実施形態では、３５ｋＤａのビオチン化抗原ＰＤ１－ＥＣＤ－ＡｖｉＨｉｓを、同じ様式で、２００ＲＵで、ＣＡＰセンサ上で捕捉した。
その後、一次抗体を、１００ｎＭで３分間、３０μｌ／分で注射し、次いで、二次抗体を１００ｎＭで３分間、３０μｌ／分で注射した。表面提示した抗原が全飽和になるまで、一次抗体を注射した。一次抗体と二次抗体の注入段階の終了時に、報告点「結合レート」（ＢＬ）を、それぞれの抗体の結合応答をモニタリングするために設定した。モル比（二次抗体結合応答「ＢＬ２」と一次抗体応答「ＢＬ１」との間の商）を計算した。抗体が、既に一次抗体によって複合体化している場合、このモル比を、二次抗体の抗原接近性の指標として使用した。
この複合体を、製造業者が推奨するように、２Ｍグアニジン－ＨＣＬ２分間、３０μｌ／分の２５０ｍＭのＮａＯＨ再生バッファーの注射によってセンサ表面から完全に除去し、その後、システムバッファーを１分間、３０μｌ／分で注射した。
実施例３
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）におけるサイトカイン産生に対する、異なる抗ＰＤ－１抗体の効果。
（３Ａ）混合リンパ球反応（ＭＬＲ）は、１つの個体（ドナーＸ）由来のリンパ球から、別の個体（ドナーＹ）由来のリンパ球までの活性化を測定する免疫細胞アッセイである。混合リンパ球反応を使用し、リンパ球エフェクター細胞に対するＰＤ１経路をブロックする効果を示した。このアッセイ中のＴ細胞は、抗ＰＤ１ ｍＡｎ存在下又は非存在下、活性化及びそのＩＦＮγ分泌について試験された。
同種異系ＭＬＲを行うために、未知のＨＬＡ型を有する少なくとも４の健康なドナーからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｌｅｕｋｏｓｅｐ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ、２２７ ２８８）を用い、密度勾配遠心分離によって単離した。簡単に言うと、ヘパリン処理された血液サンプルを３倍体積のＰＢＳで希釈し、希釈し多血液の２５ｍｌのアリコートを５０ｍｌのＬｅｕｋｏｓｅｐ管中で層状にした。８００ｘｇで１５分間、室温で遠心分離処理した後（ｗ／ｏの破壊）、リンパ球を含有するフラクションを集め、ＰＢＳで洗浄し、機能アッセイに直接使用するか、又は凍結媒体（１０％ ＤＭＳＯ、９０％ＦＣＳ）に１．０Ｅ＋０７細胞／ｍｌで再懸濁させ、液体窒素中で保存した。個々の双方向ＭＬＲ反応は、１：１刺激因子／応答因子比で、２人の異なるドナー由来のＰＢＭＣを混合し、異なる濃度範囲の精製された抗ＰＤ１モノクローナル抗体ＰＤ１－００５０、ＰＤ１－００６９、ＰＤ１－００７３、ＰＤ１－００７８、ＰＤ１－００９８、ＰＤ１－０１０２、ＰＤ１－０１０３存在下、又は非存在下、３７℃、５％ＣＯ２で６日間、平底９６ウェルプレート中、少なくとも２個ずつ、一緒に培養することによって設定された。参照抗ＰＤ１抗体として、ニボルマブ（ＭＤＸ－５Ｃ４又はＭＤＸ－１１０６としても知られる）又はペンブロリズマブ（ＭＫ－３４７５又はＯｒｇ １．０９Ａとしても知られる）のいずれかのＶＨドメインとＶＬドメインを含む抗体を合成し、ヒトＩｇＧ１の骨格と共にクローン化した（変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックス）を有する）。抗体なし、又はアイソタイプ制御抗体のいずれかを陰性コントロールとして使用し、ｒｅｃ ｈｕ ＩＬ－２（２０ＥＵ／ｍｌ）を要請コントロールとして使用した。６日後、サイトカイン測定のため、１００μｌの培地を各培養物から採取した。ＩＦＮ－γのレベルをＯｐｔＥＩＡ ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定した。
結果を表４に示す（ＩＦＮγ分泌／放出）。抗ＰＤ１モノクローナル抗体は、濃度に依存する様式で、Ｔ細胞の活性化とＩＦＮγ分泌を促進した。ＩＦＮγ分泌の増加率％の値を、任意のブロッキングｍＡｂ（基本的な同種異系刺激が誘発したＩＦＮγ値をＥ－ｃとして）のＭＬＲ非存在下での付加と、２０ＥＵ／ｍｌのｒｅｃ ｈｕ ＩＬ－２（陽性コントロール＝１００％ ＩＦＮｇ値をＥ＋ｃとして）を加えたＭＬＲのＩＦＮγ産生の関係で計算し、以下の式に従って計算した。相対刺激［％］＝（（実施例－Ｅ－ｃ）／（Ｅ＋ｃ－Ｅ－ｃ）＊１００
Figure 0006997212000026
いくつかのＰＤ１ブロッキング抗体ＰＤ１－００５０、ＰＤ１－００６９、ＰＤ１－００７３、ＰＤ１－００７８、ＰＤ１－００９８、ＰＤ１－０１０２、ＰＤ１－０１０３は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の分泌を向上させることによって、強い免疫調整活性を示した（データは、全ての抗体について示されていない）。
（３Ｂ）更なる実験では、キメラＰＤ１－０１０３（変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１アイソタイプ（ＫａｂａｔのＥＵインデックス））を評価した。ＰＤ１をキメラＰＤ１－０１０３を用いてブロックすると、同種刺激初代ヒトＴ細胞によるＩＦＮ－γ分泌を強く向上させる。キメラＰＤ１－０１０３は、参照抗ＰＤ１抗体よりも強力であった。比較のために、ニボルマブ（ＭＤＸ－５Ｃ４又はＭＤＸ－１１０６としても知られる）又はペンブロリズマブ（ＭＫ－３４７５又はＯｒｇ １．０９Ａとしても知られる）のいずれかのＶＨドメインとＶＬドメインを含む参照抗ＰＤ１抗体を合成し、ヒトＩｇＧ１の骨格と共にクローン化した（変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックス）を有する）ものを使用した。
（３Ｃ）更なる実験では、抗ＰＤ－１抗体ＰＤ１－０１０３（ヒト化抗体ＰＤ１－０１０３－０３１２、ＰＤ１－０１０３－０３１４、図２及び３、以下の実施例９も参照）のヒト化バリアントの免疫調整活性、（ａ）ＩＦＮγ放出（分泌）、（ｂ）ＴＮＦ－α放出（分泌）を、上に記載したＭＬＲで評価した。キメラＰＤ１－０１０３抗体及びそのヒト化態様の効果を、ニボルマブ（ＭＤＸ５Ｃ４又はＭＤＸ－１１０６としても知られる）及びペンブロリズマブ（ＭＫ－３４７５又はＯｒｇ １．０９Ａとしても知られる）のいずれかのＶＨドメイン及びＶＬドメインを含み、ヒトＩｇＧ１の骨格（変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックス））を有する参照抗ＰＤ１抗体と比較した。ＭＬＲ培養の６日後、５０μｌの上清を採取し、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｐｒｏ（商標）ヒトサイトカインＴｈ１／Ｔｈ２アッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を用い、複数のサイトカインを単一の培養物で測定した。（データは、全てのサイトカインについて示していない。）キメラＰＤ１－０１０３抗体及びそのヒト化態様（ＰＤ１－０１０３＿０３１２及びＰＤ１－０１０３＿０３１４）は、参照抗ＰＤ１抗体と比較して、Ｔ細胞活性化及びＩＦＮ－γ分泌の向上において、さらに強力であった。更に、キメラＰＤ１－０１０３抗体及びそのヒト化バリアントは、抗原提示細胞によって腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）及びＩＬ－１２分泌が増加し、単球／マクロファージ又は抗原提示細胞がＴ細胞を刺激する能力が向上した。
実施例４
同種異系成熟樹状細胞と共に培養されたヒトＣＤ４ Ｔ細胞によって分泌される細胞毒性グランザイムＢ放出及びＩＦＮ－γ分泌に対する抗ＰＤ－１ブロックの効果。
同種異系設定における抗ＰＤ－１処置の効果を更に観察するために、新しく精製したＣＤ４ Ｔ細胞を５日間、単球由来の同種異系成熟樹状細胞（ｍＤＣ）存在下、一緒に培養するアッセイを開発した。単球を、プラスチック接着し、その後、非接着細胞を除去する１週間前に、ＰＢＭＣから単離した。次いで、ＧＭ－ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ－４（１００ｎｇ／ｍｌ）を含有する培地中、単球由来の未成熟ＤＣを５日間培養することによって、未成熟ＤＣを単球から作成した。ｉＤＣ成熟を誘発するために、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－６（それぞれ５０ｎｇ／ｍｌ）を培地に更に２日間かけて加えた。次いで、フローサイトメトリー（ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によるＭａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｃｌａｓｓ ＩＩ（ＭＨＣＩＩ）、ＣＤ８０、ＣＤ８３及びＣＤ８６のその表面発現を測定することによって、ＤＣ成熟を評価した。
最小混合リンパ球反応（ｍＭＬＲ）の日に、ＣＤ４ Ｔ細胞を、マイクロビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって、無関係なドナーから得られた１０８ＰＢＭＣから濃縮した。培養前に、ＣＤ４ Ｔ細胞を、５μＭのカルボキシ－フルオレセイン－スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識した。次いで、１０５ＣＤ４ Ｔ細胞を、ブロッキング抗ＰＤ１抗体（ＰＤ１－０１０３、キメラＰＤ１－０１０３又はヒト化抗体ＰＤ１－０１０３－０３１２、ＰＤ１－０１０３－０３１３、ＰＤ１－０１０３－０３１４、ＰＤ１－０１０３－０３１５、０３１２、０３１３、０３１４、０３１５として省略されるもののいずれか）存在下又は非存在下、図に異なるように示されていない限り、１０μｇ／ｍｌの濃度で、成熟ａｌｌｏ－ＤＣ（５：１）と共に９６ウェルプレートに接種した。
５日後、細胞培養物上清みを集め、これを使用し、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ．）によってＩＦＮ－γレベルを測定した。Ｇｏｌｇｉ Ｐｌｕｇ（Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ）及びＧｏｌｇｉ Ｓｔｏｐ（Ｍｏｎｅｎｓｉｎ）存在下、細胞を３７℃で更に５時間放置した。次いで、細胞を染色し、その表面を、抗ヒトＣＤ４抗体及びＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ ｆｉｘａｂｌｅ ｄｙｅ Ａｑｕａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した後、Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍバッファー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で固定／透過処理した。細胞内染色は、グランザイムＢ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＩＦＮ－γ及びＩＬ－２（両方ともｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）について実施した。
全てのヒト化バリアントＰＤ１－０１０３（ヒト化抗体ＰＤ１－０１０３－０３１２、ＰＤ１－０１０３－０３１３、ＰＤ１－０１０３－０３１４、ＰＤ１－０１０３－０３１５、０３１２、０３１３、０３１４、０３１５と省略される）は、グランザイムＢ及びインターフェロンガンマを向上させる際に、等しく良好であることがわかった（データは示していない）。
実施例５
キメラＰＤ１抗体誘導体
キメラＰＤ１抗体を、抗ＰＤ１マウス抗体ＰＤ１－００９８、ＰＤ１－０１０３の可変重鎖及び軽鎖領域をＰＣＲによって増幅させ、これを重鎖発現ベクター内で、エフェクター機能を無効にし、変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックス））（ロイシン２３４からアラニン、ロイシン２３５からアラニン、プロリン３２９からグリシン）を有するヒトＩｇＧ１骨格／ヒトＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含み、ヒトＣ－κに対する融合タンパク質としての軽鎖発現ベクターを含む融合タンパク質としてクローン化することによって作成した。次いで、ＬＣ及びＨＣプラスミドをＨＥＫ２９３内で同時トランスフェクションし、抗体精製のための標準的な方法によって、上清から７日後に精製した。キメラＰＤ１－抗体は、キメラｃｈｉＰＤ１－００９８（ｃｈｉＰＤ１－００９８）及びキメラＰＤ１－０１０３（ｃｈｉＰＤ１－０１０３）と改名された。比較のために、ニボルマブ（ＭＤＸ－５Ｃ４又はＭＤＸ－１１０６としても知られる）又はペンブロリズマブ（ＭＫ－３４７５又はＯｒｇ １．０９Ａとしても知られる）のいずれかのＶＨドメインとＶＬドメインを含む参照抗ＰＤ１抗体を合成し、ヒトＩｇＧ１の骨格と共にクローン化した（変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックス）を有する）ものを使用した。
実施例６
抗ＰＤ１抗体 ＰＤ－０１０３のヒト化バリアント（ｈｕＭａｂ ＰＤ－０１０３）の作成、発現及び精製、特性決定
マウス抗ＰＤ１抗体０１０３のＶＨドメイン及びＶＬドメインのヒト化
マウス抗ＰＤ１抗体ＰＤ１－０１０３（配列番号７及び８）のマウスＶＨドメイン及びＶＬドメインのアミノ酸配列に基づき、ヒト化抗ＰＤ１抗体バリアントを作成した。
ヒト化ＶＨ－バリアントは、ヒト生殖細胞系列ＩＭＧＴ＿ｈＶＨ＿３＿２３を、いくつかの変異を有するヒトＪ－エレメント生殖細胞系列ＩＧＨＪ５－０１と組み合わせたものに基づいている。（配列番号９で得られる。）
ＶＬのヒト化バリアントは、ヒト生殖細胞系列ＩＭＧＴ＿ｈＶＫ＿４＿１、ＩＭＧＴ＿ｈＶＫ＿２＿３０、ＩＭＧＴ＿ｈＶＫ＿３＿１１及びＩＭＧＴ＿ｈＶＫ＿１＿３９を、ヒトＪ－エレメント生殖細胞系列ＩＧＫＪ１－０１と組み合わせたものに基づく。異なる変異によって、配列番号１０～配列番号１３のヒト化バリアントが得られた。
ＰＤ１－０１０３の重鎖及び軽鎖の可変領域のヒト化アミノ酸配列は、ＤＮＡに逆翻訳され、得られたｃＮＤＡを合成し（ＧｅｎＡｒｔ）、次いで、エフェクター機能を無効にするＬＡＬＡ及びＰＧ変異（ロイシン２３４からアラニン、ロイシン２３５からアラニン、プロリン３２９からグリシン）を有するヒトＩｇＧ１骨格／ヒトＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む融合タンパク質として、重鎖発現ベクター内でクローン化するか、又は軽鎖発現ベクター内で、ヒトＣ－κに対する融合タンパク質としてクローン化した。次いで、ＬＣ及びＨＣプラスミドをＨＥＫ２９３内で同時トランスフェクションし、抗体精製のための標準的な方法によって、上清から７日後に精製した。得られたヒト化ＰＤ１抗体は、以下のように名付けられる。
Figure 0006997212000027
ヒト化ＰＤ１－０１０３抗体バリアント及び親キメラＰＤ１－０１０３は、上述のように特性決定した。結果を表６に示す。
Figure 0006997212000028
ヒト化バリアントＰＤ－０１０３－０３１２は、以下、ａＰＤ１抗体クローンＰＤ１－０３７６と称される。
実施例７
抗ＬＡＧ３抗体の作成
ウサギの免疫付与
Ｒｏｃｈｅの専有品である、ヒト化抗体レパートリーを発現するトランスジェニックウサギを、ＬＡＧ３を発現するプラスミドＤＮＡを用いて免疫付与した。
１セットの３匹のウサギを、全長ヒトＬＡＧ３をコードするプラスミド発現ベクター（１５３５２＿ｐＩｎｔｒｏｎＡ＿ｆｌ－ｈＬａｇ３＿ＤＮＡ－ＩＭＳ）を用いて、４００ｕｇのベクターＤＮＡの皮内適用、その後、エレクトロポレーション（５スクエアパルスの７５０Ｖ／ｃｍ、持続時間１０ｍｓ、間隔１ｓ）によって、遺伝子的に免疫付与した。ウサギは、０、１４、２８、４９、７０、９８、１２６日目に、７回の連続免疫付与を受けた。血液（全血体積の概算値は１０％）を、３５、７７、１０５、１３３日目に採取した。血清を調製し、これをＥＬＩＳＡによるタイター決定に使用し（以下を参照）、末梢単核細胞を単離し、これを、以下のＢ細胞クローニングプロセスの抗原特異性Ｂ細胞の供給源として使用した。
血清タイターの決定（ＥＬＩＳＡ）
ヒト組換えＬＡＧ３タンパク質を、９６ウェルＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートで、２ｕｇ／ｍｌ、ＰＢＳ中、１００ｕｌ／ウェルで固定し、その後、ＰＢＳ中の２％ Ｃｒｏｔｅｉｎ Ｃ、２００ｕｌ／ウェルでプレートをブロックし、ＰＢＳ中の０．５％ Ｃｒｏｔｅｉｎ Ｃ、１００ｕｌ／ウェルで抗血清の段階希釈を２個ずつ適用し、検出した。検出は、（１）ＨＲＰ抱合されたロバ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ／Ｄｉａｎｏｖａ ７１１－０３６－１５２；１／１６０００）、又は（２）ＨＲＰ抱合されたウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ３１４２３；１／５０００）、又は（３）ビオチン化ヤギ抗ヒトκ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ／Ｂｉｏｚｏｌ ２０６３－０８、１／５０００）及びストレプトアビジン－ＨＲＰのいずれかを用い、それぞれ、ＰＢＳ中の０．５％ Ｃｒｏｔｅｉｎ Ｃ、１００ｕｌ／ウェルで希釈した。全ての工程について、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。全ての工程の間に、プレートを、ＰＢＳ中の０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で３回洗浄した。ＢＭ Ｂｌｕｅ ＰＯＤ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ可溶性（Ｒｏｃｈｅ）を１００ｕｌ／ウェルで加えることによって、シグナルを現像し、１Ｍ ＨＣｌ、１００ｕｌ／ウェルを加えることによって停止させた。吸光度を、リファレンスとしての６９０ｎｍに対し、４５０ｎｍで読み取った。タイターは、最大シグナルの半分値が得られる抗血清の希釈度であると定義された。
ウサギ末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離
免疫付与されたトランスジェニックウサギから血液サンプルを採取した。ＥＤＴＡを含有する全血を、１×ＰＢＳ（ＰＡＡ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、オーストリア）で２倍に希釈した後、製造業者の仕様に従って、哺乳動物リンパ球（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーリントン、オンタリオ、カナダ）を用い、密度遠心分離を行った。ＰＢＭＣを１×ＰＢＳで２回洗浄した。
ＥＬ－４ Ｂ５培地
１０％ ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、ＵＳＡ）、２ｍＭグルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（ＰＡＡ、パッシング、オーストリア）、２ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ、アイデンバッハ、ドイツ）及び０．０５ｍＭ ｂ－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ、ペイズリー、スコットランド）を追加したＲＰＭＩ １６４０（Ｐａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、アイデンバッハ、ドイツ）を使用した。
タンパク質抗原を用いたプレートのコーティング
滅菌細胞培養６－ウェルプレートを、炭酸バッファー（０．１Ｍ 炭酸水素ナトリウム、３４ｍＭ 炭酸水素二ナトリウム、ｐＨ９．５５）中、ヒトＦｃ部分に抱合されたヒトＬＡＧ３ ＥＣＤ（２μｇ／ｍｌ）で、４℃で一晩かけてコーティングし、使用前に、滅菌ＰＢＳでプレートを３回洗浄した。
細胞の疲弊
（ａ）ＣＨＯ細胞のコンフルエント単層で覆われた滅菌６－ウェルプレート（細胞培養グレード）を使用し、非特異的な接着及び非特異的な結合リンパ球によって、マクロファージ／単球を枯渇させた。
（ｂ）ブランク滅菌６－ウェルプレート（細胞培養グレード）を用い、マクロファージ、単球及び他の細胞を非特異的な接着によって枯渇させた。
ＰＢＭＣサンプルの半分を（ａ）に使用し、半分を（ｂ）に使用した。
各ウェルを、最大で４ｍｌの培地と、免疫付与したウサギ由来の６ｘ１０６ ＰＢＭＣとで満たし、インキュベータ中、３７℃で１時間かけて結合させた。上清中の細胞（末梢血リンパ球（ＰＢＬ））を抗原パニング工程に使用した。
ＬＡＧ３抗原上でのＢ細胞の濃縮。
タンパク質抗原：ＬＡＧ３－ＥＣＤ－ｈｕＦｃタンパク質でコーティングした６ウェル組織培養プレートを、ブランク６ウェルプレートを用いた疲弊工程からの培地４ｍｌあたり、６×１０６ＰＢＬまでを用いて接種し、インキュベータ中、３７℃で１時間結合させた。非接着細胞を、１×ＰＢＳでウェルを１～２回、注意深く洗浄することによって除去した。得られた粘着性細胞を、インキュベータ中、トリプシンによって３７℃で１０分間かけて脱離させた。ＥＬ－４ Ｂ５培地を用い、トリプシン化を止めた。免疫蛍光染色まで、細胞を氷上で保存した。
細胞表面抗原：ヒトＬＡＧ３－陽性ＣＨＯ細胞の単層で覆われた６ウェル組織培養プレートに、６×１０６までのＰＢＬを、ＣＨＯで覆われた６ウェルプレートを使用して、枯渇工程からの培地４ｍｌあたり接種し、インキュベータ中、３７℃で１時間結合させた。非接着細胞を、１×ＰＢＳでウェルを１～２回、注意深く洗浄することによって除去した。得られた粘着性細胞を、インキュベータ中、トリプシンによって３７℃で１０分間かけて脱離させた。ＥＬ－４ Ｂ５培地を用い、トリプシン化を止めた。免疫蛍光染色まで、細胞を氷上で保存した。
免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー
抗ＩｇＧ ＦＩＴＣ（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ、デュッセルドルフ、ドイツ）及び抗ｈｕＣｋ ＰＥ（Ｄｉａｎｏｖａ、ハンブルグ、ドイツ）抗体を、単一細胞選別に使用した。表面染色のために、枯渇及び濃縮工程からの細胞を、ＰＢＳ中、抗ＩｇＧ ＦＩＴＣ及び抗ｈｕＣｋ ＰＥ抗体と共にインキュベートし、４℃、暗状態で４５分間インキュベートした。染色した後、ＰＢＭＣを、氷冷したＰＢＳを用い、２倍量で洗浄した。最後に、ＰＢＭＣを氷冷したＰＢＳに再懸濁させ、すぐにＦＡＣＳ分析を行った。死んだ細胞と生きている細胞とを区別するためのＦＡＣＳ分析の前に、濃度５μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、サンディエゴ、ＣＡ、ＵＳＡ）を加えた。コンピュータ及びＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を取り付けたＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＡｒｉａを、単一細胞選別のために使用した。
Ｂ細胞培養
ウサギＢ細胞の培養は、Ｓｅｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｓ Ｓｅｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９（２）、ｅ８６１８４．２０１４、２月４日）によって記載される方法によって行われた。簡単に言うと、単一選別されたウサギＢ細胞を、９６ウェルプレート中、Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ細胞（１：１０００００）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｍｅｒｃｋ）、ダルムシュタット、ドイツ）、５％ウサギ胸腺細胞上清（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ、ベルンリート、ドイツ）及びγ照射されたマウスＥＬ－４ Ｂ５胸腺腫細胞（５×１０ｅ５細胞／ウェル）を含む２００μｌ／ウェルのＥＬ－４ Ｂ５培地と共に、インキュベータ中、３７℃で７日間インキュベートした。Ｂ細胞培養の上清をスクリーニングのために取り出し、残った細胞をすぐに集め、１００μｌのＲＬＴバッファー（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン、ドイツ）中、－８０℃で凍結させた。
ＬＡＧ３抗体のＶドメインの単離
ＶドメインのＰＣＲ増幅
全ＲＮＡを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ８／９６ ＲＮＡキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ；７４０７０９．４、７４０６９８）を用い、製造業者のプロトコルに従って、Ｂ細胞溶解物から調製した（ＲＬＴバッファー－Ｑｉａｇｅｎ－カタログ番号７９２１６に再懸濁させた）。ＲＮＡを、６０μｌのＲＮａｓｅを含まない水で溶出させた。６μｌのＲＮＡを使用し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ１８０８０－４００）及びオリゴｄＴプライマーを用い、製造業者の指示に従って、逆転写反応によってｃＤＮＡを作成した。全ての工程をＨａｍｉｌｔｏｎ ＭＬ Ｓｔａｒ Ｓｙｓｔｅｍで行った。４μｌのｃＤＮＡを使用し、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖可変領域（ＶＨ及びＶＬ）を、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ１２３４４－０４０）を用い、重鎖にはプライマーｒｂＨＣ．ｕｐ ａｎｄ ｒｂＨＣ．ｄｏ、軽鎖にはＢｃＰＣＲ＿ＦＨＬＣ＿ｌｅａｄｅｒ．ｆｗ ａｎｄ ＢｃＰＣＲ＿ｈｕＣｋａｐｐａ．ｒｅｖを用い、最終体積５０μｌで増幅させた（表７）。全ての順方向プライマーは、（それぞれＶＨ及びＶＬの）シグナルペプチドに特異的であり、一方、逆方向プライマーは、（それぞれＶＨ及びＶＬの）定常領域に特異的であった。ＲｂＶＨのＰＣＲ条件は、以下のとおりであった。９４℃で５分間で熱い状態で開始、９４℃で２０秒、７０℃で２０秒、６８℃で４５秒を３５サイクル、最後に６８℃で７分間伸長。ＨｕＶＬのＰＣＲ条件は、以下のとおりであった。９４℃で５分間で熱い状態で開始、９４℃で２０秒、５２℃で２０秒、６８℃で４５秒を４０サイクル、最後に６８℃で７分間伸長。
Figure 0006997212000029
８μｌの５０μｌ ＰＣＲ溶液を、４８Ｅ－Ｇｅｌ ２％（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｇ８００８－０２）に入れた。陽性ＰＣＲ反応を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔ ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ；７４０６０９２５０）を用い、製造業者のプロトコルを用いて洗浄し、５０μｌ溶出バッファーで溶出させた。全ての洗浄工程をＨａｍｉｌｔｏｎ ＭＬ Ｓｔａｒｌｅｔ Ｓｙｓｔｅｍで行った。
ウサギモノクローナル二価抗体の組換え発現
ウサギモノクローナル二価抗体の組換え発現のために、オーバーハング方法によって、ＶＨ又はＶＬをコードするＰＣＲ産物を、ｃＤＮＡとして発現ベクターへとクローン化した（ＲＳ Ｈａｕｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９２）１３、５１５－５１８；ＭＺ Ｌｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００７）４、２５１－２５６）。発現ベクターは、イントロンＡを含む５’ＣＭＶプロモーターと、３’ＢＧＨ ポリアデニル化配列とからなる発現カセットを含んでいた。発現カセットに加え、プラスミドは、ｐＵＣ１８由来の複製と、Ｅ．Ｃｏｌｉ中のプラスミド増幅について、アンピシリン耐性を与えるβ－ラクタマーゼ遺伝子を含んでいた。塩基性プラスミドの３つのバリアントを使用した。１つのプラスミドは、ＶＬ領域を受け入れるためのヒトκＬＣ定量領域を含みつつ、ＶＨ領域を受け入れるように設計されたウサギＩｇＧ定常領域を含んでいた。κ又はγ定常領域及びＶＬ／ＶＨ挿入物をコードする線形発現プラスミドは、重複するプラスミドを用い、ＰＣＲによって増幅された。精製されたＰＣＲ産物を、Ｔ４ ＤＮＡ－ポリメラーゼと共にインキュベートし、一本鎖オーバーハングを作成した。ｄＣＴＰ添加によって反応を止めた。
次の工程で、プラスミドと挿入物を合わせ、部位特異的な組換えを誘発するｒｅｃＡと共にインキュベートした。組換えプラスミドをＥ．Ｃｏｌｉ内で形質転換した。次の日、成長したコロニーを取り出し、プラスミド調製、制限分析及びＤＮＡシークエンシングによって、正しい組換えプラスミドについて試験した。
抗体発現のために、単離されたＨＣ及びＬＣプラスミドは、ＨＥＫ２９３細胞に一時的に同時トランスフェクトされ、上清を１週間後に集めた。
実施例８
抗ＬＡＧ３抗体の特性決定
Figure 0006997212000030
ヒトＬａｇ３のＥＬＩＳＡ
Ｎｕｎｃ ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ ４６４７１８）を、２５μｌ／ウェルの組換えヒトＬＡＧ－３ Ｆｃキメラタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、２３１９－Ｌ３）を用い、タンパク質濃度８００ｎｇ／ｍｌでコーティングし、４℃で一晩、又は室温で１時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、各ウェルを、９０μｌのブロッキングバッファー（ＰＢＳ＋２％ ＢＳＡ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）と共に、室温で１時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌの抗Ｌａｇ３サンプルを濃度１～９μｇ／ｍｌ（ＯＳＥＰバッファー中１：３希釈）で加え、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのヤギ抗ヒトＩｇ κ鎖抗ＨＲＰ抱合体（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、ＡＰ５０２Ｐ）を１：２０００希釈状態で加え、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ、番号１１８３５０３３００１）を加え、２～１０分間インキュベートした。測定をＴｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅ ２装置で、３７０／４９２ｎｍで行った。
細胞表面Ｌａｇ３結合ＥＬＩＳＡ
２５μｌ／ウェルのＬａｇ３細胞（Ｌａｇ３を発現する組換えＣＨＯ細胞、１００００細胞／ウェル）を、組織培養処理された３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３７０１）に接種し、３７℃で１日間又は２日間インキュベートした。培地を除去した次の日、２５μｌの抗Ｌａｇ３サンプル（ＯＳＥＰバッファー中１：３希釈、６～４０ｎＭの濃度で開始）を加え、４℃で２時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴ中で１ｘ９０μｌ）、３０μｌ／ウェルのグルタルアルデヒドを、最終濃度０．０５％（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｇ５８８２）に室温で１０分間添加することによって、細胞を固定した。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのヤギ抗ヒトＩｇ κ鎖抗ＨＲＰ抱合体（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、ＡＰ５０２Ｐ）を１：１０００希釈状態で加え、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ、番号１１８３５０３３００１）を加え、６～１０分間インキュベートした。測定をＴｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅ ２装置で、３７０／４９２ｎｍで行った。
抗ＬＡＧ３抗体のＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ）特性決定
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づくアッセイを使用し、二価フォーマット中の抗Ｌａｇ３抗体間の結合の速度論的パラメータを、又は一価Ｆａｂフラグメント及びヒトＦｃタグ化ヒトＬａｇ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）として、２５℃で決定した。
したがって、Ｃ１バイオセンサチップの２つのフローセルを、酢酸バッファー（ｐＨ４．５）中、２５μｇ／ｍｌまで希釈し、「固定化ウィザード」を使用して、ニュートラアビジンを固定することによってＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で調製した。これにより、約１９００ＲＵの固定化レベルが得られた。次いで、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ビオチン抗ＩｇＧ－Ｆｃ（ヒト）抱合体を、ランニングバッファー（ＨＢＳ－ＥＰ＋、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中の２０μｇ／ｍｌ希釈を用い、ニュートラアビジンに結合した。
この方法自体は、サイクルあたり、４つの命令からなっていた。第１の命令：約４６ＲＵのｈｕＬａｇ３－Ｆｃの捕捉（２０ｓ、１０μｌ／分）。第２の命令：１２０秒間サンプルを注入し、その後、流速３０μ／分で、１２００秒解離させる。第３及び第４の命令；グリシン－ＨＣｌ（ｐＨ１．５）を３０秒間注入することによって、再生。次いで、各抗体Ｆａｂフラグメントの希釈系列（３．１３ｎＭ～２００ｎＭ、ランニングバッファーでの２倍希釈）及び更なるブランクサイクルを、既に記載した方法を用いて測定した。次いで、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを利用し、捕捉レベルが完全には再現可能でないため、「ローカル」に設定されたＲｍａｘフィットパラメータ１：１のＬａｎｇｍｕｉｒフィッティングを適用することによって、速度値を得た。結果（ＫＤ値及びｋｄ値）を表８に示す。
エピトープマッピング
エピトープビニングを、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づくアッセイを用いて行った。従って、ａＬａｇ３バインダーは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置で、ｈｕＬａｇ３に結合した。次いで、既に生成しているａＬａｇ３バインダー－ｈｕＬａｇ３複合体に対する他のバインダーの接近可能性を評価した。
ＳＡ ＣＡＰキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、このアッセイを行った。特に記載されていない場合、アッセイは、ＳＡ ＣＡＰ Ｋｉｔマニュアルに従って行われた。この実行には、１サイクル型のみが含まれていた。ハイブリダイゼーション後、ビオチン化したｈｕＦｃタグ化ｈｕＬａｇ３の１０ｎＭの希釈によって、流速１０μｌ／分で２０秒間、センサチップにストレプトアビジンを結合させた。次いで、ランニングバッファーで希釈した第１の２００ｎＭのサンプルを、流速３０μｌ／分で１８０秒間注入し、直後に、第２のサンプルを同じ条件で注入した。次いで、表面を再生した。
次いで、サンプルを、同様の競争パターンを有する異なるエピトープ群に割り当てた。第１及び第２のサンプルとしてバインダーを注入したときに観察された最大値のすぐ上である閾値６．１ＲＵを用い、第２の注入の相対的な応答に基づき、第１の粗い分類を行なった。全ての値及び決定は、センサグラムの視覚観察によって、最終的に検証された。
結果を表８に示す。３つの主要なエピトープパターン（Ｅ１、Ｅ２及びＥ３）を同定した。ａＬａｇ３－０４１６及びヒト化ＢＡＰ ０５０は、同じ群を共有しているが、互いに完全に阻害することはなく、これらは、サブグループＥ２ｂ及びＥ２ｃに割り当てられた。
組換えｃｙｎｏ Ｌａｇ３陽性ＨＥＫ細胞に対するウサギ由来の抗Ｌａｇ３抗体の結合
表面でヒトＬａｇ３を組換え発現するＨＥＫ細胞を用いた結合分析に加え、カニクイザルＬａｇ３陽性ＨＥＫ細胞に対する結合も評価した。この実験のために、あらかじめｃｙｎｏ－ＬＡＧ－３で一時的にトランスフェクションされ、凍結させたＨＥＫ２９３Ｆ細胞を解凍し、遠心分離処理し、ＰＢＳ／２％ＦＢＳに再び懸濁させた。１．５ｘ１０５細胞／ウェルを９６ウェルプレートに接種した。抗Ｌａｇ３抗体を、最終的な正規化された濃度が１０μｇ／ｍｌになるように加えた。コントロールとして参照するために、自己蛍光及び陽性コントロール（Ｍｅｄａｒｅｘ ２５Ｆ７）及びアイソタイプコントロール（Ｓｉｇｍａ製ｈｕＩｇＧ１、カタログ番号Ｉ５１５４、データは示していない）抗体を調製し、この実験で測定した。ＨＥＫ細胞を、示した抗体と共に氷上で４５分間インキュベートし、２％ＦＢＳを含有する氷冷ＰＢＳバッファー２００μｌで２回洗浄した後、二次抗体（ＡＰＣ標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ－κ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＭＨ１０５１５）を加え（ＦＡＣＳ－Ｐｕｆｆｅｒ／ウェルで１：５０に希釈した）、更に、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を、再び、２００μｌの氷冷したＰＢＳ／２％ＦＢＳバッファーで２回洗浄した後、サンプルを、最終的に、１５０μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁させ、ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯ－ＩＩ ＨＴＳ Ｍｏｄｕｌｅで結合を測定した。
結果：以下の表に示すのは、ｃｙｎｏＬＡＧ３を発現するＨＥＫ２９３細胞に対する異なる抗Ｌａｇ３抗体の結合及び交差反応性、陽性細胞又はシグナル強度のＧｅｏＭｅａｎの％の単位で与えられる結合である。
Figure 0006997212000031
（活性化した）カニクイザルＰＢＭＣ／Ｌａｇ３を発現するＴ細胞に対するウサギ由来の抗Ｌａｇ３の結合
組換えＬａｇ３タンパク質及び哺乳動物細胞で組換え発現したＬａｇ３に対する結合の後、活性化されたカニクイザルＴ細胞で発現したＬａｇ３に対する結合も評価した。
カニクイザルＴ細胞又はＰＢＭＣの細胞表面で発現するＬａｇ３に対する、新しく作成した抗Ｌａｇ３抗体（Ｒｏｃｈｅのトランスジェニックウサギ由来）の結合特徴を、ＦＡＣＳ分析によって確認した。Ｌａｇ３は、ナイーブＴ細胞では発現しないが、活性化及び／又は疲弊したＴ細胞ではアップレギュレーションされる。従って、カニクイザル末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、新しいカニクイザル血液から調製し、次いで、ＣＤ３／ＣＤ２８前処理（１μｇ／ｍｌ）によって、２～３日間かけて活性化させた。その後、活性化した細胞を、Ｌａｇ３発現について分析した。簡単に言うと、１－３×１０５の活性化された細胞を、指定の抗体Ｌａｇ３抗体及びそれぞれのコントロール抗体を最終濃度１０μｇ／ｍｌで用い、氷上、３０～６０分間かけて染色した。結合した抗Ｌａｇ３抗体を、蛍光色素が抱合された抗ヒトＩｇＧ又は抗ウサギＩｇＧ二次抗体によって検出した。染色後、細胞をＰＢＳ／２％ＦＣＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ）で分析した。
結果：以下の表は、活性化したカニクイザルＰＢＭＣ中、Ｌａｇ３陽性細胞の割合をまとめたものである。
Figure 0006997212000032
活性化されたカニクイザルＴ細胞で、全てのウサギ抗Ｌａｇ３抗体は、Ｌａｇ３＋細胞に対して顕著な結合を示した。ここで、全ての新しく生成した抗体は、ヒト抗Ｌａｇ３参照抗体（例えば、ＭＤＸ２５Ｆ７、ＢＭＳ－９８６０１６）と比較して、陽性細胞の割合の増加を示した。
ヒトＡ３７５腫瘍細胞で発現するＭＨＣ－ＩＩに対するＬＡＧ－３結合の阻害（ＥＬＩＳＡによる）
２５μｌ／ウェルのＡ３７５細胞（１００００細胞／ウェル）を、組織培地で処理した３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３７０１）に接種し、３７℃で一晩インキュベートした。抗Ｌａｇ３抗体を、３μｇ／ｍｌの抗体濃度で出発して、１：３の希釈律で、細胞培地中、ビオチン化Ｌａｇ３（２５０ｎｇ／ｍｌ）を用い、１時間かけてプレインキュベートした。接種した細胞を含むウェルから培地を取り出した後、２５μｌの抗体Ｌａｇ３プレインキュベート混合物をウェルに移し、４℃で２時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴ中で１ｘ９０μｌ）、３０μｌ／ウェルのグルタルアルデヒドを、最終濃度０．０５％（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｇ５８８２）に室温で１０分間添加することによって、細胞を固定した。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのポリ－ＨＲＰ４０－ストレプトアビジン（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、６５Ｒ－Ｓ１０４ＰＨＲＰｘ）を１：２０００又は１：８０００希釈状態で添加し、シェーカー上で、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ、番号１１８３５０３３００１）を加え、２～１０分間インキュベートした。測定をＴｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅ ２装置で、３７０／４９２ｎｍで行った。
ヒトＡ３７５腫瘍細胞で発現するＭＨＣ－ＩＩに対するＬＡＧ－３結合の阻害（ＦＡＣＳ分析による）
アッセイ原理：抗Ｌａｇ３抗体のアンタゴニスト機能を調べるために、ＭＨＣＩＩ：Ｌａｇ３競争アッセイを行った。ＭＨＣＩＩ＋ヒトＡ３７５細胞を、抗Ｌａｇ３抗体と共にプレインキュベートしつつ、又はせずに、社内で作成したビオチン化Ｌａｇ３：Ｆｃ融合タンパク質を用いて染色した。この分析を、ＦＡＣＳ競争実験で試験した。Ａ３７５細胞（ＡＴＣＣ、番号ＣＲＬ－１６１９）を、ＥＢＳＳ（ＰＡＮ、カタログ番号Ｐ０４－００５０９）、１０％ ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１×ＮＥＡＡ及び１×ピルビン酸ナトリウムを追加したＥＭ Ｅａｇｌｅ培地中、２～３継代培養した。２５μｌ中、最終濃度が２０μｇ／ｍｌになるように（９６ウェルＵ字底プレート）、全ての抗体をＦＡＣＳバッファーで希釈した。２５μｌの社内で作成したビオチン化組換えＬＡＧ－３：Ｆｃ融合タンパク質を、最終濃度１０μｇ／ｍｌになるまで、培地に、又は抗Ｌａｇ３抗体又はコントロールに加え、室温で３０分間、プレインキュベートした。Ａ３７５細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中、３ｘ１０６細胞／ｍｌになるように調節した。９６ウェルＶ型底プレートに、ウェルあたり１００μｌを接種した。プレートを遠心分離処理し、上清を除去した。次いで、あらかじめインキュベートしたＬＡＧ－３：Ｆｃ融合タンパク質／抗体ミックス（５０μｌ／ウェル）をセルに加え、室温で１時間インキュベートした。この後、細胞を２００μｌのＦＡＣＳバッファーで洗浄した。細胞ＭＨＣＩＩに結合したビオチン化Ｌａｇ３：Ｆｃタンパク質を検出するために、ＡＰＣ抱合したヤギ抗ビオチン抗体を、３μｌ／サンプルで使用し（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９０－８５６）、更に１０～１５分間インキュベートした。染色後、細胞を再び洗浄し、次いで、１５０μｌ ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ／２％ ＦＢＳ）をＵ字底プレートに移し、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ－ＩＩで、ＨＴＳモジュールを用いて分析した。
２つの抗Ｌａｇ３抗体（クローン２５Ｆ７及び２６Ｈ１０；Ｍｅｄａｒｅｘ）は、陽性コントロールとして与えられ、ヒト ＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ５１５４）を適切なアイソタイプコントロールとして与えた。全ての抗体を１０μｇ／ｍｌの最終濃度で使用した。
結果：以下の表に示すのは、細胞上のＭＨＣ－ＩＩに対するＬａｇ３タンパク質結合の阻害率を示すＦＡＣＳ分析の結果である（ブロッキング抗体非存在下の最大値を参照しつつ、結合シグナルの減少として計算される）。
Figure 0006997212000033
これらのデータは、Ｌａｇ３との機能的相互作用と、全ての試験した抗体の細胞相互作用のブロックを裏付けている。
標準的なＬＡＧ３ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｂｉｏ／Ｒｅｐｏｒｔｅｒａｓｓａｙにおける新規な抗Ｌａｇ３抗体の中和能力。
ｉｎ ｖｉｔｒｏで、抑制されたＴ細胞応答を回復する際に、新規な抗Ｌａｇ３抗体の中和能力を調べるために、市販のレポーターシステムを使用した。このシステムは、Ｌａｇ３＋ＮＦＡＴ Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号ＣＳ１９４８０１）、ＭＨＣ－ＩＩ＋Ｒａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ、番号ＣＬＬ－８６）及び超抗原からなっていた。簡単に言うと、このレポーター系は、以下の３つの工程に基づく。（１）超抗原によって誘発されるＮＦＡＴ細胞の活性化、（２）ＭＨＣＩＩ（Ｒａｊｉ細胞）とＬａｇ３＋ＮＦＡＴ Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞との相互作用を阻害する活性化シグナルの阻害、（３）Ｌａｇ３アンタゴニスト／中和ａＶＨ－Ｆｃ融合構築物によるＮＦＡＴ活性化シグナルの回復。
この実験のために、Ｒａｊｉ及びＬａｇ－３＋Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－ｌｕｃ２エフェクターＴ細胞を、提供者によって記載されるように培養した。いくつかの抗Ｌａｇ３及び参照抗体の段階希釈（４０ｐｇ／ｍｌ～５０μｇ／ｍｌ）を、平らな白色底９６ウェル培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３９１７）中、アッセイ培地（ＲＰＭＩ １６４０（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号＃Ｐ０４－１８０４７）、１％ＦＣＳ）中で調製した。１×１０５Ｌａｇ３＋ＮＦＡＴ－Ｊｕｒｋａｔ細胞／ウェル）を抗体溶液に加えた。この工程の後で、２．５×１０４Ｒａｊｉ細胞／ウェルを、Ｊｕｒａｋｔ細胞／抗体ミックス及び５０ｎｇ／ｍｌの最終濃度のＳＥＤ超抗原（Ｔｏｘｉｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号ＤＴ３０３）に加えた。３７℃及び５％ＣＯ２で６時間インキュベートした後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ、番号Ｇ７９４０）を室温まで加温し、７５μｌをウェルあたり加え、５～１０分間インキュベートした後、製造業者の推奨に従って、Ｔｅｃａｎインフィニットリーダーで全体的な発光を測定した。
表に示されるのは、ＳＥＤ刺激の際の異なる抗Ｌａｇ３抗体によるＮＦＡＴルシフェラーゼシグナルＭＨＣＩＩ／Ｌａｇ３が介在する抑制の回復である（ＥＣ５０値として与えられる）。
Figure 0006997212000034
実施例９
抗ＬＡＧ３抗体の機能特性決定
表１３は、本明細書で記載する異なるアッセイで、異なる抗ＬＡＧ３抗体（単独、又は抗ＰＤ１抗体と組み合わせて）の生体活性及び効果をまとめている。
Figure 0006997212000035
同種異系成熟樹状細胞と共に培養されたヒトＣＤ４ Ｔ細胞によって分泌される細胞毒性グランザイムＢ放出及びＩＬ－２分泌に対するＰＤ－１及びＬＡＧ－３ブロックの効果。
抗ＬＡＧ－３ブロッキング抗体を、同種異系設定で抗ＰＤ－１と組み合わせてスクリーニングするために、新しく精製したＣＤ４ Ｔ細胞を、単球由来同種異系成熟樹状細胞（ｍＤＣ）と５日間、同時に培養するアッセイを開発した。単球を、プラスチック接着し、その後、非接着細胞を除去する１週間前に、ＰＢＭＣから単離した。次いで、ＧＭ－ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ－４（１００ｎｇ／ｍｌ）を含有する培地中、未成熟ＤＣを５日間培養することによって、未成熟ＤＣを単球から作成した。ｉＤＣ成熟を誘発するために、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－６（それぞれ５０ｎｇ／ｍｌ）を培地に更に２日間かけて加えた。次いで、フローサイトメトリー（ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によるＭａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｃｌａｓｓ ＩＩ（ＭＨＣＩＩ）、ＣＤ８０、ＣＤ８３及びＣＤ８６のその表面発現を測定することによって、ＤＣ成熟を評価した。
最小混合リンパ球反応（ｍＭＬＲ）の日に、ＣＤ４ Ｔ細胞を、マイクロビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって、無関係なドナーから得られた１０８ＰＢＭＣから濃縮した。培養前に、ＣＤ４ Ｔ細胞を、５μＭのカルボキシ－フルオレセイン－スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識した。次いで、１０５ＣＤ４ Ｔ細胞を、ブロッキング抗ＰＤ－１抗体ａＰＤ１（０３７６）（＝ＰＤ１－０１０３－０３１２、本明細書で上に記載したような、又はＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７３２４８に記載）のみ、又はキメラ抗ＬＡＧ－３抗体（ａＬＡＧ（０４１８）に対するａＬＡＧ３（０４０３））又は参照抗体（ヒト化ＢＡＰ０５０（ＬＡＧ５２５）及びＢＭＳ ９８６０１６）を濃度１０μｇ／ｍｌで組み合わせて、成熟ａｌｌｏ－ＤＣ（５：１）と共に９６ウェルプレートに接種した。ＤＰ４７は、ＦｃγＲによる認識を避けるためにＦｃ部分にＬＡＬＡ変異を有する非結合性ヒトＩｇＧであり、これを陰性コントロールとして使用した。
５日後、細胞培養上清を集め、これを使用し、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）によりＩＬ－２レベルを測定し、Ｇｏｌｇｉ Ｐｌｕｇ（Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ）及びＧｏｌｇｉ Ｓｔｏｐ（Ｍｏｎｅｎｓｉｎ）の存在下、細胞を３７℃で更に５時間放置した。次いで、細胞を染色し、その表面を、抗ヒトＣＤ４抗体及びＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ ｆｉｘａｂｌｅ ｄｙｅ Ａｑｕａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した後、Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍバッファー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で固定／透過処理した。細胞内染色は、Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＩＦＮ－γ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）について実施した。結果を図２Ａ及び２Ｂに示す。
Ｂ細胞リンパ芽球様細胞株（ＡＲＨ７７）と共に培養されたヒトＣＤ４ Ｔ細胞による細胞毒性グランザイムＢ放出に対する、ＰＤ－１とＬＡＧ－３のブロックの効果。
機能試験において、ＰＤ－１ブロックに対するＬＡＧ－３の拮抗作用の寄与をより良く特性決定するために、ＣＤ４ Ｔ細胞を、腫瘍細胞株ＡＲＨ７７、ｍＤＣよりもＰＤＬ－１の発現レベルが低いＢ細胞リンパ芽球様細胞株と共に一緒に培養した。実験設定及び読み取りの残りは、ｍＭＬＲから変化しないままであった。抗ＬＡＧ－３抗体（ａＬＡＧ３（０４１４）及びａＬＡＧ３（０４１６）、ｍＭＬＲにおいてＩＬ－２とグランザイムＢを一緒に分泌する能力に基づいて選択される）を、抗ＰＤ－１抗体と組み合わせると、図３に示されるように、参照抗ＬＡＧ－３抗体（（ヒト化ＢＡＰ０５０（ＬＡＧ５２５）及びＢＭＳ ９８６０１６））（Ｐ＜０．０５）及び抗ＰＤ－１のみ（Ｐ＜０．０１）よりも、ＣＤ４ Ｔ細胞によるグランザイムＢ分泌が、より有意に増加した。
照射された同種異系ＰＢＭＣと共に培養されたヒトＣＤ４ Ｔ細胞によるグランザイムＢのＴｒｅｇ抑制及びＩＦＮ－γ放出に対する、ＰＤ－１及びＬＡＧ－３ブロックの効果。
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）抑制アッセイに関与する機能的試験では、マイクロビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって、２つのサンプルに分けた同じドナー由来のＰＢＭＣ（１つはＣＤ４ Ｔ細胞に豊富に含まれており、他方はＴｒｅｇに豊富に含まれている）は、ＣＤ４＋ＣＤ２５高ＣＤ１２７低Ｔ細胞として定義される。２種類の集合を精製したら、ＣＤ４ Ｔ細胞を５μＭのカルボキシ－フルオレセイン－スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識し、一方、Ｔｒｅｇは、ＦＡＣＳで後で区別することができるように、５μＭの細胞－トレース－バイオレット（ＣＴＶ）で標識した。
次いで、ＣＤ４ Ｔ細胞（１０５）及びＴｒｅｇ（１０５）を９６ウェルプレート中、無関係なドナー由来の照射されたＣＤ４が枯渇したＰＢＭＣ（１０５）と共に、抗ＬＡＧ－３抗体（ａＬＡＧ３（０４１４）及びａＬＡＧ３（０４１６）又は参照抗ＬＡＧ－３抗体（ヒト化ＢＡＰ０５０（ＬＡＧ５２５）及びＢＭＳ ９８６０１６）存在下又は非存在下、濃度１０μｇ／ｍｌで抗ＰＤ－１抗体ａＰＤ１（０３７６）と組み合わせて、１：１の比率で一緒に培養した。ＴｒｅｇによるＣＤ４ Ｔ細胞エフェクター機能の抑制の大きさを概算するためのコントロールとして、ＣＤ４ Ｔ細胞（１０５）を、Ｔｒｅｇ非存在下、照射されたＰＢＭＣ（１０５）と共に培養した。
５日後、細胞培養上清を集め、これを後で使用し、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）によりＩＦＮ－γレベルを測定し、Ｇｏｌｇｉ Ｐｌｕｇ（Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ）及びＧｏｌｇｉ Ｓｔｏｐ（Ｍｏｎｅｎｓｉｎ）の存在下、細胞を３７℃で更に５時間放置した。次いで、細胞を染色し、その表面を、抗ヒトＣＤ４抗体及びＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ ｆｉｘａｂｌｅ ｄｙｅ Ａｑｕａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した後、Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍバッファー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で固定／透過処理した。細胞内染色は、Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＩＦＮ－γ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）について実施した。結果を図４Ａ及び４Ｂに示す。
抗ＬＡＧ－３抗体（ａＬＡＧ３（０４１４）及びａＬＡＧ３（０４１６）を、抗ＰＤ－１抗体ａＰＤ１（０３７６）（＝ＰＤ１－０１０３－０３１２、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７３２４８号から）と組み合わせると、抗ＰＤ－１のみ存在下（Ｐ＜０．０５）、又はチェックポイント阻害剤非存在下（Ｐ＜０．００１）、Ｔｃｏｎｖよりも有意に多い量のグランザイムＢの分泌によって示されるように、制御Ｔ細胞の密な制御からＴｃｏｎｖを守ることが誘発された。抗ＰＤ－１と組み合わせた参照抗ＬＡＧ－３抗体（ヒト化ＢＡＰ０５０（ＬＡＧ５２５）及びＢＭＳ ９８６０１６）は、Ｔｒｅｇ抑制からＴｃｏｎｖエフェクター機能を顕著に守らなかった。その差が、たった４人のドナーを用い、統計的有意性に達しなかったとはいえ、ＩＦＮ－γについて、同様の結果が得られた。
免疫原性黒色腫抗原ペプチドプールを用いて回収した後の黒色腫患者ＰＢＭＣ由来のＣＤ４ Ｔ細胞によるグランザイムＢ及びＩＦＮ－γ分泌に対するＰＤ－１及びＬＡＧ－３ブロックの効果。
黒色腫患者ＰＢＭＣが、検出可能な数の腫瘍抗原に特異的なＴ細胞を含むことは既に記載されている。したがって、ＰＯＣのために、免疫原性黒色腫に関連する抗原ペプチドプールを用いて一晩再刺激した黒色腫患者ＰＢＭＣに対して、抗ＬＡＧ－３抗体（０４１４）及び抗ＰＤ－１、又は抗ＰＤ－１単独を試験した。
飽和濃度（１０μｇ／ｍｌ）の抗ＰＤ－１のみ（０３７６）存在下又は非存在下、抗ＬＡＧ－３（ａＬＡＧ３（０４１４）＝（０４１４）、１０μｇ／ｍｌ）抗体と組み合わせて、室温でインキュベートした黒色腫患者由来の１０５～１０６ＰＢＭＣ。次いで、ＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ４、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１、ＮＹＥＳＯ－１、メラニン細胞タンパク質Ｐｍｅｌ １７ ｇｐ１００、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質２などの免疫原性腫瘍関連抗原のプールを用い、タンパク質輸送阻害剤Ｇｏｌｇｉ Ｐｌｕｇ（ブレフェルジンＡ）及びＧｏｌｇｉ Ｓｔｏｐ（モネンシン）存在下、Ｔ細胞を、一晩かけて再刺激した。
次いで、細胞を染色し、その表面を、抗ヒトＣＤ４抗体及びＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ ｆｉｘａｂｌｅ ｄｙｅ Ａｑｕａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した後、Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍバッファー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で固定／透過処理した。細胞内染色は、グランザイムＢ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＩＦＮ－γ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）について実施した。
抗ＬＡＧ－３と抗ＰＤ－１抗体の組み合わせ（Ｐ＜０．０１及びＰ＜０．００１）は、有意に（Ｐ＜０．０１及びＰ＜０．０００１）、腫瘍抗原特異的なＴ細胞エフェクター機能（すなわち、グランザイムＢ一部ＩＦＮ－γ分泌）を向上させた。一方、ＰＤ－１のみをブロックすると、なんら効果を示さなかった（データは示していない）。
実施例１０
二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体の作成及び製造
１０．１ １つの結合アームにＶＨ／ＶＬドメイン交換／置き換えを有し、ＣＨ１／ＣＬ界面に一本鎖の帯電したアミノ酸置換を有する、ＰＤ１及びＬＡＧ３に結合する二重特異性抗体（ＣｒｏｓｓＭＡｂＶｈ－ＶＬ）の製造及び発現
ヒトＰＤ１及びヒトＬＡＧ３に結合する多重特異性抗体は、従来の分子生物学技術による一般的な方法の章に記載されるように作成され、上述のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の２９３Ｆにおいて、一時的に発現した。多重特異性１＋１ＣｒｏｓｓＭＡｂＶｈ－Ｖｌ抗体も、ＷＯ ２００９／０８０２５２号に記載されている。多重特異性抗体は、表１４に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を含む発現プラスミドを用いて発現した。１＋１ＣｒｏｓｓＭＡｂＶｈ－Ｖｌ二重特異性抗体の模式的な構造を図１Ａに示す。
Figure 0006997212000036
全ての構築物について、ホールにノブを入れるヘテロ二量体化技術を、第１のＣＨ３ドメインにおける典型的なノブ（Ｔ３６６Ｗ）置換及び第２のＣＨ３ドメインにおける対応するホール置換（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４１０Ｖ）（及び２つの更なる導入されたシステイン残基Ｓ３５４Ｃ／Ｙ３４９’Ｃ）と共に使用した（上に記載するそれぞれの対応する重鎖（ＨＣ）配列に含まれる）。
１０．２ ＰＤ１及びＬＡＧ３に結合し、２つの結合アームにＣＨ１／Ｃｋドメイン交換／置き換え（２＋２ＣｒｏｓｓＭａｂＣＨ１／Ｃｋ）を有し、他方のＣＨ１／ＣＬ界面に帯電したアミノ酸置換を有する、多重特異性抗体の製造及び発現。
この例では、ヒトＰＤ１及びヒトＴＩＭ３に結合する多重特異性抗体は、従来の分子生物学技術による一般的な方法の章に記載されるように作成され、上述のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の２９３Ｆにおいて、一時的に発現した。多重特異性２＋２ＣｒｏｓｓＭＡｂＣＨ１／Ｃｋ抗体は、ＷＯ ２０１０／１４５７９２号にも記載される。多重特異性抗体は、表１５に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を含む発現プラスミドを用いて発現した。２＋２ＣｒｏｓｓＭＡｂＣＨ１／Ｃｋ二重特異性抗体の模式的な構造を図１Ａに示す。
Figure 0006997212000037
１０．３ ＰＤ１及びＬＡＧ３に結合し、１つの結合アームにＣＨ１／Ｃｋドメイン交換／置き換え（２＋１ＣｒｏｓｓＭａｂＣＨ１／Ｃｋ）を有し（Ｆｃノブ重鎖のＣ末端に融合したＰＤ１ ｃｒｏｓｓＦａｂ）、他方のＣＨ１／ＣＬ界面に帯電したアミノ酸置換を有する、多重特異性抗体の製造及び発現。
この例では、ヒトＰＤ１及びヒトＴＩＭ３に結合する多重特異性抗体は、従来の分子生物学技術による一般的な方法の章に記載されるように作成され、上述のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の２９３Ｆにおいて、一時的に発現した。多重特異性２＋１ＣｒｏｓｓＭＡｂＣＨ１／Ｃｋ抗体は、ＷＯ２０１３／０２６８３１号にも記載される。多重特異性抗体は、表１６に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を含む発現プラスミドを用いて発現した。２＋１ＣｒｏｓｓＭＡｂＣＨ１／Ｃｋ二重特異性抗体の模式的な構造を図１Ｂに示す。
Figure 0006997212000038
又は、Ｆｃノブ重鎖のＣ末端に融合したＰＤ１ ｃｒｏｓｓＦａｂが、一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）によって置き換わっていてもよい。このようなｓｃＦａｂを含む多重特異性２＋１抗体は、ＷＯ２０１０／１３６１７２号にも記載されており、表１７に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を含む発現プラスミドを用いて発現した。Ｆｃノブ重鎖のＣ末端に融合したｓｃＦａｂを有する２＋１二重特異性抗体の模式的な構造を図１Ｃに示す。
Figure 0006997212000039
１０．４ ＰＤ１及びＬＡＧ３に結合し、重鎖のＣ末端にそれぞれ融合したＶＨ／ＶＬを有する、多重特異性抗体（２＋１ＰＲＩＴフォーマット）の製造及び発現。
この例では、ヒトＰＤ１及びヒトＴＩＭ３に結合する多重特異性抗体は、従来の分子生物学技術による一般的な方法の章に記載されるように作成され、上述のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の２９３Ｆにおいて、一時的に発現した。この種の多重特異性２＋１抗体は、ＷＯ ２０１０／１１５５８９号にも記載されている。多重特異性抗体は、表１８に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を含む発現プラスミドを用いて発現した。２＋１ ＰＲＩＴ型二重特異性抗体の模式的な構造を図１Ｄに示す。
Figure 0006997212000040
１０．５ ＰＤ１及びＬＡＧ３に結合し、ＶＨ／ＶＬドメイン交換／置き換え（１＋１ＣｒｏｓｓＭａｂＶＨ／ＶＬｔｒａｎｓフォーマット）を１つの結合アームに有し、帯電したアミノ酸置換をＦｃホール重鎖のＣ末端に融合するＬＡＧ３ ＦａｂのＣＨ１／ＣＬ界面に有する、多重特異性抗体の製造及び発現。
ヒトＰＤ１及びヒトＬＡＧ３の両方に結合する多重特異性抗体が製造され、ＬＡＧ３ Ｆａｂは、重鎖の１つ、好ましくは、Ｆｃホール重鎖のＣ末端に、その可変重鎖ドメインを介して融合する。この分子は、従来の分子生物学技術による一般的な方法の章に記載されるように作成され、上述のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の２９３Ｆにおいて、一時的に発現した。多重特異性抗体は、表１９に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を含む発現プラスミドを用いて発現した。１＋１ＣｒｏｓｓＭＡｂＶＨ／ＶＬｔｒａｎｓ型二重特異性抗体の模式的な構造を図１Ｈに示す。
Figure 0006997212000041
１０．６ ＰＤ１及びＬＡＧ３に結合し、ＶＨ／ＶＬドメイン交換／置き換え（２＋１ＣｒｏｓｓＭａｂＶＨ／ＶＬｔｒａｎｓフォーマット）を１つの結合アームに有し、帯電したアミノ酸置換を２つのＬＡＧ３ ＦａｂのＣＨ１／ＣＬ界面に有し、その１つが、Ｆｃホール重鎖のＣ末端に融合する、多重特異性抗体の製造及び発現。
ヒトＰＤ１に一価で結合し、ヒトＬＡＧ３に二価で結合する多重特異性抗体が製造され、ＬＡＧ３ Ｆａｂは、重鎖の１つ、好ましくは、Ｆｃホール重鎖のＣ末端に、その可変重鎖ドメインを介して融合する。この分子は、従来の分子生物学技術による一般的な方法の章に記載されるように作成され、上述のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の２９３Ｆにおいて、一時的に発現した。多重特異性抗体は、表２０に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を含む発現プラスミドを用いて発現した。２＋１ＣｒｏｓｓＭＡｂＶＨ／ＶＬｔｒａｎｓ型二重特異性抗体の模式的な構造を図１Ｉに示す。
Figure 0006997212000042
１０．７ ＰＤ１及びＴＩＭ３に結合する多重特異性抗体の精製及び特性決定
上のように発現した多重特異性抗体を、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせによって、上清から精製した。全ての多重特異性抗体は、良好な収率で製造することができ、安定である。得られた生成物を、質量分析法によって属性について特性決定し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって純度、モノマー含有量及び安定性などの分析特性を特性決定した。
質量分析法
予想される一次構造を、脱グリコシル化したインタクトなＣｒｏｓｓＭａｂｓ及び脱グリコシル化した／消化したプラスミン、又は脱グリコシル化した／制限されたＬｙｓＣ消化したＣｒｏｓｓＭａｂのエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ－ＭＳ）によって分析した。
ＣＨ１／Ｃｋ ＣｒｏｓｓＭａｂｓを、リン酸バッファー又はＴｒｉｓバッファー中、タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌで、３７℃で１７時間までの時間、Ｎ－グリコシダーゼＦを用いて脱グリコシル化した。プラスミン又は制限されたＬｙｓＣ（Ｒｏｃｈｅ）消化を、１００μｇの脱グリコシル化したＣＨ１／Ｃｋ ＣｒｏｓｓＭａｂを用い、Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８）中、それぞれ、室温で１２０時間、また、３７℃で４０分間行った。質量分析の前に、サンプルを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのＨＰＬＣによって脱塩した。合計質量は、ＴｒｉＶｅｒｓａ ＮａｎｏＭａｔｅ ｓｏｕｒｃｅ（Ａｄｖｉｏｎ）が取り付けられたｍａＸｉｓ ４Ｇ ＵＨＲ－ＱＴＯＦ ＭＳシステム（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ）でのＥＳＩ－ＭＳによって決定された。
多重特異性抗体の安定性
抗体構築物の安定性を評価するために、熱安定性及び凝集開始温度を、以下の手順に従って評価する。指定の抗体のサンプルを、濃度１ｍｇ／ｍＬで、２０ｍＭのヒスチジン／塩化ヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中で調製し、１０μＬのマイクロキュベットアレイに移し、サンプルを０．１℃／分の速度で２５℃から９０℃まで加熱しつつ、２６６ｎｍレーザで励起させたときの静的光散乱データ及び蛍光データを、Ｏｐｔｉｍ１０００装置（Ａｖａｃｔａ Ｉｎｃ．）で記録した。
凝集開始温度（Ｔａｇｇ）は、散乱光強度が増加し始める温度であると定義される。融点（Ｔｍ）は、蛍光強度対波長のグラフの変曲点として定義される。
実施例１１
二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体の特性決定
１１．１ 結合Ｅｌｉｓａ
ｈｕ ＰＤ１のＥＬＩＳＡ
Ｎｕｎｃ ｍａｘｉｓｏｒｐストレプトアビジンでコーティングしたプレート（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ番号１１９７４９９８００１）を、２５μｌ／ウェルのビオチン化ＰＤ１－ＥＣＤ－ＡｖｉＨｉｓで、濃度５００ｎｇ／ｍｌでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌの抗ＰＤ１抗体サンプルを、濃度を増加させつつ加え、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのヤギ－抗ヒトＨ＋Ｌ－ＰＯＤ（ＪＩＲ，ＪＩＲ１０９－０３６－０９８）を、１：５０００希釈状態で添加し、シェーカー上で、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ、１１８３５０３３００１）を加え、ＯＤ２－３になるまでインキュベートした。測定を３７０／４９２ｎｍで行った。
ヒトＰＤ１の細胞ＥＬＩＳＡ
接着性ＣＨＯ－Ｋ１細胞株は、全長ヒトＰＤ１をコードするプラスミド１５３１１＿ｈＰＤ１－ｆｌ＿ｐＵＣ＿Ｎｅｏを用いて安定にトランスフェクションされ、Ｇ４１８を用いた選択（プラスミドでのネオマイシン耐性マーカー）を、３８４ウェル平底プレート中、濃度０．０１ｘ１０Ｅ６細胞／ウェルで接種し、一晩成長させた。
次の日、２５μｌ／ウェルのＰＤ１サンプル又はヒト抗ＰＤ１（Ｒｏｃｈｅ）／マウス抗ＰＤ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号：３２９９１２）参照抗体を加え、４℃で２時間インキュベートした（インターナリゼーションを避けるため）。注意深く洗浄した後（１ｘ９０μｌ／ウェル ＰＢＳＴ）、３０μｌ／ウェルの０．０５％グルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ５８８２、２５％）を１ｘＰＢＳバッファーに希釈したものを加えることによってセルを固定し、ＲＴで１０分間インキュベートした。洗浄した後（３ｘ９０μｌ／ウェル ＰＢＳＴ）、２５μｌ／ウェルの二次抗体ヤギ－抗ヒトＨ＋Ｌ－ＰＯＤ（ＪＩＲ、ＪＩＲ１０９－０３６－０８８）／ヒツジ－抗マウス－ＰＯＤ（ＧＥ ＮＡ９３１０）を検出のために加え、その後、シェーカー上で、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄した後（３ｘ９０μｌ／ウェル ＰＢＳＴ）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質溶液（Ｒｏｃｈｅ １１８３５０３３００１）を加え、ＯＤ１．０－２．０になるまでインキュベートした。プレートを３７０／４９２ｎｍで測定した。
細胞ＥＬＩＳＡの結果は、以下の表２１に、「ＥＣ５０ＣＨＯ－ＰＤ１」値［ｎＭ］として列挙している。
ヒトＬａｇ３のＥＬＩＳＡ
Ｎｕｎｃ ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ ４６４７１８）を、２５μｌ／ウェルの組換えヒトＬＡＧ－３ Ｆｃキメラタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、２３１９－Ｌ３）を用い、タンパク質濃度８００ｎｇ／ｍｌでコーティングし、４℃で一晩、又は室温で１時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、各ウェルを、９０μｌのブロッキングバッファー（ＰＢＳ＋２％ ＢＳＡ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）と共に、室温で１時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌの抗Ｌａｇ３サンプルを濃度１～９μｇ／ｍｌ（ＯＳＥＰバッファー中１：３希釈）で加え、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのヤギ抗ヒトＩｇ κ鎖抗ＨＲＰ抱合体（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、ＡＰ５０２Ｐ）を１：２０００希釈状態で加え、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ、番号１１８３５０３３００１）を加え、２～１０分間インキュベートした。測定をＴｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅ ２装置で、３７０／４９２ｎｍで行った。
細胞表面Ｌａｇ３結合ＥＬＩＳＡ
２５μｌ／ウェルのＬａｇ３細胞（Ｌａｇ３を発現する組換えＣＨＯ細胞、１００００細胞／ウェル）を、組織培養処理された３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３７０１）に接種し、３７℃で１日間又は２日間インキュベートした。培地を除去した次の日、２５μｌの抗Ｌａｇ３サンプル（ＯＳＥＰバッファー中１：３希釈、６～４０ｎＭの濃度で開始）を加え、４℃で２時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴ中で１ｘ９０μｌ）、３０μｌ／ウェルのグルタルアルデヒドを、最終濃度０．０５％（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｇ５８８２）に室温で１０分間添加することによって、細胞を固定した。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのヤギ抗ヒトＩｇ κ鎖抗ＨＲＰ抱合体（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、ＡＰ５０２Ｐ）を１：１０００希釈状態で加え、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ、番号１１８３５０３３００１）を加え、６～１０分間インキュベートした。測定をＴｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅ ２装置で、３７０／４９２ｎｍで行った。細胞ＥＬＩＳＡの結果は、以下の表２１に、「ＥＣ５０ＣＨＯ－ＬＡＧ３」値［ｎＭ］として列挙している。
ヒトＡ３７５腫瘍細胞で発現するＭＨＣ－ＩＩに対するＬＡＧ－３結合の阻害（ＥＬＩＳＡによる）
２５μｌ／ウェルのＡ３７５細胞（１００００細胞／ウェル）を、組織培地で処理した３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３７０１）に接種し、３７℃で一晩インキュベートした。抗Ｌａｇ３抗体を、３μｇ／ｍｌの抗体濃度で出発して、１：３の希釈律で、細胞培地中、ビオチン化Ｌａｇ３（２５０ｎｇ／ｍｌ）を用い、１時間かけてプレインキュベートした。接種した細胞を含むウェルから培地を取り出した後、２５μｌの抗体Ｌａｇ３プレインキュベート混合物をウェルに移し、４℃で２時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴ中で１ｘ９０μｌ）、３０μｌ／ウェルのグルタルアルデヒドを、最終濃度０．０５％（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｇ５８８２）に室温で１０分間添加することによって、細胞を固定した。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのポリ－ＨＲＰ４０－ストレプトアビジン（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、６５Ｒ－Ｓ１０４ＰＨＲＰｘ）を１：２０００又は１：８０００希釈状態で添加し、シェーカー上で、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴバッファーを用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ、１１８３５０３３００１）を加え、２～１０分間インキュベートした。測定をＴｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅ ２装置で、３７０／４９２ｎｍで行った。阻害ＥＬＩＳＡの結果は、以下の表２１に、「ＩＣ５０ＭＨＣＩＩ／ＥＬＩＳＡ」値［ｎＭ］として列挙している。
Figure 0006997212000043
１１．２ 結合Ｂｉａｃｏｒｅ
ＰＤ１及びＬＡＧ３に結合する多重特異性抗体の抗原結合特性
多重特異性抗体のそれぞれの標的抗原（すなわち、ＰＤ１及びＴＩＭ３）に対する結合をＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）によって評価した。
ＰＤ１結合は、以下の手順に従って評価することができる。
抗ヒト Ｆｃ ＩｇＧは、アミンカップリングによって、（Ｂｉａｃｏｒｅ）ＣＭ５センサチップの表面に固定された。次いで、サンプルを捕捉し、ｈｕ ＰＤ１－ＥＣＤをサンプルに結合させた。各分析サイクルの後、センサチップ表面を再生した。平衡定数及び動的速度定数は、このデータを１：１ラングミュアー相互作用モデルにフィッティングすることによって、最終的に得た。
約１０，０００応答単位（ＲＵ）の２０μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ 番号ＢＲ－１００８－３９）を、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって供給されるアミンカップリングキットを用い、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００中のＣＭ５ センサチップの全てのフローセルに連結した。サンプル及びランニングバッファーは、ＨＢＳ－ＥＰ＋（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）であった。フローセル温度を２５℃に設定し、サンプルコンパートメント温度を１２℃に設定した。このシステムを、ランニングバッファーを用いて準備した。
異なるサンプルを濃度１０ｎＭで１５秒間注入し、フローセル２、３及び４に連続して結合させた。次いで、ヒトＰＤ１－ＥＣＤ濃度の完全なセット（３００ｎＭ、１００ｎＭ、２×３３．３ｎＭ、１１．１ｎＭ、３．７ｎＭ、１．２ｎＭ及び２×０ｎＭ）を、各サンプルに３００秒間注入し、その後、１０／６００秒の解離時間と、３Ｍ ＭｇＣｌ２を用いた２つの３０秒の再生工程を行い、その中で、最後の１つは、ランニングバッファーを含む「注入後の余分の洗浄」を含んでいた。最後に、二重リファレンスを使用したデータを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用い、１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ相互作用モデルにフィッティングした。
ＬＡＧ３結合は、以下の手順に従って評価した。
ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって提供されるＢｉａｃｏｒｅ ＳＡ ＣＡＰ Ｋｉｔを使用し、このアッセイを行った。速度値を、ＨＢＳ－ＥＰ＋（Ｇｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）バッファー中、２５℃で得た。
ＳＡ ＣＡＰ Ｃｈｉｐを、ＣＡＰ Ｋｉｔのマニュアルに示されているとおり、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００に取り付けた。この実行方法は、４つの命令を含んでいる。第１に、ＣＡＰ試薬を１０μｌ／分の流速で３００秒間注入し、「一般的な」命令を用い、固定された一本鎖ＤＮＡをハイブリダイズした。この命令は、その後に、ランニングバッファー中の１μｇ／ｍｌのビオチン化Ｆｃタグ化ヒトＬａｇ３細胞外ドメインの希釈の１５秒の長さの注入がある。この結果、捕捉レベルは約５０ＲＵである。シングルサイクル命令を使用し、５種類の異なるサンプル濃度（１００ｎＭ～６．２５ｎＭ、２倍希釈）を注入し、その後、１２００秒の長さの解離段階を行った。次いで、チップを、ＳＡ ＣＡＰ Ｋｉｔマニュアルに記載されるように再生した。
最後に、得られた曲線を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．０を用いて評価した。
結果：この相互作用は、１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルにはフィッティングしなかった。０７９９及び０９２７以外の全てのサンプルが、２つのＬａｇ３結合部分を有し、そのため、親和性を示すからである。０７９９及び０９２７は、小さな誤って対形成した二価サンプル集合を含んでおり、これらはある程度の親和性も示した。
したがって、センサグラムは、そのオフレートのみに従ってランク分けされた。これは、単一サイクルの速度曲線の視覚的な比較によって行われた。これを行うことによって、０４１６－Ｌａｇ３ ＥＣＤ複合体は、このサンプルセット中の他のものよりも安定であることが示された。一価＜Ｌａｇ３＞Ｃｒｏｓｓｍａｂフォーマット（０７９９）も、この実験の他のサンプルよりも遅いオフレートを示す。
更に、この実験で観察したものの中で、アフィンＬａｇ３－０４１４／Ｌａｇ３－０９２７－Ｌａｇ３ ＥＣＤ複合体が、これらの中で最も弱いことがわかった。０４１４及び０４１６のアフィン結合部分は、これらの一価ＣｒｏｓｓＭａｂの相手方である０９２７及び０７９９のアフィン部分におおよそ匹敵している。結果を表２２に示す。
Figure 0006997212000044
形質変換体の親和性評価を、１＋１二重特異性抗体０９２７及び０７９９と比較した。
二重特異性分子（サンプル）及びその個々の標的と、ＰＤ１とＬＡＧ３の組み合わせ（検体）との解離定数を決定し、同時に全ての価数を有する結合によって与えられる親和性の増加を評価した。
Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋでの測定の前に、ＣＭ５センサチップを、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって与えられる標準的なアミンカップリングキットを用いて調製した。サンプルのＦｃ部分における特異的な変異（すなわち、ＰＧＬＡＬＡ変異を保有するＦｃ部分）に対して指向する社内で製造した抗体は、ここでは、抗ＰＧＬＡＬＡ抗体と呼ばれ（このような抗体は、ＷＯ ２０１７／０７２２１０号に記載される）は、酢酸バッファー（ｐＨ５．０）中、濃度５０μｇ／ｍｌになるまで希釈した。これを全てのフローセル及びチャンネルに流速８μｌ／分で１２００秒かけて連結し、約１９０００ＲＵの結合応答を得た。
ＨＢＳ－ＥＰ＋バッファー（ＧＥ ＨＣ）を、センサチップ調製及び主要な実施のランニングバッファーとして使用した。１７秒の長さのサンプル注入、その後、１０ｍＭのＮａＯＨ溶液を利用する再生工程からなるスタートアップ後、分析を開始した。第１の工程において、異なるサンプルを、流速１０μｌ／分で１７秒間注入することによって、センサチップ表面にある個々のチャンネルのフローセル２上の抗ＰＧＬＡＬＡ抗体によって捕捉した。第２に、３種類の検体の１つ（ＰＤ１、ＬＡＧ３－Ｆｃ、２＋２ ＰＤ１／ＬＡＧ３－Ｆｃ融合物）を、両方のフローセルに流速５０μｌ／分で２００秒間注入し、その後、１０００秒の長さ（ＬＡＧ３－Ｆｃの場合には６００秒）の解離段階を行った。最後に、抗ＰＧＬＡＬＡ抗体／サンプル複合体は、１０ｍＭのＮａＯＨの２回の連続した注入（長さ３０秒間）によって溶解した。それぞれの個々の速度決定因子は、異なる検体濃度を用いた４サイクルからなっていた（０ｎＭ、５ｎＭ、２５ｎＭ及び１００ｎＭ）。
得られたデータを、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて評価した。１：１解離フィッティングを適用し、得られたｋｄ値を、分単位で複合体の半減期に変換した。ＰＤ１／Ｌａｇ３－Ｆｃ融合抗原結合分子とその主な個々の寄与因子（ＰＤ１又はＬａｇ３のいずれか）の親和性結合間の差が計算され、多価二重特異性抗体による安定性の増加を記述する３つのカテゴリーの１つに選別された（表２３）。
Figure 0006997212000045
１１．３ 二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体の同時係合の後の細胞ＰＤ１及びＬＡＧ３の二量体化。
二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体を、実施例１０に記載したように、種々のフォーマットで作成した。２種類の異なる受容体の二量体化又は最後の結合／相互作用を示すために、この細胞アッセイを使用し、これらの受容体は、両標的に対して二重特異性抗体を用いて切断するか、又は架橋する際に、酵素の２つのフラグメントと細胞質融合する。ここで、唯一１つの受容体のみが、酵素活性を示さない。この特異的な相互作用について、両受容体の細胞質ゾルＣ末端は、個々に、レポーター酵素の異種サブユニットに融合する。１つの酵素サブユニットのみがレポーター活性を示さなかった。しかし、両受容体に対する抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体の同時結合は、両受容体の局所的な細胞蓄積、２種類の異種酵素サブユニットの相補性を引き起こし、最終的に、基質を加水分解し、それによって、化学発光シグナルを生成する特異的で機能的な酵素が生成すると予想される。
二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体の架橋効果を分析するために、１０，０００ ＰＤ１＋ＬＡＧ３＋ヒトＵ２ＯＳ細胞／ウェルを、白い平底９６ウェルプレート（ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３９１７番）に接種し、アッセイ培地中、一晩培養した。次の日に、細胞培地を捨て、新しい培地と交換した。抗体又はリガンド希釈物を調製し、滴定量の指定の（二重特異性）抗体を加え、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、基質／バッファーミックス（例えば、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒＦｌａｓｈ検出試薬）を加え、再び１時間インキュベートした。同時結合及び二量体化の際に誘発される化学発光を測定するために、Ｔｅｃａｎインフィニットリーダーを使用した。
結果を図５Ａ及び５Ｂに示す。抗体濃度に対し、化学発光（ＲＵで測定）がプロットされる。単一特異性（二価）抗ＬＡＧ３抗体は、化学発光シグナルを誘発することはできなかったが、一方、全ての二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体は、濃度に依存する様式で、化学発光シグナルを誘発した。
同時結合（及び発光シグナルの誘発）の特異性を示すために、競争実験を行った。既に示したように、二重特異性抗体（１２５２）を用いた処置は、用量に依存する様式で発光シグナルを誘発した（図５Ｃ）。同じ二重特異性抗体が、ａＬＡＧ３抗体（０１５６、ＭＤＸ２５Ｆ７）又は抗ＰＤ１抗体（０３７６）のいずれかの存在下で与えられる場合、シグナルは、ほとんど阻害された（ＰＤ１競争の場合）か、又は少なくとも顕著に低下した（ＬＡＧ３）。両方の親抗体は、二重特異性抗体（１２５２、２＋１ ＬＡＧ３／ＰＤ１－フォーマット）に含まれるのと同じバインダーである。競争する抗体は、それぞれ２０μｇ／ｍｌの一定濃度で与えられた。
更なる実験の結果を図５Ｄに示す。以前の競争実験と同様に、親ａＬＡＧ３（０１５６）又はＰＤ１抗体（０３７６、それぞれ、１０μｇ／ｍｌで一定）を用いたインキュベートは、発光シグナルによって測定される場合、ＰＤ１ Ｌａｇ３二重発現細胞に対する二重特異性抗体（１２５２、二重特異性ａＬＡＧ３－０１５６及びＰＤ１－０３７６の２＋１フォーマット）の結合特性に影響を与えた。抗ＰＤ１抗体（０３７６）と、また、組換えＬＡＧ３：Ｆｃタンパク質（０１６０）との競争は、シグナルをほとんど無効化し、一方、単一のａＬＡＧ３バインダー（０１５６）のみが存在すると、部分的な阻害のみが起こる。２つの更なる抗ＬＡＧ３抗体０４１４及び０４１６は、０１５６以外の異なるエピトープに結合しており、これらはシグナルを有意に調整しなかったため、ａＬＡＧ３バインダーを含む二重特異性抗体（０１５６）との結合と競争しなかった。
更なる実験では、異なるａＬＡＧ３バインダー（０４１４対０４１６）及び異なるフォーマット（１＋１対２＋１）を含む二重特異性抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ１抗体の同時結合を比較した（図６Ａ～６Ｄ）。既に記載したとおり、いくつかの抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ１二重特異性抗体を、１＋１ ＣｒｏｓｓＭａｂフォーマット（０７９９及び０９２７）又は２＋１フォーマット（２つのＬａｇ３結合アームと１つのＰＤ１ ｃｒｏｓｓＦａｂフラグメントが融合したＣ末端：８３１１及び８３１０）のいずれかで試験した。図６Ａ及び図６Ｂにおいて、バインダーａＬＡＧ３－０４１６を有する構築物についての曲線（吸光度対濃度）が、図６Ｃ及び図６Ｄにおいて、ａＬＡＧ４－０４１４を有する対応する構築物についての曲線が示される。試験した全ての構築物は、細胞に結合し、化学発光を誘発することができた。結合曲線について計算したＥＣ５０値を以下の表２４に示す。
Figure 0006997212000046
別の実験では、異なるａＬＡＧ３バインダー（０４１４対０４１６）及び異なるフォーマット（２＋１対２＋２）を含む二重特異性抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ１抗体の同時結合を比較した（図７Ａ～７Ｄ）。抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ１二重特異性抗体を、２＋１フォーマット（２つのＬＡＧ３結合アームと１つのＰＤ１ ｃｒｏｓｓＦａｂフラグメントが融合したＣ末端：８３１１及び８３１０）又は２＋２ ｃｒｏｓｓｍａｂフォーマット（２つのＬＡＧ３結合アームと２つのＰＤ１ ｃｒｏｓｓＦａｂフラグメントが融合したＣ末端：８９７０及び８９８４）のいずれかで試験した。図７Ａ及び図７Ｂにおいて、バインダーａＬＡＧ３－０４１４を有する構築物についての曲線（吸光度対濃度）が、図７Ｃ及び図７Ｄにおいて、ａＬＡＧ４－０４１６を有する対応する構築物についての曲線が示される。試験した全ての構築物は、細胞に結合し、化学発光を誘発することができた。結合曲線について計算したＥＣ５０値を以下の表２５に示す。
Figure 0006997212000047
更なる実験では、伝統的な１＋１ＣｒｏｓｓＭＡｂＶｈ－ＶＬフォーマットにおける二重特異性抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ１抗体ＰＤ１／ＬＡＧ３ ０９２７の同時結合を、１＋１ ｔｒａｎｓフォーマット（ＰＤ１／ＬＡＧ３ ０７２５）及び２＋１ ｔｒａｎｓフォーマット（ＰＤ１／ＬＡＧ３ ０７５０）における二重特異性抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ１抗体と比較した。この実験のために、この方法に対し、以下の変更を適用した。異なる抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ１抗体フォーマットの架橋効果を分析するために、７５００ ＰＤ１＋ＬＡＧ３＋ヒトＵ２ＯＳ細胞／ウェルを、白色平底９６ウェルプレートに、非段階希釈の抗体（最終濃度が０．２９ｐＭ～５４８４ｐＭ）と共に接種し、ＣＯ２インキュベータ中、３７℃で２０時間インキュベートした。次に、アッセイプレートを、室温まで平衡状態にし、基質／バッファーミックス（ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒＦｌａｓｈ検出試薬、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｘ）を加え、再び４時間インキュベートした。同時結合及び二量体化の際に誘発される化学発光を測定するために、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｌプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用した。
図７Ｅにおいて、ＰＤ１－ＬＡＧ３二重特異性抗体１＋１ ＣｒｏｓｓＭａｂ（０９２７）、Ｎ末端にａＰＤ１を有し、Ｃ末端にａＬＡＧ３を有する１＋１ ｔｒａｎｓ ＣｒｏｓｓＭａｂ（０７２５）及びＮ末端にａＰＤ１を有し、Ｎ末端とＣ末端にａＬＡＧ３を有する２＋１ ｔｒａｎｓ ＣｒｏｓｓＭａｂ（０７５０）の用量応答曲線（発光対濃度）を示している。ＰＤ１／ＬＡＧ３ ０９２７と比較し、ＰＤ１／ＬＡＧ３ ０７２５のＰＤ１ ＬＡＧ３受容体架橋効果は、明確に高く、一方、ＰＤ１／ＬＡＧ３ ０７５０については、わずかに低い。
１１．４ ＰＤ－１及びＬＡＧ－３コンボレポーターアッセイにおける二重特異性抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ１ ｔｒａｎｓ ＣｒｏｓｓＭａｂバリアントの測定。
ｉｎ ｖｉｔｒｏで、抑制されたＴ細胞応答を回復する際に、異なる抗ＰＤ１－ＬＡＧ３抗体フォーマットの中和能力を調べるために、市販のレポーターシステムを使用した。ＰＤ１及びＬＡＧ３コンボバイオアッセイは、ＰＤ１、ＬＡＧ３及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するレポーター細胞、ＭＨＣ－ＩＩ及びＰＤＬ１を発現する腫瘍細胞及びＴＣＲを活性化する抗原からなる。
エフェクター細胞は、ＮＦＡＴ応答要素（ＮＦＡＴ－ＲＥ）によって促進されるヒトＰＤ１、ヒトＬＡＧ３、ヒトＴＣＲ及びルシフェラーゼレポーターを発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞である。標的細胞は、ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＡ３７５細胞である。簡単に言うと、このレポーター系は、以下の３つの工程に基づく。（１）ＴＣＲを活性化する抗原によって誘発されるＮＦＡＴ細胞活性化、（２）ＭＨＣＩＩ（Ａ３７５細胞）及びＬＡＧ３＋（ＪｕｒｋａＴ細胞）と、ＰＤ－Ｌ１（Ａ３７５細胞）及びＰＤ１（ＪｕｒｋａＴ細胞）との間の相互作用によって介在される、活性化シグナルの阻害、（３）ＰＤ１及びＬＡＧ３アンタゴニスト／中和抗体によるＮＦＡＴ活性化シグナルの回復。
この実験のために、ウェルあたり１×１０４Ａ３７５標的細胞を、９６ウェル平底アッセイプレート中、ＴＣＲ活性化抗原（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共に、ＣＯ２インキュベータ中、３７℃で一晩インキュベートした。次に、プレートから培地を取り出し、段階希釈（最終アッセイ濃度が０．０１ｎＭから８５７ｎＭまで）の抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ１抗体及びウェルあたり５×１０４Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞を加えた。ＣＯ２インキュベータ中、３７℃で６時間インキュベートした後、アッセイプレートを室温まで平衡状態にし、８０μｌのＯＮＥ－Ｇｌｏ Ｅｘ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに加えた。１０分間インキュベートした後、発光をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｌプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。両受容体に対する抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体の同時結合は、両受容体の局所的な細胞蓄積、２種類の異種酵素サブユニットの相補性を引き起こし、最終的に、基質を加水分解し、それによって、化学発光シグナルを生成する特異的で機能的な酵素が生成すると予想される。図７Ｆにおいて、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体１＋１ ＣｒｏｓｓＭａｂ（０９２７）、Ｎ末端にａＰＤ１を有し、Ｃ末端にａＬＡＧ３を有する１＋１ ｔｒａｎｓ ＣｒｏｓｓＭａｂ（０７２５）及びＮ末端にａＰＤ１を有し、Ｎ末端とＣ末端にａＬＡＧ３を有する２＋１ ｔｒａｎｓ ＣｒｏｓｓＭａｂ（０７５０）の用量応答曲線（発光対濃度）を示している。０９２７及び０７２５が、ＰＤ１及びＬＡＧ３のそれぞれのリガンドとの相互作用をブロックすることによって、レポーター細胞活性化を回復させる能力は、匹敵するものであり、一方、０７５０については、高い。これは、表２６に列挙されるＥＣ５０値によって更に示される。
Figure 0006997212000048
実施例１２
二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体の機能特性決定
１２．１ Ｔ細胞表面に結合したときのインターナリゼーションの低下
フローサイトメトリーによる受容体インターナリゼーションの測定
受容体インターナリゼーションは、標的受容体がＴＣＲシグナル伝達を阻害する準備ができた細胞表面で迅速に再発現しつつ、数時間以内に分解し得る分子の重要なシンクを表す。したがって、フローサイトメトリーによって、構築物が結合した際の受容体インターナリゼーションを評価し、４℃で異なる二重特異性抗体で染色したサンプルを、４℃で染色した後に３７℃で３時間インキュベートしたサンプルと比較するためのリファレンスとして使用した。
３日間、ポリクローナル的に活性化されたＣＤ４ Ｔ細胞は、すでに１μｇ／ｍｌのプレートに結合した抗ＣＤ３及び１μｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ２８抗体と共に培養されており、抗ＬＡＧ３又は抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体のいずれか存在下で（２個ずつ）、４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、２つの群に分け、１つは、３７℃で更に３時間インキュベートし、他方は、ＢＤ Ｃｅｌｌ Ｆｉｘで固定する前に、標識された二次抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）ですぐに染色した。３時間インキュベートした後、第２群の細胞も、固定前に、標識された二次抗体で染色した。染色後、集める前に、細胞をＰＢＳ／２％ＦＣＳで２回洗浄した。
細胞をＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で獲得し、細胞表面の検出可能な抗体の発現レベルを、２群間で比較した。結果を図８Ｂに示す。３時間後、全ての二重特異性フォーマット及び単一特異性二価ａＬＡＧ－３抗体がインターナリゼーションされていたが、１＋１フォーマット（ＰＤ１／ＬＡＧ３ ０７９９及びＰＤ１／ＬＡＧ３ ０９２７）の二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体は、最もインターナリゼーションされていなかったことを観察した。
蛍光共焦点顕微鏡による、抗体の局在化及びインターナリゼーションの視覚化。
活性化されたＣＤ４陽性細胞をＣＭＦＤＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）で処理された丸いカバースリップの上に置いた。細胞を３７℃で４時間かけて接着させた後、蛍光タグ化抗体（１μｇ／ｍＬ：ａ－ＬＡＧ３（１２５６）、１＋１ ＰＤ１／ＬＡＧ３二重特異性抗体（０９２７）、ＰＤ１－ＬＡＧ３ １＋２二重特異性抗体（８３１０）及びＡｌｅｘａ ６４７で標識されたＰＤ１－ＬＡＧ３ ２＋２二重特異性抗体（８９７０））を、異なる時間（１５分、１時間及び３時間）、成長培地に直接加えた。冷ＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ）を使用して反応を停止させ、未結合抗体を洗い流した。次いで、細胞を、Ｃｙｔｏｆｉｘ（ＢＤ）を用いて４℃で２０分間固定し、ＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ）で２回洗浄した。次いで、カバースリップを移し、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ Ｇ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてガラススライドに取り付け、イメージングの前に、暗状態で、４℃で一晩保持した。（Ａ）蛍光画像を図９Ａに示す。白色シグナルは、標識された抗体の局在化を表す。（Ｂ）高度に標的化された細胞の膜ＲＯＩからの蛍光シグナルの強度を、同じ細胞の細胞質ＲＯＩからの蛍光シグナルの強度によって割り算し、Ｂｏｘ Ｃｈａｒｔに示される比率を得た。サンプルを比較するために、一元配置ＡＮＯＶＡ分析の未修正のＦｉｓｈｅｒ ＬＳＤを使用した（＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１）。結果を図９Ｂに示す。経時間分析は、ＴＩＭ３抗体（コントロールとして使用される）の細胞内クラスター化と比較すると、二重特異性抗体及びＬＡＧ３抗体において、より高度に膜局在化していることを示す。３時間後、全ての二重特異性フォーマット及び単一特異性二価ａＬＡＧ－３抗体が、唯一の例外である１＋１ ＰＤ１／ＬＡＧ３二重特異性抗体（０９２７）を除き、インターナリゼーションされていることを観察した（図９Ａ）。
Ｚｅｉｓｓ製の倒立ＬＳＭ ７００に６０倍の油浸対物レンズを取り付け、蛍光共焦点顕微鏡法を実施した。画像は、顕微鏡に連結したＺｅｎソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）を用いて集めた。画像の分析を、Ｉｍａｒｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ；Ｏｘｆｏｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を用いて行い、統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）によって行った。
１２．２ Ｔｒｅｇと比較した、従来のＴ細胞に対する結合
リードＰＤ１－ＬＡＧ３ ＢｓＡｂの所望な特性は、Ｔｒｅｇ上のＬＡＧ３は、その抑制機能を負に制御するようであるため、Ｔｒｅｇよりも従来のＴ細胞に対して優先的に結合する能力である。したがって、ブロッキング抗体を用いたＴｒｅｇ上のＬＡＧ３の標的化は、その抑制機能を増加させ、最終的に他のＴ細胞に対する正のブロッキング効果を覆い隠すことによって悪化し得る。したがって、一緒に培養した、活性化された従来の制御Ｔ細胞に対する、異なる抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体フォーマットの競争結合を評価した。
制御Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）及び従来のＴ細胞（Ｔｃｏｎｖ）を、健康なドナーＰＢＭＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）から選別し、５ｍＭ ＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ又はＣＦＳＥ膜染料でそれぞれ標識し、１：１の比率で、１μｇ／ｍｌのプレートに結合した抗ＣＤ３及び１μｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ２８抗体と共に３日間培養した。３日目に、ＢＤ Ｃｅｌｌ Ｆｉｘで固定され、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で獲得された、直接的に標識された抗ＰＤ１、抗ＬＡＧ３又は二重特異性抗体と共に、細胞を４℃で３０分間インキュベートした。
単一特異性抗ＬＡＧ３親抗体は、Ｔｒｅｇ及び従来のＴ細胞に等しく十分に結合するが（図１０Ａ）、抗ＰＤ１の相当物は、Ｔｒｅｇに対するよりも、エフェクターＴ細胞上でＰＤ１の発現レベルが高いため、従来のＴ細胞に優先的に結合する（図１０Ｂ）。興味深いことに、１＋１フォーマットのＰＤ１／ＬＡＧ３二重特異性抗体（０９２７）も、Ｔｒｅｇに対するよりも、従来のＴ細胞に対して優先的に結合する能力を保持していた（図１０Ｃ）。この従来のＴ細胞に対する優先的な結合は、Ｔｒｅｇに対するシグナルに対し、従来のＴ細胞に対するシグナルの差（Δ）を示すことによっても、視覚化することができる（図１０Ｄ）。２＋１及び２＋２フォーマットは、エフェクターＴ細胞に対する親和性による選択性を示さず、単一特異性抗ＬＡＧ３抗体に対する結合に匹敵するものである。
１２．３ 照射された同種異系ＰＢＭＣと共に培養されたヒトＣＤ４ Ｔ細胞によるグランザイムＢのＴｒｅｇ抑制及びＩＦＮ－γ放出に対する、ＰＤ－１及びＬＡＧ－３ブロックの効果。
二重特異性抗体フォーマットの結合特性の差が、ＴｒｅｇよりもＴｃｏｎｖに対して機能的な利点を与えるかどうかを更に試験した。制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）抑制アッセイに関与する機能的試験では、マイクロビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって、２つのサンプルに分けた同じドナー由来のＰＢＭＣ（１つはＣＤ４ Ｔ細胞に豊富に含まれており、他方はＴｒｅｇに豊富に含まれている）は、ＣＤ４＋ＣＤ２５高ＣＤ１２７低Ｔ細胞として定義される。２種類の集合を精製したら、ＣＤ４ Ｔ細胞を５μＭのカルボキシ－フルオレセイン－スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識し、一方、Ｔｒｅｇは、ＦＡＣＳで後で区別することができるように、５μＭの細胞－トレース－バイオレット（ＣＴＶ）で標識した。
次いで、ＣＤ４ Ｔ細胞（１０５）及びＴｒｅｇ（１０５）を、９６ウェルプレート中、１：１の比率で無関係なドナー由来の照射されたＰＢＭＣ（１０５）と一緒に、本願発明者らの抗ＬＡＧ３抗体（リード０４１４及びバックアップ０４１６）又は競争相手である抗ＬＡＧ３抗体（ＢＭＳ－９８６０１６及びヒト化ＢＡＰ０５０）の存在下又は非存在下、本願発明者らの抗ＰＤ１抗体と濃度１０μｇ／ｍｌで組み合わせて、培養した。ＴｒｅｇによるＣＤ４ Ｔ細胞エフェクター機能の抑制の大きさを概算するためのコントロールとして、ＣＤ４ Ｔ細胞（１０５）を、Ｔｒｅｇ非存在下、照射されたＰＢＭＣ（１０５）と共に培養した。
５日後、細胞培養上清を集め、これを後で使用し、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）によりＩＦＮ－γレベルを測定し、Ｇｏｌｇｉ Ｐｌｕｇ（Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ）及びＧｏｌｇｉ Ｓｔｏｐ（Ｍｏｎｅｎｓｉｎ）の存在下、細胞を３７℃で更に５時間放置した。次いで、細胞を染色し、その表面を、抗ヒトＣＤ４抗体及びＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ ｆｉｘａｂｌｅ ｄｙｅ Ａｑｕａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した後、Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍバッファー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で固定／透過処理した。細胞内染色は、Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＩＦＮγ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）について実施した。結果を図１１に示す。
本願発明者らのＰＤ１／ＬＡＧ－３二重特異性抗体（０９２７）は、親抗ＰＤ１抗体又はペンブロリズマブのみ存在下（Ｐ＜０．０５）、又はチェックポイント阻害剤非存在下（Ｐ＜０．００１）、Ｔｃｏｎｖよりも有意に多い量のグランザイムＢの分泌によって示されるように、制御Ｔ細胞の密な制御からＴｃｏｎｖを守ることが誘発された。ニボルマブと組み合わせた競争相手抗ＬＡＧ３抗体ＢＭＳ－９８６０１６は、Ｔｒｅｇ抑制からＴｃｏｎｖエフェクター機能を顕著に守らなかった。
１２．４ Ｂ細胞リンパ芽球様細胞株（ＡＲＨ７７）と共に培養されたヒトＣＤ４ Ｔ細胞による細胞毒性グランザイムＢ放出に対する、ＰＤ－１／ＬＡＧ－３二重特異性抗体の効果。
腫瘍細胞株ＡＲＨ７７と一緒に培養される場合、抗ＰＤ－１及び抗ＬＡＧ－３親抗体の組み合わせと比較して、また、治療標準で使用される抗ＰＤ１抗体と比較して、本願発明者らの異なる二重特異性抗体フォーマットが、ＣＤ４ Ｔ細胞によるグランザイムＢ分泌を誘発する能力を評価した。
合計で６フォーマットを試験し、３フォーマットは、抗ＰＤ１（０３７６）及び抗ＬＡＧ３（ｈｕ １２５６、ｃｈｉ ０４１４）抗体から作られ、３つの更なるフォーマットは、抗ＰＤ１（０３７６）及び抗ＬＡＧ－３（ｈｕ１２５７、ｃｈｉ ０４１６）抗体から作られていた。
図１３からわかるだろうが、抗ＬＡＧ３（ＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡとしてのｈｕ １２５６、抗ＬＡＧ３ ０４１４）及び抗ＰＤ１（０３７６）、及び親抗体の組み合わせから作られる２つの二重特異性フォーマットである１＋１（０９２７）及び２＋２（８９７０）は、未処理のＣＤ４ Ｔ細胞と比較すると、ＣＤ４ Ｔ細胞によるグランザイムＢの分泌を有意に高めた（それぞれ、Ｐ＝０．０００５、Ｐ＝０．０１及びＰ＝０．０００１）。対応する２＋１フォーマット（８３１０）は、同様の傾向を示したが、統計的有意性には達しなかった（Ｐ＝０．０７）。
抗ＬＡＧ－３（ＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡとしてのｈｕ １２５７、抗ＬＡＧ３ ０４１６）と、抗ＰＤ１（０３７６）とを合わせることによって作られた二重特異性抗体に関し、１＋１フォーマット（０７９９）及び２＋２（８９８４）は、未処理のＣＤ４細胞と比較したとき、グランザイムＢ陽性ＣＤ４ Ｔ細胞の数を有意に増やした（それぞれ、Ｐ＝０．００３２及びＰ＝０．００６４）。
ニボルマブもペンブロリズマブも、チェックポイント阻害剤非存在下で培養した細胞と比較すると、ＣＤ４ Ｔ細胞による、より多くのグランザイムＢ分泌を有意に促進しなかった。（図１３。）
Figure 0006997212000049
１２．５ 免疫原性黒色腫抗原ペプチドプールを用いて回収した後の黒色腫患者ＰＢＭＣ由来のＣＤ４ Ｔ細胞によるグランザイムＢ及びＩＦＮ－γ分泌に対するＰＤ－１及びＬＡＧ－３ブロックの効果。
黒色腫患者ＰＢＭＣが、検出可能な数の腫瘍抗原に特異的なＴ細胞を含むことは既に記載されている。したがって、概念の証明のために、抗ＬＡＧ－３抗体（０４１４）及び抗ＰＤ－１（０３７６）の組み合わせと、１＋１（０９２７）フォーマットでの誘導される二重特異性抗体又は抗ＰＤ－１単独を、免疫原性黒色腫に関連する抗原ペプチドプールを用いて一晩再刺激した黒色腫患者ＰＢＭＣについて試験した。
飽和濃度（１０μｇ／ｍｌ）の抗ＰＤ－１のみ（０３７６）存在下又は非存在下、抗ＬＡＧ－３（０４１４、１０μｇ／ｍｌ）抗体と組み合わせて、又は二重特異性１＋１フォーマット（０９２７、２０μｇ／ｍｌ）抗体として、室温でインキュベートした黒色腫患者由来の１０５～１０６ＰＢＭＣ。次いで、ＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ４、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１、ＮＹＥＳＯ－１、メラニン細胞タンパク質Ｐｍｅｌ １７ ｇｐ１００、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質２などの免疫原性腫瘍関連抗原のプールを用い、タンパク質輸送阻害剤Ｇｏｌｇｉ Ｐｌｕｇ（ブレフェルジンＡ）及びＧｏｌｇｉ Ｓｔｏｐ（モネンシン）存在下、Ｔ細胞を、一晩かけて再刺激した。
次いで、細胞を染色し、その表面を、抗ヒトＣＤ４抗体及びＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ ｆｉｘａｂｌｅ ｄｙｅ Ａｑｕａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した後、Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍバッファー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で固定／透過処理した。細胞内染色は、グランザイムＢ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＩＦＮ－γ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）について実施した。
抗ＬＡＧ－３及び抗ＰＤ－１抗体の組み合わせ（Ｐ＜０．０１及びＰ＜０．００１）と、二重特異性抗体は、両方とも、有意に（Ｐ＜０．０１及びＰ＜０．０００１）、腫瘍抗原特異的なＴ細胞エフェクター機能（すなわち、グランザイムＢ及びＩＦＮ－γ分泌）を高め、一方、ＰＤ－１ブロックのみだと、効果を示さなかった（図１２）。
実施例１３
ＰＤ１／ＬＡＧ３二重特異性抗体とＣＥＡＣＡＭ５ ＣＤ３ ＴＣＢのｉｎ ｖｉｖｏでの併用療法による、強力な抗腫瘍効果。
ＴＣＢ分子は、ＷＯ ２０１４／１３１７１２ Ａ１号又はＷＯ ２０１６／０７９０７６ Ａ１号に記載される方法に従って調製された。この実験で使用される抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体（ＣＥＡ ＣＤ３ ＴＣＢ又はＣＥＡ ＴＣＢ）の調製は、ＷＯ ２０１４／１３１７１２ Ａ１号の実施例３に記載される。ＣＥＡ ＣＤ３ ＴＣＢは、「２＋１ ＩｇＧ ＣｒｏｓｓＦａｂ」抗体であり、２つの異なる重鎖と、２つの異なる軽鎖とで構成される。２つの異なる重鎖のアセンブリを促進するために、ＣＨ３ドメイン中の点変異（「ホールにノブを入れる」）を導入した。２つの異なる軽鎖の正しいアセンブリを促進するために、ＣＤ３結合ＦａｂにおけるＶＨドメインとＶＬドメインの交換を行った。２＋１は、その分子が、ＣＥＡに特異的な２つの抗原結合ドメインと、ＣＤ３に特異的な１つの抗原結合ドメインを有することを意味する。ＣＥＡ ＣＤ３ ＴＣＢは、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８及び配列番号１４９のアミノ酸配列を含む。ＣＥＡＣＡＭ５ ＣＤ３ ＴＣＢは、同じフォーマットを有するが、別のＣＥＡバインダーを含み、軽鎖の正しい対形成を補助するために、ＣＤ３バインダーのＣＨドメイン及びＣＬドメインに点変異を含む。ＣＥＡＣＡＭ５ ＣＤ ＴＣＢは、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２及び配列番号１５３のアミノ酸配列を含む。
（ａ）実験材料及び方法
ＰＤ１／ＬＡＧ３二重特異性抗体０９２７を、１．５ｍｇ／ｋｇ又は３ｍｇ／ｋｇの濃度で、ヒト膵臓ＢＸＰＣ３癌モデルにおけるヒトＣＥＡＣＡＭ５ ＣＤ３ ＴＣＢと組み合わせて試験した。ＢＸＰＣ３細胞を、ＮＳＧヒト化マウスにおいて、マウス線維芽細胞株（３Ｔ３）と共に皮下に同時移植した。
ＢＸＰＣ３細胞株の調製：ＢＸＰＣ３細胞（ヒト膵臓癌細胞）は、元々、ＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）から得られ、増殖後、Ｇｌｙｃａｒｔ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｅｌｌ ｂａｎｋに寄託された。ＢＸＰＣ３細胞を、１０％ＦＣＳ（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｕｓｔｒｉａ）、１％ Ｇｌｕｔａｍａｘを含有するＲＰＭＩ中で培養した。５％ＣＯ２で、水飽和した雰囲気中、３７℃で細胞を培養した。
完全ヒト化マウスの製造：実験開始時に４～５週齢の雌ＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を、特定の病原体のいない条件に維持し、１日のサイクルは、関連するガイドライン（ＧＶ－Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、１２時間明状態／１２時間暗状態であった。この実験研究プロトコルは、地方政府によってまとめられ、承認された（Ｐ ２０１１／１２８）。到着した後、動物を、新しい環境に慣れさせ、観察するために１週間維持した。連続的な健康モニタリングは、定期的に行われた。ＮＳＧマウスに、１５ｍｇ／ｋｇのブスルファンを腹腔内注射し、１日後、臍帯血から単離した１ｘ１０５のヒト造血幹細胞を静脈注射した。幹細胞注入から１４～１６週後、マウスを舌下で出血させ、首尾良いヒト化のために、血液をフローサイトメトリーによって分析した。効率的に移植されたマウスは、そのヒトＴ細胞の頻度に従って、異なる処置群に無作為に分けられた。
有効性実験：完全にヒト化したＨＳＣ－ＮＳＧマウスを、１：１比率で、マトリゲル存在下、０日目に１×１０６ＢＸＰＣ３細胞（ヒト膵臓癌腫細胞株、ＣＥＡＣＡＭ５を発現する）を用いて皮下チャレンジ試験した。全実験期間中、腫瘍をカリパスによって週に２～３回測定した。１５日目に、マウスを腫瘍サイズについて無作為に分け、平均腫瘍サイズは２５０ｍｍ３であり、週に１回計画された治療（ビヒクル（ヒスチジンバッファー）、抗ＰＤ１（０３７６）、ニボルマブ、ペンブロリズマブ又は抗ＰＤ１－ＬＡＧ３ ０９２７）を開始し、最大４００μｌの腹腔内注射を与えた。カリパスを用いて腫瘍成長を週に２～３回測定し、腫瘍体積を以下のように測定した。
Ｔｖ：（Ｗ２／２）×Ｌ （Ｗ：幅、Ｌ：長さ）
試験は４７日目に終了した。
（ｂ）結果
４７日間にわたる腫瘍体積の測定（ｍｍ３±ＳＥＭ）は、マウスのそれぞれの処置群内で、平均体積として図１４に示される。ＣＥＡＣＡＭ５－ＴＣＢのみを用いた処置は、未処理ビヒクル群と同一の疾患進行を示した。逆に、ニボルマブ及びペンブロリズマブは、腫瘍成長を減少させたが、腫瘍成長制御には達していなかった。驚くべきことに、ＰＤ１／ＬＡＧ３二重特異性抗体０９２７は、濃度３ｍｇ／ｋｇで、全ての処置された動物において、腫瘍成長を完全に抑制し、ＰＤ－１に加えてＬＡＧ－３を同時にブロックする相乗効果を示している。
図１５Ａ～１５Ｆにおいて、４７日間にわたる腫瘍体積の測定（ｍｍ３±ＳＥＭ）は、それぞれの個々の動物について示されており、各群において、抗腫瘍応答の均一性を示している。
統計的有意性は、ＣＥＡＣＡＭ５ ＣＤ３ ＴＣＢ単一処置に対してＤｕｎｎｅｔｔ方法を用いることによって計算された。複数比較のための群の平均の有意な差について試験するために、Ｄｕｎｎｅｔｔ方法を用い、分散の標準的な分析（ＡＮＯＶＡ）を自動的に行う。Ｄｕｎｎｅｔｔ方法は、平均が、コントロール群の平均とは異なるかどうかを試験する。
得られたＴＧＩ及びＴＣＲの値を表２８に示す（ＴＧＩは、腫瘍成長阻害を意味し、ＴＧＩ＞１００は、腫瘍退縮を意味し、ＴＧＩ＝１００は、腫瘍の均衡状態であると定義され、ＴＣＲは、コントロールに対する処置の比率を意味し、ＴＣＲ＝１は、効果がないことを意味し、ＴＣＲ＝０は、完全な退縮であると定義される）。
Figure 0006997212000050
コントロールとの比較は、Ｄｕｎｎｅｔｔ方法を用い、ｐ値として更に示される。
ＣＥＡＣＡＭ５ ＣＤ３ ＴＣＢを用いた処置は、膵臓癌という観点で、腫瘍成長を制御することができない。しかし、二重特異性抗体抗ＰＤ１／ＬＡＧ３ ０９２７との組み合わせによって、用量特異的な様式で、腫瘍に対して強い影響を生じる。統計分析は、抗ＰＤ１／ＬＡＧ３ ０９２７との組み合わせは、抗ＰＤ１抗体であるニボルマブ及びペンブロリズマブとの組み合わせとは異なり、両方の濃度で、腫瘍成長の制御において、単一処理と比較すると、統計的有意差が得られ、ＰＤ１のみの阻害よりも二重特異性抗ＰＤ１／ＬＡＧ３抗体が優れていることを示唆しており、腫瘍成長を均衡状態にする。

Claims (33)

  1. 二重特異性抗体であって、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ３）に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、前記二重特異性抗体が１＋１フォーマットであり、
    前記ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが、
    （ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
    （ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
    （ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３とを含むＶＨドメインと、
    （ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
    （ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
    （ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３とを含むＶＬドメインとを含み、
    前記ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインが、
    （ｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
    （ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
    （ｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３とを含むＶＨドメインと、
    （ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
    （ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
    （ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３とを含むＶＬドメインとを含む、
    二重特異性抗体。
  2. 二重特異性抗体が、ＩｇＧであるＦｃドメインを含み、Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体に対する結合を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。
  3. Ｆｃドメインが、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインである、請求項２に記載の二重特異性抗体。
  4. Ｆｃ受容体が、Ｆｃγ受容体である、請求項２又は３に記載の二重特異性抗体。
  5. ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが、配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  6. 請求項１～５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体であって、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインが、
    配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、二重特異性抗体。
  7. 請求項１～６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体であって、
    ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが、配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含み、
    ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインが、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、二重特異性抗体。
  8. 二重特異性抗体が、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を有する、ヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  9. 二重特異性抗体が、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する改変を含むＦｃドメインを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  10. Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項１～９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  11. 二重特異性抗体が、Ｆｃドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第１のＦａｂフラグメントと、ＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第２のＦａｂフラグメントとを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  12. Ｆａｂフラグメントの１つにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨは、ＶＨドメインが軽鎖の一部であり、ＶＬドメインが重鎖の一部であるように互いに置き換わっている、請求項１～１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  13. ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第１のＦａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨは、互いに置き換わっている、請求項１１又は１２に記載の二重特異性抗体。
  14. 二重特異性抗体が、Ｆａｂフラグメントを含み、定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１において、位置１４７及び２１３のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項１～１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  15. ＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第２のＦａｂフラグメントの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１において、位置１４７及び２１３のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  16. 配列番号９６の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号９８の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号１００の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  17. 配列番号９６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号９８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号１００のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０１のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  18. 二重特異性抗体が、ＦｃドメインのＣ末端に融合するＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第２のＦａｂフラグメントを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  19. 配列番号９６の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号９８の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号１４４の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、請求項１～１５又は１８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  20. 配列番号９６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号９８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号１４４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０１のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、請求項１～１５、１８又は１９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  21. 請求項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド。
  22. 請求項２１に記載のポリヌクレオチドを含む原核生物又は真核生物の宿主細胞。
  23. 二重特異性抗体の発現に適した条件で、請求項２２に記載の宿主細胞を培養することと、培養物から二重特異性抗体を回収することとを含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を製造する方法。
  24. 請求項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体と、少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
  25. 医薬として使用するための請求項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項２４に記載の医薬組成物。
  26. 請求項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項２４に記載の医薬組成物であって、
    （ｉ）免疫応答の調節、例えば、Ｔ細胞活性の回復において、
    （ｉｉ）Ｔ細胞応答の刺激において、
    （ｉｉｉ）感染の処置において、
    （ｉｖ）癌の処置において、
    （ｖ）癌の進行を遅らせることにおいて、又は
    （ｖｉ）癌を患う患者の生存を延長することにおいて使用するための、二重特異性抗体又は医薬組成物。
  27. 癌の処置に使用するための請求項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項２４に記載の医薬組成物。
  28. 慢性ウイルス感染の処置に使用するための請求項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項２４に記載の医薬組成物。
  29. 二重特異性抗体は、癌免疫療法で使用するために化学療法剤、放射線及び／又は他の薬剤と組み合わせて投与される、癌の予防又は処置に使用するための請求項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項２４に記載の医薬組成物。
  30. 二重特異性抗体は、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて投与される、癌の予防又は処置に使用するための請求項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項２４に記載の医薬組成物。
  31. 癌又は感染性疾患の処置のための医薬の製造における、請求項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項２４に記載の医薬組成物の使用。
  32. 癌又は慢性ウイルス感染を有する個体を処置するための医薬であって、有効量の請求項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項２４に記載の医薬組成物を含む、医薬。
  33. 個体において腫瘍細胞の成長を阻害するための医薬であって、前記腫瘍細胞の成長を阻害するために、有効量の請求項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を含む、医薬。
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