TW202030207A - 特異性結合至pd1至lag3的雙特異性抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體。本發明亦係關於此等分子之製備方法及其使用方法。

Description

特異性結合至PD1至LAG3的雙特異性抗體
本發明係關於包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，尤其係關於進一步包括含一或多個減少與Fc受體，特別是與Fcγ受體之結合的胺基酸取代之Fc結構域的雙特異性抗體。本發明亦係關於此等分子之製備方法及其使用方法。
免疫系統在預防癌症方面之重要性係基於其能夠偵測並破壞異常細胞。然而，一些腫瘤細胞能夠藉由引起免疫抑制狀態來避開免疫系統(Zitvogel等人，Nature Reviews Immunology 6 (2006), 715-727)。T細胞在抗病毒及抗腫瘤免疫反應中具有重要作用。抗原特異性T細胞之適當活化引起其純系擴增及其效應功能之獲得，且在細胞毒性T淋巴細胞(CTL)之情況下，使其能夠特異性溶解靶細胞。T細胞成為治療上操作內源抗腫瘤免疫性的主要研究焦點係歸於以下原因：其能夠選擇性識別來源於所有細胞區室中之蛋白質的肽；其能夠直接識別並殺滅抗原表現細胞(藉助於CD8+ 效應T細胞；又稱為細胞毒性T淋巴細胞(CTL))；及其能夠將不同免疫反應(藉助於CD4+ 輔助T細胞)協調地結合在一起，由此整合適應性及先天性效應機制。T細胞會因長期暴露於抗原而出現功能異常：T細胞在抗原存在下喪失增殖能力且逐漸地無法產生細胞介素及溶解靶細胞1。功能異常之T細胞稱為耗竭之T細胞且無法增殖並發揮效應功能，諸如細胞毒性及響應於抗原刺激而分泌細胞介素。其他研究確定，耗竭之T細胞係以抑制分子PD-1(計劃性細胞死亡蛋白質1)之持續表現為特徵且在感染LCMV之小鼠中阻斷PD-1與PD-L1(PD-1配位體)相互作用可以逆轉T細胞耗竭且恢復抗原特異性T細胞反應(Barber等人，Nature 439 (2006), 682-687)。然而，僅靶向PD-1—PD-L1路徑並不總是會使T細胞耗竭逆轉(Gehring等人，Gastroenterology 137 (2009), 682-690)，表明T細胞耗竭中可能涉及其他分子(Sakuishi, J. Experimental Med. 207 (2010), 2187-2194)。 淋巴細胞活化基因-3(LAG3或CD223)最初係在設計用於選擇性分離IL-2依賴性NK細胞株中表現之分子的實驗中發現(Triebel F等人，Cancer Lett. 235 (2006), 147-153)。LAG3係結構與CD4同源且具有四個細胞外免疫球蛋白超家族樣結構域(D1-D4)的一種獨特跨膜蛋白。遠膜IgG結構域含有短胺基酸序列，即在其他IgG超家族蛋白質中未發現的所謂額外環。細胞內結構域含有使LAG3對T細胞功能發揮負面作用所需的獨特胺基酸序列(KIEELE，SEQ ID NO:75)。LAG3可以在連接肽(CP)處經金屬蛋白酶裂解以產生可在血清中偵測到的可溶性形式。與CD4相同，LAG3蛋白質結合至II類MHC分子，但其親和力高於CD4且結合位點與CD4不同(Huard等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 5744-5749)。LAG3係由T細胞、B細胞、NK細胞及漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)表現且在T細胞活化之後上調。其調節T細胞功能以及T細胞動態平衡。無反應性或展示減弱之功能的習知T細胞亞群表現LAG3。LAG3+ T細胞在腫瘤部位且在慢性病毒感染期間富集(Sierro等人，Expert Opin. Ther. Targets 15 (2011), 91-101)。經顯示，LAG3在CD8 T細胞耗竭中起作用(Blackburn等人，Nature Immunol. 10 (2009), 29-37)。因此，需要拮抗LAG3之活性且可以用於產生並恢復針對腫瘤之免疫反應的抗體。 針對LAG3之單株抗體在例如WO 2004/078928中已有描述，該案中主張包含特異性結合至CD223之抗體及抗癌疫苗之組合物。WO 2010/019570揭示結合LAG3之人類抗體，例如抗體25F7及26H10。US 2011/070238係關於可用於治療或預防器官移植物排斥反應及自體免疫疾病之細胞毒性抗LAG3抗體。WO 2014/008218描述功能特性相較於抗體25F7有所優化(亦即，脫醯胺位點減少)的LAG3抗體。另外，LAG3抗體亦揭示於WO 2015/138920 (例如BAP050)、WO 2014/140180、WO 2015/116539、WO 2016/028672、WO 2016/126858、WO 2016/200782及WO 2017/015560中。 計劃性細胞死亡蛋白1 (PD1或CD279)係CD28受體家族之抑制性成員，該家族亦包括CD28、CTLA-4、ICOS及BTLA。PD-1係細胞表面受體且在活化B細胞、T細胞及骨髓細胞上表現(Okazaki等人(2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82；Bennett等人(2003) J Immunol 170:711-8)。PD-1之結構係一種單體1型跨膜蛋白，由一個免疫球蛋白可變結構域樣細胞外結構域及含有基於免疫受體酪胺酸之抑制基元(ITIM)及基於免疫受體酪胺酸之轉換基元(ITSM)的細胞質結構域組成。活化T細胞短暫表現PD1，但PD1及其配位體PDL1之持續過度表現促進免疫耗竭，由此導致持續病毒感染、腫瘤免疫逃逸(tumor evasion)、感染增加及死亡。PD1表現係藉由T細胞受體識別抗原誘導，且其表現主要經由連續T細胞受體信號傳導維持。在長期抗原暴露之後，PD1基因座無法再甲基化，由此促進連續過度表現。阻斷PD1途徑可以使癌症及慢性病毒感染中耗竭之T細胞功能恢復(Sheridan, Nature Biotechnology 30 (2012), 729-730)。針對PD-1之單株抗體描述於例如WO 2003/042402、WO 2004/004771、WO 2004/056875、WO 2004/072286、WO 2004/087196、WO 2006/121168、WO 2006/133396、WO 2007/005874、WO 2008/083174、WO 2008/156712、WO 2009/024531、WO 2009/014708、WO 2009/101611、WO 2009/114335、WO 2009/154335、WO 2010/027828、WO 2010/027423、WO 2010/029434、WO 2010/029435、WO 2010/036959、WO 2010/063011、WO 2010/089411、WO 2011/066342、WO 2011/110604、WO 2011/110621、WO 2012/145493、WO 2013/014668、WO 2014/179664及WO 2015/112900中。 WO 2015/200119中描述可用於治療癌症或與諸如細菌、真菌或病毒之類病原體有關之疾病的與PD1及LAG3具有免疫反應性之雙特異性Fc雙功能抗體。然而，需要提供新的雙特異性抗體，該等雙特異性抗體不僅同時結合至PD1及LAG3且因此選擇性靶向表現PD1及LAG3兩者之細胞，而且鑒於LAG3之廣泛表現模式，還避免阻斷其他細胞上之LAG3。本發明之雙特異性抗體不僅有效地阻斷過度表現PD1及LAG3兩者之T細胞上的PD1及LAG3，其亦對該等細胞具有極高選擇性且由此可以避免由投與高活性LAG3抗體引起之副作用。
本發明係關於包含至少一個特異性結合至計劃性細胞死亡蛋白質1(PD1)之抗原結合結構域及至少一個特異性結合至淋巴細胞活化基因-3(LAG3)之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體。該等雙特異性抗體之有利之處在於，相較於抗PD1與抗LAG3組合策略，其提供較佳之選擇性及潛在功效。其特徵亦在於顯示出降低之吸收效應(sink effect)(如由T細胞內化減少所示)，相對於Treg，其優先結合至習知T細胞，且能夠挽救T細胞效應功能免受Treg抑制，其在活體內顯示增加之腫瘤特異性T細胞效應功能及增加之腫瘤根除。 在一個態樣中，本發明提供一種包含特異性結合至計劃性細胞死亡蛋白質1(PD1)之第一抗原結合結構域及特異性結合至淋巴細胞活化基因-3(LAG3)之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中 該特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域包含 VH結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的HVR-H1， (ii) 含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的HVR-H2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的HVR-H3；以及 VL結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的HVR-L1； (ii) 含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的HVR-L2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的HVR-L3。 確切地說，提供一種包含特異性結合至計劃性細胞死亡蛋白質1(PD1)之第一抗原結合結構域及特異性結合至淋巴細胞活化基因-3(LAG3)之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包含Fc結構域，該Fc結構域係IgG，特別是IgG1 Fc結構域或IgG4Fc結構域，且其中該Fc結構域包含一或多個減少與Fc受體，特別是與Fcγ受體之結合的胺基酸取代。 在一個態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域包含 (a) VH結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列的HVR-H1， (ii) 含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列的HVR-H2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列的HVR-H3；以及 VL結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列的HVR-L1， (ii) 含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列的HVR-L2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 19之胺基酸序列的HVR-L3；或 (b) VH結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列的HVR-H1， (ii) 含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列的HVR-H2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列的HVR-H3；以及 VL結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列的HVR-L1， (ii) 含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列的HVR-L2，及 (iii) 含SEQ ID NO:27之胺基酸序列的HVR-L3；或 (c) VH結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列的HVR-H1， (ii) 含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列的HVR-H2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列的HVR-H3；以及 VL結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的HVR-L1， (ii) 含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的HVR-L2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 35之胺基酸序列的HVR-L3；或 (d) VH結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 38之胺基酸序列的HVR-H1， (ii) 含SEQ ID NO: 39之胺基酸序列的HVR-H2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列的HVR-H3；以及 VL結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列的HVR-L1， (ii) 含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列的HVR-L2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列的HVR-L3；或 (e) VH結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列的HVR-H1， (ii) 含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的HVR-H2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的HVR-H3；以及 VL結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列的HVR-L1， (ii) 含SEQ ID NO: 50之胺基酸序列的HVR-L2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 51之胺基酸序列的HVR-L3。 在另一態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域包括 (a) 含SEQ ID NO:7之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:8之胺基酸序列的VL結構域，或 (b) 含SEQ ID NO:9之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:10之胺基酸序列的VL結構域，或 (c) 含SEQ ID NO:9之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:11之胺基酸序列的VL結構域，或 (d) 含SEQ ID NO:9之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:12之胺基酸序列的VL結構域，或 (e) 含SEQ ID NO:9之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:13之胺基酸序列的VL結構域。 在一個特定態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域包括含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的VL結構域。 在另一態樣中，提供如上文所述的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域包括 (a) 含SEQ ID NO:20之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的VL結構域，或 (b) 含SEQ ID NO:28之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:29之胺基酸序列的VL結構域，或 (c) 含SEQ ID NO:36之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:37之胺基酸序列的VL結構域，或 (d) 含SEQ ID NO:44之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:45之胺基酸序列的VL結構域，或 (e) 含SEQ ID NO:52之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:53之胺基酸序列的VL結構域。 在另一態樣中，提供如上文所述的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域包括 (a) 含SEQ ID NO:54之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:55之胺基酸序列的VL結構域，或 (b) 含SEQ ID NO:62之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:63之胺基酸序列的VL結構域，或 (c) 含SEQ ID NO:64之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:65之胺基酸序列的VL結構域，或 (d) 含SEQ ID NO:66之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:67之胺基酸序列的VL結構域。 另外，提供如上文所述的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中 該特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域包括含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的VL結構域， 且該特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域包括含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列的VL結構域，或含SEQ ID NO:52之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:53之胺基酸序列的VL結構域。 在另一態樣中，提供如上文所述的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中 該特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域包括含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的VL結構域， 且該特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域包括含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列的VL結構域。 在另一態樣中，提供如上文所述的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中 該特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域包括含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的VL結構域， 且該特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域包括含SEQ ID NO: 56之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO: 57之胺基酸序列的VL結構域。 在另一態樣中，提供如上文所述的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體係人類化或嵌合抗體。確切地說，該雙特異性抗體係人類化抗體。 在一個特定態樣中，提供如上文所述的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包含帶有胺基酸突變L234A、L235A及P329G(根據Kabat EU索引編號)的人類IgG1亞類之Fc結構域。 另外，提供如上文所述的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包含Fc結構域，該Fc結構域包含促進該Fc結構域之第一與第二次單元締合的修飾。在一個態樣中，提供一種雙特異性抗體，其中根據孔中節(knobs into holes)方法，該Fc結構域之第一次單元包含節(knob)且該Fc結構域之第二次單元包含孔。確切地說，該Fc結構域之第一次單元包含胺基酸取代S354C及T366W (EU編號)，且該Fc結構域之第二次單元包含胺基酸取代Y349C、T366S及Y407V (根據Kabat EU索引編號)。 在另一態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包括Fc結構域、包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的第一Fab片段及包含特異性結合至LAG3之抗原結合結構域的第二Fab片段。 在一個態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中在該等Fab片段之一中，可變結構域VL與VH相互置換，使得VH結構域成為輕鏈之一部分且VL結構域成為重鏈之一部分。詳言之，提供雙特異性抗體，其中在包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的第一Fab片段中，可變結構域VL與VH相互置換。 在另一態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包含Fab片段，其中在恆定結構域CL中，在位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat EU索引編號)，且在恆定結構域CH1中，在位置147及213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。詳言之，提供雙特異性抗體，其中在包含特異性結合至LAG3之抗原結合結構域的第二Fab片段中，在恆定結構域CL中，在位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat EU索引編號)，且在恆定結構域CH1中，在位置147及213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。 在一個特定態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其包括 (a) 包含與SEQ ID NO:96之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:98之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一輕鏈， 包含與SEQ ID NO:97之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈，及包含與SEQ ID NO:99之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二輕鏈，或 (b) 包含與SEQ ID NO:96之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:98之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一輕鏈， 包含與SEQ ID NO:100之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈，及包含與SEQ ID NO:101之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二輕鏈，或 (c) 包含與SEQ ID NO:102之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:104之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一輕鏈， 包含與SEQ ID NO:103之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈，及包含與SEQ ID NO:105之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二輕鏈，或 (d) 包含與SEQ ID NO:106之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:107之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一輕鏈， 包含與SEQ ID NO:103之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈，及包含與SEQ ID NO:105之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二輕鏈。 更具體而言，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其包含與SEQ ID NO:96之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:98之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一輕鏈、包含與SEQ ID NO:100之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈及包含與SEQ ID NO:101之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二輕鏈。 在另一態樣中，提供如上文所述的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包括含特異性結合至LAG3之抗原結合結構域的Fab片段，該Fab片段與Fc結構域之C末端融合。 確切地說，提供一種特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其包含與SEQ ID NO:96之序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:98之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一輕鏈、包含與SEQ ID NO:144之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈及包含與SEQ ID NO:101之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二輕鏈。 在另一態樣中，提供如上文所述的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包括包含特異性結合至LAG3之抗原結合結構域的第三Fab片段。在一個態樣中，提供一種雙特異性抗體，其中各自包含特異性結合至LAG3之抗原結合結構域的兩個Fab片段係相同的。 在另一態樣中，提供如上文所述的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的Fab片段經由肽連接子與該等重鏈之一的C末端融合。 在一個特定態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其包括 (a) 包含與SEQ ID NO:118之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:115之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一輕鏈， 包含與SEQ ID NO:119之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈，及包含與SEQ ID NO:101之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條第二輕鏈，或 (b) 包含與SEQ ID NO:120之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:115之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一輕鏈， 包含與SEQ ID NO:121之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈，及包含與SEQ ID NO:99之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條第二輕鏈，或 (c) 包含與SEQ ID NO:122之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:115之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一輕鏈， 包含與SEQ ID NO:103之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈，及包含與SEQ ID NO:105之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條第二輕鏈。 在另一態樣中，提供如上文所述的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中包含特異性結合至LAG3之抗原結合結構域的該等Fab片段之一經由肽連接子與該等重鏈之一之C末端融合。 在一個特定態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其包含與SEQ ID NO:96之序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:98之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一輕鏈、包含與SEQ ID NO:145之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈，及包含與SEQ ID NO:101之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條第二輕鏈。 在另一態樣中，提供如上文所述的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包括包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的第四Fab片段。在一個態樣中，提供一種雙特異性抗體，其中各自包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的兩個Fab片段係相同的。 在另一態樣中，提供如上文所述的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中各自包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的兩個Fab片段各自分別經由肽連接子與該等重鏈之一之C末端融合。 在一個特定態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其包括 (a) 各自包含與SEQ ID NO:114之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條重鏈、各自包含與SEQ ID NO:115之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條第一輕鏈及各自包含與SEQ ID NO:101之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條第二輕鏈，或 (b) 各自包含與SEQ ID NO:116之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條重鏈、各自包含與SEQ ID NO:115之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條第一輕鏈及各自包含與SEQ ID NO:99之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條第二輕鏈，或 (c) 各自包含與SEQ ID NO:117之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條重鏈、各自包含與SEQ ID NO:115之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條第一輕鏈及包含與SEQ ID NO:105之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條第二輕鏈。 在又另一個態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包括Fc結構域、各自包含特異性結合至LAG3之抗原結合結構域的兩個Fab片段及包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的單鏈Fab(scFab)。確切地說，包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的scFab經由肽連接子與該等重鏈之一之C末端融合。 在一個特定態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其包括 (a) 包含與SEQ ID NO:123之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:119之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈及各自包含與SEQ ID NO:101之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條輕鏈，或 (b) 包含與SEQ ID NO:124之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:121之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈及各自包含與SEQ ID NO:99之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條輕鏈，或 (c) 包含與SEQ ID NO:125之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:103之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈及包含與SEQ ID NO:105之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二輕鏈。 在又另一個態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包括Fc結構域、各自包含特異性結合至LAG3之抗原結合結構域的兩個Fab片段以及包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的VH及VL結構域。在一個態樣中，該包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的VH結構域經由肽連接子與該等重鏈之一的C末端融合且該包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的VL結構域經由肽連接子與另一個重鏈之C末端融合。在一個特定態樣中，提供一種雙特異性抗體，其包括包含與SEQ ID NO:126之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:127之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈及各自包含與SEQ ID NO: 109之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條輕鏈。 根據本發明之另一態樣，提供一種編碼如上文所述之雙特異性抗體的聚核苷酸。本發明進一步提供一種包含本發明之聚核苷酸的載體，特別是表現載體，及包含本發明之聚核苷酸或載體的原核或真核宿主細胞。在一些實施例中，宿主細胞係真核生物細胞，特別是哺乳動物細胞。 在另一態樣中，提供一種用於製造如本文中所描述的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域之雙特異性抗體的方法，其包含以下步驟：a)用包含編碼該雙特異性抗體之聚核苷酸的載體轉型宿主細胞，b)在適於表現該雙特異性抗體之條件下培養該宿主細胞及c)自培養物回收該雙特異性抗體。本發明亦涵蓋由本發明之方法製造的雙特異性抗體。 本發明進一步提供一種醫藥組合物，其包含如本文中所描述的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。 本發明亦涵蓋如本文中所描述的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，或包含該雙特異性抗體之醫藥組合物，其係用作藥物。 在另一態樣中，本發明提供如本文中所描述的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，或包含該雙特異性抗體之醫藥組合物，其係用於 i)調節免疫反應，諸如恢復T細胞活性， ii)刺激免疫反應或功能， iii)治療感染， iv)治療癌症， v)延遲癌症進展， vi)延長罹患癌症之患者的存活期。 在一個態樣中，提供如本文中所描述的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，或包含該雙特異性抗體之醫藥組合物，其係用於治療有需要個體之疾病。在一個特定態樣中，本發明提供包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，或包含該雙特異性抗體之醫藥組合物，其係用於治療癌症。在另一特定態樣中，提供包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，或包含該雙特異性抗體之醫藥組合物，其係用於調節免疫反應。在另一態樣中，提供包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，或包含該雙特異性抗體之醫藥組合物，其係用於治療慢性病毒感染。 本發明亦提供如本文中所描述的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，或包含該雙特異性抗體之醫藥組合物，其係用於預防或治療癌症，其中該雙特異性抗體係與化學治療劑、放射及/或用於癌症免疫療法中之其他藥劑組合投與。在一個特定態樣中，提供如本文中所描述的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，或包含該雙特異性抗體之醫藥組合物，其係用於預防或治療癌症，其中該雙特異性抗體係與抗CEA/抗CD3雙特異性抗體組合投與。 亦提供如本文中所描述的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域之雙特異性抗體的用途，其係用於製造供治療有需要個體之疾病用的藥物，特別是用於製造供治療癌症用之藥物；以及治療個體之疾病的方法，該方法包含向該個體投與治療有效量的呈醫藥學上可接受之形式的組合物，該組合物包含如本文中所描述之包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體。在一個特定態樣中，疾病係癌症。在另一特定態樣中，疾病係慢性病毒感染。在另一態樣中，提供一種調節個體之免疫反應的方法，其包含向該個體投與治療有效量的呈醫藥學上可接受之形式的組合物，該組合物包含如本文中所描述的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體。在上述態樣中之任一個中，個體較佳為哺乳動物，特別是人類。 本發明亦提供如本文中所描述的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，或包含該雙特異性抗體之醫藥組合物，其係用於預防或治療癌症，其中該雙特異性抗體係與化學治療劑、放射及/或用於癌症免疫療法中之其他藥劑組合投與。 另外，亦提供一種抑制個體體內腫瘤細胞生長之方法，其包含向個體投與有效量的如本文中所描述之包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體以抑制腫瘤細胞生長。該個體較佳為哺乳動物，特別是人類。
定義 除非另外定義，否則本文所使用之技術及科學術語具有與本發明所屬領域中通常所使用相同之含義。出於解釋本說明書之目的，將應用以下定義且只要合適，以單數形式使用之術語亦將包括複數且反之亦然。 如本文所使用，術語「抗原結合分子」在其最廣泛意義上係指特異性結合抗原決定子的分子。抗原結合分子之實例係抗體、抗體片段及支架抗原結合蛋白。 術語「抗體 」係以最廣義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、單特異性及多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現所需抗原結合活性即可。 如本文所使用，術語「單株抗體 」係指自大體上均質之抗體群獲得的抗體，亦即，除了例如含有天然存在之突變或在單株抗體製劑製備期間產生的可能變異體抗體外，構成該群體之個別抗體係相同的及/或結合相同抗原決定基，該等變異體一般係少量存在。與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑相對，單株抗體製劑中之每一單株抗體係針對抗原上之單一決定子。 如本文所使用，術語「單特異性 」抗體表示具有一或多個結合位點之抗體，該一或多個結合位點各自結合至同一抗原之相同抗原決定基。術語「雙特異性 」意思指抗體能夠特異性結合到至少兩個不同的抗原決定子，例如兩個結合位點各自由結合至不同抗原或結合至同一抗原上之不同抗原決定基的抗體重鏈可變結構域(VH)及抗體輕鏈可變結構域(VL)對形成。此類雙特異性抗體係1+1形式。其他雙特異性抗體形式有2+1形式(包含針對第一抗原或抗原決定基之兩個結合位點及針對第二抗原或抗原決定基之一個結合位點)或2+2形式(包含針對第一抗原或抗原決定基之兩個結合位點及針對第二抗原或抗原決定基之兩個結合位點)。通常，雙特異性抗體包含兩個抗原結合位點，其各自對不同抗原決定子具有特異性。 如本申請案中所使用，術語「價 」表示抗原結合分子中存在指定數目之結合結構域。因此，術語「二價」、「四價」及「六價」分別表示抗原結合分子中存在兩個結合結構域、四個結合結構域及六個結合結構域。根據本發明之雙特異性抗體係至少「二價」的且可以為「三價」或「多價」的(例如「四價」或「六價」)。在一個特定態樣中，本發明之抗體具有兩個或兩個以上結合位點且為雙特異性的。亦即，該等抗體可以為雙特異性的，即使是在存在超過兩個結合位點(亦即，該抗體係三價或多價)情況下。 術語「全長抗體」、「完整抗體」及「完全抗體」在本文中可互換使用，意思指具有與天然抗體結構大體上類似之結構的抗體。「天然抗體 」係指具有不同結構的天然存在之免疫球蛋白分子。舉例而言，天然IgG類抗體係約150,000道爾頓(dalton)之異四聚體醣蛋白，由二硫鍵鍵結之兩條輕鏈及兩條重鏈構成。自N末端至C末端，各重鏈具有可變區(VH)，亦稱為可變重鏈結構域或重鏈重鏈可變結構域，之後為三個恆定結構域(CH1、CH2及CH3)，亦稱為重鏈恆定區。類似地，自N末端至C末端，各輕鏈具有可變區(VL)，亦稱為可變輕鏈結構域或輕鏈可變結構域，之後為輕鏈恆定結構域(CL)，亦稱為輕鏈恆定區。抗體之重鏈可以指定為五種類型之一，該五種類型稱為α (IgA)、δ (IgD)、ε (IgE)、γ (IgG)或μ (IgM)，其中一些可以進一步分成亞型，例如γ1 (IgG1)、γ2 (IgG2)、γ3 (IgG3)、γ4 (IgG4)、α1 (IgA1)及α2 (IgA2)。抗體之輕鏈可以基於其恆定結構域之胺基酸序列指定為兩種類型之一，稱為κ及λ。 「抗體片段 」係指不同於完整抗體的分子，其包含完整抗體中結合完整抗體所結合之抗原之一部分。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2 ；雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、互換Fab片段；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；由抗體片段形成之多特異性抗體及單結構域抗體。關於某些抗體片段之評述，參見Hudson等人，Nat Med 9, 129-134 (2003)。關於scFv片段之評述，參見例如Plückthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 第113卷, Rosenburg及Moore編, Springer-Verlag, New York, 第269-315頁(1994)；亦參見WO 93/16185；及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包含救助受體結合抗原決定基殘基且具有延長之活體內半衰期之Fab及F(ab')2 片段的論述，參見美國專利第5,869,046號。雙功能抗體係具有兩個抗原結合結構域之抗體片段，其可以為二價或雙特異性的，參見例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat Med 9, 129-134 (2003)；及Hollinger等人，Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人，Nat Med 9, 129-134 (2003)中。單結構域抗體係包含抗體之重鏈可變結構域之全部或一部分或輕鏈可變結構域之全部或一部分的抗體片段。在某些實施例中，單結構域抗體係人類單結構域抗體(Domantis, Inc., Waltham, MA；參見例如美國專利第6,248,516 B1號)。此外，抗體片段包含單鏈多肽，其具有VH結構域，亦即能夠與VL結構域一起組裝成功能性抗原結合位點，或VL結構域，亦即能夠與VH結構域一起組裝成功能性抗原結合位點且藉此提供全長抗體之抗原結合特性之特徵。抗體片段可以藉由各種技術製備，包括(但不限於)蛋白質水解消化完整抗體以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌(E. coli)或噬菌體)產生，如本文中所描述。 番木瓜蛋白酶消化完整抗體產生兩個相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，其各自含有重鏈及輕鏈可變結構域以及輕鏈恆定結構域及重鏈之第一恆定結構域(CH1)。因此，如本文所使用，術語「Fab 片段 」係指包括含輕鏈VL結構域及恆定結構域(CL)之輕鏈片段，及重鏈VH結構域及第一恆定結構域(CH1)的抗體片段。Fab'片段與Fab片段之不同之處在於，在包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸之重鏈CH1結構域的羧基末端處添加有幾個殘基。Fab'-SH係恆定結構域之半胱胺酸殘基具有游離硫醇基之Fab'片段。胃蛋白酶處理產生F(ab')2 片段，其具有兩個抗原組合位點(兩個Fab片段)及Fc區之一部分。 術語「互換 Fab 片段 (cross-Fab fragment )」或「xFab片段」或「交換型Fab片段(crossover Fab fragment)」係指重鏈及輕鏈之可變區或恆定區互換之Fab片段。交換型Fab分子可能有兩種不同之鏈組成且其包含在本發明之雙特異性抗體中：一方面，Fab重鏈及輕鏈之可變區交換，亦即，交換型Fab分子包含由輕鏈可變區(VL)及重鏈恆定區(CH1)構成之肽鏈，及由重鏈可變區(VH)及輕鏈恆定區(CL)構成之肽鏈。此交換型Fab分子亦稱為互換Fab(VLVH) 。另一方面，當Fab重鏈及輕鏈之恆定區交換時，交換型Fab分子包含由重鏈可變區(VH)及輕鏈恆定區(CL)構成之肽鏈，及由輕鏈可變區(VL)及重鏈恆定區(CH1)構成之肽鏈。此交換型Fab分子亦稱為互換Fab(CLCH1) 。 「單鏈Fab片段」或「scFab 」係由抗體重鏈可變結構域(VH)、抗體恆定結構域1 (CH1)、抗體輕鏈可變結構域(VL)、抗體輕鏈恆定結構域(CL)及連接子組成之多肽，其中該等抗體結構域及該連接子沿N末端至C末端方向具有以下次序之一：a) VH-CH1-連接子-VL-CL、b) VL-CL-連接子-VH-CH1、c) VH-CL-連接子-VL-CH1或d) VL-CH1-連接子-VH-CL；且其中該連接子係具有至少30個胺基酸，較佳在32與50個之間之胺基酸的多肽。該等單鏈Fab片段經由CL結構域與CH1結構域之間的天然二硫鍵穩定化。此外，此等單鏈Fab分子可經由插入半胱胺酸殘基(例如根據Kabat編號，可變重鏈中之44位及可變輕鏈中之100位)以產生鏈間二硫鍵來進一步穩定化。 「交換型單鏈Fab片段」或「x-scFab 」係由抗體重鏈可變結構域(VH)、抗體恆定結構域1 (CH1)、抗體輕鏈可變結構域(VL)、抗體輕鏈恆定結構域(CL)及連接子組成之多肽，其中該等抗體結構域及該連接子沿N末端至C末端方向具有以下次序之一：a)VH-CL-連接子-VL-CH1及b) VL-CH1-連接子-VH-CL；其中VH與VL共同形成特異性結合至抗原之抗原結合結構域且其中該連接子係具有至少30個胺基酸之多肽。此外，此等x-scFab分子可經由插入半胱胺酸殘基(例如根據Kabat編號，可變重鏈中之44位及可變輕鏈中之100位)以產生鏈間二硫鍵來進一步穩定化。 「單鏈可變片段 ( scFv ) 」係用具有十至約25個胺基酸之短連接肽連接的抗體之重鏈(VH )及輕鏈(VL )可變區之融合蛋白。連接子通常富含甘胺酸以具有可撓性，以及富含絲胺酸或蘇胺酸以具有溶解性，且可將VH 之N末端與VL 之C末端連接，或反之亦然。儘管移除恆定區且引入連接子，但此蛋白質保留初始抗體之特異性。scFv抗體例如描述於Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96中。此外，抗體片段包含單鏈多肽，其具有VH結構域，亦即能夠與VL結構域一起組裝成功能性抗原結合位點，或VL結構域，亦即能夠與VH結構域一起組裝成功能性抗原結合位點且藉此提供全長抗體之抗原結合特性之特徵。 「支架抗原結合蛋白 」係此項技術中已知的，例如已使用纖維結合蛋白及經設計錨蛋白重複蛋白質(DARPins)作為抗原結合結構域之替代支架，參見例如Gebauer及Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics. Curr Opin Chem Biol 13:245-255 (2009)；及Stumpp等人，Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13: 695-701 (2008)。在本發明之一個態樣中，支架抗原結合蛋白係選自由以下組成之群：CTLA-4 (Evibody)；脂質運載蛋白(抗運載蛋白(Anticalin))；蛋白質A衍生之分子，諸如蛋白質A之Z結構域(親和抗體(Affibody))；A結構域(Avimer/Maxibody)；血清轉鐵蛋白(轉移體(trans -body))；經設計之錨蛋白重複蛋白(DARPin)；抗體輕鏈或重鏈之可變結構域(單結構域抗體，sdAb)；抗體重鏈之可變結構域(奈米抗體，aVH)；VNAR 片段；纖維結合蛋白(AdNectin)；C型凝集素結構域(Tetranectin)；新型抗原受體β-內醯胺酶之可變結構域(VNAR 片段)；人類γ-晶狀體球蛋白或泛素(Affilin分子)；人類蛋白酶抑制劑之孔尼茲(kunitz)型結構域，微體(microbody)，諸如來自knottin家族之蛋白質、肽適體及纖維結合蛋白(纖連蛋白(adnectin))。細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4 (Cytotoxic T Lymphocyte-associated Antigen 4，CTLA-4)係主要在CD4+ T細胞上表現之CD28家族受體。其細胞外結構域具有可變結構域樣Ig摺疊。對應於抗體CDR之環可經異源序列取代以賦予不同結合特性。經工程改造成具有不同結合特異性之CTLA-4分子亦稱為Evibody(例如US7166697B1)。Evibody與抗體(例如結構域抗體)之經分離可變區之尺寸大致相同。關於其他詳情，參見Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)。脂質運載蛋白係細胞外蛋白質家族，其轉運小疏水性分子，諸如類固醇、後色膽素、類視黃素及脂質。其具有剛性β片狀二級結構，其在圓錐形結構之開放端具有許多環，其可經工程改造以結合至不同靶抗原。抗運載蛋白之尺寸在160-180個胺基酸之間，且來源於脂質運載蛋白。關於其他詳情，參見Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000)、US7250297B1及US20070224633。親和抗體係來源於金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)之蛋白質A的支架，其可經工程改造以結合至抗原。結構域由具有約58個胺基酸之三螺旋束組成。已藉由表面殘基之隨機突變產生文庫。關於其他詳情，參見Protein Eng. Des. Sel. 2004, 17, 455-462及EP 1641818A1。Avimer係來源於A結構域支架家族之多結構域蛋白質。具有約35個胺基酸之天然結構域呈現確定的二硫鍵鍵結之結構。藉由改組由A結構域家族所展現之天然變化來產生多樣性。關於其他詳情，參見Nature Biotechnology 23(12), 1556 - 1561 (2005)及Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (2007年6月)。轉鐵蛋白係單體血清轉運醣蛋白。轉鐵蛋白可藉由在允許之表面環中插入肽序列工程改造成結合不同靶抗原。經工程改造之轉鐵蛋白支架之實例包括轉移體。關於其他詳情，參見J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)。經設計之錨蛋白重複蛋白(DARPin)係來源於錨蛋白，其為介導整合膜蛋白質與細胞骨架之連接的蛋白質之家族。單一錨蛋白重複係由兩個α螺旋及β轉角組成的具有33個殘基之基元。其可藉由使各重複之第一個α螺旋及β轉角中之殘基隨機突變進行工程改造以使其結合不同靶抗原。可藉由增加模組數目來增加其結合界面(親和力成熟法)。關於其他詳情，參見J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003)；PNAS 100(4), 1700-1705 (2003)；以及J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007)；及US20040132028A1。 單結構域抗體係由單一單體可變抗體結構域組成之抗體片段。首個單結構域係來源於來自駱駝之抗體重鏈可變結構域(奈米抗體或VH H片段)。此外，術語單結構域抗體包括自主人類重鏈可變結構域(aVH)或來源於鯊魚之VNAR 片段。纖維結合蛋白係可經工程改造成結合至抗原之支架。纖連蛋白由III型人類纖維結合蛋白(FN3)之15個重複單元中第10個結構域之天然胺基酸序列之主鏈組成。在β-夾層結構之一端處的三個環可經工程改造成使纖連蛋白能夠特異性識別所關注治療靶。關於其他詳情，參見Protein Eng. Des. Sel. 18, 435- 444 (2005)；US20080139791；WO2005056764；及US6818418B1。肽適體係組合性識別分子，其由含有在活性位點處插入之限制性可變肽環之恆定支架蛋白質，通常為硫氧還蛋白(TrxA)組成。關於其他詳情，參見Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)。微體係來源於長度為25-50個胺基酸的天然存在之微型蛋白質，其含有3-4個半胱胺酸橋，微型蛋白質之實例包括KalataBI及芋螺毒素(conotoxin)及打結素(knottin)。微型蛋白質具有環，其可經工程改造成包括至多25個胺基酸而不影響微型蛋白質之整體摺疊。關於經工程改造之打結素結構域之其他詳情，參見WO2008098796。 與參考分子「結合至相同抗原決定基之抗原結合分子 」係指這樣一種抗原結合分子，其在競爭分析中阻斷參考分子與其抗原之結合達50%或更高百分比，且相反，該參考分子在競爭分析中阻斷該抗原結合分子與其抗原之結合達50%或更高百分比。 如本文所使用，術語「抗原結合結構域 」或「抗原結合位點 」係指抗原結合分子中特異性結合至抗原決定子之部分。更具體而言，術語「抗原結合結構域」係指抗體中包含特異性結合至一部分或全部抗原且與其互補之區域的部分。當抗原較大時，抗原結合分子可僅結合至抗原之特定部分，該部分稱為抗原決定基。抗原結合結構域可由例如一或多個可變結構域(亦稱為可變區)提供。較佳地，抗原結合結構域包含抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH)。在一個態樣中，抗原結合結構域能夠結合至其抗原並阻斷或部分阻斷其功能。特異性結合至PD1或LAG3之抗原結合結構域包括抗體及其片段，如本文中另外定義。此外，抗原結合結構域可以包括支架抗原結合蛋白，例如基於經設計重複蛋白質或經設計重複結構域之結合結構域(參見例如WO 2002/020565)。 如本文所使用，術語「抗原決定子 」與「抗原」及「抗原決定基」同義且係指多肽大分子上與抗原結合部分結合，形成抗原結合部分-抗原複合物的位點(例如連續胺基酸區段或由非連續胺基酸之不同區域構成的構形組態)。有用的抗原決定子可見於例如腫瘤細胞表面上、感染病毒之細胞之表面上、其他病變細胞之表面上、免疫細胞之表面上、游離於血清中及/或細胞外基質(ECM)中。除非另外指示，否則在本文中可用作抗原之蛋白質可以為來自任何脊椎動物來源，包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)的任何天然形式之蛋白質。在特定實施例中，抗原係人類蛋白質。在本文中提及特定蛋白質的情況下，該術語涵蓋「全長」的未處理蛋白質，以及由細胞中之處理得到的任何形式之蛋白質。該術語亦涵蓋該蛋白質之天然存在之變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。 「特異性結合 」意謂結合對於抗原而言具選擇性且可以與非所需或非特異性相互作用相區分。抗原結合分子結合至特定抗原之能力可經由酶聯結免疫吸附分析(ELISA)或熟習此項技術者熟悉之其他技術，例如表面電漿子共振(SPR)技術(在BIAcore儀器上分析)(Liljeblad等人，Glyco J 17, 323-329 (2000))及傳統結合分析(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))量測。在一個實施例中，如例如藉由SPR所量測，抗原結合分子與不相關蛋白質之結合程度係抗原結合分子與抗原之結合的不到約10%。在某些實施例中，結合至抗原之分子的解離常數(Kd)≤ 1 μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM或≤ 0.001 nM (例如10-7 M或更低，例如10-7 M至10-13 M，例如10-9 M至10-13 M)。 「親和力 」或「結合親和力」係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間非共價相互作用強度之總和。除非另外指示，否則如本文所使用，「結合親和力」係指反映結合對(例如抗體與抗原)成員之間的1:1相互作用之固有結合親和力。分子X對其搭配物Y的親和力一般可由解離常數(Kd)表示，解離常數係解離速率常數與締合速率常數(分別係koff及kon)之比率。因此，等效親和力可包含不同速率常數，只要速率常數之比率保持相同即可。可藉由此項技術中已知之常用方法，包括本文所描述之方法來量測親和力。一種用於量測親和力之特定方法係表面電漿子共振(SPR)。 如本文所使用，術語抗體之「高親和力 」係指針對靶抗原之Kd為10− 9 M或更低，或甚至更特定地為10− 10 M或更低的抗體。術語抗體之「低親和力 」係指Kd為10- 8 或更高的抗體。 「親和力成熟 」抗體係指相較於在一或多個高變區(HVR)中不具有一或多個變化之親本抗體，在一或多個高變區中具有此類變化之抗體，此類變化使抗體對抗原之親和力得到改良。 術語「包含特異性結合至 PD1 之 第一抗原結合結構域及特異性結合至 LAG3 之 第二抗原結合結構域的雙特異性抗體 」、「特異性結合PD1及LAG3之雙特異性抗體」、「對PD1及LAG3具有特異性之雙特異性抗原結合分子」或「抗PD1/抗LAG3抗體」在本文中可互換地使用且係指能夠以足夠親和力結合PD1及LAG3之雙特異性抗體，使得該抗體可用作靶向PD1及LAG3之診斷劑及/或治療劑。 術語「PD1 」，亦稱為計劃性細胞死亡蛋白1，係具有288個胺基酸之I型膜蛋白，最先在1992年(Ishida等人，EMBO J., 11 (1992), 3887-3895)描述。PD1係T細胞調控因子之擴展CD28/CTLA-4家族之成員且具有兩個配位體，即PD-L1 (B7-H1，CD274)及PD-L2 (B7-DC，CD273)。該蛋白質之結構包括細胞外IgV結構域，之後為跨膜區及細胞內尾。細胞內尾含有位於基於免疫受體酪胺酸之抑制基元及基於免疫受體酪胺酸之轉換基元中的兩個磷酸化位點，由此表明PD1負調控TCR信號。此情況與配位體結合時SHP-1及SHP-2磷酸酶與PD-1之細胞質尾之結合一致。儘管PD-1不在原生T細胞上表現，但其在T細胞受體(TCR)介導之活化之後上調且在活化T細胞及耗竭T細胞上均觀察到(Agata等人，Int. Immunology 8 (1996), 765-772)。此等耗竭T細胞具有功能異常表型且不能適當地作出響應。儘管PD-1具有相對較寬的表現模式，但其最重要的作用可能係作為T細胞上之共抑制受體(Chinai等人，Trends in Pharmacological Sciences 36 (2015), 587-595)。因此，當前的治療方法集中在阻斷PD-1與其配位體之相互作用以增強T細胞反應。術語「計劃性死亡1」、「計劃性細胞死亡1」、「蛋白質PD-1」、「PD-1」、「PD1」、「PDCD1」、「hPD-1」及「hPD-I」可互換使用且包括人類PD-1之變異體、同功異型物、物種同源物及具有至少一個與PD-1共同之抗原決定基的類似物。人類PD1之胺基酸序列展示於UniProt (www.uniprot.org)登錄號Q15116 (SEQIDNO:128)中。 術語「抗 PD1 抗體 」及「包含結合至PD1之抗原結合結構域的抗體」係指能夠以足夠親和力結合PD1，尤其是細胞表面上表現之PD1多肽的抗體，使得該抗體可用作靶向PD1之診斷劑及/或治療劑。在一個態樣中，如例如藉由放射免疫分析(RIA)或流式細胞測量術(FACS)或藉由表面電漿子共振分析，使用生物感測器系統，諸如Biacore®系統所量測，抗PD1抗體與不相關之非PD1蛋白質的結合程度係該抗體與PD1之結合的不到約10%。在某些態樣中，結合至人類PD1之抗原結合蛋白具有的有關結合至人類PD1之結合親和力的KD 值≤1 μM、≤100 nM、≤10 nM、≤1 nM、≤0.1 nM、≤0.01 nM或≤0.001 nM(例如10- 8 M或更低，例如10- 8 M至10- 13 M，例如10- 9 M至10- 13 M)。在一個較佳實施例中，在使用人類PD1之細胞外結構域(ECD) (PD1-ECD)針對PD1結合親和力進行之表面電漿子共振分析中測定各別結合親和力KD 值。術語「抗PD1抗體」亦涵蓋能夠結合PD1及第二抗原之雙特異性抗體。 除非另外指示，否則如本文所使用，術語「LAG3 」或「Lag-3」或「淋巴細胞活化基因-3」或「CD223」係指來自任何脊椎動物來源，包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)的任何天然LAG3。該術語涵蓋「全長」、未處理之LAG3以及由在細胞中處理得到的任何形式之LAG3。該術語亦涵蓋LAG3之天然存在之變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。在一個較佳實施例中，術語「LAG3」係指人類LAG3。例示性經處理(不含信號序列)LAG3的胺基酸序列顯示於SEQ ID NO:73中。例示性細胞外結構域(ECD) LAG3之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO:74中。 術語「抗LAG3抗體」及「結合至LAG3之抗體」係指能夠以足夠親和力結合LAG3之抗體，使得該抗體可用作靶向LAG3之診斷劑及/或治療劑。在一個態樣中，如例如藉由放射免疫分析(RIA)所量測，抗LAG3抗體與不相關之非LAG3蛋白質之結合程度係該抗體與LAG3之結合的不到約10%。在某些實施例中，結合至LAG3之抗體的解離常數(Kd)≤ 1μM、 ≤ 100 nM、 ≤ 10 nM、 ≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM或≤ 0.001 nM (例如10-8 M或更低，例如10-8 M至10-13 M，例如10-9 M至10-13 M)。在某些態樣中，抗LAG3抗體結合至LAG3中在來自不同物種之LAG3間保守的抗原決定基。在一個較佳實施例中，「抗LAG3抗體」、「特異性結合至人類LAG3之抗體」及「結合至人類LAG3之抗體」係指以KD 值為1.0×10- 8 mol/l或更低，在一個實施例中KD 值為1.0×10- 9 mol/l或更低，在一個實施例中KD 值為1.0×10- 9 mol/l至1.0×10- 13 mol/l之結合親和力特異性結合至人類LAG3抗原或其細胞外結構域(ECD)的抗體。在此情形中，結合親和力係用標準結合分析，諸如表面電漿子共振技術(BIAcore®，GE-Healthcare Uppsala, Sweden)，例如使用LAG3細胞外結構域測定。術語「抗LAG3抗體」亦涵蓋能夠結合LAG3及第二抗原之雙特異性抗體。 「阻斷 」抗體或「拮抗劑」抗體係抑制或降低其所結合之抗原之生物活性的抗體。在一些實施例中，阻斷抗體或拮抗劑抗體大體上或完全抑制抗原之生物活性。舉例而言，本發明之雙特異性抗體阻斷經由PD-1及LAG3進行之信號傳導，以便使T細胞自功能異常狀態恢復針對抗原刺激之功能反應(例如增殖、細胞介素產生、靶細胞殺滅)。 術語「可變區 」或「可變結構域」係指抗體重鏈或輕鏈中參與抗原結合分子與抗原之結合的結構域。天然抗體之重鏈及輕鏈可變結構域(分別為VH及VL)一般具有類似的結構，且每個結構域包含四個保守構架區(FR)及三個高變區(HVR)。參見例如，Kindt等人，Kuby Immunology, 第6版, W.H. Freeman and Co., 第91頁 (2007)。單一VH或VL結構域可足以賦予抗原結合特異性。 如本文所使用，術語「高變區 」或「HVR」係指抗體可變結構域中在序列上具有高變性及/或形成結構確定之環(「高變環」)的各區域。一般而言，天然四鏈抗體包含六個HVR；三個位於VH中(H1、H2、H3)，且三個位於VL中(L1、L2、L3)。HVR一般包含來自高變環及/或來自「互補決定區」(CDR)之胺基酸殘基，後者具有最高的序列可變性及/或與抗原識別相關。例示性高變環出現在胺基酸殘基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)及96-101 (H3)處。(Chothia及Lesk,J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)。) 例示性CDR (CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)出現在L1之胺基酸殘基24-34、L2之胺基酸殘基50-56、L3之胺基酸殘基89-97、H1之胺基酸殘基31-35B、H2之胺基酸殘基50-65及H3之胺基酸殘基95-102處。(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)。) 高變區(HVR)亦稱為互補決定區(CDR)，且此等術語在本文中在提及形成抗原結合區之可變區之一部分時可互換使用。此特定區域在Kabat等人，U.S. Dept. of Health and Human Services, 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」 (1983)及Chothia等人，J. Mol. Biol . 196:901-917 (1987)中有描述，，其中在相互比較時，該等定義包括胺基酸殘基之重疊或亞群。然而，涉及抗體或其變異體之CDR之任何定義的應用意欲在如本文中所定義及所使用之術語的範圍內。涵蓋如上文所引用之參考文獻中之每一者所定義之CDR的適當胺基酸殘基闡述於下表A中作為比較。涵蓋特定CDR的確切殘基數目將取決於CDR之序列及大小而變化。在已知抗體可變區胺基酸序列的情況下，熟習此項技術者可以按常規方式確定哪些殘基包含特定CDR。 表A. CDR定義1
CDR Kabat Chothia AbM2
VH CDR1 31-35 26-32 26-35
VH CDR2 50-65 52-58 50-58
VH CDR3 95-102 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32 24-34
VL CDR2 50-56 50-52 50-56
VL CDR3 89-97 91-96 89-97
1 表A中所有CDR定義之編號皆依據Kabat等人所闡述之編號慣例(參見下文)。2 如表A中所使用的含有小寫字母「b」的「AbM」係指如藉由Oxford Molecular之「AbM」抗體建模軟體所定義的CDR。 Kabat等人亦定義適用於任何抗體的可變區序列編號系統。一般熟習此項技術者可以對任何可變區序列明確地指定此「Kabat編號」系統，而無需超過該序列本身的任何實驗資料。如本文所使用，「Kabat編號」係指Kabat等人，U.S. Dept. of Health and Human Services, 「Sequence of Proteins of Immunological Interest」 (1983)所闡述之編號系統。除非另外說明，否則提及的抗體可變區中特定胺基酸殘基位置之編號係根據Kabat編號系統。 除VH中之CDR1以外，CDR一般包含形成高變環之胺基酸殘基。CDR亦包含「特異性決定殘基」或「SDR」，其為接觸抗原之殘基。SDR包含在簡稱為-CDR或a-CDR之CDR區域內。例示性a-CDR (a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2及a-CDR-H3)出現在L1之胺基酸殘基31-34、L2之胺基酸殘基50-55、L3之胺基酸殘基89-96、H1之胺基酸殘基31-35B、H2之胺基酸殘基50-58及H3之胺基酸殘基95-102處。(參見Almagro及Fransson,Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)。) 除非另外指示，否則可變結構域中之HVR殘基及其他殘基(例如FR殘基)在本文中係根據Kabat等人編號。 「構架 」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基以外的可變結構域殘基。可變結構域之FR一般由四個FR結構域組成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，HVR及FR序列一般按以下順序出現在VH (或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。 出於本文之目的，「接受體人類構架 」係包含來源於如以下所定義的人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之輕鏈可變結構域(VL)構架或重鏈可變結構域(VH)構架之胺基酸序列的構架。「來源於」人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之接受體人類構架可包含人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之相同胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中，胺基酸變化之數目係10個或更少、9個或更少、8個或更少、7個或更少、6個或更少、5個或更少、4個或更少、3個或更少，或2個或更少。在一些實施例中，VL接受體人類構架之序列與VL人類免疫球蛋白構架序列或人類共同構架序列一致。 術語「嵌合 」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分來源於特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈之其餘部分來源於不同來源或物種之抗體。 抗體之「類別 」係指其重鏈所具有之恆定結構域或恆定區的類型。存在五個主要類別之抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中有數種可進一步分成亞類(同型)，例如IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 及IgA2 。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。 「人類化 」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含至少一個且通常兩個可變結構域之大體上全部，其中全部或大體上全部HVR (例如CDR)皆對應於非人類抗體之HVR，且全部或大體上全部FR皆對應於人類抗體之FR。人類化抗體視情況可包含來源於人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。抗體(例如非人類抗體)之「人類化形式 」係指已經歷人類化之抗體。本發明涵蓋之「人類化抗體」之其他形式係恆定區已自原始抗體之恆定區另外修飾或變化以產生根據本發明之特性，尤其是C1q結合及/或Fc受體(FcR)結合方面的抗體。 「人類 」抗體係胺基酸序列對應於由人類或人類細胞產生或來源於利用人類抗體譜系或其他人類抗體編碼序列之非人類來源之抗體之胺基酸序列的抗體。人類抗體之此定義特別排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。 如本文所使用，術語「單株抗體 」係指自大體上均質之抗體群獲得的抗體，亦即，除了例如含有天然存在之突變或在單株抗體製劑製備期間產生的可能變異體抗體外，構成該群體之個別抗體係相同的及/或結合相同抗原決定基，該等變異體一般以少量存在。與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑相對，單株抗體製劑中之每一單株抗體係針對抗原上之單一決定子。因此，修飾語「單株」指示抗體之性質係自大體上均質之抗體群體獲得，且不應解釋為需要藉由任何特定方法製備該抗體。舉例而言，根據本發明使用之單株抗體可藉由多種技術製備，包括(但不限於)融合瘤方法、重組DNA方法、噬菌體呈現方法，及利用含有全部或部分人類免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物的方法，該等方法及用於製備單株抗體之其他例示性方法在本文中有描述。 術語「Fc結構域」或「Fc 區 」在本文中用於定義抗體重鏈中含有恆定區之至少一部分的C末端區。該術語包括天然序列Fc區及變異Fc區。特定言之，人類IgG重鏈Fc區自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基末端。不過，Fc區之C末端離胺酸(Lys447)可存在或可不存在。重鏈胺基酸序列始終存在C末端離胺酸，不過，不含C末端離胺酸之變異體亦包括在本發明中。 IgG Fc區包含IgG CH2及IgG CH3結構域。人類IgG Fc區之「CH2結構域」通常自約231位之胺基酸殘基延伸至約340位之胺基酸殘基。在一個實施例中，碳水化合物鏈連接至CH2結構域。在本文中，CH2結構域可為天然序列CH2結構域或變異CH2結構域。「CH3結構域」包含Fc區中殘基C末端至CH2結構域之區段(亦即，自IgG之約341位之胺基酸殘基至約447位之胺基酸殘基)。在本文中，CH3區域可以為天然序列CH3結構域或變異CH3結構域(例如在一條鏈中引入「突起」(「節」)且在另一條鏈中相應地引入「空腔」(「孔」)之CH3結構域；參見美國專利第5,821,333號，該案明確地以引用之方式併入本文中)。此類變異CH3結構域可以用於促進如本文中所描述之兩個不一致抗體重鏈之雜二聚化。除非本文另外說明，否則Fc區或恆定區中胺基酸殘基之編號係依據EU編號系統，亦稱為EU索引，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版,  Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991中所描述。 「孔中節 (knob - into - hole )」技術描述於例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng 9, 617-621 (1996)；及Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)中。一般而言，該方法包括在第一多肽之界面處引入突起(「節」)及在第二多肽之界面處引入相應空腔(「孔」)，由此突起可以安置於空腔中以促進雜二聚體形成且阻礙同二聚體形成。突起係藉由用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)置換第一多肽界面中之小胺基酸側鏈構築。大小與突起相同或相似的補償性空腔係在第二多肽之界面中藉由用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換大胺基酸側鏈而產生。突起及空腔可例如藉由位點特異性突變誘發或藉由肽合成改變編碼多肽之核酸來產生。在一個特定實施例中，節修飾包含在Fc結構域兩個次單元之一中的胺基酸取代T366W，且孔修飾包含在Fc結構域兩個次單元中之另一個中的胺基酸取代T366S、L368A及Y407V。在另一特定實施例中，包含節修飾之Fc結構域次單元另外包含胺基酸取代S354C，且包含孔修飾之Fc結構域次單元另外包含胺基酸取代Y349C。引入此等兩個半胱胺酸殘基使得Fc區之兩個次單元之間形成二硫橋，由此使二聚體進一步穩定(Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001))。 「與免疫球蛋白Fc區等效之區域」意欲包括免疫球蛋白Fc區之天然存在之對偶基因變異體以及具有變化之變異體，該等變化產生取代、添加或缺失，但不會實質上降低免疫球蛋白介導效應功能(諸如抗體依賴性細胞毒性)之能力。舉例而言，免疫球蛋白Fc區之N末端或C末端可缺失一或多個胺基酸而不會明顯損失生物功能。此類變異體可根據此項技術中已知之通用規則選擇以對活性具有最小影響(參見例如，Bowie, J. U.等人，Science 247:1306-10 (1990))。 術語「效應功能 」係指可歸於抗體Fc區之生物活性，該等活性隨抗體同型而變化。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、細胞介素分泌、免疫複合物介導的抗原呈現細胞之抗原吸收、細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調及B細胞活化。 「活化 Fc 受體 」係這樣一種Fc受體，其在與抗體Fc區接合之後，引發信號傳導事件，由此刺激帶有該受體之細胞執行效應功能。活化Fc受體包括FcγRIIIa (CD16a)、FcγRI (CD64)、FcγRIIa (CD32)及FcαRI (CD89)。特定活化Fc受體係人類FcγRIIIa (參見UniProt登錄號P08637，141版)。 術語「肽連接子 」係指包含一或多個胺基酸，通常約2至20個胺基酸的肽。肽連接子係此項技術中已知的或描述於本文中。適合非免疫原性連接肽係例如(G4 S)n 、(SG4 )n 或G4 (SG4 )n 肽連接子，其中「n」一般係介於1與10之間，通常介於2與4之間之數字，特定言之為2，亦即，該等肽選自由以下組成之群：GGGGS (SEQ ID NO:129)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:130)、SGGGGSGGGG (SEQ ID NO:131)及GGGGSGGGGSGGGG (SEQ ID NO:132)，而且還包括序列GSPGSSSSGS (SEQ ID NO:133)、(G4S)3 (SEQ ID NO:134)、(G4S)4 (SEQ ID NO:135)、GSGSGSGS (SEQ ID NO:136)、GSGSGNGS (SEQ ID NO:137)、GGSGSGSG (SEQ ID NO:138)、GGSGSG (SEQ ID NO:139)、GGSG (SEQ ID NO:140)、GGSGNGSG (SEQ ID NO:141)、GGNGSGSG (SEQ ID NO:142)及GGNGSG (SEQ ID NO:143)。特別值得關注之肽連接子有(G4S) (SEQ ID NO:129)、(G4 S)2 或GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:130)、(G4S)3 (SEQ ID NO:134)及(G4 S)4 (SEQ ID NO:135)，更特定言之，(G4 S)2 或GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:130)。 「與……融合」或「連接至」意謂，各組分(例如抗原結合結構域及Fc結構域)係直接或經由一或多個肽連接子藉由肽鍵連接。 如本申請案內所使用的術語「胺基酸 」表示天然存在之羧基α-胺基酸之群，其包含丙胺酸(三字母代碼：ala，單字母代碼：A)、精胺酸(arg，R)、天冬醯胺(asn，N)、天冬胺酸(asp，D)、半胱胺酸(cys，C)、麩醯胺酸(gln，Q)、麩胺酸(glu，E)、甘胺酸(gly，G)、組胺酸(his，H)、異白胺酸(ile，I)、白胺酸(leu，L)、離胺酸(lys，K)、甲硫胺酸(met，M)、苯丙胺酸(phe，F)、脯胺酸(pro，P)、絲胺酸(ser，S)、蘇胺酸(thr，T)、色胺酸(trp，W)、酪胺酸(tyr，Y)及纈胺酸(val，V)。 “相對於參考多肽(蛋白質)序列之「胺基酸序列一致性百分比 (%) 」定義為在比對序列且視需要引入空位以達成最大序列一致性百分比之後，且在不將任何保守性取代視為序列一致性之一部分的情況下，候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致的胺基酸殘基之百分比。用於測定胺基酸序列一致性百分比之比對可以使用在此項技術之技能範圍內的多種方法，例如使用公開可得之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN. SAWI或Megalign (DNASTAR)軟件實現。熟習此項技術者可以確定用於比對序列之適當參數，包括在所比較序列之全長內達成最大對準所需的任何算法。然而，出於本文之目的，胺基酸序列一致性%值係使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生。ALIGN-2序列比較電腦程式係由Genentech, Inc.創造，且原始程式碼與使用說明書已提交美國版權局(U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559)，其中其係以美國版權登記號TXU510087登記。ALIGN-2程式可自Genentech, Inc., South San Francisco, California公開得到，或可由原始程式碼編寫。ALIGN-2程式應編譯成在UNIX操作系統，包括數位UNIX V4.0D上使用。所有序列比較參數均由ALIGN-2程式設定且不變化。在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情形中，給定胺基酸序列A相對於、與或針對給定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性% (或者，其可表述為相對於、與或針對給定胺基酸序列B具有或包含一定胺基酸序列一致性%的給定胺基酸序列A)性如下計算： 100乘以X/Y之分數 其中X係在用該程式比對A與B時由序列比對程程式ALIGN-2評為一致匹配之胺基酸殘基之數目，且其中Y係B中胺基酸殘基之總數。應瞭解，在胺基酸序列A之長度與胺基酸序列B之長度不相等之情況下，A相對於B之胺基酸序列一致性%與B相對於A之胺基酸序列一致性%係不相等的。除非另外具體陳述，否則本文所用之所有胺基酸序列一致性%值係如剛剛在前一段中所述，使用ALIGN-2電腦程式獲得。 在某些態樣中，涵蓋本文中提供的本發明之雙特異性抗體的胺基酸序列變異體 。舉例而言，可能需要改善雙特異性抗體之結合親和力及/或其他生物特性。雙特異性抗體之胺基酸序列變異體可藉由將適當修飾引入編碼該等分子之核苷酸序列中，或藉由肽合成製備。此類修飾包括例如抗體胺基酸序列內殘基之缺失及/或插入及/或取代。可以進行缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構築體，只要最終構築體具有所需特徵，例如抗原結合即可。用於取代性突變誘發之所關注位點包括HVR及構架(FR)。保守性取代提供於表B中標題「較佳取代」之下且在下文中參照胺基酸側鏈類別(1)至(6)進一步描述。可以將胺基酸取代引入所關注分子中並針對所需活性，例如抗原結合之保留/改善、降低之免疫原性或改善之ADCC或CDC篩選產物。 表B
原始殘基 例示性取代 較佳取代
Ala (A) Val；Leu；Ile Val
Arg (R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn (N) Gln；His；Asp；Lys；Arg Gln
Asp (D) Glu；Asn Glu
Cys (C) Ser；Ala Ser
Gln (Q) Asn；Glu Asn
Glu (E) Asp；Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile (I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸 Leu
Leu (L) 正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys (K) Arg；Gln；Asn Arg
Met (M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe (F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val；Ser Ser
Trp (W) Tyr；Phe Tyr
Tyr (Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val (V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸 Leu
胺基酸可根據共有側鏈特性進行分組： (1) 疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； (2) 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3) 酸性：Asp、Glu； (4) 鹼性：His、Lys、Arg； (5) 影響鏈取向之殘基：Gly、Pro； (6) 芳族殘基：Trp、Tyr、Phe。 非保守性取代將必然伴有此等類別之一之成員與另一類別之交換。 術語「胺基酸序列變異體 」包括大量的變異體，其中在親本抗原結合分子(例如人類化或人類抗體)之一或多個高變區殘基中存在胺基酸取代。一般而言，所得到的選擇用於進一步研究之變異體與親本抗原結合分子相比將在某些生物特性方面具有改變(例如改善)(例如增加之親和力、降低之免疫原性)及/或將大體上保持親本抗原結合分子之某些生物特性。例示性取代變異體係親和力成熟抗體，其例如宜使用基於噬菌體呈現之親和力成熟技術，諸如本文所述之技術產生。簡言之，使一或多個HVR殘基突變並在噬菌體上呈現變異抗原結合分子，且針對特定生物活性(例如結合親和力)進行篩選。在某些實施例中，一或多個HVR內可存在取代、插入或缺失，只要此類變化不會實質上降低抗原結合分子結合抗原之能力即可。舉例而言，可在HVR中進行不會實質上降低結合親和力之保守性改變(例如，如本文所提供之保守取代)。可用於鑑別可作為突變誘發之靶之抗體殘基或區域的方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」，如Cunningham及Wells (1989)Science , 244:1081-1085所述。在此方法中，鑑別出一個殘基或一組靶殘基(例如帶電殘基，諸如Arg、Asp、His、Lys及Glu)且用中性或帶負電胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)置換以確定抗體與抗原之相互作用是否受到影響。可在對初始取代展現功能敏感性之胺基酸位置處引入其他取代。替代地或另外，用抗原-抗原結合分子複合物之晶體結構鑑別抗體與抗原之間的接觸點。此類接觸殘基及鄰近殘基可作為取代候選物之靶或排除在取代候選物之外。可篩選變異體以確定其是否含有所需特性。 胺基酸序列插入包括長度在一個殘基至含有一百或更多個殘基之多肽範圍內的胺基末端及/或羧基末端融合，以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N末端甲硫胺醯基殘基之雙特異性抗體。分子之其他插入變異體包括N末端或C末端與多肽之融合，此增加雙特異性抗體之血清半衰期。 在某些態樣中，使本文提供之雙特異性抗體改變以增加或降低抗體糖基化之程度。該等分子之糖基化變異體宜藉由改變胺基酸序列以產生或移除一或多個糖基化位點來獲得，例如可以改變連接至Fc結構域之碳水化合物。由哺乳動物細胞產生之天然抗體通常包含分支鏈雙觸角寡醣，其一般藉由N鍵聯連接至Fc區CH2結構域之Asn297。參見例如Wright等人，TIBTECH 15:26-32 (1997). 寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及連接至雙觸角寡醣結構「主幹」中之GlcNAc的岩藻糖。在一些實施例中，可對本發明之雙特異性抗體中的寡醣進行修飾以便產生具有某些改善之特性的變異體。在一個態樣中，提供具有缺乏連接(直接或間接)至Fc區之岩藻糖之碳水化合物結構的雙特異性抗體之變異體。此類岩藻糖基化變異體可具有改善之ADCC功能，參見例如美國專利公開案第US 2003/0157108號(Presta, L.)或US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)。本發明之雙特異性抗體的其他變異體包括具有平分寡醣之變異體，例如其中連接至抗體Fc區之雙觸角寡醣經GlcNAc平分。此類變異體可具有減少之岩藻糖基化及/或改善之ADCC功能，參見例如WO 2003/011878 (Jean-Mairet等人)；美國專利第6,602,684號(Umana等人)；及US 2005/0123546 (Umana等人)。亦提供寡醣中之至少一個半乳糖殘基與Fc區連接之變異體。此類抗體變異體可以具有改善之CDC功能且描述於例如WO 1997/30087 (Patel等人)；WO 1998/58964 (Raju, S.)；及WO 1999/22764 (Raju, S.)中。 在某些態樣中，可能需要產生本發明之雙特異性抗體的半胱胺酸工程改造之變異體 ，例如「thioMAb」，其中該分子之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，經取代之殘基存在於該分子之可達位點處。藉由用半胱胺酸取代此等殘基，由此將反應性硫醇基安置於抗體之可達位點處且可用於使抗體與其他部分，諸如藥物部分或連接子-藥物部分偶聯以產生免疫偶聯物。在某些實施例中，以下殘基中之任一個或多個可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205 (Kabat編號)；重鏈之A118 (EU編號)；及重鏈Fc區之S400 (EU編號)。半胱胺酸工程改造之抗原結合分子可例如美國專利第7,521,541號中所述產生。 在某些態樣中，本文所提供之雙特異性抗體可進一步經修飾以含有此項技術中已知且可容易獲得的額外非蛋白質部分。適合於抗體衍生化之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚1,3-二氧雜環戊烷、聚1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及聚葡萄糖或聚(n-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如丙三醇)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其在水中之穩定性而在製造方面具有優勢。該聚合物可具有任何分子量，且可為分支或未分支的。連接至抗體之聚合物的數目可變化，且若連接多於一個聚合物，則聚合物可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生化之聚合物之數目及/或類型可基於包括(但不限於)待改善之抗體之特定特性或功能、雙特異性抗體衍生物是否將用於限定病況之療法中等考慮因素來確定。 在另一態樣中，提供抗體與可藉由暴露於輻射進行選擇性加熱之非蛋白質部分的偶聯物。在一個實施例中，非蛋白質部分係碳奈米管(Kam, N.W.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605)。輻射可具有任何波長，且包括(但不限於)不損害普通細胞但將非蛋白質部分加熱至殺死抗體-非蛋白質部分附近之細胞之溫度的波長。 「免疫偶聯物 」係抗體與一或多個異源分子，包括(但不限於)細胞毒性劑之偶聯物。 術語「聚核苷酸 」係指分離之核酸分子或構築體，例如信使RNA (mRNA)、病毒源性RNA或質體DNA (pDNA)。聚核苷酸可包含習知磷酸二酯鍵或非習知鍵(例如醯胺鍵，諸如肽核酸(PNA)中所發現的鍵)。術語「核酸分子」係指聚核苷酸中存在的任一個或多個核酸區段，例如DNA或RNA片段。 「分離 」之核酸分子或聚核苷酸意欲指已自天然環境中移出之核酸分子，即DNA或RNA。舉例而言，出於本發明之目的，將編碼載體中所含多肽之重組聚核苷酸視為經分離的。分離之聚核苷酸的其他實例包括異源宿主細胞中所維持的重組聚核苷酸或溶液中的經純化(部分或大體上純化)聚核苷酸。分離之聚核苷酸包括通常含有聚核苷酸分子之細胞中所含的聚核苷酸分子，但該聚核苷酸分子存在於染色體外或與其天然染色體位置不同之染色體位置處。分離之RNA分子包括本發明之活體內或活體外RNA轉錄物，以及正股及負股形式，及雙股形式。根據本發明之分離之聚核苷酸或核酸進一步包括以合成方式產生的此類分子。另外，聚核苷酸或核酸可為或可包括調控元件，諸如啟動子、核糖體結合位點或轉錄終止子。 一種核酸或聚核苷酸的核苷酸序列與本發明之參考核苷酸序列例如至少95%「一致」意指該聚核苷酸之核苷酸序列與參考序列一致，但該聚核苷酸序列相對於參考核苷酸序列可在每100個核苷酸中包括至多五個點突變。換言之，為了獲得核苷酸序列與參考核苷酸序列至少95%一致的聚核苷酸，參考序列中至多5%的核苷酸可缺失或經另一核苷酸取代，或參考序列中可插入佔參考序列核苷酸總數至多5%之數量的核苷酸。參考序列之此等改變可發生在參考核苷酸序列之5'或3'末端位置處或在該等末端位置之間的任何位置，其個別地間雜於參考序列之殘基中或參考序列內的一或多個連續基團中。根據實際情況，通常可以使用已知電腦程式，諸如上文關於多肽所論述之電腦程式(例如ALIGN-2)測定任何特定聚核苷酸序列是否與本發明之核苷酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。 術語「表現卡匣 」係指以重組或合成方式產生之聚核苷酸，其具有允許靶細胞中之特定核酸轉錄的一系列特定核酸元件。重組表現卡匣可併入質體、染色體、粒線體DNA、質體DNA、病毒或核酸片段中。通常，表現載體之重組表現卡匣部分包括待轉錄的核酸序列及啟動子，以及其他序列。在某些實施例中，本發明之表現卡匣包含編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其片段的聚核苷酸序列。 術語「載體 」或「表現載體」與「表現構築體」同義且係指用於引入特定基因且引導該基因表現的DNA分子，該DNA分子與該基因在靶細胞中可操作地連接。該術語包括呈自我複製核酸結構之載體以及併入已引入其之宿主細胞之基因組中的載體。本發明之表現載體包含表現卡匣。表現載體允許大量穩定mRNA發生轉錄。一旦表現載體進入靶細胞內，即藉由細胞轉錄及/或轉譯機構產生由該基因編碼的核糖核酸分子或蛋白質。在一個實施例中，本發明之表現載體包含表現卡匣，該表現卡匣包含編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其片段的聚核苷酸序列。 術語「宿主細胞 」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指已引入外源核酸之細胞，包括此類細胞之後代。宿主細胞包括「轉型體」及「轉型細胞」，其包括原代轉型細胞及由其得到的後代，不考慮傳代次數。後代之核酸含量與母細胞可能不完全相同，而且可能含有突變。本文包括針對原始轉型細胞篩選或選擇的具有相同功能或生物活性之突變後代。宿主細胞係可用於產生本發明之雙特異性抗原結合分子的任何類型之細胞系統。確切地說，宿主細胞係原核或真核宿主細胞。宿主細胞包括培養細胞，例如哺乳動物培養細胞，諸如CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或融合瘤細胞、酵母細胞、昆蟲細胞及植物細胞(僅舉數例)，而且還包括轉殖基因動物、轉殖基因植物或經培養之植物或動物組織內所含的細胞。 藥劑之「有效量 」係指在所投與之細胞或組織中引起生理變化所需的量。 藥劑，例如醫藥組合物之「治療有效量 」係指所需劑量及時間段下有效達成所需治療或預防結果的量。舉例而言，治療有效量之藥劑可消除、減少、延遲、最小化或預防疾病之不良作用。 「個體 」或「受試者」係哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)家養動物(例如牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，諸如猴)、兔及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)。特定言之，個體或受試者係人類。 術語「醫藥組合物 」係指呈允許所含活性成分之生物活性有效發揮之形式的製劑，且其不含對將投與調配物之受試者具有不可接受毒性的其他組分。 「醫藥學上可接受之賦形劑 」係指醫藥組合物中除活性成分以外的對受試者無毒之成分。醫藥學上可接受之賦形劑包括(但不限於)緩衝劑、穩定劑或防腐劑。 術語「藥品說明書 」用以指通常包括在治療性產品之商業包裝中的說明，其含有有關涉及使用此類治療性產品之適應症、用法、劑量、投與、組合療法、禁忌及/或警告的資訊。 如本文所使用，「治療 (treatment)」(及其語法變化形式，諸如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指嘗試改變所治療個體之自然病程的臨床干預，且可以用於預防目的或在臨床病理學過程中進行。所需治療作用包括(但不限於)預防疾病之發生或復發、緩解症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理性結果、預防轉移、降低疾病進展速率、改善或緩和疾病況態，及緩解或改善預後。在一些實施例中，本發明之分子係用於延遲疾病發展或減慢疾病進展。 如本文所使用，術語「癌症 」係指增殖性疾病，諸如淋巴瘤、淋巴球性白血病、肺癌、非小細胞肺(NSCL)癌、支氣管肺泡細胞肺癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭癌或頸癌、皮膚或眼內黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、結腸癌、乳癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌症、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、膀胱癌、腎癌或輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細胞癌、膽道癌、中樞神經系統(CNS)贅瘤、脊軸腫瘤、腦幹神經膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、神經鞘瘤、室管膜瘤、神經管胚細胞瘤、腦膜瘤、鱗狀細胞癌、垂體腺瘤及尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)，包括上述癌症中任一種之難治性形式，或上述癌症中一或多種之組合。本發明之雙特異性抗體 本發明提供新穎雙特異性抗體，其包含特異性結合至計劃性細胞死亡蛋白質1(PD1)之第一抗原結合結構域及特異性結合至淋巴細胞活化基因-3(LAG3)之第二抗原結合結構域且具有特別有利之特性，諸如可製造性、穩定性、結合親和力、生物活性、某些T細胞之特異性靶向、靶向效率及降低之毒性。 在某些態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其在結合至T細胞表面時顯示降低之內化。內化表示當經靶向受體在細胞表面上迅速地再表現以便抑制TCR信號傳導時可以在數小時內降解之分子的重要接收方式。在其他態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其優先結合至習知T細胞而非Treg。此舉係有利的，因為用阻斷抗體靶向Treg上之LAG-3會因增加Treg之抑制功能且最終掩蔽針對其他T細胞之積極阻斷作用而可能不利。在另一態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其能夠挽救T細胞效應功能免受Treg抑制。在另一態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，當如本文所提供之分析中所示，與腫瘤細胞株ARH77共培養時，該雙特異性抗體能夠誘導CD4 T細胞分泌顆粒酶B。在另一態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其顯示增加之腫瘤特異性T細胞效應功能及/或增強T細胞之細胞毒性作用。在另一態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其顯示增加之活體內腫瘤根除作用。A. 結合至 PD1 及 LAG3 之例示性雙特異性抗體 在一個態樣中，本發明提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域包含 VH結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的HVR-H1， (ii) 含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的HVR-H2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的HVR-H3；以及 VL結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的HVR-L1； (ii) 含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的HVR-L2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的HVR-L3。 在一個態樣中，該雙特異性抗體包含Fc結構域，該Fc結構域係IgG，特別是IgG1 Fc結構域或IgG4Fc結構域且其中該Fc結構域具有降低或甚至消除之效應功能。確切地說，該Fc結構域包含一或多個減少與Fc受體，特別是與Fcγ受體之結合的胺基酸取代。 在另一態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包含Fc結構域，該Fc結構域係IgG，特別是IgG1 Fc結構域或IgG4 Fc結構域，且其中該Fc結構域包含一或多個減少與Fc受體，特別是與Fcγ受體之結合的胺基酸取代。 在另一態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域包含 (a) VH結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列的HVR-H1， (ii) 含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列的HVR-H2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列的HVR-H3；以及 VL結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列的HVR-L1， (ii) 含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列的HVR-L2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 19之胺基酸序列的HVR-L3；或 (b) VH結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列的HVR-H1， (ii) 含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列的HVR-H2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列的HVR-H3；以及 VL結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列的HVR-L1， (ii) 含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列的HVR-L2，及 (iii) 含SEQ ID NO:27之胺基酸序列的HVR-L3；或 (c) VH結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列的HVR-H1， (ii) 含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列的HVR-H2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列的HVR-H3；以及 VL結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的HVR-L1， (ii) 含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的HVR-L2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 35之胺基酸序列的HVR-L3；或 (d) VH結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 38之胺基酸序列的HVR-H1， (ii) 含SEQ ID NO: 39之胺基酸序列的HVR-H2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列的HVR-H3；以及 VL結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列的HVR-L1， (ii) 含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列的HVR-L2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列的HVR-L3；或 (e) VH結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列的HVR-H1， (ii) 含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的HVR-H2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的HVR-H3；以及 VL結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列的HVR-L1， (ii) 含SEQ ID NO: 50之胺基酸序列的HVR-L2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 51之胺基酸序列的HVR-L3。 在另一態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域包括 (a) 含SEQ ID NO:7之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:8之胺基酸序列的VL結構域，或 (b) 含SEQ ID NO:9之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:10之胺基酸序列的VL結構域，或 (c) 含SEQ ID NO:9之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:11之胺基酸序列的VL結構域，或 (d) 含SEQ ID NO:9之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:12之胺基酸序列的VL結構域，或 (e) 含SEQ ID NO:9之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:13之胺基酸序列的VL結構域。 在另一態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域包含 (a) VH結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 80之胺基酸序列的HVR-H1， (ii) 含SEQ ID NO: 81之胺基酸序列的HVR-H2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 82之胺基酸序列的HVR-H3；以及 VL結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 83之胺基酸序列的HVR-L1， (ii) 含SEQ ID NO: 84之胺基酸序列的HVR-L2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 85之胺基酸序列的HVR-L3；或 (b) VH結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 88之胺基酸序列的HVR-H1， (ii) 含SEQ ID NO: 89之胺基酸序列的HVR-H2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 90之胺基酸序列的HVR-H3；以及 VL結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的HVR-L1， (ii) 含SEQ ID NO: 92之胺基酸序列的HVR-L2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 93之胺基酸序列的HVR-L3。 在一個態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域包括 (a) 含SEQ ID NO:86之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:87之胺基酸序列的VL結構域，或 (b) 含SEQ ID NO:94之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:95之胺基酸序列的VL結構域。 在另一態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域包括 (a) 含SEQ ID NO:20之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的VL結構域，或 (b) 含SEQ ID NO:28之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:29之胺基酸序列的VL結構域，或 (c) 含SEQ ID NO:36之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:37之胺基酸序列的VL結構域，或 (d) 含SEQ ID NO:44之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:45之胺基酸序列的VL結構域，或 (e) 含SEQ ID NO:52之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:53之胺基酸序列的VL結構域。 在另一態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域包含：VH結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 56之胺基酸序列的HVR-H1， (ii) 含SEQ ID NO: 57之胺基酸序列的HVR-H2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 58之胺基酸序列的HVR-H3；以及 VL結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 59之胺基酸序列的HVR-L1， (ii) 含SEQ ID NO: 60之胺基酸序列的HVR-L2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 61之胺基酸序列的HVR-L3。 在另一態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域包括 (a) 含SEQ ID NO:54之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:55之胺基酸序列的VL結構域，或 (b) 含SEQ ID NO:62之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:63之胺基酸序列的VL結構域，或 (c) 含SEQ ID NO:64之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:65之胺基酸序列的VL結構域，或 (d) 含SEQ ID NO:66之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:67之胺基酸序列的VL結構域。 在一個特定態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中 該特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域包括含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的VL結構域， 且該特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域包括含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列的VL結構域，或含SEQ ID NO:52之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:53之胺基酸序列的VL結構域。 在一個態樣中，本發明之雙特異性抗體包含：特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域，其包括含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的VL結構域；及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域，其包括含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列的VL結構域。 在另一態樣中，本發明之雙特異性抗體包含：特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域，其包括含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的VL結構域；及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域，其包括含SEQ ID NO: 52之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列的VL結構域。 在另一態樣中，本發明之雙特異性抗體包含：特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域，其包括含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的VL結構域；及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域，其包括含SEQ ID NO: 62之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的VL結構域。 在又另一個態樣中，本發明之雙特異性抗體包含：特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域，其包括含SEQ ID NO: 86之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO: 87之胺基酸序列的VL結構域；及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域，其包括含SEQ ID NO: 62之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的VL結構域。 在又另一個態樣中，本發明之雙特異性抗體包含：特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域，其包括含SEQ ID NO: 94之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO: 95之胺基酸序列的VL結構域；及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域，其包括含SEQ ID NO: 62之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的VL結構域。 在另一態樣中，包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體係人類、人類化或嵌合抗體。確切地說，其係人類化或嵌合抗體。 在一個態樣中，包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體係二價的。此意謂雙特異性抗體包含一個特異性結合至PD1之抗原結合結構域及一個特異性結合至LAG3之抗原結合結構域(1+1形式)。 在一個態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包括Fc結構域、包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的第一Fab片段及包含特異性結合至LAG3之抗原結合結構域的第二Fab片段。在一個特定態樣中，在Fab片段之一中，可變結構域VL與VH相互置換，使得VH結構域成為輕鏈之一部分且VL結構域成為重鏈之一部分。在一個特定態樣中，在包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的第一Fab片段中，可變結構域VL與VH相互置換。 在一個特定態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包括 (a) 包含與SEQ ID NO:96之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:98之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一輕鏈， 包含與SEQ ID NO:97之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈，及包含與SEQ ID NO:99之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二輕鏈，或 (b)包含與SEQ ID NO:96之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:98之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一輕鏈， 包含與SEQ ID NO:100之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈，及包含與SEQ ID NO:101之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二輕鏈，或 (c)包含與SEQ ID NO:102之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:104之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一輕鏈， 包含與SEQ ID NO:103之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈，及包含與SEQ ID NO:105之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二輕鏈，或 (d)包含與SEQ ID NO:106之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:107之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一輕鏈， 包含與SEQ ID NO:103之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈，及包含與SEQ ID NO:105之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二輕鏈。 更具體而言，該雙特異性抗體包括 (a) 含SEQ ID NO:96之胺基酸序列的第一重鏈、含SEQ ID NO:98之胺基酸序列的第一輕鏈， 含SEQ ID NO:97之胺基酸序列的第二重鏈，及含SEQ ID NO:99之胺基酸序列的第二輕鏈，或 (b)含SEQ ID NO:96之胺基酸序列的第一重鏈、含SEQ ID NO:98之胺基酸序列的第一輕鏈， 含SEQ ID NO:100之胺基酸序列的第二重鏈，及含SEQ ID NO:101之胺基酸序列的第二輕鏈，或 (c)含SEQ ID NO:102之胺基酸序列的第一重鏈、含SEQ ID NO:104之胺基酸序列的第一輕鏈， 含SEQ ID NO:103之胺基酸序列的第二重鏈，及含SEQ ID NO:105之胺基酸序列的第二輕鏈，或 (d)含SEQ ID NO:106之胺基酸序列的第一重鏈、含SEQ ID NO:107之胺基酸序列的第一輕鏈， 含SEQ ID NO:103之胺基酸序列的第二重鏈，及含SEQ ID NO:105之胺基酸序列的第二輕鏈。 更具體而言，該雙特異性抗體包括含SEQ ID NO:96之胺基酸序列的第一重鏈、含SEQ ID NO:98之胺基酸序列的第一輕鏈、含SEQ ID NO:100之胺基酸序列的第二重鏈及含SEQ ID NO:101之胺基酸序列的第二輕鏈。 在另一態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包括Fc結構域、包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的第一Fab片段及包含特異性結合至LAG3之抗原結合結構域的第二Fab片段，該第二Fab片段與Fc結構域之C末端融合。詳言之，包含特異性結合至LAG3之抗原結合結構域的Fab片段經由其VH結構域與Fc結構域之C末端融合(反式1+1形式)。 在一個特定態樣中，該雙特異性抗體包括包含與SEQ ID NO:96之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:98之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一輕鏈、包含與SEQ ID NO:144之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈及包含與SEQ ID NO:101之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二輕鏈。更具體而言，該雙特異性抗體包括含SEQ ID NO:96之胺基酸序列的第一重鏈、含SEQ ID NO:98之胺基酸序列的第一輕鏈、含SEQ ID NO:144之胺基酸序列的第二重鏈及含SEQ ID NO:101之胺基酸序列的第二輕鏈。 在另一態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包括Fc結構域、包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的第一Fab片段、包含特異性結合至LAG3之抗原結合結構域的第二Fab片段及包含特異性結合至LAG3之抗原結合結構域的第三Fab片段。在一個特定態樣中，包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的Fab片段經由肽連接子與該等重鏈之一之C末端融合。 在此態樣中，該雙特異性抗體係三價的，其中二價結合至LAG3且單價結合至PD1。此意謂該雙特異性抗體包含一個特異性結合至PD1之抗原結合結構域及兩個特異性結合至LAG3之抗原結合結構域(2+1形式)。 在一個特定態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包括 (a)包含與SEQ ID NO:118之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:115之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一輕鏈， 包含與SEQ ID NO:119之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈，及包含與SEQ ID NO:101之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條第二輕鏈，或 (b)包含與SEQ ID NO:120之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:115之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一輕鏈， 包含與SEQ ID NO:121之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈，及包含與SEQ ID NO:99之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條第二輕鏈，或 (c)包含與SEQ ID NO:122之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:115之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一輕鏈， 包含與SEQ ID NO:103之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈，及包含與SEQ ID NO:105之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條第二輕鏈。 更具體而言，該雙特異性抗體包括 (a)包含SEQ ID NO: 118之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO: 115之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO: 119之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO: 101之胺基酸序列的兩條第二輕鏈，或 (b)包含SEQ ID NO: 120之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO: 115之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO: 121之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列的兩條第二輕鏈，或 (c)包含SEQ ID NO: 122之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO: 115之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO: 103之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO: 105之胺基酸序列的兩條第二輕鏈。 在另一態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包括Fc結構域、包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的第一Fab片段、包含特異性結合至LAG3之抗原結合結構域的第二Fab片段及包含特異性結合至LAG3之抗原結合結構域的第三Fab片段，其中該等包含特異性結合至LAG3之抗原結合結構域的Fab片段之一經由肽連接子與該等重鏈之一之C末端融合(反式2+1形式)。 在一個特定態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包括包含與SEQ ID NO:96之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:98之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一輕鏈、包含與SEQ ID NO:145之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈及包含與SEQ ID NO:101之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條第二輕鏈。更具體而言，該雙特異性抗體包括包含與SEQ ID NO:96之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:98之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一輕鏈、包含與SEQ ID NO:145之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈及包含與SEQ ID NO:101之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條第二輕鏈。 在另一態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包括Fc結構域、各自包含特異性結合至LAG3之抗原結合結構域的兩個Fab片段及包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的單鏈Fab(scFab)。確切地說，包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的scFab經由肽連接子與該等重鏈之一之C末端融合。 在一個特定態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包括 (a)包含與SEQ ID NO:123之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:119之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈及各自包含與SEQ ID NO:101之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條輕鏈，或 (b)包含與SEQ ID NO:124之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:121之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈及各自包含與SEQ ID NO:99之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條輕鏈，或 (c)包含與SEQ ID NO:125之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:103之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈及包含與SEQ ID NO:105之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二輕鏈。 更具體而言，該雙特異性抗體包括 (a)包含SEQ ID NO: 123之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO: 119之胺基酸序列之第二重鏈及各自包含SEQ ID NO: 101之胺基酸序列兩條輕鏈，或 (b)各自包含SEQ ID NO: 124之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO: 121之胺基酸序列的第二重鏈及各自包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列的兩條輕鏈，或 (c)包含SEQ ID NO: 125之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO: 103之胺基酸序列之第二重鏈及各自包含SEQ ID NO: 105之胺基酸序列兩條輕鏈。 在另一態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包括Fc結構域、各自包含特異性結合至LAG3之抗原結合結構域的兩個Fab片段以及含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的VH及VL結構域。確切地說，該包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的VH結構域經由肽連接子與該等重鏈之一的C末端融合且該包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的VL結構域經由肽連接子與另一個重鏈之C末端融合。 在一個特定態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包括包含與SEQ ID NO:126之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:127之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈及各自包含與SEQ ID NO: 109之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條輕鏈。更具體而言，該雙特異性抗體包括含SEQ ID NO:126之胺基酸序列的第一重鏈、含SEQ ID NO:127之胺基酸序列的第二重鏈及各自包含SEQ ID NO: 109之胺基酸序列的兩條輕鏈。 在另一態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包括Fc結構域、包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的第一Fab片段、包含特異性結合至LAG3之抗原結合結構域的第二Fab片段、包含特異性結合至LAG3之抗原結合結構域的第三Fab片段及包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的第四Fab片段。 在此態樣中，該雙特異性抗體係四價的，其中二價結合至LAG3且二價結合至PD1。此意謂該雙特異性抗體包含兩個特異性結合至PD1之抗原結合結構域及兩個特異性結合至LAG3之抗原結合結構域(2+2形式)。 在一個態樣中，本發明之雙特異性抗體包括 (a)抗體之兩條輕鏈及兩條重鏈，其包括含特異性結合至LAG3之抗原結合結構域的兩個Fab片段，及 (b)包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的兩個另外的Fab片段，其中該等另外的Fab片段各自經由肽連接子連接至(a)之重鏈的C末端。 在一個特定態樣中，肽連接子係(G4 S)4 。在另一態樣中，該包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的兩個另外的Fab片段係交換型Fab片段，其中可變結構域VL與VH相互置換，且VL-CH鏈各自經由肽連接子連接至(a)之重鏈的C末端。 在一個態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中各自包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的兩個Fab片段各自分別經由肽連接子與該等重鏈之一的C末端融合。 在一個特定態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包括 (a)各自包含與SEQ ID NO:114之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條重鏈、各自包含與SEQ ID NO:115之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條第一輕鏈及各自包含與SEQ ID NO:101之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條第二輕鏈，或 (b)各自包含與SEQ ID NO:116之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條重鏈、各自包含與SEQ ID NO:115之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條第一輕鏈及各自包含與SEQ ID NO:99之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條第二輕鏈，或 (c)各自包含與SEQ ID NO:117之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條重鏈、各自包含與SEQ ID NO:115之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條第一輕鏈及包含與SEQ ID NO:105之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條第二輕鏈。 更具體而言，該雙特異性抗體包括 (a)各自包含SEQ ID NO: 114之胺基酸序列的兩條重鏈、各自包含SEQ ID NO: 115之胺基酸序列的兩條第一輕鏈及各自包含SEQ ID NO: 101之胺基酸序列的兩條第二輕鏈，或 (b)各自包含SEQ ID NO: 116之胺基酸序列的兩條重鏈、各自包含SEQ ID NO: 115之胺基酸序列的兩條第一輕鏈及各自包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列的兩條第二輕鏈，或 (c)各自包含SEQ ID NO: 117之胺基酸序列的兩條重鏈、各自包含SEQ ID NO: 115之胺基酸序列的兩條第一輕鏈及各自包含SEQ ID NO: 105之胺基酸序列的兩條第二輕鏈。降低 Fc 受體結合及 / 或效應功能之 Fc 結構域修飾 在某些態樣中，提供一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包含Fc結構域，該Fc結構域包含一或多個減少與Fc受體，特別是與Fcγ之結合並降低或消除效應功能的胺基酸修飾。 在某些態樣中，可將一或多個胺基酸修飾引入本文所提供之抗體的Fc區中，由此產生Fc區變異體。Fc區變異體可以包括在一或多個胺基酸位置處包含胺基酸修飾(例如取代)的人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。 以下部分描述包含降低Fc受體結合及/或效應功能之Fc結構域修飾的本發明之雙特異性抗原結合分子的較佳態樣。在一個態樣中，本發明係關於一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中該Fc結構域包含一或多個減少與Fc受體，特別是與Fcγ受體之結合的胺基酸取代。特定言之，Fc結構域係屬於人類IgG1亞類，具有胺基酸突變L234A、L235A及P329G (根據Kabat EU索引編號)。 Fc結構域賦予本發明之雙特異性抗體有利的藥物動力學特性，包括較長的血清半衰期，其促進靶組織中之良好積累及有利的組織-血液分佈比。然而，其同時可能使本發明之雙特異性抗體不合需要地靶向表現Fc受體之細胞而非較佳的帶有抗原之細胞。因此，在特定實施例中，相較於天然IgG Fc結構域，特別是IgG1 Fc結構域或IgG4 Fc結構域，本發明雙特異性抗體之Fc結構域展現降低的對Fc結構域之結合親和力及/或降低之效應功能。更具體而言，Fc結構域係IgG1 Fc結構域。 在一個此類態樣中，Fc結構域(或包含該Fc結構域的本發明之雙特異性抗原結合分子)與天然IgG1 Fc結構域(或包含天然IgG1 Fc結構域的本發明之雙特異性抗原結合分子)相比展現低於50%，較佳低於20%，更佳低於10%且最佳低於5%的與Fc受體之結合親和力，及/或與天然IgG1 Fc結構域(或包含天然IgG1 Fc結構域的本發明之雙特異性抗原結合分子)相比低於50%，較佳低於20%，更佳低於10%且最佳低於5%之效應功能。在一個態樣中，Fc結構域(或包含該Fc結構域的本發明之雙特異性抗原結合分子)不會實質上結合至Fc受體及/或誘導效應功能。在一個特定態樣中，Fc受體係Fcγ受體。在一個態樣中，Fc受體係人類Fc受體。在一個態樣中，Fc受體係活化Fc受體。在一個特定態樣中，Fc受體係活化人類Fcγ受體，更特定言之為人類FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特定言之為人類FcγRIIIa。在一個態樣中，Fc受體係抑制性Fc受體。在一個特定態樣中，Fc受體係抑制性人類Fcγ受體，更特定言之為人類FcγRIIB。在一個態樣中，效應功能係CDC、ADCC、ADCP及細胞介素分泌中之一或多種。在一個特定態樣中，效應功能係ADCC。在一個態樣中，Fc結構域對新生兒Fc受體(FcRn)展現的結合親和力與天然IgG1 Fc結構域大體上類似。當Fc結構域(或包含該Fc結構域的本發明之雙特異性抗原結合分子)對FcRn展現的結合親和力為天然IgG1 Fc結構域(或包含天然IgG1 Fc結構域的本發明之雙特異性抗原結合分子)的超過約70%，特定言之超過約80%，更特定言之超過約90%時，實現大體上類似的與FcRn之結合。 在一個特定態樣中，相較於未經工程改造之Fc結構域，Fc結構域經工程改造成具有減小的對Fc受體之結合親和力及/或降低之效應功能。在一個特定態樣中，本發明之雙特異性抗原結合分子的Fc結構域包含一或多個降低Fc結構域與Fc受體之結合親和力及/或效應功能的胺基酸突變。通常，Fc結構域兩個次單元中之每一者中存在相同的一或多個胺基酸突變。在一個態樣中，胺基酸突變使Fc結構域對Fc受體的結合親和力減小。在另一態樣中，胺基酸突變使Fc結構域對Fc受體之結合親和力減小至少2倍、至少5倍或至少10倍。在一個態樣中，相較於包含未經工程改造之Fc結構域的本發明之雙特異性抗體，包含經工程改造之Fc結構域的本發明之雙特異性抗原結合分子展現低於20%，特定言之低於10%，更特定言之低於5%的對Fc受體之結合親和力。在一個特定態樣中，Fc受體係Fcγ受體。在其他態樣中，Fc受體係人類Fc受體。在一個態樣中，Fc受體係抑制性Fc受體。在一個特定態樣中，Fc受體係抑制性人類Fcγ受體，更特定言之為人類FcγRIIB。在一些態樣中，Fc受體係活化Fc受體。在一個特定態樣中，Fc受體係活化人類Fcγ受體，更特定言之為人類FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特定言之為人類FcγRIIIa。較佳地，與此等受體中之每一者的結合減少。在一些態樣中，對補體組分之結合親和力，特別是對C1q之結合親和力亦減小。在一個態樣中，對新生兒Fc受體(FcRn)的結合親和力未減小。當Fc結構域(或包含該Fc結構域的本發明之雙特異性抗原結合分子)對FcRn展現的結合親和力為該Fc結構域之未經工程改造形式(或包含該Fc結構域之未經工程改造形式的本發明之雙特異性抗原結合分子)的70%時，實現與FcRn之大體上類似的結合，亦即該Fc結構域保持與該受體之結合親和力。Fc結構域或包含該Fc結構域的本發明之雙特異性抗原結合分子可以展現超過約80%且甚至超過約90%的此類親和力。在某些實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子的Fc結構域經工程改造成具有相較於未經工程改造之Fc結構域有所降低之效應功能。降低之效應功能可以包括(但不限於)以下一或多種：降低之補體依賴性細胞毒性(CDC)、降低之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、降低之抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、減少之細胞介素分泌、減少的免疫複合物介導之抗原呈現細胞之抗原吸收、減少的與NK細胞之結合、減少的與巨噬細胞之結合、減少的與單核球之結合、減少的與多形核細胞之結合、降低的誘導細胞凋亡之直接信號傳導、降低之樹突狀細胞成熟或降低之T細胞激活。 具有降低之效應功能的抗體包括Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多個經取代的抗體(美國專利第6,737,056號)。此類Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩個或兩個以上處具有取代的Fc突變體，包括殘基265及297取代為丙胺酸的所謂「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。具有增加或減少的與FcR之結合的某些抗體變異體已有描述。(例如美國專利第6,737,056號；WO 2004/056312；及Shields, R.L.等人，J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604)。 在本發明之一個態樣中，Fc結構域包含在位置E233、L234、L235、N297、P331及P329處之胺基酸取代。在一些態樣中，Fc結構域包含胺基酸取代L234A及L235A(「LALA」)。在一個此類實施例中，Fc結構域係IgG1 Fc結構域，特定言之為人類IgG1 Fc結構域。在一個態樣中，Fc結構域包含在位置P329處之胺基酸取代。在一個更特定之態樣中，胺基酸取代係P329A或P329G，特別是P329G。在一個實施例中，Fc結構域包含在位置P329處之胺基酸取代及選自由以下組成之群的另一胺基酸取代：E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在更特定的實施例中，Fc結構域包含胺基酸突變L234A、L235A及P329G (「P329G LALA」)。胺基酸取代之「P329G LALA」組合幾乎完全消除人類IgG1 Fc結構域之Fcγ受體結合，如PCT專利申請案第WO 2012/130831 A1號中所述。該文獻亦描述製備此類突變Fc結構域之方法及用於測定其特性，諸如Fc受體結合或效應功能之方法。此類抗體係具有突變L234A及L235A或具有突變L234A、L235A及P329G之IgG1(根據Kabat等人之EU索引編號，Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991)。 在一個態樣中，本發明之雙特異性抗體包含(所有位置均根據Kabat EU索引) (i)視情況具有突變P329G、L234A及L235A的人類IgG1亞類之同二聚Fc區；或(ii)視情況具有突變P329G、S228P及L235E的人類IgG4亞類之同二聚Fc區；或(iii)視情況具有突變P329G、L234A、L235A、I253A、H310A及H435A或視情況具有突變P329G、L234A、L235A、H310A、H433A及Y436A的人類IgG1亞類之同二聚Fc區；或(iv)雜二聚Fc區，其中一個Fc區多肽包含突變T366W，且另一個Fc區多肽包含突變T366S、L368A及Y407V，或其中一個Fc區多肽包含突變T366W及Y349C，且另一個Fc區多肽包含突變T366S、L368A、Y407V及S354C，或其中一個Fc區多肽包含突變T366W及S354C，且另一個Fc區多肽包含突變T366S、L368A、Y407V及Y349C；或(v)人類IgG1亞類之雜二聚Fc區，其中兩個Fc區多肽包含突變P329G、L234A及L235A，且一個Fc區多肽包含突變T366W，且另一個Fc區多肽包含突變T366S、L368A及Y407V，或其中一個Fc區多肽包含突變T366W及Y349C，且另一個Fc區多肽包含突變T366S、L368A、Y407V及S354C，或其中一個Fc區多肽包含突變T366W及S354C，且另一個Fc區多肽包含突變T366S、L368A、Y407V及Y349C。 在一個態樣中，Fc結構域係IgG4 Fc結構域。在一個更特定之實施例中，Fc結構域係包含在位置S228 (Kabat編號)處之胺基酸取代，特別是胺基酸取代S228P的IgG4 Fc結構域。在一個更特定之實施例中，Fc結構域係包含胺基酸取代L235E及S228P及P329G之IgG4 Fc結構域。此胺基酸取代減少活體內IgG4抗體之Fab臂交換(參見Stubenrauch等人，Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010))。因此，在一個態樣中，提供一種雙特異性抗體，其包含(所有位置均根據Kabat EU索引)人類IgG4亞類之雜二聚Fc區，其中兩個Fc區多肽包含突變P329G、S228P及L235E，且一個Fc區多肽包含突變T366W，且另一個Fc區多肽包含突變T366S、L368A及Y407V，或其中一個Fc區多肽包含突變T366W及Y349C，且另一個Fc區多肽包含突變T366S、L368A、Y407V及S354C，或其中一個Fc區多肽包含突變T366W及S354C，且另一個Fc區多肽包含突變T366S、L368A、Y407V及Y349C。 半衰期延長且與負責將母體IgG轉移至胎兒之新生兒Fc受體(FcRn) (Guyer, R.L.等人，J. Immunol. 117 (1976) 587-593；及Kim, J.K.等人，J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434)之結合改善的抗體描述於US 2005/0014934中。該等抗體包含具有一或多個改善Fc區與FcRn之結合之取代的Fc區。此類Fc變異體包括在以下Fc區殘基中之一或多個處具有取代：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如在Fc區殘基434處具有取代的Fc變異體(美國專利第7,371,826號)。有關Fc區變異體之其他實例，亦參見Duncan, A.R.及Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740；US 5,648,260；US 5,624,821；及WO 94/29351。 可以例如藉由ELISA，或藉由表面電漿子共振(SPR)，使用標準儀器，諸如BIAcore儀器(GE Healthcare)容易地測定與Fc受體的結合，且可諸如藉由重組表現來獲得Fc受體。適合的此類結合分析法描述於本文中。或者，Fc結構域或包含Fc結構域之細胞活化雙特異性抗原結合分子對Fc受體的結合親和力可以使用已知表現特定Fc受體的細胞株，諸如表現FcγIIIa受體之人類NK細胞評價。Fc結構域或包含Fc結構域之本發明之雙特異性抗體的效應功能可藉由此項技術中已知之方法量測。適用於量測ADCC之分析描述於本文中。評估所關注分子之ADCC活性之活體外分析的其他實例描述於美國專利第5,500,362號；Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)；及Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)；美國專利第5,821,337號；Bruggemann等人，J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)。或者，可以採用非放射性分析方法(參見例如用於流動式細胞測量術的ACTI™非放射性細胞毒性分析(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)；及CytoTox 96® 非放射性細胞毒性分析(Promega, Madison, WI))。可用於此類分析之效應細胞包括末梢血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。替代地或另外，可以在活體內，例如在動物模型中，諸如Clynes等人，Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)中所揭示之動物模型中評估所關注分子之ADCC活性。 以下部分描述包含降低Fc受體結合及/或效應功能之Fc結構域修飾的本發明之雙特異性抗體的較佳態樣。在一個態樣中，本發明係關於包含特異性結合PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中Fc結構域包含一或多個降低抗體對Fc受體，特別是對Fcγ受體之結合親和力的胺基酸取代。在另一態樣中，本發明係關於包含特異性結合PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中Fc結構域包含一或多個降低效應功能之胺基酸取代。在特定態樣中，Fc結構域係屬於人類IgG1亞類，具有胺基酸突變L234A、L235A及P329G(根據Kabat EU索引編號)。促進雜二聚化之 Fc 結構域修飾 本發明之雙特異性抗原結合分子包含與Fc結構域兩個次單元之一個或另一個融合的不同抗原結合結構域，由此Fc結構域之兩個次單元可包含在兩個不相同的多肽鏈中。此等多肽之重組共表現及隨後的二聚化產生兩種多肽之若干可能組合。因此，為提高重組製備中本發明之雙特異性抗體的產率及純度，宜在本發明之雙特異性抗原結合分子的Fc結構域中引入促進所需多肽締合之修飾。 因此，在特定態樣中，本發明係關於一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中Fc結構域包含促進Fc結構域之第一與第二次單元締合的修飾。人類IgG Fc結構域之兩個次單元之間最廣泛蛋白質-蛋白質相互作用的位點存在於Fc結構域之CH3結構域中。因此，在一個態樣中，該修飾存在於Fc結構域之CH3結構域中。 在一個特定態樣中，該修飾係所謂的「孔中節」修飾，其包含在Fc結構域兩個次單元之一中的「節」修飾及在Fc結構域兩個次單元中之另一個中的「孔」修飾。因此，本發明係關於一種包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合位點的雙特異性抗體，其中根據孔中節法，Fc結構域之第一次單元包含節且Fc結構域之第二次單元包含孔。在一個特定態樣中，Fc結構域之第一次單元包含胺基酸取代S354C及T366W (EU編號)，且Fc結構域之第二次單元包含胺基酸取代Y349C、T366S及Y407V (根據Kabat EU索引編號)。 孔中節技術描述於例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng 9, 617-621 (1996)；及Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)中。一般而言，該方法包括在第一多肽之界面處引入突起(「節」)及在第二多肽之界面處引入相應空腔(「孔」)，由此突起可以安置於空腔中以促進雜二聚體形成且阻礙同二聚體形成。突起係藉由用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)置換第一多肽界面中之小胺基酸側鏈構築。大小與突起相同或相似的補償性空腔係在第二多肽之界面中藉由用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換大胺基酸側鏈而產生。 因此，在一個態樣中，在本發明之雙特異性抗原結合分子的Fc結構域之第一次單元的CH3結構域中，胺基酸殘基置換為具有較大側鏈體積之胺基酸殘基，由此在第一次單元之CH3結構域內產生突起，該突起可安置於第二次單元之CH3結構域內的空腔中，且在Fc結構域之第二次單元的CH3結構域中，胺基酸殘基置換為具有較小側鏈體積之胺基酸殘基，由此在第二次單元之CH3結構域內產生空腔，第一次單元之CH3結構域內的突起可安置於該空腔中。突起及空腔可例如藉由位點特異性突變誘發或藉由肽合成改變編碼多肽之核酸來產生。在一個特定態樣中，在Fc結構域之第一次單元的CH3結構域中，位置366處之蘇胺酸殘基經色胺酸殘基(T366W)置換，且在Fc結構域之第二次單元的CH3結構域中，位置407處之酪胺酸殘基經纈胺酸殘基(Y407V)置換。在一個態樣中，在Fc結構域之第二次單元中，位置366處之蘇胺酸殘基另外經絲胺酸殘基置換(T366S)且位置368處之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換(L368A)。 在又一態樣中，在Fc結構域之第一次單元中，位置354之絲胺酸殘基另外經半胱胺酸殘基置換(S354C)，且在Fc結構域之第二次單元中，位置349之酪胺酸殘基另外經半胱胺酸殘基置換(Y349C)。引入此等兩個半胱胺酸殘基使得在Fc結構域兩個次單元之間形成二硫橋，使二聚體進一步穩定(Carter (2001), J Immunol Methods 248, 7-15)。在一個特定態樣中，Fc結構域之第一次單元包含胺基酸取代S354C及T366W (EU編號)，且Fc結構域之第二次單元包含胺基酸取代Y349C、T366S及Y407V (根據Kabat EU索引編號)。 替代或另外，亦可使用如EP 1 870 459所描述之其他孔中節技術。在一個實施例中，多特異性抗體在「節鏈」之CH3結構域中包含突變R409D及K370E且在「孔鏈」之CH3結構域中包含突變D399K及E357K(根據Kabat EU索引編號)。 在一個態樣中，該雙特異性抗體在「節鏈」之CH3結構域中包含T366W突變且在「孔鏈」之CH3結構域中包含突變T366S、L368A及Y407V，且另外在「節鏈」之CH3結構域中包含突變R409D及K370E且在「孔鏈」之CH3結構域中包含突變D399K及E357K (根據Kabat EU索引編號)。 在一個態樣中，該雙特異性抗體在兩個CH3結構域之一中包含突變Y349C及T366W，且在兩個CH3結構域中之另一個中包含突變S354C、T366S、L368A及Y407V，或多特異性抗體在兩個CH3結構域之一中包含突變Y349C及T366W，且在兩個CH3結構域中之另一個中包含突變S354C、T366S、L368A及Y407V，且另外在「節鏈」之CH3結構域中包含突變R409D及K370E，且在「孔鏈」之CH3結構域中包含突變D399K及E357K (根據Kabat EU索引編號)。 在一個替代性態樣中，促進Fc結構域之第一與第二次單元締合的修飾包含介導靜電轉向作用之修飾，例如PCT公開案WO 2009/089004中所描述。一般而言，此方法涉及用帶電胺基酸殘基置換兩個Fc結構域次單元之界面處之一或多個胺基酸殘基，使得同二聚體形成在靜電上不利，但同二聚化在靜電上係有利的。 除「孔中節技術」以外，用於修飾多特異性抗體之重鏈的CH3結構域增進雜二聚化的其他技術係此項技術中已知的。本文涵蓋此等技術，尤其是WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954及WO 2013/096291中所描述之技術作為「孔中節技術」之替代方案，與雙特異性抗體組合。 在一個態樣中，在雙特異性抗體中，使用EP 1870459中所描述之方法支持多特異性抗體之第一重鏈與第二重鏈的雜二聚化。此方法係基於在第一與第二重鏈之間的CH3/CH3結構域界面中之特定胺基酸位置處引入帶相反電荷之帶電胺基酸。 因此，在此態樣中，在多特異性抗體之三級結構中，第一重鏈之CH3結構域與第二重鏈之CH3結構域形成界面，該界面位於各別抗體CH3結構域之間，其中第一重鏈之CH3結構域之各別胺基酸序列及第二重鏈之CH3結構域之胺基酸序列各自包含位於抗體三級結構中之該界面內的一組胺基酸，其中來自位於一條重鏈之CH3結構域中之界面中的該組胺基酸之第一胺基酸經帶正電胺基酸取代，且來自位於另一重鏈之CH3結構域中之界面中的該組胺基酸之第二胺基酸經帶負電胺基酸取代。根據此態樣之雙特異性抗體在本文中亦稱為「CH3(+/-)工程改造之雙特異性抗體」(其中縮寫「+/-」表示引入各別CH3結構域中的帶相反電荷之胺基酸)。 在一個態樣中，在CH3(+/-)工程改造之雙特異性抗體中，帶正電胺基酸係選自K、R及H，且帶負電胺基酸係選自E或D。 在一個態樣中，在CH3(+/-)工程改造之雙特異性抗體中，帶正電胺基酸係選自K及R，且帶負電胺基酸係選自E或D。 在一個態樣中，在CH3(+/-)工程改造之雙特異性抗體中，帶正電胺基酸係K，且帶負電胺基酸係E。 在一個態樣中，在CH3(+/-)工程改造之雙特異性抗體中，在一條重鏈之CH3結構域中，位置409處之胺基酸R經D取代且位置370之胺基酸K經E取代，且在另一重鏈之CH3結構域中，位置399處之胺基酸D經K取代且位置357處之胺基酸E經K取代(根據Kabat EU索引編號)。 在一個態樣中，使用WO 2013/157953中所描述之方法支持多特異性抗體之第一重鏈與第二重鏈的雜二聚化。在一個實施例中，在一條重鏈之CH3結構域中，位置366處之胺基酸T經K取代，且在另一重鏈之CH3結構域中，位置351處之胺基酸L經D取代(根據Kabat EU索引編號)。在另一個實施例中，在一條重鏈之CH3結構域中，位置366處之胺基酸T經K取代，且位置351處之胺基酸L經K取代，且在另一重鏈之CH3結構域中，位置351處之胺基酸L經D取代(根據Kabat EU索引編號)。 在另一態樣中，在一條重鏈之CH3結構域中，位置366處之胺基酸T經K取代，且位置351處之胺基酸L經K取代，且在另一重鏈之CH3結構域中，位置351處之胺基酸L經D取代(根據Kabat EU索引編號)。另外，在另一重鏈之CH3結構域中包含以下取代中之至少一個：位置349處之胺基酸Y經E取代、位置349處之胺基酸Y經D取代及位置368處之胺基酸L經E取代(根據Kabat EU索引編號)。在一個實施例中，位置368處之胺基酸L經E取代(根據Kabat EU索引編號)。 在一個態樣中，使用WO 2012/058768中所描述之方法支持多特異性抗體之第一重鏈與第二重鏈的雜二聚化。在一個態樣中，在一條重鏈之CH3結構域中位置351處之胺基酸L經Y取代且位置407處之胺基酸Y經A取代，且在另一重鏈之CH3結構域中位置366處之胺基酸T經A取代且位置409處之胺基酸K經F取代(根據Kabat EU索引編號)。在另一實施例中，除前述取代之外，在另一重鏈之CH3結構域中位置411 (最初為T)、399 (最初為D)、400 (最初為S)、405 (最初為F)、390 (最初為N)及392 (最初為K)之胺基酸中之至少一個經取代(根據Kabat EU索引編號)。較佳取代為： -  位置411處之胺基酸T經選自N、R、Q、K、D、E及W之胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)， -  位置399處之胺基酸D經選自R、W、Y及K之胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)， -  位置400處之胺基酸S經選自E、D、R及K之胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)， -  位置405處之胺基酸F經選自I、M、T、S、V及W之胺基酸取代(根據Kabat EU index編號)； -  位置390處之胺基酸N經選自R、K及D之胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)；及 -  位置392處之胺基酸K經選自V、M、R、L、F及E之胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)。 在另一態樣中，該雙特異性抗體經工程改造(根據WO 2012/058768)，亦即，在一條重鏈之CH3結構域中位置351處之胺基酸L經Y取代且位置407處之胺基酸Y經A取代，且在另一重鏈之CH3結構域中366位置處之胺基酸T經V取代且位置409處之胺基酸K經F取代(根據Kabat EU索引編號)。在多特異性抗體之另一個實施例中，在一條重鏈之CH3結構域中位置407處之胺基酸Y經A取代，且在另一重鏈之CH3結構域中位置366處之胺基酸T經A取代且位置409處之胺基酸K經F取代(根據Kabat EU索引編號)。在前一實施例中，在該另一個重鏈之CH3結構域中，位置392處之胺基酸K經E取代、位置411處之胺基酸T經E取代、位置399處之胺基酸D經R取代且位置400處之胺基酸S經R取代(根據Kabat EU索引編號)。 在一個態樣中，使用WO 2011/143545中所描述之方法支持多特異性抗體之第一重鏈與第二重鏈的雜二聚化。在一個態樣中，兩條重鏈之CH3結構域中的胺基酸修飾係在位置368及/或409處(根據Kabat EU索引編號)引入。 在一個態樣中，使用WO 2011/090762中所描述之方法支持雙特異性抗體之第一重鏈與第二重鏈的雜二聚化。WO 2011/090762係關於根據「孔中節」(KiH)技術進行的胺基酸修飾。在一個實施例中，在一條重鏈之CH3結構域中，位置366處之胺基酸T經W取代，且在另一重鏈之CH3結構域中，位置407處之胺基酸Y經A取代(根據Kabat EU索引編號)。在另一個實施例中，在一條重鏈之CH3結構域中，位置366處之胺基酸T經Y取代，且在另一重鏈之CH3結構域中，位置407處之胺基酸Y經T取代(根據Kabat EU索引編號)。 在一個態樣中，使用WO 2009/089004中所描述之方法支持雙特異性抗體之第一重鏈與第二重鏈的雜二聚化。在一個實施例中，在一條重鏈之CH3結構域中，位置392處之胺基酸K或N經帶負電胺基酸取代(在一個實施例中經E或D取代，在一個較佳實施例中經D取代)，且在另一重鏈之CH3結構域中，位置399處之胺基酸D、位置356處之胺基酸E或D或位置357處之胺基酸E經帶正電胺基酸取代(在一個實施例中經K或R取代，在一個較佳實施例中經K取代，在一個較佳實施例中位置399或356處之胺基酸經K取代)(根據Kabat EU索引編號)。在另一實施例中，除前述取代之外，在一條重鏈之CH3結構域中位置409處之胺基酸K或R經帶負電胺基酸取代(在一個較佳實施例中經E或D取代，在一個較佳實施例中經D取代)(根據Kabat EU索引編號)。在甚至另一態樣中，除上述取代之外或作為上述取代之替代，在一條重鏈之CH3結構域中，位置439處之胺基酸K及/或位置370處之胺基酸K彼此獨立地經帶負電胺基酸取代(在一個實施例中經E或D取代，在一個較佳實施例中經D取代)(根據Kabat EU索引編號)。 在一個態樣中，使用WO 2007/147901中所描述之方法支持多特異性抗體之第一重鏈與第二重鏈的雜二聚化。在一個實施例中，在一條重鏈之CH3結構域中，位置253處之胺基酸K經E取代，位置282處之胺基酸D經K取代，且位置322處之胺基酸K經D取代，且在另一重鏈之CH3結構域中，位置239處之胺基酸D經K取代，位置240處之胺基酸E經K取代且位置292處之胺基酸K經D取代(根據Kabat EU索引編號)。 本文所報導之雙特異性抗體之重鏈的C末端可為以胺基酸殘基PGK結束之完整C末端。重鏈之C末端可為移除一或兩個C末端胺基酸殘基的縮短之C末端。在一個較佳態樣中，重鏈之C末端係以PG結束的縮短之C末端。 在本文所報導之所有態樣的一個態樣中，本文所說明的包括含C末端CH3結構域之重鏈的雙特異性抗體包含C末端甘胺酸-離胺酸二肽(G446及K447，根據Kabat EU索引編號)。在本文所報導之所有態樣的一個實施例中，本文所說明的包括含C末端CH3結構域之重鏈的雙特異性抗體包含C末端甘胺酸殘基(G446，根據Kabat EU索引編號)。Fab 結構域中之修飾 在一個態樣中，本發明係關於一種包含特異性結合至PD1之第一Fab片段一特異性結合至LAG3之第二Fab片段的雙特異性抗體，其中在該等Fab片段之一中，可變結構域VH與VL或恆定結構域CH1與CL交換。該雙特異性抗體係根據Crossmab技術製備。 在一個結合臂中具有結構域置換/交換的多特異性抗體(CrossMabVH-VL或CrossMabCH-CL)詳細地描述於WO2009/080252、WO2009/080253及Schaefer, W.等人，PNAS, 108 (2011) 11187-1191中。其明顯地減少由針對第一抗原之輕鏈與針對第二抗原之錯誤重鏈錯配而造成的副產物(與沒有此類結構域交換之方法相比較)。 在一個特定態樣中，本發明係關於一種包含特異性結合至PD1之第一Fab片段及特異性結合至LAG3之第二Fab片段的雙特異性抗體，其中在該等Fab片段之一中，可變結構域VL與VH相互置換，使得VH結構域成為輕鏈之一部分且VL結構域成為重鏈之一部分。在一個特定態樣中，該雙特異性抗體係這樣一種抗體，其中在包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的第一Fab片段中，可變結構域VL與VH相互置換。 在另一態樣中，且為了進一步改善正確配對，包含特異性結合至PD1之第一Fab片段及特異性結合至LAG3之第二Fab片段的雙特異性抗體可以含有不同的帶電荷胺基酸取代(所謂的「帶電殘基」)。將此等修飾引入互換或未互換之CH1及CL結構域中。該等修飾描述於例如WO2015/150447、WO2016/020309及PCT/EP2016/073408中。 在一個特定態樣中，本發明係關於一種包含特異性結合至PD1之第一Fab片段及特異性結合至LAG3之第二Fab片段的雙特異性抗體，其中在該等Fab片段之一中，在恆定結構域CL中位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat EU索引編號)，且在恆定結構域CH1中位置147及213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。在一個特定態樣中，雙特異性抗體係這樣一種抗體，其中在包含特異性結合至LAG3之抗原結合結構域的第二Fab片段中，恆定結構域CL之位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat EU索引編號)，且在恆定結構域CH1中位置147及213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。 在一個特定態樣中，本發明係關於一種包含特異性結合至PD1之第一Fab片段及特異性結合至LAG3之第二Fab片段的雙特異性抗體，其中在CL結構域之一中位置123(EU編號)處之胺基酸已經精胺酸(R)置換且位置124(EU編號)處之胺基酸已經離胺酸(K)取代，且其中在CH1結構域之一中，位置147 (EU編號)及位置213(EU編號)處之胺基酸已經麩胺酸(E)取代。在一個特定態樣中，該雙特異性抗體係這樣一種抗體，其中在包含特異性結合至LAG3之抗原結合結構域的第二Fab片段中，位置123(EU編號)處之胺基酸已經精胺酸(R)置換且位置124(EU編號)處之胺基酸已經離胺酸(K)取代，且其中在CH1結構域之一中，位置147 (EU編號)及位置213(EU編號)處之胺基酸已經麩胺酸(E)取代 在另一態樣中，雙特異性抗體係一種二價抗體，其包含： a) 特異性結合至第一抗原的抗體之第一輕鏈及第一重鏈，及 b) 特異性結合至第二抗原的抗體之第二輕鏈及第二重鏈，其中該第二輕鏈及該第二重鏈之可變結構域VL與VH相互置換。 a)之抗體不含如b)所報導之修飾，且a)之重鏈與輕鏈係分離之鏈。 在b)之抗體中，在輕鏈內，可變輕鏈結構域VL經該抗體之可變重鏈結構域VH置換，且在重鏈內，可變重鏈結構域VH經該抗體之可變輕鏈結構域VL置換。 在一個態樣中，(i)在a)之第一輕鏈之恆定結構域CL中，位置124 (根據Kabat編號)處之胺基酸經帶正電胺基酸取代，且其中在a)之第一重鏈之恆定結構域CH1中，位置147處之胺基酸或位置213處之胺基酸(根據Kabat EU索引編號)經帶負電胺基酸取代，或(ii)在b)之第二輕鏈之恆定結構域CL中，位置124 (根據Kabat編號)處之胺基酸經帶正電胺基酸取代，且其中在b)之第二重鏈之恆定結構域CH1中，位置147處之胺基酸或位置213處之胺基酸(根據Kabat EU索引編號)經帶負電胺基酸取代。 在另一態樣中，(i)在a)之第一輕鏈之恆定結構域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)(根據Kabat編號)取代(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且其中在a)之第一重鏈之恆定結構域CH1中，位置147處之胺基酸或位置213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)(根據Kabat EU索引編號)取代，或(ii)在b)之第二輕鏈之恆定結構域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)(根據Kabat編號)取代(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且其中在b)之第二重鏈之恆定結構域CH1中，位置147處之胺基酸或位置213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)(根據Kabat EU索引編號)取代。 在一個態樣中，在第二重鏈之恆定結構域CL中，位置124及123處之胺基酸經K取代(根據Kabat EU索引編號)。 在一個態樣中，在第二重鏈之恆定結構域CL中，位置123處之胺基酸經R取代且位置124處之胺基酸經K取代(根據Kabat EU索引編號)。 在一個態樣中，在第二輕鏈之恆定結構域CH1中，位置147及213處之胺基酸經E (根據Kabat EU索引編號)取代。 在一個態樣中，在第一輕鏈之恆定結構域CL中，位置124及123處之胺基酸經K取代，且在第一重鏈之恆定結構域CH1中，位置147及213處之胺基酸經E取代(根據Kabat EU索引編號)。 在一個態樣中，在第一輕鏈之恆定結構域CL中，位置123處之胺基酸經R取代，且位置124處之胺基酸經K取代，且在第一重鏈之恆定結構域CH1中，位置147及213處之胺基酸均經E取代(根據Kabat EU索引編號)。 在一個態樣中，在第二重鏈之恆定結構域CL中，位置124及123處之胺基酸經K取代，且其中在第二輕鏈之恆定結構域CH1中，位置147及213處之胺基酸經E取代，且在第一輕鏈之可變結構域VL中，位置38處之胺基酸經K取代，在第一重鏈之可變結構域VH中，位置39處之胺基酸經E取代，在第二重鏈之可變結構域VL中，位置38處之胺基酸經K取代，且在第二輕鏈之可變結構域VH中，位置39處之胺基酸經E取代(根據Kabat EU索引編號)。 在一個態樣中，雙特異性抗體係一種二價抗體，其包含： a)     特異性結合至第一抗原之抗體之第一輕鏈及第一重鏈，及 b)     特異性結合至第二抗原之抗體之第二輕鏈及第二重鏈，其中該第二輕鏈及該第二重鏈之可變結構域VL與VH相互置換，且其中該第二輕鏈及該第二重鏈之恆定結構域CL與CH1相互置換。 a)之抗體不含如b)所報導之修飾，且a)之重鏈與輕鏈係分離之鏈。在b)之抗體中，在輕鏈內，可變輕鏈結構域VL經該抗體之可變重鏈結構域VH置換，且恆定輕鏈結構域CL經該抗體之恆定重鏈結構域CH1置換；且在重鏈內，可變重鏈結構域VH經該抗體之可變輕鏈結構域VL置換，且恆定重鏈結構域CH1經該抗體之恆定輕鏈結構域CL置換。 在一個態樣中，雙特異性抗體係一種二價抗體，其包含： a)     特異性結合至第一抗原之抗體之第一輕鏈及第一重鏈，及 b)     特異性結合至第二抗原之抗體之第二輕鏈及第二重鏈，其中該第二輕鏈及該第二重鏈之恆定結構域CL與CH1相互置換。 a)之抗體不含如b)所報導之修飾，且a)之重鏈與輕鏈係分離之鏈。在b)之抗體中，在輕鏈內，恆定輕鏈結構域CL經該抗體之恆定重鏈結構域CH1置換；且在重鏈內，恆定重鏈結構域CH1經該抗體之恆定輕鏈結構域CL置換。 在一個態樣中，雙特異性抗體係一種雙特異性抗體抗體，其包含： a)特異性結合至第一抗原且由兩條抗體重鏈及兩條抗體輕鏈組成的全長抗體，及 b) 特異性結合至第二抗原之一、二、三或四個單鏈Fab片段， 其中b)之該單鏈Fab片段經由肽連接子與a)之該全長抗體在該全長抗體之重鏈或輕鏈的C末端或N末端融合。 在一個態樣中，結合至第二抗原的一個或兩個相同單鏈Fab片段經由肽連接子與全長抗體在該全長抗體之重鏈或輕鏈的C末端融合。 在一個態樣中，結合至第二抗原的一個或兩個相同單鏈Fab (scFab)片段經由肽連接子與全長抗體在該全長抗體之重鏈的C末端融合。 在一個態樣中，結合至第二抗原的一個或兩個相同單鏈Fab (scFab)片段經由肽連接子與全長抗體在該全長抗體之輕鏈的C末端融合。 在一個態樣中，結合至第二抗原的兩個相同單鏈Fab (scFab)片段經由肽連接子與全長抗體分別在該全長抗體之重鏈或輕鏈的C末端融合。 在一個態樣中，結合至第二抗原的兩個相同單鏈Fab (scFab)片段經由肽連接子與全長抗體分別在該全長抗體之重鏈的C末端融合。 在一個態樣中，結合至第二抗原的兩個相同單鏈Fab (scFab)片段經由肽連接子與全長抗體分別在該全長抗體之輕鏈的C末端融合。 在一個態樣中，雙特異性抗體係一種三價抗體，其包含： a)特異性結合至第一抗原且由兩條抗體重鏈及兩條抗體輕鏈組成的全長抗體， b)第一多肽，其由以下組成： ba)抗體重鏈可變結構域(VH)，或 bb) 抗體重鏈可變結構域(VH)及抗體恆定結構域1 (CH1)， 其中該第一多肽經由肽連接子以其VH結構域的N末端與該全長抗體之兩條重鏈之一的C末端融合， c)第二多肽，其由以下組成： ca)抗體輕鏈可變結構域(VL)，或 cb)抗體輕鏈可變結構域(VL)及抗體輕鏈恆定結構域(CL)， 其中該第二多肽經由肽連接子以VL結構域之N末端與該全長抗體之兩條重鏈中之另一條的C末端融合，且 其中該第一多肽之抗體重鏈可變結構域(VH)與該第二多肽之該抗體輕鏈可變結構域(VL)一起形成特異性結合至第二抗原之抗原結合結構域。 在一個態樣中，b)之多肽的抗體重鏈可變結構域(VH)與c)之多肽的抗體輕鏈可變結構域(VL)藉由在以下位置之間引入二硫鍵，經由鏈間二硫橋連接且穩定化∶ (i)重鏈可變結構域位置44至輕鏈可變結構域位置100，或 (ii)重鏈可變結構域位置105至輕鏈可變結構域位置43，或 (iii)重鏈可變結構域位置101至輕鏈可變結構域位置100 (始終根據Kabat EU索引編號)。 引入非天然二硫橋以實現穩定化之技術描述於例如WO 94/029350；Rajagopal, V.等人，Prot. Eng. (1997) 1453-1459；Kobayashi, H.等人，Nucl. Med. Biol. 25 (1998) 387-393；及Schmidt, M.等人，Oncogene 18 (1999) 1711-1721。在一個實施例中，b)及c)之多肽的可變結構域之間的可選二硫鍵係在重鏈可變結構域位置44與輕鏈可變結構域位置100之間。在一個實施例中，b)及c)之多肽的可變結構域之間的可選二硫鍵係在重鏈可變結構域位置105與輕鏈可變結構域位置43之間(始終根據Kabat編號)。在一個實施例中，在單鏈Fab片段之可變結構域VH與VL之間無該可選二硫鍵穩定化的三價雙特異性抗體係較佳的。 在一個態樣中，雙特異性抗體係一種三特異性或四特異性抗體，其包含： a)     特異性結合至第一抗原之全長抗體之第一輕鏈及第一重鏈，及 b)     特異性結合至第二抗原之全長抗體之第二(經修飾)輕鏈及第二(經修飾)重鏈，其中可變結構域VL與VH相互置換，及/或其中恆定結構域CL與CH1相互置換，且 c) 其中特異性結合至一個或兩個其他抗原(亦即，第三及/或第四抗原)之一至四個抗原結合結構域經由肽連接子與a)及/或b)之輕鏈或重鏈的C末端或N末端融合。 a)之抗體不含如b)所報導之修飾，且a)之重鏈與輕鏈係分離之鏈。 在一個態樣中，三特異性或四特異性抗體包含c)特異性結合至一個或兩個其他抗原之一個或兩個抗原結合結構域。 在一個態樣中，抗原結合結構域係選自scFv片段及scFab片段之群。 在一個態樣中，該抗原結合結構域係scFv片段。 在一個態樣中，該抗原結合結構域係scFab片段。 在一個態樣中，抗原結合結構域與a)及/或b)之重鏈的C末端融合。 在一個態樣中，三特異性或四特異性抗體包含c)特異性結合至另一抗原之一個或兩個抗原結合結構域。 在一個態樣中，三特異性或四特異性抗體包含c)特異性結合至第三抗原之兩個相同抗原結合結構域。在一個較佳實施例中，該兩個相同抗原結合結構域經由相同肽連接子與a)及b)之重鏈的C末端融合。在一個較佳實施例中，該兩個相同抗原結合結構域係scFv片段或scFab片段。 在一個態樣中，三特異性或四特異性抗體包含c)特異性結合至第三及第四抗原之兩個抗原結合結構域。在一個實施例中，該兩個抗原結合結構域經由相同肽連接子與a)及b)之重鏈的C末端融合。在一個較佳實施例中，該兩個抗原結合結構域係scFv片段或scFab片段。 在一個態樣中，雙特異性抗體係一種雙特異性四價抗體，其包含： a)特異性結合至第一抗原(且包含兩個Fab片段)之抗體之兩條輕鏈及兩條重鏈， b)     特異性結合至第二抗原之抗體之兩個額外Fab片段，其中該等額外Fab片段均經由肽連接子與a)之重鏈的C末端或N末端融合，及 其中在該等Fab片段中進行以下修飾 (i)在a)之兩個Fab片段中或在b)之兩個Fab片段中，可變結構域VL與VH相互置換，及/或恆定結構域CL與CH1相互置換，或 (ii)在a)之兩個Fab片段中，可變結構域VL與相互置換，且恆定結構域CL與CH1相互置換，且在b)之兩個Fab片段中，可變結構域VL與VH相互置換，或恆定結構域CL與CH1相互置換，或 (iii)在a)之兩個Fab片段中，可變結構域VL與VH相互置換，或恆定結構域CL與CH1相互置換，且在b)之兩個Fab片段中，可變結構域VL與VH相互置換，且恆定結構域CL與CH1相互置換，或 (iv)在a)之兩個Fab片段中，可變結構域VL與VH相互置換，且在b)之兩個Fab片段中，恆定結構域CL與CH1相互置換，或 (v)在a)之兩個Fab片段中，恆定結構域CL與CH1相互置換，且在b)之兩個Fab片段中，可變結構域VL與VH相互置換。 在一個態樣中，該等額外Fab片段均經由肽連接子與a)之重鏈的C末端或與a)之重鏈的N末端融合。 在一個態樣中，該等額外Fab片段均經由肽連接子與a)之重鏈的C末端融合。 在一個態樣中，該等額外Fab片段均經由肽連接子與a)之重鏈的N末端融合。 在一個態樣中，在Fab片段中，進行以下修飾∶在a)之兩個Fab片段中，或在b)之兩個Fab片段中，可變結構域VL與VH相互置換，及/或恆定結構域CL與CH1相互置換。 在一個態樣中，雙特異性抗體係一種四價抗體，其包含： a)特異性結合至第一抗原且包含第一VH-CH1結構域對的第一抗體之(經修飾)重鏈，其中該第一抗體之第二VH-CH1結構域對的N末端經由肽連接子與該重鏈之C末端融合， b) a)之該第一抗體之兩條輕鏈， c)特異性結合至第二抗原且包含第一VH-CLl結構域對的第二抗體之(經修飾)重鏈，其中該第二抗體之第二VH-CL結構域對的N末端經由肽連接子與該重鏈之C末端融合，及 d) c)之該第二抗體的兩條(經修飾)輕鏈，其各自包含CL-CH1結構域對。 在一個態樣中，雙特異性抗體包含 a)特異性結合至第一抗原之第一全長抗體之重鏈及輕鏈，及 b)特異性結合至第二抗原之第二全長抗體之重鏈及輕鏈，其中該重鏈之N末端經由肽連接子與該輕鏈之C末端連接。 a)之抗體不含如b)所報導之修飾，且重鏈與輕鏈係分離之鏈。 在一個態樣中，雙特異性抗體包含 a)特異性結合至第一抗原且由兩條抗體重鏈及兩條抗體輕鏈組成的全長抗體，及 b)特異性結合至第二抗原且包含VH2結構域及VL2結構域之Fv片段，其中兩個結構域經由二硫橋彼此連接， 其中僅該VH2結構域或該VL2結構域經由肽連接子與該特異性結合至第一抗原之全長抗體之重鏈或輕鏈融合。 在該雙特異性抗體中，a)之重鏈與輕鏈係分離之鏈。 在一個態樣中，VH2結構域或VL2結構域中之另一個不經由肽連接子與該特異性結合至第一抗原之全長抗體之重鏈或輕鏈融合。 在如本文所報導之所有態樣中，第一輕鏈包含VL結構域及CL結構域，且第一重鏈包含VH結構域、CH1結構域、鉸鏈區、CH2結構域及CH3結構域。 在一個態樣中，雙特異性抗體係一種三價抗體，其包含： a)特異性結合至第一抗原之兩個Fab片段， b)特異性結合至第二抗原之一個互換Fab片段，其中CH1與CL結構域彼此互換， c)包含第一Fc區重鏈及第二Fc區重鏈之一個Fc區， 其中該兩個Fab片段之CH1結構域之C末端連接至重鏈Fc區多肽之N末端，且其中互換Fab片段之CL結構域的C末端連接至一個Fab片段之VH結構域的N末端。 在一個態樣中，雙特異性抗體係一種三價抗體，其包含： a)特異性結合至第一抗原之兩個Fab片段， b)特異性結合至第二抗原之一個互換Fab片段，其中CH1與CL結構域彼此互換， c)包含第一Fc區重鏈及第二Fc區重鏈之一個Fc區， 其中第一Fab片段之CH1結構域的C末端連接至一個重鏈Fc區多肽之N末端，且互換Fab片段之CL結構域的C末端連接至另一重鏈Fc區多肽之N末端，且其中第二Fab片段之CH1結構域的C末端連接至第一Fab片段之VH結構域的N末端或互換Fab片段之VH結構域的N末端。 在一個態樣中，雙特異性抗體包含 a)特異性結合至第一抗原且由兩條抗體重鏈及兩條抗體輕鏈組成的全長抗體，及 b)特異性結合至第二抗原且包含構成重鏈片段及輕鏈片段之VH2結構域及VL2結構域的Fab片段，其中在輕鏈片段內，可變輕鏈結構域VL2經該抗體之可變重鏈結構域VH2置換，且在重鏈片段內，可變重鏈結構域VH2經該抗體之可變輕鏈結構域VL2置換， 其中重鏈Fab片段插入全長抗體之一條重鏈的CH1結構域與全長抗體之相應Fc區之間，且輕鏈Fab片段之N末端偶聯至與全長抗體中插入重鏈Fab片段之重鏈配對的全長抗體之輕鏈的C末端。 在一個態樣中，雙特異性抗體包含 a)特異性結合至第一抗原且由兩條抗體重鏈及兩條抗體輕鏈組成的全長抗體，及 b)特異性結合至第二抗原且包含構成重鏈片段及輕鏈片段之VH2結構域及VL2結構域的Fab片段，其中在輕鏈片段內，可變輕鏈結構域VL2經該抗體之可變重鏈結構域VH2置換，且在重鏈片段內，可變重鏈結構域VH2經該抗體之可變輕鏈結構域VL2置換，且其中Fab片段之重鏈片段的C末端偶聯至全長抗體之一條重鏈的N末端，且Fab片段之輕鏈片段的C末端偶聯至與全長抗體中Fab片段之重鏈片段所偶聯之重鏈配對的全長抗體之輕鏈的N末端。聚核苷酸 本發明進一步提供編碼如本文所述之雙特異性抗體或其片段的經分離之聚核苷酸。 術語「核酸分子」或「聚核苷酸」包括含核苷酸聚合物之任何化合物及/或物質。每個核苷酸係由鹼基，確切地說由嘌呤或嘧啶鹼基(亦即，胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(亦即，脫氧核糖或核糖)及磷酸酯基團構成。通常，核酸分子係用鹼基序列描述，由此該等鹼基表示核酸分子之一級結構(線性結構)。該鹼基序列通常係自5'至3'表示。在本文中，術語核酸分子涵蓋脫氧核糖核酸(DNA)，包括例如互補DNA(cDNA)及基因組DNA；核糖核酸(RNA)，特別是信使RNA(mRNA)；合成形式之DNA或RNA；及包含兩個或兩個以上該等分子之混合聚合物。核酸分子可以為線性或環形的。此外，術語核酸分子包括有義股及反義股，以及單股及雙股形式。另外，本文中描述之核酸分子可以含有天然存在或非天然存在之核苷酸。非天然存在之核苷酸之實例包括帶有衍生化糖或磷酸酯主鏈鍵聯或化學修飾之殘基的經修飾核苷酸鹼基。核酸分子亦涵蓋適用作載體以引導本發明抗體在活體外及/或活體內，例如在宿主或患者體內之表現的DNA及RNA分子。此類DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)載體可以為未修飾或經修飾的。舉例而言，mRNA可以經化學修飾以增強RNA載體之穩定性及/或增進編碼分子之表現，由此可以將mRNA注射至受試者體內以在活體內產生抗體(參見例如，Stadler等人，Nature Medicine 2017, 2017年6月12日在線公開, doi:10.1038/nm.4356或EP 2 101 823 B1)。 「經分離」之聚核苷酸係指已與其天然環境之組分分離的核酸分子。經分離之聚核苷酸包括包含在通常含有核酸分子之細胞中的核酸分子，但該核酸分子係存在於染色體外或存在於不同於其天然染色體位置之染色體位置處。 編碼本發明之雙特異性抗體的經分離之聚核苷酸可以呈編碼完整抗原結合分子之單一聚核苷酸或共表現之多個(例如兩個或兩個以上)聚核苷酸形式。由共表現之聚核苷酸編碼的多肽可以經由例如二硫鍵或其他手段締合，以形成功能性抗原結合分子。舉例而言，免疫球蛋白之輕鏈部分可以由來自免疫球蛋白之重鏈部分的獨立聚核苷酸編碼。當共表現時，重鏈多肽將與輕鏈多肽結合以形成免疫球蛋白。 在一些態樣中，經分離之聚核苷酸編碼如本文所述的根據本發明之雙特異性抗體中所包含的多肽。 在一個態樣中，本發明係針對編碼雙特異性抗體的經分離之聚核苷酸，該雙特異性抗體包含特異性結合至計劃性細胞死亡蛋白質1(PD1)之第一抗原結合結構域及特異性結合至淋巴細胞活化基因-3(LAG3)之第二抗原結合結構域，其中該特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域包含：VH結構域，其包括(i)含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的HVR-H3；以及VL結構域，其包括(i)含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的HVR-L1；(ii)含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的HVR-L2及(iii)含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的HVR-L3。B. 重組方法 可使用例如US 4,816,567中所描述之重組方法及組合物製備抗體。對於此等方法，提供編碼抗體之一或多個經分離之核酸。 在天然抗體或天然抗體片段之情況下，需要兩個核酸，一個用於輕鏈或其片段且一個用於重鏈或其片段。此類核酸編碼構成抗體之VL之胺基酸序列及/或構成VH之胺基酸序列(例如抗體之輕鏈及/或重鏈)。該等核酸可以在同一表現載體上或在不同表現載體上。在具有雜二聚體重鏈之某些雙特異性抗體的情況下，需要四個核酸，一個用於第一輕鏈，一個用於包含第一異單體Fc區多肽之第一重鏈，一個用於第二輕鏈及一個用於包含第二異單體Fc區多肽之第二重鏈。該四個核酸可以包含在一或多個核酸分子或表現載體中。舉例而言，此類核酸編碼構成抗體之第一VL之胺基酸序列及/或構成含第一異單體Fc區之第一VH的胺基酸序列及/或構成第二VL之胺基酸序列及/或構成含第二異單體Fc區之第二VH的胺基酸序列(例如抗體之第一及/或第二輕鏈及/或第一及/或第二重鏈)。該等核酸可以在同一表現載體上或不同表現載體上，通常該等核酸係位於兩個或三個表現載體上，亦即，一個載體可以包含該等核酸中之多於一個。該等雙特異性抗體之實例係CrossMab及T細胞雙特異性抗體(參見例如Schaefer, W.等人，PNAS, 108 (2011) 11187-1191)。舉例而言，異單體重鏈之一包含所謂的「節突變」(T366W及視情況S354C或Y349C之一)且另一異單體重鏈包含所謂的「孔突變」(T366S、L368A及Y407V，以及視情況Y349C或S354C)(參見例如Carter, P.等人，Immunotechnol. 2 (1996) 73)。 在一個態樣中，提供編碼本文所述之雙特異性抗體的經分離之核酸。此類核酸可以編碼構成VL之胺基酸序列及/或構成VH之分別特異性結合至PD1及LAG3之抗原結合結構域的胺基酸序列(例如在抗體之輕鏈及/或重鏈中)。在另一態樣中，提供包含此類核酸之一或多個載體(例如表現載體)。在另一態樣中，提供包含此類核酸之宿主細胞。在一個此類態樣中，宿主細胞包括(例如經以下轉型)：(1)含編碼胺基酸序列之第一對核酸的第一載體，該等胺基酸序列之一構成抗體之第一VL且另一個構成第一VH；及含編碼胺基酸序列之第二對核酸的第二載體，該等胺基酸序列之一構成該抗體之第二VL且另一個構成第二VH，或(2)含編碼構成可變結構域之一(較佳為輕鏈可變結構域)之胺基酸序列之第一核酸的第一載體；含編碼胺基酸序列之一對核酸的第二載體，該等胺基酸序列之一構成輕鏈可變結構域且另一個構成第一重鏈可變結構域；及包含編碼胺基酸序列之一對核酸的第三載體，該等胺基酸序列之一構成與該第二載體中對應的另一輕鏈可變結構域且另一個構成第二重鏈可變結構域，或(3)含編碼構成抗體之第一VL的胺基酸序列之核酸的第一載體；含編碼構成抗體之第一VH的胺基酸序列之核酸的第二載體；含編碼構成抗體之第二VL的胺基酸序列之核酸的第三載體；及含編碼構成抗體之第二VH的胺基酸序列之核酸的第四載體。在一個態樣中，宿主細胞係真核細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。在一個態樣中，提供一種製造雙特異性抗體之方法，其中該方法包含在適合於表現抗體之條件下培養如上文所提供的包含編碼抗體之核酸的宿主細胞且視情況自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收抗體。 對於重組製備如本文中所描述的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，將編碼雙特異性抗體之核酸，例如上文所描述之核酸分離並插入一或多個載體中以在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。此類核酸可以使用習知程序(例如使用能夠特異性地結合至編碼抗體重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)容易地分離及測序。 適用於選殖或表現編碼抗體之載體的宿主細胞包括本文所述之原核或真核細胞。舉例而言，抗體可以在細菌中產生，在不需要糖基化及Fc效應功能時尤其如此。有關在細菌中表現抗體片段及多肽，參見例如US 5,648,237、US 5,789,199及US 5,840,523。(亦參見Charlton, K.A., Methods in Molecular Biology, 第248卷, Lo, B.K.C. (編), Humana Press, Totowa, NJ (2003), 第245-254頁，描述在大腸桿菌中表現抗體片段。) 在表現之後，可以自細菌細胞糊狀物之可溶性部分中分離抗體且其可以進一步純化。 除原核生物外，真核微生物，諸如絲狀真菌或酵母亦為適用於編碼抗體之載體的選殖或表現宿主，包括糖基化路徑已經「人類化」，使得所產生之抗體具有部分或完全人類糖基化模式的真菌及酵母菌株。參見Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414；及Li, H.等人，Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215。 適合於表現糖基化抗體之宿主細胞亦來源於多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出可與昆蟲細胞聯合使用，特別是用於轉染草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)細胞之眾多桿狀病毒株。 植物細胞培養物亦可用作宿主。參見例如美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(描述用於在轉殖基因植物中產生抗體的PLANTIBODIESTM技術)。 脊椎動物細胞亦可用作宿主。舉例而言，適於懸浮生長之哺乳動物細胞株可為有用的。有用哺乳動物宿主細胞株之其他實例有經SV40轉型之猴腎CV1細胞株(COS-7)；人胚腎細胞株(293或293細胞，如例如Graham, F.L.等人，J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74中所描述)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞特利氏細胞(mouse sertoli cell)(TM4細胞，如例如Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252中所描述)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬科動物腎細胞(MDCK；布法羅大鼠(buffalo rat)肝細胞(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞，如例如Mather, J.P.等人，Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68中所描述；MRC 5細胞；以及FS4細胞。其他有用的哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR- CHO細胞(Urlaub, G.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220)；以及骨髓瘤細胞株，諸如Y0、NS0及Sp2/0。關於適於產生抗體之某些哺乳動物宿主細胞株的評述，參見例如Yazaki, P.及Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, 第248卷, Lo, B.K.C. (編), Humana Press, Totowa, NJ (2004), 第255-268頁。C. 分析 可以藉由此項技術中已知之各種分析針對物理/化學特性及/或生物活性鑑別、篩選或表徵本文中提供的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體。1. 親和力分析 本文中提供的雙特異性抗原結合分子、抗體及抗體片段對於相應抗原之親和力可以根據實例中闡述之方法，藉由表面電漿子共振(SPR)，使用標準儀器，諸如Biacore®儀器(GE Healthcare)測定，且可藉由重組表現獲得諸如受體或靶蛋白。用於量測結合親和力的一個具體說明性及例示性實施例描述於實例2、8或11中。根據一個態樣，KD 係藉由表面電漿子共振，使用BIACORE® T100機器(GE Healthcare)在25℃下量測。2. 結合分析及其他分析 在一個態樣中，藉由例如已知方法，諸如ELISA、西方墨點法等測試本發明之雙特異性抗體之抗原結合活性。本文提供之雙特異性抗體與相應重組抗原或抗原表現細胞的結合可以藉由如實例8或11中所述之ELISA評價。 在另一態樣中，在結合分析中使用新鮮末梢血液單核細胞(PBMC)以顯示與諸如單核球、NK細胞及T細胞之不同末梢血液單核細胞(PBMC)的結合。 在另一態樣中，使用細胞二聚化分析展示當與針對兩個靶之雙特異性抗體連接或交聯時兩種不同受體PD1及LAG3之二聚化或最終結合/相互作用，該兩種受體與酶之兩個片段經胞質融合。由此僅單獨一個受體不顯示酶活性。對於此特異性相互作用，兩個受體之胞質C末端個別地與報導體酶之異源次單元融合。僅單個酶次單元不顯示報導體活性。然而，預期與兩個受體之同時結合會導致兩個受體之局部胞質積累、兩個異源酶次單元之互補且最終引起特定功能性酶之形成，該酶水解受質，由此產生化學發光信號(實例11)。3. 活性分析 在一個態樣中，提供用於鑑別具有生物活性的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域之雙特異性抗體的分析。生物活性可以包括例如增進不同免疫細胞，尤其是T細胞之活化及/或增殖、免疫調節細胞介素諸如IFNγ或TNF-α之分泌，阻斷PD1路徑、阻斷LAG3路徑、殺滅腫瘤細胞的能力。亦提供在活體內及/或活體外具有此生物活性之抗體。 在某些態樣中，測試本發明抗體之此類生物活性。在一個態樣中，提供一種免疫細胞分析，該分析量測來自一位個體(供體X)之淋巴細胞相對於來自另一個體(供體Y)之淋巴細胞的活化情況。混合淋巴細胞反應(MLR)可以展示阻斷PD1至淋巴細胞效應細胞之路徑的作用。在該分析中，在存在或不存在本發明之雙特異性抗體下測試T細胞之活化及IFN-γ分泌情況。該分析更詳細地描述於實例9中。D. 免疫偶聯物 本發明亦提供免疫偶聯物，其包含本發明之雙特異性抗體偶聯至一或多種細胞毒性劑，諸如化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如蛋白質毒素，細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素。E. 用於診斷及偵測之方法及組合物 在某些態樣中，本文中提供的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域之雙特異性抗體中之任一種可用於偵測生物樣本中PD1及LAG3兩者之存在。如本文中所使用，術語「偵測」涵蓋定量或定性偵測。在某些實施例中，生物樣本包含細胞或組織，諸如AML癌症幹細胞。 在一個態樣中，提供一種用於診斷或偵測方法中之雙特異性抗體。在另一態樣中，提供偵測生物樣本中PD1與LAG3兩者之存在的方法。在某些實施例中，該方法包含使生物樣本與如本文所述之雙特異性抗體在允許雙特異性抗體結合至PD1及LAG3兩者之條件下接觸，及偵測在雙特異性抗體與兩種抗原之間是否形成複合物。此方法可為活體外或活體內方法。在一個實施例中，使用該雙特異性抗體選擇適合用包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域之雙特異性抗體治療的受試者，例如在PD1及LAG3係選擇患者之生物標記物之情況下。 在某些態樣中，提供標記之雙特異性抗體。標記包括(但不限於)直接偵測之標記或部分(諸如螢光、發色、電子緻密、化學發光及放射性標記)，以及例如經由酶反應或分子相互作用間接偵測之部分，諸如酶或配位體。例示性標記包括(但不限於)放射性同位素32P、14C、125I、3H及131I；螢光團，諸如稀土螯合劑或螢光素及其衍生物；若丹明(rhodamine)及其衍生物；丹醯基；傘酮；螢光素酶，例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶(美國專利第4,737,456號)；螢光素；2,3-二氫酞嗪二酮；辣根過氧化酶(HRP)；鹼性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖澱粉酶；溶菌酶；醣氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；雜環氧化酶，諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，其與採用過氧化氫氧化染料前驅體之酶，諸如HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶相結合；生物素/抗生物素蛋白；自旋標記；噬菌體標記；或穩定自由基。F. 醫藥組合物、調配物及投與途徑 在另一態樣中，本發明提供用於例如以下治療方法中之任一種中的醫藥組合物，其包括本文中提供的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域之雙特異性抗體中的任一種。在一個實施例中，醫藥組合物包含本文中提供之雙特異性抗體中的任一種及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。在另一個實施例中，醫藥組合物包含本文中提供之雙特異性抗體中的任一種及至少一種額外治療劑，例如，如下所述。 本發明之醫藥組合物包含治療有效量的溶解或分散於醫藥學上可接受之賦形劑中之一或多種雙特異性抗體。短語「醫藥學上或藥理學上可接受」係指分子實體及組合物在所用劑量及濃度下對於接受者一般為無毒，亦即，當適當時投與動物，諸如人類時不會產生不良反應、過敏反應或其他不想要之反應。如以引用之方式併入本文中的Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版, Mack Printing Company, 1990所例示，按照本發明，含有至少一種雙特異性抗體及視情況另外的活性成分之醫藥組合物的製備將係熟習此項技術者已知的。特定言之，該等組合物係凍乾調配物或水溶液。如一般熟習此項技術者所知，如本文中所使用，「醫藥學上可接受之賦形劑」包括任何及所有溶劑、緩衝劑、分散介質、包衣劑、界面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如抗細菌劑、抗真菌劑)、等張劑、鹽、穩定劑及其組合。 非經腸組合物包括設計成經注射，例如皮下、皮內、病灶內、靜脈內、動脈內、肌肉內、鞘內或腹膜內注射投藥的該等組合物。為進行注射，本發明之雙特異性抗體可以在水溶液，較佳於生理學上相容之緩衝液，諸如漢克氏溶液(Hank's solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理食鹽水緩衝液中調配。該溶液可以含有調配劑，諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。或者，雙特異性抗體可以呈在使用之前用適合媒劑，例如無菌無熱原質水復原的粉末形式。藉由將所需量的本發明之融合蛋白併入視需要具有多種以下列舉之其他成分之適當溶劑中來製備無菌可注射溶液。無菌性可藉由例如經無菌過濾膜過濾容易地實現。一般而言，分散液係藉由將各種經滅菌之活性成分併入含有基本分散介質及/或其他成分的無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液、懸浮液或乳液之無菌粉末情況下，較佳製備方法係真空乾燥或冷凍乾燥技術，該等技術利用預先無菌過濾之液體介質產生活性成分加任何其他所需成分之粉末。視需要，液體介質宜經緩衝，且在注射之前，先使液體稀釋劑與足量生理食鹽水或葡萄糖等張。該組合物在製造及儲存條件下必須為穩定的，且必須防止諸如細菌及真菌之微生物的污染作用。應瞭解，內毒素污染應最低限度地保持在安全水準，例如低於0.5 ng/mg蛋白質。適合醫藥學上可接受之賦形劑包括(但不限於)：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨；氯化六羥季銨(hexamethonium chloride)；苯紮氯銨(benzalkonium chloride)；苄索氯銨(benzethonium chloride)；酚、丁醇或苯甲醇；對羥苯甲酸烷酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；以及間甲酚)；低分子量(不到約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽反離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子型界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。水性注射懸浮液可以含有增加懸浮液黏度之化合物，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、聚葡萄糖或其類似物。視情況，懸浮液亦可含有適合穩定劑或增加化合物溶解性以允許製備高度濃縮之溶液的試劑。另外，活性化合物之懸浮液可視需要製備成油性注射懸浮液形式。適合親脂性溶劑或媒劑包括脂肪油，諸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，諸如油酸乙酯或三酸甘油酯；或脂質體。 活性成分可以例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合包覆於所製備之微膠囊中，例如羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊分別包覆於膠狀藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)或巨乳液中。此類技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences (第18版, Mack Printing Company, 1990)中。可製備持續釋放製劑。持續釋放型製劑之適合實例包括含有多肽的由固體疏水性聚合物構成之半滲透基質，該等基質呈成形物品形式，例如膜或微膠囊。在特定實施例中，可藉由在組合物中使用延遲吸收之試劑，諸如單硬脂酸鋁、明膠或其組合來延長可注射組合物之吸收。 本文中之例示性醫藥學上可接受之賦形劑進一步包括間質藥物分散劑，諸如可溶性中性活性玻尿酸酶醣蛋白(sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶醣蛋白，諸如rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)。某些例示性sHASEGP (包括rHuPH20)及使用方法描述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一個態樣中，sHASEGP與一或多種其他葡萄糖胺聚糖酶，諸如軟骨素酶組合。 例示性凍乾抗體調配物描述於美國專利第6,267,958號中。水性抗體調配物包括美國專利第6,171,586號及WO 2006/044908中所述之調配物，後一專利中之調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝液。 除前述組合物以外，雙特異性抗體亦可調配為積存式製劑形式。此類長效調配物可以藉由植入(例如皮下或肌肉內植入)或藉由肌肉內注射投與。因此，舉例而言，雙特異性抗體可以用適合聚合材料或疏水性材料(例如於可接受之油中的乳液)或離子交換樹脂調配，或調配為微溶衍生物，例如微溶鹽形式。 包含本發明之雙特異性抗體的醫藥組合物可以藉助於習知混合、溶解、乳化、囊封、包覆或凍乾製程製造。醫藥組合物可以使用一或多種有利於將蛋白質處理成可在醫藥學上使用之製劑的生理學上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或助劑，以習知方式調配。適當調配物取決於所選擇之投與途徑。 雙特異性抗體可以游離酸或鹼、中性或鹽形式調配成組合物。醫藥學上可接受之鹽係大體上保留游離酸或鹼之生物活性的鹽。此等鹽包括酸加成鹽，例如與蛋白質組合物之游離胺基形成的鹽，或與無機酸(諸如鹽酸或磷酸)或有機酸(諸如乙酸、乙二酸、酒石酸或杏仁酸)形成的鹽。與游離羧基形成之鹽亦可衍生自無機鹼，諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵；或有機鹼，諸如異丙胺、三甲胺、組胺酸或普魯卡因(procaine)。相較於相應的游離鹼形式，醫藥鹽往往更易溶於水性及其他質子溶劑中。 本文中之組合物亦可含有一種以上治療特定適應症所需之活性成分，較佳為具有互補活性且相互無不良影響的活性成分。此類活性成分宜以有效達成預期目的之量組合存在。 用於活體內投與之調配物一般係無菌的。無菌性可藉由例如經無菌過濾膜過濾容易地實現。G. 治療方法及組合物 本文中提供的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域之雙特異性抗體中的任一種可以用於治療方法中。 對於用於治療方法中，如前文所定義的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體可以按符合良好醫學實踐之方式調配、給與及投與。在此情形下考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病況、病症起因、藥劑遞送部位、投與方法、投與時程及醫學從業者已知之其他因素。 在一個態樣中，提供如本文所定義的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其係用作藥物。在其他態樣中，提供如本文所定義的包含特異性結合至PD1之第一抗原該及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其係用於治療疾病，確切地說用於治療癌症。在某些實施例中，提供包含特異性結合至PD1之第一抗原該及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其係用於治療方法中。在一個實施例中，本發明提供如本文中所描述的包含特異性結合至PD1之第一抗原該及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其係用於治療有需要個體之疾病。在某些實施例中，本發明提供包含特異性結合至PD1之第一抗原該及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其係用於治療患有疾病之個體的方法中，該方法包含向該個體投與治療有效量之雙特異性抗體。在某些實施例中，待治療之疾病係癌症。在另一態樣中，待治療之疾病係感染性疾病，特別是慢性病毒感染如HIV(人類免疫缺陷病毒)、HBV(B型肝炎病毒)、HCV(C型肝炎)、HSV1(1型單純疱疹病毒)、CMV(巨細胞病毒)、LCMV(淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒)或EBV(埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus))。需要治療之受試者、患者或「個體」通常係哺乳動物，更特定言之為人類。 在另一態樣中，本發明提供如前文所定義的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域之雙特異性抗體在製造或製備用於治療有需要個體之疾病之藥物中的用途。在一個實施例中，該藥物係用於治療疾病之方法中，該方法包含向患有疾病之個體投與治療有效量之藥物。 在某些態樣中，待治療之疾病係增生性病症，特別是癌症。癌症之實例包括膀胱癌、腦癌、頭頸癌、胰臟癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、食道癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮膚癌、鱗狀細胞癌、骨癌及腎癌。可以使用根據本發明的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體治療之其他細胞增殖病症包括(但不限於)位於腹部、骨骼、乳房、消化系統、肝臟、胰臟、腹膜、內分泌腺(腎上腺、副甲狀腺、垂體、睾丸、卵巢、胸腺、甲狀腺)、眼、頭頸部、神經系統(中樞及周圍神經系統)、淋巴系統、骨盆、皮膚、軟組織、脾臟、胸部及泌尿生殖器系統中的贅瘤。亦包括癌前病況或病變及癌症轉移。在某些態樣中，癌症係選自由組成之群：腎細胞癌、皮膚癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、腦癌、頭頸癌。在其他態樣中，癌症係選自癌瘤、淋巴瘤(例如霍奇金氏(Hodgkin's)及非霍奇金氏淋巴瘤)、母細胞瘤、肉瘤及白血病。在另一態樣中，待治療之癌症係選自鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀細胞癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、胰臟癌、神經膠質瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、白血病及其他淋巴增生性病症，及各種類型頭頸癌。 在另一態樣中，待治療之疾病係感染性疾病，特別是慢性病毒感染。術語「慢性病毒感染」係指受試者罹患或感染慢性病毒。慢性病毒感染之實例有人類免疫缺陷病毒(HIV)、B型肝炎病毒感染(HBV)、C型肝炎病毒感染(HCV)、1型單純疱疹病毒(HSV1)、巨細胞病毒(CMV)、淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)或埃-巴二氏病毒(EBV)。 熟練技術人員容易認識到，在多數情況下，雙特異性分子可能不會實現治癒，而可能僅僅提供部分益處。在一些實施例中，具有某種益處之生理變化亦視為治療上有益的。因此,在一些實施例中，提供生理變化的雙特異性抗體之量視為「有效量」或「治療有效量」。 在另一態樣中，本發明提供一種用於治療個體之疾病的方法，其包含向該個體投與治療有效量的本發明之包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體。在一個實施例中，將呈醫藥學上可接受之形式的包含本發明之雙特異性抗體的組合物投與該個體。在某些實施例中，待治療之疾病係增生性病症。在一個特定實施例中，該疾病係癌症。在某些實施例中，該方法進一步包含向該個體投與治療有效量的至少一種額外治療劑，例如若待治療之疾病係癌症，則為抗癌劑。在另一態樣中，該疾病係慢性病毒感染。根據任一上述實施例，「個體」可為哺乳動物，較佳為人類。 對於預防或治療疾病，本發明之包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域之雙特異性抗體(當單獨或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)的適當劑量將取決於待治療疾病之類型、投與途徑、患者之體重、融合蛋白之類型、疾病之嚴重程度及病程、雙特異性抗體係投與用於預防性抑或治療性目的、先前或同時進行之治療性干預、患者之臨床病史及對融合蛋白之反應，以及主治醫師之判斷。在任何情況下，負責投藥的從業者將確定組合物中活性成分之濃度及適用於個別受試者的劑量。本文中涵蓋各種給藥時程，包括(但不限於)單次投藥或在各種時間點內進行之多次投藥、快速投藥及脈衝式輸注。 宜向患者一次性或經一系列治療投與如本文所定義的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體。取決於疾病之類型及嚴重程度，可以將約1 µg/kg至15 mg/kg(例如0.1 mg/kg-10 mg/kg)之雙特異性抗體作為初始候選劑量，例如藉由一或多次獨立投藥還是藉由連續輸注向患者投與。取決於上文所提及之因素，一種典型的日劑量可在約1 μg/kg至100 mg/kg或更高劑量之範圍內。對於在數日或更長時間內之重複投藥，取決於病況，治療一般會持續至發生所需之疾病症狀抑制。雙特異性抗體之一種例示性劑量將在約0.005 mg/kg至約10 mg/kg範圍內。在其他實例中，劑量亦可包含每次投與約1 μg/kg體重、約5 μg/kg體重、約10 μg/kg體重、約50 μg/kg體重、約100 μg/kg體重、約200 μg/kg體重、約350 μg/kg體重、約500 μg/kg體重、約1 mg/kg體重、約5 mg/kg體重、約10 mg/kg體重、約50 mg/kg體重、約100 mg/kg體重、約200 mg/kg體重、約350 mg/kg體重、約500 mg/kg體重至約1000 mg/kg體重或更高劑量，及其中可衍生之任何範圍。在自本文所列數值可衍生之範圍之實例中，基於上述數值，可投與約5 mg/kg體重至約100 mg/kg體重、約5 μg/kg體重至約500 mg/kg體重等之範圍。因此，可向患者投與約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、5.0 mg/kg或10 mg/kg (或其任何組合)中之一或多種劑量。此類劑量可以間歇地投與，例如每週或每三週投與(例如由此使患者接受約兩劑至約二十劑，或例如約六劑融合蛋白)。可先投與較高起始劑量，隨後可投與一或多種較低劑量。不過，亦可使用其他給藥方案。此療法之進程易於藉由習知技術及分析進行監測。 本文所定義的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體一般將以有效達成預定目的之量使用。對於用於治療或預防疾病病況，投與或施用治療有效量的本發明之雙特異性抗體或其醫藥組合物。治療有效量之確定完全在熟習此項技術者之能力範圍內，尤其是根據本文所提供之詳細揭示內容。 對於全身性投藥，可先自活體外分析，諸如細胞培養分析估計治療有效劑量。接著，可以在動物模型中調配劑量以實現循環濃度範圍，包括如在細胞培養中測定的IC50 。此類資訊可以用於更準確地確定可用於人類之劑量。 亦可使用此項技術中熟知之技術，由活體內資料，例如動物模型估計初始劑量。一般熟習此項技術者可以基於動物資料容易地優化人類投藥。 可以個別地調整劑量及時間間隔以提供足夠維持治療作用的雙特異性抗體之血漿含量。對於注射投藥，常用的患者劑量在約0.1至50毫克/公斤/天，通常約0.5至1毫克/公斤/天範圍內。治療有效的血漿含量可以藉由每日投與多次劑量來達成。血漿含量可以藉由例如HPLC量測。 在局部投與或選擇性吸收之情況下，雙特異性抗體之有效局部濃度可能與血漿濃度不相關。熟習此項技術者能夠優化治療有效之局部劑量，而無需過度實驗。 本文所述之雙特異性抗體的治療有效劑量一般將提供治療效益，而不引起顯著毒性。可藉由標準醫藥程序測定細胞培養物或實驗動物中融合蛋白質之毒性及治療功效。可以使用細胞培養分析及動物研究來確定LD50 (導致群體中50%死亡之劑量)及ED50 (對群體中50%有效之治療劑量)。有毒作用與治療作用之間的劑量比係治療指數，可以表示為比率LD50 /ED50 。展現較大治療指數之雙特異性抗體較佳。在一個實施例中，根據本發明之雙特異性抗體展現高治療指數。可以使用自細胞培養分析及動物研究獲得的資料調配適用於人類之劑量範圍。該劑量較佳在毒性極小或無毒性之循環濃度範圍內，包括ED50。劑量可以取決於多種因素而在此範圍內變化，該等因素係例如所用劑型、所用投藥途徑、受試者之病況及其類似因素。精確配方、投藥途徑及劑量可以由個別醫師根據患者之狀況選擇(參見例如Fingl等人，1975, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 第1章, 第1頁, 以全文引用之方式併入本文中)。 用本發明之雙特異性抗體治療之患者的主治醫師將知曉如何及何時因毒性、器官功能異常及其類似情形而終止、中斷或調整投藥。相反地，主治醫師亦已知在臨床反應不充足(排除毒性)時將治療調整至較高水準。管理所關注病症時所投與劑量之量值將隨待治療病況之嚴重程度、投藥途徑及其類似因素而變化。病況之嚴重程度可以例如部分地藉由標準預後評價方法進行評價。此外，劑量及可能的給藥頻率亦將根據個別患者之年齡、體重及反應而變化。其他藥劑及治療 上文所述的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體可以與一或多種其他治療用藥劑組合投與。舉例而言，本發明之雙特異性抗體可以與至少一種額外治療劑共投與。術語「治療劑」涵蓋可以投與用於治療需要此類治療之個體之症狀或疾病的任何藥劑。此類額外治療劑可以包含適於治療特定適應症的任何活性成分，較佳為具有互補活性且彼此無不良影響的活性成分。在某些實施例中，額外治療劑係另一抗癌劑。 在本發明之一個態樣中，本文中所描述的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體或包含該雙特異性抗體之醫藥組合物係用於預防或治療癌症，其中該雙特異性抗體係與化學治療劑、放射及/或用於癌症免疫療法中之其他藥劑組合投與。 在本發明之一個特定態樣中，本文中所描述的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體或包含該雙特異性抗體之醫藥組合物係用於預防或治療癌症，其中該雙特異性抗體係與T細胞活化抗CD3雙特異性抗體，特別是抗CEA/抗CD3雙特異性抗體組合投與。在一個態樣中，抗CEA/抗CD3雙特異性抗體係一種包含第二抗原結合結構域之T細胞活化抗CD3雙特異性抗體，該第二抗原結合結構域包括(a)含SEQ ID NO:154之CDR-H1序列、SEQ ID NO:155 CDR-H2序列及SEQ ID NO:156之CDR-H3序列的重鏈可變區(VH CEA)，及/或含SEQ ID NO:157之CDR-L1序列、SEQ ID NO:158之CDR-L2序列及SEQ ID NO:159 CDR-L3序列的輕鏈可變區(VL CEA)，或(b)含SEQ ID NO:162之CDR-H1序列、SEQ ID NO:163之CDR-H2序列及SEQ ID NO:164之CDR-H3序列的重鏈可變區(VH CEA)，及/或含SEQ ID NO:165之CDR-L1序列、SEQ ID NO:166之CDR-L2序列及SEQ ID NO:167之CDR-L3序列的輕鏈可變區(VL CEA)。在一個態樣中，該抗CEA/抗CD3雙特異性抗體係一種T細胞活化抗CD3雙特異性抗體，其包括含SEQ ID NO:160之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CEA)及/或含SEQ ID NO:161之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CEA)，或第二抗原結合結構域，該第二抗原結合結構域包括含SEQ ID NO:168之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CEA)及/或含SEQ ID NO:169之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CEA)。 在另一態樣中，抗CEA/抗CD3雙特異性抗體包括含一或多個降低與Fc受體之結合及/或效應功能之胺基酸取代的Fc結構域。詳言之，抗CEA/抗CD3雙特異性抗體包括含胺基酸取代L234A、L235A及P329G之IgG1 Fc結構域。 在一個特定態樣中，抗CEA/抗CD3雙特異性抗體包含與SEQ ID NO:146之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之多肽、與SEQ ID NO:147之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之多肽、與SEQ ID NO:148之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之多肽及與SEQ ID NO:149之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之多肽。在另一特定實施例中，該雙特異性抗體包含SEQ ID NO: 146之多肽序列、SEQ ID NO: 147之多肽序列、SEQ ID NO: 148之多肽序列及SEQ ID NO: 149之多肽序列(CEA CD3 TCB)。 在另一特定態樣中，抗CEA/抗CD3雙特異性抗體包含與SEQ ID NO:150之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之多肽、與SEQ ID NO:151之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之多肽、與SEQ ID NO:152之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之多肽及與SEQ ID NO:153之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之多肽。在另一特定實施例中，該雙特異性抗體包含SEQ ID NO: 150之多肽序列、SEQ ID NO: 151之多肽序列、SEQ ID NO: 152之多肽序列及SEQ ID NO: 153之多肽序列(CEACAM5 CD3 TCB)。 在另一態樣中，提供一種醫藥組合物，其包括如本文中所描述的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，及T細胞活化抗CD3雙特異性抗體，特別是抗CEA/抗CD3雙特異性抗體。在一個特定態樣中，該醫藥組合物係用於組合、依序或同時治療疾病，特別是用於治療癌症。更具體而言，該組合物係用於治療實體腫瘤。 在另一態樣中，本發明提供一種用於治療個體之癌症或延遲其進展之方法，其包含向該受試者投與有效量的如本文中所描述之包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體以及T細胞活化抗CD3雙特異性抗體，特別是抗CEA/抗CD3雙特異性抗體或抗FolR1/抗CD3雙特異性抗體。 此類其他藥劑宜以有效達成預定目的之量組合存在。此類其他藥劑之有效量取決於所用融合蛋白之量、病症或治療之類型及上文所論述之其他因素。該等雙特異性抗體一般係以相同劑量且以如本文中所描述之投與途徑，或本文所描述之約1至99%之劑量，或以憑經驗/臨床上確定適當之任何劑量及任何途徑使用。 上述該等組合療法涵蓋組合投藥(其中兩種或兩種以上治療劑係包括在同一或獨立調配物中)及分開投藥，在此情況下，該雙特異性抗體之投與可以在投與額外治療劑及/或佐劑之前、同時及/或之後進行。H. 製品 在本發明之另一態樣中，提供含有可用於治療、預防及/或診斷上文所描述之病症之材料的製品。該製品包含容器及在容器上或與容器相連之標記或藥品說明書。適合的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以由各種材料形成，諸如玻璃或塑膠。容器容納單獨組合物或該組合物與有效治療、預防及/或診斷病況之另一組合物之組合，且可以具有無菌接取口(例如容器可以為具有皮下注射針可刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。該組合物中之至少一種活性劑係如前文所定義的包含特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域及特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體。 該標記或藥品說明書指示該組合物係用於治療所選病況。此外，該製品可以包括(a)容納組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明之雙特異性抗體；及(b)容納組合物之第二容器，其中該組合物包含另一細胞毒性劑或另外的治療劑。在本發明之此實施例中之製品可以進一步包含指示該組合物可以用於治療特定病況之藥品說明書。 替代或另外，該製品可以進一步包含第二(或第三)容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、林格氏溶液及右旋糖溶液。其亦可包括就商業及使用者觀點而言合乎需要之其他物質，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。 表C(序列)：
SEQ ID NO: 名稱 序列
1 重鏈HVR-H1，PD1-0103 GFSFSSY
2 重鏈HVR-H2，PD1-0103 GGR
3 重鏈HVR-H3，PD1-0103 TGRVYFALD
4 輕鏈HVR-L1，PD1-0103 SESVDTSDNSF
5 輕鏈HVR-L2，PD1-0103 RSS
6 輕鏈HVR-L3，PD1-0103 NYDVPW
7 重鏈可變結構域VH，PD1-0103 EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFSFSSYTMSWVRQTPEKRLDWVATISGGGRDIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLEMSSLMSEDTALYYCVLLTGRVYFALDSWGQGTSVTVSS
8 輕鏈可變結構域VL，PD1-0103 KIVLTQSPASLPVSLGQRATISCRASESVDTSDNSFIHWYQQRPGQSPKLLIYRSSTLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDVATYYCQQNYDVPWTFGGGTKLEIK
9 人類化變異體 -PD1-0103_01 (PD1 0376)之重鏈可變結構域VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGRDIYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVLLTGRVYFALDSWGQGTLVTVSS
10 人類化變異體 -PD1-0103_01 (PD1 0376)之輕鏈可變結構域VL DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVDTSDNSFIHWYQQKPGQSPKLLIYRSSTLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNYDVPWTFGQGTKVEIK
11 人類化變異體 -PD1-0103_02之輕鏈可變結構域VL DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRASESVDTSDNSFIHWYQQRPGQSPRLLIYRSSTLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQNYDVPWTFGQGTKVEIK
12 人類化變異體 -PD1-0103_03之輕鏈可變結構域VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDTSDNSFIHWYQQKPGQSPRLLIYRSSTLESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQNYDVPWTFGQGTKVEIK
13 人類化變異體 -PD1-0103_04之輕鏈可變結構域VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDTSDNSFIHWYQQKPGQSPRLLIYRSSTLESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQNYDVPWTFGQGTKVEIK
14 重鏈HVR-H1，aLAG3(0414) DYTMN
15 重鏈HVR-H2，aLAG3(0414) VISWDGGGTY YTDSVKG
16 重鏈HVR-H3，aLAG3(0414) GLTDTTLYGS DY
17 輕鏈HVR-L1，aLAG3(0414) RASQSISSYL N
18 輕鏈HVR-L2，aLAG3(0414) AASTLQS
19 輕鏈HVR-L3，aLAG3(0414) QQTYSSPLT
20 重鏈可變結構域VH，aLAG3(0414) EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFIFD DYTMNWVRQA PGKGLEWVAV ISWDGGGTYY TDSVKGRFTI SRDDFKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKGL TDTTLYGSDY WGQGTLVTVS S
21 輕鏈可變結構域VL，aLAG3(0414) DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS SYLNWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ TYSSPLTFGG GTKVEIK
22 重鏈HVR-H1，aLAG3(0403) DYTMH
23 重鏈HVR-H2，aLAG3(0403) LVSWDGGGTY YTNSVKG
24 重鏈HVR-H3，aLAG3(0403) AITDTSLYGY DY
25 輕鏈HVR-L1，aLAG3(0403) RASQSISSYL N
26 輕鏈HVR-L2，aLAG3(0403) AASSLQS
27 輕鏈HVR-L3，aLAG3(0403) QQTYSTPLT
28 重鏈可變結構域VH，aLAG3(0403) EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFD DYTMHWVRQA PGKGLEWVSL VSWDGGGTYY TNSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYFCAKAI TDTSLYGYDY WGQGILVTVS S
29 輕鏈可變結構域VL，aLAG3(0403) DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS SYLNWYQQKP GNAPKLLIYA ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ TYSTPLTFGG GTKVEIK
30 重鏈HVR-H1，aLAG3(0411) DYTMN
31 重鏈HVR-H2，aLAG3(0411) VISWDGGATY YADSVKG
32 重鏈HVR-H3，aLAG3(0411) GLTDDTLYGS DY
33 輕鏈HVR-L1，aLAG3(0411) RASQSIVSYL N
34 輕鏈HVR-L2，aLAG3(0411) ASSSLQS
35 輕鏈HVR-L3，aLAG3(0411) QQTYSTPLT
36 重鏈可變結構域VH，aLAG3(0411) EVHLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFIVD DYTMNWVRQA PGKGLEWVSV ISWDGGATYY ADSVKGRFTI SRDDFKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKGL TDDTLYGSDY WGQGTLVTVS S
37 輕鏈可變結構域VL，aLAG3(0411) DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIV SYLNWYQQKP GKAPKLLIYA SSSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ TYSTPLTFGG GTKVEIK
38 重鏈HVR-H1，aLAG3(0417) DYAMS
39 重鏈HVR-H2，aLAG3(0417) GIDNSGYYTY YTDSVKG
40 重鏈HVR-H3，aLAG3(0417) THSGLIVNDA FDI
41 輕鏈HVR-L1，aLAG3(0417) RASQSISSYL N
42 輕鏈HVR-L2，aLAG3(0417) AASSLQS
43 輕鏈HVR-L3，aLAG3(0417) QQTYSTPLT
44 重鏈可變結構域VH，aLAG3(0417) EVQLVESGGG LVQPGGSLRL ACAASGFTFS DYAMSWVRQA PGKGLEWVSG IDNSGYYTYY TDSVKGRFTI SRDDVKNTLY LQMNSLRAED TAVYLCTKTH SGLIVNDAFD IWGQGTMVTV SS
45 輕鏈可變結構域VL，aLAG3(0417) DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS SYLNWYQQKP GKAPKLLIYA ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ TYSTPLTFGG GTKVEIK
46 重鏈HVR-H1，aLAG3(0416) DYAMS
47 重鏈HVR-H2，aLAG3(0416) GIDNSGYYTY YTDSVKG
48 重鏈HVR-H3，aLAG3(0416) THSGLIVNDA FDI
49 輕鏈HVR-L1，aLAG3(0416) RASQSISSYL N
50 輕鏈HVR-L2，aLAG3(0416) DASSLES
51 輕鏈HVR-L3，aLAG3(0416) QQSYSTPLT
52 重鏈可變結構域VH，aLAG3(0416) EVQLVESGGG LVQPGGSLRL ACAASGFTFS DYAMSWVRQA PGKGLEWVSG IDNSGYYTYY TDSVKGRFTI SRDDVKNTLY LQMNSLRAED TAVYLCTKTH SGLIVNDAFD IWGQGTMVTV SS
53 輕鏈可變結構域VL，aLAG3(0416) DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS SYLNWYQQKP GKAPKLLIYD ASSLESGVPS RFSGSGSGTD ATLTISSLQP EDFATYYCQQ SYSTPLTFGG GTKVEIK
54 重鏈可變結構域VH，BMS-986016 (WO2014/008218及US2016/0326248) QVQLQQWGAG LLKPSETLSL TCAVYGGSFS DYYWNWIRQP PGKGLEWIGE INHRGSTNSN PSLKSRVTLS LDTSKNQFSL KLRSVTAADT AVYYCAFGYS DYEYNWFDPW GQGTLVTVSS
55 輕鏈可變結構域VL BMS-986016 (WO2014/008218及US2016/0326248) EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSIS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPLTFGQ GTNLEIK
56 重鏈HVR-H1，MDX25F7 (25F7) DYYWN
57 重鏈HVR-H2，MDX25F7 (25F7) EINHNGNTNSNPSLKS
58 重鏈HVR-H3，MDX25F7 (25F7) GYSDYEYNWF
59 輕鏈HVR-L1，MDX25F7 (25F7) RASQSISSYLA
60 輕鏈HVR-L2，MDX25F7 (25F7) DASNRAT
61 輕鏈HVR-L3，MDX25F7 (25F7) QQRSNWPLT
62 重鏈可變結構域VH，MDX25F7 (25F7) (US2011/0150892及WO2014/008218) QVQLQQWGAG LLKPSETLSL TCAVYGGSFS DYYWNWIRQP PGKGLEWIGE INHNGNTNSN PSLKSRVTLS LDTSKNQFSL KLRSVTAADT AVYYCAFGYS DYEYNWFDPW GQGTLVTVSS
63 輕鏈可變結構域VL，MDX25F7 (25F7) (US2011/0150892及WO2014/008218) EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSIS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPLTFGQ GTNLEIK
64 重鏈可變結構域VH，人類化BAP050 (LAG525) (US2015/0259420) QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGFTLT NYGMNWVRQT PGKGLKWMGW INTDTGEPTY ADDFKGRFAF SLETSASTAS LQINNLKNAD TATYFCARNP PYYYGTNNAE AMDYWGQGTT VTVSS
65 輕鏈可變結構域VL，人類化BAP050 (LAG525) (US2015/0259420) DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCSSSQDIS NYLMWYQQKP DGTVKVLIYY TSTLHLGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEL EDIATYYCQQ YYNLPWTFGQ GTKVEIK
66 重鏈可變結構域VH，MDX26H10 (26H10) (US 2011/0150892) QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA PGKGLEWVAV IWYDGSNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAREW AVASWDYGMD VWGQGTTVTV SS
67 輕鏈可變結構域VL，MDX26H10 (26H10) (US 2011/0150892) EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SSYLAWYQQK PGQAPRLLIY GASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYGSSPFTFG PGTKVDIK
68 人類κ輕鏈恆定區 RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC
69 人類λ輕鏈恆定區 QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA GVETTTPSKQ SNNKYAASSY LSLTPEQWKS HRSYSCQVTH EGSTVEKTVA PTECS
70 來源於IgG1之人類重鏈恆定區 ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG
71 來源於IgG1之人類重鏈恆定區，具有突變L234A、L235A及P329G ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPEAAGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LGAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG
72 來源於IgG4之人類重鏈恆定區 ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPSCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG
73 例示性人類LAG3序列(不含信號序列) VPVVWAQEGA PAQLPCSPTI PLQDLSLLRR AGVTWQHQPD SGPPAAAPGH PLAPGPHPAA PSSWGPRPRR YTVLSVGPGG LRSGRLPLQP RVQLDERGRQ RGDFSLWLRP ARRADAGEYR AAVHLRDRAL SCRLRLRLGQ ASMTASPPGS LRASDWVILN CSFSRPDRPA SVHWFRNRGQ GRVPVRESPH HHLAESFLFL PQVSPMDSGP WGCILTYRDG FNVSIMYNLT VLGLEPPTPL TVYAGAGSRV GLPCRLPAGV GTRSFLTAKW TPPGGGPDLL VTGDNGDFTL RLEDVSQAQA GTYTCHIHLQ EQQLNATVTL AIITVTPKSF GSPGSLGKLL CEVTPVSGQE RFVWSSLDTP SQRSFSGPWL EAQEAQLLSQ PWQCQLYQGE RLLGAAVYFT ELSSPGAQRS GRAPGALPAG HLLLFLILGV LSLLLLVTGA FGFHLWRRQW RPRRFSALEQ GIHPPQAQSK IEELEQEPEP EPEPEPEPEP EPEPEQL
74 人類LAG3細胞外結構域(ECD) VPVVWAQEGA PAQLPCSPTI PLQDLSLLRR AGVTWQHQPD SGPPAAAPGH PLAPGPHPAA PSSWGPRPRR YTVLSVGPGG LRSGRLPLQP RVQLDERGRQ RGDFSLWLRP ARRADAGEYR AAVHLRDRAL SCRLRLRLGQ ASMTASPPGS LRASDWVILN CSFSRPDRPA SVHWFRNRGQ GRVPVRESPH HHLAESFLFL PQVSPMDSGP WGCILTYRDG FNVSIMYNLT VLGLEPPTPL TVYAGAGSRV GLPCRLPAGV GTRSFLTAKW TPPGGGPDLL VTGDNGDFTL RLEDVSQAQA GTYTCHIHLQ EQQLNATVTL AIITVTPKSF GSPGSLGKLL CEVTPVSGQE RFVWSSLDTP SQRSFSGPWL EAQEAQLLSQ PWQCQLYQGE RLLGAAVYFT ELSSPGAQRS GRAPGALPAG HL
75 KIEELE (LAG3細胞內結構域之一部分) KIEELE
76 引子rbHC.up aagcttgcca ccatggagac tgggctgcgc tggcttc
77 引子rbHCf.do ccattggtga gggtgcccga g
78 引子BcPCR_FHLC_leader.fw atggacatga gggtccccgc
79 引子BcPCR_huCkappa.rev gatttcaact gctcatcaga tggc
80 重鏈HVR-H1，PD1-0098 GYSITSDY
81 重鏈HVR-H2，PD1-0098 YSG
82 重鏈HVR-H3，PD1-0098 HGSAPWYFD
83 輕鏈HVR-L1，PD1-0098 SQNIVHSDGNTY
84 輕鏈HVR-L2，PD1-0098 KVS
85 輕鏈HVR-L3，PD1-0098 GSHFPL
86 重鏈可變結構域VH，PD1-0098 DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVT GYSITSDY AWNWIRQFPGDKLEWLGYIT YSG FTNYNPSLKSRISISRDTSKNQFFLQLNSVATEDTATYYCARW HGSAPWYFD YWGRGTTLTVSS
87 輕鏈可變結構域VL，PD1-0098 DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRS SQNIVHSDGNTY LEWYLQKPGQSPNLLIY KVS RRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQ GSHFPL TFGAGTKLELK
88 重鏈HVR-H1，PD1-0069 GYTFTDY
89 重鏈HVR-H2，PD1-0069 YSG
90 重鏈HVR-H3，PD1-0069 GITTGFA
91 輕鏈HVR-L1，PD1-0069 SKGVSTSSYSF
92 輕鏈HVR-L2，PD1-0069 YAS
93 輕鏈HVR-L3，PD1-0069 SREFPW
94 重鏈可變結構域VH，PD1-0069 QVQLQQSGPELVRPGVSVKISCKGS GYTFTDY AMHWVKQSHARTLEWIGVIST YSG DTNYNQKFKDKATMTVDKSSSTAYLELARMTSEDSAIYYCARL GITTGFA YWGQGTLVTVSA
95 輕鏈可變結構域VL，PD1-0069 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRA SKGVSTSSYSF MHWYQQKPRQPPKLLIK YAS YLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCHH SREFPW TFGGGTKLEIK
96 1+1型PD1/LAG3 0799之重鏈1 基於PD1(0376)/ aLAG3(0416) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVDTSDNSFIHWYQQKPGQSPKLLIYRSSTLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNYDVPWTFGQGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
97 1+1型PD1/LAG3 0799之重鏈2 evqlvesggglvqpggslrlacaasgftfsdyamswvrqapgkglewvsgidnsgyytyytdsvkgrftisrddvkntlylqmnslraedtavylctkthsglivndafdiwgqgtmvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvedyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdekvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvctlppsrdeltknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
98 1+1型PD1/LAG3 0799之輕鏈1 evqllesggglvqpggslrlscaasgfsfssytmswvrqapgkglewvatisgggrdiyypdsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycvlltgrvyfaldswgqgtlvtvssasvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
99 1+1型PD1/LAG3 0799之輕鏈2 diqltqspsslsasvgdrvtitcrasqsissylnwyqqkpgkapklliydasslesgvpsrfsgsgsgtdatltisslqpedfatyycqqsystpltfgggtkveikrtvaapsvfifppsdrklksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
100 1+1型PD1/LAG3 0927之重鏈2 基於PD1(0376)/ aLAG3(0414) Evqllesggglvqpggslrlscaasgfifddytmnwvrqapgkglewvaviswdgggtyytdsvkgrftisrddfkntlylqmnslraedtavyycakgltdttlygsdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvedyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdekvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvctlppsrdeltknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
101 1+1型PD1/LAG3 0927之輕鏈2 diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsissylnwyqqkpgkapklliyaastlqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqtysspltfgggtkveikrtvaapsvfifppsdrklksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
102 1+1型PD1/LAG3 0222之重鏈1 基於PD1(0069)/ aLAG3(MDX25F7) DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRA SKGVSTSSYSF MHWYQQKPRQPPKLLIK YAS YLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCHH SREFPW TFGGGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
103 1+1型PD1/LAG3 0222之重鏈2 qvqlqqwgagllkpsetlsltcavyggsfsdyywnwirqppgkglewigeinhngntnsnpslksrvtlsldtsknqfslklrsvtaadtavyycafgysdyeynwfdpwgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvedyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdekvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvctlppsrdeltknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
104 1+1型PD1/LAG3 0222之輕鏈1 QVQLQQSGPELVRPGVSVKISCKGS GYTFTDY AMHWVKQSHARTLEWIGVIST YSG DTNYNQKFKDKATMTVDKSSSTAYLELARMTSEDSAIYYCARL GITTGFA YWGQGTLVTVSAasvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
105 1+1型PD1/LAG3 0222之輕鏈2 eivltqspatlslspgeratlscrasqsissylawyqqkpgqaprlliydasnratgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqrsnwpltfgqgtnleikrtvaapsvfifppsdrklksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
106 1+1型PD1/LAG3 0224之重鏈1 基於PD1(0098)/ aLAG3(MDX25F7) DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRS SQNIVHSDGNTY LEWYLQKPGQSPNLLIY KVS RRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQ GSHFPL TFGAGTKLELKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
107 1+1型PD1/LAG3 0224之輕鏈1 DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVT GYSITSDY AWNWIRQFPGDKLEWLGYIT YSG FTNYNPSLKSRISISRDTSKNQFFLQLNSVATEDTATYYCARW HGSAPWYFD YWGRGTTLTVSSasvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
108 aLAG3(0156)重鏈(MDX25F7) qvqlqqwgagllkpsetlsltcavyggsfsdyywnwirqppgkglewigeinhngntnsnpslksrvtlsldtsknqfslklrsvtaadtavyycafgysdyeynwfdpwgqgtlvtvssgqpkapsvfplapccgdtpsstvtlgclvkgylpepvtvtwnsgtltngvrtfpsvrqssglyslssvvsvtsssqpvtcnvahpatntkvdktvapstcskptcpppellggpsvfifppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqddpevqftwyinneqvrtarpplreqqfnstirvvstlpiahqdwlrgkefkckvhnkalpapiektiskargqplepkvytmgppreelssrsvsltcmingfypsdisvewekngkaednykttpavldsdgsyflynklsvptsewqrgdvftcsvmhealhnhytqksisrspgk
109 aLAG3(0156)輕鏈(MDX25F7) eivltqspatlslspgeratlscrasqsissylawyqqkpgqaprlliydasnratgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqrsnwpltfgqgtnleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
110 aLAG3(0414)重鏈 evqllesggglvqpggslrlscaasgfifddytmnwvrqapgkglewvaviswdgggtyytdsvkgrftisrddfkntlylqmnslraedtavyycakgltdttlygsdywgqgtlvtvssgqpkapsvfplapccgdtpsstvtlgclvkgylpepvtvtwnsgtltngvrtfpsvrqssglyslssvvsvtsssqpvtcnvahpatntkvdktvapstcskptcpppellggpsvfifppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqddpevqftwyinneqvrtarpplreqqfnstirvvstlpiahqdwlrgkefkckvhnkalpapiektiskargqplepkvytmgppreelssrsvsltcmingfypsdisvewekngkaednykttpavldsdgsyflynklsvptsewqrgdvftcsvmhealhnhytqksisrspgk
111 aLAG3(0414)輕鏈 diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsissylnwyqqkpgkapklliyaastlqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqtysspltfgggtkveikgtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
112 aLAG3(0416)重鏈 evqlvesggglvqpggslrlacaasgftfsdyamswvrqapgkglewvsgidnsgyytyytdsvkgrftisrddvkntlylqmnslraedtavylctkthsglivndafdiwgqgtmvtvssgqpkapsvfplapccgdtpsstvtlgclvkgylpepvtvtwnsgtltngvrtfpsvrqssglyslssvvsvtsssqpvtcnvahpatntkvdktvapstcskptcpppellggpsvfifppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqddpevqftwyinneqvrtarpplreqqfnstirvvstlpiahqdwlrgkefkckvhnkalpapiektiskargqplepkvytmgppreelssrsvsltcmingfypsdisvewekngkaednykttpavldsdgsyflynklsvptsewqrgdvftcsvmhealhnhytqksisrspgk
113 aLAG3(0416)輕鏈 diqltqspsslsasvgdrvtitcrasqsissylnwyqqkpgkapklliydasslesgvpsrfsgsgsgtdatltisslqpedfatyycqqsystpltfgggtkveikgtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
114 2+2型PD1/LAG3 8970之重鏈 基於PD1(0376)/ aLAG3(0414) evqllesggglvqpggslrlscaasgfifddytmnwvrqapgkglewvaviswdgggtyytdsvkgrftisrddfkntlylqmnslraedtavyycakgltdttlygsdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvedyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdekvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgggsggggsggggsggggsevqllesggglvqpggslrlscaasgfsfssytmswvrqapgkglewvatisgggrdiyypdsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycvlltgrvyfaldswgqgtlvtvssasvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
115 2+2型PD1/LAG3 8970之輕鏈1 divmtqspdslavslgeratinckasesvdtsdnsfihwyqqkpgqspklliyrsstlesgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqnydvpwtfgqgtkveikssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepksc
116 2+2型PD1/LAG3 8984之重鏈 基於PD1(0376)/ aLAG3(0416) evqlvesggglvqpggslrlacaasgftfsdyamswvrqapgkglewvsgidnsgyytyytdsvkgrftisrddvkntlylqmnslraedtavylctkthsglivndafdiwgqgtmvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvedyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdekvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgggsggggsggggsggggsevqllesggglvqpggslrlscaasgfsfssytmswvrqapgkglewvatisgggrdiyypdsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycvlltgrvyfaldswgqgtlvtvssasvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
117 2+2型PD1/LAG3 9010之重鏈 基於PD1(0376)/ aLAG3(MDX25F7) qvqlqqwgagllkpsetlsltcavyggsfsdyywnwirqppgkglewigeinhngntnsnpslksrvtlsldtsknqfslklrsvtaadtavyycafgysdyeynwfdpwgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvedyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdekvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgggsggggsggggsggggsevqllesggglvqpggslrlscaasgfsfssytmswvrqapgkglewvatisgggrdiyypdsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycvlltgrvyfaldswgqgtlvtvssasvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
118 2+1型PD1/LAG3 8310之重鏈1 基於aLAG3(0414)/PD1(0376) evqllesggglvqpggslrlscaasgfifddytmnwvrqapgkglewvaviswdgggtyytdsvkgrftisrddfkntlylqmnslraedtavyycakgltdttlygsdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvedyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdekvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvytlppcrdeltknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgggsggggsggggsggggsevqllesggglvqpggslrlscaasgfsfssytmswvrqapgkglewvatisgggrdiyypdsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycvlltgrvyfaldswgqgtlvtvssasvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
119 2+1型PD1/LAG3 8310之重鏈2 evqllesggglvqpggslrlscaasgfifddytmnwvrqapgkglewvaviswdgggtyytdsvkgrftisrddfkntlylqmnslraedtavyycakgltdttlygsdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvedyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdekvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvctlppsrdeltknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
120 2+1型PD1/LAG3 8311之重鏈1 基於aLAG3(0416)/PD1(0376) evqlvesggglvqpggslrlacaasgftfsdyamswvrqapgkglewvsgidnsgyytyytdsvkgrftisrddvkntlylqmnslraedtavylctkthsglivndafdiwgqgtmvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvedyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdekvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvytlppcrdeltknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgggsggggsggggsggggsevqllesggglvqpggslrlscaasgfsfssytmswvrqapgkglewvatisgggrdiyypdsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycvlltgrvyfaldswgqgtlvtvssasvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
121 2+1型PD1/LAG3 8311之重鏈2 evqlvesggglvqpggslrlacaasgftfsdyamswvrqapgkglewvsgidnsgyytyytdsvkgrftisrddvkntlylqmnslraedtavylctkthsglivndafdiwgqgtmvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvedyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdekvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvctlppsrdeltknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
122 2+1型PD1/LAG3 1252之重鏈1 基於aLAG3(25F7)/PD1(0376) qvqlqqwgagllkpsetlsltcavyggsfsdyywnwirqppgkglewigeinhngntnsnpslksrvtlsldtsknqfslklrsvtaadtavyycafgysdyeynwfdpwgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvedyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdekvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvytlppcrdeltknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgggsggggsggggsggggsevqllesggglvqpggslrlscaasgfsfssytmswvrqapgkglewvatisgggrdiyypdsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycvlltgrvyfaldswgqgtlvtvssasvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
123 2+1型PD1/LAG3 8312之重鏈1 基於aLAG3(0414)/PD1(0376) evqllesggglvqpggslrlscaasgfifddytmnwvrqapgkglewvaviswdgggtyytdsvkgrftisrddfkntlylqmnslraedtavyycakgltdttlygsdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvedyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdekvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvytlppcrdeltknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgggggsggggsggggsggggsdivmtqspdslavslgeratinckasesvdtsdnsfihwyqqkpgqspklliyrsstlesgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqnydvpwtfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgecggggsggggsggggsggggsggggsggggsevqllesggglvqpggslrlscaasgfsfssytmswvrqapgkglewvatisgggrdiyypdsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycvlltgrvyfaldswgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepksc
124 2+1型PD1/LAG3 8313之重鏈1 基於aLAG3(0416)/PD1(0376) evqlvesggglvqpggslrlacaasgftfsdyamswvrqapgkglewvsgidnsgyytyytdsvkgrftisrddvkntlylqmnslraedtavylctkthsglivndafdiwgqgtmvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvedyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdekvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvytlppcrdeltknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgggggsggggsggggsggggsdivmtqspdslavslgeratinckasesvdtsdnsfihwyqqkpgqspklliyrsstlesgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqnydvpwtfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgecggggsggggsggggsggggsggggsggggsevqllesggglvqpggslrlscaasgfsfssytmswvrqapgkglewvatisgggrdiyypdsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycvlltgrvyfaldswgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepksc
125 2+1型PD1/LAG3 1088之重鏈1 基於aLAG3(25F7)/PD1(0376) qvqlqqwgagllkpsetlsltcavyggsfsdyywnwirqppgkglewigeinhngntnsnpslksrvtlsldtsknqfslklrsvtaadtavyycafgysdyeynwfdpwgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvedyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdekvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvytlppcrdeltknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgggggsggggsggggsggggsdivmtqspdslavslgeratinckasesvdtsdnsfihwyqqkpgqspklliyrsstlesgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqnydvpwtfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgecggggsggggsggggsggggsggggsggggsevqllesggglvqpggslrlscaasgfsfssytmswvrqapgkglewvatisgggrdiyypdsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycvlltgrvyfaldswgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepksc
126 2+1型PD1/LAG3 0918之重鏈1 基於aLAG3(25F7)/PD1(0376) qvqlqqwgagllkpsetlsltcavyggsfsdyywnwirqppgkglewigeinhngntnsnpslksrvtlsldtsknqfslklrsvtaadtavyycafgysdyeynwfdpwgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvctlppsrdeltknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgggggsggggsggggsggggsevqllesggglvqpggslrlscaasgfsfssytmswvrqapgkglewvatisgggrdiyypdsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycvlltgrvyfaldswgqgtlvtvss
127 2+1型PD1/LAG3 0918之重鏈2 qvqlqqwgagllkpsetlsltcavyggsfsdyywnwirqppgkglewigeinhngntnsnpslksrvtlsldtsknqfslklrsvtaadtavyycafgysdyeynwfdpwgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvytlppcrdeltknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgggggsggggsggggsggggsdivmtqspdslavslgeratinckasesvdtsdnsfihwyqqkpgqspklliyrsstlesgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqnydvpwtfgqgtkveik
128 人類PD1 UniProt登記號Q15116 MQIPQAPWPV VWAVLQLGWR PGWFLDSPDR PWNPPTFSPA LLVVTEGDNA TFTCSFSNTS ESFVLNWYRM SPSNQTDKLA AFPEDRSQPG QDCRFRVTQL PNGRDFHMSV VRARRNDSGT YLCGAISLAP KAQIKESLRA ELRVTERRAE VPTAHPSPSP RPAGQFQTLV VGVVGGLLGS LVLLVWVLAV ICSRAARGTI GARRTGQPLK EDPSAVPVFS VDYGELDFQW REKTPEPPVP CVPEQTEYAT IVFPSGMGTS SPARRGSADG PRSAQPLRPE DGHCSWPL
129 肽連接子G4S GGGGS
130 肽連接子(G4S)2 GGGGSGGGGS
131 肽連接子(SG4)2 SGGGGSGGGG
132 肽連接子(G4S)2G4 GGGGSGGGGSGGGG
133 肽連接子 GSPGSSSSGS
134 肽連接子(G4 S)3 GGGGSGGGGSGGGGS
135 肽連接子(G4 S)4 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
136 肽連接子 GSGSGSGS
137 肽連接子 GSGSGNGS
138 肽連接子 GGSGSGSG
139 肽連接子 GGSGSG
140 肽連接子 GGSG
141 肽連接子 GGSGNGSG
142 肽連接子 GGNGSGSG
143 肽連接子 GGNGSG
144 1+1型PD1/LAG3 0725 (反式1+1)之重鏈2 基於aLAG3(0414) dkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvctlppsrdeltknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkggggsggggsevqllesggglvqpggslrlscaasgfifddytmnwvrqapgkglewvaviswdgggtyytdsvkgrftisrddfkntlylqmnslraedtavyycakgltdttlygsdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvedyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdekvepksc
145 2+1型PD1/LAG3 0750 (反式2+1)之重鏈2 基於aLAG3(0414) evqllesggglvqpggslrlscaasgfifddytmnwvrqapgkglewvaviswdgggtyytdsvkgrftisrddfkntlylqmnslraedtavyycakgltdttlygsdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvedyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdekvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvctlppsrdeltknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkggggsggggsevqllesggglvqpggslrlscaasgfifddytmnwvrqapgkglewvaviswdgggtyytdsvkgrftisrddfkntlylqmnslraedtavyycakgltdttlygsdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvedyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdekvepksc
146 輕鏈 「CEA2F1 」 (CEA TCB) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASAAVGTYVA WYQQKPGKAPKLLIYSASYRKR GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYTYPLFT FGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
147 輕鏈人類化  CD3CH2527 (互換fab，VL-CH1) (CEA TCB) QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYAN WVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAP GTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWV FGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
148 CEACH1A1A 98/99 — 人類化 CD3CH2527 (Crossfab VH-Ck)—Fc(節) P329GLALA (CEA TCB) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMN WVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKG RVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAMDY WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMN WVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKG RFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAY WGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
149 CEACH1A1A 98/99 (VH-CH1)—Fc(孔) P329GLALA (CEA TCB) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
150 CD3 VH-CL (CEACAM5 TCB) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
151 人類化CEA VH-CH1(EE)-Fc (孔，P329G LALA) (CEACAM5 TCB) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANGNSKYVPKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
152 人類化CEA VH-CH1(EE)-CD3 VL-CH1-Fc (節，P329G LALA) (CEACAM5 TCB) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANGNSKYVPKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
153 人類化CEA VL-CL(RK) (CEACAM5 TCB) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAGESVDIFGVGFLHWYQQKPGQAPRLLIYRASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQTNEDPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
154 CEA-HCDR1 EFGMN
155 CEA-HCDR2 WINTKTGEATYVEEFKG
156 CEA-HCDR3 WDFAYYVEAMDY
157 CEA-LCDR1 KASAAVGTYVA
158 CEA-LCDR2 SASYRKR
159 CEA-LCDR3 HQYYTYPLFT
160 CEA VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMN WVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKG RVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAMDY WGQGTTVTVSS
161 CEA VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASAAVGTYVA WYQQKPGKAPKLLIYSASYRKR GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYTYPLFT FGQGTKLEIK
162 CEA-HCDR1 (CEACAM5) DTYMH
163 CEA-HCDR2 (CEACAM5) RIDPANGNSKYVPKFQG
164 CEA-HCDR3 (CEACAM5) FGYYVSDYAMAY
165 CEA-LCDR1 (CEACAM5) RAGESVDIFGVGFLH
166 CEA-LCDR2 (CEACAM5) RASNRAT
167 CEA-LCDR3 (CEACAM5) QQTNEDPYT
168 CEA VH (CEACAM5) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANGNSKYVPKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSS
169 CEA VL (CEACAM5) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAGESVDIFGVGFLHWYQQKPGQAPRLLIYRASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQTNEDPYTFGQGTKLEIK
以下編號段落(段)描述本發明之態樣。 1. 一種包含特異性結合至計劃性細胞死亡蛋白質1(PD1)之第一抗原結合結構域及特異性結合至淋巴細胞活化基因-3(LAG3)之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中 該特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域包含 VH結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的HVR-H1， (ii) 含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的HVR-H2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的HVR-H3；以及 VL結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的HVR-L1； (ii) 含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的HVR-L2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的HVR-L3。 2. 如第1段之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包含Fc結構域，該Fc結構域係IgG，特別是IgG1 Fc結構域或IgG4 Fc結構域且其中該Fc結構域包含一或多個減少與Fc受體，特別是與Fcγ受體之結合的胺基酸取代。 3. 如第1段或第2段之雙特異性抗體，其中該特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域包含 (a) VH結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列的HVR-H1， (ii) 含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列的HVR-H2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列的HVR-H3；以及 VL結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列的HVR-L1， (ii) 含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列的HVR-L2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 19之胺基酸序列的HVR-L3；或 (b) VH結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列的HVR-H1， (ii) 含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列的HVR-H2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列的HVR-H3；以及 VL結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列的HVR-L1， (ii) 含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列的HVR-L2，及 (iii) 含SEQ ID NO:27之胺基酸序列的HVR-L3；或 (c) VH結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列的HVR-H1， (ii) 含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列的HVR-H2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列的HVR-H3；以及 VL結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的HVR-L1， (ii) 含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的HVR-L2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 35之胺基酸序列的HVR-L3；或 (d) VH結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 38之胺基酸序列的HVR-H1， (ii) 含SEQ ID NO: 39之胺基酸序列的HVR-H2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列的HVR-H3；以及 VL結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列的HVR-L1， (ii) 含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列的HVR-L2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列的HVR-L3；或 (e) VH結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列的HVR-H1， (ii) 含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的HVR-H2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的HVR-H3；以及 VL結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列的HVR-L1， (ii) 含SEQ ID NO: 50之胺基酸序列的HVR-L2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 51之胺基酸序列的HVR-L3。 4. 如第1段至第3段中任一段之雙特異性抗體，其中該特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域包括 (a) 含SEQ ID NO:7之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:8之胺基酸序列的VL結構域，或 (b) 含SEQ ID NO:9之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:10之胺基酸序列的VL結構域，或 (c) 含SEQ ID NO:9之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:11之胺基酸序列的VL結構域，或 (d) 含SEQ ID NO:9之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:12之胺基酸序列的VL結構域，或 (e) 含SEQ ID NO:9之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:13之胺基酸序列的VL結構域。 5. 如第1段至第4段中任一段之雙特異性抗體，其中該特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域包括 (a) 含SEQ ID NO:20之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的VL結構域，或 (b) 含SEQ ID NO:28之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:29之胺基酸序列的VL結構域，或 (c) 含SEQ ID NO:36之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:37之胺基酸序列的VL結構域，或 (d) 含SEQ ID NO:44之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:45之胺基酸序列的VL結構域，或 (e) 含SEQ ID NO:52之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:53之胺基酸序列的VL結構域。 6. 如第1段至第4段中任一段之雙特異性抗體，其中該特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域包括 (a) 含SEQ ID NO:54之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:55之胺基酸序列的VL結構域，或 (b) 含SEQ ID NO:62之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:63之胺基酸序列的VL結構域，或 (c) 含SEQ ID NO:64之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:65之胺基酸序列的VL結構域，或 (d) 含SEQ ID NO:66之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:67之胺基酸序列的VL結構域。 7. 如第1段至第5段中任一段之雙特異性抗體，其中 該特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域包括含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的VL結構域， 且該特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域包括含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列的VL結構域，或含SEQ ID NO:52之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:53之胺基酸序列的VL結構域。 8. 如第1段至第5段中任一段之雙特異性抗體，其中 該特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域包括含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的VL結構域， 且該特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域包括含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列的VL結構域。 9. 如第1段至第4段或第6段中任一段之雙特異性抗體，其中 該特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域包括含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的VL結構域， 且該特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域包括含SEQ ID NO: 56之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO: 57之胺基酸序列的VL結構域。 10. 如第1段至第5段中任一段之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體係人類化或嵌合抗體。 11. 如第1段至第10段中任一段之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包含帶有胺基酸突變L234A、L235A及P329G(根據Kabat EU索引編號)的人類IgG1亞類之Fc結構域。 12. 如第1段至第11段中任一段之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包含Fc結構域，該Fc結構域包含促進該Fc結構域之第一及第二次單元締合之修飾。 13. 如第1段至第12段中任一段之雙特異性抗體，其中根據孔中節方法，該Fc結構域之第一次單元包含節且該Fc結構域之第二次單元包含孔。 14. 如第1段至第13段中任一段之雙特異性抗體，其中該Fc結構域之第一次單元包含胺基酸取代S354C及T366W(根據Kabat EU索引編號)且該Fc結構域之第二次單元包含胺基酸取代Y349C、T366S及Y407V(根據Kabat EU索引編號)。 15. 如第1段至第14段中任一段之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包括Fc結構域、包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的第一Fab片段及包含特異性結合至LAG3之抗原結合結構域的第二Fab片段。 16. 如第1段至第15段中任一段之雙特異性抗體，其中在該等Fab片段之一中，可變結構域VL與VH相互置換，使得該VH結構域成為輕鏈之一部分且該VL結構域成為重鏈之一部分。 17. 如第15段或第16段之雙特異性抗體，其中在該包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的第一Fab片段中，可變結構域VL與VH相互置換。 18. 如第1段至第17段中任一段之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包含Fab片段，其中在恆定結構域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat EU索引編號)，且在恆定結構域CH1中，位置147及213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。 19. 如第15段至第18段中任一段之雙特異性抗體，其中在該包含特異性結合至LAG3之抗原結合結構域的第二Fab片段中，在恆定結構域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat EU索引編號)，且在恆定結構域CH1中，位置147及213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。 20. 如第1段至第19段中任一段之雙特異性抗體，其包括 (a) 包含與SEQ ID NO:96之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:98之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一輕鏈， 包含與SEQ ID NO:97之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈，及包含與SEQ ID NO:99之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二輕鏈，或 (b) 包含與SEQ ID NO:96之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:98之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一輕鏈， 包含與SEQ ID NO:100之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈，及包含與SEQ ID NO:101之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二輕鏈，或 (c) 包含與SEQ ID NO:102之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:104之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一輕鏈， 包含與SEQ ID NO:103之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈，及包含與SEQ ID NO:105之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二輕鏈，或 (d) 包含與SEQ ID NO:106之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:107之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一輕鏈， 包含與SEQ ID NO:103之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈，及包含與SEQ ID NO:105之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二輕鏈。 21. 如第1段至第19段中任一段之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包括含特異性結合至LAG3之抗原結合結構域的第三Fab片段。 22. 如第1段至第19段或第21段中任一段之雙特異性抗體，其中該各自包含特異性結合至LAG3之抗原結合結構域的兩個Fab片段係相同的。 23. 如第1段至第19段或第21段或第22段中任一段之雙特異性抗體，其中該包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的Fab片段經由肽連接子與該等重鏈之一的C末端融合。 24. 如第1段至第19段或第21段至第23段中任一段之雙特異性抗體，其包括 (a) 包含與SEQ ID NO:118之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:115之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一輕鏈， 包含與SEQ ID NO:119之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈，及包含與SEQ ID NO:101之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二輕鏈，或 (b) 包含與SEQ ID NO:120之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:115之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一輕鏈， 包含與SEQ ID NO:121之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈，及包含與SEQ ID NO:99之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二輕鏈，或 (c) 包含與SEQ ID NO:122之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:115之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一輕鏈， 包含與SEQ ID NO:103之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈，及包含與SEQ ID NO:105之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二輕鏈。 25. 如第1段至第19段或第21段至第23段中任一段之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包括含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的第四Fab片段。 26. 如第1段至第19段或第21段至第23段或第25段中任一段之雙特異性抗體，其中該各自包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的兩個Fab片段係相同的。 27. 如第1段至第19段或第21段至第23段或第25段或第26段中任一段之雙特異性抗體，其中該各自包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的兩個Fab片段各自分別經由肽連接子與該等重鏈之一的C末端融合。 28. 如第1段至第19段或第21段至第23段或第25段至第27段中任一段之雙特異性抗體，其包括 (a) 各自包含與SEQ ID NO:114之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條重鏈、各自包含與SEQ ID NO:115之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條第一輕鏈及各自包含與SEQ ID NO:101之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條第二輕鏈，或 (b) 各自包含與SEQ ID NO:116之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條重鏈、各自包含與SEQ ID NO:115之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條第一輕鏈及各自包含與SEQ ID NO:99之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條第二輕鏈，或 (c) 各自包含與SEQ ID NO:117之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條重鏈、各自包含與SEQ ID NO:115之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條第一輕鏈及包含與SEQ ID NO:105之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條第二輕鏈。 29. 如第1段至第14段中任一段之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包括Fc結構域、各自包含特異性結合至LAG3之抗原結合結構域的兩個Fab片段及包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的單鏈Fab(scFab)。 30. 如第1段至第14段或第29段中任一段之雙特異性抗體，其中該包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的scFab經由肽連接子與該等重鏈之一的C末端融合。 31.如第1段至第14段或第29段或第30段中任一段之雙特異性抗體，其包括 (a) 包含與SEQ ID NO:123之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:119之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈及各自包含與SEQ ID NO:101之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條輕鏈，或 (b) 包含與SEQ ID NO:124之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:121之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈及各自包含與SEQ ID NO:99之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條輕鏈，或 (c) 包含與SEQ ID NO:125之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:103之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈及包含與SEQ ID NO:105之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二輕鏈。 32. 如第1段至第14段中任一段之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包括Fc結構域、各自包含特異性結合至LAG3之抗原結合結構域的兩個Fab片段以及包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的VH及VL結構域。 33. 如第1段至第14段或第32段中任一段之雙特異性抗體，其中該包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的VH結構域經由肽連接子與該等重鏈之一的C末端融合且該包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的VL結構域經由肽連接子與另一個重鏈之C末端融合。 34. 如第1段至第14段或第32段或第33段中任一段之雙特異性抗體，其包括：包含與SEQ ID NO:126之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:127之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈，及各自包含與SEQ ID NO: 109之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條輕鏈。 35. 一種編碼如第1段至第34段中任一段之雙特異性抗體的聚核苷酸。 36. 一種包含如第35段之聚核苷酸的載體，特別是表現載體。 37. 一種包含如第35段之聚核苷酸或如第36段之載體的原核或真核宿主細胞。 38. 一種製造如第1段至第34段之雙特異性抗體的方法，其包含在適於表現該雙特異性抗體之條件下培養如第37段之宿主細胞及自培養物回收該雙特異性抗體。 39. 一種醫藥組合物，其包含如第1段至第34段中任一段之雙特異性抗體及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。 40. 如第1段至第34段中任一段之雙特異性抗體或如第39段之醫藥組合物，其係用作藥物。 41. 如第1段至第34段中任一段之雙特異性抗體或如第39段之醫藥組合物，其係用於 i) 調節免疫反應，諸如恢復T細胞活性， ii) 刺激T細胞反應， iii) 治療感染， iv) 治療癌症， v) 延遲癌症進展， vi) 延長罹患癌症之患者的存活期。 42. 如第1段至第34段中任一段之雙特異性抗體或如第39段之醫藥組合物，其係用於預防或治療癌症。 43. 如第1段至第34段中任一段之雙特異性抗體或如第39段之醫藥組合物，其係用於治療慢性病毒感染。 44. 如第1段至第34段中任一段之雙特異性抗體或如第39段之醫藥組合物，其係用於預防或治療癌症，其中該雙特異性抗體係與化學治療劑、放射及/或用於癌症免疫療法之其他藥劑組合投與。 45. 一種抑制個體體內腫瘤細胞生長之方法，其包含向該個體投與有效量的如第1段至第34段中任一項之雙特異性抗體以抑制該等腫瘤細胞之生長。實例 以下為本發明之方法及組合物之實例。應理解，根據上文所提供之一般說明，可以實施各種其他實施例。材料及通用方法 關於人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈之核苷酸序列之總體資訊在以下中給出：Kabat, E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)。抗體鏈之胺基酸係根據如上文所定義之Kabat(Kabat, E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))之編號系統編號並提及。 重組DNA技術 使用如Sambrook, J.等人，Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989中所述之標準方法操作DNA。分子生物試劑係根據製造商之說明書使用。 基因合成 由利用化學合成法製備之寡核苷酸製備所需基因區段。藉由黏接並連接寡核苷酸，包括PCR擴增來組裝側接單一限制核酸內切酶裂解位點之600-1800 bp長基因區段，且隨後經由指定限制性位點，例如KpnI/SacI或AscI/PacI選殖至基於pPCRScript (Stratagene)之pGA4選殖載體中。藉由DNA測序確定次選殖之基因片段的DNA序列。在Geneart (Regensburg, Germany)處，根據所給說明對基因合成片段定序。 DNA序列測定 在MediGenomix GmbH (Martinsried, Germany)或Sequiserve GmbH (Vaterstetten, Germany)處，藉由雙股測序測定DNA序列。 DNA及蛋白質序列分析及序列資料管理 使用GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin)套裝軟體10.2版及Infomax之Vector NT1 Advance套件8.0版進行序列創建、圖譜分析、分析、註釋及圖示。 表現載體 為表現所述抗體，基於利用或不利用CMV-內含子A啟動子之cDNA組織或基於利用CMV啟動子之基因組組織，應用表現質體之變異體進行細胞短暫表現(例如HEK293中)。 除了抗體表現卡匣之外，載體亦含有： - 允許此質體在大腸桿菌中複製之複製起點，及 - 在大腸桿菌中賦予安比西林(ampicillin)抗性之β-內醯胺酶基因。 抗體基因之轉錄單元由以下元件構成： -  在5'端之獨特限制性位點， - 來自人類巨細胞病毒之即刻早期強化子及啟動子， - 在cDNA組織化之情況下，之後為內含子A序列， - 人類抗體基因之5'非轉譯區， - 免疫球蛋白重鏈信號序列， - 存在免疫球蛋白外顯子-內含子組織的呈cDNA或呈基因組組織之人類抗體鏈(野生型或具有結構域交換) - 含聚腺苷酸化信號序列之3'非轉譯區，及 - 在3'端之獨特限制性位點。 藉由PCR及/或基因合成產生包含如下所述之抗體鏈的融合物基因並利用已知重組方法及技術，藉由使用例如各別載體中之獨特限制性位點連接相應核酸區段進行組裝。藉由DNA測序檢驗次選殖之核酸序列。對於短暫轉染，藉由質體製備，自轉型之大腸桿菌培養物(Nucleobond AX，Macherey-Nagel)製備大量質體。 細胞培養技術 使用如Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J.及Yamada, K.M. (編), John Wiley & Sons, Inc中所描述的標準細胞培養技術。 如下所述，在貼壁生長之HEK293-EBNA中或在懸浮生長之HEK29-F細胞中，藉由各別表現質體之短暫共轉染來表現多特異性抗體。 HEK293系統中之短暫轉染 藉由使用Freestyle系統(ThermoFisher)短暫轉染293F細胞，產生所有抗體及雙特異性抗體。此處，在F17培養基中培養293F細胞，經293Free (Novagene)轉染且在4小時後饋入VPA 4mM及Feed 7且在16小時後饋入0.6%葡萄糖。此外，使用Expi293F™表現系統套組(ThermoFisher)。此處，在Expi293™表現培養基中培養Expi293F™細胞且使用ExpiFectamine™ 293轉染套組，根據製造商之說明書進行轉染。由於在CH1/CL界面中另外引入帶電胺基酸對之 CrossMAbVh-VL 雙特異性抗體之穩定性及純度提高及聚集傾向降低(有關進一步詳情，參見各別序列中之位置)，故未調整質體比率。因此，對於LC、HC、雜交LC及雜交HC質體之共轉染，1+1型CrossMab使用1:1:1:1之相對質體比率，或2+2型CrossMab使用1:1:1之相對質體比率。在7天後收集細胞上清液並藉由標準方法純化。 蛋白質測定 根據Pace等人，Protein Science 1995, 4, 2411-1423，使用基於胺基酸序列計算的莫耳消光係數，藉由在280 nm下測定光密度(OD)來測定純化抗體及衍生物之蛋白質濃度。 上清液中抗體濃度之測定 藉由用蛋白質A瓊脂糖-珠粒(Roche)進行免疫沈澱，估計細胞培養物上清液中抗體及衍生物之濃度。在TBS-NP40 (50 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl、1% Nonidet-P40)中洗滌60 µL蛋白質A瓊脂糖珠粒三次。隨後，將1-15 mL細胞培養物上清液施加至在TBS-NP40中預先平衡之蛋白質A瓊脂糖珠粒上。在室溫下培育1小時後，珠粒在Ultrafree-MC-過濾器管柱(Amicon)上用0.5 mL TBS-NP40洗滌一次，用0.5 mL 2x磷酸鹽緩衝生理食鹽水(2xPBS，Roche)洗滌兩次，且短暫地用0.5 mL 100 mM檸檬酸鈉 pH 5.0洗滌四次。藉由添加35 µl NuPAGE® LDS樣本緩衝液(Invitrogen)來溶離細胞經結合之抗體。分別將一半樣本與NuPAGE®樣本還原劑組合或保持未還原，且在70℃下加熱10分鐘。最後，將5-30 µl施加至4-12% NuPAGE® Bis-Tris SDS-PAGE (Invitrogen) (對於非還原性SDS-PAGE，利用MOPS緩衝液，且對於還原性SDS-PAGE，利用含NuPAGE®抗氧化劑操作緩衝液添加劑(Invitrogen)之MES緩衝液)，且用考馬斯藍(Coomassie Blue)染色。 藉由親和HPLC層析來定量地量測細胞培養物上清液中抗體及衍生物之濃度。簡言之，將含有結合至蛋白質A之抗體及衍生物的細胞培養物上清液以200 mM KH2PO4、100 mM檸檬酸鈉pH 7.4施加至Applied Biosystems Poros A/20管柱上，且在Agilent HPLC 1100系統上用200 mM NaCl、100 mM檸檬酸pH 2.5自基質溶離。藉由UV吸光度及峰面積之積分來定量溶離之蛋白質。純化之標準IgG1抗體充當標準品。 或者，藉由夾心-IgG-ELISA來量測細胞培養物上清液中抗體及衍生物之濃度。簡言之，用100微升/孔0.1 µg/mL之生物素化抗人類IgG捕捉分子F(ab')2＜h-Fcγ＞ BI (Dianova)塗佈StreptaWell高度結合抗生物素蛋白鏈菌素A (StreptaWell High Bind Strepatavidin A)-96孔微量滴定盤(Roche)，在室溫下保持1小時，或者在4℃下保持隔夜，且隨後用200微升/孔PBS、0.05%吐溫(Tween) (PBST, Sigma)洗滌三次。將含有各別抗體之細胞培養物上清液於PBS(Sigma)中之連續稀釋液以100微升/孔添加至各孔中，且在室溫下於微量滴定盤振盪器上培育1-2小時。用200微升/孔PBST洗滌各孔三次，且在室溫下，在微量滴定盤振盪器上用100 µl之0.1 µg/mL F(ab')2＜hFcγ＞POD (Dianova)作為偵測抗體經1-2小時來偵測經結合抗體。用200微升/孔PBST洗滌未結合之偵測抗體三次，且藉由添加每孔100 µL ABTS偵測經結合之偵測抗體。在Tecan Fluor光譜儀上，在405 nm量測波長(參考波長492 nm)下測定吸光度。 蛋白質純化 參考標準方案，自經過濾之細胞培養物上清液純化蛋白質。簡言之，將抗體施加至蛋白質A瓊脂糖凝膠管柱(GE Healthcare)上並用PBS洗滌。在pH 2.8下實現抗體之溶離，隨後立即中和樣本。藉由尺寸排阻層析法(Superdex 200，GE Healthcare)，在PBS中或在20 mm組胺酸、150 mM NaCl pH 6.0中將聚集之蛋白質與單體抗體分離。彙集單體抗體溶離份，使用例如MILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO)離心濃縮器濃縮(必要時)，冷凍並在-20℃或-80℃下儲存。提供部分樣本，例如藉由SDS-PAGE、尺寸排阻層析法(SEC)或質譜法進行後續蛋白質分析及分析型表徵。 SDS-PAGE NuPAGE®預製膠系統(Invitrogen)係根據製造商說明書使用。確切地說，使用10%或4-12% NuPAGE® Novex® Bis-TRIS預製膠(pH 6.4)及NuPAGE® MES(還原性凝膠，含NuPAGE®抗氧化劑操作緩衝液添加劑)或MOPS (非還原性凝膠)操作緩衝液。 分析型尺寸排阻層析法 利用HPLC層析法進行尺寸排阻層析(SEC)以測定聚集及寡聚狀態之抗體。簡言之，將蛋白質A純化之抗體以300 mM NaCl、50 mM KH2 PO4 /K2 HPO4 (pH 7.5)施加至Agilent HPLC 1100系統上之Tosoh TSKgel G3000SW管柱上或以2×PBS施加至Dionex HPLC系統上之Superdex 200管柱(GE Healthcare)上。藉由UV吸光度及峰面積之積分來定量溶離之蛋白質。BioRad凝膠過濾標準品(Gel Filtration Standard) 151-1901用作標準品。 質譜法 此部分描述具有VH/VL交換之多特異性抗體(VH/VL CrossMab)的特徵，其中強調其正確組裝。藉由電噴霧電離質譜(ESI-MS)分析去糖基化之完整CrossMab及去糖基化/纖維蛋白溶酶消化或以其他方式去糖基化/限制性LysC消化之CrossMab的預期一級結構。 在37℃下，用N-糖苷酶F使在磷酸鹽或Tris緩衝液中蛋白質濃度為1 mg/ml之VH/VL CrossMab去糖基化，保持17小時。纖維蛋白溶酶或限制性LysC (Roche)消化係在含100 μg去糖基化之VH/VL CrossMab之Tris緩衝液pH 8中分別在室溫下進行120小時及在37℃下進行40分鐘。在質譜法之前，在Sephadex G25管柱(GE Healthcare)上經由HPLC使樣本脫鹽。在配備有TriVersa NanoMate源(Advion)之maXis 4G UHR-QTOF MS系統(Bruker Daltonik)上經由ESI-MS測定總質量。 使用表面電漿子共振(SPR) (BIACORE)測定多特異性抗體與各別抗原之結合及結合親和力 藉由表面電漿子共振，使用BIACORE儀器(GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Sweden)研究所產生之抗體與各別抗原之結合。使用相應Biacore評價軟體(Evaluation Software)進行感測器圖譜之分析及親和力資料之計算。 實例1 產生抗PD-1抗體小鼠免疫接種 使用編碼全長人類PD-1之質體表現載體，藉由皮內施用100 μg載體DNA (質體15300_hPD1-fl)，隨後電穿孔(2個1000 V/cm之方形脈衝，持續時間0.1 ms，時間間隔0.125 s；隨後4個287.5 V/cm之方形脈衝，持續時間10 ms，時間間隔0.125 s)對NMRI小鼠進行基因免疫接種。小鼠在第0、14、28、42、56、70及84天接受6次連續免疫接種。在第36、78及92天獲取血液且製備血清，用於藉由ELISA進行之力價測定(參見下文)。選擇具有最高力價之動物在第96天藉由靜脈內注射50 μg重組人類PD1人類Fc嵌合體來增強免疫，且利用融合瘤技術，藉由在增強免疫之後3天使脾細胞與骨髓瘤細胞株融合來分離單株抗體。測定血清力價 (ELISA) 將100微升/孔於PBS中0.3 μg/mL之人類重組PD1人類Fc嵌合體固定於96孔NUNC Maxisorp盤上，隨後：用200微升/孔含2% Crotein C之PBS阻斷該盤；一式兩份，以100微升/孔施加抗血清於含0.5% Crotein C之PBS中之連續稀釋液；用偶聯HRP之山羊抗小鼠抗體(Jackson Immunoresearch/Dianova 115-036-071；1/16 000)偵測。對於所有步驟，盤均在37℃下培育1小時。在所有步驟之間，用含0.05%吐溫20之PBS洗滌盤3次。藉由以100微升/孔添加BM Blue POD可溶性受質(Roche)來產生信號；且藉由以100微升/孔添加1 M HCl來停止。以690 nm作為參考，讀出在450 nm下之吸光度。力價定義為產生半數最大信號之抗血清的稀釋度。 實例2 表徵抗PD1抗體/抗PD1抗體與人類PD1之結合 針對hu PD1之ELISA 用25微升/孔生物素化PD1-ECD-AviHis塗佈Nunc maxisorp經抗生物素蛋白鏈菌素塗佈之盤(MicroCoat #11974998001)且在4℃下培育隔夜。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST緩衝液)之後，添加25 µl抗PD1樣本或參考抗體(人類抗PD1；Roche/小鼠抗PD1；Biolegend；目錄號：329912)並在室溫下培育1小時。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST緩衝液)之後，添加25微升/孔以1:2000/1:1000稀釋之山羊抗人類H+L-POD (JIR，JIR109-036-088)/綿羊抗小鼠-POD (GE Healthcare；NA9310)且在室溫下在振盪器上培育1小時。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST緩衝液)之後，添加25微升/孔的TMB受質(Roche目錄號11835033001)並培育直至OD 2-3。在370/492 nm下進行量測。 ELISA結果以EC50 值[ng/ml]列於以下綜合列表1及2中。 針對PD1之細胞ELISA 將用編碼全長人類PD1之質體15311_hPD1-fl_pUC_Neo穩定轉染且用G418 (質體上之新黴素抗性標記物)選擇之貼壁CHO-K1細胞株以0.01×10E6個細胞/孔之濃度接種至384孔平底盤中並使其生長隔夜。 次日，添加25微升/孔PD1樣本或人類抗PD1 (Roche)/小鼠抗PD1 (Biolegend；目錄號：329912)參考抗體且在4℃下培育2小時(以避免內化)。在小心地洗滌(1×90微升/孔PBST)之後，藉由添加30微升/孔在1×PBS緩衝液中稀釋之0.05%戊二醛(Sigma，目錄號G5882，25%)來固定細胞且在室溫下培育10分鐘。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST)之後，添加25微升/孔的二次抗體用於偵測：山羊抗人類H+L-POD (JIR, JIR109-036-088)/綿羊抗小鼠-POD (GE NA9310)，隨後在室溫下在振盪器上培育1小時。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST)之後，添加25微升/孔TMB受質溶液(Roche 11835033001)並培育直至OD 1.0-2.0。在370/492 nm下量測盤。 細胞ELISA結果以「EC50 CHO-PD1」值[ng/ml]列於以下綜合列表2中。 針對食蟹獼猴PD1之ELISA 用25微升/孔生物素化cynoPD1-ECD-生物素塗佈Nunc maxisorp經抗生物素蛋白鏈菌素塗佈之盤(MicroCoat #11974998001)且在4℃下培育隔夜。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST緩衝液)之後，添加25 μl抗PD1樣本或參考抗體(人類抗PD1；Roche)並在室溫下在振盪器上培育1小時。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST緩衝液)之後，添加25微升/孔以1:1000稀釋之山羊抗人類H+L-POD (JIR, JIR109-036-088)並在室溫下在振盪器上培育1小時。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST緩衝液)之後，添加25微升/孔的TMB受質(Roche，11835033001)且培育直至OD 2-3。在370/492 nm下進行量測。 ELISA結果以EC50 值[ng/ml]列於以下綜合列表1及2中。 PD配位體1置換分析 用25微升/孔生物素化PD1-ECD-AviHis塗佈Nunc maxisorp經抗生物素蛋白鏈菌素塗佈之盤(MicroCoat #11974998001)且在4℃下培育隔夜。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST緩衝液)之後，添加25 µl抗PD1樣本或參考抗體(小鼠抗PD1；Biolegend；目錄號：329912)且在室溫下在振盪器上培育1小時。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST緩衝液)之後，添加25微升/孔PD-L1 (重組人類B7-H1/PD-L1 Fc嵌合體；156-B7，R&D)且在室溫下在振盪器上培育1小時。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST緩衝液)之後，添加25微升/孔以1:1000稀釋之山羊抗人類H+L-POD (JIR，109-036-088)並在室溫下在振盪器上培育1小時。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST緩衝液)之後，添加25微升/孔的TMB受質(Roche，11835033001)且培育直至OD 2-3。在370/492 nm下進行量測。 ELISA結果以IC50 值[ng/ml]列於以下綜合列表1中。 PD配位體2置換分析 用25微升/孔生物素化PD1-ECD-AviHis塗佈Nunc maxisorp經抗生物素蛋白鏈菌素塗佈之盤(MicroCoat #11974998001)且在4℃下培育隔夜。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST緩衝液)之後，添加25 μl抗PD1樣本或參考抗體(小鼠抗huPD1；Roche)並在室溫下在振盪器上培育1小時。洗滌(每孔使用3×90微升之之PBST緩衝液)之後，添加25微升/孔PD-L2 (重組人類B7-DC/PD-L2 Fc嵌合體；1224-PL-100，R&D)且在室溫下在振盪器上培育1小時。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST緩衝液)之後，添加25微升/孔以1:2000稀釋之山羊抗人類H+L-POD (JIR，109-036-088)並在室溫下在振盪器上培育1小時。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST緩衝液)之後，添加25微升/孔的TMB(四甲基聯苯胺)受質(Roche，#11835033001)且培育直至OD 2-3。在370/492 nm下進行量測。 ELISA結果以IC50 值[ng/ml]列於以下綜合列表1中。 抗原決定基圖譜分析ELISA/結合競爭分析 用25微升/孔捕捉抗體(山羊抗小鼠IgG；JIR；115-006-071)塗佈Nunc maxisorp盤(Nunc #464718)且在室溫下在振盪器上培育1小時。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST緩衝液)之後，在室溫下在振盪器上用含有2% BSA之PBS緩衝液阻斷盤1小時。洗滌(每孔使用3×90微升之之PBST緩衝液)之後，添加25 μl小鼠抗PD1樣本且在室溫下在振盪器上培育1小時。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST緩衝液)之後，在室溫下在振盪器上用30微升/孔小鼠IgG (JIR；015-000-003)阻斷捕捉抗體1小時。同時，在室溫下在振盪器上將生物素化PD1-ECD-AviHis與第二樣本抗體一起預培育1小時。洗滌分析盤(每孔使用3×90微升之PBST緩衝液)之後，將PD1抗體混合物轉移至分析盤上並在室溫下在振盪器上培育1小時。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST緩衝液)之後，添加25微升/孔1:4000稀釋之抗生物素蛋白鏈菌素POD (Roche，#11089153001)且在室溫下在振盪器上培育1小時。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST緩衝液)之後，添加25微升/孔的TMB受質(Roche，#11089153001)且培育直至OD 1.5-2.5。在370/492 nm下進行量測。抗原決定基群係藉由針對參考抗體進行階層式群集來定義。表 1 ： 例示性抗體之結合、 PD - L1 抑制及抗原決定基區域群 ( ELISA )
抗體 ELISA huPD1 EC50 [ng/ml] ELISA cyPD1 EC50 [ng/ml] ELISA PD-L1抑制 IC50 [ng/ml] ELISA PD-L2抑制 IC50 [ng/ml] 抗原決定基區域群 (藉由競爭分析測定)
PD1- 0050 17.9 9.8 128 34 1
PD1- 0069 45.7 22.7 225 89 6
PD1- 0073 15.1 8.3 124 65 5
PD1- 0078 26.3 22.4 x 86 2
PD1- 0098 50.8 54.6 174 45 5
PD1- 0102 34.2 52.7 ＞35.5 µg/ml 140 4
PD1-0103 33.7 36.9 182 51 5
表 2 ： 來源於親本小鼠抗體 PD1 - 0103 之 人類化 PD1 抗體之生物化學及細胞結合 ( ELISA )
人類化抗體 ELISA huPD1 EC50 [ng/ml] ELISA cyPD1 EC50 [ng/ml] ELISA CHO-PD1 EC50 [ng/ml]
PD1-103-0312 11 8.3 10.1
PD1-103-0313 15 11 10.8
PD1-103-0314 11 8.3 7.7
PD1-103-0315 10 7.9 7.3
人類化抗PD-1抗體之Biacore表徵 已使用基於表面電漿子共振(SPR)之分析來測定若干鼠類PD1結合劑以及市售人類PD1結合參考物之間之結合的動力學參數。因此，抗人類IgG藉由與(Biacore) CM5感測器晶片表面經歷胺偶合進行固定。接著，捕捉樣本且使hu PD1-ECD與其結合。在每個分析週期之後，使感測器晶片表面再生。最後，藉由將資料擬合至1:1朗格繆爾相互作用模型(langmuir interaction model)獲得平衡常數及動力學速率常數。 藉由使用GE Healthcare供應之胺偶合套組在pH 5.0下將約2000個反應單位(RU)之20 μg/ml抗人類IgG (GE Healthcare #BR-1008-39)偶合至Biacore T200中CM5感測器晶片之流槽1及2 (或者：3及4)上。 樣本及操作緩衝液係HBS-EP+ (0.01 M HEPES、0.15 M NaCl、3 mM EDTA、0.05% v/v界面活性劑P20，pH 7.4)。流槽溫度設定為25℃且樣本隔室溫度設定為12℃。用操作緩衝液預處理系統。 經20秒注入濃度為10 nM之樣本且使其與第二流槽結合。接著，在各樣本上注射一整組濃度(144 nM、48 nM、16 nM、5.33 nM、1.78 nM、0.59 nM、0.20 nM及0 nM)之人類PD1-ECD，保持120秒，隨後為30/300秒之解離時間及兩個用3 M MgCl2 進行之20秒再生步驟，其中最後一個步驟含有用操作緩衝液進行「注射後額外洗滌」。 最後，用Biacore T200評價軟體將雙重參考資料擬合至1:1朗格繆爾相互作用模型。由此得到的KD 、ka 及kd 值示於表3中。表 3 ： 藉由 Biacore 測定的嵌合 PD1 - 0103 及人類化 PD1 - Ab 之動力學速率常數及平衡常數
配位體 k a [M-1 s-1 ] k d [s-1 ] K D  [nM]
嵌合PD1-0103 3.86E+05 3.07E-04 0.8
PD1-0103-0312 1.95E+05 3.45E-04 1.8
PD1-0103-0313 1.60E+05 3.67E-04 2.3
PD1-0103-0314 1.87E+05 2.79E-04 1.5
PD1-0103-0315 1.89E+05 2.91E-04 1.5
如表3中所示，嵌合PD1-0103 (產生參見實例6)之所有人類化形式均展示與親本抗體(嵌合PD1-0103)類似之動力學特性。 動力學 根據製造商之說明書，將S系列CM5感測器安裝至Biacore 4000系統中並以水動力方式確定偵測點。 將多株兔IgG抗體＜IgGFCγM＞R (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.)以10000 Ru固定於流槽1、2、3及4中之偵測點1及5上。根據製造商之說明書，經由EDC/NHS化學法完成偶合。流槽中之其餘點充當參照。樣本緩衝液係補充有1 mg/ml羧甲基葡聚糖之系統緩衝液。 在一個實施例中，該分析係在25℃下驅動。在另一實施例中，該分析係在37℃下驅動。藉由以10 µl/min經1分鐘注射將50 nM之每一鼠類單株抗體捕捉於感測器表面上。隨後，以30 μl/min注射100 nM、2×33 nM、11 nM、4 nM、1 nM及系統緩衝液0 nM濃度系列之各別抗原，保持4分鐘締合期時間。再監測解離4分鐘。藉由以30 µl/min經3分鐘注射10 mM甘胺酸(pH 1.5)來使捕捉系統再生。根據製造商說明書，使用Biacore評價軟體計算相關動力學資料。 抗原決定基圖譜分析 將Biacore CAP感測器安裝至Biacore 4000儀錶上且根據製造商之推薦進行準備。儀器緩衝液係HBS-ET (10 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.005% w/v吐溫20)。在25℃下操作儀器。 將所有樣本稀釋於系統緩衝液中。藉由以30 µl/min經1分鐘注射於流槽1、2、3及4中在點1及5中，將35kDa生物素化抗原PD1-ECD-AviHis以200 RU捕捉於CAP感測器表面上。點2、3及4充當參考。在另一實施例中，以同樣的方式將35 kDa生物素化抗原PD1-ECD-AviHis以200 RU捕捉於CAP感測器上。 隨後，以30 µl/min經3分鐘注射100 nM一次抗體，接著以30 µl/min經3分鐘注射100 nM二次抗體。注射一次抗體直至表面呈現之抗原完全飽和。在一次抗體及二次抗體注射期結束時，設定報導點「結合後期」 (Binding Late，BL)以監測各別抗體之結合反應。計算二次抗體結合反應「BL2」與一次抗體反應「BL1」之間的莫耳比，即商。該莫耳比用作當抗原與一次抗體形成複合物時二次抗體之抗原接近性之指標。 根據製造商推薦，藉由以30 µl/min經2分鐘注射2 M鹽酸胍250 nM NaOH再生緩衝液，隨後以30 µl/min經1分鐘注射系統緩衝液，自感測器表面完全移除該等複合物。 實例3 混合淋巴細胞反應(MLR)中不同抗PD-1抗體對細胞介素產生之影響3A) 混合淋巴細胞反應(MLR)係度量來自一個體(供體X)之淋巴細胞相對於來自另一個體(供體Y)之淋巴細胞之活化情況的免疫細胞分析。混合淋巴細胞反應係用於展示阻斷PD1至淋巴細胞效應細胞之路徑的影響。在該分析中測試在存在或不存在抗PD1 mAb下T細胞之活化及其IFNγ分泌。 為進行同種異體MLR，藉由密度梯度離心，使用Leukosep (Greiner Bio One, 227 288)自至少四個HLA類型未知之健康供體分離出末梢血液單核細胞(PBMC)。簡言之，用三倍體積之PBS稀釋肝素化血液樣本並將稀釋血液之25 ml等分試樣鋪在50 ml Leukosep管中。在室溫下以800×g下離心15分鐘(無暫停)之後，收集含有淋巴細胞之部分，在PBS中洗滌並直接用於功能性分析中，或以1.0E+07個細胞/毫升再懸浮於冷凍培養基(10% DMSO、90% FCS)中並儲存於液氮中。藉由以1:1之刺激物/響應細胞比率混合來自兩個不同供體之PBMC設定個體之雙向MLR反應，且至少一式兩份，在平底96孔盤中在37℃及5% CO2 下，在存在或不存在不同濃度範圍之經純化抗PD1單株抗體PD1-0050、PD1-0069、PD1-0073、PD1-0078、PD1-0098、PD1-0102、PD1-0103之情況下共培養6天。作為參考抗PD1抗體，用人類IgG1之主鏈(具有突變L234A、L235A及P329G (Kabat EU索引))合成及選殖包含納武單抗(亦稱為MDX-5C4或MDX-1106)或帕博利珠單抗(亦稱為MK-3475或Org 1.09A)之VH及VL結構域的抗體。使用無抗體情形或使用同型對照抗體作為陰性對照並使用rec hu IL-2 (20 EU/ml)作為陽性對照。在第6天之後，自各培養物取出100 µl培養基用於量測細胞介素。使用OptEIA ELISA套組(BD Biosciences)量測IFN-γ之含量。 結果示於表4中(IFNγ分泌/釋放)。抗PD1單株抗體以濃度依賴性方式促進T細胞活化及IFNγ分泌。相對於在不添加任何阻斷mAb下之MLR(基礎同種異體刺激誘導之IFNγ值，表示為E-c)及添加20 EU/ml rec hu IL-2下之MLR(陽性對照=100% IFNγ值，表示為E+c)的IFNγ產量來計算IFNγ分泌之增加百分比值且根據下式計算：相對刺激 [%]  = ((實例- E-c)/(E+c - E-c)×100。表 4 ：相較於作為陽性對照之重組人類 IL-2 治療 (20 EU/ml) (=100% 增加 ) 之影響，在同種異體刺激及用抗 PD-1 抗體治療之後 IFNγ 分泌之百分比
   濃度(µg/ml) 1:12 1:120 1:1200 MLR之影響
PD1-0050 44 136 96 33 +++
PD1-0069 60 76 71 55 +++
PD1-0073 43 103 63 38 ++
PD1-0078 64 99 72 21 ++
若干PD1阻斷抗體PD1-0050、PD1-0069、PD1-0073、PD1-0078、PD1-0098、PD1-0102、PD1-0103藉由增進干擾素γ (IFNγ)之分泌而展示強烈的免疫調節活性(全部抗體之資料未示出)。3B) 在另一實驗中，評價嵌合PD1-0103 (具有突變L234A、L235A及P329G (Kabat EU索引)之人類IgG1同型)。用嵌合PD1-0103阻斷PD1明顯增加同種異體刺激之原代人類T細胞之IFN-γ分泌。嵌合PD1-0103比參考抗PD1抗體有效。為進行比較，用人類IgG1 (具有突變L234A、L235A及P329G (Kabat EU索引))之主鏈合成及選殖包含納武單抗(亦稱為MDX5C4或MDX-1106)及帕博利珠單抗(亦稱為MK-3475或Org 1.09A)之VH及VL結構域的參考抗PD1抗體。3C) 在其他實驗中，如上所述在MLR中評價抗PD-1抗體PD1-0103之人類化變異體(人類化抗體PD1-0103-0312、PD1-0103-0314，圖2及3，亦參見以下實例9)的免疫調節活性：a) IFNγ釋放(分泌)；b) TNF-α釋放(分泌)。將嵌合PD1-0103抗體及其人類化形式之影響與帶有人類IgG1主鏈(具有突變L234A、L235A及P329G (Kabat EU索引))的包含納武單抗(亦稱為MDX5C4或MDX-1106)及帕博利珠單抗(亦稱為MK-3475或Org 1.09A)之VH及VL結構域的參考抗PD1抗體相比較。在6天MLR培養之後，獲取50 µl上清液且使用Bio-Plex Pro™人類細胞介素Th1/Th2分析 (Bio-Rad Laboratories Inc.)在單一培養物中量測多種細胞介素。(所有細胞介素之資料未示出)。在增進T細胞活化及IFN-γ分泌方面，嵌合PD1-0103抗體及其人類化形式(PD1-0103_0312及PD1-0103_0314)比參考抗PD1抗體有效。另外，嵌合PD1-0103抗體及其人類化變異體增加抗原呈現細胞之腫瘤壞死因子α(TNF α)及IL-12分泌並增強單核球/巨噬細胞或抗原呈現細胞刺激T細胞之能力。 實例4 抗PD-1阻斷對與同種異體成熟樹突狀細胞共培養之人類CD4 T細胞之細胞毒性顆粒酶B釋放及IFN-γ分泌之影響 為進一步研究在同種異體背景下抗PD-1治療之影響，開發出一種分析，其中在單核球源性同種異體成熟樹突狀細胞(mDC)存在下共培養新鮮純化之CD4 T細胞5天。提前一週經由塑性黏附自新鮮PBMC分離單核球，隨後移除非黏附細胞。接著，藉由在含有GM-CSF (50 ng/ml)及IL-4 (100 ng/ml)之培養基中培養5天，自單核球產生未成熟DC。為誘導iDC成熟，添加TNF-α、IL-1β及IL-6 (各50 ng/ml)至培養基中，再保持2天。接著，藉由經流式細胞測量術(LSRFortessa，BD Biosciences)量測DC表面II類主要組織相容複合體(MHCII)、CD80、CD83及CD86之表現來評估DC成熟情況。 在最小混合淋巴細胞反應(mMLR)當天，經由微珠套組(Miltenyi Biotec)由自不相關供體獲得的108 個PBMC富集CD4 T細胞。培養之前，用5 µM之羧基螢光素琥珀醯亞胺酯(CFSE)標記CD4 T細胞。接著，在存在或不存在10 µg/ml濃度(若圖式中無不同指示)之阻斷抗PD1抗體(PD1-0103、嵌合PD1-0103或人類化抗體PD1-0103-0312、PD1-0103-0313、PD1-0103-0314、PD1-0103-0315，簡稱為0312、0313、0314、0315)之情況下，將105 個CD4 T細胞與成熟同種異體DC (5:1)一起塗鋪於96孔盤中。 五天後收集細胞培養物上清液，並用於藉由ELISA (R&D systems)量測IFN-γ含量。在37℃下，使細胞在Golgi Plug(布雷菲爾德菌素A(Brefeldin A))及Golgi Stop(莫能菌素(Monensin))存在下再保持5小時。接著洗滌細胞，在表面上用抗人類CD4抗體及Live/Dead可固定細胞染料Aqua (Invitrogen)染色，之後用固定/滲透化(Fix/Perm)緩衝液(BD Bioscience)固定/滲透。針對顆粒酶B (BD Bioscience)、IFN-γ及IL-2 (二者來自eBioscience)進行細胞內染色。 發現所有人類化變異體PD1-0103(人類化抗體PD1-0103-0312、PD1-0103-0313、PD1-0103-0314、PD1-0103-0315，簡寫為0312、0313、0314、0315)在增加顆粒酶B及干擾素γ方面同樣良好(資料未示出)。 實例5 嵌合PD1抗體衍生物 藉由經PCR擴增抗PD1小鼠抗體PD1-0098、PD1-0103之重鏈及輕鏈可變區並將其以與具有消除效應功能之突變L234A、L235A及P329G (Kabat EU索引)(白胺酸234變為丙胺酸、白胺酸235變為丙胺酸、脯胺酸329變為甘胺酸)之人類IgG1主鏈/人類CH1-鉸鏈-CH2-CH3之融合蛋白形式選殖至重鏈表現載體中及以與人類C-κ之融合蛋白形式選殖至輕鏈表現載體中來產生嵌合PD1抗體。接著，將LC及HC質體共轉染至HEK293中並在7天之後，藉由標準抗體純化方法自上清液純化。將嵌合PD1抗體重新命名為嵌合chiPD1-0098 (chiPD1-0098)及嵌合PD1-0103 (chiPD1-0103)。為進行比較，用人類IgG1 (具有突變L234A、L235A及P329G (Kabat EU索引))之主鏈合成及選殖包含納武單抗(亦稱為MDX-5C4或MDX-1106)及帕博利珠單抗(亦稱為MK-3475或Org 1.09A)之VH及VL結構域的參考抗PD1抗體。 實例6 抗PD1抗體PD-0103之人類化變異體(huMab PD-0103)之產生、表現及純化以及表徵鼠類抗 PD1 抗體 0103 之 VH 及 VL 結構域之人類化 基於鼠類抗PD1抗體PD1-0103之鼠類VH及VL結構域之胺基酸序列(SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:8)產生人類化抗PD1抗體變異體。 人類化VH變異體係基於人類生殖系IMGT_hVH_3_23與具有若干突變之人類J元件生殖系IGHJ5-01之組合。(產生SEQ ID NO: 9)。 VL之人類化變異體係基於人類生殖系IMGT_hVK_4_1、IMGT_hVK_2_30、IMGT_hVK_3_11及IMGT_hVK_1_39與人類J元件生殖系IGKJ1-01之組合。不同突變得到SEQ ID NO:10至SEQ ID NO:13之人類化變異體。 將PD1-0103之重鏈及輕鏈可變區的人類化胺基酸序列逆轉譯成DNA中並合成所得cNDA (GenArt)且接著，將其以與具有消除效應功能之LALA及PG突變(白胺酸234變成丙胺酸、白胺酸235變成丙胺酸、脯胺酸329變成甘胺酸)之人類IgG1主鏈/人類CH1-鉸鏈-CH2-CH3之融合蛋白形式選殖至重鏈表現載體中及以與人類C-κ之融合蛋白形式選殖至輕鏈表現載體中。接著，將LC及HC質體共轉染至HEK293中並在7天之後，藉由標準抗體純化方法自上清液純化。所得人類化PD1抗體命名如下：表 5 ：PD1-0103之人類化變異抗體之VH及VL序列
人類化 PD1-0103 抗體 VH 之人類化變異體 /SEQ ID NO: VL 之人類化變異體 /SEQ ID NO:
PD1-0103-0312 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10
PD1-0103-0313 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 11
PD1-0103-0314 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 12
PD1-0103-0315 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 13
如上所述表徵人類化PD1-0103抗體變異體及親本嵌合PD1-0103。結果顯示於表6中。表 6 ： 人類化PD1-0103抗體變異體及親本嵌合PD1-0103之結果的概述
分析 嵌合PD1-0103 PD-0103-0312 PD-0103-0313 PD-0103-0314 PD-0103-0315
親和力K D 37 ℃  [nM] 2.0 / 0.8 1.5 / 1.8 1.9 / 2.3 1.6 / 1.5 1.7 / 1.5
ELISA EC50 [nM] 0.2    0.1 0.07 0.07 0.06
CHO-PD1 EC50 + + + + +
IC50 PD-L1, 2 [nM] 1.35 tbd tbd tbd tbd
混合淋巴細胞反應分析 +++ +++ +++ ++++ ++
食蟹獼猴交叉反應性 (EC50 [nm]) + 0.08 0.06 0.05 0.04
人類化變異體PD-0103-0312在下文中稱為aPD1抗體純系PD1-0376。 實例7 產生抗LAG3抗體兔免疫接種 用表現LAG3之質體DNA對表現人類化抗體譜系之Roche專有轉殖基因兔進行免疫接種。 使用編碼全長人類LAG3之質體表現載體(15352 _ pIntronA _ fl - hLag3 _ DNA - IMS )，藉由皮內施用400 μg載體DNA，隨後電穿孔(5個750 V/cm之方形脈衝，持續時間10 ms，時間間隔1 s)對一組3隻兔進行基因免疫接種。兔在第0、14、28、49、70、98及126天接受7次連續免疫接種。在第35、77、105及133天獲取血液(估計總血量之10%)。製備血清，藉由ELISA測定其力價(參見下文)，並分離出末梢單核細胞，使用該等單核細胞作為以下B細胞選殖程序中抗原特異性B細胞之來源。 測定血清力價(ELISA) 將100微升/孔於PBS中2 μg/ml之人類重組LAG3蛋白質固定於96孔NUNC Maxisorp盤上，隨後：用200微升/孔含2% Crotein C之PBS阻斷該盤；一式兩份，以100微升/孔施加抗血清於含0.5% Crotein C之PBS中的連續稀釋液；用100微升/孔分別在含0.5% Crotein C之PBS中稀釋的(1)偶聯HRP之驢抗兔IgG抗體(Jackson Immunoresearch/Dianova 711-036-152；1/16 000)，或(2)偶聯HRP之兔抗人類IgG抗體(Pierce/Thermo Scientific 31423；1/5000)，或(3)生物素化山羊抗人類κ抗體(Southern Biotech/Biozol 2063-08，1/5 000)及抗生物素蛋白鏈菌素-HRP偵測。對於所有步驟，將盤在37℃下培育1小時。在所有步驟之間，用含0.05%吐溫20之PBS洗滌盤3次。藉由以100微升/孔添加BM Blue POD可溶性受質(Roche)來產生信號；且藉由以100微升/孔添加1 M HCl來停止。以690 nm作為參考，讀出在450 nm下之吸光度。力價定義為產生半數最大信號之抗血清的稀釋度。 分離兔末梢血液單核細胞(PBMC) 自免疫接種之轉殖基因兔獲取血液樣本。用1× PBS (PAA, Pasching, Austria)將含EDTA之全血稀釋兩倍，隨後使用哺乳動物淋巴細胞(Cedarlane Laboratories, Burlington, Ontario, Canada)，根據製造商之說明進行密度離心。用1× PBS洗滌PBMC兩次。 EL-4 B5培養基 使用補充有10% FCS (Hyclone, Logan, UT, USA)、2 mM麩醯胺酸、1%青黴素/鏈黴素溶液(PAA, Pasching, Austria)、2 mM丙酮酸鈉、10 mM HEPES (PAN Biotech, Aidenbach, Germany)及0.05 mM b-巰基乙醇(Gibco, Paisley, Scotland)之RPMI 1640 (Pan Biotech, Aidenbach, Germany)。 用蛋白質抗原塗佈盤 在4℃下，在碳酸鹽緩衝液(0.1 M碳酸氫鈉、34 mM碳酸氫二鈉，pH 9.55)中用偶聯至人類Fc部分之人類LAG3 ECD(2 µg/ml)塗佈無菌細胞培養級6孔盤隔夜。使用之前，在無菌PBS中洗滌盤三次。 細胞耗竭 (a)使用覆蓋有匯合之CHO細胞單層的無菌6孔盤(細胞培養級)經由非特異性黏附及非特異性結合淋巴細胞耗竭巨噬細胞/單核球。 (b)使用空白無菌6孔盤(細胞培養級)經由非特異性黏附耗竭巨噬細胞及單核球以及其他細胞。 一半PBMC樣本用於(a)且一半用於(b)。 用4 ml培養基及多達6×106 個來自經免疫接種兔之PBMC最大限度地填充各孔且使其在恆溫箱中於37℃下結合1小時。上清液中之細胞(末梢血液淋巴細胞(PBL))用於抗原淘選(panning)步驟。 B細胞富集LAG3抗原 蛋白質抗原：用來自使用空白6孔盤之耗竭步驟的多達6×106 個PBL/4 ml培養基接種塗佈有LAG3-ECD-huFc蛋白質之6孔組織培養盤並使其在恆溫箱中於37℃下結合1小時。藉由用1× PBS小心地洗滌該等孔1-2次來移除非黏附細胞。在恆溫箱中於37℃下用胰蛋白酶將殘留黏性細胞剝離，持續10分鐘。用EL-4 B5培養基停止胰蛋白酶作用。將細胞保持在冰上直至免疫螢光染色。 細胞表面抗原：用來自使用覆蓋CHO之6孔盤之耗竭步驟的多達6×106 個PBL/4 ml培養基接種覆蓋有人類LAG3陽性CHO細胞單層之6孔組織培養盤並使其在恆溫箱中於37℃下結合1小時。藉由用1× PBS小心地洗滌該等孔1-2次來移除非黏附細胞。在恆溫箱中於37℃下用胰蛋白酶將殘留黏性細胞剝離，持續10分鐘。用EL-4 B5培養基停止胰蛋白酶作用。將細胞保持在冰上直至免疫螢光染色。 免疫螢光染色及流動式細胞測量術 使用抗IgG FITC(AbD Serotec, Düsseldorf, Germany)及抗huCk PE(Dianova,, Hamburg, Germany)抗體進行單細胞分選。對於表面染色，將來自耗竭及富集步驟之細胞與抗IgG FITC及抗huCk PE抗體一起在PBS中培育，且在暗處在4℃下培育45分鐘。在染色之後，用冰冷的PBS洗滌PBMC兩次。最後，使PBMC再懸浮於冰冷的PBS中且立即進行FACS分析。在FACS分析之前，添加濃度為5 μg/ml之碘化丙錠(BD Pharmingen, San Diego, CA, USA)以區別死細胞與活細胞。使用配備有電腦及FACSDiva軟體之Becton Dickinson FACSAria (BD Biosciences, USA)進行單細胞分選。 B細胞培養 利用Seeber等人(S Seeber等人，PLoS One 9 (2), e86184.  2014年2月4日)所描述之方法培養兔B細胞。簡言之，在恆溫箱中，在37℃下於96孔盤中用200微升/孔含有Pansorbin細胞(1:100000) (Calbiochem (Merck), Darmstadt, Deutschland)、5%兔胸腺細胞上清液(MicroCoat, Bernried, Germany)及γ照射之鼠類EL-4B5胸腺瘤細胞(5 × 10e5個細胞/孔)之EL-4B5培養基培育單次分選之兔B細胞7天。移出B細胞培養之上清液進行篩選，且立即收集殘留細胞並在-80℃下於100 μl RLT緩衝液(Qiagen, Hilden, Germany)中冷凍。 分離LAG3抗體之V結構域PCR 擴增 V 結構域 使用NucleoSpin 8/96 RNA套組(Macherey&Nagel；740709.4，740698)，根據製造商之方案由B細胞溶解產物(再懸浮於RLT緩衝液-Qiagen目錄號79216中)製備總RNA。用60 µl不含RNA酶之水溶離RNA。根據製造商之說明書，使用Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen；18080-400)及寡聚dT引子，使用6 µl RNA藉由逆轉錄酶反應產生cDNA。所有步驟均在Hamilton ML Star系統上進行。使用4 µl cDNA，用AccuPrime SuperMix (Invitrogen；12344-040)以50 µl最終體積針對重鏈使用引子rbHC.up及rbHC.do且針對輕鏈使用BcPCR_FHLC_leader.fw及BcPCR_huCkappa.rev來擴增免疫球蛋白重鏈及輕鏈可變區(VH及VL)(表7)。所有正向引子均對信號肽(分別為VH及VL之信號肽)具有特異性，而反向引子對恆定區(分別為VH及VL之恆定區)具有特異性。用於RbVH之PCR條件如下：在94℃下熱起動5分鐘；進行35個循環的在94℃下20秒、在70℃下20秒、在68℃下45秒；及在68℃下最終延長7分鐘。用於HuVL之PCR條件如下：在94℃下熱起動5分鐘；進行40個循環的在94℃下20秒、在52℃下20秒、在68℃下45秒；及在68℃下最終延長7分鐘。 表7
SEQ ID NO: 76 rbHC.up  AAGCTTGCCACCATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTC
SEQ ID NO: 77 rbHCf.do CCATTGGTGAGGGTGCCCGAG
SEQ ID NO: 78 BcPCR_FHLC_leader.fw ATGGACATGAGGGTCCCCGC
SEQ ID NO: 79 BcPCR_huCkappa.rev GATTTCAACTGCTCATCAGATGGC
在50 µl PCR溶液中取8 µl裝載於48 E-Gel 2% (Invitrogen G8008-02)上。根據製造商之方案，使用NucleoSpin Extract II套組(Macherey&Nagel；740609250)清潔陽性PCR反應物，且在50 μl溶離緩衝液中溶離。所有清潔步驟均在Hamilton ML Starlet系統上進行。兔單株二價抗體之重組表現 對於兔單株抗體之重組表現，利用突出物選殖法(overhang cloning method)(RS Haun等人，Biotechniques(1992)13, 515-518；MZ Li等人，Nature Methods (2007)4, 251-256)將編碼VH或VL之PCR產物以cDNA形式選殖至表現載體中。表現載體含有由包括內含子A之5' CMV啟動子及3' BGH聚腺苷醯化序列組成的表現卡匣。除表現卡匣之外，質體亦含有pUC18源性複製起點及向大腸桿菌中質體擴增賦予安比西林抗性之β-內醯胺酶基因。使用基礎質體之三種變異體：一種質體含有設計成接受VH區之兔IgG恆定區，而另外二種質體含有用於接受VL區之人類κ LC恆定區。藉由PCR，使用重疊引子來擴增編碼κ或γ恆定區及VL/VH插入序列的線性化表現質體。將純化之PCR產物與T4 DNA聚合酶一起培育，由此產生單股突出物。藉由添加dCTP停止反應。 在接下來的步驟中，將質體與插入序列組合並與recA一起培育，以誘導位點特異性重組。將重組質體轉型至大腸桿菌中。次日，選取生長菌落且藉由質體製備、限制分析及DNA測序測試所要的重組質體。 對於抗體表現，將經分離之HC及LC質體短暫共轉染至HEK293細胞中且在1週後收集上清液。 實例8 表徵抗LAG3抗體 表8：不同抗LAG3抗體之特徵的概述
抗Lag3 抗體 aLAG3 (0403) aLAG3 (411) aLAG3 (414) aLAG3 (416) aLAG3 (417) MDX-25F7(25F7) BMS-986016 MDX-26H10 (26H10) 人類化BAP 050 (LAG525)
KD [M] 單價    二價 tbd       tbd tbd       tbd 4.63 E-10    tbd 2.82 E-11    tbd tbd       tbd tbd       tbd tbd       tbd tbd       tbd tbd       tbd
kd [1/s] 5.00 E-06 3.87 E-05 1.95 E-04 2.21 E-04 9.48 E-05 3.86 E-04    3.99 E-04   
抗原決定基分組 E3 E3 E3 E2b E3 E5 (D1-環) E5 E4 E2c
MHCII/ ELISA IC50 [nM] 0.9 0.8 0.9 0.9 0.9 0.8/ 0.6      /0.4 0.9 / 0.6      /1.0
CHO細胞ELISA 拐點[ng/ml] 30.9 41.3 48.1 37.2 27.8 75         
針對人類Lag3之ELISA 用25微升/孔蛋白質濃度為800 ng/ml之重組人類LAG-3 Fc嵌合體蛋白質(R&D Systems, 2319-L3)塗佈Nunc maxisorp盤(Nunc 464718)並在4℃下培育隔夜或在室溫下培育1小時。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST緩衝液)之後，在室溫下將各孔與90 µl阻斷緩衝液(PBS+2% BSA+0.05%吐溫20)一起培育1小時。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST緩衝液)之後，添加25 µl濃度為1-9 µg/ml(1:3稀釋於OSEP緩衝液中)之抗Lag3樣本並在室溫下培育1小時。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST緩衝液)之後，添加25微升/孔1:2000稀釋的山羊抗人類Igκ鏈抗體-HRP偶聯物(Milipore, AP502P)並在室溫下培育1小時。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST緩衝液)之後，添加25微升/孔的TMB受質(Roche, 11835033001)並培育2-10分鐘。量測在Tecan Safire 2儀器上在370/492 nm下進行。 細胞表面Lag3結合ELISA 將25微升/孔Lag3細胞(表現Lag3之重組CHO細胞，10000個細胞/孔)接種於組織培養物處理之384孔盤(Corning, 3701)中並在37℃下培育一或兩天。次日，在移除培養基之後，添加25 µl抗Lag3樣本(1:3稀釋於OSEP緩衝液中，起始濃度為6-40 nM)並在4℃下培育2小時。洗滌(1×90 µl，PBST)之後，藉由添加30微升/孔戊二醛達到0.05%最終濃度(Sigma目錄號：G5882)，在室溫下保持10分鐘來固定細胞。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST緩衝液)之後，添加25微升/孔1:1000稀釋的山羊抗人類Igκ鏈抗體-HRP偶聯物(Milipore, AP502P)並在室溫下培育1小時。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST緩衝液)之後，添加25微升/孔的TMB受質(Roche, 11835033001)並培育6-10分鐘。量測在Tecan Safire 2儀器上在370/492 nm下進行。 SPR (Biacore)表徵抗LAG3抗體 已使用基於表面電漿子共振(SPR)之分析測定在25℃下呈二價形式或單價片段形式之抗Lag3抗體與人類Fc標記之人類Lag3細胞外結構域(ECD)之間的結合動力學參數。 因此，C1生物感測器晶片之兩個流槽係在Biacore T200中，藉由使用『固定嚮導(immobilization wizard)』將在pH 4.5之乙酸鹽緩衝液中稀釋至25 µg/ml的中性抗生物素蛋白固定至其上製備。由此得到約1900 RU之固定量。接著，使用20 µg/ml於操作緩衝液(HBS-EP+，GE Healthcare)中之稀釋液，使CaptureSelect™生物素抗IgG-Fc(人類)偶聯物結合至中性抗生物素蛋白。 該方法本身由每個週期四條命令組成。第一命令：捕捉約46 RU之huLag3-Fc(20s，10 µl/min)。第二命令：以30 µl/min之流速經120秒注入樣本，隨後為1200秒之長時間解離。第三及第四命令：藉由經30秒注入pH 1.5之鹽酸甘胺酸，實現再生。接著，使用先前所描述之方法量測各抗體Fab片段之連續稀釋液(3.13 nM-200 nM，在操作緩衝液中兩倍稀釋)及另外的空白週期。由於捕捉量無法完全再現，故接著利用Biacore T200評價軟體，藉由將利用Rmax擬合參數集之1:1朗格繆爾擬合應用於『局部』來獲得動力學值。結果(KD 值及kd值)顯示於表8中。 抗原決定基圖譜分析 使用基於表面電漿子共振(SPR)之分析進行抗原決定基分組。因此，使aLag3結合劑在Biacore T200儀器上結合至huLag3。接著，評估其他結合劑與先前形成之aLag3結合劑-huLag3複合物之可接近性。 使用SA CAP套組(GE Healthcare)進行此分析。若未另外描述，則該分析係根據SA CAP套組手冊進行。該操作僅包括一種週期類型。在雜交之後，使生物素化、huFc標記之huLag3之10 nM稀釋液以10 µl/min之流動速率結合至感測器晶片上之抗生物素蛋白鏈菌素，持續20秒。接著，以30 µl/min之流動速率經180秒注射在操作緩衝液中稀釋之第一份200 nM樣本，隨後立即在相同條件下注射第二份樣本。接著使表面再生。 接著將樣本分配至具有類似競爭模式之不同抗原決定基組。基於使用6.1 RU之臨限值進行第二次注射之相對響應進行第一次粗略分類，該臨限值剛好高於當注射結合劑作為第一及第二樣本時所觀察到的最高值。所有值及決定最後均藉由目視檢查感測器圖譜進行驗證。 結果示於表8中。鑑別出三個主要抗原決定基模式(E1、E2及E3)。由於aLag3-0416與人類化BAP 050同屬相同組但彼此不完全抑制，故將其分配至亞組E2b及E2c。 來自tg兔之抗Lag3抗體與重組cyno Lag3陽性HEK細胞之結合 除使用在表面上重組表現人類Lag3之HEK細胞進行結合分析外，亦評價與食蟹獼猴Lag3陽性HEK細胞之結合。在此實驗中，將預先用cyno-LAG-3短暫轉染之冷凍HEK293F細胞解凍，離心且再懸浮於PBS/2% FBS中。將1.5×105 個細胞/孔接種於96孔盤中。添加抗Lag3抗體達到10 µg/ml之最終歸一化濃度。為進行參考並作為對照，在該實驗中製備並量測自體螢光及陽性對照(Medarex 25F7)以及同型對照(來自Sigma之huIgG1，目錄號#I5154，資料未示出 )抗體。將HEK細胞與指定抗體一起在冰上培育45分鐘，用200µl含有2% FBS之冰冷PBS緩衝液洗滌兩次，隨後添加二次抗體(APC標記之山羊抗人類IgG-κ，Invitrogen，目錄號#MH10515)(1:50稀釋於FACS-Puffer中/孔)並在冰上再培育30分鐘。再用200µl冰冷的PBS/2% FBS緩衝液洗滌細胞兩次，隨後使樣本最終再懸浮於150 µl FACS緩衝液中，並在FACS CANTO-II HTS模組上量測結合。結果 ：下表中顯示不同抗Lag3抗體與表現cynoLAG3之HEK293細胞之結合及交叉反應性，結合係以陽性細胞百分比或信號強度之幾何平均值給出。 表9：不同抗LAG3抗體與重組cyno Lag3陽性HEK細胞之結合
LAG3 抗體 % pos. GeoMean
參考LAG3抗體MDX25F7 41.2 3062
aLAG3(0411) 88.6 11007
aLAG3(0414) 81.6 9169
aLAG3(0416) 67.9 4221
aLAG3(0417) 75.9 7115
aLAG3(0403) 82.0 7457
來自兔之抗Lag3抗體與表現Lag3之(活化)食蟹獼猴PBMC/T細胞的結合 在結合至重組Lag3蛋白質及哺乳動物細胞上重組表現之Lag3之後，亦評估與活化食蟹獼猴T細胞上表現之Lag3的結合。 藉由FACS分析確定新產生之抗Lag3抗體(來源於Roche之轉殖基因兔)與食蟹獼猴T細胞或PBMC之細胞表面上表現之Lag3的結合特徵。儘管Lag3在天然T細胞上不表現，但其在T細胞活化及/或耗竭時上調。因此，由新鮮食蟹獼猴血液製備食蟹獼猴末梢血液單核細胞(PBMC)且接著藉由CD3/CD28預處理(1µg/ml) 2-3天使其活化。隨後，分析活化細胞中之Lag3表現：簡言之，在冰上用最終濃度為10μg/ml之指定抗Lag3抗體及相應對照抗體對1-3×105 個活化細胞染色30-60分鐘。經由螢光染料偶聯之抗人類IgG或抗兔IgG二次抗體偵測經結合抗Lag3抗體。染色之後，用PBS/2% FCS洗滌細胞兩次並在FACS Fortessa(BD)上進行分析。結果： 下表概括在活化之食蟹獼猴PBMC內Lag3陽性細胞之百分含量。 表10：不同抗LAG3抗體與表現Lag3之(活化)食蟹獼猴PBMC/T細胞之結合
抗Lag3/ 對照抗體 % 在CD3/CD28 活化後陽性cyno 細胞(PBL)
僅二次抗體(hu) 7.62
DP47 (人類同型) 9.19
參考LAG3抗體(MDX25F7) 22.1
參考LAG3抗體BMS-986016 18.6
參考LAG3抗體(人類化BAP050(LAG525)) 50.7
僅二次抗體(rb) 5.26
aLAG3(0403) 44.2
aLAG3(0411) 46.6
aLAG3(0414) 43.0
aLAG3(0416) 38.9
aLAG3(0417) 35.3
所有兔抗Lag3抗體均展示與活化食蟹獼猴T細胞上Lag3+ 細胞之顯著結合。由此，相較於人類抗Lag3參考抗體(例如MDX25F7、BMS-986016)，所有新產生的抗體均顯示陽性細胞之百分含量增加。 抑制LAG-3與人類A375腫瘤細胞上表現之MHC-II之結合(藉由ELISA測定) 將25微升/孔A375細胞(10000個細胞/孔)接種於組織培養物處理之384孔盤(Corning, 3701)中並在37℃下培育隔夜。將抗Lag3抗體與在細胞培養基中以3 µg/ml抗體濃度起始，經1:3稀釋之生物素化Lag3(250 ng/ml)一起預培育1小時。在自接種有細胞之孔中移除培養基之後，將25 µl抗體-Lag3預培育混合物轉移至孔中並在4℃下培育2小時。洗滌(1×90 µl，PBST)之後，藉由添加30微升/孔戊二醛達到0.05%最終濃度(Sigma目錄號：G5882)，在室溫下保持10分鐘來固定細胞。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST緩衝液)之後，添加25微升/孔1:2000或1:8000稀釋之聚HRP40-抗生物素蛋白鏈菌素(Fitzgerald, 65R-S104PHRPx)並在室溫下培育1小時。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST緩衝液)之後，添加25微升/孔TMB受質(Roche, #11835033001)並培育2至10分鐘。量測在Tecan Safire 2儀器上在370/492 nm下進行。 抑制LAG-3與人類A375腫瘤細胞上表現之MHC-II之結合(藉由FACS分析測定)分析原理 ：為研究抗Lag3抗體之拮抗功能，進行MHCII:Lag3競爭分析。用與或不與抗Lag3抗體一起預培育的內部產生之生物素化Lag3:Fc融合蛋白對MHCII+ 人類A375細胞染色。本分析係以FACS競爭實驗研究：在補充有EBSS(PAN，目錄號#P04-00509)、10% FBS、2mML-麩醯胺酸、1×NEAA及1×丙酮酸鈉之EM伊格爾氏培養基(EM Eagle's medium)中培養A375細胞(ATCC，#CRL-1619)達2-3代。所有抗體均在FACS緩衝液中以25µl稀釋至20µg/ml最終濃度(在96孔U形底盤中)。將25µl內部產生之生物素化重組LAG-3:Fc融合蛋白添加至培養基或抗Lag3抗體或對照中達到10µg/ml最終濃度並在室溫下預培育30分鐘。用PBS洗滌A375細胞並在PBS中調整至3×106 個細胞/毫升。在96孔V形底盤中每孔接種100µl。對各盤離心並移除上清液。接著，將預培育之LAG-3:Fc融合蛋白/抗體混合物(50微升/孔)添加至細胞中並在室溫下培育1小時。之後，用200µl FACS緩衝液洗滌細胞。為偵測結合至細胞MHCII之生物素化Lag3:Fc蛋白質，使用每份樣本3µl之APC偶聯山羊抗生物素抗體(Miltenyi Biotec，目錄號#130-090-856)並再培育10-15分鐘。染色之後，再次洗滌細胞且接著將其用150µl FACS緩衝液(PBS/2% FBS)轉移至U形底盤上並在FACS Canto-II上使用HTS模組進行分析。 兩種抗Lag3抗體(純系25F7及26H10；Medarex)充當陽性對照且適當時，人類IgG1(Sigma，目錄號#I5154)充當同型對照。使用的所有抗體之最終濃度均為10 µg/ml。結果 ：下表中顯示FACS分析之結果，展示Lag3蛋白質與細胞上MHC-II之結合的抑制百分比(以結合信號相對於在無阻斷抗體存在下之最大值的降低計算)。 表11：不同抗LAG3抗體與表現Lag3之(活化)食蟹獼猴PBMC/T細胞之結合
aLAG3抗體 %抑制
aLAG3(0403) 34.9
aLAG3(0414) 67.3
aLAG3(0411) 45.6
aLAG3(0416) 68.6
aLAG3(0417) 59.1
參考MDX25F7 70.0
參考MDX26H10 71.7
同型對照 -2.9
無mAb 0.0
該等資料支持所有測試抗體與Lag3之功能相互作用以及細胞相互作用之阻斷。 在標準LAG3阻斷Bio/報導體分析中新穎抗Lag3抗體之中和效力 為了測試新穎抗Lag3抗體在活體外恢復受抑制之T細胞反應中的中和效力，使用可商購之報導體系統。此系統由Lag3+ NFAT Jurkat效應細胞(Promega，目錄號#CS194801)、MHC-II+ Raji細胞(ATCC，#CLL-86)及超級抗原組成。簡言之，該報導體系統係基於三個步驟：(1)超級抗原誘導之NFAT細胞活化；(2)由MHCII(Raji細胞)與Lag3+ NFAT Jurkat效應細胞之間之抑制相互作用介導之活化信號抑制；及(3)藉由Lag3拮抗性/中和性aVH-Fc融合構築體恢復NFAT活化信號。 在此實驗中，如提供商所描述，培養Raji及Lag-3+ Jurkat/NFAT-luc2效應T細胞。在白色平底96孔盤(Costar，目錄號#3917)中，在分析培養基(RPMI 1640(PAN Biotech，目錄號#P04-18047)、1% FCS)中製備若干抗Lag3及參考抗體之連續稀釋液(40 pg/ml-50 µg/ml)。將1×105 個Lag3+ NFAT-Jurkat細胞/孔添加至抗體溶液中。此步驟之後，將2.5×104 個Raji細胞/孔添加至Jurakt細胞/抗體混合物以及50ng/ml最終濃度之SED超級抗原(Toxin technology，目錄號DT303)中。在37℃及5% CO2 下培育六小時之後，使Bio-Glo受質(Promega, #G7940)升溫至室溫並每孔添加75 µl，培育5-10分鐘，隨後根據該套組之製造商的建議，在Tecan Infinite讀取器上量測總體發光。 表中顯示當SED刺激時不同抗Lag3抗體對MHCII/Lag3介導之NFAT螢光素酶信號抑制的恢復作用(以EC50 值提供)： 表12：在標準LAG3阻斷Bio/報導體分析中不同抗LAG3抗體之結果
抗LAG3 在Jurkat LAG3 + SED + Raji中之EC50 [nM]
第1次分析 第2次分析 第3次分析
參考MDX25F7 7.8/5.9 8.6 n.t.
參考BMS-986016 n.t. 9.6 n.t.
參考人類化BAP050(LAG525) n.t. 22.6 n.t.
Lag3 IgG-Fc n.t. 無影響 n.t.
aLAG3(0411) 1.1 1.0 n.t.
aLAG3(0414) 1.1 1.0 1.8
aLAG3(0416) 3.1 2.5 3.5
aLAG3(0417) 1.0 n.t. n.t.
n.t. 分子在本實驗中未測試 實例9 抗LAG3抗體之功能表徵 表13概述在如本文中所描述之不同分析中不同抗LAG3抗體(單獨或與抗PD1抗體之組合)的生物活性及作用。 表13：不同抗LAG3抗體(單獨或與抗PD1抗體之組合)之生物活性概述
分析類型 抗Lag3 aLAG3 ( 0403) 抗Lag3 aLAG3 ( 0411) 抗Lag3 aLAG3 ( 0414) 抗Lag3 aLAG3 ( 0416) 抗Lag3 aLAG3 ( 0417) 參考 1 BMS 986016 參考 2 人類化BAP050 (LAG525)
mMLR (GrzB) + - +++ ++ + - ++
mMLR (IL-2) - - + + ++ + ++
CD4+ARH77       +++ +++    + +
Treg抑制(GrzB)       +++ +    - +
Treg抑制 (IFN-γ)       +++ ++    + +
黑素瘤患者PBMC       +++            
PD-1及LAG-3阻斷對與同種異體成熟樹突狀細胞共培養之人類CD4 T細胞之細胞毒性顆粒酶B釋放及IL-2分泌之影響 為篩選在同種異體背景中抗LAG-3阻斷抗體與抗PD-1之組合，開發出一種分析，其中在單核球源性同種異體成熟樹突狀細胞(mDC)存在下共培養新鮮純化之CD4 T細胞5天。提前一週經由塑性黏附自新鮮PBMC分離單核球，隨後移除非黏附細胞。接著，藉由在含有GM-CSF (50 ng/ml)及IL-4 (100 ng/ml)之培養基中培養5天，由單核球產生未成熟DC。為誘導iDC成熟，添加TNF-α、IL-1β及IL-6 (各50 ng/ml)至培養基中，再保持2天。接著，藉由經流式細胞測量術(LSRFortessa，BD Biosciences)量測DC表面II類主要組織相容複合體(MHCII)、CD80、CD83及CD86之表現來評估DC成熟情況。 在最小混合淋巴細胞反應(mMLR)當天，經由微珠套組(Miltenyi Biotec)由自不相關供體獲得的108 個PBMC富集CD4 T細胞。培養之前，用5 µM之羧基螢光素琥珀醯亞胺酯(CFSE)標記CD4 T細胞。接著，在存在或不存在10 μg/ml濃度的單獨或與嵌合抗LAG-3抗體(aLAG3(0403)至aLAG(0418))或參考抗體(人類化BAP050(LAG525)及BMS 986016)組合之阻斷抗PD-1抗體aPD1(0376)(=如上文或PCT申請案PCT/EP2016/073248中所述之PD1-0103-0312)下，將105 個CD4 T細胞與成熟同種異體DC(5:1)一起塗鋪於96孔盤中。DP47係在Fc部分中具有LALA突變以避免由FcγR識別之非結合人類IgG且用作陰性對照。 五天後收集細胞培養物上清液，並用以藉由ELISA (R&D systems)量測IL-2含量，且在37℃下，在Golgi Plug (布雷菲爾德菌素A)及Golgi Stop (莫能菌素)存在下再靜置細胞5小時。接著洗滌細胞，在表面上用抗人類CD4抗體及Live/Dead可固定染料Aqua (Invitrogen)染色，之後用固定/滲透化緩衝液(BD Bioscience)固定/滲透。針對顆粒酶B(BD Bioscience)及IFN-γ(eBioscience)進行細胞內染色。結果顯示於圖 2A 及 2B 中。 PD-1及LAG-3阻斷對與B細胞-淋巴母細胞樣細胞株(ARH77)共培養之人類CD4 T細胞之細胞毒性顆粒酶B釋放的影響. 在功能研究中，將CD4 T細胞與腫瘤細胞株ARH77，即PDL-1之表現量低於mDC之B細胞淋巴母細胞樣細胞株共培養，以更好地表徵LAG-3拮抗作用對PD-1阻斷之作用。其餘實驗設置及讀出相對於mMLR保持不變。如圖 3 中所示，抗LAG-3抗體(aLAG3(0414)及aLAG3(0416)，基於在mMLR中共分泌IL-2及顆粒酶B之能力選擇)與抗PD-1抗體之組合使CD4 T細胞之顆粒酶B分泌相較於單獨參考抗LAG-3抗體((人類化BAP050(LAG525)及BMS 986016))(P ＜0.05)及抗PD-1(P ＜0.01)有顯著增加。 PD-1及LAG-3阻斷對Treg抑制與經照射之同種異體PBMC共培養的人類CD4 T細胞之顆粒酶B及IFN-γ釋放的影響. 在涉及調控T細胞(Treg)抑制分析之功能研究中，將來自同一供體之PBMC分成兩份樣本：經由微珠套組(Miltenyi Biotec)，一份富集CD4 T細胞且另一份富集Treg，定義為CD4+ CD25高 CD127低 T細胞。在純化該兩個細胞群後，用5μM羧基螢光素琥珀醯亞胺酯(CFSE)標記CD4 T細胞，而Treg用5 μM Cell-Trace-Violet(CTV)標記以便能在隨後的FACS中對其進行區分。 接著，在存在或不存在10 μg/ml濃度之抗LAG-3抗體(aLAG3(0414)及aLAG3(0416)或參考抗LAG-3抗體(人類化BAP050(LAG525)及BMS 986016)與抗PD-1抗體aPD1(0376)之組合下，在96孔盤中以1:1比率共培養CD4 T細胞(105 )及Treg(105 )以及來自不相關供體的經照射CD4耗竭之PBMC(105 )。作為估計Treg對CD4T細胞效應功能之抑制量值的對照，亦在無Treg存在下共培養CD4 T細胞(105 )與經照射PBMC(105 )。 五天後收集細胞培養物上清液，並在稍後用於藉由ELISA (R&D systems)量測IFN-γ量，且在37℃下，在Golgi Plug (布雷菲爾德菌素A)及Golgi Stop (莫能菌素)存在下再靜置細胞5小時。接著洗滌細胞，在表面上用抗人類CD4抗體及Live/Dead可固定染料Aqua (Invitrogen)染色，之後用固定/滲透化緩衝液(BD Bioscience)固定/滲透。針對顆粒酶B(BD Bioscience)及IFN-γ(eBioscience)進行細胞內染色。結果示於圖 4A 及 4B 中。 如由顆粒酶B之分泌量明顯高於在單獨抗PD-1存在下(P ＜0.05)或在無檢查點抑制劑存在下(P ＜0.001)之Tconv所證實，抗LAG-3抗體(aLAG3(0414)及aLAG3(0416)與抗PD-1抗體aPD1(0376)之組合(=PD1-0103-0312，來自PCT申請案PCT/EP2016/073248)使Tconv脫離調控T細胞之緊密控制。參考抗LAG-3抗體(人類化BAP050(LAG525)及BMS 986016)與抗PD-1之組合不能明顯挽救Tconv效應功能不受Treg抑制。關於IFN-γ獲得類似結果，即使僅用4個供體，差異無法達到統計顯著性。 PD-1及LAG-3阻斷對在用免疫原性黑素瘤抗原肽池回憶之後來自黑素瘤患者PBMC之CD4 T細胞之顆粒酶B及IFN-γ分泌的影響. 先前已描述，黑素瘤患者之PBMC含有可偵測頻率之腫瘤抗原特異性T細胞。因此，出於POC目的，針對用免疫原性黑素瘤相關抗原肽池再刺激隔夜之黑素瘤患者PBMC測試抗LAG-3抗體(0414)加抗PD-1相對於單獨抗PD-1。 在室溫下，在存在或不存在飽和濃度(10 μg/ml)之單獨抗PD-1(0376)、抗PD-1與抗LAG-3(aLAG3(0414)=(0414)，10 μg/ml)抗體之組合下培育來自黑素瘤患者之105 至106 個PBMC。接著，在蛋白質轉運抑制劑Golgi Plug(布雷菲爾德菌素A)及Golgi Stop(莫能菌素)存在下，用一組免疫原性腫瘤相關抗原，如MAGEA1、MAGEA3、MAGEA4、Melan-A/MART-1、NYESO-1、黑色素細胞蛋白質Pmel 17 gp100、酪胺酸酶、酪胺酸酶相關蛋白質2再刺激T細胞隔夜。 接著洗滌細胞，在表面上用抗人類CD4抗體及Live/Dead可固定染料Aqua (Invitrogen)染色，之後用固定/滲透化緩衝液(BD Bioscience)固定/滲透。針對顆粒酶B(BD Bioscience)及IFN-γ(eBioscience)進行細胞內染色。 抗LAG-3與抗PD-1抗體之組合(P ＜0.01及P ＜0.001)顯著(P ＜0.01及P ＜0.0001)增強腫瘤抗原特異T細胞效應功能(亦即，顆粒酶B及IFN-γ分泌)，而單獨PD-1阻斷不顯示任何作用(資料未示出)。 實例10 雙特異性抗PD1/抗LAG3抗體之產生及製造10.1 在一個結合臂中具有 VH / VL 結構域交換 / 替代 ( CrossMAbVh - VL ) 且在 CH1 / CL 界面中具有 單一帶電胺基酸取代的結合至 PD1 及 LAG3 之 雙特異性抗體之製造及表現 如通用方法部分中所描述，藉由經典分子生物技術產生結合至人類PD1及人類LAG3之多特異性抗體，且如上文所描述，在Expi293F 293F細胞中短暫表現。多特異性1+1型CrossMAbVh - Vl 抗體在WO 2009/080252中亦有描述。使用含有編碼表 14 中描繪之胺基酸序列之核酸的表現質體表現該等多特異性抗體。1+1型 CrossMAbVh - Vl 雙特異性抗體之示意性結構顯示於圖1A中。表 14 ：輕鏈 ( LC ) 及重鏈 ( HC ) 之胺基酸序列 ， 具有 VH / VL 結構域交換 / 替代 ( 1 + 1 型 CrossMAbVh - VL )
1+1型抗體 HC1 HC2 LC1 LC2
PD1/LAG3 0799 PD1(0376)/ aLAG3(0416) SEQ ID NO:96 SEQ ID NO:97 SEQ ID NO:98 SEQ ID NO:99
PD1/LAG3 0927 PD1(0376)/ aLAG3(0414) SEQ ID NO:96 SEQ ID NO:100 SEQ ID NO:98 SEQ ID NO:101
PD1/LAG3 0222 PD1(0069)/ aLAG3(25F7) SEQ ID NO:102 SEQ ID NO:103 SEQ ID NO:104 SEQ ID NO:105
PD1/LAG3 0224 PD1(0098)/ aLAG3(25F7) SEQ ID NO:106 SEQ ID NO:103 SEQ ID NO:107 SEQ ID NO:105
對於所有構築體，使用孔中節雜二聚化技術，其中在第一個CH3結構域中具有典型節取代(T366W)且第二個CH3結構域中具有相應孔取代(T366S、L368A及Y410V) (以及兩個額外引入之半胱胺酸殘基S354C/Y349'C) (包含在以上所描繪之各別相應重鏈(HC)序列中)。10.2 在兩個結合臂中具有 CH1 / Ck 結構域交換 / 替代 ( 2 + 2 型 CrossMabCH1 / Ck ) 且在另一臂之 CH1 / CL 界面中具有帶電胺基酸取代的結合至 PD1 及 LAG3 之 多特異性抗體之製造及表現 在本實例中，如通用方法部分中所描述，藉由經典分子生物技術產生結合至人類PD1及LAG3之多特異性抗體，且如上文所描述，在Expi293F 293F細胞中短暫表現。多特異性2+2型CrossMAbCH1 / Ck 抗體在WO 2010/145792中亦有描述。使用含有編碼表 15 中描繪之胺基酸序列之核酸的表現質體表現該等多特異性抗體。2+2型 CrossMAbCH1 / Ck 雙特異性抗體之示意性結構顯示於圖1G中。表 15 ： 輕鏈 ( LC ) 及重鏈 ( HC ) 之胺基酸序列 ， 具有 VH / VL 結構域交換 / 替代 ( 2 + 2 型 CrossMAbCH1 / Ck )
2+2型抗體 2x HC 2x LC1 2x LC2
PD1/LAG3 8970 PD1(0376)/ aLAG3(0414) SEQ ID NO:114 SEQ ID NO:115 SEQ ID NO:101
PD1/LAG3 8984 PD1(0376)/ aLAG3(0416) SEQ ID NO:116 SEQ ID NO:115 SEQ ID NO:99
PD1/LAG3 9010 PD1(0376)/ aLAG3(25F7) SEQ ID NO:117 SEQ ID NO:115 SEQ ID NO:105
10.3 在一個結合臂 ( PD1 互換 Fab 與 Fc 節重鏈之 C 末端的 融合物 ) 中具有 CH1 / Ck 結構域交換 / 替代 ( 2 + 1 型 CrossMabCH1 / Ck ) 且在另一結合臂之 CH1 / CL 界面中具有帶電胺基酸取代的結合至 PD1 及 LAG3 之 多特異性抗體之製造及表現 在本實例中，如通用方法部分中所描述，藉由經典分子生物技術產生結合至人類PD1及LAG3之多特異性抗體，且如上文所描述，在Expi293F 293F細胞中短暫表現。多特異性2+1CrossMAbCH1 / Ck 抗體在WO2013/026831中亦有描述。使用含有編碼表 16 中描繪之胺基酸序列之核酸的表現質體表現該等多特異性抗體。2+1型 CrossMAbCH1 / Ck 雙特異性抗體之示意性結構顯示於圖1B中。表 16 ： 輕鏈 ( LC ) 及重鏈 ( HC ) 之胺基酸序列 ， 具有 CH1 / Ck 結構域交換 / 替代 ( 2 + 1 型 CrossMabCH1 / Ck )
2+1型抗體 HC1 HC2 LC1 2× LC2
PD1/LAG3 8310 aLAG3(0414)/ PD1(0376) SEQ ID NO:118 SEQ ID NO:119 SEQ ID NO:115 SEQ ID NO:101
PD1/LAG3 8311 aLAG3(0416)/ PD1(0376) SEQ ID NO:120 SEQ ID NO:121 SEQ ID NO:115 SEQ ID NO:99
PD1/LAG3 1252 aLAG3(25F7)/ PD1(0376) SEQ ID NO:122 SEQ ID NO:103 SEQ ID NO:115 SEQ ID NO:105
或者，PD1 互換Fab與Fc節重鏈之C末端的融合物可以用單鏈Fab(scFab)替代。此類包含scFab之多特異性2+1型抗體在WO2010/136172中亦有描述且可以使用含有編碼表17 中描繪之胺基酸序列之核酸的表現質體表現。在Fc節重鏈之C末端融合scFab之2+1型雙特異性抗體的示意性結構顯示於圖1C中。表 17 ： 輕鏈 ( LC ) 及重鏈 ( HC ) 之 胺基酸序列 ， 具有 PD1 scFab
2+1型抗體 HC1 HC2 2× LC
PD1/LAG3 8312 aLAG3(0414)/ PD1(0376) SEQ ID NO:123 SEQ ID NO:119 SEQ ID NO:101
PD1/LAG3 8313 aLAG3(0416)/ PD1(0376) SEQ ID NO:124 SEQ ID NO:121 SEQ ID NO:99
PD1/LAG3 1088 aLAG3(25F7)/ PD1(0376) SEQ ID NO:125 SEQ ID NO:103 SEQ ID NO:105
10.4 在重鏈之 C 末端分別 融合 VH / VL 的 結合至 PD1 及 LAG3 之 多特異性抗體 ( 2 + 1 型 PRIT 形式 ) 之製造及表現 在本實例中，如通用方法部分中所描述，藉由經典分子生物技術產生結合至人類PD1及LAG3之多特異性抗體，且如上文所描述，在Expi293F 293F細胞中短暫表現。此類多特異性2+1型抗體在WO 2010/115589中亦有描述。使用含有編碼表 18 中描繪之胺基酸序列之核酸的表現質體表現該等多特異性抗體。2+1型PRIT型雙特異性抗體之示意性結構顯示於圖1D中。表 18 ： 輕鏈 ( LC ) 及重鏈 ( HC ) 之 胺基酸序列 ， 其中 VH 及 VL 結構域經 C 末端與 重鏈融合
2+1型抗體 HC1 HC2 2x LC
PD1/LAG3 0918 aLAG3(25F7)/ aPD1(0376) SEQ ID NO:126 SEQ ID NO:127 SEQ ID NO:109
10.5 在一個結合臂中具有 VH / VL 結構域交換 / 替代 ( 反式 1 + 1 型 CrossMabVH / VL ) 且在與 Fc 孔重鏈之 C 末端 融合 LAG3 Fab 的 CH1 / CL 界面中具有帶電胺基酸取代的結合至 PD1 及 LAG3 之 多特異性抗體之製造及表現 製造單價結合至人類PD1及人類LAG3兩者的多特異性抗體，其中LAG3 Fab經由其可變重鏈結構域與重鏈之一，較佳Fc孔重鏈之C末端融合。如通用方法部分中所描述，藉由經典分子生物學技術產生該等分子並如上文所描述，在Expi293F 293F細胞中短暫表現。使用含有編碼表 19 中描繪之胺基酸序列之核酸的表現質體表現該等多特異性抗體。反式 1 + 1 型 CrossMabVH / VL 雙特異性抗體之示意性結構顯示於圖1H中。表 19 ： 輕鏈 ( LC ) 及重鏈 ( HC ) 之胺基酸序列 ， 其中 aLAG3 Fab 經 C 末端與 重鏈融合
1+1型抗體 HC1 HC2 LC1 LC2
PD1/LAG3 0725 aLAG3(0414)/ aPD1(0376) SEQ ID NO:96 SEQ ID NO:144 SEQ ID NO:98 SEQ ID NO:101
10.6 在一個結合臂中具有 VH / VL 結構域交換 / 替代 ( 反式 2 + 1 型 CrossMabVH / VL ) 且在 兩個 LAG3 Fab ( 其中之一與 Fc 孔 重鏈之 C 末端 融合 ) 之 CH1 / CL 界面中具有帶電胺基酸取代的結合至 PD1 及 LAG3 之 多特異性抗體之製造及表現 製造單價結合至人類PD1且二價結合至人類LAG3的多特異性抗體，其中LAG3 Fab經由其可變重鏈結構域與重鏈之一，較佳Fc孔重鏈之C末端融合。如通用方法部分中所描述，藉由經典分子生物學技術產生該等分子並如上文所描述，在Expi293F 293F細胞中短暫表現。使用含有編碼表 20 中描繪之胺基酸序列之核酸的表現質體表現該等多特異性抗體。反式 2 + 1 型 CrossMabVH / VL 雙特異性抗體之示意性結構顯示於圖1I中。表 20 ： 輕鏈 ( LC ) 及重鏈 ( HC ) 之胺基酸序列 ， 其中 aLAG3 Fab 之一經 C 末端與 重鏈融合
1+1型抗體 HC1 HC2 LC1 2 x LC2
PD1/LAG3 0750 aLAG3(0414)/ aPD1(0376) SEQ ID NO:96 SEQ ID NO:145 SEQ ID NO:98 SEQ ID NO:101
10.7 結合至 PD1 及 LAG3 之多特異性抗體之純化及表徵 利用蛋白質A親和層析法與尺寸排阻層析法之組合，自上清液純化出以上表現之多特異性抗體。所有多特異性抗體均可以良好產率產生且穩定。藉由質譜法表徵所得產物之屬性，且藉由SDS-PAGE表徵諸如純度、單體含量及穩定性之分析特性。質譜 藉由電噴霧電離質譜(ESI-MS)分析去糖基化之完整CrossMab及去糖基化/纖維蛋白溶酶消化或以其他方式去糖基化/限制性LysC消化之CrossMab的預期一級結構。 在37℃下，用N-糖苷酶使在磷酸鹽或Tris緩衝液中蛋白質濃度為1 mg/ml之CH1/Ck CrossMab去糖基化，保持17小時。纖維蛋白溶酶或限制性LysC (Roche)消化係在含100 μg去糖基化之CH1/Ck CrossMab的Tris緩衝液pH 8中分別在室溫下進行120小時及在37℃下進行40分鐘。在質譜法之前，在Sephadex G25管柱(GE Healthcare)上經由HPLC使樣本脫鹽。在配備有TriVersa NanoMate源(Advion)之maXis 4G UHR-QTOF MS系統(Bruker Daltonik)上經由ESI-MS測定總質量。多特異性抗體之穩定性 為評估抗體構築體之穩定性，根據以下程序評估熱穩定性以及聚集起始溫度。在20 mM組胺酸/組胺酸氯化物、140 mM NaCl pH 6.0中製備濃度為1 mg/mL之指定抗體之樣本，轉移至10 µL微量比色皿陣列中，並將樣本以0.1℃/min之速率自25℃加熱至90℃，同時用Optim1000儀器(Avacta Inc.)記錄在用266 nm雷射激發時的靜態光散射資料以及螢光資料。 聚集起始溫度(Tagg )定義為散射光強度開始增加時之溫度。熔融溫度(Tm )定義為螢光強度對比波長之圖中的拐點。 實例11 表徵雙特異性抗PD1/抗LAG3抗體11.1 結合 Elisa 針對 hu PD1 之 ELISA 用25微升/孔濃度為500 ng/ml之生物素化PD1-ECD-AviHis塗佈Nunc maxisorp經抗生物素蛋白鏈菌素塗佈之盤(MicroCoat #11974998001)且在4℃下培育隔夜。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST緩衝液)之後，添加25微升遞增濃度之抗PD1樣本並在室溫下培育1小時。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST緩衝液)之後，添加25微升/孔以1:5000稀釋之山羊抗人類H+L-POD (JIR, JIR109-036-098)並在室溫下在振盪器上培育1小時。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST緩衝液)之後，添加25微升/孔的TMB受質(Roche，11835033001)並培育直至OD 2-3。在370/492 nm下進行量測。 針對人類PD1之細胞ELISA 將用編碼全長人類PD1之質體15311_hPD1-fl_pUC_Neo穩定轉染且用G418 (質體上之新黴素抗性標記物)選擇之貼壁CHO-K1細胞株以0.01×10E6個細胞/孔之濃度接種至384孔平底盤中並使其生長隔夜。 次日，添加25微升/孔PD1樣本或人類抗PD1 (Roche)/小鼠抗PD1 (Biolegend；目錄號：329912)參考抗體且在4℃下培育2小時(以避免內化)。在小心地洗滌(1×90微升/孔PBST)之後，藉由添加30微升/孔在1×PBS緩衝液中稀釋之0.05%戊二醛(Sigma，目錄號G5882，25%)來固定細胞且在室溫下培育10分鐘。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST)之後，添加25微升/孔的二次抗體用於偵測：山羊抗人類H+L-POD (JIR, JIR109-036-088)/綿羊抗小鼠-POD (GE NA9310)，隨後在室溫下在振盪器上培育1小時。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST)之後，添加25微升/孔TMB受質溶液(Roche 11835033001)並培育直至OD 1.0-2.0。在370/492 nm下量測盤。 細胞ELISA結果以「EC50 CHO-PD1」值[nM]列於下表21中。 針對人類Lag3之ELISA 用25微升/孔蛋白質濃度為800 ng/ml之重組人類LAG-3 Fc嵌合體蛋白質(R&D Systems, 2319-L3)塗佈Nunc maxisorp盤(Nunc 464718)並在4℃下培育隔夜或在室溫下培育1小時。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST緩衝液)之後，在室溫下將各孔與90 µl阻斷緩衝液(PBS+2% BSA+0.05%吐溫20)一起培育1小時。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST緩衝液)之後，添加25 µl濃度為1-9 µg/ml(1:3稀釋於OSEP緩衝液中)之抗Lag3樣本並在室溫下培育1小時。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST緩衝液)之後，添加25微升/孔1:2000稀釋的山羊抗人類Igκ鏈抗體-HRP偶聯物(Milipore, AP502P)並在室溫下培育1小時。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST緩衝液)之後，添加25微升/孔的TMB受質(Roche, 11835033001)並培育2-10分鐘。量測在Tecan Safire 2儀器上在370/492 nm下進行。 細胞表面Lag3結合ELISA 將25微升/孔Lag3細胞(表現Lag3之重組CHO細胞，10000個細胞/孔)接種於組織培養物處理之384孔盤(Corning, 3701)中並在37℃下培育一或兩天。次日，在移除培養基之後，添加25 µl抗Lag3樣本(1:3稀釋於OSEP緩衝液中，起始濃度為6-40 nM)並在4℃下培育2小時。洗滌(1×90 µl，PBST)之後，藉由添加30微升/孔戊二醛達到0.05%最終濃度(Sigma目錄號：G5882)，在室溫下保持10分鐘來固定細胞。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST緩衝液)之後，添加25微升/孔1:1000稀釋的山羊抗人類Igκ鏈抗體-HRP偶聯物(Milipore, AP502P)並在室溫下培育1小時。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST緩衝液)之後，添加25微升/孔的TMB受質(Roche, 11835033001)並培育6-10分鐘。量測在Tecan Safire 2儀器上在370/492 nm下進行。細胞ELISA結果以「EC50 CHO-LAG3」值[nM]列於下表21中。 抑制LAG-3與人類A375腫瘤細胞上表現之MHC-II之結合(藉由ELISA測定) 將25微升/孔A375細胞(10000個細胞/孔)接種於組織培養物處理之384孔盤(Corning, 3701)中並在37℃下培育隔夜。將抗Lag3抗體與在細胞培養基中以3 µg/ml抗體濃度起始，經1:3稀釋之生物素化Lag3(250 ng/ml)一起預培育1小時。在自接種有細胞之孔中移除培養基之後，將25 µl抗體-Lag3預培育混合物轉移至孔中並在4℃下培育2小時。洗滌(1×90 µl，PBST)之後，藉由添加30微升/孔戊二醛達到0.05%最終濃度(Sigma目錄號：G5882)，在室溫下保持10分鐘來固定細胞。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST緩衝液)之後，添加25微升/孔1:2000或1:8000稀釋之聚HRP40-抗生物素蛋白鏈菌素(Fitzgerald, 65R-S104PHRPx)並在室溫下培育1小時。洗滌(每孔使用3×90微升之PBST緩衝液)之後，添加25微升/孔TMB受質(Roche, #11835033001)並培育2至10分鐘。量測在Tecan Safire 2儀器上在370/492 nm下進行。細胞ELISA結果以「IC50 MHCII/ELISA」值[nM]列於下表21中。 表21：不同雙特異性抗PD1/抗LAG3抗體之結合的概述
雙特異性抗體 ELISA huPD1 rel. EC50 [nM] ELISA huLAG3 rel. EC50 [nM] EC50 CHO-PD1 rel. EC50 [nM] EC50 CHO-LAG3 rel. EC50 [nM] MHCII/ELISA IC50 [nM]
PD1/LAG3 0927 (PD1-0376/LAG3-0414) (1+1) 0.07 0.18 0.1 0.23 1.11
PD1/LAG3 0799 (PD1-0376/LAG3-0416) (1+1) 0.06 0.07 0.07 0.20 0.72
PD1/LAG3 0222 (PD1-0069/ LAG3 25F7) (1+1) 0.16 1.14 0.28 0.72 0.77
PD1/LAG3 0224 (PD1-0098/ LAG3 25F7) (1+1) 0.04 0.86 0.06 0.86 0.79
PD1/LAG3 8310 (PD1-0376/LAG3-0414) (1+2) 0.06 0.06 0.34 0.20 0.47
PD1/LAG3 8311 (PD1-0376/LAG3-0416) (1+2) 0.05 0.06 0.32 0.17 0.39
PD1/LAG3 1252 (PD1-0376/LAG3 25F7) (1+2) 0.03 0.02 0.31 0.64 0.47
PD1/LAG3 8970 (PD1-0376/LAG3-0414) (2+2) 0.05 0.04 0.46 0.20 0.45
PD1/LAG3 8984 (PD1-0376/LAG3-0416) (2+2) 0.05 0.05 0.54 0.17 0.44
PD1/LAG3 9010 (PD1-0376/LAG3-25F7) (2+2) 0.04 0.05 0.36 0.48 0.52
11.2 結合 Biacore 結合至 PD1 及 LAG3 之多特異性抗體之抗原結合特性 藉由Biacore®評估多特異性抗體與其相應靶抗原，亦即PD1及LAG3之結合。PD1 結合可以根據以下程序評估 ： 抗人類Fc IgG藉由與(Biacore) CM5感測器晶片表面經歷胺偶合進行固定。接著，捕捉樣本且使hu PD1-ECD與其結合。在每個分析週期之後，使感測器晶片表面再生。最後，藉由將資料擬合至1:1朗格繆爾相互作用模型獲得平衡常數及動力學速率常數。 藉由使用GE Healthcare供應之胺偶合套組，將約10,000個反應單位(RU)之20 μg/ml抗人類IgG (GE Healthcare #BR-1008-39)偶合至Biacore T200中CM5感測器晶片之所有流槽上。樣本及操作緩衝液係HBS-EP+ (0.01 M HEPES、0.15 M NaCl、3 mM EDTA、0.05% v/v界面活性劑P20，pH 7.4)。流槽溫度設定為25℃且樣本隔室溫度設定為12℃。用操作緩衝液預處理系統。 經15秒注入濃度為10 nM之不同樣本，且使其連續結合至流槽2、3及4。接著，在各樣本上經300秒注射一整組濃度(300 nM、100 nM、2×33.3 nM、11.1 nM、3.7 nM、1.2 nM及2×0 nM)之人類PD1-ECD，隨後為10/600秒之解離時間及兩個用3 M MgCl2 進行之30秒再生步驟，其中最後一個步驟含有用操作緩衝液進行「注射後額外洗滌」。最後，用Biacore T200評價軟體將雙重參考資料擬合至1:1朗格繆爾相互作用模型。根據以下程序評估 LAG3 結合 ： 使用GE Healthcare提供之Biacore SA CAP套組進行此分析。在25℃下，在HBS-EP+(GE Healthcare)緩衝液中獲得動力學值。 如CAP套組手冊中所規定，將SA CAP晶片對接至Biacore T200。該操作方法含有四條命令。首先，使用『通用』命令，以10 µl/min流動速率經300秒注射CAP試劑以雜交固定之單股DNA。該命令之後為經15秒長時間注入1 µg/ml生物素化Fc標記之人類Lag3細胞外結構域於操作緩衝液中之稀釋液。由此引起約50 RU之捕捉量。使用單週期命令注射五個不同的樣本濃度(100 nM-6.25 nM，2倍稀釋)，隨後為1200秒長的解離期。接著，如SA CAP套組手冊中所規定，使晶片再生。 最後，使用Biacore T200評價軟體3.0版評價所得到的曲線。結果： 該等相互作用並不擬合至1:1朗格繆爾結合模型，因為除0799及0927外的所有樣本均具有兩個Lag3結合部分且因此顯示親合力。由於0799及0927含有一小群錯誤配對之二價樣本，故其亦顯示出一定親合力。 因此，僅根據解離速度對感測器圖譜分級。此係藉由目測比較單週期動力學曲線進行。由此顯示，0416-Lag3 ECD複合物比此樣本集中之任何其他樣本穩定。在此實驗中，單價＜Lag3＞Crossmab形式(0799)仍展示比任何其他樣本慢的解離速率。 另外，亦發現親和性Lag3-0414/Lag3-0927-Lag3 ECD複合物係在此實驗中所觀察的樣本中最弱的。0414及0416之親和結合部分與其單價Crossmab對應物0927及0799之親和部分大致類似。結果指示於表 22 中。表 22 ： 藉由 SPR 量測所測定的 PD1 - LAG3 雙特異性抗體之結合品質
樣本 結合品質
aLAG3(0414) ++
aLAG3(0416) +++
PD1/LAG3 0927 (1+1) +
PD1/LAG3 0799 (1+1) +++
aLAG3(25F7) ++
aLAG3(MDX26H10) ++
aLAG3(BMS986016) ++
aLAG3(BAP050) +
反式形式與 1 + 1 型 雙特異性抗體 0927 及 0799 之 親合力評估比較： 測定雙特異性分子(樣本)及其個別靶以及PD1及LAG3(分析物)之組合的解離常數以評估由所有價態同時結合所提供的親合力增益。 在Biacore 8K上量測之前，使用GE Healthcare提供之標準胺偶合套組準備CM5感測器晶片。因此，在pH 5.0乙酸鹽緩衝液中將針對樣本Fc部分(亦即，帶有PGLALA突變之Fc部分)中之特定突變的內部製造之抗體，本文中稱為抗PGLALA抗體(此類抗體在WO 2017/072210中有描述)稀釋至50 µg/ml濃度。經1200秒，以8 µl/min流速使其偶合至所有流槽及通道，得到約19000 RU之結合反應。 使用HBS-EP+ 緩衝液(GE HC)作為操作緩衝液進行感測器晶片準備以及主操作本身。該分析係在由三次17秒長之樣本注射隨後利用10 mM NaOH溶液進行之再生步驟組成的啟動之後開始。在第一步驟中，藉由經17秒以10 µl/min流動速率注射抗PGLALA抗體將不同樣本捕捉至感測器晶片表面上個別通道之流槽2上。其次，經200秒以50 µl/min流動速率將三種分析物(PD1、LAG3-Fc、2+2型PD1/LAG3-Fc融合物)之一注射至兩個流槽中，隨後為1000秒長(在LAG3-Fc之情況下為600秒)之解離期。最後，藉由兩次連續注射(30秒長)10 mM NaOH溶解抗PGLALA抗體/樣本複合物。各個別動力學測定由利用不同分析物濃度(0 nM、5 nM、25 nM及100 nM)之四個循環組成。 使用Biacore 8K評價軟體評價所得到的資料。應用1:1解離擬合並將由此得到的kd值轉換成以分鐘計的複合物半衰期。計算PD1/Lag3-Fc融合物抗原結合分子與其主要個別促成物(PD1或Lag3)之親合力結合之間的差異並分選至描述由多價及雙特異性結合引起之穩定性增益的三個類別之一中(表23)。表 23 ： 藉由 SPR 量測所測定的由 PD1 - LAG3 雙特異性抗體之親合力提供之複合物穩定性的增加
樣本 結合品質
PD1/LAG3 0927 (1+1) ++
PD1/LAG3 0799 (1+1) +++
PD1/LAG3 0725 (反式1+1) +
PD1/LAG3 0750 (反式1+2) ++
11.3 在經由雙特異性抗PD1/抗LAG3雙特異性抗體同時接合之後細胞PD1及LAG3之二聚化 如實例10中所描述，產生各種形式之雙特異性抗PD1/抗LAG3抗體。使用此細胞分析展示當與針對兩個靶之雙特異性抗體連接或交聯時兩種不同受體之二聚化或最終結合/相互作用，該等受體與酶之兩個片段經胞質融合。由此僅單獨一個受體不顯示酶活性。對於此特異性相互作用，兩個受體之胞質C末端個別地與報導體酶之異源次單元融合。僅單個酶次單元不顯示報導體活性。然而，預期抗PD1/抗LAG3雙特異性抗體構築體同時結合至兩個受體會導致兩個受體之局部胞質積累、兩個異源酶次單元之互補且最終引起特定功能性酶之形成，該酶水解受質，由此產生化學發光信號。 為了分析雙特異性抗PD1/抗LAG3抗體之交聯作用，10,000個PD1+ LAG3+ 人類U2OS細胞/孔接種於96孔白色平底盤(costar，目錄號#3917)中並在分析培養基中培養隔夜。次日，丟棄細胞培養基並更換為新鮮培養基。製備抗體或配位體稀釋液並添加滴定量之指定(雙特異性)抗體，且在37℃下培育2小時。接下來，添加受質/緩衝液混合物(例如PathHunterFlash偵測試劑)且再培育1小時。為量測在同時結合及二聚化時誘導之化學發光，使用Tecan infinite讀取器。 結果顯示於圖 5A 及 5B 中。標繪化學發光(以RU為單位度量)隨抗體濃度變化之圖。單特異性(二價)抗LAG3抗體不能引起化學發光信號，而所有雙特異性抗PD1/抗LAG3抗體以濃度依賴性方式誘導化學發光信號。 為顯示同時結合之特異性(及發光信號之誘導)，進行競爭實驗：如先前所示，用雙特異性抗體(1252)處理以劑量依賴性方式誘導發光信號(圖 5C )。若在aLAG3抗體(0156，MDX25F7)或抗PD1抗體(0376)存在下提供該雙特異性抗體，則信號幾乎完全抑制(對於PD1競爭)或至少明顯減弱(LAG3)。親本抗體係與雙特異性抗體(1252、2+1型LAG3/PD1)中所包含相同之結合劑。提供的競爭抗體各自為20 µg/ml恆定濃度。 另一實驗之結果顯示於圖 5D 中。與先前的競爭實驗類似，如藉由發光信號所量測，與親本aLAG3(0156)PD1抗體(0376；各自恆定地在10µg/ml)一起培育對雙特異性抗體(1252、2+1型雙特異性aLAG3-0156及PD1-0376)與PD1 Lag3雙重表現性細胞之結合特性具有影響。用抗PD1抗體(0376)以及重組LAG3:Fc蛋白質(0160)競爭幾乎消除該信號，而單獨aLAG3結合劑(0156)之存在僅引起部分抑制。結合至與0156不同之抗原決定基的兩種其他抗LAG3抗體0414及0416不與包含aLAG3結合劑(0156)之雙特異性抗體競爭結合，因為該等抗體沒有明顯調節該信號。 在另一實驗中，比較包含不同aLAG3結合劑(0414相對於0416)及呈不同形式(1+1相對於2+1)之雙特異性抗LAG3/抗PD1抗體的同時結合(圖 6A 至 6D )。如前所述，測試呈1+1 CrossMab形式(0799及0927)或2+1形式(兩個Lag3結合臂及一個C末端融合之PD1 互換Fab片段：8311及8310)的若干抗LAG3/抗PD1雙特異性抗體。在圖6A及6B中顯示具有結合劑aLAG3-0416之構築體的曲線(吸光度相對於濃度)且在圖6C及6D中顯示具有aLAG4-0414之相應構築體的曲線。所有測試構築體均能夠結合至細胞並誘導化學發光。結合曲線之EC50 計算值顯示於下表24中。表 24 ：在二聚化結合分析中所量測之 EC50 值
雙特異性抗體 形式 MW [kD] EC50 [pM]
0927 (PD1-0376/LAG3-0414) 1+1 145 41
0799 (PD1-0376/LAG3-0416) 1+1 145 76
8310 (PD1-0376/LAG3-0414) 1+2 193 28
8311 (PD1-0376/LAG3-0416) 1+2 193 119
在另一實驗中，比較包含不同aLAG3結合劑(0414相對於0416)及呈不同形式(2+1相對於2+2)之雙特異性抗LAG3/抗PD1抗體的同時結合(圖 7A 至 7D )。測試呈2+1形式(兩個LAG3結合臂及一個經C末端融合之PD1 互換Fab片段：8311及8310)或呈2+2 crossmab形式(兩個LAG3結合臂及兩個經C末端融合之PD1 互換Fab片段：8970及8984)的抗LAG3/抗PD1雙特異性抗體。在圖7A及7B中顯示具有結合劑aLAG3-0414之構築體的曲線(吸光度相對於濃度)且在圖7C及7D中顯示具有aLAG4-0416之相應構築體的曲線。所有測試構築體均能夠結合至細胞並誘導化學發光。結合曲線之EC50 計算值顯示於下表25中。表 25 ：在二聚化結合分析中所量測之 EC50 值
雙特異性抗體 形式 MW [kD] EC50 [pM]
8310 (PD1-0376/LAG3-0414) 2+1 193 114
8311 (PD1-0376/LAG3-0416) 2+1 193 124
8970 (PD1-376/LAG3-0414) 2+2 242 83
8984 (PD1-0376/LAG3-0416) 2+2 242 91
在另一實驗中，將呈經典1+1CrossMAbVh - VL 形式之雙特異性抗LAG3/抗PD1抗體PD1/LAG3 0927之同時結合與呈反式1+1形式(PD1/LAG3 0725)及反式2+1形式(PD1/LAG3 0750)之雙特異性抗LAG3/抗PD1抗體相比較。在此實驗中，對該方法作出以下改變。為了分析不同抗LAG3/抗PD1抗體形式之交聯作用，將7500個PD1+ LAG3+ 人類U2OS細胞/孔與抗體之不連續稀釋液(最終濃度為0.29 pM至5484 pM)一起接種於96孔白色平底盤中並在CO2 恆溫箱中於37℃下培育20小時。接下來，將分析盤平衡至室溫並添加受質/緩衝液混合物(PathHunterFlash偵測試劑，Discoverx)且再培育4小時。為量測在同時結合及二聚化時誘導的化學發光，使用SpectraMax L盤讀取器(Molecular Devices)。 在圖 7E 中，描繪PD1-LAG3雙特異性抗體1+1型CrossMab(0927)、具有N末端aPD1及C末端aLAG3之反式1+1型CrossMab(0725)以及具有N末端aPD1及N末端加C末端aLAG3之反式2+1型CrossMab(0750)的劑量反應曲線(發光相對於濃度)。相較於PD1/LAG3 0927，PD1/LAG3 0725之PD1 LAG3受體交聯作用明顯較高，而其略微低於PD1/LAG3 0750。 11.4 在PD-1及LAG-3組合報導體分析中量測雙特異性抗LAG3/抗PD1反式CrossMab變異體 為了測試不同抗PD1-LAG3抗體形式在活體外恢復受抑制之T細胞反應中的中和效力，使用可商購之報導體系統。PD1及LAG3組合生物分析由PD1表現性、LAG3表現性及T細胞受體(TCR)表現性報導體細胞、MHC-II表現性及PDL1表現性腫瘤細胞及TCR活化抗原組成。 效應細胞係表現人類PD1、人類LAG3、人類TCR及由NFAT反應元件(NFAT-RE)驅動之螢光素酶報導體的Jurkat T細胞。靶細胞係表現人類PD-L1之A375細胞。簡言之，報導體系統係基於三個步驟：(1)TCR活化抗原誘導之NFAT細胞活化、(2)抑制由MHCII(A375細胞)與LAG3+ (Jurkat細胞)以及PD-L1(A375細胞)與PD1(Jurkat細胞)之間之相互作用介導的活化信號，及(3)藉由PD1及LAG3拮抗/中和抗體恢復NFAT活化信號。 在此實驗中，在CO2 恆溫箱中在37℃下將每孔1×104 個A375靶細胞與TCR活化抗原(Promega)一起於96孔平底分析盤中培育隔夜。接下來，移除盤中之培養基並添加抗LAG3/抗PD1抗體之連續稀釋液(最終分析濃度為0.01 nM至857 nM)以及每孔5×104 個Jurkat效應細胞。在CO2 恆溫箱中於37℃下培育6小時之後，將分析盤平衡至室溫並將80 µl ONE-Glo Ex受質(Promega)添加至各孔中。培育10分鐘之後，在SpectraMax L盤讀取器(Molecular Devices)中量測發光。預期抗PD1/抗LAG3雙特異性抗體構築體同時結合至兩個受體會導致兩個受體之局部胞質積累、兩個異源酶次單元之互補且最終引起特定功能性酶之形成，該酶水解受質，由此產生化學發光信號。在圖 7F 中，描繪抗PD1/抗LAG3雙特異性抗體1+1型CrossMab(0927)、具有N末端aPD1及C末端aLAG3之反式1+1型CrossMab(0725)以及具有N末端aPD1及N末端加C末端aLAG3之反式2+1型CrossMab(0750)的劑量反應曲線(發光相對於濃度)。0927與0725藉由阻斷PD1及LAG3與其相應配位體之相互作用恢復報導體細胞活化之能力係相當的，但其高於0750。此係由表26中所列之EC50 值進一步指示。表 26 ： 在 PD - 1 及 LAG - 3 組合報導體分析中量測之 EC50 值
雙特異性抗體 形式 MW [kD] EC50 [nM]
PD1/LAG3 0927 1+1順式 145259 3.1
PD1/LAG3 0725 1+1反式 145890 2.2
PD1/LAG3 0750 2+1反式 192888 0.6
實例12 雙特異性抗PD1/抗LAG3抗體之功能表徵 12.1 在結合至T細胞表面時內化減少藉由流式細胞測量術量測受體內化 受體內化表示當經靶向受體在細胞表面上迅速地再表現以便抑制TCR信號傳導時可以在數小時內降解之分子的重要接收方式。因此，藉由流式細胞測量術評估當結合構築體時受體之內化情況，其中使用在4℃下用不同雙特異性形式染色之樣本作為參考以與在4℃下染色之後於37℃下培育3小時之樣本相比較。 在4℃下，將先前與1 μg/ml盤結合之抗CD3及1 μg/ml可溶性抗CD28抗體一起培養的三天多株活化CD4 T細胞在抗LAG3或抗PD1/抗LAG3雙特異性抗體存在下培育30分鐘(一式兩份)。接著洗滌細胞，將其分成兩組，一組在37℃下再培育3小時且另一組立即用經標記之二次抗體(eBioscience)染色，隨後用BD Cell Fix固定。培育3小時後，第二組細胞亦用經標記之二級抗體染色，隨後固定。染色之後，用PBS/2% FCS洗滌細胞兩次，隨後採集細胞。 在LSRFortessa (BD Biosciences)獲得細胞且比較兩組中可偵測抗體在細胞表面上之表現量。結果顯示於圖 8B 中。據觀察，在3小時之後，所有雙特異性形式以及單特異性二價aLAG-3抗體均已內化，不過呈1+1形式之雙特異性抗PD1/抗LAG3抗體(PD1/LAG3 0799及PD1/LAG3 0927)內化程度最低。藉由螢光共聚焦顯微鏡觀測抗體定位及內化情況 活化CD4陽性細胞用CMFDA(Invitrogen)染色並塗鋪於用Retronectin(Takara Bio)處理之圓形蓋玻片上。在37℃下，使細胞黏附4小時，隨後將螢光標記之抗體(1μg/mL：經Alexa 647標記的a-LAG3(1256) 、1+1型PD1/LAG3 Bispec(0927)、PD1-LAG3 1+2型Bispec(8310)及PD1-LAG3 2+2型Bispec(8970))直接添加至生長培養基中，保持不同持續時間(15分鐘、1小時及3小時)。使用冷PBS (Lonza)淬滅反應且洗去未結合之抗體。接著，在4℃下用Cytofix(BD)固定細胞20分鐘並用PBS(Lonza)洗滌兩次。接著轉移蓋玻片並用Fluoromount G(eBioscience)安放在玻璃載片上且在暗處，在4℃下保持隔夜，隨後獲取圖像。A) 螢光圖像顯示於圖 9A 中 。白色信號表示經標記抗體之位置。來自高度靶向細胞之膜ROI的螢光信號強度除以來自相同細胞之細胞質ROI之螢光信號強度，得到方框圖中展示之比率。為了比較樣本，使用單因素變異數分析未校正之費雪LSD(*=p＜0.05；**=p ＜0.01)。結果顯示於圖 9B 中。隨時間進行之分析顯示當與LAG3抗體之細胞內群集(用作對照)相比較時，該等雙特異性抗體及LAG3抗體在膜中定位程度較高。據觀察，在3小時之後，所有雙特異性形式以及單特異性二價aLAG-3抗體均已內化，僅1+1型PD1/LAG3 Bispec(0927)除外(圖9A)。 用來自Zeiss的具有60x油浸物鏡之倒置式LSM 700進行螢光共聚焦顯微鏡檢查。使用耦接至顯微鏡之Zen軟體(Zeiss)收集圖像。圖像分析係用Imaris軟體(Bitplane; Oxford Instrument)進行且統計分析係由GraphPad Prism(Graphpad Software)進行。 12.2 與習知T細胞及Treg之結合的比較 主導PD1-LAG3 BsAb之期望特性係能夠優先結合至習知T細胞而非Treg，因為Treg上之LAG3看來會不利地調控其抑制功能。因此，用阻斷抗體靶向Treg上之LAG3會因增加其抑制功能且最終掩蓋所需對其他T細胞之阻斷作用而不利。因此，評估不同抗PD1/抗LAG3雙特異性抗體形式與一起培養的經活化習知及調控T細胞之競爭性結合。 自健康供體PBMC(Miltenyi)分選出調控T細胞(Treg)及習知T細胞(Tconv)，分別用5mM CellTraceViolet或CFSE膜染料標記，並以1:1比率與1 μg/ml盤結合之抗CD3及1 μg/ml可溶性抗CD28抗體一起培養3天。第3天，在4℃下將細胞與直接標記之抗PD1、抗LAG3或雙特異性抗體一起培育30分鐘，用BD Cell Fix固定並在LSRFortessa(BD Biosciences)採集。 儘管單特異性抗LAG3親本抗體與Treg及習知T細胞之結合同樣良好(圖 10A )，但由於PD1在效應T細胞上之表現量高於在Treg上之表現量，故抗PD1對應物優先結合至習知T細胞(圖 10B )。值得注意的是，1+1形式之PD1/LAG3雙特異性抗體(0927)亦保留優先結合至習知T細胞而非Treg之能力(圖 10C )。該與習知T細胞之優先結合亦可藉由描繪習知T細胞上之信號相對於Treg上之信號的差異(Δ)來觀測(圖 10D )。2+1形式與2+2形式均未顯示出親合力驅動的對效應T細胞之選擇性且在其與單特異性抗LAG3抗體之結合方面係相當的。 12.3 PD-1及LAG-3阻斷對Treg抑制與經照射之同種異體PBMC共培養的人類CD4 T細胞之顆粒酶B及IFN-γ釋放的影響. 進一步測試雙特異性抗體形式之結合特性差異是否會使Tconv相對於Treg具有任何功能優勢。在涉及調控T細胞(Treg)抑制分析之功能研究中，將來自同一供體之PBMC分成兩份樣本：經由微珠套組(Miltenyi Biotec)，一份富集CD4 T細胞且另一份富集Treg，定義為CD4+ CD25高 CD127低 T細胞。在該兩個群體純化後，CD4 T細胞用5 μM羧基螢光素琥珀醯亞胺酯(CFSE)標記，而Treg用5 μM Cell-Trace-Violet(CTV)標記以便能在隨後的FACS中對其進行區分。 接著，在存在或不存在10 μg/ml濃度之抗LAG-3抗體(主導0414及後備0416)或競爭劑抗LAG-3抗體(BMS-986016及人類化BAP050))與抗PD-1抗體之組合下，在96孔培養盤中以1:1比率共培養CD4 T細胞(105 )及Treg (105 )以及來自不相關供體的經照射PBMC (105 )。作為估計Treg對CD4T細胞效應功能之抑制量值的對照，亦在無Treg存在下共培養CD4 T細胞(105 )與經照射PBMC(105 )。 五天後收集細胞培養物上清液，並在稍後用於藉由ELISA (R&D systems)量測IFNγ含量，且在37℃下，在Golgi Plug (布雷菲爾德菌素A)及Golgi Stop (莫能菌素)存在下再靜置細胞5小時。接著洗滌細胞，在表面上用抗人類CD4抗體及Live/Dead可固定染料Aqua (Invitrogen)染色，之後用固定/滲透化緩衝液(BD Bioscience)固定/滲透。針對顆粒酶B(BD Bioscience)及IFNγ(eBioscience)進行細胞內染色。結果顯示於圖 11 中。 如藉由顆粒酶B之分泌量明顯高於在單獨親本抗PD1抗體或帕博利珠單抗存在下(P ＜0.05)或在無檢查點抑制劑存在下(P ＜0.001)之Tconv所展示，PD1/LAG-3雙特異性抗體(0927)使Tconv脫離調控T細胞之緊密控制。競爭劑抗LAG3抗體BMS-986016與納武單抗之組合不能明顯挽救Tconv效應功能不受Treg抑制。 12.4 PD-1/LAG-3雙特異性抗體對與B細胞-淋巴母細胞樣細胞株(ARH77)共培養之人類CD4 T細胞之細胞毒性顆粒酶B釋放的影響 評估相較於抗PD-1及抗LAG-3親本抗體之組合及標準治療中使用之抗PD1抗體，不同雙特異性抗體形式誘導當與腫瘤細胞株ARH77共培養時CD4 T細胞之顆粒酶B分泌的能力。 總計測試6種形式，3種由抗PD1(0376)及抗LAG3(1256，chi 0414)抗體之組合產生且另外3種形式由抗PD1(0376)及抗LAG-3(hu1257，chi 0416)抗體產生。 在圖 13 中可以看出，當與未處理CD4 T細胞相比較時，由抗LAG3(hu 1256，抗LAG3 0414作為IgG1 PGLALA)及抗PD1(0376)產生的兩種雙特異性形式1+1(0927)及2+2(8970)以及親本抗體組合明顯增加CD4 T細胞之顆粒酶B分泌(分別為P =0.0005、P =0.01及P =0.0001)。相應2+1形式(8310)顯示出類似趨勢，但其未達到統計顯著性(P =0.07)。 關於藉由組合抗LAG-3(hu 1257，抗LAG3 0416作為IgG1 PGLALA)與抗PD1(0376)產生之雙特異性抗體，當與未處理之CD4細胞相比較時，該1+1形式(0799)及2+2形式(8984)使顆粒酶B陽性CD4 T細胞之頻率明顯增加(分別為P =0.0032及P = 0.0064)。 當與在無檢查點抑制劑存在下培養之細胞相比較時，納武單抗及帕博利珠單抗均不能明顯促進CD4 T細胞之較高顆粒酶B分泌。(圖 13 )。表 27 ：測試 PD1 - LAG3 雙特異性抗體對細胞毒性顆粒酶 B 釋放之影響
樣本 作用
PD1/LAG3 0927 (1+1) +++
PD1/LAG3 8970 (2+2) +
PD1/LAG3 8310 (1+2) +/-
PD1/LAG3 0799 (1+1) ++
PD1/LAG3 8984 (2+2) ++
PD1/LAG3 8311 (1+2) +/-
aLAG3(BMS986016) ++
12.5 PD-1及LAG-3阻斷對在用免疫原性黑素瘤抗原肽池回憶之後來自黑素瘤患者PBMC之CD4 T細胞之顆粒酶B及IFN-γ分泌的影響 先前已描述，黑素瘤患者之PBMC含有可偵測頻率之腫瘤抗原特異性T細胞。因此，出於概念驗證目的，針對用免疫原性黑素瘤相關抗原肽池再刺激隔夜之黑素瘤患者PBMC測試抗LAG-3抗體(0414)加抗PD-1(0376)之組合相對於所得呈1+1形式之雙特異性抗體(0927)或單獨抗PD-1的差異。 在室溫下，在存在或不存在飽和濃度(10μg/ml)之單獨抗PD-1(0376)、與抗LAG-3抗體之組合(0414，10 μg/ml)或呈雙特異性1+1形式之抗體(0927，20 μg/ml)下培育來自黑素瘤患者之105 至106 個PBMC。接著，在蛋白質轉運抑制劑Golgi Plug(布雷菲爾德菌素A)及Golgi Stop(莫能菌素)存在下，用一組免疫原性腫瘤相關抗原，如MAGEA1、MAGEA3、MAGEA4、Melan-A/MART-1、NYESO-1、黑色素細胞蛋白質Pmel 17 gp100、酪胺酸酶、酪胺酸酶相關蛋白質2再刺激T細胞隔夜。 接著洗滌細胞，在表面上用抗人類CD4抗體及Live/Dead可固定染料Aqua (Invitrogen)染色，之後用固定/滲透化緩衝液(BD Bioscience)固定/滲透。針對顆粒酶B(BD Bioscience)及IFN-γ(eBioscience)進行細胞內染色。 抗LAG-3與抗PD-1抗體之組合(P ＜0.01及P ＜0.001)以及該雙特異性抗體明顯(P ＜0.01及P ＜0.0001)增強腫瘤抗原特異性T細胞效應功能(亦即，顆粒酶B及IFN-γ分泌)，而單獨PD-1阻斷未顯示任何作用(圖 12 )。 實例13 PD1/LAG3雙特異性抗體及CEACAM5 CD3 TCB之組合療法在活體內之強效抗腫瘤作用 已根據WO 2014/131712 A1或WO 2016/079076 A1中描述之方法製備TCB分子。WO 2014/131712 A1之實例3中描述實驗中使用之抗CEA/抗CD3雙特異性抗體(CEA CD3 TCB或CEA TCB)之製備。CEA CD3 TCB係「2+1型IgG 互換Fab」抗體且由兩條不同重鏈及兩條不同輕鏈組成。在CH3結構域中引入點突變(「孔中節」)以促進兩條不同重鏈之組裝。使CD3結合Fab中的VH結構域與VL結構域交換以便促進兩條不同輕鏈之正確組裝。2+1意謂該分子具有兩個對CEA具有特異性之抗原結合結構域及一個對CD3具有特異性之抗原結合結構域。CEA CD3 TCB包含SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148及SEQ ID NO:149之胺基酸序列。CEACAM5 CD3 TCB具有相同形式，但包含另一CEA結合劑且在CD3結合劑之CH及CL結構域中包含點突變以便支持輕鏈之正確配對。CEACAM5 CD TCB包含SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152及SEQ ID NO:153之胺基酸序列。 a) 實驗材料及方法 在人類胰臟BXPC3癌症模型中測試1.5 mg/kg或3 mg/kg濃度之PD1/LAG3雙特異性抗體0927與人類CEACAM5 CD3 TCB之組合。在NSG人類化小鼠中經皮下共移植BXPC3細胞及小鼠纖維母細胞細胞株(3T3)。。製備 BXPC3 細胞株 ：BXPC3細胞(人類胰臟癌細胞)最初係自ECACC(歐洲細胞培養物保藏中心(European Collection of Cell Culture))獲得且在擴增後保藏於Glycart內部細胞庫中。在含有10% FCS(PAA Laboratories, Austria)、1% Glutamax之RPMI中培養BXPC3細胞。在37℃及5% CO2 下於水飽和氛圍中培養細胞。製造完全人類化之小鼠 ：根據提交之準則(GV-Solas；Felasa；TierschG)，在無特定病原體之條件下以12小時亮/12小時暗之每日循環維持在實驗開始時年齡為4-5週之雌性NSG小鼠(Jackson Laboratory)。實驗研究方案經過當地政府審查及批准(P 2011/128)。動物在到達之後維持一週以使其適應新環境並進行觀察。定期地進行連續健康監測。對NSG小鼠腹膜內注射15 mg/kg白消安(Busulfan)，一天後靜脈內注射1×105 個自臍帶血分離之人類造血幹細胞。在幹細胞注射後14至16週，對小鼠進行舌下抽血，且藉由流動式細胞測量術針對成功人類化對血液進行分析。經有效移植之小鼠根據其人類T細胞頻率隨機分入不同治療組中。功效實驗 ：第0天，在1:1比率之基質膠存在下用1×106 BXPC3細胞(表現CEACAM5之人類胰臟癌細胞株)皮下攻擊完全人類化HSC-NSG小鼠。在整個實驗期間，藉由測徑規每週量測腫瘤2至3次。第15天，針對腫瘤尺寸(平均腫瘤尺寸為250 mm3 )對小鼠隨機分組並起始每週安排之療法(媒劑(組胺酸緩衝液)、抗PD1(0376)、納武單抗、帕博利珠單抗或抗PD1-LAG3 0927)並以400 μl最大量經腹膜內注射給與。使用測徑規每週量測腫瘤生長2-3次，且如下計算腫瘤體積： Tv : (W2 /2) × L            (W：寬度；L：長度) 研究在第47天終止。 b) 結果 圖 14 中以各別小鼠治療組內之平均體積顯示47天時間內之腫瘤體積量測值(mm3 +/-SEM)。用CEACAM5-TCB治療僅顯示與未治療之媒劑組相同的疾病進展。相反，納武單抗及帕博利珠單抗使腫瘤生長減慢，但未實現控制腫瘤生長。意外地是，PD1/LAG3雙特異性抗體0927在3 mg/Kg濃度下完全抑制所有經治療動物之腫瘤生長，顯示LAG-3與PD-1共阻斷之協同效應。 在圖 15A至 15F中，顯示出每隻動物在47天時間內之腫瘤體積量測值(mm3 +/-SEM)，顯示各組中抗腫瘤反應之均一性。 藉由使用鄧尼特氏方法(Dunnett's Method)，針對CEACAM5 CD3 TCB單藥治療計算統計顯著性。為了測試組平均值之顯著差異以進行多重比較，使用鄧尼特氏方法自動產生標準變異數分析。鄧尼特氏方法測試該等平均值是否不同於對照組之平均值。 所得TGI及TCR值顯示於表 28 中(TGI意謂腫瘤生長抑制，TGI＞100意謂腫瘤消退，且TGI=100定義為腫瘤停滯，TCR意味著治療組與對照組比，TCR=1意味著無影響且TCR=0定義為完全消退)。表 28 ： 第 46 天腫瘤生長抑制 ( TGI ) 及治療組與對照組比 ( TCR )
組 ( 第 46 天參考 CEACAM5-TCB) TGI TCR p值
CEACAM5 CD3 TCB 2.5 mg/kg + 抗PD1/LAG3 0927 1.5 mg/kg 93.06119 0.207878 0.0056
CEACAM5 CD3 TCB 2.5 mg/kg + 抗PD1/LAG3 0927 3 mg/kg 79.22326 0.006863 0.005
CEACAM5 CD3 TCB 2.5 mg/kg + 納武單抗1.5 mg/kg 32.9787 0.668563 0.513
CEACAM5 CD3 TCB 2.5 mg/kg + 帕博利珠單抗1.5 mg/kg 55.33328 0.437398 0.07
使用鄧尼特氏方法，以p值進一步顯示與對照組之比較。 在胰臟癌情況下，用CEACAM5 CD3 TCB治療不能控制腫瘤生長。然而，其與雙特異性抗體抗PD1/LAG3 0927之組合以劑量特異性方式對腫瘤控制造成明顯影響。統計分析顯示，當與單藥治療相比較時，與抗PD1/LAG3 0927之組合在兩種濃度下在控制腫瘤生長方面引起統計顯著差異，但與抗PD1抗體納武單抗及帕博利珠單抗之組合則不然，表明雙特異性抗PD1/LAG3抗體相對於僅PD1抑制之優越性，使腫瘤生長停滯。
圖 1 ： 本文所描述之雙特異性抗PD1/抗LAG3抗體之不同形式的示意性說明。圖 1A 顯示雙特異性1+1形式，其中PD1結合結構域包含互換Fab(具有VH/VL結構域交換)且LAG3結合結構域包含帶有支持正確配對之胺基酸突變的CH1及CK結構域(「帶電變異體」)。Fc部分包含孔中節突變(以黑色箭頭示出)且胺基酸突變L234A、L235A及P329G幾乎完全消除人類IgG1 Fc結構域與Fcγ受體之結合(以白色區域示出)。圖 1B 顯示2+1形式，其具有在CH1/CK中包含突變之兩個抗LAG3結合Fab結構域及在一條重鏈之C末端處融合的一個PD1結合Fab結構域。圖 1C 顯示類似2+1形式，其具有在CH1/CK中包含突變之兩個抗LAG3結合FAB結構域，但在一條重鏈之C末端處融合之一個PD1結合單鏈scFab結構域。在圖 1D 中顯示2+1形式，其具有兩個抗LAG3結合Fab結構域及各自與一個重鏈C末端融合的PD1結合VH及VL。圖 1E 顯示與圖1D之構築體類似之構築體，不過該構築體在VH與VL之間具有經工程改造之二硫鍵且在圖1F 中顯示具有弗林蛋白酶(Furin)位點之變異體。圖 1G 顯示雙特異性2+2形式，其具有在CH1/CK中包含突變之兩個抗LAG3結合Fab結構域及在各重鏈之C末端融合的兩個PD1結合互換Fab結構域。在圖 1H 中顯示雙特異性1+1形式(稱為「反式」)，其中PD1結合結構域包含互換Fab (具有VH/VL結構域交換)且LAG3結合結構域以其VH結構域在Fc孔鏈之C末端融合。Lag3結構域包含帶有支持正確配對之胺基酸突變的CH1及CK結構域(「帶電變異體」)。圖 1I 顯示2+1反式形式，其中PD1結合結構域包含互換Fab(具有VH/VL結構域交換)且一個LAG3結合結構域包含帶有支持正確配對之胺基酸突變的CH1及CK結構域(「帶電變異體」)，而另一個LAG3結合結構域以其VH結構域在Fc孔鏈之C末端處融合。圖 2 ： aLAG-3抗體對與同種異體成熟樹突狀細胞共培養之人類CD4 T細胞之細胞毒性顆粒酶B釋放及IL-2分泌的影響。在圖 2A 中顯示如本文中所描述之aLAG3抗體對顆粒酶B分泌之影響(GrzB FACS)且在圖 2B 中顯示aLAG3抗體對IL-2分泌之影響(IL-2 ELISA)。圖 3 ： aLAG3抗體與aPD1抗體(0376)之組合對與B細胞-淋巴母細胞樣細胞株(ARH77)共培養之人類CD4 T細胞之細胞毒性顆粒酶B釋放的影響。顯示出不同aLAG3抗體與aPD1抗體(0376)之組合及與單獨aPD1抗體(0376)之比較。(CD4 T細胞與ARH-77 GrzB)圖 4 ： aLAG3抗體與aPD1抗體(0376)之組合對Treg抑制與經照射之同種異體PBMC共培養的人類CD4 T細胞之顆粒酶B及IFN-γ釋放的影響。圖 4A 顯示與單獨aPD1(0376)相比較之顆粒酶B釋放情況(Tconv + Treg GrzB)且圖 4B 顯示與單獨aPD1(0376)相比較之IFN-γ釋放情況(Tconv + Tregs IFN-γ)。圖 5 ： 由雙特異性抗PD1/抗LAG3抗體結合至重組PD1+ Lag3+ 細胞引起的同時結合及受體二聚化。標繪化學發光(以RU為單位度量)隨抗體濃度變化之圖。圖 5A 及圖 5B 顯示雙特異性抗PD1/抗LAG3抗體與單特異性抗LAG3抗體之比較。僅該等雙特異性形式能夠誘導化學發光。圖 5C 中顯示一個競爭實驗。若在aLAG3抗體(0156，MDX25F7)或抗PD1抗體(0376)存在下提供該雙特異性抗體，則信號幾乎完全受抑制(對於PD1競爭)或至少明顯減弱(Lag3)。圖 5D 中顯示另一競爭實驗。雙特異性抗PD1/抗LAG3抗體與該抗PD1抗體(0376)以及重組LAG3:Fc蛋白質(0160)競爭使信號幾乎完全消除，而存在該aLAG3結合劑(0156)僅引起部分抑制且兩種另外的抗LAG3抗體0414及0416不明顯調節信號。圖 6 ： 呈不同形式(1+1相對於2+1)且具有不同aLAG3結合劑之雙特異性抗PD1/抗LAG3抗體之同時結合的比較。圖 6A 顯示構築體0799(呈1+1形式之抗PD1(0376)/抗LAG3(0416))的結合曲線。圖 6B 中顯示構築體8311(呈1+2形式之抗PD1(0376)/抗LAG3(0416))的結合曲線。圖 6C 顯示構築體0927(呈1+1形式之抗PD1(0376)/抗LAG3(0414))的結合曲線。圖 6D 中顯示構築體8310(呈1+2形式之抗PD1(0376)/抗LAG3(0414))的結合曲線。圖 7 ： 呈不同形式(2+1相對於2+2)且具有不同aLAG3結合劑之雙特異性抗PD1/抗LAG3抗體之同時結合的比較。圖 7A 顯示構築體8310(呈1+2形式之抗PD1(0376)/抗LAG3(0414))之結合曲線。圖 7B 中顯示構築體8970(呈2+2形式之抗PD1(0376)/抗LAG3(0414))之結合曲線。圖 7C 顯示構築體8311(呈1+2形式之抗PD1(0376)/抗LAG3(0416))之結合曲線。圖 7D 中顯示構築體8984(呈2+2形式之抗PD1(0376)/抗LAG3(0416))之結合曲線。圖 7E 中顯示構築體0725(呈反式1+1形式之抗PD1(0376)/抗LAG3(0414))及0750(呈反式1+2形式之抗PD1(0376)/抗LAG3(0414))之結合曲線與構築體0927(呈1+1形式之抗PD1(0376)/抗LAG3(0414))之結合曲線的比較。亦在可商購之PD1/LAG3組合報導體分析中比較該3種構築體且相應結合曲線顯示於圖 7F 中。圖 8 ： 如用流式細胞測量術量測的在自添加至投與活化T細胞3小時之後呈不同形式之雙特異性抗PD1/抗LAG3抗體及親本抗LAG3抗體的內化情況。圖 8A 顯示該實驗之代表性直方圖，圖 8B 中顯示該等不同形式之內化百分比(T細胞中之內化作用)。圖 9 ： 隨時間進行之分析顯示當與顯示較高內化程度之其他形式相比較時，1+1形式之雙特異性抗PD1/抗LAG3抗體(0927)具有較明顯之膜定位。圖 9A 顯示在15分鐘、1小時及3小時之後如利用共聚焦顯微鏡檢查偵測的螢光圖像。活化CD4細胞以黑色球顯示。顯示LAG3抗體之螢光圖像作為明顯內化的一個實例。圖 9B 中顯示該等圖像之定量分析。圖 10 ： 與習知T細胞及與Treg之結合的比較。圖 10A 至 10C 示出由顯示與習知T細胞(黑色曲線)及Treg(灰色區域)之結合的一個代表性供體得到的資料。圖 10A 中顯示抗LAG3抗體0414(hu IgG1 PGLALA)之結合，圖 10B 及10C 分別顯示抗PD1抗體0376及雙特異性抗PD1/抗LAG3抗體(0927)之結合。在圖 10D 中顯示在習知T細胞上相對於在同一樣本內之Treg上結合之給定分子之幾何螢光平均強度的Δ值(抗體與Tconv之結合對比與Treg之結合)。結果(中值)係來自用3個不同供體進行之3個獨立實驗。圖 11 ： PD1及Treg共阻斷使tconv效應功能免受Treg抑制影響。顯示在共培養5天之後由Tconv分泌之顆粒酶B的Treg抑制百分比。結果(中值)係來自用10個不同供體進行之10個獨立實驗。P值係使用雙因素變異數分析(two-way ANOVA)計算。圖 12 ： PD-1及LAG-3阻斷對在用免疫原性黑素瘤抗原肽池回憶之後來自黑素瘤患者PBMC之CD4 T細胞之顆粒酶B及IFN-γ分泌的影響。圖 12 顯示由單獨抗PD1(0376)、抗PD1(0376)與aLAG3(0414)之組合及雙特異性抗體0927(呈1+1形式之抗PD1(0376)/抗LAG3(0414))引起的對顆粒酶B及IFN-γ釋放之影響的比較。顯示相對於肽池刺激的來自12位黑素瘤患者PBMC之CD4 T細胞，顆粒酶B及IFNγ產量之增加倍數。(PD-1及LAG-3共阻斷使黑素瘤患者PBMC中之腫瘤抗原特異性T細胞效應功能增強)圖 13 ： aPD1/aLAG3雙特異性抗體對與B細胞-淋巴母細胞樣細胞株(ARH77)共培養之人類CD4 T細胞之細胞毒性顆粒酶B釋放的影響。將如本文中所描述之不同雙特異性抗PD1/抗LAG3抗體與標準治療或臨床試驗中使用之抗體相比較。(CD4與ARH77之共培養物的GrzB含量；針對未處理細胞歸一化)圖 14 ： 在用胰腺癌BxPC3攻擊之人類化小鼠中進行之功效研究。當與習知PD1抗體相比較時，與CEACAM CD3 TCB組合，僅aPD1/aLAG3雙特異性抗體提供統計顯著之腫瘤防護作用。顯示用BxPC3細胞皮下攻擊並用指定分子與CEACAM5-TCB之組合治療之人類化小鼠的腫瘤生長曲線。圖 15 ： 顯示每一個別動物在47天時間內之腫瘤體積量測值(mm3 +/-SEM)，顯示組抗腫瘤反應之均一性。顯示圖15A 中之媒劑組、圖 15B 中之單獨CEACAM5 CD3 TCB(2.5 mg/kg)、圖 15C 中的CEACAM5 CD3 TCB(2.5 mg/kg)與納武單抗(Nivolumab)(1.5 mg/kg)之組合、圖 15D 中的CEACAM5 CD3 TCB(2.5 mg/kg)與帕博利珠單抗(Pembrolizumab)(1.5 mg/kg)之組合、圖 15E 中CEACAM5 CD3 TCB(2.5 mg/kg)與PD1/LAG3 0927(1.5 mg/kg)之組合及圖 15F 中CEACAM5 CD3 TCB(2.5 mg/kg)與PD1/LAG3 0927(3 mg/kg雙特異性抗體)之組合的腫瘤生長曲線。
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Claims (42)

  1. 一種包含特異性結合至計劃性細胞死亡蛋白質1(PD1)之第一抗原結合結構域及特異性結合至淋巴細胞活化基因-3(LAG3)之第二抗原結合結構域的雙特異性抗體，其中 該特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域包含 VH結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的HVR-H1， (ii) 含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的HVR-H2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的HVR-H3；以及 VL結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的HVR-L1； (ii) 含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的HVR-L2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的HVR-L3， 及其中該特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域包含 VH結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列的HVR-H1， (ii) 含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的HVR-H2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的HVR-H3；以及 VL結構域，其包括 (i) 含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列的HVR-L1， (ii) 含SEQ ID NO: 50之胺基酸序列的HVR-L2，及 (iii) 含SEQ ID NO: 51之胺基酸序列的HVR-L3。
  2. 如請求項1之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包含Fc結構域，該Fc結構域為IgG，特別是IgG1 Fc結構域或IgG4 Fc結構域，且其中該Fc結構域包含一或多個減少與Fc受體之結合的胺基酸取代。
  3. 如請求項2之雙特異性抗體，其中該Fc受體是Fcγ受體。
  4. 如請求項1至3中任一項之雙特異性抗體，其中該特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域包括 (a) 含SEQ ID NO:7之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:8之胺基酸序列的VL結構域，或 (b) 含SEQ ID NO:9之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:10之胺基酸序列的VL結構域，或 (c) 含SEQ ID NO:9之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:11之胺基酸序列的VL結構域，或 (d) 含SEQ ID NO:9之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:12之胺基酸序列的VL結構域，或 (e) 含SEQ ID NO:9之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO:13之胺基酸序列的VL結構域。
  5. 如請求項1至3中任一項之雙特異性抗體，其中該特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域包括含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的VH 結構域及含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的VL結構域。
  6. 如請求項1至3中任一項之雙特異性抗體，其中該特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域包括 包含SEQ ID NO:52之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列的VL結構域。
  7. 如請求項1至3中任一項之雙特異性抗體，其中 該特異性結合至PD1之第一抗原結合結構域包括含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的VH結構域及含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的VL結構域， 且該特異性結合至LAG3之第二抗原結合結構域包括包含SEQ ID NO:52之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列的VL結構域。
  8. 如請求項1至3中任一項之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包含帶有胺基酸突變L234A、L235A及P329G(根據Kabat EU索引編號)的人類IgG1亞類之Fc結構域。
  9. 如請求項1至3中任一項之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包含Fc結構域，該Fc結構域包含促進該Fc結構域之第一及第二次單元締合的修飾。
  10. 如請求項1至3中任一項之雙特異性抗體，其中該Fc結構域之第一次單元包含胺基酸取代S354C及T366W (根據Kabat EU索引編號)且該Fc結構域之第二次單元包含胺基酸取代Y349C、T366S及Y407V (根據Kabat EU索引編號)。
  11. 如請求項1至3中任一項之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包括Fc結構域、包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的第一Fab片段及包含特異性結合至LAG3之抗原結合結構域的第二Fab片段。
  12. 如請求項1至3中任一項之雙特異性抗體，其中在該等Fab片段之一中，該等可變結構域VL與VH相互置換，使得該VH結構域成為該輕鏈之一部分且該VL結構域成為該重鏈之一部分。
  13. 如請求項11之雙特異性抗體，其中在該包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的第一Fab片段中，該等可變結構域VL與VH相互置換。
  14. 如請求項1至3中任一項之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包含Fab片段，其中在恆定結構域CL中，在位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat EU索引編號)，且在恆定結構域CH1中，在位置147及213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
  15. 如請求項11之雙特異性抗體，其中在該包含特異性結合至LAG3之抗原結合結構域的第二Fab片段中，在恆定結構域CL中，在位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat EU索引編號)，且在恆定結構域CH1中，在位置147及213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
  16. 如請求項1至3中任一項之雙特異性抗體，其包括 包含與SEQ ID NO:96之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:98之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一輕鏈， 包含與SEQ ID NO:97之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈，及包含與SEQ ID NO:99之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二輕鏈。
  17. 如請求項1至3中任一項之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包括包含特異性結合至LAG3之抗原結合結構域的第二Fab片段，該第二Fab片段與該Fc結構域之C末端融合。
  18. 如請求項1至3中任一項之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包括包含特異性結合至LAG3之抗原結合結構域之第三Fab片段。
  19. 如請求項1至3中任一項之雙特異性抗體，其中該包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的Fab片段係經由肽連接子與該等重鏈之一之C末端融合。
  20. 如請求項1至3中任一項之雙特異性抗體，其包括 包含與SEQ ID NO:120之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:115之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一輕鏈， 包含與SEQ ID NO:121之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈，及包含與SEQ ID NO:99之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條第二輕鏈。
  21. 如請求項1至3中任一項之雙特異性抗體，其中該等包含特異性結合至LAG3之抗原結合結構域的Fab片段之一係經由肽連接子與該等重鏈之一之C末端融合。
  22. 如請求項1至3中任一項之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包括包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的第四Fab片段。
  23. 如請求項1至3中任一項之雙特異性抗體，其中各自包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的該兩個Fab片段係相同的。
  24. 如請求項1至3中任一項之雙特異性抗體，其中各自包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的該兩個Fab片段各自分別經由肽連接子與該等重鏈之一之C末端融合。
  25. 如請求項1至3中任一項之雙特異性抗體，其包括 各自包含與SEQ ID NO:116之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條重鏈、各自包含與SEQ ID NO:115之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條第一輕鏈及各自包含與SEQ ID NO:99之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條第二輕鏈。
  26. 如請求項1至3中任一項之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包括Fc結構域、各自包含特異性結合至LAG3之抗原結合結構域的兩個Fab片段及包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的單鏈Fab (scFab)。
  27. 如請求項26之雙特異性抗體，其中該包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的scFab係經由肽連接子與該等重鏈之一之C末端融合。
  28. 如請求項1至3中任一項之雙特異性抗體，其包括 包含與SEQ ID NO:124之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第一重鏈、包含與SEQ ID NO:121之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的第二重鏈及各自包含與SEQ ID NO:99之序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的兩條輕鏈。
  29. 如請求項1至3中任一項之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包括Fc結構域、各自包含特異性結合至LAG3之抗原結合結構域的兩個Fab片段以及包含特異性結合至PD1之抗原結合結構域的VH及VL結構域。
  30. 如請求項1至3中任一項之雙特異性抗體，其中該特異性結合至PD1之抗原結合結構域的VH結構域係經由肽連接子與該等重鏈之一之C末端融合且該特異性結合至PD1之抗原結合結構域的VL結構域係經由肽連接子與另一個重鏈之C末端融合。
  31. 一種編碼如請求項1至30中任一項之雙特異性抗體的聚核苷酸。
  32. 一種包含如請求項31之聚核苷酸的原核或真核宿主細胞。
  33. 一種製造如請求項1至30之雙特異性抗體的方法，其包含在適於表現該雙特異性抗體之條件下培養如請求項32之宿主細胞及自培養物回收該雙特異性抗體。
  34. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至30中任一項之雙特異性抗體及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。
  35. 一種如請求項1至30中任一項之雙特異性抗體或如請求項34之醫藥組合物在製造藥物中的用途。
  36. 一種如請求項1至30中任一項之雙特異性抗體或如請求項34之醫藥組合物在製造用於以下之藥物中的用途 i)調節免疫反應， ii)刺激T細胞反應， iii)治療感染， iv)治療癌症， v)延遲癌症進展， vi)延長罹患癌症之患者的存活期。
  37. 如請求項36之用途，其中該調節免疫反應為恢復T細胞活性。
  38. 一種如請求項1至30中任一項之雙特異性抗體或如請求項34之醫藥組合物在製造用於治療癌症之藥物中的用途。
  39. 一種如請求項1至30中任一項之雙特異性抗體或如請求項34之醫藥組合物在製造用於治療慢性病毒感染之藥物中的用途。
  40. 一種如請求項1至30中任一項之雙特異性抗體或如請求項34之醫藥組合物在製造用於預防或治療癌症之藥物中的用途，其中該藥物係與化學治療劑、放射及/或用於癌症免疫療法中之其他藥劑組合投與。
  41. 一種如請求項1至30中任一項之雙特異性抗體或如請求項34之醫藥組合物在製造用於預防或治療癌症之藥物中的用途，其中該藥物係與抗CEA/抗CD3雙特異性抗體組合投與。
  42. 一種如請求項1至30中任一項之雙特異性抗體或如請求項34之醫藥組合物在製造用於治療癌症或感染性疾病之藥物中的用途。
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