CN116375876A - 特异性结合pd1和lag3的双特异性抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特异性结合PD1和LAG3的双特异性抗体。本发明涉及双特异性抗体，所述双特异性抗体包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域。本发明进一步涉及生产这些分子的方法和使用它们的方法。

Description

特异性结合PD1和LAG3的双特异性抗体
本申请是申请日为2018年04月03日、中国申请号为201880021208.8、发明名称为“特异性结合PD1和LAG3的双特异性抗体”的发明申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，特别地涉及进一步包含Fc结构域的双特异性抗体，该Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，该一个或多个氨基酸取代减少与Fc受体的结合，尤其是与Fcγ受体的结合。本发明进一步涉及产生这些分子的方法和使用它们的方法。
背景技术
免疫系统在预防癌症方面的重要性是基于其检测和破坏异常细胞的能力。然而，一些肿瘤细胞能够通过引起免疫抑制状态来逃避免疫系统(Zitvogel等人，NatureReviews Immunology 6(2006),715–727)。T细胞在抗病毒和抗肿瘤免疫应答中具有重要作用。抗原特异性T细胞的适当活化导致其克隆扩增并获得效应子功能，并且在细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的情况下，这使CTL能够特异性地裂解靶细胞。T细胞一直是治疗上操纵内源性抗肿瘤免疫力的主要焦点，这是由于T细胞的选择性识别所有细胞区室中的蛋白质衍生肽的能力；直接识别和杀伤抗原表达细胞的能力(通过CD8+效应T细胞；也被称为细胞毒性T淋巴细胞(CTL))和协调各种免疫应答的能力(通过CD4+辅助T细胞)，这整合了适应性和先天性效应机制。T细胞功能障碍由于持续的抗原暴露而发生：T细胞丧失了在抗原存在下进行增殖的能力，并且逐渐不能产生细胞因子及裂解靶细胞。功能障碍的T细胞被称为耗竭的T细胞，其不能增殖并发挥效应子功能(诸如细胞毒性和响应于抗原刺激而进行细胞因子分泌)。进一步研究发现，耗竭的T细胞的特征为抑制性分子PD-1(程序性细胞死亡蛋白1)的持续表达，而阻断PD-1和PD-L1(PD-1配体)相互作用可以逆转T细胞耗竭并在感染LCMV的小鼠中恢复抗原特异性T细胞应答(Barber等人，Nature 439(2006),682-687)。然而，仅靶向PD-1–PD-L1途径并不总是导致T细胞耗竭的逆转(Gehring等人，Gastroenterology 137(2009),682–690)，这表明其他分子可能参与T细胞耗竭(Sakuishi，J.ExperimentalMed.207(2010),2187-2194)。
淋巴细胞活化基因-3(LAG3或CD223)最初在设计用于选择性分离在IL-2依赖性NK细胞系中表达的分子的实验中发现(Triebel F等人，Cancer Lett.235(2006),147–153)。LAG3是一种独特的跨膜蛋白，其与具有四个细胞外免疫球蛋白超家族样结构域(D1-D4)的CD4具有结构同源性。膜远端IgG结构域含有短氨基酸序列，即在其他IgG超家族蛋白中未发现的所谓额外环。细胞内结构域含有独特的氨基酸序列(KIEELE,SEQ ID NO:75)，该氨基酸序列是LAG3对T细胞功能产生负面影响所必需的。LAG3可以由金属蛋白酶在连接肽(CP)处裂解，以产生在血清中可检测到的可溶形式。与CD4一样，LAG3蛋白与MHCⅡ类分子结合，但是具有更高的亲和力并且在与CD4不同的位点处(Huard等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(1997),5744-5749)。LAG3由T细胞、B细胞、NK细胞和浆细胞样树突细胞(pDC)表达，并且在T细胞活化后上调。它调节T细胞功能以及T细胞稳态。免疫无能的或功能受损的常规T细胞的亚群表达LAG3。LAG3+T细胞在肿瘤部位和慢性病毒感染期间富集(Sierro等人，ExpertOpin.Ther.Targets 15(2011),91-101)。已有研究表明，LAG3在CD8 T细胞耗竭中起作用(Blackburn等人，Nature Immunol.10(2009),29-37)。因此，需要能够拮抗LAG3的活性并可用于产生及恢复对肿瘤的免疫应答的抗体。
已经例如在WO 2004/078928中描述了针对LAG3的单克隆抗体，其中要求保护包含特异性结合CD223的抗体和抗癌疫苗的组合物。WO2010/019570公开了结合LAG3的人抗体，例如抗体25F7和26H10。US2011/070238涉及可用于治疗或预防器官移植排斥和自体免疫疾病的细胞毒性抗LAG3抗体。WO 2014/008218描述了与抗体25F7相比具有优化的功能特性(即减少的脱酰胺位点)的LAG3抗体。此外，LAG3抗体还公开于WO 2015/138920(例如BAP050)、WO 2014/140180、WO 2015/116539、WO 2016/028672，WO 2016/126858，WO 2016/200782和WO 2017/015560中。
程序性细胞死亡蛋白1(PD-1或CD279)是CD28受体家族的抑制成员，其还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1是细胞表面受体并且在活化的B细胞、T细胞和骨髓细胞上表达(Okazaki等人(2002)Curr.Opin.Immunol.14:391779-82；Bennett等人(2003)JImmunol 170:711-8)。PD-1的结构是单体1型跨膜蛋白，其由一个免疫球蛋白可变样细胞外结构域和细胞质结构域组成，该细胞质结构域含有免疫受体酪氨酸基抑制基序(ITIM)和免疫受体酪氨酸基转换基序(ITSM)。活化的T细胞瞬时表达PD1，但PD1及其配体PDL1的持续过表达促进免疫耗竭，从而导致病毒感染持续，肿瘤逃逸，感染和死亡率增加。通过借助T细胞受体进行抗原识别来诱导PD1表达，并且其表达主要经由连续的T细胞受体信号传导维持。在持续抗原暴露后，PD1基因座无法再被甲基化，这促进了持续的过表达。阻断PD1途径可以恢复癌症和慢性病毒感染中耗竭的T细胞功能(Sheridan,Nature Biotechnology 30(2012),729-730)。例如，在WO2003/042402、WO 2004/004771、WO 2004/056875、WO 2004/072286、WO2004/087196、WO 2006/121168、WO 2006/133396、WO 2007/005874、WO2008/083174、WO 2008/156712、WO 2009/024531、WO 2009/014708、WO2009/101611、WO 2009/114335、WO 2009/154335、WO 2010/027828、WO2010/027423、WO 2010/029434、WO 2010/029435、WO 2010/036959、WO2010/063011、WO 2010/089411、WO 2011/066342、WO 2011/110604、WO2011/110621、WO 2012/145493、WO 2013/014668、WO 2014/179664和WO 2015/112900中描述了针对PD-1的单克隆抗体。
WO 2015/200119中描述了具有与PD1和LAG3的免疫反应性的双特异性Fc双抗体，其用于治疗癌症或与病原体(诸如细菌、真菌或病毒)相关的疾病。然而，需要提供新的双特异性抗体，其不仅同时结合PD1和LAG3，并由此选择性地靶向表达PD1和LAG3两者的细胞，而且鉴于LAG3的广泛表达谱避免了对其他细胞上的LAG3的阻断。本发明的双特异性抗体不仅有效阻断过表达PD1和LAG3两者的T细胞上的PD1和LAG3，而且它们对这些细胞具有非常大的选择性，因此可以避免通过施用高活性LAG3抗体产生的副作用。
发明内容
本发明涉及双特异性抗体，其包含特异性结合程序性细胞死亡蛋白1(PD1)的至少一个抗原结合结构域和特异性结合淋巴细胞活化基因-3(LAG3)的至少一个第二抗原结合结构域。这些双特异性抗体是有利的，因为它们提供比抗PD1和抗LAG3组合策略更好的选择性和潜在的功效。它们进一步表征为显示出降低的下沉效应(如由减少的T细胞内化所示)，它们相对于Treg优先与常规T细胞结合并且能够从Treg抑制中挽救T细胞效应子功能物，它们显示出增强的肿瘤特异性T细胞效应子功能和增强的体内肿瘤根除。
在一个方面，本发明提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合程序性细胞死亡蛋白1(PD1)的第一抗原结合结构域和特异性结合淋巴细胞活化基因-3(LAG3)的第二抗原结合结构域，其中
特异性结合PD1的所述第一抗原结合结构域包含
VH结构域，其包含
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；以及
VL结构域，其包含
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
具体地，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合程序性细胞死亡蛋白1(PD1)的第一抗原结合结构域和特异性结合淋巴细胞活化基因-3(LAG3)的第二抗原结合结构域，其中所述双特异性抗体包含Fc结构域，所述Fc结构域是IgG，特别地是IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域，并且其中所述Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代减少与Fc受体的结合，尤其是与Fcγ受体的结合。
在一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中所述特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域包含
(a)VH结构域，其包含
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列；以及
VL结构域，其包含
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列；或者
(b)VH结构域，其包含
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；以及
VL结构域，其包含
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列；或者
(c)VH结构域，其包含
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列；以及
VL结构域，其包含
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列；或者
(d)VH结构域，其包含
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列；以及
VL结构域，其包含
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列；或者
(e)VH结构域，其包含
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列；以及
VL结构域，其包含
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列。
在另一方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中所述特异性结合PD1的第一抗原结合结构域包含
(a)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或者
(b)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，或者
(c)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，或者
(d)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，或者
(e)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在一个具体方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中所述特异性结合PD1的第一抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
在另一方面，提供了一种双特异性抗体，其包含如前文所述的特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中所述特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域包含
(a)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，或者
(b)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列，或者
(c)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列，或者
(d)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列，或者
(e)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列。
在另一方面，提供了一种双特异性抗体，其包含如前文所述的特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中所述特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域包含
(a)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列，或者
(b)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列，或者
(c)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列，或者
(d)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列。
此外，提供了一种双特异性抗体，其包含如前文所述的特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中
所述特异性结合PD1的第一抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，
并且所述特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列且所述VL结构域包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，或者所述VH结构域包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列且所述VL结构域包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列。
在另一方面，提供了一种双特异性抗体，其包含如前文所述的特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中
所述特异性结合PD1的第一抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，
并且所述特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。
在另一方面，提供了一种双特异性抗体，其包含如前文所述的特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中
所述特异性结合PD1的第一抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，
并且所述特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列。
在另一方面，提供了一种双特异性抗体，其包含如前文所述的特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中所述双特异性抗体是人源化抗体或嵌合抗体。具体地，所述双特异性抗体是人源化抗体。
在一个具体方面，提供了一种双特异性抗体，其包含如前文所述的特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中所述双特异性抗体包含人IgG1亚类的Fc结构域，该Fc结构域具有氨基酸突变L234A、L235A和P329G(根据KabatEU索引编号)。
此外，提供了一种双特异性抗体，其包含如前文所述的特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中所述双特异性抗体包含Fc结构域，该Fc结构域包含促进其第一亚基和第二亚基缔合的修饰。在一个方面，提供了一种双特异性抗体，其中所述Fc结构域的第一亚基包含突起，而所述Fc结构域的第二亚基包含根据突起入孔方法(knobs into holes method)的孔。具体地，所述Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W(EU编号)，而所述Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
在另一方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中所述双特异性抗体包含Fc结构域、第一Fab片段和第二Fab片段，所述第一Fab片段包含特异性结合PD1的抗原结合结构域，所述第二Fab片段包含特异性结合LAG3的抗原结合结构域。
在一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中在所述Fab片段中的一个中，可变结构域VL和VH彼此替换，使得所述VH结构域是轻链的一部分而所述VL结构域是重链的一部分。具体地，提供了一种双特异性抗体，其中在包含特异性结合PD1的抗原结合结构域的第一Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换。
在另一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中所述双特异性抗体包含Fab片段，其中在恒定结构域CL中，124位处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据KabatEU索引编号)独立地取代，而在恒定结构域CH1中，147位和213位处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)独立地取代。具体地，提供了双特异性抗体，其中在包含特异性结合LAG3的所述抗原结合结构域的所述第二Fab片段中，在恒定结构域CL中，124位处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat EU索引编号)独立地取代，而在恒定结构域CH1中，147位和213位处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)独立地取代。
在一个特定方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，所述双特异性抗体包含(a)第一重链、第一轻链、第二重链和第二轻链，所述第一重链包含与SEQ ID NO:96所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第一轻链包含与SEQ ID NO:98所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二重链包含与SEQ ID NO:97所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二轻链包含与SEQID NO:99所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，或者(b)第一重链、第一轻链、第二重链和第二轻链，所述第一重链包含与SEQ ID NO:96所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第一轻链包含与SEQ ID NO:98所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，
所述第二重链包含与SEQ ID NO:100所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二轻链包含与SEQ ID NO:101所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，或者(c)第一重链、第一轻链、第二重链和第二轻链，所述第一重链包含与SEQ IDNO:102所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第一轻链包含与SEQ IDNO:104所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二重链包含与SEQ IDNO:103所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二轻链包含与SEQIDNO:105所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，或者(d)第一重链、第一轻链、第二重链和第二轻链，所述第一重链包含与SEQ ID NO:106所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第一轻链包含与SEQ ID NO:107所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二重链包含与SEQ ID NO:103所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二轻链包含与SEQID NO:105所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列。
更具体地，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，所述双特异性抗体包含第一重链、第一轻链、第二重链和第二轻链，所述第一重链包含与SEQ ID NO:96所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第一轻链包含与SEQ ID NO:98所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二重链包含与SEQ ID NO:100所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二轻链包含与SEQ ID NO:101所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列。
在另一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含如前文所述的特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中所述双特异性抗体包含Fab片段，所述Fab片段包含特异性结合LAG3的抗原结合结构域，所述Fab片段与Fc结构域的C末端融合。
具体地，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，所述双特异性抗体包含第一重链、第一轻链、第二重链和第二轻链，所述第一重链包含与SEQ ID NO:96所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第一轻链包含与SEQ ID NO:98所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二重链包含与SEQ ID NO:144所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二轻链包含与SEQ ID NO:101所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列。
在另一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含如前文所述的特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中所述双特异性抗体包含第三Fab片段，所述第三Fab片段包含特异性结合LAG3的抗原结合结构域。在一个方面，提供了一种双特异性抗体，其中均包含特异性结合LAG3的抗原结合结构域的两个Fab片段是相同的。
在另一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含如前文所述的特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中包含特异性结合PD1的抗原结合结构域的所述Fab片段经由肽接头与所述重链中的一条的C末端融合。
在一个特定方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，所述双特异性抗体包含(a)第一重链、第一轻链、第二重链和两条第二轻链，
所述第一重链包含与SEQ ID NO:118所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第一轻链包含与SEQ ID NO:115所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，
所述第二重链包含与SEQ ID NO:119所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述两条第二轻链包含与SEQ ID NO:101
所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，或者(b)第一重链、第一轻链、第二重链和两条第二轻链，
所述第一重链包含与SEQ ID NO:120所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第一轻链包含与SEQ ID NO:115所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，
所述第二重链包含与SEQ ID NO:121所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述两条第二轻链含有与SEQ ID NO:99所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，或者(c)第一重链、第一轻链、第二重链和两条第二轻链，
所述第一重链包含与SEQ ID NO:122所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第一轻链包含与SEQ ID NO:115所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，
所述第二重链包含与SEQ ID NO:103所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述两条第二轻链包含与SEQ ID NO:105
所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列。
在另一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含如前文所述的特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中包含特异性结合LAG3的抗原结合结构域的所述Fab片段中的一个经由肽接头与所述重链中的一条的C末端融合。
在一个特定方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，所述双特异性抗体包含第一重链、第一轻链、第二重链和两条第二轻链，所述第一重链包含与SEQ ID NO:96所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第一轻链包含与SEQ ID NO:98所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二重链包含与SEQ ID NO:145所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述两条第二轻链包含与SEQ ID NO:101所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列。
在另一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含如前文所述的特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中所述双特异性抗体包含第四Fab片段，所述第四Fab片段包含特异性结合PD1的抗原结合结构域。在一个方面，提供了一种双特异性抗体，其中均包含特异性结合PD1的抗原结合结构域的两个Fab片段是相同的。
在另一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含如前文所述的特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中均包含特异性结合PD1的抗原结合结构域的两个Fab片段各自分别经由肽接头与所述重链中的一条的C末端融合。
在一个特定方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，所述双特异性抗体包含
(a)两条重链、两条第一轻链和两条第二轻链，所述两条重链均包含与SEQ ID NO:114所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述两条第一轻链均包含与SEQID NO:115所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述两条第二轻链均包含与SEQ ID NO:101所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，或者
(b)两条重链、两条第一轻链和两条第二轻链，所述两条重链均包含与SEQ ID NO:116所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述两条第一轻链均包含与SEQID NO:115所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述两条第二轻链均包含与SEQ ID NO:99所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，或者
(c)两条重链、两条第一轻链和两条第二轻链，所述两条重链均包含与SEQ ID NO:117所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述两条第一轻链均包含与SEQID NO:115所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述两条第二轻链包含与SEQ ID NO:105所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列。
在另一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中所述双特异性抗体包含Fc结构域、两个Fab片段和单链Fab(scFab)，所述两个Fab片段均包含特异性结合LAG3的抗原结合结构域，所述单链Fab(scFab)包含特异性结合PD1的抗原结合结构域。具体地，包含特异性结合PD1的抗原结合结构域的所述scFab经由肽接头与所述重链中的一条的C末端融合。
在一个特定方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，所述双特异性抗体包含
(a)第一重链、第二重链和两条轻链，所述第一重链包含与SEQ ID NO:
123所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二重链包含与SEQID NO:119所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述两条轻链均包含与SEQID NO:101所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，或者
(b)第一重链、第二重链和两条轻链，所述第一重链包含与SEQ IDNO:124所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二重链包含与SEQ ID NO:121所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述两条轻链均包含与SEQ ID NO:99所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，或者
(c)第一重链、第二重链和第二轻链，所述第一重链包含与SEQ ID NO:
125所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二重链包含与SEQID NO:103所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二轻链包含与SEQID NO:105所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列。
在另一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中所述双特异性抗体包含Fc结构域、两个Fab片段和VH和VL结构域，所述两个Fab片段均包含特异性结合LAG3的抗原结合结构域，所述VH和VL结构域包含特异性结合PD1的抗原结合结构域。在一个方面，特异性结合PD1的所述抗原结合结构域的VH结构域经由肽接头与所述重链中的一条的C末端融合，而特异性结合PD1的所述抗原结合结构域的VL结构域经由肽接头与所述重链中的另一条的C末端融合。在一个特定方面，提供了一种双特异性抗体，其包含第一重链、第二重链和两条轻链，所述第一重链包含与SEQ ID NO:126所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二重链包含与SEQ ID NO:127所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述两条轻链均包含与SEQ ID NO:109所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列。
根据本发明的另一方面，提供了一种编码如前文所述的双特异性抗体的多核苷酸。本发明还提供一种载体，特别是表达载体，所述载体包含本发明的多核苷酸；并且提供一种原核或真核宿主细胞，所述原核或真核宿主细胞包含本发明的多核苷酸或载体。在一些实施例中，宿主细胞是真核细胞，特别是哺乳动物细胞。
在另一个方面，提供了一种产生包含如本文所述的特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域的双特异性抗体的方法，所述方法包括以下步骤：a)用包含编码所述双特异性抗体的多核苷酸的载体转化宿主细胞，b)在适于表达所述双特异性抗体的条件下培养所述宿主细胞，以及c)从培养物中回收所述双特异性抗体。本发明还涵盖通过本发明的方法产生的双特异性抗体。
本发明还提供一种药物组合物，其包含双特异性抗体和至少一种药学上可接受的赋形剂，所述双特异性抗体包含如本文所述的特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域。
本发明还涵盖双特异性抗体，其包含如本文所述的特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域；或者涵盖用作药物的包含所述双特异性抗体的药物组合物。
在另一个方面，本发明提供一种双特异性抗体，其包含如本文所述的包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域的双特异性抗体；或提供包含所述双特异性抗体的药物组合物，其用于
i)调节免疫应答，诸如恢复T细胞活性，
ii)刺激免疫应答或功能，
iii)治疗感染，
iv)治疗癌症，
v)延缓癌症发展，
vi)延长癌症患者的存活期。
在一个方面，提供了双特异性抗体，其包含如本文所述的特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域；或提供了包含所述双特异性抗体的药物组合物，其用于治疗有需要的个体的疾病。在一个特定方面，本发明提供一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域；或提供用于治疗癌症的包含所述双特异性抗体的药物组合物。在另一个特定方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域；或提供了用于调节免疫应答的包含所述双特异性抗体的药物组合物。在另一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域；或提供了用于治疗慢性病毒感染的包含所述双特异性抗体的药物组合物。
本发明还提供一种双特异性抗体，其包含如本文所述的特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域；或提供用于预防或治疗癌症的包含所述双特异性抗体的药物组合物，其中所述双特异性抗体与化学治疗剂、放射和/或用于癌症免疫疗法的其他药剂联合施用。在一个特定方面，提供了一种双特异性抗体，其包含如本文所述的特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域；或提供了用于预防或治疗癌症的包含所述双特异性抗体的药物组合物，其中所述双特异性抗体与抗CEA/抗CD3双特异性抗体联合施用。
还提供了包含如本文所述的特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域的双特异性抗体的用途，用于制备用于治疗有需要的个体的疾病的药物，特别是用于制备用于治疗癌症的药物；以及提供了一种治疗个体的疾病的方法，其包括向所述个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含药学上可接受形式的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含如本文所述的特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域。在一个特定方面，所述疾病是癌症。在另一个特定方面，所述疾病是慢性病毒感染。在另一个方面，提供了一种调节个体中免疫应答的方法，其包括向所述个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含药学上可接受形式的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域。在上述方面中的任何方面，所述个体优选是哺乳动物，特别是人。
本发明还提供一种双特异性抗体，其包含如本文所述的特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域；或提供用于预防或治疗癌症的包含所述双特异性抗体的药物组合物，其中所述双特异性抗体与化学治疗剂、放射和/或用于癌症免疫疗法的其他药剂联合施用。
此外，提供了一种抑制个体中肿瘤细胞生长的方法，其包括向所述个体施用有效量的双特异性抗体以抑制肿瘤细胞的生长，所述双特异性抗体包含如本文所述的特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域。所述个体优选是哺乳动物，特别是人。
附图简要说明
图1A-1I：本文描述的不同形式的双特异性抗PD1/抗LAG3抗体的示意图。图1A示出了双特异性1+1形式，其中所述PD1结合结构域包含crossFab(具有VH/VL结构域交换)，而LAG3结合结构域包含具有氨基酸突变的CH1结构域和CK结构域以支持正确配对(“带电变体”)。Fc部分包含突起入孔突变(由黑色箭头示出)以及氨基酸突变L234A、L235A和P329G，所述氨基酸突变L234A、L235A和P329G几乎完全消除人IgG1 Fc结构域的Fcγ受体结合(如由白色区域所示)。图1B示出了2+1形式，其中两个抗LAG3结合Fab结构域包含CH1/CK中的突变，并且PD1结合Fab结构域在一条重链的C端处融合。图1C示出了类似的2+1形式，其中两个抗LAG3结合Fab结构域包含CH1/CK中的突变，而PD1结合单链scFab结构域在一条重链的C末端处融合。在图1D中示出了2+1形式，其中两个抗LAG3结合Fab结构域和PD1结合VH和VL各自融合到所述重链的C末端中的一个。图1E示出了类似于上述图1D的构建体，然而在VH与VL之间具有经工程化的二硫键，并且在图1F中示出了具有弗林蛋白酶位点的变体。图1G示出了双特异性2+2形式，其中两个抗LAG3结合Fab结构域包含CH1/CK中的突变，并且两个PD1结合crossFab结构域在每条重链的C末端处融合。在图1H中示出了双特异性1+1形式(称为“反式”)，其中PD1结合结构域包含crossFab(具有VH/VL结构域交换)，而LAG3结合结构域与其VH结构域在Fc孔链的C末端处融合。Lag3结构域包含具有氨基酸突变的CH1和CK结构域以支持正确的配对(“带电变体”)。图1I示出了2+1反式形式，其中所述PD1结合结构域包含crossFab(具有VH/VL结构域交换)，而一个LAG3结合结构域包含具有氨基酸突变的CH1和CK结构域以支持正确配对(“带电变体”)并且第二LAG3结合结构域与其VH结构域在Fc孔链的C末端处融合。
图2A-2B：aLAG-3抗体对与同种异体成熟树突细胞共培养的人CD4T细胞的细胞毒性颗粒酶B释放和IL-2分泌的影响。在图2A中示出了如本文所述的aLAG3抗体对颗粒酶B分泌的影响，而在图2B中示出了aLAG3抗体对IL-2分泌的影响。
图3：aLAG3抗体与aPD1抗体(0376)的组合对与B细胞-类成淋巴细胞系(ARH77)共培养的人CD4 T细胞的细胞毒性颗粒酶B释放的影响。示出了不同aLAG3抗体与aPD1抗体(0376)的组合和单独的aPD1抗体(0376)的比较。
图4A-4B：aLAG3抗体与aPD1抗体(0376)的组合对与经辐照的同种异体PBMC共培养的人CD4 T细胞的颗粒酶B和IFN-释放进行Treg抑制的影响。图4A示出了与单独的aPD1(0376)相比的颗粒酶B释放，而图4B示出了与单独的aPD1(0376)相比的IFN-释放。
图5A-5D：由双特异性抗PD1/抗LAG3抗体与重组PD1+Lag3+细胞的结合引起的同时结合和受体二聚化。绘制的是化学发光(以RU为单位测量)相对于抗体浓度的曲线图。图5A和图5B示出了双特异性抗PD1/抗LAG3抗体与单特异性抗LAG3抗体的比较。只有双特异性形式才能诱导化学发光。竞争实验在图5C中示出。如果在aLAG3抗体(0156，MDX25F7)或抗PD1抗体(0376)存在下提供相同的双特异性抗体，则信号几乎被抑制(由于PD1竞争)或至少被显著降低(Lag3)。进一步的竞争实验在图5D中示出。双特异性抗PD1/抗LAG3抗体与相同的抗PD1抗体(0376)以及重组LAG3:Fc蛋白(0160)的竞争几乎消除了信号，而相同的aLAG3结合剂(0156)的存在仅导致部分抑制，并且两种另外的抗LAG3抗体0414和0416未显著调控信号。
图6A-6D：双特异性抗PD1/抗LAG3抗体的不同形式(1+1对比2+1)及与不同aLAG3结合物的同时结合的比较。图6A示出了构建体0799(1+1形式的抗PD1(0376)/抗LAG3(0416))的结合曲线。构建体8311(1+2形式的抗PD1(0376)/抗LAG3(0416))的结合曲线示出于图6B中。图6C示出了构建体0927(1+1形式的抗PD1(0376)/抗LAG3(0414))的结合曲线。构建体8310(1+2形式的抗PD1(0376)/抗LAG3(0414))的结合曲线示出于图6D中。
图7A-7F：双特异性抗PD1/抗LAG3抗体的不同形式(2+1对比2+2)及与不同aLAG3结合物的同时结合的比较。图7A示出了构建体8310(1+2形式的抗PD1(0376)/抗LAG3(0414))的结合曲线。构建体8970(2+2形式的抗PD1(0376)/抗LAG3(0414))的结合曲线示出于图7B中。图7C示出了构建体8311(1+2形式的抗PD1(0376)/抗LAG3(0416))的结合曲线。构建体8984(2+2形式的抗PD1(0376)/抗LAG3(0416))的结合曲线示出于图7D中。构建体0725(反式1+1形式的抗PD1(0376)/抗LAG3(0414))和构建体0750(反式1+2形式的抗PD1(0376)/抗LAG3(0414))的结合曲线与构建体0927(1+1形式的抗PD1(0376)/抗LAG3(0414))的结合曲线的比较示出于图7E中。还在市售PD1/LAG3combo Reporter测定中比较了这3种构建体，并且相应的结合曲线示出于图7F中。
图8A-8B：如使用流式细胞术所测得的，在添加以施用至活化的T细胞3小时后，不同形式的双特异性抗PD1/抗LAG3抗体和亲本抗LAG3抗体的内化。图8A示出了实验的代表性直方图，不同形式的内化百分比示出于图8B中。
图9A-9B：随着时间推移的分析显示，当与显示出更高程度的内化的其他形式相比时，1+1形式的双特异性抗PD1/抗LAG3抗体(0927)的膜定位更高。图9A示出了15分钟、1小时和3小时后，通过共焦显微镜检测到的荧光图像。活化的CD4细胞示出为黑球。TIM3抗体的荧光图像被示出为强内化的示例。图像的定量分析示出于图9B中。
图10A-10D：与传统T细胞的结合相对于与Treg的结合。图10A至图10C示出了来自一个代表供体的数据，显示了与传统T细胞(黑色曲线)和Treg(灰色区域)的结合。抗LAG3抗体0414(hu IgG1 PGLALA)的结合示出于图10A、图10B和图10C中，分别显示了抗PD1抗体0376和双特异性抗PD1/抗LAG3抗体(0927)的结合。在图10D中示出了给定分子结合在传统T细胞上相对于在同一样品内结合在Treg上的几何荧光平均强度的δ。结果(中位值)来自具有3个不同供体的3个独立实验。
图11：PD1和Treg共阻断从Treg抑制中挽救了Tconv效应子功能。示出了共培养5天后，Treg对Tconv分泌的颗粒酶B的抑制的百分比。结果(中位值)来自具有10个不同供体的10个独立实验。使用双因素方差分析来计算P。
图12：在用免疫原性黑素瘤-抗原肽池唤起记忆后，PD-1和LAG-3阻断对来自黑素瘤患者PBMC的CD4 T细胞的颗粒酶B和IFN-分泌的影响。图12示出了对由单独的抗PD1(0376)、抗PD1(0376)与aLAG3(0414)的组合和双特异性抗体0927(1+1形式的抗PD1(0376)/抗LAG3(0414))造成的对颗粒酶B和IFN-释放的影响的比较。示出了相对于来自12种黑素瘤患者PBMC肽池刺激的CD4 T细胞，颗粒酶B和IFN产生的成倍增加。
图13：aPD1/aLAG3双特异性抗体对与B细胞-类成淋巴细胞系(ARH77)共培养的人CD4 T细胞的细胞毒性颗粒酶B释放的影响。将如本文所述的不同双特异性抗PD1/抗LAG3抗体与在标准护理或临床试验中使用的抗体进行比较。
图14：对用胰腺癌BxPC3攻击的人源化小鼠的功效研究。与CEACAM CD3 TCB组合时，仅aPD1/aLAG3双特异性抗体提供与传统PD1抗体相比统计学上显著的肿瘤保护。示出了用BxPC3细胞皮下攻击并用指定分子与CEACAM5-TCB的组合治疗的人源化小鼠中的肿瘤生长曲线。
图15A-15F：示出了每个个体动物在47天的时段内的肿瘤体积测量值(mm3+/-SEM)，显示了组抗肿瘤反应的均一性。在图15A中示出了载体组的肿瘤生长曲线，在图15B中示出了单独的CEACAM5 CD3 TCB(2.5mg/kg)的肿瘤生长曲线，在图15C中示出了CEACAM5CD3 TCB与纳武单抗(Nivolumab)的组合(1.5mg/kg)的肿瘤生长曲线，在图15D示出了CEACAM5 CD3 TCB与派姆单抗(Pembrolizumab)的组合(1.5mg/kg)的肿瘤生长曲线，在图15E中示出了CEACAM5 CD3 TCB与PD1/LAG3 0927的组合(1.5mg/kg)的肿瘤生长曲线，并且在图15F中示出了(3mg/kg双特异性抗体)的肿瘤生长曲线。
具体实施方式
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数，反之亦然。
如本文所用，术语“抗原结合分子”在其最广泛意义上是指特异性结合抗原决定簇的分子。抗原结合分子的示例是抗体、抗体片段和支架抗原结合蛋白。
本文的术语“抗体”在最广泛意义上使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，以及抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异抗体(例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量存在)之外，包含所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。
如本文所用的术语“单特异性”抗体表示这样的抗体，其具有一个或多个结合位点，每一结合位点结合至相同抗原的相同表位。术语“双特异性”意指抗体能够特异性结合至少两种不同的抗原决定簇，例如各自由一对抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)形成的两个结合位点与不同抗原或同一抗原上的不同表位结合。此类双特异性抗体为1+1形式。其他双特异性抗体形式是2+1形式(包含第一抗原或表位的两个结合位点和第二抗原或表位的一个结合位点)或2+2形式(包含第一抗原或表位的两个结合位点和第二抗原或表位的两个结合位点)。通常，双特异性抗体包含两个抗原结合位点，每个抗原结合位点特异于不同的抗原决定簇。
如在当前应用中所用的术语“价”表示抗原结合分子存在指定数目的结合结构域。因此，术语“二价”“四价”和“六价”分别表示抗原结合分子中存在两个结合结构域、四个结合结构域和六个结合结构域。根据本发明的双特异性抗体是至少“二价的”，并且可以是“三价的”或“多价的”(例如“四价的”或“六价的”)。在一个特定方面，本发明的抗体具有两个或更多个结合位点并且是双特异性的。也就是说，即使在存在多于两个结合位点(即抗体是三价的或多价的)的情况下，抗体也可以是双特异性的。
术语“全长抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用地指代具有与天然抗体结构基本上相似的结构的抗体。“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG类抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由二硫键键合的两条轻链和两条重链组成。从N末端到C末端，每条重链具有可变区(VH)(也称为可变重链结构域或重链可变结构域)，之后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)(也称为重链恒定区)。类似地，从N末端到C末端，每条轻链具有可变区(VL)(也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域)，之后是轻链恒定结构域(CL)(也称为轻链恒定区)。抗体的重链可以分配为五种类型中的一种，所述五种类型被称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，它们中的一些可以进一步分为亚型，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以归属于两种类型中的一种，所述两种类型称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。
“抗体片段”是指完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分，所述部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的示例包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；双体抗体、三体抗体、四体抗体、交叉Fab片段；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；由抗体片段和单结构域抗体形成的多特异性抗体。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人，NatMed 9,129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Plückthun在The harmacology ofMonoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315(1994)中所述；还可参见WO 93/16185；以及美国专利No.5,571,894和No.5,587,458。对于包含挽救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab片段和F(ab’)2片段的讨论，参见美国专利No.5,869,046。双体抗体是具有两个抗原结合结构域的抗体片段，所述双体抗体可以是二价的或双特异性的，参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)；以及Hollinger等人，Proc Natl Acad SciUSA 90,6444-6448(1993)。在Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)中也描述了三体抗体和四体抗体。单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施例中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.，Waltham，MA；参见例如美国专利No.6,248,516B1)。另外，抗体片段包含单链多肽，所述单链多肽具有VH结构域的特征，即能够与VL结构域一起装配到功能性抗原结合位点；或具有VL结构域的特征，即能够与VH结构域一起装配到功能性抗原结合位点，从而提供全长抗体的抗原结合特性。抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文所述。
木瓜蛋白酶消化完整抗体产生两个称为“Fab”片段的相同的抗原结合片段，每个“Fab”片段含有重链可变结构域和轻链可变结构域以及轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。因此，如本文所用，术语“Fab片段”是指这样的抗体片段，其包含含有VL结构域和轻链恒定结构域(CL)的轻链片段，以及重链的VH结构域和第一恒定结构域(CH1)。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于Fab’片段在重链CH1结构域的羧基末端添加了一些残基，这些残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是Fab’片段，其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离巯基。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，该片段具有两个抗原结合位点(两个Fab片段)和Fc区的一部分。
术语“交叉Fab片段”或“xFab片段”或“交换型Fab片段”是指这样的Fab片段，其中重链和轻链的可变区或恒定区被交换。交换型Fab分子的两种不同链组成是可能的，并且包含在本发明的双特异性抗体中：在一个方面，Fab重链和轻链的可变区被交换，即交换型Fab分子包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)组成的肽链，以及由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的肽链。该交换型Fab分子也称为CrossFab(VLVH)。在另一个方面，当Fab重链和轻链的恒定区被交换时，交换型Fab分子包含由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的肽链，以及由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)组成的肽链。该交换型Fab分子也称为CrossFab(CLCH1)。
“单链Fab片段”或“scFab”是由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽，其中所述抗体结构域和所述接头在N末端至C末端方向上具有以下顺序中的一种：a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1，或d)VL-CH1-接头-VH-CL；并且其中所述接头是至少30个氨基酸，优选在32个与50个氨基酸之间的多肽。所述单链Fab片段经由CL结构域与CH1结构域之间的天然二硫键而稳定化。此外，这些单链Fab分子可以通过经由插入半胱氨酸残基(例如根据Kabat编号的可变重链中的44位和可变轻链中的100位)产生链间二硫键，而进一步稳定化。
“交换型单链Fab片段”或“x-scFab”是由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽，其中所述抗体结构域和所述接头在N末端至C末端方向上具有以下顺序中的一种：a)VH-CL-接头-VL-CH1和b)VL-CH1-接头-VH-CL；其中VH和VL一起形成与抗原特异性结合的抗原结合结构域，并且其中所述接头是至少30个氨基酸的多肽。此外，这些x-scFab分子可以通过经由插入半胱氨酸残基(例如根据Kabat编号的可变重链中的44位和可变轻链中的100位)产生链间二硫键，而进一步稳定化。
“单链可变片段(scFv)”是抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的融合蛋白，与10个至约25个氨基酸的短接头肽连接。接头通常富含甘氨酸以获得柔性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以获得溶解度，并且可以将VH的N末端与VL的C末端连接，或反之亦然。尽管去除了恒定区并引入了接头，但该蛋白保留了原始抗体的特异性。scFv抗体例如描述于Houston,J.S.,Methods in Enzymol.203(1991)46-96)中。另外，抗体片段包含单链多肽，所述单链多肽具有VH结构域的特征，即能够与VL结构域一起装配到功能性抗原结合位点；或具有VL结构域的特征，即能够与VH结构域一起装配到功能性抗原结合位点，从而提供全长抗体的抗原结合特性。
“支架抗原结合蛋白”是本领域已知的，例如纤连蛋白和设计的锚蛋白重复序列蛋白(DARPin)已被用作抗原结合结构域的替代支架，参见例如Gebauer和Skerra，Engineeredprotein scaffolds as next-generation antibody therapeutics.Curr Opin ChemBiol 13:245-255(2009)和Stumpp等人，Darpins:A new generation of proteintherapeutics.Drug Discovery Today13:695-701(2008)。在本发明的一个方面中，支架抗原结合蛋白选自由以下项组成的组：CTLA-4(Evibody)、脂质运载蛋白(Anticalin)、蛋白A衍生的分子(诸如蛋白A的Z结构域(亲和体))、A结构域(Avimer/巨型抗体)、血清转铁蛋白(反式体)；设计的锚蛋白重复序列蛋白(DARPin)、抗体轻链或重链的可变结构域(单结构域抗体，sdAb)、抗体重链的可变结构域(纳米抗体，aVH)、VNAR片段、纤连蛋白(AdNectin)、C型凝集素结构域(四连接素)；新抗原受体β-内酰胺酶的可变结构域(VNAR片段)、人γ-晶体蛋白或泛素蛋白(Affilin分子)；人蛋白酶抑制剂的kunitz型结构域、微型体(诸如来自knottin家族的蛋白质)、肽适体和纤连蛋白(adnectin)。CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4)是主要在CD4+T细胞上表达的CD28家族受体。其细胞外结构域具有可变结构域样Ig折叠。对应于抗体CDR的环可以用异源序列取代，以赋予不同的结合性质。经工程化以具有不同结合特异性的CTLA-4分子也称为Evibody(例如US7166697B1)。Evibody与抗体(例如结构域抗体)的分离的可变区大小大致相同。关于进一步的细节，参见Journal ofImmunological Methods 248(1-2),31-45(2001)。脂质运载蛋白是细胞外蛋白质家族，其运输小的疏水性分子，诸如类固醇、胆素、类维生素A和脂质。它们具有刚性β-片层二级结构，在锥形结构的开口端处具有许多环，可以设计成与不同的靶抗原结合。Anticalin的大小介于160-180个氨基酸之间，并且来源于脂质运载蛋白。关于进一步的细节，参见BiochimBiophys Acta 1482:337-350(2000)、US7250297B1和US20070224633。亲和体是来源于金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A的支架，其可以被工程化以结合抗原。该结构域由约58个氨基酸的三螺旋束组成。已经通过表面残基的随机化产生了文库。关于进一步细节，参见Protein Eng.Des.Sel.2004,17,455-462和EP 1641818A1。Avimer是来源于A结构域支架家族的多结构域蛋白。约35个氨基酸的天然结构域采用确定的二硫键键合结构。多样性是通过改变A结构域家族表现出的自然变异而产生的。关于进一步的细节，参见Nature Biotechnology 23(12),1556-1561(2005)和Expert Opinion onInvestigational Drugs 16(6),909-917(2007年6月)。转铁蛋白是单体血清转运糖蛋白。可以通过在允许的表面环中插入肽序列来工程化转铁蛋白，以结合不同的靶抗原。工程化的转铁蛋白支架的示例包括反式体。关于进一步的细节，参见J.Biol.Chem 274,24066-24073(1999)。设计的锚蛋白重复序列蛋白(DARPin)来源于锚蛋白，锚蛋白是介导整合膜蛋白与细胞支架的附接的蛋白质家族。单个锚蛋白重复序列是由两个α-螺旋和一个β-转角组成的33残基基序。它们可以通过随机化每个重复序列中的第一α-螺旋和β-转角中的残基，而设计成结合不同的靶抗原。它们的结合界面可以通过增加模块的数量来增加(亲和力成熟方法)。关于进一步的细节，参见J.Mol.Biol.332,489-503(2003)、PNAS 100(4),1700-1705(2003)和J.Mol.Biol.369,1015-1028(2007)以及US20040132028A1。
单结构域抗体是由单一单体可变抗体结构域组成的抗体片段。第一单结构域来源于骆驼科动物的抗体重链的可变结构域(纳米抗体或VHH片段)。此外，术语单结构域抗体包含自体人重链可变结构域(aVH)或来源于鲨鱼的VNAR片段。纤连蛋白可以经工程化以结合抗原的支架。Adnectin由Ⅲ型人纤连蛋白(FN3)的15个重复单元的第10结构域的天然氨基酸序列的主链组成。β-夹层的一个端部处的三个环可以经工程化，以使Adnectin能够特异性识别感兴趣的治疗靶标。关于进一步细节，参见Protein Eng.Des.Sel.18,435-444(2005)、US20080139791、WO2005056764和US6818418B1。肽适体是组合的识别分子，该组合的识别分子由恒定的支架蛋白，通常是硫氧还蛋白(TrxA)组成，所述恒定的支架蛋白含有在活性位点处插入的受约束的可变肽环。关于进一步细节，参见Expert Opin.Biol.Ther.5,783-797(2005)。微体来源于含有3-4个半胱氨酸桥、长度为25-50个氨基酸的天然存在的微蛋白，所述微蛋白的示例包括KalataBI和芋螺毒素以及knottin。微蛋白具有环，该环可以经工程化为包括多达25个氨基酸而不影响微蛋白的整体折叠。关于工程化的knottin结构域的进一步细节，参见WO2008098796。
作为参考分子的“结合相同表位的抗原结合分子”是指这样的抗原结合分子，在竞争测定中所述抗原结合分子使参考分子与其抗原的结合被阻断50％或更多，并且相反地，在竞争测定中参考分子使抗原结合分子与其抗原的结合被阻断50％或更多。
如本文所用，术语“抗原结合结构域”或“抗原结合位点”是指抗原结合分子中特异性结合抗原决定簇的部分。更具体地，术语“抗原结合结构域”是指抗体的一部分，所述部分包含与抗原的一部分或全部特异性结合并互补的区域。在抗原很大的情况下，抗原结合分子可以仅结合抗原的特定部分，该部分称为表位。抗原结合结构域可以由例如一个或多个可变结构域(也称为可变区)提供。优选地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。在一个方面，抗原结合结构域能够结合其抗原并阻断或部分阻断所述抗原的功能。特异性结合PD1或LAG3的抗原结合结构域包括如本文进一步定义的抗体及其片段。另外，抗原结合结构域可包括支架抗原结合蛋白，例如基于设计的重复序列蛋白或设计的重复序列结构域的结合结构域(参见例如WO 2002/020565)。
如本文所用，术语“抗原决定簇”与“抗原”和“表位”同义，并且是指多肽大分子上的位点(例如一段连续的氨基酸或由非连续氨基酸的不同区域组成的构象构型)，抗原结合部分与所述位点结合，从而形成抗原结合部分-抗原复合物。有用的抗原决定簇可以在例如肿瘤细胞的表面上、病毒感染细胞的表面上、其他患病细胞的表面上、免疫细胞的表面上、血清中的游离物和/或细胞外基质(ECM)中找到。除非另有说明，否则本文中用作抗原的蛋白质可以是来自任何脊椎动物来源的任何天然形式的蛋白质，所述脊椎动物来源包括诸如灵长类动物(例如人类)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)等哺乳动物。在一个具体实施例中，抗原是人蛋白质。当提及本文中的特定蛋白质时，该术语涵盖“全长”、未加工的蛋白质，以及由细胞内加工而产生的任何形式的蛋白质。该术语还涵盖天然存在的蛋白质变体，例如剪接变体或等位基因变体。
“特异性结合”是指结合对于抗原具有选择性，并且可以与不需要的或非特异性的相互作用区分开。抗原结合分子与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术(例如表面等离子体共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等人，Glyco J 17,323-329(2000))以及传统的结合测定(Heeley,Endocr Res28,217-229(2002))来测量。在一个实施例中，例如如通过SPR所测得的，抗原结合分子与不相关蛋白的结合程度小于所述抗原结合分子与抗原的结合程度的约10％。在某些实施例中，与抗原结合的分子的解离常数(Kd)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-7M或更低，例如10-7M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
“亲和力”或“结合亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映了结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)表示，解离常数(Kd)是解离速率常数与缔合速率常数(分别为koff和kon)的比率。因此，等效亲和力可以包括不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同即可。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些方法。测量亲和力的特定方法是表面等离子体共振(SPR)。
如本文所用，术语抗体的“高亲和力”是指抗体对靶抗原的Kd为10-9M或更低，甚至更特别地为10-10M或更低。术语抗体的“低亲和力”是指抗体的Kd为10-8M或更高。
“亲和力成熟的”的抗体是指在一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，与不具有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致了抗体对抗原的亲和力的改善。
术语“包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域的双特异性抗体”“特异性结合PD1和LAG3的双特异性抗体”“特异于PD1和LAG3的双特异性抗原结合分子”或“抗PD1/抗LAG3抗体”在本文中可互换使用，并且是指能够以足够的亲和力结合PD1和LAG3，使得该抗体可用作靶向PD1和LAG3的诊断和/或治疗剂的双特异性抗体。
术语“PD1”，也称为程序性细胞死亡蛋白1，是一种由288个氨基酸组成的I型膜蛋白，最初在1992年描述(Ishida等人，EMBO J.,11(1992),3887–3895)。PD-1是T细胞调节因子的扩展CD28/CTLA-4家族的成员，并具有两个配体PD-L1(B7-H1、CD274)和PD-L2(B7-DC、CD273)。蛋白质结构包括细胞外IgV结构域，之后是跨膜区和细胞内尾部。细胞内尾部含有位于免疫受体酪氨酸基抑制基序和免疫受体酪氨酸基转换基序中的两个磷酸化位点，这表明PD-1负调节TCR信号。这与配体结合后SHP-1磷酸酶和SHP-2磷酸酶与PD-1的细胞质尾部的结合一致。虽然PD-1不在原初T细胞上表达，但其在T细胞受体(TCR)介导的激活后上调，并且在激活的和耗竭的T细胞上都被观察到(Agata等人，Int.Immunology 8(1996),765-772)。这些耗竭的T细胞具有功能障碍的表型并且不能适当地作出反应。尽管PD-1具有相对较宽的表达模式，但其最重要的作用可能是作为T细胞上的共抑制受体(Chinai等人，Trends in Pharmacological Sciences 36(2015),587-595)。因此，目前的治疗方法聚焦于阻断PD-1与其配体的相互作用以增强T细胞应答。术语“程序性死亡1”“程序性细胞死亡1”“蛋白质PD-1”“PD-1”“PD1”“PDCD1”“hPD-1”和“hPD-I”可互换使用，并且包括人PD-1的变体、同种型、物种同源物，以及与PD-1具有至少一个共同表位的类似物。人PD1的氨基酸序列示出于UniProt(www.uniprot.org)登录号Q15116(SEQ ID NO:128)中。
术语“抗PD1抗体”和“包含结合PD1的抗原结合结构域的抗体”是指这样的抗体，其能够结合PD1，尤其是在细胞表面上表达的PD1多肽，并具有足够的亲和力以使得所述抗体可用作靶向PD1的诊断和/或治疗剂。在一个方面，例如如通过放射免疫测定(RIA)或流式细胞术(FACS)或使用生物传感器系统(诸如
Figure BDA0004029792780000311
系统)通过表面等离子体共振测定所测得的，抗PD1抗体与不相关的非PD1蛋白的结合程度小于所述抗体与PD1的结合程度的约10％。在某些方面，结合人PD1的抗原结合蛋白具有KD值为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如
10-9M至10-13M)的与人PD1结合的结合亲和力。在一个优选实施例中，在表面等离子体共振测定中，使用人PD1(PD1-ECD)的细胞外结构域(ECD)测定结合亲和力的相应KD值，以获得PD1结合亲和力。术语“抗PD1抗体”还涵盖能够结合PD1和第二抗原的双特异性抗体。
除非另有说明，否则如本文所用的术语“LAG3”或“Lag-3”或“淋巴细胞激活基因-3”或“CD223”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然LAG3，所述脊椎动物来源包括诸如灵长类动物(例如人类)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)等哺乳动物。该术语涵盖“全长”、未加工的LAG3，以及由细胞内加工而产生的任何形式的LAG3。该术语还涵盖LAG3的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。在一个优选实施例中，术语“LAG3”是指人LAG3。示例性经加工(无信号序列)的LAG3的氨基酸序列如SEQ ID NO:73所示。示例性细胞外结构域(ECD)LAG3的氨基酸序列如SEQ ID NO:74所示。
术语“抗LAG3抗体”和“结合LAG3的抗体”是指这样的抗体，其能够以足够的亲和力结合LAG3，使得所述抗体可用作靶向LAG3的诊断和/或治疗剂。在一个方面，例如如通过放射免疫测定(RIA)所测得的，抗LAG3抗体与不相关的非LAG3蛋白的结合程度小于所述抗体与LAG3结合程度的约10％。在某些实施例中，结合LAG3的抗体的解离常数(Kd)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10- 13M，例如10-9M至10-13M)。在某些方面，抗LAG3抗体结合LAG3的表位，所述表位在来自不同物种的LAG3中是保守的。在一个优选实施例中，“抗LAG3抗体”“特异性结合人LAG3的抗体”和“结合人LAG3的抗体”是指特异性结合人LAG3抗原或其细胞外结构域(ECD)的抗体，其具有KD值为1.0×10-8mol/l或更低，在一个实施例中KD值为1.0×10-9mol/l或更低，在一个实施例中KD值为1.0×10-9mol/l至1.0×10-13mol/l的结合亲和力。在该情境中，例如使用LAG3细胞外结构域，使用标准结合测定(诸如表面等离子体共振技术(
Figure BDA0004029792780000321
GE-HealthcareUppsala，瑞典))来确定结合亲和力。术语“抗LAG3抗体”还涵盖能够结合LAG3和第二抗原的双特异性抗体。
“阻断性”抗体或“拮抗剂”抗体是抑制或降低其所结合的抗原的生物学活性的抗体。在一些实施例中，阻断性抗体或拮抗剂抗体基本上或完全抑制抗原的生物活性。例如，本发明的双特异性抗体阻断通过PD-1和LAG3的信号传导，以便将由T细胞进行的功能性应答(例如增殖、细胞因子产生、靶细胞杀伤)从功能障碍状态恢复到抗原刺激。
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗原结合分子与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如，Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。
如本文所用的术语“高变区”或“HVR”是指在序列上高变和/或形成结构上限定的环(“高变环”)的抗体可变结构域区域中的每一者。通常，天然四链抗体包含六个HVR：三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR通常包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基具有最高的序列可变性和/或参与抗原识别。示例性高变环发生在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处。(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)。)示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)发生在L1的氨基酸残基24-34、L2的氨基酸残基50-56、L3的氨基酸残基89-97、H1的氨基酸残基31-35B、H2的氨基酸残基50-65，以及H3的氨基酸残基95-102处。(Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991)。)高变区(HVR)也称为互补决定区(CDR)，并且这些术语在本文中可互换地用于指形成抗原结合区的可变区部分。该特定区域已由Kabat等人，U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest"(1983)以及Chothia等人，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)描述，其中所述定义包括当彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，使用这两者中的任一定义来指代抗体的CDR或其变体应在如本文所定义和使用的术语的范围内。作为比较，在下表A中列出了包含如上文引用的参考文献中的每一者所定义的CDR的相应氨基酸残基。包含特定CDR的确切残基数将根据CDR的序列和大小而变化。在给定抗体的可变区氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可以常规地确定哪些残基包含特定CDR。
表A.CDR定义1
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Figure BDA0004029792780000341
1表A中所有CDR定义的编号是根据Kabat等人提出的编号惯例(参见下文)。
2如表A中所用的具有小写字母“b”的“AbM”是指由Oxford Molecular的“AbM”抗体建模软件定义的CDR。
Kabat等人还定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员可以明确地将该“Kabat编号”系统分配给任何可变区序列，而不依赖于序列本身之外的任何实验数据。如本文所用，“Kabat编号”是指由Kabat等人，U.S.Dept.of Health andHuman Services,"Sequence of Proteins of Immunological Interest"(1983)所述的编号系统。除非另有说明，否则提及抗体可变区中特定氨基酸残基位置的编号是根据Kabat编号系统。
除VH中的CDR1外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，其是与抗原接触的残基。SDR包含在被称为缩短CDR或a-CDR的CDR区域内。示例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2和a-CDR-H3)发生在L1的氨基酸残基31-34、L2的氨基酸残基50-55、L3的氨基酸残基89-96、H1的氨基酸残基31-35B、H2的氨基酸残基50-58，以及H3的氨基酸残基95-102处。(参见Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)。)除非另有说明，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如FR残基)在本文中根据Kabat等人编号。
“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常在VH(或VL)中以如下序列出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
出于本文目的的“受体人框架”是这样的框架，其包含来源于如下所定义的人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列。“来源于”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含与所述人免疫球蛋白框架或人共有框架相同的氨基酸序列，或者其可以包含氨基酸序列变化。在一些实施例中，氨基酸变化的数量为10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少，或2个或更少。在一些实施例中，VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，在所述抗体中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同的来源或物种。
抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的若干可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
“人源化”抗体是指这样的嵌合抗体，其包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些实施例中，人源化抗体将基本上包含所有至少一个，通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的HVR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。“人源化形式”的抗体，例如非人抗体，是指已经经历人源化的抗体。本发明涵盖的其他形式的“人源化抗体”是这样的抗体，相对于原始抗体，所述抗体中的恒定区已经经过了另外修饰或改变，以产生根据本发明的性质，特别是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的性质。
“人”抗体是这样的抗体，其具有的氨基酸序列与由人或人细胞产生的或来源于利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列相对应。人抗体的该定义特别地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异抗体(例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量存在)之外，包含所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法，以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，在本文中描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
本文中的术语“Fc结构域”或“Fc区”用于定义含有恒定区的至少一部分的抗体重链C末端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。具体地，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。重链的氨基酸序列总是呈现为具有C末端赖氨酸，然而在本发明中包括没有C末端赖氨酸的变体。
IgG Fc区包含IgG CH2结构域和IgG CH3结构域。人IgG Fc区的“CH2结构域”通常从大致231位的氨基酸残基延伸至大致340位的氨基酸残基。在一个实施例中，碳水化合物链附接至CH2结构域。本文的CH2结构域可以是天然序列CH2结构域或变体CH2结构域。“CH3结构域”包含Fc区中CH2结构域C末端的一段残基(即，从IgG的约341位的氨基酸残基到约447位的氨基酸残基)。本文的CH3区可以是天然序列CH3结构域或变体CH3结构域(例如在一条链中具有引入的“凸起”(“突起”)而在另一条链中具有相应的引入的“空腔”(“孔”)的CH3结构域；参见以引用方式明确并入本文的美国专利No.5,821,333)。此类变体CH3结构域可用于促进如本文所述的两条不相同的抗体重链的异源二聚化。除非本文另外规定，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，EU编号系统也称为EU索引，如在Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
“突起入孔(knob-into-hole)”技术描述于例如US 5,731,168；US7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng 9,617-621(1996)和Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入凸起(“突起”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“孔”)，使得所述凸起可以定位在所述空腔中，以便促进异源二聚体的形成并阻碍同源二聚体的形成。凸起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与凸起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。凸起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸来制备，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成。在一个具体实施例中，突起修饰包含Fc结构域的两个亚基中的一个中的氨基酸取代T366W，而孔修饰包含Fc结构域的两个亚基中的另一个中的氨基酸取代T366S、L368A和Y407V。在另一个具体实施例中，包含突起修饰的Fc结构域的亚基另外包含氨基酸取代S354C，而包含孔修饰的Fc结构域的亚基另外包含氨基酸取代Y349C。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc区的两个亚基之间形成二硫桥，从而进一步稳定化二聚体(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
“与免疫球蛋白的Fc区等同的区域”旨在包括免疫球蛋白的Fc区的天然存在的等位基因变体，以及具有产生取代、添加或缺失但基本上不降低免疫球蛋白介导效应子功能(诸如抗体依赖性细胞毒性)的能力的修改的变体。例如，可以使一个或多个氨基酸从免疫球蛋白的Fc区的N末端或C末端缺失，而基本上不丧失生物学功能。可以根据本领域中已知的一般规则来选择此类变体，以便对活性具有最小的影响(参见例如Bowie,J.U.等人，Science 247:1306-10(1990))。
术语“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区、随着抗体同种型的变化而变化的那些生物活性。抗体效应子功能的示例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)，以及B细胞激活。
“激活Fc受体”是这样的Fc受体，其在抗体的Fc区接合后，引起刺激携带受体的细胞执行效应子功能的信号传导事件。激活Fc受体包括FcγRⅢa(CD16a)、FcγRⅠ(CD64)、FcγRⅡa(CD32)和FcαRⅠ(CD89)。特定的激活Fc受体是人FcγRⅢa(参见UniProt登录号P08637，版本141)。
术语“肽接头”是指包含一个或多个氨基酸，通常约2至20个氨基酸的肽。肽接头是本领域中已知的或在本文中描述的。合适的非免疫原性连接肽是例如(G4S)n、(SG4)n或G4(SG4)n肽接头，其中“n”通常为介于1与10之间、通常介于2与4之间的数字，特别地是2，即选自由以下项组成的组的肽：GGGGS(SEQ ID NO:129)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:130)、SGGGGSGGGG(SEQ ID NO:131)和GGGGSGGGGSGGGG(SEQ IDNO:132)，但也包括以下序列：GSPGSSSSGS(SEQ ID NO:133)、(G4S)3(SEQ ID NO:134)、(G4S)4(SEQ ID NO:135)、GSGSGSGS(SEQ ID NO:136)、GSGSGNGS(SEQ ID NO:137)、GGSGSGSG(SEQ ID NO:138)、GGSGSG(SEQ IDNO:139)、GGSG(SEQ ID NO:140)、GGSGNGSG(SEQ ID NO:141)、GGNGSGSG(SEQ ID NO:142)和GGNGSG(SEQ ID NO:143)。特别感兴趣的肽接头是(G4S)(SEQ ID NO:129)、(G4S)2或GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:130)、(G4S)3(SEQ ID NO:134)和(G4S)4(SEQ ID NO:135)，并且更具体地是(G4S)2或GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:130)。
“融合至”或“连接至”是指部件(例如抗原结合结构域和FC结构域)直接地或经由一个或多个肽接头而通过肽键连接。
如本申请中所用的术语“氨基酸”表示包括以下项的天然存在的羧基α-氨基酸的组：丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、蛋氨酸(met，M)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro，P)、丝氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr，T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)，以及缬氨酸(val，V)。
相对于参考多肽(蛋白质)序列的“氨基酸序列一致性百分比(％)”被定义为在比对候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基并引入缺口(如果需要的话)以实现最大的序列一致性百分比后，并且在不将任何保守取代考虑为所述序列一致性的一部分的情况下，与所述参考多肽序列中的氨基酸残基相同的所述候选序列中的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列一致性百分比的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN.SAWI或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成氨基酸序列一致性％的值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写，并且源代码已经与用户文档一起提交到U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559，在那里以美国版权登记号TXU510087注册。ALIGN-2程序可从Genentech,Inc.,SouthSan Francisco,California公开获得，或者可以从所述源代码编译。ALIGN-2程序应经编译以在UNIX操作系统上使用，所述UNIX操作系统包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设置并且不变。在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B的氨基酸序列一致性％(其可以替代地表达为给定氨基酸序列A具有或包含与给定氨基酸序列B的某一氨基酸序列一致性％)计算如下：
100乘以分数X/Y
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序对A和B的比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，而其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A与B的氨基酸序列一致性％将不等于B与A的氨基酸序列一致性％。除非另外特别指明，否则本文所使用的所有氨基酸序列一致性％的值是如前一段中所述使用ALIGN-2计算机程序获得的。
在某些方面中，设想了本文提供的本发明的双特异性抗体的氨基酸序列变体。例如，可能需要改善双特异性抗体的结合亲和力和/或其他生物学性质。双特异性抗体的氨基酸序列变体可以通过向编码分子的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内残基的缺失、和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以实现最终构建体，前提条件是最终构建体具有所需特征，例如抗原结合。用于取代诱变的感兴趣的位点包括HVR和框架(FR)。保守取代在表B中表头“优选的取代”下提供，并在下文中参考氨基酸侧链类别(1)至(6)进一步描述。可以将氨基酸取代引入感兴趣的分子中，并对产物进行所需活性(例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC)筛选。
表B
Figure BDA0004029792780000411
可根据共同的侧链特性将氨基酸分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代将需要用这些类别中的一个的成员交换另一类别。
术语“氨基酸序列变体”包括实质性变体，其中在亲本抗原结合分子(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基中存在氨基酸取代。通常，相对于亲本抗原结合分子，选为用于进一步研究的一个或多个所得变体将在某些生物学特性方面(例如，亲和力增加、免疫原性降低)有改变(例如，改善)和/或将基本上保留亲本抗原结合分子的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和力成熟抗体，其可例如使用诸如本文所述的那些基于噬菌体展示的亲和力成熟技术方便地生成。简而言之，将一个或多个HVR残基突变并且将变体抗原结合分子展示在噬菌体上并针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。在某些实施例中，取代、插入或缺失可发生在一个或多个HVR内，只要此类改变基本上不降低抗原结合分子的抗原结合能力即可。例如，可在HVR中进行基本上不降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文提供的保守性取代)。可用于鉴别可被靶向诱变的抗体残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在此方法中，鉴别残基或一组靶残基(例如，带电残基，诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并用中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替换以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可在对初始取代展示功能敏感性的氨基酸位置引入其他取代。另选地或另外地，利用抗原-抗原结合分子复合物的晶体结构鉴别抗体与抗原之间的接触点。可靶向或消除作为取代的候选的此类接触残基和相邻残基。可筛选变体以确定它们是否具备期望的特性。
氨基酸序列插入包括长度范围为一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及一个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的示例包括具有N末端甲硫氨酰残基的双特异性抗体。分子的其他插入变体包括与增加双特异性抗体的血清半衰期的多肽的N末端或C末端的融合。
在某些方面，改变本文提供的双特异性抗体以增加或降低抗体糖基化的程度。可通过改变氨基酸序列，使得产生或除去一个或多个糖基化位点，例如可改变附接于Fc结构域的碳水化合物，来便利地获得分子的糖基化变体。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含具有支链的双触角寡糖，所述双触角寡糖通常通过N-连接附接于Fc区的CH2结构域的Asn297。参见，例如，Wright等人TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附接于双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施例中，可对本发明的双特异性抗体中的寡糖进行修饰，以产生具有某些改善的特性的变体。在一个方面，提供了双特异性抗体的变体，其具有缺乏附接(直接或间接)于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能，参见例如美国专利公开文本No.US 2003/0157108(Presta,L.)或US 2004/0093621(协和发酵工业株式会社(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd))。本发明的双特异性抗体的其他变体包括具有两分型寡糖的变体，例如其中附接于Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能，参见例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利No.6,602,684(Umana等人)；以及US 2005/0123546(Umana等人)。还提供了在附接于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的变体。此类抗体变体可具有改善的CDC功能并描述于例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；以及WO 1999/22764(Raju,S.)中。
在某些方面，可期望产生本发明的双特异性抗体的半胱氨酸工程化改造的变体，例如“thioMAb”，其中分子的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定实施例中，取代的残基存在于分子的可接近位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可用于将抗体与其他部分，诸如药物部分或接头-药物部分缀合，以产生免疫缀合物。在某些实施例中，可用半胱氨酸取代下列残基中的任何一个或多个：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；以及重链Fc区的S400(EU编号)。可如例如美国专利No.7,521,541中所述生成半胱氨酸工程化改造的抗原结合分子。
在某些方面，可进一步修饰本文提供的双特异性抗体以使其含有本领域已知且易于获得的另外的非蛋白质部分。适合于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性示例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇以及它们的混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在制造中可具有优势。聚合物可具有任何分子量，并且可以具有支链或不具有支链。附接于抗体的聚合物的数目可变化，并且如果附接了多于一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。通常，可基于以下考虑因素确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体待改善的特定特性或功能、双特异性抗体衍生物是否将用于限定条件下的疗法等。
在另一个方面，提供了抗体和可通过暴露于辐射而选择性地加热的非蛋白质性部分的缀合物。在一个实施例中，非蛋白质性部分是碳纳米管(Kam,N.W.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005)11600-11605)。辐射可具有任何波长，并且包括但不限于对普通细胞没有伤害，但是将非蛋白质性部分加热至抗体-非蛋白质性部分附近的细胞被杀死的温度的波长。
“免疫缀合物”是与一种或多种异源分子，包括但不限于细胞毒性剂缀合的抗体。
术语“多核苷酸”是指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)、病毒来源的RNA或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包含常规磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键，诸如在肽核酸(PNA)中存在的)。术语“核酸分子”是指存在于多核苷酸中的任何一个或多个核酸区段，例如DNA或RNA片段。
关于“分离的”核酸分子或多核苷酸，是指已经从其天然环境中移除的核酸分子，DNA或RNA。例如，编码包含在载体中的多肽的重组多核苷酸出于本发明的目的被视为分离的。分离的多核苷酸的另外的示例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或处于溶液中的纯化的(部分地或基本上纯化的)多核苷酸。分离的多核苷酸包括包含在通常包含多核苷酸分子的细胞中，但多核苷酸分子存在于染色体外或存在于与其天然染色体位置不同的染色体位置上的多核苷酸分子。分离的RNA分子包括本发明的体内或体外RNA转录物，以及正链和负链形式和双链形式。根据本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括通过合成产生的此类分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可包括调控元件，诸如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
关于与本发明的参考核苷酸序列具有至少例如95％“一致”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸，是指除了多核苷酸序列可包括参考核苷酸序列的每100个核苷酸至多五个点突变之外，多核苷酸的核苷酸序列与参考序列是一致的。换句话讲，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％一致的核苷酸序列的多核苷酸，参考序列中至多5％的核苷酸可缺失或被另外的核苷酸取代，或参考序列中总核苷酸的至多5％的数量的核苷酸可插入到参考序列中。参考序列的这些改变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置或那些末端位置之间的任意位置，或单个地散布在参考序列的残基之中，或以一个或多个连续的组散布在参考序列内。作为一种实际情况，可以使用已知的计算机程序，诸如上文针对多肽所讨论的程序(例如ALIGN-2)，常规确定任何特定多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
术语“表达盒”是指通过重组或合成生成的多核苷酸，其具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列特定核酸元件。重组表达盒可以掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质粒DNA、病毒或核酸片段中。典型地，表达载体的重组表达盒部分除其他序列之外还包括待转录的核酸序列和启动子。在某些实施例中，本发明的表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“载体”或“表达盒”与“表达构建体”是同义的并且是指用于将特定基因引入与其可操作地关联的靶细胞中并指导所述基因的表达的DNA分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及整合入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体允许大量稳定mRNA的转录。一旦表达载体处于靶细胞内部，即通过细胞转录和/或翻译机制产生由该基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施例中，本发明的表达载体包含表达盒，所述表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“宿主细胞”“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指外源核酸已被引入其中的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于所述原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全一致，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。宿主细胞是可以用于生成本发明的双特异性抗原结合分子的任何类型的细胞系统。具体地，宿主细胞是原核或真核宿主细胞。宿主细胞包括培养的细胞，举几个例子，例如培养的哺乳动物细胞，诸如CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞，以及包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中的细胞。
药剂的“有效量”是指在其所施用的细胞或组织中产生生理学变化所需的量。
药剂(例如药物组合物)的“治疗有效量”是指在必需的剂量和时段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。治疗有效量的药剂例如消除、减少、延迟、最小化或预防疾病的不良影响。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。具体地，个体或受试者是人。
术语“药物组合物”是指处于允许包含在其中的活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对于将被施用配制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外组分的制剂。
“药学上可接受的赋形剂”是指药物组合物中除有效成分之外的成分，其对受试者无毒。药学上可接受的赋形剂包括但不限于缓冲剂、稳定剂或防腐剂。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包括的说明书，其含有涉及此类治疗产品的使用的有关适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变型，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预，并且可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施例中，本发明的分子用于延迟疾病的发展或用于减缓疾病的进展。
如本文所用的术语“癌症”是指增生性疾病，诸如淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、肺癌、非小细胞肺(NSCL)癌、支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastriccancer)、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆管癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、脊椎轴肿瘤、脑干胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、成髓细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤和尤文氏肉瘤，包括以上癌症中的任一种的难治性型式，或一种或多种以上癌症的组合。
本发明的双特异性抗体
本发明提供了新型双特异性抗体，其包含特异性结合程序性细胞死亡蛋白1(PD1)的第一抗原结合结构域和特异性结合淋巴细胞活化基因-3(LAG3)的第二抗原结合结构域，其具有特别有利的特性，诸如可生产性、稳定性、结合亲和力、生物活性、某些T细胞的特异性靶向、靶向效率和减小的毒性。
在某些方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其在与T细胞表面结合时显示出减少的内化。内化表示分子的重要下沉，所述分子可以在几小时内降解，同时靶向受体在细胞表面上快速地重新表达，以备用于抑制TCR信号传导。在另外的方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其优先结合常规T细胞，而不是Treg。这是有利的，因为利用阻断抗体靶向Treg上的LAG-3可通过增加它们的抑制性功能并最终遮蔽其他T细胞上的正阻断效应而是有害的。在另一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其能够从Treg抑制中挽救T细胞效应子功能。在另一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，当与肿瘤细胞系ARH77共同培养时，其能够诱导CD4 T细胞的颗粒酶B分泌，如本文提供的测定中所示。在另一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其显示出增加的肿瘤特异性T细胞效应子功能和/或增强T细胞的细胞毒性作用。在另一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其显示出增强的体内肿瘤根除。
A.结合PD1和LAG3的示例性双特异性抗体
在一个方面，本发明提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中特异性结合PD1的所述第一抗原结合结构域包含
VH结构域，其包含
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；以及
VL结构域，其包含
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在一个方面，双特异性抗体包含Fc结构域，所述Fc结构域是IgG，具体地是IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域，并且其中Fc结构域具有降低或甚至消除的效应子功能。具体地，Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代减少与Fc受体的结合，具体地是与Fcγ受体的结合。
在另一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中双特异性抗体包含Fc结构域，所述Fc结构域是IgG，具体地是IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域，并且其中Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代减少与Fc受体的结合，具体地是与Fcγ受体的结合。
在另一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域包含
(a)VH结构域，其包含
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列；以及
VL结构域，其包含
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列；或者
(b)VH结构域，其包含
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；以及
VL结构域，其包含
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列；或者(c)VH结构域，其包含
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列；以及VL结构域，其包含
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列；或者(d)VH结构域，其包含
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列；以及VL结构域，其包含
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列；或者(e)VH结构域，其包含
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列；以及VL结构域，其包含
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列。
在另一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中特异性结合PD1的第一抗原结合结构域包含
(a)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或者
(b)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，或者
(c)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，或者
(d)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，或者
(e)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在另一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中特异性结合PD1的第一抗原结合结构域包含
(a)VH结构域，其包含
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:81所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:82所示的氨基酸序列；以及
VL结构域，其包含
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:83所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:85所示的氨基酸序列；或者
(b)VH结构域，其包含
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:88所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:90所示的氨基酸序列；以及
VL结构域，其包含
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:92所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:93所示的氨基酸序列。
在一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中特异性结合PD1的第一抗原结合结构域包含
(a)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:87所示的氨基酸序列，或者
(b)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:94所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列。
在另一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域包含
(a)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，或者
(b)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列，或者
(c)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列，或者
(d)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列，或者
(e)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列。
在另一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域包含VH结构域，所述VH结构域包含
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列；以及
VL结构域，其包含
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。
在另一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域包含
(a)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列，或者
(b)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列，或者
(c)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列，或者
(d)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列。
在一个特定方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中
所述特异性结合PD1的第一抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，
并且所述特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列且所述VL结构域包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，或者所述VH结构域包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列且所述VL结构域包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列。
在一个方面，本发明的双特异性抗体包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列且所述VL结构域包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；所述第二抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列且所述VL结构域包含SEQ IDNO:21所示的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明的双特异性抗体包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列且所述VL结构域包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；所述第二抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列且所述VL结构域包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明的双特异性抗体包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列且所述VL结构域包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；所述第二抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列且所述VL结构域包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明的双特异性抗体包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ IDNO:86所示的氨基酸序列且所述VL结构域包含SEQ IDNO:87所示的氨基酸序列；所述第二抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列且所述VL结构域包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明的双特异性抗体包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ IDNO:94所示的氨基酸序列且所述VL结构域包含SEQ IDNO:95所示的氨基酸序列；所述第二抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列且所述VL结构域包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列。
在另一个方面，包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域的双特异性抗体是人、人源化或嵌合抗体。具体地，所述抗体是人源化或嵌合抗体。
在一个方面，包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域的双特异性抗体是二价的。这意指双特异性抗体包含特异性结合PD1的一个抗原结合结构域和特异性结合LAG3的一个抗原结合结构域(1+1形式)。
在一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中双特异性抗体包含Fc结构域、第一Fab片段和第二Fab片段，所述第一Fab片段包含特异性结合PD1的抗原结合结构域，所述第二Fab片段包含特异性结合LAG3的抗原结合结构域。在一个特定方面，在Fab片段中的一个中，可变结构域VL和VH彼此替换，使得VH结构域是轻链的一部分而VL结构域是重链的一部分。在一个特定方面，在包含特异性结合PD1的抗原结合结构域的第一Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换。
在一个特定方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中双特异性抗体包含
(a)第一重链、第一轻链、第二重链和第二轻链，所述第一重链包含与SEQ ID NO:96所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第一轻链包含与SEQ ID NO:98所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二重链包含与SEQ ID NO:
97所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二轻链包含与SEQID NO:99所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，或者
(b)第一重链、第一轻链、第二重链和第二轻链，所述第一重链包含与SEQ ID NO:96所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第一轻链包含与SEQ ID NO:98所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二重链包含与SEQ ID NO:
100所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二轻链包含与SEQID NO:101所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，或者
(c)第一重链、第一轻链、第二重链和第二轻链，所述第一重链包含与SEQ ID NO:102所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第一轻链包含与SEQ ID NO:104所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二重链包含与SEQ IDNO:103所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二轻链包含与SEQ ID NO:105所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，或者
(d)第一重链、第一轻链、第二重链和第二轻链，所述第一重链包含与SEQ ID NO:106所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第一轻链包含与SEQ ID NO:107所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二重链包含与SEQ IDNO:103所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二轻链包含与SEQ ID NO:105所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列。
更具体地，双特异性抗体包含
(a)第一重链、第一轻链、第二重链和第二轻链，所述第一重链包含SEQ ID NO:96所示的氨基酸序列，所述第一轻链包含SEQ IDNO:98所示的氨基酸序列，所述第二重链包含SEQ ID NO:97所示的氨基酸序列，所述第二轻链包含SEQ ID NO:99所示的氨基酸序列，或者
(b)第一重链、第一轻链、第二重链和第二轻链，所述第一重链包含SEQ ID NO:96所示的氨基酸序列，所述第一轻链包含SEQ IDNO:98所示的氨基酸序列，所述第二重链包含SEQ ID NO:100
所示的氨基酸序列，所述第二轻链包含SEQ ID NO:101所示的氨基酸序列，或者
(c)第一重链、第一轻链、第二重链和第二轻链，所述第一重链包含SEQ ID NO:102所示的氨基酸序列，所述第一轻链包含SEQ IDNO:104所示的氨基酸序列，所述第二重链包含SEQ ID NO:103
所示的氨基酸序列，所述第二轻链包含SEQ ID NO:105所示的氨基酸序列，或者
(d)第一重链、第一轻链、第二重链和第二轻链，所述第一重链包含SEQ ID NO:106所示的氨基酸序列，所述第一轻链包含SEQ IDNO:107所示的氨基酸序列，所述第二重链包含SEQ ID NO:103
所示的氨基酸序列，所述第二轻链包含SEQ ID NO:105所示的氨基酸序列。
更具体地，双特异性抗体包含第一重链、第一轻链、第二重链和第二轻链，所述第一重链包含SEQ ID NO:96所示的氨基酸序列，所述第一轻链包含SEQ ID NO:98所示的氨基酸序列，所述第二重链包含SEQ ID NO:100所示的氨基酸序列，所述第二轻链包含SEQ IDNO:101所示的氨基酸序列。
在另一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中双特异性抗体包含Fc结构域、第一Fab片段和第二Fab片段，所述第一Fab片段包含特异性结合PD1的抗原结合结构域，所述第二Fab片段包含特异性结合LAG3的抗原结合结构域，所述第二Fab片段与Fc结构域的C末端融合。具体地，包含特异性结合LAG3的抗原结合结构域的Fab片段经由其VH结构域与Fc结构域的C末端融合(反式1+1形式)。
在一个特定方面，双特异性抗体包含第一重链、第一轻链、第二重链和第二轻链，所述第一重链包含与SEQ ID NO:96所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第一轻链包含与SEQ ID NO:98所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二重链包含与SEQ ID NO:144所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二轻链包含与SEQ ID NO:
101所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列。更具体地，双特异性抗体包含第一重链、第一轻链、第二重链和第二轻链，所述第一重链包含SEQ ID NO:96所示的氨基酸序列，所述第一轻链包含SEQ ID NO:98所示的氨基酸序列，所述第二重链包含SEQ IDNO:144所示的氨基酸序列，所述第二轻链包含SEQ ID NO:101所示的氨基酸序列。
在另一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中双特异性抗体包含Fc结构域、第一Fab片段、第二Fab片段和第三Fab片段，所述第一Fab片段包含特异性结合PD1的抗原结合结构域，所述第二Fab片段包含特异性结合LAG3的抗原结合结构域，所述第三Fab片段包含特异性结合LAG3的抗原结合结构域。在一个特定方面，包含特异性结合PD1的抗原结合结构域的Fab片段经由肽接头与重链中的一条的C末端融合。
在此方面，双特异性抗体是三价的，其中二价结合LAG3而一价结合PD1。这意指双特异性抗体包含特异性结合PD1的一个抗原结合结构域和特异性结合LAG3的两个抗原结合结构域(2+1形式)。
在一个特定方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中双特异性抗体包含
(a)第一重链、第一轻链、第二重链和两条第二轻链，
所述第一重链包含与SEQ ID NO:118所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第一轻链包含与SEQ ID NO:115所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，
所述第二重链包含与SEQ ID NO:119所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述两条第二轻链包含与SEQ ID NO:
101所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，或者
(b)第一重链、第一轻链、第二重链和两条第二轻链，
所述第一重链包含与SEQ ID NO:120所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第一轻链包含与SEQ ID NO:115所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，
所述第二重链包含与SEQ ID NO:121所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述两条第二轻链含有与SEQ ID NO:99
所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，或者
(c)第一重链、第一轻链、第二重链和两条第二轻链，
所述第一重链包含与SEQ ID NO:122所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第一轻链包含与SEQ ID NO:115所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，
所述第二重链包含与SEQ ID NO:103所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述两条第二轻链包含与SEQ ID NO:
105所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列。
更具体地，双特异性抗体包含
(a)第一重链、第一轻链、第二重链和两条第二轻链，所述第一重链包含SEQ IDNO:118所示的氨基酸序列，所述第一轻链包含SEQ ID NO:115所示的氨基酸序列，所述第二重链包含SEQ IDNO:119所示的氨基酸序列，所述两条第二轻链包含SEQ ID NO:
101所示的氨基酸序列，或者
(b)第一重链、第一轻链、第二重链和两条第二轻链，所述第一重链包含SEQ IDNO:120所示的氨基酸序列，所述第一轻链包含SEQ ID NO:115所示的氨基酸序列，所述第二重链包含SEQ IDNO:121所示的氨基酸序列，所述两条第二轻链包含SEQ ID NO:
99所示的氨基酸序列，或者
(c)第一重链、第一轻链、第二重链和两条第二轻链，所述第一重链包含SEQ IDNO:122所示的氨基酸序列，所述第一轻链包含SEQ ID NO:115所示的氨基酸序列，所述第二重链包含SEQ IDNO:103所示的氨基酸序列，所述两条第二轻链包含SEQ ID NO:
105所示的氨基酸序列。
在另一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中双特异性抗体包含Fc结构域、第一Fab片段、第二Fab片段和第三Fab片段，所述第一Fab片段包含特异性结合PD1的抗原结合结构域，所述第二Fab片段包含特异性结合LAG3的抗原结合结构域，所述第三Fab片段包含特异性结合LAG3的抗原结合结构域，其中包含特异性结合LAG3的抗原结合结构域的Fab片段中的一个经由肽接头与重链中的一条的C末端融合(反式2+1形式)。
在一个特定方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中双特异性抗体包含第一重链、第一轻链、第二重链和两条第二轻链，所述第一重链包含与SEQ ID NO:96所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第一轻链包含与SEQ ID NO:98所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二重链包含与SEQ ID NO:145所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述两条第二轻链包含与SEQ ID NO:101所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列。更具体地，双特异性抗体包含第一重链、第一轻链、第二重链和两条第二轻链，所述第一重链包含与SEQ ID NO:96所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第一轻链包含与SEQ ID NO:98所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二重链包含与SEQ ID NO:145所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述两条第二轻链包含与SEQ ID NO:101所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列。
在另一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中双特异性抗体包含Fc结构域、两个Fab片段和单链Fab(scFab)，所述两个Fab片段各自包含特异性结合LAG3的抗原结合结构域，所述单链Fab(scFab)包含特异性结合PD1的抗原结合结构域。具体地，包含特异性结合PD1的抗原结合结构域的所述scFab经由肽接头与所述重链中的一条的C末端融合。
在一个特定方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中双特异性抗体包含
(a)第一重链、第二重链和两条轻链，所述第一重链包含与SEQ IDNO:123所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二重链包含与SEQ ID NO:119所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述两条轻链均包含与SEQ ID NO:101
所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，或者
(b)第一重链、第二重链和两条轻链，所述第一重链包含与SEQ IDNO:124所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二重链包含与SEQ ID NO:121所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述两条轻链均包含与SEQ ID NO:99
所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，或者
(c)第一重链、第二重链和第二轻链，所述第一重链包含与SEQ IDNO:125所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二重链包含与SEQ ID NO:103所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二轻链包含与SEQ ID NO:105所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列。
更具体地，双特异性抗体包含
(a)第一重链、第二重链和两条轻链，所述第一重链包含SEQ ID NO:
123所示的氨基酸序列，所述第二重链包含SEQ ID NO:119所示的氨基酸序列，所述两条轻链均包含SEQ ID NO:101所示的氨基酸序列，或者
(b)第一重链、第二重链和两条轻链，所述第一重链包含SEQ ID NO:
124所示的氨基酸序列，所述第二重链包含SEQ ID NO:121所示的氨基酸序列，所述两条轻链均包含SEQ ID NO:99所示的氨基酸序列，或者
(c)第一重链、第二重链和两条轻链，所述第一重链包含SEQ ID NO:
125所示的氨基酸序列，所述第二重链包含SEQ ID NO:103所示的氨基酸序列，所述两条轻链均包含SEQ ID NO:105所示的氨基酸序列。
在另一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中所述双特异性抗体包含Fc结构域、两个Fab片段以及VH和VL结构域，所述两个Fab片段各自包含特异性结合LAG3的抗原结合结构域，所述VH和VL结构域包含特异性结合PD1的抗原结合结构域。具体地，特异性结合PD1的抗原结合结构域的VH结构域经由肽接头与重链中的一条的C末端融合，而特异性结合PD1的抗原结合结构域的VL结构域经由肽接头与重链中的另一条的C末端融合。
在一个特定方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中所述双特异性抗体包含第一重链、第二重链和两条轻链，所述第一重链包含与SEQ ID NO:126所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二重链包含与SEQ ID NO:127所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述两条轻链各自包含与SEQ ID NO:109所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列。更具体地，双特异性抗体包含第一重链、第二重链和两条轻链，所述第一重链包含SEQ ID NO:126所示的氨基酸序列，所述第二重链包含SEQ ID NO:127所示的氨基酸序列，所述两条轻链均包含SEQ ID NO:109所示的氨基酸序列。
在另一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中所述双特异性抗体包含Fc结构域、第一Fab片段、第二Fab片段、第三Fab片段和第四Fab片段，所述第一Fab片段包含特异性结合PD1的抗原结合结构域，所述第二Fab片段包含特异性结合LAG3的抗原结合结构域，所述第三Fab片段包含特异性结合LAG3的抗原结合结构域，所述第四Fab片段包含特异性结合PD1的抗原结合结构域。
在此方面，双特异性抗体是四价的，其中二价结合LAG3而二价结合PD1。这意指双特异性抗体包含特异性结合PD1的两个抗原结合结构域和特异性结合LAG3的两个抗原结合结构域(2+2形式)。
在一个方面，本发明的双特异性抗体包含
(a)包含两个Fab片段的抗体的两条轻链和两条重链，所述Fab片段包含特异性结合LAG3的抗原结合结构域，以及
(b)包含特异性结合PD1的抗原结合结构域的两个另外的Fab片段，其中所述两个另外的Fab片段各自经由肽接头与(a)的重链的C
末端连接。
在一个特定方面，肽接头是(G4S)4。在另一个方面，包含特异性结合PD1的抗原结合结构域的两个另外的Fab片段是交换型Fab片段，其中可变结构域VL和VH彼此替换并且VL-CH链各自经由肽接头与(a)的重链的C末端连接。
在一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中各自包含特异性结合PD1的抗原结合结构域的两个Fab片段各自分别经由肽接头与重链中的一条的C末端融合。
在一个特定方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中双特异性抗体包含
(a)两条重链、两条第一轻链和两条第二轻链，所述两条重链均包含与SEQ ID NO:114所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述两条第一轻链均包含与SEQID NO:115所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述两条第二轻链均包含与SEQ ID NO:101所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，或者
(b)两条重链、两条第一轻链和两条第二轻链，所述两条重链均包含与SEQ ID NO:116所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述两条第一轻链均包含与SEQID NO:115所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述两条第二轻链均包含与SEQ ID NO:99所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，或者
(c)两条重链、两条第一轻链和两条第二轻链，所述两条重链均包含与SEQ ID NO:117所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述两条第一轻链均包含与SEQID NO:115所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述两条第二轻链包含与SEQ ID NO:105所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列。
更具体地，双特异性抗体包含
(a)两条重链、两条第一轻链和两条第二轻链，所述两条重链均包含SEQ ID NO:114所示的氨基酸序列，所述两条第一轻链均包含SEQ ID NO:115所示的氨基酸序列，所述两条第二轻链均包含SEQ ID NO:101所示的氨基酸序列，或者
(b)两条重链、两条第一轻链和两条第二轻链，所述两条重链均包含SEQ ID NO:116所示的氨基酸序列，所述两条第一轻链均包含SEQ ID NO:115所示的氨基酸序列，所述两条第二轻链均包含SEQ ID NO:99所示的氨基酸序列，或者
(c)两条重链、两条第一轻链和两条第二轻链，所述两条重链均包含SEQ ID NO:117所示的氨基酸序列，所述两条第一轻链均包含SEQ ID NO:115所示的氨基酸序列，所述两条第二轻链均包含SEQ ID NO:105所示的氨基酸序列。
减少Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域修饰
在某些方面，提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中双特异性抗体包含Fc结构域，所述Fc结构域包含一个或多个氨基酸修饰，所述一个或多个氨基酸修饰减少与Fc受体的结合，具体地是与Fcγ受体的结合，并且降低或消除效应子功能。
在某些方面，一个或多个氨基酸修饰可引入本文提供的抗体的Fc区中，从而生成Fc区变体。Fc区变体可包含人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，其在一个或多个氨基酸位置上包含氨基酸修饰(例如取代)。
以下章节描述包含减少Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域修饰的本发明的双特异性抗原结合分子的优选方面。在一个方面，本发明涉及包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域的双特异性抗体，其中Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代减少与Fc受体的结合，具体地是与Fcγ受体的结合。具体地，Fc结构域属于人IgG1亚类，具有氨基酸突变L234A、L235A和P329G(根据Kabat EU索引编号)。
Fc结构域对本发明的双特异性抗体赋予有利的药代动力学特性，包括有助于靶组织中的良好积聚的长血清半衰期和有利的组织-血液分配比。然而，与此同时，可能导致本发明的双特异性抗体不期望地靶向表达Fc受体的细胞，而不是优选的抗原携带细胞。因此，在特定实施例中，与天然IgG Fc结构域，具体地是IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域相比，本发明的双特异性抗体的Fc结构域表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。更具体地，Fc结构域是IgG1 Fc结构域。
在一个这种方面，与天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子)相比，所述Fc结构域(或包含所述Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子)表现出对Fc受体的结合亲和力的少于50％、优选地少于20％、更优选地少于10％且最优选地少于5％；和/或与天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子)相比，所述Fc结构域(或包含所述Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子)表现出效应子功能的少于50％、优选地少于20％、更优选地少于10％且最优选地少于5％。在一个方面，Fc结构域(或包含所述Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子)不显著结合Fc受体和/或诱导效应子功能。在一个特定方面，Fc受体是Fcγ受体。在一个方面，Fc受体是人Fc受体。在一个方面，Fc受体是活化的Fc受体。在一个具体方面，Fc受体是活化的人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体地是人FcγRIIIa。在一个方面，Fc受体是抑制性Fc受体。在一个具体方面，Fc受体是抑制性人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIB。在一个方面，效应子功能是CDC、ADCC、ADCP和细胞因子分泌中的一个或多个。在一个特定方面，效应子功能是ADCC。在一个方面，与天然IgG1 Fc结构域相比，Fc结构域表现出基本上类似的对新生儿Fc受体的结合亲和力。当Fc结构域(或包含所述Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子)表现出天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子)对FcRn的结合亲和力的大于约70％、具体地大于约80％、更具体地大于约90％时，实现了基本上类似的与FcRn的结合。
在一个特定方面，Fc结构域经过工程化改造，以与非工程化改造的Fc结构域相比具有降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在一个特定方面，本发明的双特异性抗原结合分子的Fc结构域包含降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸突变。典型地，相同的一个或多个氨基酸突变存在于Fc结构域的两个亚基中的每一个中。在一个方面，氨基酸突变降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力。在另一个方面，氨基酸突变将Fc结构域对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍、至少5倍或至少10倍。在一个方面，与包含非工程化改造的Fc结构域的本发明的双特异性抗体相比，包含工程化改造的Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子表现出对Fc受体的结合亲和力的少于20％、具体地少于10％、更具体地少于5％。在一个特定方面，Fc受体是Fcγ受体。在其他方面，Fc受体是人Fc受体。在一个方面，Fc受体是抑制性Fc受体。在一个具体方面，Fc受体是抑制性人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIB。在一些方面，Fc受体是活化的Fc受体。在一个具体方面，Fc受体是活化的人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体地是人FcγRIIIa。优选地，与这些受体中的每一个的结合降低。在一些方面，对互补组分的结合亲和力，具体地对C1q的结合亲和力也降低。在一个方面，对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力不降低。当Fc结构域(或包含所述Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子)表现出Fc结构域的非工程化改造形式(或包含Fc结构域的所述非工程化改造形式的本发明的双特异性抗原结合分子)对FcRn的结合亲和力的大于约70％时，实现了基本上类似的与FcRn的结合，即实现了Fc结构域对所述受体的结合亲和力的保留。Fc结构域或包含所述Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子可表现出这种亲和力的大于约80％或甚至大于约90％。在某些实施例中，本发明的双特异性抗原结合分子的Fc结构域被工程化改造，以相比于非工程化改造的Fc结构域具有降低的效应子功能。降低的效应子功能可以包括但不限于以下中的一个或多个：降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)、降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、降低的抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)、减少的细胞因子分泌、减少的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、减少的与NK细胞的结合、减少的与巨噬细胞的结合、减少的与单核细胞的结合、减少的与多形核细胞的结合、减少的直接信号传导诱导性细胞凋亡、降低的树突细胞成熟或减少的T细胞引发。
具有降低的效应子功能的抗体包括具有一个或多个Fc区残基238、265、269、270、297、327和329的取代的那些(美国专利No.6,737,056)。此类Fc突变体包括在两个或多个第265、269、270、297和327位氨基酸处具有取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297被取代为丙氨酸(美国专利No.7,332,581)。描述了具有改善的或降低的与FcR的结合的某些抗体变体。(例如美国专利No.6,737,056；WO 2004/056312，以及Shields,R.L.等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。
在本发明的一个方面，Fc结构域在E233、L234、L235、N297、P331和P329位处包含氨基酸取代。在一些方面，Fc结构域包含氨基酸取代L234A和L235A(“LALA”)。在一个这样的实施例中，Fc结构域是IgG1 Fc结构域，特别地是人IgG1 Fc结构域。在一个方面，Fc结构域在P329位处包含氨基酸取代。在一个更具体的方面，氨基酸取代是P329A或P329G，特别地是P329G。在一个实施例中，Fc结构域在位置P329处包含氨基酸取代并且包含选自由E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S组成的组的另外的氨基酸取代。在更特定的实施例中，Fc结构域包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G(“P329GLALA”)。氨基酸取代的“P329GLALA”组合几乎完全消除人IgG1 Fc结构域的Fcγ受体结合，如PCT专利申请No.WO 2012/130831 A1中所述。所述文档还描述了制备此类突变Fc结构域的方法和用于确定其特性(诸如Fc受体结合或效应子功能)的方法。这种抗体是具有突变L234A和L235A或具有突变L234A、L235A和P329G的IgG1(根据Kabat等人的EU索引编号，Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD,1991)。
在一个方面，本发明的双特异性抗体包含(所有位置均根据Kabat的EU索引)(i)任选地具有突变P329G、L234A和L235A的人IgG1亚类的同二聚体Fc区，或(ii)任选地具有突变P329G、S228P和L235E的人IgG4亚类的同二聚体Fc区，或(iii)任选地具有突变P329G、L234A、L235A、I253A、H310A和H435A，或任选地具有突变P329G、L234A、L235A、H310A、H433A和Y436A的人IgG1亚类的同二聚体Fc区，或(iv)异二聚体Fc区，其中一个Fc区多肽包含突变T366W并且另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A和Y407V，或者其中一个Fc区多肽包含突变T366W和Y349C并且另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和S354C，或者其中一个Fc区多肽包含突变T366W和S354C并且另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和Y349C，或(v)人IgG1亚类的异二聚体Fc区，其中两个Fc区多肽均包含突变P329G、L234A和L235A，并且一个Fc区多肽包含突变T366W，而另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A和Y407V；或其中一个Fc区多肽包含突变T366W和Y349C，而另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和S354C；或其中一个Fc区多肽包含突变T366W和S354C，并且另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和Y349C。
在一个方面，Fc结构域是IgG4 Fc结构域。在一个更具体的实施例中，Fc结构域是在S228位处(Kabat编号)包含氨基酸取代，具体地是氨基酸取代S228P的IgG4 Fc结构域。在一个更具体的实施例中，Fc结构域是包含氨基酸取代L235E和S228P以及P329G的IgG4 Fc结构域。这种氨基酸取代减少IgG4抗体的体内Fab臂交换(参见Stubenrauch等人，DrugMetabolism and Disposition 38,84-91(2010))。因此，在一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含(所有位置均根据Kabat的EU索引)人IgG4亚类的异二聚体Fc区，其中两个Fc区多肽均包含突变P329G、S228P和L235E并且一个Fc区多肽包含突变T366W而另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A和Y407V，或其中一个Fc区多肽包含突变T366W和Y349C而另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和S354C，或其中一个Fc区多肽包含突变T366W和S354C而另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和Y349C。
具有延长的半衰期和改善的新生儿Fc受体(FcRn)结合、负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer,R.L.等人，J.Immunol.117(1976)587-593，以及Kim,J.K.等人，J.Immunol.24(1994)2429-2434)的抗体描述于US2005/0014934中。那些抗体包含这样的Fc区，所述Fc区中具有改善Fc区与FcRn的结合的一个或多个取代。此类Fc变体包括在以下Fc区残基中的一处或多处具有取代的Fc变体：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如对Fc区残基434的取代(美国专利No.7,371,826)。关于Fc区变体的其他示例，还参见Duncan,A.R.和Winter,G.,Nature 322(1988)738-740；US 5,648,260；US 5,624,821；以及WO94/29351。
与Fc受体的结合可以例如使用标准仪器(诸如BIAcore仪器(GE Healthcare))，通过ELISA或通过表面等离子体共振(SPR)容易地确定，并且Fc受体诸如可以通过重组表达获得。本文描述了合适的此类结合测定。或者，可以使用已知表达特定Fc受体的细胞系(诸如表达FcγⅢa受体的人NK细胞)来评估Fc结构域或包含Fc结构域的细胞激活双特异性抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力。Fc结构域的效应子功能，或本发明的包含Fc结构域的双特异性抗体，可以通过本领域已知的方法来测量。本文描述了用于测量ADCC的合适测定。用于评定感兴趣的分子的ADCC活性的体外测定的其他示例描述于美国专利No 5,500,362；Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 83,7059-7063(1986)和Hellstrom等人，ProcNatl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985)；美国专利No5,821,337；Bruggemann等人，J ExpMed 166,1351-1361(1987)。或者，可以使用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；以及
Figure BDA0004029792780000701
Figure BDA0004029792780000702
非放射性细胞毒性测定(威斯康星州，麦迪逊市，普洛麦格公司(Promega,Madison,WI))。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。替代地或另外地，可例如在诸如在Clynes等人，Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)中公开的动物模型中体内评定感兴趣的分子的ADCC活性。
以下部分描述了包含降低Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域修饰的本发明的双特异性抗体的优选方面。在一个方面中，本发明涉及双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中所述Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代降低抗体与Fc受体的结合亲和力，特别是对Fcγ受体的结合亲和力。在另一个方面中，本发明涉及双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中所述Fc结构域包含降低效应子功能的一个或多个氨基酸取代。在特定方面，所述Fc结构域是人IgG1亚类的，具有氨基酸突变L234A、L235A和P329G(根据Kabat EU索引编号)。
促进异源二聚化的Fc结构域修饰
本发明的双特异性抗原结合分子包含与Fc结构域的两个亚基中的一个或另一个融合的不同抗原结合结构域，因此所述Fc结构域的两个亚基可包含在两个不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后的二聚化导致了两种多肽的几种可能的组合。为了在重组生产中提高本发明的双特异性抗体的产率和纯度，因此在本发明的双特异性抗原结合分子的Fc结构域中引入促进所需多肽的缔合的修饰将是有利的。
因此，在特定的方面，本发明涉及一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，其中所述Fc结构域包含促进所述Fc结构域的第一和第二亚基的缔合的修饰。人IgG Fc结构域的两个亚基之间最广泛的蛋白质间相互作用位点在Fc结构域的CH3结构域中。因此，在一个方面中，所述修饰在Fc结构域的CH3结构域中。
在一个具体方面，所述修饰是所谓的“突起入孔”修饰，所述修饰包括Fc结构域的两个亚基中的一个中的“突起”修饰和Fc结构域的两个亚基中的另一个中的“孔”修饰。因此，本发明涉及一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合位点，其中根据突起入孔方法，所述Fc结构域的第一亚基包含突起而所述Fc结构域的第二亚基包含孔。在一个特定方面中，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W(EU编号)而Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
突起入孔技术描述于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng9,617-621(1996)和Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入凸起(“突起”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“孔”)，使得所述凸起可以定位在所述空腔中，以便促进异源二聚体的形成并阻碍同源二聚体的形成。凸起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与凸起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。
因此，在一个方面，在本发明的双特异性抗原结合分子的Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，某一氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基取代，从而在第一亚基的CH3结构域内产生凸起，所述凸起可定位于第二亚基的CH3结构域内的空腔中；而在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，某一氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基取代，从而在第二亚基的CH3结构域内产生空腔，第一亚基的CH3结构域内的所述凸起可定位在所述空腔内。凸起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸来制备，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成。在一个具体方面中，在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，366位处的苏氨酸残基被色氨酸残基(T366W)替换，而在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，407位处的酪氨酸残基被缬氨酸残基(Y407V)替换。在一个方面中，另外在Fc结构域的第二亚基中，366位处的苏氨酸残基被丝氨酸残基(T366S)替换，并且368位处的亮氨酸残基被丙氨酸残基(L368A)替换。
在另一个方面中，另外在Fc结构域的第一亚基中，354位处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基(S354C)替换，并且另外在Fc结构域的第二亚基中，349位的酪氨酸残基被半胱氨酸残基(Y349C)替换。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc结构域的两个亚基之间形成二硫桥，从而进一步稳定化二聚体(Carter(2001),J Immunol Methods 248,7-15)。在一个特定方面中，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W(EU编号)而Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
但是，也可以替代地或另外地使用如EP 1 870 459所述的其他突起入孔技术。在一个实施例中，多特异性抗体包含“突起链”的CH3结构域中的突变R409D和K370E，以及“孔链”的CH3结构域中的突变D399K和E357K(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面中，双特异性抗体包含“突起链”的CH3结构域中的T366W突变和“孔链”的CH3结构域中的突变T366S、L368A和Y407V，以及另外“突起链”的CH3结构域中的突变R409D和K370E和“孔链”的CH3结构域中的突变D399K和E357K(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面中，双特异性抗体包含在所述两个CH3结构域中的一个中的突变Y349C和T366W和在所述两个CH3结构域中的另一个中的突变S354C、T366S、L368A和Y407V，或者多特异性抗体包含在所述两个CH3结构域中的一个中的突变Y349C和T366W和在所述两个CH3结构域中的另一个中的突变S354C、T366S、L368A和Y407V以及另外在“突起链”的CH3结构域中的突变R409D和K370E和在“孔链”的CH3结构域中的突变D399K和E357K(根据Kabat EU索引编号)。
在另一个方面中，促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰包括介导静电转向效应的修饰，例如如在PCT公开WO 2009/089004中所述。通常，该方法涉及用带电荷的氨基酸残基替换两个Fc结构域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基，使得同源二聚体形成变得在静电上不利，但异源二聚化在静电上有利。
除了“突起入孔技术”之外，用于修饰多特异性抗体的重链的CH3结构域以实施异源二聚化的其他技术也是本领域中已知的。这些技术，尤其是在WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954和WO 2013/096291中描述的技术，在本文中被认为是“突起入孔技术”与双特异性抗体的组合的替代方案。
在一个方面中，在双特异性抗体中，使用EP 1870459中描述的方法来支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异源二聚化。该方法基于在第一和第二重链之间的CH3/CH3-结构域-界面中的特定氨基酸位处引入带相反电荷的带电氨基酸。
因此，在多特异性抗体的三级结构的该方面中，第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域形成位于相应的抗体CH3结构域之间的界面，其中第一重链的CH3结构域的相应氨基酸序列和第二重链的CH3结构域的氨基酸序列各自包含位于所述抗体的三级结构中的所述界面内的一组氨基酸，其中从位于一条重链的CH3结构域中的界面中的所述一组氨基酸，第一氨基酸被带正电荷的氨基酸取代，并且从位于另一条重链的CH3结构域中的界面中的所述一组氨基酸，第二氨基酸被带负电荷的氨基酸取代。根据该方面的双特异性抗体在本文中也称为“CH3(+/-)工程化的双特异性抗体”(其中缩写“+/-”代表在相应CH3结构域中引入的带相反电荷的氨基酸)。
在一个方面中，在CH3(+/-)工程化的双特异性抗体中，带正电荷的氨基酸选自K、R和H，而带负电荷的氨基酸选自E或D。
在一个方面中，在CH3(+/-)工程化的双特异性抗体中，带正电荷的氨基酸选自K和R，而带负电荷的氨基酸选自E或D。
在一个方面中，在CH3(+/-)工程化的双特异性抗体中，带正电荷的氨基酸是K，而带负电荷的氨基酸是E。
在一个方面中，在一条重链的CH3结构域中的CH3(+/-)工程化的双特异性抗体中，409位处的氨基酸R被D取代并且位处的氨基酸K被E取代，而在另一条重链的CH3结构域中，399位的氨基酸D被K取代并且357位处的氨基酸E被K取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面中，使用WO 2013/157953中描述的方法来支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异源二聚化。在一个实施例中，在一条重链的CH3结构域中，366位处的氨基酸T被K取代，而在另一条重链的CH3结构域中，351位处的氨基酸L被D取代(根据Kabat EU索引编号)。在另一个实施例中，在一条重链的CH3结构域中，366位处的氨基酸T被K取代并且351位处的氨基酸L被K取代，而在另一条重链的CH3结构域中，351位处的氨基酸L被D取代(根据Kabat EU索引编号)。
在另一个方面中，在一条重链的CH3结构域中，366位处的氨基酸T被K取代并且351位处的氨基酸L被K取代，而在另一条重链的CH3结构域中，351位处的氨基酸L被D取代(根据Kabat EU索引编号)。另外，下列取代中的至少一种取代包含在另一条重链的CH3结构域中：349位处的氨基酸Y被E取代，349位处的氨基酸Y被D取代，并且368位处的氨基酸L被E取代(根据Kabat EU索引编号)。在一个实施例中，368位处的氨基酸L被E取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面中，使用WO 2012/058768中描述的方法来支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异源二聚化。在一个方面中，在一条重链的CH3结构域中，351位处的氨基酸L被Y取代并且407位处的氨基酸Y被A取代，而在另一条重链的CH3结构域中，366位处的氨基酸T被A取代并且409位处的氨基酸K被F取代(根据Kabat EU索引编号)。在另一个实施例中，除了上述取代之外，在另一条重链的CH3结构域中，411位处的氨基酸(最初为T)、399位处的氨基酸(最初为D)、400位处的氨基酸(最初为S)、405位处的氨基酸(最初为F)、390位处的氨基酸(最初为N)和392位处的氨基酸(最初为K)中的至少一个氨基酸被取代(根据Kabat EU索引编号)。优选的取代是：
-用选自N、R、Q、K、D、E和W的氨基酸取代411位处的氨基酸T(根据Kabat EU索引编号)，
-用选自R、W、Y和K的氨基酸取代399位处的氨基酸D(根据Kabat EU索引编号)，
-用选自E、D、R和K的氨基酸取代400位处的氨基酸S(根据Kabat EU索引编号)，
-用选自I、M、T、S、V和W的氨基酸取代405位处的氨基酸F(根据Kabat EU索引编号)；
-用选自R、K和D的氨基酸取代390位处的氨基酸N(根据Kabat EU索引编号)；以及
-用选自V、M、R、L、F和E的氨基酸取代392位处的氨基酸K(根据Kabat EU索引编号)。
在另一个方面中，根据WO 2012/058768对双特异性抗体进行工程化，即在一条重链的CH3结构域中，351位处的氨基酸L被Y取代并且407位处的氨基酸Y被A取代，而在另一条重链的CH3结构域中，366位处的氨基酸T被V取代并且409位处的氨基酸K被F取代(根据Kabat EU索引编号)。在多特异性抗体的另一个实施例中，在一条重链的CH3结构域中，407位处的氨基酸Y被A取代，而在另一条重链的CH3结构域中，366位处的氨基酸T被A取代并且409位处的氨基酸K被F取代(根据Kabat EU索引编号)。在最后一个上述实施例中，在另一条重链的CH3结构域中，392位处的氨基酸K被E取代，411位处的氨基酸T被E取代，399位处的氨基酸D被R取代，并且400位处的氨基酸S被R取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面中，使用WO 2011/143545中描述的方法来支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异源二聚化。在一个方面中，在两条重链的CH3结构域中在368和/或409位处引入氨基酸修饰(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面中，使用WO 2011/090762中描述的方法来支持双特异性抗体的第一重链和第二重链的异源二聚化。WO 2011/090762涉及根据“突起入孔”(KiH)技术的氨基酸修饰。在一个实施例中，在一条重链的CH3结构域中，366位处的氨基酸T被W取代，而在另一条重链的CH3结构域中，407位处的氨基酸Y被A取代(根据Kabat EU索引编号)。在另一个实施例中，在一条重链的CH3结构域中，366位处的氨基酸T被Y取代，而在另一条重链的CH3结构域中，407位处的氨基酸Y被T取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面中，使用WO 2009/089004中描述的方法来支持双特异性抗体的第一重链和第二重链的异源二聚化。在一个实施例中，在一条重链的CH3结构域中，392位处的氨基酸K或N被带负电荷的氨基酸取代(在一个实施例中被E或D取代，在一个优选实施例中被D取代)，而在另一条重链的CH3结构域中，399位处的氨基酸D、356位处的氨基酸E或D或357位处的氨基酸E被带正电荷的氨基酸取代(在一个实施例中被K或R取代，在一个优选实施例中被K取代，在一个优选的实施例中，399或356位处的氨基酸被K取代)(根据Kabat EU索引编号)。在另一个实施例中，除了上述取代之外，在一条重链的CH3结构域中，409位处的氨基酸K或R被带负电荷的氨基酸取代(在一个实施例中被E或D取代，在一个优选实施例中被D取代)(根据Kabat EU索引编号)。在另一方面中，作为上述取代的补充或作为上述取代的替代，在一条重链的CH3结构域中，439位处的氨基酸K和/或370位处的氨基酸K彼此独立地被带负电荷的氨基酸取代(在一个实施例中被E或D取代，在一个优选实施例中被D取代)(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面中，使用WO 2007/147901中描述的方法来支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异源二聚化。在一个实施例中，在一条重链的CH3结构域中，253位处的氨基酸K被E取代，282位处的氨基酸D被K取代，并且322位的氨基酸K被D取代，而在另一条重链的CH3结构域中，239位处的氨基酸D被K取代，240位处的氨基酸E被K取代，并且292位处的氨基酸K被D取代(根据Kabat EU索引编号)。
如本文报道的双特异性抗体的重链的C末端可以是以氨基酸残基PGK结束的完整C末端。重链的C末端可以是缩短的C末端，在所述缩短的C末端中已经去除了一个或两个C末端氨基酸残基。在一个优选的方面中，重链的C末端是以PG结束的缩短的C末端。
在本文报道的所有方面中的一个方面，如本文所指定的包含含有C末端CH3结构域的重链的双特异性抗体，包含C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat EU索引编号)。在本文报道的所有方面的一个实施例中，如本文所指定的包含含有C末端CH3结构域的重链的双特异性抗体，包含C末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat EU索引编号)。
Fab结构域中的修饰
在一个方面中，本发明涉及一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一Fab片段和特异性结合LAG3的第二Fab片段，其中在所述Fab片段的一个中，可变结构域VH和VL或恒定结构域CH1和CL被交换。根据Crossmab技术制备双特异性抗体。
在WO2009/080252、WO2009/080253和Schaefer,W.等人，PNAS,108(2011)11187-1191中详细描述了在一个结合臂中具有结构域置换/交换的多特异性抗体(CrossMabVH-VL或CrossMabCH-CL)。它们明显减少了由抗第一抗原的轻链与抗第二抗原的错误重链的错配导致的副产物(与没有此类结构域交换的方法相比)。
在一个具体方面中，本发明涉及一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一Fab片段和特异性结合LAG3的第二Fab片段，其中在所述Fab片段中的一个中，可变结构域VL和VH彼此替换，使得所述VH结构域是轻链的一部分而所述VL结构域是重链的一部分。在一个具体方面中，双特异性抗体是这样的双特异性抗体，其中在包含特异性结合PD1的抗原结合结构域的第一Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换。
在另一方面中，并且为了进一步改善正确的配对，包含特异性结合PD1的第一Fab片段和特异性结合LAG3的第二Fab片段的双特异性抗体可含有不同的带电氨基酸取代(所谓的“带电残基”)。将这些修饰引入交叉或非交叉的CH1和CL结构域中。例如在WO2015/150447、WO2016/020309和PCT/EP2016/073408中描述了此类修饰。
在一个特定方面中，本发明涉及一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一Fab片段和特异性结合LAG3的第二Fab片段，其中在恒定结构域CL中的Fab片段的一个中，124位处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)，而在恒定结构域CH1中147位和213位处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)。在一个特定方面中，双特异性抗体是这样的双特异性抗体，其中在包含特异性结合TIM3的抗原结合结构域的第二Fab片段中，在恒定结构域CL中124位处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)，并且在恒定结构域CH1中，147位和213位处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个特定方面中，本发明涉及一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一Fab片段和特异性结合LAG3的第二Fab片段，其中在CL结构域中的一个中，123位(EU编号)处的氨基酸已经被精氨酸(R)取代并且124位(EU编号)处的氨基酸已经被赖氨酸(K)取代，而其中在CH1结构域的一个中，147位(EU编号)和213位(EU编号)处的氨基酸已经被谷氨酸(E)取代。在一个特定方面中，双特异性抗体是这样的双特异性抗体，其中在包含特异性结合LAG3的抗原结合结构域的第二Fab片段中，123位(EU编号)处的氨基酸已被精氨酸(R)替换并且124位(EU编号)处的氨基酸已被赖氨酸(K)替换，而其中在CH1结构域中的一个中，147位(EU编号)和213位(EU编号)处的氨基酸已被谷氨酸(E)取代。
在另一方面中，双特异性抗体是二价抗体，其包含
a)特异性结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，以及
b)特异性结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中所述第二轻链和所述第二重链的可变结构域VL和VH彼此替换。
a)下的抗体不含有如b)下报道的修饰，并且a)下的重链和轻链是分离的链。
在b)下的抗体中，在轻链内可变轻链结构域VL被所述抗体的可变重链结构域VH替换，而在重链内可变重链结构域VH被所述抗体的可变轻链结构域VL替换。
在一个方面，(i)在a)下的第一轻链的恒定结构域CL中，124位(根据Kabat编号)处的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代，而其中在a)下的第一重链的恒定结构域CH1中，147位处的氨基酸或213位处的氨基酸(根据Kabat EU索引编号)被带负电荷的氨基酸取代；或(ii)在b)下的第二轻链的恒定结构域CL中，124位(根据Kabat编号)处的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代，而其中在b)下的第二重链的恒定结构域CH1中，147位处的氨基酸或213位处的氨基酸(根据Kabat EU索引编号)被带负电荷的氨基酸取代。
在另一方面中，(i)在a)下的第一轻链的恒定结构域CL中，124位处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)(在一个优选的实施例中，被赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)，而其中在a)下的第一重链的恒定结构域CH1中，147位处的氨基酸或213位处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)；或者(ii)在b)下的第二轻链的恒定结构域CL中，124位处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)(在一个优选的实施例中，被赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)，而其中在b)下的第二重链的恒定结构域CH1中，147位处的氨基酸或213位处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面中，在第二重链的恒定结构域CL中，124位和123位处的氨基酸被K取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面中，在第二重链的恒定结构域CL中，123位处的氨基酸被R取代并且124位处的氨基酸被K取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面中，在第二轻链的恒定结构域CH1中，147位和213位处的氨基酸被E取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面中，在第一轻链的恒定结构域CL中，124位和123位处的氨基酸被K取代，而在第一重链的恒定结构域CH1中，147位和213位处的氨基酸被E取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面中，在第一轻链的恒定结构域CL中，123位处的氨基酸被R取代并且124位处的氨基酸被K取代，而在第一重链的恒定结构域CH1中，147位和213位的氨基酸都被E取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面中，在第二重链的恒定结构域CL中，124位和123位处的氨基酸被K取代；在第二轻链的恒定结构域CH1中，147位和213位处的氨基酸被E取代；在第一轻链的可变结构域VL中，38位处的氨基酸被K取代；在第一重链的可变结构域VH中，39位处的氨基酸被E取代；在第二重链的可变结构域VL中，38位处的氨基酸被K取代；并且在第二轻链的可变结构域VH中，39位处的氨基酸被E取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面中，双特异性抗体是二价抗体，其包含
a)特异性结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，以及
b)特异性结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的可变结构域VL和VH彼此替换，而其中第二轻链和第二重链的恒定结构域CL和CH1彼此替换。
a)下的抗体不含有如b)下报道的修饰，并且a)下的重链和轻链是分离的链。在b)下的抗体中，在轻链内，可变轻链结构域VL被所述抗体的可变重链结构域VH替换，而恒定轻链结构域CL被所述抗体的恒定重链结构域CH1替换；在重链内，可变重链结构域VH被所述抗体的可变轻链结构域VL替换，而恒定重链结构域CH1被所述抗体的恒定轻链结构域CL替换。
在一个方面中，双特异性抗体是二价抗体，其包含
a)特异性结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，以及
b)特异性结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中所述第二轻链和所述第二重链的恒定结构域CL和CH1彼此替换。
a)下的抗体不含有如b)下报道的修饰，并且a)下的重链和轻链是分离的链。在b)下的抗体中，在轻链内，恒定轻链结构域CL被所述抗体的恒定重链结构域CH1替换；而在重链内，恒定重链结构域CH1被所述抗体的恒定轻链结构域CL替换。
在一个方面中，双特异性抗体是包含以下各项的双特异性抗体
a)全长抗体，其特异性结合第一抗原并由两条抗体重链和两条抗体轻链组成；以及
b)特异性结合第二抗原的一个、两个、三个或四个单链Fab片段，
其中b)下的所述单链Fab片段经由在所述全长抗体的重链或轻链的C末端或N末端处的肽接头与a)下的所述全长抗体融合。
在一个方面中，结合第二抗原的一个或两个相同的单链Fab片段经由在所述全长抗体的重链或轻链的C末端处的肽接头与所述全长抗体融合。
在一个方面中，结合第二抗原的一个或两个相同的单链Fab(scFab)片段经由在所述全长抗体的重链的C末端处的肽接头与所述全长抗体融合。
在一个方面中，结合第二抗原的一个或两个相同的单链Fab(scFab)片段经由在所述全长抗体的轻链的C末端处的肽接头与所述全长抗体融合。
在一个方面中，结合第二抗原的两个相同的单链Fab(scFab)片段经由在所述全长抗体的每条重链或轻链的C末端处的肽接头与所述全长抗体融合。
在一个方面中，结合第二抗原的两个相同的单链Fab(scFab)片段经由在所述全长抗体的每条重链的C末端处的肽接头与所述全长抗体融合。
在一个方面中，结合第二抗原的两个相同的单链Fab(scFab)片段经由在所述全长抗体的每条轻链的C末端处的肽接头与所述全长抗体融合。
在一个方面中，双特异性抗体是三价抗体，其包含
a)全长抗体，所述全长抗体特异性结合第一抗原并由两条抗体重链和两条抗体轻链组成，
b)第一多肽，其由以下项组成：
ba)抗体重链可变结构域(VH)，或
bb)抗体重链可变结构域(VH)和抗体恒定结构域1(CH1)，
其中所述第一多肽以其VH结构域的N末端经由肽接头与所述全长抗体的两条重链中的一条的C末端融合，
c)第二多肽，其由以下项组成：
ca)抗体轻链可变结构域(VL)，或
cb)抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定结构域(CL)，
其中所述第二多肽以VL结构域的N末端经由肽接头与所述全长抗体的两条重链中的另一条的C末端融合，并且
其中第一多肽的抗体重链可变结构域(VH)和第二多肽的抗体轻链可变结构域(VL)一起形成特异性结合第二抗原的抗原结合结构域。
在一个方面中，b)下的多肽的抗体重链可变结构域(VH)和c)下的多肽的抗体轻链可变结构域(VL)通过在以下位置之间引入二硫键而经由链间二硫桥连接和稳定化：
(i)重链可变结构域44位至轻链可变结构域100位，或
(ii)重链可变结构域105位至轻链可变结构域43位，或
(iii)重链可变结构域101位至轻链可变结构域100位(总是根据Kabat EU索引编号)。
例如在WO 94/029350，Rajagopal,V.等人，Prot.Eng.(1997)1453-1459；Kobayashi,H.等人，Nucl.Med.Biol.25(1998)387-393；和Schmidt,M.等人，Oncogene 18(1999)1711-1721中描述了引入非天然二硫桥以用于稳定化的技术。在一个实施例中，b)和c)下多肽的可变结构域之间的任选二硫键在重链可变结构域44位与轻链可变结构域100位之间。在一个实施例中，b)和c)下多肽的可变结构域之间的任选二硫键在重链可变结构域105位与轻链可变结构域43位之间(总是根据Kabat编号)。在一个实施例中，在单链Fab片段的可变结构域VH与VL之间没有所述任选的二硫键稳定化的三价双特异性抗体是优选的。
在一个方面中，双特异性抗体是包含以下项的三特异性或四特异性抗体
a)特异性结合第一抗原的全长抗体的第一轻链和第一重链，以及
b)特异性结合第二抗原的全长抗体的第二(修饰的)轻链和第二(修饰的)重链，其中可变结构域VL和VH彼此替换，和/或其中恒定结构域CL和CH1彼此替换，并且
c)其中特异性结合一种或两种其他抗原(即第三种和/或第四种抗原)的一至四个抗原结合结构域经由肽接头与a)和/或b)的轻链或重链的C末端或N末端融合。
a)下的抗体不含有如b)下报道的修饰，并且a)下的重链和轻链是分离的链。
在一个方面中，在c)下三特异性或四特异性抗体包含特异性结合一种或两种其他抗原的一个或两个抗原结合结构域。
在一个方面中，抗原结合结构域选自由scFv片段和scFab片段组成的组。
在一个方面中，抗原结合结构域是scFv片段。
在一个方面中，抗原结合结构域是scFab片段。
在一个方面中，抗原结合结构域与a)和/或b)下的重链的C末端融合。
在一个方面中，在c)下三特异性或四特异性抗体包含特异性结合另一种抗原的一个或两个抗原结合结构域。
在一个方面中，在c)下三特异性或四特异性抗体包含特异性结合第三抗原的两个相同的抗原结合结构域。在一个优选的实施例中，此类两个相同的抗原结合结构域均经由相同的肽接头与a)和b)下的重链的C末端融合。在一个优选的实施例中，两个相同的抗原结合结构域是scFv片段或scFab片段。
在一个方面中，在c)下三特异性或四特异性抗体包含特异性结合第三和第四抗原的两个抗原结合结构域。在一个实施例中，所述两个抗原结合结构域经由相同的肽接头与a)和b)下的重链的C末端融合。在一个优选的实施例中，所述两个抗原结合结构域是scFv片段或scFab片段。
在一个方面中，双特异性抗体是双特异性的四价抗体，其包含
a)特异性结合第一抗原(并包含两个Fab片段)的抗体的两条轻链和两条重链，
b)特异性结合第二抗原的抗体的另外两个Fab片段，其中所述另外的Fab片段均经由肽接头与a)的重链的C末端或N末端融合，并且
其中在Fab片段中执行以下修饰
(i)在a)的两个Fab片段中，或在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，和/或恒定结构域CL和CH1彼此替换，或者
(ii)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，并且恒定结构域CL和CH1彼此替换，而在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，或恒定结构域CL和CH1彼此替换，或者
(iii)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，或恒定结构域CL和CH1彼此替换，而在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，并且恒定结构域CL和CH1彼此替换，或者
(iv)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，而在b)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1彼此替换，或者
(v)在a)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1彼此替换，而在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换。
在一个方面中，所述另外的Fab片段均经由肽接头与a)的重链的C末端或a)的重链的N末端融合。
在一个方面中，所述另外的Fab片段经由肽接头与a)的重链的C末端融合。
在一个方面中，所述另外的Fab片段经由肽接头与a)的重链的N末端融合。
在一个方面中，在Fab片段中，执行以下修饰：在a)的两个Fab片段中，或在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，和/或恒定结构域CL和CH1彼此替换。
在一个方面中，双特异性抗体是四价抗体，其包含：
a)特异性结合第一抗原并且包含第一VH-CH1结构域对的第一抗体的(经修饰的)重链，其中所述第一抗体的第二VH-CH1结构域对的N末端经由肽接头与所述重链的C末端融合，
b)a)的所述第一抗体的两条轻链，
c)特异性结合第二抗原并包含第一VH-CL结构域对的第二抗体的(经修饰的)重链，其中所述第二抗体的第二VH-CL结构域对的N末端经由肽接头与所述重链的C末端融合，以及
d)c)的所述第二抗体的两条(经修饰的)轻链，每条轻链包含CL-CH1结构域对。
在一个方面中，双特异性抗体包含
a)特异性结合第一抗原的第一全长抗体的重链和轻链，以及
b)特异性结合第二抗原的第二全长抗体的重链和轻链，其中所述重链的N末端经由肽接头连接至所述轻链的C末端。
a)下的抗体不含有如b)下报道的修饰，并且重链和轻链是分离的链。
在一个方面中，双特异性抗体包含
a)全长抗体，其特异性结合第一抗原并由两条抗体重链和两条抗体轻链组成；以及
b)特异性结合第二抗原的Fv片段，所述Fv片段包含VH2结构域和VL2结构域，其中所述两个结构域经由二硫桥相互连接，
其中只有VH2结构域或VL2结构域中的一者经由肽接头与特异性结合第一抗原的全长抗体的重链或轻链融合。
在双特异性抗体中，a)下的重链和轻链是分离的链。
在一个方面中，VH2结构域或VL2结构域中的另一个不经由肽接头与特异性结合第一抗原的全长抗体的重链或轻链融合。
在本文报道的所有方面中，第一轻链包含VL结构域和CL结构域，并且第一重链包含VH结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
在一个方面中，双特异性抗体是三价抗体，其包含
a)特异性结合第一抗原的两个Fab片段，
b)特异性结合第二抗原的一个CrossFab片段，在所述CrossFab片段中CH1和CL结构域彼此交换，
c)一个Fc区，其包含第一Fc区重链和第二Fc区重链，
其中两个Fab片段的CH1结构域的C末端连接到重链Fc区多肽的N末端，而其中CrossFab片段的CL结构域的C末端连接到Fab片段中的一个的VH结构域的N末端。
在一个方面中，双特异性抗体是三价抗体，其包含
a)特异性结合第一抗原的两个Fab片段，
b)特异性结合第二抗原的一个CrossFab片段，在所述CrossFab片段中CH1和CL结构域彼此交换，
c)一个Fc区，其包含第一Fc区重链和第二Fc区重链，
其中第一Fab片段的CH1结构域的C末端连接到重链Fc区多肽中的一个的N末端，并且CrossFab片段的CL结构域的C末端连接到另一重链Fc区多肽的N末端，而其中第二Fab片段的CH1结构域的C末端连接到第一Fab片段的VH结构域的N末端或连接到CrossFab片段的VH结构域的N末端。
在一个方面中，双特异性抗体包含
a)全长抗体，其特异性结合第一抗原并由两条抗体重链和两条抗体轻链组成；以及
b)特异性结合第二抗原的Fab片段，所述Fab片段包含构成重链片段和轻链片段的VH2结构域和VL2结构域，其中在所述轻链片段内，可变轻链结构域VL2被所述抗体的可变重链结构域VH2替换，而在所述重链片段内，可变重链结构域VH2被所述抗体的可变轻链结构域VL2替换。
其中重链Fab片段插入在所述全长抗体的重链中的一条的CH1结构域与所述全长抗体的相应Fc区之间，并且轻链Fab片段的N末端缀合至所述全长抗体的轻链的C末端，所述全长抗体的轻链与已插入所述重链Fab片段的所述全长抗体的重链配对。
在一个方面中，双特异性抗体包含
a)全长抗体，其特异性结合第一抗原并由两条抗体重链和两条抗体轻链组成；以及
b)特异性结合第二抗原的Fab片段，所述Fab片段包含构成重链片段和轻链片段的VH2结构域和VL2结构域，其中在所述轻链片段内，可变轻链结构域VL2被所述抗体的可变重链结构域VH2替换，而在所述重链片段内，可变重链结构域VH2被所述抗体的可变轻链结构域VL2替换，并且其中所述Fab片段的所述重链片段的C末端缀合至所述全长抗体的重链中的一条的N末端，并且所述Fab片段的所述轻链片段的C末端缀合至所述全长抗体的所述轻链的N末端，所述全长抗体的轻链与所述Fab片段的重链片段缀合至的所述全长抗体的重链配对。
多核苷酸
本发明还提供了编码如本文所述的双特异性抗体或其片段的分离的多核苷酸。
术语“核酸分子”或“多核苷酸”包括包含核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基组成，特别是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即脱氧核糖或核糖)和磷酸基团。通常，核酸分子通过碱基序列进行描述，由此所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基序列通常表示为从5'至3'。在本文中，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA)(包括例如互补DNA(cDNA)和基因组DNA)、核糖核酸(RNA)(特别是信使RNA(mRNA))、DNA或RNA的合成形式，以及包含这些分子中的两种或更多种的混合聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。此外，术语核酸分子包括有义链和反义链，以及单链和双链形式。此外，本文所描述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的示例包括具有衍生化的糖或磷酸主链键或经化学修饰的残基的经修饰的核苷酸碱基。核酸分子还涵盖适合作为用于本发明的抗体的体外和/或体内(例如，在宿主或患者体内)直接表达的载体的DNA和RNA分子。此类DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)载体可以是未修饰的或经修饰的。例如，可以对mRNA进行化学修饰以增强RNA载体的稳定性和/或编码分子的表达，使得可以将mRNA注射到受试者体内以产生体内抗体(参见例如Stadler等人，Nature Medicine 2017，2017年6月12日在线发表，doi:10.1038/nm.4356或EP 2 101 823 B1)。
“分离的”多核苷酸是指已经与其天然环境的组分分离的核酸分子。分离的多核苷酸包括这样的核酸分子，其包含在通常含有所述核酸分子的细胞中，但所述核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
编码本发明双特异性抗体的分离的多核苷酸可以表达为编码完整抗原结合分子的单个多核苷酸，或表达为共表达的多个(例如两个或更多个)多核苷酸。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以经由例如二硫键或其他手段缔合以形成功能性抗原结合分子。例如，免疫球蛋白的轻链部分可以由来自免疫球蛋白的重链部分的单独多核苷酸编码。当共表达时，重链多肽将与轻链多肽缔合以形成免疫球蛋白。
在一些方面中，分离的多核苷酸编码如本文所述的包含在根据本发明的双特异性抗体中的多肽。
在一个方面，本发明涉及编码双特异性抗体的分离的多核苷酸，所述双特异性抗体包含特异性结合程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)的第一抗原结合结构域和特异性结合淋巴细胞活化基因3(LAG3)的第二抗原结合结构域，其中特异性结合PD1的所述第一抗原结合结构域包含VH结构域，所述VH结构域包含(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，以及(iii)HVR-H3，其包含SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列；以及VL结构域，所述VL结构域包含(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，以及(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
B.重组方法
可以使用重组方法和组合物来产生抗体，例如，如在US 4,816,567中所述。对于这些方法，提供了编码抗体的一种或多种分离的核酸。
在天然抗体或天然抗体片段的情况下，需要两种核酸，一种用于轻链或其片段，一种用于重链或其片段。此类核酸编码构成抗体的VL的氨基酸序列和/或构成抗体的VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。这些核酸可以在相同的表达载体上或不同的表达载体上。在具有异源二聚重链的某些双特异性抗体的情况下，需要四种核酸，一种用于第一轻链，一种用于包含第一异单体(heteromonomeric)Fc区多肽的第一重链，一种用于第二轻链，并且一种用于包含第二异单体Fc区多肽的第二重链。四种核酸可包含在一种或多种核酸分子或表达载体中。例如，此类核酸编码构成抗体的第一VL的氨基酸序列和/或构成抗体的包含第一异单体Fc区的第一VH的氨基酸序列和/或构成抗体的第二VL的氨基酸序列和/或构成抗体的包含第二异单体Fc区的第二VH的氨基酸序列(例如抗体的第一轻链和/或第二轻链和/或第一重链和/或第二重链)。这些核酸可以在相同的表达载体上或在不同的表达载体上，通常这些核酸位于两个或三个表达载体上，即一个载体可以包含这些核酸中的多于一种。这些双特异性抗体的示例是CrossMabs和T细胞双特异性(参见例如Schaefer,W.等人，PNAS,108(2011)11187-1191)。例如，所述异单体重链中的一条包含所谓的“突起突变”(T366W，以及任选地S354C或Y349C中的一者)，并且所述异单体重链中的另一条包含所谓的“孔突变”(T366S、L368A和Y407V，以及任选地Y349C或S354C)(参见例如Carter,P.等人，Immunotechnol.2(1996)73)。
在一个方面中，提供了编码本文所述的双特异性抗体的分离的核酸。此类核酸可以编码构成分别特异性结合PD1和LAG3的抗原结合结构域的VL的氨基酸序列和/或构成所述抗原结合结构域的VH的氨基酸序列(例如在抗体的轻链和/或重链中)。在另一方面中，提供了包含此类核酸的一种或多种载体(例如表达载体)。在另一方面中，提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类方面，宿主细胞包含以下项(例如已被用以下转化)：(1)包含编码氨基酸序列的第一对核酸的第一载体和包含编码氨基酸序列的第二对核酸的第二载体，所述第一对核酸中的一个核酸包含抗体的第一VL，并且另一个核酸包含抗体的第一VH；所述第二对核酸中的一个核酸包含抗体的第二VL，并且另一个核酸包含抗体的第二VH，或者(2)包含编码氨基酸序列的第一核酸的第一载体、包含编码氨基酸序列的一对核酸的第二载体、以及包含编码氨基酸序列的一对核酸的第三载体，所述第一载体所包含的编码氨基酸序列的第一核酸包含可变结构域中的一者(优选轻链可变结构域)；所述第二载体所包含的编码氨基酸序列的一对核酸中的一个核酸包含轻链可变结构域，并且另一个核酸包含第一重链可变结构域；所述第三载体所包含的编码氨基酸序列的一对核酸中的一个核酸如在第二载体中一样包含相应的另一轻链可变结构域，并且另一个核酸包含第二重链可变结构域，或者(3)包含编码氨基酸序列的核酸的第一载体、包含编码氨基酸序列的核酸的第二载体、包含编码氨基酸序列的核酸的第三载体、以及包含编码氨基酸序列的核酸的第四载体，所述第一载体所包含的编码氨基酸序列的核酸包含抗体的第一VL，所述第二载体所包含的编码氨基酸序列的核酸包含抗体的第一VH，所述第三载体所包含的编码氨基酸序列的核酸包含抗体的第二VL，所述第四载体所包含的编码氨基酸序列的核酸包含抗体的第二VH。在一个方面中，宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个方面中，提供了一种制备双特异性抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达抗体的条件下培养包含如上提供的编码所述抗体的核酸的宿主细胞，以及任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收所述抗体。
对于如本文所述的包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域的双特异性抗体的重组产生，将例如如上所述的编码所述双特异性抗体的核酸分离并插入到一个或多个载体中以进行进一步克隆和/或在宿主细胞中表达。可以使用常规程序来容易地对此类核酸进行分离和测序(例如，通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。
用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。关于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如US5,648,237、US 5,789,199和US 5,840,523，(还参见Charlton,K.A.,在：Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo,B.K.C.(ed.),HumanaPress,Totowa,NJ(2003),第245-254页中，描述的抗体片段在大肠杆菌中的表达。)抗体可在表达后在可溶性级分中从细菌细胞糊中分离，并且可以进一步纯化。
除了原核生物外，诸如丝状真菌或酵母等真核微生物也是用于编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主，所述真核微生物包括这样的真菌和酵母菌株，其糖基化途径已经“人源化”，从而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；以及Li,H.等人，Nat.Biotech.24(2006)210-215。
用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞也来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的示例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出了可以与昆虫细胞结合使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的许多杆状病毒株。
植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利No.5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他示例是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾细胞系(如在例如Graham,F.L.等人，J.Gen Virol.36(1977)59-74中所述的293或293细胞)；小仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利氏细胞(例如在Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中描述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如例如在Mather,J.P.等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所述；MRC 5细胞；以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub,G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；以及骨髓瘤细胞系，诸如Y0、NS0和Sp2/0。关于适用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki,P.和Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo,B.K.C.(编辑)，Humana Press,Totowa,NJ(2004)，第255-268页。
C.测定
本文提供的包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域的双特异性抗体可通过本领域已知的各种测定来鉴定、筛选或表征其物理/化学性质和/或生物活性。
1.亲和力测定
本文提供的双特异性抗原结合分子、抗体和抗体片段对相应抗原的亲和力可以使用诸如
Figure BDA0004029792780000921
仪器(GE Healthcare)等标准仪器和诸如可通过重组表达获得的受体或靶蛋白，根据实例中阐述的方法通过表面等离子体共振(SPR)来确定。用于测量结合亲和力的特定说明性和示例性实施例描述于实例2、8或11中。根据一个方面，在25℃下使用
Figure BDA0004029792780000922
T100机器(GE Healthcare)通过表面等离子体共振来测量KD。
2.结合测定和其他测定
在一个方面中，例如通过诸如ELISA、蛋白质印迹等已知方法来测试本发明的双特异性抗体的抗原结合活性。本文提供的双特异性抗体与相应的重组抗原或与抗原表达细胞的结合可以通过如实例8或11中所述的ELISA来评估。
在又一个方面中，在结合测定中使用新鲜的外周血单核细胞(PBMC)来显示与诸如单核细胞、NK细胞和T细胞等不同外周血单核细胞(PBMC)的结合。
在另一个方面中，使用细胞二聚化测定来证明两种不同的受体PD1和LAG3的二聚化或最后结合/相互作用，所述两种不同的受体PD1和LAG3在与抗这两种靶的双特异性抗体连接或交联后与酶的两个片段在细胞质内融合。因此，单独仅一种受体显示为没有酶活性。对于这种特异性相互作用，两种受体的细胞质C末端单独地与报告酶的异源亚基融合。单独的单个酶亚基未显示出报告活性。然而，预期与两种受体的同时结合会导致这两种受体的局部胞质聚集，两个异源酶亚基的互补，并最终导致形成特异性和功能性的酶，该酶水解底物从而产生化学发光信号(实例11)。
3.活性测定
在一个方面中，提供了用于鉴定具有生物活性的包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域的双特异性抗体的测定。生物学活性可以包括例如增强不同免疫细胞(尤其是T细胞)的活化和/或增殖、免疫调节细胞因子(诸如IFNγ或TNF-α)的分泌、对PD1途径的阻断、对LAG3途径的阻断、对肿瘤细胞的杀伤的能力。还提供了在体内和/或体外具有此类生物活性的抗体。
在某些方面中，测试本发明的抗体的此类生物活性。在一个方面中，提供了免疫细胞测定，其测量来自一个个体(供体X)的淋巴细胞对来自另一个体(供体Y)的淋巴细胞的活化。混合淋巴细胞反应(MLR)可以证明阻断PD1途径对淋巴细胞效应细胞的影响。在存在或不存在本发明的双特异性抗体的情况下，测试测定中的T细胞的活化及其IFN-γ分泌。在实例9中更详细地描述了该测定。
D.免疫缀合物
本发明还提供免疫缀合物，其包含与一种或多种细胞毒性剂缀合的本发明的双特异性抗体，所述一种或多种细胞毒性剂为诸如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的蛋白质毒素、酶活性毒素，或它们的片段)，或放射性同位素。
E.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些方面中，本文提供的包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域的双特异性抗体中的任一者可用于检测生物样品中PD1和LAG3两者的存在。如本文所用的术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施例中，生物样品包括细胞或组织，诸如AML癌干细胞。
在一个方面中，提供了用于诊断或检测方法的双特异性抗体。在另一个方面中，提供了检测生物样品中PD1和LAG3的存在的方法。在某些实施例中，该方法包括在允许如本文所述的双特异性抗体与PD1和LAG3两者结合的条件下使生物样品与所述双特异性抗体接触，以及检测是否在双特异性抗体与这两种抗原之间形成了复合物。此类方法可以是体外或体内方法。在一个实施例中，使用双特异性抗体来选择有资格进行使用包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域的双特异性抗体的治疗的受试者，例如其中PD1和LAG3是用于选择患者的生物标志物。
在某些方面中，提供了标记的双特异性抗体。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(诸如荧光标记、发色标记、电子致密标记、化学发光标记，以及放射性标记)，以及间接(例如通过酶促反应或分子相互作用)检测的部分(诸如酶或配体)。示例性标记包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I；荧光团，诸如稀土螯合物或荧光素(fluorescein)及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、伞形酮；萤光素酶(luciferase)，例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利No.4,737,456)；萤光素(luciferin)；2,3-二氢二氮杂萘二酮(2,3-dihydrophthalazinedione)；辣根过氧化物酶(HRP)；碱性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖淀粉酶；溶菌酶；糖氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；杂环氧化酶，诸如尿酸氧化酶和黄嘌呤氧化酶；与采用过氧化氢来氧化染料前体的酶(诸如HRP、乳过氧化物酶，或微过氧化物酶)偶联；生物素/抗生物素蛋白；纺丝标记；噬菌体标记或稳定自由基。
F.药物组合物、制剂和施用途径
在又一方面中，本发明提供了药物组合物，其包含任一种本文提供的包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域的双特异性抗体，所述药物组合物例如用于任一种以下治疗方法。在一个实施例中，所述药物组合物包含任一种本文提供的双特异性抗体和至少一种药学上可接受的赋形剂。在另一实施例中，药物组合物包含任一种本文提供的双特异性抗体和例如如下所述的至少一种另外的治疗剂。
本发明的药物组合物包含溶解或分散在药学上可接受的赋形剂中的治疗有效量的一种或多种双特异性抗体。术语“药学上或药理学上可接受的”是指分子实体和组合物在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，即当视情况而定施用于动物(例如人)时不产生不利的、过敏的或其他不良反应。含有至少一种双特异性抗体和任选的附加活性成分的药物组合物的制备将是鉴于本公开而为本领域的技术人员已知的，如由Remington'sPharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company,1990所示例的，该文献以引用方式并入本文。具体地，该组合物是冻干制剂或水溶液。如本文所用，“药学上可接受的赋形剂”包括任何和所有溶剂、缓冲剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、盐、稳定剂以及它们的组合，正如对于本领域普通技术人员来说所知的。
肠胃外组合物包括设计用于通过注射施用的肠胃外组合物，所述注射为例如皮下、皮内、病灶内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射。对于注射，本发明的双特异性抗体可在水溶液中配制，优选在生理相容的缓冲液(诸如Hanks溶液、林格氏溶液，或生理盐水缓冲液)中配制。溶液可含有配制剂(formulatory agent)，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，双特异性抗体可以是粉末形式，用于在使用前用合适的媒介物(例如无菌无热原水)构建。根据需要，通过将本发明的融合蛋白以所需的量与下面列举的各种其他成分一起掺入适当的溶剂中，来制备无菌可注射溶液。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入含有基础分散介质和/或其他成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液、悬浮液或乳液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥或冻干技术，所述真空干燥或冻干技术产生来自先前无菌过滤的液体介质的活性成分加上任何附加所需成分的粉末。如果需要的话，液体介质应适当缓冲，并且在注射之前应首先使用足够的盐水或葡萄糖来使液体稀释剂等渗。该组合物必须是在制造和贮存条件下稳定的，并且保存为抗诸如细菌和真菌等微生物的污染作用。应当理解，内毒素污染应以例如低于0.5ng/mg蛋白质的安全水平保持最低。合适的药学上可接受的赋形剂包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的化合物，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、葡聚糖等。任选地，悬浮液还可含有合适的稳定剂或增大化合物溶解度的试剂，以允许制备高浓度溶液。另外，活性化合物的悬浮液可以制备成适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，诸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，诸如油酸乙酯或甘油三酯；或脂质体。
活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中；在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白、微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中；或在粗乳液中。此类技术在Remington'sPharmaceutical Sciences(第18版，Mack Printing Company,1990)中公开。可以制备缓释制备物。缓释制备物的合适示例包括含有多肽的固态疏水聚合物的半透性基质，所述基质是例如膜或微胶囊等成型制品的形式。在特定实施例中，可注射组合物的延长吸收可以通过在所述组合物中使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝、明胶或它们的组合)来实现。
本文的示例性药学上可接受的赋形剂还包括间质药物分散剂，诸如可溶中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20
Figure BDA0004029792780000961
Baxter International,Inc.)。某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20，描述于美国专利公开No.2005/0260186和2006/0104968中。在一个方面中，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶(诸如软骨素酶)组合。
示例性的冻干抗体制剂描述于美国专利No.6,267,958中。水性抗体制剂包括在美国专利No.6,171,586和WO2006/044908中描述的那些，后一者中的制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
除了先前描述的组合物之外，双特异性抗体也可以配制成长效制备物。此类长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内植入)或通过肌内注射施用。因此，例如，双特异性抗体可以用合适的聚合或疏水材料(例如配制成可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂配制，或配制成微溶衍生物(例如配制成微溶盐)。
包含本发明的双特异性抗体的药物组合物可借助于常规混合、溶解、乳化、包封、包埋或冻干过程来制造。药物组合物可以使用一种或多种生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂以常规方式配制，所述载体、稀释剂、赋形剂或助剂有助于将蛋白质加工成可以在药学上使用的制备物。适当的制剂取决于所选择的施用途径。
所述双特异性抗体可以配制成以游离酸或碱、中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐是基本上保留游离酸或碱的生物活性的盐。这些药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如用蛋白质组合物的游离氨基形成的酸加成盐，或用无机酸(诸如盐酸或磷酸)或有机酸(诸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸)形成的酸加成盐。用游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或者有机碱，诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因。与相应的游离碱形式相比，药用盐倾向于更易溶于水性和其他质子溶剂中。
本文的组合物还可含有多于一种对于所治疗的特定适应症是必需的活性成分，优选是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。此类活性成分适当地以对预期目的有效的量组合存在。
待用于体内施用的制剂通常是无菌的。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。
G.治疗方法和组合物
任一种本文提供的包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域的双特异性抗体可以在治疗方法中使用。
为了在所述治疗方法中使用，如本文先前所定义的包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域的双特异性抗体可以符合良好医疗实践的方式配制、定剂量并施用。在这种情况下需要考虑的因素包括所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排，以及执业医师已知的其他因素。
在一个方面中，提供了双特异性抗体，如本文所定义，所述双特异性抗体包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，所述双特异性抗体用作药物。在其他方面中，提供了双特异性抗体，如本文所定义，所述双特异性抗体包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，所述双特异性抗体用于治疗疾病，特别是用于治疗癌症。在某些实施例中，提供了双特异性抗体，所述双特异性抗体包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，所述双特异性抗体用于治疗方法中。在一个实施例中，本发明提供双特异性抗体，如本文所述，所述双特异性抗体包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，所述双特异性抗体用于治疗有需要的个体的疾病。在某些实施例中，本发明提供双特异性抗体，其包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域，所述双特异性抗体用于治疗具有疾病的个体的方法中，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的双特异性抗体。在某些实施例中，待治疗的疾病是癌症。在另一个方面，待治疗的疾病是传染性疾病，特别是慢性病毒感染，如HIV(人类免疫缺陷病毒)、HBV(乙型肝炎病毒)、HCV(丙型肝炎)、HSV1(单纯疱疹病毒1类)、CMV(巨细胞病毒)、LCMV(淋巴细胞性脑膜炎病毒)或EBV(爱泼斯坦巴尔病毒(Epstein-Barrvirus))。需要治疗的受试者、患者或“个体”通常是哺乳动物，更特别地是人。
在又一方面中，本发明提供了如本文先前所定义的包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域的双特异性抗体在制造或制备用于治疗有需要的个体的疾病的药物中的用途。在一个实施例中，所述药物用于治疗疾病的方法中，所述方法包括向具有所述疾病的个体施用治疗有效量的所述药物。
在某些方面中，待治疗的疾病是增殖性疾患，特别地是癌症。癌症的示例包括膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌，以及肾癌。可使用根据本发明的包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域的双特异性抗体治疗的其他细胞增殖性疾病包括但不限于位于腹部、骨骼、乳房、消化系统、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼睛、头颈部、神经系统(中枢神经系统和外周神经系统)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸部和泌尿生殖系统中的肿瘤。还包括癌前病症或病变和癌转移。在某些方面中，癌症选自由以下项组成的组：肾细胞癌、皮肤癌、肺癌、结直肠癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌。在其他方面中，癌症选自癌、淋巴瘤(例如，霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤)、母细胞瘤、肉瘤和白血病。在另一方面中，待治疗的癌症选自鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(livercancer)、膀胱癌、肝癌(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、白血病和其他淋巴组织增生性疾患，以及各种类型的头颈癌。
在另一方面中，待治疗的疾病是感染性疾病，特别是慢性病毒感染。术语“慢性病毒感染”是指受试者承受慢性病毒或被慢性病毒感染。慢性病毒感染的示例是人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒感染(HBV)、丙型肝炎病毒感染(HCV)、单纯疱疹病毒1(HSV1)、巨细胞病毒(CMV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)或爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)。
本领域技术人员容易地认识到，在许多情况下，双特异性分子可能无法提供治愈，而仅可以提供部分益处。在一些实施例中，具有一些益处的生理变化也被认为是治疗上有益的。因此，在一些实施例中，提供生理变化的双特异性抗体的量被认为是“有效量”或“治疗有效量”。
在又一方面中，本发明提供了一种用于治疗个体的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的本发明的包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域的双特异性抗体。在一个实施例中，向所述个体施用组合物，所述组合物包含药学上可接受形式的本发明的双特异性抗体。在某些实施例中，待治疗的疾病是增殖性疾病。在一个特定实施例中，所述疾病是癌症。在某些实施例中，如果待治疗的疾病是癌症，则所述方法还包括向所述个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如抗癌剂。在另一个方面中，所述疾病是慢性病毒感染。根据上述实施例中的任一实施例的“个体”可以是哺乳动物，优选地是人。
为了预防或治疗疾病，本发明的包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域的双特异性抗体(当单独使用或与一种或多种附加治疗剂组合使用时)的适当剂量将取决于待治疗疾病的类型、施用途径、患者体重、融合蛋白的类型、疾病的严重程度和进程、双特异性抗体是出于预防还是治疗目的而施用、先前或同时进行的治疗性干预、患者的临床病史和对融合蛋白的反应，以及主治医师的判断力。在任何情况下，负责施用的执业者将针对个体受试者来确定组合物中活性成分的浓度和适当剂量。本文考虑了各种投配时间安排，包括但不限于在各个时间点处的单次或多次施用、推注施用，以及脉冲输注。
如本文所定义的包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域的双特异性抗体在一个时刻或在一系列治疗中被适当地施用于患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的双特异性抗体可以是例如通过一次或多次单独施用或通过连续输注而施用于患者的初始候选剂量。取决于上述因素，一种典型的日剂量的范围可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病症，治疗通常会持续直至发生所需的疾病症状抑制。双特异性抗体的一种示例性剂量的范围为约0.005mg/kg至约10mg/kg。在其他示例中，剂量还可包括每次施用约1μg/kg体重、约5μg/kg体重、约10μg/kg体重、约50μg/kg体重、约100μg/kg体重、约200μg/kg体重、约350μg/kg体重、约500μg/kg体重、约1mg/kg体重、约5mg/kg体重、约10mg/kg体重、约50mg/kg体重、约100mg/kg体重、约200mg/kg体重、约350mg/kg体重、约500mg/kg体重至约1000mg/kg体重或更多，以及其中可推导出的任何范围。在从本文所列数字可推导出的范围的示例中，可以基于上述数字施用约5mg/kg体重至约100mg/kg体重、约5μg/kg体重至约500mg/kg体重等的范围。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg(或它们的任何组合)的一种或多种剂量。此类剂量可以间歇地施用，例如每周或每三周施用(例如，使得患者接受约2至约20或例如约6个剂量的融合蛋白)。可施用初始较高负荷剂量，然后施用一种或多种较低剂量。然而，其他剂量方案可能有用。该疗法的进展通过常规技术和测定而容易地监测。
如本文所定义的包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域的双特异性抗体通常以有效实现预期目的的量使用。为了用于治疗或预防疾病病症，本发明的双特异性抗体或其药物组合物以治疗有效量施用或施加。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文提供的详细公开内容。
对于全身施用，最初可以根据体外测定(诸如细胞培养测定)来估计治疗有效剂量。可以随后在动物模型中配制剂量，以实现包括如在细胞培养中测定的IC50循环浓度范围。此类信息可用于更准确地确定对人类的有用剂量。
还可以使用本领域熟知的技术来根据体内数据(例如动物模型)估计初始剂量。本领域普通技术人员可以基于动物数据来容易地优化对人的施用。
剂量和间隔可以单独地调节，以提供足以维持疗效的血浆双特异性抗体水平。通过注射施用的常用患者剂量的范围是约0.1至50mg/kg/天，通常约0.5至1mg/kg/天。通过每天施用多个剂量可以实现治疗有效的血浆水平。可以例如通过HPLC来测量血浆中的水平。
在局部施用或选择性摄入的情况下，双特异性抗体的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域技术人员将能够在无需过多实验的情况下优化治疗有效的局部剂量。
本文所描述的治疗有效剂量的双特异性抗体通常将在不会引起显著毒性的情况下提供治疗益处。融合蛋白的毒性和治疗功效可通过细胞培养或实验动物中的标准药学程序来测定。细胞培养测定和动物研究可以用于测定LD50(致死群体的50％的剂量)和ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)毒性和疗效之间的剂量比是治疗指数，所述治疗指数可以表示为比率LD50/ED50。表现出大治疗指数的双特异性抗体是优选的。在一个实施例中，根据本发明的双特异性抗体表现出高治疗指数。从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制适用于人类的一系列剂量。剂量优选在包括毒性很小或没有毒性的ED50的循环浓度范围内。剂量可以取决于多种因素而在该范围内变化，所述多种因素为例如所采用的剂型、所利用的施用途径、受试者的病症等。确切的配方、施用途径和剂量可以由个别医生根据患者的病症来选择(参见例如Fingl等人，1975，在：The Pharmacological Basis ofTherapeutics，第1章，第1页中，该文献的全部内容以引用方式并入本文中)。
用本发明的双特异性抗体治疗的患者的主治医师将知道如何以及何时由于毒性、器官功能障碍等终止、中断或调节施用。相反地，如果临床反应不充分(排除毒性)，则主治医师也会知道将治疗调节到更高水平。在感兴趣的病症的管理中施用的剂量的大小将随着待治疗病症的严重程度、施用途径等而变化。例如，可以部分地通过标准预后评估方法来评估病症的严重性。此外，剂量和可能的剂量频率也将根据个体患者的年龄、体重和反应而变化。
其他药剂和治疗
如本文先前所述的包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域的双特异性抗体可在治疗中与一种或多种其他药剂组合施用。例如，本发明的双特异性抗体可与至少一种附加治疗剂共同施用。术语“治疗剂”包括可以施用用于治疗需要此类治疗的个体的症状或疾病的任何药剂。此类附加治疗剂可包含适合于所治疗的具体适应症的任何活性成分，优选地是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。在某些实施例中，附加治疗剂是另一种抗癌剂。
在本发明的一个方面中，如本文所述的包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域的双特异性抗体或包含所述双特异性抗体的药物组合物用于预防或治疗癌症，其中所述双特异性抗体与化学治疗剂、放射和/或用于癌症免疫疗法的其他药剂联合施用。
在本发明的一个特定方面中，如本文所述的包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域的双特异性抗体或包含所述双特异性抗体的药物组合物用于预防或治疗癌症，其中所述双特异性抗体与T细胞活化抗CD3双特异性抗体，特别是抗CEA/抗CD3双特异性抗体联合施用。在一个方面中，抗CEA/抗CD3双特异性抗体是T细胞活化抗CD3双特异性抗体，其包含第二抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域包含(a)重链可变区(VHCEA)和/或轻链可变区(VLCEA)，所述重链可变区包含CDR-H1(SEQID NO:154所示的序列)、CDR-H2(SEQ ID NO:155所示的序列)和CDR-H3(SEQ ID NO:156所示的序列)，所述轻链可变区包含CDR-L1(SEQ ID NO:157所示的序列)、CDR-L2(SEQ ID NO:158所示的序列)和CDR-L3(SEQ IDNO:159所示的序列)；或者(b)重链可变区(VHCEA)和/或轻链可变区(VLCEA)，所述重链可变区包含CDR-H1(SEQ ID NO:162所示的序列)、CDR-H2(SEQ ID NO:163所示的序列)和CDR-H3(SEQ ID NO:164所示的序列)，所述轻链可变区包含CDR-L1(SEQ ID NO:165所示的序列)、CDR-L2(SEQ ID NO:166所示的序列)和CDR-L3(SEQIDNO:167所示的序列)。在一个方面中，抗CEA/抗CD3双特异性抗体是T细胞活化抗CD3双特异性抗体，其包含含有SEQ ID NO:160所示氨基酸序列的重链可变区(VHCEA)，和/或含有SEQ ID NO:161所示氨基酸序列的轻链可变区(VLCEA)，或含有第二抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:168所示氨基酸序列的重链可变区(VHCEA)和/或含有SEQ ID NO:169所示氨基酸序列的轻链可变区(VLCEA)。
在另一方面中，抗CEA/抗CD3双特异性抗体包含Fc结构域，所述Fc结构域包含减少与Fc受体的结合和/或降低效应子功能的一个或多个氨基酸取代。具体地，抗CEA/抗CD3双特异性抗体包含IgG1 Fc结构域，所述IgG1 Fc结构域包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G。
在一个特定方面中，抗CEA/抗CD3双特异性抗体包含与SEQ ID NO:146所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％一致的多肽，与SEQ ID NO:147所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％一致的多肽，与SEQ ID NO:148所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％一致的多肽，以及与SEQ ID NO:149所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％一致的多肽。在又一具体实施例中，双特异性抗体包含SEQ ID NO:146所示的多肽序列、SEQ ID NO:147所示的多肽序列、SEQ ID NO:148所示的多肽序列和SEQ ID NO:149所示的多肽序列(CEA CD3 TCB)。
在另一个特定方面中，抗CEA/抗CD3双特异性抗体包含与SEQ IDNO:150所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％一致的多肽，与SEQ ID NO:151所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％一致的多肽，与SEQ ID NO:152所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％一致的多肽，以及与SEQ ID NO:153所示的序列至少95％、96％、97％、98％或99％一致的多肽。在又一具体实施例中，双特异性抗体包含SEQ ID NO:150所示的多肽序列、SEQ ID NO:151所示的多肽序列、SEQ IDNO:152所示的多肽序列和SEQ ID NO:153所示的多肽序列(CEACAM5CD3 TCB)。
在另一个方面中，提供了一种药物组合物，其包含如本文所述的包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域的双特异性抗体，以及T细胞活化抗CD3双特异性抗体，特别是抗CEA/抗CD3双特异性抗体。在一个特定方面中，该药物组合物用于联合、顺序或同时治疗疾病，特别是用于治疗癌症。更具体地，该组合物用于治疗实体瘤。
在另一个方面中，本发明提供了一种治疗个体的癌症或延缓个体的癌症进展的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的如本文所述的包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域的双特异性抗体与T细胞活化抗CD3双特异性抗体，特别是抗CEA/抗CD3双特异性抗体或抗FolR1/抗CD3双特异性抗体的组合。
此类其他药剂适当地以对预期目的有效的量组合存在。此类其他药剂的有效量取决于所用融合蛋白的量、病症或治疗的类型，以及上面讨论的其他因素。所述双特异性抗体通常以与本文所述相同的剂量和施用途径，或本文所述剂量的约1％至99％，或以任何剂量且通过经验/临床上确定为合适的途径使用。
上述此类联合疗法涵盖联合施用(其中两种或更多种治疗剂被包含在同一组合物或分开的组合物中)，以及分开施用，在分开施用的情况下，双特异性抗体的施用可以在施用附加治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后发生。
H.制品
在本发明的另一个方面中，提供了一种制品，其含有可用于治疗、预防和/或诊断上述疾患的物质。所述制品包括容器和在所述容器上或与所述容器相关的标签或包装插页(package insert)。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、静脉注射(IV)溶液袋等。所述容器可以由诸如玻璃或塑料等多种材料形成。所述容器容纳组合物，所述组合物单独或与另一种有效用于治疗、预防和/或诊断所述病症的组合物组合，并且所述容器可具有无菌入口(例如所述容器可以是静脉注射溶液袋或具有可用皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。所述组合物中的至少一种活性剂是如本文先前所定义的包含特异性结合PD1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域的双特异性抗体。
标签或包装插页指示该组合物用于治疗所选择的病症。此外，所述制品可包括(a)第一容器，所述第一容器中含有包含本发明的双特异性抗体的组合物；以及(b)第二容器，所述第二容器中含有包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂组合物。本发明该实施例中的制品还可包含包装插页，所述包装插页指示所述组合物可用于治疗特定病症。
替代地或另外地，所述制品还可包括第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包括药学上可接受的缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。所述制品还可包括从商业和用户角度所需的其他物质，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
表C(序列)：
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Figure BDA0004029792780001431
以下编号的段落描述了本发明的各方面：
1.一种双特异性抗体，其包含特异性结合程序性细胞死亡蛋白1(PD1)的第一抗原结合结构域和特异性结合淋巴细胞活化基因-3(LAG3)的第二抗原结合结构域，其中
特异性结合PD1的所述第一抗原结合结构域包含
VH结构域，其包含
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；以及
VL结构域，其包含
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
2.根据段落1所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含Fc结构域，所述Fc结构域是IgG，特别是IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域，并且其中所述Fc结构域包含减少与Fc受体，特别是与Fcγ受体结合的一个或多个氨基酸取代。
3.根据段落1或2所述的双特异性抗体，其中特异性结合LAG3的所述第二抗原结合结构域包含
(a)VH结构域，其包含
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列；以及
VL结构域，其包含
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列；或者
(b)VH结构域，其包含
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；以及
VL结构域，其包含
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列；或者
(c)VH结构域，其包含
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列；以及
VL结构域，其包含
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列；或者
(d)VH结构域，其包含
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列；以及
VL结构域，其包含
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列；或者
(e)VH结构域，其包含
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列；以及
VL结构域，其包含
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列。
4.根据段落1至3中任一项所述的双特异性抗体，其中特异性结合PD1的所述第一抗原结合结构域包含
(a)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或者
(b)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，或者
(c)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，或者
(d)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，或者
(e)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
5.根据段落1至4中任一项所述的双特异性抗体，其中特异性结合LAG3的所述第二抗原结合结构域包含
(a)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，或者
(b)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列，或者
(c)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列，或者
(d)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列，或者
(e)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列。
6.根据段落1至4中任一项所述的双特异性抗体，其中特异性结合LAG3的所述第二抗原结合结构域包含
(a)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列，或者
(b)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列，或者
(c)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列，或者
(d)VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列。
7.根据段落1至5中任一项所述的双特异性抗体，其中
所述特异性结合PD1的第一抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，并且所述特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列且所述VL结构域包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，或者所述VH结构域包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列且所述VL结构域包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列。
8.根据段落1至5中任一项所述的双特异性抗体，其中
所述特异性结合PD1的第一抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，并且所述特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。
9.根据段落1至4或6中任一项所述的双特异性抗体，其中
所述特异性结合PD1的第一抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，并且所述特异性结合LAG3的第二抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列。
10.根据段落1至5中任一项所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体是人源化抗体或嵌合抗体。
11.根据段落1至10中任一项所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含人IgG1亚类的Fc结构域，所述Fc结构域具有氨基酸突变L234A、L235A和P329G(根据Kabat EU索引编号)。
12.根据段落1至11中任一项所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含Fc结构域，所述Fc结构域包含促进所述Fc结构域的第一和第二亚基缔合的修饰。
13.根据段落1至12中任一项所述的双特异性抗体，其中所述Fc结构域的第一亚基包含突起，并且所述Fc结构域的第二亚基包含根据突起入孔方法的孔。
14.根据段落1至13中任一项所述的双特异性抗体，其中所述Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W(EU编号)，并且所述Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
15.根据段落1至14中任一项所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含Fc结构域、第一Fab片段和第二Fab片段，所述第一Fab片段包含特异性结合PD1的所述抗原结合结构域，所述第二Fab片段包含特异性结合LAG3的所述抗原结合结构域。
16.根据段落1至15中任一项所述的双特异性抗体，其中在所述Fab片段中的一个中，所述可变结构域VL和VH彼此替换，使得所述VH结构域是所述轻链的一部分而所述VL结构域是所述重链的一部分。
17.根据段落15或16所述的双特异性抗体，其中在包含特异性结合PD1的所述抗原结合结构域的所述第一Fab片段中，所述可变结构域VL和VH彼此替换。
18.根据段落1至17中任一项所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含Fab片段，其中在所述恒定结构域CL中，124位处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)，而在所述恒定结构域CH1中，147位和213位处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)。
19.根据段落15至18中任一项所述的双特异性抗体，其中在包含特异性结合LAG3的所述抗原结合结构域的所述第二Fab片段中，在所述恒定结构域CL中，124位处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)，而在所述恒定结构域CH1中，147位和213位处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)。
20.根据段落1至19中任一项所述的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含
(a)第一重链、第一轻链、第二重链和第二轻链，所述第一重链包含与SEQ ID NO:96所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第一轻链包含与SEQ ID NO:98所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二重链包含与SEQ ID NO:97所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二轻链包含与SEQID NO:99所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，或者
(b)第一重链、第一轻链、第二重链和第二轻链，所述第一重链包含与SEQ ID NO:96所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第一轻链包含与SEQ ID NO:98所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二重链包含与SEQ ID NO:100所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二轻链包含与SEQID NO:101所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，或者(c)第一重链、第一轻链、第二重链和第二轻链，所述第一重链包含与SEQ ID NO:102所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第一轻链包含与SEQ ID NO:104所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二重链包含与SEQ ID NO:103所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二轻链包含与SEQID NO:105所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，或者(d)第一重链、第一轻链、第二重链和第二轻链，所述第一重链包含与SEQ IDNO:106所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第一轻链包含与SEQ IDNO:107所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二重链包含与SEQ IDNO:103所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二轻链包含与SEQIDNO:105所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列。
21.根据段落1至19中任一项所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含第三Fab片段，所述第三Fab片段包含特异性结合LAG3的抗原结合结构域。
22.根据段落1至19或21中任一项所述的双特异性抗体，其中各自包含特异性结合LAG3的抗原结合结构域的所述两个Fab片段是相同的。
23.根据段落1至19或21或22中任一项所述的双特异性抗体，其中包含特异性结合PD1的抗原结合结构域的所述Fab片段经由肽接头与所述重链中的一条的C末端融合。
24.根据段落1至19或21至23中任一项所述的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含
(a)第一重链、第一轻链、第二重链和第二轻链，所述第一重链包含与SEQ ID NO:118所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第一轻链包含与SEQ ID NO:115所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二重链包含与SEQ ID NO:119所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二轻链包含与SEQID NO:101所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，或者(b)第一重链、第一轻链、第二重链和第二轻链，所述第一重链包含与SEQ ID NO:120所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第一轻链包含与SEQ ID NO:115所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二重链包含与SEQ ID NO:121所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二轻链包含与SEQID NO:99所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，或者
(c)第一重链、第一轻链、第二重链和第二轻链，所述第一重链包含与SEQ ID NO:122所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第一轻链包含与SEQ ID NO:115所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二重链包含与SEQ ID NO:103所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二轻链包含与SEQID NO:105所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列。
25.根据段落1至19或21至23中任一项所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含第四Fab片段，所述第四Fab片段包含特异性结合PD1的抗原结合结构域。
26.根据段落1至19或21至23或25中任一项所述的双特异性抗体，其中各自包含特异性结合PD1的抗原结合结构域的所述两个Fab片段是相同的。
27.根据段落1至19或21至23或25或26中任一项所述的双特异性抗体，其中各自包含特异性结合PD1的抗原结合结构域的所述两个Fab片段各自分别经由肽接头与所述重链中的一条的C末端融合。
28.根据段落1至19或21至23或25至27中任一项所述的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含
(a)两条重链、两条第一轻链和两条第二轻链，所述两条重链均包含与SEQ ID NO:114所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述两条第一轻链均包含与SEQID NO:115所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述两条第二轻链均包含与SEQ ID NO:101所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，或者
(b)两条重链、两条第一轻链和两条第二轻链，所述两条重链均包含与SEQ ID NO:116所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述两条第一轻链均包含与SEQID NO:115所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述两条第二轻链均包含与SEQ ID NO:99所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，或者
(c)两条重链、两条第一轻链和两条第二轻链，所述两条重链均包含与SEQ ID NO:117所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述两条第一轻链均包含与SEQID NO:115所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述两条第二轻链包含与SEQ ID NO:105所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列。
29.根据段落1至14中任一项所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含Fc结构域、两个Fab片段和单链Fab(scFab)，所述两个Fab片段各自包含特异性结合LAG3的抗原结合结构域，所述单链Fab(scFab)包含特异性结合PD1的抗原结合结构域。
30.根据段落1至14或29中任一项所述的双特异性抗体，其中包含特异性结合PD1的抗原结合结构域的所述scFab经由肽接头与所述重链中的一条的C末端融合。
31.根据段落1至14或29或30中任一项所述的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含
(a)第一重链、第二重链和两条轻链，所述第一重链包含与SEQ ID NO:
123所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二重链包含与SEQID NO:119所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述两条轻链均包含与SEQID NO:101所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，或者
(b)第一重链、第二重链和两条轻链，所述第一重链包含与SEQ IDNO:124所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二重链包含与SEQ ID NO:121所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述两条轻链均包含与SEQ ID NO:99所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，或者
(c)第一重链、第二重链和第二轻链，所述第一重链包含与SEQ ID NO:
125所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二重链包含与SEQID NO:103所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二轻链包含与SEQID NO:105所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列。
32.根据段落1至14中任一项所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含Fc结构域、两个Fab片段和VH和VL结构域，所述两个Fab片段各自包含特异性结合LAG3的抗原结合结构域，所述VH和VL结构域包含特异性结合PD1的抗原结合结构域。
33.根据段落1至14或32中任一项所述的双特异性抗体，其中特异性结合PD1的抗原结合结构域的所述VH结构域经由肽接头与所述重链中的一条的C末端融合，而特异性结合PD1的抗原结合结构域的所述VL结构域经由肽接头与所述重链中的另一条的C末端融合。
34.根据段落1至14或32或33中任一项所述的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含第一重链、第二重链和两条轻链，所述第一重链包含与SEQ ID NO:126所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述第二重链包含与SEQ ID NO:127所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，所述两条轻链各自包含与SEQ ID NO:109所示的序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列。
35.一种多核苷酸，其编码根据段落1至34中任一项所述的双特异性抗体。
36.一种载体，特别是表达载体，其包含根据段落35所述的多核苷酸。
37.一种原核或真核宿主细胞，其包含根据段落35所述的多核苷酸或根据段落36所述的载体。
38.一种产生根据段落1至34所述的双特异性抗体的方法，所述方法包括在适于表达所述双特异性抗体的条件下培养根据段落37所述的宿主细胞，以及从所述培养物中回收所述双特异性抗体。
39.一种药物组合物，其包含根据段落1至34中任一项所述的双特异性抗体和至少一种药学上可接受的赋形剂。
40.根据段落1至34中任一项所述的双特异性抗体或根据段落39所述的药物组合物，所述双特异性抗体或所述药物组合物用作药物。
41.根据段落1至34中任一项所述的双特异性抗体或根据段落39所述的药物组合物，所述双特异性抗体或所述药物组合物用于
i)调节免疫应答，诸如恢复T细胞活性，
ii)刺激T细胞应答，
iii)治疗感染，
iv)治疗癌症，
v)延缓癌症发展，
vi)延长癌症患者的存活期。
42.根据段落1至34中任一项所述的双特异性抗体或根据段落39所述的药物组合物，所述双特异性抗体或所述药物组合物用于预防或治疗癌症。
43.根据段落1至34中任一项所述的双特异性抗体或根据段落39所述的药物组合物，所述双特异性抗体或所述药物组合物用于治疗慢性病毒感染。
44.根据段落1至34中任一项所述的双特异性抗体或根据段落39所述的药物组合物，所述双特异性抗体或所述药物组合物用于预防或治疗癌症，其中所述双特异性抗体与化学治疗剂、放射物和/或用于癌症免疫疗法的其他试剂联合施用。
45.一种抑制个体中肿瘤细胞生长的方法，其包括向所述个体施用有效量的根据段落1至34中任一项所述的双特异性抗体以抑制所述肿瘤细胞的生长。
实例
以下是本发明的方法和组合物的实例。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实践各种其他实施例。
材料和一般方法
关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息给出于：Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中。根据如上所定义的根据Kabat(Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))的编号系统来对抗体链的氨基酸进行编号和引用。
重组DNA技术
使用标准方法来操纵DNA，如在Sambrook,J.等人，Molecular Cloning:Alaboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NewYork,1989中所述。根据制造商的说明来使用分子生物学试剂。
基因合成
从通过化学合成制得的寡核苷酸来制备所需的基因区段。侧翼为单一限制性内切核酸酶切割位点的600-1800bp长的基因区段，通过退火和连接寡核苷酸(包括PCR扩增)而装配，并随后基于pGA4克隆载体，经由指定的限制性位点(例如KpnI/SacI或AscI/PacI)克隆到pPCRScript(Stratagene)中。通过DNA测序来确认亚克隆基因片段的DNA序列。根据Geneart(Regensburg，Germany)的给定规格对基因合成片段进行排序。
DNA序列测定
通过在MediGenomix GmbH(Martinsried，Germany)或Sequiserve GmbH(Vaterstetten，Germany)处执行的双链测序来确定DNA序列。
DNA和蛋白质序列分析及序列数据管理
使用GCG(Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin)的软件包10.2版和Infomax的Vector NT1 Advance套件8.0版来进行序列创建、图谱绘制、分析、注释和说明。
表达载体
为了表达所述抗体，应用了基于具有或不具有CMV-内含子A启动子的cDNA组织或基于具有CMV启动子的基因组组织的用于瞬时表达(例如在HEK293中)细胞的表达质粒的变体。
除抗体表达盒外，载体还包含：
-复制起点，其允许在大肠杆菌中进行该质粒的复制，以及
-β-内酰胺酶基因，其赋予大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性。
抗体基因的转录单位由以下元件组成：
-5’端的独特限制性位点，
-来自人巨细胞病毒的即刻早期增强子和启动子，
-在cDNA组织的情况下，之后是内含子A序列，
-人抗体基因的5'非翻译区，
-免疫球蛋白重链信号序列，
-人抗体链(野生型或具有结构域交换)，该人抗体链作为cDNA或作为具有免疫球蛋白外显子-内含子组织的基因组组织
-具有多腺苷酸化信号序列的3'非翻译区，以及
-3'端的独特限制性位点。
通过PCR和/或基因合成产生包含如下所述的抗体链的融合基因，并将所述融合基因通过已知的重组方法和技术，通过例如使用相应载体中的独特限制性位点连接相应的核酸区段来进行装配。通过DNA测序来验证亚克隆的核酸序列。为了进行瞬时转染，通过质粒制备从转化的大肠杆菌培养物制备较大量的质粒(Nucleobond AX,Macherey-Nagel)。
细胞培养技术
使用如在Current Protocols in Cell Biology(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.和Yamada,K.M.(编辑)，John Wiley&Sons,Inc中所述的标准细胞培养技术。
如下所述，通过在贴壁生长的HEK293-EBNA细胞中或在悬浮生长的HEK29-F细胞中瞬时共转染相应的表达质粒来表达多特异性抗体。
HEK293系统中的瞬时转染
通过使用Freestyle系统(ThermoFisher)瞬时转染293F细胞来产生所有抗体和双特异性抗体。在此将293F细胞在F17培养基中培养，用293Free(Novagene)转染，并在4小时后饲以VPA 4mM和Feed 7，且在16h后饲以0.6％的葡萄糖。此外，使用Expi293FTM表达系统试剂盒(ThermoFisher)。在此，将Expi293FTM细胞在Expi293TM表达培养基中培养，并根据制造商的说明使用ExpiFectamineTM293转染试剂盒进行转染。由于在CH1/CL界面中具有额外引入的带电氨基酸对(关于进一步细节，参见相应序列中的位置)的CrossMAbVh-VL双特异性抗体的改善的稳定性和纯度以及降低的聚集倾向，所以没有对质粒比进行调节。因此，使用针对1+1CrossM的相对质粒比1:1:1:1或针对2+2CrossMab的相对质粒比1:1:1来共转染LC质粒、HC质粒、交叉LC质粒和交叉HC质粒。7天后收获细胞上清液，并通过标准方法纯化。
蛋白质测定
通过使用根据Pace等人，Protein Science,1995,4,2411-1423的基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数测定280nm处的光密度(OD)，来确定纯化的抗体和衍生物的蛋白质浓度。
上清液中的抗体浓度测定
通过用蛋白A琼脂糖珠粒(罗氏(Roche))进行免疫沉淀来估计细胞培养物上清液中抗体和衍生物的浓度。将60μL蛋白A琼脂糖珠粒在TBS-NP40(50mM Tris，pH 7.5，150mMNaCl、1％ Nonidet-P40)中洗涤三次。随后，将1-15mL的细胞培养上清液施加至在TBS-NP40中预平衡的蛋白A琼脂糖珠粒。在室温下孵育1小时后，将珠粒在Ultrafree-MC-过滤器柱(Amicon)上用0.5mL TBS-NP40洗涤一次，用0.5mL 2×磷酸盐缓冲盐水(2×PBS，罗氏)洗涤两次，并用0.5mL pH 5.0的100mM柠檬酸钠短暂洗涤四次。通过添加35μl的
Figure BDA0004029792780001571
LDS样品缓冲液(Invitrogen)来洗脱结合的抗体。将一半样品分别与/>
Figure BDA0004029792780001572
样品还原剂混合或保持不还原，并在70℃下加热10分钟。由此，将5-30μl施加至4-12％/>
Figure BDA0004029792780001573
Bis-Tris SDS-PAGE(Invitrogen)(使用MOPS缓冲液进行非还原SDS-PAGE，并使用具有
Figure BDA0004029792780001574
抗氧化剂电泳缓冲液添加剂(Invitrogen)的MES缓冲液进行还原SDS-PAGE)，并用考马斯蓝染色。
通过亲和HPLC色谱法定量地测量细胞培养上清液中的抗体和衍生物的浓度。简而言之，将含有与蛋白质A结合的抗体和衍生物的细胞培养物上清液施加至200mM KH2PO4、100mM柠檬酸钠，pH 7.4中的Applied Biosystems Poros A/20柱，并在Agilent HPLC 1100系统上用200mM NaCl、100mM柠檬酸，pH 2.5从基质中洗脱。通过UV吸光度和峰面积积分来定量洗脱的蛋白质。将纯化的标准IgG1抗体用作标准品。
或者，通过Sandwich-IgG-ELISA测量细胞培养物上清液中抗体和衍生物的浓度。简而言之，将StreptaWell High Bind Strepatavidin A-96孔微量滴定板(罗氏)用100μL/孔的0.1μg/mL的生物素化的抗人IgG捕获分子F(ab’)2<h-Fcγ>BI(Dianova)在室温下包被1小时或在4℃下包被过夜，随后用200μL/孔的PBS、0.05％的吐温(PBST，Sigma)洗涤三次。将100μL/孔的含有相应抗体的PBS(Sigma)稀释系列的细胞培养上清液加入到孔中，并在室温下在微量滴定板振荡器上孵育1-2小时。将孔用200μL/孔的PBST洗涤三次，并用100μl0.1μg/mL的F(ab’)2<hFcγ>POD(Dianova)作为检测抗体，在室温下在微量滴定板振荡器上1-2小时来检测结合的抗体。用200μL/孔的PBST洗去未结合的检测抗体三次，并通过加入100μL ABTS/孔来检测结合的检测抗体。在Tecan Fluor光谱仪上，在405nm的测量波长(参考波长为492nm)下执行吸光度测定。
蛋白质纯化
参照标准方案从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白质。简言之，将抗体施加至蛋白质A琼脂糖柱(GE healthcare)并用PBS洗涤。在pH 2.8下实现抗体的洗脱，之后立即中和样品。通过尺寸排阻色谱法(Superdex200，GE Healthcare)在PBS中或在20mM组氨酸、150mM NaCl pH 6.0中将聚集的蛋白质与单体抗体分离。将单体抗体级分合并，使用例如MILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)离心浓缩器浓缩(若需要)，冷冻并储存在-20℃或-80℃下。提供样品的部分以例如通过SDS-PAGE、尺寸排阻色谱(SEC)或质谱法来进行后续的蛋白质分析和分析表征。
SDS-PAGE
根据制造商的说明使用
Figure BDA0004029792780001581
预制凝胶系统(Invitrogen)。具体地，使用10％或4-12％/>
Figure BDA0004029792780001582
Bis-TRIS预制凝胶(pH 6.4)和/>
Figure BDA0004029792780001583
MES(还原凝胶，具有/>
Figure BDA0004029792780001584
抗氧化剂电泳缓冲添加剂)或MOPS(非还原凝胶)电泳缓冲液。
分析尺寸排阻色谱
通过HPLC色谱法执行用于测定抗体的聚集和寡聚状态的尺寸排阻色谱(SEC)。简而言之，将蛋白质A纯化的抗体施加至Agilent HPLC 1100系统上的300mM NaCl、50mMKH2PO4/K2HPO4，pH 7.5中的Tosoh TSKgel G3000SW柱，或施加至Dionex HPLC系统上的2×PBS中的Superdex 200柱(GE Healthcare)。通过UV吸光度和峰面积积分来定量洗脱的蛋白质。将BioRad凝胶过滤标准品151-1901用作标准品。
质谱
本节描述了对具有VH/VL交换(VH/VL CrossMab)的多特异性抗体的表征，重点在于所述多特异性抗体的正确装配。通过对脱糖基化的完整CrossMab和脱糖基化/纤溶酶消化或者脱糖基化/限制性LysC消化的CrossMab进行电喷雾电离质谱(ESI-MS)，来分析预期的一级结构。
在37℃下以1mg/ml的蛋白质浓度将VH/VL CrossMab用磷酸盐或Tris缓冲液中的N-糖苷酶F脱糖基化至多17h。纤溶酶消化或有限的LysC(罗氏)消化用pH 8的Tris缓冲液中的100μg去糖基化的VH/VL CrossMab分别在室温下执行120小时和在37℃下执行40min。在质谱分析之前，将样品经由HPLC在Sephadex G25柱(GE Healthcare)上脱盐。在配备有TriVersa NanoMate源(Advion)的maXis 4G UHR-QTOF MS系统(Bruker Daltonik)上经由ESI-MS来测定总质量。
使用表面等离子体共振(SPR)测定多特异性抗体对相应抗原的结合亲和力(BIACORE)
通过使用BIACORE仪器(GE Healthcare Biosciences AB，Uppsala,Sweden)进行表面等离子体共振来研究产生的抗体与相应抗原的结合。使用相应的Biacore评估软件来分析传感图和计算亲和力数据。
实例1
抗-PD-1抗体的生成
小鼠的免疫接种
NMRI小鼠为经遗传免疫的，采用的是编码全长人PD-1的质粒表达载体，首先通过皮下施用100ug载体DNA(plasmid15300_hPD1-fl)，随后采用电穿孔法(2次1000V/cm的方形脉冲，持续0.1ms，间隔0.125s；随后是4次287.5V/cm的方形脉冲，持续10ms，间隔0.125s)。小鼠在第0、14、28、42、56、70和84天中的任意6天接受连续免疫接种。在第36、78和92天采血并制备血清，用于通过ELISA法进行效价测定(见下文)。在第96天，选出效价最高的小鼠，通过向其静脉注射50ug重组人PD1人Fc嵌合体来进行增强。在增强后3天，将脾细胞与骨髓瘤细胞系进行融合，通过杂交瘤技术分离单克隆抗体。
血清效价的测定(ELISA)
将人重组PD1人Fc嵌合体(0.3ug/ml，100ul/孔)于PBS中固定在96孔NUNCMaxisorp平板上，然后进行以下处理：用PBS中的2％Crotein C(200ul/孔)封闭该平板；施用连续稀释抗血清(一式两份，于PBS中的0.5％ Crotein C中，100ul/孔)；用HRP缀合的羊抗鼠抗体(Jackson Immunoresearch/Dianova 115-036-071，1/16 000)检测。对于以上所有步骤，平板在37℃下孵育1小时。所有步骤之间，用PBS中的0.05％ Tween 20洗涤3次。通过添加100ul/孔的BM蓝POD可溶性底物(罗氏)产生信号；通过添加1M HCl(100ul/孔)停止信号。以690nm为参照，读出450nm处的吸光值。效价定义为稀释抗血清产生的半数最大信号。
实例2
表征抗-PD1抗体/抗-PD1抗体与人PD1的结合
ELISA法检测hu PD1
Nunc maxisorp链霉亲和素包被的平板(MicroCoat#11974998001)是用25μl/孔的生物素化的PD1-ECD-AviHis包被的，并于4℃下孵育过夜。洗涤(PBST-缓冲液，3×90μl/孔)后，加入25μl抗PD1样本或参考抗体(人抗PD1；罗氏/鼠抗PD1；Biolegen；目录号329912)，并于室温下孵育1小时。洗涤(PBST-缓冲液，3×90μl/孔)后，以1:2000/1:1000的稀释度，加入25μl/孔的羊抗人H+L-POD(JIR，JIR109-036-088)/羊抗鼠-POD(GE Healthcare，NA9310)，并在摇床上于室温下孵育1小时。洗涤(PBST-缓冲液，3×90μl/孔)后，加入25μl/孔的TMB底物(罗氏，目录号11835033001)，并孵育至OD值为2-3。在370/492nm处进行测量。
ELISA的结果以EC50值[ng/ml]列于下方的汇总表1和汇总表2中。
细胞LISA法检测PD1
用编码全长人PD1的质粒15311_hPD1-fl_pUC_Neo稳定地转染粘附CHO-K1细胞系，并用G418(质粒上的新霉素抗性标记)进行选择，然后以0.01×10E6细胞/孔的浓度将其接种于384孔平板中，并生长过夜。
次日，加入25μl/孔的PD1样本或人抗PD1(罗氏)/鼠抗PD1(Biolegend，目录号329912)参考抗体，并于4℃下孵育2小时(以避免内化)。仔细洗涤(PBST，1×90μl/孔)后，通过加入稀释于1×PBS缓冲液的0.05％戊二醛(Sigma，目录号G5882，25％)(30μl/孔)将细胞固定，并于室温下孵育10分钟。洗涤(PBST，3×90μl/孔)后，加入25μl/孔的二抗：羊抗人H+L-POD(JIR，JIR109-036-088)/羊抗鼠-POD(GE NA9310)用于检测，随后在摇床上于室温下孵育1小时。洗涤(PBST，3×90μl/孔)后，加入25μl/孔的TMB底物溶液(罗氏11835033001)，并孵育至OD值为1.0-2.0。于370/492nm处，对平板进行测定。
细胞ELISA的结果以“EC50 CHO-PD1”值[ng/ml]列于下方的表2中。
ELISA法检测cyno PD1
Nunc maxisorp链霉亲和素包被的平板(MicroCoat#11974998001)是用25μl/孔的生物素化的cynoPD1-ECD-生物素包被的，并于4℃下孵育过夜。洗涤(PBST-缓冲液，3×90μl/孔)后，加入25μl抗PD1样本或参考抗体(人抗PD1，罗氏)，并在摇床上于室温下孵育1小时。洗涤(PBST-缓冲液，3×90μl/孔)后，以1:1000的稀释度，加入25μl/孔的羊抗人H+L-POD(JIR，JIR109-036-088)，并在摇床上于室温下孵育1小时。洗涤(PBST-缓冲液，3×90μl/孔)后，加入25μl/孔的TMB底物(罗氏，11835033001)，并孵育至OD值为2-3。在370/492nm处进行测量。
ELISA的结果以EC50值[ng/ml]列于下方的汇总表1和汇总表2中。
PD配体1替代试验
Nunc maxisorp链霉亲和素包被的平板(MicroCoat#11974998001)是用25μl/孔的生物素化的PD1-ECD-AviHis包被的，并于4℃下孵育过夜。洗涤(PBST-缓冲液，3×90μl/孔)后，加入25μl抗PD1样本或参考抗体(鼠抗PD1，Biolegen，目录号329912)，并在摇床上于室温下孵育1小时。洗涤(PBST-缓冲液，3×90μl/孔)后，加入25μl/孔的PD-L1(重组人B7-H1/PD-L1 Fc嵌合体，156-B7，R&D)，并在摇床上于室温下孵育1小时。洗涤(PBST-缓冲液，3×90μl/孔)后，以1:1000的稀释度，加入25μl/孔的羊抗人H+L-POD(JIR，109-036-088)，并在摇床上于室温下孵育1小时。洗涤(PBST-缓冲液，3×90μl/孔)后，加入25μl/孔的TMB底物(罗氏，11835033001)，并孵育至OD值为2-3。在370/492nm处进行测量。
ELISA的结果以IC50值[ng/ml]列于下方的汇总表1中。
PD配体2替代试验
Nunc maxisorp链霉亲和素包被的平板(MicroCoat#11974998001)是用25μl/孔的生物素化的PD1-ECD-AviHis包被的，并于4℃下孵育过夜。洗涤(PBST-缓冲液，3×90μl/孔)后，加入25μl抗PD1样本或参考抗体(鼠抗huPD1，罗氏)，并在摇床上于室温下孵育1小时。洗涤(PBST-缓冲液，3×90μl/孔)后，加入25μl/孔的PD-L2(重组人B7-DC/PD-L2Fc嵌合体，1224-PL-100，R&D)，并在摇床上于室温下孵育1小时。洗涤(PBST-缓冲液，3×90μl/孔)后，以1:2000的稀释度，加入25μl/孔的羊抗人H+L-POD(JIR，109-036-088)，并在摇床上于室温下孵育1小时。洗涤(PBST-缓冲液，3×90μl/孔)后，加入25μl/孔的TMB(四甲基联苯胺)底物(罗氏，#11835033001)，并孵育至OD值为2-3。在370/492nm处进行测量。
ELISA的结果以IC50值[ng/ml]列于下方的汇总表1中。
表位作图ELISA/结合竞争性测定
Nunc maxisorp平板(Nunc#464718)是用25μl/孔的捕获抗体(羊抗鼠IgG，JIR，115-006-071)包被的，并在摇床上于室温下孵育1小时。洗涤(PBST-缓冲液，3×90μl/孔)后，用含有PBS缓冲液的2％ BSA在摇床上于室温下封闭1小时。洗涤(PBST-缓冲液，3×90μl/孔)后，加入25μl鼠抗PD1样本，并在摇床上于室温下孵育1小时。洗涤(PBST-缓冲液，3×90μl/孔)后，用30μl/孔的鼠IgG(JIR，015-000-003)在摇床上于室温下封闭捕获抗体1小时。与此同时，用第二样本抗体在摇床上于室温下预孵育生物素化的PD1-ECD-AviHis 1小时。洗涤测定板(PBST-缓冲液，3×90μl/孔)后，将PD1抗体混合物转移至测定板，并在摇床上于室温下孵育1小时。洗涤(PBST-缓冲液，3×90μl/孔)后，以1:4000的稀释度，加入25μl/孔的链霉亲和素POD(罗氏，#11089153001)，并在摇床上于室温下孵育1小时。洗涤(PBST-缓冲液，3×90μl/孔)后，加入25μl/孔的TMB底物(罗氏，#11089153001)，并孵育至OD值为1.5-2.5。在370/492nm处进行测量。通过对照参考抗体的层次聚类来界定表位组。
表1：结合，PD-L1抑制及示例性抗体的表位区组(ELISA)
Figure BDA0004029792780001631
表2：源自亲本小鼠抗体PD1-0103的人源化PD1抗体的生物化学及细胞结合(ELISA)
Figure BDA0004029792780001641
人源化抗PD-1抗体的Biacore表征
使用基于表面等离子体共振(SPR)的试验来测量几种鼠PD1结合剂以及商品化的人PD1结合参考物之间的结合动力学参数。因此，通过偶联到(Biacore)CM5传感器芯片表面的胺固定抗人IgG。然后捕获样本，并使hu PD1-ECD与它们结合。在每个分析循环后，再生传感器芯片表面。通过将数据拟合成1:1朗格缪尔(langmuir)相互作用模型，最终得到平衡常数和动力学速率常数。
通过使用由GE Healthcare提供的胺偶联试剂盒，将大约2000响应单位(RU)的20μg/ml抗人IgG(GE Healthcare#BR-1008-39)偶联到pH 5.0的Biacore T200中的CM5传感器芯片的流动池1和2(或者3和4)。
样本及运行缓冲液为HBS-EP+(0.01M HEPES、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05％v/v表面活性剂P20，pH 7.4)。流动池温度设为25℃，样本隔室温度设为12℃。用运行缓冲液装填系统。
将样本以10nM的浓度注射20秒，并结合至第二流动池。然后将浓度(144nM、48nM、16nM、5.33nM、1.78nM、0.59nM、0.20nM及0nM)为一整套的人PD1-ECD注射到每个样本上方，持续120s。随后是30/300s的解离时间，以及用3M MgCl2进行的两次20s再生步骤，其中最后一次包括用运行缓冲液进行的“注射后的额外洗涤”。
最后，使用Biacore T200评估软件将双份的参考数据拟合至1:1Langmuir相互作用模型。得到的D、ka和kd值如表3所示。
表3：由Biacore测定的嵌合PD1-0103和人源化PD1-Ab的动力学速率常数和平衡常数
配体 ka[M-1s-1] kd[s-1] KD[nM]
嵌合PD1-0103 3.86E+05 3.07E-04 0.8
PD1-0103-0312 1.95E+05 3.45E-04 1.8
PD1-0103-0313 1.60E+05 3.67E-04 2.3
PD1-0103-0314 1.87E+05 2.79E-04 1.5
PD1-0103-0315 1.89E+05 2.91E-04 1.5
如表3所示，嵌合PD1-0103(其产生参见实例6)的所有人源化版本显示与亲本抗体(嵌合PD1-0103)相似的动力学特性。
动力学
将CM5传感器系列S安装到Biacore 4000系统，根据制造商的说明对检测点进行了流体动力学处理。
将多克隆兔IgG抗体<IgGFCγM>R(Jackson ImmunoResearch LaboratoriesInc.)以10000RU固定于流动池1、2、3、4中的检测点1和5上。根据制造商的说明通过EDC/NHS化学过程完成偶联。流动池中的剩余检测点作为参照。样品缓冲液是补充1mg/ml羧甲基葡聚糖凝胶的系统缓冲液。
在一个实施例中，该试验在25℃下驱动。在另一个实施例中，该试验在37℃下驱动。通过以10μl/min的速度注射1min，在传感器表面上捕获50nM的各鼠单克隆抗体。随后，将各抗原以100nM、2×33nM、11nM、4nM、1nM的系列浓度和系统缓冲液0nM以30μl/min的速度注射，缔合阶段时间为4min。再监控解离4min。利用以30μl/min的速度注射10mM pH 1.5的甘氨酸3min来再生捕获系统。根据制造商的说明使用Biacore评估软件来计算相关动力学数据。
表位作图
如制造商所推荐的那样，将Biacore CAP传感器安装到Biacore 4000仪器，并准备好。仪器缓冲液为HBS-ET(10mM pH 7.4的HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005％w/v Tween20)。仪器在25℃下运行。
所有样本在系统缓冲液中稀释。通过在检测点1和5中的流动池1、2、3和4中以30μl/min的速度注射1min，将35kDa生物素化抗原PD1-ECD-AviHis以200RU捕获于CAP传感器表面。检测点2、3和4作为参照。在另一个实施例中，以同样的方式将35kDa生物素化抗原PD1-ECD-AviHis以200RU捕获于CAP传感器表面。
随后，以30μl/min的速度注射100nM的一抗3min，接着以30μl/min的速度注射100nM的二抗3min。注射一抗直至呈递抗原的表面完全饱和。在一抗和二抗注射阶段结束时，设置“晚期结合”(BL)报告点以监控各抗体的结合响应。计算摩尔比率，即二抗结合响应“BL2”与一抗结合响应“BL1”之间的商。摩尔比率用作当抗原已被一抗复合时二抗的抗原可及性指标。
通过以30μl/min注射制造商推荐的2M盐酸胍和250mM NaOH再生缓冲液2min来将复合物从传感器表面完全移除，随后以30μl/min的速度注射系统缓冲液1min。
实例3
混合淋巴细胞反应(MLR)中不同抗PD-1抗体对细胞因子生成的影响3A)混合淋巴细胞反应(MLR)是免疫细胞试验，其测量来自一个个体(供体X)的淋巴细胞到来自另一个个体(供体Y)的淋巴细胞的活化。混合淋巴细胞反应用于表明阻断PD1通路对淋巴细胞效应细胞的影响。在试验中，检测存在或不存在抗PD1单克隆抗体的情况下T细胞的活化及它们的IFNγ分泌物。
为了进行同种异体MLR，使用Leukosep(Greiner Bio One，227288)通过密度梯度离心法分离来自至少四位未知HLA类型的健康供体的外周血单核细胞(PBMC)。简而言之，肝素化血液样本用三倍体积的PBS进行稀释，并且稀释血液的25ml等分试样在50ml Leukosep试管中进行分层。在室温下以800g离心15分钟(无中断)后，收集含有淋巴细胞的级分，在PBS中洗涤并直接用于功能性试验或以1.0E+07细胞/ml再悬浮于冷冻介质(10％ DMSO、90％FCS)中，并储存于液氮中。通过以1:1的刺激细胞/应答细胞比率混合来自两个不同供体的PBMC来建立个体双向MLR反应，并在37℃、5％ CO2、存在或不存在不同浓度范围的纯化抗PD1单克隆抗体(PD1-0050、PD1-0069、PD1-0073、PD1-0078、PD1-0098、PD1-0102和PD1-0103)的条件下，至少一式两份在平底96孔板中共培养6天。作为参考抗PD1抗体，用人IgG1(具有突变L234A、L235A和P329G(Kabat的EU索引))的主链合成并克隆包括纳武单抗(也称为MDX-5C4或MDX-1106)或派姆单抗(也称为MK-3475或Org 1.09A)中任一者的VH和VL结构域的抗体。不使用抗体或使用同种型对照抗体作为阴性对照，使用rec hu IL-2(20Eu/ml)作为阳性对照。在第6天后，从每个培养物中取出100μl培养基用于细胞因子测量。使用OptEIA ELISA试剂盒(BD Biosciences)测量IFNγ的水平。
结果如表4所示(IFNγ分泌/释放)。抗PD1单克隆抗体以浓度依赖性方式促进T细胞活化及IFNγ分泌。相对于不添加任何阻断mAb(基础同种异体刺激诱导的IFNγ值E-c)和添加20EU/ml rec hu IL-2(阳性对照＝100％ IFNg值E+c)的MLR的IFNγ生成，按照以下公式计算IFNγ分泌的％增加值：相对刺激[％]＝((样本-E-c)/(E+c-E-c)*100
表4：同种异体刺激及用抗PD-1抗体处理后IFNγ分泌的百分比与作为阳性对照的重组人IL-2处理(20EU/ml)(＝100％增加)效果的比较
Figure BDA0004029792780001671
通过增强干扰素γ(IFNγ)的分泌，几个PD1阻断抗体PD1-0050、PD1-0069、PD1-0073、PD1-0078、PD1-0098、PD1-0102和PD1-0103表现强烈的免疫调控活性(没有示出所有抗体的数据)。
3B)在进一步的实验中，对嵌合PD1-0103(具有突变L234A、L235A和P329G(Kabat的EU索引)的人IgG1同种型)进行评价。用嵌合PD1-0103阻断PD1强烈地增强同种异体刺激的原代人T细胞的IFNγ分泌。嵌合PD1-0103比参考抗PD1抗体作用更强。为了比较，用人IgG1(具有L234A、L235A和P329G突变(Kabat的EU索引))的主链合成并克隆包括纳武单抗(也称为MDX5C4或MDX-1106)和派姆单抗(也称为MK-3475或Org 1.09A)中任一者的VH和VL结构域的参考抗PD1抗体。
3C)在另外的实验中，如上所述，在MLR中对抗PD-1抗体PD1-0103的人源化变体(图2A-2B和图3中的人源化抗体PD1-0103-0312和PD1-0103-0314，另请参阅下方实例9)的免疫调控活性a)IFNγ释放(分泌)b)TTNF-α释放(分泌)进行评价。比较了嵌合PD1-0103抗体及其人源化版本与参考抗PD1抗体的效果。参考抗PD1抗体具有人IgG1(具有L234A、L235A和P329G突变(Kabat的EU索引))的主链，包括纳武单抗(也称为MDX5C4或MDX-1106)和派姆单抗(也称为MK-3475或Org 1.09A)中任一者的VH和VL结构域。在MLR培养6天之后，获取50μl上清液并使用Bio-Plex ProTM人细胞因子Th1/Th2测定法(Bio-Rad Laboratories Inc.)在单培养中测量多个细胞因子。(未示出所有细胞因子的数据)。相比于参考抗PD1抗体，嵌合PD1-0103抗体及其人源化型式(PD1-0103_0312和PD1-0103_0314)更有效地增强T细胞活化和IFN-γ分泌。此外，嵌合PD1-0103抗体及其人源化变体增加抗原呈递细胞的肿瘤坏死因子α(TNFα)和IL-12分泌并且增强单核细胞/巨噬细胞或抗原呈递细胞刺激T细胞的能力。
实例4
抗PD-1阻断对与同种异体成熟树突细胞共培养的人CD4 T细胞的细胞毒性颗粒酶B释放和IFN-γ分泌的影响
为了进一步研究抗PD-1处理在同种异体环境中的影响，我们开发了一种测定法，其中将新鲜纯化的CD4 T细胞在单核细胞来源的同种异体成熟树突细胞(mDC)的存在下共培养5天。一周前通过塑料粘附从新鲜PBMC中分离单核细胞，之后移除非贴壁细胞。然后我们通过在含有GM-CSF(50ng/ml)和IL-4(100ng/ml)的培养基中培养5天来由单核细胞产生未成熟DC。为了诱导iDC成熟，我们将TNF-α、IL-1β和IL-6(各50ng/ml)添加至培养基，再培养2天。然后我们通过利用流式细胞术(LSRFortessa，BD Biosciences)测量Ⅱ类主要组织相容性复合体(MHCⅡ)、CD80、CD83和CD86的表面表达来评估DC成熟。
在最小程度的混合淋巴细胞反应(mMLR)当天，经由微珠试剂盒(MiltenyiBiotec)从获自无关供体的108个PBMC中富集CD4 T细胞。在培养之前，用5μM的羧基-荧光素-琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记CD4 T细胞。然后将105个CD4 T细胞与成熟的同种异体DC一起(5:1)涂板在96孔平板中，其中存在或不存在浓度为10μg/ml(如果未在图中不同地指示的话)的阻断抗PD1抗体(PD1-0103、嵌合PD1-0103或人源化抗体PD1-0103-0312、PD1-0103-0313、PD1-0103-0314、PD1-0103-0315，缩写为0312、0313、0314、0315)。
五天后，收集细胞培养上清液，并用于通过ELISA(R&D系统)测量IFN-γ水平。使细胞在Golgi Plug(布雷菲德菌素A)和Golgi Stop(莫能菌素)的存在下在37℃下再放置5小时。然后洗涤细胞，用抗人CD4抗体和Live/Dead可固定染料Aqua(Invitrogen)进行表面染色，之后用Fix/Perm缓冲液(BD Bioscience)进行固定/透化。将颗粒酶B(BD Bioscience)、IFN-γ和IL-2(后两者均来自eBioscience)进行细胞内染色。
发现所有人源化变体PD1-0103(人源化抗体PD1-0103-0312、PD1-0103-0313、PD1-0103-0314、PD1-0103-0315，缩写为0312、0313、0314、0315)在增强颗粒酶B和干扰素γ方面一样好(数据未示出)。
实例5
嵌合PD1抗体衍生物
通过经由PCR扩增抗PD1小鼠抗体PD1-0098和PD1-0103的可变重链区和可变轻链区，并且将它们克隆到重链表达载体和轻链表达载体中来生成嵌合PD1抗体，所述重链表达载体为具有包含消除效应子功能的突变L234A、L235A和P329G(Kabat的EU索引)(亮氨酸234突变为丙氨酸、亮氨酸235突变为丙氨酸、脯氨酸329突变为甘氨酸)的人IgG1骨架/人CH1-铰链-CH2-CH3的融合蛋白的形式，所述轻链表达载体为与人C-κ的融合蛋白的形式。然后将LC和HC质粒共转染到HEK293中，并且在7天之后通过抗体纯化的标准方法从上清液中纯化。嵌合PD1抗体重新命名为嵌合chiPD1-0098(chiPD1-0098)和嵌合PD1-0103(chiPD1-0103)。为了比较，用人IgG1(具有L234A、L235A和P329G突变(Kabat的EU索引))的主链合成并克隆包括纳武单抗(也称为MDX-5C4或MDX-1106)和派姆单抗(也称为MK-3475或Org 1.09A)中任一者的VH和VL结构域的参考抗PD1抗体。
实例6
抗PD1抗体PD-0103的人源化变体(huMab PD-0103)的生成、表达和纯化以及表征
鼠抗PD1抗体0103的VH和VL结构域的人源化
基于鼠抗PD1抗体PD1-0103的鼠VH和VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:7和8)，生成人源化的抗PD1抗体变体。
人源化的VH变体基于与具有若干突变的人J-元件种系IGHJ5-01组合的人种系IMGT_hVH_3_23。(产生SEQ ID NO:9)。
VL的人源化变体基于与人J-元件种系IGKJ1-01组合的人种系IMGT_hVK_4_1、IMGT_hVK_2_30、IMGT_hVK_3_11和IMGT_hVK_1_39。不同的突变产生SEQ ID NO:10至SEQ IDNO:13的人源化变体。
将PD1-0103的重链可变区和轻链可变区的人源化氨基酸序列反翻译成DNA，合成所得的cNDA(GenArt)，并且接着将其克隆到重链表达载体或轻链表达载体中，所述重链表达载体为具有包含消除效应子功能的LALA和PG突变(亮氨酸234突变为丙氨酸、亮氨酸235突变为丙氨酸、脯氨酸329突变为甘氨酸)的人IgG1骨架/人CH1-铰链-CH2-CH3的融合蛋白的形式，所述轻链表达载体为与人C-κ的融合蛋白的形式。然后将LC和HC质粒共转染到HEK293中，并且在7天之后通过抗体纯化的标准方法从上清液中纯化。所得的人源化PD1抗体命名如下：
表5：PD1-0103的人源化变体抗体的VH和VL序列
Figure BDA0004029792780001701
Figure BDA0004029792780001711
人源化PD1-0103抗体变体和亲本嵌合PD1-0103如上所述进行表征。结果在表6中示出。
表6：人源化PD1-0103抗体变体和亲本嵌合PD1-0103的结果汇总
Figure BDA0004029792780001712
人源化变体PD-0103-0312在下文称为PD1抗体克隆PD1-0376。
实例7
抗LAG3抗体的生成
家兔的免疫
用表达LAG3的质粒DNA对表达人源化抗体谱的罗氏专有(Roche proprietary)转基因家兔进行免疫。
使用编码全长人LAG3(15352_pIntronA_fl-hLag3_DNA-IMS)的质粒表达载体，通过皮内施加400ug载体DNA，然后进行电穿孔(750V/cm的5个矩形脉冲，持续时间10ms，间隔1s)，对一组3只家兔进行遗传免疫。家兔在第0天、第14天、第28天、第49天、第70天、第98天和第126天接受7次连续免疫。在第35天、第77天、第105天和第133天获取血液(所估计的总血液体积的10％)。制备用于通过ELISA进行滴度测定(参见下文)的血清，并且分离外周血单核细胞，所述外周血单核细胞用作下文B细胞克隆过程中的抗原特异性B细胞的来源。
血清效价的测定(ELISA)
将人重组LAG3蛋白以2ug/ml、100ul/孔在PBS中固定化于96孔NUNC Maxisorp平板上，然后：将平板用在PBS中的2％ Crotein C封闭，200ul/孔；将抗血清的系列稀释液一式两份施加在PBS中的0.5％ Crotein C中，100ul/孔；使用(1)HRP缀合的驴抗兔IgG抗体(Jackson Immunoresearch/Dianova 711-036-152；1/16000)，或(2)HRP缀合的兔抗人IgG抗体(Pierce/Thermo Scientific 31423；1/5000)，或(3)生物素化的山羊抗人κ抗体(Southern Biotech/Biozol 2063-08，1/5000)和链霉抗生素蛋白-HRP进行检测；各自稀释于PBS中的0.5％ Crotein C中，100ul/孔。对于所有步骤，将平板在37℃下温育1h。在所有步骤之间，将平板用在PBS中的0.05％ Tween 20洗涤3次。通过添加100ul/孔的BM蓝POD可溶性底物(罗氏)产生信号；通过添加1M HCl(100ul/孔)停止信号。以690nm为参照，读出450nm处的吸光值。效价定义为稀释抗血清产生的半数最大信号。
家兔外周血单核细胞(PBMC)的分离
获取经过免疫的转基因家兔的血液样品。将含有全血的EDTA用1×PBS(奥地利帕兴市的PAA公司(PAA,Pasching,Austria))稀释两倍，之后使用哺乳动物淋巴细胞(安大略省伯灵顿市的赛达兰实验室(Cedarlane Laboratories,Burlington,Ontario,Canada))根据制造商的说明书进行密度离心。用1×PBS洗涤PBMC两次。
EL-4B5培养基
使用RPMI 1640(德国艾登巴赫的Pan Biotech公司(PAN Biotech,Aidenbach,Germany))，并添加10％ FCS(美国犹他州洛根市的海克隆公司(Hyclone,Logan,UT,USA))、2mM Glutamin、1％盘尼西林/链霉素溶液(奥地利帕兴市的PAA公司)、2mM丙酮酸钠、10mMHEPES(德国艾登巴赫的PAN Biotech公司)以及0.05mM b-巯基乙醇(苏格兰佩斯利的吉博公司(Gibco,Paisley,Scotland))。
用蛋白质抗原包被平板
将无菌细胞培养6孔平板用碳酸盐缓冲液(0.1M碳酸氢钠、34mM碳酸氢二钠，pH9.55)中的缀合于人Fc部分的人LAG3 ECD(2μg/ml)在4℃下包被过夜。使用前在无菌PBS中洗涤平板三次。
细胞的耗尽
(A)使用覆盖有铺满的单层CHO细胞的无菌6孔平板(细胞培养级)，以通过非特异性粘附以及非特异性地结合淋巴细胞来耗尽巨噬细胞/单核细胞。
(B)使用空白无菌6孔平板(细胞培养级)，以通过非特异性粘附耗尽巨噬细胞和单核细胞以及其他细胞。
PBMC样品的一半用于(a)而一半用于(b)。
每个孔最多装有4ml培养基和至多6×106个来自经免疫家兔的PBMC，并且使其在培养箱中在37℃下结合1h。上清液中的细胞(外周血淋巴细胞(PBL))用于抗原淘筛步骤。
B细胞在LAG3抗原上的富集
蛋白质抗原：对包被有LAG3-ECD-huFc蛋白的6孔组织培养平板接种每4ml培养基至多6×106个来自使用空白6孔平板的耗尽步骤的PBL，并且使其在培养箱中在37℃下结合1h。通过用1×PBS小心地洗涤孔1-2次来移除非贴壁细胞。在培养箱中在37℃下持续10min通过胰蛋白酶使剩余的粘性细胞脱离。利用EL-4B5培养基停止胰蛋白酶化。将细胞保持在冰上，直到进行免疫荧光染色。
细胞表面抗原：对覆盖有单层人LAG3阳性CHO细胞的6孔组织培养平板接种每4ml培养基至多6×106个来自使用CHO覆盖的6孔平板的耗尽步骤的PBL，并且使其在培养箱中在37℃下结合1h。通过用1×PBS小心地洗涤孔1-2次来移除非贴壁细胞。在培养箱中在37℃下持续10min通过胰蛋白酶使剩余的粘性细胞脱离。利用EL-4B5培养基停止胰蛋白酶化。将细胞保持在冰上，直到进行免疫荧光染色。
免疫荧光染色和流式细胞术
抗IgG FITC(德国杜塞尔多夫的AbD Serotec公司(AbD Serotec,Düsseldorf,Germany))和抗huCk PE(德国汉堡的Dianova公司(Dianova,Hamburg,Germany))抗体用于单细胞分选。对于表面染色，将来自耗尽和富集步骤的细胞与在PBS中的抗IgG FITC和抗huCk PE抗体一起温育，并且在黑暗中在4℃下温育45min。在染色之后，将PBMC用冰冷的PBS洗涤两次。最后，将PBMC重悬于冰冷的PBS中并立即进行FACS分析。在FACS分析之前添加浓度为5μg/ml的碘化丙啶(美国加利福尼亚州圣迭戈的BD Pharmingen公司(BD Pharmingen,San Diego,CA,USA))以辨别死细胞和活细胞。配备有计算机的Becton DickinsonFACSAria以及FACSDiva软件(BD Biosciences，美国)用于单细胞分选。
B细胞培养
家兔B细胞的培养通过Seeber等人(S Seeber等人PLoS One 9(2),e86184.2014年2月4日)所述的方法进行。简而言之，将单分选的家兔B细胞在96孔平板中与200μl/孔的EL-4B5培养基一起在培养箱中在37℃下温育7天，所述EL-4B5培养基含有Pansorbin细胞(1:100000)(德国达姆施塔特的Calbiochem公司(默克)(Calbiochem(Merck),Darmstadt,Deutschland))、5％家兔胸腺细胞上清液(德国贝尔恩里德的MicroCoat公司(MicroCoat,Bernried,Germany))和经γ辐照的鼠EL-4B5胸腺瘤细胞(5×10e5个细胞/孔)。移除B细胞培养的上清液以用于筛选，并且立即收集剩余细胞并将其在-80℃下冷冻于100μl RLT缓冲液(德国希尔登的凯杰公司(Qiagen,Hilden,Germany))中。
LAG3抗体的V结构域的分离
V结构域的PCR扩增
使用NucleoSpin 8/96RNA试剂盒(Macherey&Nagel；740709.4、740698)根据制造商的方案由B细胞裂解物(重悬于RLT缓冲液-Qiagen-目录号79216)制备总RNA。用60μl无RNA酶水洗脱RNA。6μl的RNA用于使用SuperscriptⅢFirst-Strand Synthesis SuperMix(Invitrogen18080-400)和oligo dT引物根据制造商的说明通过逆转录酶反应生成cDNA。所有步骤在Hamilton ML Star System上进行。以50μl的最终体积，利用AccuPrimeSupermix(Invitrogen 12344-040)，使用4μl的cDNA扩增免疫球蛋白重链和轻链可变区(VH和VL)，对于重链使用引物rbHC.up和rbHC.do而对于轻链使用引物BcPCR_FHLC_leader.fw和BcPCR_huCκ.rev(表7)。所有正向引物(分别为VH和VL的)对信号肽具有特异性，而所有反向引物(分别为VH和VL的)对恒定区具有特异性。用于RbVH的PCR条件如下：热启动，94℃，5min；94℃20s、70℃20s、68℃45s，35个循环；以及在68℃下最终延伸7min。用于HuVL的PCR条件如下：热启动，94℃，5min；94℃20s、52℃ 20s、68℃45s，40个循环；以及在68℃下最终延伸7min。
表7
Figure BDA0004029792780001751
将50μl PCR溶液中的8μl上样到48E-Gel 2％(Invitrogen G8008-02)上。阳性PCR反应液使用NucleoSpin ExtractⅡ试剂盒(Macherey&Nagel；740609250)根据制造商的方案进行净化，并且在50μl洗脱缓冲液中洗脱。所有净化步骤在Hamilton ML StarletSystem上进行。
家兔单克隆二价抗体的重组表达
为了重组表达家兔单克隆二价抗体，通过突出端克隆法(RS Haun等人，Biotechniques(1992)13,515-518；MZ Li等人，Nature Methods(2007)4,251-256)将编码VH或VL的PCR产物作为cDNA克隆到表达载体中。表达载体含有表达盒，所述表达盒由包括内含子A的5'CMV启动子和3'BGH聚腺苷酸化序列组成。除了表达盒之外，质粒还含有源于pUC18的复制起点和赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因，以用于在大肠杆菌(E.coli)中进行质粒扩增。使用了基本质粒的三种变体，所述基本质粒为：含有设计用以接受VH区的家兔IgG恒定区，同时含有用以接受VL区的人κLC恒定区的一种质粒。使用重叠引物通过PCR扩增编码κ或γ恒定区和VL/VH插入序列的线性化表达质粒。将纯化的PCR产物与T4 DNA聚合酶一起温育，这生成单链突出端。通过添加dCTP停止反应。
在下一步骤中，将质粒和插入序列合并并且与诱导位点特异性重组的recA一起温育。将重组质粒转化到大肠杆菌中。第二天，挑取生长菌落并且通过质粒制备、限制性酶切分析和DNA测序测试正确重组的质粒。
对于抗体表达，将分离的HC和LC质粒瞬时共转染到HEK293细胞中，并在1周后收获上清液。
实例8
抗LAG3抗体的表征
表8：不同抗LAG3抗体表征的汇总
Figure BDA0004029792780001761
Figure BDA0004029792780001771
人Lag3的ELISA
将Nunc maxisorp平板(Nunc 464718)用25μl/孔的蛋白质浓度为800ng/ml的重组人LAG-3Fc嵌合蛋白(R&D系统，2319-L3)包被，并且在4℃下温育过夜或在室温下温育1h。洗涤(PBST缓冲液，3×90μl/孔)后，将每个孔用90μl封闭缓冲液(PBS+2％ BSA+0.05％ Tween20)在室温下温育1h。洗涤(PBST缓冲液，3×90μl/孔)后，添加25μl的浓度为1-9μg/ml的抗Lag3样品(在OSEP缓冲液中的1:3稀释液)，并且在室温下温育1h。洗涤(PBST缓冲液，3×90μl/孔)后，以1:2000稀释度添加25μl/孔的山羊抗人Igκ链抗体-HRP缀合物(Milipore，AP502P)，并且在室温下温育1h。洗涤(3×90μl/孔，使用PBST缓冲液)后，添加25μl/孔的TMB底物(罗氏，11835033001)，并温育2-10min。在370/492nm下在Tecan Safire 2仪器上进行测量。
细胞表面Lag3结合ELISA
将25μl/孔的Lag3细胞(表达Lag3的重组CHO细胞，10000个细胞/孔)接种到经组织培养处理的384孔平板(Corning，3701)中，并且在37℃下温育一或两天。第二天，在移除培养基之后，添加25μl的抗Lag3样品(在OSEP缓冲液中的1:3稀释液，以6-40nM的浓度开始)，并且在4℃下温育2h。洗涤(1×90μl，在PBST中)后，通过添加30μl/孔的戊二醛至0.05％的最终浓度(Sigma，目录号：G5882)将细胞在室温下固定10min。洗涤(PBST缓冲液，3×90μl/孔)后，以1:1000稀释度添加25μl/孔的山羊抗人Igκ链抗体-HRP缀合物(Milipore，AP502P)，并且在室温下温育1h。洗涤(PBST缓冲液，3×90μl/孔)后，添加25μl/孔的TMB底物(罗氏，11835033001)，并温育6-10min。在370/492nm下在Tecan Safire 2仪器上进行测量。
抗LAG3抗体的SPR(Biacore)表征
使用基于表面等离子体共振(SPR)的测定法确定在25℃下处于二价形式或作为一价Fab片段的抗Lag3抗体与人Fc标签化的人Lag3细胞外结构域(ECD)之间的结合的动力学参数。
因此，C1生物传感器芯片的两个流动池通过使用“固定化向导(immobilizationwizard)”在Biacore T200中将在pH 4.5的乙酸盐缓冲液中稀释至25μg/ml的中性抗生物素蛋白(neutravidin)固定于其上而制备。这产生大约1900RU的固定化水平。接着，使用在运行缓冲液(HBS-EP+，GE Healthcare)中的20μg/ml稀释液使CaptureSelectTM生物素抗IgG-Fc(人)缀合物与中性抗生物素蛋白结合。
该方法本身每个循环由四个命令组成。第一命令：捕获约46RU的huLag3-Fc(20s，10μl/min)。第二命令：样品注射120s，接着是长1200s的解离，流速为30μl/min。第三和第四命令：通过注射甘氨酸-HCl(pH 1.5)再生30s。然后使用先前所述的方法测量每个抗体Fab片段的稀释系列(3.13nM-200nM，在运行缓冲液中的两倍稀释液)和另外的空白循环。由于捕获水平不可完全再现，因此接着通过应用设置为“局部”的Rmax拟合参数应用1:1郎格缪尔拟合(Langmuir fit)，利用Biacore T200评估软件得到动力学值。结果(KD值和kd值)在表8中示出。
表位作图
使用基于表面等离子体共振(SPR)的测定进行表位建仓。因此，aLag3结合剂(binder)在Biacore T200仪器上与huLag3结合。接着，评估先前形成的aLag3结合剂–huLag3复合物对其他结合剂的可及性。
使用SA CAP试剂盒(GE Healthcare)进行此测定。如果未另外描述，根据SA CAP试剂盒手册进行该测定。运行仅包括一个循环类型。在杂交之后，使生物素化的、huFc标签化的huLag3的10nM稀释液在传感器芯片上与链霉抗生素蛋白结合20s，流动速率为10μl/min。接着以30μl/min的流动速率持续180s注射稀释于运行缓冲液中的第一200nM样品，并且之后立即在相同条件下注射第二样品。然后使表面再生。
然后将样品分配给具有类似竞争模式的不同表位群组。使用6.1RU的阈值，基于第二注射的相对反应进行第一粗略分类，所述阈值恰好高于当将结合剂作为第一和第二样品注射时所观察到的最高值。所有的值和判定通过传感图的视觉检查进行最终验证。
结果在表8中示出。鉴别了三个主要表位模式(E1、E2和E3)。由于aLag3-0416和人源化BAP 050共享相同的群组，但不完全彼此抑制，因此可将它们分配至亚组E2b和E2c。
来自tg家兔的抗Lag3抗体与重组cyno Lag3阳性HEK细胞的结合
除了使用在表面上重组表达人Lag3的HEK细胞的进行结合分析之外，还评估了与食蟹猴Lag3阳性HEK细胞的结合。对于此实验，将先前用cyno-LAG-3瞬时转染的冰冻的HEK293F细胞解冻、离心并且再补充于PBS/2％ FBS中。将1.5×105个细胞/孔接种到96孔平板中。添加抗Lag3抗体，至10μg/ml的最终标准化浓度。为进行参考且作为对照，在实验中制备和测量自体荧光和阳性对照(Medarex 25F7)以及同种型对照(来自Sigma的huIgG1，目录号#I5154，数据未示出)抗体。HEK细胞与指示抗体一起在冰上温育45min，用含有2％ FBS的200μl冰冷的PBS缓冲液洗涤两次，之后添加二抗(APC标记的山羊抗人IgG-κ，Invitrogen，目录号#MH10515)(1:50稀释于FACS-Puffer/孔)，并且在冰上再温育30min。将细胞再次用200μl的冰冷PBS/2％ FBS缓冲液洗涤两次，然后将样品最终重悬于150μl FACS缓冲液中，并且在FACS CANTO-ⅡHTS模块上测量结合。
结果：下表示出不同的抗Lag3抗体与表达cynoLAG3的HEK293细胞的结合和交叉反应性，结合以％阳性细胞或信号强度的几何平均值(GeoMean)给出。
表9：抗Lag3抗体与重组cyno Lag3阳性HEK细胞的结合
LAG3抗体 ％阳性细胞 几何平均值
参考LAG3抗体MDX25F7 41.2 3062
aLAG3(0411) 88.6 11007
aLAG3(0414) 81.6 9169
aLAG3(0416) 67.9 4221
aLAG3(0417) 75.9 7115
aLAG3(0403) 82.0 7457
来自tg家兔的抗Lag3抗体与表达Lag3的(活化的)食蟹猴PBMC/T细胞的结合
在评估了与重组Lag3蛋白和在哺乳动物细胞上重组表达的Lag3的结合之后，还评估了与在活化的食蟹猴T细胞上表达的Lag3的结合。
通过FACS分析，确认新生成的抗Lag3抗体(来源于罗氏的转基因家兔)与在食蟹猴T细胞或PBMC的细胞表面上表达的Lag3的结合特征。虽然Lag3不在天然T细胞上表达，但是它在活化时和/或在耗竭的T细胞上被上调。因此，由新鲜的食蟹猴血液制备食蟹猴外周血单核细胞(PBMC)，然后通过CD3/CD28预处理(1μg/ml)2-3天进行活化。随后对活化细胞的Lag3表达进行分析：简而言之，将1-3×105个活化细胞在冰上用最终浓度为10μg/ml的所指示的抗Lag3抗体和相应对照抗体染色30-60min。经由荧光染料缀合的抗人IgG或抗兔IgG二抗，检测所结合的抗Lag3抗体。染色之后，将细胞用PBS/2％ FCS洗涤两次，并且在FACSFortessa(BD)上进行分析。
结果：下表汇总了活化的食蟹猴PBMC内的Lag3阳性细胞的百分比。
表10：不同抗LAG3抗体与表达Lag3的(活化的)食蟹猴PBMC/T细胞的结合
Figure BDA0004029792780001811
在活化的食蟹猴T细胞上，所有兔抗Lag3抗体表现出与Lag3+细胞的显著结合。由此，相比于人抗Lag3参考抗体(例如MDX25F7、BMS-986016)，所有新生成的抗体显示出增加的阳性细胞百分比。
LAG-3与在人A375肿瘤细胞上表达的MHC-Ⅱ的结合的抑制(通过ELISA)
将25μl/孔的A375细胞(10000个细胞/孔)接种到经组织培养处理的384孔平板(Corning，3701)中，并且在37℃下温育过夜。抗Lag3抗体以1:3稀释度与在细胞培养基中的生物素化的Lag3(250ng/ml)一起预温育1h，以3μg/ml的抗体浓度开始。从具有接种细胞的孔中移除培养基之后，将25μl抗体-Lag3预温育混合物转移至孔中并且在4℃下温育2h。洗涤(1×90μl，在PBST中)后，通过添加30μl/孔戊二醛至0.05％的最终浓度(Sigma，目录号：G5882)，将细胞在室温下固定10min。洗涤(PBST缓冲液，3×90μl/孔)后，以1:2000或1:8000稀释度添加25μl/孔的聚-HRP40-链霉抗生素蛋白(Fitzgerald，65R-S104PHRPx)，并且在室温下温育1h。洗涤(PBST缓冲液，3×90μl/孔)后，添加25μl/孔的TMB底物(罗氏，#11835033001)并温育2至10min。在370/492nm下在Tecan Safire 2仪器上进行测量。
LAG-3与在人A375肿瘤细胞上表达的MHC-Ⅱ的结合的抑制(通过FACS分析)
测定原理：为了研究抗Lag3抗体的拮抗功能，进行MHCⅡ:Lag3竞争测定。在与或不与抗Lag3抗体预温育的情况下，用内部产生的生物素化的Lag3:Fc融合蛋白对MHCⅡ+人A375细胞进行染色。这一分析在FACS竞争实验中进行：将A375细胞(ATCC，#CRL-1619)在添加有EBSS(PAN，目录号#P04-00509)、10％ FBS、2mM L-Glutamin、1×NEAA以及1×丙酮酸钠的EM Eagle培养基中培养2-3代。所有抗体均在FACS缓冲液中稀释至25μl的20μg/ml最终浓度(在96孔U底平板中)。将25μl内部产生的生物素化的重组LAG-3:Fc融合蛋白添加至培养基或抗Lag3抗体或对照，至10μg/ml的最终浓度，并且在室温下预温育30min。将A375细胞用PBS洗涤并在PBS中调整至3×106个细胞/ml。在96孔V底平板中每孔接种100μl。将平板离心并移除上清液。然后将预温育的LAG-3:Fc融合蛋白/抗体混合物(50μl/孔)添加至细胞，并且在室温下温育1h。此后，用200μl FACS缓冲液洗涤细胞。对于与细胞MHCⅡ结合的生物素化的Lag3:Fc蛋白的检测，以3μl/样品使用APC缀合的山羊抗生物素抗体(MiltenyiBiotec，目录号#130-090-856)，并且再温育10-15min。在染色之后，将细胞再次洗涤，接着在150μl FACS缓冲液(PBS/2％ FBS)中转移到U底平板中，并且使用HTS模块在FACS Canto-Ⅱ上进行分析。
两个抗Lag3抗体(克隆25F7和26H10；Medarex)用作阳性对照，而人IgG1(Sigma，目录号#I5154)用作适当的同种型对照。所有抗体以10μg/ml最终浓度使用。
结果：下表示出FACS分析的结果，展示了Lag3蛋白与细胞上的MHC-Ⅱ的结合的抑制百分比(计算为参考不存在阻断抗体时的最大值降低的结合信号)。
表11：不同的抗LAG3抗体与表达Lag3的(活化的)食蟹猴PBMC/T细胞的结合
aLAG3抗体 ％抑制
aLAG3(0403) 34.9
aLAG3(0414) 67.3
aLAG3(0411) 45.6
aLAG3(0416) 68.6
aLAG3(0417) 59.1
参考MDX25F7 70.0
参考MDX26H10 71.7
同种型对照 -2.9
无mAb 0.0
这些数据支持与Lag3的功能性相互影响以及所有测试抗体的细胞相互作用的阻断。
标准LAG3阻断Bio/Reporter测定中新型抗Lag3抗体的中和效力
为了测试新型抗Lag3抗体在体外恢复被抑制的T细胞应答的中和效力，使用可商购获得的报告系统。此系统由Lag3+NFAT Jurkat效应细胞(普洛麦格公司，目录号#CS194801)、MHC-Ⅱ+Raji细胞(ATCC，#CLL-86)和超级抗原组成。简而言之，报告系统基于三个步骤：(1)超级抗原诱导的NFAT细胞活化，(2)由抑制MHCⅡ(Raji细胞)与Lag3+NFATJurkat效应细胞之间的相互作用介导的激活信号的抑制，以及(3)通过Lag3-拮抗/中和VH-Fc融合构建体而恢复NFAT激活信号。
对于此实验，如提供者所述培养Raji和Lag-3+Jurkat/NFAT-luc2效应T细胞。在白色平底96孔培养平板(Costar，目录号#3917)中，于测定培养基(RPMI 1640(PAN Biotech，目录号#P04-18047)、1％ FCS)中制备若干抗Lag3和参考抗体的系列稀释液(40pg/ml-50μg/ml)。将1×105个Lag3+NFAT-Jurkat细胞/孔添加至抗体溶液。在此步骤之后，将2.5×104个Raji细胞/孔添加至Jurakt细胞/抗体混合物以及最终浓度50ng/ml的SED超级抗原(Toxin technology，目录号DT303)。在37℃和5％ CO2下温育六小时之后，将Bio-Glo底物(普洛麦格公司，#G7940)升温至室温并且每孔添加75μl，温育5-10min，然后根据试剂盒的制造商的推荐在Tecan Infinite读板器上测量总体发光。
表中示出在SED刺激时由不同的抗Lag3抗体造成的MHCⅡ/Lag3介导的NFAT荧光素酶信号抑制的恢复(作为EC50值给出)：
表12：在标准LAG3阻断Bio/Reporter测定中使用不同抗LAG3抗体时的结果
Figure BDA0004029792780001841
n.t.在此实验中未测试的分子
实例9
抗LAG3抗体的功能性表征
表13汇总了如本文所述的不同测定中不同抗LAG3抗体(单独或与抗PD1抗体组合)的生物活性和作用。
表13：不同抗LAG3抗体(单独或与抗PD1抗体组合)的生物活性的汇总
Figure BDA0004029792780001842
/>
Figure BDA0004029792780001851
PD-1和LAG-3阻断对与同种异体成熟树突细胞共培养的人CD4 T细胞的细胞毒性颗粒酶B释放和IL-2分泌的影响
为了筛选同种异体环境中与抗PD-1组合的抗LAG-3阻断抗体，开发了一种测定法，其中将新鲜纯化的CD4 T细胞在单核细胞来源的同种异体成熟树突细胞(mDC)的存在下共培养5天。一周前通过塑料粘附从新鲜PBMC中分离单核细胞，之后移除非贴壁细胞。然后通过在含有GM-CSF(50ng/ml)和IL-4(100ng/ml)的培养基中培养5天由单核细胞生成未成熟DC。为了诱导iDC成熟，将TNF-α、IL-1β和IL-6(各50ng/ml)添加至培养基，再培养2天。然后通过利用流式细胞术(LSRFortessa，BD Biosciences)测量Ⅱ类主要组织相容性复合体(MHCⅡ)、CD80、CD83和CD86的表面表达来评估DC成熟。
在最小程度的混合淋巴细胞反应(mMLR)当天，经由微珠试剂盒(MiltenyiBiotec)从获自无关供体的108个PBMC中富集CD4 T细胞。在培养之前，用5μM的羧基-荧光素-琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记CD4 T细胞。接着将105个CD4 T细胞与成熟的同种异体DC(5:1)一起涂板在96孔平板中，其中存在或不存在浓度为10μg/ml的单独的或与嵌合抗LAG-3抗体(aLAG3(0403)至aLAG(0418))或参考抗体(人源化BAP050(LAG525)和BMS 986016)组合的阻断抗PD-1抗体aPD1(0376)(＝PD1-0103-0312，如本文之前或在PCT申请PCT/EP2016/073248中所述)。DP47是在Fc部分中具有用以避免被FcγR识别的LALA突变的非结合的人IgG，并且用作阴性对照。
五天后，收集细胞培养上清液并用于通过ELISA(R&D系统)测量IL-2水平，并且使细胞在Golgi Plug(布雷菲德菌素A)和Golgi Stop(莫能菌素)的存在下在37℃下再放置5小时。然后洗涤细胞，用抗人CD4抗体和Live/Dead可固定染料Aqua(Invitrogen)进行表面染色，之后用Fix/Perm缓冲液(BD Bioscience)进行固定/透化。我们对颗粒酶B(BDBioscience)和IFN-γ(eBioscience)进行了细胞内染色。结果在图2A和图2B中示出。
PD-1和LAG-3阻断对与B细胞-类成淋巴细胞系(ARH77)共培养的人CD4 T细胞的细胞毒性颗粒酶B释放的影响。
在功能研究中，将CD4 T细胞与肿瘤细胞系ARH77(表达比mDC更低的PDL-1水平的B细胞类淋巴母细胞系)一起共培养，以更好地表征LAG-3拮抗对PD-1阻断的贡献。实验设置和读出的其余部分保持与mMLR不变。与参考抗LAG-3抗体(人源化BAP050(LAG525)和BMS986016)(P<0.05)和单独的抗PD-1(P<0.01)相比，抗PD-1抗体与抗LAG-3抗体(aLAG3(0414)和aLAG3(0416)，基于其在mMLR中共分泌IL-2和颗粒酶B的能力选择)的组合导致CD4T细胞的颗粒酶B的分泌更加显著地增加，如图3所示。
PD-1和LAG-3阻断对与经辐照的同种异体PBMC共培养的人CD4T细胞的颗粒酶B和IFN-γ释放的Treg抑制的影响。
在涉及调节性T细胞(Treg)抑制测定的功能研究中，经由微珠试剂盒(MiltenyiBiotec)将来自相同供体的PBMC分在两个样品中：一个样品富集CD4 T细胞而另一个样品富集被定义为CD4+CD25高CD127低T细胞的Treg。一旦将两个群体纯化，即用5μM的羧基-荧光素-琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记CD4 T细胞，同时用5μM Cell-Trace-Violet(CTV)标记Treg，以便能够在随后的FACS上区分所述CD4 T细胞和所述Treg。
然后将CD4 T细胞(105)和Treg(105)在96孔板中以1:1比率与来自无关供体的经辐照的CD4耗尽的PBMC(105)一起共培养，其中存在或不存在浓度为10g/ml的与抗PD-1抗体aPD1(0376)组合的抗LAG-3抗体(aLAG3(0414)和aLAG3(0416)或参考抗LAG-3抗体(人源化的BAP050(LAG525)和BMS 986016)。作为估计Treg对CD4 T细胞效应子功能的抑制的幅度的对照，还将CD4 T细胞(105)在Treg的存在下与经辐照的PBMC(105)一起共培养。
五天后，收集细胞培养上清液，并随后用于通过ELISA(R&D系统)测量IFN-γ水平，并且使细胞在Golgi Plug(布雷菲德菌素A)和Golgi Stop(莫能菌素)的存在下在37℃下再放置5小时。然后洗涤细胞，用抗人CD4抗体和Live/Dead可固定染料Aqua(Invitrogen)进行表面染色，之后用Fix/Perm缓冲液(BD Bioscience)进行固定/透化。对颗粒酶B(BDBioscience)和IFN-γ(eBioscience)进行细胞内染色。结果在图4A和4B中示出。
抗PD-1抗体aPD1(0376)(＝PD1-0103-0312，来自PCT申请PCT/EP2016/073248)与抗LAG-3抗体(aLAG3(0414)和aLAG3(0416))的组合引发Tconv从调节性T细胞的严格控制中逃逸，如由与存在单独的抗PD-1的情况下(P<0.05)或不存在检查点抑制剂的情况下(P<0.001)的Tconv相比显著更大量的颗粒酶B的分泌所证实的。与抗PD-1组合的参考抗LAG-3抗体(人源化BAP050(LAG525)和BMS 986016)不显著拯救Tconv效应子功能免于Treg抑制。IFN-γ获得类似的结果，虽然仅使用4个供体差异未达到统计学显著性。
在用免疫原性黑素瘤-抗原肽池唤起记忆后，PD-1和LAG-3阻断对来自黑素瘤患者PBMC的CD4 T细胞的颗粒酶B和IFN-γ分泌的影响。
先前已经描述，黑素瘤患者PBMC含有可检测频率的肿瘤抗原特异性T细胞。因此，出于POC目的，我们在用免疫原性黑素瘤相关抗原肽汇集物重新刺激过夜的黑素瘤患者PBMC上测试了抗LAG-3抗体(0414)加抗PD-1对比单独的抗PD-1。
来自黑素瘤患者的105至106个PBMC在存在或不存在单独的、与抗LAG-3(aLAG3(0414)＝(0414)，10μg/ml)抗体组合的饱和浓度(10 g/ml)的抗PD-1(0376)的情况下在室温下温育。然后在蛋白质转运抑制剂Golgi Plug(布雷菲德菌素A)和Golgi Stop(莫能菌素)的存在下，将T细胞用免疫原性肿瘤相关抗原如MAGEA1、MAGEA3、MAGEA4、Melan-A/MART-1、NYESO-1、黑素细胞蛋白Pmel 17gp100、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白2的汇集物重新刺激过夜。
然后洗涤细胞，用抗人CD4抗体和Live/Dead可固定染料Aqua(Invitrogen)进行表面染色，之后用Fix/Perm缓冲液(BD Bioscience)进行固定/透化。对颗粒酶B(BDBioscience)和IFN-γ(eBioscience)进行细胞内染色。
抗LAG-3和抗PD-1抗体的组合(P<0.01和P<0.001)显著(P<0.01和P<0.0001)增强肿瘤抗原特异性T细胞效应子功能(即颗粒酶B和IFN-γ分泌)，而单独的PD-1阻断未显示出任何效果(数据未示出)。
实例10
双特异性抗PD1/抗LAG3抗体的生成和产生
10.1在一个结合臂中具有VH/VL结构域交换/替换(CrossMAbVh-VL)且在CH1/CL界面中具有单个带电荷的氨基酸取代的结合PD1和LAG3的双特异性抗体的产生和表达
结合人PD1和人LAG3的多特异性抗体如一般方法章节中所述通过经典分子生物学技术生成，并且在如上所述的Expi293F的293F中瞬时表达。多特异性1+1CrossMAbVh-Vl抗体还描述于WO 2009/080252中。多特异性抗体使用含有编码表14描绘的氨基酸序列的核酸的表达质粒表达。1+1CrossMAbVh-Vl双特异性抗体的示意性结构在图1A中示出。
表14：具有VH/VL结构域交换/替换的轻链(LC)和重链(HC)的氨基酸序列(1+1CrossMAbVh-Vl)
Figure BDA0004029792780001891
/>
所有构建体使用了突起入孔异二聚化技术，其具有第一CH3结构域中的典型突起(T366W)取代和第二CH3结构域中的对应孔取代(T366S、L368A和Y410V)(以及两个另外引入的半胱氨酸残基S354C/Y349’C)(包含在上述各自相应的重链(HC)序列中)。
10.2在两个结合臂中具有CH1/Ck结构域交换/替换(2+2CrossMabCH1/Ck)且在另一个结合臂的CH1/CL界面中具有带电荷的氨基酸取代的结合PD1和LAG3的多特异性抗体的产生和表达
在此实例中，结合人PD1和人TIM3的多特异性抗体如一般方法章节中所述通过经典分子生物学技术生成，并且在如上所述的Expi293F的293F中瞬时表达。多特异性2+2CrossMAbCH1/Ck抗体还描述于WO2010/145792中。多特异性抗体使用含有编码表15描绘的氨基酸序列的核酸的表达质粒表达。2+2CrossMAbCH1/Ck双特异性抗体的示意性结构在图1A中示出。
表15：具有VH/VL结构域交换/替换的轻链(LC)和重链(HC)的氨基酸序列(2+2CrossMAbCH1/Ck)
Figure BDA0004029792780001901
10.3在一个结合臂(与Fc突起重链的C末端融合的PD1 crossFab)中具有CH1/Ck结构域交换/替换(2+1CrossMabCH1/Ck)且在另一个结合臂的CH1/CL界面中具有带电荷的氨基酸取代的结合PD1和LAG3的多特异性抗体的产生和表达
在此实例中，结合人PD1和人TIM3的多特异性抗体如一般方法章节中所述通过经典分子生物学技术生成，并且在如上所述的Expi293F的293F中瞬时表达。多特异性2+1CrossMAbCH1/Ck抗体还描述于WO2013/026831中。多特异性抗体使用含有编码表16描绘的氨基酸序列的核酸的表达质粒表达。2+1CrossMAbCH1/Ck双特异性抗体的示意性结构在图1B中示出。
表16：具有CH1/Ck结构域交换/替换的轻链(LC)和重链(HC)的氨基酸序列(2+1CrossMabCH1/Ck)
Figure BDA0004029792780001902
Figure BDA0004029792780001911
另选地，可以将与Fc突起重链的C末端融合的PD1 crossFab替换成单链Fab(scFab)。包含scFab的此类多特异性2+1抗体还描述于WO2010/136172中，并且可以使用含有编码表17中描绘的氨基酸序列的核酸的表达质粒表达。具有融合在Fc突起重链的C末端的scFab的2+1双特异性抗体的示意性结构在图1C中示出。
表17：具有PD1 scFab的轻链(LC)和重链(HC)的氨基酸序列
Figure BDA0004029792780001912
10.4具有各自融合在重链的C末端的VH/VL的结合PD1和LAG3的多特异性抗体的产生和表达(2+1PRIT形式)
在此实例中，结合人PD1和人TIM3的多特异性抗体如一般方法章节中所述通过经典分子生物学技术生成，并且在如上所述的Expi293F的293F中瞬时表达。这种类型的多特异性2+1抗体还描述于WO2010/115589中。多特异性抗体使用含有编码表18描绘的氨基酸序列的核酸的表达质粒表达。2+1PRIT-类型的双特异性抗体的示意性结构在图1D中示出。
表18：具有在C末端融合于重链的VH和VL结构域的轻链(LC)和重链(HC)的氨基酸序列
Figure BDA0004029792780001921
10.5在一个结合臂中具有VH/VL结构域交换/替换(1+1CrossMabVH/VL反式形式)且在与Fc孔重链的C末端融合的LAG3 Fab的CH1/CL界面中具有带电荷的氨基酸取代的结合PD1和LAG3的多特异性抗体的产生和表达
产生一价结合人PD1和人LAG3的多特异性抗体，其中LAG3 Fab经由其可变重链结构域与重链中的一条的C末端融合，优选地与Fc孔重链的C末端融合。所述分子如一般方法章节中所述通过经典分子生物学技术生成，并且在如上所述的Expi293F的293F中瞬时表达。多特异性抗体使用含有编码表19描绘的氨基酸序列的核酸的表达质粒表达。1+1CrossMabVH/VL反式-类型的双特异性抗体的示意性结构在图1H中示出。
表19：具有在C末端融合于重链的aLAG3 Fab的轻链(LC)和重链(HC)的氨基酸序列
Figure BDA0004029792780001922
10.6在一个结合臂中具有VH/VL结构域交换/替换(2+1CrossMabVH/VL反式形式)且在两个LAG3 Fab(其中的一个与Fc孔重链的C末端融合)的CH1/CL界面中具有带电荷的氨基酸取代的结合PD1和LAG3的多特异性抗体的产生和表达
产生一价结合人PD1并且二价结合人LAG3的多特异性抗体，其中LAG3 Fab经由其可变重链结构域与重链中的一条的C末端融合，优选地与Fc孔重链的C末端融合。所述分子如一般方法章节中所述通过经典分子生物学技术生成，并且在如上所述的Expi293F的293F中瞬时表达。多特异性抗体使用含有编码表20描绘的氨基酸序列的核酸的表达质粒表达。2+1CrossMabVH/VL反式-类型的双特异性抗体的示意性结构在图1I中示出。
表20：轻链(LC)和重链(HC)的氨基酸序列，其中aLAG3 Fab中的一个在C末端融合于重链
Figure BDA0004029792780001931
10.7结合PD1和TIM3的多特异性抗体的纯化和表征
通过蛋白质A亲和色谱和尺寸排阻色谱的组合，从上清液中纯化上述表达的多特异性抗体。所有多特异性抗体可以良好的收率产生并且是稳定的。针对身份(通过质谱法)和诸如纯度等分析特性(通过SDS-PAGE)、单体含量和稳定性对所获得的产物进行表征。
质谱
通过对脱糖基化的完整CrossMab和脱糖基化/纤溶酶消化或者脱糖基化/限制性LysC消化的CrossMab进行电喷雾电离质谱(ESI-MS)，来分析预期的一级结构。
在磷酸盐或Tris缓冲液中用N-糖苷酶F将CH1/Ck CrossMab去糖基化，在37℃下持续至多17h，蛋白质浓度为1mg/ml。在Tris缓冲液pH 8中用100μg去糖基化的CH1/CkCrossMab进行纤溶酶或限制性LysC(罗氏)消化，分别在室温下持续120小时和在37℃下持续40min。在质谱分析之前，将样品经由HPLC在Sephadex G25柱(GE Healthcare)上脱盐。在配备有TriVersa NanoMate源(Advion)的maXis 4G UHR-QTOF MS系统(Bruker Daltonik)上经由ESI-MS来测定总质量。
多特异性抗体的稳定性
为了评估抗体构建体的稳定性，根据以下程序评估热稳定性以及聚集开始温度。所指示抗体的样品以1mg/mL的浓度在20mM组氨酸/组氨酸氯化物、140mM NaCl，pH 6.0中制备，转移到10μL微管阵列中，并且用Optim1000仪器(Avacta Inc.)记录用266nm激光激发时的静态光散射数据以及荧光数据，同时将样品以0.1℃/min的速率从25℃加热至90℃。
聚集开始温度(Tagg)定义为散射光强度开始增大时的温度。解链温度(Tm)定义为荧光强度相对于波长的曲线图中的拐点。
实例11
双特异性抗PD1/抗LAG3抗体的表征
11.1结合Elisa
ELISA法检测hu PD1
将Nunc maxisorp链霉抗生素蛋白包被的平板(MicroCoat#11974998001)用浓度为500ng/ml的25μl/孔的生物素化的PD1-ECD-AviHis包被，并且在4℃下温育过夜。洗涤(PBST缓冲液，3×90μl/孔)后，以逐渐增加的浓度添加25μl抗PD1抗体样品，并且在室温下温育
1h。洗涤(PBST缓冲液，3×90μl/孔)后，以1:5000的稀释度添加25μl/孔的山羊抗人H+L-POD(JIR，JIR109-036-098)，并且在振荡器上在室温下温育1h。洗涤(PBST缓冲液，3×90μl/孔)后，添加25μl/孔的TMB底物(罗氏，11835033001)，并温育直到OD为2–3。在370/492nm处进行测量。
人PD1的细胞ELISA
用编码全长人PD1的质粒15311_hPD1-fl_pUC_Neo稳定地转染粘附CHO-K1细胞系，并用G418(质粒上的新霉素抗性标记)进行选择，然后以0.01×10E6细胞/孔的浓度将其接种于384孔平板中，并生长过夜。
次日，加入25μl/孔的PD1样本或人抗PD1(罗氏)/鼠抗PD1(Biolegend，目录号329912)参考抗体，并于4℃下孵育2小时(以避免内化)。仔细洗涤(PBST，1×90μl/孔)后，通过加入稀释于1×PBS缓冲液的0.05％戊二醛(Sigma，目录号G5882，25％)(30μl/孔)将细胞固定，并于室温下孵育10分钟。洗涤(PBST，3×90μl/孔)后，加入25μl/孔的二抗：羊抗人H+L-POD(JIR，JIR109-036-088)/羊抗鼠-POD(GE NA9310)用于检测，随后在摇床上于室温下孵育1小时。洗涤(PBST，3×90μl/孔)后，加入25μl/孔的TMB底物溶液(罗氏11835033001)，并孵育至OD值为1.0-2.0。于370/492nm处，对平板进行测定。
细胞ELISA结果在下表21中以“EC50 CHO-PD1”值[nM]列出。
人Lag3的ELISA
将Nunc maxisorp平板(Nunc 464718)用25μl/孔的蛋白质浓度为800ng/ml的重组人LAG-3Fc嵌合蛋白(R&D系统，2319-L3)包被，并且在4℃下温育过夜或在室温下温育1h。洗涤(PBST缓冲液，3×90μl/孔)后，将每个孔用90μl封闭缓冲液(PBS+2％ BSA+0.05％ Tween20)在室温下温育1h。洗涤(PBST缓冲液，3×90μl/孔)后，添加25μl的浓度为1-9μg/ml的抗Lag3样品(在OSEP缓冲液中的1:3稀释液)，并且在室温下温育1h。洗涤(PBST缓冲液，3×90μl/孔)后，以1:2000稀释度添加25μl/孔的山羊抗人Igκ链抗体-HRP缀合物(Milipore，AP502P)，并且在室温下温育1h。洗涤(3×90μl/孔，使用PBST缓冲液)后，添加25μl/孔的TMB底物(罗氏，11835033001)，并温育2-10min。在370/492nm下在Tecan Safire 2仪器上进行测量。
细胞表面Lag3结合ELISA
将25μl/孔的Lag3细胞(表达Lag3的重组CHO细胞，10000个细胞/孔)接种到经组织培养处理的384孔平板(Corning，3701)中，并且在37℃下温育一或两天。第二天，在移除培养基之后，添加25μl的抗Lag3样品(在OSEP缓冲液中的1:3稀释液，以6-40nM的浓度开始)，并且在4℃下温育2h。洗涤(1×90μl，在PBST中)后，通过添加30μl/孔的戊二醛至0.05％的最终浓度(Sigma，目录号：G5882)将细胞在室温下固定10min。洗涤(PBST缓冲液，3×90μl/孔)后，以1:1000稀释度添加
25μl/孔的山羊抗人Igκ链抗体-HRP缀合物(Milipore，AP502P)，并且在室温下温育1h。洗涤(PBST缓冲液，3×90μl/孔)后，添加25μl/孔的TMB底物(罗氏，11835033001)，并温育6-10min。在370/492nm下在Tecan Safire 2仪器上进行测量。细胞ELISA结果在下表21中以“EC50CHO-LAG3”值[nM]列出。
LAG-3与在人A375肿瘤细胞上表达的MHC-Ⅱ的结合的抑制(通过ELISA)
将25μl/孔的A375细胞(10000个细胞/孔)接种到经组织培养处理的384孔平板(Corning，3701)中，并且在37℃下温育过夜。抗Lag3抗体以1:3稀释度与在细胞培养基中的生物素化的Lag3(250ng/ml)一起预温育1h，以3μg/ml的抗体浓度开始。从具有接种细胞的孔中移除培养基之后，将25μl抗体-Lag3预温育混合物转移至孔中，并且在4℃下温育2h。洗涤(1×90μl，在PBST中)后，通过添加30μl/孔的戊二醛至0.05％的最终浓度(Sigma，目录号：G5882)，将细胞在室温下固定10min。洗涤(PBST缓冲液，3×90μl/孔)后，以1:2000或1:8000稀释度添加25μl/孔的聚-HRP40-链霉抗生素蛋白(Fitzgerald，65R-S104PHRPx)，并且在室温下温育1h。洗涤(PBST缓冲液，3×90μl/孔)后，添加25μl/孔的TMB底物(罗氏，11835033001)并温育2至10min。在370/492nm下在Tecan Safire 2仪器上进行测量。抑制ELISA结果在下表21中以“IC50MHCⅡ/ELISA”值[nM]列出。
表21：不同的双特异性抗PD1/抗LAG3抗体的结合的汇总
Figure BDA0004029792780001961
/>
Figure BDA0004029792780001971
11.2结合Biacore
结合PD1和LAG3的多特异性抗体的抗原结合特性
通过
Figure BDA0004029792780001981
评估多特异性抗体与其相应靶抗原(即PD1和TIM3)的结合。
PD1结合可根据以下程序评估：
通过胺偶联将抗人Fc IgG固定化至(Biacore)CM5传感器芯片的表面。然后捕获样本，并使hu PD1-ECD与它们结合。在每个分析循环后，再生传感器芯片表面。通过将数据拟合至1:1朗格缪尔(Langmuir)相互作用模型，最终获得平衡常数和动力学速率常数。
使用GE Healthcare提供的胺偶联试剂盒将约10,000响应单位(RU)的20μg/ml的抗人IgG(GE Healthcare#BR-1008-39)偶联到Biacore T200中的CM5传感器芯片的所有流动池上。样本及运行缓冲液为HBS-EP+(0.01MHEPES、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05％v/v表面活性剂P20，pH7.4)。流动池温度设为25℃，样本隔室温度设为12℃。用运行缓冲液装填系统。
不同的样品以10nM的浓度注射15秒并且连续结合于流动池2、3和4。接着将一整组人PD1-ECD浓度(300nM、100nM、2×33.3nM、11.1nM、3.7nM、1.2nM和2×0nM)注射在每个样品上，持续300s，接着是10/600s的解离时间以及用3M MgCl2进行的两个30s再生步骤，其中最后一个含有用运行缓冲液进行的“注射后的额外洗涤”。最后，使用Biacore T200评估软件将双份的参考数据拟合至1:1Langmuir相互作用模型。
LAG3结合根据以下程序评估：
使用由GE Healthcare提供的Biacore SA CAP试剂盒进行此测定。动力学值在25℃下在HBS-EP+(GE Healthcare)缓冲液中获得。
如CAP试剂盒的手册中所规定的，将SA CAP芯片接入Biacore T200。运行方法含有四个命令。首先，使用“General”命令，以10μl/min的流动速率持续300s注射CAP试剂，以杂交固定化的单链DNA。该命令之后是长15秒的处于运行缓冲液中的生物素化的Fc标签化的人Lag3细胞外结构域的1μg/ml稀释液的注射。这导致约50RU的捕获水平。使用单循环命令注射五个不同的样品浓度(100nM–6.25nM，2倍稀释液)，接着是长1200秒的解离阶段。然后如SA CAP试剂盒手册中所规定的将芯片再生。
最后，使用Biacore T200评估软件3.0版评估所得的曲线。
结果：未将相互作用拟合至1:1朗格缪尔结合模型，因为除0799和0927以外的所有样品具有两个Lag3结合部分并且因此显示出亲合力。由于0799和0927含有小的错配的(miss-paired)二价样品群，它们也显示出一些亲合力。
因此传感图仅根据它们的离解速率排序。这通过单循环动力学曲线的视觉比较进行。通过这样做，显示出0416-Lag3 ECD复合物比样品组中的任何其他样品更加稳定。一价<Lag3>Crossmab形式(0799)仍然表现出低于此实验中的任何其他样品的离解速率。
此外，观察到同源(affine)的Lag3-0414/Lag3-0927–Lag3 ECD复合物是此实验中的那些样品中最弱的。0414和0416的同源结合部分与它们的一价Crossmab对应部分0927和0799的同源部分大致相当。结果在表22中示出。
表22：通过SPR测量确定的PD1-LAG3双特异性抗体的结合质量
样品 结合质量
aLAG3(0414) ++
aLAG3(0416) +++
PD1/LAG3 0927(1+1) +
PD1/LAG3 0799(1+1) +++
aLAG3(25F7) ++
aLAG3(MDX26H10) ++
aLAG3(BMS986016) ++
aLAG3(BAP050) +
相比于1+1双特异性抗体0927和0799，反式形式的亲合力评估：
确定了双特异性分子(样品)和它们的单独靶标以及PD1和LAG3的组合(分析物)的解离常数，以评估通过同时结合所有效价提供的亲合力增益。
在Biacore 8K上进行测量之前，使用GE Healthcare提供的标准胺偶联试剂盒制备CM5传感器芯片。因此将针对样品的Fc部分(即携带PGLALA突变的Fc部分)中的特定突变的内部制备的抗体，本文称为抗PGLALA抗体(此类抗体描述于WO 2017/072210中)在pH 5.0乙酸盐缓冲液中稀释至50μg/ml的浓度。所述抗体以8μl/min的流速经1200s偶联于所有流动池和通道，从而得到约19000RU的结合响应。
HBS-EP+缓冲液(GE HC)用作传感器芯片制备以及主运行本身的运行缓冲液。在由三个17s长的样品注射组成的启动之后开始分析，接着利用10mM NaOH溶液进行再生步骤。在第一步骤中，通过以10μl/min的流动速率注射17s，通过抗PGLALA抗体将不同样品捕获到传感器芯片表面上的单独通道的流动池二上。第二步，以50μl/min的流动速率持续200s将三种分析物(PD1、LAG3-Fc、2+2PD1/LAG3-Fc融合体)中的一种注射到两个流动池中，接着是长1000s(在LAG3-Fc的情况下是600s)的解离阶段。最后，通过两次连续注射(长30s)10mMNaOH将抗PGLALA抗体/样品复合物溶解。每个单独的动力学测定由具有不同分析物浓度(0nM、5nM、25nM和100nM)的四个循环组成。
使用Biacore 8K评估软件评估所得数据。应用1:1解离拟合并且将所得的kd值转换成复合物半衰期(以分钟计)。PD1/Lag3-Fc融合抗原结合分子与其主要的单独贡献者(PD1或Lag3)的亲合结合之间的差异被计算并分选到三个类别中的一个中，描述通过一价且双特异性结合获得的稳定性增益(表23)。
表23：通过SPR测量确定的由PD1-LAG3双特异性抗体的亲合力提供的复合物稳定性的增加
Figure BDA0004029792780002001
Figure BDA0004029792780002011
11.3在经由双特异性抗PD1/抗LAG3双特异性抗体同时接合之后细胞的PD1和LAG3的二聚化
如实例10中所述以各种形式生成双特异性抗PD1/抗LAG3抗体。此细胞测定用于展示两种不同受体的二聚化或最后结合/相互作用，所述受体在与针对两种靶标的双特异性抗体连接或交联时与酶的两个片段在胞质中融合。因此，单独仅一种受体显示为没有酶活性。对于这种特异性相互作用，两种受体的细胞质C末端单独地与报告酶的异源亚基融合。单独的单个酶亚基未显示出报告活性。然而，预期抗PD1/抗LAG3双特异性抗体构建体与两种受体的同时结合会导致两种受体的局部胞质聚集、两个异源酶亚基的互补，并最终导致形成特异性和功能性的酶，该酶水解底物从而产生化学发光信号。
为了分析双特异性抗PD1/抗LAG3抗体的交联作用，将10,000个PD1+LAG3+人U2OS细胞/孔接种到白色平底96孔平板(Costar，目录号#3917)中，并且在测定培养基中培养过夜。第二天，将细胞培养基弃去并且替换为新鲜培养基。制备抗体或配体稀释液并且添加滴定量的指示(双特异性)抗体，并在37℃下温育2小时。接着，添加底物/缓冲液混合物(例如PathHunterFlash检测试剂)，并且再次温育1h。为了测量在同时结合和二聚化时诱导的化学发光，使用Tecan infinite读板器。
结果在图5A和5B中示出。绘制的是化学发光(以RU为单位测量)相对于抗体浓度的曲线图。单特异性(二价)抗LAG3抗体不能引起化学发光信号，而所有双特异性抗PD1/抗LAG3抗体以浓度依赖性方式诱导化学发光信号。
为了显示同时结合(和发光信号的诱导)的特异性，进行竞争实验：如先前所示，用双特异性抗体(1252)进行处理，以剂量依赖性方式诱导发光信号(图5C)。如果在aLAG3抗体(0156，MDX25F7)或抗PD1抗体(0376)存在下提供相同的双特异性抗体，则信号几乎被抑制(由于PD1竞争)或至少被显著降低(LAG3)。两种亲本抗体与双特异性抗体(1252，2+1LAG3/PD1形式)中所含的结合剂是相同的。竞争性抗体各自以20μg/ml的恒定浓度给出。
另一实验的结果在图5D中示出。与先前的竞争实验类似，与亲本aLAG3(0156)或PD1抗体(0376)(各自恒定处于10μg/ml)一起温育对双特异性抗体(1252，双特异aLAG3-0156和PD1-0376的2+1形式)与PD1Lag3双表达细胞的结合特性具有影响，如通过发光信号所测量的。与抗PD1抗体(0376)以及重组LAG3:Fc蛋白(0160)的竞争几乎消除信号，而单个aLAG3结合剂(0156)的存在仅导致部分抑制。与不同于0156的表位结合的另外两种抗LAG3抗体0414和0416不与包含aLAG3结合剂(0156)的双特异性抗体竞争结合，因为它们不显著调节信号。
在另一个实验中，对包含不同aLAG3结合剂(0414相对于0416)和不同形式(1+1相对于2+1)的双特异性抗LAG3/抗PD1抗体的同时结合进行比较(图6A至6D)。如先前所述，测试了若干抗LAG3/抗PD1双特异性抗体，所述抗体为1+1CrossMab形式(0799和0927)或2+1形式(两个Lag3结合臂和一个PD1 crossFab片段融合的C末端：8311和8310)。在图6A和6B中示出具有结合剂aLAG3-0416的构建体的曲线(吸光度相对于浓度)，而在图6C和6D中示出具有aLAG4-0414的相应构建体的曲线。所测试的所有构建体均能够与细胞结合并诱导化学发光。针对结合曲线所计算的EC50值在下方表24中示出。
表24：在二聚化结合测定中测量得到的EC50值
双特异性抗体 形式 MW[kD] EC50[pM]
0927(PD1-0376/LAG3-0414) 1+1 145 41
0799(PD1-0376/LAG3-0416) 1+1 145 76
8310(PD1-0376/LAG3-0414) 1+2 193 28
8311(PD1-0376/LAG3-0416) 1+2 193 119
在另一个实验中，对包含不同aLAG3结合剂(0414相对于0416)和不同形式(2+1相对于2+2)的双特异性抗LAG3/抗PD1抗体的同时结合进行比较(图7A至7D)。测试了抗LAG3/抗PD1双特异性抗体，所述抗体为2+1形式(两个LAG3结合臂和一个PD1 crossFab片段融合的C末端：8311和8310)或2+2crossmab形式(两个LAG3结合臂和两个PD1crossFab片段融合的C末端：8970和8984)。在图7A和7B中示出具有结合剂aLAG3-0414的构建体的曲线(吸光度相对于浓度)，而在图7C和7D中示出具有aLAG4-0416的相应构建体的曲线。所测试的所有构建体均能够与细胞结合并诱导化学发光。针对结合曲线所计算的EC50值在下方表25中示出。
表25：在二聚化结合测定中测量得到的EC50值
双特异性抗体 形式 MW[kD] EC50[pM]
8310(PD1-0376/LAG3-0414) 2+1 193 114
8311(PD1-0376/LAG3-0416) 2+1 193 124
8970(PD1-376/LAG3-0414) 2+2 242 83
8984(PD1-0376/LAG3-0416) 2+2 242 91
在另一个实验中，将经典1+1CrossMAbVh-VL形式的双特异性抗LAG3/抗PD1抗体PD1/LAG3 0927的同时结合与1+1反式形式(PD1/LAG3 0725)和2+1反式形式(PD1/LAG3 0750)的双特异性抗LAG3/抗PD1抗体进行比较。对于此实验，应用了对该方法的以下改变。为了分析不同的抗LAG3/抗PD1抗体形式的交联效果，将7500个PD1+LAG3+人U2OS细胞/孔与抗体的非系列稀释液(最终浓度为0.29pM至5484pM)一起接种到白色平底96孔平板中，并且在CO2培养箱中在37℃下温育20h。接着，将测定平板平衡至室温，并且添加底物/缓冲液混合物(PathHunterFlash检测试剂，Discoverx)，并再次温育4h。为了测量在同时结合和二聚化时诱导的化学发光，使用SpectraMax L读板器(Molecular Devices)。
在图7E中，描绘了PD1-LAG3双特异性抗体1+1CrossMab(0927)、具有N末端aPD1和C末端aLAG3的1+1反式CrossMab(0725)以及具有N末端aPD1和N加C末端aLAG3的2+1反式CrossMab(0750)的剂量-响应曲线(发光相对于浓度)。与PD1/LAG3 0927相比，PD1/LAG30725的PD1 LAG3受体交联效果明显较高，而PD1/LAG3 0750的效果则略低。
11.4双特异性抗LAG3/抗PD1反式CrossMab变体在PD-1与LAG-3combo Reporter测定中的测量
为了测试不同的抗PD1-LAG3抗体形式在体外恢复被抑制的T细胞应答方面的中和效力，使用可商购获得的报告系统。PD1与LAG3 combo生物测定由表达PD1、LAG3和T细胞受体(TCR)的报告细胞、表达MHC-Ⅱ和PDL1的肿瘤细胞以及TCR活化抗原组成。
效应细胞是表达人PD1、人LAG3、人TCR和由NFAT应答元件(NFAT-RE)驱动的荧光素酶报告基因的Jurkat T细胞。靶细胞是表达人PD-L1的A375细胞。简而言之，报告系统基于三个步骤：(1)TCR活化抗原诱导的NFAT细胞激活，(2)由MHCⅡ(A375细胞)与LAG3+(Jurkat细胞)以及PD-L1(A375细胞)与PD1(Jurkat细胞)之间的相互作用介导的激活信号的抑制，以及(3)由PD1和LAG3拮抗/中和抗体造成的NFAT激活信号的恢复。
对于此实验，将每孔1×104个A375细胞与TCR活化抗原(普洛麦格公司)一起在96孔平底测定平板中在CO2培养箱中于37℃下温育过夜。接着，从平板中移除培养基，并且添加抗LAG3/抗PD1抗体的系列稀释液(最终测定浓度为0.01nM至857nM)以及每孔5×104个Jurkat效应细胞。在CO2培养箱中于37℃下温育6小时之后，将测定平板平衡至室温，并且向每个孔中添加80μl ONE-Glo Ex底物(普洛麦格公司)。在温育10min之后，在SpectraMax L读板器(Molecular Devices)中测量发光。预期抗PD1/抗LAG3双特异性抗体构建体与两种受体的同时结合会导致两种受体的局部胞质聚集、两个异源酶亚基的互补，并最终导致形成特异性和功能性的酶，该酶水解底物从而产生化学发光信号。在图7F中，描绘了抗PD1/抗LAG3双特异性抗体1+1CrossMab(0927)、具有N末端aPD1和C末端aLAG3的1+1反式CrossMab(0725)以及具有N末端aPD1和N加C末端aLAG3的2+1反式CrossMab(0750)的剂量-响应曲线(发光相对于浓度)。0927和0725通过阻断PD1和LAG3与其相应配体的相互作用而恢复报告细胞活化的能力是相当的，但高于0750。这通过表26中列出的EC50值进一步表明。
表26：在PD-1和LAG-3combo报告测定中测得的EC50值
双特异性抗体 形式 MW[kD] EC50[nM]
PD1/LAG3 0927 1+1顺式 145259 3.1
PD1/LAG3 0725 1+1反式 145890 2.2
PD1/LAG3 0750 2+1反式 192888 0.6
实例12
双特异性抗PD1/抗LAG3抗体的功能性表征
12.1与T细胞表面结合时减少的内化
通过流式细胞术测量受体内化
受体内化代表分子的重要下沉，所述分子可以在几小时内降解，同时靶向受体在细胞表面上快速地重新表达，以备用于抑制TCR信号传导。因此我们通过流式细胞术评估了在我们的构建体结合时的受体内化，其中在4℃下用不同的双特异性形式染色的样品用作参考，以与在4℃下染色之后在37℃下温育3小时的样品进行比较。
将先前与1μg/ml的平板结合的抗CD3和1μg/ml的可溶性抗CD28抗体一起培养的多克隆激活三天的CD4 T细胞在抗LAG3或抗PD1/抗LAG3双特异性抗体(一式两份)存在下在4℃下温育30分钟。然后将细胞洗涤，分成两组，其中的一组在37℃下再温育3小时而另一组立即用标记的二抗(eBioscience)进行染色，然后用BD Cell Fix固定。温育3小时后，第二组细胞也在固定之前用标记的二抗染色。染色之后，将细胞用PBS/2％ FCS洗涤两次，然后采集。
在LSRFortessa(BD Biosciences)上采集细胞，并且比较两组之间细胞表面上的可检测抗体的表达水平。结果在图8B中示出。我们观察到在3小时之后，所有双特异性形式以及单特异性二价aLAG-3抗体已被内化，然而1+1形式的双特异性抗PD1/抗LAG3抗体(PD1/LAG3 0799和PD1/LAG3 0927)被内化最少。
通过荧光共焦显微术可视化抗体定位和内化
将活化的CD4阳性细胞用CMFDA(Invitrogen)染色，并且涂板在用Retronectin(Takara Bio)处理的圆形盖玻片上。使细胞在37℃下贴壁4小时，然后将荧光标签化的抗体(1g/mL：a-LAG3(1256)、1+1PD1/LAG3 Bispec(0927)、PD1-LAG3 1+2Bispec(8310)和用Alexa 647标记的PD1-LAG3 2+2Bispec(8970))直接添加到生长培养基中，培养不同的时间(15min、1小时和3小时)。用冷的PBS(Lonza)淬灭反应并洗掉未结合的抗体。然后将细胞与Cytofix(BD)在4℃下混合20分钟并用PBS(Lonza)洗涤两次。接着将盖玻片转移并安装在具有Fluoromount G(eBioscience)的玻璃载玻片上，并且在成像之前在4℃、黑暗中保持过夜。A)荧光图像在图9A中示出。白色信号代表标记抗体的定位。B)将来自高度靶向细胞的膜ROI的荧光信号的强度除以来自相同细胞的细胞质ROI的荧光信号的强度，得到在方框统计图(Box Chart)中显示的比率。为了对样品进行比较，使用单因素方差分析法(One WayANOVA)分析未校正的Fisher LSD(*＝p<0.05；**＝p<0.01)。结果在图9B中示出。随时间推移的分析显示，当与TIM3抗体(用作对照)的细胞内簇集相比较时，双特异性抗体和LAG3抗体中的膜定位更高。我们观察到，在3小时之后，除了1+1PD1/LAG3 Bispec(0927)之外，所有双特异性形式以及单特异性二价aLAG-3抗体已被内化(图9A)。
使用60×油物镜，利用来自Zeiss的倒置LSM 700进行荧光共焦显微术。使用联接至显微镜的Zen软件(Zeiss)收集图像。图像的分析使用Imaris软件(Bitplane；OxfordInstrument)进行，而统计分析通过GraphPad Prism(Graphpad Software)进行。
12.2与常规T细胞的结合相对于与Treg的结合
前导PD1-LAG3 BsAb的期望特性是优先结合常规T细胞而不是Treg的能力，因为Treg上的LAG3表现为负调节它们的抑制功能。因此，利用阻断抗体靶向Treg上的LAG3，会增加它们的抑制功能并最终遮蔽其他T细胞上的正阻断效应，从而产生不利影响。因此，我们评估了不同抗PD1/抗LAG3双特异性抗体形式与簇集在一起的活化的常规T细胞和调节性T细胞的竞争性结合。
调节性T细胞(Treg)和常规T细胞(Tconv)从健康供体PBMC(Miltenyi)中分选，分别用5mM Cell Trace Violet或CFSE膜染料标记，并且以1:1比率与1 g/ml平板结合的抗CD3和1g/ml可溶性抗CD28抗体一起温育3天。在第3天，将细胞与直接标记的抗PD1、抗LAG3或双特异性抗体一起在4℃下温育30min，用BD Cell Fix固定，并且在LSRFortessa(BDBiosciences)上采集。
虽然单特异性抗LAG3亲本抗体同样良好地结合Treg和常规T细胞(图10A)，但是抗PD1对应物由于PD1在效应T细胞上高于在Treg上的表达水平而优先结合常规T细胞(图10B)。有趣的是，PD1/LAG3双特异性抗体的1+1形式(0927)也保持相比于Treg优先结合常规T细胞的能力(图10C)。与常规T细胞的这种优先结合也可通过描绘常规T细胞上的信号相对于Treg上的信号的差(δ)而可视化(图10D)。2+1和2+2形式未显示出对效应T细胞的亲和力驱动的选择性，并且在与单特异性抗LAG3抗体的结合方面是相当的。
12.3PD-1和LAG-3阻断对与经辐照的同种异体PBMC共培养的人CD4 T细胞的颗粒酶B和IFN-γ释放的Treg抑制的影响
进一步测试了双特异性抗体形式的结合特性的差异是否将为Tconv提供优于Treg的任何功能优势。在涉及调节性T细胞(Treg)抑制测定的功能研究中，经由微珠试剂盒(Miltenyi Biotec)将来自相同供体的PBMC分在两个样品中：一个样品富集CD4 T细胞而另一个样品富集被定义为CD4+CD25高CD127低T细胞的Treg。一旦将两个群体纯化，即用5M的羧基-荧光素-琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记CD4 T细胞，同时用5MCell-Trace-Violet(CTV)标记Treg，以便能够随后在FACS上区分所述CD4T细胞和所述Treg。
然后将CD4 T细胞(105)和Treg(105)在96孔板中以1:1比率与来自无关供体的经辐照的PBMC(105)一起共培养，其中存在或不存在浓度为10g/ml的与抗PD-1抗体组合的抗LAG3抗体(前导(lead)0414和候补(backup)0416)或竞争性抗LAG3抗体(BMS-986016和人源化BAP050)。作为估计Treg对CD4 T细胞效应子功能的抑制的幅度的对照，还将CD4 T细胞(105)在Treg的存在下与经辐照的PBMC(105)一起共培养。
五天后，我们收集细胞培养上清液，随后用于通过ELISA(R&D系统)测量IFNγ水平，并且使细胞在Golgi Plug(布雷菲德菌素A)和Golgi Stop(莫能菌素)的存在下在37℃下再放置5小时。然后洗涤细胞，用抗人CD4抗体和Live/Dead可固定染料Aqua(Invitrogen)进行表面染色，之后用Fix/Perm缓冲液(BD Bioscience)进行固定/透化。我们对颗粒酶B(BD Bioscience)和IFNγ(eBioscience)进行细胞内染色。结果在图11中示出。
我们的PD1/LAG-3双特异性抗体(0927)引发Tconv从调节性T细胞的严格控制中逃逸，如由与存在单独的亲本抗PD1抗体或派姆单抗情况下(P<0.05)或不存在检查点抑制剂情况下(P<0.001)的Tconv相比显著更大量的颗粒酶B的分泌所证实的。与纳武单抗组合的竞争性抗LAG3抗体BMS-986016不显著拯救Tconv效应功能免于Treg抑制。
12.4PD-1/LAG-3双特异性抗体对与B细胞-类成淋巴细胞系(ARH77)共培养的人CD4 T细胞的细胞毒性颗粒酶B释放的影响
我们评估了与抗PD-1和抗LAG-3亲本抗体的组合或以护理标准使用的抗PD1抗体相比，当与肿瘤细胞系ARH77共培养时，我们的不同双特异性抗体形式诱导CD4 T细胞分泌颗粒酶B的能力。
测试了总共6种形式，3种形式由抗PD1(0376)和抗LAG3(hu1256、chi 0414)抗体的组合生成而另3种形式由抗PD1(0376)和抗LAG-3(hu1257、chi 0416)抗体生成。
如图13中可以看出，由抗LAG3(hu 1256，作为IgG1 PGLALA的抗LAG3 0414)和抗PD1(0376)生成的两种双特异性形式1+1(0927)和2+2(8970)以及亲本抗体的组合当与未处理的CD4 T细胞相比时显著增强CD4T细胞的颗粒酶B分泌(分别为P＝0.0005、P＝0.01和P＝0.0001)。相应的2+1形式(8310)显示出类似的趋势，但未达到统计学显著性(P＝0.07)。
关于通过将抗LAG-3(hu 1257，作为IgG1 PGLALA的抗LAG30416)与抗PD1(0376)组合生成的双特异性抗体，当与未处理的CD4细胞相比时，1+1形式(0799)和2+2(8984)显著增加颗粒酶B阳性CD4 T细胞的频率(分别为P＝0.0032和P＝0.0064)。
当与在不存在检查点抑制剂的情况下培养的细胞相比时，纳武单抗和派姆单抗均不显著促进CD4 T细胞的更高的颗粒酶B分泌。(图13)。
表27：所测试的PD1-LAG3双特异性抗体对细胞毒性颗粒酶B释放的影响
样品 影响
PD1/LAG3 0927(1+1) +++
PD1/LAG3 8970(2+2) +
PD1/LAG3 8310(1+2) +/-
PD1/LAG3 0799(1+1) ++
PD1/LAG3 8984(2+2) ++
PD1/LAG3 8311(1+2) +/-
aLAG3(BMS986016) ++
12.5在用免疫原性黑素瘤-抗原肽汇集物唤起记忆后，PD-1和LAG-3阻断对来自黑素瘤患者PBMC的CD4 T细胞的颗粒酶B和IFN-γ分泌的影响
先前已经描述，黑素瘤患者PBMC含有可检测频率的肿瘤抗原特异性T细胞。因此，出于概念证明的目的，在用免疫原性黑素瘤相关抗原肽汇集物重新刺激过夜的黑素瘤患者PBMC上对抗LAG-3抗体(0414)加抗PD-1(0376)的组合相对于1+1(0927)形式的衍生双特异性抗体或单独的抗PD-1进行测试。
来自黑素瘤患者的105至106个PBMC在存在或不存在饱和浓度(10g/ml)的单独的、与抗LAG-3(0414，10g/ml)抗体组合的、或作为双特异性1+1形式(0927，20g/ml)抗体的抗PD-1(0376)的情况下在室温下温育。然后在蛋白质转运抑制剂Golgi Plug(布雷菲德菌素A)和Golgi Stop(莫能菌素)的存在下，将T细胞用免疫原性肿瘤相关抗原如MAGEA1、MAGEA3、MAGEA4、Melan-A/MART-1、NYESO-1、黑素细胞蛋白Pmel 17gp100、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白2的汇集物重新刺激过夜。
然后洗涤细胞，用抗人CD4抗体和Live/Dead可固定染料Aqua(Invitrogen)进行表面染色，之后用Fix/Perm缓冲液(BD Bioscience)进行固定/透化。对颗粒酶B(BDBioscience)和IFN-γ(eBioscience)进行细胞内染色。
抗LAG-3和抗PD-1抗体的组合(P<0.01和P<0.001)和双特异性抗体均显著(P<0.01和P<0.0001)增强肿瘤抗原特异性T细胞效应子功能(即颗粒酶B和IFN-γ分泌)，而单独的PD-1阻断未显示出任何效果(图12)。
实例13
PD1/LAG3双特异性抗体和CEACAM5 CD3 TCB的组合疗法的体内有效抗肿瘤效果
根据WO 2014/131712 A1或WO 2016/079076 A1中描述的方法制备了TCB分子。在实验中使用的抗CEA/抗CD3双特异性抗体(CEA CD3 TCB或CEA TCB)的制备描述于WO 2014/131712 A1的实例3中。CEA CD3TCB是“2+1IgG CrossFab”抗体并且包括两条不同的重链和两条不同的轻链。引入CH3结构域中的点突变(“突起入孔”)以促进两条不同重链的组装。进行CD3结合Fab中的VH和VL结构域的交换，以便促进两条不同轻链的正确组装。2+1意指分子具有两个对于CEA具有特异性的抗原结合结构域和一个对于CD3具有特异性的抗原结合结构域。CEA CD3TCB包含SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148和SEQ IDNO:149所示的氨基酸序列。CEACAM5 CD3 TCB具有相同的形式，但是包含另一CEA结合剂并且包含CD3结合剂的CH和CL结构域中的点突变，以便支持轻链的正确配对。CEACAM5 CD TCB包含SEQID NO:150、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:153所示的氨基酸序列。
a)实验材料和方法
PD1/LAG3双特异性抗体0927以1.5mg/kg或3mg/kg的浓度与人CEACAM5 CD3 TCB的组合在人胰腺BXPC3癌模型中进行测试。将BXPC3细胞与小鼠成纤维细胞系(3T3)一起皮下共移植到NSG人源化小鼠中。
BXPC3细胞系的制备：BXPC3细胞(人胰腺癌细胞)初始获自ECACC(欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of Cell Culture))，并且在扩培之后沉积在Glycart内部细胞库中。在含有10％FCS(奥地利的PAA实验室(PAA Laboratories,Austria))、1％Glutamax的RPMI中培养BXPC3细胞。在5％ CO2下，在水饱和的气氛中于37℃下培养细胞。
完全人源化小鼠的产生：根据规定指南(GV-Solas；Felasa；TierschG)，将实验开始时为4-5周龄的雌性NSG小鼠(Jackson实验室)维持在不含特定病原体的条件下，日循环为12h光照/12h黑暗。实验研究方案经过地方政府的审查和批准(P 2011/128)。到达之后，将动物维持一周以适应新环境并进行观察。定期进行连续健康状态监测。对NSG小鼠i.p.注射15mg/kg的白消安，接着在一天后i.v.注射从脐带血中分离的1×105个人造血干细胞。在干细胞注射后第14-16周，对小鼠进行舌下放血并且通过流式细胞术针对成功的人源化对血液进行分析。将有效移植的小鼠根据它们的人T细胞频率随机化为不同的处理组。
功效实验：在第0天，在1:1比率的基底胶的存在下，将完全人源化的HSC-NSG小鼠用1×106个BXPC3细胞(人胰腺癌细胞系，表达CEACAM5)进行皮下激发。在整个实验期间通过卡尺每周2至3次测量肿瘤。在第15天，针对肿瘤尺寸将小鼠随机化为具有250mm3的平均肿瘤尺寸，并且开始每周安排的疗法(媒介物(组氨酸缓冲液)、抗PD1(0376)、纳武单抗、派姆单抗或抗PD1-LAG3 0927)并且以最大400μl通过腹膜内注射给予。每周2-3次使用卡尺测量肿瘤生长并且如下计算肿瘤体积：
Tv：(W2/2)×L(W：宽度，L：长度)
研究在第47天终止。
b)结果
在47天时期内的肿瘤体积测量结果(mm3+/-SEM)在图14中以相应处理组内的平均体积示出。用CEACAM5-TCB处理仅显示出与未处理的媒介物组相同的疾病进展。相反，纳武单抗和派姆单抗减少肿瘤生长，然而，未达到肿瘤生长控制。令人惊讶的是，浓度为3mg/Kg的PD1/LAG3双特异性抗体0927在所有处理动物中完全抑制肿瘤生长，显示出除PD-1之外的LAG-3共阻断的协同作用。
在图15A至15F中，示出了每只单独动物在47天的时期内的肿瘤体积测量结果(mm3+/-SEM)，显示了每组中抗肿瘤反应的均一性。
针对CEACAM5 CD3 TCB单处理使用邓尼特方法(Dunnett’s Method)计算统计学显著性。为了测试多个比较的组平均值的显著差异，使用邓尼特方法自动产生标准方差分析(ANOVA)。邓尼特方法测试平均值是否与对照组的平均值不同。
所得的TGI和TCR值在表28中示出(TGI意指肿瘤生长抑制，TGI>100意指肿瘤消退，而TGI＝100定义为肿瘤停滞；TCR意指处理与对照的比率，TCR＝1意指没有效果，而TCR＝0定义为完全消退)。
表28：第46天时的肿瘤生长抑制(TGI)和处理与对照的比率(TCR)
Figure BDA0004029792780002131
与对照的比较使用邓尼特方法以p值进一步示出。
使用CEACAM5 CD3 TCB进行处理在胰腺癌的背景中不能控制肿瘤生长。然而，其与双特异性抗体抗PD1/LAG3 0927的组合以剂量特异性方式对肿瘤控制产生强烈影响。统计学分析显示，当与单处理相比时，具有两种浓度的抗PD1/LAG3 0927的组合，但不是具有抗PD1抗体纳武单抗和派姆单抗的组合导致肿瘤生长控制的统计学上显著的差异，表明了双特异性抗PD1/LAG3抗体对单独PD1的抑制的优越性，从而使肿瘤生长停滞。

Claims (9)

1.一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包含特异性结合程序性细胞死亡蛋白1(PD1)的第一抗原结合结构域和特异性结合淋巴细胞活化基因-3(LAG3)的第二抗原结合结构域，其中
特异性结合PD1的所述第一抗原结合结构域包含
VH结构域，所述VH结构域包含
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；以及
VL结构域，所述VL结构域包含
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，以及
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
2.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求1所述的双特异性抗体。
3.一种原核或真核宿主细胞，所述原核或真核宿主细胞包含根据权利要求2所述的多核苷酸。
4.一种产生根据权利要求1所述的双特异性抗体的方法，所述方法包括在适于表达所述双特异性抗体的条件下培养根据权利要求3所述的宿主细胞，以及从所述培养物中回收所述双特异性抗体。
5.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1所述的双特异性抗体和至少一种药学上可接受的赋形剂。
6.根据权利要求1所述的双特异性抗体或根据权利要求5所述的药物组合物，所述双特异性抗体或所述药物组合物用作药物。
7.根据权利要求1所述的双特异性抗体或根据权利要求5所述的药物组合物在制备用于治疗癌症或感染性疾病的药物中的用途。
8.一种治疗患有癌症或慢性病毒感染的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的根据权利要求1所述的双特异性抗体或根据权利要求5所述的药物组合物。
9.一种抑制个体中肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的根据权利要求1所述的双特异性抗体以抑制所述肿瘤细胞的生长。
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