CN108348601B - 与lag3结合的抗体治疗剂 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了涉及或来源于抗LAG3抗体的组合物和方法。更具体地，本申请公开了与LAG3结合的全人抗体、LAG3抗体结合片段和所述抗体的衍生物，以及包含所述片段的LAG3结合多肽。进一步地，本申请公开了编码所述抗体，抗体片段和衍生物及多肽的核酸，包含所述多核苷酸的细胞，制备所述抗体、抗体片段和衍生物及多肽的方法，以及使用所述抗体、抗体片段和衍生物及多肽的方法，包括治疗疾病的方法。

Description

与LAG3结合的抗体治疗剂
相关申请：
本申请要求2015年7月22日提交申请号为62/195,651的美国临时申请的优先权，其全文内容在此以引用方式并入本文。
序列表
本申请包含以ASCII格式电子提交的序列表，其全文内容在此以引用方式并入本文。所述ASCII副本创建于2016年7月20日，命名为126036-04720_SL.txt，其大小为21,123字节。
技术领域
本公开提供了涉及或源自抗LAG3抗体的组合物及方法。更具体地，本发明供与LAG3结合的全人抗体、LAG3-抗体结合片段和所述抗体的衍生物，以及包含所述片段的LAG3结合多肽。进一步地，本公开提供抗体片段和衍生物及多肽、包含所述多核苷酸的细胞、制备所述抗体、抗体片段和衍生物及多肽的方法，以及使用所述抗体、抗体片段和衍生物及多肽的方法，包括治疗疾病的方法。
背景技术
淋巴细胞活化基因-3或称LAG3(也称为CD223)是免疫球蛋白超基因家族的成员，并且在结构上和基因上与CD4有关。LAG3在休眠的外周血淋巴细胞上不表达，但在活化的T细胞和NK细胞上表达。LAG3是由位于12号染色体短臂远端部分、靠近CD4基因的基因编码的膜蛋白，表明LAG3基因可能通过基因复制而进化(Triebel et al.(1990)J.Exp.Med.171:1393-1405)。
与CD4类似，LAG3已被证明与MHC II类分子相互作用，但与CD4不同的是，LAG3不与人免疫缺陷病毒gp120蛋白相互作用(Baixeras et al.(1992)J.Exp.Med.176:327-337)。使用可溶性LAG3免疫球蛋白融合蛋白(sLAG3Ig)的研究证明了LAG3与MHC II类分子在细胞表面的直接和特异性结合(Huard et al.(1996)Eur.J.Immunol.26:1180-1186)。
在抗原特异性T细胞应答的体外研究中，加入抗LAG3抗体导致T细胞增殖提高、活化抗原如CD25的表达更高，以及细胞因子的浓度更高(如支持LAG3/MHC II类相互作用在下调CD4+T淋巴细胞的抗原依赖性刺激中的作用的干扰素-γ和白细胞介素-4)(Huard etal.(1994)Eur.J.Immunol.24:3216-3221)。已经证明LAG3的胞质内区域与名为LAP的蛋白相互作用，LAP被认为是参与CD3/TCR活化途径下调的信号转导分子(Iouzalen et al.(2001)Eur.J.Immunol.31:2885-2891)。此外，已显示CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)在活化时表达LAG3，而LAG3抗体在体外和体内均抑制由诱导的Treg细胞引起的抑制，表明LAG3有助于Treg细胞的抑制活性(Huang，C.et al.(2004)Immunity 21:503-513)。更进一步地，已显示LAG3在T细胞依赖性和独立机制中均通过调节性T细胞而负调节T细胞稳态(Workman andVignali(2005)J.Immunol.174:688-695)。
在某些情况下，LAG3也显示出具有免疫刺激作用。例如，与未转染的肿瘤细胞相比，移植到同系小鼠中的LAG3转染的肿瘤细胞显示生长减少或完全消退，表明肿瘤细胞上的LAG3表达通过经由MHC II类分子触发抗原LAG3呈递细胞而刺激抗肿瘤应答(Prigent etal.(1999)Eur.J.Immunol.29:3867-3876)。此外，已经证实，当与抗原一起给小鼠给药时，可溶性LAG3Ig融合蛋白刺激体液和细胞免疫应答，其表明可溶性LAG3Ig可以充当疫苗佐剂(El Mir and Triebel(2000)J.Immunol.164:5583-5589)。此外，已显示可溶性人LAG3Ig增强体外生成I型肿瘤特异性免疫(Casati et al.(2006)Cancer Res.66:4450-4460)。Triebel(2003)(Trends Immunol.24:619-622)进一步综述了LAG3的功能活性。鉴于上述情况，用于调节LAG3活性的其他药剂是令人感兴趣的。
发明内容
本发明提供了新型抗人LAG3(hLAG3)抗体及其片段。本发明涉及有利的抗LAG3抗体，例如，它们可以充当免疫检查点抑制剂，并且可以用于免疫治疗以治疗诸如癌症之类的疾病。
在一个实施例中，本公开提供以至少10-6M的结合亲和性结合LAG3表位的IgG类的全人抗体，其中所述抗体有与选自以下氨基酸序列至少95％相同的重链可变区序列：SEQID NO.1、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12及其组合，且有轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与选自以下氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.14及其组合。在一个实施例中，所述全人抗体具有重链和轻链，其中所述抗体具有选自以下序列的重链/轻链可变区序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2(此处称为L35D4)、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.3(此处称为L35G6)、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.4(此处称为L33H11)、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.5(此处称为L32A9)、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.6(此处称为L32D10)、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.7(此处称为L32A4)、SEQ ID NO.8/SEQ ID NO.9(此处称为L3A1)、SEQ ID NO.10/SEQ ID NO.11(此处称为L3A10)、SEQ ID NO.12/SEQ IDNO.13(此处称为L3C5)、SEQ ID NO.8/SEQ ID NO.14(此处称为L3E3)及其组合。
在一个实施例中，本公开提供具有来自重链的可变区和来自轻链的可变区的Fab全人抗体片段，其中所述重链可变区序列与选自以下氨基酸序列至少95％相同：SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12及其组合，且有轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与选自以下氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.14及其组合。在一个实施例中，所述全人抗体Fab片段具有重链可变区和轻链可变区，其中所述抗体具有选自以下序列的重链/轻链可变区序列：SEQ ID NO.1/SEQID NO.2、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.1/SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8/SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10/SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12/SEQ ID NO.13，和SEQ ID NO.8/SEQ IDNO.14，及其组合。
在一个实施例中，本发明提供单链人抗体，其具有来自重链的可变区和来自轻链的可变区以及连接重链和轻链可变区的肽接头，其中所述重链可变区序列与选自以下氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12，且有轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与选自以下氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14及其组合。在一个实施例中，所述全人单链抗体具有重链可变区和轻链可变区，其中所述单链全人抗体具有选自以下序列的重链/轻链可变区序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.7、SEQID NO.8/SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10/SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12/SEQ ID NO.13，和SEQID NO.8/SEQ ID NO.14，及其组合。
在一个实施例中，本公开进一步提供一种用于给药治疗广普哺乳动物癌症、感染性疾病或自身免疫反应的方法，包括给药抗LAG3多肽；其中所述全人抗体具有重链可变区序列，所述重链可变区序列与选自以下氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12及其组合，且具有轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与选自以下氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.14及其组合。
在一个实施例中，所述Fab全人抗体片段具有与以下氨基酸序列至少95％相同的重链可变区序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12及其组合，且具有轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与选自以下氨基酸序列至少95％相同：SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14及其组合。
在一个实施例中，所述单链人抗体具有与以下氨基酸序列至少95％相同的重链可变区序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12及其组合，且具有轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与选自以下氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14及其组合。
在一个实施例中，所述全人抗体具有重链可变区和轻链可变区，其中所述抗体具有选自以下序列的重链/轻链可变区序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2(此处称为L35D4)、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.3(此处称为L35G6)、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.4(此处称为L33H11)、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.5(此处称为L32A9)、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.6(此处称为L32D10)、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.7(此处称为L32A4)、SEQ ID NO.8/SEQ ID NO.9(此处称为L3A1)、SEQ ID NO.10/SEQ ID NO.11(此处称为L3A10)、SEQ ID NO.12/SEQ ID NO.13(此处称为L3C5)、SEQ ID NO.8/SEQ ID NO.14(此处称为L3E3)及其组合。在一个实施例中，所述全人单链抗体具有重链可变区和轻链可变区，其中所述单链全人抗体具有选自以下序列的重链/轻链可变区序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQID NO.1/SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.1/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8/SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10/SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12/SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.8/SEQ ID NO.14及其组合。
在一个实施例中，所述待治疗的广谱哺乳动物癌症、感染性疾病或自身免疫反应选自：非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma，NHL)、伯基特淋巴瘤(Burkitt'slymphoma，BL)、多发性骨髓瘤(MM)、B型慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)、B和T型急性淋巴细胞白血病(ALL)、T细胞淋巴瘤(TCL)、急性骨髓细胞白血病(AML)、毛细胞白血病(HCL)、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's Lymphoma，HL)和慢性骨髓细胞白血病(CML)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性骨髓细胞白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性骨髓细胞白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)、乳腺癌、卵巢癌、头颈癌、膀胱癌、黑素瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、肺癌、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、神经胶质瘤、恶性胶质瘤和实体瘤，其中所述实体瘤选自乳腺肿瘤、卵巢肿瘤、肺肿瘤、胰腺肿瘤、前列腺肿瘤、黑素瘤肿瘤、结肠直肠肿瘤、肺肿瘤、头颈肿瘤、膀胱肿瘤、食道肿瘤、肝肿瘤和肾肿瘤。
在一个实施例中，本发明提供与LAG3表位结合的IgG类的分离的全人抗体，所述抗体包含：与选自以下氨基酸序列至少95％相同的重链可变区序列：SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.10，和SEQ ID NO.12；与选自以下氨基酸序列至少95％相同的轻链可变区序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14。
在一个实施例中，所述全人抗体包含选自以下序列的重链/轻链可变区序列：SEQID NO.1/SEQ ID NO.2(L35D4)、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.3(L35G6)、SEQ ID NO.1/SEQ IDNO.4(L33H11)、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.5(L32A9)、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.6(L32D10)、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.7(L32A4)、SEQ ID NO.8/SEQ ID NO.9(L3A1)、SEQ ID NO.10/SEQID NO.11(L3A10)、SEQ ID NO.12/SEQ ID NO.13(L3C5)、SEQ ID NO.8/SEQ ID NO.14(L3E3)。
在一个实施例中，本发明的特征在于抗LAG3全人抗体Fab片段，其包含与以下氨基酸序列至少95％相同的重链可变区序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10，和SEQID NO.12；且包含与选自以下氨基酸序列至少95％相同的轻链可变区序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQID NO.11、SEQ ID NO.13，和SEQ ID NO.14。在一个实施例中，所述全人抗体Fab片段包含选自以下序列的重链/轻链可变区序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.1/SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8/SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10/SEQ ID NO.11、SEQID NO.12/SEQ ID NO.13，和SEQ ID NO.8/SEQ ID NO.14。
在一个实施例中，本发明提供抗LAG3单链人抗体，其包含由肽接头连接的重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含与选自以下氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10，和SEQ ID NO.12；且所述轻链可变区包含与选自以下氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.13，和SEQ ID NO.14。
在一个实施例中，所述单链全人抗体包含选自以下序列的重链/轻链可变区序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.4、SEQID NO.1/SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8/SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10/SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12/SEQ ID NO.13，和SEQ IDNO.8/SEQ ID NO.14。
在一个实施例中，本发明提供分离的抗人LAG3(hLAG3)抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区，所述重链可变区包含如选自如下的重链可变区氨基酸序列中所示的互补决定区(CDR)：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10，和SEQ ID NO.12；且包含轻链可变区，所述轻链可变区包含如选自如下的轻链可变区氨基酸序列中所示的CDR：SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13，和SEQ ID NO.14。在一个实施例中，所述重链可变区包含与选自以下氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.10，和SEQ ID NO.12；且所述轻链可变区包含与选自以下氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14。在一个实施例中，所述重链可变区包含选自以下序列的氨基酸序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10，和SEQ ID NO.12；且所述轻链可变区包括选自以下序列的氨基酸序列：SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14。
在另一个实施例中，本发明的特征在于分离的抗人LAG3(hLAG3)抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区，所述重链可变区包含选自以下序列组的重链CDR组(CDR1、CDR2和CDR3)：SEQ ID No：15，16和17；SEQ ID No：36，37和38；SEQ ID No：42，43和44；SEQ IDNo：48，49和50；且包含轻链可变区，所述轻链可变区包含选自以下序列组的轻链CDR组(CDR1、CDR2和CDR3)：SEQ ID No：18，19和20；SEQ ID No：21，22和23；SEQ ID No：24，25和26；SEQ ID No：27，28和29；SEQ ID No：30，31和32；SEQ ID No：33，34和35；SEQ ID No：39，40和41；SEQ ID No：45，46和47；SEQ ID No：51，52和53；SEQ ID No：54，55和56。
在一个实施例中，所述抗体包含重链CDR组/轻链CDR组，其选自以下序列组：重链可变区CDR组：SEQ ID No：15，16和17，以及轻链可变区CDR组：18，19和20；重链可变区CDR组：SEQ ID No：15，16和17，以及轻链可变区CDR组：21，22和23；重链可变区CDR组：SEQ IDNo：15，16和17，以及轻链可变区CDR组：24，25和26；重链可变区CDR组：SEQ ID No：15，16和17，以及轻链可变区CDR组：27，28和29；重链可变区CDR组：SEQ ID No：15，16和17，以及轻链可变区CDR组：30，31和32；重链可变区CDR组：SEQ ID No：15，16和17，以及轻链可变区CDR组：33，34和35；重链可变区CDR组：SEQ ID No：36，37和38，以及轻链可变区CDR组：39，40和41；重链可变区CDR组：SEQ ID No：42，43和44，以及轻链可变区CDR组：45，46和47；重链可变区CDR组：SEQ ID No：48，49和50，以及轻链可变区CDR组：51，52和53；重链可变区CDR组：SEQID No：36，37和38，以及轻链可变区CDR组：54，55和56。
在一个实施例中，抗LAG3抗体或抗体片段可用于治疗患有癌症、感染性疾病或自身免疫疾病的对象的方法中，所述方法包括向对象给药有效量的抗LAG3抗体或抗体片段。
在一个实施例中，所述癌症选自非霍奇金淋巴瘤(NHL)、伯基特淋巴瘤(BL)、多发性骨髓瘤(MM)、B型慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)、B和T型急性淋巴细胞白血病(ALL)、T细胞淋巴瘤(TCL)、急性骨髓细胞白血病(AML)、毛细胞白血病(HCL)、霍奇金淋巴瘤(HL)和慢性骨髓细胞白血病(CML)、黑素瘤、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌和肺癌。
在另一个实施例中，所述癌症选自骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门癌、胃癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病，所述慢性或急性白血病包括急性骨髓细胞白血病、慢性骨髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、儿童实体瘤、淋巴细胞白血病、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症以及由石棉诱导的癌症。
在另一个实施例中，所述癌症是表达PD-L1的转移性癌症。
在一个实施例中，所述感染性疾病选自HIV、肝炎(Hepatitis，A、B和C)、流行性感冒(Influenza)、疱疹(Herpes)、贾第虫(Giardia)、疟疾(Malaria)、利什曼虫(Leishmania)、金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、虫媒病毒(flaviviruses)、艾柯病毒(echovirus)、鼻病毒(rhinovirus)、柯萨奇病毒(coxsackie virus)、冠状病毒(coronavirus)、呼吸道合胞体病毒(respiratorysyncytial virus)、腮腺炎病毒(mumps virus)、轮状病毒(rotavirus)、麻疹病毒(measlesvirus)、风疹病毒(rubella virus)、细小病毒(parvovirus)、牛痘病毒(vaccinia virus)、HTLV病毒、登革热病毒(dengue virus)、乳头瘤病毒(papillomavirus)、软疣病毒(molluscum virus)、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、狂犬病病毒(rabies virus)、JC病毒和虫媒病毒脑炎病毒(arboviral encephalitis virus)。
在另一个实施例中，所述感染性疾病选自衣原体(chlamydia)、立克次体细菌(rickettsial bacteria)、分枝杆菌(mycobacteria)、葡萄球菌(staphylococci)、链球菌(streptococci)、肺炎球菌(pneumonococci)、脑膜炎球菌和淋球菌(meningococci andgonococci)、克雷伯氏杆菌(klebsiella)、变形杆菌(proteus)、沙雷氏菌(serratia)、假单胞菌(pseudomonas)、军团杆菌(legionella)、白喉(diphtheria)、沙门氏菌(salmonella)、杆菌(bacilli)、霍乱(cholera)、破伤风(tetanus)、肉毒中毒(botulism)、炭疽(anthrax)、瘟疫(plague)、细螺旋体病(leptospirosis)和莱姆病细菌(Lyme disease bacteria)。
在另一个实施例中，所述感染性疾病选自痢疾阿米巴(Entamoeba histolytica)、结肠小袋纤毛虫(Balantidium coli)、福氏耐格里阿米巴(Naegleria fowleri)、棘阿米巴属(Acanthamoeba sp.)、氏贾第鞭毛虫(Giardia lambia)、隐孢子虫属(Cryptosporidiumsp.)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、田鼠巴贝虫(Babesia microti)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼虫(Leishmania donovani)、鼠弓形虫(Toxoplasma gondii)和巴西日圆线虫(Nippostrongylus brasiliensis)。
在一个实施例中，所述自身免疫病选自阿尔茨海默病(Alzheimer's disease)、过敏症(allergy)、哮喘(asthma)、乳糜泻(celiac disease)、克罗恩病(Crohn's disease)、格雷夫病(Grave's disease)、炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)、狼疮(lupus)、多发性硬化症(multiple sclerosis)、重症肌无力(Myasthenia Gravis)、风湿性多肌痛(polymyalgia rheumatica)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、I型糖尿病(type I diabetes)和血管炎(vasculitis)。
在一些实施例中，本发明的抗LAG3抗体或其抗原结合片段的结合亲和性(KD)至少为1x 10-6M。在其他实施例中，本发明的抗体或其抗原结合片段的KD至少为1x10-7M。在其他实施例中，本发明的抗体或其抗原结合片段的KD至少为1x 10-8M。
在一些实施例中，所述抗体是IgG1同种型。在其他实施例中，所述抗体是IgG4同种型。
在一个实施例中，本申请所述的抗体或抗原结合片段是重组体。在另一个实施例中，本申请所述的抗体或抗原结合片段是重组人抗体或抗体的抗原结合片段。
在一个实施例中，本发明提供包含有效量的本申请公开的抗LAG3抗体或抗体片段的药物组合物和药学上可接受的载体。
附图说明
图1显示了几种抗LAG3抗体对活化T细胞具有反应性，表示为％阳性细胞。
图2显示了抗hLAG3抗体L35G6、L33H11、L35D4、L32A9、L32A4和L32D10对重组小鼠LAG3和人LAG3的交叉反应性。使用抗AIP抗体C7作为对照。
图3显示了确定抗LAG3抗体对表达LAG3的T细胞的作用的结果。如图3所示，计算相对于培养基对照的百分比变化。使用同种型匹配IgG作为对照(cIg)。
图4提供了使用混合淋巴细胞反应(MLR)来测量T细胞活化的体外研究结果。测定细胞的CD25表达作为T细胞活化的量度(％CD25阳性)。
图5显示了确定抗LAG3抗体L32D10、L3E3、L3C5和L3A1(浓度为5μg/ml和0.5μg/ml)对IL-2细胞因子产生的作用的ELISA测定结果。
图6显示了确定抗LAG3抗体L32D10、L3E3、L3C5和L3A1(浓度为5μg/ml和0.5μg/ml)对干扰素γ(IFNγ)细胞因子产生的作用的ELISA测定结果。
具体实施方式
概念定义
术语“肽”、“多肽”和“蛋白”各指的是包括两个或多个氨基酸残基通过肽键彼此结合的分子。这些术语涵盖例如天然和人工蛋白、蛋白片段和蛋白序列的多肽类似物(例如突变蛋白、变体蛋白或融合蛋白)，以及翻译后修饰蛋白，或共价或非共价修饰蛋白。肽、多肽或蛋白可以为单体或聚合物。
多肽(例如，抗体)的“变体”包括：相对于另一多肽序列而插入、删除和/或取代了一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。公开的变体包括，例如，融合蛋白。
多肽的“衍生物”是经过化学修饰的多肽(例如，抗体)，例如通过连接另一个化学部分(例如，聚乙二醇或白蛋白，如人血清白蛋白)、磷酸化和糖基化。
除非另有说明，术语“抗体”除了包括2条全长重链(每条链包含可变区和恒定区)和两条全长轻链(每条链包含可变区和恒定区)的抗体之外，还包括其衍生物、变体、片段或突变体，其例子在下文有描述。
“抗原结合蛋白”是一种蛋白质，其包括结合至抗原的一部分，和可选地，使抗原结合部分采用促进抗原结合蛋白结合至抗原的构象的骨架或框架部分。抗原结合蛋白的示例包括抗体、抗体片段(例如，抗体的抗原结合部分)、抗体衍生物和抗体类似物。所述抗原结合蛋白可以包括，例如，具有移植的CDR或CDR衍生物的可替代的蛋白质骨架或人工骨架。这些骨架包括，但不限于，抗体衍生的骨架(包括引入以例如使抗原结合蛋白的三维结构稳定的突变)以及完全合成的骨架，包括，例如，生物相容性聚合物。参见，例如：Korndorfer etal.，2003，Proteins:Structure，Function，and Bioinformatics，Volume 53，Issue 1:121-129；Roque et al.，2004，Biotechnol.Prog.20:639-654。此外，可以使用肽抗体类似物(“PAM”)以及基于抗体类似物的骨架(利用纤维连接蛋白组件作为骨架)。
抗原结合蛋白可以具有，例如，天然存在的免疫球蛋白(例如IgG)的结构。“免疫球蛋白G”(或IgG)是四聚体分子。在天然存在的IgG中，每个四聚体由两个相同的多肽链对组成，每对具有一条“轻”(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基端部分包括主要负责抗原识别的、约100至110或更多个氨基酸的可变区(或域)。每条链的羧基端部分定义主要负责效应子功能的恒定区。人轻链分为κ或λ轻链。重链分为μ、Δ、γ、α或ε，分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。优选地，本申请公开的所述抗LAG3抗体的特征在于其重链和轻链氨基酸序列中的可变区序列(VH和VL)。在轻链和重链中，所述可变区和恒定区由约12个或以上氨基酸的“J”区连接，且重链还包括含约10个或以上氨基酸的“D”区。一般参见，《基础免疫学》(Fundamental Immunology)第7章(Paul，W.，ed.，2nded.Raven Press，N.Y.(1989))。每条轻/重链的可变区配对形成抗体结合位点，使得完整的免疫球蛋白具有两个结合位点。
天然存在的免疫球蛋白链的可变区显示出相同的一般结构：由三个高变区(也称为互补决定区或CDR)连接相对保守的构架区(FR)。从N端至C端，轻链和重链都包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每个结构域中的氨基酸分配可以与Kabat et al.在Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.，US Dept.of Health andHuman Services，PHS，NIH，NIH Publication no.91-3242，1991中所述一致。其他的免疫球蛋白链氨基酸编号系统包括IMGT.RTM.(国际免疫遗传学信息系统(InternationalImMunoGeneTics information system)；Lefranc et al.，Dev.Comp.Immunol.29:185-203；2005)和AHo(Honegger and Pluckthun，J.Mol.Biol.309(3):657-670；2001)。
在一个实施例中，除非另有说明，“抗体”是指完整的免疫球蛋白(例如IgG)或与完整的抗体为特异性结合而竞争的抗原结合部分。在一个实施例中，所述完整的抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。重链和轻链可变区序列和CDR可分别选自本文描述的SEQ ID No：1到14和SEQ ID No：15到56。
本文所用术语“单特异性”是指对一个特定抗原表位显示出亲和力的抗体。单特异性抗体制剂可以由约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或99.9％的针对特定抗原具有特异性结合活性的抗体组成。
“抗体片段”、“抗体的抗原结合部分”或“抗体的抗原结合片段”包含完整抗体的一部分，优选包含抗体抗原结合或可变区。抗体片段的示例包括Fab、Fab'，F(ab')2、Fv片段和线性抗体。
Fab片段为具有VL、VH、CL和CH1结构域的单价片段；F(ab')2片段为双价片段，其通过在铰链区的二硫键连接2个Fab片段；Fd片段具有VH和CH1结构域；Fv片段具有抗体的单臂的VL和VH结构域；并且dAb片段具有VH结构域、VL结构域，或VH或VL结构域的抗原结合片段(美国专利6，846，634；6，696，245，美国专利申请公开20/0202512；2004/0202995；2004/0038291；2004/0009507；20 03/0039958，和Ward et al.，Nature 341:544-546，1989)。
单链抗体(scFv)是一种抗体，其中VL和VH区由连接子(例如，氨基酸残基合成序列)连接以形成连续蛋白链，且该连接子的长度足以允许所述蛋白链自身折叠并形成单价抗原结合位点(例如参见Bird et al.，1988，Science 242:423-26和Huston et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-83))。
双抗体是包含两条多肽链的二价抗体，其中每条多肽链包括由连接子连接的VH和VL域，且所述连接子长度短，不允许同一条链上的两个域之间配对，由此每个域能够与另一条多肽链上的互补域配对(例如参见Holliger et al.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-48，和Poljak et al.，1994，Structure 2:1121-23)。如果双抗体的两条多肽链是相同的，那么来源于其配对的双抗体将具有2个相同的抗原结合位点。具有不同序列的多肽链可以用于制备具有2个不同抗原结合位点的双抗体。类似地，三抗体和四抗体分别为包含3条和4条多肽链并分别形成3个和4个抗原结合位点(可以是相同的或是不同的)的抗体。
抗原结合蛋白如抗体可以具有一个或多个结合位点。如果多于一个结合位点，那么结合位点可以与另一个结合位点相同或不同。例如，天然存在的人免疫球蛋白通常具有两个相同的结合位点，而“双特异性”或“双功能”抗体具有两个不同的结合位点。
术语“人抗体”包括所有具有来自人免疫球蛋白序列的一个或多个可变区和恒定区的抗体。在一个实施例中，所有的抗体可变区和恒定区均源自人免疫球蛋白序列(称为全人抗体)。这些抗体可以从多种途径制备，下文对此进行了举例，包括通过与小鼠的目标抗原的免疫反应，其中小鼠经过基因改造以表达源自人重链和/或轻链编码基因的抗体。在一个优选的实施例中，使用重组方法制备全人抗体。
“人源化抗体”的序列与来源于非人物种的抗体的序列不同，区别在于一个或更多个氨基酸取代、删除和/或增加，使得当人对象服用时，人源化抗体相比非人物种的抗体不太可能诱导免疫应答，和/或诱导的免疫应答不太严重。在一个实施例中，使非人物种抗体的重链和/或轻链的框架和恒定区中的某些氨基酸突变以产生人源化抗体。在另一个实施例中，来自人抗体的恒定区融合至非人物种的可变区中。在另一个实施例中，改变非人抗体的一个或多个CDR序列中的一个或多个氨基酸残基，以降低所述非人抗体向人类对象给药时可能的免疫原性，其中改变的氨基酸残基要么对于所述抗体与其抗原的免疫特异结合来说并不重要，或所述氨基酸序列的改变是保守变化，由此所述人源化抗体与抗原的结合并不显著差于所述非人抗体与抗原的结合。如何制备人源化抗体的示例可以参见美国专利6054297，5886152和5877293。
术语“嵌合抗体”是指包含来自一个抗体的一个或多个区和来自一个或多个其他抗体的一个或多个区的抗体。在一个实施例中，一个或多个CDR来源于人抗LAG3抗体。在另一个实施例中，所有CDR都源自人抗LAG3抗体。在另一个实施例中，源自多个人抗LAG3抗体的CDR混合搭配在嵌合抗体中。例如，嵌合抗体可以包括来自第一个人抗PAR-2抗体的轻链的CDR1、来自第二个人抗LAG3抗体的轻链的CDR2和CDR3，以及来自第三个抗LAG3抗体的重链的CDR。其它组合也是可能的。
此外，框架区可以来源于相同抗LAG3抗体中的一个、来自一个或更多个不同抗体，比如人抗体，或来自人源化抗体。在嵌合抗体的一个示例中，重链和/或轻链的一部分与一种来自特定物种或属于特定抗体类或子类的抗体相同、同源，或衍生自该抗体，而链的剩余部分与来自另一物种或属于特定抗体类或子类的抗体相同、同源或衍生自该抗体。还包括所述抗体具有所需生物活性(即，能够特异性结合LAG3的能力)的片段。
“CDR接枝抗体”是包含来自特定物种或同种型(isotape)的抗体的一个或多个CDR和来自相同或不同物种或同种型的另一抗体的框架的抗体。
“多特异抗体”是识别一种或多种抗原上的多个表位的抗体。此类型抗体的一个子类为“双特异抗体”，其识别相同或不同抗原上的两个不同表位。
若抗原结合蛋白在结合抗原(例如人LAG3)时的解离常数为1纳摩尔或以下，则称其与抗原“特异性结合”。
“抗原结合域”、“抗原结合区”或”抗原结合位点”为包含与抗原相互作用并造成抗原结合蛋白对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基(或其它部分)的抗原结合蛋白的一部分。对于特异性结合至其抗原的抗体，这包括其CDR域中的至少一个的至少一部分。
术语“Fc多肽”包括源于抗体Fc区的多肽的原生和突变蛋白形式。还包括包含促进二聚化的铰链区的所述多肽的截短形式。包含Fc部分的融合蛋白(及由此形成的低聚体)提供的有益效果在于，易于通过蛋白质A或蛋白质G柱来以亲和层析法进行纯化。
“表位”是通过抗原结合蛋白(例如，通过抗体)结合的分子的部分。表位可以包括该分子的非邻近部分(例如，在多肽中，在多肽一级序列中并不相邻但在该多肽的三级和四级结构中相互足够靠近从而被抗原结合蛋白结合的氨基酸残基)。
两个多核苷酸或两个多肽序列的“相同百分比”或“同源百分比”是用GAP电脑程序(GCG Wisconsin Package，version 10.3(Accelrys，San Diego，Calif.)中的一部分)以其默认参数来比较序列而确定的。
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”在全文中可交换地使用，其包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如mRNA)、以核苷酸类似物生成的DNA或RNA类似物(例如，肽核酸和非天然存在核苷酸类似物)及其杂合体。核酸分子可以为单链或双链。在一个实施例中，本发明的核酸分子包括编码抗体的连续开放阅读框，或片段、衍生物、突变体，或变体。
如果两条单链多聚核苷酸的序列可以在反向平行的方向对齐，使得在没有引入空位且任一序列的5'或3'端均无不配对的核苷酸的情况下，其中一条多聚核苷酸中的每个核苷酸均可与另一条多聚核苷酸中的互补核苷酸相对，那么该两个单链多聚核苷酸是彼此的“互补物”(complement)。如果两条多聚核苷酸可在中等严格的条件下彼此杂交，那么该多聚核苷酸是与另一多聚核苷酸“互补”(complementary)。因此，一条多聚核苷酸可以与另一条多聚核苷酸互补而无需是其互补物。
“载体”为一条核酸，其可以用于将连接至该载体的其它核酸引入细胞。一种载体类型是“质粒”，其指的是可将额外核酸片段连接入其中的线形或环形双链DNA分子。另一种载体类型是病毒载体(例如复制缺陷反转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其中额外DNA片段可引入病毒基因组中。某些载体被引入宿主细胞后能够进行自主复制(例如，包含细菌复制起点的细菌载体和附加体哺乳类载体)。其他载体(例如，非附加体哺乳类载体)在引入宿主细胞时整合入宿主细胞的基因组，由此随着宿主基因组进行复制。“表达载体”是一种能够指导选定的多核苷酸表达的载体类型。
当核苷酸序列所连接的调控序列影响该核苷酸序列的表达(例如表达的水平、时机或位点)时，则称所述核苷酸序列“可操作地”连接到所述调控序列。“调控序列”是能够影响与之可操作地连接的核酸的表达(例如表达水平、时机或位点)的核酸。例如，调控序列可以直接对其所调控的核酸起作用，或通过一个或多个其他分子(例如与所述调控序列和/或核酸结合的多肽)来起作用。调控序列的示例包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。调控序列的更多示例记述在例如Goeddel，1990，Gene ExpressionTechnology:Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.和Baronet al.，1995，Nucleic Acids Res.23:3605-06.中。
“宿主细胞”是可用于表达核酸例如本发明核酸的细胞。宿主细胞可以是原核细胞，例如大肠杆菌(E.coli)；或其可以是真核细胞，例如真核单细胞(如酵母菌或其他真菌)、植物细胞(例如，烟草或番茄植物细胞)、动物细胞(如人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、小鼠细胞、大鼠细胞或昆虫细胞)或杂种细胞。宿主细胞的示例包括猴肾细胞COS-7系(ATCC CRL1651)(参见Gluzman et al.，1981，Cell 23:175)、L细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCC CCL163)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或其衍生物(例如Veggie CHO)和在无血清培养基上生长的相关细胞系(参见Rasmussen et al.，1998，Cytotechnology 28:31)，或CHO的DX-B11品系(DHFR缺失)(参见Urlaub et al.，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-20)、HeLa细胞、BHK(ATCC CRL 10)细胞系、源于非洲绿猴肾细胞系CV1的CV1/EBNA细胞系(ATCC CCL70)(参见McMahan et al.，1991，EMBO J.10:2821)、人胚肾细胞(例如293、293EBNA或MSR293)、人表皮A431细胞、人Colo205细胞、其他转化灵长类细胞系、正常二倍体细胞、源于初生组织和初生外植体的体外培养所得的细胞系、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞。在一个实施例中，宿主细胞是非人宿主细胞的哺乳动物宿主细胞。通常，宿主细胞是能够用编码多肽的核酸(其随后可以在宿主细胞中表达)转化或转染的培养的细胞。术语“重组宿主细胞”可用于表示已经用待表达的核酸转化或转染后的宿主细胞。宿主细胞也可以是，包含核酸，但除非将调节序列引入到所述宿主细胞并可操作地连接至所述核酸，否则不以期望水平表达所述核酸的细胞。应当理解，术语“宿主细胞”并不单指特定的对象细胞，而是也指所述细胞的后代或潜在后代。由于例如突变或环境影响的存在，后代中可能产生某些修饰，使得这些后代事实上与其亲代细胞并不等同，但其仍应属于本申请中的“宿主细胞”术语所涵盖的范围。
术语“重组抗体”是指从用一个或多个包含抗体编码序列(例如编码重链或轻链DNA序列)的表达载体转染后的细胞或细胞系中表达的抗体，其中所述编码序列不与细胞天然相关。在一个实施例中，在自然环境下存在时，重组抗体的糖基化模式不同于具有相同序列的抗体的糖基化模式。在一个实施例中，重组抗体在非人宿主细胞的哺乳动物宿主细胞中表达。值得注意的是，个体哺乳动物宿主细胞具有独特的糖基化模式
本申请所用术语“有效量”是指与LAG3结合的抗体或其抗原结合部分的量，该量足以在给药于对象时达到有效治疗、预后或诊断如本申请所述与LAG3依赖信号相关的疾病的效果。本申请提供的抗体在单独或以组合使用时的治疗有效量，，其变化取决于抗体及其组合的相对活性(例如，在抑制细胞生长中)，且取决于所治疗的对象和疾病状况、对象的体重和年龄、疾病状况的严重程度、给药方式等，其可以由本领域普通技术人员容易地确定。
术语“分离的”是指蛋白质(例如抗体)基本上不含其它细胞材料和/或化学物质。在一个实施例中，分离的抗体由来自不同物种的细胞表达(例如，在CHO细胞中表达的人抗体)，并且基本上不含来自该不同物种的其它蛋白质。通过使用本领域熟知的蛋白质纯化技术进行分离，该蛋白质可以基本上不含天然伴生组分(或与用于产生抗体的细胞表达系统相关的组分)。在一个实施例中，本发明的抗LAG3抗体或抗原结合片段是分离的。
“中和性抗体”或“抑制性抗体”为，当使用如此述的实施例中的试验时，过量的抗LAG3抗体降低至少约20％的活化量时，抑制LAG3的蛋白水解活性的抗体。在各种实施例中，抗原结合蛋白降低至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％和99.9％LAG3蛋白水解活化量。
LAG3抗原结合蛋白
本发明涉及LAG3结合蛋白，特别是抗LAG3抗体或其抗原结合部分及其用途。本发明的各个方面涉及抗体和抗体片段、药物组合物、核酸、重组表达载体，以及用于制备所述抗体和片段的宿主细胞。本发明还包括使用本发明抗体在体外或体内检测人LAG3以抑制LAG3活性，以及预防或治疗疾病如癌症的方法。
如下表3所述，本发明包括对人LAG3有特异性的新型人抗体重链和轻链可变区和CDRs。
在一个实施例中，本发明提供抗LAG3抗体或其抗原结合片段，其包括具有可变区的重链，所述重链可变区包括如以下任一序列中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.10，和SEQ ID NO.12。在一个实施例中，本发明提供抗LAG3抗体或其抗原结合片段，其包括具有可变区的轻链，所述轻链可变区包括如以下任一序列中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13，和SEQ ID NO.14。在一个实施例中，本发明提供抗LAG3抗体或其抗原结合片段，其包括具有可变区的轻链，所述轻链可变区包括如以下任一序列中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13，和SEQ IDNO.14；和具有可变区的重链，所述可变区包括如以下任一序列中所示的氨基酸序列：SEQID NO.1、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10，和SEQ ID NO.12。
在一个实施例中，本发明提供以至少10-6M的结合亲和性结合LAG3表位的IgG类的全人抗体，其中所述抗体有与选自以下氨基酸序列至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同的重链可变区序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.8、SEQID NO.10、SEQ ID NO.12及其组合，且有轻链可变区序列，该轻链可变区序列与选自以下氨基酸序列至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、或至少99％相同：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14及其组合。
在一个实施例中，所述全人抗体具有重链和轻链，其中所述抗体具有选自以下序列的重链/轻链可变区序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2(此处称为L35D4)、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.3(此处称为L35G6)、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.4(此处称为L33H11)、SEQ IDNO.1/SEQ ID NO.5(此处称为L32A9)、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.6(此处称为L32D10)、SEQID NO.1/SEQ ID NO.7(此处称为L32A4)、SEQ ID NO.8/SEQ ID NO.9(此处称为L3A1)、SEQID NO.10/SEQ ID NO.11(此处称为L3A10)、SEQ ID NO.12/SEQ ID NO.13(此处称为L3C5)、SEQ ID NO.8/SEQ ID NO.14(此处称为L3E3)及其组合。
互补决定区(CDR)在抗体的轻链和重链可变区中都被称为高变区。可变区的较高度恒定部分被称为框架(FR)。可以利用本领域公知的系统，例如Kabat等人的上述文献、Lefranc等人的上述文献和/或Honegger和Pluckthun的上述文献中描述的系统来识别指定抗体的互补决定区(CDR)和框架区(FR)。例如，Kabat等人(1991，NIH Publication 91-3242，National Technical Information Service，Springfield，Va.)所描述的编号系统是本领域技术人员所熟知的。Kabat等人定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员可以明确地将该系统的“Kabat编号”分配给任何可变区氨基酸序列，而不依赖于序列本身以外的任何实验数据。
在一些实施例中，本发明提供包含表3(SEQ ID No：1至14)中所述的重链和轻链可变区的CDR的抗LAG3抗体。例如，本发明提供抗LAG3抗体或其抗原结合片段，其包括具有以下任一氨基酸序列所示的CDR的重链可变区：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10，和SEQ ID NO.12。在一个实施例中，本发明提供抗LAG3抗体或其抗原结合片段，其包括具有以下任一序列所示的氨基酸序列所描述的CDR的轻链可变区：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.13，和SEQ ID NO.14。在一个实施例中，本发明提供抗LAG3抗体或其抗原结合片段，其包括具有以下任一序列所示的氨基酸序列所描述的CDR的轻链可变区：SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.13，和SEQ ID NO.14；和具有以下任一序列所示的氨基酸序列所描述的CDR的重链可变区：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10，和SEQ ID NO.12。
在一个实施例中，本发明的特征在于分离的抗人LAG3(hLAG3)抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区，所述重链可变区包含选自以下序列组的重链CDR组(CDR1、CDR2和CDR3)：SEQ ID No：15，16和17；SEQ ID No：36，37和38；SEQ ID No：42，43和44；SEQ ID No：48，49和50；且包含轻链可变区，所述轻链可变区包含选自以下序列组的轻链CDR组(CDR1、CDR2和CDR3)：SEQ ID No：18，19和20；SEQ ID No：21，22和23；SEQ ID No：24，25和26；SEQID No：27，28和29；SEQ ID No：30，31和32；SEQ ID No：33，34和35；SEQ ID No：39，40和41；SEQ ID No：45，46和47；SEQ ID No：51，52和53；SEQ ID No：54，55和56。
在一个实施例中，本发明的所述抗体包含选自以下的重链CDR组/轻链CDR组：重链可变区CDR组：SEQ ID No：15，16和17，以及轻链可变区CDR组：18，19和20；重链可变区CDR组：SEQ ID No：15，16和17，以及轻链可变区CDR组：21，22和23；重链可变区CDR组：SEQ IDNo：15，16和17，以及轻链可变区CDR组：24，25和26；重链可变区CDR组：SEQ ID No：15，16和17，以及轻链可变区CDR组：27，28和29；重链可变区CDR组：SEQ ID No：15，16和17，以及轻链可变区CDR组：30，31和32；重链可变区CDR组：SEQ ID No：15，16和17，以及轻链可变区CDR组：33，34和35；重链可变区CDR组：SEQ ID No：36，37和38，以及轻链可变区CDR组：39，40和41；重链可变区CDR组：SEQ ID No：42，43和44，以及轻链可变区CDR组：45，46和47；重链可变区CDR组：SEQ ID No：48，49和50，以及轻链可变区CDR组：51，52和53；重链可变区CDR组：SEQID No：36，37和38，以及轻链可变区CDR组：54，55和56。
在一个实施例中，本发明提供抗LAG3抗体或其抗原结合片段，其包括重链，所述重链包含如以下任一序列所述的CDR3域：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ IDNO.12，且包括可变区，所述可变区包含与以下任一序列至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.8、SEQID NO.10或SEQ ID NO.12。在一个实施例中，本发明提供抗LAG3抗体或其抗原结合片段，其包括重链，所述重链包含如以下任一序列所述的CDR3域：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.13或SEQ ID NO.14，且具有轻链可变区，所述轻链可变区包含与以下任一序列所示的至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14。因此，在一些实施例中，CDR3域保持不变，而其余CDR和/或重链或轻链可变区序列的框架区可引入可变性，而抗体或其抗原结合片段保留结合LAG3的能力，并保留亲本功能特征，例如结合亲和性。
可以将一个或多个CDR通过共价键或非共价键整合到分子中以使其成为抗原结合蛋白。
抗原结合蛋白可以使CDR整合为较大的多肽链的一部分，可以通过共价键将CDR连接至另一条多肽链，或可以通过非共价键整合CDR。CDR使该抗原结合蛋白特异性结合至感兴趣的特定抗原。
在一个实施例中，在至少95％相同(或至少96％相同、或至少97％相同、或至少98％相同或至少99％相同)的重链或轻链中进行的置换是保守性氨基酸置换。“保守性氨基酸置换”是指氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链(R基团)的另一个氨基酸残基所置换。通常，保守性氨基酸置换基本上不会改变蛋白质的功能特性。在两个或更多个氨基酸序列因保守性置换彼此不同的情况下，可以向上调整序列同一性百分比或相似程度，对置换的保守性质作出校正。用于进行所述调整的方法是本领域技术人员所熟知的。例如，参见Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331，其通过引用并入本文。具有相似化学性质的侧链的氨基酸组的示例包括(1)脂肪族侧链：甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳香族侧链：苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸；(5)基础侧链：赖氨酸，精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，和(7)含硫侧链是半胱氨酸和甲硫氨酸。
在一个实施例中，本发明涉及具有表3所述任何抗体的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。
在一个实施例中，本发明涉及具有抗体L35D4的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段其。在一个实施例中，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包含如以下序列所示的重链可变区序列：SEQ ID NO：1，和如以下序列所示的轻链可变区序列：SEQ ID NO：2。在一个实施例中，本发明涉及抗体，所述抗体具有含SEQ ID NO：1的CDR的重链可变区，和具有含SEQ ID NO：2的CDR的轻链可变区。在一个实施例中，本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有与SEQ ID NO.1所示的至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同的氨基酸序列，所述轻链可变区具有与SEQ ID NO.2所示的至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同的氨基酸序列。在一个实施例中，本发明的特征在于抗LAG3抗体或其抗原结合部分，其包括重链可变区，所述重链可变区包括包含如SEQ ID NO：17所示的氨基酸的CDR3域、包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸的CDR2域、包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸的CDR1域；其还包括轻链可变区，所述轻链可变区包括包含SEQ ID NO：20所示的氨基酸的CDR3域、包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸的CDR2域、包含SEQ ID NO：18所示的氨基酸的CDR1域。所述抗体还可以是IgG1或IgG4同种型。
在一个实施例中，本发明涉及具有抗体L35G6的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段，其。在一个实施例中，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包含如以下序列所示的重链可变区序列：SEQ ID NO：1，和如以下序列所示的轻链可变区序列：SEQ ID NO：3。在一个实施例中，本发明涉及抗体，所述抗体具有含SEQ ID NO：1的CDR的重链可变区，和含SEQID NO：3的CDR的轻链可变区。在一个实施例中，本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有与SEQ ID NO：1所示的至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同的氨基酸序列，所述轻链可变区具有与SEQ ID NO：3所示的至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同，至少98％相同或至少99％相同的氨基酸序列。在一个实施例中，本发明的特征在于抗LAG3抗体或其抗原结合部分，其包括重链可变区，所述重链可变区包括包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸的CDR3域、包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸的CDR2域、包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸的CDR1域；其还包括轻链可变区，所述轻链可变区包括包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸的CDR3域、包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸的CDR2域、包含SEQ ID NO：21所示的氨基酸的CDR1域。所述抗体还可以是IgG1或IgG4同种型。
在一个实施例中，本发明涉及具有抗体L33H11的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施例中，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包含如以下序列所示的重链可变区序列：SEQ ID NO：1，和如以下序列所示的轻链可变区序列：SEQ ID NO：4。在一个实施例中，本发明涉及抗体，所述抗体包含包括SEQ ID NO：1的CDR的重链可变区，和包括SEQID NO：4的CDR的轻链可变区。在一个实施例中，本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有与SEQ ID NO：1所示的至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：4所示的至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同的氨基酸序列。在一个实施例中，本发明的特征在于抗LAG3抗体或其抗原结合部分，其包括重链可变区，所述重链可变区包括包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸的CDR3域、包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸的CDR2域、包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸的CDR1域；其还包括轻链可变区，所述轻链可变区包括包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸的CDR3域、包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸的CDR2域、包含SEQ ID NO：24所示的氨基酸的CDR1域。所述抗体还可以是IgG1或IgG4同种型。
在一个实施例中，本发明涉及具有抗体L32A9的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施例中，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包含如以下序列所示的重链可变区序列：SEQ ID NO：1，和如以下序列所示的轻链可变区序列：SEQ ID NO：5。在一个实施例中，本发明涉及抗体，所述抗体具有包括SEQ ID NO：1的CDR的重链可变区，和包括SEQID NO：5的CDR的轻链可变区。在一个实施例中，本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有与SEQ ID NO：1所示的至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：5至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同氨基酸序列。在一个实施例中，本发明的特征在于抗LAG3抗体或其抗原结合部分，其包括重链可变区，所述重链可变区包括包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸的CDR3域、包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸的CDR2域、包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸的CDR1域；其还包括轻链可变区，所述轻链可变区包括包含SEQ ID NO：29所示的氨基酸的CDR3域、包含SEQ ID NO：28所示的氨基酸的CDR2域、包含SEQ ID NO：27所示的氨基酸的CDR1域。所述抗体还可以是IgG1或IgG4同种型。
在一个实施例中，本发明涉及具有抗体L32D10的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施例中，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包含如以下序列所示的重链可变区序列：SEQ ID NO：1，和如以下序列所示的轻链可变区序列：SEQ ID NO：6。在一个实施例中，本发明涉及抗体，所述抗体具有包括SEQ ID NO：1的CDR的重链可变区，和包括SEQID NO：6的CDR的轻链可变区。在一个实施例中，本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：1所示的至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：6所示的至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同的氨基酸序列。在一个实施例中，本发明的特征在于抗LAG3抗体或其抗原结合部分，其包括重链可变区，所述重链可变区包括包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸的CDR3域、包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸的CDR2域、包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸的CDR1域；其还包括轻链可变区，所述轻链可变区包括包含SEQ ID NO：32所示的氨基酸的CDR3域、包含SEQ ID NO：31所示的氨基酸的CDR2域、包含SEQ ID NO：30所示的氨基酸的CDR1域。所述抗体还可以是IgG1或IgG4同种型。
在一个实施例中，本发明涉及具有抗体L32A4的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施例中，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包含如以下序列所示的重链可变区序列：SEQ ID NO：1，和如以下序列所示的轻链可变区序列：SEQ ID NO：7。在一个实施例中，本发明涉及抗体，所述抗体具有包括SEQ ID NO：1的CDR的重链可变区，和包括SEQID NO：7的CDR的轻链可变区。在一个实施例中，本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：1所示的至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：7所示的至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同的氨基酸序列。在一个实施例中，本发明的特征在于抗LAG3抗体或其抗原结合部分，其包括重链可变区，所述重链可变区包括包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸的CDR3域、包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸的CDR2域、包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸的CDR1域；其还包括轻链可变区，所述轻链可变区包括包含SEQ ID NO：35所示的氨基酸的CDR3域、包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸的CDR2域、包含SEQ ID NO：33所示的氨基酸的CDR1域。所述抗体还可以是IgG1或IgG4同种型。
在一个实施例中，本发明涉及具有抗体L3A1的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施例中，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包含如以下序列所示的重链可变区序列：SEQ ID NO：8，和如以下序列所示的轻链可变区序列：SEQ ID NO：9。在一个实施例中，本发明涉及抗体，所述抗体具有包括SEQ ID NO：8的CDR的重链可变区，和包括SEQ IDNO：9的CDR的轻链可变区。在一个实施例中，本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：8所示的至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：9所示的至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同的氨基酸序列。在一个实施例中，本发明的特征在于抗LAG3抗体或其抗原结合部分，其包括重链可变区，所述重链可变区包括包含SEQ ID NO：38所示的氨基酸的CDR3域、包含SEQ ID NO：37所示的氨基酸的CDR2域、包含SEQ ID NO：36所示的氨基酸的CDR1域；其还包括轻链可变区，所述轻链可变区包括包含SEQ ID NO：41所示的氨基酸的CDR3域、包含SEQ ID NO：40所示的氨基酸的CDR2域、包含SEQ ID NO：39所示的氨基酸的CDR1域。所述抗体还可以是IgG1或IgG4同种型。
在一个实施例中，本发明涉及具有抗体L3A10的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施例中，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包含SEQ ID NO：10所示的重链可变区序列，和SEQ ID NO：11所示的轻链可变区序列。在一个实施例中，本发明涉及抗体，所述抗体具有包括SEQ ID NO：10的CDR的重链可变区，和包括SEQ ID NO：11的CDR的轻链可变区。在一个实施例中，本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：10所示的至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：11所示的至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同的氨基酸序列。在一个实施例中，本发明的特征在于抗LAG3抗体或其抗原结合部分，其包括重链可变区，所述重链可变区包括包含SEQ ID NO：44所示的氨基酸的CDR3域、包含SEQ ID NO：43所示的氨基酸的CDR2域、包含SEQ ID NO：42所示的氨基酸的CDR1域；其还包括轻链可变区，所述轻链可变区包括包含SEQ ID NO：47所示的氨基酸的CDR3域、包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸的CDR2域、包含SEQ ID NO：45所示的氨基酸的CDR1域。所述抗体还可以是IgG1或IgG4同种型。
在一个实施例中，本发明涉及具有抗体L3C5的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施例中，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包含如以下序列所示的重链可变区序列：SEQ ID NO：12，和如以下序列所示的轻链可变区序列：SEQ ID NO：13。在一个实施例中，本发明涉及抗体，所述抗体具有包括SEQ ID NO：12的CDR的重链可变区，和包括SEQID NO：13的CDR的轻链可变区。在一个实施例中，本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：12所示的至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：13所示的至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同的氨基酸序列。在一个实施例中，本发明的特征在于抗LAG3抗体或其抗原结合部分，其包括重链可变区，所述重链可变区包括包含SEQ ID NO：50所示的氨基酸的CDR3域、包含SEQ ID NO：49所示的氨基酸的CDR2域、包含SEQ ID NO：48所示的氨基酸的CDR1域；其还包括轻链可变区，所述轻链可变区包括包含SEQ ID NO：53所示的氨基酸的CDR3域、包含SEQ ID NO：52所示的氨基酸的CDR2域、包含SEQ ID NO：51所示的氨基酸的CDR1域。所述抗体还可以是IgG1或IgG4同种型。
在一个实施例中，本发明涉及抗体或其抗原结合片段，其具有抗体L3E3的抗原结合区。在一个实施例中，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包含如以下序列所示的重链可变区序列：SEQ ID NO：8，和如以下序列所示的轻链可变区序列：SEQ ID NO：14。在一个实施例中，本发明涉及抗体，所述抗体具有包括SEQ ID NO：8的CDR的重链可变区，和包括SEQID NO：14的CDR的轻链可变区。在一个实施例中，本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：8所示的至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：14所示的至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同的氨基酸序列。在一个实施例中，本发明的特征在于抗LAG3抗体或其抗原结合部分，其包括重链可变区，所述重链可变区包括包含SEQ ID NO：38所示的氨基酸的CDR3域、包含SEQ ID NO：37所示的氨基酸的CDR2域、包含SEQ ID NO：36所示的氨基酸的CDR1域；其还包括轻链可变区，所述轻链可变区包括包含SEQ ID NO：56所示的氨基酸的CDR3域、包含SEQ ID NO：55所示的氨基酸的CDR2域、包含SEQ ID NO：54所示的氨基酸的CDR1域。所述抗体还可以是IgG1或IgG4同种型。
如表3所述，抗体L35D4、L35G6、L33H11、L32A9、L32D10和L32A4具有重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO.1序列所示的氨基酸序列。而且如表3所述、SEQ ID NO.1与SEQ ID NO：8(如L3A1和L3E3所述)至少95％相同。
如表3所述、SEQ ID NO：7(如L32A4所述)与SEQ ID NO：9(如L3A1所述)至少95％相同。
可以通过常规技术产生本发明的抗原结合蛋白的抗原结合片段。所述片段的例子包括但不限于Fab和F(ab')2片段。
可以通过氨基酸桥(短肽接头)连接重链和轻链可变区(Fv区)片段得到单条多肽链，形成单链抗体。通过将编码肽接头的DNA融合在编码两个可变区多肽(VL和VH)的DNA之间来制备这些单链Fv(scFv)。所得多肽可以自身折叠来形成抗原结合单体，或其可以形成多聚体(例如二聚体、三聚体或四聚体)，取决于两个可变区之间的柔性接头的长度(Korttet al.，1997，Prot.Eng.10:423；Kortt et al.，2001，Biomol.Eng.18:95-108)。通过连接不同的含VL和VH的多肽，可以形成能与不同表位结合的多价scFv(Kriangkum et al.，2001，Biomol.Eng.18:31-40)。为制备单链抗体而开发的技术包括如美国专利4946778；Bird，1988，Science242:423；Huston et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879；Ward et al.，1989，Nature 334:544，de Graaf et al.，2002，Methods Mol.Biol.178:379-87所述的技术。
在一些实施例中，本公开提供具有来自重链的可变区和来自轻链的可变区的Fab全人抗体片段，其中所述重链可变区序列与选自以下的氨基酸序列至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同：SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12及其组合，且有轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与选自以下的氨基酸序列至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14及其组合。优选地，全人抗体Fab片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该抗体包含选自以下序列的重链/轻链可变区序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.1/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8/SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10/SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12/SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.8/SEQ ID NO.14及其组合。
在一个实施例中，本公开提供一种单链人抗体，其具有来自重链的可变区和来自轻链的可变区和连接重链和轻链可变区的肽接头，其中所述重链可变区序列与选自以下氨基酸序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，至少99％相同，或至少100％相同：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12，所述重链可变区序列与以下氨基酸序列及其组合至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，至少99％相同，或至少100％相同：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.14。优选地，所述全人单链抗体具有重链可变区和轻链可变区，其中所述单链全人抗体具有选自以下序列及其组合的重链/轻链可变区序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.1/SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8/SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10/SEQID NO.11、SEQ ID NO.12/SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.8/SEQ ID NO.14。
用于从感兴趣的抗体得到不同子类或同种型的抗体的技术是已知的，即子类转换。因此，例如可以从IgM抗体得到IgG抗体，反之亦然。所述技术允许制备既具有特定抗体(亲代抗体)的抗原结合性质，也具有不同于亲代抗体的抗体种型或子类的相关生物性质的新抗体。可以采用重组DNA技术。所述过程中可以使用编码特定抗体多肽的克隆DNA，例如编码期望的同种型抗体的恒定域的DNA(Lantto et al.，2002，Methods Mol.Biol.178:303-16)。此外，若需要的是IgG4，还可能希望在铰链区中引入点突变(CPSCP->CPPCP)(Bloom etal.，1997，Protein Science 6:407)，以减缓重链间形成二硫键从而可能导致IgG4抗体异质性的趋势。因此，在一个实施例中，本发明的抗体是人IgG1抗体。因此，在一个实施例中，本发明的抗体是人IgG4抗体。
本公开提供了许多结构特征在于其可变区的氨基酸序列的抗体。然而，所述氨基酸序列在保持其与其特异性靶标的高结合度的同时，可能发生一些变化。更具体地，可变区范围中的许多氨基酸可以通过保守性置换来改变，并且可以预测所得抗体的结合特征不会不同于野生型抗体序列的结合特征。抗体可变区中有许多氨基酸不直接与抗原相互作用或影响抗原结合，且不会对抗体结构的决定产生关键性影响。例如，任何在此公开的抗体中所预测的非必需氨基酸残基，优选为被来自相同类别的另一氨基酸残基置换。用于鉴定不消除抗原结合性的氨基酸保守置换的方法在本领域中是众所周知的(例如，参见Brummell etal.，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi et al.Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:412-417(1997))。Near et al.(Mol.Immunol.30:369-377，1993)解释了如何通过定点突变影响或不影响结合。Near等人认为只有突变的残基才具有改变抗原结合性的高可能性。大多数泽对结合亲和性(Near等人，表3)和结合不同形式的地高辛(Near等人，表2)影响不大或具有负面影响。
在某些实施例中，本发明提供的抗体或其抗原结合片段具有的解离常数(KD)为：1×10-6M或以下；5×10-7M或以下；1×10-7M或以下；5×10-8M或以下；1×10-8M或以下；5×10- 9M或以下；或1×10-9M或以下。在一个实施例中，本发明的抗体或其抗原结合片段的KD为从1x 10-7M至1x 10-10M。在一个实施例中，本发明的抗体或其抗原结合片段的KD为从1x 10-8M至1x 10-10M。
本领域普通技术人员知晓，用于测定抗体或其片段的KD的已知标准方法。例如，在一个实施例中，通过放射性抗原结合试验(RIA)来测量KD。在一个实施例中，使用Fab版本的目标抗体及其抗原进行RIA。例如，Fab对抗原的溶液结合亲和性通过以下方法测定：在无标记抗原滴定系列存在的情况下，用最小浓度的(125I)-标记的抗原平衡Fab，然后用被抗Fab抗体包覆的板捕获被结合的抗原(例如，参见Chen et al.，J.Mol.Biol.93:865-881(1999))。
根据另一个实施例，使用BIACORE表面等离子体共振试验来测量KD。本文所用术语“表面等离子体共振”，是指允许通过检测生物传感器矩阵内的蛋白质浓度变化来分析实时相互作用的光学现象，例如使用BIACORE系统(Biacore Life Sciences division of GEHealthcare，Piscataway，NJ)。也可以用表面等离子共振测定Koff和Ka值。
在特定的实施例中，本发明的抗原结合蛋白对LAG3的结合亲和性(Ka)为至少103M-1S-1。在其它实施例中，所述抗原结合蛋白的Ka为至少103M-1S-1、至少104M-1S-1、至少105M-1S-1，或至少106M-1S-1。在其它进一步的实施例中，所述抗原结合蛋白的Ka为至少107M-1S-1。在其它进一步的实施例中，所述抗原结合蛋白的Ka为至少107M-1S-1、至少108M-1S-1、至少109M- 1S-1，或至少1010M-1S-1。在一个实施例中，本发明的抗LAG3抗体或其片段的KD为至少103至107M-1S-1。在另一实施例中，该抗原结合蛋白的Ka与本申请实施例中描述的抗体的Ka基本上相同。Ka可以由Biacore测试确定，例如用Biacore 3000或T200。
在另一个实施例中，本公开提供对LAG3具有低解离速率的抗原结合蛋白。在一个实施例中，所述抗原结合蛋白的Koff为1×10-4至10-1sec-1或更低。在另一个实施例中，所述Koff为5×10-5至10-1sec-1或更低。在另一个实施例中，所述Koff为5×10-6至10-1sec-1或更低。在另一实施例中，所述Koff与在本申请中所述的抗体的Koff基本上相同。在另一个实施例中，所述抗原结合蛋白与LAG3结合的Koff与本申请中所述的抗体基本上相同。
在另一个方面，本公开提供抑制LAG3的活性的抗原结合蛋白。在一个实施例中，所述抗原结合蛋白的IC50为1000nM或更低。在另一个实施例中，所述IC50为100nM或更低；在另一个实施例中，所述IC50为10nM或更低。在另一个实施例中，所述IC50与在本申请实施例中描述的抗体的IC50基本上相同。在另一个实施例中，所述抗原结合蛋白以与在申请中所述的抗体的IC50基本上相同的IC50抑制LAG3的活性。
在另一个方面，本发明提供结合至在细胞表面上表达的LAG3的抗原结合蛋白，当这样结合时，在不会使在细胞表面上的LAG3的量显著下降的情况下抑制LAG3在细胞中的信号传递活性。可以使用任何确定或评估在细胞表面上和/或细胞内部的LAG3的量的方法。在其它实施例中，所述抗原结合蛋白结合至表达LAG3的细胞使少于约75％、50％、40％、30％、20％、15％、10％、5％、1％，或0.1％的细胞表面的LAG3内在化。
在另一方面，本公开提供在体外或体内(例如，使人对象服用时)半衰期为至少一天的抗原结合蛋白。在一个实施例中，所述抗原结合蛋白的半衰期为至少三天。在另一实施例中，所述抗原结合蛋白的半衰期为四天或更长。在另一实施例中，所述抗原结合蛋白的半衰期为八天或更长。在另一实施例中，所述抗原结合蛋白是衍生的或修饰的使得其相比未衍生或未修饰的抗原结合蛋白具有较长的半衰期。在另一实施例中，所述抗原结合蛋白包含一个或多个点突变以增加血清半衰期，比如在WO00/09560中所述，该文献通过引入并入本申请。
本公开进一步提供多特异性抗原结合蛋白，例如双特异抗原结合蛋白，例如通过两个不同的抗原结合位点或区域，与LAG3的两个不同表位结合或与LAG3的一个表位和另一分子的一个表位结合的抗原结合蛋白。此外，本申请公开的双特异抗原结合蛋白可以包括：来自本申请所述的一种抗体的LAG3结合位点，以及来自本申请所述的另一种抗体的另一LAG3结合区，其中涵盖本申请引用其他出版物所描述的抗体。可选地，双特异性抗原结合蛋白可以包括来自在此描述的抗体之一的抗原结合位点和来自本领域已知的另一LAG3抗体，或来自通过已知的方法或在此描述的方法制备的抗体的第二抗原结合位点。
本领域已知许多制备双特异性抗体的方法。所述方法包括使用杂交-杂交瘤(hybrid-hybridomas)，如Milstein et al.，1983，Nature 305:537所述，以及抗体片段的化学偶联(Brennan et al.，1985，Science 229:81；Glennie et al.，1987，J.Immunol.139:2367；美国专利6，010，902)。此外，双特异性抗体可以通过重组途径来制备，例如使用亮氨酸拉链部分(即，来自优选地形成异源二聚体的Fos和Jun蛋白；Kostelnyet al.，1992，J.Immunol.148:1547)或其他锁匙互动域结构，如美国专利5582996所述。额外的可用技术包括如美国专利5959083和5807706中所述的技术。
在又一个方面中，所述抗原结合蛋白包括抗体的衍生物。衍生抗体可以包括任何赋予所述抗体想要的性质(比如，在特定用途中延长半衰期)的分子或物质。所述衍生抗体可以包括，例如，可检测的(或标记)部分(例如：放射性、比色的、抗原性或酶活性分子)、可检测珠(例如磁性或电子致密性(如金珠)珠)、或结合另一分子的分子(例如生物素或链霉亲和素)、治疗性或诊断性部分(例如，放射性、细胞毒性或药学活性部分)或能够增加所述抗体对一种特定用途(例如向对象如人人对象给药，或其他体内或体外用途)的适用度的分子。可用于衍生抗体的分子的示例包括白蛋白(例如人血清白蛋白)和聚乙二醇(PEG)。可以利用本领域周知的技术制备连接白蛋白的和聚乙二醇化的抗体衍生物。在一个实施例中，所述抗体缀合或以其他方式连接至转甲状腺素蛋白(TTR)或TTR变体。所述TTR或TTR变体可以用选自如下的化学制品进行化学修饰：例如，葡聚糖、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)、聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化的多元醇和聚乙烯醇。
包含一个或多个抗原结合蛋白的低聚体可以用作LAG3的拮抗剂。低聚体可以为共价连接或非共价连接的二聚体、三聚体或更高的低聚体的形式。可考虑使用包含两个或更多个抗原结合蛋白的低聚体，一个示例是同二聚体。其它低聚体包括异源二聚体、同源三聚体、异源三聚体、同源四聚体、异源四聚体等。
一个实施例针对包括通过在融合至该抗原结合蛋白的肽部分之间的共价或非共价相互作用连接的多个抗原结合蛋白的低聚体。所述肽可以是肽接头(间隔段)，或具有促进低聚化的性质的肽。亮氨酸拉链和来源于抗体的某些多肽是能够促进附着至所述肽的抗原结合蛋白的低聚化的肽，如下文更详细的描述。
在特定实施例中，所述低聚体包括两个至四个抗原结合蛋白。所述低聚体的抗原结合蛋白可以是任何形式，例如上述任何形式，例如变体或片段。优选地，所述低聚体包括具有LAG3结合活性的抗原结合蛋白。
在一个实施例中，使用源自免疫球蛋白的多肽制备低聚体。包含与抗体衍生多肽的不同部分融合的某些异源多肽的融合蛋白的制备已被例如，Ashkenazi et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10535；Byrn et al.，1990，Nature 344:677；andHollenbaugh et al.，1992"Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins"，inCurrent Protocols in Immunology，Suppl.4，pages 10.19.1-10.19.11描述。
一个实施例针对包括两个融合蛋白的二聚体，所述两个融合蛋白通过将抗LAG3抗体的LAG3结合片段融合至抗体的Fc区产生。可以通过如下步骤制备所述二聚体：例如，将编码该融合蛋白的融合基因插入合适的表达载体中，在用重组表达载体转化的宿主细胞中表达所述融合基因，并且使该表达的融合蛋白能够非常像抗体分子一样组装，因此在Fc部分之间形成链间二硫键以产生二聚体。
制备低聚化抗原结合蛋白的另一方法涉及使用亮氨酸拉链。亮氨酸拉链结构域为促进发现所述亮氨酸拉链结构域的蛋白质的低聚化的肽。亮氨酸拉链最初是在若干DNA结合蛋白中识别出来的(Landschulz et al.，1988，Science 240:1759)，此后在各种不同蛋白中也发现过。已知的亮氨酸拉链中有二聚化或三聚化的天然存在的多肽及其衍生物。适用于制备可溶寡聚蛋白的亮氨酸拉链域的示例如WO 94/10308所述，以及如Hoppe et al.，1994，FEBS Letters 344:191中所述的源自肺表面活化蛋白D(SPD)的亮氨酸拉链。Fanslowet al.，1994，Semin.Immunol.6:267-78描述了能够稳定融合上的异源蛋白质的稳定三聚化的修饰的亮氨酸拉链的使用。在一种方法中，在合适的宿主细胞中表达包括抗抗体片段或融合至亮氨酸拉链肽的衍生物的重组融合蛋白，从培养物的上清液中回收可溶性低聚化抗LAG3抗体片段或其形成的衍生物。
例如，在体外或体内检测LAG3多肽的存在的试验中，可以使用针对LAG3的抗原结合蛋白。所述抗原结合蛋白也可以用于通过免疫亲和层析纯化LAG3蛋白。本申请公开的方法中可以使用阻断性抗原结合蛋白。可以采用作为LAG3拮抗剂的抗原结合蛋白治疗任何LAG3诱导的症状，包括但不限于各种癌症。
在体外过程中可以采用抗原结合蛋白，或体内服用该抗原结合蛋白以抑制LAG3诱导的生物活性。因此，可以治疗由LAG3的蛋白水解(直接或间接)引起或恶化的病症，在此提供了示例。在一个实施例中，本发明提供了治疗方法，其包括：以降低LAG3诱导的生物活性的有效剂量，用LAG3阻断性抗原结合蛋白对需要其的哺乳动物进行体内给药。
在本发明的某些实施例中，抗原结合蛋白包括抑制LAG3生物活性的全人单克隆抗体。
抗原结合蛋白，包括本申请所述抗体及抗体片段，可以由多种常规技术中的任一种来制备。例如，可以从天然表达所述抗原结合蛋白的细胞中纯化所述抗原结合蛋白(例如，可以从产生抗体的杂交瘤中纯化所述抗体)，或利用本领域已知的任何技术，在重组表达体系中产生所述抗原结合蛋白。例如，参见Monoclonal Antibodies，Hybridomas:A NewDimension in Biological Analyses，Kennet et al.(eds.)，Plenum Press，New York(1980)；and Antibodies:A Laboratory Manual，Harlow and Land(eds.)，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1988)。
本领域已知的任何表达体系均可用于制备本发明的重组多肽，包括本发明所述抗体及抗体片段。一般来说，以包含编码所需多肽的DNA的重组表达载体来转化宿主细胞。可以使用的宿主细胞是原核生物、酵母菌或高等真核细胞。原核生物包括革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌，例如大肠杆菌或杆菌。更高等的真核细胞包括昆虫细胞和已建立的源于哺乳类的细胞系。合适的哺乳动物宿主细胞系的示例包括猴肾细胞COS-7系(ATCC CRL 1651)(Gluzman et al.，1981，Cell 23:175)、L细胞、293细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCC CCL163)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、BHK(ATCC CRL 10)细胞系和如McMahan et al.,1991,EMBO J.10:2821所述的来源于非洲绿猴肾细胞系CV1的CV1/EBNA细胞系(ATCC CCL70)。适用于细菌、真菌、酵母菌和哺乳类细胞宿主的克隆和表达载体如Pouwels et al.(Cloning Vectors:A Laboratory Manual,Elsevier,N.Y.,1985)所述。
可以在促进多肽表达的条件下培养转化细胞，并且通过常规蛋白纯化过程回收所述多肽。这样的纯化过程之一包括使用亲和层析，例如在与所有或部分(例如，细胞外结构域)LAG3结合的基质上的亲和层析。在此考虑使用的多肽包括基本同源的、基本上没有污染内源物质的哺乳动物抗LAG3重组抗体多肽。
可以通过许多已知技术中的任何一种制备并筛选具有所需性质的抗原结合蛋白。某些所述技术涉及分离编码所需抗原结合蛋白(例如，抗LAG3抗体)的多肽链(或其部分)的核酸，并通过重组DNA技术操作所述核酸。例如，所述核酸可以融合至所需的另一核酸，或被改变(例如，通过突变或其它常规技术)从而添加、删除或取代一个或多个氨基酸残基。
可以利用本领域已知的任何标准方法产生本公开的多肽。在一个实施例中，使用重组DNA方法，通过将编码所述多肽的核酸序列(例如cDNA)插入重组表达载体中，并在促进表达的条件下表达所述DNA序列，从而制备所述多肽。本发明包括编码SEQ ID No：1至56中所述的任何多肽序列的核酸，以及包含所述核酸序列的载体。
编码任一个本申请公开的各种多肽的核酸可以通过化学合成制得。可以选择密码子使用，以提高在细胞中的表达。所述密码子使用取决于选择的细胞类型。针对大肠杆菌和其他细菌，以及哺乳动物细胞、植物细胞、酵母菌细胞和昆虫细胞，开发了特定的密码子使用模式。
核酸操作的通用技术记载于例如Sambrook et al.，Molecular Cloning:ALaboratory Manual，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2ed.，1989，或F.Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology(Green Publishing andWiley-Interscience:New York，1987)及其定期更新中，在此以引用方式并入。编码所述多肽的DNA可操作地连接在来自哺乳动物、病毒或昆虫基因的适宜转录元件或转录调控元件上。所述调控元件包括转录增强子、可选的用于控制转录的操作子序列、编码合适mRNA核糖体结合位点的序列、控制转录和翻译终止的序列。另外，还加入了在宿主中的复制能力(通常由复制起点赋予和促进转化体识别的选择基因)。
重组DNA也可以包括可以用于纯化蛋白质的任何类型的蛋白标记序列。蛋白标记的示例包括，但不限于组氨酸标签、FLAG标签、myc标签、HA标签，或GST标签。适用于细菌、真菌、酵母菌和哺乳动物细胞宿主的克隆和表达载体可以参见Cloning Vectors:ALaboratory Manual，(Elsevier，N.Y.，1985)。
利用适合于宿主细胞的方法将表达构建体引入宿主细胞中。本领域已知将核酸引入宿主细胞的各种方法，包括但不限于：电穿孔、采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其它物质的转染；基因枪法；脂质体转染；和感染(其中载体是传染剂)。合适的宿主细胞包括原核细胞、酵母菌、哺乳动物细胞，或细菌细胞。
适当的细菌包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如，大肠杆菌或芽孢杆菌。酵母菌，优选为Saccharomyces菌种(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))，也可以用于多肽制备。各种哺乳类或昆虫细胞培养体系也可用于表达重组蛋白。Luckow和Summers(Bio/Technology，6:47，1988)综述了系统在昆虫细胞中用于生产异源蛋白质的杆状病毒系统。合适的哺乳动物宿主细胞系的示例包括内皮细胞、COS-7猴肾细胞、CV-1、L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、人胚肾细胞、HeLa、293、293T，和BHK细胞系。通过培养合适的宿主/载体系统以表达重组蛋白，从而制备纯化的多肽。在许多应用中，本申请公开的众多多肽的小尺寸使得在大肠杆菌中表达成为优选表达方法。然后，从培养基或细胞提取物中纯化该蛋白。
蛋白还可以使用细胞翻译体系来制备。为此，必须对编码该多肽的核酸进行修饰，以允许体外转录以产生mRNA，并允许所述mRNA在所用的特定无细胞体系(真核(例如哺乳类或酵母菌)无细胞翻译体系或原核(例如细菌)无细胞翻译体系)中进行无细胞翻译。
LAG3结合性多肽还可以通过化学合成来制备(例如，通过如Solid Phase PeptideSynthesis，2nd ed.，1984，The Pierce Chemical Co.，Rockford，Ill.中所述的方法)。还可以通过化学合成来产生对蛋白的修饰。
可以通过蛋白化学领域公知的蛋白分离/纯化方法纯化本发明的多肽。非限制性示例包括提取、重结晶、盐析(例如，用硫酸铵或硫酸钠)、离心、透析、超滤、吸附层析、离子交换层析、疏水层析、正相层析、反相层析、凝胶过滤、凝胶渗透层析、亲和层析、电泳、逆流分配或其任意组合。纯化后，可以通过本领域已知的各种方法中的任何一种，包括但不限于过滤和透析，使多肽交换到不同的缓冲液和/或浓缩。
纯化后的多肽优选至少85％纯，更优选至少95％纯，并且最优选至少98％纯。无论纯度的确切数值如何，多肽都足够纯以用作药物产品。
在某些实施例中，本公开提供与LAG3结合的单克隆抗体。可以利用本领域已知的任何技术，例如，通过在完成免疫计划后，从转基因动物中收集的脾细胞并使其永生化，产生单克隆抗体。可以使用本领域已知的任何技术使脾细胞永生化，例如，通过使脾细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。在产生杂交瘤的融合步骤中使用的骨髓瘤细胞优选为不产生抗体的，具有高融合效率，和具有使该骨髓瘤细胞不能在某些仅支持期望的融合细胞(杂交瘤)生长的选择培养基中生长的酶缺陷。在小鼠融合中使用的合适的细胞系的示例包括Sp-20，P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 4 1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XX0Bul；在大鼠融合中使用的细胞系的例子包括R210.RCY3、Y3-Ag1.2.3、IR983F和48210。用于细胞融合的其它细胞系为U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6。
可以通过常规技术产生本发明的抗原结合蛋白的抗原结合片段。
多肽的翻译后修饰
在某些实施例中，本发明的结合多肽可以进一步包括翻译后修饰。蛋白翻译后修饰的示例包括磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化、泛素化、糖基化、羰基化、SUMO化，生物素化或多肽侧链或疏水基团的添加。其结果是，修饰的可溶性多肽可包含非氨基酸元件，例如脂质、多糖或单糖，和磷酸盐。糖基化的优选形式是唾液酸化，其中一个或多个唾液酸部分与多肽结合。唾液酸部分改善溶解性和血清半衰期，同时还减少该蛋白质的可能的免疫原性。(参见Raju et al.Biochemistry.2001 31；40(30):8868-76)。
在一个实施例中，所述可溶性多肽的修饰形式可以包括将对象可溶性多肽连接至非蛋白质聚合物。在一个实施例中，所述高分子为聚乙二醇(“PEG”)、聚丙二醇或聚氧化烯烃，如美国专利4640835；4496689；4301144；4670417；4791192或4179337所述。
PEG是可溶于水的聚合物，其市面有售，或可以根据本领域所熟知的方法(Sandlerand Karo，Polymer Synthesis，Academic Press，New York，Vol.3，pages 138-161)通过乙二醇的开环聚合制备而成。术语“PEG”用于广泛涵盖任何聚乙二醇分子，无论其大小或PEG末端的修饰为何，且可以用以下公式代表：X--O(CH2CH2O)n-CH2CH2OH(1)，其中n＝20-2300且X为H或末端修饰，例如：C1-4烷基。在一个实施例中，本发明的PEG的一个末端以羟基或甲氧基结尾，即X为H或CH3(“甲氧基PEG”)。PEG可以包含结合反应所需的另外的化学基团，所述化学基团得自分子的化学合成，或者是使分子的各部分具有最佳距离的间隔段。另外，所述PEG可以由一条或更多条连接在一起的PEG侧链组成。具有多于一条PEG侧链的PEG被称为多臂或枝化状PEG。枝化状PEG的制备可以通过，例如，将聚环氧乙烷加入各种多元醇中，包括甘油、季戊四醇和山梨糖醇。例如，四臂枝化状PEG可以由季戊四醇和环氧乙烷制备。分支PEG参见例如EP-A0473084和美国专利5932462所述。PEG的一种形式包括两个通过赖氨酸的主要氨基链接的PEG侧链(PEG2)(Monfardini et al.，Bioconjugate Chem.6(1995)62-69)。
相对于未经修饰的结合多肽的清除率，PEG修饰的多肽的血清清除率可以降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％，或甚至90％。PEG修饰的多肽的半衰期(t1/2)高于未修饰蛋白质的半衰期。相对于未修饰的结合多肽的半衰期，结合PEG的多肽的半衰期可以增加至少10％、20％，30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、400％或500％，或者甚至1000％。在一些实施例中，在体外确定蛋白质半衰期，比如，在缓冲盐溶液或在血清中。在其它实施例中，蛋白质半衰期是在体内的半衰期，比如在动物的血清或其它体液中的蛋白质的半衰期。
治疗方法，剂型和给药模式
本公开进一步提供了用于治疗广谱哺乳动物癌症、感染性疾病或自身免疫反应的方法。
在一个实施例中，本发明的特征在于用于治疗或预防金黄色酿脓葡萄球菌感染的方法，包括给药本发明的抗LAG3抗体或抗原结合片段。
本发明还提供了用于治疗广谱哺乳动物癌症、感染性疾病或自身免疫反应的方法，包括使用本发明的抗体和抗体片段来给药抗LAG3多肽。在一个实施例中，本发明提供了通过将抗人LAG3抗体给药于有需要的对象来治疗癌症的方法。可以在本申请公开的治疗方法中使用的抗体及其片段的示例包括具有至少10-6M的结合亲和性的IgG类的抗人LAG3人抗体或抗人LAG3Fab抗体片段，所述抗人LAG3Fab抗体片段包含来自SEQ ID Nos.1-14所述的抗体序列或者包含SEQ ID No：1-14的任何抗体序列中所述的CDR的重链可变区和轻链可变区。在一个实施例中，本申请所述方法包括给药全人抗体，所述全人抗体包含重链可变区序列，所述重链可变区序列与选自以下氨基酸序列及其组合至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、或至少99％相同：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12，且包含轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与选自以下的氨基酸序列至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、或至少99％相同：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14，及其组合。在一个实施例中，本申请公开的方法包括给药IgG人抗hLAG3抗体，所述抗体包含选自以下序列的重链可变区序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12；且具有选自以下序列的轻链可变区序列：SEQID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14。
在一个实施例中，本申请所述的方法包括全人Fab抗体片段的用途，所述全人Fab抗体片段包含重链可变区序列，所述重链可变区序列与选自以下氨基酸序列至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同，或至少99％相同：SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12，及其组合；且包含轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与选自以下氨基酸序列至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同，或至少99％相同：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14，及其组合。在一个实施例中，本申请所述的方法包括人Fab抗体片段的用途，所述人Fab抗体片段包含选自以下序列的重链可变区序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12；且包含选自以下序列的轻链可变区序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14。
在一个实施例中，本申请所述的方法包括单链人抗体的用途，所述单链人抗体包含重链可变区序列，所述重链可变区序列与选自以下氨基酸序列至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同，或至少99％相同：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.12，及其组合；且包含轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与选自以下氨基酸序列及其组合至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同，或至少99％相同：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14。在一个实施例中，本申请所述的方法包括单链人抗体的用途，所述单链人抗体包含重链可变区，所述重链可变区具有选自以下序列的氨基酸序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12；且包含轻链可变区，所述轻链可变区具有选自以下序列的氨基酸序列：SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14
在一个实施例中，所述全人抗体具有重链和轻链，其中所述抗体具有选自以下序列的重链/轻链可变区序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2(此处称为L35D4)、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.3(此处称为L35G6)、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.4(此处称为L33H11)、SEQ IDNO.1/SEQ ID NO.5(此处称为L32A9)、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.6(此处称为L32D10)、SEQID NO.1/SEQ ID NO.7(此处称为L32A4)、SEQ ID NO.8/SEQ ID NO.9(此处称为L3A1)、SEQID NO.10/SEQ ID NO.11(此处称为L3A10)、SEQ ID NO.12/SEQ ID NO.13(此处称为L3C5)、SEQ ID NO.8/SEQ ID NO.14(此处称为L3E3)，及其组合。
在一个实施例中，全人抗体Fab片段具有重链可变区区域和轻链可变区区域，其中所述抗体具有选自以下序列的重链/轻链可变区序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2(此处称为L35D4)、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.3(此处称为L35G6)、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.4(此处称为L33H11)、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.5(此处称为L32A9)、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.6(此处称为L32D10)、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.7(此处称为L32A4)、SEQ ID NO.8/SEQ ID NO.9(此处称为L3A1)、SEQ ID NO.10/SEQ ID NO.11(此处称为L3A10)、SEQ ID NO.12/SEQ IDNO.13(此处称为L3C5)、SEQ ID NO.8/SEQ ID NO.14(此处称为L3E3)，及其组合。
在一个实施例中，全人单链抗体具有重链可变区区域和轻链可变区区域，其中所述单链全人抗体具有选自以下序列的重链/轻链可变区序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.5、SEQID NO.1/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8/SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10/SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12/SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.8/SEQ ID NO.14。
癌症适应症
本发明的抗LAG3抗体和抗体片段可用于治疗癌症。可以治疗的癌症示例包括但不限于恶性胶质瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、伯基特淋巴瘤(BL)、多发性骨髓瘤(MM)、B型慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)、B和T型急性淋巴细胞白血病(ALL)、T细胞淋巴瘤(TCL)、急性骨髓细胞白血病(AML)、毛细胞白血病(HCL)、霍奇金淋巴瘤(HL)和慢性骨髓细胞白血病(CML)。
在一个实施例中，本申请所述的抗LAG3抗体及抗体片段用于对癌症或其他肿瘤疾病的治疗、延缓进程、预防复发或缓解症状，包括血液恶性肿瘤和/或LAG3+肿瘤。本申请所述的LAG3抗体及抗体片段用于治疗癌症，所述癌症选自非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性骨髓细胞白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性骨髓细胞白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)、乳腺癌、卵巢癌、头颈癌、膀胱癌、黑素瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、肺癌、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、神经胶质瘤、恶性胶质瘤和实体瘤，其中实体瘤选自乳腺肿瘤、卵巢肿瘤、肺肿瘤、胰腺肿瘤、前列腺肿瘤、黑素瘤肿瘤、结肠直肠肿瘤、肺肿瘤、头颈肿瘤、膀胱肿瘤、食道肿瘤、肝肿瘤和肾肿瘤。
如本申请所用，“血液癌症”是指血液的癌症，并且包括白血病、淋巴瘤和骨髓瘤等。“白血病”是指一种血液的癌症，其中血液中产生太多对抗感染无效的白细胞，从而挤掉构成血液的其他部分，如血小板和红细胞。白血病病例分为急性或慢性。
白血病的某些形式包括急性淋巴细胞白血病(ALL)；急性骨髓细胞白血病(AML)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；慢性骨髓细胞白血病(CML)；骨髓增殖性疾病/肿瘤(MPDS)；和骨髓发育不良综合征。“淋巴瘤”可以指霍奇金淋巴瘤，既指无痛侵袭性非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和滤泡淋巴瘤(小细胞和大细胞)等。骨髓瘤可以指多发性骨髓瘤(MM)，巨细胞性骨髓瘤，重链骨髓瘤和轻链或Bence-Jones骨髓瘤。
通过抗体阻断LAG3可增强患者对抗癌细胞的免疫应答。本申请公开的抗LAG3抗体或抗体片段可以单独用于抑制癌性肿瘤的生长。可选地，本申请公开的抗LAG3抗体或抗体片段可以与其他免疫原性试剂、标准癌症治疗或其他抗体联合使用。在一个实施例中，本发明提供了抑制对象中肿瘤细胞生长的方法，其包括向对象给药治疗有效量的抗LAG3抗体或其抗原结合片段。优选地，所述抗体或抗体片段是人抗LAG-3抗体或抗体片段(例如本申请所述的任何人抗LAG3抗体)。
在一个实施例中，其生长可被抑制的优选的癌症包括典型地对免疫疗法响应的癌症。优选用于治疗的癌症的非限制性示例包括黑素瘤(例如转移性恶性黑素瘤)、肾癌(例如透明细胞癌)、前列腺癌(例如激素难治性前列腺腺癌)、乳腺癌、结肠癌、纤维肉瘤和肺癌(例如非小细胞肺癌)。可以使用所公开的抗体治疗的其他癌症的示例包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门癌、胃癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病，所述慢性或急性白血病包括急性骨髓细胞白血病、慢性骨髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、儿童实体瘤、淋巴细胞白血病、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症以及由石棉诱导的癌症。可以用所公开的抗体治疗的其它癌症是转移性癌症，特别是表达PD-L1的转移性癌症(Iwai et al.(2005)Int.Immunol.17:133-144)。
可选地，本申请所述的LAG3的抗体和抗体片段可以与免疫原性试剂结合，例如癌细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)、细胞和用编码免疫刺激性细胞因子的基因转染的细胞(He et al(2004)J.Immunol.173:4919-28)。可以使用的肿瘤疫苗的非限制性示例包括黑素瘤抗原的肽，例如gp100、MAGE抗原、Trp-2，MART1和/或酪氨酸酶，或表达细胞因子GM-CSF的转染肿瘤细胞的肽(下文进一步描述)。
在人体中，一些肿瘤已被证明是免疫原性的，如黑素瘤。通过提高LAG3阻断的T细胞活化阈值，可以激活宿主中的肿瘤反应。
当与疫苗接种方案结合时，LAG3阻断可能更有效。已经设计了针对肿瘤的疫苗接种的许多实验性策略。在这些策略之一中，使用自体同源或同种异体的肿瘤细胞制备疫苗。已经证明，当肿瘤细胞被转导以表达GM-CSF时，这些细胞疫苗是最有效的。已经显示GM-CSF是肿瘤疫苗接种的抗原呈递的有效激活剂(Dranoff et al.(1993)Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.90:3539-43)。
对各种肿瘤中的基因表达和大规模基因表达模式的研究，导致了所谓的肿瘤特异性抗原的定义(Rosenberg，S A(1999)Immunity 10:281-7)。在许多情况下，这些肿瘤特异性抗原是在肿瘤和肿瘤发生的细胞中表达的分化抗原，例如黑素细胞抗原gp100、MAGE抗原和Trp-2。更重要的是，许多这些抗原可被证明是宿主中发现的肿瘤特异性T细胞的靶标。LAG3阻断可以与肿瘤中表达的重组蛋白和/或肽的集合联合使用，以便产生对这些蛋白的免疫应答。这些蛋白质通常被免疫系统看作是自身抗原，因此对它们是容忍的。肿瘤抗原可以包括蛋白质端粒酶，其是合成染色体端粒所必需的，并且在超过85％的人类癌症中和仅在有限数量的体细胞组织中表达(Kim et al.(1994)Science 266:2011-2013)。(这些体细胞组织可通过各种手段免受免疫攻击)。由于改变蛋白质序列的体细胞突变或在两个不相关的序列(即费城染色体中的bcr-abl)之间产生融合蛋白、或者来自B细胞肿瘤的独特型，肿瘤抗原也可以是在癌细胞中表达的“新抗原”。
其他肿瘤疫苗可以包括来自人类癌症中涉及的病毒的蛋白质，例如人类乳头状瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV和HCV)和卡波西氏疱疹肉瘤病毒(KHSV)。可以与LAG3阻断联合使用的另一种形式的肿瘤特异性抗原，是从肿瘤组织本身分离的纯化热休克蛋白(HSP)。这些热休克蛋白包含来自肿瘤细胞的蛋白质片段，并且这些HSP在递送至抗原呈递细胞时高度有效地引发肿瘤免疫(Suot&Srivastava(1995)Science 269:1585-1588；Tamura et al.(1997)Science 278:117-120)。
树突状细胞(DC)是可用于引发抗原特异性应答的有效抗原呈递细胞。DC可以在体外产生并加载各种蛋白质和肽抗原以及肿瘤细胞提取物(Nestle et al.(1998)NatureMedicine 4:328-332)。也可以通过遗传手段转导DC以表达这些肿瘤抗原。为了免疫的目的，DC也直接与肿瘤细胞融合(Kugler et al.(2000)Nature Medicine 6:332-336)。作为接种疫苗的方法，DC免疫可以有效地与LAG3阻断有效结合以激活更有力的抗肿瘤应答。
LAG3阻断(使用本申请公开的抗LAG3抗体和片段)也可以与标准癌症治疗结合。LAG3阻断可以有效地与化疗方案相结合。在这些情况下，给药的化学治疗剂的剂量可能减少(Mokyr et al.(1998)Cancer Research 58:5301-5304)。这种组合的一个示例是抗LAG3抗体与氮烯咪胺(decarbazine)组合用于治疗黑素瘤。这种组合的另一个示例是抗LAG3抗体与白细胞介素-2(IL-2)的组合用于治疗黑素瘤。结合使用LAG3阻断剂和化学疗法的科学原理是细胞死亡，细胞死亡是多数化学治疗化合物的细胞毒性作用的结果，会导致抗原呈递途径中肿瘤抗原的水平增加。可能导致与LAG3阻断剂通过细胞死亡协同作用的其他组合疗法是辐射、手术和激素摘除。这些方案中的每一个都在宿主中产生肿瘤抗原的来源。血管生成抑制剂也可以与LAG3阻断剂组合。血管生成的抑制通常导致肿瘤细胞死亡，这可能使得肿瘤抗原进入宿主抗原呈递途径。
双特异性抗体可用于靶向两种不同的抗原。例如，已经使用抗Fc受体/抗肿瘤抗原(例如Her-2/neu)双特异性抗体将巨噬细胞靶向肿瘤部位。这种靶向可以更有效地激活肿瘤特异性应答。这些答应的T细胞臂将通过使用本申请所述的抗LAG3抗体和抗体片段来使用LAG3阻断剂而得到增强。或者，可以通过使用结合肿瘤抗原和树突细胞特异性细胞表面标记的双特异性抗体将抗原直接递送至DC。
双特异性抗体可用于靶向两种不同的肿瘤抗原。可以考虑多种肿瘤靶标，包括例如表达Her2、cMet、EGFR和VEGFR的肿瘤。这样，在一个实施例中，本发明提供了双特异性抗体，其包含抗LAG3抗体(或抗原结合片段)，其所述抗LAG3抗体(或抗原结合片段)包含本申请所述的重链和轻链可变区序列或包含包括一组本申请所述的CDR序列和抗Her2、抗EGFR、抗VEGFR(例如，参见美国专利号9，029，510中描述的抗体，其通过引用并入本文)或抗cMet抗体(或其抗原结合部分)的重链和轻链可变区。在一个实施例中，本发明包括对LAG3和EGFR有特异性的双特异性抗体，其中所述抗体包含本申请公开的抗LAG3抗体或片段和如国际公开号WO2013/173255或国际公布号WO 2014/066530中所述的抗EGFR抗体或片段，二者全部内容通过引用并入本文。在一个实施例中，本发明包括对LAG3和EGFR有特异性的双特异性抗体，其中所述抗体包含本申请公开的抗LAG3抗体或片段和美国专利号9，029，510中所述的抗VEGFR抗体或片段，其全部内容通过引用并入本文。在一个实施例中，本发明包括对LAG3和cMet有特异性的双特异性抗体，其中所述抗体包含本申请公开的抗LAG3抗体或片段和国际公布号WO 2016/094455中所述的抗cMet抗体或片段，其全部内容通过引用并入本文。
本申请所述的LAG3阻断抗体和抗体片段也可以与将例如表达Fcα或Fcγ受体的效应细胞靶向到肿瘤细胞的双特异性抗体组合使用(美国专利5，922，845和5，837，243)。
肿瘤通过多种机制逃避宿主的免疫监视。许多这些机制可以通过使由肿瘤表达的免疫抑制性蛋白质失活来克服。这些包括TGF-β(Kehrl et al.(1986)J.Exp.Med.163:1037-1050)、IL-10(Howard&O'Garra(1992)Immunology Today 13:198-200)和作为配体的Fas(Hahne et al.(1996)Science 274:1363-1365)。这些实体中的每一个的抗体可以与本申请所述的抗LAG3抗体和抗体片段组合使用，以抵消免疫抑制剂的作用并且有利于宿主的肿瘤免疫应答。
激活宿主免疫响应的其他抗体可以与本申请所述的抗LAG3抗体和抗体片段组合使用。这些包括树突细胞表面上的激活DC功能和抗原呈递的分子。抗CD40抗体能够有效地取代T细胞辅助活性(Ridge et al.(1998)Nature 393:474-478)，并且可以与LAG3抗体联合使用(Ito et al.(2000)Immunobiology 201(5)527-40)。激活针对T细胞共刺激分子如CTLA-4、OX-40、4-1BB和ICOS的抗体还可以提供增加水平的T细胞活化。LAG3阻断剂可用于增加供体移植的肿瘤特异性T细胞的效力。
还有几种实验治疗方案，其涉及抗原特异性T细胞的离体激活和扩增，以及将这些细胞过继转移到受体中，以刺激针对肿瘤的抗原特异性T细胞(Greenberg&Riddell(1999)Science 285:546-51)。这些方法也可用于激活T细胞对感染性病原体如CMV的应答。在抗LAG3抗体存在下的体外活化可以增加过继转移的T细胞的频率和活性。
下文(例如在“联合疗法”部分)公开了使用本发明的抗LAG3抗体和片段治疗癌症的其它方法。
感染性疾病
本发明进一步提供了治疗对象的感染性疾病的方法，其包括向对象给药抗LAG3抗体或其抗原结合部分，从而治疗对象的感染性疾病。优选地，所述抗体是人抗人LAG3抗体或抗体片段(例如本申请所述的任何人抗LAG3抗体)。与其应用于肿瘤类似，抗体介导的LAG3阻断剂可单独使用，或作为佐剂与疫苗组合使用，以刺激对病原体、毒素和自身抗原的免疫应答。这种治疗方法特别有用的病原体的示例包括，目前没有有效疫苗的病原体或常规疫苗对其不完全有效的病原体。这些包括但不限于HIV、肝炎(A、B和C)、流感、疱疹、贾第虫、疟疾、利什曼虫、金黄色酿脓葡萄球菌、绿脓杆菌。LAG3阻断剂特别有用于抵抗由药剂(如在感染过程中呈递改变的抗原的HIV)引起的感染。在抗人LAG3给药时，这些新的表位被认为是外来的，因此引起强烈的T细胞应答，而不会被LAG3的负信号抑制。
引起可由所公开的抗体治疗的感染的病原性病毒的一些示例包括HIV、肝炎(A、B和C)、疱疹病毒(例如，VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II和CMV、EB病毒(Epstein Barr virus))、腺病毒(adenovirus)、流行性感冒病毒、虫媒病、艾柯病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞体病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒和虫媒病毒脑炎病毒。
引起可由所公开的抗体治疗的感染的致病细菌的一些示例包括衣原体、立克次体细菌、分枝杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、脑膜炎球菌和淋球菌、克雷伯氏杆菌、变形杆菌、沙雷氏菌、假单胞菌、军团杆菌、白喉、沙门氏菌、杆菌、霍乱、破伤风、肉毒中毒、炭疽、瘟疫、细螺旋体病和莱姆病细菌。
引起可由所公开的抗体治疗的感染的病原真菌的一些例子包括假丝酵母属(即Candida，白色念珠菌(albicans)、克鲁丝酵母(krusei)、光滑假丝酵母(glabrata)、热带念珠菌(tropicalis)等)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、曲霉菌(即Aspergillus，烟曲霉(fumigatus)、黑曲霉(niger)等)、毛霉属(即Genus Mucorales，白霉(mucor)、犁头霉(absidia)、根霉(rhizopus))、申克氏胞丝菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)，巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)，粗球孢子菌(Coccidioides immitis)和荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)。
引起可用所公开的抗体治疗的感染的病原性寄生虫的一些示例，包括痢疾阿米巴(Entamoeba histolytica)、结肠小袋纤毛虫(Balantidium coli)、福氏耐格里阿米巴(Naegleriafowleri)、棘阿米巴属(Acanthamoeba sp.)、氏贾第鞭毛虫(Giardia lambia)、隐孢子虫属(Cryptosporidium sp.)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、田鼠巴贝虫(Babesia microti)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼虫(Leishmania donovani)、鼠弓形虫(Toxoplasma gondii)和巴西日圆线虫(Nippostrongylus brasiliensis)。
LAG3阻断剂可以与其它形式的免疫治疗例如细胞因子治疗(例如干扰素、GM-CSF、G-CSF、IL-2)或双特异性抗体治疗组合，其提供增强的肿瘤抗原呈递(例如，参见Holliger(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak(1994)Structure 2:1121-1123)。
自身免疫反应
抗LAG3抗体可能会引起和放大自身免疫应答。实际上，使用肿瘤细胞和肽疫苗诱导抗肿瘤应答揭示了许多涉及抗自身反应性的抗肿瘤应答(van Elsas et al.(2001)J.Exp.Med.194:481-489；Overwijk，et al.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:2982-2987；Hurwitz，(2000)supra；Rosenberg&White(1996)J.Immunother Emphasis TumorImmunol 19(1):81-4)。因此，有可能考虑使用抗LAG3抗体，如本申请所述的在LAG3阻断剂中与各种自身蛋白质结合的LAG3抗体，以便设计疫苗接种方案以有效地产生抗这些自身蛋白质的疾病治疗的免疫应答。例如，阿尔茨海默病涉及脑中淀粉体沉积物中Aβ肽的不适当积累；针对淀粉体的抗体应答能够清除这些淀粉体沉积物(Schenk et al.，(1999)Nature400:173-177)。
其他自身蛋白也可以用作靶点，例如用于治疗变态反应和哮喘的IgE和用于类风湿性关节炎的TNFα。最后，通过使用抗LAG-3抗体可诱导对各种激素的抗体应答。对生殖激素的中和抗体应答可用于避孕。对特定肿瘤生长所需的激素和其他可溶性因子的中和抗体应答也可以被认为是可能的疫苗接种目标。
使用抗LAG3抗体和抗体片段的如上所述的类似方法可用于诱导治疗性自身免疫应答，以治疗不适当积聚其他自身抗原的患者，例如淀粉体沉积物，包括阿尔茨海默病中的Aβ、细胞因子如TNFα和IgE。此外，抗LAG3抗体和抗体片段可用于诱导治疗性自身免疫反应，以治疗患有其他自身免疫疾病的患者，包括但不限于乳糜泻、克罗恩病、格雷夫病、炎症性肠病(IBD)、狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、风湿性多肌痛、类风湿性关节炎、I型糖尿病和血管炎。
疫苗
本发明的抗LAG3抗体和抗体片段可用于通过与抗LAG3抗体或具有目标抗原的抗体部分(例如疫苗)共同给药，来刺激抗原特异性免疫应答。因此，本发明进一步提供了增强对象中对抗原的免疫应答的方法，其包括向对象给药：(i)抗原；和(ii)抗LAG3抗体或其抗原结合部分，从而增强对对象对抗原的免疫应答。优选地，所述抗体是人抗人LAG3抗体(例如本申请所述的任何人抗LAG3抗体)。所述抗原可以是例如肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或来自病原体的抗原。此类抗原的非限制性示例包括上文讨论的抗原，例如上文讨论的肿瘤抗原(或肿瘤疫苗)、或来自上述病毒、细菌或其他病原体的抗原。
联合疗法
LAG3结合多肽(例如，抗LAG3抗体或抗体片段)可单独给药或与一种或多种附加疗法共同给予，例如化疗、放疗、免疫疗法、手术治疗或其任意组合。如上所述，在其他治疗策略中，也同样可以使用长期疗法作为辅助疗法。
在这些方法的某些实施例中，可以一起(同时地)或在不同时间(依次)服用一种或多种多肽治疗剂。此外，多肽治疗剂可以与另一类型的化合物一起服用以治疗癌症或抑制血管生成。
所公开的人抗LAG-3抗体可以与一种或多种其他治疗剂例如细胞毒性剂、放射性毒剂或免疫抑制剂共同给药。所述抗体可以与药剂(作为免疫复合物)连接或可以与药剂分开给药。在后一种情况下(单独给药)，所述抗体可以在药剂之前、之后或同时给药，或者可以与其它已知疗法(例如抗癌疗法，例如辐射)共同给药。这些治疗剂尤其包括抗肿瘤剂如多柔沙星(即阿霉素)、顺铂博莱霉素硫酸盐、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、氮烯唑胺和环磷酰胺羟基脲，其本身仅在对患者有毒或亚毒的水平上有效。顺铂以每四周一次100mg/ml的剂量静脉内给药，阿霉素以每21天一次60-75mg/ml的剂量静脉内给药一次。本发明的抗LAG3抗体和抗体片段与化学治疗剂的共同给药提供了两种抗癌剂，其通过对人肿瘤细胞产生细胞毒性作用的不同机制起作用。这样的共同给药可以解决由于对药物的抗性的发展或肿瘤细胞抗原性的改变而使肿瘤细胞与抗体不反应的问题。
如本申请所述的抗LAG3抗体或抗体片段可以与一种或多种有效刺激免疫应答的其他抗体共同给药，从而进一步增强、刺激或上调对象中的免疫应答。例如，本发明提供了用于刺激对象的免疫应答的方法，其包括向对象给药抗LAG3抗体或抗体片段和一种或多种其他免疫刺激性抗体，诸如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和/或抗CTLA-4抗体，从而刺激对象的免疫应答，例如抑制肿瘤生长或刺激抗病毒应答。
免疫系统的一个重要部分是它能够区分身体内的正常细胞和被视为“外来”的细胞。这让免疫系统攻击外来细胞，同时保持正常细胞的独立。为此，它使用“检查点”，其是某些免疫细胞上为了启动免疫应答而需要被激活(或失活)的分子。癌细胞有时会找到使用这些检查点的方法，以免被免疫系统攻击。因此，免疫检查点抑制剂包括的药物或试剂(例如抗体)可以激活在不存在该药物或试剂时失活的T细胞，，这至少部分是由于维持T细胞失活状态的癌细胞信号传导。
因此，在一个实施例中，本发明的抗LAG3抗体或抗原结合抗体片段与免疫检查点抑制剂组合用于治疗癌症。例如，在一个实施例中，本申请所述的抗LAG3抗体或抗原结合片段与作为免疫检查点抑制剂的抗体组合给药，所述抗体包括但不限于抗细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)抗体、抗程序性死亡1(PD-1)抗体或抗程序性死亡配体1(PD-L1)抗体。在一个实施例中，本申请所述的抗LAG3抗体或抗原结合片段与曲妥珠单抗(赫赛汀(Herceptin))组合给药。
在一个实施例中，向对象给药抗LAG3抗体或抗体片段和抗PD-1抗体。在另一个实施例中，向对象给药抗LAG3抗体或抗体片段和抗PD-L1抗体。在另一个实施例中，向对象给药抗LAG-3抗体或抗体片段和抗CTLA-4抗体。
在一个实施例中，本发明提供了治疗过度增殖性疾病(例如癌症)的方法，其包括向对象给药LAG3抗体和CTLA-4抗体。在进一步的实施例中，以亚治疗剂量给药抗LAG3抗体，以亚治疗剂量给药抗CTLA-4抗体，或以亚治疗剂量给药二者。可选地，用免疫刺激剂改变与治疗过度增殖性疾病相关的不良事件的方法，包括向对象给药抗LAG3抗体和亚治疗剂量的抗CTLA-4抗体。在一个实施例中，本申请描述的抗LAG3抗体或抗原结合片段与抗细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)抗体组合给药，例如易普利姆玛(ipilimumab)(YERVOY)或tremelimumab(CP-675，206；MedImmune)。
另一种组合包括向对象给药LAG3抗体或抗体片段和PD-1或PD-L1抗体。在一个实施例中，本申请描述的抗LAG3抗体或抗原结合片段与抗程序性死亡1(PD-1抗体)组合给药，例如，如派姆单抗(KEYTRUDA)或纳武单抗(OPDIVO)在一个实施例中，本申请描述的抗LAG3抗体或抗原结合片段与抗程序性死亡-配体1(PD-L1抗体，例如阿维鲁单抗(MSB0010718C)，阿特珠单抗(TECENTRIQ)或durvalumab(MEDI4736))组合给药。在进一步的实施例中，以亚治疗剂量给药抗LAG-3抗体，以亚治疗剂量给药抗PD-1或PD-L1抗体，或以亚治疗剂量给药二者。
通过抗体阻断剂LAG3和一种或多种第二靶向抗原如CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1的抗体，可增强对患者癌细胞的免疫应答。使用本申请公开的抗体可以抑制癌症的生长，所述癌症包括典型地对免疫疗法有反应的癌症。用本公开的组合疗法治疗的癌症的代表性例子包括上文在对抗LAG3抗体单一疗法的讨论中具体列出的那些癌症。
治疗方法和组合物
本申请所述的抗体组合物(例如人单克隆抗体、多特异性和双特异性分子与免疫轭合物)的合适的体内和体外给药途径是本领域熟知，并且可以由本领域普通技术人员选择的。例如，抗体组合物可以通过注射(例如静脉内或皮下)给药。所用分子的合适剂量取决于对象的年龄和体重以及抗体组合物的浓度和/或制剂。
给药的技术和剂量根据特定的多肽的类型和待治疗的特定症状而不同，但可以由技术人员轻易确定。通常，管理机构要求用作治疗剂的蛋白质试剂被配制成具有可接受的低水平热原。因此，治疗性制剂与其它制剂的区别通常在于：其基本上无热原，或者至少包含的热原不超过由合适管理机构(例如，FDA)确定的可接受水平。
本公开的治疗组合物可以与药学可接受稀释剂、载体或赋形剂以单位剂型形式一同给药。作为非限制性的例子，可以肠胃外(例如，静脉内、皮下)、口服或局部给药。此外，可以采用任何基因治疗技术(使用编码本发明的多肽的核酸)，例如裸DNA递送、重组基因和载体、基于细胞的递送，包括离体操作患者的细胞等。
所述组合物可以是用于口服给药的丸剂、片剂、胶囊、液体、或持续释放片剂；或用于静脉内、皮下或肠胃外给药的液体；或者用于局部给药的凝胶、洗剂、软膏、霜剂，或聚合物或其它持续释放的赋形剂。
本领域中熟知的制剂方法可以参见例如"Remington:The Science and Practiceof Pharmacy"(20th ed.，ed.A.R.Gennaro A R.，2000，Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia，Pa.)。肠胃外给药的制剂可以包括例如赋形剂、无菌水、盐水、聚亚烷基二醇如聚乙二醇、植物来源的油或氢化萘。可以使用可生物相容、可生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物来控制化合物的释放。纳米颗粒制剂(例如，可生物降解的纳米颗粒、固体脂质纳米颗粒、脂质体)可用于控制化合物的生物分布。其它有用的潜在的肠胃外递送体系包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入式输注系统，和脂质体。制剂中的化合物浓度根据许多因素(包括药物的给药剂量和给药途径)而不同。
可选地，所述多肽可以作为药学可接受的盐的形式来给药，例如常用于药学产业中的无毒性酸加成盐或金属复合物。酸加成盐的例子包括有机酸，比如乙酸、乳酸、双羟萘酸、马来酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、苯甲酸、棕榈酸、辛二酸、水杨酸、酒石酸、甲磺酸、甲苯磺酸，或三氟乙酸等；聚合酸比如单宁酸、羧甲基纤维素等；和无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸，等。金属复合物包括锌、铁，等等。在一个实施例中，在乙酸钠存在的情况下配制所述多肽，以增加热稳定性。
口服的制剂包括片剂，所述片剂在与药学上可接受的无毒赋形剂的混合物中包含活性成分。所述赋形剂可以是，例如，惰性稀释剂或填充剂(例如，蔗糖和山梨糖醇)、润滑剂、助流剂和抗粘合剂(例如，硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、二氧化硅、氢化植物油或滑石)。
口服的制剂也可以下方式提供：可咀嚼片剂，或硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂混合，或软明胶胶囊剂，其中活性成分与水或油介质混合。
治疗有效剂量是指对服用的目的产生治疗效果的剂量。确切的剂量取决于待处理的病症，并且本领域技术人员可以利用已知技术确定。通常，每天服用约0.01μg/kg至约50mg/kg，优选0.01mg/kg至约30mg/kg，最优选0.1mg/kg至约20mg/kg的多肽。可以每天(例如，每天一次、二次、三次或四次)或优选地以较低频率地(例如，每周、每两周、每三周、每月或每季度)给予所述多肽。此外，如本领域已知，可能需要根据年龄以及体重、总体健康状况、性别、饮食、给药时间、药物相互作用和疾病的严重程度做出调整，并且将由本领域技术人员通过常规实验确定。
优选地，所公开的抗体通过吸入给药，但由于全IgG抗体的分子尺寸(～150kDa)，其雾化可能受限。为了使可用的商用雾化装置最大化，可能需要更小的Fab片段。
在某些实施例中，本发明所述抗LAG3抗体或抗体片段可单独使用。
诊断和试剂盒
在某些实施例中，为了诊断的目的，可以标记或不标记结合多肽，例如，抗体或其片段。通常，诊断分析需要检测由结合多肽(例如抗体)与LAG3的结合产生的复合物的形成。与抗体类似，可以直接标记所述结合多肽或片段。可以使用各种标记，包括但不限于，放射性核素、荧光剂、酶、酶底物、辅酶因子、酶抑制剂和配体(例如生物素、半抗原)。本领域技术人员熟知多种适当的免疫分析法(例如，参见美国专利3817827、3850752、3901654和4098876)。未标记的结合性多肽可用于化验分析，例如凝集试验。未标记的结合多肽(例如，抗体或其片段)还可以与另一种(一种或多种)可用于检测该结合所述多肽的适当试剂(例如能与所述结合多肽反应的已标记抗体或其他适当试剂(如标记的蛋白A))组合使用。
在一个实施例中，可以在酶免疫分析法中利用本发明的结合多肽(例如，抗体或其片段)，其中所述多肽可以与酶共轭。当包含LAG3蛋白的生物样品与所述结合多肽组合时，在所述结合多肽和LAG3蛋白之间发生结合。在一个实施例中，包含表达LAG3蛋白的细胞(例如内皮细胞)的样本与所述抗体接触，在结合多肽和载有能被所述结合多肽识别的LAG3蛋白的细胞之间发生结合。这些结合的细胞可以与未结合的试剂分离，并且可以确定特异地结合至细胞的结合多肽-酶轭合物的存在，例如，通过令所述样本与在酶的作用下产生颜色变化或其它可检测变化的酶底物。在又一个实施例中，所述结合多肽可以不标记，而添加第二种已标记多肽(例如一种抗体)来识别所述结合多肽。
在一些方面中，还可以制备用本发明的抗体或其片段来检测生物样本中的LAG3蛋白的存在的试剂盒。所述试剂盒可包括与LAG3蛋白或所述受体的部分相结合的LAG3结合多肽(例如，抗体或其片段)，以及一种或多种适用于检测结合多肽与受体蛋白或其部分之间的复合物的存在的辅助试剂。本发明的多肽组合物可以单独或与专门用于其它表位的另外的抗体联合制备成冻干形式。所述标记或未标记的结合多肽和/或抗体可以与辅料(例如，缓冲液，例如Tris、磷酸和碳酸盐缓冲液、稳定剂、赋形剂、杀菌剂和/或惰性蛋白例如牛血清白蛋白)一起包含在试剂盒中。例如，所述结合多肽和/或抗体可以与辅料共同提供为冻干混合物，或辅料可以单独提供，由使用者来组合。一般地，这些附加材料的存在重量占活性结合多肽或抗体的量小于约5％，通常其存在重量占多肽或抗体浓度的总量至少约0.001％重量。当采用能结合至所述结合多肽的第二抗体时，可以在所述试剂盒中，例如在单独的小瓶或容器中，提供这些抗体。所述第二抗体，如果存在，通常是标记的，并且可以以与上文描述的抗体制剂相似的方式配制。
以下实施例中进一步描述了本发明，答案并不意图限制本发明的范围。
实施例1
筛选鉴定人类抗人LAG3抗体、重链和轻链可变氨基酸序列(包括其CDR)。
为了确定本发明公开的各种抗LAG3抗体的结合能力，将T细胞与涂覆有与CD3和CD28反应的抗体的磁珠进行培养。培养三天后，有显著百分比的细胞表达LAG3。将表达LAG3的细胞与测试抗体(1微克/毫升)培养，然后用藻红蛋白标记的山羊抗人IgG抗体染色。几种抗体与活化的T细胞具有反应性，其在图1中显示。
还进行了各种LAG3抗体与重组小鼠LAG3和人LAG3的交叉反应性的分析。用2ug/mL重组人和小鼠LAG3/Fc(空白：PBS)包被Maxisorb ELISA板。在4℃培养过夜。用PBS-吐温(PBST)将平板洗涤3次，然后用酪蛋白封闭缓冲液在室温下封闭1小时。接下来，加入在酪蛋白(约5ug/ml)中稀释的IgG，振荡培养30分钟。用PBST洗涤板3次。加入辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗人λHRP(酪蛋白中1:1000)，然后加入3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)作为底物，显色30分钟。用2M H2SO4终止反应，在450nm读取OD。使用抗AIP抗体C7作为对照抗体。结果提供在图2中，其显示抗LAG3抗体L35G6、L33H11、L35D4、L32A9、L32A4和L32D10与人LAG3结合但不与小鼠LAG3结合。
还使用BiaCore测定来测试抗体L3C5对人LAG3的结合亲和性。对于抗体L3C5，Ka测为4.73E5(1/Ms)，Kd测为0.0717(1/s)，Rmax测为261(RU)，KA测为6.6E6(1/M)，KD测为1.52E-7(M)，且χ2为3.65。使用Biacore来测量LAG3抗体L3C5的亲和力。使用标准NHS/EDC偶联方法将抗人Fc抗体(GE，BR-1008-39)固定在CM5传感器芯片上至约5000RU。以10μL/min的流速捕获抗体(约2μg/ml)60秒。将重组人LAG3/His在运行缓冲液(HBS-EP)中连续稀释。所有测量均在30μL/min的流速下进行。用3M MgCl2(来自人抗体试剂盒)进行60秒的表面再生。使用1：1结合模型(Langmuir模型)来拟合数据。
实施例2
使用两步活化方案的混合淋巴细胞反应(MLR)来进行功能性体外研究，以测量T细胞活化。通过测量抗LAG3抗体对表达LAG3的T细胞对由超抗原葡萄球菌肠毒素B(葡萄球菌肠毒素B：SEB)刺激的反应的影响，来评估抗LAG3抗体的功能活性。用与CD3和CD28反应的抗体包被的磁珠培养T细胞。第二天，除去珠粒并在新鲜培养基中培养细胞。再过两天后，收集T细胞并以每孔1x105个细胞的浓度将其加入到平底微量滴定板的孔中。向这些孔中加入2×104个新鲜制备的B细胞和SEB(10ng/ml)。培养三天后，将细胞染色以表达CD25。为了测定抗LAG3抗体的影响，如图3所示，计算相对于培养基对照的百分比变化。图4显示了在抗LAG3抗体存在下，通过CD25表达测量的T细胞活化水平。该数据表示为与培养基对照相比的百分比变化，如图3所示。图3和图4共同表明，所测试的五种抗LAG3抗体中，四种对T细胞活化的增强大于对照IgG。因此，所述抗体能够阻断LAG3活性并促进T细胞活化。
实施例3
使用混合淋巴细胞反应(MLR)进行功能性体外研究，以评估其他抗LAG3抗体，其中细胞因子产量是T细胞活化的量度。进行ELISA测定以确定抗LAG3抗体L32D10、L3E3、L3C5和L3A1(浓度为5μg/ml和0.5μg/ml)对IL-2和干扰素γ(IFNγ)细胞因子产生的作用。IL-2和IFNγ细胞因子产生是T细胞活化的量度。ELISA试剂盒购自Biolegend，并按照制造商的说明进行测定。图5和图6中的结果显示L32D10和L3E3各自增加了IL-2和干扰素γ(IFNγ)的产量，而克隆L3A1仅增加IL-2产生。使用不结合LAG3的IgG1和仅培养基作为对照。
可以理解的是，本申请所述的示例和实施例仅用于说明的目的，本领域技术人员知晓，可以对其进行的各种修改或改变均将被包括在所附权利要求的思路和范围内。本申请引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用整体并入本文用于所有目的。
表3.序列表
Figure BDA0001605611330000511
Figure BDA0001605611330000521
Figure BDA0001605611330000531
Figure BDA0001605611330000541
Figure BDA0001605611330000551
序列表
<110> 索伦托治疗有限公司
<120> 与LAG3结合的抗体治疗剂
<130> 126036-04720
<150> 62/195,651
<151> 2015-07-22
<160> 56
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Ala Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Leu Met Ala Thr Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Tyr Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu
35 40 45
Met Ile Phe Glu Val Thr Glu Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Val Tyr Phe Cys Ser Ser Tyr Ser Gly Ser
85 90 95
Asn Asn Pro Gly Ala Met Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 3
<211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Gln Ala Gly Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Ser Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Lys His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Thr Tyr Thr Arg Ser
85 90 95
Asn Thr Leu Val Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 4
<211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Asn Thr Leu Leu Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 5
<211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg His Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Thr Ser Asp Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Arg Leu Gln
65 70 75 80
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu
85 90 95
Ser Ala Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 6
<211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asp Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Gln Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Thr Thr Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 7
<211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Ala Tyr
20 25 30
Asn Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Ser
85 90 95
Gly Ser Ala Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 8
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Ala Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Leu Met Ala Thr Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Ala Tyr
20 25 30
Asn Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Ser
85 90 95
Gly Ser Ala Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 10
<211> 121
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn His
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Lys Lys Phe Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Ala His Gly Tyr Thr Ser Gly Trp His Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 11
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Arg Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val
35 40 45
Ser Ala Ala Ser Ser Leu Gln Gly Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Thr Tyr Ser Ser Pro Gln
85 90 95
Cys Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 12
<211> 121
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Asp Leu Gly Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 13
<211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ala Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Asn Arg
85 90 95
Asn Thr Leu Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 14
<211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
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Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asn Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Asn Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Ser Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Ile Ile Asn Pro Ser Ala Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 17
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Glu Leu Met Ala Thr Gly Gly Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 18
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Glu Val Thr Glu Arg Ala Ser
1 5
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<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Ser Ser Tyr Ser Gly Ser Asn Asn Pro Gly Ala Met
1 5 10
<210> 21
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Thr Gly Ser Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Ser Tyr Val Ser
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Asp Val Thr Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 23
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Ser Thr Tyr Thr Arg Ser Asn Thr Leu Val
1 5 10
<210> 24
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
Asp Val Thr Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 26
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Asn Thr Leu Leu
1 5 10
<210> 27
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Asp Asn Asn Lys Arg His Ser
1 5
<210> 29
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ala Tyr Val
1 5 10
<210> 30
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asp Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Thr Thr Leu Val
1 5 10
<210> 33
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Ala Tyr Asn Phe Val Ser
1 5 10
<210> 34
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
Gly Val Ser Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
Ser Ser Tyr Thr Thr Ser Gly Ser Ala Val
1 5 10
<210> 36
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
Ser Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 37
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
Ile Ile Asn Pro Ser Ala Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 38
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
Glu Leu Met Ala Thr Gly Gly Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 39
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Ala Tyr Asn Phe Val Ser
1 5 10
<210> 40
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
Gly Val Ser Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 41
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 41
Ser Ser Tyr Thr Thr Ser Gly Ser Ala Val
1 5 10
<210> 42
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
Asn His Ala Met His
1 5
<210> 43
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Lys Lys Phe Tyr Ser Asp Ser Val Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 44
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
Gly Ala His Gly Tyr Thr Ser Gly Trp His Asp Tyr
1 5 10
<210> 45
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 45
Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Arg Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 46
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Gly
1 5
<210> 47
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 47
Gln Gln Thr Tyr Ser Ser Pro Gln Cys Thr
1 5 10
<210> 48
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 48
Asn Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 49
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 49
Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 50
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 50
Asp Ser Gly Tyr Asp Leu Gly Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 51
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 51
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 52
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 52
Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 53
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 53
Ser Ser Tyr Thr Asn Arg Asn Thr Leu Leu
1 5 10
<210> 54
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 54
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 55
Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 56
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 56
Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Asn Val
1 5 10

Claims (22)

1.与LAG3表位结合的IgG类的分离的全人抗体，所述抗体包含重链可变区序列和轻链可变区序列，其特征在于，所述重链可变区序列为SEQ ID NO.1；和所述轻链可变区序列为SEQ ID NO.6。
2.根据权利要求1所述的全人抗体，其特征在于，所述抗体具有至少1x10-6M的KD。
3.抗LAG3全人抗体Fab片段，所述全人抗体Fab片段包含重链可变区序列和轻链可变区序列，其特征在于，所述重链可变区序列为SEQ ID NO.1；且所述轻链可变区序列为SEQ IDNO.6。
4.根据权利要求3所述的抗LAG3全人抗体Fab片段，其特征在于，所述抗体具有至少1x10-6M的KD。
5.抗LAG3单链人抗体，其包括由肽接头连接的重链可变区和轻链可变区，其特征在于，所述重链可变区为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；且所述轻链可变区为SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求5所述的抗LAG3单链人抗体，其特征在于，所述抗体具有至少1x10-6M的KD。
7.分离的抗人LAG3抗体或其抗原结合片段，包括
重链可变区，所述重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，其中，所述CDR1为SEQ ID No：15，所述CDR2为SEQ ID No：16，且所述CDR3为SEQ ID No：17；和
轻链可变区，所述轻链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，其中，所述CDR1为SEQ ID No：30，所述CDR2为SEQ ID No：31，且所述CDR3为SEQ ID No：32。
8.根据权利要求7所述的抗人LAG3抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区包含与氨基酸序列SEQ ID NO.1至少95％相同的氨基酸序列以及CDR1、CDR2和CDR3，其中，所述CDR1为SEQ ID No：15，所述CDR2为SEQ ID No：16，且所述CDR3为SEQ ID No：17；且所述轻链可变区包含与氨基酸序列SEQ ID NO.6至少95％相同的氨基酸序列以及CDR1、CDR2和CDR3，其中，所述CDR1为SEQ ID No：30，所述CDR2为SEQ ID No：31，且所述CDR3为SEQID No：32。
9.根据权利要求7所述的抗人LAG3抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；且所述轻链可变区为SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的抗人LAG3抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗人LAG3抗体为IgG。
11.根据权利要求10所述的抗人LAG3抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗人LAG3抗体是IgG1或IgG4同种型。
12.根据权利要求7-9中任一项所述的抗人LAG3抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述片段是Fab片段。
13.药物组合物，其包含根据权利要求1或2所述的全人抗体、根据权利要求3或4所述的抗LAG3全人抗体Fab片段、根据权利要求5或6所述的抗LAG3单链人抗体、或根据权利要求7-12中任一项所述的抗人LAG3抗体或其抗原结合片段，还包括药学上可接受的载体。
14.根据权利要求1或2所述的全人抗体、根据权利要求3或4所述的抗LAG3全人抗体Fab片段、根据权利要求5或6所述的抗LAG3单链人抗体、或根据权利要求7-12中任一项所述的抗人LAG3抗体或其抗原结合片段在制备用于提高IL-2和IFNγ的表达的药物中的用途。
15.根据权利要求14所述的用途，其特征在于，所述药物用于治疗癌症、感染性疾病或自身免疫疾病。
16.根据权利要求14所述的用途，其特征在于，所述药物用于治疗癌症，所述癌症选自恶性胶质瘤、血液肿瘤、转移性黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、多发性骨髓瘤、B型慢性淋巴细胞白血病、B和T型急性淋巴细胞白血病、T细胞淋巴瘤、急性骨髓细胞白血病、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤和慢性骨髓细胞白血病、黑素瘤、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌和肺癌。
17.根据权利要求14所述的用途，其特征在于，所述药物用于治疗癌症，所述癌症为骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门癌、胃癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病，所述慢性或急性白血病包括急性骨髓细胞白血病、慢性骨髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、儿童实体瘤、淋巴细胞白血病、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症、由石棉诱导的癌症以及表达PD-L1的转移性癌症。
18.根据权利要求14所述的用途，其特征在于，所述药物用于治疗癌症，所述癌症是表达PD-L1的转移性癌症。
19.根据权利要求14所述的用途，其特征在于，所述药物用于治疗感染性疾病，所述感染性疾病选自HIV、肝炎A、B和C、流行性感冒、疱疹、贾第虫、疟疾、利什曼虫、金黄色酿脓葡萄球菌、绿脓杆菌、虫媒病、艾柯病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞体病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒和虫媒病毒脑炎病毒。
20.根据权利要求14所述的用途，其特征在于，所述药物用于治疗感染性疾病，所述感染性疾病选自衣原体、立克次体细菌、分枝杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、脑膜炎球菌和淋球菌、克雷伯氏杆菌、变形杆菌、沙雷氏菌、假单胞菌、军团杆菌、白喉、沙门氏菌、杆菌、霍乱、破伤风、肉毒中毒、炭疽、瘟疫、细螺旋体病和莱姆病细菌。
21.根据权利要求14所述的用途，其特征在于，所述药物用于治疗感染性疾病，所述感染性疾病选自痢疾阿米巴、结肠小袋纤毛虫、福氏耐格里阿米巴、棘阿米巴属、氏贾第鞭毛虫、隐孢子虫属、卡氏肺孢子虫、间日疟原虫、田鼠巴贝虫、布氏锥虫、克氏锥虫、杜氏利什曼虫、鼠弓形虫和巴西日圆线虫。
22.根据权利要求14所述的用途，其特征在于，所述药物用于治疗自身免疫疾病，所述自身免疫疾病选自阿尔茨海默病、过敏症、哮喘、乳糜泻、克罗恩病、格雷夫病、炎症性肠病、狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、风湿性多肌痛、类风湿性关节炎、I型糖尿病和血管炎。
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