ES2858091T3 - Moléculas de unión que se unen a PD-L1 y LAG-3 - Google Patents

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Katy Louise Everett
Miguel Gaspar
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Katarzyna Kmiecik
Mustapha Faroudi
Natalie Fosh
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Abstract

Una molécula de anticuerpo que se une al ligando 1 de muerte programada (PD-L1) y al gen 3 de activación de linfocitos (LAG-3), en donde la molécula de anticuerpo comprende: (i) un sitio de unión a antígeno basado en la región determinante de la complementariedad (CDR) para PD-L1 que comprende las CDR mostradas en las SEQ ID NO 86 a 91; y (ii) un sitio de unión al antígeno LAG-3 localizado en un dominio CH3 de la molécula de anticuerpo, en donde el sitio de unión a LAG-3 comprende las secuencias de aminoácidos WDEPWGED (SEQ ID NO: 1) y PYDRWVWPDE (SEQ ID NO: 3), y en donde la secuencia de aminoácidos WDEPWGED está localizada en el bucle AB del dominio CH3 y la secuencia de aminoácidos PYDRWVWPDE está localizada en el bucle EF del dominio CH3.

Description

DESCRIPCIÓN
Moléculas de unión que se unen a PD-L1 y LAG-3
Solicitudes relacionadas
El presente caso está relacionado con US 62/352482 presentado el 20 de junio de 2016.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a moléculas de anticuerpos que se unen al ligando 1 de muerte programada (PD-L1) y al gen 3 de activación de linfocitos (LAG-3). Las moléculas de anticuerpos comprenden un sitio de unión a antígeno basado en CDR para PD-L1 y un sitio de unión a antígeno LAG-3 que está localizado en dos o más bucles estructurales de un dominio CH3 de la molécula de anticuerpo. Las moléculas de anticuerpos de la invención encuentran aplicación, por ejemplo, en la terapia del cáncer.
Antecedentes de la invención
El Gen 3 de Activación de Linfocitos (LAG-3; CD223) es un miembro de la superfamilia de Ig, y está relacionado genética y estructuralmente con CD4 (aunque con solo un 20% de identidad de secuencia). Al igual que CD4, LAG-3 se une a moléculas de MHC de clase II, pero con mayor afinidad que CD4 (Kd = 60 nM). LAG-3 se expresa en células T activadas, células NK, pDC, células B, células T y¿ y participa en la inmunosupresión, particularmente a través de una fuerte expresión persistente en un porcentaje de células T reguladoras (Treg) (Liang et al, 2008).
El gen LAG-3 está localizado en el cromosoma 12 humano, adyacente al gen CD4, y abarca 8 exones. Hay cinco transcritos alternativos, dos de los cuales generan productos proteicos: una proteína transmembrana de longitud completa y una forma monomérica soluble con corte y empalme alternativo. El transcrito de longitud completa codifica una proteína de 525 aminoácidos con un peso molecular de 70 kDa y tiene actividad funcional, mientras que la forma soluble parece no unirse a las moléculas de MHC de clase II y se desconoce su función. La proteína LAG-3 humana de longitud completa tiene un 93% de identidad de secuencia con LAG-3 de Macaca fascicularis (mono cinomolgo) y un 70% de identidad de secuencia con LAG-3 de Mus musculus (ratón doméstico).
LAG-3 es una proteína transmembrana con cuatro dominios extracelulares similares a Ig (D1-D4) y una porción citoplásmica responsable de la señalización de LAG-3. El dominio citoplásmico tiene un resto EP (ácido glutámico/prolina) que se asocia con la proteína asociada a LAG-3 (LAP), así como un resto KIEELE que se cree que es necesario para la modulación por LAG-3 de la función de las células T. Los informes sobre el papel del resto EP sugieren que puede ser responsable del transporte de LAG-3 a la membrana de la superficie de las células T (Bae et al, 2014), o puede ser directamente responsable de modular la señalización aguas abajo de STAT5 durante la activación de las células T (Durham et al, 2014), o posiblemente ambos.
Se cree que el mecanismo inmunosupresor de LAG-3 en las células T está dirigido por la reticulación de LAG-3 en las células T activadas, lo que da lugar a una disminución del flujo de calcio y la liberación de IL-2 durante la activación de las células T (Huard et al, 1997). En las células presentadoras de antígeno (APC), la unión a las moléculas de MHC II por las células T reguladoras positivas para LAG-3 provoca una disminución de la secreción de IL-12 y una regulación a la baja de CD86 (Liang et al, 2008), una "señal secundaria" de activación, lo que da lugar a anergia de las células T por activación inadecuada y/o presentación reducida de antígenos por las APC. Los modelos de ratón de inactivación de LAG-3 son viables, con sólo una hiperproliferación linfoide leve (Workman et al, 2003), lo que indica que LAG-3 actúa como un "freno" inmune modesto.
También se ha propuesto que esta interacción supresora entre LAG-3 y MHC de clase II ocurre entre las Treg y las células T positivas para CD4 (Sega et al, 2014). Las Treg suprimen la respuesta inmune mediante la liberación de citoquinas supresoras (tales como IL-10 y TGFp), la manipulación del metabolismo inflamatorio (tal como la adenosina catabolizada por CD73), la regulación de la maduración de las APC o la interacción directa entre las células T reguladoras y las células T efectoras. Existe evidencia en los seres humanos de que las Treg positivas para MHC de clase II son más supresoras que las Treg negativas para MHC de clase II (Baecher-Allen et al, 2006) y suprimen activamente la respuesta inmune a través de la interacción directa con LAG-3 expresada en las células T efectoras. Mientras que las Treg negativas para LAG-3 pueden suprimir la proliferación de las células T convencionales, las células T CD4 y CD8 negativas para LAG-3 son resistentes a la inmunosupresión por Treg. Se describió que este proceso ocurre entre las células T humanas a través de un proceso conocido como trogocitosis (Sega et al, 2014) por el cual las Treg no solo previenen la maduración de las APC, sino que también adquieren MHC de clase II para suprimir las células T CD4 positivas para LAG-3 cebadas.
La expresión de LAG-3 también es un marcador de estimulación antigénica repetida. En el cáncer, las células T adoptan comúnmente un fenotipo "agotado", que implica la expresión de inmunosupresores tales como PD-1, CTLA-4, TIM-3 y LAG-3 (Wherry et al, 2011), donde las células tienen una incapacidad general para proliferar y secretar quimioquinas de forma adecuada en respuesta al antígeno. La inhibición de estos inmunosupresores reduce el umbral inmune y (re) permite una respuesta anticancerosa adecuada por parte de las células T. En modelos preclínicos, esto se ha confirmado usando anticuerpos antagonistas contra LAG-3, CTLA-4 y PD-1, donde se observó una disminución de la carga tumoral. Se cree que la inhibición de LAG-3 por anticuerpos antagonistas reactiva la respuesta inmune en el microambiente tumoral, donde la expresión de LAG-3 en las células T positivas para CD4 y células T positivas para CD8 se asocia con un fenotipo agotado, y la expresión de LAG-3 en Treg se asocia con potentes capacidades inmunosupresoras. Los anticuerpos que bloquean LAG-3 incrementan la proliferación de células efectoras T, la producción de citoquinas, la citotoxicidad y disminuyen la actividad supresora de Treg, lo que conduce a una disminución del crecimiento tumoral.
En los tumores humanos, se encontró una expresión incrementada de LAG-3 en linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) de carcinomas de células renales humanos y otros tumores, tales como melanomas y linfomas (Demeure et al, 2001; Wolchock et al, 2013). Es importante destacar que LAG-3 también se correlaciona estrechamente con la disfunción de las células T en pacientes con infección viral crónica (Workman et al, 2005) y cáncer (Workman et al, 2003). LAG-3 también se ha identificado como un marcador de superficie para Treg infiltrantes de tumores en una variedad de cánceres humanos (Camisachi et al. 2010; Gandhi et al, 2006).
Los anticuerpos monoclonales contra LAG-3 humano están en desarrollo clínico para suprimir la inmunosupresión y aumentar potencialmente la presentación de antígenos en cánceres (malignidades sólidas y hematológicas).
LAG-525 e IMP-701 (Novartis AG), son anticuerpos humanos contra LAG-3 y han avanzado a estudios clínicos de fase II y I, respectivamente, en cáncer de riñón (cáncer de células renales); cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC); cáncer de nasofaringe; cáncer colorrectal; melanoma; cáncer gástrico y adenocarcinoma de la unión gastroesofágica.
El anticuerpo anti-LAG-3 BMS-986016 (Bristol-Myers Squibb Company), se encuentra actualmente en ensayo clínico de fase I para el cáncer de ovario; NSCLC; cáncer colorrectal; cáncer de cuello uterino; melanoma; cáncer gástrico; cáncer de vejiga; carcinoma de células escamosas de cáncer de cabeza y cuello; carcinoma de células renales y en estudios de fase II en NSCLC; leucemia linfocítica crónica recidivante (CLL); leucemia linfocítica crónica refractaria (CLL); melanoma; linfoma no de Hodgkin; linfoma de Hodgkin; linfoma difuso de células B grandes; linfoma indolente; linfoma de células del manto; mieloma múltiple refractario; y mieloma múltiple recidivante bien como monoterapia o como parte de terapias combinadas.
También se encuentran en desarrollo preclínico otros anticuerpos contra LAG-3.
La muerte celular programada 1 (PD-1) y sus ligandos PD-L1 (CD274, B7-H1) y PD-L2 (B7-DC) administran señales inhibidoras que regulan el equilibrio entre la activación de las células T, la tolerancia y la inmunopatología. PD-L1 se expresa transitoriamente en todas las células inmunes y en algunas células tumorales.
PD-L1 es una proteína transmembrana de tipo I con dos dominios similares a Ig dentro de la región extracelular, un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico corto. El dominio citoplásmico no tiene un resto de transducción de señales conocido, lo que sugiere que no hay señalización por PD-L1 en la interacción del ligando con su receptor. Su peso molecular es de 40 kDa (290 aminoácidos) y está codificado por el gen CD274 en el cromosoma 19 del ratón y en el cromosoma 9 humano, respectivamente. PD-L1 es un miembro de la familia de proteínas B7 y comparte aproximadamente un 20% de identidad de secuencia de aminoácidos con B7.1 y B7.2. El PD-L1 humano comparte un 70% y un 93% de identidad de aminoácidos con los ortólogos murinos y de cinomolgo de PD-L1, respectivamente.
PD-L1 se une a su receptor PD-1 con afinidad (Kd) de 770 nM. PD-1 se expresa en células T activadas, células B y células mieloides, y modula la activación o inhibición de las respuestas inmunes celulares. La unión de PD-L1 a PD-1 proporciona una señal inhibidora que reduce la producción de citoquinas y la proliferación de las células T. En consecuencia, la expresión de PD-L1 por parte de las células puede mediar la protección contra la muerte de los linfocitos T citotóxicos (CTL) y es un mecanismo regulador que amortigua las respuestas inmunes crónicas durante las infecciones virales. El cáncer, como enfermedad crónica y proinflamatoria, subvierte esta ruta de protección inmune a través de la regulación al alza de la expresión de PD-L1 para evadir la respuesta inmune del huésped. En el contexto de una respuesta inmune activa, el IFNy también regula al alza la expresión de PD-L1.
PD-L1 también media la supresión inmune a través de la interacción con otra proteína, B7.1 (también conocida como CD80), bloqueando su capacidad para proporcionar una de las señales secundarias de activación en las células T a través de CD28. En cuanto a la expresión de PD-L1 en las células tumorales y su unión con B7.1, la relevancia de esta interacción específica en la resistencia inmune tumoral aún no está clara.
Se ha mostrado la expresión de PD-L1 en una amplia variedad de tumores sólidos. De 654 muestras examinadas en un estudio, que abarcan 19 tumores de diferentes sitios, 89 (14%) fueron positivas para PD-L1 (frecuencia >5%). Las frecuencias positivas para PD-L1 más altas se observaron en cáncer de cabeza y cuello (17/54; 31%), cuello uterino (10/34; 29%), cáncer de origen primario desconocido (CUP; 8/29; 28%), glioblastoma multiforme (GBM; 5/20; 25%), vejiga (8/37; 21%), esofágico (16/80; 20%), mama triple negativo (TN) (6/33; 18%) y hepatocarcinoma (6/41; 15%) (Grosso et al, 2013). Se ha mostrado que la expresión de PD-L1 asociada tumores confiere inmunorresistencia y protege potencialmente a las células tumorales de la apoptosis mediada por las células T.
Las terapias dirigidas a PD-L1 han mostrado excelentes resultados en estudios murinos in vivo. En el modelo murino de melanoma B16, el tratamiento con anti-PD-L1 combinado con estrategias de vacunación con GVAX o FVAX dio como resultado un efecto significativo tanto en la supervivencia (30 días para el control frente a 52 días para los tratados con PD-L1) como en el porcentaje de animales libres de tumor (5%) al finalizar el estudio (Curran et al, 2010). La terapia anti-PD-L1 también se ha usado para estudiar el mecanismo de inmunosupresión en el modelo de mastoma murino P815. Las células de P815 inyectadas en ratones normalmente desencadenan una fuerte respuesta inmune, lo que resulta en su rechazo. Cuando PD-L1 se expresa en células P815, estas células escapan del ataque inmune, que a su vez puede ser anulado a través de la administración de anticuerpos anti-PD-L1 (Iwai et al, 2002). Es evidente que el tomar como diana el eje PD-1/PD-L1 en cánceres humanos inmunogénicos (Herbst et al, 2014) da como resultado una ventaja de supervivencia a través de la estimulación de una respuesta inmune anticancerosa (Wolchock et al, 2013; Larkin et al, 2015).
El atezolizumab (MPDL3280A, RG7466, TECENTRIQ) es un anticuerpo IgG1 humanizado que se une a PD-L1. Se encuentra en ensayos clínicos como agente único y también en combinación con otras terapias biológicas y/o de moléculas pequeñas para el tratamiento de cánceres sólidos, que incluyen cáncer colorrectal, cáncer de mama, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, cáncer de vejiga y carcinoma de células renales. El tratamiento con atezolizumab dio como resultado tasas de respuesta objetiva (ORR) del 23% en el NSCLC, del 36% en el melanoma, del 33% en la vejiga, del 14% en el RCCy del 13% en los cánceres de cabeza y cuello (Herbst et al, 2014; Powles et al, 2014).
El avelumab (MSB0010718C) es un anticuerpo IgG1 completamente humano que se une a PD-L1 y se está sometiendo a ensayos clínicos en varios cánceres, incluyendo cáncer de vejiga, cáncer gástrico, cáncer de cabeza y cuello, mesotelioma, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, cáncer de ovario, cáncer renal y carcinoma de células de Merkel.
El durvalumab (MEDI4736) es un anticuerpo IgG1 humano que se une a PD-L1 y se está ensayando en ensayos clínicos solo o en combinación con tremelimumab en cáncer de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer pancreático y con otras moléculas biológicas y pequeñas en ensayos para cánceres sólidos adicionales tales como cánceres gástricos, melanoma y carcinoma hepatocelular irresecable.
Se han ensayado más anticuerpos anti-PD-L1 en ensayos clínicos, incluyendo BMS-936559 y otros se encuentran en ensayos preclínicos.
Sin embargo, pocas terapias anti-LAG-3 se encuentran actualmente en ensayos clínicas y ninguna ha sido aprobada para terapia, por lo que sigue existiendo la necesidad de desarrollar moléculas adicionales que se dirijan a LAG-3. Si bien se están desarrollando algunas terapias anti-PD-L1, los datos actuales muestran que el tratamiento general con monoterapia anti-PD-L1 da como resultado una respuesta en menos del 50% de los pacientes con cáncer. Por tanto, sigue existiendo una necesidad en la técnica de moléculas adicionales que puedan dirigirse a LAG-3 y/o PD-L1 y que encuentren aplicación en la terapia del cáncer.
Declaraciones de invención
Los anticuerpos anti-PD-1 y anti-PD-L1 están implicados predominantemente en la ruptura de la tolerancia inmune y en la activación de una respuesta inmune antitumoral. LAG-3, expresado en las células T después de la activación, y expresado constitutivamente en las células T agotadas, mantiene además a estas células en un estado supresor. También se ha mostrado que el bloqueo de LAG-3, cuando se emplea en combinación con otras moléculas inmunosupresoras establecidas (es decir: PD-1, PD-L1), proporciona una respuesta inmune sinérgica mejorada en modelos de tumores murinos (Woo et al, 2012). Los presentes inventores postularon que las terapias dirigidas a ambas rutas simultáneamente abordarán directamente los mecanismos que promueven y mantienen el agotamiento de las células T. Además, los inventores esperan que el tomar como diana LAG-3 pueda suprimir la presentación de antígenos a través de la acción de las células T reguladoras que expresan LAG-3 en las APC y la investigación publicada que documenta la regulación a la baja de CD86 (Grosso et al, 2013). Se espera que el bloqueo de esta interacción mantenga la presentación de antígenos, mientras que se espera que el bloqueo de la señalización de PD-L1 rompa la tolerancia, dando como resultado una respuesta antitumoral significativa cuando ambas rutas se inhiben al mismo tiempo.
Los datos publicados sobre las combinaciones de anticuerpos anti-LAG-3 y anti-PD-L1 son limitados, aunque existen algunos resultados de modelos de carga viral y tumores de ratón singénicos preclínicos. En un modelo murino de mieloma, se administró una combinación de anticuerpos bloqueantes anti-PD-L1 y anti-LAG-3 después de una irradiación de dosis baja en todo el cuerpo y se mejoraron las tasas de supervivencia a más del 80% (Jing et al, 2015; WO2015/048312). No se observó evidencia de autoinmunidad sistémica o específica de órganos. Los ratones con inactivación de LAG-3 y PD-1 mostraron un incremento notable de la supervivencia y el aclaramiento de múltiples tumores trasplantables (Woo et al, 2012).
Los presentes inventores postularon que los anticuerpos biespecíficos que se unen tanto a LAG-3 como a PD-L1 conferirían una serie de ventajas sobre la combinación de anticuerpos monoclonales contra estos antígenos, que incluyen:
1. Terapia dirigida
Las células T activadas expresan LAG-3 en los ganglios linfáticos. Una parte del anticuerpo biespecífico anti-LAG-3/PD-L1 está dirigida a las células T positivas para LAG-3 cebadas en el ganglio linfático, que luego se transportan al sitio del tumor, transportando el anticuerpo biespecífico. Una vez dentro del microentorno del tumor, las células T que portan el anticuerpo biespecífico pueden unirse a y bloquear inmediatamente PD-L1 en las células tumorales a través de la porción anti-PD-L1. En consecuencia, todas las células T que viajen al sitio del tumor serían resistentes a la señalización tanto de LAG-3 como de PD-L1/PD-1.
2. Formación de puentes
Las células T positivas para CD8 cebadas encuentran antígenos tumorales dentro del microentorno tumoral, donde responden matando la célula tumoral en ausencia de señales supresoras. Se espera que los anticuerpos biespecíficos sean superiores a las combinaciones de terapias monoclonales individuales en el mantenimiento o prolongación de este contacto entre las células T y las células tumorales. La fuerza de la señal en la activación de las células T es esencial, que en el caso del antígeno presentado en cánceres puede ser clave (Engels et al, 2013) y se espera que la presencia de un anticuerpo anti-LAG-3/PD-L1 biespecífico unido a dianas en las APC o las células cancerosas incremente el tiempo en el que las células T pueden reconocer con éxito el antígeno y activarse.
3. Localización
En áreas de inflamación y respuestas inmunes en curso, la expresión de PD-L1 se incrementa significativamente debido a la liberación localizada de IFN-y. Esto es cierto ya sea en células cancerosas diana, macrófagos asociados a tumores (TAM) o estimulación repetida de poblaciones de células T. Se espera que un anticuerpo biespecífico que antagoniza PD-L1 y LAG-3 se localice y se concentre en las áreas de mayor expresión de PD-L1 en el tumor mientras permite que la porción anti-LAG-3 se una y prevenga la supresión mediada por LAG-3 de las células T.
Tras un extenso programa de cribado y maduración por afinidad, los presentes inventores pudieron identificar diez miembros de unión específicos que comprenden un sitio de unión específico para LAG-3 en el dominio CH3 de la molécula. Se mostró que estas moléculas tienen una alta afinidad por LAG-3 humano y de cinomolgo. Se espera que la alta afinidad por LAG-3 humano sea ventajosa en el tratamiento, p. ej., de cánceres que contienen linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) que expresan LAG-3 en pacientes humanos, mientras que se espera que la alta afinidad por LAG-3 de cinomolgo, que es comparable a la afinidad por LAG-3 humano, sea útil en la evaluación de las propiedades de los miembros de unión específicos en modelos de enfermedad del mono cinomolgo. La razón de esto es que los resultados obtenidos tienen más probabilidades de predecir los efectos del miembro de unión específico en pacientes humanos que cuando se ensaya una molécula que tiene una mayor variabilidad en su afinidad por LAG-3 humano y de cinomolgo en modelos de monos cinomolgos.
También se mostró que los miembros de unión específicos tienen una alta actividad en un ensayo de activación de células T, que se espera que sea predictivo de una eficacia mejorada en pacientes humanos a través de una inhibición aumentada de LAG-3.
Los presentes inventores combinaron además estos miembros de unión específicos que comprenden un sitio de unión específico para LAG-3 en el dominio CH3 con un dominio Fab de anticuerpo que comprende un sitio de unión a antígeno basado en CDR para PD-L1 para crear moléculas de anticuerpos biespecíficas que comprenden sitios de unión tanto para LAG-3 como para PD-L1, que se espera que tengan las ventajas detalladas anteriormente. Los inventores también prepararon versiones murinas sustitutas de estas moléculas de anticuerpos que se unen a LAG-3 murino y PD-L1 murino y se mostró que son capaces de inhibir significativamente el crecimiento tumoral en modelos de cáncer singénicos de ratón. En particular, el uso de estas moléculas murinas sustitutas demostró que existe un efecto sinérgico sobre la supresión del crecimiento tumoral cuando una molécula de anticuerpo que comprende sitios de unión para LAG-3 y PD-L1 se administra a ratones en los modelos de ratón ensayados. Sobre la base del mecanismo de acción similar de LAG-3 y PD-L1 de ratón y humano en el entorno tumoral, se espera que los estudios murinos que muestran eficacia en la disminución de la carga tumoral se traduzcan en beneficios terapéuticos clínicos en pacientes humanos con cáncer. En base a estos resultados, por lo tanto, se espera que las moléculas de anticuerpos de la invención muestren un efecto superior en el tratamiento del cáncer en pacientes humanos, en particular en la supresión del crecimiento tumoral, que, por ejemplo, la administración de dos moléculas separadas que se unen a LAG-3 y PD-L1, respectivamente.
Por tanto, la presente invención proporciona una molécula de anticuerpo que se une al ligando 1 de muerte programada (PD-L1) y al gen 3 de activación de linfocitos (LAG-3), en donde la molécula de anticuerpo comprende:
(i) un sitio de unión a antígeno basado en la región determinante de complementariedad (CDR) para PD-L1 que comprende las CDR mostradas en las SEQ ID NO 86 a 91; y
(ii) un sitio de unión a antígeno LAG-3 localizado en un dominio CH3 de la molécula de anticuerpo, en donde el sitio de unión a LAG-3 comprende las secuencias de aminoácidos WDEPWGED (SEQ ID NO: 1) y PYd Rw VWPDE (SEQ ID NO: 3), y en donde la secuencia de aminoácidos WDEPWGED está localizada en el bucle AB del dominio CH3 y la secuencia de aminoácidos PYDRWVWPDE está localizada en el bucle EF del dominio CH3.
La secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 está localizada preferiblemente en los residuos 11 a 18 del dominio CH3; y/o la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3 está localizada en los residuos 92 a 101 del dominio CH3; en donde la numeración de los residuos de aminoácidos se realiza según el esquema de numeración de ImMunoGeneTics IMGT).
El sitio de unión a antígeno LAG-3 de la molécula de anticuerpo puede comprender además una de las siguientes secuencias, preferiblemente en el bucle CD del dominio CH3 de la molécula de anticuerpo:
(i) SNGQPENNY (SEQ ID NO 2, 8 y 18);
(ii) SNGQPEDNY (SEQ ID NO: 13);
(iii) SNGYPEIEF (SEQ ID NO: 23);
(iv) SNGIPEWNY (SEQ ID NO: 28);
(v) SNGYAEYNY (SEQ ID NO: 33);
(vi) SNGYKEENY (SEQ ID NO: 38);
(vii) SNGVPELNV (SEQ ID NO: 43); o
(viii) SNGYQEDNY (SEQ ID NO: 48).
Preferiblemente, el sitio de unión a antígeno LAG-3 de la molécula de anticuerpo comprende además una de las siguientes secuencias, preferiblemente en el bucle CD del dominio CH3 de la molécula de anticuerpo: la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, 28, o 38 en el bucle CD del dominio CH3. Más preferiblemente, el sitio de unión a antígeno LAG-3 de la molécula de anticuerpo comprende además la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 en el bucle CD del dominio CH3
La secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, 8, 13, 18, 23, 28, 33, 38, 43 o 48 se está localizada preferiblemente en los residuos 43 a 78 del dominio CH3 de la molécula de anticuerpo, en donde el los residuos se numeran según el esquema de numeración IMGT.
La secuencia del dominio CH3 de la molécula de anticuerpo, además de las secuencias del sitio de unión a antígeno LAG-3, no está particularmente limitada. Preferiblemente, el dominio CH3 es un dominio G de inmunoglobulina humana, tal como un dominio CH3 de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana, lo más preferiblemente un dominio CH3 de IgG1 humana. Las secuencias de los dominios CH3 de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humanas son conocidas en la técnica.
En una realización preferida, la molécula de anticuerpo comprende el dominio CH3 mostrado en la SEQ ID NO: 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50, más preferiblemente el dominio CH3 mostrado en la SEQ ID. NO: 5, 30 o 40, lo más preferiblemente el dominio CH3 mostrado en la SEQ ID NO: 5. Alternativamente, la molécula de anticuerpo puede comprender un dominio CH3 con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50, preferiblemente la SEQ ID NO: 5, 30 o 40, más preferiblemente la SEQ ID NO: 5.
La molécula de anticuerpo puede comprender además un dominio CH2. El dominio CH2 está localizado preferiblemente en el extremo N del dominio CH3, como en el caso de una molécula de IgG humana. El dominio CH2 de la molécula de anticuerpo es preferiblemente el dominio CH2 de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humanas, más preferiblemente el dominio CH2 de IgG1 humana. Las secuencias de los dominios de IgG humanas se conocen en la técnica. En una realización preferida, la molécula de anticuerpo comprende un dominio CH2 de IgG con la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 54, o un dominio CH2 con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 54.
En una realización preferida, la molécula de anticuerpo comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 6, 7, 11, 12, 16, 17, 21, 22, 26, 27, 31, 32, 36, 37, 41, 42, 46, 47, 51 o 52, o una secuencia que tiene al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 6, 7, 11, 12, 16, 17, 21, 22, 26, 27, 31, 32, 36, 37, 41,42, 46, 47, 51 o 52. Más preferiblemente, la molécula de anticuerpo comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 6, 7, 31, 32, 41 o 42, o una secuencia que tiene al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 6, 7, 31,32, 41 o 42. Aún más preferiblemente, la molécula de anticuerpo comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 6 o 7, o una secuencia que tiene que tiene al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 6 o 7.
En una realización preferida, la molécula de anticuerpo es una molécula de inmunoglobulina G humana, tal como una molécula de IgG 1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana, más preferiblemente una molécula de IgG 1 humana. Las secuencias de moléculas de inmunoglobulina G humana se conocen en la técnica y la introducción de un dominio CH3 o una secuencia de dominio CH3 como se describe aquí en dicha molécula no presentaría ninguna dificultad para el experto en la técnica.
La molécula de anticuerpo comprende las seis regiones determinantes de complementariedad mostradas en las SEQ ID NO 86 a 91. Preferiblemente, la molécula de anticuerpo comprende los dominios VH y/o VL mostrados en las SEQ ID NO 92 y 93, respectivamente.
En una realización preferida, la molécula de anticuerpo comprende la secuencia de cadena pesada mostrada en una cualquiera de las SEQ ID NO: 94 a 113, o una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia con una cualquiera de las SEQ ID NO: 94 a 113, siempre que el dominio VH de la secuencia de la cadena pesada permanezca sin cambios. Más preferiblemente, la molécula de anticuerpo comprende la secuencia de cadena pesada mostrada en una cualquiera de las SEQ ID NO: 94, 95, 104, 105, 108 y 109, o una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia con una cualquiera de las SEQ ID NO: 94, 95, 104, 105, 108 y 109, siempre que el dominio VH de la secuencia de la cadena pesada permanezca sin cambios. Aún más preferiblemente, la molécula de anticuerpo comprende la secuencia de la cadena pesada mostrada en la SEQ ID NO: 94 o 95, o una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 94 o 95, siempre que el dominio VH de la secuencia de la cadena pesada permanezca sin cambios.
En una realización preferida adicional, la molécula de anticuerpo puede comprender además, o alternativamente, la secuencia de cadena ligera mostrada en la SEQ ID NO: 116, o una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 116, siempre que el dominio VL de la secuencia de la cadena ligera permanezca sin cambios.
La molécula de anticuerpo preferiblemente es capaz de unirse simultáneamente a PD-L1 y LAG-3. El PD-L1 y LAG-3 pueden, por ejemplo, estar presentes en dos células diferentes. Sin desear estar limitado por la teoría, se cree que esto da como resultado un entrecruzamiento entre las células y la internalización de PD-L1 y/o LAG-3 haciendo que no estén disponibles para la estimulación.
Los presentes inventores han mostrado que una molécula de anticuerpo que comprende (i) un sitio de unión a antígeno basado en CDR para PD-L1; y (ii) un sitio de unión a antígeno LAG-3 localizado en un dominio CH3 de la molécula de anticuerpo, según la presente invención, FS18-7-9/84G09, mediaba sorprendentemente la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) de células que expresan PD-L1 pero no de células que expresan LAG-3, incluso cuando estaba presente en la muestra una mezcla de células que expresan LAG-3 y PD-L1. Se espera que esta propiedad sea útil cuando, como es el caso con FS18-7-9/84G09, la unión a antígeno basada en CDR de la molécula de anticuerpo esté dirigida a una célula tumoral y el sitio de unión localizado en un dominio constante de la molécula de anticuerpo esté dirigido a una célula inmune, ya que la célula inmune estaría protegida de CDC mediada por la unión a la molécula de anticuerpo, mientras que las células tumorales estarían sujetas a CDC.
Por tanto, también se describe una molécula de anticuerpo que se une al antígeno tumoral y al antígeno de una célula inmune, en donde la molécula de anticuerpo comprende:
(i) un sitio de unión a antígeno basado en CDR para un antígeno tumoral; y
(ii) un sitio de unión a antígeno para un antígeno de célula inmune localizado en un dominio constante, preferiblemente un dominio CH3 o CH2, más preferiblemente un dominio CH3, de la molécula de anticuerpo,
en donde la molécula de anticuerpo no media, o no media significativamente, la citotoxicidad dependiente del complemento de una célula inmune que comprende dicho antígeno de célula inmune cuando dicha célula inmune se une a la molécula de anticuerpo.
La molécula de anticuerpo puede mediar además la citotoxicidad dependiente del complemento de una célula tumoral que comprende dicho antígeno tumoral cuando dicha célula tumoral se une a la molécula de anticuerpo.
Los métodos para medir la CDC de una molécula de anticuerpo se conocen en la técnica y se describen en la presente memoria.
Los presentes inventores han mostrado además que una molécula de anticuerpo que comprende (i) un sitio de unión a antígeno basado en CDR para PD-L1; y (ii) un sitio de unión a antígeno LAG-3 localizado en un dominio CH3 de la molécula de anticuerpo, según la presente invención, FS18-7-9/84G09, mediaba sorprendentemente una baja citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) de las células que expresan LAG-3 en comparación con la ADCC de las células que expresan PD-L1. Se espera nuevamente que esta propiedad sea útil cuando, como es el caso con FS18-7-9/84G09, la unión a antígeno basada en CDR de la molécula de anticuerpo esté dirigida a una célula tumoral y el sitio de unión localizado en un dominio constante de la molécula de anticuerpo esté dirigido a una célula inmune, ya que la célula inmune estaría sujeta a una ADCC menor que una célula tumoral unida por el anticuerpo.
Como se explica en la presente memoria, se conocen en la técnica mutaciones para reducir o suprimir la actividad ADCC de moléculas de anticuerpo. Una de dichas mutaciones es la mutación LALA descrita en la presente memoria. Se encontró inesperadamente que FS18-7-9/84G09 tiene una baja actividad de ADCC hacia las células que expresan LAG-3. Cuando no sea necesario suprimir completamente la actividad de ADCC, esto puede representar una ventaja.
Por tanto, también se describe una molécula de anticuerpo que se une al antígeno tumoral y al antígeno de una célula inmune, en donde la molécula de anticuerpo comprende:
(i) un sitio de unión a antígeno basado en CDR para un antígeno tumoral; y
(ii) un sitio de unión a antígeno para un antígeno de célula inmune localizado en un dominio constante, preferiblemente un dominio CH3 o CH2, más preferiblemente un dominio CH3, de la molécula de anticuerpo,
en donde la molécula de anticuerpo provoca menos ADCC con respecto a las células inmunes que comprenden dicho antígeno de células inmunes cuando dichas células inmunes se unen a la molécula de anticuerpo que las células tumorales que comprenden dicho antígeno tumoral cuando dichas células tumorales se unen a la molécula de anticuerpo. La molécula de anticuerpo puede no mediar, o no mediar significativamente, la ADCC de una célula inmune que comprende dicho antígeno de la célula inmune cuando dicha célula inmune se une a la molécula de anticuerpo. La molécula de anticuerpo puede además no mediar, o no mediar significativamente, la citotoxicidad dependiente del complemento de una célula inmune que comprende dicho antígeno de la célula inmune cuando dicha célula inmune se une a la molécula de anticuerpo y/o puede mediar la citotoxicidad dependiente del complemento de una célula tumoral que comprende dicho antígeno tumoral cuando dicha célula tumoral se une a la molécula de anticuerpo.
Los métodos para medir la ADCC de una molécula de anticuerpo se conocen en la técnica y se describen en la presente memoria.
Se conocen en la técnica diversos antígenos tumorales y antígenos de células inmunes. El antígeno tumoral y el antígeno de la célula inmune pueden ser antígenos de la superficie celular. El antígeno de la célula inmune puede ser un antígeno presente en los linfocitos infiltrantes de tumores.
El sitio de unión a antígeno para el antígeno de la célula inmune puede comprender una o más modificaciones en uno o más bucles estructurales del dominio constante de la molécula de anticuerpo, tal como el bucle AB, CD y/o EF del dominio constante. Por ejemplo, el sitio de unión puede ser un sitio de unión de LAG-3 como se describe en la presente memoria.
La molécula de anticuerpo de la invención puede conjugarse con un modulador del sistema inmune, molécula citotóxica. radioisótopo o marcador detectable. El modulador del sistema inmune o la molécula citotóxica puede ser una citoquina.
La presente invención también proporciona un ácido nucleico que codifica una molécula de anticuerpo de la invención, así como un vector que comprende dicho ácido nucleico.
También se proporciona una célula huésped recombinante que comprende un ácido nucleico o el vector de la invención. Dicha célula huésped recombinante puede usarse para producir una molécula de anticuerpo. Por tanto, también se proporciona un método para producir una molécula de anticuerpo de la invención, comprendiendo el método cultivar la célula huésped recombinante en condiciones para la producción de la molécula de anticuerpo. El método puede comprender además una etapa de aislamiento y/o purificación de la molécula de anticuerpo.
Se espera que las moléculas de anticuerpo de la presente invención encuentren aplicación en aplicaciones terapéuticas, en particular aplicaciones terapéuticas en seres humanos, tales como el tratamiento del cáncer. Por tanto, también se proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula de anticuerpo según la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
La presente invención también proporciona una molécula de anticuerpo de la invención, para su uso en un método de tratamiento del cáncer en un paciente. Se proporciona además el uso de una molécula de anticuerpo según la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer en un paciente. El tratamiento puede comprender además administrar una vacuna antitumoral y/o un agente quimioterapéutico al paciente.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: A muestra un alineamiento de secuencia de los nueve Fcab identificados después de la segunda maduración por afinidad, FS18-7-32; FS18-7-33; FS18-7-36; FS18-7-58; FS18-7-62; FS18-7-65; FS18-7-78; FS18-7-88; y FS18-7-95, frente al Fcab parental, FS18-7-9. B muestra el porcentaje de identidad de secuencia de cada uno de estos Fcab con la secuencia del Fcab parental, FS18-7-9.
La Figura 2 muestra los resultados de un ensayo de activación de células T. Específicamente, la Figura 2 muestra gráficos representativos de la liberación de IL-2, que es indicativa de la activación de las células T, en el panel de líneas celulares tratadas con mAb2 FS18-7-9/84G09 (Figura 2A-C), o FS18-7-62/84G09 o FS18-7-78/84G09 (Figura 2D-F), y anticuerpos de control. Figura 2A: El ensayo con LAG-3 y PD-L1 requirió la inhibición de ambas dianas (FS18-7-9/84G09LALA, FS18-7-9/4420LALA 84G09, 25F7 84G09LALA o 25F7 S1LALA) para tener activación. Figura 2B: El ensayo con LAG-3 solo requirió la inhibición de LAG-3 para la activación (FS18-7-9/84G09LALA, FS18-7-9/4420LALA 84G09, 25F7 84G09LALA, 25F7 S1LALA, 25F7, FS18-7-9/4420 LALA). Figura 2C: El ensayo con PD-L1 solo requirió la inhibición de PD-L1 para la activación (FS18-7-9/84G09LALA, FS18-7-9/4420LALA 84G09, 25F7 84G09LALA, 25F7 S1 LALA, 84G09LALA). Figura 2D: El ensayo con LAG-3 y PD-L1 requirió la inhibición de ambas dianas (FS18-7-62/84G09LALA, FS18-7-78/84G09LALA, FS18-7-62/4420LALA 84G09, FS18-7-78/4420LALA 84G09, 25F7 84G09La La o 25F7 S1LALA) para tener activación. Figura E: El ensayo solo con LAG-3 requirió inhibición de LAG-3 para la activación (FS18-7-62/84G09LALA, FS18-7-62/4420LALA, FS18-7-78/84G09LALA, FS18-7-78/4420LALA, FS18-7-62/4420LALA 84G09, FS18-7-78/4420LALA 84G09, 25F7 84G09LALA o 25F7 S1 LALA). Figura 2F: El ensayo solo con PD-L1 requirió la inhibición de PD-L1 para la activación (FS18-7-62/84G09LALA, FS18-7-78/84G09LALA, FS18-7-62/4420LALA 84G09, FS18-7-78/4420LALA 84G09, 25F7 84G09LALA o 25F7 S1 LALA).
La Figura 3 muestra que FS18-7-9/84G09 fue capaz de inducir la activación de las células T, como lo indica la liberación de IL-2, en presencia de cLAG-3 cPD-L1 y cLAG-3 o cPD-L1 solo, mostrando una reactividad cruzada funcional con cinomolgo.
La Figura 4 muestra un gráfico representativo del ensayo SEB. El mAb2 LAG-3/PD-L1 y la combinación del mAb2 LAG-3/4420 84G09LALA mostró una mayor activación que el mAb 84G09LALA solo, mientras que el mAb2 LAG-3/4420 o mAb 4420 no mostró una activación significativa.
La Figura 5 muestra los pesos tumorales finales el día 20 en el modelo de tumor singénico MC38 no establecido. Los ratones tratados con el mAb2 LAG-3/PD-L1 (FS18-29/S1) tenían tumores finales con pesos significativamente más pequeños que los tratados con una combinación de mAb de referencia, C9B7W y S1.
La Figura 6 muestra las curvas de crecimiento del modelo de tumor singénico MC38 no establecido. Los ratones tratados con el mAb2 LAG-3/PD-L1 (FS18-29/S1) tenían tumores más pequeños que los tratados con una combinación de mAb de referencia, C9B7W y S1, o los tratados con S1 solo. El mAb2 lAg -3/4420 y el mAb anti-LAG-3 de referencia tuvo poco impacto sobre el crecimiento tumoral.
La Figura 7 muestra los pesos tumorales finales el día 24 en el modelo de tumor singénico MC38 establecido. El mAb2 LAG-3/PD-L1 (FS18-29/S1) fue tan eficaz en la supresión del crecimiento tumoral como la combinación de anticuerpos de referencia, C9B7W y S1. FS18-29/4420 solo no tuvo un impacto notable sobre el crecimiento tumoral y S1 y C9B7W tuvieron ambos un efecto leve sobre el crecimiento tumoral resultante.
La Figura 8 muestra las curvas de crecimiento tumoral del modelo de tumor singénico MC38 establecido. Los ratones tratados con el mAb2 LAG-3/PD-L1 (FS18-29/S1) tenían volúmenes tumorales similares a los tratados con una combinación de mAb de referencia, C9B7W y S1. Los ratones tratados con S1 o C9B7W solos mostraron volúmenes tumorales intermedios mientras que el tratamiento con el mAb2 LAG-3/4420 no tuvo ningún impacto sobre el crecimiento tumoral.
La Figura 9 muestra los pesos tumorales finales el día 20 en el modelo de tumor singénico CT26 no establecido. Los mAb2 LAG-3/PD-L1 (FS18-29/S1 y FS18-35/S1) suprimieron el crecimiento tumoral en mayor medida que la combinación de anticuerpos de referencia, C9B7W y S1.
La Figura 10 muestra las curvas de crecimiento tumoral del modelo de tumor singénico CT26 no establecido. Hubo una diferencia estadísticamente significativa demostrada en FS18-35/S1 frente al control de IgG en la supresión del crecimiento tumoral. No se observó dicha diferencia estadísticamente significativa con la combinación de anticuerpos de referencia frente al grupo de control de IgG.
La Figura 11 muestra los pesos tumorales finales el día 22 en el modelo de tumor singénico MC38 no establecido usado para comparar el efecto de la mutación LALA en el mAb2 sobre la inhibición del crecimiento tumoral. No hubo una diferencia estadísticamente significativa en el peso tumoral final entre los ratones tratados con mAb2 con y sin la mutación LALA.
La Figura 12 muestra las curvas de crecimiento tumoral del modelo de tumor singénico MC38 no establecido usado para comparar el efecto de mAb2 con y sin la mutación LALA sobre la inhibición del crecimiento tumoral. No hubo una diferencia estadísticamente significativa en las curvas de crecimiento tumoral entre los ratones tratados con mAb2 con y sin la mutación LALA, sin embargo, hubo una tendencia hacia una mayor inhibición del crecimiento tumoral por las moléculas que contenían la mutación LALA.
La Figura 13 muestra el efecto del tratamiento con mAb2 sobre la expresión de LAG-3 de células T. La expresión de LAG-3 en linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) CD8 (A), CD4 (B) y FoxP3 (C) tratados con mAb2 FS18-29/S1, FS18-29/4420, S1, FS18-29/4420 y S1, o el anticuerpo de control 4420 se muestra el día 19 y 23 después de la inoculación del tumor, correspondiente a los días 3 y 7 después de la última dosificación de mAb2/anticuerpo, respectivamente. La expresión de LAG-3 disminuyó después del tratamiento con mAb2 FS18-29/S1 los días 19 y 23. Los animales que recibieron una combinación de FS18-29/4420 y S1 también mostraron una disminución en la expresión de LAG-3 pero el efecto se retrasó hasta el día 23, mientras que FS18-29/4420 o S1 administrados individualmente dieron como resultado poca o ninguna disminución en la expresión de LAG-3.
La Figura 14 muestra el porcentaje de lisis de células Raji que expresan PD-L1 y LAG-3 después de varios tratamientos con anticuerpo/mAb2 usando un ensayo CDC de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH). A y B muestran la lisis mediada por CDC de células Raji que expresan PD-L1 y LAG-3, respectivamente. Las células se incubaron con anticuerpo anti-LAG-3 25F7, anticuerpo anti-PD-L1 84G09, anticuerpo anti-PD-L1 84G09 que comprende la mutación LALA, anticuerpo anti-CD20 Rituximab, mAb2 FS18-7-9/84G09, mAb2 FS18-7-9/84G09 que comprende la mutación LALA, o Rituximab que comprende la mutación LALA. La liberación de LDH se midió 4 horas después del tratamiento con complemento de crías de conejo y se expresó como porcentaje en comparación con la lisis total. La concentración del tratamiento con anticuerpo/mAb2 está indicado en el eje X. Se estableció un valor compartido para las pendientes de todas las curvas con el fin de poder comparar las curvas.
La Figura 15 muestra el porcentaje de células Raji que expresan PD-L1 y LAG-3 muertas después de varios tratamientos usando un ensayo de CDC basado en citometría de flujo. Se incubó una mezcla de células que expresan PD-L1 y LAG-3 marcadas con fluorescencia diferencial con el anticuerpo de control 4420, el anticuerpo anti-CD20 Rituximab (RIT), una combinación del anticuerpo anti-LAG-3 25F7 y el anticuerpo anti-PD-L1 84G09, o mAb2 FS18-7-9/84G09. A continuación, las células se trataron con complemento de crías de conejo y se tiñeron usando un tinte que solo teñía las células muertas. El porcentaje de células muertas en las dos poblaciones de células se evaluó como porcentaje del total de células. El tipo de célula (que expresa PD-L1 o que expresa LAG-3, identificado por los marcadores fluorescentes diferenciales) evaluado después de cada tratamiento se indica en la Figura 15 después del nombre del tratamiento relevante, véase, p. ej., 4420 PDL1, que se refiere a la evaluación de la viabilidad de las células Raji que expresan PD-L1 después del tratamiento con el anticuerpo de control 4420. La concentración del tratamiento con anticuerpo/mAb2 está indicada en el eje X.
La Figura 16 muestra el porcentaje de lisis (citotoxicidad) de células Raji que expresan PD-L1 y LAG-3 después de varios tratamientos usando un ensayo de ADCC de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH). Las células se trataron con anticuerpo anti-CD20 Rituximab, anticuerpo anti-PD-L1 84G09, mAb2 FS18-7-9/84G09, Rituximab que comprende la mutación LALA, mAb2 FS18-7-9/84G09 que comprende la mutación LALA, anticuerpo anti-LAG-3 25F7, anticuerpo anti-PD-L1 84G09 que comprende la mutación LALA, anticuerpo de control 4420 o anticuerpo de control 4420 que comprende la mutación LALA. A continuación, las células tratadas se coincubaron con células NK primarias y se midió la liberación de LDH específica como porcentaje en comparación con la lisis total de las células diana. La concentración del tratamiento con anticuerpo/mAb2 está indicada en el eje X.
Descripción detallada
La presente invención se refiere a moléculas de anticuerpos que se unen tanto a PD-L1 como a LAG-3. Específicamente, las moléculas de anticuerpos de la presente invención comprenden un sitio de unión a antígeno basado en CDR para PD-L1 y un sitio de unión a antígeno LAG-3 localizado en un dominio constante de la molécula de anticuerpo como se muestra en las reivindicaciones. Los términos "PD-L1" y "LAG-3" pueden referirse a PD-L1 humano y LAG-3 humano, PD-L1 murino y LAG-3 murino, y/o PD-L1 de mono cinomolgo y LAG-3 de mono cinomolgo, a no ser que el contexto requiera otra cosa. Preferiblemente, los términos "PD-L1" y "LAG-3" se refieren a PD-L1 humano y LAG-3 humano, a no ser que el contexto requiera otra cosa.
El término "molécula de anticuerpo" describe una inmunoglobulina, ya sea natural o producida parcial o totalmente sintéticamente. La molécula de anticuerpo puede ser humana o humanizada. La molécula de anticuerpo es preferiblemente una molécula de anticuerpo monoclonal. Los ejemplos de anticuerpos son los isotipos de inmunoglobulina, tal como la inmunoglobulina G, y sus subclases isotípicas, tales como IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, así como fragmentos de las mismas.
El término "molécula de anticuerpo", tal y como se usa en la presente memoria, incluye fragmentos de anticuerpo, siempre que dichos fragmentos comprendan un sitio de unión a antígeno basado en CDR para PD-L1 y un sitio de unión a antígeno LAG-3 localizado en un dominio constante, tal como un dominio CH1, CH2, o CH3, preferiblemente un dominio CH3, de la molécula de anticuerpo. A no ser que el contexto requiera otra cosa, el término "molécula de anticuerpo", tal y como se usa en la presente memoria, es por tanto equivalente a "molécula de anticuerpo o fragmento de la misma".
Es posible tomar anticuerpos monoclonales y de otro tipo y usar técnicas de tecnología de ADN recombinante para producir otros anticuerpos o moléculas quiméricas que retienen la especificidad del anticuerpo original. Dichas técnicas pueden implicar la introducción de las CDR, o regiones variables, y/o las secuencias de dominio constante que proporcionan el sitio de unión a antígeno LAG-3, en una inmunoglobulina diferente. La introducción de las CDR de una inmunoglobulina en otra inmunoglobulina se describe, por ejemplo, en EP-A-184187, GB 2188638A o EP-A-239400. Se podrían emplear técnicas similares para las secuencias de dominio constante relevantes. Alternativamente, un hibridoma u otra célula que produzca una molécula de anticuerpo puede someterse a una mutación genética u otros cambios, que pueden alterar o no la especificidad de unión de los anticuerpos producidos.
Dado que los anticuerpos pueden modificarse de varias formas, el término "molécula de anticuerpo" debe interpretarse como que cubre fragmentos de anticuerpos, derivados, equivalentes funcionales y homólogos de anticuerpos, incluyendo cualquier polipéptido que comprenda un dominio de unión de inmunoglobulina, ya sea natural o total o parcialmente sintético. Por lo tanto, se incluyen las moléculas quiméricas que comprenden un dominio de unión de inmunoglobulina, o equivalente, fusionado a otro polipéptido. La clonación y expresión de anticuerpos quiméricos se describen en EP-A-0120694 y EP-A-0125023.
Un ejemplo de un fragmento de anticuerpo que comprende tanto secuencias de CDR como dominio CH3 es un minicuerpo, que comprende un scFv unido a un dominio CH3 (Hu et al. (1996), Cancer Res., 56 (13): 3055-61).
La molécula de anticuerpo de la presente invención se une a PD-L1 y LAG-3. La unión en este contexto puede referirse a una unión específica. El término "específico" puede referirse a la situación en la que la molécula de anticuerpo no mostrará ninguna unión significativa a moléculas distintas de su o sus parejas de unión específicas, aquí PD-L1 y LAG-3. El término "específico" también es aplicable cuando la molécula de anticuerpo es específica para epítopos particulares, tales como epítopos en PD-L1 y LAG-3, que son portados por varios antígenos, en cuyo caso la molécula de anticuerpo podrá unirse a los diversos antígenos portadores del epítopo.
LAG-3 comparte un 40% de identidad de secuencia con CD4, su proteína más estrechamente relacionada. Los presentes inventores ensayaron el Fcab FS18-7-9, que comprende las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO 1 a 3, para la unión a CD4. El Fcab FS18-7-9 no mostró unión a CD4, lo que demuestra que esta molécula se une a LAG-3 específicamente. Por tanto, en una realización preferida, el sitio de unión a LAG-3 de una molécula de anticuerpo de la presente invención no se une, o no muestra ninguna unión significativa, a CD4.
Una molécula de anticuerpo de la invención comprende un sitio de unión a antígeno LAG-3. El sitio de unión a antígeno LAG-3 está localizado en un dominio CH3. El sitio de unión a LAG-3 comprende las secuencias de aminoácidos WDEPWGED (SEQ ID NO: 1) y PYDRWVWPDE. (SEQ ID NO: 3). Estas secuencias estaban presentes en todos los clones principales Fcab anti-LAG-3 identificados por los presentes inventores después de un extenso programa de cribado y caracterización como se describe en los ejemplos.
Las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO 1 y 2 están localizadas en bucles estructurales del dominio CH3 de la molécula de anticuerpo. La introducción de secuencias en las regiones de bucle estructural de dominios constantes de anticuerpos para crear nuevos sitios de unión a antígenos se describe, por ejemplo, en WO2006/072620 y WO2009/132876.
Los bucles estructurales de los dominios constantes de anticuerpos incluyen los bucles AB, CD y EF. En el dominio CH3, los bucles AB, CD y EF están localizados en los residuos 11-18, 43-78 y 92-101 del dominio CH3, donde la numeración de los residuos de aminoácidos es según el esquema de numeración ImMunoGeneTics (IMGT). La secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 está localizada en el bucle AB del dominio CH3. La secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3 está localizada en el bucle EF del dominio CH3. Más preferiblemente, la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 está localizada en los residuos 11 a 18 del dominio CH3; y/o la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3 está localizada en los residuos 92 a 101 del dominio CH3, en donde la numeración de los residuos de aminoácidos es según el esquema de numeración IMGT.
Además, la molécula de anticuerpo comprende preferiblemente la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, 8, 13, 18, 23, 28, 33, 38, 43 o 48, más preferiblemente la SEQ ID NO: 2, 28, o 38, aún más preferiblemente la SEQ ID NO: 2, en un bucle estructural de un dominio CH3 de la molécula de anticuerpo. El bucle estructural es preferiblemente el bucle CD. La secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, 8, 13, 18, 23, 28, 33, 38, 43 o 48 está localizada preferiblemente en los residuos 43 a 78 del dominio CH3, en donde la numeración de los residuos de aminoácidos es según el esquema de numeración IMGT.
Una molécula de anticuerpo de la invención puede comprender además un residuo de ácido glutámico (E) en la posición 36 y/o un residuo de tirosina (Y) en la posición 85.2 del dominio CH3 (como se muestra en la Figura 1A), en donde la numeración de los residuos de aminoácidos es según el esquema de numeración IMGT. En particular, una molécula de anticuerpo que comprende la región de bucle estructural CD mostrada en la SEQ ID NO: 8 preferiblemente comprende además un residuo de ácido glutámico (E) en la posición 36 del dominio CH3. De manera similar, una molécula de anticuerpo que comprende la región de bucle estructural CD mostrada en la SEQ ID NO: 18 preferiblemente comprende además un residuo de tirosina (Y) en la posición 85.2 del dominio CH3.
En una realización preferida, la molécula de anticuerpo de la invención comprende un dominio CH3 que comprende, tiene o consiste en la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50, preferiblemente un dominio CH3 con la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 5, 30 o 40, más preferiblemente, un dominio CH3 con la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 5.
La molécula de anticuerpo de la invención puede comprender un dominio CH3 que comprende, tiene o consiste en la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50, en donde la secuencia del dominio CH3 comprende además un residuo de lisina (K) en el extremo C inmediato de la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50. Así, por ejemplo, la molécula de anticuerpo de la invención puede comprender un dominio CH3 que comprende, tiene o consiste en la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 5 con un residuo de lisina en el extremo C de la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 5. La secuencia de dicho dominio CH3 sería entonces la siguiente:
GQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS
DGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK {SEQ ID NO: 135)
Además, la molécula de anticuerpo de la invención puede comprender un dominio CH2 de una molécula de inmunoglobulina G, tal como un dominio CH2 de una molécula de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. Preferiblemente, la molécula de anticuerpo de la invención comprende un dominio CH2 de una molécula de IgG1. El dominio CH2 puede tener la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 53.
El dominio CH2 de la molécula de anticuerpo puede comprender una mutación para reducir o suprimir la unión del dominio CH2 a uno o más receptores Fcy, tales como FcyRI, FcYRIIa, FcYRIIb, FcyRIII y/o al complemento. Los dominios CH2 de los dominios de IgG humana normalmente se unen a los receptores Fcy y al complemento y los inventores postulan que la unión reducida a los receptores Fcy reducirá la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y la unión reducida al complemento reducirá la actividad de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) de la molécula de anticuerpo. Las mutaciones para reducir o suprimir la unión del dominio CH2 a uno o más receptores Fcy y complemento son conocidas e incluyen la "mutación LALA" descrita en Bruhns, et al. (2009) y Xu et al. (2000). Por tanto, la molécula de anticuerpo puede comprender un dominio CH2, en donde el dominio CH2 comprende residuos de alanina en las posiciones 4 y 5 del dominio CH2, en donde la numeración se realiza según el esquema de numeración IMGT. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende un dominio CH2 de IgG1 que comprende, tiene o consiste en la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 54.
La molécula de anticuerpo de la presente invención comprende un sitio de unión de antígeno basado en CDR para PD-L1, como se muestra en la reivindicación 1. El término "sitio de unión a antígeno basado en CDR" se refiere al sitio de unión a antígeno de una región variable de molécula de anticuerpo que está compuesto por seis CDR. La preparación de moléculas de anticuerpos contra PD-L1 y la determinación de las secuencias de CDR de dichas moléculas de anticuerpos están dentro de las capacidades del experto en la técnica y se conocen muchas técnicas adecuadas en la técnica.
La molécula de anticuerpo de la invención comprende la HCDR3 del anticuerpo 84G09. Se sabe que la HCDR3 juega un papel en la determinación de la especificidad de una molécula de anticuerpo (Segal et al., (1974), PNAS, 71: 4298­ 4302; Amit et al., (1986), Science, 233: 747-753; Chothia et al., (1987), J. Mol. Biol. 196: 901-917.; Chothia et al., (1989), Nature, 342: 877-883; Caton et al., (1990), J. Immunol., 144: 1965-1968; Sharon et al., (1990a), PNAS, 87: 4814-4817; Sharon et al., (1990b), J. Immunol., 144: 4863-4869; Kabat et al., (1991b), J. Immunol., 147: 1709-1719).
La molécula de anticuerpo comprende además HCDR1, HCDR2, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 del anticuerpo 84G09. El experto en la técnica no tendría dificultad para determinar las secuencias de las CDR a partir de las secuencias de los dominios VH y VL del anticuerpo 84G09 mostradas en las SEQ ID NO 92 y 93, respectivamente. Las secuencias de CDR pueden determinarse, por ejemplo, según Kabat (Kabat, E.A. et al., (1991)) o el esquema de numeración IMGT.
Las secuencias de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 del anticuerpo 84G09, según el esquema de numeración IMGT, se muestran en las SEQ ID NO 86, 87, 88, 89, 90 y 91, respectivamente.
Las secuencias de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 del anticuerpo 84G09, según Kabat, se muestran en las SEQ ID NO 136, 137, 138, 139, 140 y 141, respectivamente.
El anticuerpo también puede comprender el dominio VH y/o VL del anticuerpo 84G09. Las secuencias de los dominios VH y VL del anticuerpo 84G09 se muestran en las SEQ ID NO 92 y 93, respectivamente.
En una realización preferida, la molécula de anticuerpo de la invención comprende (i) un sitio de unión a antígeno basado en CDR para PD-L1 que comprende las secuencias de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 del anticuerpo 84G09, y (ii) un sitio de unión a antígeno LAG-3 localizado en un dominio CH3 de la molécula de anticuerpo, en donde el sitio de unión a LAG-3 comprende las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO 1 y 3, y una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO 2, 8, 13, 18, 23, 28, 33, 38, 43 y 48, como se muestra en las reivindicaciones.
Más preferiblemente, la molécula de anticuerpo de la invención comprende (i) un sitio de unión a antígeno basado en CDR para PD-L1 que comprende las secuencias de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 del anticuerpo 84G09, y (ii) un sitio de unión a antígeno LAG-3 localizado en un dominio CH3 de la molécula de anticuerpo, en donde el sitio de unión a LAG-3 comprende las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO 1 y 3, y una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO 2, 28 y 38, como se muestra en las reivindicaciones.
Aún más preferiblemente, la molécula de anticuerpo de la invención comprende (i) un sitio de unión a antígeno basado en CDR para PD-L1 que comprende las secuencias de HCDR1, HCDR2, Hc Dr 3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 del anticuerpo 84G09, y (ii) un sitio de unión a antígeno LAG-3 localizado en un dominio CH3 de la molécula de anticuerpo, en donde el sitio de unión a LAG-3 comprende las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO 1, 2 y 3, como se muestra en las reivindicaciones.
En una realización preferida, la molécula de anticuerpo de la invención comprende un dominio VH y un dominio VL que comprende, tiene o consiste en la secuencia mostrada en las SEQ ID NO 92 y 93, respectivamente, y un dominio CH3 que comprende, tiene o consiste en la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50, preferiblemente un CH3 que comprende, tiene o consiste en la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 5, 30 o 40, más preferiblemente, un dominio CH3 que comprende, tiene o consiste en la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 5.
En una realización preferida adicional, la molécula de anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende, tiene o consiste en la secuencia mostrada en las SEQ ID NO: 94 a 113 y una cadena ligera que comprende, tiene o consiste en la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 116. Más preferiblemente, la molécula de anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende, tiene o consiste en la secuencia mostrada en las SEQ ID NO: 94, 95, 104, 105, 108 y 109 y una cadena ligera que comprende, tiene o consiste en la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 116. Lo más preferiblemente, la molécula de anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende, tiene o consiste en la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 94 o 95 y una cadena ligera que comprende, tiene o consiste en la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 116.
Las moléculas de anticuerpo descritas en la presente memoria también pueden comprender variantes de las secuencias del bucle estructural, dominio CH3, dominio CH2, dominio CH2 y CH3, cadena ligera o cadena pesada descritas en la presente memoria, siempre que los dominios VL y VH de las secuencias de cadena ligera y pesada, respectivamente, permanezcan sin cambios. Pueden obtenerse variantes adecuadas mediante métodos de alteración o mutación de secuencia y cribado. En un aspecto preferido, una molécula de anticuerpo que comprende una o más secuencias variantes retiene una o más de las características funcionales de la molécula de anticuerpo parental, tales como especificidad de unión y/o afinidad de unión para LAG-3 y PD-L1. Por ejemplo, una molécula de anticuerpo que comprende una o más secuencias variantes se une preferiblemente a LAG-3 y/o PD-L1 con la misma afinidad, o una mayor afinidad, que la molécula de anticuerpo (parental). La molécula de anticuerpo parental es una molécula de anticuerpo que no comprende la o las sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos que se han incorporado en la molécula de anticuerpo variante.
Por ejemplo, una molécula de anticuerpo puede comprender un bucle estructural, dominio CH3, dominio CH2, dominio CH2 y CH3, secuencia de cadena ligera o cadena pesada que tiene al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, al menos un 99,1%, al menos un 99,2%, al menos un 99,3%, al menos un 99,4%, al menos un 99,5%, al menos un 99,6%, al menos un 99,7%, al menos un 99,8% o al menos un 99,9% de identidad de secuencia con una secuencia de bucle estructural, dominio CH3, dominio CH2, dominio CH2 y CH3, cadena ligera o cadena pesada descrita en la presente memoria, siempre que los dominios VL y VH de las secuencias de cadena ligera y pesada, respectivamente, permanezcan sin cambios.
La molécula de anticuerpo puede comprender una secuencia de dominio CH3 que tiene al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, al menos un 99,1%, al menos un 99,2%, al menos un 99,3%, al menos un 99,4%, al menos un 99,5%, al menos un 99,6%, al menos un 99,7%, al menos un 99,8% o al menos un 99,9% de identidad de secuencia con la secuencia del dominio CH3 mostrada en la SEQ ID NO: 4, 5 o 135.
Alternativamente, la molécula de anticuerpo comprende una secuencia de dominio CH3 y CH2, que tiene al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, al menos un 99,1%, al menos un 99,2%, al menos un 99,3%, al menos un 99,4%, al menos un 99,5%, al menos un 99,6%, al menos un 99,7%, al menos un 99,8% o al menos un 99,9% de identidad de secuencia con la secuencia de dominio CH2 y CH3 mostrada en la SEQ ID NO: 6 o 7.
La identidad de secuencia se define comúnmente con referencia al algoritmo GAP (paquete Wisconsin GCG, Accelerys Inc, San Diego, EE. UU.). GAP usa el algoritmo de Needleman y Wunsch para alinear dos secuencias completas que maximiza el número de coincidencias y minimiza el número de huecos. Generalmente, se usan parámetros por defecto, con una penalización por creación de huecos = 12 y una penalización por extensión de huecos = 4. Se puede preferir el uso de GAP, pero se pueden usar otros algoritmos, p. ej., BLAST (que usa el método de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 405-410), FASTA (que usa el método de Pearson y Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444­ 2448), o el algoritmo de Smith-Waterman (Smith y Waterman (1981) J. Mol Biol. 147: 195-197), o el programa TBLASTN, de Altschul et al. (1990) supra, empleando generalmente parámetros por defecto. En particular, puede usarse el algoritmo psi-Blast (Nucl. Acids Res. (1997) 253389-3402).
Una molécula de anticuerpo también puede comprender una secuencia de bucle estructural, dominio CH3, dominio CH2, dominio CH2 y CH3, cadena ligera o cadena pesada que tiene una o más alteraciones de la secuencia de aminoácidos (adición, deleción, sustitución y/o inserción de un residuo de aminoácido), preferiblemente 20 alteraciones o menos, 15 alteraciones o menos, 10 alteraciones o menos, 5 alteraciones o menos, 4 alteraciones o menos, 3 alteraciones o menos, 2 alteraciones o menos, o 1 alteración en comparación con una secuencia de bucle estructural, dominio CH3, dominio CH2, dominio CH2 y CH3, cadena ligera o cadena pesada descrita en la presente memoria, siempre que los dominios VL y VH de las secuencias de cadena ligera y pesada, respectivamente, permanezcan sin cambios. En particular, se pueden realizar alteraciones en una o más regiones marco de la molécula de anticuerpo fuera de las secuencias de los dominios VH y VL.
Por ejemplo, la molécula de anticuerpo puede comprender una secuencia de dominio CH3 con una o más alteraciones de la secuencia de aminoácidos (adición, deleción, sustitución y/o inserción de un residuo de aminoácido), preferiblemente 20 alteraciones o menos, 15 alteraciones o menos, 10 alteraciones o menos, 5 alteraciones o menos, 4 alteraciones o menos, 3 alteraciones o menos, 2 alteraciones o menos, o 1 alteración en comparación con la secuencia del dominio CH3 mostrada en la SEQ ID NO: 4, 5 o 135.
Alternativamente, la molécula de anticuerpo comprende una secuencia de dominio CH3 y CH2, con una o más alteraciones de la secuencia de aminoácidos (adición, deleción, sustitución y/o inserción de un residuo de aminoácido), preferiblemente 20 alteraciones o menos, 15 alteraciones o menos, 10 alteraciones o menos, 5 alteraciones o menos, 4 alteraciones o menos, 3 alteraciones o menos, 2 alteraciones o menos, o 1 alteración en comparación con la secuencia de dominio CH2 y CH3 mostrada en la SEQ ID NO: 6 o 7.
También se describe una molécula de anticuerpo que compite con una molécula de anticuerpo de la invención para la unión a LAG-3 y/o PD-L1, o que se une al mismo epítopo en LAG-3 y/o PD-L1 que una molécula de anticuerpo de la invención, en donde la molécula de anticuerpo comprende un sitio de unión a antígeno basado en CDR para PD-L1 y un sitio de unión a antígeno LAG-3 localizado en un dominio CH3 de la molécula de anticuerpo. Se conocen en la técnica métodos para determinar la competición para un antígeno por dos anticuerpos. Por ejemplo, la competición de la unión a un antígeno por dos anticuerpos se puede determinar usando BIAcore. Los métodos para mapear el epítopo unido por un anticuerpo se conocen de manera similar en la técnica.
La molécula de anticuerpo de la invención se une preferiblemente a LAG-3 con una afinidad (Kd) de 1 x 10-9 M o una afinidad mayor. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo de la invención puede unirse a LAG-3 con una afinidad (Kd) de 8 x 10-10 M, o una afinidad mayor.
Los Fcab tienen una interfaz de unión más pequeña que los anticuerpos monoclonales, ya que los sitios de unión de los Fcab forman un fragmento de anticuerpo relativamente compacto con dos sitios de unión situados muy cerca. Por el contrario, los brazos Fab de un mAb típico están separados por una región bisagra flexible. Los dos sitios de unión a antígeno de un Fcab también están espacialmente próximos entre sí, en comparación con los de un mAb típico. En base a esta interfaz de unión más pequeña y la flexibilidad reducida de los dos sitios de unión, fue sorprendente que los Fcab anti-LAG-3 fueran capaces de unirse a e inhibir LAG-3 con una afinidad y potencia similares a las de un anticuerpo monoclonal de referencia.
La molécula de anticuerpo de la invención se une preferiblemente a PD-L1 con una afinidad (Kd) de 1 x 10-9 M o una afinidad mayor.
La afinidad de unión de una molécula de anticuerpo a un antígeno cognado, tal como LAG-3 o PD-L1, puede determinarse mediante resonancia de plasmón de superficie (SPR), por ejemplo. La afinidad de unión de una molécula de anticuerpo a un antígeno cognado, tal como LAG-3 o PD-L1, expresado en una superficie celular puede determinarse mediante citometría de flujo.
La molécula de anticuerpo de la presente invención es preferiblemente capaz de unirse a LAG-3 y PD-L1 expresados en la superficie de una célula. La célula es preferiblemente una célula cancerosa.
La molécula de anticuerpo de la presente invención es preferiblemente capaz de unirse simultáneamente a LAG-3 y PD-L1. En una realización preferida, la molécula de anticuerpo de la presente invención es capaz de unirse simultáneamente a LAG-3 y PD-L1, en donde LAG-3 y PD-L1 se expresan en la superficie de una sola célula, o en la superficie de dos células separadas.
La molécula de anticuerpo de la invención puede unirse a LAG-3 humano, LAG-3 murino y/o LAG-3 de mono cinomolgo. Preferiblemente, la molécula de anticuerpo de la invención se une a LAG-3 humano. Lo más preferiblemente, la molécula de anticuerpo de la invención se une a LAG-3 humano y al PD-L1 humano.
La molécula de anticuerpo de la invención comprende (i) un sitio de unión a antígeno basado en CDR para PD-L1; y (ii) un sitio de unión a antígeno LAG-3 localizado en un dominio constante de la molécula de anticuerpo como se muestra en las reivindicaciones. Las moléculas de anticuerpo que no comprenden un sitio de unión a antígeno LAG-3 localizado en un dominio constante, tal como un dominio CH3, de la molécula de anticuerpo, no forman parte, por tanto, de la presente invención. De manera similar, una molécula que no comprende un sitio de unión a antígeno basado en CDR para PD-L1 no forma parte de la presente invención.
La molécula de anticuerpo de la presente invención puede conjugarse con un agente terapéutico o un marcador detectable. En este caso, la molécula de anticuerpo puede referirse como un conjugado. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo puede conjugarse con un modulador del sistema inmune, molécula citotóxica, radioisótopo o marcador detectable. El modulador del sistema inmune o la molécula citotóxica puede ser una citoquina. El marcador detectable puede ser un radioisótopo, p. ej., un radioisótopo no terapéutico.
La molécula de anticuerpo puede conjugarse con el agente terapéutico o marcador detectable, por medio de un enlace o conector peptídico, es decir, dentro de un polipéptido de fusión que comprende dicho agente terapéutico o marcador detectable y la molécula de anticuerpo o un componente de la cadena polipeptídica del mismo. Otros medios para la conjugación incluyen la conjugación química, especialmente el entrecruzamiento usando un reactivo bifuncional (p. ej., empleando la Guía de selección de reactivos de entrecruzamiento DOUBLE-REAGENTS™, Pierce).
Por tanto, la molécula de anticuerpo y el agente terapéutico o marcador detectable pueden conectarse entre sí directamente, por ejemplo, a través de cualquier enlace químico adecuado o a través de un conector, por ejemplo, un conector peptídico.
El conector peptídico puede ser una cadena corta de aminoácidos (2-20, preferiblemente 2-15 residuos). Se conocen en la técnica ejemplos adecuados de secuencias conectoras peptídicas. Pueden usarse uno o más conectores diferentes. El conector puede tener una longitud de aproximadamente 5 aminoácidos.
El enlace químico puede ser, por ejemplo, un enlace covalente o iónico. Los ejemplos de enlaces covalentes incluyen enlaces peptídicos (enlaces amida) y enlaces disulfuro. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo y el agente terapéutico o de diagnóstico pueden estar unidos covalentemente. Por ejemplo, mediante enlaces peptídicos (enlaces amida). Por tanto, la molécula de anticuerpo y el agente terapéutico o de diagnóstico pueden producirse (secretarse) como un polipéptido monocatenario.
La invención también proporciona ácidos nucleicos aislados que codifican las moléculas de anticuerpos de la invención. El experto en la técnica no tendrá dificultad en preparar dichos ácidos nucleicos usando métodos bien conocidos en la técnica. Puede usarse un ácido nucleico aislado para expresar la molécula de anticuerpo de la invención, por ejemplo, mediante expresión en una célula huésped bacteriana, de levadura, de insecto o de mamífero. Una célula huésped preferida es una célula de mamífero tal como una célula CHO, HEK o NS0. El ácido nucleico se proporcionará generalmente en forma de un vector recombinante para la expresión.
El ácido nucleico aislado puede comprender, por ejemplo, la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 142, 4, 9, 14, 19, 24, 29, 34, 39, 44 o 49, que codifica los dominios CH3 de FS18-7-9 (secuencia de nucleótidos optimizada para codones de CHO), FS18-7-9 (secuencia de nucleótidos expresada en HEK293), FS18-7-32, FS18-7-33, FS18-7-36, FS18-7-58, FS18-7-62, FS18-7-65, FS18-7-78, FS18-7-88 y FS18-7-95, respectivamente.
Las células huésped in vitro que comprenden dichos ácidos nucleicos y vectores son parte de la invención, al igual que su uso para expresar las moléculas de anticuerpos de la invención, que posteriormente pueden purificarse a partir de cultivos celulares y, opcionalmente, formularse en una composición farmacéutica. Por tanto, la presente invención proporciona además un método para producir la molécula de anticuerpo de la invención, que comprende cultivar la célula huésped recombinante de la invención en condiciones para la producción de la molécula de anticuerpo. Los métodos para cultivar células huésped adecuadas como se mencionó anteriormente son bien conocidos en la técnica. El método puede comprender además aislar y/o purificar la molécula de anticuerpo. El método también puede comprender formular la molécula de anticuerpo en una composición farmacéutica, opcionalmente con un excipiente u otra sustancia farmacéuticamente aceptable como se describe a continuación.
Se sabe que PD-L1 se expresa en muchas células cancerosas, mientras que la expresión de LAG-3 en células cancerosas es más limitada. Ambos se expresan en células del sistema inmune. En particular, se sabe que LAG-3 se expresa en células T agotadas dentro del entorno tumoral. Además, los presentes inventores han mostrado que el uso de una molécula de anticuerpo que se une tanto a LAG-3 como a PD-L1 es efectivo para suprimir el crecimiento tumoral en modelos singénicos de cáncer en ratones, y que dichas moléculas de anticuerpos son más efectivas que la administración. de dos moléculas de unión que se unen a LAG-3 y PD-L1, respectivamente.
Por tanto, una molécula de anticuerpo de la invención puede usarse en un método para tratar el cáncer en un paciente. El paciente es preferiblemente un paciente humano.
Las células del cáncer que se van a tratar usando la molécula de anticuerpo de la invención pueden expresar LAG-3, p. ej. en su superficie celular. En una realización, se puede haber determinado que las células del cáncer que se van a tratar expresan LAG-3, p. ej., en su superficie celular. Por ejemplo, se ha mostrado que los linfomas de células B expresan LAG-3 en su superficie celular. Los métodos para determinar la expresión de un antígeno en una superficie celular son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, citometría de flujo.
El ejemplo 4 a continuación muestra que las moléculas de anticuerpos de la presente invención se pueden usar para tratar tumores con altos niveles de células inmunes que expresan LAG-3, tales como TIL que expresan LAG-3, en ratones. Por tanto, además, o alternativamente, los tumores del cáncer que se van a tratar usando la molécula de anticuerpo de la invención pueden comprender células inmunes que expresan LAG-3. Las células inmunes que expresan LAG-3, tales como los TIL que expresan LAG-3, están presentes entre las células tumorales en muchos cánceres. En una realización, se ha determinado que los tumores del cáncer que se van a tratar usando la molécula de anticuerpo de la invención contienen células inmunes que expresan LAG-3. Se conocen en la técnica métodos para determinar la presencia de células inmunes que expresan LAG-3 en un tumor o en la periferia del tumor.
El ejemplo 4 a continuación también muestra que las moléculas de anticuerpos de la presente invención pueden usarse para tratar tumores que expresan PD-L1 en su superficie celular. Por tanto, además, o alternativamente, las células del cáncer que se van a tratar usando la molécula de anticuerpo de la invención pueden expresar PD-L1, p. ej., en su superficie celular. Además, o alternativamente, los tumores del cáncer que se van a tratar pueden comprender células inmunes, tales como TIL, que expresan PD-L1. Se puede haber determinado que las células del cáncer que se van a tratar expresan PD-L1, p. ej., en su superficie celular. Además, o alternativamente, se puede haber determinado que los tumores del cáncer que se van a tratar contienen células inmunes, tales como TIL, que expresan PD-L1.
Se espera que la expresión en la superficie celular de LAG-3 y PD-L1 permita que la molécula de anticuerpo se una a LAG-3 y PD-L1 expresados en la superficie de la célula inmune y/o la célula cancerosa. Se cree que esto da como resultado una terapia dirigida, formación de puente y una localización de las células cancerosas y las células inmunes.
Un cáncer que se va a tratar usando una molécula de anticuerpo de la invención puede seleccionarse del grupo que consiste en linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin (tal como linfoma difuso de células B grandes, linfoma no de Hodgkin indolente, linfoma de células del manto, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer colorrectal, fibrosarcoma, carcinoma de células renales, melanoma, cáncer pancreático, cáncer de mama, glioblastoma multiforme, cáncer de pulmón (tal como cáncer de pulmón de células no pequeñas), cáncer de cabeza y cuello (tal como carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello) , cáncer de estómago (cáncer gástrico), cáncer de vejiga, cáncer de cuello uterino, cáncer de uterino, cáncer de vulva, cáncer testicular, cáncer de pene, leucemia (tal como leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide, leucemia linfoblastoide aguda o leucemia linfoblastoide crónica), mieloma múltiple, cáncer de células escamosas, cáncer testicular, cáncer de esófago (tal como adenocarcinoma de la unión gastroesofágica), sarcoma de Kaposi y linfoma del sistema nervioso central (SNC), carcinoma hepatocelular, cáncer de nasofaringe, carcinoma de células de Merkel y mesotelioma. Se sabe, o se espera, que los tumores de estos cánceres expresen PD-L1 en su superficie celular y/o contengan células inmunes, tales como TIL, que expresan PD-L1 y/o LAG-3.
El tratamiento del carcinoma de células renales, cáncer de pulmón (tal como cáncer de pulmón de células no pequeñas), cáncer de nasofaringe, cáncer colorrectal, melanoma, cáncer de estómago (cáncer gástrico), cáncer de esófago (tal como adenocarcinoma de la unión gastroesofágica), cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello (tal como carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello), leucemia (tal como leucemia linfocítica crónica, linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin (tal como linfoma difuso de células B grandes, linfoma no de Hodgkin indolente, linfoma de células del manto) y mieloma múltiple usando anticuerpos anti-LAG-3 se ha investigado en ensayos clínicos y ha mostrado resultados prometedores. Por lo tanto, el cáncer que se va a tratar usando las moléculas de anticuerpos de la presente invención puede ser un carcinoma de células renales, cáncer de pulmón (tal como cáncer de pulmón de células no pequeñas), cáncer de nasofaringe, cáncer colorrectal, melanoma, cáncer de estómago (cáncer gástrico), cáncer de esófago (tal como adenocarcinoma de la unión gastroesofágica), cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello (tal como carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello), leucemia (tal como leucemia linfocítica crónica, linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin (tal como linfoma difuso de células B grandes, linfoma no de Hodgkin indolente, linfoma de células del manto) o mieloma múltiple.
El tratamiento de melanoma, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de vejiga, carcinoma de células renales, cáncer de vejiga, cáncer gástrico, cáncer de cabeza y cuello (tal como carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello), mesotelioma, cáncer de pulmón (tal como cáncer de pulmón de células no pequeñas), cáncer de ovario, carcinoma de células de Merkel, cáncer pancreático, melanoma y carcinoma hepatocelular usando anticuerpos anti-PD-L1 también se ha investigado en ensayos clínicos y ha mostrado resultados prometedores. Por tanto, el cáncer que se va a tratar usando las moléculas de anticuerpos de la presente invención puede ser un melanoma, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de vejiga, carcinoma de células renales, cáncer de vejiga, cáncer gástrico, cáncer de cabeza y cuello (tal como carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello), mesotelioma, cáncer de pulmón (tal como cáncer de pulmón de células no pequeñas), cáncer de ovario, carcinoma de células de Merkel, cáncer pancreático, melanoma o carcinoma hepatocelular.
Los cánceres preferidos para el tratamiento usando las moléculas de anticuerpos de la presente invención son cáncer de pulmón (tal como cáncer de pulmón de células no pequeñas), cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello (carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello), linfoma difuso de células B grandes, cáncer gástrico, cáncer pancreático y carcinoma hepatocelular. Se sabe que los tumores de estos cánceres comprenden células inmunes que expresan LAG-3 y que expresan PD-L1 en su superficie celular o que comprenden células inmunes que expresan PD-L1.
Cuando la solicitud se refiere a un tipo particular de cáncer, tal como cáncer de mama, este se refiere a una transformación maligna del tejido relevante, en este caso un tejido de mama. Un cáncer que se origina a partir de la transformación maligna de un tejido diferente, p. ej., tejido ovárico, puede dar como resultado lesiones metastásicas en otra localización del cuerpo, tal como la mama, pero no es por ello un cáncer de mama como se hace referencia en la presente memoria, sino un cáncer de ovario.
El cáncer puede ser un cáncer primario o secundario. Por tanto, la molécula de anticuerpo de la presente invención puede usarse en un método de tratamiento del cáncer en un paciente, en donde el cáncer es un tumor primario y/o una metástasis tumoral.
Las moléculas de anticuerpos de la invención están diseñadas para usarse en métodos de tratamiento de pacientes, preferiblemente pacientes humanos. Las moléculas de anticuerpos normalmente se administrarán en forma de una composición farmacéutica, que puede comprender al menos un componente además de la molécula de anticuerpo, tal como un excipiente farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, una composición farmacéutica de la presente invención puede comprender, además del ingrediente activo, un excipiente, vehículo, tampón, estabilizador u otros materiales farmacéuticamente aceptables bien conocidos por los expertos en la técnica. Dichos materiales no deben ser tóxicos y no deben interferir con la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del vehículo u otro material dependerá de la ruta de administración, que puede ser por inyección, p. ej., intravenosa o subcutánea. La molécula de anticuerpo se puede administrar por la ruta intravenosa o subcutánea.
Las composiciones farmacéuticas líquidas generalmente comprenden un vehículo líquido tal como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. Se pueden incluir disolución salina fisiológica, dextrosa u otra disolución de sacárido o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol.
Para inyección intravenosa, o inyección en el sitio de la aflicción, la molécula de anticuerpo, o composición farmacéutica que comprende la molécula de anticuerpo, está preferiblemente en la forma de una disolución acuosa parenteralmente aceptable que no contiene pirógenos y que tiene un pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Los expertos en la técnica son capaces de preparar disoluciones adecuadas usando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de Ringer con lactato. Pueden emplearse conservantes, estabilizadores, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos, según se requiera. Los expertos en la técnica conocen muchos métodos para la preparación de formulaciones farmacéuticas. Véase, p. ej., Robinson ed., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.
Una composición que comprende moléculas de anticuerpos según la presente invención puede administrarse sola o en combinación con otros tratamientos, de forma concurrente o secuencial o como una preparación combinada con otro agente o agentes terapéuticos, dependiendo de la afección que se va a tratar. Por ejemplo, se puede administrar una molécula de anticuerpo de la invención en combinación con un agente terapéutico existente para la enfermedad que se va a tratar, p. ej., un cáncer como se mencionó anteriormente. Por ejemplo, una molécula de anticuerpo de la presente invención puede administrarse al paciente en combinación con una segunda terapia anticancerosa, tal como quimioterapia, vacunación antitumoral (también denominada vacuna contra el cáncer), radioterapia, inmunoterapia, un virus oncolítico, terapia de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) o terapia hormonal.
Se espera que la molécula de anticuerpo de la invención pueda actuar como un adyuvante en la terapia anticancerosa, tal como quimioterapia, vacunación antitumoral o radioterapia. Sin desear estar limitado por la teoría, se cree que la administración de la molécula de anticuerpo al paciente como parte de la quimioterapia, vacunación antitumoral o radioterapia desencadenará una mayor respuesta inmune contra los antígenos asociados al cáncer LAG-3 y PD-L1, de la que se logra con quimioterapia, vacunación antitumoral o radioterapia sola. Por ejemplo, las terapias anti-LAG-3 han mostrado una buena eficacia en el tratamiento de patologías de base viral en ratones (Blackburn SD, et al., 2009).
Por tanto, un método para tratar el cáncer en un paciente puede comprender administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de una molécula de anticuerpo según la presente invención en combinación con un agente quimioterapéutico, vacuna antitumoral, radionúclido, agente inmunoterapéutico, virus oncolíticos, células CAR-T o agente para terapia hormonal. El agente quimioterapéutico, vacuna antitumoral, radionúclido, agente inmunoterapéutico, virus oncolíticos, células CAR-T o agente para terapia hormonal es preferiblemente un agente quimioterapéutico, vacuna antitumoral, radionúclido, agente inmunoterapéutico, virus oncolíticos, células CAR-T, o agente para terapia hormonal para el cáncer en cuestión, es decir, un agente quimioterapéutico, vacuna antitumoral, radionúclido, agente inmunoterapéutico, virus oncolíticos, células CAR-T, o agente para terapia hormonal que ha mostrado ser efectivo en el tratamiento del cáncer en cuestión. La selección de un agente quimioterapéutico, vacuna antitumoral, radionúclido, agente inmunoterapéutico, virus oncolíticos, células CAR-T o agente para la terapia hormonal adecuados que se ha mostrado que es efectivo para el cáncer en cuestión está dentro de las capacidades del experto en la técnica.
Por ejemplo, cuando el método comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de una molécula de anticuerpo según la presente invención en combinación con un agente quimioterapéutico, el agente quimioterapéutico del grupo que consiste en: taxanos, antibióticos citotóxicos, inhibidores de tirosina quinasa, inhibidores de PARP, inhibidores de la enzima B_RAF, agentes alquilantes, análogos de platino, análogos de nucleósidos, derivados de talidomida, agentes quimioterapéuticos antineoplásicos y otros. Los taxanos incluyen docetaxel, paclitaxel y nab-paclitaxel; los antibióticos citotóxicos incluyen actinomicina, bleomicina, antraciclinas, doxorrubicina y valrrubicina; los inhibidores de la tirosina quinasa incluyen erlotinib, gefitinib, axitinib, PLX3397, imatinib, cobemitinib y trametinib; Los inhibidores de PARP incluyen piraparib; los inhibidores de la enzima B-Raf incluyen vemurafenib y dabrafenib; los agentes alquilantes incluyen dacarbazina, ciclofosfamida, temozolomida; los análogos de platino incluyen carboplatino, cisplatino y oxaliplatino; los análogos de nucleósidos incluyen gemcitabina y azacitidina; los antineoplásicos incluyen fludarabina. Otros agentes quimioterapéuticos adecuados para su uso en la presente invención incluyen metotrexato, defactinib, entinostat, pemetrexed, capecitabina, eribulina, irinotecán, fluorouracilo y vinblastina.
Las estrategias de vacunación para el tratamiento de cánceres se han implementado en la clínica y se han discutido con detalle en la bibliografía científica (tal como Rosenberg, S. 2000 Development of Cancer Vaccines). Esto implica principalmente estrategias para impulsar al sistema inmune a responder a diversos marcadores celulares expresados por células cancerosas autólogas o alogénicas mediante el uso de esas células como método de vacunación, con o sin factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF). El GM-CSF provoca una fuerte respuesta en la presentación de antígenos y funciona particularmente bien cuando se emplea con dichas estrategias.
La administración puede ser en una "cantidad terapéuticamente efectiva", que es suficiente para mostrar beneficio a un paciente. Dicho beneficio puede ser al menos la mejora de al menos un síntoma. Por tanto, "tratamiento" de una enfermedad específica se refiere a la mejora de al menos un síntoma. La cantidad real administrada y la velocidad y el curso temporal de la administración dependerán de la naturaleza y la gravedad de lo que se esté tratando, del paciente en particular que se esté tratando, de la condición clínica del paciente individual, de la causa del trastorno, del sitio de administración de la composición, del tipo de molécula de anticuerpo, del método de administración, de la programación de la administración y de otros factores conocidos por los médicos. La prescripción del tratamiento, p. ej., las decisiones sobre la dosificación, etc., son responsabilidad de los médicos generales y otros médicos, y pueden depender de la gravedad de los síntomas y/o de la progresión de una enfermedad que se esté tratando. Las dosis apropiadas de moléculas de anticuerpos son bien conocidas en la técnica (Ledermann et al. (1991) Int. J. Cancer 47: 659-664; y Bagshawe et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922). Se pueden usar las dosificaciones específicas indicadas en la presente memoria, o en Physician's Desk Reference (2003), según sea apropiado para una molécula de anticuerpo que se esté administrando. Se puede determinar una cantidad terapéuticamente efectiva o una dosis adecuada de una molécula de anticuerpo comparando su actividad in vitro y actividad in vivo en un modelo animal. Se conocen métodos para la extrapolación de dosificaciones efectivas en ratones y otros animales de ensayo a seres humanos. La dosis precisa dependerá de varios factores, incluyendo el tamaño y la localización del área que se va a tratar y la naturaleza precisa de la molécula de anticuerpo. Los tratamientos pueden repetirse a intervalos diarios, dos veces por semana, semanales o mensuales, a criterio del médico. El tratamiento se puede proporcionar antes y/o después de la cirugía y se puede administrar o aplicar directamente en el sitio anatómico del tratamiento quirúrgico.
"Y/o" cuando se usa en la presente memoria debe tomarse como descripción específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin el otro. Por ejemplo, "A y/o B" debe tomarse como la descripción específica de cada uno de (i) A, (ii) B y (iii) A y B, como si cada uno se mostrara individualmente en la presente memoria.
A no ser que el contexto dicte otra cosa, las descripciones y definiciones de las características mostradas anteriormente no se limitan a ningún aspecto o realización particular de la invención, que es como se muestra en las reivindicaciones, y se aplican igualmente a todos los aspectos y realizaciones que se describen.
Determinados aspectos y realizaciones de la invención se ilustrarán ahora a modo de ejemplo y con referencia a las figuras descritas anteriormente.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Selección y caracterización de moléculas Fcab
1.1 Selección sin tratamiento previo y maduración por afinidad de Fcab anti-LAG-3 humano
1.1.1 Selección sin tratamiento previo
Se usaron bibliotecas de fagos sin tratamiento previo que mostraban el dominio CH3 de IgG1 humana (numeración IMGT 1.4-130) con aleatorización dentro de los bucles AB (residuos 14-18) y EF (residuos 92-101) para la selección con antígeno LAG-3 humano etiquetado con Fc recombinante (LAG-3 Fc) (R&D systems, 2319-L3-050). Las bibliotecas se seleccionaron en tres rondas usando antígeno capturado en perlas de Proteína A (Life Technologies, 10002D) o Proteína G (Life Technologies, 10004D). Los resultados se cribaron mediante ELISA y los aglutinantes positivos se subclonaron y expresaron como Fcab solubles (que contienen una bisagra truncada) en Pichia pastoris usando el kit de expresión en Pichia EasySelect (Life Technologies, K1740-01). A continuación, los Fcab se cribaron para determinar su unión a LAG-3 Fc humano recombinante en el Biacore 3000 (GE Healthcare). Brevemente, se acopló LAG-3 Fc (R&D systems, 2319-L3-050) a una densidad de 7.200 RU a un chip CM5 (g E Healthcare, BR-100012) usando acoplamiento de amina (GE Healthcare, BR-1000-50). Los Fcab se diluyeron en tampón HBS-P (GE Healthcare, BR100368) y se inyectaron a 250 nM, 500 nM y 1.000 nM durante 3 min y después se dejó que se disociaran en tampón durante 5 min. Los datos restados de la referencia (celda de flujo LAG-3 Fc 2-celda de flujo en blanco) se analizaron usando el software BIAevaluation 3.2 para identificar la unión. A continuación, se ensayó la unión de los Fcab a LAG-3 humano expresado en células HEK (LAG-3 clonado en el vector pcDNA5FRT [Life Technologies, V6010-20] [Véase la metodología en la sección 1.4.5]). Brevemente, las células HEK 293 que sobreexpresaban LAG-3 humano cultivadas en DMEM (Life Technologies, 61965-026) que contenía FBS al 10% (Life Technologies, 10270-1-6), 100 pg/ml de Higromicina B (Melford Laboratories Ltd, Z2475), 15 pg/ml de blasticidina (Melford Laboratories Ltd, B1105) y 1 pg/ml de doxiciclina (Sigma, D9891) se despegaron de matraces de cultivo de tejidos usando tampón de disociación celular (Life Technologies, 13151-014) y se sembraron en placas de 96 pocillos con fondo en V a 2x105 células/pocillo. Los Fcab se incubaron con las células a 5 pM en un volumen de 100 pl durante 1 h 4 °C. Las placas se lavaron, el anticuerpo secundario (Anti-Fc-humano 488, Jackson ImmunoResearch, 109-546­ 098) se diluyó 1:1.000 en PBS y se añadieron 100 pl a las células y se incubaron durante 30 min a 4 °C. Las placas se lavaron y las células se resuspendieron en 100 pl de PBS que contenía 1 pg/ml de DAPI (Biotium, 40043). La placa se leyó en un citómetro BD FACSCanto II (BD Biosciences) y los datos se analizaron usando FlowJoX. A continuación, los Fcab se expresaron en células de mamíferos mediante transformación usando lipofectamina (Life Technologies, 11668-019) en células Flp-In T-Rex 293 (Life Technologies, R780-07). Las Fcab que se unían a LAG-3 se ensayaron para determinar la inhibición de la unión de MHC de clase II humano en células A375 (ATCC, CRL-1619) a LAG-3 Fc recombinante (usando la metodología del ejemplo 1.6). Se identificaron 54 secuencias de Fcab únicas a partir de tres rondas de selección de fagos, y se determinó que 12 de estos Fcab se unían a LAG-3 Fc mediante análisis BIAcore y/o se unían a células HEK que expresaban LAG-3. Tres de los Fcab seleccionados también pudieron inhibir la interacción de LAG-3 con MHC de clase II y se seleccionaron para la maduración por afinidad. Los tres Fcab se denominaron FS18-3, FS18-7 y FS18-21.
1.1.2 Maduración por afinidad
Primera maduración por afinidad
Se construyeron seis bibliotecas de maduración por afinidad en presentación en fagos aleatorizando cinco residuos en el bucle AB (residuos 14-18) y cinco (residuos 92-94 y 97-98) u ocho (residuos 92-94 y 97-101) residuos en el bucle EF de cada uno de los tres Fcab identificados usando el proceso de selección sin tratamiento previo descrito anteriormente.
Las bibliotecas de maduración por afinidad se seleccionaron usando LAG-3 Fc humano recombinante (R&D systems, 2319-L3-050) y células HEK que expresaban LAG-3 humano (como se describió anteriormente). Los resultados se cribaron mediante ELISA de fagos, los aglutinantes positivos se subclonaron y se expresaron como Fcab solubles (que contenían una bisagra truncada) en células HEK Expi293 (Fcab clonados en el vector pTT5 [National Research Council de Canadá] transfectadas usando el kit de transfección ExpiFectamine 293 [Life Technologies, A14524] en células Expi293F [Life Technologies, A14527]). Los Fcab solubles expresados en HEK se cribaron entonces para determinar la unión a LAG-3 humano expresado en células, la unión a LAG-3 de cinomolgo expresado en células (metodología como en el ejemplo 1.4.3) y la capacidad de bloquear la unión de MHC de clase II a LAG-3 Fc recombinante (metodología como en el ejemplo 1.6). Los Fcab de bloqueo se ensayaron adicionalmente para determinar si eran capaces de revertir la inhibición inducida por LAG-3 de la secreción de IL-2 en un ensayo de activación de células T (metodología como en el ejemplo 2.1). Se identificaron 61 Fcab anti-LAG-3 únicos a partir de las seis bibliotecas de maduración por afinidad usando estos métodos de cribado. Se demostró que los Fcab madurados por afinidad del linaje FS18-7 tenían el nivel más alto de reactividad cruzada con LAG-3 de mono cinomolgo. Se seleccionaron los tres Fcab de este linaje con la unión más fuerte a LAG-3 Fc de mono cinomolgo y la mayor actividad en el ensayo de activación de células T (denominados FS18-7-7, FS18-7-9 y FS18-7-11) para una maduración por afinidad adicional. También se mostró que estos tres Fcab bloqueaban la interacción de LAG-3 Fc con MHC de clase II expresado en células.
Segunda maduración por afinidad
Se usó un combinado de los tres Fcab (FS18-7-7, FS18-7-9 y FS18-7-11) de la primera maduración por afinidad para crear más bibliotecas de maduración por afinidad adicionales. El bucle CD se aleatorizó de forma sólida usando cebadores aleatorizados de ELLA Biotech. Se aleatorizó una parte de las posiciones de los aminoácidos en el bucle CD (residuos 45.1-78) usando una distribución equimolar de aminoácidos excluyendo la cisteína. También se llevó a cabo una PCR propensa a errores en toda la secuencia del dominio CH3 para introducir mutaciones adicionales que podrían aumentar la unión.
Las bibliotecas de maduración por afinidad se generaron en fagos y las selecciones se realizaron contra LAG-3 avi-Fc recombinante biotinilado (BPS Bioscience, 71147) y células HEK hLAG-3 y se cribaron para determinar la unión a LAG-3 Fc recombinante (R&D systems, 2319-L3-050) mediante ELISA de fagos. Se expresaron 86 Fcab únicos (que contenían una bisagra truncada) en células HEK293F. Los Fcab seleccionados también se cribaron para determinar su actividad en un ensayo de activación de células T como se describió anteriormente. Los nueve Fcab identificados durante la segunda maduración por afinidad con la actividad más alta en el ensayo de activación de células T (FS18-7-32; FS18-7-33; FS18-7-36; FS18-7-58; FS18-7-62; FS18-7-65; FS18-7-78; FS18-7-88; y FS18-7-95), así como el clon de Fcab parental, FS18-7-9, se caracterizaron adicionalmente como se describe a continuación. Un alineamiento de las secuencias de estos nueve Fcab contra el clon Fcab parental, FS18-7-9, se muestra en la Figura 1A. La Figura 1B detalla el porcentaje de identidad de secuencia de cada uno de los nueve clones de Fcab con el clon de Fcab parental, FS18-7-9. Los Fcab que se originan a partir de la maduración por afinidad de los otros dos clones de Fcab parentales, FS18-7-7 y FS18-7-11, no eran candidatos tan prometedores como los que se originan a partir de la maduración por afinidad de FS18-7-9 y, por lo tanto, no se siguieron investigando.
1.2 Selección de Fcab subrogado específico para LAG-3 de ratón
Se usó Fcab FS18-7, que se seleccionó usando el protocolo de selección sin tratamiento previo descrito anteriormente, para generar bibliotecas de fagos para seleccionar contra LAG-3 de ratón. Se realizaron dos rondas de maduración por afinidad, y se seleccionaron los clones de Fcab FS18-7-108-29 y FS18-7-108-35, que mostraron unión específica de alta afinidad a LAG-3 de ratón después de la maduración por afinidad. Se confirmó la capacidad de FS18-7-108-29 y FS18-7-108-35 para inhibir LAG-3 de ratón en un ensayo de activación de células T. El mapeo de epítopos usando el Octet (Forteo Bio) mostró que los Fcab anti-LAG-3 de ratón compiten con los Fcab anti-LAG-3 humano (seleccionados después de la segunda maduración por afinidad como se describió anteriormente) para unirse a LAG-3 humano. Hay entre 4 y 8 diferencias de residuos entre los Fcab anti-LAG-3 humano y anti-LAG-3 de ratón. Por lo tanto, se espera que los Fcab anti-LAG-3 de ratón representen subrogados adecuados para la unión y función de los Fcab anti-LAG-3 humanos en ratones.
1.3 Construcción y expresión de mAb2 simulado
Se prepararon mAb2 "simulados" que comprenden los Fcab líderes anti-LAG-3 humano y anti-LAG-3 de ratón identificados en 1.1 y 1.2 anteriores con el fin de permitir la caracterización de estos Fcab en formato de mAb2. Estos mAb2 simulados se prepararon a partir de los Fcab anti-LAG-3 y las regiones variables del anticuerpo anti-FITC 4420 (véanse la SEQ ID No : 83, SEQ ID NO: 84 y SEQ ID NO: 85 para detalles) (Bedzyk, WD, et al. 1989 y Bedzyk, WD, et al. 1989). Los mAb2 simulados se prepararon tanto con (SEQ ID NO: 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 y 81) como sin (SEQ ID NO: 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80 y 82) la mutación LALA en el dominio CH2 de la cadena pesada (véase la sección 1.5 a continuación para detalles) y además comprendían la cadena ligera del mAb anti-FITC 4420 (SEQ ID NO: 85). Los mAb2 simulados se produjeron mediante expresión transitoria en células HEK293-6E y se purificaron usando columnas de proteína A mAb Select SuRe.
1.4 Afinidad de unión de los Fcab a LAG-3
1.4.1 Afinidad de unión de los Fcab a LAG-3 humano determinada por resonancia de plasmón de superficie (SPR)
Se usó un BIAcore T200 (GE Healthcare) para medir la afinidad de los Fcab anti-LAG-3 humano en el formato mAb2 simulado para LAG-3 humano. La celda de flujo 4 de un chip sensor CM5 (GE Healthcare, BR1005-30) se inmovilizó con LAG-3-Fc humano (R&D Systems, 2319-L3-050) y la celda de flujo 3 se inmovilizó con tampón como referencia usando el kit acoplamiento de amina (GE Healthcare, BR-1000-50). Se diluyó LAG-3-Fc a 5 pg/ml en acetato de sodio pH 5 (ForteoBio, 18-1069) y se inyectó a una velocidad de flujo de 10 pl/min durante 12 segundos seguido de la desactivación de la superficie mediante inyección de etanolamina durante 420 segundos. El nivel de inmovilización fue de 158 RU. Los mAb2 simulados (o mAb anti-LAG-3 humano de control, 25F7) se diluyeron en tampón HBS-P (GE Healthcare, BR-1003-68) en una serie de diluciones de 2 veces a partir de 4 pg/ml. El mAb de control/mAb2 simulado se inyectaron con un tiempo de asociación de 240 segundos a 30 pl/min y un tiempo de disociación de 300 segundos a 30 pl/min. La superficie se regeneró usando NaOH 25 mM durante 30 segundos a 100 pl/min. Los datos se restaron por referencia doble y se analizaron usando el software BIAevaluation 3.2 para calcular las constantes cinéticas. Los Fcab en el formato mAb2 simulado tenían afinidades por LAG-3 humano en el rango de 0,8 - 1,1 nM (Tabla 1), que es similar a la afinidad del mAb 25F7 anti-LAG-3 humano de referencia. Esto fue sorprendente porque los Fcab tienen una interfaz de unión más pequeña que los anticuerpos monoclonales, ya que los sitios de unión de los Fcab forman un fragmento de anticuerpo relativamente compacto con dos sitios de unión situados muy cerca. Por el contrario, los brazos Fab de un mAb típico están separados por una región bisagra flexible. En base a esta interfaz de unión más pequeña y la flexibilidad reducida asociada de los dos sitios de unión en la región Fc, fue inesperado que los Fcab anti-LAG-3 fueran capaces de unirse a e inhibir LAG-3 con una afinidad y potencia similares a las del anticuerpo de referencia 25F7.
Tabla 1: Afinidad de unión de los Fcab específicos de LAG-3 en formato de mAb2 simulado a LAG-3 humano
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1.4.2 Afinidad de unión de Fcab subrogado específico para LAG-3 de ratón a LAG-3 de ratón determinada por SPR
Se usó un Biacore 3000 (GE Healthcare) para medir la afinidad de los Fcab subrogados específicos para LAG-3 de ratón a LAG-3 de ratón. Se usó acoplamiento de amina (kit de acoplamiento de amina, GE Healthcare, BR-1000-50) para recubrir mLAG-3 Fc (R&D Systems, 3328-L3-050) diluido en acetato de sodio 10 mM pH 5,0 (ForteBio, 18-1069) directamente en un chip CM5 (GE Healthcare, BR-1000-12). La celda de flujo 1 se recubrió con Fc de ratón (SinoBiological, 51094-MNAH) y la celda de flujo 2 se recubrió con mLAG-3 Fc a 950 RU. Los Fcab se diluyeron en tampón HBS-P (GE Healthcare, BR-1003-68) y se inyectaron a diversas concentraciones (diluciones cuádruples a partir de 100 nM) durante 3 min a 20 pl/min y después se dejó que se disociaran en tampón durante 12 min. El chip se regeneró mediante inyección de glicina 10 mM pH 2,5 durante 30 s a 30 pl/min. Los datos se restaron por referencia doble y se analizaron usando el software BIAevaluation 3.2 para calcular las constantes cinéticas. Los Fcab subrogados ensayados se unieron a LAG-3 de ratón con afinidad nanomolar de un solo dígito como se muestra en la Tabla 2.
Tabla 2: Afinidad de unión (Kd) de Fcab específicos de LAG-3 subrogados a LAG-3 de ratón
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1.4.3 Afinidad de unión de loa Fcab a LAG-3 humano expresado en células determinada por citometría de flujo
Producción de líneas celulares que sobreexpresan LAG-3
Se usó la metodología de transducción lentiviral para generar células DO11.10 (National Jewish Health) que sobreexpresaban LAG-3 humano, de cinomolgo o de ratón usando el sistema de empaquetado Lenti-X HTX (Clontech, No. de Cat. 631249). El vector de expresión Lenti-X (pLVX) (Clontech, No. de Cat. 631253), que contenía el ADNc de LAG-3 de ratón (SEQ ID NO: 96), ADNc de LAG-3 humano (SEQ ID NO: 95) o ADNc de LAG-3 de cinomolgo (SEQ ID NO: 97), se cotransfectó con una mezcla de empaquetamiento Lenti-X HTX en la línea celular Lenti-X 293T (Clontech, No. de Cat. 632180) para generar virus. La línea celular DO11.10 se transdujo usando los vectores lentivirales producidos con el sistema de empaquetamiento Lenti-X HTX.
La afinidad de los Fcab anti-LAG-3 humano en formato mAb2 simulado para las células que expresaban LAG-3 humano (línea celular DO11.10 transfectada con LAG-3 humano) se midió usando citometría de flujo. Se prepararon diluciones de mAb2 y mAb de control (2 x concentración final) por triplicado en 1 x DPBS (Gibco, 14190-094). Se prepararon suspensiones de células DO11.10:LAG-3 en PBS Bs A al 2% (Sigma, A7906) y se sembraron a 4 x 10-6 células/ml con 50 pl/pocillo en placas de 96 pocillos con fondo en V (Costar, 3897). Se añadieron 50 pl de las diluciones de mAb2 o mAb de control (mAb anti-LAG-3 humano, 25F7) a los pocillos que contenían células (volumen final 100 pl) y se incubaron a 4 °C durante 1 hora. Las placas se lavaron y luego se añadieron 100 pl/pocillo de anticuerpo secundario (anticuerpo anti-Fc humano-488, Jackson ImmunoResearch, 109-546-098) diluido 1:1.000 en PBS BSA al 2% y se incubó durante 30 minutos a 4 °C en la oscuridad. Las placas se lavaron y se resuspendieron en 100 pl de PBS que contenía DAPI (Biotium, 40043) a 1 mg/ml. Las placas se leyeron usando un citómetro de flujo Canto II (BD Bioscience). Se excluyeron las células muertas y se midió la fluorescencia en el canal FITC (488 nm/530/30). Los datos se ajustaron usando log (agonista) frente a respuesta en el Software GraphPad Prism. Todos los Fcab ensayados en formato mAb2 simulado y el mAb anti-LAG-3 humano de referencia, 25F7, se unieron a LAG-3 humano con afinidad similar (CE50), en el rango de 1,2 - 2,1 nM como se muestra en la Tabla 3.
Tabla 3: Afinidad de unión de los Fcab anti-LAG-3 humano en formato mAb2 simulado a las células DO11.10 que expresan LAG-3 humano determinada por citometría de flujo
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1.4.4 Afinidad de unión de los Fcab a LAG-3 de cinomolgo expresado en células determinada por citometría de flujo
La afinidad de los Fcab anti-LAG-3 humano en formato mAb2 simulado para las células que expresan LAG-3 de cinomolgo (línea celular DO11.10 transfectada con LAG-3 de cinomolgo) se midió usando citometría de flujo. Se prepararon diluciones de mAb2 y mAb de control (2 x concentración final) por triplicado en 1 x DPBS (Gibco, 14190­ 094). Se prepararon suspensiones de células DO11.10:LAG-3 en PBS BSA al 2% (Sigma, A7906) y se sembraron a 4 x 10-6 células/ml con 50 pl/pocillo en placas de 96 pocillos con fondo en V (Costar, 3897). Se añadieron 50 pl de diluciones de mAb2 o de mAb de control (mAb anti-LAG-3 humano, 25F7) a los pocillos que contenían células (volumen final 100 pl) y se incubaron a 4 °C durante 1 hora. Las placas se lavaron y después se añadieron 100 pl/pocillo de anticuerpo secundario (anticuerpo anti-Fc humano-488, Jackson ImmunoResearch, 109-546-098) diluido 1:1.000 en PBS BSA al 2% y se incubó durante 30 minutos a 4 °C en la oscuridad. Las placas se lavaron y se resuspendieron en 100 pl de PBS que contenía DAPI (Biotium, 40043) a 1 mg/ml. Las placas se leyeron usando un citómetro de flujo Canto II (BD Bioscience). Se excluyeron las células muertas y se midió la fluorescencia en el canal FITC (488 nm/530/30). Los datos se ajustaron usando log (agonista) frente a respuesta en el Software GraphPad Prism. Los Fcab ensayados en formato mAb2 simulado se unieron a LAG-3 de cinomolgo con una afinidad de 0,5-0,6 nM, lo que indica que se esperaría que los estudios de toxicología en monos cinomolgos fueran predictivos de los efectos observados en los seres humanos (véase la Tabla 4). El mAb anti-LAG-3 humano de referencia, 25F7, se une a LAG-3 de cinomolgo con una afinidad 15 veces menor (CE50) (Tabla 4).
Tabla 4: Afinidad de unión de los Fcab anti-LAG-3 a células DO11.10 que expresan LAG-3 de cinomolgo mediante citometría de flujo
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1.4.5 Afinidad de unión de los Fcab anti-LAG-3 de ratón subrogados y Fcab anti-LAG-3 humano a LAG-3 de ratón expresado en células determinada por citometría de flujo
Producción de células HEK que sobreexpresan mLAG-3
La secuencia de LAG-3 de ratón (SEQ ID NO: 96) se subclonó en el vector pcDNA5FRT (Life Technologies, V6010-20) usando digestión de restricción con Kpnl (NEB, R0142) y Notl (NEB, R0146). A continuación, el vector se transformó en la línea celular FIp-In T-REx 293 HEK (Life Technologies, R780-07) usando Lipofectamine 2000 (Life Technologies, 11668-019). Las células FIp-In T-REx 293 transformadas se cultivaron en DMEM (Life Technologies, 61965-026) que contenía FBS al 10% (Life Technologies, 10270-1-6), 100 pg/ml de higromicina B (Melford Laboratories Ltd, Z2475), 15 pg/ml de blasticidina (Melford Laboratories Ltd, B1105) durante 3-4 semanas hasta que aparecieron colonias de células transformadas de forma estable. Estas colonias se amplificaron en presencia de 1 Mg/ml de Doxiciclina (Sigma, D9891) y se ensayaron para determinar la expresión de LAG-3 de ratón usando anti-LAG-3 de ratón conjugado con PE (clon C9B7W, BD Biosciences, 552380).
La afinidad de los Fcab anti-LAG-3 ratón subrogados (que contienen la bisagra truncada; SEQ ID NO: 58) para LAG-3 de ratón expresado en células se determinó usando citometría de flujo. Las células HEK que expresaban mLAG-3 cultivadas en DMEM (Life Technologies, 61965-026) que contenía Fb S al 10% (Life Technologies, 10270-1-6), 100 Mg/ml de higromicina B (Melford Laboratories Ltd, Z2475), 15 pg/ml de blasticidina (Melford Laboratories Ltd, B1105) y 1 Mg/ml de Doxiciclina (Sigma, D9891) se despegaron de matraces de cultivo de tejidos usando tampón de disociación celular (Life Technologies, 13151-014) y se sembraron en placas de 96 pocillos con fondo en V (Costar, 3897) a 2x105 células/pocillo. Las placas se centrifugaron a 1.500 rpm durante 3 min a 4 °C para sedimentar las células. Se incubó una serie de diluciones de los Fcab (o mAb de control) con las células en un volumen de 100 pl durante 1 h a 4 °C. Las placas se lavaron y el anticuerpo secundario (Anti-Fc humano-488, Jackson ImmunoResearch, 109-546-098 para los Fcab o IgG anti-rata (H L), conjugado con Alexa Fluor 488, ThermoFisher, A-11006 para C9B7W) se diluyó 1:1.000 en PBS y se añadieron 100 pl a las células durante 30 min a 4 °C (las placas se mantuvieron en la oscuridad). A continuación, se lavaron las placas y las células se resuspendieron en 100 pl de PBS que contenía 1 Mg/ml de DAPI (Biotium, 40043). Las placas se leyeron usando un citómetro de flujo Canto II (BD Bioscience). Se excluyeron las células muertas y se midió la fluorescencia en el canal FITC (488 nm/530/30). Los datos se ajustaron usando log (agonista) frente a respuesta en el Software GraphPad Prism. Los Fcab ensayados se unieron a l AG-3 de ratón con afinidad similar (véase la Tabla 5). El mAb de LAG-3 de referencia, C9B7W (2B Scientific, BE0174-50MG), se une a LAG-3 de ratón con una afinidad 17 veces menor (CE50) que los Fcab (Tabla 5).
Tabla 5: Afinidad de unión de los Fcab anti-LAG-3 de ratón subrogados a células HEK que expresan LAG-3 de ratón mediante citometría de flujo
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La afinidad del Fcab anti-LAG-3 humano FS18-7-9 en formato mAb2 simulado para LAG-3 de ratón expresado en células se determinó usando citometría de flujo. Las células HEK que expresaban mLAG-3 cultivadas en DMEM (Life Technologies, 61965-026) que contenía Fb S al 10% (Life Technologies, 10270-1-6), 100 pg/ml de higromicina B (Melford Laboratories Ltd, Z2475), 15 pg/ml de blasticidina (Melford Laboratories Ltd, B1 105) y 1 pg/ml de Doxiciclina (Sigma, D9891) se despegaron de matraces de cultivo de tejidos usando tampón de disociación celular (Life Technologies, 13151-014). Las células se recogieron por centrifugación a 1500 rpm durante 3 min a 4 °C para sedimentar las células y luego se resuspendieron en 1 x DPBS y luego se sembraron en placas de 96 pocillos con fondo en V (Costar, 3897) a 1,2x105 células/pocillo en 30 pl. Se añadió un volumen 1:1 de una serie de diluciones del mAb2 (o mAb de control) y se incubó con las células durante 1 h a 4 °C. Las placas se lavaron y el anticuerpo secundario (Anti-Fc humano-488, Jackson ImmunoResearch, 109-546-098) se diluyó 1:1.000 en PBS y se añadieron 60 pl a las células durante 30 min a 4 °C (las placas se mantuvieron en la oscuridad). A continuación, se lavaron las placas y las células se resuspendieron en 60 pl de PBS que contenía 1 pg/ml de DAPI (Biotium, 40043). Las placas se leyeron usando un citómetro de flujo Canto II (BD Bioscience). Se excluyeron las células muertas y se midió la fluorescencia en el canal FITC (488 nm/530/30). Los datos se ajustaron usando log (agonista) frente a respuesta en el Software GraphPad Prism. El Fcab anti-LAG-3 humano FS18-7-9 en formato mAb2 simulado se unió a LAG-3 de ratón con una CE50 de 19 nM en comparación con una CE50 de 2,6 nM para el Fcab anti-LAG-3 de ratón subrogado FS18-7-9-108 (Tabla 6). El mAb humano, 25F7 no muestra ninguna unión detectable a LAG-3 de ratón, lo que indica que el Fcab de LAG-3 humano, FS18-7-9, tiene un epítopo de unión en LAG-3 diferente al de 25F7.
Tabla 6: Afinidad de unión de Fcab anti-LAG-3 humano FS18-7-9 a células HEK que expresan LAG-3 de ratón mediante citometría de flujo
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1.5 Afinidad de unión de los Fcab a receptores de Fc
Se sabe que la introducción de la mutación LALA en el dominio CH2 de la IgG1 humana reduce la unión al receptor de Fcy (Bruhns, P., et al. (2009); y Xu, D. et al. (2000)). Se usó BIAcore para confirmar que la mutación LALA había reducido la afinidad de unión de los Fcab (en formato mAb2 simulado) a los receptores de Fcy. El ensayo de unión de FcyR humano se realizó en un instrumento Biacore T200 (GE Healthcare) usando los Fcab en el formato mAb2 simulado. Los FcyR humanos (R&D Systems, 1257-FC, 1330-CD, 1875-CD, 4325-FC) se inmovilizaron usando un acoplamiento de amina (kit de acoplamiento de amina, GE Healthcare, BR-1000-50) en un chip CM5 Serie S (GE Healthcare, BR-1005-30) a una densidad de superficie de 370 RU para FcyRI, 264 RU para FcyRIII (FcyR humanos de alta afinidad) y 500 RU para FcYRIIa y FcYRIIb (FcyR humanos de baja afinidad). Para cada chip inmovilizado, se dejó en blanco una celda de flujo para la sustracción del fondo. Los FcyR se inmovilizaron usando una concentración de 5 pg/ml en acetato de sodio pH 5 (ForteBio, 18-1069) y se inyectaron a una velocidad de flujo de 10 pl/min en ciclos de 15 segundos hasta que se alcanzó el nivel de inmovilización requerido.
Para FcyRI y FcyRIII de alta afinidad, se hicieron fluir 200 pg/ml de mAb o mAb2 simulado a través del chip durante 3 min a una velocidad de flujo de 30 pl/min y se siguió la disociación durante 5 min. El tampón de ejecución fue HBS-P (HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M, tensioactivo P20 al 0,005% v/v, GE Healthcare, b R-1003-68). Para FcYRIIa y FcYRIIb de baja afinidad, la concentración de mAb2 simulado se incrementó a 500 pg/ml.
El control positivo fue un mAb de isotipo IgG1 de tipo salvaje, que se comparó con los controles de mAb LALA IgG1 y mAb monoclonales de isotipo IgG2 e IgG4 con dianas irrelevantes. Las celdas de flujo se regeneraron inyectando hidróxido de sodio 10 mM (VWR, 28244.262) a una velocidad de flujo de 100 pl/min durante 30 segundos. El análisis de los datos se realizó con el software BiaEvaluation versión 3.2 RC1 haciendo doble referencia contra la celda de flujo en blanco (sin FcyR inmovilizado) y restando un ciclo de tampón del mAb2 de ensayo. Los resultados se muestran en la Tabla 7.
Tabla 7: Respuesta de unión de los Fcab anti-LAG-3 humano en formato mAb2 simulado (que comprende la mutación LALA como se detalla anteriormente) a receptores Fcy humanos por SPR
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Todos los mAb2 simulados ensayados (comprendiendo todos la mutación LALA como se ha mostrado anteriormente) mostraron una unión significativamente reducida a los receptores Fcy ensayados en comparación con el anticuerpo de control (mAb IgG 1 simulado) sin la mutación LALA, lo que indica que la mutación LALA ha reducido la unión al receptor Fcy por estos mAb2 simulados y, por lo tanto, se espera que reduzca la actividad ADCC del mAb2.
1.6 Bloqueo de la unión de MHC de clase II a LAG-3
La capacidad de los Fcab (que contienen la bisagra truncada; SEQ ID NO: 58) para bloquear la interacción entre el LAG-3 Fc recombinante humano o de ratón y el MHC de Clase II humano se estudió midiendo la unión de LAG-3 Fc a las células A375, una línea celular de melanoma que expresa MHC de Clase II humano. Las células A375 (ATCC, CRL-1619) cultivadas en DMEM (Life Technologies, 61965-026) que contenían FBS al 10% (Life Technologies, 10270­ 106) se despegaron de matraces de cultivo celular usando tampón de disociación celular (Life Technologies, 13151­ 014) y se sembraron en placas de 96 pocillos con fondo en V (Costar, 3897) a 2 x 105 células/pocillo. Las placas se centrifugaron a 1.500 rpm durante 3 min a 4 °C para sedimentar las células. Las concentraciones relevantes de Fcab o mAb de control se incubaron con 1 pg/ml de LAG-3 Fc (LAG-3-Fc humano R&D Systems, 2319-L3-050 o LAG-3 Fc de ratón R&D Systems, 3328-L3-050) en 100 pl de DMEM que contenía FBS al 10% durante 1 h a 4 °C. Se añadió una mezcla de LAG-3/Fcab a las células A375 y se incubó durante 1 h a 4 °C. Se lavaron las células. Se diluyó el anticuerpo secundario (F(ab')2 anti-Fc humano de cabra conjugado con Alexa Fluor 488, Jackson Immunoresearch, 109-546-098 o conjugado de IgG anti-ratón de cabra (H L) 488, Life Technologies, A-1101) 1:1.000 en PBS y se añadieron 100 pl a las células durante 30 min a 4 °C (las placas se mantuvieron en la oscuridad). Las células se lavaron una vez en PBS y se resuspendieron en 100 pl de PBS 1 pg/ml de DAPI (Biotium, 40043). Las placas se leyeron en un citómetro BD FACSCanto II (BD Biosciences) y los datos se analizaron usando el software FlowJo.
Ambos Fcab anti-LAG-3 de ratón fueron capaces de inhibir la interacción del MHC de clase II humano con LAG-3 de ratón, mientras que el mAb anti-LAG-3 ratón de control (C9B7W, 2B Scientific, BE0174-50MG) no lo fue (véase la Tabla 8).
Tabla 8: Los Fcab anti-LAG-3 de ratón subrogados inhiben la unión de LAG-3 de ratón al MHC de clase II
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Los Fcab anti-LAG-3 humano ensayados también fueron capaces de inhibir la interacción del MHC de clase II humano con LAG-3 humano con una potencia similar a la del mAb anti-LAG-3 humano de control (25F7).
Tabla 9: Los Fcab anti-LAG-3 humano inhiben la unión del LAG-3 humano al MHC de clase II
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Ejemplo 2: preparación y caracterización de moléculas de mAb y mAb2
2.1 Preparación del mAb 84G09
2.1.1 Generación de la construcción de ADN
Los insertos de ADN que codifican las regiones de cadena ligera y pesada variables de 84G09 fueron optimizados por codones para la expresión en mamíferos y sintetizados por DNA2.0 (Menlo Park, CA, EE. UU.). Los insertos suministrados en el vector huésped pJ-Amp-high se subclonaron en los vectores de expresión pFS-hHC2.1-G1 m17(z) LALA (cadena pesada de IgG que contiene la mutación LALA) o pFS-hHC2.1-G1m17(z) (cadena pesada de IgG sin mutación LALA) y pFShK1.0 (cadena ligera kappa de IgG) a través de digestión de restricción con EcoRI y Nhel.
La fidelidad de la clonación se verificó mediante PCR de colonias y posterior análisis de secuenciación de nucleótidos por un tercero (GATC Biotech).
2.1.2 Mantenimiento celular
Las células HEK293-6E (NRCC) se subcultivaron en medio F17 precalentado (Invitrogen, A13835-01) suplementado con 4 mM de GlutaMAX-1 (Invitrogen, 35050-038), 0,1% de Pluronic F-68 (Invitrogen A13835 -01) y 25 pg/ml de geneticina (Invitrogen, 10131-027). Las células se incubaron a 37 °C, 140 rpm, CO2 al 5% y se subcultivaron a 0,3 x 106 células/ml en un régimen de tres y después cuatro días.
2.1.3 Transfección transitoria
Las células HEK293-6E se transfectaron transitoriamente usando PEIpro a 1 mg/ml (Polyplus, PPLU115). 24 horas antes de la transfección, las células se sembraron a 0,8 x 106 células/ml en medio de cultivo. Por cada 200 ml de cultivo celular, se preparó una mezcla de ADN mezclando 10 ml de Opti-MEMI templado (Invitrogen, 11058-021), 100 pg de ADN libre de endotoxinas que codificaba la cadena pesada y 100 pg de ADN libre de endotoxinas que codificaba la cadena ligera. La mezcla de PEI se preparó mezclando 10 ml de Opti-MEMI templado y 200 pl de PEIpro y agitando con vórtex. La mezcla de ADN se añadió rápidamente a la mezcla de PEI agitada con vórtex, se mezcló con vórtex por pulsación 3 veces durante 1 s, se incubó 3 min a temperatura ambiente y se añadió gota a gota a las células. 48 horas después de la transfección, se añadieron a cada matraz 20 ml de F17 más suplementos con Triptona N1 al 0,5% (TekniScience Inc., 19553).
6 días después de la transfección, las células se recogieron mediante centrifugación a 4.500 rpm durante 40 min. A continuación, el sobrenadante se filtró con una unidad de filtro de poliétersulfona de 0,22 pm (Millipore, SCGPU01 RE, SCGPU02RE, SCGPU05RE, SCGPU11 RE) y se almacenó a 4 °C hasta la purificación.
2.1.4 Cromatografía en proteína A
Los sobrenadantes clarificados se purificaron usando columnas HiTrap MabSelect SuRe de 5 ml preempaquetadas (GE Healthcare, 11-0034-95) en un ÁKTAexplorer o ÁKTAxpress. Brevemente, las columnas se equilibraron con Tris-HCl 50 mM, NaCl 250 mM a pH 7,0, el material no unido se lavó con el mismo tampón a 5 ml/min. Los productos se eluyeron con formato de sodio 10 mM pH 3,0 a 5 ml/min. Las muestras eluidas se intercambiaron inmediatamente de tampón en PBS pH 7,4 usando columnas PD-10 (GE Healthcare, 17-0851-01) preequilibradas con PBS pH 7,4 según las recomendaciones del fabricante.
2.1.5 Medición de la concentración del producto por espectrometría
La absorbancia a 280 nm de cada producto purificado se midió usando LabChip DS (PerkinElmer, 133089) con DropPlate 96 D+ (PerkinElmer, CLS135136). La concentración del producto se calculó usando el coeficiente de extinción (A280 de 1 mg/ml) calculado usando el software VectorNTI Advance v11.5.4 (Thermofisher Scientific, A13784)
2.1.6 Concentración del producto
Cuando fue necesario, las fracciones purificadas se concentraron usando la Unidad de Filtro Centrífugo de 30K Amicon Ultra-4 (Millipore, UFC803024). Después de equilibrar la membrana de celulosa regenerada de Ultracel con PBS pH 7,4 mediante centrifugación 10 min a 3.000 rpm, las muestras se cargaron en la unidad de 4 ml y se centrifugaron a 3.000 rpm hasta que se alcanzó la concentración de proteína deseada.
2.1.6 Esterilización por filtración
Las muestras finales se filtraron usando filtros de jeringa de PVDF Millex-GV prehumedecidos (Millipore, SLGV013SL).
2.2 Preparación de mAb2 de LAG-3/PD-L1 humano
Las cadenas pesadas de las moléculas de mAb2 FS18-7-9/84G09 (SEQ ID NO 94 y 95), FS18-7-32/84G09 (SEQ ID NO 96 y 97), FS18-7-33/84G09 (SEQ ID NO 98 y 99), FS18-7-36/84G09 (SEQ ID NO 100 y 101), FS18-7-58/84G09 (SEQ ID NO 102 y 103), FS18-7-62/84G09 (SEQ ID NO 104 y 105), FS18-7-65/84G09 (SEQ ID NO 106 y 107), FS18-7-78/84G09 (SEQ ID NO 108 y 109), FS18-7-88/84G09 (SEQ ID NO 110 y 111) y FS18-7-95/84G09 (SEQ ID NO 112 y 113) se prepararon reemplazando los dominios CH3 de los anticuerpos monoclonales 84G09 (con y sin la mutación LALA) con los dominios CH3 de los Fcab específicos de LAG-3 humano FS18-7-9, FS18-7-32, FS18-7-33, FS18-7-36, FS18-7-58, FS18-7-62, FS18-7-65, FS18-7-78, FS18-7-88 y FS18-7-95 en los sitios de Xhol y BamHI presentes en la secuencia del dominio CH3 no modificado de IgG1 humana. La cadena pesada de los mAb2 se cotransfectaron con la cadena ligera de 84G09 (SEQ ID NO: 116) como se describe para el mAb 84G09 en la sección 2.1 anterior. Los mAb2 se expresaron y purificaron entonces como se describe para el mAb 84G09 en la sección 2.1 anterior.
2.3 Preparación de mAb2 de LAG-3/simulado humano
El mAb anti-FITC (con y sin mutación LALA) se preparó como se describe para el mAb 84G09 en la sección 2.1 anterior usando las cadenas pesadas (SEQ ID NO 83 y 84; con y sin mutación LALA) y cadena ligera (SEQ ID NO: 85) del mAb 4420.
Las cadenas pesadas de las moléculas de mAb2 FS18-7-9/4420 (SEQ ID NO 63 y 64), FS18-7-32/4420 (SEQ ID NO 65 y 66), FS18-7-33/4420 (SEQ ID NO 67 y 68, FS18-7-36/4420 (SEQ ID NO 69 y 70), FS18-7-58/4420 (SEQ ID NO 71 y 72), FS18-7-62/4420 (SEQ ID NO 73 y 74), FS18-7-65/4420 (SEQ ID NO 75 y 76), FS18-7-78/4420 (SEQ ID NO 77 y 78), FS18-7-88/4420 (SEQ ID NO 79 y 80) y FS18-7-95/4420 (SEQ ID NO 81 y 82) se prepararon reemplazando los dominios CH3 de los anticuerpos monoclonales 4420 (con y sin la mutación LALA) con los dominios CH3 de los Fcab específicos de LAG-3 humano FS18-7-9, FS18-7-32, FS18-7-33, FS18-7-36, FS18-7-58, FS18-7-62, FS18-7-65, FS18-7-78, FS18-7-88 y FS18-7-95 en los sitios de Xhol y BamHI presentes en la secuencia del dominio CH3 no modificado de IgG1 humana. Las cadenas pesadas de los mAb2 se cotransfectaron con la cadena ligera del mAb 4420 como se describe para el mAb 84G09 en la sección 2.1 anterior. Las proteínas se expresaron y purificaron entonces como se describe para el mAb 84G09 en la sección 2.1 anterior.
2.4 Preparación de mAb2 de LAG-3/PD-L1 de ratón
El mAb anti-PD-L1 de ratón (con y sin la mutación LALA) se preparó como se describe para el mAb 84G09 en la sección 2.1 anterior usando la cadena pesada (SEQ ID n O 122 y 123) y la cadena ligera (SEQ ID NO: 119) del mAb S1.
La cadena pesada de las moléculas de mAb2 FS18-7-108-29/S1 (SEQ ID NO 117 y 118) y FS18-7-108-35/S1 (SEQ ID NO 120 y 121) se prepararon reemplazando los dominios CH3 de los anticuerpos monoclonales S1 (con y sin la mutación LALA) con los dominios CH3 de los Fcab específicos de LAG-3 de ratón FS18-7-108-29 y FS18-7-108-35 en los sitios de Xhol y BamHI presentes en la secuencia del dominio CH3 no modificado de IgG 1 humana. La cadena pesada de los mAb2 se cotransfectaron con la cadena ligera de S1 como se describe para el mAb 84G09 en la sección 2.1 anterior. Las proteínas se expresaron y purificaron entonces como se describe para el mAb 84G09 en la sección 2.1 anterior.
2.5 Afinidad y cinética de unión de mAb2 para LAG-3 humano y PD-L1 humano
La proteína L (Thermo, 21189) se inmovilizó en las celdas de flujo 1 y 2 de un chip CM5 Serie S (GE Healthcare, BR-1005-30) mediante acoplamiento de amina (GE Healthcare, BR-1000-50) a una densidad de superficie de 2.000 RU siguiendo las instrucciones del fabricante del instrumento BIAcore T200. Para la unión de LAG-3, las muestras de mAb2 (conteniendo todas la mutación LALA) se capturaron solo en la celda de flujo 2 y se hizo fluir LAG-3Fc humano (R&D Systems, 2319-L3) a 4 concentraciones en una serie de dilución de dos veces empezando a 0,5 nM a través de la celda de flujo 1 y 2 a una velocidad de flujo de 30 pl/min. El tiempo de asociación fue de 3 min y el tiempo de disociación fue de 6 min. El tampón de ejecución fue HBS-P (GE Healthcare, BR-1003-68). Ambas celdas de flujo se regeneraron inyectando hidróxido de sodio (NaOH) 10 mM a una velocidad de flujo de 100 pl/min durante 20 segundos. Los datos se analizaron mediante doble referencia frente a la celda de flujo en blanco.
Para la unión de PD-L1, se hicieron fluir cuatro concentraciones en una serie de dilución de dos veces de PD-L1 Fc (R&D Systems, 156-B7), empezando a 40 nM, a través de mAb2 capturado en el mismo chip de proteína L. Todas las demás condiciones fueron las mismas que para la unión de LAG-3 (véase más arriba).
La cinética de unión se ajustó con un modelo de Langmuir 1:1 para generar tasas de asociación (ka) y disociación (kd) de la unión. Las constantes de unión en equilibrio (Kd) se calcularon dividiendo la tasa de disociación por la tasa de asociación para cada muestra. El análisis de los datos se realizó con el software BiaEvaluation versión 3.2. Los resultados se muestran en las Tablas 10 y 11.
Tabla 10: Afinidad y cinética de unión de mAb2 a LAG-3 humano determinadas por SPR
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Tabla 11: Afinidad y cinética de unión de mAb2 a PD-L1 humano determinadas por SPR
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Las afinidades de unión para PD-L1 humano y LAG-3 humano fueron comparables para todos los mAb2 ensayados. Las afinidades de unión de los mAb2 para PD-L1 humano fueron comparables a 84G09, lo que indica que la introducción del sitio de unión a LAG-3 en el dominio CH3 no afectó la unión a PD-L1.
2.6 Unión simultánea de mAb2 a LAG-3 humano y al PD-L1 humano
La capacidad de los mAb2 (FS18-7-09/84G09, FS18-7-32/84G09, FS18-7-33/84G09, FS18-7-36/84G09, FS18-7-62/84G09, FS18-7-65/84G09 y FS18-7-78/84G09 todos con la mutación LALA) para unirse simultáneamente a LAG-3 y PD-L1 se ensayó por SPR. Se inmovilizó PD-L1 Fc humano (R&D Systems, 156-B7) en la celda de flujo 2 de un chip CM5 Serie S (GE Healthcare, BR-1005-30) a una densidad de superficie de 150 RU siguiendo las instrucciones del fabricante. La celda de flujo 1 se activó y desactivó sin que se inmovilizara ninguna proteína para la sustracción de fondo. Para cada muestra, se hicieron fluir 10 pg/ml de mAb2 a través de las celdas de flujo 1 y 2, a una velocidad de flujo de 10 pl/min durante 3 min. Posteriormente, se hizo fluir 40 nM de LAG-3Fc (R&D Systems, 2319-L3) a través de ambas celdas de flujo 1 y 2 a una velocidad de flujo de 10 pl/min durante 3 min. Para cada etapa de unión, se siguió la disociación durante 3 min. El chip sensor se regeneró después de cada ciclo con una inyección de 15 s de NaOH 25 mM a una velocidad de flujo de 100 pl/min.
Todos los mAb2 ensayados fueron capaces de unirse simultáneamente a LAG-3 y PD-L1. El mAb anti-PD-L1 parental, 84G09, solo se une a PD-L1.
2.7. Unión simultánea de mAb2 subrogado a LAG-3 murino y PD-L1 murino
La capacidad de los dos mAb2 de ratón subrogados (FS18-7-108-29/S1 y FS18-7-108-35/S1, ambos contienen la mutación LALA) para unirse simultáneamente a LAG-3 murino y PD-L1 murino se ensayó por SPR en un BIAcore 3000 (GE Healthcare). Se inmovilizó PD-L1 Fc murino (R&D Systems, 1019-B7-100) en la celda de flujo 4 de un chip CM5 a una densidad de superficie de 830 RU según las instrucciones del fabricante. La celda de flujo 3 se inmovilizó con 820 RU de Fc humano (R&D system, 110-HG) para la sustracción del fondo. Para cada muestra, se hizo fluir 50 nM de mAb2 a través de las celdas de flujo 1 y 2, a una velocidad de flujo de 20 pl/min durante 150 segundos. Posteriormente, se hizo fluir 50 nM de LAG-3Fc murino (R&D Systems, 3328-L3-050) a través de ambas celdas de flujo 3 y 4 a una velocidad de flujo de 20 pl/min durante 150 segundos. Para cada etapa de unión, se siguió la disociación durante 3 min. El chip sensor se regeneró después de cada ciclo con 2 x 10 pl de NaOH 50 mM. Ambos mAb2 ensayados fueron capaces de unirse simultáneamente a LAG-3 murino y PD-L1 murino y, por lo tanto, son subrogados adecuados para el mAb2 LAG-3/PD-L1 humano.
2.8 Unión a receptores de Fcy humanos por mAb2 que comprenden la mutación LALA
Los receptores de Fcy humanos se inmovilizaron en un chip CM5 a una densidad de superficie de aproximadamente 200 RU para Fcy RI (R&D Systems, 1257-FC) y Fcy RlIIa (R&D Systems, 4325-FC) y aproximadamente 500 RU para Fcy RIIa (R&D Systems, 1330-CD) y Fcy RIIb/c (R&D Systems, 1875-CD), según las instrucciones del fabricante para el instrumento BIAcore3000. Para Fcy RI y Fcy RIIIa, se hicieron fluir 100 pg/ml de mAb o mAb2 a través del chip durante 3 min a una velocidad de flujo 10 pl/min y se siguió la disociación durante 5 min. El tampón de ejecución fue PBS (Lonza, BE17-516F) tensioactivo p20 al 0,05% (v/v) (GE Healthcare, BR-1000-54). El control positivo fue IgG1 4420-mAb de tipo salvaje. Se incluyeron como puntos de referencia mAb monoclonales IgG2 e IgG4 para dianas irrelevantes (20H4 y MOR7490) e IgG1 de ratón (Sigma, P5305). No se requirió regeneración debido a las rápidas tasas de disociación de los complejos de unión. Para Fcy RIIa y Fcy RIIb/c el ensayo de la concentración de mAb2 se incrementó hasta 500 pg/ml para compensar la unión más débil a estos dos receptores. Los resultados se muestran en la Tabla 12.
Tabla 12: Respuesta de unión de mAb2 anti-LAG-3/PD-L1 a los receptores de Fcy humanos determinada por SPR
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Como era de esperar, la variante LALA introducida en el mAb o mAb2 reduce la capacidad de estas moléculas para unirse a los receptores de Fcy humanos.
2.9 Unión de mAb2 a las células que expresan LAG-3 humano y de cinomolgo
La secuencia de LAG-3 humano (SEQ ID NO: 126) o la secuencia de LAG-3 de cinomolgo (SEQ ID NO: 128) se subclonaron en el vector pcDNA5FRT (Life Technologies, V6010-20) usando la digestión por restricción con Kpnl (NEB, R0142) y Notl (NEB, R0146). A continuación, el vector se transformó en la línea celular Flp-In T-REx 293 HEK (Life Technologies, R780-07) usando Lipofectamine 2000 (Life Technologies, 11668-019). Se cultivaron células Flp-In T-REx 293 transformadas en DMEM (Life Technologies, 61965-026) que contenía FBS al 10% (Life Technologies, 10270-1-6), 100 pg/ml de higromicina B (Melford Laboratories Ltd, Z2475), 15 pg/ml de blasticidina (Melford Laboratories Ltd, B1105) durante 3-4 semanas hasta que fueron aparentes colonias de células transformadas de forma estable. Estas colonias se amplificaron en presencia de 1 pg/ml de Doxiciclina (Sigma, D9891) y se ensayaron para determinar la expresión de LAG-3 mediante citometría de flujo.
La afinidad de los mAb2 (todos contienen la mutación LALA) para LAG-3 humano o de cinomolgo expresado en células se determinó usando citometría de flujo. Las células HEK que expresaban LAG-3 humano o de cinomolgo cultivadas en DMEM (Life Technologies, 61965-026) que contenía FBS al 10% (Life Technologies, 10270-1-6), 100 pg/ml de higromicina B (Melford Laboratories Ltd, Z2475), 15 pg/ml de blasticidina (Melford Laboratories Ltd, B1105) y 1 pg/ml de doxiciclina (Sigma, D9891) se despegaron de matraces de cultivo de tejidos usando tampón de disociación celular (Life Technologies, 13151-014) y se sembraron en placas de 96 pocillos con fondo en V (Costar, 3897) a 2 x 105 células/pocillo. Las placas se centrifugaron a 1.500 rpm durante 3 min a 4 °C para sedimentar las células. Una serie de diluciones del mAb2 (o mAb de control) se incubaron con las células en un volumen de 100 pl durante 1 h a 4 °C. Las placas se lavaron y el anticuerpo secundario (Anti-Fc humano-488, Jackson ImmunoResearch, 109-546-098) se diluyó 1:1.000 en PBS y se añadieron 100 pl a las células durante 30 min a 4 °C (las placas se mantuvieron en la oscuridad). Las placas se lavaron y luego las células se resuspendieron en 100 pl de PBS que contenía 1 pg/ml de DAPI (Biotium, 40043). Las placas se leyeron usando un citómetro de flujo Canto II (BD Bioscience). Se excluyeron las células muertas y se midió la fluorescencia en el canal FITC (488 nm/530/30). Los datos se ajustaron usando log (agonista) frente a respuesta en el Software GraphPad Prism. Las placas se leyeron en un citómetro BD FACSCanto II (BD Biosciences) y los datos se analizaron usando FlowJo. Los resultados se muestran en la Tabla 13.
Tabla 13: Afinidad de unión de mAb2 anti-LAG-3/PD-L1 a células HEK que expresan LAG-3 humano o de cinomolgo determinada por citometría de flujo
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Los resultados confirman la unión de mAb2 a LAG-3 humano y de cinomolgo expresados en células HEK. Respecto a los valores calculados de CE50, los mAb2 ensayados muestran una unión mejor o igual al LAG-3 humano y al menos una unión dos veces mejor al LAG-3 de cinomolgo en comparación con el anticuerpo anti-LAG-3 de control 25F7. No se observó reactividad cruzada con otras proteínas expresadas en la superficie de la línea celular HEK.
2.10 Unión de mAb2 a las células que expresan PD-L1 humano y de cinomolgo
La secuencia de PD-L1 humano (SEQ ID NO: 129) o la secuencia de PD-L1 de cinomolgo (SEQ ID NO: 131) se subclonaron en el vector pcDNA5FRT (Life Technologies, V6010-20) usando la digestión por restricción con Kpnl (NEB, R0142) y Notl (NEB , R0146). A continuación, el vector se transformó en la línea celular Flp-In T-REx 293 HEK (Life Technologies, R780-07) usando Lipofectamine 2000 (Life Technologies, 11668-019). Se cultivaron células Flp-In T-REx 293 transformadas en DMEM (Life Technologies, 61965-026) que contenía FBS al 10% (Life Technologies, 10270-1-6), 100 pg/ml de higromicina B (Melford Laboratories Ltd, Z2475), 15 pg/ml de blasticidina (Melford Laboratories Ltd, B1105) durante 3-4 semanas hasta que fueron aparentes colonias de células transformadas de forma estable. Estas colonias se amplificaron en presencia de 1 pg/ml de Doxiciclina (Sigma, D9891) y la expresión de LAG-3 se confirmó mediante citometría de flujo.
La afinidad de la unión de los mAb2 (todos contienen la mutación LALA) a PD-L1 humano de cinomolgo expresados en células o al parental (células no transformadas) se determinó usando citometría de flujo. Las células HEK que expresaban PD-L1 humano de cinomolgo cultivadas en DMEM (Life Technologies, 61965-026) que contenía FBS al 10% (Life Technologies, 10270-1-6), 100 pg/ml de higromicina B (Melford Laboratories Ltd, Z2475), 15 pg/ml de blasticidina (Melford Laboratories Ltd, B1105) y 1 pg/ml de doxiciclina (Sigma, D9891) se despegaron de matraces de cultivo de tejidos usando tampón de disociación celular (Life Technologies, 13151-014) y se sembraron en placas de 96 pocillos con fondo en V (Costar, 3897) a 2 x 105 células/pocillo. Las placas se centrifugaron a 1.500 rpm durante 3 min a 4 °C para sedimentar las células. Una serie de diluciones del mAb2 (o mAb de control) se incubó con las células en un volumen de 100 pl durante 1 h a 4 °C. Las placas se lavaron y el anticuerpo secundario (Anti-Fc humano-488, Jackson ImmunoResearch, 109-546-098) se diluyó 1:1.000 en PBS y se añadieron 100 pl a las células durante 30 min a 4 °C (las placas se mantuvieron en la oscuridad). Las placas se lavaron y luego las células se resuspendieron en 100 pl de PBS que contenía 1 pg/ml de DAPI (Biotium, 40043). Las placas se leyeron usando un citómetro de flujo Canto II (BD Bioscience). Se excluyeron las células muertas y se midió la fluorescencia en el canal FITC (488 nm/530/30). Los datos se ajustaron usando log (agonista) frente a respuesta en el Software GraphPad Prism. Las placas se leyeron en un citómetro BD FACSCanto II (BD Biosciences) y los datos se analizaron usando FlowJo. Los resultados se muestran en la Tabla 14.
Tabla 14: Afinidad de unión de mAb2 anti-LAG-3/PD-L1 a las células HEK que expresan PD-L1 humano o de cinomolgo medida por citometría de flujo
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Todos los mAb2 LAG-3/PD-L1 ensayados se unieron a PD-L1 humano y PD-L1 de cino con una CE50 cercana al del mAb 84G09, lo que demuestra que la afinidad de unión a PD-L1 no se vio afectada por la introducción del sitio de unión a LAG-3 en el dominio CH3 del mAb2.
2.11 Unión de mAb2 de ratón subrogado a las células que expresan LAG-3 de ratón o PD-L1 de ratón
La secuencia de LAG-3 murino (SEQ ID NO: 127) o la secuencia de PD-L1 murino (SEQ ID NO: 130) se subclonaron en el vector pcDNA5FRT (Life Technologies, V6010-20) usando digestión por restricción con Kpnl (NEB, R0142) y Notl (NEB, R0146). A continuación, el vector se transformó en la línea celular Flp-In T-REx 293 HEK (Life Technologies, R780-07) usando Lipofectamine 2000 (Life Technologies, 11668-019). Se cultivaron células Flp-In T-REx 293 transformadas en d Me M (Life Technologies, 61965-026) que contenía Fb S al 10% (Life Technologies, 10270-1-6), 100 gg/ml de higromicina B (Melford Laboratories Ltd, Z2475), 15 gg/ml de blasticidina (Melford Laboratories Ltd, B1105) durante 3-4 semanas hasta que fueron aparentes colonias de células transformadas de forma estable. Estas colonias se amplificaron en presencia de 1 gg/ml de Doxiciclina (Sigma, D9891) y la expresión de LAG-3 o PD-L1 se confirmó mediante citometría de flujo.
La afinidad de la unión de los mAb2 (todos contienen las mutaciones LALA) a LAG-3 murino o PD-L1 murino expresados en células se determinó usando citometría de flujo. Las células HEK que expresaban LAG-3 murino o PD-L1 murino cultivadas en DMEM (Life Technologies, 61965-026) que contenía FBS al 10% (Life Technologies, 10270­ 1-6), 100 gg/ml de higromicina B (Melford Laboratories Ltd, Z2475), 15 gg/ml de blasticidina (Melford Laboratories Ltd, B1105) y 1 gg/ml de doxiciclina (Sigma, D9891) se despegaron de matraces de cultivo de tejidos usando tampón de disociación celular (Life Technologies, 13151-014) y se sembraron en placas de 96 pocillos con fondo en V (Costar, 3897) a 2 x 105 células/pocillo. Las placas se centrifugaron a 1.500 rpm durante 3 min a 4 °C para sedimentar las células. Una serie de diluciones del mAb2 (o mAb de control) se incubaron con las células en un volumen de 60 gl durante 1 h a 4 °C. Las placas se lavaron y el anticuerpo secundario (Anti-Fc humano-488, Jackson ImmunoResearch, 109-546-098 para mAb2 o IgG anti-rata (H L), Alexa Fluor 488, ThermoFisher, A-11006 para el anti-LAG-3 control, C9B7W) se diluyó 1:1.000 en PBS y se añadieron 50 gl a las células durante 30 min a 4 °C (las placas se mantuvieron en la oscuridad). Las placas se lavaron y luego las células se resuspendieron en 50 gl de FACS Cell Fix (BD Bioscience, 340181) durante 15 minutos, luego se lavaron y se resuspendieron en 100 gl de PBS que contenía 1 gg/ml de DAPI (Biotium, 40043). Las placas se leyeron usando un citómetro de flujo Canto II (BD Bioscience). Se excluyeron las células muertas y se midió la fluorescencia en el canal FITC (488 nm/530/30). Los datos se ajustaron usando log (agonista) frente a respuesta en el Software GraphPad Prism. Las placas se leyeron en un citómetro BD FACSCanto II (BD Biosciences) y los datos se analizaron usando FlowJo. Los resultados se muestran en la Tabla 15.
Tabla 15: Afinidad de unión de mAb2 anti-LAG-3/PD-L1 de ratón subrogado a células HEK que expresan LAG-3
murino o PD-L1 murino por citometría de flujo
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Los mAb2 subrogados fueron capaces de unirse a LAG-3 murino expresado en células y a PD-L1 murino expresado en células. La afinidad de unión del mAb2 subrogado a LAG-3 murino expresado en células es aproximadamente la misma que la afinidad del mAb2 anti-LAG-3/PD-L1 humano a LAG-3 humano (2,3-3,8 nM en comparación con 2,5­ 4,2 nM) y la afinidad de unión del mAb2 subrogado a PD-L1 murino expresado en células está dentro de 3 veces la afinidad del mAb2 anti-LAG-3/PD-L1 humano a PD-L1 humano (11,9-12,3 nM en comparación con 3,1-4,0 nM), lo que demuestra que estos mAb2 son subrogados adecuados del mAb2 anti-LAG-3/PD-L1 humano para su uso en estudios en ratones in vivo.
Ejemplo 3: Actividad de las moléculas de mAb2 en ensayos de activación de células T y un ensayo SEB
3.1 Ensayo de activación de células T
Se usó un ensayo de liberación de IL-2 basado en las líneas de células de hibridoma de linfocitos T DO11.10 OVA y linfocitos B LK35.2 para el cribado funcional del mAb2. La liberación de IL-2 es un marcador de la activación de las células T. Las células T, que expresan PD-1 murino endógeno, se transfectaron con un vector vacío (pLVX) o con la construcción de LAG-3 humano. Las células B se transfectaron con un vector vacío (pLVX) o una construcción de PD-L1 humano.
Se usaron tres combinaciones de estas cuatro líneas celulares en paralelo para ensayar la activación de las células T por el mAb2:
• DO11.10 pLVX LK35.2 hPD-L1 para actividad anti-PD-L1;
• DO11.10 hLAG-3 LK35.2 pLVX para actividad anti-LAG-3;
• DO11.10 hLAG-3 LK35.2 hPD-L1 para actividad anti-LAG-3/anti-PD-L1 simultánea.
Todos los mAb2 (todos contienen la mutación LALA) se ensayaron dos veces en este ensayo de activación de células T. La reactividad cruzada con LAG-3 y PD-L1 de cinomolgo se ensayó en un ensayo de activación de células T funcional usando células que sobreexpresan dianas de cinomolgo (cPD-L1 y cLAG-3).
Producción de líneas de células T que sobreexpresan LAG-3
Se usó la metodología de transducción lentiviral para generar células DO11.10 (National Jewish Health) que sobreexpresan LAG-3 humano, de cinomolgo o de ratón usando el sistema de empaquetamiento Lenti-X HTX (No. de Cat. 631249). El vector de expresión de Lenti-X (pLVX) (No. de Cat. 631253), que contiene el ADNc de LAG-3 de ratón (SEQ ID NO: 127), ADNc de LAG-3 humano (SEQ ID NO: 126) o ADNc de LAG-3 de cinomolgo (SEQ ID NO: 128), se cotransfectó con una mezcla de empaquetamiento Lenti-X HTX en la línea celular Lenti-X 293T (No. de Cat. 632180) para generar virus. La línea celular DO11.10 se transdujo usando los vectores lentivirales producidos con el sistema de empaquetamiento Lenti-X HTX.
Producción de células presentadoras de antígeno que sobreexpresan PD-L1
Se usó la metodología de transducción lentiviral para generar linfoma de células B LK35.2 (ATCC, HB-98) que sobreexpresa PD-L1 humano, de cinomolgo o de ratón usando el sistema de empaquetamiento Lenti-X HTX (No. de Cat. 631249). El vector de expresión de Lenti-X (pLVX) (No. de Cat. 631253), que contiene el ADNc de PD-L1 de ratón (SEQ ID NO: 130), ADNc de PD-L1 humano (s Eq ID NO: 129 o ADNc de PD-L1 de cinomolgo (SEQ ID NO: 131), se cotransfectó con una mezcla de empaquetamiento Lenti-X HTX en la línea celular Lenti-X 293T (No. de Cat. 632180) para generar virus. La línea celular LK35.2 se transdujo usando los vectores lentivirales producidos con el sistema de empaquetamiento Lenti-X HTX.
Medios y péptidos
Medio de cultivo celular: DMEM (Gibco, 61965-026) FBS al 10% (Gibco, 10270-106), piruvato de sodio 1 mM (Gibco, 11360-070), 1 Mg/ml de puromicina (Gibco, A11138-03)
Medio experimental: medio de cultivo DO11.10 completo sin puromicina.
Péptido OVA (PM = 1.773,9 Da): H-ISQAVHAAHAEINEAGR-OH (Pepscan)
Células:
• DO11.10 hLAG-3: hibridoma de células T DO11.10 transducido con un vector lentiviral para sobreexpresar LAG-3 humano;
• DO11.10 pLVX: hibridoma de células T DO11.10 transducido con un vector lentiviral vacío;
• DO11.10 cLAG-3: hibridoma de células T DO11.10 transducido con un vector lentiviral para sobreexpresar LAG-3 de cinomolgo.
• LK 35.2 hPD-L1: hibridoma de células B transducido con un vector lentiviral que contiene hPD-L1 para sobreexpresar PD-L1 humano;
• LK 35.2 PLVX: hibridoma de células B transducido con un vector lentiviral vacío (pLVX);
• LK 35.2 cPD-L1: hibridoma de células B transducido con un vector lentiviral para sobreexpresar PD-L1 de cinomolgo.
Las células DO11.10 (células DO11.10 pLVX o células DO11.10 hLAG-3) a 0,3 x 106 células/ml se mezclaron en una relación de 1:1 con anticuerpos a 3 x concentración final. Los anticuerpos y las células DO11.10 se incubaron a 37 °C, CO2 al 5% durante 1 hora. Las células LK 35.2 (tanto pLVX como PD-L1-pLVX) se incubaron a 3 x 105 células/ml de medio experimental con el péptido OVA a 1,5 mM durante 30 min. Se añadieron células LK 35.2 OVA a células DO11.10/mezcla de tratamiento en una relación de 1:2 en las siguientes combinaciones:
Cribado funcional humano
DO11.10 pLVX LK35.2 hPD-L1,
DO11.10 hLAG-3 LK35.2 pLVX,
DO11.10 hLAG-3 LK35.2 hPD-L1;
Pantalla de reactividad cruzada de cinomolgo
DO11.10 pLVX LK35.2 cPD-L1,
DO11.10 cLAG-3 LK35.2 pLVX,
DO11.10 cLAG-3 LK35.2 cPD-L1;
Las células se incubaron a 37 °C, CO2 al 5% durante 24 horas. Los sobrenadantes se recogieron y analizaron con el kit de ELISA de IL-2 de ratón (eBioscience, 88-7024-88 o R&D systems, SM2000) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las placas se leyeron a 450 nm usando el lector de placas con el software Gen5, BioTek. Los valores de absorbancia de 570 nm se restaron de los de 450 nm (Corrección). La curva estándar para el cálculo de la concentración de citoquinas se basó en el ajuste de la curva logístico de cuatro parámetros (Software Gen5, BioTek). Se representó gráficamente la concentración de mIL-2 frente al log de la concentración de Fcab o mAb y las curvas resultantes se ajustaron usando la ecuación log (agonista) frente a respuesta en GraphPad Prism. La Tabla 16 muestra los valores de CE50 y la liberación máxima de IL-2 del mAb2 y mAb de control, calculados como un porcentaje del control (84G09 25F7). Las Figuras 2A-F muestran gráficos representativos de la liberación de IL-2 por el panel de líneas celulares tratadas con FS18-7-9/84G09, FS18-7-62/84G09 o FS18-7-78/84G09 y controles. En el ensayo de activación de células T con ambas dianas presentes (DO11.10 hLAG-3 LK35.2 hPD-L1), la liberación de IL-2 solo se indujo cuando se inhibieron tanto LAG-3 como PD-L1, por ejemplo, cuando se usó el mAb2 o una combinación de anticuerpos de LAG-3 y PD-L1. Por lo tanto, el mAb2 tiene beneficio sobre un único agente solo. En los ensayos con solo La G-3 (DO11.10 hLAG-3 LK35.2 pvlx) o PD-L1 (DO11.10 pvlx LK35.2 PD-L1), el mAb2 mostró una actividad similar a la de los agentes únicos en la inhibición de estas dianas, lo que demuestra que el mAb2 es la única molécula que pudo conducir a la activación de las células T en presencia de LAG-3, PD-L1 o LAG-3 PD-L1.
Tabla 16: CE50 y liberación máxima de IL2 (calculada por el porcentaje de liberación de IL2 en comparación con el control - 84G09 25F7) para nueve mAb2
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Uno de los mAb2 (FS18-7-9/84G09 que contiene la mutación LALA) se ensayó para determinar la reactividad cruzada funcional con cinomolgo en el ensayo de activación de células T DO11.1-/LK35.2. Las Figuras 3 A-C muestran los resultados en el panel de tres ensayos basados en células. FS18-7-9/84G09 pudo inducir la activación de las células T en presencia de cLAG-3 cPD-L1 y cLAG-3 o cPD-L1 solo, lo que indica que los mAb2 tienen una reactividad cruzada funcional con cinomolgo y, por lo tanto, son adecuados para su uso en estudios de seguridad basados en primates.
3.2 Ensayo de enterotoxina B estafilococal
Se ensayaron tres mAb2 (todos contienen la mutación LALA) en el ensayo de enterotoxina B estafilococal basado en PBMC humanas (ensayo SEB). La enterotoxina B estafilococal es un superantígeno y se une a las moléculas del MHC de clase II en las células presentadoras de antígeno (APC) y a la cadena vp del receptor de células T (TCR), causando la activación inespecífica de las células T y la liberación de citoquinas. No es necesario que el antígeno esté presente para observar la activación de las células T. El ensayo SEB usa células humanas estimuladas (PBMC) con niveles fisiológicos de inhibidores de puntos de control, y se puede usar para confirmar que el mAb2 aumenta la activación de las células T en un sistema humano. Se ensayaron tres mAb2 en el sistema SEB con células procedentes de cuatro donantes diferentes.
Generación de células T expandidas
Las PMBC se aislaron de los conos de leucocitos mediante separación en gradiente de Ficoll. Las células T CD4+ se aislaron usando el kit de aislamiento de células T CD4+ humanas (Miltenyi Biotec Ltd, 130-096-533) según las instrucciones del fabricante. Se resuspendieron mediante agitación con vórtex Dynabeads CD3/CD28 activadores de células T humanas (Life Technologies, 11131D). Las perlas se transfirieron a un tubo estéril de 15 ml y se añadieron 10 ml de RPMI (Life Technologies, 61870044) con FBS al 10% (Life Technologies, 10270106) y 1x penicilina estreptomicina (Life Technologies, 15140122) para lavar las Dynabeads. Se descartó el sobrenadante. La cantidad requerida de células T CD4+ a 1,0 x 106 células/ml en RPMI con FBS al 10% y 1x disolución de penicilina estreptomicina y 50 UI/ml de IL2 humana recombinante (Peprotech, 200-02-50ug) con una relación de perlas a células de 3:1 se transfirió a un matraz T75 (Greiner Bio-one, 690195) y se incubó a 37 °C CO2 al 5%. Después de 3 días, las células se resuspendieron suavemente y se contaron. La densidad celular se mantuvo entre 0,8-1 x 106 células/ml añadiendo medio fresco (RPMI-FBS al 10% disolución de penicilina estreptomicina 1X 50 UI/ml de rhuIL2) según fue necesario. El día 7 u 8, se retiraron las perlas CD3/28 y las células T CD4+ se dejaron reposar toda la noche a 1 x 106 células/ml de medio fresco RPMI-FBS al 10% disolución de penicilina estreptomicina 1X con 10 UI/ml de rhuIL2 reducido. Las células se almacenaron congeladas hasta que se requirieron.
Generación de MoiDC
Se aislaron monocitos intactos de PBMC humanas usando el kit de aislamiento de monocitos generales humanos, (Miltenyi Biotec Ltd, 130-096-537) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los monocitos se diferenciaron a iDC utilizando medio de diferenciación de Mo-DC humano (Miltenyi Biotec Ltd, 130-094-812) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Ensayo SEB
Las células T expandidas se descongelaron un día antes del experimento, se lavaron con medio AIM (Gibco, 12055­ 091) y se incubaron a 37 °C, CO2 al 5% toda la noche a 1 x 106 células/ml en medio AIM. Se preparó una concentración de 2 pM de cada anticuerpo/mezcla en DPBS (Gibco, 14190-169) y se diluyó 1:10 en medio (30 pl 270 pl) para obtener 200 nM. En una placa de 96 pocillos, se llevaron a cabo diluciones en serie a 1:10 (30 pl 270 pl de medio experimental; concentración final 2x). Las MoiDC se descongelaron, se lavaron con medio AIM y se mezclaron con células T del mismo donante en una proporción de 1:10 (5 ml de iDC a 2 x 105 células/ml se combinaron con 5 ml de células T a 2 x 106 células/ml). Se añadieron 20 pl de SEB (Sigma, S4881) a 0,1 pg/ml a 10 ml de las células. En una placa de 96 pocillos de fondo redondo, se añadieron 100 pl de la mezcla de células/SEB a 100 pl de la dilución del anticuerpo, dando una proporción de 104 células iDC a 105 Células T con SEB 0,1 ng/ml en 200 pl de medio AIM por pocillo con concentraciones finales de anticuerpo de 100, 10, 1,0,1,0,01,0,001 nM. Las células se incubaron a 37 °C, CO2 al 5% durante 3 días. Los sobrenadantes se recogieron y analizaron inmediatamente con el kit de ELISA de IFNy humano (R&D Systems, PDIF50) o se congelaron a -20 °C para análisis adicionales. El ensayo se realizó según las instrucciones del fabricante del kit usando sobrenadantes diluidos 1:30 con PBA (DPBS, BSA al 2% (Sigma, A7906-100G)). Se representó gráficamente la concentración de IFNy humano frente al log de la concentración de mAb2 o mAb y las curvas resultantes se ajustaron usando la ecuación log (agonista) frente a respuesta en el software GraphPad Prism. La Tabla 17 muestra los valores de CE50 y el rango de la liberación de IFNy en el ensayo SEB con células de cuatro donantes de células diferentes (donantes A a D). La Figura 4 muestra un gráfico representativo del ensayo SEB con un solo donante. En los seis ensayos, el mAb2 de LAG-3/PD-L1 y la combinación del mAb2 de LAG-3/FITC 84G09LALA mostró una mayor activación que el mAb 84G09LALA solo, mientras que cuando se ensayaron el mAb2 de LAG-3/FITC o el mAb 4420, no mostraron una activación significativa. Por lo tanto, los resultados del ensayo SEB confirman los resultados del ensayo DO11.10/LK35.2 en un sistema más fisiológico.
Tabla 17. Valores de CE50 calculados para seis mAb2 basado en seis ensayos SEB con 4 donantes de células diferentes.
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Ejemplo 4: Actividad in vivo de las moléculas de mAb2 en modelos de tumores murinos
4.1 Actividad de las moléculas de mAb2 en un modelo de tumor MC38 no establecido
En este experimento se usó el modelo de tumor singénico MC38 ya que se sabe que los tumores MC38 expresan PD-L1 en su superficie celular y son altamente inmunogénicos, lo que da como resultado un incremento de la expresión de LAG-3 en las células inmunes en el tumor y la periferia del tumor.
El mAb2 de ratón subrogado FS18-7-108-29/S1 que contiene la mutación LALA (SEQ ID NO: 117 y 119) referido como FS18-29/S1 se ensayó para determinar su actividad in vivo usando un modelo de crecimiento tumoral de ratón singénico MC38. La capacidad del mAb2 para inhibir el crecimiento tumoral se comparó con el del mAb2 LAG-3/simulado, FS18-7-108-29/4420 que contiene la mutación LALA (SEQ ID NO: 132 y 85) referido como FS18-29/4420, el mAb anti-LAG-3 de referencia C9B7W (2B Scientific; Número de Catálogo BE0174-50MG ), el mAb S1 anti-PD-L1 de referencia que contiene la mutación LALA (SEQ ID NO: 122 y 119) y una combinación de los mAb C9B7W y S1.
Se dejaron en reposo ratones hembra C57BL/6 (Charles River) de 8-10 semanas de edad y con un peso de 20-25 g cada uno, durante una semana antes del inicio del estudio. A todos los animales se les puso un microchip y se les proporcionó un identificador único. Cada cohorte tenía 10 ratones. La línea celular de carcinoma de colon MC38 (S. Rosenberg, NIH) fue inicialmente expandida, almacenada y luego precribada por IDEXX Bioresearch para patógenos usando el protocolo IMPACT I y se mostró que carecía de patógenos. Las células MC38 se descongelaron del almacenamiento a -150 °C y se añadieron a 20 ml de DMEM (Gibco, 61965-026) con FCS al 10% (Gibco, 10270-106) en un matraz de cultivo de tejidos T175. Los ratones se anestesiaron usando isoflurano (Abbott Laboratories) y cada animal recibió 2 x 106 células inyectadas por ruta subcutánea en el flanco izquierdo. 7-8 días después de la inoculación de las células tumorales, los ratones que no tenían tumores en este punto se retiraron del estudio.
Todas las moléculas de mAb2 y los anticuerpos de control se analizaron dentro de las 24 horas previas a la inyección mediante perfil SEC-HPLC y se comprobaron las impurezas. Los anticuerpos se prepararon a una concentración final de 10 mg/kg en PBS y se combinaron con un segundo anticuerpo en los estudios de combinación. Las moléculas de mAb2 y los anticuerpos de control se administraron a los ratones mediante inyección intraperitoneal (IP) los días 8, 11 y 14 después de la inoculación del tumor. Se tomaron mediciones precisas de los tumores, se realizó cualquier dosificación de fármaco debida el día en cuestión y se sometió a los ratones a una estrecha observación durante el resto del ensayo. Se tomaron mediciones del volumen del tumor con calibradores para determinar el eje más largo y el eje más corto del tumor. Se usó la siguiente fórmula para calcular el volumen del tumor:
Figure imgf000037_0001
Donde L = eje más largo; S = eje más corto
El ensayo se detuvo el día 20 cuando la carga tumoral se consideró cercana a las restricciones. Todos los ratones se sacrificaron humanitariamente y los tumores se extirparon y pesaron.
Los resultados se muestran en las Figuras 5 y 6. Los ratones tratados con mAb2 de LAG-3/PD-L1 (FS18-29/S1) tenían tumores terminales con pesos significativamente más pequeños que los tratados con una combinación de mAb de referencia, C9B7W y S1. Específicamente, el análisis estadístico de los pesos de los tumores terminales se realizó usando una prueba de la t de Student de dos colas dentro del paquete de software GraphPad Prism que demuestra una diferencia estadísticamente significativa entre la administración de FS18-29/S1 y la administración de la combinación de anticuerpos de referencia C9B7W y S1 (p = 0,0125), lo que indica que la inhibición de LAG-3 y PD-L1 proporcionada por la misma molécula dio como resultado un efecto sinérgico sobre los pesos de los tumores terminales en comparación con la inhibición de LAG-3 y PD-L1 proporcionada por moléculas separadas.
El mAb2 subrogado FS18-29/S1 también tuvo un efecto marcado sobre el crecimiento tumoral previniendo el establecimiento en 6 de 8 tumores MC38 en crecimiento y ralentizando el crecimiento de los 2 restantes. La administración de los anticuerpos anti-LAG-3 y PD-L1 de referencia en combinación ralentizó el crecimiento tumoral en 7 animales sin que ningún animal estuviera libre de tumor.
FS18-29/4420 solo no tuvo un efecto marcado sobre el crecimiento tumoral, lo que indica que, para una eficacia máxima, el mAb2 requiere el Fab anti-PD-L1. El anticuerpo de referencia anti-LAG-3 de ratón solo tuvo poco o ningún efecto sobre el crecimiento tumoral resultante, mientras que el anti-PD-L1 de ratón de referencia impidió el establecimiento de 1 de 7 tumores en esta cohorte y tuvo algún efecto global de ralentización del crecimiento tumoral.
Los modelos de ratón singénicos se aceptan como sistemas murinos apropiados para ensayar el efecto antitumoral de la inhibición de dianas terapéuticas y se han usado ampliamente para validar el desarrollo de agentes terapéuticos humanos.
4.2 Actividad de las moléculas de mAb2 en un modelo de tumor MC38 establecido
El mAb2 de ratón subrogado FS18-7-108-29/S1 que contiene la mutación LALA, (SEQ ID NO: 117 y 119) referido como FS18-29/S1, se ensayó para determinar la actividad in vivo en un modelo de crecimiento tumoral de ratón singénico MC38. La capacidad del mAb2 para inhibir el crecimiento tumoral se comparó con la del mAb2 LAG-3/simulado, FS18-7-108-29/4420 que contiene la mutación LALA (SEQ ID NO: 132 y 85), referido como FS18-29/4420, el mAb de LAG-3 de referencia C9B7W, el mAb S1 de PD-L1 de referencia que contiene el Mutación LALA (SEQ ID NO: 122 y 119) y una combinación de C9B7W y S1.
Se dejaron en reposo ratones hembra C57BL/6 (Charles River) de 8-10 semanas de edad y con un peso de 20-25 g cada uno, durante una semana antes del inicio del estudio. A todos los animales se les puso un microchip y se les proporcionó un identificador único. Cada cohorte tenía 10 ratones. La línea celular de carcinoma de colon MC38 (S. Rosenberg, NIH) fue inicialmente expandida, almacenada y luego precribada por IDEXX Bioresearch para patógenos usando el protocolo IMPACT I y se mostró que carecía de patógenos. Las células MC38 (aproximadamente 3-5 x 106) se descongelaron del almacenamiento a -150 °C y se añadieron a 20 ml de DMEM (Gibco, 61965-026) con FCS al 10% (Gibco, 10270-106) en un matraz de cultivo de tejidos T175. Los ratones se anestesiaron usando isoflurano (Abbott Laboratories) y se inyectaron 2 x 106 células en 100 gl por ruta subcutánea en el flanco izquierdo de cada ratón. 7-8 días después de la inoculación de las células tumorales, los ratones se monitorizaron de forma rutinaria para determinar la salud y el crecimiento del tumor apropiado para el inicio del estudio. Cuando la mayoría de los ratones presentó tumores de 5-10 mm de diámetro, se clasificaron y aleatorizaron nuevamente a las cohortes de estudio. Todos los ratones que no tuvieran tumores de tamaño apropiado en este punto se retiraron del estudio.
Todas las moléculas de mAb2 y los anticuerpos de control se analizaron dentro de las 24 horas previas a la inyección mediante perfil SEC-HPLC y se comprobaron las impurezas. Los anticuerpos se prepararon a una concentración final de 10 mg/kg en PBS y se combinaron con el segundo anticuerpo para los estudios de combinación. Las moléculas de mAb2 y los anticuerpos de control se administraron a los ratones los días 15, 18 y 21 después de la inoculación del tumor mediante inyección IP. Se cribaron los animales en cuanto a salud bajo anestesia tres veces a la semana de forma ciega, tiempo durante el cual se tomaron mediciones precisas de los tumores. Se tomaron mediciones del volumen del tumor con calibradores para determinar el eje más largo y el eje más corto del tumor. La fórmula usada para calcular el volumen del tumor fue la mostrada en la sección 4.1 anterior.
El ensayo se detuvo el día 24 cuando la carga tumoral se consideró cercana a las restricciones. Todos los ratones se sacrificaron humanitariamente y los tumores se extirparon y pesaron. Los resultados se muestran en las Figuras 7 y 8.
El control efectivo o la supresión del crecimiento tumoral en modelos de tumores singénicos en ratones se logra mejor mediante la intervención terapéutica en puntos de tiempo tempranos (volúmenes tumorales iniciales de menos de 40 mm3). Cuanto más tarde se administra la intervención, más difícil es observar efectos positivos con respecto al crecimiento tumoral, aunque quizás esto sea más parecido a la situación en el entorno clínico humano.
FS18-29/S1 tuvo un efecto positivo tanto en la supresión del crecimiento tumoral como en la prevención del establecimiento del carcinoma de colon MC38 en ratones inmunocompetentes cuando se administró en puntos de tiempo tempranos en ratones C57BL/6. Cuando se administra en puntos de tiempo posteriores (volúmenes tumorales iniciales de 50-125 mm3), FS18-29/S1 fue tan eficaz en la supresión del crecimiento tumoral como la combinación de anticuerpos de referencia. FS18-29/4420 solo no tuvo un impacto notable sobre el crecimiento tumoral y S1 y C9B7W tuvieron ambos un efecto leve sobre el crecimiento tumoral resultante.
4.3 Actividad de las moléculas de mAb2 en un modelo de tumor CT26 no establecido
En este experimento se usó el modelo de tumor singénico CT26 ya que se sabe que los tumores CT26 expresan PD-L1 en su superficie celular y son altamente inmunogénicos, lo que da como resultado un incremento de la expresión de LAG-3 en las células inmunes en el tumor y la periferia.
El mAb2 de ratón subrogado FS18-7-108-29/S1 que contiene la mutación LALA (SEQ ID NO: 117 y 119), referido como FS18-29/S1, y FS18-7-108-35/S1 que contiene la mutación LALA (SEQ ID NO: 120 y 119), referido como FS18-35/S1, se ensayaron para determinar la actividad in vivo en un modelo de crecimiento tumoral de ratón singénico CT26. La capacidad del mAb2 para inhibir el crecimiento tumoral se comparó con la del mAb2 LAG-3/simulado, FS18-7-108-29/4420 que contiene la mutación LALA (SEQ ID NO: 132 y 85), referido como FS18-29/4420, y FS18-7-108-35/4420 que contiene la mutación LALA (SEQ ID NO: 133 y 85), referido como FS18-35/4420, el mAb de LAG-3 de referencia C9B7W, el mAb de PD-L1 de referencia S1 que contiene la mutación LALA (SEQ ID NO: 122 y 119) y una combinación de C9B7W y S1.
Se dejaron en reposo ratones hembra BALB/c (Charles River) de 8-10 semanas de edad y con un peso de 20-25 g cada uno, durante una semana antes del inicio del estudio. A todos los animales se les puso un microchip y se les proporcionó un identificador único. Cada cohorte tenía 10 ratones. La línea celular de carcinoma de colon CT26 (ATCC, CRL-2638) fue inicialmente expandida, almacenada y luego precribada por IDEXX Bioresearch para patógenos usando el protocolo IMPACT I y se mostró que carecía de patógenos. Las células CT26 (aproximadamente 3-5 x 106) se descongelaron de un almacenamiento a -150 °C y se añadieron a 20 ml de DMEM (Gibco, 61965-026) con FCS al 10% (Gibco, 10270-106) en un matraz de cultivo de tejidos T175. 7-8 días después de la inoculación de las células tumorales, los ratones se monitorizaron de forma rutinaria para determinar la salud y el crecimiento del tumor apropiado para el inicio del estudio. Cuando la mayoría de los ratones presentaban tumores con un diámetro de 3-5 mm3, se clasificaron y aleatorizaron nuevamente en cohortes de estudio. Todos los ratones que no tenían tumores en este momento se retiraron del estudio.
Todas las moléculas de mAb2 y los anticuerpos de control se analizaron dentro de las 24 horas posteriores a la inyección mediante perfiles de SEC-HPLC y se verificaron las impurezas. Los anticuerpos se prepararon a una concentración final de 10 mg/kg en PBS y se combinaron con un segundo anticuerpo en los estudios de combinación. Las moléculas de mAb2 y los anticuerpos de control se administraron a los ratones los días 8, 11 y 14 después de la inoculación del tumor. Se cribaron los animales en cuanto a salud, tiempo durante el cual se tomaron mediciones precisas de los tumores. Se tomaron mediciones del volumen del tumor con calibradores para determinar el eje más largo y el eje más corto del tumor. La fórmula usada para calcular el volumen del tumor fue la mostrada en la sección 4.1 anterior:
El ensayo se detuvo el día 20 cuando la carga tumoral se consideró cercana a las restricciones. Todos los ratones se sacrificaron humanitariamente y los tumores se extirparon y pesaron. Los resultados se muestran en las Figuras 9 y 10.
El análisis estadístico de los pesos de los tumores finales se realizó usando una prueba de la t de Student de dos colas dentro del paquete de software GraphPad Prism. El análisis estadístico de las curvas de crecimiento tumoral se determinó usando la función de comparación de curvas de crecimiento del paquete de modelado estadístico, statmod (Elso et al., 2004 y Baldwin et al., 2007), disponible en el Proyecto R de Computación Estadística.
Hubo una diferencia estadísticamente significativa demostrada entre el mAb2 FS18-35/S1 y el control de IgG (crecimiento normal) en la supresión del crecimiento tumoral. Dicha diferencia estadísticamente significativa no se observó ni con la combinación de anticuerpos de referencia ni con el mAb2 FS18-29/S1 frente al grupo de control de IgG, o frente a cualquier otra cohorte en este ensayo.
El modelo de tumor CT26 es un modelo de tumor agresivo, de crecimiento rápido, que es inherentemente propenso a que los ratones desarrollen metástasis intestinales y, como resultado, tiene una ventana terapéutica muy limitada.
Sorprendentemente, la combinación de los anticuerpos de referencia de LAG-3 y PD-L1 no suprimió significativamente el crecimiento tumoral en comparación con la cohorte de control de IgG. Sin embargo, la cohorte tratada con FS18-35/S1 reveló una supresión significativa del crecimiento en comparación con el control de IgG. FS18-29/S1, aunque suprimió el crecimiento tumoral también en comparación con el control de IgG, no fue estadísticamente significativo. Este ensayo muestra un segundo modelo de tumor en el que el mAb2 de LAG-3/PD-L1 reactivo de ratón ha demostrado un efecto positivo en la ralentización del crecimiento tumoral al menos en el mismo grado que la administración de una combinación de anticuerpos monoclonales de referencia.
4.4 Efecto de la mutación LALA sobre la inhibición del crecimiento tumoral en el modelo de tumor MC38 no establecido
Se ensayaron dos mAb2 (FS18-7-108-29/S1 LALA y FS18-7-108-29/S1) para examinar las posibles diferencias en la actividad antitumoral de estos mAb2 con y sin la mutación LALA en la región Fc. El mAb2 de ratón subrogado FS18-7-108-29/S1 referido como FS18-29/S1 con (SEQ ID NO: 117 y 119) y sin la mutación LALA (SEQ ID NO: 118 y 119) se ensayaron para determinar la actividad in vivo usando un modelo de crecimiento tumoral de ratón singénico MC38. La capacidad del mAb2 para inhibir el crecimiento tumoral se comparó con la del mAb2 LAG-3/simulado, FS18-7-108-29/4420 con (SEQ ID NO: 132 y 85) y sin la mutación LALA (SeQ ID NO: 134 y 85) referido como FS18-29/4420LALA y FS18-29/4420 y una combinación del mAb2 LAG-3/simulado con y sin mutación LALA con el mAb S1 de PD-L1 de referencia con (SEQ ID NO: 122 y 119) y sin la mutación LALA (SeQ ID NO: 123 y 119).
Se dejaron en reposo ratones hembra C57BL/6 (Charles River) de 8-10 semanas de edad y con un peso de 20-25 g cada uno, durante una semana antes del inicio del estudio. A todos los animales se les puso un microchip y se les proporcionó un identificador único. Cada cohorte tenía 10 ratones. La línea celular de carcinoma de colon MC38 (S. Rosenberg, NIH) fue inicialmente expandida, almacenada y luego precribada por IDEXX Bioresearch para patógenos usando el protocolo IMPACT I y se mostró que carecía de patógenos. Las células MC38 (aproximadamente 3-5 x 106) se descongelaron del almacenamiento a -150 °C y se añadieron a 20 ml de DMEM (Gibco, 61965-026) con FCS al 10% (Gibco, 10270-106) en un matraz de cultivo de tejidos T175. Los ratones se anestesiaron usando isoflurano (Abbott Laboratories) y se inyectaron 2 x 106 células en 100 pl por ruta subcutánea en el flanco izquierdo de cada ratón. Se dejó que los ratones se recuperaran en observación y la fecha de la inoculación se anotó como Día 0. 7-8 días después de la inoculación de las células tumorales, los ratones se monitorizaron de forma rutinaria para determinar la salud y el crecimiento del tumor apropiado para el inicio del estudio. Todos los ratones que no tuvieran tumores en este punto se retiraron del estudio.
Todas las moléculas de mAb2y los anticuerpos de control se analizaron dentro de las 24 horas previas a la inyección mediante perfil de SEC-HPLC y se comprobaron las impurezas. Los anticuerpos se prepararon a una concentración final de 10 mg/kg en PBS y se combinaron con un segundo anticuerpo en los estudios de combinación. Las moléculas de mAb2 y los anticuerpos de control se administraron a los ratones los días 8, 11 y 14 después de la inoculación del tumor mediante inyección IP. Se cribaron los animales en cuanto a salud bajo anestesia tres veces a la semana de forma ciega, tiempo durante el cual se tomaron mediciones precisas de los tumores. Se tomaron mediciones del volumen del tumor con calibradores para determinar el eje más largo y el eje más corto del tumor. La fórmula usada para calcular el volumen tumoral fue la mostrada en la sección 4.1.
Todos los ratones se sacrificaron humanitariamente y los tumores se extirparon y pesaron. Los resultados se muestran en las Figuras 11 y 12.
Este ensayo confirma que la presencia o ausencia de la mutación LALA, que suprime la actividad de ADCC, no tiene un efecto estadísticamente significativo sobre el crecimiento tumoral en el modelo de carcinoma de colon MC38; sin embargo, los mAb2 que incluyeron la mutación LALA tendían a producir una supresión incrementada del crecimiento tumoral. Sin embargo, la justificación para incluir la mutación para inhibir potencialmente la actividad de ADCC contra las células T que expresan LAG-3 o PD-L1 está justificada, ya que la mutación LALA no tiene un efecto perjudicial sobre la actividad antitumoral del mAb2 de LAG-3/PD-L1. Hubo alguna evidencia que sugirió que la inclusión de la mutación LALA solo era crítica para el anticuerpo de PD-L1.
Este ensayo también examinó si el mAb2 de LAG-3/PD-L1 puede tener una eficacia incrementada sobre la administración de los anticuerpos individuales (LAG-3 LALA PD-L1 LALA). En este caso, no hubo diferencias significativas entre estas dos cohortes. Ambos grupos suprimieron el crecimiento en el modelo de carcinoma de colon MC38.
4.5 Conclusión
En general, está claro a partir de los resultados anteriores que existe un efecto sinérgico sobre la supresión del crecimiento tumoral cuando una molécula de mAb2 que comprende sitios de unión tanto para LAG-3 como para PD-L1 se administra a ratones en los modelos de ratón ensayados. En base a estos resultados, se espera que las moléculas de anticuerpos de la invención muestren un efecto superior en el tratamiento del cáncer en pacientes humanos, en particular en la supresión del crecimiento tumoral, que la administración de dos moléculas separadas que se unen a LAG-3 y PD- L1, respectivamente.
Ejemplo 5: Efecto del tratamiento con mAb2 sobre la expresión de LAG-3 en las células T
El mecanismo por el cual el mAb2 de ratón subrogado FS18-7-108-29/S1 que contiene la mutación LALA, (SEQ ID NO: 117 y 119) referido como FS18-29/S1 condujo a una disminución de la carga tumoral se ensayó en un modelo de crecimiento tumoral de ratón singénico MC38 que expresa ovoalbúmina (MC38.OVA). El efecto de FS18-29/S1 se comparó con el del mAb2 LAG-3/simulado, FS18-7-108-29/4420 que contiene la mutación LALA (SEQ ID NO: 132 y 85), referido como FS18-29/4420, el mAb S1 de PD-L1 de referencia que contiene la mutación LALA (SEQ ID NO: 122 y 119) y una combinación de FS18-29/4420 y S1.
El día del implante, se recogieron células MC38.OVA cultivadas durante el crecimiento en fase logarítmica (Confluencia ~ 75%) y se resuspendieron en PBS a una concentración de 1 x 107 células/mL. Los tumores se iniciaron anestesiando primero a cada animal con isoflurano, luego implantando subcutáneamente 1 x 106 células MC38.OVA (suspensión de 0,1 mL) en el flanco izquierdo de cada animal de ensayo. Once días después de la implantación de las células tumorales, los animales se aleatorizaron, usando un método de aleatorización determinista, en cinco grupos con volúmenes tumorales individuales de 32 a 62,5 mm3. Los animales se dosificaron con 10 mg/kg de anticuerpo o mAb2 los días 12, 14 y 16 después de la inoculación del tumor, y los tumores se recogieron de tres animales/grupo los días 19 y 23 después de la inoculación del tumor. Se usó el disociador GentleMACS™ para disociar el tumor con células tamizadas posteriormente a través de un colador de células de 70 pm para obtener una suspensión de células individuales. Se resuspendieron 1 x 106 células/pocillo en una placa de 96 pocillos en tampón FACS con tinción de viabilidad 1:3.000 y bloqueo de Fc (anticuerpo anti-CD16/32). Las células para el análisis FACS se tiñeron usando una mezcla maestra que incluía anticuerpos marcados contra CD43, CD8a, CD4, FoxP3 y LAG-3. Para la tinción intracelular de FoxP3, las células se fijaron y permeabilizaron antes de la tinción con el anticuerpo FoxP3. Las muestras se procesaron en el citómetro de flujo Canto II con una matriz de compensación y se contó un mínimo de 500.000 eventos.
En este experimento, se examinaron los TIL para determinar la expresión de LAG-3 después de haberse administrado la tercera dosis de anticuerpo/mAb2, cuando se observa una separación en el crecimiento del tumor entre los tratamientos control y mAb2, pero antes de que haya una gran diferencia entre los tamaños de los tumores que podría sesgar los resultados. En este punto de tiempo, se descubrió que la expresión de LAG-3 en los TIL disminuyó notablemente en los animales tratados con mAb2 FS18-29/S1 o con la combinación de FS18-29/4420 y S1. Específicamente, como se muestra en la Figura 13, la expresión de LAG-3 en linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) CD8, CD4 y FoxP3 disminuyó después del tratamiento con FS18-29/S1 los días 19 y 23 después de la inoculación del tumor, lo que corresponde a 3 y 7 días después de la última dosificación de anticuerpo/mAb2, respectivamente. La disminución en la expresión de LAG-3 fue más pronunciada en el día 23, pero todavía era evidente en el día 19. Los animales que recibieron una combinación de FS18-29/4420 y S1 también muestran una disminución en la expresión de LAG-3 en los TIL, pero el efecto se retrasó hasta el día 23, mientras que el tratamiento con FS18-29/4420 o S1 administrados individualmente tuvo poco o ningún efecto sobre la expresión de LAG-3 en los TIL.
Estos resultados muestran que se requiere una inhibición dual de LAG-3 y PD-L1 para una disminución en la expresión de LAG-3 por los TIL, ya que este fenómeno no se observó en los animales tratados con agentes únicos contra LAG-3 o PD-L1. Sin desear estar limitado por la teoría, se cree que el tratamiento dual anti-LAG-3 y anti-PD-L1 da lugar a una disminución en la expresión de LAG-3 en los TIL, reduciendo de esta manera el efecto inhibidor de LAG-3 y permitiendo que los TIL superen el agotamiento. Una vez que los TIL se activan, pueden reconocer los neoantígenos expresados por el tumor y montar una respuesta contra él. Por lo tanto, se cree que este es el mecanismo por el cual el tratamiento con mAb2 anti-LAG3/PD-L1 da como resultado una reducción de la carga tumoral.
Ejemplo 6: Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y actividad de citotoxicidad dependiente del complemento de mAb2
Los anticuerpos IgG 1 normalmente presentan funciones efectoras a través de sitios de interacción conservados dentro de la región constante de la molécula. Estos incluyen la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), mediada por la unión a FcyR expresado en monocitos/macrófagos, células dendríticas, células NK, neutrófilos y otros granulocitos, y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), mediada por la inducción de la cascada del complemento iniciada por la unión. al componente del complemento C1q. Dado que LAG-3 se expresa predominantemente en las células T activadas y que PD-L1 se expresa en estas, pero también en células tumorales en niveles altos, se investigó la capacidad de mAb2 FS18-7-9/84G09 (SEQ ID NO 94 y 116) para inducir ADCC y CDC.
Específicamente, se ensayó si el tratamiento con FS18-7-9/84G09 de células que expresan LAG-3 o PD-L1, seguido de incubación con células NK o complemento, induce la lisis de las células diana respectivas. Además, dado que FS18-7-9/84G09 es un anticuerpo biespecífico, también se ensayó si la unión de la diana en una de las especificidades afecta la función efectora hacia las células que expresan la diana para la otra especificidad.
La comprensión de las funciones efectoras de mAb2 FS18-7-9/84G09 es útil por varias razones, incluyendo la determinación de si una mutación que reduce las funciones efectoras, tal como la mutación LALA, debe incluirse en la molécula para proteger a las células T efectoras que expresan LAG-3 que participan en la destrucción de tumores de la ADCC y/o CDC mediadas por FS18-7-9/84G09.
6.1 Diseño del estudio
Las células Raji que expresan de manera recombinante LAG-3 o PD-L1 se usaron para todos los ensayos, usando su expresión endógena de CD20 como control para el direccionamiento con una versión genérica de rituximab para demostrar la actividad funcional de las preparaciones de complemento y de células NK añadidas independiente de la expresión recombinante de las proteínas diana. La expresión de la diana se confirmó antes de estos experimentos.
Para determinar la actividad básica de CDC hacia células que expresan LAG-3 o PD-L1, esta actividad se midió usando la liberación de LDH, medida por conversión de un sustrato en un tinte fluorescente (CytoTox-ONE™ de Promega). Para medir qué células diana en una mezcla celular que comprende tanto células que expresan LAG-3 como células que expresan PD-L1 se estaban lisando, se midió la CDC diferencial mediante citometría de flujo de células diana marcadas con fluorescencia diferencial después de la incubación con el mAb2/anticuerpo, detectando las células muertas usando un tinte fluorescente excluido de las células vivas.
Para determinar la actividad de ADCC hacia las células que expresan LAG-3 o PD-L1, esta actividad se midió usando células NK aisladas de PBMC congeladas y la liberación de LDH medida colorimétricamente (CytoTox 96 de Promega). Para todos estos estudios, se usó como control rituximab en diversos isotipos y configuraciones de Fc. No se conoce ningún método fiable para medir la ADCC de forma diferencial, por lo que no se midió la actividad de ADCC diferencial.
En todos los experimentos, el mAb específico de PD-L1 (84G09) y el mAb específico de LAG-3 (25F7) se usaron como controles. También se usó un control de isotipo de IgG (4420) que se usó como control negativo o para generar la actividad de fondo de CDC. Las versiones LALA de los respectivos anticuerpos y mAb2 (excluyendo 25F7) también se compararon con las versiones de tipo salvaje de IgG1 en los ensayos de CDC y ADCC para determinar el efecto de esta mutación en estas funciones efectoras.
6.2 Materiales y métodos
6.2.1 Ensayos de CDC
Todos los anticuerpos/mAb2, incluyendo rituximab, se diluyeron en 10 puntos 1 en 2 diluciones seriadas. También se prepararon pocillos de control que contenían IgG (4420 LALA) a la concentración más alta usada. Se prepararon suspensiones celulares de células Raji que expresan de manera recombinante LAG-3 o PD-L1 respectivamente, en medio sin suero para el ensayo de liberación de LDH y se añadieron a un volumen igual al de los anticuerpos/mAb2 preparados.
Para el ensayo de CDC basado en citometría de flujo, se prepararon suspensiones celulares de 5 x 107 células y se resuspendieron en CellTracker rojo oscuro 0,5 pM (CellTracker™ Rojo Oscuro, Thermo Fisher, No. C34565) o para CellTracker Verde 5 pM (CellTracker™ Verde CMFDA (diacetato de 5-clorometilfluoresceína, Thermo Fisher, No. C7025) en medio libre de suero. Después de una incubación de 30 min a 37 °C, las células se lavaron en medio libre de suero y se añadieron a los pocillos que contenían anticuerpo/mAb2 preparado directamente, o se combinaron con la otra línea celular teñida diferencialmente en volúmenes iguales y luego se añadieron a los pocillos que contenían anticuerpo/mAb2 como se ha descrito anteriormente. Para ambos ensayos, después de una incubación de 30 minutos en condiciones de cultivo celular, los pocillos se rellenaron con un volumen igual de complemento de cría de conejo, al 10% en medio libre de suero (complemento de cría de conejo, TEBU-bio, No. CL3441). Las placas se incubaron durante 4 horas en condiciones de cultivo celular. Para el ensayo de CDC de liberación de LDH, se generaron controles de lisis al 100% añadiendo Triton X 100 a la mitad de los pocillos tratados con 4420 LALA y el ensayo Cytotox se realizó según las instrucciones del fabricante (CytotoxOne, Promega, G7891). Después de obtener las lecturas, la señal de los controles de lisis al 100% se estableció en 100% y las señales de los pocillos de muestra se calcularon como un porcentaje de ese nivel.
Para el ensayo de CDC basado en citometría de flujo, al final del período de incubación, se diluyó el colorante de células muertas (SYTOX® Tinción Azul de Células Muertas, Thermo Fisher, No. S34857) 1 en 500 en PBS y los pocillos se rellenaron con un volumen igual. La citometría de flujo se realizó en un citómetro de flujo Cytoflex que controlaba las poblaciones de células intactas basándose en FSC y SSC y detectaba el porcentaje de células positivas para Sytox (canal PB450) de las poblaciones de células positivas para CellTracker™ Rojo Oscuro y CellTracker™ CMFDA verde.
6.3.2 Ensayo de ADCC
La ADCC se midió como se ha descrito anteriormente (Broussas, Matthieu; Broyer, Lucile; y Goetsch, Liliane. (2013) Evaluation of Antibody-Dependent Cell Cytotoxicity Using Lactate Dehydrogenase (LDH) Measurement in Glycosylation Engineering of Biopharmaceuticals: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Nueva York: Springer Science Business Media. Volumen 988, p 305-317). Brevemente, las células diana se preincubaron con los anticuerpos antes de añadir células NK primarias aisladas de PBMC humanas (kit de aislamiento de células NK, Miltenyi Biotec, 130-092-657) en una relación de 20 a 1 durante 4 horas. El ensayo de citotoxicidad se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante (ensayo de citotoxicidad no radiactiva CytoTox 96, Promega, G1780). El% de lisis se calculó basándose en el 100% de lisis de células diana, teniendo en cuenta la lisis espontánea de las células efectoras y diana.
6.3 Resultados y conclusiones
6.3.1 Ensayo de CDC
Las células Raji que expresaban PD-L1 se tomaron como diana por el anticuerpo anti-CD20 rituximab, lo que dio lugar a una lisis máxima de <60% cuando se midió la CDC por liberación genérica de LDH. El anticuerpo anti-PD-L1 84G09 (que comprende la porción de F(ab)2 de mAb2 FS18-7-9/84G09) y FS18-7-9/84G09 en formato IgG1, mostró mayor lisis máxima y también mayor potencia de lisis, con dosis mitad de la máxima estimadas de aproximadamente la mitad de las requeridas por rituximab en formato IgG1. Esto muestra que la introducción del sitio de unión a LAG-3 en el anticuerpo 84G09 no cambió su actividad de direccionamiento a PD-L1 con respecto a la potencia o la respuesta máxima, ya que ambas fueron muy similares cuando se compararon 84G09 y FS18-7-9/84G09. La introducción de la mutación LALa dio lugar a una respuesta máxima reducida para rituximab, 84G09 y FS18-7-9/84G09, sin embargo, la potencia solo se redujo para 84G09 y FS18-7-9/84G09. Como se esperaba, el anticuerpo anti-LAG-3 25F7 no tuvo efecto sobre la viabilidad celular de las células Raji que expresan PD-L1, ya que estas células no expresan LAG-3 humano. Estos resultados se muestran en la Figura 14a .
Las células Raji que expresaban LAG-3 se tomaron como diana para la CDC por el anticuerpo anti-CD20 rituximab, sin embargo, el anticuerpo de LAG-3 25F7 mostró una potencia incluso mejor con una dosis mitad de la máxima estimada de aproximadamente la mitad de la requerida para rituximab. Ninguno de los otros anticuerpos mostró actividad de CDC contra células Raji que expresan LAG-3, incluyendo FS18-7-9/84G09. La introducción de la mutación LALA tuvo un efecto muy limitado sobre la actividad de CDC de rituximab (Figura 14B).
6.3.2 Ensayo de CDC diferencial
Los inventores desarrollaron un ensayo de CDC diferencial, que emplea citometría de flujo, para distinguir qué células que expresan la diana se lisaron cuando se trataron con FS18-7-9/84G09 o anticuerpos de control. Este ensayo se usó para confirmar los resultados del ensayo básico de CDC de liberación de LDH descrito anteriormente. En comparación con el anticuerpo de control de isotipo IgG (4420), que no tuvo ningún efecto sobre el porcentaje de células vivas, el rituximab mediaba una reducción de células vivas y un incremento de células muertas, tanto de células que expresaban PD-L1 como LAG-3. Sin embargo, FS18-7-9/84G09 no tuvo ningún efecto sobre las células que expresaban LAG-3, pero lisó muy eficazmente las células que expresaban PD-L1. De manera similar, la mezcla del anticuerpo específico de LAG-3 25F7 y el anticuerpo de PD-L1 84G09 también mostró una disminución dependiente de la dosis en las células vivas y un incremento recíproco en las células muertas, sin embargo, la lisis máxima de las células que expresaban LAG-3 fue solo poco más del 50% de las células, pero ya se alcanzó a una concentración de alrededor de 1 nM, la dosis más baja para lograr la lisis máxima de todos los anticuerpos ensayados. Esto confirma el hallazgo anterior de que el sitio de unión a LAG-3 en el dominio CH3 de FS18-7-9/84G09 no induce la lisis mediada por CDC de las células diana que expresan LAG-3. Además, este experimento muestra que la presencia de células que expresan LAG-3 no tiene ningún efecto sobre la actividad de CDC de FS18-7-9/84G09 hacia las células que expresan PD-L1. Los resultados se muestran en la Figura 15.
6.3.3 Ensayo de ADCC
Las células Raji que expresaban PD-L1 se tomaron como diana para la ADCC por el anticuerpo anti-CD20 rituximab, FS18-7-9/84G09 y 84G09 con una eficacia y potencia muy similares, lo que dio lugar a una lisis máxima de alrededor del 40% de las células. El rituximab y 84G09 que contenían la mutación LALA no mostraron lisis mediada por ADCC y FS18-7-9/84G09 que contenía la mutación LALA no mostró lisis meditada por ADCC o muy baja de las células diana que expresaban PD-L1. El anticuerpo específico de LAG-3 25F7 y el control de isotipo 4420 con y sin la mutación LALA no mostraron ninguna actividad en este ensayo.
Estos resultados muestran que la introducción del sitio de unión a LAG-3 en el anticuerpo 84G09 no cambió su actividad de ADCC dirigida a PD-L1 en potencia o respuesta máxima, ya que ambas fueron muy similares al anticuerpo específico de PD-L1 84G09. La introducción de la mutación LALA dio lugar a la supresión de la actividad de ADCC (Figura 16A).

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de anticuerpo que se une al ligando 1 de muerte programada (PD-L1) y al gen 3 de activación de linfocitos (LAG-3), en donde la molécula de anticuerpo comprende:
(i) un sitio de unión a antígeno basado en la región determinante de la complementariedad (CDR) para PD-L1 que comprende las CDR mostradas en las SEQ ID NO 86 a 91; y
(ii) un sitio de unión al antígeno LAG-3 localizado en un dominio CH3 de la molécula de anticuerpo, en donde el sitio de unión a LAG-3 comprende las secuencias de aminoácidos WDEPWGED (SEQ ID NO: 1) y PYd Rw VWPDE (SEQ ID NO: 3), y en donde la secuencia de aminoácidos WDEPWGED está localizada en el bucle AB del dominio CH3 y la secuencia de aminoácidos PYDRWVWPDE está localizada en el bucle EF del dominio CH3.
2. Una molécula de anticuerpo según la reivindicación 1, en donde el sitio de unión al antígeno LAG-3 comprende además una de las siguientes secuencias en el bucle CD del dominio CH3:
(i) SNGQPENNY (SEQ ID NO 2, 8 y 18);
(ii) SNGQPEDNY (SEQ ID NO: 13);
(iii) SNGYPEIEF (SEQ ID NO: 23);
(iv) SNGIPEWNY (SEQ ID NO: 28);
(v) SNGYAEYNY (SEQ ID NO: 33);
(vi) SNGYKEENY (SEQ ID NO: 38);
(vii) SNGVPELNV (SEQ ID NO: 43); o
(viii) SNGYQEDNY (SEQ ID NO: 48);
preferiblemente en donde el sitio de unión al antígeno LAG-3 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, 28 o 38,
preferiblemente en donde el sitio de unión al antígeno LAG-3 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2.
3. Una molécula de anticuerpo según la reivindicación 1 o 2, en donde la molécula de anticuerpo es una molécula de inmunoglobulina G (IgG), preferiblemente una molécula de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, preferiblemente una molécula de IgG1.
4. Una molécula de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la molécula de anticuerpo comprende el dominio CH3 mostrado en la SEQ ID NO: 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50, preferiblemente la s Eq ID NO: 5, 30 o 40, preferiblemente la SEQ ID NO: 5.
5. Una molécula de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la molécula de anticuerpo comprende un dominio CH2 y el dominio CH2 tiene la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 54.
6. Una molécula de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la molécula de anticuerpo comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 6, 7, 11, 12, 16, 17, 21,22, 26, 27, 31,32, 36, 37, 41,42, 46, 47, 51 o 52, preferiblemente la SEQ ID NO: 6, 7, 31,32, 41 o 42, preferiblemente la SEQ iD n O: 6 o 7.
7. Una molécula de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la molécula de anticuerpo comprende los dominios VH y/o VL mostrados en las SEQ ID NO 92 y 93.
8. Una molécula de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -7, en donde la molécula de anticuerpo comprende la secuencia de cadena pesada mostrada en una cualquiera de las SEQ ID NO: 94 a 113, preferiblemente la SEQ ID NO: 94, 95, 104, 105, 108, o 109, preferiblemente la SEQ ID NO: 94 o 95.
9. Una molécula de anticuerpo según la reivindicación 7 u 8, en donde la molécula de anticuerpo comprende la secuencia de cadena ligera mostrada en la SEQ ID NO: 116.
10. Una molécula de anticuerpo según la reivindicación 9, en donde la molécula de anticuerpo comprende la secuencia de cadena pesada mostrada en la SEQ ID NO: 94 y la secuencia de cadena ligera mostrada en la SEQ ID NO: 116.
11. Una molécula de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la molécula de anticuerpo está conjugada con un modulador del sistema inmune, molécula citotóxica, radioisótopo o marcador detectable, opcionalmente en donde el modulador del sistema inmune o molécula citotóxica es una citoquina.
12. Un ácido nucleico que codifica una molécula de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una molécula de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
13. Una célula huésped recombinante que comprende el ácido nucleico o vector de la reivindicación 12.
14. Un método para producir una molécula de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende cultivar la célula huésped recombinante de la reivindicación 13 en condiciones para la producción de la molécula de anticuerpo, en donde el método comprende opcionalmente además aislar y/o purificar la molécula de anticuerpo.
15. Una composición farmacéutica que comprende una molécula de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
16. Una molécula de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para su uso en un método de tratamiento del cáncer en un paciente, opcionalmente en donde el método comprende además administrar al paciente:
(a) una vacuna antitumoral; o
(b) un agente quimioterapéutico.
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