KR20230035680A - Pd-l1 및 lag-3에 결합하는 결합 분자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 예정사-리간드 1 (PD-L1) 및 림프구-활성화 유전자 3 (LAG-3)에 결합하는 항체 분자에 관한 것이다. 항체 분자는 바람직하게는 PD-L1에 대한 CDR-기반 항원 결합 부위, 및 상기 항체 분자의 CH3 도메인의 2개 이상의 구조적 루프에 위치할 수 있는 LAG-3 항원 결합 부위를 포함한다. 본 발명의 항체 분자는, 예를 들어, 암 요법에 있어서의 응용을 발견한다.

Description

PD-L1 및 LAG-3에 결합하는 결합 분자{BINDING MOLECULES BINDING PD-L1 AND LAG-3}
관련 출원
본 건은 그의 내용이 전체로서 참고로 본원에 포함되는, 2016년 6월 20일자로 출원된 US 62/352482에 관한 것이다.
발명의 분야
본 발명은 세포예정사 1 (programmed cell death 1: PD-1) 및 림프구-활성화 유전자 3 (lymphocyte-activation gene 3: LAG-3)에 결합하는 항체 분자에 관한 것이다. 상기 항체는 바람직하게는 PD-L1에 대한 CDR-기반 항원 결합 부위 (CDR-based antigen binding site), 및 상기 항체 분자의 CH3 도메인의 2개 이상의 구조적 루프 (structural loop)에 위치할 수 있는 LAG-3 항원-결합 부위를 포함한다. 본 발명의 항체는, 예를 들어, 암 요법 (cancer therapy)에 있어서의 응용을 발견한다.
림프구 활성화 유전자-3 (LAG-3; CD223)은 Ig 수퍼패밀리 (superfamily)의 구성원이고, CD4와 (단지 20% 서열 동일성 (sequence identity)에 불과하지만) 유전적 및 구조적으로 관련이 있다. CD4와 같이, LAG-3은 MHC 클래스 II 분자에 결합하지만, CD4보다 낮은 친화도 (affinity) (K D = 60 nM)를 갖는다. LAG-3은 활성화 T 세포, NK 세포, pDCs, B 세포, γδ T 세포 상에서 발현되고, 특히 일부 조절 T 세포 (Tregs)는 지속적인 강력한 발현을 통해 면역 억제에 관여한다 (Liang et al, 2008).
LAG-3 유전자는 CD4 유전자에 인접한 인간 염색체 12에 위치하고 있으며, 8개의 엑손에 걸쳐 있다. 5개의 택일적 전사체가 존재하며, 그 중 2개는 단백질 산물을 생성한다: 전장 (full length)의 막횡단 단백질 및 택일적으로 스플라이싱된 가용성 단량체 형태. 전장의 전사체는 70 kDa의 분자량을 갖는 525개 아미노산 단백질을 인코딩하고 기능적 활성을 갖는 반면, 가용성 형태는 MHC 클래스 II 분자에 결합하지 않는 것으로 보이고 그의 기능은 알려져 있지 않다. 인간의 전장 LAG-3 단백질은 마카카 파스시쿨라리스 (Macaca fascicularis) (시노몰구스 원숭이(cynomolgus monkey)) LAG-3와 93% 서열 동일성 및 무스 무스쿨러스 (Mus musculus) (생쥐(house mouse)) LAG-3와 70% 서열 동일성을 갖는다.
LAG-3은 4개의 세포외 Ig-유사 도메인 (D1-D4)을 갖는 막횡단 단백질이고 LAG-3 신호전달을 담당하는 세포질 부분이다. 세포질 도메인은 T 세포 기능의 LAG-3 조절에 요구되는 것으로 생각되는 KIEELE 모티프뿐만 아니라 LAG-3-연관 단백질 (LAP)과 연관된 EP (글루탐산/프롤린) 모티프를 갖는다. EP 모티프의 역할에 대한 보고에 따르면 EP 모티프가 T 세포 표면 막으로의 LAG-3의 유인 (trafficking)을 담당할 수 있거나 (Bae et al, 2014), T 세포 활성화 도중에 STAT5의 하류 신호전달의 조절을 직접적으로 담당할 수 있거나, 이 둘 모두일 수 있음을 시사한다.
T 세포에 대한 LAG-3의 면역-억제 메커니즘은 T 세포 활성화 동안 칼슘 유동 및 IL-1 방출의 감소를 초래하는 활성화된 T 세포에 대한 LAG-3의 교차-결합에 의해 유도되는 것으로 생각된다 (Huard et al, 1997). 항원 제시 세포 (APCs)에서, LAG-3 양성 조절 T 세포에 의한 MHC II 분자에의 결합은 IL-12 분비의 감소 및 CD86의 하향 조절 (Liang et al, 2008), 즉 "활성화의 이차 신호"를 초래하여 부적절한 활성화 및/또는 APCs에 의한 항원 제시의 감소로 인한 T 세포 아네르기 (anergy)를 유발한다. LAG-3 넉아웃 (knock out) 마우스 모델은 단지 경미한 림프-과다증식 (lympho-hyperproliferation)만으로 실현 가능한데 (Workman et al, 2003), 이는 LAG-3이 적절한 면역 "브레이크"로 작용함을 나타낸다.
LAG-3과 MHC 클래스 II 사이의 이러한 억제 상호작용은 또한 Tregs와 CD4 양성 T 세포 사이에서 일어나는 것으로 제안되었다 (Sega et al, 2014). Tregs는 억제성 시토카인 (cytokine) (예컨대, IL-10 및 TGFβ)의 방출, 염증성 대사의 조작 (예컨대, CD73 이화된 아데노신), APC 성숙의 조절, 또는 조절 T 세포와 효과기 T 세포 사이의 직접적인 상호작용 중 어느 하나에 의해 면역 반응을 억제한다. MHC 클래스 II 양성 Tregs 세포가 MHC 클래스 II 음성 Tregs보다 더 억제적이고 (Baecher-Allen et al, 2006) 효과기 T 세포에서 발현된 LAG-3와의 직접적인 상호작용을 통해 면역 반응을 적극적으로 억제한다는 증거가 인간에 존재한다. LAG-3 음성 Tregs가 통상적인 T 세포 증식을 억제할 수 있지만, LAG-3 음성 CD4 및 CD8 T 세포는 Treg 면역 억제에 내성이 있다. 이 과정은 트로고사이토시스 (trogocytosis)라고 알려진 과정을 통해 인간 T 세포 사이에서 일어나는 것으로 기술되었으며 (Sega et al, 2014) 그로써 Tregs는 APC 성숙을 방지할 뿐만 아니라 MHC 클래스 II를 획득하여 초회항원자극된 (primed) LAG-3 양성 CD4 T 세포를 억제한다.
LAG-3 발현은 또한 반복된 항원 자극의 마커이다. 암에서, T 세포는 일반적으로 PD-1, CTLA-4, TIM-3, 및 LAG-3과 같은 면역-억제자의 발현을 포함하는 "고갈된 (exhausted)" 표현형을 채택하고 (Wherry et al, 2011), 이때 세포는 항원에 반응하여 적절히 증식하고 케모카인을 분비하는데 일반적인 무능력을 갖는다. 이들 면역-억제제의 저해는 면역 역치를 낮추고 T 세포에 의한 적절한 항암 반응을 (재-)가능케 한다. 전임상 모델에서, 이는 종양 부하 (tumor burden)의 감소가 보이는 LAG-3, CTLA-4 및 PD-1에 대한 길항제 항체를 사용하여 입증되었다. 길항제 항체에 의한 LAG-3 저해는 종양 미세환경에서 면역 반응을 재활성화시키는 것으로 생각되고, 여기서 CD4 양성 T 세포 및 CD8 양성 T 세포에서의 LAG-3 발현은 고갈된 표현형과 연관이 있고, Tregs에서의 LAG-3 발현은 강력한 면역-억제 능력과 연관이 있다. 항체 차단 LAG-3은 T 효과기 세포 증식, 시토카인 생산, 세포독성을 증가시키고, Treg 억제제 활성을 감소시켜 종양 성장의 감소를 초래한다.
인간 종양에서, LAG-3의 증가된 발현이 흑색종 및 림프종과 같은, 인간 신세포 암종 (renal cell carcinoma) 및 다른 종양으로부터의 종양-침윤성 림프구 (TIL)에서 발견되었다 (Demeure et al, 2001; Wolchock et al, 2013). 중요하게는, LAG-3은 또한 만성 바이러스 감염 (Workman et al, 2005) 및 암 (Workman et al, 2003) 환자에서 T 세포 기능장애와 밀접한 상관관계가 있다. LAG-3은 또한 다양한 인간 암에서 종양-침윤성 Tregs의 표면 마커로서 동정되었다 (Camisachi et al. 2010; Gandhi et al, 2006).
인간 LAG-3에 대한 단클론 항체는 면역 억제를 폐기하고 (abrogate) 잠재적으로 암 (고형 및 혈액학적 악성 종양)에서 항원 제시를 향상시키기 위해 임상 개발 중에 있다.
LAG-525 및 IMP-701 (Novartis AG)은 LAG-3에 대한 인간 항체이고 신장암 (renal cancer)(신세포암); 비-소세포 폐암 (NSCLC); 비인두암; 결장직장암 (colorectal cancer); 흑색종; 위암 및 위식도 접합부의 선암종에서 각각 임상 II 및 I기 연구가 진행되고 있다.
항-LAG-3 항체 BMS-986016 (Bristol-Myers Squibb Company)은 현재 난소암; NSCLC; 결장직장암; 자궁경부암; 흑색종; 위암; 방광암; 두경부암 (head and neck cancer), 편평세포 암종 (squamous cell carcinoma); 신장세포 암종에서 임상 I기 시험이, NSCLC; 재발성 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 난치성 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 흑색종; 비-호지킨 림프종; 호지킨 림프종; 미만성 거대 B-세포 림프종; 지연성 림프종; 외투 세포 림프종; 난치성 다발성 골수종; 및 재발성 다발성 골수종에서 임상 II기 연구가 단일 요법 또는 병용 요법의 일부 중 하나로서 진행되고 있다.
LAG-3에 대한 다른 항체가 또한 전임상 개발 중에 있다.
세포예정사 1 (PD-1), 및 이의 리간드 PD-L1 (CD274, B7-H1) 및 PD-L2 (B7-DC)는 T 세포 활성화, 내성 (tolerance) 및 면역 병리 (immunopathology) 간의 균형을 조절하는 억제 신호를 전달한다. PD-L1은 모든 면역 세포 및 일부 종양 세포 상에 일시적으로 발현된다.
PD-L1은 세포외 부위에 2개의 Ig-유사 도메인, 막관통 도메인 및 짧은 세포질 도메인을 갖는, I형 막관통 단백질이다. 세포질 도메인은 PD-L1이 리간드와 이의 수용체의 상호 작용에 대한 신호 전달 (signaling)이 없다는 것을 알려주는 공지된 신호 전달 모티프 (signal transduction motif)를 가지고 있지 않다. 이의 분자량은 40 kDa (290개 아미노산)이고, 각각 마우스 염색체 19 및 인간 염색체 9 상의 CD274 유전자에 의해 인코딩된다 (encoded). PD-L1은 B7 단백질 패밀리의 구성원이며, B7.1 및 B7.2와 약 20%의 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 인간 PD-L1은 각각 뮤린 및 시노몰구스 오르소로그 (cynomolgus ortholog)의 PD-L1과 70 % 및 93 % 아미노산 동일성을 공유한다.
PD-L1은 770 nM의 친화도 (KD)으로 이의 수용체 PD-1에 결합한다. PD-1은 활성화된 T 세포, B 세포 및 골수 세포 상에 발현되며, 세포 면역 반응의 활성화 또는 억제를 조절한다. PD-L1의 PD-1으로의 결합은 억제 신호, 시토카인 생성 및 T 세포 증식을 전달한다. 결과적으로 세포에 의한 PD-L1 발현은 세포독성 T 림프구 (CTL) 사멸에 대한 보호를 매개할 수 있으며, 이는 바이러스 감염 동안 만성 면역 반응을 둔화시키는 조절 메커니즘이다. 만성 및 전-염증성 질환 (pro-inflammatory disease)과 같은 암은, PD-L1 발현의 상향-조절을 통해 이러한 면역-보호 경로를 전복시켜 숙주 면역 반응을 회피한다. 활성 면역 반응의 맥락에서, IFNγ은 또한 PD-L1의 발현을 상향조절한다.
PD-L1은 또한 또 다른 단백질인 B7.1 (CD80으로도 알려짐)과의 상호작용을 통해 면역 억제를 매개하여, CD28을 통한 T 세포에 대한 활성화의 2차 신호 중 하나를 전달하는 이의 능력을 차단한다. 종양 세포 상의 PD-L1 발현 및 B7.1과의 이들의 계합 (engagement)의 측면에서, 종양 면역 내성 (immune resistance)에서 이러한 특이적인 상호작용에 관한 관련성은 여전히 불명확하다.
PD-L1 발현은 매우 다양한 고형 종양에서 나타난다. 상이한 부위에서부터 19개 종양에 걸친, 한가지 연구에서 시험된 654개 샘플 중, 89개 (14%)는 PD-L1 양성 (≥5% 빈도)이었다. 가장 높은 PD-L1 양성 빈도는 두경부 (17/54; 31%), 자궁경부 (10/34; 29%), 원인불명 원발성 기원의 암 (cancer of unknown primary origin: CUP; 8/29; 28%), 다형성 교모세포종 (glioblastoma multiforme: GBM; 5/20; 25%), 방광 (8/37; 21%), 식도 (oesophageal) (16/80; 20%), 삼중 음성 (triple negative: TN) 유방 (6/33; 18%) 및 간암종 (hepatocarcinoma) (6/41; 15%) (Grosso et al, 2013)에서 나타났다. PD-L1의 종양-관련 발현은 면역 내성을 부여하고, 잠재적으로 T 세포 매개된 세포자멸사로부터 종양 세포를 보호하는 것으로 밝혀졌다.
PD-L1 표적화 요법은 뮤린 생체내 연구에서 우수한 결과를 나타냈다. 흑색종 (melanoma)의 B16 뮤린 모델에서, GVAX 또는 FVAX 백신화 전략 (vaccination strategy)과 조합된 항-PD-L1으로의 처리는, 연구 종료시 동물의 생존 (PD-L1-처리에 대해서 52일 대비 대조군에 대해서 30일) 및 무-종양 생존률 (5%) 모두에 유의한 효과를 끼쳤다 (Curran et al, 2010). 항-PD-L1 요법은 또한 P815 뮤린 비만세포종 (mastoma) 모델에서 면역 억제의 메커니즘을 연구하는데 사용되었다. 마우스로 주사된 P815 세포는 일반적으로 강력한 면역 반응을 촉발시켰으며, 이는 이들의 거부를 야기하였다. PD-L1이 P815 세포 상에 발현되는 경우, 이러한 세포는 면역 공격 (immune attack)을 면하고, 이는 차례로 항-PD-L1 항체의 투여로 무효화될 수 있다 (Iwai et al, 2002). 면역원성 인간 암에서 PD-1/PD-L1 축 (axis)을 표적화하는 것 (Herbst et at, 2014)이, 항-암 면역 반응의 자극을 통한 생존적 이점을 초래한다는 것은 분명하다.
아테졸리주맙 (Atezolizumab) (MPDL3280A, RG7466, TECENTRIQ)은 PD-L1에 결합하는 인간화된 IgG1 항체이다. 이는, 결장직장암, 유방암, 비-소-세포 폐 암종 (non-small-cell lung carcinoma), 방광암 및 신세포 암종을 비롯한, 고형 암의 치료를 위하여, 단일 작용제로서 및 또한 다른 생물학적 및/또는 소분자 요법과 조합하여 임상 시험중이다. 아테졸리주맙을 이용한 처리는 NSCLC에서 23%, 36% 흑색종, 33% 방광, RCC에서 14% 및 두경부암에서 13%의 목적 반응 비율 (objective response rate: ORR)을 초래한다 (Herbst et al, 2014; Powles et al, 2014).
아벨루맙 (Avelumab) (MSB0010718C)은 PD-L1에 결합하는 완전 인간 IgG1 항체이며, 방광암, 위암, 두경부암, 중피종 (mesothelioma), 비-소-세포 폐암종, 난소암, 신장암 및 메르켈-세포 암종 (Merkel-cell carcinoma)을 비롯한, 수많은 암에서 임상 시험 중이다.
두르발루맙 (Durvalumab) (MEDI4736)은 PD-L1에 결합하는 인간 IgG 항체이며, 이는 단독으로, 또는 비-소-세포 폐암, 두경부의 편평세포암종, 방광암, 췌장암에서 트레멜리무맙 (tremelimumab)과 조합하여, 및 위암, 흑색종 및 절제불가능한 간세포 암종과 같은 추가적인 고형 암을 위한 시험 (trial)에서 다른 생물학적 소분자와 조합하여 임상 시험에서 시험중이다.
추가로, BMS-936559를 비롯한 항-PD-L1 항체는 임상시험에서 시험되고 있으며, 다른 항체는 전임상 시험 (preclinical testing) 중에 있다.
그러나, 현재 몇몇의 항-LAG-3 요법이 임상 시험중이며, 이들 중 어느 것도 치료에 승인되지 않아, LAG-3를 표적화하는 추가적인 분자를 개발하기 위한 필요성이 남아있다. 일부 항-PD-L1 치료제 (therapeutics)가 개발중에 있으나, 현재의 데이터는 항-PD-L1 단일요법을 이용한 전반적인 처리가 50% 미만의 암 환자의 반응을 야기한다는 것을 나타낸다. 따라서, 당해 분야에서 LAG-3 및/또는 PD-L1을 표적화할 수 있고, 암 요법에서의 적용을 발견하는 추가적인 분자에 대한 필요가 남아있다.
발명의 설명
항-PD-1 및 항-PD-L1 항체는 면역 관용 (immune tolerance)을 깨고 항-종양 면역 반응을 활성화시키는데 주로 연관된다. 활성화 이후 T 세포 상에서 발현되고 고갈된 T 세포 상에 구성 요소로서 발현되는, LAG-3는 이러한 세포를 억제 상태 (suppressive state)로 추가로 유지시킨다. 다른 확립된 면역 억제성 분자 (예: PD-1, PD-L1)와 조합하여 사용되는 경우, LAG-3의 차단은 또한 뮤린 종양 모델에서 상승적인 개선된 면역 반응을 제공하는 것으로 나타났다 (Woo et al, 2012). 본 발명자들은, 이러한 경로 모두를 표적화하는 요법이 T 세포 고갈 (cell exhaustion)을 촉진하고 이를 유지시키는 메커니즘을 동시에 직접 다룰 것이라는 것을 가정하였다. 또한, 본 발명자들은, LAG-3 표적화가 APC 상에 조절 T 세포를 발현하는 LAG-3의 작용 및 CD86의 하향-조절을 입증하는 공개된 연구를 통하여 항원 제시를 억제할 수 있다는 것을 예상한다 (Grosso et al, 2013). 이러한 상호작용의 차단은 항원 제시를 유지시키는 것으로 예상되지만, PD-L1 신호전달의 차단은 내성을 깨는 것으로 예상되어, 두 경로 모두가 동시에 억제되는 경우 유의한 항-종양 반응을 일으킨다.
항-LAG-3 및 항-PD-L1 항체 조합에 관한 공개된 데이터는 비록 제한적이나, 전임상 동계 (syngeneic) 마우스 종양 및 바이러스 부하된 모델 (viral load model)로부터 기인한 일부 결과가 존재한다. 골수종의 뮤린 모델에서, 저용량 전신 조사 (whole body irradiation) 이후 항-PD-L1 및 항-LAG-3 차단 항체의 조합을 투여하였으며, 생존률은 80% 초과로 개선되었다 (Jing et al, 2015). 전신 또는 장기-특이적 자가면역의 증거는 관찰되지 않았다. LAG-3 및 PD-1 녹-아웃 (knock-out) 마우스는 현저하게 증가된 생존률 및 다수의 이식가능한 종양의 클리어런스 (clearance)를 나타냈다 (Woo et al, 2012).
본 발명자들은, LAG-3 및 PD-L1에 모두 결합하는 이중특이적 항체가 이러한 항원에 대한 단클론 항체의 조합 보다 수많은 이점을 제공할 것이라고 가정하였으며, 이는 다음을 포함한다:
1. 직접 요법 (directed therapy)
활성화된 T 세포는 림프절에서 LAG-3을 발현한다. 항-LAG-3/PD-L1 이중특이적 항체의 일 부분은 림프절 내 초회항원자극된 LAG-3-양성 T 세포를 표적화하며, 이어서, 종양의 부위를 관계하여 (traffic) 이중특이적 항체를 전달한다. 종양 미세환경 내에서, 이중특이적 항체를 운반하는 T 세포는 항-PD-L1 부분을 통해 종양 세포 상의 PD-L1에 즉시 계합 (engage)하고 이를 차단할 수 있다. 결과적으로, 종양 부위를 이동하는 모든 T 세포는 LAG-3 및 PD-L1/PD-1 신호전달 모두에 대해 내성이 있을 것이다.
2. 브릿징 (bridging)
초회항원자극된 CD8 양성 T 세포는 종양 미세환경 내에서 종양 항원을 마주하며, 여기서, 이들은 억제 신호의 부재하에 종양 세포를 사멸시킴으로써 반응한다. 이중특이적 항체는, T 세포 및 종양 세포 사이의 이러한 접촉을 유지하거나 또는 연장시킴으로써 개별적인 단클론 요법의 조합보다 우수할 것으로 예상된다. 암에서 제시된 항원이 중요한 것인 경우, T 세포의 활성화에서의 신호 강도는 필수적일 수 있으며 (Engels et al, 2013), APC 또는 암세포 상의 표적에 결합된 이중특이적 항-LAG-3/PD-L1 항체의 존재는, T 세포가 항원을 성공적으로 인식하고 활성화 될 수 있는 경우 증가할 것으로 예상된다.
3. 국소화 (localisation)
염증 및 진행중인 면역 반응 부위에서, PD-L1 발현은, 국소화된 IFN-γ 방출로 인하여 유의하게 증가된다. 이는, 표적 암 항원, 종양-관련 대식세포 (tumour-associated macrophages: TAM) 또는 반복되는 T 세포 군의 자극 여부에 관계없이 사실이다. PD-L1 및 LAG-3을 길항시키는 (antagonize) 이중특이적 항체는, 종양 내 가장 큰 PD-L1 발현 부위에 국한되고 농축되며, 항-LAG-3 부분에 결합하고 T 세포의 LAG-3 매개된 억제를 예방할 것으로 예상된다.
광범위한 스크리닝 및 친화도 성숙 프로그램에 따라, 본 발명자들은 분자의 CH3 도메인에서 LAG-3에 특이적인 결합 부위를 포함하는 10개의 특이적 결합 구성원 (specific binding member)을 동정할 수 있었다. 이들 분자들은 인간 및 시노몰구스 LAG-3 둘 다에 대해 높은 친화도를 갖는 것으로 나타났다. 인간 LAG-3에 대한 높은 친화도는, 예컨대 인간 환자에서 LAG-3을 발현하는 종양-침윤성 림프구 (TIL)를 함유하는 암의 치료에 유리한 것으로 기재되는 반면, 인간 LAG-3에 대한 친화도에 상응하는 시노몰구스 LAG-3에 대한 높은 친화도는 시노몰구스 원숭이 모델에서 특이적 결합 구성원의 특성을 평가하는데 유용할 것으로 예상된다. 그 이유는 수득된 결과가 인간 및 시노몰구스 LAG-3에 대한 그의 친화도에서 더 높은 가변성을 갖는 분자가 시노몰구스 원숭이 모델에서 시험될 때보다 인간 환자에서 특이적 결합 구성원의 효과를 예측할 가능성이 더 높기 때문이다.
특이적 결합 구성원은 또한 T 세포 활성화 검정에서 높은 활성을 갖는 것으로 나타났으며, 이는 LAG-3의 증가된 저해를 통해 인간 환자에서 개선된 효능의 예측일 것으로 예상된다.
본 발명자들은, CH3 도메인 내 LAG-3에 특이적인 결합 부위를 포함하는 이러한 특이적 결합 구성원을 PD-L1에 대한 CDR-기반 항원 결합 부위를 포함하는 항체 Fab 도메인과 추가로 조합하여, LAG-3 및 PD-L1 모두에 대한 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체 분자를 생성하였으며, 이는 상기 상세된 이점을 갖는 것으로 예상된다. 또한, 본 발명자들에 의하여, 뮤린 LAG-3 및 뮤린 PD-L1에 결합하는 이러한 항체 분자의 대리 뮤린 버전 (surrogate murine version)이 제조되었으며, 이는 암의 동계 마우스 모델에서 종양 성장을 유의하게 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 특히, 이러한 뮤린 모델의 사용은, LAG-3 및 PD-L1 모두에 대한 결합 부위를 포함하는 항체 분자가 시험된 마우스 모델의 마우스로 투여되는 경우, 종양 성장 억제에 관한 상승적 효과가 존재한다는 것을 입증하였다. 종양 미세환경에서의 마우스 및 인간 LAG-3 및 PD-L1의 작용의 유사한 메커니즘을 기반으로, 종양 부하를 감소시키는 효능을 보이는 뮤린 연구가, 인간 암 환자에서 임상 치료적 이점으로 전환될 것으로 예상된다. 따라서, 이러한 결과에 기반하여, 본 발명의 항체 분자가, 예를 들어, LAG-3 및 PD-L1에 각각 결합하는 2개의 개별적인 분자의 투여 보다, 인간 환자의 암, 특히 종양 성장 억제의 치료에 보다 우수한 효과를 나타낼 것이라는 것이 예상된다.
따라서, 제1 양태에서, 본 발명은 PD-L1 및 LAG-3에 모두 결합하는 항체 분자를 제공한다. 구체적으로, 이러한 항체는
(i) PD-L1에 대한 CDR-기반 항원 결합 부위; 및
(ii) 상기 항체 분자의 CH3 도메인의 2개 이상의 구조적 루프에 위치하거나, 또는 상기 루프 내로 조작되는 LAG-3 항원 결합 부위를 포함한다. 상기 LAG-3 결합 부위는 바람직하게는 아미노산 서열 WDEPWGED (서열번호 1) 및 PYDRWVWPDE (서열번호 3)을 포함한다.
항체 분자는 바람직하게는 AB 루프에서 서열번호 1로 제시된 아미노산 서열, 및 CH3 도메인의 상기 EF 루프에서 서열번호 3으로 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
따라서, 제1 양태에서, 본 발명은 예정사-리간드 1 (PD-L1) 및 림프구-활성화 유전자 3 (LAG-3)에 결합하는 항체 분자이다. 항체 분자는 바람직하게는 (i) PD-L1에 대한 CDR-기반 항원 결합 부위; 및 (ii) 상기 항체 분자의 CH3 도메인에 위치한 LAG-3 항원 결합 부위를 포함한다.
LAG-3 결합 부위는 바람직하게는 아미노산 서열 WDEPWGED (서열번호 1) 및 PYDRWVWPDE (서열번호 3)을 포함한다. 아미노산 서열 WDEPWGED는 바람직하게는 CH3 도메인의 제1 구조적 루프에 위치하고 아미노산 서열 PYDRWVWPDE는 바람직하게는 CH3 도메인의 제2 구조적 루프에 위치한다.
예를 들어, LAG-3 항원-결합 부위는 항체 분자의 CH3 도메인의 구조적 루프 영역에 위치할 수 있고, 상기 구조적 루프 영역은 바람직하게는 2개 이상의 구조적 루프를 포함하고, LAG-3 결합 부위는 바람직하게는 아미노산 서열 WDEPWGED (서열번호 1) 및 PYDRWVWPDE (서열번호 3)을 포함한다.
또 다른 예로서, LAG-3 항원-결합 부위는 항체 분자의 CH3 도메인의 2개 이상의 구조적 루프로 조작될 수 있고, 상기 LAG-3 결합 부위는 바람직하게는 아미노산 서열 WDEPWGED (서열번호 1) 및 PYDRWVWPDE (서열번호 3)를 포함한다.
상기에 언급된 바와 같이, LAG-3 결합 부위의 서열은 바람직하게는 항체 분자의 CH3 도메인의 2개 이상의 구조적 루프에 위치한다. 바람직한 실시형태에서, LAG-3 항원-결합 부위는 CH3 도메인의 AB 루프에서 서열번호 1로 제시된 아미노산 서열을 포함하고, EF 루프에서 서열번호 3으로 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
서열번호 1로 제시된 아미노산 서열은 바람직하게는 CH3 도메인의 잔기 11 내지 18에 위치하고/하거나; 서열번호 3으로 제시된 아미노산 서열은 CH3 도메인의 잔기 92 내지 101에 위치하고; 상기 아미노산 잔기 넘버링은 ImMunoGeneTics (IMGT) 넘버링 방식에 따른다.
항체 분자의 LAG-3 항원-결합 부위는 바람직하게는 항체 분자의 CH3 도메인의 CD 루프에 하기 서열 중 하나를 추가로 포함할 수 있다:
(i) SNGQPENNY (서열번호 2, 8 및 18);
(ii) SNGQPEDNY (서열번호 13);
(iii) SNGYPEIEF (서열번호 23);
(iv) SNGIPEWNY (서열번호 28);
(v) SNGYAEYNY (서열번호 33);
(vi) SNGYKEENY (서열번호 38);
(vii) SNGVPELNV (서열번호 43); 또는
(viii) SNGYQEDNY (서열번호 48).
바람직하게는, 항체 분자의 LAG-3 항원-결합 부위는 바람직하게는 항체 분자의 CH3 도메인의 CD 루프에 하기 서열 중 하나를 추가로 포함한다: CH3 도메인의 CD 루프에서 서열번호 2, 28, 또는 38로 제시된 아미노산 서열. 더욱 바람직하게는, 항체 분자의 LAG-3 항원-결합 부위는 CH3 도메인의 CD 루프에서 서열번호 2로 제시된 아미노산 서열을 추가로 포함한다.
서열번호 2, 8, 13, 18, 23, 28, 33, 38, 43, 또는 48로 제시된 아미노산 서열은 바람직하게는 항체 분자의 CH3 도메인의 잔기 43 내지 78에 위치하고, 이때 잔기는 IMGT 넘버링 방식에 따라 넘버링된다.
LAG-3 항원-결합 부위의 서열 이외에, 항체 분자의 CH3 도메인의 서열은 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는, CH3 도메인은 인간 면역글로불린 G 도메인, 예컨대 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 CH3 도메인, 가장 바람직하게는 인간 IgG1 CH3 도메인이다. 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 CH3 도메인의 서열은 당해 분야에 공지되어 있다.
바람직한 실시형태에서, 항체 분자는 서열번호 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50으로 제시된 CH3 도메인, 더욱 바람직하게는 서열번호 5, 30, 또는 40으로 제시된 CH3 도메인, 가장 바람직하게는 서열번호 5로 제시된 CH3 도메인을 포함한다. 대안적으로, 항체 분자는 서열번호 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50에 대해, 바람직하게는 서열번호 5, 30, 또는 40에 대해, 더욱 바람직하게는 서열번호 5에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CH3 도메인을 포함할 수 있다.
항체 분자는 CH2 도메인을 추가로 포함할 수 있다. CH2 도메인은 바람직하게는 인간 IgG 분자의 경우에서와 같이 CH3 도메인의 N-말단에 위치한다. 항체 분자의 CH2 도메인은 바람직하게는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 CH2 도메인, 더욱 바람직하게는 인간 IgG1의 CH2 도메인이다. 인간 IgG 도메인의 서열은 당해 분야에 공지되어 있다. 바람직한 실시형태에서, 항체 분자는 서열번호 53 또는 서열번호 54로 제시된 서열을 갖는 IgG CH2 도메인, 또는 서열번호 53 또는 서열번호 54에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CH2 도메인을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 항체 분자는 서열번호 6, 7, 11, 12, 16, 17, 21, 22, 26, 27, 31, 32, 36, 37, 41, 42, 46, 47, 51, 또는 52로 제시된 서열, 또는 서열번호 6, 7, 11, 12, 16, 17, 21, 22, 26, 27, 31, 32, 36, 37, 41, 42, 46, 47, 51, 또는 52로 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 항체 분자는 서열번호 6, 7, 31, 32, 41, 또는 42로 제시된 서열, 또는 서열번호 6, 7, 31, 32, 41, 또는 42에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 더 더욱 바람직하게는, 항체 분자는 서열번호 6 또는 7로 제시된 서열, 또는 서열번호 6 또는 7에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 항체 분자는 인간 면역글로불린 G 분자, 예컨대, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 분자, 보다 바람직하게는, 인간 IgG1 분자이다. 인간 면역글로불린 G 분자의 서열은 당업계에 공지되어 있는, 본원에 기재된 CH3 도메인 또는 CH3 도메인 서열을 이러한 분자에 도입하는 것은 당업자에게 어떤 어려움을 주지 않을 것이다.
항체 분자는 바람직하게는 서열번호 92 및 93으로 제시된 VH 및/또는 VL 도메인의 CDR을 포함한다. 소정의 VH 또는 VL 도메인 내의 CDR 서열을 측정하는 방법은 당업계에 공지되며, 카밧 (Kabat) 및 IMGT 넘버링 방식을 포함한다. 보다 바람직하게는, 항체 분자는 서열번호 86 또는 91로 제시된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 6개 모두의 상보성 결정 영역 (complementarity determining region)을 포함한다. 바람직하게는, 항체 분자는 각각 서열번호 92 및 93으로 제시된 VH 및/또는 VL 도메인을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 항체 분자는 서열번호 94 내지 113 중 임의의 서열로 제시된 중쇄 서열, 또는 서열번호 94 내지 113 중 임의의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하되, 단, 이 경우, 상기 중쇄 서열의 VH 도메인은 변하지 않은 채로있다. 보다 바람직하게는, 항체 분자는 서열번호 94, 95, 104, 105, 108 및 109 중 임의의 서열로 제시된 중쇄 서열, 또는 서열번호 94, 95, 104, 105, 108 및 109 중 임의의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하되, 단, 이 경우, 상기 중쇄 서열의 VH 도메인은 변하지 않은 채로있다. 보다 더욱 바람직하게는, 항체 분자는 서열번호 94 또는 95로 제시된 중쇄 쇄열, 또는 서열번호 94 또는 95와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하되, 단, 이 경우, 상기 중쇄 서열의 VH 도메인은 변하지 않은 채로있다.
추가로 바람직한 실시형태에서, 항체 분자는 추가적으로, 또는 대안적으로 서열번호 116으로 제시된 경쇄 서열, 또는 서열번호 116과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함할 수 있으며, 단, 이 경우, 상기 경쇄 서열의 VL 도메인은 변하지 않은 채로있다.
항체 분자는 바람직하게는 PD-L1 및 LAG-3에 동시에 결합할 수 있다. PD-L1 및 LAG-3은, 예를 들어, 2개의 상이한 세포 상에 존재할 수 있다. 이론에 구애됨 없이, 이는, 세포간의 가교-결합 (cross-linking), 및 PD-L1 및/또는 LAG-3에 대한 자극을 이용할 수 없게 만드는 이들의 내재화 (internalization)를 초래하는 것으로 여겨진다.
본 발명자들은, (i) PD-L1에 대한 CDR-기반 항원 결합 부위; 및 (ii) 본 발명에 따른 항체 분자의 CH3 도메인에 위치한 LAG-3 항원 결합 부위를 포함하는 항체 분자, FS18-7-9/84G09가 놀랍게도, 심지어 샘플 중에 LAG-3 및 PD-L1 발현 세포의 혼합물이 존재하는 경우에도, LAG-3 발현 세포가 아닌, PD-L1 발현 세포의 보체 의존적 세포독성 (Complement Dependent Cytotoxicity: CDC)을 매개한다는 것을 밝혔다. 이러한 특성은, FS18-7-9/84G09를 사용하는 경우, 항체 분자의 CDR-기반 항원 결합이 종양 세포를 표적화하고, 항제 분자의 불변 도메인에 위치한 결합 부위가 면역 세포를 표적화하면서, 면역 세포는 항체 분자에 결합함으로써 매개되는 CDC로부터 보호될 수 있는 반면 종양 세포는 CDC에 영향을 받을 수 있기 때문에, 유용할 것으로 예상된다.
따라서, 추가의 실시형태에서, 본 발명은 종양 항원 및 면역 세포 항원에 결합하는 항체 분자에 관한 것이며, 여기서, 항체 분자는
(i) 종양 항원에 대한 CDR-기반 항원 결합 부위; 및
(ii) 항체 분자의 불변 도메인, 바람직하게는, CH3 또는 CH2 도메인, 보다 바람직하게는, CH3 도메인에 위치한 면역 세포 항원에 대한 항원 결합 부위
를 포함하며,
여기서, 상기 항체 분자는, 상기 면역 세포가 항체 분자에 의해 결합되는 경우, 상기 면역 세포 항원을 포함하는 면역 세포의 유의한 보체 의존적 세포독성을 매개하지 않거나, 또는 유의하게 매개하지 않는다.
바람직하게는, 항체 분자는, 상기 종양 세포가 항체 분자에 결합되는 경우, 상기 종양 항원을 포함하는 종양 세포의 보체 의존적 세포 독성을 추가로 매개한다.
항체 분자의 CDC를 결정하는 방법은 당업계에 공지되며, 본원에 기재된다.
본 발명자들은, (i) PD-L1에 대한 CDR-기반 항원 결합 부위; 및 (ii) 본 발명에 따른 항체 분자의 CH3 도메인에 위치한 LAG-3 항원 결합 부위를 포함하는, 항체 분자, FS18-7-9/84G09가 놀랍게도, PD-L1 발현 세포의 ADCC와 비교하여, LAG-3 발현 세포의 더 낮은 항체 의존적 세포독성 (Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity: ADCC)를 매개한다는 것을 추가로 밝혔다. 이러한 특성은, FS18-7-9/84G09를 사용하는 경우, 항체 분자의 CDR-기반 항원 결합이 종양 세포를 표적화하고, 항체 분자의 불변 도메인에 위치한 결합 부위가 면역 세포를 표적화하면서, 면역 세포가 항체에 결합된 종양 세포보다 더 낮은 ADCC에 영향을 받을 수 있기 때문에, 유용할 것으로 예상된다.
본원에 설명된 바와 같이, 항체 분자의 ADCC 활성을 감소 또는 폐기 (abrogating)시키기 위한 돌연변이가 당업계에 공지된다. 이러한 하나의 돌연변이는 본원에 기재된 LALA 돌연변이이다. FS18-7-9/84G09가 LAG-3-발현 세포에 대해 더 낮은 ADCC 활성을 갖는다는 것이 예상치 못하게 밝혀졌다. ADCC 활성을 완전히 폐기시킬 필요가 없는 경우, 이점이 나타날 수 있다.
따라서, 추가의 실시형태에서, 본 발명은 종양 항원 및 면역 세포 항원에 결합하는 항체 분자에 관한 것이며, 여기서, 항체 분자는
(i) 종양 항원에 대한 CDR-기반 항원 결합 부위; 및
(ii) 항원 분자의 불변 도메인, 바람직하게는, CH3 또는 CH2 도메인, 보다 바람직하게는, CH3 도메인에 위치한 면역 세포 항원에 대한 항원 결합 부위
를 포함하며,
여기서, 항체 분자는, 상기 종양 세포가 항체 분자에 결합되는 경우의 상기 종양 항원을 포함하는 종양 세포에 대한 ADCC 보다, 상기 면역 세포가 항원 분자에 결합되는 경우의 상기 면역 세포 항원을 포함하는 면역 세포에 대한 더 적은 ADCC를 일으킨다. 바람직하게는, 항체 분자는 상기 면역 세포가 항체 분자에 결합되는 경우의 상기 면역 세포 항원을 포함하는 면역 세포의 유의한 ADCC를 매개하지 않거나, 또는 매개하지 않는다. 항체 분자는, 상기 면역 세포가 항체 분자에 결합된 경우의 상기 면역 세포 항원을 포함하는 면역 세포의 유의한 보체 의존적 세포독성을 추가로 매개할 수 없거나, 또는 매개할 수 없고/없거나, 상기 종양 세포가 항체 분자에 결합되는 경우의 상기 종양 항원을 포함하는 종양 세포의 보체 의존적 세포독성을 매개할 수 있다.
항체 분자의 ADCC를 측정하는 방법이 당업계에 공지되며, 본원에 기재된다.
다양한 종양 항원 및 면역 세포 항원이 당업계에 공지된다. 종양 항원 및 면역 세포 항원은 바람직하게는 세포-표면 항원이다. 면역 세포 항원은 바람직하게는 종양-침윤성 림프구 상에 제시된 항원이다.
면역 세포 항원에 대한 항원 결합 부위는 바람직하게는 항원 분자의 불변 도메인의 1개 이상의 구조적 루프, 예컨대, 불변 도메인의 AB, CD 및/또는 EF 루프에서 1개 이상의 변형을 포함한다. 예를 들어, 결합 부위는 본원에 기재된 LAG-3 결합 부위일 수 있다.
본 발명의 항체 분자는 면역계 조절인자 (immune system modulator), 세포독성 분자, 방사성 동위원소, 또는 검출가능 표지에 추가로 접합될 수 있다. 면역계 조절인자는 시토카인인 세포독성 분자일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 분자를 인코딩하는 핵산뿐만 아니라 이러한 핵산을 포함하는 벡터도 제공한다.
본 발명의 핵산 또는 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포가 또한 제공된다. 이러한 재조합 숙주 세포는 본 발명의 항체 분자를 생산하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 분자를 생산하는 방법이 제공되고, 이 방법은 항체 분자의 생산을 위한 조건하에서 재조합 숙주 세포를 배양하는 것을 포함한다. 방법은 항체 분자를 단리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 분자는 치료적 응용, 특히 암 치료와 같은 인간에서의 치료적 적용에서 응용을 발견할 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명에 따른 항체 분자 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 또한 제공된다.
본 발명은 또한 환자에서 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 항체 분자를 제공한다. 본 발명에 따른 항체 분자의 치료학적 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법이 또한 제공된다. 환자에서 암의 치료를 위한 의약품의 제조에 사용하기 위한 본 발명에 따른 항체 분자의 용도가 제공된다. 치료는 환자에게 항-종양 백신 및/또는 화학요법제를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
도 1A는 제2 친화도 성숙에 따라 동정된 9개 Fcab의 모체 Fcab, FS18-7-9에 대한 서열 정렬을 나타낸다: FS18-7-32; FS18-7-33; FS18-7-36; FS18-7-58; FS18-7-62; FS18-7-65; FS18-7-78; FS18-7-88; 및 FS18-7-95. 도 1B는 모체 Fcab, FS18-7-9의 서열과 이들 Fcab 각각의 서열 동일성 백분율을 나타내었다.
도 2는 T 세포 활성화 검정 (T cell activation assay)의 결과를 나타낸다. 구체적으로, 도 2는 mAb2 FS18-7-9/84G09 (도 A-C), 또는 FS18-7-62/84G09 또는 FS18-7-78/84G09 (도 2D-F), 및 대조군 항체로 처리된 세포주의 패널에서, T 세포 활성화의 지표인, IL-2 방출의 대표적인 플롯을 나타낸다. 도 2A: LAG-3 및 PD-L1을 사용한 검정은 활성화되기 위하여 두 표적 (FS18-7-9/84G09LALA, FS18-7-9/4420LALA+84G09, 25F7+84G09LALA 또는 25F7+S1LALA)의 억제를 필요로 한다. 도 2B: LAG-3을 사용한 검정은 활성화를 위하여 LAG-3의 억제 만을 필요로 한다 (FS18-7-9/84G09LALA, FS18-7-9/4420LALA+84G09, 25F7+84G09LALA, 25F7+S1LALA, 25F7, FS18-7-9/4420 LALA). 도 2C: PD-L1을 사용한 검정은 활성화를 위하여 PD-L1의 억제 만을 필요로 한다 (FS18-7-9/84G09LALA, FS18-7-9/4420LALA+84G09, 25F7+84G09LALA, 25F7+S1LALA, 84G09LALA). 도 2D: LAG-3 및 PD-L1을 사용한 검정은 활성화되기 위하여 두 표적 (FS18-7-62/84G09LALA, FS18-7-78/84G09LALA, FS18-7-62/4420LALA+84G09, FS18-7-78/4420LALA+84G09, 25F7+84G09LALA 또는 25F7+S1LALA)의 억제를 필요로 한다. 도 2E: LAG-3을 사용한 검정은 활성화를 위하여 LAG-3의 억제만을 필요로 한다 (FS18-7-62/84G09LALA, FS18-7-62/4420LALA, FS18-7-78/84G09LALA, FS18-7-78/4420LALA, FS18-7-62/4420LALA+84G09, FS18-7-78/4420LALA+84G09, 25F7+84G09LALA 또는 25F7+S1LALA). 도 2F: PD-L1을 사용한 검정은 활성화를 위하여 PD-L1의 억제 만을 필요로 한다 (FS18-7-62/84G09LALA, FS18-7-78/84G09LALA, FS18-7-62/4420LALA+84G09, FS18-7-78/4420LALA+84G09, 25F7+84G09LALA 또는 25F7+S1LALA).
도 3은, 기능적으로 시노몰구스 교차-반응성 (cross-reactivity)을 나타내는, cLAG-3 + cPD-L1 모두, 및 cLAG-3 또는 cPD-L1 단독의 존재에서, IL-2 방출에 의해 지시되는 바와 같이, FS18-7-9/84G09가 T 세포 활성화를 유도할 수 있었다는 것을 나타낸다.
도 4는, SEB 검정으로부터의 대표적인 플롯을 나타낸다. LAG-3/PD-L1 mAb2 및, LAG-3/4420 mAb2 + 84G09LALA의 조합은 84G09LALA mAb 단독일 때보다 더욱 큰 활성화를 나타냈으나, 반면, LAG-3/4420 mAb2 또는 4420 mAb는 유의한 활성을 나타내지 않았다.
도 5는 비-확립된 MC38 동계 종양 모델에서 20일에 최종 종양 (end tumor) 무게를 나타낸다. LAG-3/PD-L1 mAb2 (FS18-29/S1) 처리된 마우스는 기준 (benchmark) mAb, C9B7W 및 S1의 조합으로 처리된 마우스보다 유의하게 더 적은 무게의 최종 종양을 가졌다.
도 6은 비-확립된 MC38 동계 종양 모델의 성장 곡선을 나타낸다. LAG-3/PD-L1 mAb2 (FS18-29/S1) 처리된 마우스는 기준 mAb, C9B7W 및 S1의 조합으로 처리된 마우스, 또는 S1 단독으로 처리된 마우스 보다 더 작은 종양을 가졌다. LAG-3/4420 mAb2 및 기준 항-LAG-3 mAb는 종양 성장에 더 적은 영향을 끼쳤다.
도 7은 확립된 MC38 동계 종양 모델에서 24일에 최종 종양 무게를 나타낸다. LAG-3/PD-L1 mAb2 (FS18-29/S1)는 기준 항체, C9B7W 및 S1의 조합과 마찬가지로 종양 성장 억제에 있어서 효과적이었다. FS18-29/4420 단독은 종양 성장에 주목할만한 영향을 보이지 않았고, S1 및 C9B7W는 생성된 종양 성장에 미미한 영향을 미쳤다.
도 8은 확립된 MC38 동계 종양 모델의 종양 성장 곡선을 나타낸다. LAG-3/PD-L1 mAb2 (FS18-29/S1) 처리된 마우스는 기준 mAb, C9B7W 및 S1의 조합으로 처리된 마우스에서와 유사한 종양 부피를 가졌다. S1 또는 C9B7W 단독으로 처리된 마우스는 중간 정도의 종양 부피를 나타낸 반면, LAG-3/4420 mAb2 처리는 종양 성장에 영향을 끼치지 않았다.
도 9는 비-확립된 CT26 동계 종양 모델에서 20일에 최종 종양 무게를 나타냈다. LAG-3/PD-L1 mAb2 (FS18-29/S1 및 FS18-35/S1)은 기준 항체, C9B7W 및 S1의 조합보다 더욱 크게 종양 성장을 억제했다.
도 10은 비-확립된 CT26 동계 종양 모델의 종양 성장 곡선을 나타낸다. 종양 성장 억제에 있어서, FS18-35/S1 대 IgG 대조군에서의 통계학적으로 입증된 유의한 차이가 존재했다. 이러한 통계학적으로 유의한 차이는 기준 항체의 조합 대 IgG 대조군에서 관찰되지 않았다.
도 11은 종양 성장 억제를 위한 mAb2에서의 LALA 돌연변이의 효과를 비교하기 위하여 사용되는 비-확립된 MC38 동계 종양 모델에서 22일에 최종 종양 무게를 나타낸다. LALA 돌연변이를 함유 및 비함유하는 mAb2 처리된 마우스 간의 최종 종양 무게의 통계학적으로 유의한 차이는 존재하지 않았다.
도 12는 종양 성장 억제를 위한 LALA 돌연변이를 함유 및 비함유하는 mAb2의 효과를 비교하기 위하여 사용되는 비-확립된 MC38 동계 종양 모델의 종양 성장 곡선을 나타낸다. LALA 돌연변이를 함유 및 비함유하는 mAb2 처리된 마우스 간의 종양 성장 곡선의 통계학적으로 유의한 차이는 존재하지 않았으나, LALA 돌연변이를 함유하는 분자에 의한 증가된 종양 성장 억제에 관한 경항이 존재하였다.
도 13은 T 세포 LAG-3 발현에 대한 mAb2 처리의 효과를 나타낸다. mAb2 FS18-29/S1, FS18-29/4420, S1, FS18-29/4420 및 S1, 또는 대조군 항체 4420으로 처리된, CD8 (A), CD4 (B) 및 FoxP3 (C) 종양 침윤성 림프구 (TIL)에서의 LAG-3 발현은 종양 접종 후 19일 및 23일째에 나타났고, 이는 각각 마지막 mAb2/항체 투약 후 3일 및 7일째에 상응한다. LAG-3 발현은 19 및 23일 째에 mAb2 FS18-29/S1로 처리 후 감소하였다. FS18-29/4420 및 S1의 조합이 주어진 동물은 LAG-3 발현에서 감소를 나타냈으나, 이러한 효과는 23일까지 지속된 반면, 개별적으로 투여된 FS18-29/4420 또는 S1은 LAG-3의 발현 감소를 거의 내지는 아예 유발하지 않았다.
도 14는 젖산 탈수소효소 (lactate dehydrogenase: LDH) 방출 CDC 검정을 이용한 다양한 항체/mAb2 처리 후 PD-L1 및 LAG-3 발현 라지 세포의 용해 백분율을 나타낸다. A 및 B는 각각 PD-L1 및 LAG-3을 발현하는 라지 세포의 CDC- 매개된 용해를 나타낸다. 항-LAG-3 항체 25F7, 항-PD-L1 항체 84G09, LALA 돌연변이를 포함하는 항-PD-L1 항체 84G09, 항-CD20 항체 리툭시맙 (Rituximab), mAb2 FS18-7-9/84G09, LALA 돌연변이를 포함하는 mAb2 FS18-7-9/84G09, 또는 LALA 돌연변이를 포함하는 리툭시맙으로 세포를 인큐베이션하였다. 새끼 토끼 (baby rabbit) 보체로 처리 후 4시간에 LDH의 방출을 측정하였고, 전체 용해율과 비교하여 백분율로 나타냈다. 항체/mAb2 처리의 농도를 X-축에 나타낸다. 곡선에 전체에 걸쳐 비교할 수 있도록, 모든 곡선의 기울기에 대해 공유 값 (shared value)을 설정하였다.
도 15는 유세포 분석 기반 CDC 검정을 사용한 다양한 처리 후 PD-L1 및 LAG-3을 발현하는 라지 세포의 사멸율을 나타낸다. 차별적으로 형광 표지된 PD-L1 및 LAG-3을 발현하는 세포의 혼합물을 대조군 항체 4420, 항-CD20 항체 리툭시맙 (RIT), 항-LAG-3 항체 25F7 및 항-PD-L1 항체 84G09의 조합, 또는 mAb2 FS18-7-9/84G09로 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 새끼 토끼 보체로 처리하고, 사멸한 세포만을 염색하는 염료를 사용하여 염색하였다. 2개 세포 군 중 사멸한 세포의 백분율을 전체 세포의 백분율로 평가하였다. 각 처리 후 평가된 세포 유형 (PD-L1 발현 또는 LAG-3 발현, 차별 형광 표지로 식별)을 관련 처리의 명칭, 예를 들어, 4420 PDL1 이후 도 15에 나타내었으며, 이는 대조군 항체 4420으로 처리 후 PD-L1을 발현하는 라지 세포의 생육성의 평가를 지칭한다. 항체/mAb2 처리의 농도를 X-축에 나타낸다.
도 16은 젖산 탈수소효소 (LDH) 방출 ADCC 검정을 이용한 다양한 처리 후 PD-L1 및 LAG-3을 발현하는 라지 세포의 용해율 (세포독성)을 나타낸다. 세포를, 항-CD20 항체 리툭시맙, 항-PD-L1 항체 84G09, mAb2 FS18-7-9/84G09, LALA 돌연변이를 포함하는 리툭시맙, LALA 돌연변이를 포함하는 mAb2 FS18-7-9/84G09, 항-LAG-3 항체 25F7, LALA 돌연변이를 포함하는 항-PD-L1 항체 84G09, 대조군 항체 4420, 또는 LALA 돌연변이를 포함하는 대조군 항체 4420으로 처리하였다. 이어서, 처리된 세포를 1차 NK 세포로 동시-인큐베이션하고, 특이적인 LDH 방출을 표적 세포의 전체 용해와 비교하여 백분율로 측정하였다. 항체/mAb2 처리의 농도를 X-축에 나타낸다.
본 발명은 PD-L1 및 LAG-3에 결합하는 항체 분자에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 항체 분자는 PD-L1에 대한 CDR-기반 항원 결합 부위 및 항체 분자의 불변 도메인에 위치한 LAG-3 항원 결합 부위를 포함한다. 용어 "PD-L1" 및 "LAG-3"은 맥락이 달리 요구하지 않는 한, 인간 PD-L1 및 인간 LAG-3, 뮤린 PD-L1 및 뮤린 LAG-3, 및/또는 시노몰구스 원숭이 PD-L1 및 시노몰구스 원숭이 LAG-3를 지칭할 수 있다. 바람직하게는, 용어 "PD-L1" 및 "LAG-3"은 맥락이 달리 요구하지 않는 한, 인간 PD-L1 및 인간 LAG-3을 지칭한다.
용어 "항체 분자"는 천연이든 부분적으로 또는 전체적으로 합성이든지 간에, 면역글로불린을 설명한다. 항체 분자는 인간 또는 인간화된 것일 수 있다. 항체 분자는 바람직하게는 단클론 항체 분자이다. 항체 분자의 예는 면역글로불린 이소형, 예컨대 면역글로불린 G, 및 이들의 이소형 서브클래스, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, 뿐만 아니라 이들의 단편이다.
따라서, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체 분자"는 항체 단편을 포함하되, 단 상기 단편은 항체 분자의 불변 도메인, 예컨대 CH1, CH2, 또는 CH3 도메인, 바람직하게는 CH3 도메인에 위치한 PD-L1 및 LAG-3에 대한 CDR-기반 항원 결합 부위를 포함한다. 따라서, 맥락이 달리 요구하지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체 분자"는 "항체 분자 또는 이의 단편"과 동의이다.
단클론 및 다른 항체를 취하여 재조합 DNA 기법을 사용함으로써 원래 항체의 특이성을 유지하면서 다른 항체 또는 키메라 분자를 생산할 수 있다. 이러한 기법은 상이한 면역글로불린 내로의 CDR, 또는 가변 영역 및/또는 LAG-3 항원 결합 부위를 제공하는 불변 도메인 서열의 도입을 포함할 수 있다. 한 면역글로불린의 CDR의 다른 면역글로불린 내로의 도입은, 예를 들어 EP-A-184187, GB 2188638A 또는 EP-A-239400에 기술되어 있다. 유사한 기법이 관련 불변 도메인에 대해 이용될 수 있다. 대안적으로, 항체 분자를 생산하는 하이브리도마 또는 다른 세포는 생산된 항체의 결합 특이성을 변경하거나 변경하지 않을 수 있는 유전적 돌연변이에 적용될 수 있다.
항체는 다수의 방식으로 변형될 수 있으므로, 용어 "항체 분자"는 천연이든 전부 또는 부분적으로 합성이든지 간에, 면역글로불린 결합 도메인을 포함하는 임의의 폴리펩티드를 비롯한, 항체 단편, 항체의 유도체, 기능적 등가물 및 동족체를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 또 다른 폴리펩티드에 융합된 면역글로불린 결합 도메인 또는 등가물을 포함하는 키메라 분자가 포함된다. 키메라 항체의 클로닝 및 발현은 EP-A- 0120694 및 EP-A-0125023에 기재된다.
CDR 서열 및 CH3 도메인 둘 다를 포함하는 항체 단편의 예는 CH3 도메인에 결합된 scFv를 포함하는 미니바디 (minibody)이다 (Hu et al. (1996), Cancer Res., 56(13): 3055-61).
본 발명의 항체 분자는 PD-L1 및 LAG-3에 결합한다. 이 맥락에서의 결합은 특이적 결합을 지칭할 수 있다. 용어 "특이적"은 항체 분자가 본원에서 PD-L1 및 LAG-3인, 그의 특이적 결합 파트너가 아닌 분자에 임의의 유의미한 결합을 나타내지 않는 상황을 지칭할 수 있다. 용어 "특이적"은 또한 항체 분자가 에피토프를 보유하는 다양한 항원에 결합할 수 있을 것인 경우에 항체 분자가 다수의 항원에 위해 운반되는 특정 에피토프, 예컨대 PD-L1 및 LAG-3 상의 에피토프에 특이적인 경우에 적용가능하다.
LAG-3은 그의 가장 밀접한 관련 단백질인, CD4와 40% 서열 동일성을 공유한다. 본 발명자들은 CD4에 대한 결합에 대해서, 서열번호 1 내지 3으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는, FS18-7-9 Fcab를 시험하였다. FS18-7-9 Fcab는 CD4에 대해 아무런 결합도 나타내지 않았는데, 이는 항체 분자가 LAG-3에 특이적으로 결합함을 입증한다. 따라서, 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 항체 분자의 LAG-3 결합 부위는 CD4에 결합하지 않거나 임의의 유의미한 결합을 나타내지 않는다.
본 발명의 항체 분자는 바람직하게는 LAG-3 항원 결합 부위를 포함한다. LAG-3 항원 결합 부위는 항체 분자의 불변 도메인, 예컨대 CH1, CH2, CH3 또는 CH4 도메인에 위치한다. 바람직하게는, LAG-3 항원 결합 부위는 항체 분자의 CH3 도메인에 위치한다. LAG-3 결합 부위는 바람직하게는 아미노산 서열 WDEPWGED (서열번호 1) 및 PYDRWVWPDE (서열번호 3)을 포함한다. 이들 서열은 실시예에 기술된 바와 같은 광범위한 스크리닝 및 특성화 프로그램에 따라 본 발명자들에 의해 동정된 선두 (lead) 항-LAG-3 Fcab 클론 모두에 존재하였다.
서열번호 1 및 2에 기재된 아미노산 서열은 바람직하게는 항체 분자의 불변 도메인의 구조적 루프에 존재한다. 새로운 항원-결합 부위를 생성하기 위한 항체 불변 도메인의 구조적 루프 영역 내로의 서열 도입은, 예를 들어 WO2006/072620 및 WO2009/132876에 기술되어 있다.
항체 불변 도메인의 구조적 루프는 AB, CD 및 EF 루프를 포함한다. CH3 도메인에서, AB, CD, 및 EF 루프는 CH3 도메인의 잔기 11-18, 43-78 및 92-101에 위치하고, 이때 아미노산 잔기 넘버링은 ImMunoGeneTics (IMGT) 넘버링 방식에 따른다. 서열번호 1로 제시된 아미노산 서열은 바람직하게는 불변 도메인의 AB 루프에 위치한다. 서열번호 3으로 제시된 아미노산 서열은 바람직하게는 불변 도메인의 EF 루프에 위치한다. 더욱 바람직하게는, 서열번호 1로 제시된 아미노산 서열은 CH3 도메인의 잔기 11 내지 18에 위치하고/하거나; 서열번호 3으로 제시된 아미노산 서열은 CH3 도메인의 잔기 92 내지 101에 위치하고, 상기 아미노산 잔기 넘버링은 IMGT 넘버링 방식에 따른다.
또한, 항체 분자는 바람직하게는 항체 분자의 불변 도메인의 구조적 루프에서 서열번호 2, 8, 13, 18, 23, 28, 33, 38, 43, 또는 48, 더욱 바람직하게는 서열번호 2, 28, 또는 38, 더 더욱 바람직하게는 서열번호 2로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 구조적 루프는 바람직하게는 CD 루프이고 불변 도메인은 바람직하게는 CH3 도메인이다. 서열번호 2, 8, 13, 18, 23, 28, 33, 38, 43, 또는 48로 제시된 아미노산 서열은 바람직하게는 CH3 도메인의 잔기 43 내지 78에 위치하고, 상기 아미노산 서열 넘버링은 IMGT 넘버링 방식에 따른다.
본 발명의 항체 분자는 CH3 도메인의 위치 36에 글루탐산 잔기 (E) 및/또는 위치 85.2에 티로신 잔기 (Y)를 추가로 포함할 수 있고 (도 1A에 나타난 바와 같음), 상기 아미노산 넘버링은 IMGT 넘버링 방식에 따른다. 구체적으로, 서열번호 8로 제시된 CD 구조적 루프 영역을 포함하는 항체 분자는 바람직하게는 CH3 도메인의 위치 36에 글루탐산 잔기 (E)를 추가로 포함한다. 유사하게는, 서열번호 18로 제시된 CD 구조적 루프 영역을 포함하는 항체 분자는 바람직하게는 CH3 도메인의 위치 85.2에 티로신 잔기 (Y)를 추가로 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 항체 분자는 서열번호 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50으로 제시된 서열을 포함하고, 갖거나, 또는 이로 구성되는 CH3 도메인, 바람직하게는 서열번호 5, 30, 또는 40으로 제시된 서열을 갖는 CH3 도메인, 더욱 바람직하게는, 서열번호 5로 제시된 서열을 갖는 CH3 도메인을 포함한다.
본 발명의 항체 분자는 서열번호 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50으로 제시된 서열을 포함하고, 갖거나, 또는 이로 구성되는 CH3 도메인을 포함할 수 있고, 상기 CH3 도메인 서열은 서열번호 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50으로 나타낸 서열의 C-말단 바로 (immediate C-terminus)에 리신 잔기 (K)를 추가로 포함한다. 따라서, 예를 들어, 본 발명의 항체 분자는 서열번호 5로 나타낸 서열의 C-말단에 리신 잔기를 갖는 서열번호 5로 제시된 서열을 포함하고, 갖고, 또는 이로 구성되는 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 CH3 도메인의 서열은 다음과 같을 것이다:
GQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 135)
또한, 본 발명의 항체 분자는 면역글로불린 G 분자의 CH2 도메인, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 분자의 CH2 도메인을 포함할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 항체 분자는 IgG1 분자의 CH2 도메인을 포함할 수 있다. CH2 도메인은 서열번호 53으로 제시된 서열을 가질 수 있다.
항체 분자의 CH2 도메인은 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIII와 같은 하나 이상의 Fcγ 수용체 및/또는 보체에 대한 CH2 도메인의 결합을 감소 또는 파괴하기 위한 돌연변이를 포함할 수 있다. 인간 IgG 도메인의 CH2 도메인은 일반적으로 Fcγ 수용체 및 보체에 결합하고 본 발명자들은 Fcγ 수용체에 대한 감소된 결합이 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 감소시킬 것이고 보체에 대한 감소된 결합은 항체 분자의 보체-의존적 세포독성 (CDC) 활성을 감소시킬 것으로 가정된다. 하나 이상의 Fcγ 수용체 및 보체에 대한 CH2 도메인의 결합을 감소 또는 파괴하기 위한 돌연변이는 공지되어 있으며 문헌 [Bruhns, et al. (2009) 및 Xu et al. (2000)]에 기술된 "LALA 돌연변이"를 포함한다. 따라서, 항체 분자는 CH2 도메인을 포함할 수 있고, 상기 CH2 도메인은 CH2 도메인의 위치 4 및 5에 알라닌 잔기를 포함하며, 상기 넘버링은 IMGT 넘버링 방식에 따른다. 예를 들어, 항체 분자는 서열번호 54로 제시된 서열을 포함하고, 갖고, 또는 이로 구성되는 IgG1 CH2 도메인을 포함한다.
본 발명에 따른 항체 분자는 PD-L1에 대한 CDR-기반 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 용어 "CDR-기반 항원 결합 부위"는 6개 CDR로 이루어진 항체 분자 가변 영역의 항원-결합 부위를 지칭한다. PD-L1에 대한 항체 분자의 제조, 및 이러한 항체 분자의 CDR 서열의 결정은 당업자의 능력 범위 내이고 다수의 적합한 기법이 당해 분야에 공지되어 있다.
바람직하게는, 본 발명의 항체 분자는 항체 84G09의 HCDR3를 포함한다. HCDR3은 항체 분자의 특이성을 결정하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져있다 (Segal et al., (1974), PNAS, 71:4298-4302; Amit et al., (1986), Science, 233:747-753; Chothia et al., (1987), J. Mol. Biol., 196:901-917; Chothia et al., (1989), Nature, 342:877-883; Caton et al., (1990), J. Immunol., 144:1965-1968; Sharon et al., (1990a), PNAS, 87:4814-4817; Sharon et al., (1990b), J. Immunol., 144:4863-4869; Kabat et al., (1991b), J. Immunol., 147:1709-1719).
항체 분자는 항체 84G09의 HCDR1, HCDR2, LCDR1, LCDR2 및/또는 LCDR3를 추가로 포함할 수 있다. 당업자는 서열번호 92 및 93에 각각 나타난 항체 84G09의 VH 및 VL 도메인 서열로부터의 CDR의 서열을 결정하는데 어려움을 겪지 않을 것이다. CDR 서열은, 예를 들어, Kabat (Kabat, E.A. et al., (1991)) 또는 IMGT 넘버링 방식에 따라 결정될 수 있다.
IMGT 넘버링 방식에 따른 항체 84G09의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 서열은 서열번호 86, 87, 88, 89, 90, 및 91에서 각각 설정된다.
Kabat에 따른 항체 84G09의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 서열은 서열번호 136, 137, 138, 139, 140, 및 141에서 각각 설정된다.
항체는 또한 항체 84G09의 VH 및 VL 도메인을 포함할 수 있다. 항체 84G09의 VH 및 VL 도메인은 서열번호 92 및 93에 각각 나타난다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 항체 분자는 (i) 항체 84G09의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 포함하는 PD-L1에 대한 CDR-기반 항원 결합 부위; 및 (ii) 상기 항체 분자의 CH3 도메인에 위치한 LAG-3 항원 결합 부위를 포함하며, 여기서, 상기 LAG-3 결합 부위는 서열번호 1 및 3에 기재된 아미노산 서열, 및 서열번호 2, 8, 13, 18, 23, 28, 33, 38, 43 및 48으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
보다 바람직하게는, 본 발명의 항체 분자는 (i) 항체 84G09의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 포함하는 PD-L1에 대한 CDR-기반 항원 결합 부위; 및 (ii) 상기 항체 분자의 CH3 도메인에 위치한 LAG-3 항원 결합 부위를 포함하며, 여기서, 상기 LAG-3 결합 부위는 서열번호 1 및 3에 기재된 아미노산 서열, 및 서열번호 2, 28 및 38으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
보다 더욱 바람직하게는, 본 발명의 항체 분자는 (i) 항체 84G09의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 포함하는 PD-L1에 대한 CDR-기반 항원 결합 부위; 및 (ii) 상기 항체 분자의 CH3 도메인에 위치한 LAG-3 항원 결합 부위를 포함하며, 여기서, 상기 LAG-3 결합 부위는 서열번호 1, 2 및 3에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 항체 분자는 각각 서열번호 92 및 93에 기재된 서열을 포함하거나, 갖거나 또는 이로 이루어진 VH 도메인 및 VL 도메인, 및 서열번호 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50에 기재된 서열을 포함하거나, 갖거나 또는 이로 이루어진 CH3 도메인, 바람직하게는, 서열번호 5, 30 또는 40에 기재된 서열을 포함하거나, 갖거나 또는 이로 이루어진 CH3 도메인, 보다 바람직하게는, 서열번호 5에 기재된 서열을 포함하거나, 갖거나 또는 이로 이루어진 CH3 도메인을 포함한다.
추가의 바람직한 실시형태에서, 항체 분자는 서열번호 94 또는 113에 기재된 서열을 포함하거나, 갖거나 또는 이로 이루어진 중쇄, 및 서열번호 116에 기재된 서열을 포함하거나, 갖거나 또는 이로 이루어진 경쇄를 포함한다. 보다 바람직하게는, 항체 분자는 서열번호 94, 95, 104, 105, 108, 및 109에 기재된 서열을 포함하거나, 갖거나 또는 이로 이루어진 중쇄, 및 서열번호 116에 기재된 서열을 포함하거나, 갖거나 또는 이로 이루어진 경쇄를 포함한다. 보다 바람직하게는, 항체 분자는 서열번호 94 또는 95에 기재된 서열을 포함하거나, 갖거나 또는 이로 이루어진 중쇄, 및 서열번호 116에 기재된 서열을 포함하거나, 갖거나 또는 이로 이루어진 경쇄를 포함한다.
본 발명의 항체 분자는 또한 본원에 기술된 구조적 루프, CH3 도메인, CH2 도메인, CH2 및 CH3 도메인, 경쇄 또는 중쇄 서열의 변이체를 포함할 수 있되, 단, 이 경우, 상기 경쇄 및 중쇄 서열의 VL 및 VH 도메인은 각각 변하지 않은 채로있다. 적합한 변이체는 서열 변형, 또는 돌연변이, 및 스크리닝의 방법을 이용해 수득될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 하나 이상의 변이체 서열을 포함하는 항체 분자는 모체 항체 분자의 하나 이상의 기능적 특성, 예컨대 LAG-3 및 PD-L1에 대한 결합 특이성 및/또는 결합 친화도를 보유한다. 예를 들어, 하나 이상의 변이체 서열을 포함하는 항체 분자는 바람직하게는 (모체) 항체 분자와 동일한 친화도, 또는 그보다 더 높은 친화도로 LAG-3 및 PD-L1에 결합한다. 모체 항체 분자는 변이체 항체 분자 내로 도입된 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함하지 않는 항체 분자이다.
예를 들어, 본 발명의 항체 분자는 본원에 기술된 구조적 루프, CH3 도메인, CH2 도메인, CH2 및 CH3 도메인, 경쇄 또는 중쇄 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.1%, 적어도 99.2%, 적어도 99.3%, 적어도 99.4%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8%, 또는 적어도 99.9% 서열 동일성을 갖는, 구조적 루프, CH3 도메인, CH2 도메인, CH2 및 CH3 도메인, 경쇄 또는 중쇄 서열을 포함할 수 있되, 단, 이 경우, 상기 경쇄 및 중쇄 서열의 VL 및 VH 도메인은 각각 변하지 않은 채로있다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 항체 분자는 서열번호 4, 5, 또는 135에 기재된 CH3 도메인 서열에 대해 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.1%, 적어도 99.2%, 적어도 99.3%, 적어도 99.4%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8%, 또는 적어도 99.9% 서열 동일성을 갖는 CH3 도메인 서열을 포함한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 항체 분자는 서열번호 6 또는 7로 제시된 CH2 및 CH3 도메인 서열에 대해 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.1%, 적어도 99.2%, 적어도 99.3%, 적어도 99.4%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8%, 또는 적어도 99.9% 서열 동일성을 갖는, CH3 및 CH2 도메인 서열을 포함한다.
서열 동일성은 일반적으로 알고리즘 GAP (Wisconsin GCG package, Accelerys Inc, San Diego USA)을 참조하여 정의된다. GAP은 매칭의 수를 최대화하고 갭의 수를 최소화하는 2개의 완전한 서열을 정렬하도록 Needleman 및 Wunsch 알고리즘을 사용한다. 일반적으로, 갭 생성 패널티 = 12 및 갭 신장 패널티 = 4로, 디폴트 (default) 파라미터가 사용된다. GAP의 사용이 바람직할 수 있지만, 예컨대 BLAST [문헌 (Altschul et al. (1990) J. MoI. Biol. 215: 405-410)의 방법을 사용함], FASTA [문헌 (Pearson and Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448)의 방법을 사용함], 또는 Smith-Waterman 알고리즘 (Smith and Waterman (1981) J. MoI Biol. 147: 195-197)과 같은 다른 알고리즘이 사용될 수 있고, 또는 문헌 [Altschul et al. (1990) 상동]의 TBLASTN 프로그램은 일반적으로 디폴트 파라미터를 사용한다. 구체적으로, psi-Blast 알고리즘 (Nucl. Acids Res. (1997) 25: 3389-3402)이 사용될 수 있다.
본 발명의 항체 분자는 또한 본원에 기술된 구조적 루프, CH3 도메인, CH2 도메인, CH2 및 CH3 도메인, 경쇄 또는 중쇄 서열에 비해 하나 이상의 아미노산 서열 변형 (아미노산 잔기의 부가, 결실, 치환 및/또는 삽입), 바람직하게는 20개 이하 변형, 15개 이하 변형, 10개 이하 변형, 5개 이하 변형, 4개 이하 변형, 3개 이하 변형, 2개 이하 변형, 또는 1개 변형을 갖는, 구조적 루프, CH3 도메인, CH2 도메인, CH2 및 CH3 도메인, 경쇄 또는 중쇄 서열을 포함할 수 있되, 단, 이 경우, 상기 경쇄 및 중쇄 서열의 VL 및 VH 도메인은 각각 변하지 않은 채로있다. 구체적으로, 변형은 VH 및 VL 도메인 서열 외부의 항체 분자의 하나 이상의 골격 (framework) 내에서 이루어질 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 항체 분자는 서열번호 4, 5, 또는 135로 제시된 CH3 도메인 서열에 비해 하나 이상의 아미노산 서열 변형 (아미노산 잔기의 부가, 결실, 치환 및/또는 삽입), 바람직하게는 20개 이하 변형, 15개 이하 변형, 10개 이하 변형, 5개 이하 변형, 4개 이하 변형, 3개 이하 변형, 2개 이하 변형, 또는 1개 변형을 갖는 CH3 도메인 서열을 포함할 수 있다.
다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 항체 분자는 서열번호 6 또는 7로 제시된 CH2 및 CH3 도메인 서열에 비해 하나 이상의 아미노산 서열 변형 (아미노산 잔기의 부가, 결실, 치환 및/또는 삽입), 바람직하게는 20개 이하 변형, 15개 이하 변형, 10개 이하 변형, 5개 이하 변형, 4개 이하 변형, 3개 이하 변형, 2개 이하 변형, 또는 1개 변형을 갖는 CH3 및 CH2 도메인 서열을 포함할 수 있다.
LAG-3 및/또는 PD-L1에 대한 결합에 대해 본 발명의 항체 분자와 경쟁하거나, 또는 본 발명의 항체 분자와 같이 LAG-3 및/또는 PD-L1의 동일한 에피토프에 결합하는 항체 분자가 또한 고려되고, 상기 항체 분자는 PD-L1에 대한 CDR-기반 항원 결합 부위 및 항체 분자의 CH3 도메인에 위치한 LAG-3 항원 결합 부위를 포함한다. 항원에 대한 2개 항체의 경쟁을 결정하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 항원에 대한 2개 항체의 결합의 경쟁은 BIAcore를 사용하여 결정될 수 있다. 항체에 의해 결합된 에피토프의 맵핑 방법도 유사하게 당해 분야에 알려져 있다.
본 발명의 항체 분자는 바람직하게는 1×10-9 M의 친화도 (KD) 또는 이보다 큰 친화도로 LAG-3에 결합한다. 예를 들어, 본 발명의 항체 분자는 8×10-10 M의 친화도 (KD) 또는 이보다 큰 친화도로 LAG-3에 결합할 수 있다.
Fcab의 결합 부위가 바로 가까이에 위치한 2개의 결합 부위와 상대적으로 조밀한 항체 단편을 형성하기 때문에 Fcab는 단클론 항체보다 더 작은 결합 계면을 갖는다. 반대로, 전형적인 mAb의 Fab 아암 (arms)은 가요성 힌지 영역에 의해 분리된다. Fcab의 2개 항원 결합 부위는 또한 전형적인 mAb의 것들에 비해, 공간적으로 서로에게 가깝다. 2개 결합 부위의 이렇게 더 작은 결합 계면 및 감소된 가요성에 기초할 때 항-LAG-3 Fcab가 기준 단클론 항체와 유사한 친화도 및 효능으로 LAG-3에 결합하여 이를 억제할 수 있다는 것은 놀라운 일이었다.
본 발명의 항체 분자는 바람직하게는 1 x 10-9 M의 친화도 (KD) 또는 더 큰 친화도로 PD-L1에 결합한다.
동족 항원, 예컨대 LAG-3 또는 PD-L1에 대한 항체 분자의 결합 친화도는, 예를 들어 표면 플라즈마 공명 (SPR)에 의해 결정될 수 있다. 세포 표면에서 발현되는, 동족 항원, 예컨대 LAG-3 또는 PD-L1에 대한 항체 분자의 결합 친화도는 유세포 분석에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 항체 분자는 바람직하게는 세포의 표면에서 발현된 LAG-3 및 PD-L1에 대해 결합할 수 있다. 세포는 바람직하게는 암세포이다.
본 발명의 항체 분자는 바람직하게는 LAG-3 및 PD-L1에 동시에 결합할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 항체 분자는 LAG-3 및 PD-L1에 동시에 결합할 수 있고, 상기 LAG-3 및 PD-L1은 단일 세포의 표면에서, 또는 2개 별개 세포의 표면에서 발현된다.
본 발명의 항체 분자는 인간 LAG-3, 뮤린 LAG-3, 및/또는 시노몰구스 원숭이 LAG-3에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체 분자는 인간 LAG-3에 결합한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 항체 분자는 인간 LAG-3 및 인간 PD-L1에 결합한다.
본 발명의 항체 분자는 (i) PD-L1에 대한 CDR-기반 항원 결합 부위; 및 (ii) 항체 분자의 불변 도메인에 위치하는 LAG-3 항원 결합 부위를 포함한다. 따라서, 항체 분자의 불변 도메인, 예컨대, CH3 도메인에 위치한 LAG-3 항원 결합 부위를 포함하지 않는 항체 분자는 본 발명의 일부를 형성하지 않는다. 유사하게, PD-L1에 대한 CDR-기반 항원 결합 부위를 포함하지 않는 분자는 본 발명의 일부를 형성하지 않는다.
본 발명의 항체 분자는 치료제 또는 검출가능 표지에 접합될 수 있다. 이 경우에, 항체 분자는 접합체로서 지칭될 수 있다. 예를 들어, 항체 분자는 면역계 조절인자, 세포독성 분자, 방사성 동위원소, 또는 검출가능 표지에 접합될 수 있다. 면역계 조절인자 또는 세포독성 분자는 시토카인일 수 있다. 검출가능 표지는 방사성 동위원소, 예컨대 비-치료적 방사성 동위원소일 수 있다.
항체 분자는 펩티드 결합 또는 링커에 의해, 즉 상기 치료제 또는 검출가능 표지 및 항체 분자 또는 이의 폴리펩티드 쇄 성분을 포함하는 융합 폴리펩티드 내에서 치료제 또는 검출가능 표지에 접합될 수 있다. 접합을 위한 다른 수단에는 화학적 접합, 특히 이관능성 시약 (예컨대, DOUBLE-REAGENTSTM Cross-linking Reagents Selection Guide, Pierce 사용)을 이용한 교차-결합이 포함된다.
따라서 항체 분자 및 치료제 또는 검출가능 표지는, 예를 들어 임의의 적합한 화학적 결합을 통해 또는 링커를 통해, 예를 들어 펩티드 링커를 통해 서로에 직접 연결될 수 있다.
펩티드 링커는 짧을 수 있다 (2-20개, 바람직하게는 2-15개 잔기 아미노산의 신장). 펩티드 링커 서열의 적합한 예는 당해 분야에 공지되어 있다. 하나 이상의 상이한 링커가 사용될 수 있다. 링커는 약 5개 아미노산 길이일 수 있다.
화학적 결합은, 예를 들어 공유 또는 이온 결합일 수 있다. 공유 결합의 예시에는 펩티드 결합 (아미드 결합) 및 이황화 결합이 포함된다. 예를 들어, 항체 분자 및 치료제 또는 진단제는 공유적으로, 예를 들어 펩티드 결합 (아미드 결합)에 의해 연결될 수 있다. 따라서, 항체 분자 및 치료제 또는 진단제는 단쇄 폴리펩티드로서 생산 (분비)될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 분자를 인코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 당업자는 당해 분야에 익히 공지된 방법을 이용하여 이러한 핵산을 제조하는데 별다른 어려움을 갖지 않을 것이다. 단리된 핵산은, 예를 들어 세균, 효모, 곤충 또는 포유류 숙주 세포에서의 발현에 의해 본 발명의 항체 분자를 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 숙주 세포는 CHO, HEK 또는 NS0 세포와 같은 포유류 세포이다. 핵산은 일반적으로 발현용 재조합 벡터의 형태로 제공될 것이다.
단리된 핵산은, 예를 들어 서열번호 142, 4, 9, 14, 19, 24, 29, 34, 39, 44, 또는 49로 제시된 서열을 포함할 수 있고, 이는 각각 FS18-7-9 (CHO 코돈 최적화 뉴클레오티드 서열), FS18-7-9 (HEK293-발현 뉴클레오티드 서열), FS18-7-32, FS18-7-33, FS18-7-36, FS18-7-58, FS18-7-62, FS18-7-65, FS18-7-78, FS18-7-88, 및 FS18-7-95의 CH3 도메인을 인코딩한다.
이러한 핵산 및 벡터를 포함하는 시험관 내 숙주 세포는 본 발명의 항체 분자를 발현시키는데 사용되는 바와 같이 본 발명의 일부이고, 이는 후속적으로 세포 배양물로부터 정제될 수 있으며 선택적으로 약제학적 조성물로 제제화될 수 있다. 따라서 본 발명은 항체 분자의 생산을 위한 조건하에서 본 발명의 재조합 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 본 발명의 항체 분자를 생산하는 방법을 또한 제공한다. 상기에 언급된 바와 같은 적합한 숙주 세포를 배양하는 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 이 방법은 항체 분자의 분리 및/또는 정제를 추가로 포함할 수 있다. 이 방법은 또한 하기에 기술된 바와 같은 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 다른 성분과 함께, 약제학적 조성물로의 항체 분자의 제제화를 포함할 수 있다.
PD-L1은 수많은 암 세포에서 발현되는 것으로 알려진 반면, 암세포에서 LAG-3의 발현은 보다 제한된다. 이 둘 모두는 면역계의 세포에서 발현된다. 구체적으로, LAG-3은 종양 환경에서 고갈된 T 세포에서 발현되는 것으로 알려져 있다. 또한, 본 발명은 LAG-3 및 PD-L1 모두에 결합하는 항체 분자의 사용이 암의 동계 마우스 모델에서 종양 성장을 억제하는데 효과적이며, 이러한 항체 분자는, 각각 LAG-3 및 PD-L1에 결합하는 2개 결합 분자의 투여 보다 더욱 효과적인 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명의 항체 분자는 환자에서 암을 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 환자는 바람직하게는 인간 환자이다.
본 발명의 항체 분자를 사용하여 치료되는 암세포는, 예컨대 그의 세포 표면에서 LAG-3을 발현할 수 있다. 일 실시형태에서, 치료되는 암세포는, 예컨대 그의 세포 표면에서 LAG-3을 발현하는 것으로 결정될 수 있다. 예를 들어, B 세포 림프종은 그의 세포 표면에 LAG-3을 발현하는 것으로 나타났다. 세포 표면에서 항원의 발현을 결정하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 유세포 분석을 포함한다.
하기 실시예 4는 본 발명의 항체 분자가 마우스에서 높은 수준의 LAG-3-발현 면역 세포, 예컨대 LAG-3을 발현하는 TIL를 갖는 종양을 치료하는데 사용될 수 있음을 보여준다. 따라서, 부가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 항체 분자를 사용하여 치료되는 암의 종양은 LAG-3 발현 면역 세포를 포함할 수 있다. LAG-3 발현 면역 세포, 예컨대 LAG-3 발현 TIL은 다수의 암에서 종양 세포 중에 존재한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 항체 분자를 사용하여 치료되는 암의 종양은 LAG-3 발현 면역 세포를 함유하는 것으로 결정되었다. 종양 또는 종양의 주변에서 LAG-3 발현 면역 세포의 존재를 결정하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
또한, 실시예 4는 본 발명의 항체 분자가 사용되어 이들의 세포 표면상에 PD-L1을 발현하는 종양을 치료할 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 추가로 또는 대안적으로, 본 발명의 항체 분자를 사용하여 치료되는 암의 세포는, 예를 들어, PD-L1을 이들의 세포 표면에 발현할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 치료되는 암의 종양은 PD-L1을 발현하는 면역 세포, 예컨대, TIL을 포함할 수 있다. 치료되는 암의 세포는, 예를 들어, 이들의 세포 표면상에 PD-L1을 발현하도록 결정될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 치료되는 암의 종양은 PD-L1을 발현하는 면역 세포, 예컨대, TIL을 함유하도록 결정될 수 있다.
LAG-3 및 PD-L1의 세포 표면 발현은 항체 분자를 면역 세포 및/또는 암 세포의 표면상에 발현되는 LAG-3 및 PD-L1에 결합하는 것으로 예상된다. 이는, 암 세포 및 면역 세포의 직접 요법, 브릿징 및 국소화를 일으키는 것으로 생각된다.
본 발명의 항체 분자를 사용하여 치료되는 암은 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종 (예컨대, 미만성 거대 B-세포 림프종, 무통성 비-호지킨 림프종, 외투 세포 림프종), 난소암, 전립선암, 결장직장암, 섬유육종 (fibrosarcoma), 신세포 암종, 흑색종, 췌장암, 유방암, 다형성 교모세포종 (glioblastoma multiforme), 폐암 (예컨대, 비-소세포 폐암), 두경부암 (예컨대, 두경부 편평상피암), 위암 (위암 (gastric cancer), 방광암, 자궁경부암 (cervical cancer), 자궁암 (uterine cancer), 외음부암 (vulvar cancer), 고환암 (testicular cancer), 음경암 (penile cancer), 백혈병 (예컨대, 만성 림프구성 백혈병, 골수성 백혈병, 급성 조임파구 백혈병, 또는 만성 조임파구 백혈병), 다발성 골수종 (multiple myeloma), 편평세포암, 고환암, 식도암 (예컨대, 위식도 접합부의 선암종), 카포시 육종 (Kaposi's sarcoma), 및 중추신경계 (CNS) 림프종, 간세포 암종 (hepatocellular carcinoma), 비인두암 (nasopharyngeal cancer), 메르켈 세포 암종 (Merkel cell carcinoma), 및 중피종 (mesothelioma)으로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다. 이러한 암의 종양은 이들의 이들의 세포 표면에 PD-L1를 발현하고/하거나 PD-L1 및/또는 LAG-3을 발현하는 면역 세포, 예컨대 TIL를 함유하는 것으로 알려지거나, 예상된다.
항-LAG-3 항체를 사용한 신세포 암종, 폐암 (예컨대, 비-소세포 폐암), 비인두암, 결장직장암, 흑색종, 위암 (위암), 식도암 (예컨대, 위식도 접합부의 선암종), 난소암, 자궁경부암, 방광암, 두경부암 (예컨대, 두경부 편평상피암), 백혈병 (예컨대, 만성 림프구성 백혈병, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종 (예컨대, 미만성 거대 B-세포 림프종, 무통성 비-호지킨 림프종, 외투 세포 림프종), 및 다발성 골수종의 치료가 임상 시험에서 조사되었고 유망한 결과를 나타내었다. 따라서, 본 발명의 항체 분자를 사용하여 치료되는 암은 신세포 암종, 폐암 (예컨대, 비-소세포 폐암), 비인두암, 결장직장암, 흑색종, 위암 (위암), 식도암 (예컨대, 위식도 접합부의 선암종), 난소암, 자궁경부암, 방광암, 두경부암 (예컨대, 두경부 편평상피암), 백혈병 (예컨대, 만성 림프구성 백혈병, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종 (예컨대, 미만성 거대 B-세포 림프종, 무통성 비-호지킨 림프종, 외투 세포 림프종), 또는 다발성 골수종일 수 있다.
항-PD-L1을 사용한 흑색종, 결장직장암, 유방암, 방광암, 신장 세포 암종, 방광암, 위암, 두경부암 (예컨대, 두경부의 편평상피암), 중피종, 폐암 (예컨대, 비-소-세포 폐암), 난소암, 메르켈 세포 암종, 췌장암, 흑색종 및 간세포 암종의 치료는 임상 시험에서 연구되어 유망한 결과를 나타냈다. 따라서, 본 발명의 항체 분자를 사용하여 치료되는 암은, 흑색종, 결장직장암, 유방암, 방광암, 신장 세포 암종, 방광암, 위암, 두경부암 (예컨대, 두경부의 편평상피암), 중피종, 폐암 (예컨대, 비-소-세포 폐암), 난소암, 메르켈 세포 암종, 췌장암, 흑색종, 또는 간세포 암종일 수 있다.
본 발명의 항체 분자를 사용하는 치료에 바람직한 암은 폐암 (예컨대, 비-소세포 폐암), 방광암, 두경부암 (두경부의 편평상피암), 미만성 거대 B 세포 림프종, 위암, 췌장암 및 간세포 암종이다. 이러한 암의 종양은 LAG-3 발현 면역 세포를 포함하고 그들의 세포 표면에 PD-L1을 발현하거나 PD-L1을 발현하는 면역 세포를 포함하는 것으로 알려져 있다.
본 출원이 유방암과 같은 특정 유형의 암을 언급하는 경우, 이는 관련 조직, 이 경우 유방 조직의 악성 전환을 지칭한다. 다른 조직, 예컨대 난소 조직의 악성 전환으로부터 유래하는 암은 신체의 다른 위치, 예컨대 유방에서 전이 병변을 초래할 수 있지만, 그로 인해 이는 본원에 언급된 바와 같은 유방암이 아니라 난소암이다.
암은 1차 또는 2차 암일 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 분자는 환자에서 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 것일 수 있고, 상기 암은 일차 종양 및/또는 종양 전이이다.
본 발명의 항체 분자는 환자, 바람직하게는 인간 환자의 치료 방법에 사용되도록 설계된다. 항체 분자는 일반적으로 항체 분자에 추가로 적어도 하나의 성분, 예컨대 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있는, 약제학적 조성물의 형태로 투여될 것이다. 예를 들어, 본 발명의 약제학적 조성물은 활성 성분에 추가로, 당업자에게 익히 공지된 약제학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 비-독성이어야 하고 활성 성분의 효능을 방해하지 않아야 한다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 특성은, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사일 수 있는, 투여 경로에 좌우될 것이다. 항체 분자는 정맥내로 또는 피하로 투여될 수 있다.
액체 약제학적 조성물은 일반적으로 물, 석유 동물유 또는 식물유, 광물유 또는 합성유와 같은 액체 담체를 포함한다. 생리학적 식염수, 덱스트로스 또는 다른 당류 용액 또는 글리콜, 예컨대 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 포함될 수 있다.
정맥내 주사 또는 고통 부위에의 주사를 위해, 항체 분자, 또는 항체 분자를 포함하는 약제학적 조성물은 바람직하게는 발열원 무함유이고 적절한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용가능한 수성액의 형태이다. 당해 분야의 숙련자는, 예를 들어, 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 락테이트 링거 주사액을 사용하여 적절한 용액을 쉽게 제조할 수 있다. 보존제, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 필요에 따라 사용될 수 있다. 약제학적 제제의 제조를 위한 많은 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 예컨대, 문헌 [Robinson ed., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.
본 발명에 따른 항체 분자를 포함하는 조성물은 치료되는 상태에 따라, 단독으로 또는 다른 치료와 조합하여, 동시에 또는 순차적으로 또는 다른 치료제 또는 제제와의 조합된 제제로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 분자는 치료되는 질병, 예컨대 상기에 언급된 바와 같은 암에 대한 기존 치료제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 분자는 제2 항암 요법, 예컨대 화학요법, 항-종양 백신접종 (암 백신접종으로도 언급됨), 방사선요법, 면역요법, 종양용해 (oncolytic) 바이러스, 키메릭 항원 수용체 (CAR) T-세포 요법, 또는 호르몬 요법과 함께 환자에게 투여될 수 있다.
본 발명의 항체 분자는 항암 요법, 예컨대 화학요법, 항-종양 백신접종, 또는 방사선요법에서 아쥬번트로 작용할 수 있는 것으로 예상된다. 이론에 구애됨이 없이, 화학요법, 항-종양 백신접종, 또는 방사선요법의 일부로서 환자에의 항체 분자의 투여는 화학요법, 항-종양 백신접종, 또는 방사선요법 단독으로 달성되는 것보다 암 연관 항원 LAG-3 및 PD-L1에 대해 더 큰 면역 반응을 유발할 것으로 생각된다. 예를 들어, 항-LAG-3 요법은 마우스에서 바이러스 기반 병리를 치료하는데 우수한 효능을 나타내었다 (Blackburn SD, et al., 2009).
따라서 환자에서 암을 치료하는 방법은 화학요법제, 항-종양 백신, 방사성핵종, 면역치료제, 종양용해 바이러스, CAR-T 세포, 또는 호르몬 요법을 위한 제제와 함께 본 발명에 따른 항체 분자의 치료학적 유효량을 환자에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 화학요법제, 항-종양 백신, 방사성핵종, 면역치료제, 종양용해 바이러스, CAR-T 세포, 또는 호르몬 요법을 위한 제제는 바람직하게는 당해 암에 대한 화학요법제, 항-종양 백신, 방사성핵종, 면역치료제, 종양용해 바이러스, CAR-T 세포, 또는 효르몬 요법을 위한 제제, 즉 당해 암의 치료에 효과적인 것으로 나타난 화학요법제, 항-종양 백신, 방사성핵종, 면역치료제, 종양용해 바이러스, CAR-T 세포, 또는 호르몬 요법을 위한 제제이다. 당해 암에 효과적인 것으로 나타난 적합한 화학요법제, 항-종양 백신, 방사성핵종, 면역치료제, 종양용해 바이러스, CAR-T 세포, 또는 호르몬 요법을 위한 제제의 선택은 익히 숙련된 종사자의 능력 범위 내에 있다.
예를 들어, 방법이 화학요법제와 함께 본 발명에 따른 항체 분자의 치료학적 유효량을 환자에 투여하는 것을 포함하는 경우, 화학요법제는: 탁산, 세포독성 항생제, 티로신 키나제 억제제, PARP 억제제, B_RAF 효소 억제제, 알킬화제, 백금 유사체, 뉴클레오시드 유사체, 탈리도마이드 유도체, 항신생물성 화학요법제 및 기타로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다. 탁산은 도세탁셀, 파클리탁셀 및 납-파클리탁셀 (nab-paclitaxel)을 포함하고; 세포독성 항생제는 악티노마이신, 블레오마이신, 안트라사이클린, 독소루비신 및 발루비신을 포함하고; 티로신 키나제 억제제는 에를로티닙, 게피티닙, 악시티닙, PLX3397, 이마티닙, 코베미티닙 및 트라메티닙을 포함하고; PARP 억제제는 피라파립을 포함하고; B-Raf 효소 억제제는 베무라페닙 및 다브라페닙을 포함하고; 알킬화제는 다카르바진, 사이클로포스파미드, 테모졸로미드를 포함하고; 백금 유사체는 카르보플라틴, 시스플라틴 및 옥살리플라틴을 포함하고; 뉴클레오시드 유사체는 겜시타빈 및 아자시티딘을 포함하고; 항신생물제는 플루다라빈을 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 다른 화학요법제에는 메토트랙세이트, 데팍티닙, 엔티노스탓, 페메트렉스드, 카페시타빈, 에리불린, 이리노테칸, 플루오로우라실, 및 빈블라스틴이 포함된다.
암의 치료를 위한 백신접종 전략이 임상에서 실행되었으며 과학적 문헌에도 상세히 논의되었다 (예컨대, Rosenberg, S. 2000 Development of Cancer Vaccines). 이는 과립구-대식세포 콜로니-자극인자 (GM-CSF)의 유무에 상관 없이, 백신접종 방법으로서 자가 또는 동종 암세포를 사용함으로써 이들에 의해 발현되는 다양한 세포 마커에 대해 반응하도록 면역계를 자극하는 전략을 주로 포함한다. GM-CSF는 항원 제시에 있어서 강력한 반응을 일으키고 상기 전략과 함께 사용될 때 특히 잘 작용한다.
"치료학적 유효량"으로 투여될 수 있는데, 이는 환자에 이익을 나타내기에 충분하다. 이러한 이익은 적어도 하나의 증상의 적어도 개선일 수 있다. 따라서, 특정 질병의 "치료"는 적어도 하나의 증상의 개선을 지칭한다. 투여되는 실제 양, 및 투여 속도 및 시간 경과는 치료되는 질병의 특성 및 중증도, 치료되는 특정 환자, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 조성물의 전달 부위, 항체 분자의 유형, 투여 방법, 투여 스케줄 및 의료 종사자에게 알려진 다른 요인에 좌우될 것이다. 치료의 처방, 예컨대 투여량의 결정 등은 일반 의사 및 다른 의사의 책임 하에 있으며, 증상의 중증도 및/또는 치료되는 질병의 진행에 좌우될 수 있다. 항체 분자의 적합한 투여량은 당해 분야에 익히 공지되어 있다 (Ledermann et al. (1991) Int. J. Cancer 47: 659-664; and Bagshawe et al. (1991) Antibodies, Immun℃onjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922). 투여되는 항체 분자에 대해 적합한 바와 같은 본원 또는 문헌 (Physician's Desk Reference, 2003)에 지시된 특정한 투여량이 사용될 수 있다. 항체 분자의 치료학적 유효량 또는 적합한 투여량은 동물 모델에서 그의 시험관 내 활성 및 생체 내 활성을 비교함으로써 결정될 수 있다. 마우스 및 다른 시험 동물에서 효과적인 투여량을 인간에 외삽하는 방법은 공지되어 있다. 정확한 투여량은 치료되는 부위의 크기 및 위치, 및 항체 분자의 정확한 특성을 비롯해 다수의 요인에 좌우될 것이다. 치료는 의사의 재량에 따라 매일, 매주 2회, 매주, 또는 매월 간격으로 반복될 수 있다. 치료는 수술 전 및/또는 수술 후에 주어질 수 있고, 외과적 치료의 해부학적 부위에 직접 투여되거나 적용될 수 있다.
본 발명의 추가 양태 및 실시형태는 다음의 실험적 예시를 포함하는 본 발명의 개시가 주어지면 당업자에게 자명할 것이다.
본 명세서에 언급된 모든 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다.
본원에 사용되는 경우 "및/또는"은 다른 요소의 존재 또는 부재하에 2개의 특정된 특징 또는 구성요소 각각에 대한 구체적인 개시로 간주된다. 예를 들어, "A 및/또는 B"는 마치 각각이 본원에 개별적으로 개시된 것과 같이, (i) A, (ii) B 및 (iii) A와 B의 각각에 대한 구체적인 개시로 간주된다.
맥락이 달리 명시하지 않는 한, 전술한 특징의 설명 및 정의는 본 발명의 임의의 특정 양태 또는 실시형태로 제한되지 않으며 기술된 모든 양태 및 실시형태에 동등하게 적용된다.
본 발명의 특정 양태 및 실시형태는 상기에 기술된 도면을 참조하여 이제 실시예로서 예시될 것이다.
실시예
실시예 1 - Fcab 분자의 선택 및 특성화
1.1 항-인간 LAG-3 Fcab의 나이브 (Naive) 선택 및 친화도 성숙
1.1.1 나이브 선택
AB (잔기 14-18) 및 EF (잔기 92-101) 루프 내에서 무작위로 인간 IgG1의 CH3 도메인 (IMGT 넘버링 1.4-130)을 나타내는 나이브 파아지 라이브러리를 재조합 Fc-태그된 인간 LAG-3 (LAG-3 Fc) 항원 (R&D systems, 2319-L3-050)을 이용한 선택에 사용하였다. 라이브러리를 단백질 A (Life Technologies, 10002D) 또는 단백질 G (Life Technologies, 10004D) 비드 상에 포획된 항원을 사용한 3회 라운드에서 선택하였다. 결과를 ELISA로 스크리닝하고 양성 결합자를 서브-클로닝하고 EasySelect 피치아 (Pichia) 발현 키트 (Life Technologies, K1740-01)를 사용하여 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)에서 가용성 Fcab (절두된 힌지 함유)로서 발현시켰다. 이어서 Fcab를 Biacore 3000 (GE Healthcare) 상에서 재조합 인간 LAG-3 Fc에 대한 결합에 대해 스크리닝하였다. 간략히는, LAG-3 Fc (R&D systems, 2319-L3-050)를 아민 커플링 (GE Healthcare, BR-1000-50)을 이용해 CM5 칩 (GE Healthcare, BR-100012)에 7200 RU의 밀도로 결합시켰다. Fcab를 HBS-P (GE Healthcare, BR100368) 완충제로 희석하고 250 nM, 500 nM 및 1000 nM로 3분간 주입한 후 5분간 완충제 중에서 해리시켰다. 참조 감산 데이터 (LAG-3 Fc 유동 세포 2 - 블랭크 유동 세포)를 BIAevaluation 3.2 소프트웨어를 사용하여 분석하여 결합을 확인하였다. 그 후에 Fcab를 HEK 세포-발현된 인간 LAG-3 (pcDNA5FRT 벡터 내로 클로닝됨 [Life Technologies, V6010-20] [방법에 대한 항목 1.4.5 참조])에 대한 결합에 대해 시험하였다. 간략히는, 10% FBS (Life Technologies, 10270-1-6), 100 μg/ml 하이그로마이신 B (Melford Laboratories Ltd, Z2475), 15　μg/ml 블라스티시딘 (Blasticidin) (Melford Laboratories Ltd, B1105) 및 1 μg/ml 독시사이클린 (Doxycyclin) (Sigma, D9891)을 함유하는 DMEM 중에서 성장한 인간 LAG-3을 과발현하는 HEK 293 세포를 세포 해리 완충제 (Life Technologies, 13151-014)를 사용해 조직 배양 플라스크로부터 분리시키고 2×105 세포/웰로 V-바닥 96-웰 플레이트에 접종하였다. Fcab를 100 μl 부피로 1시간 동안 4℃에서 5 μM로 세포와 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고 이차 항체 (항-인간 Fc-488, Jackson ImmunoResearch, 109-546-098)를 PBS 중에서 1:1000으로 희석하고 100 μl를 세포에 첨가하고 4℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고 세포를 1 μg/ml DAPI (Biotium, 40043)를 함유하는 100 μl PBS 중에 재현탁하였다. 플레이트를 BD FACSCanto II 세포분석기 (cytometer) (BD Biosciences) 상에서 판독하고 데이터를 FlowJoX를 사용해 분석하였다. 이어서 Fcab를 Flp-In T-Rex 293 세포 (Life Technologies, R780-07) 내로 리포펙타민 (Lipofectamine) (Life Technologies, 11668-019)을 사용해 형질전환시킴으로써 포유류 세포에서 발현시켰다. LAG-3 결합 Fcab를 A375 세포 (ATCC, CRL-1619) 상의 인간 MHC 클래스 II의 재조합 LAG-3 Fc (실시예 1.6의 방법 이용)에 대한 결합의 억제에 대해 시험하였다. 54개의 독특한 Fcab 서열을 3회의 파아지 선택으로부터 동정하였고, 이들 Fcab 중 12개를 BIAcore 분석에 의해 LAG-3 Fc에 결합하고/하거나 LAG-3 발현 HEK 세포에 결합하는 것으로 결정하였다. 선택된 3개의 Fcab는 또한 MHC 클래스 II와 LAG-3의 상호작용을 억제할 수 있었고 이들을 친화도 성숙을 위해 선택하였다. 3개의 Fcab를 FS18-3, FS18-7 및 FS18-21로 명명하였다.
1.1.2 친화도 성숙
제1 친화도 성숙
6개 파아지 디스플레이 친화도 성숙 라이브러리를 상기에 기술된 나이브 선택에 사용해 동정된 3개 Fcab 각각의 AB 루프 내 5개 잔기 (잔기 14-18) 및 EF 루프 내 5개 (잔기 92-94 및 97-98) 또는 8개 (잔기 92-94 및 97-101) 잔기의 무작위화에 의해 구축하였다 .
친화도 성숙 라이브러리를 재조합 인간 LAG-3 Fc (R&D systems, 2319-L3-050) 및 인간 LAG-3을 발현하는 HEK 세포를 사용하여 선택하였다 (상기에 기술된 바와 같음). 결과를 파아지 ELISA로 스크리닝하였고, 양성 결합자를 서브클로닝하고 HEK Expi293 세포 (pTT5 벡터 [National Research Council of Canada]에 클로닝된 Fcab를 Expi293F 세포 [Life technologies, A14527] 내로 ExpiFectamine 293 형질감염 키트 [Life Technologies, A14524]를 사용하여 형질감염시킴)에서 가용성 Fcab (절두된 힌지 함유)로 발현시켰다. 그 후에 HEK 발현된 가용성 Fcab를 세포 발현된 인간 LAG-3에 대한 결합, 세포 발현된 시노몰구스 LAG-3에 대한 결합 (실시예 1.4.3과 같은 방법), 재조합 LAG-3 Fc에 대한 MHC 클래스 II 결합을 차단하는 능력 (실시예 1.6과 같은 방법)에 대해 스크리닝하였다. 차단하는 Fcab를 추가로 시험하여 이들이 T 세포 활성화 검정에서 IL-2 분비의 LAG-3 유도된 억제를 역전시킬 수 있었는지 여부를 결정하였다 (실시예 2.1과 동일한 방법). 61개의 독특한 항-LAG-3 Fcab를 이 스크리닝 방법을 이용해 6개 친화도 성숙 라이브러리로부터 동정하였다. FS18-7 계통으로부터 친화도 성숙된 Fcab는 시노몰구스 원숭이 LAG-3와 가장 높은 수준의 교차-반응성을 갖는 것으로 나타났다. 시노몰구스 원숭이 LAG-3 Fc에 대해 가장 강력한 결합 및 T 세포 활성화 검정에서 가장 높은 활성을 갖는 이 계통으로부터의 3개 Fcab (FS18-7-7, FS18-7-9, 및 FS18-7-11로 명명됨)를 추가 친화도 성숙을 위해 선택하였다. 이들 3개 Fcab는 또한 세포 발현된 MHC 클래스 II와 LAG-3 Fc의 상호작용을 차단하는 것으로 나타났다.
제2 친화도 성숙
제1 친화도 성숙으로부터의 3개 Fcab (FS18-7-7, FS18-7-9, 및 FS18-7-11)의 풀 (pool)을 사용하여 추가 친화도 성숙 라이브러리를 생성하였다. CD 루프를 ELLA Biotech사로부터의 무작위화 프라이머를 사용하여 충분히 무작위화하였다. CD 루프 내 아미노산 위치의 부분 (잔기 45.1-78)을 시스테인을 제외한 아미노산의 등몰 분포를 사용하여 무작위화하였다. 또한, 결합을 증강시킬 수 있는 부가적 돌연변이의 도입을 위해 전체 CH3 도메인 서열에 걸쳐서 오류 경향 (error prone) PCR을 수행하였다.
친화도 성숙 라이브러리를 비오틴화 재조합 LAG-3 avi-Fc (BPS Bioscience, 71147) 및 HEK hLAG-3 세포에 대해 수행된 파아지 및 선택에서 생성하였고 파아지 ELISA에 의해 재조합 LAG-3 Fc (R&D systems, 2319-L3-050)에 대한 결합에 대해 스크리닝하였다. 86개의 독특한 Fcab (절두된 힌지 함유)를 HEK293F 세포에서 발현시켰다. 선택된 Fcab를 또한 상기에 기술된 바와 같이 T 세포 활성화 검정에서 활성에 대해 스크리닝하였다. 제2 친화도 성숙 동안 모체 Fcab 클론 FS18-7-9뿐만 아니라, 9개 Fcab가 T 세포 활성화 검정에서 가장 높은 활성을 갖는 것으로 동정되었고 (FS18-7-32; FS18-7-33; FS18-7-36; FS18-7-58; FS18-7-62; FS18-7-65; FS18-7-78; FS18-7-88; 및 FS18-7-95), 이어서 상기에 기술된 바와 같이 이들을 더욱 특성화하였다. 모체 Fcab 클론, FS18-7-9에 대한 이들 9개 Fcab의 서열 정렬을 도 1A에 나타내었다. 도 1B는 모체 Fcab 클론, FS18-7-9에 대한 9개 Fcab 클론 각각의 서열 동일성의 백분율을 열거한다. 2개의 다른 모체 Fcab 클론, FS18-7-7 및 FS18-7-11의 친화도 성숙으로부터 유래하는 Fcab는 FS18-7-9의 친화도 성숙으로부터 유래하는 것만큼 유망한 후보자가 아니었고, 따라서 이들은 더 이상 고려하지 않았다.
1.2 마우스 LAG-3에 특이적인 대리 Fcab (surrogate Fcab)의 선택
상기에 기술된 프로토콜에 따른 나이브 선택에 의해 선택된 Fcab FS18-7을 사용하여 마우스 LAG-3에 대한 선택을 위한 파아지 라이브러리를 생성하였다. 2회의 친화도 성숙을 수행하였고, 마우스 LAG-3에 대해 높은 친화도, 특이적 결합을 나타낸 Fcab 클론 FS18-7-108-29 및 FS18-7-108-35을 하기 친화도 성숙을 위해 선택하였다. T 세포 활성화 검정에서 마우스 LAG-3을 억제하는 FS18-7-108-29 및 FS18-7-108-35의 능력을 확인하였다. Octet (Forteo Bio)을 사용한 에피토프 맵핑에 따르면 항-마우스 LAG-3 Fcab가 인간 LAG-3에 대한 결합에 대해 항-인간 LAG-3 Fcab (상기에 기술된 바와 같은 하기 제2 친화도 성숙에 따라 선택됨)와 경쟁하는 것으로 나타났다. 항-인간 LAG-3와 항-마우스 LAG-3 Fcab 사이에는 4개 내지 8개 잔기의 차이가 있다. 따라서 항-마우스 LAG-3 Fcab가 마우스에서 항-인간 LAG-3 Fcab의 결합 및 기능에 대한 적합한 대리 (suitable surrogates)를 나타내는 것으로 예상된다.
1.3 모의 mAb 2 (mock mAb 2 )의 작제 및 발현
상기 1.1 및 1.2에서 동정된 선두 항-인간 LAG-3 및 항-마우스 LAG-3 Fcab를 포함하는 "모의" mAb2를 mAb2 포맷으로 이들 Fcab의 특성화를 가능케 하기 위해 제조하였다. 이들 모의 mAb2를 항-LAG-3 Fcab 및 항-FITC 항체 4420의 가변 영역 (상세히는 서열번호 83, 서열번호 84, 및 서열번호 85 참조) (Bedzyk, W. D., et al. 1989 및 Bedzyk, W. D., et al. 1989)으로부터 제조하였다. 중쇄의 CH2 도메인에 LALA 돌연변이를 갖고 (서열번호 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 및 81) 및 갖지 않는 (서열번호 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 및 82) 모의 mAb2 둘 다를 제조하였고 (상세히는 하기 항목 1.5 참조) 이들은 항-FITC mAb 4420의 경쇄 (서열번호 85)를 추가로 포함하였다. HEK293-6E 세포에서의 일시적 발현에 의해 모의 mAb2를 생산하였고 mAb Select SuRe 단백질 A 칼럼을 사용하여 정제하였다.
1.4 LAG-3에 대한 Fcab의 결합 친화도
1.4.1 표면 플라즈마 공명 (SPR)에 의해 결정되는 바와 같은 LAG-3에 대한 Fcab의 결합 친화도
BIAcore T200 (GE Healthcare)을 사용하여 인간 LAG-3에 대한 모의 mAb2 포맷의 항-인간 LAG-3 Fcab의 친화도를 측정하였다. CM5 센서 칩의 플로우 셀 (flow cell) 4 (GE Healthcare, BR1005-30)를 인간 LAG-3-Fc (R&D Systems, 2319-L3-050)로 고정화시키고, 플로우 셀 3을 아민 커플링 키트 (GE Healthcare, BR-1000-50)를 사용하여 참조용 완충제로 고정화시켰다. LAG-3-Fc를 아세트산나트륨 pH 5 (ForteoBio, 18-1069) 중에 5 μg/ml로 희석하고 12초간 10 μl/분의 유속으로 주입한 후 이어서 420초 동안 에탄올아민의 주입에 의해 표면을 비활성화시켰다. 고정화 수준은 158 RU였다. 모의 mAb2 (또는 대조군 항-인간 LAG-3 mAb, 25F7)를 4 μg/ml로부터 2-배 연속 희석으로 HBS-P 완충제 (GE Healthcare, BR-1003-68) 중에 희석하였다. 대조군 mAb/모의 mAb2를 30 μl/분으로 240초의 결합 시간 및 30 μl/분으로 300초의 해리 시간으로 주입하였다. 표면을 100 μl/분으로 30초간 25 mM NaOH를 사용해 재생시켰다. 데이터를 이중 참조 공제하고 BIAevaluation 3.2 소프트웨어로 분석하여 동역학 상수를 계산하였다. 모의 mAb2 포맷의 Fcab는 인간 LAG-3에 대해 0.8 내지 1.1 nM 범위의 친화도를 갖는데 (표 1), 이는 기준 항-인간 LAG-3 mAb 25F7의 친화도와 유사하다. Fcab의 결합 부위가 매우 근접하게 위치한 2개의 결합 부위를 갖는 상대적으로 조밀한 항체 단편을 형성함으로써 Fcab가 단클론 항체보다 더 작은 결합 계면을 가지기 때문에 이러한 결과는 놀라운 것이다. 이에 반해, 전형적인 mAb의 Fab 아암은 가요성 힌지 영역에 의해 분리된다. Fc 영역에서 2개 결합 부위의 이렇게 더 작은 결합 계면 및 연관된 가요성의 감소를 토대로, 항-LAG-3 Fcab가 기준 항체 25F7와 유사한 친화도 및 효능으로 LAG-3에 결합하여 이를 억제할 수 있음은 예상 밖의 일이었다.
인간 LAG-3에 대한 모의 mAb2 포맷의 LAG-3 특이적 Fcab의 결합 친화도
모의 mAb2 포맷의 항-인간 LAG-3 Fcab 및 기준 항-인간 LAG-3 mAb, 25F7 KD (M)
FS18-7-9 8.3×10-10
FS18-7-62 9.5×10-10
FS18-7-78 8.4×10-10
FS18-7-32 8.6×10-10
FS18-7-36 8.9×10-10
FS18-7-65 1.1×10-9
25F7 3.2×10-10
1.4.2 SPR에 의해 결정되는 바와 같은 마우스 LAG-3에 대한 마우스 LAG-3 특이적인 대리 Fcab의 결합 친화도
Biacore 3000 (GE Healthcare)을 사용하여 마우스 LAG-3에 특이적인 대리 Fcab의 친화도를 마우스 LAG-3에 대해 측정하였다. 아민 커플링 (아민 커플링 키트, GE Healthcare, BR-1000-50)을 사용하여 10 mM 아세트산나트륨 pH 5.0 (ForteBio, 18-1069) 중에 희석된 mLAG-3 Fc (R&D Systems, 3328-L3-050)를 CM5 칩 (GE Healthcare, BR-1000-12)에 직접 코팅하였다. 플로우 셀 1을 마우스 Fc (SinoBiological, 51094-MNAH)로 코팅하고, 플로우 셀 2를 950 RU로 mLAG-3 Fc로 코팅하였다. Fcab를 HBS-P 완충제 (GE Healthcare, BR-1003-68)로 희석하고 20 μl/분으로 3분간 다양한 농도 (100 nM로부터 4배 희석)로 주입한 후 이어서 12분간 완충제 중에서 해리되게 하였다. 칩을 30 μl/분으로 30초간 10 mM 글리신 pH 2.5의 주입에 의해 재생시켰다. 데이터를 이중 참조 공제하고 BIAevaluation 3.2 소프트웨어로 분석하여 동역학 상수를 계산하였다. 시험된 대리 Fcab는 표 2에 기재된 바와 같은 한 자릿수의 친화도로 마우스 LAG-3에 결합하였다.
마우스 LAG-3에 대한 대리 LAG-3 특이적 Fcab의 결합 친화도 (KD)
마우스 LAG-3에 특이적인 대리 Fcab 친화도 KD (nM)
FS18-7-108-29 1.5
FS18-7-108-35 2.1
1.4.3 유세포 분석에 의해 결정되는 바와 같은 세포에서 발현된 LAG-3에 대한 Fcab의 결합 친화도
LAG-3을 과-발현하는 세포주의 생산
Lenti-X HTX 패키징 시스템 (Clontech, Cat. No 631249)을 사용하는 렌티바이러스 형질도입 방법을 이용하여 인간, 시노몰구스 또는 마우스 LAG-3을 과-발현하는 DO11.10 세포 (National Jewish Health)를 생성하였다. 마우스 LAG-3 cDNA (서열번호 96), 인간 LAG-3 cDNA (서열번호 95) 또는 시노몰구스 LAG-3 cDNA (서열번호 97)를 함유하는 Lenti-X 발현 벡터 (pLVX) (Clontech, Cat. No 631253)를 Lenti-X HTX 패키징 믹스와 함께 Lenti-X 293T 세포주 (Clontech, Cat. No 632180) 내로 동시-형질감염시켜 바이러스를 생성하였다. DO11.10 세포주를 Lenti-X HTX 패키징 시스템과 함께 생산된 렌티바이러스 벡터를 사용하여 형질도입하였다.
인간 LAG-3 발현 세포 (인간 LAG-3로 형질감염된 DO11.10 세포주)에 대한 모의 mAb2 포맷의 항-인간 LAG-3 Fcab의 친화도를 유세포 분석을 이용하여 측정하였다. mAb2 및 대조군 mAb 희석액 (2× 최종 농도)을 1× DPBS (Gibco, 14190-094)로 3회 반복 제조하였다. DO11.10:LAG-3 세포 현탁액을 PBS+2% BSA (Sigma, A7906) 중에 제조하고 50 μl/웰로 V-바닥 96-웰 플레이트 (Costar, 3897)에 4×10-6 세포/ml로 접종하였다. 50 μl의 mAb2 또는 대조군 mAb (항-인간 LAG-3 mAb, 25F7) 희석액을 세포를 함유하는 웰 (최종 부피 100 μl)에 첨가하고 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고 PBS+2% BSA 중에 1:1000으로 희석된 100 μl/웰의 이차 항체 (항-인간 Fc-488 항체, Jackson ImmunoResearch, 109-546-098)를 첨가한 후 4℃의 어둠하에 30분간 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고 1 mg/ml로 DAPI (Biotium, 40043)를 함유하는 100 μl의 PBS에 재현탁하였다. 플레이트를 Canto II 유세포 분석기 (BD Bioscience)를 사용해 판독하였다. 죽은 세포를 배제하고 FITC 채널 (488 nm/530/30) 내 형광을 측정하였다. 데이터를 GraphPad Prism 소프트웨어에서 로그 (작동제) 대 응답을 사용하여 피팅하였다. 모의 mAb2 포맷의 시험된 모든 Fcab 및 기준 항-인간 LAG-3 mAb, 25F7은 표 3에 기재된 바와 같이 1.2 내지 2.1 nM의 범위인 유사한 친화도 (EC50)로 인간 LAG-3에 결합하였다.
유세포 분석에 의해 결정된 바와 같은 인간 LAG-3을 발현하는 DO11.10 세포에 대한 모의 mAb2 포맷의 항-인간 LAG-3 Fcab의 결합 친화도
모의 mAb2 포맷의 항-인간 LAG-3 Fcab 기준 항-인간 LAG-3 mAb, 25F7 EC50 (nM)
FS18-7-9 1.2
FS18-7-32 1.6
FS18-7-33 1.5
FS18-7-36 1.5
FS18-7-62 2.1
FS18-7-65 1.6
FS18-7-78 1.7
25F7 2.1
1.4.4 유세포 분석에 의해 결정되는 바와 같은 세포에서 발현된 시노몰구스 LAG-3에 대한 Fcab의 결합 친화도
시노몰구스 LAG-3을 발현하는 세포 (시노몰구스 LAG-3으로 형질감염된 DO11.10 세포주)에 대한 모의 mAb2 포맷의 항-인간 LAG-3 Fcab의 친화도를 유세포 분석을 이용하여 측정하였다. mAb2 및 대조군 mAb 희석액 (2× 최종 농도)을 1× DPBS (Gibco, 14190-094) 중에 3회 반복 제조하였다. DO11.10:LAG-3 세포 현탁액을 PBS+2% BSA (Sigma, A7906) 중에 제조하였고 50 μl/웰로 V-바닥 96-웰 플레이트 (Costar, 3897)에 4×10-6 세포/ml로 접종하였다. 50 μl의 mAb2 또는 대조군 mAb (항-인간 LAG-3 mAb, 25F7) 희석액을 세포를 함유하는 웰 (최종 부피 100 μl)에 첨가하고 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고 PBS+2% BSA 중에 1:1000으로 희석된 100 μl/웰의 이차 항체 (항-인간 Fc-488 항체, Jackson ImmunoResearch, 109-546-098)를 첨가한 후 4℃의 어둠하에 30분간 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고 1 mg/ml로 DAPI (Biotium, 40043)를 함유하는 100 μl의 PBS 중에 재현탁하였다. 플레이트를 Canto II 유세포 분석기 (BD Bioscience)를 사용하여 판독하였다. 죽은 세포를 배제하고 FITC 채널 (488 nm/530/30) 내 형광을 측정하였다. 데이터를 GraphPad Prism 소프트웨어에서 로그 (작동제) 대 응답을 사용하여 피팅하였다. 모의 mAb2 포맷의 시험된 모든 Fcab는 0.5 내지 0.6 nM의 친화도로 시노몰구스 LAG-3에 결합하였는데, 이는 시노몰구스 원숭이에서의 독성 연구가 인간에게 나타나는 효과의 예측이 될 수 있을 것으로 예상된다 (표 4 참조). 기준 항-인간 LAG-3 mAb, 25F7은 15배 더 약한 친화도 (EC50)로 시노몰구스 LAG-3에 결합한다 (표 4).
유세포 분석에 의한 시노몰구스 LAG-3을 발현하는 DO11.10 세포에 대한 항-LAG-3 Fcab의 결합 친화도
모의 mAb2 포맷의 항-인간 LAG-3 Fcab 및 기준 항-인간 LAG-3 mAb, 25F7 EC50 (nM)
FS18-7-9 0.6
FS18-7-62 0.5
FS18-7-78 0.5
25F7 9.0
1.4.5 유세포 분석에 의해 결정된 바와 같은 세포에서 발현된 마우스 LAG-3에 대한 대리 항-마우스 LAG-3 Fcab 및 항-인간 LAG-3 Fcab의 결합 친화도
mLAG-3을 과-발현하는 HEK 세포의 생산
마우스 LAG-3 서열 (서열번호 96)을 KpnI (NEB, R0142) 및 NotI (NEB, R0146) 제한 분해를 사용해 pcDNA5FRT 벡터 (Life Technologies, V6010-20) 내로 서브클로닝하였다. 이어서 벡터를 리포펙타민 2000 (Life Technologies, 11668-019)을 사용해 Flp-In T-REx 293 HEK 세포주 (Life Technologies, R780-07) 내로 형질전환시켰다. 형질전환된 Flp-In T-REx 293 세포를 10% FBS (Life Technologies, 10270-1-6), 100 μg/ml 하이그로마이신 (Hygromycin) B (Melford Laboratories Ltd, Z2475), 15　μg/ml 블라스티시딘 (Melford Laboratories Ltd, B1105)을 함유하는 DMEM (Life Technologies, 61965-026) 중에서, 안정하게 형질전환된 세포의 콜로니가 명백해질 때까지 3-4주간 성장시켰다. 이들 콜로니를 1 μg/ml 독시사이클린 (Sigma, D9891)의 존재하에서 증폭시키고 PE 접합된 항-마우스 LAG-3 (클론 C9B7W, BD Biosciences, 552380)을 사용하여 마우스 LAG-3 발현에 대해 시험하였다.
세포-발현된 마우스 LAG-3에 대한 대리 항-마우스 LAG-3 Fcab (절두된 힌지 함유; 서열번호 58)의 친화도를 유세포 분석을 이용하여 결정하였다. 10% FBS (Life Technologies, 10270-1-6), 100 μg/ml 하이그로마이신 B (Melford Laboratories Ltd, Z2475), 15　μg/ml 블라스티시딘 (Melford Laboratories Ltd, B1105) 및 1 μg/ml 독시사이클린 (Sigma, D9891)을 함유하는 DMEM (Life Technologies, 61965-026) 중에서 성장한 mLAG-3을 발현하는 HEK 세포를 세포 해리 완충제 (Life Technologies, 13151-014)를 사용해 조직 배양 플라스크로부터 분리시키고 2×105 세포/웰로 V-바닥 96-웰 플레이트 (Costar, 3897)에 접종하였다. 플레이트를 4℃에서 3분간 1500 rpm으로 원심분리하여 세포를 펠렛화하였다. Fcab (또는 대조군 mAb)의 연속 희석액을 100 μl 부피로 4℃에서 1시간 동안 세포와 함께 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고 이차 항체 (항-인간 Fc-488, Jackson ImmunoResearch, Fcab 또는 항-Rat IgG (H+L)에 대해 109-546-098, Alexa Fluor 488 컨주게이트, ThermoFisher, C9B7W에 대해 A-11006)를 PBS 중에서 1:1000으로 희석하고 100 μl를 4℃에서 30분간 세포에 첨가하였다 (플레이트는 어둠 속에 유지됨). 그 후에 플레이트를 세척하고 세포를 1 μg/ml DAPI (Biotium, 40043)를 함유하는 100 μl PBS에 재현탁하였다. 플레이트를 Canto II 유세포 분석기 (BD Bioscience)를 사용해 판독하였다. 죽은 세포를 배제하고 FITC 채널 (488 nm/530/30) 내 형광을 측정하였다. 데이터를 GraphPad Prism 소프트웨어에서 로그 (작동제) 대 응답을 사용하여 피팅하였다. 시험된 Fcab는 유사한 친화도로 마우스 LAG-3에 결합하였다 (표 5 참조). 기준 LAG-3 mAb, C9B7W (2B Scientific, BE0174-50MG)는 Fcab보다 17배 더 약한 친화도 (EC50)로 마우스 LAG-3에 결합한다 (표 5).
유세포 분석에 의한 마우스 LAG-3을 발현하는 HEK 세포에 대한 대리 항-마우스 LAG-3 Fcab의 결합 친화도
항-마우스 LAG-3 Fcab 및 기준 항-마우스 LAG-3 mAb, C9B7W EC50 (nM)
FS18-7-108-29 4.5
FS18-7-108-35 4.5
C9B7W 79
세포-발현된 마우스 LAG-3에 대한 모의 mAb2 포맷의 항-인간 LAG-3 Fcab FS18-7-9의 친화도를 유세포 분석을 이용하여 결정하였다. 10% FBS (Life Technologies, 10270-1-6), 100 μg/ml 하이그로마이신 B (Melford Laboratories Ltd, Z2475), 15　μg/ml 블라스티시딘 (Melford Laboratories Ltd, B1105) 및 1 μg/ml 독시사이클린 (Sigma, D9891)을 함유하는 DMEM (Life Technologies, 61965-026) 중에서 성장한 mLAG-3을 발현하는 HEK 세포를 세포 해리 완충제 (Life Technologies, 13151-014)를 사용해 조직 배양 플라스크로부터 분리하였다. 세포를 4℃에서 3분간 1500 rpm으로의 원심분리로 수집하여 세포의 펠렛을 수득한 후 1× DPBS에 재현탁하고 30 μl를 V-바닥 96-웰 플레이트 (Costar, 3897)에 1.2×105 세포/웰로 접종하였다. 1:1 부피의 mAb2 (또는 대조군 mAb)의 연속 희석액을 첨가하고 4℃에서 1시간 동안 세포와 함께 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고 이차 항체 (항-인간 Fc-488, Jackson ImmunoResearch, 109-546-098)를 PBS 중에 1:1000으로 희석하고 60 μl를 4℃에서 30분간 세포에 첨가하였다 (플레이트는 어둠 속에 유지됨). 그 후에 플레이트를 세척하고 1 μg/ml DAPI (Biotium, 40043)를 함유하는 60 μl의 PBS에 재현탁하였다. 플레이트를 Canto II 유세포 분석기 (BD Bioscience)를 사용하여 판독하였다. 죽은 세포를 배제하고 FITC 채널 (488 nm/530/30) 내 형광을 측정하였다. 데이터를 GraphPad Prism 소프트웨어에서 로그 (작동제) 대 응답을 사용하여 피팅하였다. 모의 mAb2 포맷의 항-인간 LAG-3 Fcab FS18-7-9는 대리 항-마우스 LAG-3 Fcab FS18-7-9-108에 대한 2.6 nM의 EC50에 비해 19 nM의 EC50으로 마우스 LAG-3에 결합하였다 (표 6). 인간 mAb, 25F7은 마우스 LAG-3에 대해 임의의 검출가능한 결합을 나타내지 않았는데, 이는 인간 LAG-3 Fcab, FS18-7-9가 25F7과는 다른 LAG-3 상의 상이한 결합 에피토프를 가짐을 나타낸다.
유세포 분석에 의한 마우스 LAG-3을 발현하는 HEK 세포에 대한 인간 항-LAG-3 Fcab FS18-7-9의 결합 친화도
항-인간 LAG-3 Fcab, 항-마우스 LAG-3 Fcab 및 기준 항-인간 LAG-3 mAb, 25F7 EC50 (nM)
FS18-7-108-29 2.6
FS18-7-9 19
25F7 결합 부재
1.5 Fc 수용체에 대한 Fcab의 결합 친화도
인간 IgG1의 CH2 도메인 내 LALA 돌연변이의 도입은 Fc g 수용체 결합을 감소시키는 것으로 알려져 있다 (Bruhns, P., et al. (2009) 및 Xu, D. et al. (2000)). BIAcore를 사용하여 LALA 돌연변이가 Fcγ 수용체에 대한 (모의 mAb2 포맷의) Fcab의 결합 친화도를 감소시켰음을 확인하였다. 모의 mAb2 포맷의 Fcab를 사용하여 Biacore T200 기기 (GE Healthcare)에서 인간 FcγR 결합 검정을 수행하였다. 인간 FcγRs (R&D Systems, 1257-FC, 1330-CD, 1875-CD, 4325-FC)를 Series S CM5 칩 (GE Healthcare, BR-1005-30) 상에 FcγRI에 대해 370 RU, FcγRIII에 대해 264 RU (고 친화도 인간 FcγRs) 및 FcγRIIa 및 FcγRIIb에 대해 500 RU (저 친화도 인간 FcγRs)의 표면 밀도로 아민 커플링 (아민 커플링 키트, GE Healthcare, BR-1000-50)을 사용하여 고정하였다. 각각의 고정된 칩에 대해 플로우 셀 (flow cell)을 백그라운드 공제를 위한 블랭크로 놔두었다. FcγR을 아세트산나트륨 pH 5 (ForteBio, 18-1069) 중의 5 μg/ml의 농도를 사용하여 고정하고 요구되는 고정화 수준에 도달할 때까지 15초 주기로 10 μl/분의 유속으로 주입하였다.
고 친화도 FcγRI 및 FcγRIII의 경우, 200 μg/ml의 mAb 또는 모의 mAb2를 30 μl/분의 유속으로 3분간 칩을 가로질러 흘려보내고 5분간 해리가 이어졌다. 런닝 완충제는 HBS-P (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.005% v/v 계면활성제 P20, GE Healthcare, BR-1003-68)였다. 저 친화도 FcγRIIa 및 FcγRIIb의 경우, 모의 mAb2의 농도를 500 μg/ml로 증가시켰다.
양성 대조군은 야생형 IgG1 이소형 mAb였고, 이를 무관한 표적에 대해 대조군 LALA IgG1 mAb 및 단클론 IgG2 및 IgG4 이소형 mAb에 대해 비교하였다. 플로우 셀을 30초간 100 μl/분의 유속으로 10 mM 수산화나트륨 (VWR, 28244.262)을 주입함으로써 재생시켰다. 블랭크 플로우 셀 (고정화된 FcγR 부재)에 대한 이중 참조 및 시험 mAb2로부터 완충제 주기의 공제에 의해 BiaEvaluation 소프트웨어 버전 3.2 RC1을 이용해 데이터 분석을 수행하였다. 결과를 표 7에 나타내었다.
SPR에 의한 인간 Fcγ 수용체에 대한 모의 mAb2 포맷의 항-인간 LAG-3 Fcab (상기에 기술된 바와 같은 LALA 돌연변이 포함)의 결합 반응
mAb/모의 mAb2 해리 말기의 결합 반응 (RU)
FcγRI FcγRIII FcγRIIa FcγRIIb
FS18-7-9 1.4 6.6 -9.8 -8.5
FS18-7-62 -0.9 0.7 -10 -8.5
FS18-7-78 -0.3 4.0 -10.7 -9.2
모의 mAb LALA 2 8.0 -12.7 -9.6
IgG2 0 1.9 9.7 7.4
IgG4 9 3.1 4.3 15.1
모의 mAb IgG1 26 44 13 17.7
시험된 모든 모의 mAb2 (모두 상기에 기재된 바와 같은 LALA 돌연변이를 포함함)는 LALA 돌연변이를 갖지 않는 대조군 항체 (모의 mAb IgG1)에 비해 시험된 Fcγ 수용체에 대해 현저하게 감소된 결합을 나타내었는데, 이는 LALA 돌연변이가 이들 모의 mAb2에 의한 Fcγ 수용체 결합을 감소시키고 따라서 mAb2의 ADCC 활성을 감소시킬 것으로 예상된다.
1.6 LAG-3에 대한 MHC 클래스 II 결합의 차단
재조합 인간 또는 마우스 LAG-3 Fc와 인간 MHC 클래스 II 사이의 상호작용을 차단하는 Fcab (절두된 힌지 함유; 서열번호 58)의 능력을 인간 MHC 클래스 II를 발현하는 흑색종 세포주인, A375 세포에 대한 LAG-3 Fc의 결합을 측정함으로써 연구하였다. 10% FBS (Life Technologies, 10270-106)를 함유하는 DMEM (Life Technologies, 61965-026) 중에서 성장시킨 A375 (ATCC, CRL-1619) 세포를 세포 해리 완충제 (Life Technologies, 13151-014)를 사용하여 세포 배양 플라스크로부터 분리시키고 V-바닥 96-웰 플레이트 (Costar, 3897)에 2×105 세포/웰로 접종하였다. 플레이트를 4℃에서 3분간 1500 rpm으로 원심분리하여 세포의 펠렛을 얻었다. 관련 농도의 Fcab 또는 대조군 mAb를 10% FBS를 함유하는 100 μl의 DMEM 중에서 1 μg/ml LAG-3 Fc (인간 LAG-3-Fc R&D Systems, 2319-L3-050 또는 마우스 LAG-3 Fc R&D Systems, 3328-L3-050)와 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. LAG-3/Fcab 믹스를 A375 세포에 첨가하고 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 세척하였다. 이차 항체 (Alexa Fluor 488 접합된 염소 항-인간 Fc F(ab')2, Jackson Immunoresearch, 109-546-098 또는 염소 항-마우스 IgG (H+L) 488 접합체, Life Technologies, A-1101)를 PBS 중에 1:1000로 희석하고 100 μl를 4℃에서 30분간 세포에 첨가하였다 (플레이트는 어둠 속에 유지됨). 세포를 PBS로 1회 세척하고 100 μl PBS + 1 μg/ml DAPI (Biotium, 40043)에 재현탁하였다. 플레이트를 BD FACSCanto II 세포분석기 (BD Biosciences) 상에서 판독하고 데이터를 FlowJo 소프트웨어를 사용해 분석하였다.
항-마우스 LAG-3 Fcab 둘 다는 인간 MHC 클래스 II와 마우스 LAG-3의 상호작용을 억제할 수 있지만, 대조군 항-마우스 LAG-3 mAb (C9B7W, 2B Scientific, BE0174-50MG)는 그렇지 않았다 (표 8 참조).
대리 항-마우스 LAG-3 Fcab는 MHC 클래스 II에 대한 마우스 LAG-3의 결합을 억제함
대리 항-마우스 LAG-3 Fcab 및 대조군 항-마우스 LAG-3 mAb C9B7W IC50 (nM)
FS18-7-108-29 0.6
FS18-7-108-35 0.7
C9B7W 차단 부재
시험된 항-인간 LAG-3 Fcab는 또한 대조군 항-인간 LAG-3 mAb (25F7)와 유사한 효능으로 인간 MHC 클래스 II와 인간 LAG-3의 상호작용을 억제할 수 있었다.
항-인간 LAG-3 Fcab는 MHC 클래스 II에 대한 인간 LAG-3의 결합을 억제함
항-인간 LAG-3 Fcab 및 대조군 항-인간 LAG-3 mAb 25F7 IC 50 (nM)
FS18-7-108-33 2.6
FS18-7-108-78 2.4
25F7 3.6
실시예 2: mAb 및 mAb 2 분자의 제조 및 특성화
2.1 mAb 84G09의 제조
2.1.1 DNA 작제물 생성
84G09의 가변 중쇄 및 경쇄 영역을 인코딩하는 DNA 삽입물을 포유동물 발현을 위해 코돈 최적화하고 (codon optimised), DNA2.0 (Menlo Park, CA, USA)으로 합성시켰다. pJ-Amp-high 숙주 벡터에 공급된 삽입물을, EcoRI 및 NheI 제한 다이제스트 (restriction digest)를 통해, 발현 벡터 pFS-hHC2.1-G1m17(z) LALA (LALA 돌연변이 함유 IgG 중쇄) 또는 pFS-hHC2.1-G1m17(z) (LALA 돌연변이 비함유 IgG 중쇄) 및 pFShK1.0 (IgG 카파 경쇄) 내로 서브-클로닝 하였다 (sub-cloned).
클로닝의 정확성 (fidelity)을 콜로니 PCR에 의해 및 제3자 (GATC Biotech)에 의한 후속 뉴클레오티드 서열분석에 의해 검증하였다.
2.1.2 세포 유지 (cell maintenance)
HEK293-6E 세포 (NRCC)를, 4mM의 GlutaMAX-1 (Invitrogen, 35050-038), 0.1%의 플루로닉 (Pluronic) F-68 (Invitrogen A13835-01) 및 25 μg/ml의 제네티신 (geneticin) (Invitrogen, 10131-027)으로 보충된 미리-가온된 F17 배지 (Invitrogen, A13835-01)에 계대-배양하였다 (sub-cultured). 세포를 37 ℃, 140 rpm, 5% CO2에서 인큐베이션하고 (incubated), 3일에 이어서 4일 요법 (regime)으로 0.3x106 세포/ml에 계대배양하였다.
2.1.3 일시 형질감염 (transient transfection)
1 mg/ml의 PEIpro (Polyplus, PPLU115)를 사용하여 HEK293-6E 세포를 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염 24시간 전, 세포를 배양물 배지 중 0.8x106 세포/ml로 시딩하였다 (seeded). 각 200 ml의 세포 배양물에 대해서, 10 ml의 가온된 Opti-MEMI (Invitrogen, 11058-021), 100 μg의 중쇄를 인코딩하는 내독소-비함유 DNA 및 100 μg의 경쇄를 인코딩하는 내독소-비함유 DNA를 혼합하여 DNA혼합물을 제조하였다. 10 ml의 가온된 Opti-MEMI 및 200 μl의 PEIpro를 혼합하고, 볼텍싱 (vortexing)하여 PEI 혼합물을 제조하였다. DNA 혼합물을 볼텍싱된 PEI 혼합물에 빠르게 첨가하고, 1초 동안 3회 볼텍스 펄싱 (vortex pulsing)하여 혼합하고, 실온에서 3분간 인큐베이션하고, 세포에 한방울씩 첨가하였다. 형질감염 48시간 후, 각 플라스크에 0.5% 트립톤 N1 (TekniScience Inc., 19553)이 첨가된 보충물 + F17 20 ml를 첨가하였다.
형질감염 6일 후, 4500 rpm으로 40분 동안 원심분리하여 세포를 수확하였다. 이어서, 상청액을 0.22 μm 폴리에테르설폰 필터 유닛 (filter unit)(Millipore, SCGPU01RE, SCGPU02RE, SCGPU05RE, SCGPU11RE)으로 여과하고, 정제할 때까지 +4 ℃에 저장하였다.
2.1.4 단백질 A 크로마토그래피
맑아진 상청액을 AKTAexplorer 또는 AKTAxpress에서 미리-패키징된 5ml HiTrap MabSelect SuRe 컬럼 (GE Healthcare, 11-0034-95)을 사용하여 정제하였다. 간략하게는, 상기 컬럼을 50mM Tris-HCl, pH 7.0의 250mM NaCl, 5 ml/min의 동일한 완충액으로 세척된 비결합된 물질로 평형화하였다 (equilibrated). 생성물을 5 ml/min의 10mM 포름산 나트륨 pH 3.0으로 용출시켰다. 용출된 샘플을 제조사의 권고에 따라 PBS pH 7.4로 미리-평형화된 PD-10 컬럼 (GE Healthcare, 17-0851-01)을 사용하여 PBS pH 7.4로 즉시 완충액 교환하였다.
2.1.5 분광분석에 의한 생성물 농도 측정
각각의 정제된 생성물의 280 nm에서의 흡광도를 DropPlate 96 D+ (PerkinElmer, CLS135136)가 구비된 LabChip DS (PerkinElmer, 133089)을 사용하여 측정하였다. VectorNTI Advance v11.5.4 소프트웨어 (Thermofisher Scientific, A13784)를 사용하여 계산된 흡광 계수 (1mg/ml의 A280)를 사용하여 생성물 농도를 계산하였다.
2.1.6 생성물 농도
필요한 경우, 정제된 분획을 Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit 30K (Millipore, UFC803024)를 사용하여 농축시켰다. 3000 rpm에서 10분 동안 원심분리함으로써 PBS pH 7.4를 포함하는 Ultracel 재생 셀룰로오스 막 (Ultracel regenerated cellulose membrane)의 평형화 이후, 샘플을 4 ml 유닛으로 로딩하고 (loaded), 목적하는 단백질 농도가 달성될 때까지 3000 rpm에서 원심분리하였다.
2.1.6 여과 살균 (Filter sterilisation)
최종 샘플을 사전에-적셔진 (pre-wet) Millex-GV PVDF 주사기 필터 (syringe filter) (Millipore, SLGV013SL)를 사용하여 여과하였다.
2.2 인간 LAG-3/PD-L1 mAb 2 의 제조
단클론 항체 84G09 (LALA 돌연변이 함유 및 비함유)의 CH3 도메인을, 인간 IgG1의 비변형된 CH3 도메인의 서열 내 존재하는 XhoI 및 BamHI 부위 내의 인간 LAG-3 특이적 Fcab FS18-7-9, FS18-7-32, FS18-7-33, FS18-7-36, FS18-7-58, FS18-7-62, FS18-7-65, FS18-7-78, FS18-7-88 및 FS18-7-95의 CH3 도메인으로 대체함으로써, mAb2 분자 FS18-7-9/84G09 (서열번호 94 및 95), FS18-7-32/84G09 (서열번호 96 및 97), FS18-7-33/84G09 (서열번호 98 및 99), FS18-7-36/84G09 (서열번호 100 및 101), FS18-7-58/84G09 (서열번호 102 및 103), FS18-7-62/84G09 (서열번호 104 및 105), FS18-7-65/84G09 (서열번호 106 및 107), FS18-7-78/84G09 (서열번호 108 및 109), FS18-7-88/84G09 (서열번호 110 및 111) 및 FS18-7-95/84G09 (서열번호 112 및 113)의 중쇄를 제조하였다. mAb2의 중쇄를 상기 섹션 2.1에서 mAb 84G09에 대해 기재된 바와 같이 84G09 (서열번호 116)의 경쇄로 공동-형질감염 (co-transfected) 시켰다. 이어서, mAb 2 를 상기 섹션 2.1에서 mAb 84G09에 대해 기재된 바와 같이 발현시키고 정제하였다.
2.3 인간 LAG-3/모의 mAb 2 의 제조
mAb 4420의 중쇄 (서열번호 83 및 84; LALA 돌연변이 함유 및 비함유) 및 경쇄 (서열번호 85)를 사용하여, 상기 섹션 2.1에서 mAb 84G09에 대해 기재된 바와 같이 항-FITC mAb (LALA 돌연변이 함유 및 비함유)를 제조하였다.
단클론 항체 4420 (LALA 돌연변이 함유 및 비함유)의 CH3 도메인을, 인간 IgG1의 비변형된 CH3 도메인의 서열 내 존재하는 XhoI 및 BamHI 부위 내의 인간 LAG-3 특이적 Fcab FS18-7-9, FS18-7-32, FS18-7-33, FS18-7-36, FS18-7-58, FS18-7-62, FS18-7-65, FS18-7-78, FS18-7-88 및 FS18-7-95의 CH3 도메인으로 대체함으로써, mAb2 분자 FS18-7-9/4420 (서열번호 63 및 64), FS18-7-32/4420 (서열번호 65 및 66), FS18-7-33/4420 (서열번호 67 및 68), FS18-7-36/4420 (서열번호 69 및 70), FS18-7-58/4420 (서열번호 71 및 72), FS18-7-62/4420 (서열번호 73 및 74), FS18-7-65/4420 (서열번호 75 및 76), FS18-7-78/4420 (서열번호 77 및 78), FS18-7-88/4420 (서열번호 79 및 80) 및 FS18-7-95/4420 (서열번호 81 및 82)의 중쇄를 제조하였다. mAb2의 중쇄를 상기 섹션 2.1에서 mAb 84G09에 대해 기재된 바와 같이 mAb 4420의 경쇄로 공동-형질감염시켰다. 이어서, 상기 섹션 2.1에서 mAb 84G09에 대해 기재된 바와 같이 단백질을 발현시키고 정제하였다.
2.4 마우스 LAG-3/PD-L1 mAb 2 의 제조
마우스 항-PD-L1 mAb (LALA 돌연변이 함유 및 비함유)를 mAb S1의 중쇄 (서열번호 122 및 123) 및 경쇄 (서열번호 119)를 사용하여 상기 섹션 2.1에서 mAb 84G09에 대해 기재된 바와 같이 제조하였다.
단클론 항체 S1 (LALA 돌연변이 함유 및 비함유)의 CH3 도메인을, 인간 IgG1의 비변형된 CH3 도메인의 서열 내 존재하는 XhoI 및 BamHI 부위 내의 마우스 LAG-3 특이적 Fcab FS18-7-108-29 및 FS18-7-108-35의 CH3 도메인으로 대체함으로써, mAb2 분자 FS18-7-108-29/S1 (서열번호 117 및 118) 및 FS18-7-108-35/S1 (서열번호 120 및 121)의 중쇄를 제조하였다. mAb2의 중쇄를 상기 섹션 2.1에서 mAb 84G09에 대해 기재된 바와 같이 S1의 경쇄로 공동-형질감염시켰다. 이어서, 상기 섹션 2.1에서 mAb 84G09에 대해 기재된 바와 같이 단백질을 발현시키고 정제하였다.
2.5 인간 LAG-3 및 인간 PD-L1에 대한 mAb 2 의 결합 친화도 및 동역학
BIAcore T200 기기에 대한 제조사의 지침에 따라 2000 RU의 표면 밀도로 아민 결합시킴으로써 Series S CM5 칩 (GE Healthcare, BR-1005-30)의 유동 세포 1 및 2상에 단백질 L (Thermo, 21189)을 고정시켰다. LAG-3 결합에 대하여, mAb2 샘플 (모두 LALA 돌연변이 함유)을 단지 유동 세포 2 상에 포획하고, 0.5 nM로 시작하는 2-배 희석 시리즈에서 4개 농도의 인간 LAG-3Fc (R&D Systems, 2319-L3)을 30 ㎕/min의 유속으로 유동 세포 1 및 2 모두를 가로질러 흘려보냈다. 결합 시간은 3분 이었고, 해리 시간은 6분 이었다. 러닝 완충액 (Running buffer)은 HBS-P (GE Healthcare, BR-1003-68) 였다. 100 ㎕/min의 유속으로 20초 동안 10 mM 수산화나트륨 (NaOH)을 주입함으로써 2개의 유동 세포 모두를 재생시켰다. 블랭크 (blank) 유동 세포에 대해 이중 참조 (double referencing)함으로써 데이터를 분석하였다.
PD-L1 결합에 대하여, 40 nM로 시작하는 PD-L1 Fc (R&D Systems, 156-B7)의 2-배 희석 시리즈에서 4개의 농도를 동일한 단백질 L 칩 상에 포획된 mAb2를 가로질러 흘려보냈다. 모든 다른 조건은 LAG-3 결합에 대한 것과 동일하였다 (상기 참조).
결합 동력학을 1:1 랭뮤어 모델에 피팅시켜 결합 (binding association) (ka) 및 해리 (kd) 속도를 생성하였다. 각 샘플에 대한 해리 속도를 결합 속도로 나눔으로써 평형 결합 상수 (KD)를 계산하였다. BiaEvaluation software version 3.2로 데이터 분석을 수행하였다. 결과를 표 10 및 11에 나타낸다.
SPR로 측정된 mAb2의 인간 LAG-3로의 결합 친화도 및 동력학
mAb2 KD (pM) ka (1/Ms) x 106 kd (1/s) x 10-4
84G09LALA 결합 없음 - -
FS18-7-09/84G09LALA 56 6.3 3.5
FS18-7-32/84G09LALA 49 5.6 2.8
FS18-7-33/84G09LALA 43 4.2 1.8
FS18-7-36/84G09LALA 38 4.4 1.7
FS18-7-62/84G09LALA 36 5.4 2.0
FS18-7-65/84G09 LALA 39 5.9 2.3
FS18-7-78/84G09 LALA 29 4.8 1.4
SPR로 측정된 mAb2의 인간 PD-L1으로의 결합 친화도 및 동력학
mAb2 KD (nM) ka (1/Ms) x105 kd (1/s) x 10-4
84G09LALA 1.2 3.8 4.6
FS18-7-09/84G09LALA 1.0 3.8 3.9
FS18-7-32/84G09LALA 1.0 3.4 3.2
FS18-7-33/84G09LALA 1.1 3.7 4.2
FS18-7-36/84G09LALA 3.5 1.6 5.6
FS18-7-62/84G09LALA 1.3 1.7 2.2
FS18-7-65/84G09 LALA 1.1 1.3 1.4
FS18-7-78/84G09 LALA 1.0 1.0 1.0
인간 PD-L1 및 인간 LAG-3에 대한 결합 친화도는 시험된 모든 mAb2에 필적하였다. 인간 PD-L1에 대한 mAb2 결합 친화도는 84G09에 필적하였고, 이는 LAG-3 결합 부위의 CH3 도메인으로의 도입이 PD-L1 결합에 영향을 끼치지 않았다는 것을 의미한다.
2.6 mAb 2 의 인간 LAG-3 및 인간 PD-L1으로의 동시 결합
LAG-3 및 PD-L1에 동시에 결합하는 mAb2 (FS18-7-09/84G09, FS18-7-32/84G09, FS18-7-33/84G09, FS18-7-36/84G09, FS18-7-62/84G09, FS18-7-65/84G09, 및 FS18-7-78/84G09 모두 LALA 돌연변이 포함)의 능력을 SPR로 시험하였다. 제조사의 지침에 따라 150 RU의 표면 밀도로 Series S CM5 칩 (GE Healthcare, BR-1005-30)의 유동 세포 2 상에 인간 PD-L1Fc (R&D Systems, 156-B7)를 고정시켰다. 유동 세포 1을 활성화시키고, 백그라운드 공제를 위해 고정된 임의의 단백질 없이 이를 비활성화시켰다. 각각의 샘플에 대해 10 ㎍/ml의 mAb2를 10 ㎕/min의 유속으로 3분 동안 유동 세포 1 및 2를 가로질러 흘려보냈다. 그 후에, 40 nM의 LAG-3Fc (R&D Systems, 2319-L3)를 10 ㎕/min의 유속으로 3분 동안 유동 세포 1 및 2 모두를 가로질러 흘려보냈다. 각각의 결합 단계에 있어서, 해리는 3분 동안 이어졌다. 각 사이클에서 100 ㎕/min의 유속으로 25 mM NaOH를 15 s 주입한 후, 센서 칩을 재생시켰다.
시험된 모든 mAb2는 LAG-3 및 PD-L1에 동시에 결합할 수 있었다. 모체 항-PD-L1 mAb, 84G09는 오직 PD-L1에만 결합한다.
2.7. 대리 mAb 2 의 뮤린 LAG-3 및 뮤린 PD-L1로의 동시 결합
뮤린 LAG-3 및 뮤린 PD-L1에 동시에 결합하는 2개 대리 마우스 mAb2 (FS18-7-108-29/S1 및 FS18-7-108-35/S1, 모두 LALA 돌연변이 함유)의 능력을 BIAcore 3000 (GE Healthcare)에서 SPR로 시험하였다. 뮤린 PD-L1Fc (R&D Systems, 1019-B7-100)를 제조사의 지침에 따라 830 RU의 포면 밀도로 CM5 칩의 유동 세포 4 상에 고정하였다. 배경 제거를 위해 인간-Fc의 820 RU (R&D system, 110-HG)로 유동 세포 3을 고정하였다. 각각의 샘플에 있어서, 50 nM의 mAb2를 20 ㎕/min의 유속으로 159 초 동안 유동 세포 1 및 2를 가로질러 흘려보냈다. 이어서, 50 nM의 뮤린 LAG-3Fc (R&D Systems, 3328-L3-050)를 20 ㎕/min의 유속으로 150 초 동안 유동 세포 3 및 4 모두를 가로질러 흘려보냈다. 각각의 결합 단계에 있어서, 해리는 3분 동안 이어졌다. 각 사이클에서 2 x 10 μl의 50 mM NaOH 주입 후 센서 칩을 재생시켰다. 시험된 2개 모든 mAb2는 뮤린 LAG-3 및 뮤린 PD-L1에 동시에 결합할 수 있었고, 따라서, 인간 LAG-3/PD-L1 mAb2를 위한 적절한 대리이다.
2.8 LALA 돌연변이를 포함하는 mAb 2 에 의한 인간 Fcγ로의 결합
BIAcore3000 기기에 대한 제조사의 지침에 따라, Fcγ RI (R&D Systems, 1257-FC) 및 Fcγ RIIIa (R&D Systems, 4325-FC)에 대해 약 200 RU, 및 Fcγ RIIa (R&D Systems, 1330-CD) 및 Fcγ RIIb/c (R&D Systems, 1875-CD)에 대해 약 500 RU의 표면 밀도로 CM5 칩 상에 인간 Fcγ 수용체를 고정시켰다. FcγRI 및 FcγRIIIa에 있어서, 100㎍/ml의 mAb 또는 mAb2를 10 ㎕/min의 유속으로 3분 동안 칩을 가로질러 흘려보내고, 이어서 5분 동안 해리시켰다. 러닝 완충액은 PBS (Lonza, BE17-516F) + 0.05% (v/v) P20 계면활성제 (GE Healthcare, BR-1000-54) 였다. 양성 대조군은 야생형 IgG1 4420-mAb 였다. 무관한 표적 (20H4 및 MOR7490) 및 마우스 IgG1 (Sigma, P5305)에 대한 단클론 IgG2 및 IgG4 mAb를 기준점 (reference point)으로 포함시켰다. 결합 복합체의 빠른 해리 속도로 인해 재생이 필요하지 않았다. FcγRIIa 및 FcγRIIb/c 시험에 있어서, 이러한 2개 수용체의 약한 결합을 보상하기 위하여 mAb2의 농도를 500 ㎍/ml로 증가시켰다. 결과를 표 12에 나타낸다.
SPR로 측정된 항-LAG-3/PD-L1 mAb2의 인간 Fcγ 수용체로의 결합 반응
mAb/mAb2 해리 말기의 결합 반응 (RU)
FcγRI FcγRIII FcγRIIa FcγRIIb/c
FS18-7-9/84G09 LALA <1 <5 <1 <2
FS18-7-33/84G09 LALA <1 <5 <1 <2
FS18-7-62/84G09 LALA <1 <5 <1 <2
FS18-7-78/84G09 LALA <1 <5 <1 <2
84G09 mAb LALA <1 <5 <1 <2
IgG2 <1 <5 9 <2
IgG4 8 <5 8 9
4420 mAb IgG1 30 28 29 18
마우스 IgG1 <1 <5 7 <2
예상되는 바와 같이, mAb 또는 mAb2로 도입된 LALA 변이체는 인간 Fcγ 수용체에 결합하는 이러한 분자의 능력을 감소시켰다.
2.9 mAb 2 의 인간 및 시노몰구스 LAG-3를 발현하는 세포로의 결합
인간 LAG-3 서열 (서열번호 126) 또는 시노몰구스 LAG-3 서열 (서열번호 128)을 KpnI (NEB, R0142) 및 NotI (NEB, R0146) 제한 소화 (restriction digestion)를 사용하는 pcDNA5FRT 벡터 내로 서브클로닝하였다. 이어서, 벡터를 리포펙타민 2000 (Life Technologies, 11668-019)를 사용하여 Flp-In T-REx 293 HEK 세포주 (Life Technologies, R780-07) 내로 형질전환하였다. 형질전환된 Flp-In T-REx 293 세포를, 안정적으로 형질전환된 세포의 콜로니가 분명해질 때까지 3-4주 동안 10% FBS (Life Technologies, 10270-1-6), 100 μg/ml 하이그로마이신 B (Melford Laboratories Ltd, Z2475), 15　μg/ml 블라스티시딘 (Melford Laboratories Ltd, B1105)를 함유하는 DMEM (Life Technologies, 61965-026) 중에서 성장시켰다. 이러한 콜로니를 1 μg/ml의 독시사이클린 (Sigma, D9891)의 존재 하에 증폭시키고, LAG-3 발현을 시험하기 위하여 유세포 분석으로 이를 확인하였다.
세포 발현된 인간 또는 시노몰구스 LAG-3에 대한 mAb2 (모두 LALA 돌연변이 함유)의 친화도를 유세포 분석을 사용하여 측정하였다. 10% FBS (Life Technologies, 10270-1-6), 100 μg/ml 하이그로마이신 B (Melford Laboratories Ltd, Z2475), 15　μg/ml 블라스티시딘 (Melford Laboratories Ltd, B1105) 및 1 μg/ml 독시사이클린 (Sigma, D9891)를 함유하는 DMEM (Life Technologies, 61965-026) 중에서 성장한 인간 또는 시노몰구스 LAG-3를 발현하는 HEK 세포를 세포 해리 완충액 (Life Technologies, 13151-014)을 사용하여 조직 배양물 플라스크로부터 분리하고, 이를 2x105 세포/웰의 V형-바닥 96-웰 플레이트 (Costar, 3897)에 시딩하였다. 플레이트를 4 ℃에서 3분 동안 1500 rpm으로 원심분리하여 세포를 펠릿화하였다. mAb2 (또는 대조군 mAb)의 일련의 희석물을 4 ℃에서 1시간 동안 100 μl 부피의 세포와 함께 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 2차 항체 (Anti-human Fc-488, Jackson ImmunoResearch, 109-546-098)를 PBS 중에 1:1000 희석하고, 4 ℃에서 30분 동안 세포에 100 μl를 첨가하였다 (플레이트를 어둠하에 유지). 플레이트를 세척하고, 이어서, 세포를 1 μg/ml DAPI (Biotium, 40043)를 함유하는 100 μl PBS 중에 재현탁하였다. Canto II 유세포 분석기 (flow cytometer) (BD Bioscience)를 사용하여 플레이트를 판독하였다. 사멸한 세포를 배제하고, FITC 채널에서 형광 (488nm/530/30)을 측정하였다. GraphPad Prism Software에서 로그 (작동제) 대 반응을 사용하여 데이터를 피팅하였다. BD FACSCanto II cytometer (BD Biosciences)에서 플레이트를 판독하고, FlowJo를 사용하여 데이터를 분석하였다. 결과를 표 13에 나타낸다.
유세포 분석으로 측정된 인간 또는 시노몰구스 LAG-3를 발현하는 HEK 세포에 대한 항-LAG-3/PD-L1 mAb2의 결합 친화도
인간 LAG-3 시노몰구스 LAG-3
EC50
(nM)		 95% Conf. Int. EC50
(nM)		 95% Conf. Int.
FS18-7-09/84G09LALA 3.179 2.311 내지 4.372 29.9 22.16 내지 40.35
FS18-7-62/84G09LALA 4.079 2.736 내지 6.083 26.37 15.80 내지 44.02
FS18-7-78/84G09LALA 2.526 1.474 내지 4.329 24.75 19.31 내지 31.73
25F7 4.192 2.791 내지 6.297 156.5 107.3 내지 228.2
결과는 HEK 세포 상에 발현된 인간 및 시노몰구스 LAG-3에 결합하는 mAb2를 확인했다. 계산된 EC50 값에 관하여, 시험된 mAb2는, 대조군 항-LAG-3 항체 25F7과 비교한 경우, 인간 LAG-3에 대해 더 뛰어나거나 동등한 결합, 및 시노몰구스 LAG-3에 적어도 2배의 더 뛰어한 결합을 나타낸다. HEK 세포주의 표면 상에 발현된 다른 단백질과의 교차-반응성은 관찰되지 않았다.
2.10 mAb 2 의 인간 및 시노몰구스 PD-L1를 발현하는 세포로의 결합
인간 PD-L1 서열 (서열번호 129) 또는 시노몰구스 PD-L1 서열 (서열번호 131)를 KpnI (NEB, R0142) 및 NotI (NEB, R0146) 제한 소화를 사용하는 pcDNA5FRT 벡터 (Life Technologies, V6010-20) 내로 서브클로닝하였다. 이어서, 리포펙타민 2000 (Life Technologies, 11668-019)을 사용하여 벡터를 Flp-In T-REx 293 HEK 세포주 (Life Technologies, R780-07) 내로 형질전환하였다. 형질전환된 Flp-In T-REx 293 세포를, 안정적으로 형질전환된 세포의 콜로니가 분명해질 때까지 3-4주 동안 10% FBS (Life Technologies, 10270-1-6), 100 μg/ml 하이그로마이신 B (Melford Laboratories Ltd, Z2475), 15　μg/ml 블라스티시딘 (Melford Laboratories Ltd, B1105)를 함유하는 DMEM (Life Technologies, 61965-026) 중에서 성장시켰다. 이러한 콜로니를 1 μg/ml의 독시사이클린 (Sigma, D9891)의 존재 하에 증폭시키고, 유세포 분석으로 LAG-3 발현을 확인하였다.
세포 발현된 인간 또는 시노몰구스 PD-L1에 대해, 또는 모체 (parental) (비형질전환된 세포)에 대해 결합하는 mAb2 (모두 LALA 돌연변이 함유)의 친화도를 유세포 분석을 사용하여 측정하였다. 10% FBS (Life Technologies, 10270-1-6), 100 μg/ml 하이그로마이신 B (Melford Laboratories Ltd, Z2475), 15　μg/ml 블라스티시딘 (Melford Laboratories Ltd, B1105) 및 1 μg/ml 독시사이클린 (Sigma, D9891)를 함유하는 DMEM (Life Technologies, 61965-026) 중에서 성장한 인간 또는 시노몰구스 PD-L1을 발현하는 HEK 세포를 세포 해리 완충액 (Life Technologies, 13151-014)을 사용하여 조직 배양물 플라스크로부터 분리하고, 이를 2x105 세포/웰의 V형-바닥 96-웰 플레이트 (Costar, 3897)에 시딩하였다. 플레이트를 4 ℃에서 3분 동안 1500 rpm으로 원심분리하여 세포를 펠릿화하였다. mAb2 (또는 대조군 mAb)의 일련의 희석물을 4 ℃에서 1시간 동안 100 μl 부피의 세포와 함께 인큐베이션하였다. 플레이트트 세척하고, 2차 항체 (Anti-human Fc-488, Jackson ImmunoResearch, 109-546-098)를 PBS 중에 1:1000 희석하고, 4 ℃에서 30분 동안 세포에 100 μl를 첨가하였다 (플레이트를 어둠하에 유지). 플레이트를 세척하고, 이어서, 세포를 1 μg/ml DAPI (Biotium, 40043)를 함유하는 100 μl PBS 중에 재현탁하였다. Canto II 유세포 분석기 (BD Bioscience)를 사용하여 플레이트틀 판독하였다. 사멸한 세포를 배제하고, FITC 채널에서 형광 (488nm/530/30)을 측정하였다. GraphPad Prism Software에서 로그(log)(작동제) 대 반응을 사용하여 데이터를 피팅하였다. BD FACSCanto II cytometer (BD Biosciences)에서 플레이트를 판독하고, FlowJo를 사용하여 데이터를 분석하였다. 결과를 표 14에 나타낸다.
유세포 분석으로 측정된 인간 또는 시노몰구스 PD-L1을 발현하는 HEK 세포로의 항-LAG-3/PD-L1 mAb2의 결합 친화도
인간 PD-L1 HEK 시노몰구스 PD-L1
EC50
(nM)		 95% Conf. Int. EC50
(nM)		 95% Conf. Int.
84G09 3.107 2.230 내지 4.331 1.641 1.244 내지 2.164
FS18-7-09/84G09 3.19 2.208 내지 4.610 1.674 1.393 내지 2.012
FS18-7-09/84G09 3.51 2.570 내지 4.794 1.814 1.503 내지 2.189
FS18-7-33/84G09 3.448 2.436 내지 4.881 1.895 1.566 내지 2.292
FS18-7-32/84G09 3.816 2.749 내지 5.298 1.984 1.644 내지 2.393
FS18-7-58/84G09 3.775 2.957 내지 4.820 1.861 1.541 내지 2.247
FS18-7-33/84G09 3.225 2.214 내지 4.700 1.733 1.397 내지 2.150
FS18-7-65/84G09 3.999 2.782 내지 5.750 1.845 1.455 내지 2.339
FS18-7-36/84G09 3.907 2.844 내지 5.367 1.999 1.580 내지 2.528
FS18-7-88/84G09 3.492 2.541 내지 4.800 1.814 1.464 내지 2.247
FS18-7-58/84G09 3.907 2.998 내지 5.093 2.033 1.622 내지 2.550
84G09 (parental) 3.051 2.181 내지 4.267 1.959 1.515 내지 2.533
인간 PD-L1 및 시노몰구스 PD-L1에 결합된 모든 시험된 LAG-3/PD-L1 mAb2의 EC50은 84G09 mAb의 EC50에 근접하며, 이는 PD-L1 결합 친화도가 LAG-3 결합 부위의 mAb2의 CH3 도메인으로의 도입에 의해 영향을 받지 않았다는 것을 입증한다.
2.11 대리 마우스 mAb 2 의 마우스 LAG-3 또는 마우스 PD-L1을 발현하는 세포로의 결합
뮤린 LAG-3 서열 (서열번호 127) 또는 뮤린 PD-L1 서열 (서열번호 130)을 KpnI (NEB, R0142) 및 NotI (NEB, R0146) 제한 소화를 사용하는 pcDNA5FRT 벡터 (Life Technologies, V6010-20) 내로 서브클로닝하였다. 이어서, 리포펙타민 2000 (Life Technologies, 11668-019)을 사용하여 벡터를 Flp-In T-REx 293 HEK 세포주 (Life Technologies, R780-07) 내로 형질전환하였다. 형질전환된 Flp-In T-REx 293 세포를, 안정적으로 형질전환된 세포의 콜로니가 분명해질 때까지 3-4주 동안 10% FBS (Life Technologies, 10270-1-6), 100 μg/ml 하이그로마이신 B (Melford Laboratories Ltd, Z2475), 15　μg/ml 블라스티시딘 (Melford Laboratories Ltd, B1105)를 함유하는 DMEM (Life Technologies, 61965-026) 중에서 성장시켰다. 이러한 콜로니를 1 μg/ml의 독시사이클린 (Sigma, D9891)의 존재 하에 증폭시키고, 유세포 분석으로 LAG-3 또는 PD-L1 발현을 확인하였다.
세포 발현된 뮤린 LAG-3 또는 뮤린 PD-L1에 결합하는 mAb2 (모두 LALA 돌연변이 함유)의 친화도를 유세포 분석을 사용하여 측정하였다. 10% FBS (Life Technologies, 10270-1-6), 100 μg/ml 하이그로마이신 B (Melford Laboratories Ltd, Z2475), 15　μg/ml 블라스티시딘 (Melford Laboratories Ltd, B1105) 및 1 μg/ml 독시사이클린 (Sigma, D9891)를 함유하는 DMEM (Life Technologies, 61965-026) 중에서 성장한 뮤린 LAG-3 또는 뮤린 PD-L을 발현하는 HEK 세포를 세포 해리 완충액 (Life Technologies, 13151-014)을 사용하여 조직 배양물 플라스크로부터 분리하고, 이를 2x105 세포/웰의 V형-바닥 96-웰 플레이트 (Costar, 3897)에 시딩하였다. 플레이트를 4 ℃에서 3분 동안 1500 rpm으로 원심분리하여 세포를 펠릿화하였다. mAb2 (또는 대조군 mAb)의 일련의 희석물을 4 ℃에서 1시간 동안 60 μl 부피의 세포와 함께 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 2차 항체 (mAb2에 대한 항-인간 Fc-488, Jackson ImmunoResearch, 109-546-098 또는 항-LAG-3 대조군에 대한 Anti-Rat IgG (H+L), Alexa Fluor 488, ThermoFisher, C9B7W)를 PBS 중에 1:1000 희석하고, 50 μl를 4 ℃에서 30분 동안 세포에 첨가하였다 (플레이트를 어둠하에 유지). 플레이트를 세척하고, 이어서, 세포를 50 μl의 FACS Cell Fix (BD Bioscience, 340181) 중에 15분 동안 재현탁시키고, 이어서, 세척하고, 1 μg/ml DAPI (Biotium, 40043)를 함유하는 100 μl PBS 중에 재현탁시켰다. Canto II 유세포 분석기 (BD Bioscience)를 사용하여 플레이트를 판독하였다. 사멸한 세포를 배제하고, FITC 채널에서 형광 (488nm/530/30)을 측정하였다. GraphPad Prism Software에서 로그 대 반응 (agonist)을 사용하여 데이터를 보정하였다. BD FACSCanto II cytometer (BD Biosciences)에서 플레이트를 판독하고, FlowJo를 사용하여 데이터를 분석하였다. 결과를 표 15에 나타낸다.
유세포 분석으로 측정된 뮤린 LAG-3 또는 뮤린 PD-L1을 발현하는 HEK 세포로의 대리 항-마우스 LAG-3/PD-L1 mAb2의 결합 친화도
뮤린 LAG-3 HEK 뮤린 PD-L1 HEK
EC50 (nM) 95% Conf. Int. EC50
(nM)		 95% Conf. Int.
C9B7W 27 12.27 내지 58.04 N/A -
FS18-7-108-29/S1 2.27 1.064 내지 4.857 11.9 7.627 내지 18.68
FS18-7-108-29/4420 2.29 1.256 내지 4.164 N/A -
FS18-7-108-35/S1 3.84 2.126 내지 6.926 12.3 8.873 내지 17.16
FS18-7-108-35/4420 2.38 0.7819 내지 7.239 N/A -
대리 mAb2는 세포-발현된 뮤린 LAG-3 및 세포 발현된 뮤린 PD-L1에 결합할 수 있었다. 대리 mAb2의 세포 발현된 뮤린 LAG-3로의 결합 친화도는 항-인간 LAG-3/PD-L1 mAb2의 인간 LAG-3로의 친화도 (2.5-4.2 nM 대비 2.3-3.8 nM)와 대략 동일하고, 대리 mAb2의 세포-발현된 뮤린 PD-L1로의 결합 친화도는 항-인간 LAG-3/PD-L1 mAb2의 인간 PD-L1로의 친화도 (3.1-4.0 nM 대비 11.9-12.3 nM)의 3배 이내이며, 이는 이러한 mAb2가 마우스에서 생체내 연구에 사용하기 위한 항-인간 LAG-3/PD-L1 mAb2에 대한 적절한 대리임을 입증한다.
실시예 3: T 세포 활성화 검정 및 SEB 검정에서 mAb 2 분자의 활성
3.1 T 세포 활성화 검정
mAb2의 기능적 스크리닝을 위하여 DO11.10 OVA T-림프구 및 LK35.2 B-림프구 하이브리도마 세포주에 기반한 IL-2 방출 검정 (release assay)을 사용하였다. IL-2 방출은 T 세포 활성화의 마커이다. 내인성 뮤린 PD-1을 발현하는 T 세포를 빈 벡터 (empty vector)(pLVX) 또는 인간 LAG-3 작제물로 형질감염시켰다. B-세포를 빈 벡터 (pLVX) 또는 인간 PD-L1 작제물로 형질감염시켰다.
이러한 4개 세포주의 3개 조합을 나란히 사용하여 mAb2에 의한 T 세포 활성화를 시험하였다:
● 항-PD-L1 활성을 위한 DO11.10 pLVX + LK35.2 hPD-L1;
● 항-LAG-3 활성을 위한 DO11.10 hLAG-3 + LK35.2 pLVX;
● 항-LAG-3/ 항-PD-L1 동시 활성을 위한 DO11.10 hLAG-3 + LK35.2 hPD-L1.
모든 mAb2 (모두 LALA 돌연변이 함유)를 이러한 T 세포 활성화 검정에 2회 시험하였다. 시노몰구스 표적 (cPD-L1 및 cLAG-3)을 과발현하는 세포를 사용하여 기능적 T 세포 활성화 검정에서 시노몰구스 LAG-3 및 PD-L1와의 상호 교차-반응성을 시험하였다.
LAG-3을 과-발현하는 T 세포주의 생성
렌티바이러스 형질도입 방법 (lentiviral transduction methodology)을 사용하여 Lenti-X HTX 패키징 시스템 (Cat. No 631249)를 이용한 인간, 시노몰구스 또는 마우스 LAG-3을 과발현하는 DO11.10 세포 (National Jewish Health)를 생성하였다. 마우스 LAG-3 cDNA (서열번호 127), 인간 LAG-3 cDNA (서열번호 126) 또는 시노몰구스 LAG-3 cDNA (서열번호 128)를 함유하는 Lenti-X 발현 벡터 (pLVX) (Cat. No 631253)를 Lenti-X HTX 패키징 믹스와 함께 Lenti-X 293T 세포주 (Cat. No 632180) 내로 공동-형질감염시켜 바이러스를 생성하였다. Lenti-X HTX 패키징 시스템으로 생성된 렌티바이러스 벡터를 사용하여 DO11.10 세포주를 형질도입하였다.
PD-L1을 과-발현하는 항원 제시 세포의 생성
렌티바이러스 형질도입 방법을 사용하여, Lenti-X HTX 패키징 시스템 (Cat. No 631249)을 이용한 인간, 시노몰구스 또는 마우스 PD-L1를 과발현하는 LK35.2 B 세포 림프종 (ATCC, HB-98)을 생성하였다. 마우스 PD-L1 cDNA (서열번호 130), 인간 PD-L1 cDNA (서열번호 129) 또는 시노몰구스 PD-L1 cDNA (서열번호 131)를 함유하는 렌티-X 발현 벡터 (pLVX) (Cat. No 631253)를 Lenti-X HTX 패키징 믹스와 함께 Lenti-X 293T 세포주 (Cat. No 632180)로 공동-형질감염시켜 바이러스를 생성하였다. Lenti-X HTX 패키징 시스템으로 생성된 렌티바이러스 벡터를 사용하여 LK35.2 세포주를 형질도입하였다.
배지 및 펩티드
세포 배양물 배지: DMEM (Gibco, 61965-026) 10% FBS (Gibco, 10270-106), 1 mM 소디움 피루베이트 (Gibco, 11360-070), 1 μg/ml 푸로마이신 (Gibco, A11138-03)
실험 배지: 푸로마이신 무함유 완전 DO11.10 배양 배지
OVA 펩티드 (MW = 1773.9 Da): H-ISQAVHAAHAEINEAGR-OH (Pepscan)
세포:
· DO11.10 hLAG-3: 인간 LAG-3를 과발현하기 위하여 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 DO11.10 T 세포 하이브리도마;
· DO11.10 pLVX: 빈 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 DO11.10 T 세포 하이브리도마;
· DO11.10 cLAG-3: 시노몰구스 LAG-3을 과발현하기 위하여 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 DO11.10 T 세포 하이브리도마;
· LK 35.2 hPD-L1: 인간 PD-L1을 과발현하기 위하여 hPD-L1를 함유하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 B 세포 하이브리도마;
LK 35.2 PLVX: 빈 렌티바이러스 (pLVX) 벡터로 형질도입된 B 세포 하이브리도마;
· LK 35.2 cPD-L1: 시노몰구스 PD-L1을 과발현하기 위하여 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 B 세포 하이브리도마.
0.3 x 106 세포/ml의 DO11.10 세포 (DO11.10 pLVX 세포 또는 DO11.10 hLAG-3 세포)를 3 x 최종 농도의 항체와 함께 1:1 비율로 혼합하였다. 항체 및 DO11.10 세포를 37 ℃, 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. LK 35.2 세포 (pLVX 및 PD-L1-pLVX 둘 모두)를 1.5 μM의 OVA 펩티드를 포함하는 3x105 세포/ml 실험 배지에서 30분 동안 인큐베이션하였다. LK 35.2 세포 + OVA를 하기 조합의 1:2 비율의 DO11.10 세포/처리 믹스에 첨가하였다:
인간 기능적 스크린
DO11.10 pLVX + LK35.2 hPD-L1,
DO11.10 hLAG-3 + LK35.2 pLVX,
DO11.10 hLAG-3 + LK35.2 hPD-L1;
시노몰구스 교차 반응성 스크린
DO11.10 pLVX + LK35.2 cPD-L1,
DO11.10 cLAG-3 + LK35.2 pLVX,
DO11.10 cLAG-3 + LK35.2 cPD-L1;
세포를 37 ℃, 5%CO2 에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 상청액을 수집하고, 제조사의 지침에 따라 마우스 IL-2 ELISA 키트 (eBioscience, 88-7024-88 or R&D systems, SM2000)를 사용하여 분석하였다. Gen5 Software, BioTek가 있는 플레이트 판독기를 사용하여 플레이트를 450 nm에서 판독하였다. 570 nm의 흡광도 값에서 450 nm의 흡광도 값 (보정)을 뺐다. 시토카인 농도의 계산을 위한 표준 곡선은 4개 파라미터 로지스틱 곡선 정합 (logistic curve fit)(Gen5 Software, BioTek)을 기반으로 하였다. mIL-2의 농도를 Fcab 또는 mAb의 로그 농도에 대해 플롯팅하고 GraphPad Prism에서 로그 (작동제) 대 반응 방적식을 사용하여 피팅하였다. 표 16은 대조군 (84G09 + 25F7)의 백분율로서 계산되는, mAb2 및 대조군 mAb의 EC50 값 및 최대 IL-2 방출을 나타낸다. 도 2A-F는 FS18-7-9/84G09, FS18-7-62/84G09, 또는 FS18-7-78/84G09으로 처리된 세포주, 및 대조군의 패널에 의한 IL-2 방출의 대표적인 플롯을 도시한다. 존재하는 2개 표적 (DO11.10 hLAG-3 + LK35.2 hPD-L1)을 이용한 T 세포 활성화 검정에서, LAG-3 및 PD-L1 모두가 억제되는 경우, 예를 들어, mAb2 또는 LAG-3 및 PD-L1 항체의 조합이 사용되는 경우에만, IL-2가 유도되었다. 따라서, mAb2는 단일 작용제 단독 이상의 이점을 갖는다. 단지 LAG-3 (DO11.10 hLAG-3 + LK35.2 pvlx) 또는 PD-L1 (DO11.10 pvlx + LK35.2 PD-L1)를 사용한 분석에서, mAb2는 이러한 표적의 억제에 있어서, 단일 작용제로서 유사한 활성을 나타내었으며, 이는 mAb2가 LAG-3, PD-L1 또는 LAG-3+PD-L1의 존재하에 T 세포 활성화를 유도할 수 있는 유일한 단일 분자라는 것을 입증한다.
9개 mAb2에 대한 EC50 및 최대 IL2 방출 (대조군 - 84G09+25F7과 비교한 IL2 방출의 백분율로 계산됨)
mAb2/대조군 mAb 평균 SD 평균 SD
　 EC50
　		 % ctrl (84G09+25F7)로 계산된
최대 IL-2 방출
FS18-7-09/84G09LALA 0.75 0.20 65.89 24.04
FS18-7-33/84G09LALA 0.82 0.35 63.95 36.56
FS18-7-78/84G09LALA 0.82 0.38 64.39 39.28
FS18-7-62/84G09LALA 0.65 0.02 58.97 18.13
FS18-7-65/84G09LALA 0.81 0.20 70.25 2.22
FS18-7-95/84G09LALA 1.10 - 79.77 -
FS18-7-32/84G09LALA 1.19 0.00 82.94 14.67
FS18-7-36/84G09LALA 1.05 0.32 71.56 8.83
FS18-7-58/84G09LALA 1.16 0.21 79.40 0.10
84G09LALA + 25F7 1.32 0.25 100.00 　
mAb2 (LALA 돌연변이를 함유하는 FS18-7-9/84G09) 중 하나를 DO11.1-/LK35.2 T 세포 활성화 검정에서 시노몰구스 기능성 교차 반응성에 대해 시험하였다. 도 3A-C는 3개 세포 기반 분석의 패널에서의 결과를 도시한다. FS18-7-9/84G09는 cLAG-3 + cPD-L1 및 cLAG-3 또는 cPD-L1 단독 모두의 존재하에 T 세포 활성화를 유도할 수 있었고, 이는 mAb2가 기능적으로 시노몰구스 교차-반응성이며, 따라서, 영장류 기반 안정성 시험에 사용하기에 적합하다는 것을 의미한다.
3.2 스타필로코칼 엔테로톡신 (Staphylococcal Enterotoxin) B 검정
3개의 mAb2 (모두 LALA 돌연변이 함유)를 인간-PBMC 기반 스타필로코칼 엔테로톡신 B 검정 (SEB 검정)에서 시험하였다. 스타필로코칼 엔테로톡신 B는 초항원 (superantigen)이며, 항원 제시 세포 (APC) 상의 MHC 부류 II 분자 및 T 세포 수용체 (TCR)의 vβ 쇄에 결합하며, T 세포의 비-특이적 활성화 및 시토카인 방출을 유발한다. T 세포 활성화를 확인하기 위하여 항원이 존재해야할 필요는 없다. SEB 검정은 생리학적 수준의 체크포인트 억제제를 갖는 자극된 인간 세포 (PBMC)를 사용하며, 인간 체계에서 mAb2에 의해 T 세포 활성화가 증진된다는 것을 확인하기 위하여 사용될 수 있다. 4개 상이한 공여체 (donor)로부터의 세포를 이용하여 SEB 시스템에서 3개 mAb2를 시험하였다.
증대된 (expanded) T 세포의 생성
피콜 구배 분리 (Ficoll gradient seperation)에 의하여 백혈구 원뿔 (leukocyte cone)로부터 PMBC를 단리하였다. 제조사의 지침에 따라 인간 CD4+ T 세포 단리 키트 (Miltenyi Biotec Ltd, 130-096-533)를 사용하여 CD4+ T 세포를 단리하였다. 인간 T-Activator CD3/CD28 Dynabeads (Life technologies, 11131D)를 볼텍싱하여 재현탁시켰다. 무균 15ml 튜브 및 10% FBS (Life Technologies, 10270106)를 포함하는 10ml RPMI (Life Technologies, 61870044)에 비드를 옮기고, 1x 페니실린 스트렙토마이신 (Life Technologies, 15140122)을 첨가하여 Dynabead를 세척하였다. 상청액을 버렸다. 3:1의 비드 대 세포 비율을 갖는, 필요량의, 10% FBS를 포함하는 RPMI 중 1.0 x106 세포/ml의 CD4+ T 세포 및 1x 페니실린 스트렙토마이신 용액 및 50 IU/ml 재조합 인간 IL2 (Peprotech, 200-02-50ug)를 T75 플라스크 (Greiner Bio-one, 690195)에 옮기고, 37 ℃ + 5% CO2에서 이를 인큐베이션하였다. 3일 후, 세포를 천천히 재현탁시키고 계수하였다. 필요에 따라 새로운 배지 (RPMI-10% FBS + 페니실린 스트렙토마이신 용액 1X + 50IU/ml rhuIL2)를 첨가함으로써 세포 밀도를 0.8-1 x 106 세포/ml로 유지시켰다. 7 또는 8일에 CD3/28 비드를 제거하고, CD4+ T 세포를 감소된 10IU/ml rhuIL2를 포함하는 1 x 106 세포/ml의 새로운 배지 RPMI-10% FBS + 페니실린 스트렙토마이신 용액 1X에서 밤새 휴지시켰다 (rested). 필요할 때까지 세포를 동결 저장하였다.
MoiDC의 생성
제조사의 지침에 따라 인간 범(Pan) 단핵구 단리 키트, (Miltenyi Biotec Ltd, 130-096-537)를 사용하여 인간 PBMC로부터 손대지 않은 (untouched) 단핵구를 단리하였다. 제조사의 지침에 따라 human Mo-DC Differentiation Medium (Miltenyi Biotec Ltd, 130-094-812)를 사용하여 단핵구를 iDC로 분화시켰다.
SEB 검정
증대된 T 세포를 실험 1일 전 해동시키고, AIM 배지 (Gibco, 12055-091)로 세척하고, 37 ℃, 5% CO2 에서 AIM 배지 중 1x106 세포/ml로 밤새 인큐베이션하였다. 2 μM 농도의 각각의 항체/혼합물을 DPBS (Gibco, 14190-169) 중에서 제조하고, 배지 (30 μl + 270 μl) 중에서 1:10로 희석하여 200 nM을 수득하였다. 96 웰 플레이트에서, 연속 분석을 1:10 (30 μl + 270 μl 실험 배지; 2x 최종 농도)로 수행하였다. MoiDCs를 해동시키고, AIM 배지로 세척하고, 동일한 공여체로부터의 T 세포를 1:10 비율로 (2x105 세포/ml의 iDC 5 ml를 2x106 세포/ml의 T 세포 5 ml와 배합하였음) 혼합하였다. 0.1 μg/ml의 SEB (Sigma, S4881) 20 μl를 10 ml의 세포에 첨가하였다. 둥근 바닥 96 웰 플레이트에서, 100 μl의 세포/SEB 혼합물을 100 μl의 항체 희석물에 첨가하여, 100, 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 nM의 최종 항체 농도로, 웰 당 200 μl의 AIM 배지 중 0.1 ng/ml SEB을 포함하는 105 T 세포에 대한 104 iDC 세포의 비율을 생성하였다. 세포를 37 ℃, 5% CO2 에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 상청액을 수집하고, 인간 IFNγ ELISA 키트 (R&D Systems, PDIF50)로 바로 분석하거나 또는 추가의 분석을 위하여 -20 ℃에서 동결시켰다. PBA (DPBS, 2% BSA (Sigma, A7906-100G))로 1:30 희석된 상청액을 사용하여, 키트 제조사의 지침에 따라 분석을 수행하였다. 인간 IFNγ의 농도 대 mAb2 또는 mAb의 로그 농도를 플로팅하고, GraphPad Prism software에서 로그 (작동제) 대 반응 방정식을 사용하여 생성된 곡선을 피팅하였다. 표 17은 4개 상이한 세포 공여체 (공여체 A 내지 D)로부터의 세포를 사용한 SEB 검정에서 EC50 값 및 IFNγ 방출의 범위를 나타낸다. 도 4는 단일 공여체를 사용한 SEB 검정의 대표적인 플롯을 도시한다. 모든 6개 분석에서, LAG-3/PD-L1 mAb2 및 LAG-3/FITC mAb2 + 84G09LALA의 조합은 84G09LALA mAb 단독인 것보다 더욱 큰 활성을 나타냈으나, LAG-3/FITC mAb2 또는 4420 mAb를 분석한 경우, 이들은 유의한 활성을 나타내지 않았다. 따라서, SEB 검정의 결과는 보다 생리학적인 체계에서 DO11.10/LK35.2 검정의 결과를 입증한다.
4개 상이한 세포 공여체를 사용한 6가지 SEB 검정에 기반한 6개 mAb2에 대해 계산된 EC50 값
검정 1 공여체 A
　 EC50
(nM)		 95% Conf. Int. SPAN 95% Conf. Int.
FS18-7-09/84G09LALA 0.1551 0.08521 내지 0.2824 12280 10802 내지 13758
FS18-7-62/84G09LALA 0.1424 0.08665 내지 0.2340 12120 10897 내지 13342
FS18-7-78/84G09LALA 0.2774 0.1220 내지 0.6310 14156 11970 내지 16341
84G09 LALA 0.1884 0.08960 내지 0.3962 10077 8612 내지 11542
FS18-7-09/4420LALA - - 1010 384.8 내지 1635
FS18-7-62/4420LALA - - 416.1 -443.1 내지 1275
FS18-7-78/4420LALA - - 411 -1103 내지 1925
84G09 LALA + FS18-7-09/4420LAL 0.2455 0.1030 내지 0.5850 11836 9888 내지 13785
84G09 LALA + FS18-7-62/4420LAL 0.1601 0.05399 내지 0.4750 11448 8958 내지 13937
84G09 LALA + FS18-7-78/4420LAL 0.1774 0.06863 내지 0.4587 12250 9955 내지 14544
4420 LALA - - 218.6 -35.91 내지 473.1
검정 1 공여체 B
　 EC50
(nM)		 95% Conf. Int. SPAN 95% Conf. Int.
FS18-7-09/84G09LALA 0.07316 0.02255 내지 0.2374 11825 8919 내지 14730
FS18-7-62/84G09LALA 0.03236 0.007146 내지 0.1465 12170 8419 내지 15921
FS18-7-78/84G09LALA 0.09718 0.03128 내지 0.3019 15198 11594 내지 18802
84G09 LALA 0.08562 0.03403 내지 0.2154 12343 9957 내지 14730
FS18-7-09/4420LALA - - 1337 -195.8 내지 2870
FS18-7-62/4420LALA - - 2508 -2118 내지 7133
FS18-7-78/4420LALA - - 1425 -58.52 내지 2908
84G09 LALA + FS18-7-09/4420LAL 0.2861 0.1005 내지 0.8143 16037 12890 내지 19184
84G09 LALA + FS18-7-62/4420LAL 0.1431 0.02857 내지 0.7172 13907 9358 내지 18455
84G09 LALA + FS18-7-78/4420LAL 0.3775 0.08929 내지 1.596 14418 10502 내지 18334
4420 LALA - - 2293 1028 내지 3558
검정 2 공여체 A
　 EC50
(nM)		 95% Conf. Int. SPAN 95% Conf. Int.
FS18-7-09/84G09LALA 0.2761 0.1654 내지 0.4611 20727 18729 내지 22724
FS18-7-33/84G09LALA 0.1934 0.07990 내지 0.4681 171 03 14156 내지 20049
FS18-7-78/84G09LALA 0.2384 0.1596 내지 0.3560 19822 18311 내지 21333
84G09 LALA 0.3788 0.1166 내지 1.230 11745 9138 내지 14352
FS18-7-09/4420LALA - - 1991 -1927 내지 5909
FS18-7-33/4420LALA - - ~ 1.053e+006 (매우 광범위)
FS18-7-78/4420LALA - - ~ 72657 (매우 광범위)
84G09 LALA + FS18-7-09/4420LALA 0.5202 0.2624 내지 1.031 23346 20230 내지 26462
84G09 LALA + FS18-7-33/4420LALA 0.2881 0.1529 내지 0.5428 22529 19853 내지 25205
84G09 LALA + FS18-7-78/4420LALA 0.4335 0.2089 내지 0.8996 20955 18038 내지 23873
검정 2 공여체 B
　 EC50
(nM)		 95% Conf. Int. SPAN 95% Conf. Int.
FS18-7-09/84G09LALA 0.139 0.04157 내지 0.4646 21572 16269 내지 26874
FS18-7-33/84G09LALA 0.07278 0.01615 내지 0.3280 19554 13408 내지 25699
FS18-7-78/84G09LALA 0.1356 0.03552 내지 0.5178 22319 16212 내지 28426
84G09 LALA 0.1959 0.03365 내지 1.140 12077 7938 내지 16216
FS18-7-09/4420LALA - - 1272 -963.4 내지 3507
FS18-7-33/4420LALA - - 2272 -190.8 내지 4735
FS18-7-78/4420LALA - - 1960 -1287 내지 5207
84G09 LALA + FS18-7-09/4420LALA 0.2889 0.07772 내지 1.074 23661 17835 내지 29488
84G09 LALA + FS18-7-33/4420LALA 0.3 0.06936 내지 1.298 26145 18971 내지 33320
84G09 LALA + FS18-7-78/4420LALA 0.271 0.03980 내지 1.845 25489 16292 내지 34686
검정 1 공여체 C
EC50
(nM)		 95% Conf. Int. SPAN 95% Conf. Int.
FS18-7-09/84G09LALA 0.06739 0.01933 내지 0.2349 2987 15107 내지 27710
84G09 LALA 0.08347 0.0331 내지 0.2105 1509 11046 내지 17414
84G09 LALA + FS18-7-09/4420LALA 0.1618 0.06635 내지 0.3944 1744 13346 내지 20704
검정 1 공여체 D
　 EC50
(nM)		 95% Conf. Int. SPAN 95% Conf. Int.
FS18-7-09/84G09LALA 0.04373 0.01797 내지 0.1064 1850 15995 내지 23799
84G09 LALA 0.07043 0.03483 내지 0.1424 1045 10996 내지 15405
84G09 LALA + FS18-7-09/4420LALA 0.1351 0.08359 내지0.2182 968 15318 내지 19403
실시예 4: 뮤린 종양 모델에서 mAb 2 분자의 생체내 활성
4.1 MC38 비-확립된 종양 모델에서 mAb 2 분자의 활성
MC38 종양은 이들의 세포 표면상에 PD-L1을 발현하며, 종양 및 종양 주변 (tumour periphery)에서 면역 세포 상에 증가된 LAG-3 발현을 유도하여 매우 면역원성인 것으로 공지되기 때문에, 이러한 실험에 MC38 동계 종양 모델을 사용하였다.
FS18-29/S1로 지칭되는, LALA 돌연변이를 함유하는 대리 마우스 mAb2 FS18-7-108-29/S1 (서열번호 117 및 119)를 MC38 동계 마우스 종양 성장 모델을 사용하여 생체내 활성에 대해 시험하였다. 종양 성장을 억제하기 위한 mAb2의 능력을, LAG-3/모의 mAb2, FS18-29/4420로 지칭되는, LALA 돌연변이를 함유하는 FS18-7-108-29/4420 (서열번호 132 및 85), 기준 항-LAG-3 mAb C9B7W (2B scientific; Catalogue Number BE0174-50MG), LALA 돌연변이를 함유하는 기준 항-PD-L1 mAb S1 (서열번호 122 및 119), 및 mAb C9B7W 및 S1의 조합의 능력과 비교하였다.
8-10 주령 및 20-25 g 무게의 C57BL/6 암컷 마우스 (Charles River)를 연구 시작 1주 전 동안 쉬게하였다. 모든 동물을 마이크로-칩화 (micro-chipped)하고, 고유한 식별자 (identifier)를 부여하였다. 각각의 코호트는 10마리 마우스를 가졌다. MC38 결장 암종 (colon carcinoma) 세포주 (S. Rosenberg, NIH)를 초기에 증대시키고, 저장하고, 이어서 IMPACT I 프로토콜을 사용하여 병원체에 대해 IDEXX Bioresearch로 사전-스크리닝하였고 (pre-screened), 병원체가 없는 것으로 나타났다. MC38 세포를 -150 ℃ 저장으로부터 해동시키고, T175 조직 배양물 플라스크 중 10% FCS (Gibco, 10270-106)를 포함하는 20 ml DMEM (Gibco, 61965-026)에 첨가하였다. 이소플루란 (Abbott Laboratories)을 사용하여 마우스를 마취시키고, 각 동물의 좌측 옆구리에 피하로 2x106 세포를 주사하였다. 종양 세포 접종 7-8일 후, 이러한 시험에 종양을 갖지 않는 마우스를 연구에서 제거하였다.
모든 mAb2 분자 및 대조군 항체를 SEC-HPLC 프로파일링에 의한 주사 24시간 전 이내에 분석하고, 불순물을 체크하였다. PBS 중 10 mg/kg의 최종 농도로 항체를 제조하고, 조합 연구에서 2차 항체와 조합하였다. 종양 접종 후 8, 11 및 14 일에 복강내 (IP) 주사로 마우스에게 mAb2 분자 및 대조군 항체를 투여하였다. 종양을 정확히 측정하고, 알고자 하는 (in question) 만기일에 임의의 약물 투약 (drug dosing)을 수행하고, 나머지 시험 동안 마우스를 면밀히 관찰하였다. 캘리퍼로 종양 부피 측정을 수행하여 종양의 가장 긴 축 (axis)과 가장 짧은 축을 측정하였다. 하기의 수학식을 사용하여 종양 부피를 계산하였다:
L x (S2) / 2
상기 식에서,
L = 가장 긴 축; S = 가장 짧은 축이다.
종양 부하가 제한에 가까운 것으로 고려되는 20일에 시험을 중단하였다. 모든 마우스를 인도적으로 희생시키고, 종양을 절제하고, 측량하였다.
결과는 도 5 및 6에 도시된다. LAG-3/PD-L1 mAb2 (FS18-29/S1) 처리된 마우스는, 기준 mAb, C9B7W 및 S1의 조합으로 처리된 마우스 보다 유의하게 더 적은 무게의 최종 종양을 가졌다. 구체적으로, GraphPad Prism 소프트웨어 패키지에서 양방적 스튜던트 t-시험 (two tailed Student's t-test)을 사용하여 최종 종양의 통계학적 분석을 수행하여, FS18-29/S1의 투여, 및 기준 항체 C9B7W 및 S1의 조합의 투여 사이의 통계학적으로 유의한 차이를 입증하였으며 (p = 0.0125), 이는 동일한 분자에 의해 제공된 LAG-3 및 PD-L1 억제가, 개별 분자에 의해 제공된 LAG-3 및 PD-L1 억제와 비교하여, 최종 종양 무게에 대한 상승적인 효과를 초래한다는 것을 의미한다.
또한, 대리 mAb2 FS18-29/S1는 8개 성장 MC38 종양 중 6개에서 확립 (establishment)을 예방하고 나머지 2개의 성장을 늦추는, 종양 성장에 대한 현저한 효과를 갖는다. 기준 항-LAG-3 및 PD-L1 항체의 조합의 투여는 7마리 동물에서 종양 성장을 늦췄으며, 종양이 없는 동물은 없었다.
FS18-29/4420 단독은 종양 성장에 현저한 효과를 가지지 않았고, 이는 최대 효능에 대해서, mAb2가 항-PD-L1 Fab를 필요로 한다는 것을 의미한다. 기준 항-마우스 LAG-3 항체 단독은 생성된 종양 성장에 대해 미미한 효과를 갖거나 효과를 미치지 않았으나, 기준 항-마우스 PD-L1은 이러한 코호트에서 7개 종양 중 1개의 확립을 방지하였으며, 종양 성장을 늦추는 일부 전반적인 효과를 가졌다.
치료 표적을 억제하는 항-종양 효과를 시험하기 위한 적절한 뮤린 모델로서 동계 마우스 모델을 채택하고, 이를 인간 치료제의 개발을 광범위하게 검증하는데 사용하였다.
4.2 MC38 확립된 종양 모델에서 mAb2 분자의 활성
FS18-29/S1로 지칭되는, LALA 돌연변이를 함유하는 대리 마우스 mAb2 FS18-7-108-29/S1 (서열번호 117 및 119)를 MC38 동계 마우스 종양 성장 모델에서의 생체내 활성에 대해 시험하였다. 종양 성장을 억제하는 mAb2의 능력을, LAG-3/모의 mAb2, FS18-29/4420로 지칭되는 LALA 돌연변이를 함유하는 FS18-7-108-29/4420 (서열번호 132 및 85), 기준 LAG-3 mAb C9B7W, LALA 돌연변이를 함유하는 기준 PD-L1 mAb S1 (서열번호 122 및 119), 및 C9B7W 및 S1의 조합의 능력과 비교하였다.
8-10 주령 및 20-25 g 무게의 C57BL/6 암컷 마우스 (Charles River)를 연구 시작 1주 전 동안 쉬게하였다. 모든 동물을 마이크로-칩화하고, 고유한 식별자를 부여하였다. 각각의 코호트는 10마리 마우스를 가졌다. MC38 결장 암종 세포주 (S. Rosenberg, NIH)를 초기에 증대시키고, 저장하고, 이어서 IMPACT I 프로토콜을 사용하여 병원체에 대해 IDEXX Bioresearch로 사전-스크리닝하여, 병원체가 없는 것으로 밝혀졌다. MC38 세포 (약 3-5x106)를 -150 ℃ 저장으로부터 해동시키고, T175 조직 배양물 플라스크 중 10% FCS (Gibco, 10270-106)를 포함하는 20 ml DMEM (Gibco, 61965-026)에 첨가하였다. 이소플루란 (Abbot Laboratories)을 사용하여 마우스를 마취시키고, 각 동물의 좌측 옆구리에 피하로 2x106 세포 100 μl을 주사하였다. 종양 세포 접종 7-8일 후, 마우스를 연구 초기에 적합하게 건강 및 종양 성장에 대해 정기적으로 모니터링하였다. 대다수의 마우스가 5-10 mm 직경의 종양을 나타내는 경우, 이들을 분류하고, 연구 코호트로 다시 무작위화하였다. 이러한 시점에 적절한 크기의 종양을 갖지 않는 임의의 마우스를 연구에서 제거하였다.
모든 mAb2 분자 및 대조군 항체를 SEC-HPLC 프로파일링에 의한 주사 24시간 전 이내에 분석하고, 불순물을 체크하였다. PBS 중 10 mg/kg의 최종 농도로 항체를 제조하고, 조합 연구에서 2차 항체와 조합하였다. 종양 접종 후 15, 18 및 21 일에 IP 주사로 마우스에게 mAb2 분자 및 대조군 항체를 투여하였다. 동물을 마취하에 맹검 방식 (blinded fashion)으로 1주 3회 건강 스크리닝하였고, 이 동안 종양을 정확히 측정하였다. 캘리퍼로 종양 부피 측정을 수행하여 종양의 가장 긴 축과 가장 짧은 축을 측정하였다. 상기 섹션 4.1에 설정된 바와 같이, 수학식을 사용하여 종양 부피를 계산하였다.
종양 부하가 제한에 가까운 것으로 고려되는 24일에 시험을 중단하였다. 모든 마우스를 인도적으로 희생시키고, 종양을 절제하고, 측량하였다. 결과는 도 7 및 8에 도시된다.
마우스의 동계 종양 모델에서의 종양 성장의 효과적인 조절 또는 억제는 초기 시점 (40mm3 미만의 종양 부피로 시작)에 치료적 개입 (therapeutic intervention)을 통해 가장 잘 달성된다. 인간 임상 설정에서의 상황과 더욱 유사할지라도, 개입이 더 늦게 시행될수록, 종양 성장에 대해 양성 효과를 관잘하는 것이 더욱 어렵다.
FS18-29/S1은, 이른 시점에 C57BL/6 마우스에게 주어지는 경우, 면역 적격 (immune competent) 마우스에서 종양 성장의 억제 및 MC38 결장 암종의 확립 예방 모두에 있어서 양성 효과를 가졌다. 더 늦은 시점 (50-125mm3의 종양 부피로 시작)에 투여한 경우, FS18-29/S1은 단지 기준 항체의 조합으로 종양 성장을 억제하는데 있어서 효과적이었다. FS18-29/4420 단독으로는 종양 성장에 주목할만한 영향을 갖지 않았고, S1 및 C9B7W 모두는 생성된 종양 성장에 미미한 영향을 가졌다.
4.3 CT26 비-확립된 종양 모델에서 mAb 2 분자의 활성
CT26 종양은 이들의 세포 표면상에 PD-L1을 발현하며, 매우 면역원성으로 종양 및 종양 주변에서 면역 세포 상에 증가된 LAG-3 발현을 유도하는 것으로 공지되기 때문에, 이러한 실험에 동계 CT26 종양 모델을 사용하였다.
FS18-29/S1로 지칭되는, LALA 돌연변이를 함유하는 대리 마우스 mAb2 FS18-7-108-29/S1 (서열번호 117 및 119), 및 FS18-35/S1로 지칭되는, LALA 돌연변이를 함유하는 FS18-7-108-35/S1 (서열번호 120 및 119)를 CT26 동계 마우스 종양 성장 모델에서 생체내 활성에 대하여 시험하였다. 종양 성장을 억제하기 위한 mAb2의 능력을, LAG-3/모의 mAb2, FS18-29/4420로 지칭되는, LALA 돌연변이를 함유하는 FS18-7-108-29/4420 (서열번호 132 및 85) 및, FS18-35/4420로 지칭되는, LALA 돌연변이를 함유하는 FS18-7-108-35/4420 (서열번호 133 및 85), 기준 LAG-3 mAb C9B7W, LALA 돌연변이를 함유하는 기준 PD-L1 mAb S1 (서열번호 122 및 119), 및 C9B7W 및 S1의 조합의 능력과 비교하였다.
8-10 주령 및 20-25 g 무게의 BALB/c 암컷 마우스 (Charles River)를 연구 시작 1주 전 동안 쉬게하였다. 모든 동물을 마이크로-칩화하고, 고유한 식별자를 부여하였다. 각각의 코호트는 10마리 마우스를 가졌다. CT26 결장 암종 세포주 (ATCC, CRL-2638)를 초기에 증대시키고, 저장하고, 이어서 IMPACT I 프로토콜을 사용하여 병원체에 대해 IDEXX Bioresearch로 사전-스크리닝하여, 병원체가 없는 것으로 밝혀졌다. T26 세포 (약 3-5x106)를 -150 ℃ 저장으로부터 해동시키고, T175 조직 배양물 플라스크 중 10% FCS (Gibco, 10270-106)를 포함하는 20 ml DMEM (Gibco, 61965-026)에 첨가하였다. 종양 세포 접종 7-8일 후, 마우스를 연구 초기에 적합하게 건강 및 종양 성장에 대해 정기적으로 모니터링하였다. 대다수의 마우스가 3-5 mm3 직경의 종양을 나타내는 경우, 이들을 분류하고, 연구 코호트로 다시 무작위화하였다. 이러한 시험에 적절한 크기의 종양을 갖지 않는 임의의 마우스를 연구에서 제거하였다.
모든 mAb2 분자 및 대조군 항체를 SEC-HPLC 프로파일링에 의한 주사 24시간 전 이내에 분석하고, 불순물을 체크하였다. PBS 중 10 mg/kg의 최종 농도로 항체를 제조하고, 조합 연구에서 2차 항체와 조합하였다. 종양 접종 후 8, 11 및 14 일에 마우스에게 mAb2 분자 및 대조군 항체를 투여하였다. 동물을 건강 스크리닝하였고, 이 동안 종양을 정확히 측정하였다. 캘리퍼로 종양 부피 측정을 수행하여 종양의 가장 긴 축과 가장 짧은 축을 측정하였다. 상기 섹션 4.1에 설정된 바와 같이, 수학식을 사용하여 종양 부피를 계산하였다.
종양 부하가 제한에 가까운 것으로 고려되는 20일에 시험을 중단하였다. 모든 마우스를 인도적으로 희생시키고, 종양을 절제하고, 측량하였다. 결과는 도 9 및 10에 도시된다.
GraphPad Prism 소프트웨어 패키지에서 양방적 스튜던트 t-시험을 사용하여 최종 종양 무게의 통계학적 분석을 수행하였다. Statistical Computing의 R Project에서 제공하는 통계학적 모델링 패키지 (Statistical Modeling package), statmod (Elso et al., 2004 and Baldwin et al., 2007)로부터의 비교 성장 곡선 함수를 사용하여 종양 성장 곡선의 통계학적 분석을 결정하였다.
종양 성장 억제에 있어서 FS18-35/S1 mAb2 및 IgG 대조군 (정상 성장) 간의 통계학적으로 유의한 차이가 입증되었다. 기준항체의 조합, 또는 FS18-29/S1 mAb2 대 IgG 대조군 그룹, 또는 이러한 시험에서 임의의 다른 코호트를 사용하여, 이러한 통계학적으로 유의한 차이를 관찰하였다.
CT26 종양 모델은, 마우스에 대해 본질적으로 장내 전이를 발병하는 경향이 있는, 공격적인 빠르게 성장하는 종양 모델이며, 결과적으로 매우 제한된 치료 창 (therapeutic window)을 갖는다.
놀랍게도, 기준 LAG-3 및 PD-L1의 조합은, IgG 대조군 코호트와 비교하여, 종양 성장을 유의적으로 억제하지 않았다. 그러나, FS18-35/S1 처리된 코호트는, IgG 대조군과 비교하여, 유의한 성장 억제를 나타냈다. FS18-29/S1은, 마찬가지로 IgG 대조군과 비교하여, 종양 성장 억제를 나타냈으나, 이는 통계학적으로 유의한 것이 아니었다. 이러한 시험은, 마우스 반응성 LAG-3/PD-L1 mAb2인 제2 종양 모델이, 기준 단클론 항체의 조합의 투여와 적어도 동일한 정도로 종양 성장을 늦추는 양성 효과를 입증한다는 것을 밝힌다.
4.4 MC38 비-확립된 종양 모델에서 종양 성장 억제에 관한 LALA 돌연변이의 효과
2개 mAb2 (FS18-7-108-29/S1 LALA 및 FS18-7-108-29/S1)을 시험하여 Fc 영역 내 LALA 돌연변이를 포함 및 포함하지 않는 이러한 mAb2의 항-종양 활성의 잠재적인 차이점을 조사하였다. LALA 돌연변이를 포함하는 FS18-29/S1로 지칭되는 대리 마우스 mAb2 FS18-7-108-29/S1 (서열번호 117 및 119), 및 LALA 돌연변이를 포함하지 않는 대리 마우스 mAb2 FS18-7-108-29/S1 (서열번호 118 및 119)를 MC38 동계 마우스 종양 성장 모델을 사용하여 생체내 활성에 대해 시험하였다. 종양 성장을 억제하는 mAb2의 능력을, LAG-3/모의 mAb2, LALA 돌연변이를 포함하는 FS18-7-108-29/4420 (서열번호 132 및 85), 및 FS18-29/4420 및 FS18-29/4420LALA로 지칭되는, LALA 돌연변이를 포함하지 않는 FS18-7-108-29/4420 (서열번호 134 및 85), 및 LALA 돌연변이를 포함하는 및 포함하지 않는 LAG-3/모의 mAb2과 LALA 돌연변이를 포함하는 기준 PD-L1 mAb S1 (서열번호 122 및 119) 및 LALA 돌연변이를 포함하지 않는 기준 PD-L1 mAb S1 (서열번호 123 및 119)의 조합의 능력을 비교하였다.
8-10 주령 및 20-25 g 무게의 C57BL/6 암컷 마우스 (Charles River)를 연구 시작 1주 전 동안 쉬게하였다. 모든 동물을 마이크로-칩화하고, 고유한 식별자를 부여하였다. 각각의 코호트는 10마리 마우스를 가졌다. MC38 결장 암종 세포주 (S. Rosenberg, NIH)를 초기에 증대시키고, 저장하고, 이어서 IMPACT I 프로토콜을 사용하여 병원체에 대해 IDEXX Bioresearch로 사전-스크리닝하였고, 병원체가 없는 것으로 나타났다. MC38 세포 (약 3-5x106)를 -150 ℃ 저장으로부터 해동시키고, T175 조직 배양물 플라스크 중 10% FCS (Gibco, 10270-106)를 포함하는 20 ml DMEM (Gibco, 61965-026)에 첨가하였다. 이소플루란 (Abbot Laboratories)을 사용하여 마우스를 마취시키고, 각 동물의 좌측 옆구리에 피하로 2x106 세포 100 μl을 주사하였다. 마우스를 관찰하에 회복시키고, 접종일을 0일로 기록하였다. 종양 세포 접종 7-8일 후, 마우스를 연구 초기에 적합하게 건강 및 종양 성장에 대해 정기적으로 모니터링하였다. 이러한 시험에 적절한 크기의 종양을 갖지 않는 임의의 마우스를 연구에서 제거하였다.
모든 mAb2 분자 및 대조군 항체를 SEC-HPLC 프로파일링에 의한 주사 24시간 전 이내에 분석하고, 불순물을 체크하였다. PBS 중 10 mg/kg의 최종 농도로 항체를 제조하고, 조합 연구에서 2차 항체와 조합하였다. 종양 접종 후 8, 11 및 14 일에 IP 주사로 마우스에게 mAb2 분자 및 대조군 항체를 투여하였다. 동물을 마취하에 맹검 방식으로 1주 3회 건강 스크리닝하였고, 이 동안 종양을 정확히 측정하였다. 캘리퍼로 종양 부피 측정을 수행하여 종양의 가장 긴 축과 가장 짧은 축을 측정하였다. 상기 섹션 4.1에 설정된 바와 같이, 수학식을 사용하여 종양 부피를 계산하였다.
모든 마우스를 인도적으로 희생시키고, 종양을 절제하고, 측량하였다. 결과는 도 11 및 12에 도시된다.
이러한 시험은, ADCC 활성을 폐기시키는 LALA 돌연변이의 존재 또는 부재가 MC38 결장 암종 모델에서 종양 성장에 관한 통계학적으로 유의한 효과를 갖지 않으나, LALA 돌연변이가 포함된 이들의 mAb2는 증가된 종양 성장 억제를 초래하는 경향이 있다는 것을 확인한다. 그럼에도 불구하고, LAG-3 또는 PD-L1를 발현하는 T 세포에 대한 ADCC 활성을 잠재적으로 억제하기 위하여 돌연변이를 포함하는 근거는, LALA 돌연변이가 LAG-3/PD-L1 mAb2의 항-종양 활성에 대한 유해한 효과를 갖지 않기 때문에 정당화된다. LALA 돌연변이의 포함은 단지 PD-L1 항체에 대해서만 결정적이라는 것을 시사하는 일부 증거가 존재하였다.
또한, 이러한 시험은 LAG-3/PD-L1 mAb2가 개별적인 항체 (LAG-3 LALA + PD-L1 LALA)의 투여보다 증가된 효능을 가질 수 있는 지의 여부를 조사하였다. 이러한 경우, 이러한 2개 코호트 간에 유의한 차이는 존재하지 않았다. 2개 모두 그룹은 MC38 결장 암종 모델에서의 성장을 억제했다.
4.5 결론
말하자면, 상기의 결과로부터, LAG-3 및 PD-L1 모두에 대한 결합 부위를 포함하는 mAb2 분자가 시험된 마우스 모델에서 마우스로 투여되는 경우, 종양 성장 억제에 관한 상승적인 효과가 존재한다는 것이 명백하다. 이러한 결과를 바탕으로, 본 발명의 항체 분자는 인간 환자의 암 치료, 특히 종양 성장 억제에 있어서, LAG-3 및 PD-L1에 각각 결합하는 2개 개별적인 분자의 투여보다 더욱 우수한 효과를 나타낼 것이라고 예상된다.
실시예 5: T 세포 LAG-3 발현에 대한 mAb2 처리의 효과
FS18-29/S1로 지칭되는, LALA 돌연변이를 함유하는 대리 마우스 FS18-7-108-29/S1 (서열번호 117 및 119)이 종양 부하를 감소시키는 메커니즘을 오브알부민 (ovalbumin)을 발현하는 MC38 동계 마우스 종양 성장 모델 (MC38.OVA)에서 시험하였다. FS18-29/S1의 효과를, FS18-29/4420로 지칭되는, LALA 돌연변이를 함유하는 LAG-3/모의 mAb2, FS18-7-108-29/4420, LALA 돌연변이를 함유하는 기준 PD-L1 mAb S1 (서열번호 122 및 119), 및 FS18-29/4420 및 S1의 조합의 효과와 비교하였다.
이식 당일에, 배양된 MC38.OVA 세포를 지수기 성장 동안에 수확하였고 (융합성 ~75%) 1×107 세포/mL의 농도로 PBS에 재현탁하였다. 각 동물을 먼저 이소플루란으로 마취시킨 후 종양을 개시시킨 후 각 시험 동물의 좌측 옆구리 내로 1×106 MC38.OVA 세포 (0.1 mL 현탁액)를 이식함으로써 종양을 개시시켰다. 종양 세포 이식 7일 후 동물을 결정론적 무작위화 방법을 이용하여 32 내지 62.5 mm3의 개별 종양 부피을 갖는 5개 그룹으로 무작위화하였다. 종양 접종 12, 14, 및 16일째에 10 mg/kg 항체 또는 mAb2를 동물에 투약하고, 종양 접종 19일 및 23일째에 그룹당 3마리로부터 종양을 수집하였다. GentleMACSTM 해리기 (Dissociator)를 사용하여 70 μm 세포 스트레이너 (strainer)를 통해 연속적으로 체에 걸러서 세포 함유 종양을 해리시켜 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 96-웰 플레이트에 1×106 세포/웰을 1:3000 생존능 염색 및 Fc 블록 (항-CD16/32 항체) 함유 FACS 완충제 중에 재현탁하였다. FACS 분석용 세포를 CD43, CD8a, CD4, FoxP3, 및 LAG-3에 대한 표지된 항체를 포함하는 Master Mix를 사용하여 염색하였다. FoxP3의 경우 세포내 염색 세포를 고정시키고 FoxP3 항체로의 염색 전에 투과화시켰다. 시료를 보정 매트릭스 및 최소 500,000건의 사례로 계산된 Canto II 유세포 분석기 상에서 분석하였다.
이 실험에서, 항체/mAb2의 3차 용량이 투여된 후 LAG-3 발현에 대해 TIL를 시험하였고, 이때 대조군과 mAb2 처리 사이에 종양 성장의 분리가 관찰되지만, 그 전에는 결과가 왜곡될 수 있는 종양 크기간의 큰 차이가 존재한다. 이 시점에서, TIL 상의 LAG-3 발현은 mAb2 FS18-29/S1 또는 FS18-29/4420 및 S1의 조합으로 처리된 동물에서 현저히 감소하는 것으로 확인되었다. 구체적으로, 도 13에 나타난 바와 같이, CD8, CD4 및 FoxP3 종양 침윤 림프구 (TIL)에서의 LAG-3 발현은 종양 접종 후 19 및 23일에 FS18-29/4420 및 S1 byFS18-29/S1의 조합을 사용한 처리 후 감소하였으며, 이는 각각 마지막 항체/mAb2 투여 후 3 및 7일에 상응한다. LAG-3 발현의 감소는 23일에 보다 더욱 두드러졌으나, 19일에 여전히 분명했다. FS18-29/4420 및 S1의 조합이 주어진 동물은 TIL상에서의 LAG-3 발현에 대해 감소를 나타냈으나 효과는 23까지 지속되었고, 반면 개별적으로 투여된 FS18-29/4420 또는 S1을 사용한 처리는 TIL상에서의 LAG-3 발현에 거의 영향을 미치지 않았다.
상기 결과는, 이러한 현상이 LAG-3 또는 PD-L1에 대한 단일 제제로 처리된 동물에서는 나타나지 않았기 때문에, LAG-3 및 PD-L1의 이중 억제가 TIL에 의한 LAG-3 발현의 감소에 필요함을 나타낸다. 이론에 구애됨이 없이, 이중 항-LAG-3 및 항-PD-L1 처리는 TIL에서의 LAG-3 발현 감소를 초래하고, 그로써 LAG-3의 억제 효과를 감소시키고 TIL이 고갈을 극복하게 하는 것으로 생각된다. 일단 TIL이 활성화되면, 이들은 종양에 의해 발현되는 신-항원 (neo-antigen)을 인식하고 이에 대한 반응을 유발할 수 있다. 따라서, 이는, 항-LAG3/PD-L1 mAb2로의 처리가 종양 부담의 감소를 초래하는 처리에 의한 메커니즘으로 생각된다.
실시예 6: mAb 2 의 항체 의존적 세포독성 및 보체 의존적 세포독성
IgG1 항체는 일반적으로 분자의 불변 영역 내의 보존된 상호작용 부위를 통하여 효과기 기능을 나타낸다. 이는, 단핵구/대식세포, 수지상 세포, NK 세포, 호중구 및 다른 과립구 상에 발현된 FcγR로의 결합으로 매개되는, 항체 의존적 세포독성 (ADCC), 및 C1q 보체 성분에의 결합으로 개시되는 보체 캐스캐이드 (complements cascade)의 유도로 매개되는, 보체 의존적 세포독성을 포함한다. LAG-3은 활성화된 T 세포 상에 우세하게 발현되고, PD-L1은 이들 상에 발현되나, 종양 세포에 더 높은 수준으로 발현되기 때문에, ADCC 및 CDC를 유도하는 mAb2 FS18-7-9/84G09 (서열번호 94 및 116)의 능력을 조사하였다.
구체적으로, LAG-3 또는 PD-L1 발현 세포의 FS18-7-9/84G09 처리에 이어서, NK 세포 또는 보체와의 인큐베이션이 각각의 표적 세포의 용해를 유도하는 지의 여부를 시험하였다. 또한, FS18-7-9/84G09가 이중특이적 항체이기 때문에, 특이성 중 하나에 대한 표적 계합이 다른 특이성에 대한 표적을 발현하는 세포에 대한 효과기 기능에 영향을 끼치는지의 여부에 대해서도 시험하였다.
mAb2 FS18-7-9/84G09의 효과기 기능에 관한 이해는, LALA 돌연변이와 같은 효과기 기능을 감소시키는 돌연변이가 FS18-7-9/84G09-매개된 ADCC 및/또는 CDC로부터의 종양 사멸에 관련된 효과기 T 세포를 발현하는 LAG-3을 보호하기 위한 분자에 포함되어야 하는지를 결정하는 것을 비롯한, 다양한 이유에 있어서 유용하다.
6.1 연구 설계
표적 단백질의 재조합 발현과는 무관하게, 첨가된 보체 및 NK 세포의 기능적 활성을 입증하기 위하여, 제네릭 버전 (generic version)의 리툭시맙 (Rituximab)과 함께 표적화하기 위한 대조군으로 CD20의 이들의 내인성 발현을 이용하여, LAG-3 또는 PD-L1을 재조합적으로 발현하는 라지 세포 (Raji cell)를 모든 분석에 사용하였다. 이러한 실험 전 표적 발현을 확인하였다.
LAG-3 또는 PD-L1 발현 세포에 대한 기본적인(basic) CDC 활성을 측정하기 위하여, 기질의 형광 염료 (CytoTox-ONE™ by Promega)로의 전환으로 측정되는, LDH 방출을 사용하여 이러한 활성을 측정하였다. 용해된 LAG-3 발현 세포 및 PD-L1 발현 세포 모두를 포함하는 세포 혼합물 중 어떠한 표적 세포가 용해되었는 지를 측정하기 위하여, mAb2/항체와의 인큐베이션 후 차별적으로 형광 표지된 표적의 유세포 분석으로 차별적 CDC를 측정하였으며, 생 세포 (live cell)로부터 제외된 형광 염료를 사용하여 사멸한 세포를 검출하였다.
LAG-3 또는 PD-L1 발현 세포에 대한 ADCC 활성을 측정하기 위하여, 동결된 PBMC로부터 단리된 NK 세포 및 비색계 (CytoTox 96 by Promega)로 측정된 LDH 방출을 사용하여 이러한 활성을 측정하였다. 모든 이러한 연구를 위하여, 다양한 이소형의 리툭시맙 및 Fc 구성을 대조군으로 사용하였다. 차별적으로 ADCC를 측정하기 위한 신뢰할 만한 방법은 알려지지 않으므로, 차별 ADCC 활성은 측정하지 않았다.
모든 실험에서, 대조군으로 PD-L1 특이적 mAb (84G09) 및 LAG-3 특이적 mAb (25F7)를 사용하였다. 음성 대조군으로 사용하거나 CDC 백그라운드 활성을 생성하기 위하여 사용된 IgG 이소형 대조군 (4420)을 또한 사용하였다. LALA 버전의 각각의 항체 및 mAb2 (25F7 제외)를 또한 CDC 및 ADCC 검정에서 IgG1 야생형 버전과 비교하여 이러한 효과기 기능에 대한 이러한 돌연변이의 효과를 측정하였다.
6.2 재료 및 방법
6.2.1 CDC 검정
리툭시맙을 비롯한 모든 항체/mAb2를 2중 1 연속 희석으로 10 포인트로 희석하였다. 가장 높은 농도의 IgG (4420 LALA)를 함유하는 대조군 웰을 또한 제조하였다. LDH 방출 검정을 위하여 무혈청 배지 (serum free medium)에서 LAG-3 또는 PD-L1을 각각 재조합적으로 발현하는 라지 세포의 세포 현탁액을 제조하고, 동일한 부피의 제조된 항체/mAb2를 첨가했다.
유세포 분석 기반 CDC 검정을 위하여, 5 x 107 세포의 세포 현탁액을 제조하고, 무혈청 배지 중 0.5 μM CellTracker deep red (CellTracker™ Deep Red, Thermo Fisher, #C34565) 또는 5 μM의 CellTracker Green (CellTracker™ Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate, Thermo Fisher, # C7025)에 재현탁하였다. 37 ℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 무혈청 배지 중에서 세척하고, 제조된 항체/mAb2-함유 웰에 직접 첨가하거나 또는 동일한 부피의 다른 차별적으로 염색된 세포주와 배합하고, 이어서, 상기 기재된 바와 같은 항체/mAb2-함유 웰에 첨가하였다. 이 두 분석을 위하여, 세포 배양물 조건 하에 30분간 인큐베이션 한 후, 10% 무혈청 배지 중 동일한 부피의 새끼 토끼 (baby rabbit) 보충물로 웰을 가득채웠다 (Baby Rabbit Complement,TEBU-bio, #CL3441). 세포 배양물 조건 하에 4시간 동안 플레이트를 인큐베이션하였다. LDH 방출 CDC 검정을 위하여, 4420 LALA 처리된 웰의 절반에 Triton X 100을 첨가함으로써 100% 용해 대조군을 생성하고, 제조사의 지침에 따라 세포독성 검정을 수행하였다 (CytotoxOne,Promega, G7891). 판독치를 수득한 후, 100% 용해 대조군으로부터의 시그널을 100%로 설정하고, 샘플 웰로부터의 신호를 백분율 수준으로 계산하였다.
유세포 분석 기반 CDC 검정을 위하여, 인큐베이션 기간 종료시, 사멸한 세포 염료 (SYTOX® Blue Dead Cell Stain, Thermo Fisher, #S34857)를 500 PBS 중 1로 희석하고, 동일한 부피로 웰을 가득채웠다. Cytoflex 유세포 분석기 상에서 유세포 분석을 수행하여, FSC 및 SSC에 기반하여 무손상 (intact) 세포군에 대해 게이팅하고 (gating), CellTracker™ Deep Red 양성 및 CellTracker™ Green CMFDA 양성 세포군 모두의 Sytox 양성 세포 (channel PB450)의 백분율을 측정하였다.
6.3.2 ADCC 검정
이전에 기재된 바와 같이 ADCC를 측정하였다 (Broussas, Matthieu; Broyer, Lucile; and Goetsch, Liliane. (2013) Evaluation of Antibody-Dependent Cell Cytotoxicity Using Lactate Dehydrogenase (LDH) Measurement in Glycosylation Engineering of Biopharmaceuticals: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. New York: Springer Science + Business Media. Volume 988, pp 305-317). 간략하게는, 4시간 동안 20 대 1의 비율의 인간 PBMC로부터 단리된 일차 NK 세포 (NK cell isolation kit, Miltenyi Biotec, 130-092-657)를 첨가하기 전, 표적 세포를 항체로 사전-인큐베이션하였다. 세포 독성 검정을 하기의 제조사의 지침에 따라 수행하였다 (CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay, Promega, G1780). 효과기 및 표적 세포의 자발적 용해 (spontaneous lysis)를 고려하여, 100% 표적 세포 용해에 기반하여 용해율 (%)을 계산하였다.
6.3 결과 및 결론
6.3.1 CDC 검정
PD-L1 발현 라지 세포를 항-CD20 항체 리툭시맙으로 표적화하고, 제네릭 LDH 방출로 CDC를 측정한 경우 <60%의 최대 용해 (maximum lysis)를 산출하였다. 항-PD-L1 항체 84G09 (mAb2 FS18-7-9/84G09의 F(ab)2 부위 포함), 및 IgG1 포맷의 FS18-7-9/84G09는 더 높은 최대 용해 및 또한 더 높은 용해 효능을 나타냈고, 이는 IgG1 포맷의 리툭시맙에 의해 요구되는 대략 절반의 반-최고 투여량 (half maximal dose)으로 추정된다. 이는, 84G09 및 FS18-7-9/84G09를 비교한 경우 이 둘 모두가 매우 유사했기 때문에, LAG-3 결합 부위의 84G09 항체로의 도입은 효능 또는 최대 반응에 관한 이의 PD-L1 표적화 활성을 변화시키지 않았다는 것을 밝힌다. LALA 돌연변이의 도입은 리툭시맙, 84G09 및 FS18-7-9/84G09에 대한 감소된 최대 반응을 야기하였으나, 84G09 및 FS18-7-9/84G09의 경우에만 효능이 감소되었다. 예상한 바와 같이, 항-LAF-3 항체 25F7은, 이러한 세포가 인간 LAG-3를 발현하지 않았기 때문에, PD-L1 발현 라지 세포의 세포 생육성에는 영향을 끼치지 않았다. 이러한 결과는 도 14A에 도시된다.
LAG-3 발현 라지 세포를 항-CD20 항체 리툭시맙에 대해 표적화하였으나, LAG-3 항체 25F7은 리툭시맙에 의해 요구되는 대략 절반의 추정치 반-최고 투여량으로 보다 양호한 효능을 나타냈다. FS18-7-9/84G09을 비롯한, 어떠한 다른 항체도, LAG-3 발현 라지 세포에 대하여 CDC 활성을 나타내지 않았다. LALA 돌연변이의 도입은 리툭시맙의 CDC 활성에 대하여 매우 제한된 효과를 가졌다 (도 14B).
6.3.2 차별적 CDC 검정
본 발명자들에 의하여 유세포 분석을 활용하는 차별적 CDC 어제이가 개발되어, FS18-7-9/84G09 또는 대조군 항체로 처리된 경우 어떠한 표적 발현 세포가 용해되었는지를 구별하였다. 이러한 검정을 사용하여 상기 기재된 기본적인 LDH 방출 CDC 검정으로부터의 결과를 확인하였다. 생 세포의 백분율에 영향을 미치지 않았던 IgG 이소형 대조군 항체 (4420)과 비교하여, 리툭시맙은 PD-L1 및 LAG-3 발현 세포 모두에서 생 세포의 감소 및 사멸한 세포의 증가를 매개하였다. 그러나, FS18-7-9/84G09는 LAG-3 발현 세포에 영향을 미치지 않았으나, PD-L1 발현 세포를 매우 효과적으로 용해시켰다. 유사하게도, LAG-3 특이적 항체 25F7 및 PD-L1 항체 84G09의 혼합물은 또한 생 세포에서 용량-의존적인 감소 및 사멸한 세포에서 상호 증가 (reciprocal increase)를 나타냈으나, LAG-3 발현 세포의 최대 용해는 단지 세포의 50% 이상이었고, 시험된 모든 항체의 최대 용해를 달성할 수 있는 가장 낮은 용량인 약 1 nM의 농도에 이미 도달하였다. 이는, FS18-7-9/84G09의 CH3 도메인에서 LAG-3 결합 부위가 LAG-3 발현 표적 세포의 CDC 매개된 용해를 유도하지 않는다는 이전의 발견을 확증한다. 또한, 이러한 실험은, LAG-3 발현 세포의 존재가 PD-L1 발현 세포에 대한 FS18-7-9/84G09의 CDC 활성에 영향을 미치지 않는다는 것을 밝힌다. 결과를 도 15에 도시한다.
6.3.3 ADCC 검정
매우 유사한 유효성 및 효능을 갖는 항-CD20 항체 리툭시맙, FS18-7-9/84G09, 및 84G09에 의하여 ADCC에 대해 PD-L1 발현 라지 세포를 표적화하였으며, 약 40%의 세포의 최대 용해를 산출하였다. 리툭시맙 및 LALA 돌연변이를 함유하는 84G09는 ADCC-매개된 용해를 나타내지 않았고, LALA 돌연변이를 함유하는 FS18-7-9/84G09는 PD-L1 발현 표적 세포의 매우 낮은 ADCC-매개된 용해를 나타내거나 또는 나타내지 않았다. LAG-3 특이적 항체 25F7 및 LALA 돌연변이를 함유 및 비함유하는 이소형 대조군 4420은 이러한 분석에서 활성을 나타내지 않았다.
이러한 결과는 항체 84G09로의 LAG-3 결합 부위의 도입이, 이 둘 모두가 PD-L1 특이적 항체 84G09와 매우 유사하기 때문에, 효능 또는 최대 반응에서 이러한 PD-L1 표적화된 ADCC 활성을 변경하지 않는다는 것을 밝힌다. LALA 돌연변이의 도입은 ADCC 활성의 폐기 (abrogation)를 야기하였다 (도 16A).
ADCC-매개된 용해에 대하여 리툭시맙 및 25F7에 의해 LAG-3 발현 라지 세포를 표적화하였으며, 약 40%의 최대 용해를 산출하였다. FS18-7-9/84G09는 또한 ADCC에 의하여 LAG-3 발현 세포의 용해를 매개하였고, 이는 더욱 낮은 효능 및 유효성을 가졌고, 단지 2.5 nM 농도에서 20% 이하의 용해에 도달하였다. LALA 돌연변이의 도입은 리툭시맙 및 FS18-7-9/84G09의 모든 ADCC 활성을 폐기시켰다. 84G09 및 LALA 돌연변이를 함유 및 비함유하는 이소형 대조군 4420은, 이러한 항체가 LAG-3에 결합하지 않으므로, 예상한 바와 같이 이러한 검정에서 ADCC 활성을 나타내지 않았다 (도 16B).
서열 목록
Fcab FS18-7-9 루프 영역의 아미노산 서열
FS18-7-9 AB 루프 - WDEPWGED (서열번호 1)
FS18-7-9 CD 루프 - SNGQPENNY (서열번호 2)
FS18-7-9 EF 루프 - PYDRWVWPDE (서열번호 3)
Fcab FS18-7-9 CH3 도메인의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 4)
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Fcab FS18-7-9 CH3 도메인의 CHO 코돈 최적화 뉴클레오티드 서열 (서열번호 142)
GGCCAGCCCCGGGAACCCCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCTGGGATGAGCCCTGGGGCGAGGATGTGTCTCTGACCTGTCTCGTGAAAGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGCCCTACGACAGATGGGTGTGGCCCGACGAGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCCCGGC
Fcab FS18-7-9 CH3 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 5)
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C-말단 리신을 포함하는 Fcab FS18-7-9 CH3 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 135)
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LALA 돌연변이 (밑줄)를 포함하는 Fcab FS18-7-9 CH2 및 CH3 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 6)
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LALA 돌연변이를 갖지 않는 Fcab FS18-7-9 CH2 및 CH3 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 7)
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Fcab FS18-7-32 루프 영역의 아미노산 서열
FS18-7-32 AB 루프 - WDEPWGED (서열번호 1)
FS18-7-32 CD 루프 - SNGQPENNY (서열번호 8)
FS18-7-32 EF 루프 - PYDRWVWPDE (서열번호 3)
Fcab FS18-7-32 CH3 도메인의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 9)
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Fcab FS18-7-32 CH3 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 10)
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LALA 돌연변이 (밑줄)를 포함하는 Fcab FS18-7-32 CH2 및 CH3 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 11)
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LALA 돌연변이를 갖지 않는 Fcab FS18-7-32 CH2 및 CH3 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 12)
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Fcab FS18-7-33 루프 영역의 아미노산 서열
FS18-7-33 AB 루프 - WDEPWGED (서열번호 1)
FS18-7-33 CD 루프 - SNGQPEDNY (서열번호 13)
FS18-7-33 EF 루프 - PYDRWVWPDE (서열번호 3)
Fcab FS18-7-33 CH3 도메인의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 14)
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Fcab FS18-7-33 CH3 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 15)
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LALA 돌연변이 (밑줄)를 포함하는 Fcab FS18-7-33 CH2 및 CH3 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 16)
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LALA 돌연변이를 갖지 않는 Fcab FS18-7-33 CH2 및 CH3 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 17)
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Fcab FS18-7-36 루프 영역의 아미노산 서열
FS18-7-36 AB 루프 - WDEPWGED (서열번호 1)
FS18-7-36 CD 루프 - SNGQPENNY (서열번호 18)
FS18-7-36 EF 루프 - PYDRWVWPDE (서열번호 3)
Fcab FS18-7-36 CH3 도메인의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 19)
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Fcab FS18-7-36 CH3 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 20)
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LALA 돌연변이 (밑줄)를 포함하는 Fcab FS18-7-36 CH2 및 CH3 도메인의 CH2+CH3의 아미노산 서열 (서열번호 21)
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LALA 돌연변이를 갖지 않는 Fcab FS18-7-36 CH2 및 CH3 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 22)
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Fcab FS18-7-58 루프 영역의 아미노산 서열
FS18-7-58 AB 루프 - WDEPWGED (서열번호 1)
FS18-7-58 CD 루프 - SNGYPEIEF (서열번호 23)
FS18-7-58 EF 루프 - PYDRWVWPDE (서열번호 3)
Fcab FS18-7-58 CH3 도메인의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 24)
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Fcab FS18-7-58 CH3 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 25)
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LALA 돌연변이 (밑줄)를 포함하는 Fcab FS18-7-58 CH2 및 CH3 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 26)
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LALA 돌연변이를 갖지 않는 Fcab FS18-7-58 CH2 및 CH3 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 27)
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Fcab FS18-7-62 루프 영역의 아미노산 서열
FS18-7-62 AB 루프 - WDEPWGED (서열번호 1)
FS18-7-62 CD 루프 - SNGIPEWNY (서열번호 28)
FS18-7-62 EF 루프 - PYDRWVWPDE (서열번호 3)
Fcab FS18-7-62 CH3 도메인의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 29)
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Fcab FS18-7-62 CH3 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 30)
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LALA 돌연변이 (밑줄)를 포함하는 Fcab FS18-7-62 CH2 및 CH3 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 31)
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LALA 돌연변이를 갖지 않는 Fcab FS18-7-62 CH2 및 CH3 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 32)
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Fcab FS18-7-65 루프 영역의 아미노산 서열
FS18-7-65 AB 루프 - WDEPWGED (서열번호 1)
FS18-7-65 CD 루프 - SNGYAEYNY (서열번호 33)
FS18-7-65 EF 루프 - PYDRWVWPDE (서열번호 3)
Fcab FS18-7-65 CH3 도메인의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 34)
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Fcab FS18-7-65 CH3 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 35)
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LALA 돌연변이 (밑줄)를 포함하는 Fcab FS18-7-65 CH2 및 CH3 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 36)
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LALA 돌연변이를 갖지 않는 Fcab FS18-7-65 CH2 및 CH3 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 37)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYAEYNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS18-7-78 루프 영역의 아미노산 서열
FS18-7-78 AB 루프 - WDEPWGED (서열번호 1)
FS18-7-78 CD 루프 - SNGYKEENY (서열번호 38)
FS18-7-78 EF 루프 - PYDRWVWPDE (서열번호 3)
Fcab FS18-7-78 CH3 도메인의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 39)
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCTGGGATGAGCCGTGGGGTGAAGACGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGTATAAAGAAGAAAACTATAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATGATAGGTGGGTTTGGCCGGATGAGTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Fcab FS18-7-78 CH3 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 40)
GQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYKEENYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이 (밑줄)를 포함하는 Fcab FS18-7-78 CH2 및 CH3 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 41)
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYKEENYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이를 갖지 않는 Fcab FS18-7-78 CH2 및 CH3 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 42)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYKEENYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS18-7-88 루프 영역의 아미노산 서열
FS18-7-88 AB 루프 - WDEPWGED (서열번호 1)
FS18-7-88 CD 루프 - SNGVPELNV (서열번호 43)
FS18-7-88 EF 루프 - PYDRWVWPDE (서열번호 3)
Fcab FS18-7-88 CH3 도메인의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 44)
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCTGGGATGAGCCGTGGGGTGAAGACGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGGTTCCAGAACTGAACGTTAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATGATAGGTGGGTTTGGCCGGATGAGTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Fcab FS18-7-88 CH3 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 45)
GQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGVPELNVKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이 (밑줄 표시)를 포함하는 Fcab FS18-7-88 CH2 및 CH3 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 46)
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGVPELNVKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이를 갖지 않는 Fcab FS18-7-88 CH2 및 CH3 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 47)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGVPELNVKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS18-7-95 루프 영역의 아미노산 서열
FS18-7-95 AB 루프 - WDEPWGED (서열번호 1)
FS18-7-95 CD 루프 - SNGYQEDNY (서열번호 48)
FS18-7-95 EF 루프 - PYDRWVWPDE (서열번호 3)
Fcab FS18-7-95 CH3 도메인의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 49)
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCTGGGATGAGCCGTGGGGTGAAGACGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGTATCAGGAAGATAACTATAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATGATAGGTGGGTTTGGCCGGATGAGTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Fcab FS18-7-95 CH3 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 50)
GQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYQEDNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이 (밑줄 표시)를 포함하는 Fcab FS18-7-95 CH2 및 CH3 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 51)
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYQEDNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이를 갖지 않는 Fcab FS18-7-95 CH2 및 CH3 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 52)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYQEDNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
야생형 인간 IgG1 CH2 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 53)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
LALA 돌연변이 (밑줄 표시)를 포함하는 인간 IgG1 CH2 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 54)
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
LALA 돌연변이를 갖지 않는 "야생형" Fcab CH2 및 CH3 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 55)
Figure pat00001
LALA 돌연변이 (밑줄 표시)를 포함하는 "야생형" Fcab CH2 및 CH3 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 56)
Figure pat00002
인간 IgG1 힌지 영역의 아미노산 서열 (서열번호 57)
EPKSCDKTHTCPPCP
인간 IgG1 절두된 힌지 영역의 아미노산 서열 (서열번호 58)
TCPPCP
LALA 돌연변이 (밑줄 표시)를 포함하는 항-마우스 LAG-3 Fcab FS18-7-108-29의 아미노산 서열 (서열번호 59)
CH3 도메인은 이탤릭체로 표시됨. CH3 도메인의 Ab, CD 및 EF 루프는 굵게 밑줄로 표시됨.
TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIVVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PFERWMWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이를 갖지 않는 항-마우스 LAG-3 Fcab FS18-7-108-29의 아미노산 서열 (서열번호 60)
CH3 도메인은 이탤릭체로 표시됨. CH3 도메인의 Ab, CD 및 EF 루프는 굵게 밑줄로 표시됨.
TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIVVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PFERWMWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이 (밑줄 표시)를 포함하는 항-마우스 LAG-3 Fcab FS18-7-108-35의 아미노산 서열 (서열번호 61)
CH3 도메인은 이탤릭체로 표시됨. AB, CD 및 EF 루프 영역은 굵게 및 밑줄로 표시됨.
TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDISVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PFERWMWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이를 갖지 않는 항-마우스 LAG-3 Fcab FS18-7-108-35의 아미노산 서열 (서열번호 62)
CH3 도메인은 이탤릭체로 표시됨. AB, CD 및 EF 루프 영역은 굵게 및 밑줄로 표시됨.
TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDISVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PFERWMWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이를 포함하는 항-인간 LAG-3/FITC mAb 2 FS18-7-9/4420의 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 63)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨. LALA 돌연변이의 위치는 밑줄로 표시됨.
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이를 갖지 않는 항-인간 LAG-3/FITC mAb 2 FS18-7-9/4420의 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 64)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨.
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이를 포함하는 항-인간 LAG-3/FITC mAb 2 FS18-7-32/4420의 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 65)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨. LALA 돌연변이의 위치는 밑줄로 표시됨.
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSEIAVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이를 갖지 않는 항-인간 LAG-3/FITC mAb 2 FS18-7-32의 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 66)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨.
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSEIAVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이를 포함하는 항-인간 LAG-3/FITC mAb 2 FS18-7-33/4420의 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 67)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨. LALA 돌연변이의 위치는 밑줄로 표시됨.
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPEDNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이를 갖지 않는 항-인간 LAG-3/FITC mAb 2 FS18-7-33/4420의 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 68)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨. EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPEDNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이를 포함하는 항-인간 LAG-3/FITC mAb 2 FS18-7-36/4420의 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 69)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨. LALA 돌연변이의 위치는 밑줄로 표시됨.
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSYFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이를 갖지 않는 항-인간 LAG-3/FITC mAb 2 FS18-7-36/4420의 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 70)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨.
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSYFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이를 포함하는 항-인간 LAG-3/FITC mAb 2 FS18-7-58/4420의 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 71)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨. LALA 돌연변이의 위치는 밑줄로 표시됨.
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGYPEIEF KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이를 갖지 않는 항-인간 LAG-3/FITC mAb 2 FS18-7-58/4420의 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 72)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨.
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGYPEIEF KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이를 포함하는 항-인간 LAG-3/FITC mAb 2 FS18-7-62/4420의 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 73)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨. LALA 돌연변이의 위치는 밑줄로 표시됨. EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGIPEWNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이를 갖지 않는 항-인간 LAG-3/FITC mAb 2 FS18-7-62/4420의 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 74)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨. EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGIPEWNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이를 포함하는 항-인간 LAG-3/FITC mAb 2 FS18-7-65/4420의 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 75)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨. LALA 돌연변이의 위치는 밑줄로 표시됨. EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGYAEYNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPD EFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이를 갖지 않는 항-인간 LAG-3/FITC mAb 2 FS18-7-65/4420의 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 76)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨. EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGYAEYNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPD EFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이를 포함하는 항-인간 LAG-3/FITC mAb 2 FS18-7-78/4420의 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 77)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨. LALA 돌연변이의 위치는 밑줄로 표시됨.
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGYKEENY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이를 갖지 않는 항-인간 LAG-3/FITC mAb 2 FS18-7-78/4420의 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 78)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨.
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGYKEENY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변를 포함하는 항-인간 LAG-3/FITC mAb 2 FS18-7-88/4420의 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 79)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨. LALA 돌연변이의 위치는 밑줄로 표시됨. EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGVPELNV KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이를 갖지 않는 항-인간 LAG-3/FITC mAb 2 FS18-7-88/4420의 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 80)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨. EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGVPELNV KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이를 포함하는 항-인간 LAG-3/FITC mAb 2 FS18-7-95/4420의 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 81)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨. LALA 돌연변이의 위치는 밑줄로 표시됨. EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGYQEDNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이를 갖지 않는 항-인간 LAG-3/FITC mAb 2 FS18-7-95/4420의 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 82)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨. EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGYQEDNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이를 포함하는 항-FITC mAb 4420의 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 83)
CDR의 위치는 밑줄로 표시됨. LALA 돌연변이의 위치는 밑줄로 표시됨.
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이를 포함하는 항-FITC mAb 4420의 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 84)
CDR의 위치는 밑줄로 표시됨.
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
항-FITC mAb 4420 경쇄의 아미노산 서열 (서열번호 85)
CDR의 위치는 밑줄로 표시됨.
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLRWYLQKPGQSPKVLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
항-PD-L1 항체 84G09의 CDR의 아미노산 서열 (IMGT에 따라)
HCDR1 GFTFDDYA (서열번호 86)
HCDR2 ISWKSNII (서열번호 87)
HCDR3 ARDITGSGSYGWFDP (서열번호 88)
LCDR1 QSISSY (서열번호 89)
LCDR2 VAS (서열번호 90)
LCDR3 QQSYSNPIT (서열번호 91)
항-PD-L1 항체 84G09의 CDR의 아미노산 서열 (Kabat에 따라)
HCDR1 DYAMH (서열번호 136)
HCDR2 GISWKSNIIGYADSVKG (서열번호 137)
HCDR3 DITGSGSYGWFDP (서열번호 138)
LCDR1 RASQSISSYLN (서열번호 139)
LCDR2 VASSLQS (서열번호 140)
LCDR3 QQSYSNPIT (서열번호 141)
항-PD-L1 항체 84G09 VH 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 92)
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNIIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDPWGQGTLVTVSS
항-PD-L1 항체 84G09 VL 도메인의 아미노산 ㅅ서열 (서열번호 93)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKPLIYVASSLQSGVPSSFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSNPITFGQGTRLEIK
LALA 돌연변이 중쇄를 갖는 항-인간 LAG-3/PD-L1 mAb 2 FS18-7-19/84G09의 아미노산 서열 (서열번호 94)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨. LALA 돌연변이의 위치는 밑줄로 표시됨.
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNIIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
항-인간 LAG-3/PD-L1 mAb 2 FS18-7-9/84G09 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 95)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨.
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNIIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이 중쇄를 포함하는 항-인간 LAG-3/PD-L1 mAb 2 FS18-7-32/84G09 아미노산 서열 (서열번호 96)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨. LALA 돌연변이의 위치는 굵게 표시됨.
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNIIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSEIAVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
항-인간 LAG-3/PD-L1 mAb 2 FS18-7-32/84G09 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 97)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨.
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNIIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSEIAVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이 중쇄를 포함하는 항-인간 LAG-3/PD-L1 mAb 2 FS18-7-33/84G09의 아미노산 서열 (서열번호 98)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨. LALA 돌연변이의 위치는 굵게 표시됨.
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNIIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPEDNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
항-인간 LAG-3/PD-L1 mAb 2 FS18-7-33/84G09 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 99)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨.
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNIIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPEDNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이 중쇄를 포함하는 항-인간 LAG-3/PD-L1 mAb 2 FS18-7-36/84G09의 아미노산 서열 (서열번호 100)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨. LALA 돌연변이의 위치는 굵게 표시됨.
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNIIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSYFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
항-인간 LAG-3/PD-L1 mAb 2 FS18-7-36/84G09 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 101)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨.
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNIIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSYFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이 중쇄를 포함하는 항-인간 LAG-3/PD-L1 mAb 2 FS18-7-58/84G09의 아미노산 서열 (서열번호 102)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨. LALA 돌연변이의 위치는 굵게 표시됨.
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNIIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGYPEIEF KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
항-인간 LAG-3/PD-L1 mAb 2 FS18-7-58/84G09 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 103)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨.
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNIIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGYPEIEF KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이 중쇄를 포함하는 항-인간 LAG-3/PD-L1 mAb 2 FS18-7-62/84G09의 아미노산 서열 (서열번호 104)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨. LALA 돌연변이의 위치는 굵게 표시됨.
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNIIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGIPEWNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
항-인간 LAG-3/PD-L1 mAb 2 FS18-7-62/84G09 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 105)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨.
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNIIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGIPEWNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이 중쇄를 포함하는 항-인간 LAG-3/PD-L1 mAb 2 FS18-7-65/84G09의 아미노산 서열 (서열번호 106)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨. LALA 돌연변이의 위치는 굵게 표시됨.
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNIIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGYAEYNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
항-인간 LAG-3/PD-L1 mAb 2 FS18-7-65/84G09 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 107)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨.
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNIIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGYAEYNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이 중쇄를 포함하는 항-인간 LAG-3/PD-L1 mAb 2 FS18-7-78/84G09의 아미노산 서열 (서열번호 108)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨. LALA 돌연변이의 위치는 굵게 표시됨.
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNIIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGYKEENY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
항-인간 LAG-3/PD-L1 mAb 2 FS18-7-78/84G09 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 109)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨.
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNIIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGYKEENY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이 중쇄를 포함하는 항-인간 LAG-3/PD-L1 mAb 2 FS18-7-88/84G09 의 아미노산 서열 (서열번호 110)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨. LALA 돌연변이의 위치는 굵게 표시됨.
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNIIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGVPELNV KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
항-인간 LAG-3/PD-L1 mAb 2 FS18-7-88/84G09 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 111)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨.
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNIIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGVPELNV KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이 중쇄를 포함하는 항-인간 LAG-3/PD-L1 mAb 2 FS18-7-95/84G09의 아미노산 서열 (서열번호 112)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨. LALA 돌연변이의 위치는 굵게 표시됨.
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNIIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGYQEDNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
항-인간 LAG-3/PD-L1 mAb 2 FS18-7-95/84G09 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 113)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨. LALA 돌연변이의 위치는 굵게 표시됨.
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNIIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGYQEDNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이 중쇄를 포함하는 항-인간 PD-L1 mAb 84G09의 아미노산 서열 (서열번호 114)
CDR의 위치는 밑줄로 표시됨. LALA 돌연변이의 위치는 굵게 표시됨.
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNIIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
항-인간 PD-L1 mAb 84G09 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 115)
CDR의 위치는 밑줄로 표시됨.
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNIIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
항-인간 PD-L1 mAb 84G09 경쇄의 아미노산 서열 (서열번호 116)
CDR의 위치는 밑줄로 표시됨.
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKPLIYVASSLQSGVPSSFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSNPITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
LALA 돌연변이 중쇄를 포함하는 항-마우스 LAG-3/PD-L1 mAb 2 FS18-7-108-29/S1의 아미노산 서열 (서열번호 117)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨. LALA 돌연변이의 위치는 굵게 표시됨.
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIVVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PFERWMWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LAG-3/PD-L1 mAb 2 FS18-7-108-29/S1 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 118)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨.
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIVVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PFERWMWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
항-마우스 PD-L1 mAb S1 경쇄의 아미노산 서열 (서열번호 119)
CDR의 위치는 밑줄로 표시됨.
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLFTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
LALA 돌연변이 중쇄를 포함하는 항-마우스 LAG-3/PD-L1 mAb 2 FS18-7-108-35/S1의 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 120)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨. LALA 돌연변이의 위치는 밑줄로 표시됨.
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDISVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PFERWMWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
항-마우스 LAG-3/PD-L1 mAb 2 FS18-7-108-35/S1 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 121)
CDR의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨.
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDISVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PFERWMWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이 중쇄를 포함하는 대조군 PD-L1 mAb S1의 아미노산 서열 (서열번호 122)
CDR의 위치는 밑줄로 표시됨. LALA 돌연변이의 위치는 굵게 표시됨.
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
대조군 PD-L1 mAb S1 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 123)
CDR의 위치는 밑줄로 표시됨. LALA 돌연변이의 위치는 밑줄로 표시됨.
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
항-인간 LAG-3 mAb 25F7 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 124)
CDR의 위치는 밑줄로 표시됨.
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSDYYWNWIRQPPGKGLEWIGEINHRGSTNSNPSLKSRVTLSLDTSKNQFSLKLRSVTAADTAVYYCAFGYSDYEYNWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
대조군 항-인간 LAG-3 mAb 25F7 경쇄의 아미노산 서열 (서열번호 125)
CDR의 위치는 밑줄로 표시됨.
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGQGTNLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
인간 LAG-3의 아미노산 서열 (서열번호 126)
MWEAQFLGLLFLQPLWVAPVKPLQPGAEVPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLEPPTPLTVYAGAGSRVGLPCRLPAGVGTRSFLTAKWTPPGGGPDLLVTGDNGDFTLRLEDVSQAQAGTYTCHIHLQEQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPVSGQERFVWSSLDTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLYQGERLLGAAVYFTELSSPGAQRSGRAPGALPAGHLLLFLILGVLSLLLLVTGAFGFHLWRRQWRPRRFSALEQGIHPPQAQSKIEELEQEPEPEPEPEPEPEPEPEPEQL
마우스 LAG-3의 아미노산 서열 (서열번호 127)
MREDLLLGFLLLGLLWEAPVVSSGPGKELPVVWAQEGAPVHLPCSLKSPNLDPNFLRRGGVIWQHQPDSGQPTPIPALDLHQGMPSPRQPAPGRYTVLSVAPGGLRSGRQPLHPHVQLEERGLQRGDFSLWLRPALRTDAGEYHATVRLPNRALSCSLRLRVGQASMIASPSGVLKLSDWVLLNCSFSRPDRPVSVHWFQGQNRVPVYNSPRHFLAETFLLLPQVSPLDSGTWGCVLTYRDGFNVSITYNLKVLGLEPVAPLTVYAAEGSRVELPCHLPPGVGTPSLLIAKWTPPGGGPELPVAGKSGNFTLHLEAVGLAQAGTYTCSIHLQGQQLNATVTLAVITVTPKSFGLPGSRGKLLCEVTPASGKERFVWRPLNNLSRSCPGPVLEIQEARLLAERWQCQLYEGQRLLGATVYAAESSSGAHSARRISGDLKGGHLVLVLILGALSLFLLVAGAFGFHWWRKQLLLRRFSALEHGIQPFPAQRKIEELERELETEMGQEPEPEPEPQLEPEPRQL
시노몰구스 LAG-3의 아미노산 서열 (서열번호 128)
MWEAQFLGLLFLQPLWVAPVKPPQPGAEISVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPPVPGHRPAAPYSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRATVHLRDRALSCRLRLRVGQASMTASPPGSLRTSDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRSRGQGRVPVQGSPHHHLAESFLFLPHVGPMDSGLWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLEPATPLTVYAGAGSRVELPCRLPPAVGTQSFLTAKWAPPGGGPDLLVAGDNGDFTLRLEDVSQAQAGTYICHIRLQGQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPASGQEHFVWSPLNTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLHQGERLLGAAVYFTELSSPGAQRSGRAPGALRAGHLPLFLILGVLFLLLLVTGAFGFHLWRRQWRPRRFSALEQGIHPPQAQSKIEELEQEPELEPEPELERELGPEPEPGPEPEPEQL
인간 PD-L1의 아미노산 서열 (서열번호 129)
MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET
뮤린 PD-L1의 아미노산 서열 (서열번호 130)
MRIFAGIIFTACCHLLRAFTITAPKDLYVVEYGSNVTMECRFPVERELDLLALVVYWEKEDEQVIQFVAGEEDLKPQHSNFRGRASLPKDQLLKGNAALQITDVKLQDAGVYCCIISYGGADYKRITLKVNAPYRKINQRISVDPATSEHELICQAEGYPEAEVIWTNSDHQPVSGKRSVTTSRTEGMLLNVTSSLRVNATANDVFYCTFWRSQPGQNHTAELIIPELPATHPPQNRTHWVLLGSILLFLIVVSTVLLFLRKQVRMLDVEKCGVEDTSSKNRNDTQFEET
시노몰구스 PD-L1의 아미노산 서열 (서열번호 131)
MRIFAVFIFTIYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLTSLIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSNYRQRAQLLKDQLSLGNAALRITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLLNVTSTLRINTTANEIFYCIFRRLDPEENHTAELVIPELPLALPPNERTHLVILGAIFLLLGVALTFIFYLRKGRMMDMKKCGIRVTNSKKQRDTQLEET
LALA 돌연변이를 포함하는 항-마우스 LAG-3/FITC mAb 2 FS18-7-108-29/4420의 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 132)
CDR 의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨. LALA 돌연변이의 위치는 밑줄로 표시됨.
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIVVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PFERWMWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
LALA 돌연변이를 포함하는 항-마우스 LAG-3/FITC mAb 2 FS18-7-108-35/4420의 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 133)
CDR 의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨. LALA 돌연변이의 위치는 밑줄로 표시됨.
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDISVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PFERWMWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
항-마우스 LAG-3/FITC mAb 2 FS18-7-108-29/4420 중쇄의 아미노산 서열 (서열번호 134)
CDR 의 위치는 밑줄로 표시되고, AB, CD, 및 EF 루프 서열은 굵게 밑줄로 표시됨. LALA 돌연변이의 위치는 밑줄로 표시됨.
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIVVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PFERWMWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
참고 문헌
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Figure pat00003
Figure pat00004
Figure pat00005
SEQUENCE LISTING <110> F-star Therapeutics Limited <120> BINDING MOLECULES BINDING PD-L1 AND LAG-3 <130> IPA181527-GB-D1 <140> PCT/EP2017/065073 <141> 2017-06-20 <150> US 62/352482 <151> 2016-06-20 <160> 142 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FS18-7-9 AB loop <400> 1 Trp Asp Glu Pro Trp Gly Glu Asp 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FS18-7-9 CD loop <400> 2 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 1 5 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FS18-7-9 EF loop <400> 3 Pro Tyr Asp Arg Trp Val Trp Pro Asp Glu 1 5 10 <210> 4 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of Fcab FS18-7-9 CH3 domain <400> 4 ggccagcctc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cctgggatga gccgtggggt 60 gaagacgtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgaaat cgccgtggag 120 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 180 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtgccgt atgataggtg ggtttggccg 240 gatgagttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 300 ctctccctgt ctccgggt 318 <210> 5 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Fcab FS18-7-9 CH3 domain <400> 5 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Trp Asp 1 5 10 15 Glu Pro Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp Arg Trp Val Trp Pro 65 70 75 80 Asp Glu Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 100 105 <210> 6 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Fcab FS18-7-9 CH2 and CH3 domains, comprising LALA mutation <400> 6 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Trp Asp Glu Pro 115 120 125 Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp Arg Trp Val Trp Pro Asp Glu 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 <210> 7 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Fcab FS18-7-9 CH2 and CH3 domains without LALA mutation <400> 7 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Trp Asp Glu Pro 115 120 125 Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp Arg Trp Val Trp Pro Asp Glu 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FS18-7-32 CD loop <400> 8 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 1 5 <210> 9 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of Fcab FS18-7-32 CH3 domain <400> 9 ggccagcctc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cctgggatga gccgtggggt 60 gaagacgtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgaaat cgccgtggag 120 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 180 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtgccgt atgataggtg ggtttggccg 240 gatgagttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 300 ctctccctgt ctccgggt 318 <210> 10 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Fcab FS18-7-32 CH3 domain <400> 10 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Trp Asp 1 5 10 15 Glu Pro Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Glu Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp Arg Trp Val Trp Pro 65 70 75 80 Asp Glu Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 100 105 <210> 11 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Fcab FS18-7-32 CH2 and CH3 domains, comprising LALA mutation <400> 11 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Trp Asp Glu Pro 115 120 125 Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Glu Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp Arg Trp Val Trp Pro Asp Glu 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 <210> 12 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Fcab FS18-7-32 CH2 and CH3 domains without LALA mutation <400> 12 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Trp Asp Glu Pro 115 120 125 Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Glu Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp Arg Trp Val Trp Pro Asp Glu 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FS18-7-33 CD loop <400> 13 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asp Asn Tyr 1 5 <210> 14 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of Fcab FS18-7-33 CH3 domain <400> 14 ggccagcctc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cctgggatga gccgtggggt 60 gaagacgtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 120 tgggagagca atgggcagcc ggaggacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 180 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtgccgt atgataggtg ggtttggccg 240 gatgagttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 300 ctctccctgt ctccgggt 318 <210> 15 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Fcab FS18-7-33 CH3 domain <400> 15 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Trp Asp 1 5 10 15 Glu Pro Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp Arg Trp Val Trp Pro 65 70 75 80 Asp Glu Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 100 105 <210> 16 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Fcab FS18-7-33 CH2 and CH3 domains, comprising LALA mutation <400> 16 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Trp Asp Glu Pro 115 120 125 Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asp Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp Arg Trp Val Trp Pro Asp Glu 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 <210> 17 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Fcab FS18-7-33 CH2 and CH3 domains without LALA mutation <400> 17 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Trp Asp Glu Pro 115 120 125 Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asp Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp Arg Trp Val Trp Pro Asp Glu 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FS18-7-36 CD loop <400> 18 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 1 5 <210> 19 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of Fcab FS18-7-36 CH3 domain <400> 19 ggccagcctc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cctgggatga gccgtggggt 60 gaagacgtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 120 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 180 gacggctcct acttcctcta cagcaagctc accgtgccgt atgataggtg ggtttggccg 240 gatgagttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 300 ctctccctgt ctccgggt 318 <210> 20 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Fcab FS18-7-36 CH3 domain <400> 20 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Trp Asp 1 5 10 15 Glu Pro Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp Arg Trp Val Trp Pro 65 70 75 80 Asp Glu Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 100 105 <210> 21 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CH2+CH3 of Fcab FS18-7-36 CH2 and CH3 domains, comprising LALA mutation <400> 21 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Trp Asp Glu Pro 115 120 125 Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp Arg Trp Val Trp Pro Asp Glu 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 <210> 22 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Fcab FS18-7-36 CH2 and CH3 domains without LALA mutation <400> 22 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Trp Asp Glu Pro 115 120 125 Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp Arg Trp Val Trp Pro Asp Glu 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FS18-7-58 CD loop <400> 23 Ser Asn Gly Tyr Pro Glu Ile Glu Phe 1 5 <210> 24 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of Fcab FS18-7-58 CH3 domain <400> 24 ggccagcctc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cctgggatga gccgtggggt 60 gaagacgtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 120 tgggagagca atgggtatcc agaaatcgaa ttcaagacca cgcctcccgt gctggactcc 180 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtgcctt atgataggtg ggtttggccg 240 gatgagttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 300 ctctccctgt ctccgggt 318 <210> 25 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Fcab FS18-7-58 CH3 domain <400> 25 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Trp Asp 1 5 10 15 Glu Pro Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Tyr Pro Glu 35 40 45 Ile Glu Phe Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp Arg Trp Val Trp Pro 65 70 75 80 Asp Glu Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 100 105 <210> 26 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Fcab FS18-7-58 CH2 and CH3 domains, comprising LALA mutation <400> 26 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Trp Asp Glu Pro 115 120 125 Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Tyr Pro Glu Ile Glu 145 150 155 160 Phe Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp Arg Trp Val Trp Pro Asp Glu 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 <210> 27 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Fcab FS18-7-58 CH2 and CH3 domains without LALA mutation <400> 27 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Trp Asp Glu Pro 115 120 125 Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Tyr Pro Glu Ile Glu 145 150 155 160 Phe Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp Arg Trp Val Trp Pro Asp Glu 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FS18-7-62 CD loop <400> 28 Ser Asn Gly Ile Pro Glu Trp Asn Tyr 1 5 <210> 29 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of Fcab FS18-7-62 CH3 domain <400> 29 ggccagcctc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cctgggatga gccgtggggt 60 gaagacgtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 120 tgggagagca atgggatccc agaatggaac tataagacca cgcctcccgt gctggactcc 180 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtgccgt atgataggtg ggtttggccg 240 gatgagttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 300 ctctccctgt ctccgggt 318 <210> 30 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Fcab FS18-7-62 CH3 domain <400> 30 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Trp Asp 1 5 10 15 Glu Pro Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Ile Pro Glu 35 40 45 Trp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp Arg Trp Val Trp Pro 65 70 75 80 Asp Glu Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 100 105 <210> 31 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Fcab FS18-7-62 CH2 and CH3 domains, comprising LALA mutation <400> 31 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Trp Asp Glu Pro 115 120 125 Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Ile Pro Glu Trp Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp Arg Trp Val Trp Pro Asp Glu 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 <210> 32 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Fcab FS18-7-62 CH2 and CH3 domains without LALA mutation <400> 32 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Trp Asp Glu Pro 115 120 125 Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Ile Pro Glu Trp Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp Arg Trp Val Trp Pro Asp Glu 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FS18-7-65 CD loop <400> 33 Ser Asn Gly Tyr Ala Glu Tyr Asn Tyr 1 5 <210> 34 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of Fcab FS18-7-65 CH3 domain <400> 34 ggccagcctc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cctgggatga gccgtggggt 60 gaagacgtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 120 tgggagagca atgggtatgc agaatataac tataagacca cgcctcccgt gctggactcc 180 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtgccgt atgataggtg ggtttggccg 240 gatgagttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 300 ctctccctgt ctccgggt 318 <210> 35 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Fcab FS18-7-65 CH3 domain <400> 35 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Trp Asp 1 5 10 15 Glu Pro Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Tyr Ala Glu 35 40 45 Tyr Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp Arg Trp Val Trp Pro 65 70 75 80 Asp Glu Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 100 105 <210> 36 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Fcab FS18-7-65 CH2 and CH3 domains, comprising LALA mutation <400> 36 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Trp Asp Glu Pro 115 120 125 Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Tyr Ala Glu Tyr Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp Arg Trp Val Trp Pro Asp Glu 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 <210> 37 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Fcab FS18-7-65 CH2 and CH3 domains without LALA mutation <400> 37 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Trp Asp Glu Pro 115 120 125 Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Tyr Ala Glu Tyr Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp Arg Trp Val Trp Pro Asp Glu 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FS18-7-78 CD loop <400> 38 Ser Asn Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Tyr 1 5 <210> 39 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of Fcab FS18-7-78 CH3 domain <400> 39 ggccagcctc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cctgggatga gccgtggggt 60 gaagacgtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 120 tgggagagca atgggtataa agaagaaaac tataagacca cgcctcccgt gctggactcc 180 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtgccgt atgataggtg ggtttggccg 240 gatgagttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 300 ctctccctgt ctccgggt 318 <210> 40 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Fcab FS18-7-78 CH3 domain <400> 40 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Trp Asp 1 5 10 15 Glu Pro Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Tyr Lys Glu 35 40 45 Glu Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp Arg Trp Val Trp Pro 65 70 75 80 Asp Glu Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 100 105 <210> 41 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Fcab FS18-7-78 CH2 and CH3 domains, comprising LALA mutation <400> 41 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Trp Asp Glu Pro 115 120 125 Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Tyr Lys Glu Glu Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp Arg Trp Val Trp Pro Asp Glu 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 <210> 42 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Fcab FS18-7-78 CH2 and CH3 domains without LALA mutation <400> 42 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Trp Asp Glu Pro 115 120 125 Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Tyr Lys Glu Glu Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp Arg Trp Val Trp Pro Asp Glu 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FS18-7-88 CD loop <400> 43 Ser Asn Gly Val Pro Glu Leu Asn Val 1 5 <210> 44 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of Fcab FS18-7-88 CH3 domain <400> 44 ggccagcctc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cctgggatga gccgtggggt 60 gaagacgtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 120 tgggagagca atggggttcc agaactgaac gttaagacca cgcctcccgt gctggactcc 180 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtgccgt atgataggtg ggtttggccg 240 gatgagttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 300 ctctccctgt ctccgggt 318 <210> 45 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Fcab FS18-7-88 CH3 domain <400> 45 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Trp Asp 1 5 10 15 Glu Pro Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Val Pro Glu 35 40 45 Leu Asn Val Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp Arg Trp Val Trp Pro 65 70 75 80 Asp Glu Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 100 105 <210> 46 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Fcab FS18-7-88 CH2 and CH3 domains, comprising LALA mutation <400> 46 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Trp Asp Glu Pro 115 120 125 Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Val Pro Glu Leu Asn 145 150 155 160 Val Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp Arg Trp Val Trp Pro Asp Glu 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 <210> 47 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Fcab FS18-7-88 CH2 and CH3 domains without LALA mutation <400> 47 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Trp Asp Glu Pro 115 120 125 Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Val Pro Glu Leu Asn 145 150 155 160 Val Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp Arg Trp Val Trp Pro Asp Glu 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FS18-7-95 CD loop <400> 48 Ser Asn Gly Tyr Gln Glu Asp Asn Tyr 1 5 <210> 49 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of Fcab FS18-7-95 CH3 domain <400> 49 ggccagcctc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cctgggatga gccgtggggt 60 gaagacgtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 120 tgggagagca atgggtatca ggaagataac tataagacca cgcctcccgt gctggactcc 180 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtgccgt atgataggtg ggtttggccg 240 gatgagttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 300 ctctccctgt ctccgggt 318 <210> 50 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Fcab FS18-7-95 CH3 domain <400> 50 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Trp Asp 1 5 10 15 Glu Pro Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Tyr Gln Glu 35 40 45 Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp Arg Trp Val Trp Pro 65 70 75 80 Asp Glu Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 100 105 <210> 51 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Fcab FS18-7-95 CH2 and CH3 domains, comprising LALA mutation <400> 51 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Trp Asp Glu Pro 115 120 125 Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Tyr Gln Glu Asp Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp Arg Trp Val Trp Pro Asp Glu 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 <210> 52 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Fcab FS18-7-95 CH2 and CH3 domains without LALA mutation <400> 52 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Trp Asp Glu Pro 115 120 125 Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Tyr Gln Glu Asp Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp Arg Trp Val Trp Pro Asp Glu 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 <210> 53 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the wild-type human IgG1 CH2 domain <400> 53 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 54 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the human IgG1 CH2 domain comprising the "LALA mutation" <400> 54 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 55 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of "wild-type" Fcab CH2 and CH3 domains without LALA mutation <400> 55 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 <210> 56 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of "wild-type" Fcab CH2 and CH3 domains, comprising LALA mutation <400> 56 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 <210> 57 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the human IgG1 hinge region <400> 57 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 58 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the human IgG1 truncated hinge region <400> 58 Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 <210> 59 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence anti-mouse LAG-3 Fcab FS18-7-108-29, comprising LALA mutation <400> 59 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val 1 5 10 15 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 20 25 30 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 35 40 45 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 65 70 75 80 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 85 90 95 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 100 105 110 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 115 120 125 Pro Ser Trp Asp Glu Pro Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Val Val Glu Trp Glu Ser Asn 145 150 155 160 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 165 170 175 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Phe Glu Arg 180 185 190 Trp Met Trp Pro Asp Glu Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 195 200 205 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220 <210> 60 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the anti-mouse LAG-3 Fcab FS18-7-108-29 without LALA mutation <400> 60 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 1 5 10 15 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 20 25 30 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 35 40 45 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 65 70 75 80 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 85 90 95 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 100 105 110 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 115 120 125 Pro Ser Trp Asp Glu Pro Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Val Val Glu Trp Glu Ser Asn 145 150 155 160 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 165 170 175 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Phe Glu Arg 180 185 190 Trp Met Trp Pro Asp Glu Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 195 200 205 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220 <210> 61 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the anti-mouse LAG-3 Fcab FS18-7-108-35, comprising LALA mutation <400> 61 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val 1 5 10 15 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 20 25 30 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 35 40 45 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 65 70 75 80 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 85 90 95 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 100 105 110 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 115 120 125 Pro Ser Trp Asp Glu Pro Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn 145 150 155 160 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 165 170 175 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Phe Glu Arg 180 185 190 Trp Met Trp Pro Asp Glu Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 195 200 205 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220 <210> 62 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the anti-mouse LAG-3 Fcab FS18-7-108-35 without LALA mutation <400> 62 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 1 5 10 15 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 20 25 30 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 35 40 45 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 65 70 75 80 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 85 90 95 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 100 105 110 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 115 120 125 Pro Ser Trp Asp Glu Pro Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn 145 150 155 160 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 165 170 175 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Phe Glu Arg 180 185 190 Trp Met Trp Pro Asp Glu Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 195 200 205 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220 <210> 63 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the heavy chain of anti-human LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-9/4420 comprising LALA mutation <400> 63 Glu Val Lys Leu Asp Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Pro Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Met Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Gly Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Trp Asp Glu Pro Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp 405 410 415 Arg Trp Val Trp Pro Asp Glu Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 64 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the heavy chain of anti-human LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-9/4420 without LALA mutation <400> 64 Glu Val Lys Leu Asp Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Pro Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Met Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Gly Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Trp Asp Glu Pro Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp 405 410 415 Arg Trp Val Trp Pro Asp Glu Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 65 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the heavy chain of anti-human LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-32/4420 comprising LALA mutation <400> 65 Glu Val Lys Leu Asp Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Pro Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Met Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Gly Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Trp Asp Glu Pro Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Glu Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp 405 410 415 Arg Trp Val Trp Pro Asp Glu Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 66 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the heavy chain of anti-human LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-32/without LALA mutation <400> 66 Glu Val Lys Leu Asp Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Pro Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Met Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Gly Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Trp Asp Glu Pro Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Glu Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp 405 410 415 Arg Trp Val Trp Pro Asp Glu Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 67 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the heavy chain of anti-human LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-33/4420 comprising LALA mutation <400> 67 Glu Val Lys Leu Asp Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Pro Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Met Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Gly Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Trp Asp Glu Pro Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp 405 410 415 Arg Trp Val Trp Pro Asp Glu Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 68 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the heavy chain of anti-human LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-33/4420 without LALA mutation <400> 68 Glu Val Lys Leu Asp Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Pro Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Met Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Gly Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr 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mutation <400> 71 Glu Val Lys Leu Asp Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Pro Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Met Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Gly Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn 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<223> Amino acid sequence of the heavy chain of anti-human LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-95/4420 comprising LALA mutation <400> 81 Glu Val Lys Leu Asp Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Pro Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Met Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Gly Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 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<223> Amino acid sequence of the anti-mouse LAG-3/PD-L1 mAb2 FS18-7-108-29/S1 with LALA mutation heavy chain <400> 117 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 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Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr 340 345 350 Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu 355 360 365 Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser 370 375 380 Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala 385 390 395 400 Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln 405 410 415 Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser 420 425 430 Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly 435 440 445 His Leu Leu Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Ser Leu Leu Leu Leu 450 455 460 Val Thr Gly Ala Phe Gly Phe His Leu Trp Arg Arg Gln Trp Arg Pro 465 470 475 480 Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu Gln Gly Ile His Pro Pro Gln Ala Gln 485 490 495 Ser Lys Ile Glu Glu Leu Glu Gln Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro 500 505 510 Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Gln Leu 515 520 525 <210> 127 <211> 521 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of mouse LAG-3 <400> 127 Met Arg Glu Asp Leu Leu Leu Gly Phe Leu Leu Leu Gly Leu Leu Trp 1 5 10 15 Glu Ala Pro Val Val Ser Ser Gly Pro Gly Lys Glu Leu Pro Val Val 20 25 30 Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Val His Leu Pro Cys Ser Leu Lys Ser 35 40 45 Pro Asn Leu Asp Pro Asn Phe Leu Arg Arg Gly Gly Val Ile Trp Gln 50 55 60 His Gln Pro Asp Ser Gly Gln Pro Thr Pro Ile Pro Ala Leu Asp Leu 65 70 75 80 His Gln Gly Met Pro Ser Pro Arg Gln Pro Ala Pro Gly Arg Tyr Thr 85 90 95 Val Leu Ser Val Ala Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly Arg Gln Pro Leu 100 105 110 His Pro His Val Gln Leu Glu Glu Arg Gly Leu Gln Arg Gly Asp Phe 115 120 125 Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Leu Arg Thr Asp Ala Gly Glu Tyr His 130 135 140 Ala Thr Val Arg Leu Pro Asn Arg Ala Leu Ser Cys Ser Leu Arg Leu 145 150 155 160 Arg Val Gly Gln Ala Ser Met Ile Ala Ser Pro Ser Gly Val Leu Lys 165 170 175 Leu Ser Asp Trp Val Leu Leu Asn Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg 180 185 190 Pro Val Ser Val His Trp Phe Gln Gly Gln Asn Arg Val Pro Val Tyr 195 200 205 Asn Ser Pro Arg His Phe Leu Ala Glu Thr Phe Leu Leu Leu Pro Gln 210 215 220 Val Ser Pro Leu Asp Ser Gly Thr Trp Gly Cys Val Leu Thr Tyr Arg 225 230 235 240 Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Thr Tyr Asn Leu Lys Val Leu Gly Leu 245 250 255 Glu Pro Val Ala Pro Leu Thr Val Tyr Ala Ala Glu Gly Ser Arg Val 260 265 270 Glu Leu Pro Cys His Leu Pro Pro Gly Val Gly Thr Pro Ser Leu Leu 275 280 285 Ile Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly Pro Glu Leu Pro Val Ala 290 295 300 Gly Lys Ser Gly Asn Phe Thr Leu His Leu Glu Ala Val Gly Leu Ala 305 310 315 320 Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys Ser Ile His Leu Gln Gly Gln Gln Leu 325 330 335 Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Val Ile Thr Val Thr Pro Lys Ser Phe 340 345 350 Gly Leu Pro Gly Ser Arg Gly Lys Leu Leu Cys Glu Val Thr Pro Ala 355 360 365 Ser Gly Lys Glu Arg Phe Val Trp Arg Pro Leu Asn Asn Leu Ser Arg 370 375 380 Ser Cys Pro Gly Pro Val Leu Glu Ile Gln Glu Ala Arg Leu Leu Ala 385 390 395 400 Glu Arg Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Glu Gly Gln Arg Leu Leu Gly Ala 405 410 415 Thr Val Tyr Ala Ala Glu Ser Ser Ser Gly Ala His Ser Ala Arg Arg 420 425 430 Ile Ser Gly Asp Leu Lys Gly Gly His Leu Val Leu Val Leu Ile Leu 435 440 445 Gly Ala Leu Ser Leu Phe Leu Leu Val Ala Gly Ala Phe Gly Phe His 450 455 460 Trp Trp Arg Lys Gln Leu Leu Leu Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu His 465 470 475 480 Gly Ile Gln Pro Phe Pro Ala Gln Arg Lys Ile Glu Glu Leu Glu Arg 485 490 495 Glu Leu Glu Thr Glu Met Gly Gln Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro 500 505 510 Gln Leu Glu Pro Glu Pro Arg Gln Leu 515 520 <210> 128 <211> 533 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of cynomolgus LAG-3 <400> 128 Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp 1 5 10 15 Val Ala Pro Val Lys Pro Pro Gln Pro Gly Ala Glu Ile Ser Val Val 20 25 30 Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile 35 40 45 Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln 50 55 60 His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Pro 65 70 75 80 Val Pro Gly His Arg Pro Ala Ala Pro Tyr Ser Trp Gly Pro Arg Pro 85 90 95 Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly 100 105 110 Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln 115 120 125 Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala 130 135 140 Gly Glu Tyr Arg Ala Thr Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys 145 150 155 160 Arg Leu Arg Leu Arg Val Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro 165 170 175 Gly Ser Leu Arg Thr Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser 180 185 190 Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Ser Arg Gly Gln 195 200 205 Gly Arg Val Pro Val Gln Gly Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser 210 215 220 Phe Leu Phe Leu Pro His Val Gly Pro Met Asp Ser Gly Leu Trp Gly 225 230 235 240 Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn 245 250 255 Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Ala Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala 260 265 270 Gly Ala Gly Ser Arg Val Glu Leu Pro Cys Arg Leu Pro Pro Ala Val 275 280 285 Gly Thr Gln Ser Phe Leu Thr Ala Lys 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Pro Glu Leu Glu Pro Glu Pro 500 505 510 Glu Leu Glu Arg Glu Leu Gly Pro Glu Pro Glu Pro Gly Pro Glu Pro 515 520 525 Glu Pro Glu Gln Leu 530 <210> 129 <211> 290 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of human PD-L1 <400> 129 Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu 1 5 10 15 Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr 20 25 30 Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu 35 40 45 Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile 50 55 60 Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser 65 70 75 80 Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn 85 90 95 Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr 100 105 110 Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val 115 120 125 Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val 130 135 140 Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr 145 150 155 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Glu Lys Glu Asp Glu Gln Val 50 55 60 Ile Gln Phe Val Ala Gly Glu Glu Asp Leu Lys Pro Gln His Ser Asn 65 70 75 80 Phe Arg Gly Arg Ala Ser Leu Pro Lys Asp Gln Leu Leu Lys Gly Asn 85 90 95 Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr 100 105 110 Cys Cys Ile Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Lys Val Asn Ala Pro Tyr Arg Lys Ile Asn Gln Arg Ile Ser Val Asp 130 135 140 Pro Ala Thr Ser Glu His Glu Leu Ile Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro 145 150 155 160 Glu Ala Glu Val Ile Trp Thr Asn Ser Asp His Gln Pro Val Ser Gly 165 170 175 Lys Arg Ser Val Thr Thr Ser Arg Thr Glu Gly Met Leu Leu Asn Val 180 185 190 Thr Ser Ser Leu Arg Val Asn Ala Thr Ala Asn Asp Val Phe Tyr Cys 195 200 205 Thr Phe Trp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asn His Thr Ala Glu Leu Ile 210 215 220 Ile Pro Glu Leu Pro Ala Thr His Pro Pro Gln Asn Arg Thr His Trp 225 230 235 240 Val Leu Leu Gly Ser Ile Leu Leu Phe Leu Ile Val Val Ser Thr Val 245 250 255 Leu Leu Phe Leu Arg Lys Gln Val Arg Met Leu Asp Val Glu Lys Cys 260 265 270 Gly Val Glu Asp Thr Ser Ser Lys Asn Arg Asn Asp Thr Gln Phe Glu 275 280 285 Glu Thr 290 <210> 131 <211> 290 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of cynomolgus PD-L1 <400> 131 Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Thr Ile Tyr Trp His Leu Leu 1 5 10 15 Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr 20 25 30 Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu 35 40 45 Asp Leu Thr Ser Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile 50 55 60 Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Asn 65 70 75 80 Tyr Arg Gln Arg Ala Gln Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn 85 90 95 Ala Ala Leu Arg Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr 100 105 110 Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val 115 120 125 Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val 130 135 140 Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr 145 150 155 160 Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser 165 170 175 Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Leu Asn 180 185 190 Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Ala Asn Glu Ile Phe Tyr 195 200 205 Cys Ile Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu 210 215 220 Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala Leu Pro Pro Asn Glu Arg Thr His 225 230 235 240 Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Phe Leu Leu Leu Gly Val Ala Leu Thr 245 250 255 Phe Ile Phe Tyr Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Met Lys Lys Cys 260 265 270 Gly Ile Arg Val Thr Asn Ser Lys Lys Gln Arg Asp Thr Gln Leu Glu 275 280 285 Glu Thr 290 <210> 132 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the heavy chain of anti-mouse LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-108-29/4420 comprising LALA mutation <400> 132 Glu Val Lys Leu Asp Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Pro Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Met Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Gly Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 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Amino acid sequence of the heavy chain of anti-mouse LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-108-35/4420 comprising LALA mutation <400> 133 Glu Val Lys Leu Asp Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Pro Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Met Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Gly Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Trp Asp Glu Pro Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 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330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Trp Asp Glu Pro Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Val Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Phe Glu 405 410 415 Arg Trp Met Trp Pro Asp Glu Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 135 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Fcab FS18-7-9 CH3 domain comprising C-terminal lysine <400> 135 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Trp Asp 1 5 10 15 Glu Pro Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp Arg Trp Val Trp Pro 65 70 75 80 Asp Glu Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 136 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequences of the CDRs of anti-PD-L1 antibody 84G09 (according to Kabat) HCDR1 <400> 136 Asp Tyr Ala Met His 1 5 <210> 137 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequences of the CDRs of anti-PD-L1 antibody 84G09 (according to Kabat) HCDR2 <400> 137 Gly Ile Ser Trp Lys Ser Asn Ile Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 138 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequences of the CDRs of anti-PD-L1 antibody 84G09 (according to Kabat) HCDR3 <400> 138 Asp Ile Thr Gly Ser Gly Ser Tyr Gly Trp Phe Asp Pro 1 5 10 <210> 139 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequences of the CDRs of anti-PD-L1 antibody 84G09 (according to Kabat) LCDR1 <400> 139 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 140 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequences of the CDRs of anti-PD-L1 antibody 84G09 (according to Kabat) LCDR2 <400> 140 Val Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 141 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequences of the CDRs of anti-PD-L1 antibody 84G09 (according to Kabat) LCDR3 <400> 141 Gln Gln Ser Tyr Ser Asn Pro Ile Thr 1 5 <210> 142 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHO codon optimised nucleotide sequence of Fcab FS18-7-9 CH3 domain <400> 142 ggccagcccc gggaacccca ggtgtacaca ctgcctccat cctgggatga gccctggggc 60 gaggatgtgt ctctgacctg tctcgtgaaa ggcttctacc cctccgatat cgccgtggaa 120 tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggactcc 180 gacggctcat tcttcctgta cagcaagctg acagtgccct acgacagatg ggtgtggccc 240 gacgagttct cctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 300 ctgtccctga gccccggc 318

Claims (25)

  1. 예정사-리간드 1 (programmed death-ligand 1: PD-L1) 및 림프구-활성화 유전자 3 (lymphocyte-activation gene 3: LAG-3)에 결합하는 항체 분자로서, 상기 항체 분자는 하기를 포함하는 것인, 항체 분자:
    (i) PD-L1에 대한 상보성 결정 영역(CDR)-기반 항원-결합 부위; 및
    (ii) 상기 항체 분자의 CH3 도메인에 위치한 LAG-3 항원-결합 부위로서, 여기서, LAG-3 항원-결합 부위는 아미노산 서열 WDEPWGED (서열번호 1) 및 PYDRWVWPDE (서열번호 3)를 포함하고, 상기 아미노산 서열 WDEPWGED는 상기 CH3 도메인의 AB 구조적 루프에 위치하고, 상기 아미노산 서열 PYDRWVWPDE는 상기 CH3 도메인의 EF 구조적 루프에 위치하는, LAG-3 항원-결합 부위.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 LAG-3 항원-결합 부위는 CH3 도메인의 CD 루프에 하기의 서열 중 하나를 추가로 포함하는 것인, 항체 분자:
    (i) SNGQPENNY (서열번호 2, 8 및 18);
    (ii) SNGQPEDNY (서열번호 13);
    (iii) SNGYPEIEF (서열번호 23);
    (iv) SNGIPEWNY (서열번호 28);
    (v) SNGYAEYNY (서열번호 33);
    (vi) SNGYKEENY (서열번호 38);
    (vii) SNGVPELNV (서열번호 43); 또는
    (viii) SNGYQEDNY (서열번호 48).
  3. 제2항에 있어서,
    상기 LAG-3 항원-결합 부위는 CH3 도메인의 CD 루프에 서열번호 2로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항체 분자.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 항체 분자는 면역글로불린 G1 (IgG1) 분자인 것인, 항체 분자.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 항체 분자는 서열번호 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50으로 제시된 CH3 도메인을 포함하는 것인, 항체 분자.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 항체 분자의 CH3 도메인 서열은 서열번호 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50으로 나타낸 서열의 C-말단 바로 (immediate C-terminus)에 리신 잔기 (K)를 추가로 포함하는 것인, 항체 분자.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 항체 분자는 서열번호 5로 제시된 CH3 도메인을 포함하는 것인, 항체 분자.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 항체 분자는 CH2 도메인을 포함하고, 상기 CH2 도메인은 서열번호 53 또는 서열번호 54로 제시된 서열을 갖는 것인, 항체 분자.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 항체 분자는 서열번호 6, 7, 11, 12, 16, 17, 21, 22, 26, 27, 31, 32, 36, 37, 41, 42, 46, 47, 51 또는 52로 제시된 서열을 포함하는 것인, 항체 분자.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 항체 분자는 서열번호 6 또는 7로 제시된 서열을 포함하는 것인, 항체 분자.
  11. 제1항에 있어서, 하기를 포함하는 항체 분자:
    (i) 서열번호 86 내지 91로 제시된 CDR로서, 여기서 CDR은 ImMunoGeneTics (IMGT) 넘버링 방식에 따라 정의되는 CDR; 및/또는
    (ii) 서열번호 136 내지 141로 제시된 CDR로서, 여기서 CDR은 카밧 (Kabat) 넘버링 방식에 따라 정의되는 CDR.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 항체 분자는 서열번호 92으로 제시된 VH 도메인, 서열번호 93으로 제시된 VL 도메인, 또는 이들 둘 다를 포함하는 것인, 항체 분자.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 항체 분자는 서열번호 94 내지 113 중 어느 하나에 제시된 중쇄 서열을 포함하는 것인, 항체 분자.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 항체 분자는 서열번호 94 또는 95로 제시된 중쇄 서열을 포함하는 것인, 항체 분자.
  15. 제11항에 있어서,
    상기 항체 분자는 서열번호 116으로 제시된 경쇄 서열을 포함하는 것인, 항체 분자.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 항체 분자는 서열번호 116으로 제시된 경쇄 서열을 포함하는 것인, 항체 분자.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 항체 분자는 서열번호 94로 제시된 중쇄 서열을 포함하는 것인, 항체 분자.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 중쇄의 CH3 도메인 서열이 서열번호 135로 제시된 서열을 갖는 것인, 항체 분자.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자를 인코딩하는 핵산, 또는 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터.
  20. 제19항의 핵산 또는 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
  21. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자의 생산 방법으로서,
    상기 항체 분자를 인코딩하는 핵산 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를, 상기 항체 분자의 생산을 위한 조건하에서 배양하는 단계를 포함하고,
    임의로 상기 항체 분자를 단리, 정제, 또는 단리 및 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 생산 방법.
  22. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  23. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자를 포함하는, 환자에서 암을 치료하기 위한 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 암이 흑색종, 결장직장암, 유방암, 방광암, 신세포 암종, 위암, 두경부암, 두경부 편평세포 암종, 중피종, 폐암, 비-소세포 폐암, 난소암, 메르켈 세포 암종, 췌장암, 간세포 암종, 자궁경부암, 비-호지킨 림프종, 및 미만성 거대 B-세포 림프종으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 암이 두경부 편평세포 암종, 비-소세포 폐암, 또는 미만성 거대 B-세포 림프종인, 조성물.
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