CN110950966B

CN110950966B - 融合蛋白、编码核酸和细胞及用途

Info

Publication number: CN110950966B
Application number: CN201911280688.2A
Authority: CN
Inventors: 蒋俊; 林鑫; 谢桦函
Original assignee: Qichensheng Biotechnology Zhuhai Co ltd
Current assignee: Qichensheng Biotechnology Zhuhai Co ltd
Priority date: 2019-12-13
Filing date: 2019-12-13
Publication date: 2020-12-11
Anticipated expiration: 2039-12-13
Also published as: CN110950966A

Abstract

本发明公开一种融合蛋白、编码核酸和细胞及用途。本发明的融合蛋白包含作为第一部分的可溶性免疫球蛋白CD223和作为第二部分的可溶性程序死亡受体1。其中，第一部分通过连接子共价连接至第二部分。本发明的融合蛋白具有特定“Y”型结构，能够使第一部分和第二部分的功能协同作用，既能够阻断PD‑1信号通路，又同时可以阻断LAG3信号通路，从而可以有效地解除PD‑1/LAG3信号通路活化后对T细胞的抑制，显著增强T细胞的抗肿瘤功能。

Description

融合蛋白、编码核酸和细胞及用途

技术领域

本发明涉及免疫学以及医药领域，具体地涉及用于封闭肿瘤细胞免疫抑制位点的融合蛋白、其编码核酸，和含有此类融合蛋白或核酸的细胞以及作为免疫抑制剂在解除免疫抑制中的用途。

背景技术

自2015年首个PD-1抗体药物上市以来，该类药物体现出了出色的安全性和有效性，目前以PD-1、PDL-1为基础的联合用药成为肿瘤治疗新方向，一些已开展的临床联合用药研究也已获得令人振奋的数据，越来越多的人对免疫检查点联合用药抱有信心。

PD-1抑制剂包括PD-1抗体和PD-L1抗体，是一种肿瘤免疫治疗新药。不同于手术、放化疗和靶向药，PD-1抑制剂本身并不能直接杀伤癌细胞，而是通过激活病人自身的免疫系统来抗癌。PD-1抑制剂2006年开始做第一项临床试验，2014年9月正式上市，此后接连被《Science》、美国临床肿瘤学会评选为年度最大进展，PD-1抑制剂的发明人也已经获得了被誉为诺贝尔医学奖风向标之称的拉斯克医学奖，2018年诺贝尔医学奖就颁给了PD-1研究者。

截止到目前，已有5种PD-1抑制剂在欧美几十个国家上市，包括2种PD-1抗体和3种PD-L1抗体。分别是：Nivolumab（商品名Opdivo，简称O药）、Pembrolizumab（商品名Keytruda，简称K药）、Atezolizumab（商品名Tecentriq，简称T药）、Avelumab（商品名Bavencio，简称B药）和Durvalumab（商品名Imfinzi，简称I药）。现在国内获批上市，分别是：Nivolumab（商品名Opdivo，简称O药）、Pembrolizumab（商品名Keytruda，简称K药）、信达公司的信迪利单抗(达伯舒)和君实生物的特瑞普利单抗（拓益）。此外，还有恒瑞、百济等多个国产的PD-1抑制剂，正在开展临床试验，排队上市。

在绝大多数肿瘤中，PD-1抑制剂单独使用的有效率约在10%-30%，目前已经观察到30%左右的患者，出现了疾病的耐药。总体的副作用远小于传统的放化疗。最常见的副作用是“流感”样的表现，例如发热、乏力、头晕、全身肌肉酸痛、嗜睡等，发生率在30%左右，对症处理即可。此外，大约5%-10%的患者，会出现严重的免疫相关的炎症反应。例如甲状腺炎症（表现为甲亢、甲减、或先甲亢后甲减）、免疫性肺炎、免疫性肠炎和免疫性肝炎，甚至免疫性心肌炎。免疫性炎症如果发现不及时，处理不到位，偶尔发生致命的事故。为了进一步提高且有效率的联合治疗是亟待解决的问题。

目前已公开了使用CD223与PD1抑制剂联合用药的报道及临床研究。CD223的单抗与其它免疫检查点抑制剂（如PD-1单抗）的联合使用越来越受到关注和重视，目前20项NIH在册针对CD223的临床试验中就有13项与PD-1抑制剂联用。但是这些报道或研究均为两种药物的组合物形式。例如，已公开了使用以CD223为靶点的药物与Pembrolizumab(PD-1单抗)I期临床剂量递增治疗不可切除或转移性黑色素瘤，50%患者肿瘤减小，其中包括1例确认完全缓解，改病历曾接受过Pembrolizumab单独治疗，但疾病进展缓慢。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，发明人利用高通量筛选技术，在对改造后的大量重组蛋白进行筛选后，发现通过连接子使作为第一部分的可溶性免疫球蛋白CD223和作为第二部分的可溶性程序死亡受体1共价连接，得到的具有“Y”型结构的融合蛋白能够协同作用，同时调节多个通路，可以有效地解除PD-1/LAG3信号通路活化后对T细胞的抑制，显著增强T细胞的抗肿瘤功能。至少部分地基于上述发现完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种融合蛋白，其包含作为第一部分的可溶性免疫球蛋白CD223和作为第二部分的可溶性程序死亡受体1，其中，所述第一部分通过连接子共价连接至所述第二部分。

根据本发明的融合蛋白，优选地，所述第一部分包含SEQ ID No. 1所示的序列，所述第二部分包含SEQ ID No.2所示的序列。

根据本发明的融合蛋白，优选地，所述第一部分为免疫球蛋白类CD223的胞外结构域，所述第二部分为程序死亡受体1的胞外结构域。

根据本发明的融合蛋白，优选地，所述免疫球蛋白CD223的胞外结构域包含选自由Y77F、R88A、D109E和R115A组成的组中的至少一种点突变。

根据本发明的融合蛋白，优选地，所述连接子包含第一弹性区、第二弹性区和位于所述第一弹性区和所述第二弹性区之间的回转区。

根据本发明的融合蛋白，优选地，所述第一弹性区和所述第二弹性区分别具有SEQID No.3所示的序列。

根据本发明的融合蛋白，优选地，所述回转区具有SEQ ID No.4所示的序列。

本发明的第二方面，提供一种核酸，其包含编码第一方面所述的融合蛋白。

本发明的第三方面，提供一种细胞，其包含根据第一方面所述的融合蛋白，或包含第二方面所述的核酸。

本发明的第四方面，提供第一方面所述的融合蛋白在制备免疫抑制剂中的用途。

本发明得到的具有“Y”型结构的融合蛋白能够使第一部分和第二部分之间的功能协同作用，同时调节多个通路，可以有效地解除PD-1/LAG3信号通路活化后对T细胞的抑制，显著增强T细胞的抗肿瘤功能。在某些实施方案中，通过在第一部分中设计突变，降低了CD223对MHC II的亲和力，阻断了其对MHC II的结合。

附图说明

图1 为使用编码本发明一种示例性融合蛋白的mRNA转染DC细胞后，流式细胞仪对转染效率的测定结果。

图2为使用编码本发明一种示例性蛋白的mRNA转染DC细胞后，DC细胞表型的检测结果。

图3为ELISA检测上清中蛋白浓度的结果图。

图4为使用编码本发明一种示例性融合蛋白的mRNA以及抗原mRNA转染DC细胞后，在体外致敏T细胞的实验中CD8 T细胞免疫应答结果。在图的每组柱中，从左到向依次为CD8IFN-γ+；CD8 TNF-α+，IFN-γ+；CD8 TNF-α+。其中，CD223+PD1表示融合蛋白。

图5为使用编码本发明一种示例性融合蛋白的mRNA以及抗原mRNA转染DC细胞后，在体外致敏T细胞的实验中CD4 T细胞免疫应答结果。在图的每组柱中，从左到向依次为CD4IFN-γ+；CD4 TNF-α+，IFN-γ+；CD4 TNF-α+。其中，CD223+PD1表示融合蛋白。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

本发明中，术语“核酸”包括脱氧核糖核酸(即DNA)和核糖核酸(即RNA)。在RNA的情况下，为了防止RNA的不稳定性和多种途径的降解，根据已知的RNA多种天然降解途径，可以对核酸分子进行多种优化。例如，末端结构对mRNA的稳定是至关重要的。比如，在天然存在的mRNA的5’端，存在有修饰的鸟苷核苷酸，称之为5’帽子结构，并且3’端有一段长约150-300个碱基的腺苷核苷酸(即多聚A尾巴)结构，例如150-200个，220-270个等，5’和3’端的UTR序列，比如人的beta-球蛋白的UTR序列。

[融合蛋白]

本发明的第一方面，提供一种融合蛋白，其包含作为第一部分的可溶性免疫球蛋白类CD223和作为第二部分的可溶性程序死亡受体1，其中，所述第一部分通过连接子共价连接至所述第二部分。

本发明的融合蛋白中，第一部分为可溶性CD223，其中CD223是免疫球蛋白类超家族一员。本发明的第一部分为源自CD223的可溶性片段。优选地，可溶性CD223为CD223蛋白的胞外结构域(或称胞外区)，其包含D1、D2、D3和D4四部分。更优选地，可溶性CD223仅包含D1和D2，而不包含D3和D4两部分。在某些实施方案中，本发明的可溶性CD223中包含至少一种突变，从而降低CD223分子与MHC II的亲和力。此类突变的实例包括但不限于Y77F、R88A、D109E和R115A等。本发明的可溶性CD223中可包含上述突变中的一种或多种。这些突变降低了CD223对MHCII的亲和力，阻断了其对MHC II的结合。在某些实施方案中，本发明的可溶性免疫球蛋白CD223包含SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，其包含Y77F突变。优选地，在SEQ IDNo.1所示氨基酸序列的N端进一步包含MWEAQFLGLLFLQPLWVAPVKP的序列，从而增强其胞外表达。本领域技术人员已知，可溶性免疫球蛋白CD223也可包含由SEQ ID No.1衍生的序列。此类衍生的序列的实例包括但不限于突变体和同源序列。同源序列是指与SEQ ID No.3的同源性为95%以上，优选98%以上，更优选99%以上的序列且来源于同一物种的序列。在示例性实施方案中，本发明的可溶性免疫球蛋白CD223由SEQ ID No.6所示的核酸序列得到。

本发明的融合蛋白中，第二部分为可溶性程序性死亡受体1(本文有时也简称为“sPD-1”或“可溶性PD1”)，是指源自程序性死亡受体1的功能片段。此处的“功能”是指与程序性死亡受体1的配体结合而不能进行信号转导的功能。本发明发现当将sPD-1与可溶性CD223融合时，可大大增强解除T细胞的耗竭以及凋亡的功能。本发明的sPD-1优选为PD1蛋白的胞外结构域(即，胞外区)。更优选地，本发明的第二部分的序列包含SEQ ID No.2所示的序列。还优选地，进一步包含其他序列以增强原有性能或增加新功能。例如，在SEQ IDNo.2所示序列的N端进一步包含MQIPQAPWPVVWAVLQLGWR，从而增强其胞外分泌性能。在某些实施方案中，本发明的第二部分由SEQ ID No.7所示的序列编码得到。

本发明的融合蛋白还包含位于第一部分和第二部分之间的连接子。连接子的功能在于使第一部分和第二部分单独发挥各自功能。优选地，本发明的连接子包含第一弹性区、第二弹性区和位于两者之间的回转区。本发明发现具有这三种区域结构的连接子，不仅可以使第一部分和第二部分单独发挥各自功能，而且还会大大促进第一部分和第二部分的协同作用，这是意料不到。

本发明中，第一弹性区和第二弹性区有时统称为弹性区。弹性区为由多个氨基酸通过肽键组成的具有弹性或扭转的短序列。一般而言，弹性区不形成α螺旋。优选地，弹性区包含半胱氨酸，从而使弹性区之间形成二硫键。为了能有效形成二硫键，弹性区的长度一般应控制为10-20个氨基酸长度。在示例性实施方案中，本发明的第一弹性区和第二弹性区各自分别包含SEQ ID No.3所示的序列。

本发明的连接子中的回转区为能够形成弯曲结构的氨基酸序列。优选地，回转区还具有其他功能，例如增强融合蛋白稳定性的序列，其实例包括SEQ ID No.4所示的序列。回转区可以包含一个SEQ ID No.4所示的序列，也可以包含两个以上SEQ ID No.4所示的序列。

本发明中，第一部分、连接子和第二部分之间优选通过共价键连接，从而形成融合蛋白。优选地，连接子之间可进一步形成二硫键，从而使融合蛋白具有“Y”型结构。本发明的融合蛋白的“Y”型结构使第一部分和第二部分的功能具有协同作用。

[核酸]

本发明的第二方面，提供一种核酸，其为用于产生得到本发明的融合蛋白的核酸。本发明的核酸包含编码融合蛋白的基因，可选地，进一步包含与其可操作连接的操作子。例如，启动子、增强子等。优选地，本发明的核酸还包含编码其他功能区的序列。例如，编码信号肽的序列等。在某些实施方案中，本发明的核酸包含SEQ ID No.5所示的序列。

[细胞]

本发明的第三方面，提供一种细胞，其包含第一方面所述的融合蛋白，或第二方面所述的核酸，从而能够用于产生第一方面所述的融合蛋白。

本发明的细胞类型不特别限定，包括原核细胞，例如大肠杆菌等细菌细胞，还包括动物和植物细胞等真核细胞。本发明优选为动物细胞和人源细胞。

在某些实施方案中，本发明的细胞为抗原递呈细胞。通过基因工程手段使本发明的抗原递呈细胞包含第一方面所述的融合蛋白或能够产生该融合蛋白。本发明的抗原递呈细胞是指机体内具有摄取、处理和传递抗原信息，并将抗原递呈给免疫细胞并辅助和调节T细胞、B细胞识别抗原并诱发免疫应答作用的细胞。其实例包括但不限于巨噬细胞、树突状细胞、并指状细胞、郎罕细胞和B细胞。优选地，本发明的免疫细胞为树突状细胞，更优选为人源树突细胞。本发明的树突细胞可以是成熟的树突细胞，也可以是未成熟的树突细胞。需要注意的是，这里的树突状细胞为通过体外诱导培养获得，即，从外周血单核细胞(PBMC)中分离出单个核细胞，在不同类型培养基和各类细胞因子的刺激下诱导单个核细胞成为DC细胞。在某些实施方案中，进行体外培养所使用的培养基包括AIM-V培养基、iDC培养基和mDC培养基，进行体外诱导培养的使用的细胞因子包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-4。

优选地，本发明的抗原递呈细胞进一步包含抗原或其编码核酸。“抗原”指可以被免疫系统识别，并能够通过形成抗体或/和抗原特异性T细胞而引起抗原特异的免疫应答的物质。一般地，抗原可以是包含至少一个抗原表位，由抗原递呈细胞(APC)捕获，并且可以被呈递到T细胞表面的蛋白或者多肽。在本发明中，抗原可以是mRNA翻译的产物，也可以是DNA转录翻译后的产物。在某些实施方案中，本发明的抗原为肝细胞癌抗原，例如GPC3抗原。

本发明的细胞的制备方法不特定限定。在示例性制备方法中，本发明的细胞的制备方法包括以下步骤：

(1) 构建能够产生融合蛋白的核酸；

(2) 从静脉血中分离得到外周血单核细胞，并诱导分化得到抗原递呈细胞；和

(3) 将步骤(1)的核酸引入步骤(2)的抗原递呈细胞，并在适于所述核酸表达的条件下培养所述抗原递呈细胞。

在某些实施方案中，本发明的方法包括制备包含编码相应DNA的质粒。之后进行体外转录过程，首先使用限制性内切酶将质粒线性化，以线性化的质粒为模板，使用T7 RNA聚合酶体外转录制备核糖核酸分子。最后进行抗原递呈细胞的体外诱导培养和转染表达过程。

[用途]

本发明的第四方面，提供融合蛋白的用途，包括在制备免疫抑制剂中的用途。

本发明的用途中，免疫抑制剂是指具有下述活性或药效的成分、细胞或组合物：

(1)促进CD8 T细胞产生IFN-γ和/或TNF-α；

(2)促进CD4 T细胞产生IFN-γ和/或TNF-α；

(3) 封闭肿瘤细胞的免疫抑制位点；或

(4) 解除肿瘤细胞的免疫抑制功能。

实施例1

本制备例为制备一种示例性融合蛋白的方法。

1. 制备DNA和mRNA构建体

构建用于产生编码本发明一种示例性融合蛋白的基因，其序列如SEQ ID No. 5所示。另外，进一步构建用于产生作为对照的单独的可溶性免疫球蛋白CD223和可溶性程序性死亡受体1的基因，其序列分别如SEQ ID No.6和7所示。此外，在后续实验中使用的抗原GPC3由SEQ ID No. 8所示的序列编码得到。这些序列信息如下表1所示。

表-1DNA序列表

2. 体外转录

首先使用限制性内切酶将制备得到的相应DNA质粒线性化，以线性化的质粒为模板，使用T7 RNA聚合酶体外转录制备mRNA。然后用氯化锂沉淀法纯化制备的mRNA。

3. 细胞转染

3.1 DC细胞的体外诱导培养

无菌抽取健康人静脉血50ml，在超净工作台内用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞，将单核细胞加入AIM-V培养基中，放入37℃，5% CO₂培养箱中温育，使单核细胞贴壁。2h后，去掉未贴壁细胞，贴壁细胞加入iDC培养基(AIM-V培养基中加入终浓度为800U/mL的GM-CSF，500U/mL的IL-4)，放入37℃，5%CO₂培养箱中培养6天。将一半细胞培养基转移到离心管中，500g离心收集细胞，去掉上清，加入等体积的新鲜mDC培养基(mDC新鲜培养基的配置：AIM-V培养基中加入终浓度为1600U/mL的GM-CSF和1000U/mL的IL-4，TNF-α(5 ng/ml)，IL-1β(5 ng/ml)，IL-6(150 ng/ml)和prostaglandin E2(PGE2)(1μg/ml)，重悬细胞后，加入到培养瓶中，培养8-18个小时，诱导DC细胞成熟。

3.2融合蛋白基因转染DC细胞

转染当天，用非酶类的细胞消化试剂把DC细胞消化成细胞悬液，离心后以PBS洗细胞两次，以PBS重悬细胞，调整细胞密度在25-30×10⁶ DCs/ml。按照每10⁶ DC细胞转染5μgmRNA的比例，混合DC细胞和抗原mRNA与不同的mRNA组合，将细胞-mRNA混合物加入电转杯，使用ECM630电转仪，将抗原mRNA转染到DC细胞中。电转后的细胞，用无细胞因子的AIM-V培养基中重悬，调整细胞密度到1×10⁶DCs/ml，以每孔200μl的体积种到96孔细胞培养板中，放入37℃，5% CO₂细胞培养箱中继续培养。以同样的条件转染GFP mRNA到DC细胞中，作为对照组。

3.3转染效率的测定

转染24小时后，以流式细胞仪分析表达绿色荧光蛋白的DC细胞占所有DC细胞的比例，如图1所示，转染24小时后，GFP阳性DC细胞比例为69.9%，说明mRNA成功转染到DC细胞中。

3.4融合蛋白的表达检测

转染24小时后，收集细胞上清，使用ELISA试剂盒分别检测上清中的各蛋白的浓度。如图2结果所示，本发明描述的编码可溶性蛋白的mRNA，在DC细胞中能够表达较高水平的目的蛋白。

3.5DC细胞表型的鉴定

应用直接免疫荧光标记法，将转染DC细胞离心，用FACS buffer（含2%FBS的PBS溶液)重悬DC细胞，细胞浓度为1×10⁶cells/ml，取100μl转染DC细胞悬液加入流式细胞管，分别加入5μl相应的检测CD80、CD83、CD86的流式抗体，以及相应的同型对照。4℃避光染色30min。每管加入3ml FACS Buffer洗细胞，弃上清，加入500μl FACS buffer，流式分析检测CD80、CD83、CD86的表达。结果如图3所示，与未转染的DC细胞相比，转染了融合蛋白的DC细胞，其表面DC细胞标志物CD80、CD83、CD86稳定表达，没有明显的差异。

实施例2

除了将实施例1中的抗原变为AFP以外，以与实施例1相同的方式进行实验。结果如下表所示。

	T 细胞对照组	mDC对照	AFP 组	AFP + PD-1 组	AFP + CD223组	AFP +CD223-PD-1组
							CD8 IFN-r+	0.049	0.026	0.029	0.064	0.248	0.46
CD8 TNF-a+	0.049	0	0	0.021	0.262	0.236
							CD8 TNF-a+, IFN-r+	0.049	0	0	0	0.18	0.15
CD4 IFN-r+	0.3	0.027	0	0.24	0.165	0.64
							CD4 TNF-a+	0.201	0.28	0.27	0.35	0.37	1
CD4 TNF-a+,IFN-r+	0.15	0	0	0.13	0.14	0.14

测试例

本测试例用于研究本发明的融合蛋白对T细胞应答的影响。

1.DC细胞的体外诱导培养

无菌抽取健康人静脉血50ml，在超净工作台内用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞，将单核细胞加入AIM-V培养基中，放入37℃，5% CO₂培养箱中温育，使单核细胞贴壁。2h后，去掉未贴壁细胞，贴壁细胞加入iDC培养基(AIM-V培养基中加入终浓度为800U/mL的GM-CSF，500U/mL的IL-4)，放入37℃，5% CO₂培养箱中培养6天。将一半细胞培养基转移到离心管中，500g离心收集细胞，去掉上清，加入等体积的新鲜mDC培养基(mDC新鲜培养基的配置：AIM-V培养基中加入终浓度为1600U/mL的GM-CSF和1000U/mL的IL-4，TNF-α(5 ng/ml)，IL-1β(5 ng/ml)，IL-6(150 ng/ml)和prostaglandin E2(PGE2)(1μg/ml)，重悬细胞后，加入到培养瓶中，培养8-18个小时，诱导DC细胞成熟。

2. 转染DC细胞

转染当天，用非酶类的细胞消化试剂把DC细胞消化成细胞悬液，离心后以PBS洗细胞两次，以PBS重悬细胞，调整细胞密度在25-30×10⁶ DCs/ml。按照每10⁶ DC细胞转染5μg抗原 mRNA和3μg融合蛋白mRNA的比例，混合DC细胞和抗原mRNA与不同蛋白的mRNA组合，将细胞-mRNA混合物加入电转杯，使用ECM630电转仪，将抗原mRNA转染到DC细胞中。电转后的细胞，用无细胞因子的1640培养基中重悬，调整细胞密度到2×10⁵ DCs/ml，放入37℃，5%CO₂细胞培养箱中继续培养6小时。本实验中，使用的mRNA组合如下所述：

1)不加任何mRNA的对照(mDC对照组)

2)只加编码GPC3抗原的mRNA(GPC3对照组)

3) 编码GPC3抗原的mRNA与PD1的mRNA(PD1组)

4) 编码GPC3抗原的mRNA与CD223的mRNA(CD223组)

5) 编码GPC3抗原的mRNA与融合蛋白的mRNA(实验组)

3. 将复苏过夜的外周血单核细胞PBMC以2×10⁶/ml的浓度接种到96孔板中，每个孔接种100μl细胞，进行T淋巴细胞的激活。测试分组情况为：不加DC细胞的PBMC对照组，分别用上一步骤中所述五个分组的DC细胞与PBMC细胞共培养的组；根据分组情况在不同孔中加入负载有相应mRNA的DC细胞，PBMC:DC=10:1；将细胞于37℃培养10-12天。

4. 在共培养的10-12天，进行胞内细胞因子检测。

在收集细胞前5-8h，将培养的T细胞混匀，调整细胞密度到2×10⁶/ml,按照每个孔100μl的体积分别种到96孔板中，于37°C培养箱中孵育。阳性对照为PMA(50ng/ml)+ionomycin (1μg/ml)，阴性对照仅含悬浮细胞。

准备负载抗原的DC细胞作为靶细胞。复苏已经制备的负载抗原的冻存的DC细胞，并用台盼蓝染色计数细胞，用含IL-7及IL-2细胞因子的RPMI完全培养基重悬细胞，并调整细胞浓度为2×10⁵/ml，每孔加入100µl细胞。

在细胞培养液中加入终浓度为2µM Monensin或3µg/ml Brefeldin A，充分混匀。Monensin和Brefeldin A作为蛋白运输的阻断剂，在细胞液中的时间不应超过12h，4-6小时后，进行胞内染色检测。

5. 取出细胞，将细胞转移到相应的流式管中，以荧光标记的CD3、CD4、CD8抗体染色细胞后，固定并通透细胞，以荧光标记的TNF-α和IFN-γ抗体进行胞内染色。

6. 用流式细胞仪检测淋巴细胞中TNF-α+和IFN-γ+细胞的比例。

所得结果如图4及图5所示。在体外致敏实验中，本发明的融合蛋白能够显著提高抗原呈递细胞DC细胞致敏T细胞的功能。如图5所示，如使用只转染了GPC3抗原mRNA的DC细胞致敏T细胞，仅仅有0.049%的CD4+ T细胞被诱导出INF-γ阳性反应，TNF-α阳性细胞的比例仅仅为0.254%，双阳性CD4 T细胞的比例为0.014%。而在转染了本发明融合蛋白的组中，有0.5%的CD4 T细胞被诱导出INF-γ阳性反应，TNF-α阳性细胞的比例为1.31%，双阳性CD4T细胞的比例为0.29%，分别提高了10.2、5.2以及20.7倍。在转染了可溶性PD1和可溶性CD223的组中，TNF-α以及IFN-γ阳性细胞在CD4细胞中的比例，比转染了GPC3抗原的组均有显著提高，但均显著低于使用了本发明所述实验组。

同样地，在CD8 T细胞中，如图4所示，使用只转染了GPC3抗原mRNA的DC细胞致敏T细胞，仅仅有0.025%的CD8 T细胞被诱导出INF-γ阳性反应，TNF-α阳性细胞的比例仅仅为0.0236%，双阳性CD8T细胞的比例为0.006%。而使用转染了本发明所述的融合蛋白与GPC3抗原mRNA的DC细胞致敏T细胞，有1.04%的CD8 T细胞被诱导出INF-γ阳性反应，TNF-α阳性细胞的比例为2.25%，双阳性CD8T细胞的比例为0.85%，分别提高了41.6、95以及141.7倍。而转染了GPC3抗原mRNA与可溶性PD1或者可溶性CD223的组中，CD8 T细胞中INF-γ阳性细胞比例分别为0.17%和0.169%，TNF-α阳性细胞比例分别为0.34%和0.33%，TNF-α和IFN-γ双阳性细胞比例分别为0.16%和0.17%，比只转染了GPC3抗原mRNA的组有明显提高，但均远远低于使用了本发明的实验组。

尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

序列表

<110> 启辰生生物科技（珠海）有限公司

<120> 融合蛋白、编码核酸和细胞及用途

<141> 2019-12-13

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 242

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val Trp Ala Gln Glu Gly Ala

1 5 10 15

Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile Pro Leu Gln Asp Leu Ser

20 25 30

Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln His Gln Pro Asp Ser Gly

35 40 45

Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Pro

50 55 60

Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro Arg Arg Phe Thr Val Leu

65 70 75 80

Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly Arg Leu Pro Leu Gln Pro

85 90 95

Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln Arg Gly Asp Phe Ser Leu

100 105 110

Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala Gly Glu Tyr Arg Ala Ala

115 120 125

Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys Arg Leu Arg Leu Arg Leu

130 135 140

Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro Gly Ser Leu Arg Ala Ser

145 150 155 160

Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg Pro Ala

165 170 175

Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln Gly Arg Val Pro Val Arg

180 185 190

Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser Phe Leu Phe Leu Pro Gln

195 200 205

Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly Cys Ile Leu Thr Tyr Arg

210 215 220

Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn Leu Thr Val Leu Gly Leu

225 230 235 240

Glu Pro

<210> 2

<211> 147

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr

1 5 10 15

Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe

20 25 30

Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr

35 40 45

Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu

50 55 60

Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu

65 70 75 80

Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn

85 90 95

Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala

100 105 110

Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg

115 120 125

Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly

130 135 140

Gln Phe Gln

145

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 3

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

<210> 4

<211> 217

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 4

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

<210> 5

<211> 1977

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 5

atgtgggagg ctcagttcct gggcttgctg tttctgcagc cgctttgggt ggctccagtg 60

aagcctctcc agccaggggc tgaggtcccg gtggtgtggg cccaggaggg ggctcctgcc 120

cagctcccct gcagccccac aatccccctc caggatctca gccttctgcg aagagcaggg 180

gtcacttggc agcatcagcc agacagtggc ccgcccgctg ccgcccccgg ccatcccctg 240

gcccccggcc ctcacccggc ggcgccctcc tcctgggggc ccaggccccg ccgcttcacg 300

gtgctgagcg tgggtcccgg aggcctgcgc agcgggaggc tgcccctgca gccccgcgtc 360

cagctggatg agcgcggccg gcagcgcggg gacttctcgc tatggctgcg cccagcccgg 420

cgcgcggacg ccggcgagta ccgcgccgcg gtgcacctca gggaccgcgc cctctcctgc 480

cgcctccgtc tgcgcctggg ccaggcctcg atgactgcca gccccccagg atctctcaga 540

gcctccgact gggtcatttt gaactgctcc ttcagccgcc ctgaccgccc agcctctgtg 600

cattggttcc ggaaccgggg ccagggccga gtccctgtcc gggagtcccc ccatcaccac 660

ttagcggaaa gcttcctctt cctgccccaa gtcagcccca tggactctgg gccctggggc 720

tgcatcctca cctacagaga tggcttcaac gtctccatca tgtataacct cactgttctg 780

ggtctggagc ccgagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 840

cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 900

atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 960

gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 1020

cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 1080

gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 1140

atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 1200

cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 1260

ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1320

aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc 1380

gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1440

ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaaga gcccaaatct 1500

tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccaccaggat ggttcttaga ctccccagac 1560

aggccctgga acccccccac cttctcccca gccctgctcg tggtgaccga aggggacaac 1620

gccaccttca cctgcagctt ctccaacaca tcggagagct tcgtgctaaa ctggtaccgc 1680

atgagcccca gcaaccagac ggacaagctg gccgccttcc ccgaggaccg cagccagccc 1740

ggccaggact gccgcttccg tgtcacacaa ctgcccaacg ggcgtgactt ccacatgagc 1800

gtggtcaggg cccggcgcaa tgacagcggc acctacctct gtggggccat ctccctggcc 1860

cccaaggcgc agatcaaaga gagcctgcgg gcagagctca gggtgacaga gagaagggca 1920

gaagtgccca cagcccaccc cagcccctca cccaggccag ccggccagtt ccaatga 1977

<210> 6

<211> 1491

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 6

atgtgggagg ctcagttcct gggcttgctg tttctgcagc cgctttgggt ggctccagtg 60

aagcctctcc agccaggggc tgaggtcccg gtggtgtggg cccaggaggg ggctcctgcc 120

cagctcccct gcagccccac aatccccctc caggatctca gccttctgcg aagagcaggg 180

gtcacttggc agcatcagcc agacagtggc ccgcccgctg ccgcccccgg ccatcccctg 240

gcccccggcc ctcacccggc ggcgccctcc tcctgggggc ccaggccccg ccgcttcacg 300

gtgctgagcg tgggtcccgg aggcctgcgc agcgggaggc tgcccctgca gccccgcgtc 360

cagctggatg agcgcggccg gcagcgcggg gacttctcgc tatggctgcg cccagcccgg 420

cgcgcggacg ccggcgagta ccgcgccgcg gtgcacctca gggaccgcgc cctctcctgc 480

cgcctccgtc tgcgcctggg ccaggcctcg atgactgcca gccccccagg atctctcaga 540

gcctccgact gggtcatttt gaactgctcc ttcagccgcc ctgaccgccc agcctctgtg 600

cattggttcc ggaaccgggg ccagggccga gtccctgtcc gggagtcccc ccatcaccac 660

ttagcggaaa gcttcctctt cctgccccaa gtcagcccca tggactctgg gccctggggc 720

tgcatcctca cctacagaga tggcttcaac gtctccatca tgtataacct cactgttctg 780

ggtctggagc ccgagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 840

cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 900

atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 960

gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 1020

cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 1080

gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 1140

atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 1200

cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 1260

ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1320

aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc 1380

gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1440

ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaatg a 1491

<210> 7

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 7

atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60

ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 120

ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 180

gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 240

gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 300

cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 360

tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca 420

gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccaccccag cccctcaccc 480

aggccagccg gccagttcca agagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg 540

tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 600

gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 660

gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 720

acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 780

ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc 840

ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 900

tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 960

gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 1020

aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc 1080

aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 1140

catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 1200

<210> 8

<211> 1985

<212> RNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 8

gagaccggcc ucgagcagcu gaagcuuccu gcaggucgac ucuagagcca ccaugagggc 60

ccugugggug cugggccucu gcugcguccu gcugaccuuc gggucgguca gagcugacga 120

ugaaguugau gugcagccuc cuccuccucc uccagacgcu acaugucacc agguccgcuc 180

cuucuuccag aggcugcagc caggacucaa gugggugcca gagacaccag ugccaggaag 240

cgaucugcag gucugucugc cuaagggccc uaccuguugc ucccggaaga uggaggagaa 300

guaccagcug accgccaggc ugaacaugga acagcugcug cagagcgcca gcauggagcu 360

gaaguuccug aucauccaga acgccgccgu guuccaggag gccuucgaga ucgucgugcg 420

gcacgccaag aacuacacca acgccauguu caagaacaac uaccccagcc ugacaccuca 480

ggccuuugag uucguggggg aguucuucac cgacgugucu cuguacaucc ugggcagcga 540

caucaacgug gacgacaugg ugaacgagcu guucgacagc cuguuccccg ugaucuacac 600

ccagcugaug aacccaggcc ugccagauag cgcucuggau aucaacgagu gccugagggg 660

agccagaaga gaccugaagg uguucggcaa cuuccccaag cugaucauga cccagguguc 720

caagagccug caggucacca ggaucuuccu gcaggcccug aaccugggca ucgaggucau 780

caacaccacc gaccaccuga aguucagcaa ggauugcggc cggaugcuca cccgcaugug 840

guauuguagc uauugccagg gccugaugau ggugaagccu ugcggcggcu auugcaacgu 900

cgugaugcag gguuguaugg ccggcguggu ggagaucgac aaguauuggc gggaguacau 960

ccugagccug gaggagcugg ugaacggcau guaccggauc uacgacaugg agaacgugcu 1020

gcugggccug uucuccacca uccacgacag cauccaguac gugcagaaga acgccggcaa 1080

gcugacaacc accaucggaa agcucugcgc ccacucucag cagaggcagu acagaagcgc 1140

cuacuacccc gaggaccugu ucaucgacaa gaaggugcug aagguggccc acguggaaca 1200

cgaagagaca cugagcagcc ggaggagaga gcugauccag aagcugaagu ccuucaucuc 1260

cuucuacagc gcccugccag gcuacauuug cagccacagc ccaguggccg agaacgacac 1320

ccucuguugg aacggccagg agcuggugga gagauacucu cagaaggccg ccaggaacgg 1380

caugaagaac caguucaacc ugcacgagcu gaagaugaag ggcccagagc cagugguguc 1440

ccagaucauc gacaagcuga agcacaucaa ccagcugcug cggaccauga gcaugccuaa 1500

gggcagggug cuggacaaga accuggacga ggagggcuuc gagucaggag auugcggcga 1560

cgacgaagac gaguguauug gcggaagcgg cgacggcaug aucaagguca agaaccagcu 1620

gcgguuccug gccgaacugg ccuacgaucu ggacguggac gacgcuccag gcaauucuca 1680

gcaggccaca ccuaaggaca acgagaucag caccuuccac aaccugggca acgugcacuc 1740

uccucugaag cugcugacca gcauggccau uagcgucguc ugcuucuucu uccuggugca 1800

ucugaucccc aucgcugugg guggugcccu ggcggggcug guccucaucg uccucaucgc 1860

cuaccucguc ggcaggaaga ggagucacgc aggcuaccag acuaucuagg aauucuuaau 1920

uaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980

aaaaa 1985

Claims

1.融合蛋白在制备用于提高抗原呈递细胞致敏T细胞功能的制剂中的用途，其中，所述抗原呈递细胞为人工改造从而过表达GPC3或AFP的抗原呈递细胞，所述致敏T细胞功能是指促进CD8 T细胞或CD4 T细胞产生IFN-γ和/或TNF-α，其特征在于：

所述融合蛋白包含第一部分和第二部分，其中，所述第一部分通过连接子共价连接至所述第二部分，所述第一部分由SEQ ID No. 1所示的可溶性免疫球蛋白CD223的序列和位于其N端的MWEAQFLGLLFLQPLWVAPVKP的序列组成，所述第二部分由SEQ ID No.2所示的序列和位于其N端的MQIPQAPWPVVWAVLQLGWR的序列组成，所述连接子包含第一弹性区、第二弹性区和位于所述第一弹性区和所述第二弹性区之间的回转区，所述第一弹性区和所述第二弹性区的序列分别如SEQ ID No.3所示，所述回转区的序列如SEQ ID No.4所示。

2.融合蛋白在提高抗原呈递细胞体外致敏T细胞功能中的用途，其中，抗原呈递细胞为人工改造从而过表达GPC3或AFP的抗原呈递细胞，所述致敏T细胞功能是指促进CD8 T细胞或CD4 T细胞产生IFN-γ和/或TNF-α，其特征在于：

包括通过基因工程手段使抗原递呈细胞包含融合蛋白或能够产生该融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含第一部分和第二部分，其中，所述第一部分通过连接子共价连接至所述第二部分，所述第一部分由SEQ ID No. 1所示的可溶性免疫球蛋白CD223的序列和位于其N端的MWEAQFLGLLFLQPLWVAPVKP的序列组成，所述第二部分由SEQ ID No.2所示的序列和位于其N端的MQIPQAPWPVVWAVLQLGWR的序列组成，所述连接子包含第一弹性区、第二弹性区和位于所述第一弹性区和所述第二弹性区之间的回转区，所述第一弹性区和所述第二弹性区的序列分别如SEQ ID No.3所示，所述回转区的序列如SEQ ID No.4所示。