CN113480662B

CN113480662B - 包含cd40抗体和il-15的融合蛋白及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN113480662B
Application number: CN202110732177.0A
Authority: CN
Inventors: 段海峰; 解晶; 张晶; 孟文华; 杨继业
Original assignee: Beijing Shuangyin Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Huaao Xuande Biomedical Technology Co., Ltd.
Priority date: 2021-06-29
Filing date: 2021-06-29
Publication date: 2022-07-22
Anticipated expiration: 2041-06-29
Also published as: CN113480662A

Abstract

本发明公开了包含细胞因子IL‑15和CD40抗体或者免疫活性片段的双特异性融合蛋白及其制备方法和用途，所述融合蛋白包括了不同结构式的人CD40抗体和细胞因子IL‑15，由不同质粒共转染、表达得到。本发明公开的融合蛋白可以同时激活APC细胞、T细胞和NK细胞，增强细胞因子的肿瘤靶向性；能够刺激DC细胞成熟和分泌IL‑12，能够显著抑制小鼠黑色素瘤的生长，减小黑色素瘤的体积和平均肺转移灶。

Description

包含CD40抗体和IL-15的融合蛋白及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及包含细胞因子IL-15和CD40抗体或者免疫活性片段的双特异性融合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

CD40是一种40～50kDa的I型跨膜糖蛋白，属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族，它广泛表达于各种抗原呈递细胞(APCs)(如树突状细胞DCs)和B淋巴细胞等非免疫细胞(如上皮细胞和血小板等)，并且在某些肿瘤细胞表面也有表达。CD40在细胞和体液免疫中都起到重要作用。

CD40与其自然受体CD40L或者激活型CD40抗体结合后，可以激活APC细胞，特别是DC细胞。激活的DC细胞通过上调其他的共刺激分子(包括主要组织相容性复合物MHCII、CD80/86等)的表达，并且下调免疫抑制分子的表达来提高其抗原呈递的能力，同时增加多种细胞因子(包括IL-12、INF-γ)的分泌，进而进一步增强细胞毒性反应和组织免疫耐受。通过改进CD40抗体的Fc区可以增加对FcγRIIB的亲和力，从而增加其活性。

目前，有多种激活型CD40抗体已进入临床前研究或者临床研究，在动物模型和肿瘤患者中都显示出了较强的抗肿瘤免疫反应。但是，当前的临床试验还处于早期阶段，出现了较多的副作用，包括I级至II级的细胞因子综合征、剂量相关的血液学毒性和肝功能损伤等。因此，现有的CD40抗体药物的安全性仍然有待商榷。

细胞因子白介素15(IL-15)对NK细胞和CD8+记忆性T细胞的增殖和活化都非常关键，IL-15先与IL-15Rα结合，再与表达IL-15Rβγ的NK细胞和T细胞结合，将信号反式呈递出来。同白介素2(IL-2)一样，IL-15也是抗肿瘤免疫治疗的热门靶点之一。但是，IL-15并不支持CD4+CD25+FoxP3调节性T细胞的生长，并且不会诱导激活CD8+T细胞的凋亡。目前，有多个IL-15的临床前研究或者临床研究显示出了很好的抗肿瘤活性，但是，也存在多个副作用，如引发包括促炎性因子的细胞因子级联反应、参与某些肿瘤的增殖和抑制其凋亡。

近年来，抗体-细胞因子融合蛋白代表了新一类的治疗肿瘤的生物药，目前报道的抗体-细胞因子融合蛋白主要都是将抗肿瘤抗原或者基质抗原的抗体与细胞因子融合，目的是增强细胞因子的肿瘤靶向性。此外，还有将抗人PD-1抗体与IL-1融合，通过增强T细胞和NK细胞的活性来达到抗肿瘤的作用。但是，到目前为止，还未见有抗人CD40抗体与IL-15融合蛋白的报道。

因此，亟需提供包含CD40抗体和IL-15的融合蛋白，以同时激活APC细胞、T细胞和NK细胞，且能够应用于实体瘤或者造血系统恶性肿瘤的治疗方面。

发明内容

为了克服上述问题，本发明人进行了锐意研究，制备了具有不同结构式的人CD40抗体和细胞因子IL-15的双特异性融合蛋白，其可以同时激活APC细胞、T细胞和NK细胞，且该融合蛋白能够有效应用于实体瘤或者造血系统恶性肿瘤的治疗，从而完成了本发明。

具体来说，本发明的目的在于提供以下方面：

第一方面，提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，其中，

第一结构域，包含能与CD40结合的单克隆抗体或其免疫活性片段，

第二结构域，包括含有细胞因子白介素-15或其变体的氨基酸序列的多肽。

第二方面，提供了第一方面所述的融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

步骤1，构建表达融合蛋白的载体；

步骤2，将构建的表达载体转染细胞；

步骤3，由细胞中获得表达的融合蛋白；

优选地，在步骤3之后，还包括步骤4，对融合蛋白进行纯化。

第三方面，提供了第一方面所述的融合蛋白在制备治疗肿瘤药物方面的应用。

本发明所具有的有益效果包括：

(1)本发明提供的融合蛋白，可以同时激活APC细胞、T细胞和NK细胞，增强细胞因子的肿瘤靶向性；

(2)本发明提供的融合蛋白，能够显著刺激单核细胞来源的DC细胞分泌IL12p70和IFN-γ，以及明显上调单核细胞来源DC细胞成熟的表面分子标记；

(3)本发明提供的融合蛋白，能够显著抑制小鼠黑色素瘤的生长，减小黑色素瘤的体积和平均肺转移灶，其效果明显优于单独结构的蛋白(CD40抗体和IL-15)，甚至优于将两种单独结构的蛋白联用。

附图说明

图1示出了四种融合蛋白的结构式，其中的(a)示出了融合蛋白1的结构式，(b)示出了融合蛋白2的结构式；(c)示出了融合蛋白3的结构式；(d)示出了融合蛋白4的结构式；图2示出根据本发明一种优选实施方式的不同质粒结构示意图；图3中的(a)示出了融合蛋白1、2刺激单核细胞来源DC细胞分泌细胞因子的结果图；(b)示出了融合蛋白1～4刺激DC细胞分泌细胞因子的结果图；图4中的(a)和(b)示出了融合蛋白上调单核细胞来源DC细胞成熟的表面分子标记的结果图；图5示出了融合蛋白刺激NK92细胞增殖的结果图；图6示出了融合蛋白对小鼠肿瘤体积的影响结果图；图7示出了融合蛋白对小鼠肿瘤重量的影响结果图；图8示出了融合蛋白对小鼠肿瘤肺转移的影响结果图；图9示出了融合蛋白对小鼠脾脏淋巴细胞的影响结果图。

具体实施方式

下面通过优选实施方式和实施例对本发明进一步详细说明。通过这些说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。

在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，其中，

第二结构域，包括含有细胞因子白介素-15(IL-15)或其变体的氨基酸序列的多肽。

在本发明中，所述单克隆抗体是指能够特异性结合细胞表面CD40抗原的抗体。其中，所述“抗体”可以涵盖具有所需特异性的结合结构域的抗CD40特异性结合因子，包括与之同源的抗体片段、衍生物以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽(包括天然的或合成的)。

优选地，所述CD40为哺乳动物CD40蛋白质，优选为灵长类动物CD40蛋白质，更优选为人CD40蛋白质。

根据本发明一种优选的实施方式，所述能与CD40结合的单克隆抗体或其免疫活性片段包括单价抗体、单链抗体、双链抗体、嵌合抗体或它们的衍生物或同源物，或

免疫球蛋白的片段或Fv片段，或

包括抗体片段或含有抗原结合结构域的多肽。

在本发明中，所述衍生物和同源物是指基本上保持与所述的单价抗体、单链抗体、双链抗体、嵌合抗体相同的生物学功能或活性的蛋白。即，所述衍生物和同源物所涵盖的氨基酸序列的变化，存在于相应抗体的非关键性部位。

其中，所述免疫球蛋白的片段至少是免疫球蛋白分子的一个免疫活性区段，如Fab、Fab'、F(ab')₂。

在进一步优选的实施方式中，所述能与CD40结合的单克隆抗体或其免疫活性片段选自单价抗体、单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、及它们的衍生物或同源物中的一种或多种；或

为免疫球蛋白的片段和/或Fv片段，或

为抗体片段和/或含有抗原结合结构域的多肽。

根据本发明一种优选的实施方式，所述能与CD40结合的单克隆抗体或其免疫活性片段包括轻链区和重链区，或者

包括scFv或Fab。

其中，scFv是指包含抗体的重链可变区和轻链可变区，并且可以由“轻链可变区(VL)-接头-重链可变区(VH)”构成的scFv，接头是指具有一定长度的氨基酸序列，其功能是人工地连接重链可变区与轻链可变区。

Fab是指包含轻链的可变区和恒定区以及重链的可变区和CH1区的Fab。

优选地，所述能与CD40结合的单克隆抗体或其免疫活性片段还包括Fc区。

在本发明中，Fc区是指免疫球蛋白重链的C端区域，其包含恒定区的一部分。Fc区通常包含抗体重链恒定区的CH2和CH3，此外，Fc区还包括野生型Fc区和变体Fc区。

更优选地，所述Fc区优选来源于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区(CH)；或者，所述Fc区可以为异二聚体，且异二聚体Fc中的一个可以具有节结构，另一个可以具有孔结构，节或孔结构可以位于Fc区中的CH3处。

在进一步优选的实施方式中，所述能与CD40结合的单克隆抗体或其免疫活性片段的轻链区包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，编码轻链区的核酸分子包含如SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列；

所述能与CD40结合的单克隆抗体或其免疫活性片段的重链区包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，编码重链区的核酸分子包含如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

在更进一步优选的实施方式中，所述能与CD40结合的单克隆抗体或其免疫活性片段的轻链区的氨基酸序列与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少90％的一致性，优选具有至少95％的一致性，更优选具有至少99％的一致性；

所述能与CD40结合的单克隆抗体或其免疫活性片段的重链区的氨基酸序列与SEQID NO：3所示的氨基酸序列具有至少90％的一致性，优选具有至少95％的一致性，更优选具有至少99％的一致性。

优选地，所述能与CD40结合的单克隆抗体或其免疫活性片段的轻链区的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；所述能与CD40结合的单克隆抗体或其免疫活性片段的重链区的氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

根据本发明一种优选的实施方式，所述细胞因子IL-15为哺乳动物细胞因子IL-15，优选为灵长类动物细胞因子IL-15，更优选为人细胞因子IL-15。

在进一步优选的实施方式中，所述细胞因子IL-15包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，编码细胞因子IL-15的核酸分子包含如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。

在更进一步优选的实施方式中，所述细胞因子IL-15的氨基酸序列与SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列具有至少90％的一致性，优选具有至少95％的一致性，更优选具有至少99％的一致性。

优选地，所述细胞因子IL-15的氨基酸序列为SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。

在本发明中，所述细胞因子IL-15的变体是指基本上保持与本发明所述的细胞因子IL-15相同的生物学功能或活性的蛋白。

根据本发明一种优选的实施方式，所述第二结构域包括细胞因子IL-15的受体α的sushi区和细胞因子IL-15。

在本发明中，细胞因子IL-15的受体α的sushi区是指起始于IL-15Rα的信号肽之后的66个氨基酸对应于IL-15Rα的胞外区域的一部分，所述sushi结构域是其结合至IL-15所必需的。

根据本发明一种优选的实施方式，所述融合蛋白通过将第一结构域的C端与第二结构域中细胞因子IL-15的受体α的sushi区的N端融合获得。

在进一步优选的实施方式中，所述融合为通过连接物融合或者无连接物直接融合，

其中，当通过连接物融合时，如图1所示，所述连接物为连接肽L1，所述连接物L1的氨基酸序列为G4S。

在更进一步优选的实施方式中，所述第二结构域中的细胞因子IL-15的受体α的sushi区的C端与细胞因子IL-15的N端之间通过连接物融合或者无连接物直接融合，

当通过连接物融合时，如图1所示，所述连接物为连接肽L2，所述连接物L2的氨基酸序列为(G4S)3。

根据本发明一种优选的实施方式，所述融合蛋白可以刺激DC细胞成熟和分泌IL-12；

所述融合蛋白可以同时刺激APC细胞、T细胞和NK细胞增殖。

在本发明一种优选的实施方式中，如图1中的a所示，所述融合蛋白由能与CD40结合的单克隆抗体与细胞因子IL-15的受体α的sushi区的N端通过连接物融合获得，其中，

所述连接物为连接肽L1，所述连接物L1的氨基酸序列为G4S；

所述细胞因子IL-15的受体α的sushi区的C端与细胞因子IL-15的N端之间通过无连接物的方式直接融合。

在进一步优选的实施方式中，所述融合蛋白由质粒1、质粒2和质粒3通过共转染、表达得到，其中，

所述质粒1含有能与CD40结合的单克隆抗体的轻链基因，质粒2含有能与CD40结合的单克隆抗体的重链基因与细胞因子IL-15的受体α的sushi区基因的融合基因，质粒3含有细胞因子IL-15的基因，如图2所示。

在更进一步优选的实施方式中，所述能与CD40结合的单克隆抗体的轻链基因具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述能与CD40结合的单克隆抗体的重链基因与细胞因子IL-15的受体α的sushi区基因的融合基因具有如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列如SEQ IDNO：8所示；

所述细胞因子IL-15的基因具有如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

根据本发明的实施例，将质粒1(p3.4-CD40-L)、质粒2(p3.4-CD40-H-sushi)和质粒3(p3.4-IL-15)共转染ExpiCHO-S细胞，并用ExpiCHO表达系统表达获得融合蛋白1。具体地，用3个质粒单独表达相应的蛋白然后在细胞内组装成多聚体的融合蛋白。

在本发明一种优选的实施方式中，如图1中的b所示，所述融合蛋白由能与CD40结合的单克隆抗体与细胞因子IL-15的受体α的sushi区的N端通过连接物融合，再与细胞因子IL-15的N端融合获得，其中，

能与CD40结合的单克隆抗体与细胞因子IL-15的受体α的sushi区的N端之间的连接物为连接肽L1，所述连接物L1的氨基酸序列为G4S；

细胞因子IL-15的受体α的sushi区的C端与细胞因子IL-15的N端之间的连接物为连接肽L2，连接物L2的氨基酸序列为(G4S)3。

在进一步优选的实施方式中，所述融合蛋白由质粒1和质粒4通过共转染、表达得到，其中，

所述质粒1含有能与CD40结合的单克隆抗体的轻链基因，所述质粒4含有能与CD40结合的单克隆抗体的重链基因、细胞因子IL-15的受体α的sushi区基因及细胞因子IL-15基因三者的融合基因，如图2中所示。

在更进一步优选的实施方式中，所述能与CD40结合的单克隆抗体的重链基因、细胞因子IL-15的受体α的sushi区基因及IL-15基因三者的融合基因具有如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。

根据本发明的实施例，将质粒1(p3.4-CD40-L)和质粒4(p3.4-CD40-H-sushi-15)共转染ExpiCHO-S细胞，并用ExpiCHO表达系统表达获得融合蛋白2。具体地，用2个质粒单独表达相应的蛋白，然后在细胞内组装成多聚体的融合蛋白。

在本发明一种优选的实施方式中，如图1中的c所示，所述融合蛋白由能与CD40结合的免疫活性片段(scFv或Fab)与Fc区的N端融合，再与细胞因子IL-15的受体α的sushi区的N端融合获得。

在本发明中，所述Fc区包括Fc片段及其突变体片段；优选地，所述Fc为IgG1Fc，其突变体对FcγRIIB(抑制性IgG受体)的亲和力增强。

其中，所述细胞因子IL-15的受体α的sushi区的C端与细胞因子IL-15的N端之间通过无连接物的方式直接融合。

优选地，上述两个融合处具有或者不具有连接物。

更优选地，所述能与CD40结合的免疫活性片段(scFv或Fab)与Fc区的N端通过连接肽L3融合，所述连接肽L3的氨基酸序列为(G4S)3；

所述Fc区的C端与细胞因子IL-15的受体α的sushi区的N端通过连接肽L1融合。

在进一步优选的实施方式中，所述融合蛋白由质粒3和质粒7通过共转染、表达得到，其中，

所述质粒3含有细胞因子IL-15的基因，质粒7含有能与CD40结合的单链抗体(CD40scFv)的基因、Fc区的基因和细胞因子IL-15的受体α的sushi区基因三者的融合基因，如图2所示。

在更进一步优选的实施方式中，所述能与CD40结合的单链抗体(CD40scFv)的基因、Fc区的基因和细胞因子IL-15的受体α的sushi区基因三者的融合基因，具有如SEQ IDNO：11所示的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示

根据本发明的实施例，将质粒3(p3.4-IL-15)和质粒7(scfv-Fc-sushi)共转染ExpiCHO-S细胞，并用ExpiCHO表达系统表达获得融合蛋白3。

在本发明一种优选的实施方式中，如图1中的d所示，所述融合蛋白由能与CD40结合的免疫活性片段(scFv或Fab)与Fc区的N端融合，然后与细胞因子IL-15的受体α的sushi区的N端融合，再与细胞因子IL-15的N端融合获得。

优选地，上述两个融合处具有或者不具有连接物。

所述Fc区的C端与细胞因子IL-15的受体α的sushi区的N端通过连接肽L1融合，

所述细胞因子IL-15的受体α的sushi区的C端与细胞因子IL-15的N端之间通过连接肽L2融合。

在进一步优选的实施方式中，所述融合蛋白由质粒8转染、表达得到，其中，

所述质粒8含有能与CD40结合的单链抗体(CD40scFv)的基因、Fc区的基因、细胞因子IL-15的受体α的sushi区基因及细胞因子IL-15基因四者的融合基因，如图2所示。

在更进一步优选的实施方式中，所述能与CD40结合的单链抗体(CD40scFv)的基因、Fc区的基因、细胞因子IL-15的受体α的sushi区基因及细胞因子IL-15基因四者的融合基因，具有如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示

根据本发明的实施例，将质粒8(scfv-Fc-sushi-15)转染ExpiCHO-S细胞，并用ExpiCHO表达系统表达获得融合蛋白4。

根据本发明的实施例，本发明所述的融合蛋白1～融合蛋白4可以刺激DC细胞成熟和分泌IL-12，同时也可以刺激T细胞和NK细胞增殖。

本发明的第二方面，提供了第一方面所述融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

步骤1，构建表达融合蛋白的载体。

在本发明中，优选采用pcDNA3.4-TOPOTA cloning kit(购自英潍捷基(上海)贸易有限公司)构建表达融合蛋白的pcDNA3.4质粒。

其中，如图2所示，质粒p3.4-CD40-L(质粒1)含有能与CD40结合的单克隆抗体的轻链基因；p3.4-CD40-H-sushi(质粒2)含有能与CD40结合的单克隆抗体的重链基因和细胞因子IL-15的受体α的sushi区基因的融合基因；p3.4-IL-15(质粒3)含有细胞因子IL-15的基因；p3.4-CD40-H-sushi-15(质粒4)含有能与CD40结合的单克隆抗体的重链基因、细胞因子IL-15的受体α的sushi区基因及细胞因子IL-15基因三者的融合基因，scfv-Fc-sushi(质粒7)含有能与CD40结合的单链抗体(CD40scFv)的基因、Fc区的基因和细胞因子IL-15的受体α的sushi区基因三者的融合基因，scfv-Fc-sushi-15(质粒8)含有能与CD40结合的单链抗体(CD40scFv)的基因、Fc区的基因、细胞因子IL-15的受体α的sushi区基因及细胞因子IL-15基因四者的融合基因。

其中，采用现有技术常用的方法构建表达融合蛋白的载体，优选地，采用包括下述步骤的方法构建表达融合蛋白的载体：首先，通过PCR获得目的基因片段，再用融合PCR的方法得到融合的目的基因片段；再将融合后的目的片段通过无缝克隆的方法连接至载体上，构建得到表达融合蛋白的载体。

步骤2，将构建的表达载体转染细胞。

根据本发明一种优选的实施方式，将构建的表达融合蛋白的载体转染细胞进行表达。

优选地，转染的细胞为ExpiCHO-S细胞。

步骤3，由细胞中获得表达的融合蛋白。

优选地，用ExpiCHO表达系统试剂盒(购自英潍捷基(上海)贸易有限公司)表达融合蛋白。

步骤4，对融合蛋白进行纯化。

在本发明中，优选采用下述方法纯化获得的融合蛋白：上清用0.45μm滤膜过滤去除细胞碎片；用5倍柱体积的平衡缓冲液(5.6mM NaH₂PO₄，14.4mM Na₂HPO₄，0.15M NaCl，pH7.2)处理protein A亲和柱HiTrapMabSelectSuRe(购自GE通用公司)，再将上清进行上样，上样结束后，用缓冲液(5.6mM NaH₂PO₄·H2O，14.4mM Na₂HPO₄，0.5M NaCl，pH7.2)冲洗结合不牢固的杂蛋白至基线；再用洗脱液50mM柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液(含0.02％吐温-80+5％甘露醇，pH3.2)洗脱蛋白；再用1M Tris-Cl(pH8.0)调节pH至7.0。纯化后的样品经0.22μm滤膜过滤除菌后保存于4℃。

本发明所述方法制备的融合蛋白(尤其是融合蛋白1)，能明显刺激单核细胞来源的DC细胞分泌IL12p70和IFN-γ，能明显上调单核细胞来源的DC细胞成熟时的表面分子标记CD83和CD86，能够保留IL-15的生物活性，且能够显著抑制CD40人源化的小鼠中黑色素瘤的生长。

本发明的第三方面，提供了第一方面所述融合蛋白在制备治疗肿瘤药物方面的应用。

其中，所述肿瘤优选为实体瘤或造血系统恶性肿瘤，例如黑色素瘤、B细胞淋巴瘤、乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌。

实施例

以下通过具体实例进一步描述本发明，不过这些实例仅仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1

制备融合蛋白：

(1)目的基因的获得：

由中美泰和生物技术(北京)有限公司合成的含有目的片段的合成质粒为模板，按照表1所述的引物和模板，表2所述的反应体系，以及表3所述的反应条件进行PCR扩增，获得相应的目的基因片段。

表1

表2

反应体系	体积
		10×ExTaq缓冲液(购自Takara公司，货号为RR001A)	5μL
dNTP mixture(每种2.5mM)(购自Takara公司，货号为RR001A)	4μL
		上游引物(10μM)	2.5μL
下游引物(10μM)	2.5μL
		模板(0.1μg/μL)	1μL
ExTaq(购自Takara公司，货号为RR001A，5U/μL)	0.25μL
		H<sub>2</sub>O	补至50μL

表3

(2)表达载体的构建：采用pcDNA3.4-TOPOTA cloning kit(购自英潍捷基(上海)贸易有限公司)构建表达融合蛋白的pcDNA3.4质粒，其中，本实施例构建的pcDNA3.4质粒含有能与CD40结合的单克隆抗体的轻链基因、能与CD40结合的单克隆抗体的重链基因和细胞因子IL-15的受体α的sushi区基因的融合基因、以及细胞因子IL-15的基因(如图2中所示的质粒1～3)。

(3)转染细胞进行表达；将上述构建的表达融合蛋白的载体转染ExpiCHO-S细胞，其中，所述ExpiCHO-S细胞购自英潍捷基(上海)贸易有限公司，按照ExpiCHO表达系统试剂盒(购自英潍捷基(上海)贸易有限公司)的方法进行转染；根据试剂盒的说明书于转染后第10天收集细胞上清。

(4)融合蛋白的表达：用ExpiCHO表达系统试剂盒(购自英潍捷基(上海)贸易有限公司)表达融合蛋白，记为融合蛋白1。

(5)融合蛋白的纯化：上清用0.45μm滤膜过滤去除细胞碎片；用5倍柱体积的平衡缓冲液(5.6mM NaH₂PO₄，14.4mM Na₂HPO₄，0.15M NaCl，pH7.2)处理protein A亲和柱HiTrapMabSelectSuRe(购自GE通用公司)，再将上清进行上样，上样结束后，用缓冲液(5.6mM NaH₂PO₄·H2O，14.4mM Na₂HPO₄，0.5M NaCl，pH7.2)冲洗结合不牢固的杂蛋白至基线；再用洗脱液50mM柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液(含0.02％吐温-80+5％甘露醇，pH3.2)洗脱蛋白；再用1M Tris-Cl(pH8.0)调节pH至7.0。纯化后的样品经0.22μm滤膜过滤除菌后保存于4℃。

实施例2

本实施例所采用的融合蛋白的制备方法与实施例1相似，区别仅在于：

步骤(2)中构建的表达载体含有能与CD40结合的单克隆抗体的轻链基因，和能与CD40结合的单克隆抗体的重链基因、细胞因子IL-15的受体α的sushi区基因及IL-15基因三者的融合基因(如图2中所示的质粒1和4)。

表达的融合蛋白记为融合蛋白2。

实施例3

步骤(2)中构建的表达载体含有细胞因子IL-15的基因，和能与CD40结合的单链抗体(CD40scFv)的基因、Fc区的基因和细胞因子IL-15的受体α的sushi区基因三者的融合基因(如图2中所示的质粒3和7)。

表达的融合蛋白记为融合蛋白3。

实施例4

步骤(2)中构建的表达载体含有能与CD40结合的单链抗体(CD40scFv)的基因、Fc区的基因、细胞因子IL-15的受体α的sushi区基因及细胞因子IL-15基因四者的融合基因(如图2中所示的质粒8)。

表达的融合蛋白记为融合蛋白4。

对比例

对比例1

本对比例所采用的融合蛋白的制备方法与实施例1相似，区别仅在于：

步骤(2)中构建的表达载体含有能与CD40结合的单克隆抗体的轻链基因和能与CD40结合的单克隆抗体的重链基因(如图1中所示的质粒1和5)，其中，能与CD40结合的单克隆抗体的重链基因具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

表达的融合蛋白记为CD40Ab。

对比例2

步骤(2)中构建的表达载体含有细胞因子IL-15的基因，和能与CD40结合的单克隆抗体的重链Fc区与sushi区的融合基因(如图1中所示的质粒3和6)，其中，能与CD40抗体的重链Fc区与sushi区的融合基因具有如SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。

表达的融合蛋白记为IL-15。

实验例

实验例1对融合蛋白刺激单核细胞来源DC细胞分泌细胞因子的检测

采用单核细胞来源的DC细胞来检测本发明实施例1、2和对比例1、2制备的融合蛋白能否刺激细胞因子的分泌，具体步骤如下：

用人外周血淋巴细胞分离液(购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)从健康志愿者来源的外周血中分离出淋巴细胞；用RPMI1640(含10％灭活胎牛血清)培养基重悬成2×10⁶个细胞/mL，在37℃、5％CO₂培养箱预贴壁培养2h；2h后弃未贴壁的细胞，贴壁的细胞用含5％灭活胎牛血清的MD培养基继续培养，并加入50ng/ml rhIL-4(重组人白细胞介素4)和100ng/ml rhGM-CSF(重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)；继续培养6天以后，收集悬浮的细胞即为单核细胞来源的DC细胞；

取1×10⁵个细胞加入96孔板中(平行设置4个实验组)，4个实验组中分别加入终浓度为1μg/mL的融合蛋白1(实施例1)、终浓度为1μg/mL的融合蛋白2(实施例2)、与融合蛋白等摩尔浓度的对照蛋白CD40Ab(对比例1)和与融合蛋白等摩尔浓度的对照蛋白IL-15(对比例2)；细胞加药处理24h和48h后分别收集上清，用ELISA试剂盒检测细胞因子IL12p70(欣博盛)和IFN-γ(达科为)的含量，结果如图3中的(a)所示，其中，“*”表示与IL-15相比差异显著(p值<0.05)，“***”表示与IL-15相比差异极显著(p值<0.001)，“#”表示CD40Ab相比差异显著(p值<0.05)，“##”表示与CD40Ab相比差异极显著(p值<0.01)，“###”表示与CD40Ab相比差异极显著(p值<0.001)。

由图3可知，实施例1制备的融合蛋白1能明显刺激单核细胞来源的DC细胞分泌IL12p70和IFN-γ，并且比对照蛋白CD40Ab和IL-15增加显著，而实施例2制备的融合蛋白2刺激单核细胞来源的DC细胞分泌IL12p70和IFN-γ的效果低于对照蛋白CD40Ab。

进一步地，取1×10⁵个细胞加入96孔板中(平行设置5个实验组)，5个实验组中分别加入终浓度为1μg/mL的融合蛋白1(实施例1)、终浓度为1μg/mL的融合蛋白2(实施例2)、终浓度为1μg/mL的融合蛋白3(实施例3)、终浓度为1μg/mL的融合蛋白4(实施例4)、与融合蛋白等摩尔浓度的对照蛋白CD40Ab(对比例1)；细胞加药处理24h和48h后分别收集上清，用ELISA试剂盒检测细胞因子IL12p70(欣博盛)的含量，结果如图3中的(b)所示，其中，“*”表示与融合蛋白1相比差异显著(p值<0.05)，“***”表示与融合蛋白1相比差异极显著(p值<0.001)。

由图3中的(b)可知，实施例1制备的融合蛋白1和实施例3制备的融合蛋白3能明显刺激单核细胞来源的DC细胞分泌IL12p70，并且比对照蛋白CD40Ab显著增加，其中，融合蛋白1刺激DC细胞分泌IL12p70的量最多；而实施例2制备的融合蛋白2和实施例4制备的融合蛋白刺激DC细胞分泌IL12p70的效果明显低于对照蛋白CD40Ab。

实验例2对融合蛋白上调单核细胞来源DC细胞成熟的表面分子标记的检测

取1×10⁵个细胞加入96孔板中(平行设置5个实验组)，其中的4个实验组中分别加入终浓度为1μg/mL的融合蛋白1(实施例1)、与融合蛋白等摩尔浓度的对照蛋白CD40Ab(对比例1)、与融合蛋白等摩尔浓度的对照蛋白IL-15(对比例2)、与融合蛋白等摩尔浓度的CD40Ab与IL-15的混合物，第5个实验组中不添加蛋白，作为空白对照；细胞加药处理24h后收集细胞，用抗CD40、CD83和CD86流式抗体标记细胞，再用流式细胞术检测相应表面分子的表达，结果如图4所示。

由图4可知，融合蛋白1能明显上调单核细胞来源的DC细胞成熟时的表面分子标记CD83和CD86，而且，虽然融合蛋白1处理细胞后，CD83和CD86表达阳性的细胞所占比率与对照蛋白CD40Ab及CD40Ab、IL-15两种蛋白联用的实验组相近，但是融合蛋白1处理的实验组中两种分子表达较强的细胞数高于对照蛋白CD40Ab及CD40Ab、IL-15两种蛋白联用的实验组。

实验例3对融合蛋白是否具有IL-15的生物活性的检测

由于IL-15能够刺激NK细胞和T细胞的增殖，本实验例实用刺激NK92细胞的增殖的方法来检测融合蛋白是否保留IL-15的生物活性。

将常规传代培养的NK92细胞用含5％灭活胎牛血清的X-VIVO^TM15培养基(lonza公司)接种至96孔板中，每孔2×10⁴个细胞(平行设置3个实验组)，向每个实验组中分别加入等摩尔的梯度稀释的融合蛋白1(实施例1)、融合蛋白2(实施例2)和对照蛋白IL-15(对比例2)，于37℃、5％CO₂条件下继续培养48h；每孔加入10μLCCK8(购于碧云天生物技术有限公司)，于37℃、5％CO₂条件下继续培养2h后，检测OD450值，结果如图所示。

由图5可知，融合蛋白2的活性与IL-15没有差异，而融合蛋白1的活性相对IL-15明显下降。

实验例4对融合蛋白能否抑制CD40人源化的小鼠中黑色素瘤的生长的检测

本实验例采用融合蛋白对CD40人源化的小鼠中黑色素瘤的生长抑制作用来评价其在体内的抗肿瘤作用，具体使用6-8周龄的雌性CD40人源化的小鼠(购自上海南方模式生物科技股份有限公司)。

具体地：将5×10⁵个小鼠黑色素瘤B16F10细胞/100μL注射至小鼠右腋皮下，再将小鼠随机分成5组；接种肿瘤后第5天开始给药(其中4组小鼠分别给予融合蛋白1、对照蛋白CD40Ab、对照蛋白IL-15、对照蛋白CD40Ab和IL-15联用、第5组小鼠不给药作为对照)，皮下注射，每组药物调成等摩尔量，一周给药两次，共给药6次；

待肿瘤长至肉眼可见时，测量肿瘤的长度和宽度，计算肿瘤的体积，其中体积计算方法为长度×宽度×宽度/2，具体检测结果如图6所示，其中，“*”表示与对照组(control)相比差异显著(p值<0.05)，“**”表示与对照组(control)相比差异极显著(p值<0.01)；“#”代表与融合蛋白1相比差异显著(p值<0.05)

由图6可知，4个给药组相对于对照组的肿瘤体积均明显减小，而CD40Ab和IL-15的联用组与融合蛋白1组的肿瘤体积在治疗后20天时体积最小，明显小于CD40Ab、IL-15的单独用药组。

在治疗20天后，用颈椎脱臼的方法处死小鼠，剥离肿瘤和、肺、脾脏，称重肿瘤、记录肺转移灶，结果如图7所示，其中，“*”表示与对照组(control)相比差异显著(p值<0.05)；“**”表示与对照组(control)相比差异极显著(p值<0.01)；“#”表示与融合蛋白1相比差异显著(p值<0.05)。

由图7可知，4个用药组的瘤重明显小于对照组，且CD40Ab和IL-15联用组与融合蛋白1组的瘤重明显小于CD40Ab、IL-15的单独用药组。

进一步地，图8示出了患瘤小鼠在治疗20天后肺转移的情况，其中，“*”表示与对照组(control)相比差异显著(p值<0.05)。由图8可知，融合蛋白1组的平均肺转移灶明显小于对照组和其他给药组。

将分离的脾脏研磨并过70μm筛网，获得的细胞悬液按照小鼠脏器淋巴细胞分离试剂盒(购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)的方法分离淋巴细胞，用抗小鼠CD3、CD8、NK1.1的流式抗体标记获得的淋巴细胞，用流式细胞术检测CD3+CD8+细胞和CD3-NK1.1+细胞的比率，检测结果如图9所示，其中，“*”表示与对照组(control)相比差异显著(p值<0.05)；“**”表示与对照组(control)相比差异极显著(p值<0.01)；“***”表示与对照组(control)相比差异极显著(p值<0.001)；“#”表示与融合蛋白1相比差异显著(p值<0.05)；“##”表示与融合蛋白1相比差异极显著(p值<0.01)。

由图9可知，四个给药组小鼠的NK细胞和CD3+CD8+T细胞明显高于对照组，且融合蛋白1的NK细胞和CD3+CD8+T细胞明显高于单独用药的CD40Ab组。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。

序列表

<110> 北京双因生物科技有限公司

<120> 包含CD40抗体和IL-15的融合蛋白及其制备方法和用途

<130> 2021

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 214

<212> PRT

<213> 氨基酸序列(人工序列)

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Thr Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ile Phe Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 2

<211> 645

<212> DNA

<213> 核苷酸序列(人工序列)

<400> 2

gatattcaga tgactcaatc tccctcctct gtgtctgcta gtgttggaga tcgcgttacc 60

atcacttgta gggcttccca aggcatctac tcttggctcg catggtatca acagaagcca 120

ggcaaggcac ctaacctcct catctacact gcctccaccc tccagtctgg tgtgccttct 180

cgcttcagtg gatctgggtc tggcaccgat ttcactctga ctatttctag cctccagcct 240

gaggactttg ctacatacta ttgccaacag gccaacatct tcccactgac tttcggaggc 300

ggtactaaag tggaaatcaa acggaccgtg gcggcgccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggtaccgct agcgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645

<210> 3

<211> 456

<212> PRT

<213> 氨基酸序列(人工序列)

<400> 3

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr

100 105 110

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

115 120 125

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

130 135 140

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

145 150 155 160

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

165 170 175

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

180 185 190

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

195 200 205

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val

210 215 220

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

225 230 235 240

Pro Glu Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

245 250 255

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

260 265 270

Val Asp Val Ser Asp Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

275 280 285

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

290 295 300

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

305 310 315 320

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

325 330 335

Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

340 345 350

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

355 360 365

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

370 375 380

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

385 390 395 400

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

405 410 415

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

420 425 430

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

435 440 445

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455

<210> 4

<211> 1371

<212> DNA

<213> 核苷酸序列(人工序列)

<400> 4

caggtccagc tggtgcagtc tggtgccgaa gtgaagaagc caggtgcctc tgtcaaagtc 60

agctgtaaag ccagtggcta tacattcact ggatactaca tgcactgggt cagacaggca 120

cctggacagg gtctggaatg gatgggctgg attaaccctg actccggtgg tacaaactat 180

gcccagaagt tccagggtag agttactatg accagggaca catctatttc tactgcttac 240

atggaactga atcggctcag gagcgatgat acagctgtct actactgcgc acgcgatcag 300

cctctcggat attgtaccaa tggagtttgt tcttacttcg actactgggg acagggaaca 360

ctcgtcactg tcagttccgc tagcaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc 420

tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 480

gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg 540

gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc 600

agcttgggca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg 660

gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 720

cctgaactcc tgggggacga ctcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 780

atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcga cgaagacggt 840

gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 900

cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgg gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 960

gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccacggccc 1020

atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 1080

cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 1140

ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1200

aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc 1260

gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1320

ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaatg a 1371

<210> 5

<211> 114

<212> PRT

<213> 氨基酸序列(人工序列)

<400> 5

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

1 5 10 15

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

20 25 30

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

35 40 45

Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

50 55 60

Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val

65 70 75 80

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

85 90 95

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

100 105 110

Thr Ser

<210> 6

<211> 345

<212> DNA

<213> 核苷酸序列(人工序列)

<400> 6

aactgggtga atgtaataag tgatttgaaa aaaattgaag atcttattca atctatgcat 60

attgatgcta ctttatatac ggaaagtgat gttcacccca gttgcaaagt aacagcaatg 120

aagtgctttc tcttggagtt acaagttatt tcacttgagt ccggagatgc aagtattcat 180

gatacagtag aaaatctgat catcctagca aacaacagtt tgtcttctaa tgggaatgta 240

acagaatctg gatgcaaaga atgtgaggaa ctggaggaaa aaaatattaa agaatttttg 300

cagagttttg tacatattgt ccaaatgttc atcaacactt cttga 345

<210> 7

<211> 1581

<212> DNA

<213> 核苷酸序列(人工序列)

<400> 7

caggtccagc tggtgcagtc tggtgccgaa gtgaagaagc caggtgcctc tgtcaaagtc 60

agctgtaaag ccagtggcta tacattcact ggatactaca tgcactgggt cagacaggca 120

cctggacagg gtctggaatg gatgggctgg attaaccctg actccggtgg tacaaactat 180

gcccagaagt tccagggtag agttactatg accagggaca catctatttc tactgcttac 240

atggaactga atcggctcag gagcgatgat acagctgtct actactgcgc acgcgatcag 300

cctctcggat attgtaccaa tggagtttgt tcttacttcg actactgggg acagggaaca 360

ctcgtcactg tcagttccgc tagcaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc 420

tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 480

gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg 540

gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc 600

agcttgggca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg 660

gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 720

cctgaactcc tgggggacga ctcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 780

atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcga cgaagacggt 840

gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 900

cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgg gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 960

gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccacggccc 1020

atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 1080

cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 1140

ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1200

aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc 1260

gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1320

ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtggagg tggtggatcc 1380

atcacgtgcc ctccccccat gtccgtggaa cacgcagaca tctgggtcaa gagctacagc 1440

ttgtactcca gggagcggta catttgtaac tctggtttca agcgtaaagc cggcacgtcc 1500

agcctgacgg agtgcgtgtt gaacaaggcc acgaatgtcg cccactggac aacccccagt 1560

ctcaaatgca ttagagactg a 1581

<210> 8

<211> 526

<212> PRT

<213> 氨基酸序列(人工序列)

<400> 8

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr

100 105 110

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

115 120 125

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

130 135 140

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

145 150 155 160

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

165 170 175

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

180 185 190

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

195 200 205

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val

210 215 220

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

225 230 235 240

Pro Glu Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

245 250 255

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

260 265 270

Val Asp Val Ser Asp Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

275 280 285

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

290 295 300

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

305 310 315 320

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

325 330 335

Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

340 345 350

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

355 360 365

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

370 375 380

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

385 390 395 400

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

405 410 415

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

420 425 430

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

435 440 445

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ile Thr Cys Pro

450 455 460

Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser Tyr Ser

465 470 475 480

Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys Arg Lys

485 490 495

Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala Thr Asn

500 505 510

Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp

515 520 525

<210> 9

<211> 1980

<212> DNA

<213> 核苷酸序列(人工序列)

<400> 9

caggtccagc tggtgcagtc tggtgccgaa gtgaagaagc caggtgcctc tgtcaaagtc 60

agctgtaaag ccagtggcta tacattcact ggatactaca tgcactgggt cagacaggca 120

cctggacagg gtctggaatg gatgggctgg attaaccctg actccggtgg tacaaactat 180

gcccagaagt tccagggtag agttactatg accagggaca catctatttc tactgcttac 240

atggaactga atcggctcag gagcgatgat acagctgtct actactgcgc acgcgatcag 300

cctctcggat attgtaccaa tggagtttgt tcttacttcg actactgggg acagggaaca 360

ctcgtcactg tcagttccgc tagcaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc 420

tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 480

gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg 540

gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc 600

agcttgggca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg 660

gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 720

cctgaactcc tgggggacga ctcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 780

atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcga cgaagacggt 840

gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 900

cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgg gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 960

gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccacggccc 1020

atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 1080

cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 1140

ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1200

aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc 1260

gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1320

ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtggagg tggtggatcc 1380

atcacgtgcc ctccccccat gtccgtggaa cacgcagaca tctgggtcaa gagctacagc 1440

ttgtactcca gggagcggta catttgtaac tctggtttca agcgtaaagc cggcacgtcc 1500

agcctgacgg agtgcgtgtt gaacaaggcc acgaatgtcg cccactggac aacccccagt 1560

ctcaaatgca ttagagacag cggagggtcc ggcggaggcg gaagcggagg cggaggaagc 1620

ggcggtggcg gcagcaactg ggtgaatgta ataagtgatt tgaaaaaaat tgaagatctt 1680

attcaatcta tgcatattga tgctacttta tatacggaaa gtgatgttca ccccagttgc 1740

aaagtaacag caatgaagtg ctttctcttg gagttacaag ttatttcact tgagtccgga 1800

gatgcaagta ttcatgatac agtagaaaat ctgatcatcc tagcaaacga cagtttgtct 1860

tctaatggga atgtaacaga atctggatgc aaagaatgtg aggaactgga ggaaaaaaat 1920

attaaagaat ttttgcagag ttttgtacat attgtccaaa tgttcatcaa cacttcttga 1980

<210> 10

<211> 659

<212> PRT

<213> 氨基酸序列(人工序列)

<400> 10

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr

100 105 110

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

115 120 125

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

130 135 140

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

145 150 155 160

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

165 170 175

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

180 185 190

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

195 200 205

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val

210 215 220

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

225 230 235 240

Pro Glu Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

245 250 255

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

260 265 270

Val Asp Val Ser Asp Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

275 280 285

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

290 295 300

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

305 310 315 320

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

325 330 335

Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

340 345 350

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

355 360 365

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

370 375 380

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

385 390 395 400

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

405 410 415

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

420 425 430

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

435 440 445

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ile Thr Cys Pro

450 455 460

Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser Tyr Ser

465 470 475 480

Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys Arg Lys

485 490 495

Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala Thr Asn

500 505 510

Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp Ser Gly

515 520 525

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

530 535 540

Ser Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu

545 550 555 560

Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val

565 570 575

His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu

580 585 590

Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val

595 600 605

Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn

610 615 620

Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn

625 630 635 640

Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile

645 650 655

Asn Thr Ser

<210> 11

<211> 1680

<212> DNA

<213> 核苷酸序列(人工序列)

<400> 11

gatattcaga tgactcaatc tccctcctct gtgtctgcta gtgttggaga tcgcgttacc 60

atcacttgta gggcttccca aggcatctac tcttggctcg catggtatca acagaagcca 120

ggcaaggcac ctaacctcct catctacact gcctccaccc tccagtctgg tgtgccttct 180

cgcttcagtg gatctgggtc tggcaccgat ttcactctga ctatttctag cctccagcct 240

gaggactttg ctacatacta ttgccaacag gccaacatct tcccactgac tttcggaggc 300

ggtactaaag tggaaatcaa acggaccgtg gcggcgccat ctggaggcgg agggagcgga 360

ggtggtggta gtggaggtgg tggcagccag gtccagctgg tgcagtctgg tgccgaagtg 420

aagaagccag gtgcctctgt caaagtcagc tgtaaagcca gtggctatac attcactgga 480

tactacatgc actgggtcag acaggcacct ggacagggtc tggaatggat gggctggatt 540

aaccctgact ccggtggtac aaactatgcc cagaagttcc agggtagagt tactatgacc 600

agggacacat ctatttctac tgcttacatg gaactgaatc ggctcaggag cgatgataca 660

gctgtctact actgcgcacg cgatcagcct ctcggatatt gtaccaatgg agtttgttct 720

tacttcgact actggggaca gggaacactc gtcactgtca gttccgctag cgagcccaaa 780

tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct gggggacgac 840

tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 900

gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagcgac gaagacggtg aggtcaagtt caactggtac 960

gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 1020

acgtaccggg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1080

tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccacggccca tcgagaaaac catctccaaa 1140

gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 1200

accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1260

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1320

gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1380

caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1440

aagagcctct ccctgtctcc gggtggaggt ggtggatcca tcacgtgccc tccccccatg 1500

tccgtggaac acgcagacat ctgggtcaag agctacagct tgtactccag ggagcggtac 1560

atttgtaact ctggtttcaa gcgtaaagcc ggcacgtcca gcctgacgga gtgcgtgttg 1620

aacaaggcca cgaatgtcgc ccactggaca acccccagtc tcaaatgcat tagagactga 1680

<210> 12

<211> 559

<212> PRT

<213> 氨基酸序列(人工序列)

<400> 12

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Thr Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ile Phe Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly

130 135 140

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly

145 150 155 160

Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp

165 170 175

Met Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys

180 185 190

Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala

195 200 205

Tyr Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

210 215 220

Cys Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser

225 230 235 240

Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

245 250 255

Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

260 265 270

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

275 280 285

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

290 295 300

Val Val Asp Val Ser Asp Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

305 310 315 320

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

325 330 335

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

340 345 350

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

355 360 365

Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

370 375 380

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

385 390 395 400

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

405 410 415

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

420 425 430

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

435 440 445

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

450 455 460

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

465 470 475 480

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ile Thr Cys

485 490 495

Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser Tyr

500 505 510

Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys Arg

515 520 525

Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala Thr

530 535 540

Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp

545 550 555

<210> 13

<211> 2079

<212> DNA

<213> 核苷酸序列(人工序列)

<400> 13

gatattcaga tgactcaatc tccctcctct gtgtctgcta gtgttggaga tcgcgttacc 60

atcacttgta gggcttccca aggcatctac tcttggctcg catggtatca acagaagcca 120

ggcaaggcac ctaacctcct catctacact gcctccaccc tccagtctgg tgtgccttct 180

cgcttcagtg gatctgggtc tggcaccgat ttcactctga ctatttctag cctccagcct 240

gaggactttg ctacatacta ttgccaacag gccaacatct tcccactgac tttcggaggc 300

ggtactaaag tggaaatcaa acggaccgtg gcggcgccat ctggaggcgg agggagcgga 360

ggtggtggta gtggaggtgg tggcagccag gtccagctgg tgcagtctgg tgccgaagtg 420

aagaagccag gtgcctctgt caaagtcagc tgtaaagcca gtggctatac attcactgga 480

tactacatgc actgggtcag acaggcacct ggacagggtc tggaatggat gggctggatt 540

aaccctgact ccggtggtac aaactatgcc cagaagttcc agggtagagt tactatgacc 600

agggacacat ctatttctac tgcttacatg gaactgaatc ggctcaggag cgatgataca 660

gctgtctact actgcgcacg cgatcagcct ctcggatatt gtaccaatgg agtttgttct 720

tacttcgact actggggaca gggaacactc gtcactgtca gttccgctag cgagcccaaa 780

tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct gggggacgac 840

tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 900

gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagcgac gaagacggtg aggtcaagtt caactggtac 960

gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 1020

acgtaccggg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1080

tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccacggccca tcgagaaaac catctccaaa 1140

gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 1200

accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1260

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1320

gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1380

caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1440

aagagcctct ccctgtctcc gggtggaggt ggtggatcca tcacgtgccc tccccccatg 1500

tccgtggaac acgcagacat ctgggtcaag agctacagct tgtactccag ggagcggtac 1560

atttgtaact ctggtttcaa gcgtaaagcc ggcacgtcca gcctgacgga gtgcgtgttg 1620

aacaaggcca cgaatgtcgc ccactggaca acccccagtc tcaaatgcat tagagacagc 1680

ggagggtccg gcggaggcgg aagcggaggc ggaggaagcg gcggtggcgg cagcaactgg 1740

gtgaatgtaa taagtgattt gaaaaaaatt gaagatctta ttcaatctat gcatattgat 1800

gctactttat atacggaaag tgatgttcac cccagttgca aagtaacagc aatgaagtgc 1860

tttctcttgg agttacaagt tatttcactt gagtccggag atgcaagtat tcatgataca 1920

gtagaaaatc tgatcatcct agcaaacgac agtttgtctt ctaatgggaa tgtaacagaa 1980

tctggatgca aagaatgtga ggaactggag gaaaaaaata ttaaagaatt tttgcagagt 2040

tttgtacata ttgtccaaat gttcatcaac acttcttga 2079

<210> 14

<211> 692

<212> PRT

<213> 氨基酸序列(人工序列)

<400> 14

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Thr Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ile Phe Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly

130 135 140

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly

145 150 155 160

Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp

165 170 175

Met Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys

180 185 190

Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala

195 200 205

Tyr Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

210 215 220

Cys Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser

225 230 235 240

Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

245 250 255

Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

260 265 270

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

275 280 285

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

290 295 300

Val Val Asp Val Ser Asp Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

305 310 315 320

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

325 330 335

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

340 345 350

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

355 360 365

Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

370 375 380

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

385 390 395 400

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

405 410 415

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

420 425 430

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

435 440 445

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

450 455 460

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

465 470 475 480

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ile Thr Cys

485 490 495

Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser Tyr

500 505 510

Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys Arg

515 520 525

Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala Thr

530 535 540

Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp Ser

545 550 555 560

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

565 570 575

Gly Ser Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp

580 585 590

Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp

595 600 605

Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu

610 615 620

Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr

625 630 635 640

Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser Asn Gly

645 650 655

Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys

660 665 670

Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe

675 680 685

Ile Asn Thr Ser

690

<210> 15

<211> 909

<212> DNA

<213> 核苷酸序列(人工序列)

<400> 15

gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60

ggggacgact cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120

acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagcgacg aagacggtga ggtcaagttc 180

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240

tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cacggcccat cgagaaaacc 360

atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 420

gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 480

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 600

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660

tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtggaggtg gtggatccat cacgtgccct 720

ccccccatgt ccgtggaaca cgcagacatc tgggtcaaga gctacagctt gtactccagg 780

gagcggtaca tttgtaactc tggtttcaag cgtaaagccg gcacgtccag cctgacggag 840

tgcgtgttga acaaggccac gaatgtcgcc cactggacaa cccccagtct caaatgcatt 900

agagactga 909

<210> 16

<211> 302

<212> PRT

<213> 氨基酸序列(人工序列)

<400> 16

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser Asp Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ile Thr Cys Pro

225 230 235 240

Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser Tyr Ser

245 250 255

Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys Arg Lys

260 265 270

Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala Thr Asn

275 280 285

Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp

290 295 300

Claims

1.一种多聚体融合蛋白，其特征在于，

所述多聚体融合蛋白由能与CD40结合的单克隆抗体的轻链、C端连接有细胞因子IL-15的受体α的sushi区的能与CD40结合的单克隆抗体的重链、细胞因子IL-15三部分组成，

三部分在ExpiCHO-S细胞中单独表达，然后在细胞内组装成多聚体融合蛋白，

细胞因子IL-15的受体α的sushi区的N端通过连接肽连接在能与CD40结合的单克隆抗体的重链的C端；

能与CD40结合的单克隆抗体的轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，能与CD40结合的单克隆抗体的重链的氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，细胞因子IL-15的氨基酸序列为SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。

2.一种多聚体融合蛋白，其特征在于，

所述多聚体融合蛋白由两部分组成，第一部分为能与CD40结合的单链抗体连接Fc区，再连接细胞因子IL-15的受体α的sushi区，第二部分为细胞因子IL-15；

两部分在ExpiCHO-S细胞中单独表达，然后在细胞内组装成多聚体融合蛋白，

第一部分的氨基酸序列为SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列，第二部分的氨基酸序列为SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。

3.权利要求1或2所述的多聚体融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

步骤1，构建表达融合蛋白的载体；

步骤2，将构建的表达载体转染细胞；

步骤3，由细胞中获得表达的融合蛋白；

在步骤3之后，还包括步骤4，对融合蛋白进行纯化。

4.权利要求1或2所述的多聚体融合蛋白在制备治疗肿瘤药物方面的应用。