CN109280085A - 一种异二聚体蛋白及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种异二聚体蛋白，所述的异二聚体蛋白包含两个CH3区的相互结合的多肽，其中第一多肽的CH3区和第二多肽的CH3区引入氨基酸突变，在其相互作用面上形成具有极性相互作用的氨基酸对，以形成特异性相互作用的异二聚体蛋白。本发明的异二聚体蛋白可防止Fc错配，避免同二聚体形成，并且收率高、稳定性好。

Description

一种异二聚体蛋白及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种异二聚体蛋白，包括组成异二聚体蛋白的单独的多肽、编 码这些多肽的核酸序列，本发明还涉及形成异二聚体蛋白的方法。

技术背景

抗体靶向药物具有特异性高、副作用小、半衰期长等优势，是一种非常具 有发展前途的生物治疗的方法。目前FDA已批准超过48种抗体药物用于临床 疾病治疗，有超过17种抗体药物批准用于肿瘤临床治疗，更多的抗体候选药 物正在进行临床前及临床研究。目前，抗体靶向药物已逐渐成为肿瘤临床治疗 的重要手段。然而，由于肿瘤发生、发展的复杂性和多因素性，决定了仅仅依 靠单一靶标的单靶向抗体很难取得更好的疗效。因此，绝大多数的患者在治疗 过程中逐渐产生耐受和复发。因此，迫切需要研发具有更好疗效的靶向抗体用 于临床疾病治疗。双/多靶向抗体由于能够靶向多个靶点，具有比单靶向抗体 更好的临床应用潜力，是目前靶向抗体研究领域的热点。

自然状态下不存在双/多特异性抗体，只能通过特殊方法进行制备。目前 FDA已经批准的两个双靶向抗体药物Blinatumomab和Catumaxomab，分别是借 助基因工程方法和杂交瘤技术制备的双特异性抗体。然而，由于杂交瘤法生产 的双特异抗体，其轻链、重链随机配对产生的多种可能抗体形式，使得双特异 抗体生产、纯化变得非常困难。而且，这种大鼠与小鼠杂交瘤生产的双特异性 抗体，由于是异种来源，极大限制了其在临床的疗效。因此，目前绝大多数进 行临床试验的双靶向抗体药物都是采用基因工程技术进行制备。众所周知，全 抗体IgG的结构在临床治疗中具有很多优势，对抗体诱导的ADCC(抗体依赖的 细胞介导的细胞毒性作用)/ADCP(抗体依赖的细胞介导的吞噬作用)杀伤、抗体 在肿瘤组织的扩散以及抗体的半衰都具有非常重要的作用。目前 Knobs-into-Holes(KIH)技术是制备具有类似全抗体IgG结构双/多特异性抗 体的主要技术之一。KIH技术是将Fc中的两个CH3区域接触面进行氨基酸突变， 在一侧CH3接触面区域将一个侧链小的氨基酸突变成一个侧链大的氨基酸，同 时将另一侧CH3接触面区域的某些氨基酸突变成侧链小的氨基酸。同时，在两 个CH3区域之间引入一个二硫键来进一步巩固异二聚体的结合能力。然而在他 们研究结果中，依然会有大约5％形成同二聚体(Brinkmann U,Kontermann RE. The making ofbispecific antibodies.MAbs.2017；9(2):182–212.)，为 后续产业化生产、纯化带来一定困难。

为了解决上述问题，本发明公开了一种异二聚体蛋白的制备方法，所涉及 的异二聚体蛋白包含两个经过相应改造的CH3区域的多肽，它们相互作用促使 两个包含相应改造的CH3区域多肽的异二聚体形成，防止Fc错配，避免同二 聚体形成。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种异二聚体蛋白。

本发明的另一个目的是提供一种异二聚体蛋白的制备方法。

在本发明的第一方面，提供了一种异二聚体蛋白，所述异二聚体蛋白包含 两个CH3区的相互结合的多肽，其中第一多肽的CH3区和第二多肽的CH3区引 入氨基酸突变，在其相互作用面上形成具有极性相互作用的氨基酸对，以形成 特异性相互作用的异二聚体蛋白，其中，所述的氨基酸突变包括：

第一多肽的CH3区的D356K、Q347K和D399K与第二多肽CH3区的K439D、 K360E、K409D和K392D；

或者第一多肽的CH3区的D356K、Q347K和D399K与第二多肽CH3区的 K439E、K360E、K409D和K392D。

在另一优选例中，所述的氨基酸突变还包括：第一多肽的CH3区的K392C。

在另一优选例中，所述的氨基酸突变还包括：第二多肽的CH3区的D399C。

在另一优选例中，所述的氨基酸突变包括：第一多肽的CH3区D356K、 Q347K、D399K和K392C与第二多肽的CH3区K439D、K360E、K409D、K392D和 D399C；

或所述的氨基酸突变包括：第一多肽的CH3区D356K、Q347K、D399K和K392C 与第二多肽的CH3区K439E、K360E、K409D、K392D和D399C。

在另一优选例中，所述异二聚体的多肽对为选自下组序列所示的多肽对之 一：

SEQ ID NO:18所示的第一多肽和SEQ ID NO:20所示的第二多肽；(注： test1-1)

SEQ ID NO:18所示的第一多肽和SEQ ID NO:22所示的第二多肽；(注： test1-2)

SEQ ID NO:24所示的第一多肽和SEQ ID NO:26所示的第二多肽；(注： test1-5)和

SEQ ID NO:24所示的第一多肽和SEQ ID NO:28所示的第二多肽。(注： test1-6)。

在另一优选例中，所述异二聚体蛋白为抗体蛋白或融合蛋白。

在另一优选例中，所述异二聚体蛋白为双靶向抗体或双靶向融合蛋白。

在另一优选例中，所述异二聚体蛋白的结构类型为下述结构之一：

包含两条Fab/scFv/融合受体或配体-CH2-CH3链的Y字体；

包含两条Fab/scFv/融合受体或配体-CH3链的Y字体；

包含两条Fab/scFv/融合受体或配体-Fab/scFv/融合受体或配体-CH2-CH3 链的Y字体；或

包含两条Fab/scFv/融合受体或配体-Fab/scFv/融合受体或配体-CH3链的 Y字体。

在另一优选例中，所述异二聚体蛋白包括在第一多肽的CH3区与第二多肽 的CH3区之间通过氨基酸突变形成二硫键，并且所述二硫键的形成来自第一多 肽的CH3区的K392C和来自第二多肽的CH3区的D399C。

在另一优选例中，所述异二聚体蛋白包括抗肿瘤的抗体。

在本发明的第二方面，提供了一种制备如本发明第一方面所述异二聚体蛋 白的方法，所述方法中在第一多肽的CH3区和第二多肽的CH3区引入氨基酸突 变，在其相互作用面上形成具有极性相互作用的氨基酸对。

在另一优选例中，在CH3区引入氨基酸突变的氨基酸在蛋白的空间结构上 分布于两个多肽相互接触面的外周。

在另一优选例中，所述方法利用第一多肽的CH3区和第二多肽的CH3区之 间形成的正负电荷相互作用和形成二硫键相结合的方式，使得所述二聚体形 成。

在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物或制剂，所述药物组合物或 制剂中包含：

(i)如本发明第一方面所述的异二聚体蛋白；

(ii)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述药物组合物或制剂选自下组：混悬制剂、液体制剂 或冻干制剂。

在另一优选例中，所述液体制剂为水针制剂。

在另一优选例中，所述液体制剂的保存期限为一年至三年，较佳地一年至 两年，更佳地一年。

在另一优选例中，所述液体制剂的保存温度为0℃-16℃，较佳地0℃-10 ℃，更佳地2℃-8℃。

在另一优选例中，所述冻干制剂的保存期限为半年至两年，较佳地半年至 一年，更佳地半年。

在另一优选例中，所述冻干制剂的保存温度为≤42℃，较佳地≤37℃，更 佳地≤30℃。

在另一优选例中，所述药学上可接受的载体包括：表面活性剂、溶液稳定 剂、等渗调节剂、缓冲液，或其组合。

在另一优选例中，所述溶液稳定剂选自下组：糖类溶液稳定剂、氨基酸类 溶液稳定剂、醇类溶液稳定剂，或其组合。

在另一优选例中，所述糖类溶液稳定剂选自下组：还原性糖类溶液稳定剂 或非还原性糖类溶液稳定剂。

在另一优选例中，所述氨基酸类溶液稳定剂选自下组：谷氨酸单钠或组氨 酸。

在另一优选例中，所述醇类溶液稳定剂选自下组：三元醇、高级糖醇、丙 二醇、聚乙二醇，或其组合。

在另一优选例中，所述等渗调节剂选自下组：氯化钠或甘露醇。

在另一优选例中，所述缓冲液选自下组：TRIS、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓 冲液，或其组合。

在另一优选例中，所述药物组合物或制剂的施用对象为包括人或非人动 物。

在另一优选例中，所述非人动物包括：啮齿动物(如大鼠、小鼠)、灵长动 物(如猴)。

在另一优选例中，所述组分(i)占所述药物组合物或制剂总重量的 0.1-99.9wt％，较佳地10-99.9wt％，更佳地20-99.9wt％。

在另一优选例中，在所述药物组合物或制剂的施用中，施用的量为 0.01-10g/天，较佳地0.05-5000mg/天，更佳地0.1-3000mg/天。

在另一优选例中，所述药物组合物或制剂用于抑制和/或治疗肿瘤。

在另一优选例中，所述抑制和/或治疗肿瘤包括伴随肿瘤生长相关症状发 展的延迟和/或这些症状严重程度的降低。

在另一优选例中，所述抑制和/或治疗肿瘤还包括已存在的肿瘤生长伴随 症状的减轻并防止其他症状的出现。

在另一优选例中，对于肿瘤的治疗，所述药物组合物或制剂可以和其他的 抗肿瘤药联合给药。

在另一优选例中，所述联合给药的抗肿瘤药选自下组：细胞毒类药物、激 素类抗雌激素、生物反应调节剂、单克隆抗体、或其他一些目前机制不明和有 待进一步研究的药物。

在另一优选例中，所述细胞毒类药物包括：作用于DNA化学结构的药物、 影响核酸合成的药物、作用于核酸转录的药物、主要作用于微管蛋白合成的药 物，或其他细胞毒药。

在另一优选例中，所述作用于DNA化学结构的药物包括：烷化剂如氮芥类、 亚硝尿类、甲基磺酸酯类；铂类化合物如顺铂、卡铂、草酸铂；丝裂霉素(MMC)。

在另一优选例中，所述影响核酸合成的药物包括：二氢叶酸还原酶抑制剂 如甲氨喋呤(MTX)和Alimta等；胸腺核苷合成酶抑制剂如氟尿嘧啶类(5FU、 FT-207、卡培他滨)等；嘌呤核苷合成酶抑制剂如6-巯基嘌呤(6-MP)和6-TG 等；核苷酸还原酶抑制剂如羟基脲(HU)等；DNA多聚酶抑制剂如阿糖胞苷(Ara-C) 和健择(Gemz)等。

在另一优选例中，所述作用于核酸转录的药物包括：选择性作用于DNA模 板，抑制DNA依赖RNA聚合酶，从而抑制RNA合成的药物如：放线菌素D、柔 红霉素、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素等。

在另一优选例中，所述主要作用于微管蛋白合成的药物包括：紫杉醇、泰 索帝、长春花碱、长春瑞滨、鬼臼硷类、高三尖杉酯碱。

在另一优选例中，所述其他细胞毒药包括：主要抑制蛋白质的合成的门冬 酰胺酶。

在另一优选例中，所述激素类抗雌激素包括：三苯氧胺、屈洛昔芬、依西 美坦等；芳香化酶抑制剂：氨鲁米特、兰特隆、来曲唑、瑞宁德等；抗雄激素： 氟它氨RH-LH激动剂/拮抗剂：诺雷德、依那通等。

在另一优选例中，所述生物反应调节剂包括：干扰素；白细胞介素-2； 胸腺肽类。

在另一优选例中，所述单克隆抗体包括：美罗华(MabThera)；Cetuximab (C225)；赫赛汀(Trastuzumab)；Bevacizumab(Avastin)；Yervoy (Ipilimumab)；Nivolumab(OPDIVO)；Pembrolizumab(Keytruda)； Atezolizumab(Tecentriq)。

在本发明的第四方面，提供了一种如本发明第一方面所述异二聚体蛋白的 用途，其特征在于，用于制备治疗肿瘤的药物或抗病毒的药物。

在本发明第五方面，提供了一种在包含CH3区的多肽之间形成异二聚体的 方法，包括在组成所述多肽的两个CH3区的相互作用面上引入氨基酸突变，形 成具有极性相互作用的氨基酸对，以形成特异性相互作用的异二聚体蛋白；其 中所述引入氨基酸突变的氨基酸在蛋白的空间结构上分布于两个多肽相互接 触面的外周。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施 例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技 术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为IgG1抗体结构及不同区域示意图；

图中：VH为抗体重链可变区，VL为抗体轻链可变区，CH1为抗体重链恒定 区1，CL为抗体轻链恒定区，Hinge为抗体铰链区，CH2为抗体重链恒定区2， CH3为抗体重链恒定区3。

图2为CH3异二聚体形成的空间结构示意图；

其中，在CH3异二聚体对照组a、b中，相互作用接触面包括了深色部分 和浅色部分，浅色部分表示CH3异二聚体对照组的突变位点在CH3异二聚体相 互作用面上的位置；在Key1和Lock1中，深色部异分表示CH3二聚体相互作 用接触面，浅灰色表示Test1突变位点在CH3异二聚体相互作用面上的位置。

图3显示异二聚体蛋白的几种结构组合示意图；

A.为抗体Fab、单链抗体(scFv)、受体蛋白膜外区或者配体与抗体铰链区 (hinge)或linker以及CH2、CH3串联形成多肽链，借助本发明提供的一对CH3 区(或片段)形成特异性的组合；

B.为抗体Fab、单链抗体(scFv)、受体蛋白膜外区或者配体与抗体铰链区 (hinge)或linker以及CH3串联形成多肽链，借助本发明提供的一对CH3区(或 片段)形成特异性的组合；

C.为抗体Fab、单链抗体(scFv)、受体蛋白膜外区或者配体与抗体铰链区 (hinge)或linker以及CH3串联形成多肽链，借助本发明提供的一对CH3区(或 片段)形成特异性的组合；

D.为抗体Fab、单链抗体(scFv)、受体蛋白膜外区或者配体通过linker 与抗体Fab、单链抗体(scFv)、受体蛋白膜外区或配体连接后，与抗体铰链区 (hinge)或linker以及CH2和CH3串联形成多肽链，借助本发明提供的一对CH3 区(或片段)形成特异性的组合；

E.为抗体Fab、单链抗体(scFv)、受体蛋白膜外区或者配体通过linker 与抗体Fab、单链抗体(scFv)、受体蛋白膜外区或配体连接后，与抗体铰链区 (hinge)或linker以及CH3串联形成多肽链，借助本发明提供的一对CH3区(或 片段)形成特异性的组合；

F.为抗体Fab、单链抗体(scFv)、受体蛋白膜外区或者配体通过linker 与抗体Fab、单链抗体(scFv)、受体蛋白膜外区或配体连接后，与抗体铰链区 (hinge)或linker以及CH3串联形成多肽链，借助本发明提供的一对CH3区(或 片段)形成特异性的组合。

图4为改造后CH3-CH3异二聚体蛋白氨基酸突变方式演示图；

分别在CH3-CH3野生型氨基酸相应位点突变为如图所示相应氨基酸，其中 包括对照组、实验组Test1、Test1-2、Test2、Test2-2、Test1-5、Test1-6。 其中对照组包括对照组a、对照组b；Test1包括Key1、Lock1；Test1-2包括 Key1、Lock1-2；Test2包括Key2、Lock2；Test2-2包括key2、lock2-2；Test1-5 包括key1-5、lock1-5；Test1-6包括key1-5、lock1-6。

图5为分子动力学模拟CH3-CH3结构稳定性评价结果；

分别对CH3-CH3二聚体的wt及Test1、Test1-2、Test2、Test2-2以及对 照组进行分子动力学模拟，分别在300K和355K温度下，进行1微秒时间尺度 的模拟。采用方均根偏移(RMSD)分析不同时间CH3二聚体空间结构的变化。如 图所示，300K温度下都能够保持结构的相对稳定，而在355K高温下，WT依然 保持结构的稳定，对照组的结构发生相对较大的波动，而实验组基本保持相对 稳定。

图6为验证本发明异二聚体蛋白组装效率而设计的试验模型结构示意图；

该模型的左侧部分为完整的C225抗体重轻链组合，右侧部分将抗体的Fab 区用CL替换后组成的CH3异二聚体蛋白验证模型。按照本发明所述的突变位 点，分别在左右两侧的CH3区引入相应突变位点。由于左右两侧重链的分子量 有显著差异，因此可以快速评价异二聚体蛋白组装效率。

图7为异二聚体蛋白聚合稳定性检测结果；

分别将PD-1全抗体、对照组和实验组采用PBS稀释至1μg/ml后，在37 度水浴孵育1、3、7天后，进行SDS/PAGE后采用银染分析其稳定性。

图8为采用流式法检测异二聚体蛋白对靶蛋白EGFR的结合；

将EGFR阳性细胞与抗体孵育后，采用荧光二抗染色并采用流式细胞仪检 测其平均荧光强度(MFI)。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量地筛选，首次意外地开发了一 种异二聚体抗蛋白及其制备方法。该方法是在两个CH3区域相互接触面进行相 应极性改造，使得包含CH3区域的多肽形成异二聚体蛋白，有效避免包含CH3 区域的多肽形成同二聚体蛋白,进一步降低同聚错配几率。在此基础上完成了本 发明。

异二聚体蛋白

根据本发明的一个方面，所述异二聚体蛋白包括两个包含CH3区的相互结 合的多肽，其中第一多肽的CH3区和第二多肽的CH3区引入氨基酸突变，在其 相互作用面上形成具有极性相互作用的氨基酸对，以形成特异性相互作用的异 二聚体蛋白。

与KIH技术中将Fc中的两个CH3区域接触面的氨基酸进行突变形成异二 聚体的方法不同，本发明构建异二聚体蛋白的出发点在于引入氨基酸突变的氨 基酸在蛋白的空间结构上分布于两个多肽相互接触面的外周(如图2所示)。

在本发明中，用于形成异二聚体的多肽可以是任何至少包含完整CH3区域 或部分CH3区域的蛋白，例如抗体蛋白、融合蛋白等。

在形成的异二聚体的具体结构中，可选的是下述结构类型：

包含两条Fab/scFv/融合受体或配体-CH2-CH3链的Y字体(如图3A所示)；

包含两条Fab/scFv/融合受体或配体-CH3链的Y字体(如图3B、3C所示)；

包含两条Fab/scFv/融合受体或配体-Fab/scFv/融合受体或配体-CH2-CH3 链的Y字体(如图3D所示)；

包含两条Fab/scFv/融合受体或配体-Fab/scFv/融合受体或配体-CH3链的 Y字体(如图3E、3F所示)；

以上结构类型仅为示例形式，并不限制本发明，本领域技术人员可以理解 的是本发明的要点是在两个多肽的CH3区的氨基酸发生极性相互作用，对于多 肽的类型并不限制。

进一步地，其中所述第一多肽的CH3区(第一CH3区)在所选择位点的氨基 酸突变为带有正电荷的赖氨酸；所述第二多肽的CH3区(第二CH3区)在所选择 位点的氨基酸突变为带有负电荷的谷氨酸或天冬氨酸；可选地，还可以在第一 CH3区与第二CH3区之间通过氨基酸突变形成二硫键，以形成更为稳定的空间 结构。

优选地，所述第一CH3区的氨基酸突变位点选自第356、347、399和392 位氨基酸，所述第二CH3的氨基酸突变位点选自第439、360、409、392和399 位氨基酸。上述突变位点的位置以Atwell S,Ridgway JBB,Wells JA,Carter P.Stable heterodimers fromremodeling the domain interface of a homodimer using a phage displaylibrary.-PubMed-NCBI.J Mol Biol. 1997；270(1):26–35.中CH3区氨基酸编号作为参考模板。

更优选地，所述第一CH3区的氨基酸突变选自D356K、Q347K、D399K和 K392C；所述第二CH3区的氨基酸突变选自K439D、K439E、K360E、K409D、K392D 和D339C(见图4)。

根据本发明的一个优选实施例，所述异二聚体蛋白的第一CH3区突变为D356K、Q347K和D399K，第二CH3区突变为K439D、K360E、K409D和K392D；

根据本发明另一个优选实施例，所述异二聚体蛋白的第一CH3区突变为 D356K、Q347K和D399K，第二CH3区突变为K439E、K360E、K409D和K392D；

根据本发明的再一个优选实施例，所述异二聚体蛋白的第一CH3区突变为 D356K、Q347K、D399K和K392C，第二CH3区突变为K439E、K360E、K409D、K392D 和D399C。

上述异二聚体蛋白可以是双靶向抗体或双靶向融合蛋白。

含异二聚体蛋白的制剂和给药方式

所述异二聚体蛋白可以和药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂从而 更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明的异二聚体蛋白氨基酸核心序列 的结构完整性，同时还要保护蛋白质的多官能团防止其降解(包括但不限于凝 聚、脱氨或氧化)。所述制剂可以是各种形态，通常情况下，对于液体制剂， 通常可以在2℃-8℃条件下至少稳定保存一年，对于冻干制剂，在30℃至 少六个月保持稳定。在这里制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂， 优选水针或冻干制剂。

对于本发明的异二聚体蛋白的水针或冻干制剂，其中药学上可以接受的辅 料包括表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合，其中表 面活性剂包括非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或 80)；poloxamer(如poloxamer188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂硫 酸钠；十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics；MONAQUATTM等，其 加入量应使异二聚体蛋白的颗粒化趋势最小，溶液稳定剂可以为糖类，包括还 原性糖和非还原性糖，氨基酸类包括谷氨酸单钠或组氨酸，醇类包括三元醇、 高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇之一或其组合，溶液稳定剂的加入量应该使最后 形成的制剂在本领域的技术人员认为达到在稳定的时间内保持稳定状态，等渗 调节剂可以为氯化钠、甘露醇之一，缓冲液可以为TRIS、组氨酸缓冲液、磷酸 盐缓冲液之一。

使用上述异二聚体蛋白及其药物制剂在对包括人在内的动物给药时，给药 剂量因病人的年龄和体重、疾病特性和严重性、以及给药途径而异，可以参考 动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。具体讲静脉注射的 剂量是0.1～3000mg/天。

本发明的异二聚体蛋白和含有其的药物制剂可以作为抗肿瘤药物用于肿 瘤治疗，本发明所称的抗肿瘤药物，指具有抑制和/或治疗肿瘤的药物，可以 包括伴随肿瘤生长相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，它进 一步还包括已存在的肿瘤生长伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还也减 少或防止转移。

上述异二聚体蛋白及其药物制剂还可以和其他的抗肿瘤药联合给药，用于 肿瘤的治疗，这些用于联合给药的抗肿瘤药包括但不限于：1、细胞毒类药物 (1)作用于DNA化学结构的药物：烷化剂如氮芥类、亚硝尿类、甲基磺酸酯类； 铂类化合物如顺铂、卡铂和草酸铂等；丝裂霉素(MMC)；(2)影响核酸合成的药 物：二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨喋呤(MTX)和Alimta等；胸腺核苷合成酶抑 制剂如氟尿嘧啶类(5FU、FT-207、卡培他滨)等；嘌呤核苷合成酶抑制剂如6- 巯基嘌呤(6-MP)和6-TG等；核苷酸还原酶抑制剂如羟基脲(HU)等；DNA多聚酶 抑制剂如阿糖胞苷(Ara-C)和健择(Gemz)等；(3)作用于核酸转录的药物：选择 性作用于DNA模板，抑制DNA依赖RNA聚合酶，从而抑制RNA合成的药物如： 放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素等；(4) 主要作用于微管蛋白合成的药物：紫杉醇、泰索帝、长春花碱、长春瑞滨、鬼 臼硷类、高三尖杉酯碱；(5)其他细胞毒药：门冬酰胺酶主要抑制蛋白质的合 成；2、激素类抗雌激素：三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦等；芳香化酶抑制 剂：氨鲁米特、兰特隆、来曲唑、瑞宁德等；抗雄激素：氟它氨RH-LH激动剂 /拮抗剂：诺雷德、依那通等；3、生物反应调节剂：主要通过机体免疫功能抑 制肿瘤干扰素；白细胞介素-2；胸腺肽类；4、单克隆抗体：美罗华(MabThera)； Cetuximab(C225)；赫赛汀(Trastuzumab)；Bevacizumab(Avastin)；Yervoy (Ipi limumab)；Nivolumab(OPDIVO)；Pembrolizumab(Keytruda)； Atezolizumab(Tecentriq)；5、其他括一些目前机制不明和有待进一步研究 的药物；细胞分化诱导剂如维甲类；细胞凋亡诱导剂。

制备方法

根据本发明的另一方面，提供一种在包含CH3区的多肽之间形成异二聚体 的方法，该方法包括在组成所述多肽的两个CH3区的相互作用面上引入氨基酸 突变，形成具有极性相互作用的氨基酸对，以形成特异性相互作用的异二聚体 蛋白。优选地，所述两个CH3区的相互作用面在蛋白的空间结构上分布于两个 多肽相互接触面的外周。

根据本发明的另一个方面，具体建立了上述异二聚体蛋白的制备方法。

在本发明的异二聚体蛋白制备方法中，可以使用任何合适的载体，可选自 pDR1、pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1/ZEO(+)、pDHFR之一，表达载体中包括连接有 合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序列。

真核/原核宿主细胞均可用于本发明的异二聚体蛋白的表达，真核宿主细 胞优选哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统，优选COS、CHO、NS0、sf9及sf21 等细胞均；原核宿主细胞优选为DH5a、BL21(DE3)、TG1之一。

可在表达条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达异二聚体蛋白，分离或 纯化所述的异二聚体蛋白。

可以利用亲和层析的方法对本发明公开的异二聚体蛋白进行分离纯化，根 据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变PH等 方法洗脱结合在亲和柱上的异二聚体蛋白。

利用上述方法，可以将异二聚体蛋白纯化为基本均一的物质，例如在 SDS-PAGE电泳上为单一条带。

为验证本发明所描述的CH3异二聚体蛋白，本发明人设计了便于进行验证 CH3异二聚体蛋白组合效率的试验验证模型(图6)。如图6所示，左侧部分为 完整抗体重轻链组合；为了便于通过分子量大小快速鉴定出CH3异二聚体蛋白 组合效率，本发明人在右侧部分，将抗体的抗原结合区(Fab)替换为CL。这样 的好处是，如果存在CH3异二聚体蛋白的错误组装(CH3同二聚体)，其分子量 大小有显著性差异，进而能够快速评价CH3异二聚体蛋白的组装效率。

所述制备异二聚体蛋白的方法具体包括以下步骤：

1)克隆抗体的可变区基因；

2)将抗体重链可变区基因与人抗体IgG1抗体CH1及Fc区进行融合，构建 第一抗体C225VH-CH1-Hinge-CH2-CH3融合片段；(本发明中，C225VH指C225 抗体重链可变区,CH1为抗体重链恒定区1，Hinge为抗体铰链区，CH2、CH3 分别为抗体重链恒定区2、3)

将第一抗体轻链可变区基因与人抗体CL进行融合，构建第一抗体 C225VL-CL融合片段；(本发明中，C225VL指C225抗体轻链可变区，CL指轻链 恒定区)

将CL与IgG1抗体Fc区进行融合，构建CL-Hinge-CH2-CH3融合片段；

3)分别对第一抗体的CH3区域和第二抗体的CH3区域构建突变体，突变方 式选自如下(见图4)：第一CH3区突变为D356K、Q347K和D399K，第二CH3区 突变为K439D、K360E、K409D和K392D；

或第一CH3区突变为D356K、Q347K和D399K，第二CH3区突变为K439E、 K360E、K409D和K392D；

或第一CH3区突变为D356K、Q347K、D399K和K392C，第二CH3区突变为 K439D、K360E、K409D、K392D和D399C；

或第一CH3区突变为D356K、Q347K、D399K和K392C，第二CH3区突变为 K439E、K360E、K409D、K392D和D399C；

4)分别将包含第一CH3区突变体的融合基因C225VH-CH1-Hinge-CH2-CH3，C225VL-CL以及包含第二CH3区突变体的融合基因CL-Hinge-CH2-CH3，装入表 达载体；

5)将上述装入表达载体的融合基因C225VH-CH1-Hinge-CH2-CH3、 C225VL-CL、CL-Hinge-CH2-CH3进行共转表达，通过分离纯化得到异二聚体蛋 白；其中所述表达载体为pcDNA3.1(+)(Invitrogen公司产品)，用PEI法转染 293F细胞(Thermo Fisher)，采用无血清培养基培养9天后，用Protein A层 析柱，通过亲和层析从细胞培养物的上清中纯化得到异二聚体蛋白。

本发明的主要优点包括：本发明提供了一种异二聚体抗蛋白及其制备方 法。该方法是在两个CH3区域相互接触面进行相应极性改造，使得包含CH3区 域的多肽形成异二聚体蛋白，有效避免包含CH3区域的多肽形成同二聚体蛋白, 进一步降低同聚错配几率。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂 商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

如无特别说明，实施例所用的材料和试剂均为市售产品。

以下实施例以C225单抗和CL-Hinge-CH2-CH3融合蛋白，示例性说明异二 聚体的构建过程。本领域技术人员可以根据需要选择其他抗体或蛋白作为形成 异二聚体的第一多肽和第二多肽。

实施例1：第一抗体可变区克隆

参照专利(PCT/US1996/009847),合成C225重链可变区基因和轻链可变区 基因，分别命名为C225VH和C225VL。抗体信号肽氨基酸序列 MGWSCIILFLVATATGVHS。SEQ ID NO：2显示C225重链可变区的氨基酸序列，其 核苷酸序列为SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：4为C225轻链可变区的氨基酸序列， 其核苷酸序列为SEQ ID NO：3。

实施例2：人源IgG1抗体CL、重链CH1、Fc区的克隆

用淋巴细胞分离液(生工生物工程股份有限公司产品)分离健康人淋巴细 胞，用Trizol试剂(Life公司产品)提取总RNA，根据文献(Cloned human and mouse kappaimmunoglobulin constant and J region genes conserve homology in functionalsegments.Hieter PA,Max EE,Seidman JG,Maizel JV Jr, Leder P.Cell.1980Nov；22(1Pt 1):197-207.)和文献(The nucleotide sequence of a human immunoglobulin Cgamma1gene.Ellison JW,Berson BJ,Hood LE.Nucleic Acids Res.1982Jul 10；10(13):4071-9.)采用RT-PCR 反应扩增抗体轻链恒定区，重链恒定区CH1以及Fc区基因。其中信号肽基因 为ATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCC。PCR产 物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体中，测序验证后确认获得 了正确的克隆。其中CL核苷酸序列为SEQ ID NO：5,其氨基酸序列为SEQ ID NO：6；Fc核苷酸序列为SEQ IDNO：7,其氨基酸序列为SEQ ID NO：8；CH1 核苷酸序列为SEQ ID NO：9,其氨基酸序列为SEQID NO：10。

实施例3：融合蛋白基因片段构建

采用Overlap PCR的方法将实施例1和2中得到的基因片段进行融合，将 实施例1中克隆的抗体重链可变区C225VH、IgG1抗体CH1及Fc区融合，形成 C225VH-CH1-Hinge-CH2-CH3融合片段；将实施例1中克隆的抗体轻链可变区 VL与实施例2中克隆的轻链恒定区融合，形成C225VL-CL融合片段；将实施例 2中克隆的CL与Fc基因进行融合，形成CL-Hinge-CH2-CH3。PCR产物经琼脂 糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体中，测序验证后确认获得了正确的 克隆,并装入表达载体。其中C225VH-CH1-Hinge-CH2-CH3的核苷酸序列为SEQID NO：11，其氨基酸序列为SEQ ID NO：12；C225VL-CL的核苷酸序列为SEQ ID NO：13，其氨基酸序列为SEQ ID NO：14；CL-Hinge-CH2-CH3的核苷酸序列为 SEQ ID NO：15，其氨基酸序列为SEQ ID NO：16。

实施例4：抗体CH3区域的突变改造

对实施例2获得的Fc区中的CH3进行改造，采用快速定点突变试剂盒 (TIANGEN公司)引入突变点，其中以Atwell S,Ridgway JBB,Wells JA,Carter P.Stableheterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using aphage display library.-PubMed-NCBI.J Mol Biol. 1997；270(1):26–35.中CH3区氨基酸编号作为参考模板。

4.1优选突变方式Ⅰ(Test1)

第一CH3区突变为D356K、Q347K和D399K，命名为Key1；第二CH3区 (CL-Hinge-CH2-CH3)突变为K439D、K360E、K409D和K392D，命名为Lock1； 其中Key1的核苷酸序列为SEQ IDNO：17，其氨基酸序列为SEQ ID NO：18； Lock1的核苷酸序列为SEQ ID NO：19，其氨基酸序列为SEQ ID NO：20；

4.2优选突变方式Ⅱ(Test1-2)

第一CH3区突变为D356K、Q347K和D399K,为Key1；第二CH3区突变为 K439E、K360E、K409D和K392D，命名为Lock1-2；Lock1-2的核苷酸序列为SEQ ID NO：21，其氨基酸序列为SEQ ID NO：22；

4.3优选突变方式Ⅲ(test1-5)

第一CH3区突变为D356K、Q347K、D399K和K392C，命名为Key1-5；第二 CH3区突变为K439D、K360E、K409D、K392D和D399C，命名为Lock1-5；其中 Key1-5的核苷酸序列为SEQ IDNO：23，其氨基酸序列为SEQ ID NO：24；Lock1-5 的核苷酸序列为SEQ ID NO：25，其氨基酸序列为SEQ ID NO：26；

4.4优选突变方式Ⅳ(test1-6)

第一CH3区突变为D356K、Q347K、D399K和K392C，为Key1-5；第二CH3 区突变为K439E、K360E、K409D、K392D和D399C，命名为Lock1-6；其中Lock1-6 的核苷酸序列为SEQ IDNO：27，其氨基酸序列为SEQ ID NO：28。

实施例5：异二聚体融合蛋白的构建

5.1异二聚体蛋白Ⅰ的构建

参照实施例4优选方式I，采用快速定点突变试剂盒(TIANGEN公司KM101) 在融合蛋白CH3区域引入相应点突变。其中在C225VH-CH1-Hinge-CH2-CH3的 CH3区域引入Key1点突变，命名为C225VH-CH1-Hinge-CH2-CH3-Key1；在 CL-Hinge-CH2-CH3的CH3区域引入Lock1点突变，命名为 CL-Hinge-CH2-CH3-Lock1。其中C225VH-CH1-Hinge-CH2-CH3-Key1的核苷酸序 列为SEQ ID NO：29，其氨基酸序列为SEQ ID NO：30；CL-Hinge-CH2-CH3-Lock1的核苷酸序列为SEQ ID NO：31，其氨基酸序列为SEQ ID NO：32。

5.2异二聚体蛋白II～IV的构建

依照上述方法构建包含突变方式II～IV的异二聚体蛋白II～IV。其中 CL-Hinge-CH2-CH3-Lock1-2的核苷酸序列为SEQ ID NO：33，其氨基酸序列为 SEQ ID NO：34；C225VH-CH1-Hinge-CH2-CH3-Key1-5的核苷酸序列为SEQ ID NO： 35，其氨基酸序列为SEQ ID NO：36；CL-Hinge-CH2-CH3-Lock1-5的核苷酸序 列为SEQ ID NO：37，其氨基酸序列为SEQ IDNO：38；CL-Hinge-CH2-CH3-Lock1-6 的核苷酸序列为SEQ ID NO：39，其氨基酸序列为SEQID NO：40。

实施例6：异二聚体蛋白的表达纯化

在1L的培养瓶中培养293F细胞(Thermo Fisher)，当密度达到2×10⁶进 行转染：分别将异二聚体蛋白I(SEQ ID NO：13、29、31)、II(SEQ ID NO： 13、29、33)、III(SEQ IDNO：13、35、37)、Ⅳ(SEQ ID NO：13、35、 39)按照质量比1：1：1的比例与PEI(Sigma)分别溶于500μl无血清培养基 (FreeStyle^TM293Expression Medium)，室温静置5分钟，将以上2 种液体混合，室温孵育20分钟以使DNA-PEI复合物形成，然后将形成的DNA- 脂质体复合物加入到培养瓶进行悬浮培养。取细胞培养上清用ELISA检测筛选 高表达克隆：羊抗人IgG(Fc)包被于ELISA板，4℃过夜，用2％BSA-PBS于 37℃封闭2h，加入待测的抗性克隆培养上清或标准品(Human myeloma IgG1,κ)，37℃温育2h，加入HRP-羊抗人IgG(κ)进行结合反应，37℃温 育1h，加入TMB于37℃作用5min，最后用H2SO4终止反应，测A450值。将 筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱(GE公 司产品)分离纯化双靶向抗体。将纯化抗体用PBS进行透析，最后以紫外吸收 法定量确定纯化后抗体的浓度。

实施例7：分子动力学模拟评价CH3-CH3结构稳定性

具体方法参见【计算机辅助设计新型EGFR和PD-1双靶向抗体的设计及 初步鉴定-硕士毕业论文-崔月倩】。简要地说，将抗体CH3部分晶体结构文件 (5HSF)、以及引入test1、test1-2、test1-5、test1-6突变后的结构文件、 对照组的CH3部分晶体文件(5DI8)，采用pdb4amber进行预处理，将水和其他 离子去除后。在蛋白周围加入半径为的TIP3PBOX水分子，并在体系中加 入Na离子或Cl离子中和体系所带的电荷至中性。将能量最小化优化后的结构， 采用NVT体系(ntb＝1,ntp＝0)将蛋白体系的温度从100K升温到300K或355K，其中控温方法采用Langevin dynamics的方法(gamma_ln＝1.0)；采用NPT体系 (ntb＝2,ntp＝1),对整个体系进行平衡；采用NPT体系(ntb＝2,ntp＝1)，其中压 力控制采用MonteCarlo barostat的方法，温度控制采用weak-coupling algorithm的方法,对整个体系进行1微秒长时间尺度的分子动力学模拟。对 平衡后的模拟轨迹进行RMSD分析。如图5所示，在300K条件下CH3-CH3未突 变(WT)、对照组、test1、test1-2、test2、test2-2都未产生较大的波动，其 结构都相对比较稳定。然而在355K温度下，WT、test1、test2、test2-2都保 持相对结构稳定，而对照组产生较大的波动，test1-2表现出一定的波动性， 表明WT、test1、test1-2、test2、test2-2具有相对较好的结构稳定性。

实施例8：异二聚体蛋白组合效率检测

将获得的异二聚体蛋白进行SDS-PAGE电泳后，进行银染后评价异二聚体 蛋白组合效率的评价。如图6所示，本发明人构建的CH3异二聚体蛋白组合效 率验证模型由于C225VH-CH1-Hinge-CH2-CH3与CL-Hinge-CH2-CH3分子量相差 较大，因此根据银染后分子量大小，可以判断出组装成异二聚体、同二聚体的 效率。结果显示，test1、test1-2、test1-5、test1-6能够较特异的形成异二 聚体(表1)。

表1源自CH3变体的异二聚体收率

实施例9：异二聚体蛋白稳定性检测

参照Zhao L,Tong Q,Qian W,et al.Eradication of non-Hodgkin lymphomathrough the induction of tumor-specific T cell immunity by CD20-FlexBiFP.Blood.2013；122(26):4230–4236.的方法，将对照组和实 验组按照5ug/ml的浓度在PBS溶液里37度分别孵育1、3、7天后，进行SDS-PAGE 和银染显色。由于PAGE凝胶大小的限制，这里将对照组与具有代表性的 test1-6于同一块凝胶进行展示。如图7所示，test1-6在1、3和7天都能够 保持稳定，未发生降解。更重要的是，test1-6始终保持异二聚体，未检测到 异二聚体的解离。其他实验室组也未发现有明显的降解。而对照组在1、3、7 天都能够检测到明显的未正确组装的蛋白条带。

实施例10：异二聚体蛋白结合活性检测

采用流式法检测异二聚体蛋白对靶蛋白EGFR的结合，参见Zhao L,Tong Q, QianW,et al.Eradication of non-Hodgkin lymphoma through the induction of tumor-specific T cell immunity by CD20-Flex BiFP.Blood. 2013；122(26):4230–4236.。简要的说，将2×10⁴的A549细胞(ATCC CCL-185) 分别与不同浓度的Cetuximab、对照组、Test1、Test1-2、Test1-5和Test1-6 进行孵育后，PBS洗3遍后，用抗人H+L的荧光标记二抗(Thermo Fisher, A-11013)冰上孵育1小时。PBS洗3遍后进行流式检测。如图8所示，异二聚体蛋白Test1、Test1-2、Test1-5、Test1-6与亲本抗体Cetuximab表现出相 似的结合活性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 赵, 磊

宝腾泰克(北京)生物科技有限公司

<120> 一种异二聚体蛋白及其制备方法

<130> BJ1929-17P121568

<150> PCT/CN2017/093787

<151> 2017-07-21

<160> 40

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 1

caggtgcagc tgaagcagtc aggacctggc ctagtgcagc cctcacagag cctgtccatc 60

acctgcacag tctctggttt ctcattaact aactatggtg tacactgggt tcgccagtct 120

ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagtg atatggagtg gtggaaacac agactataat 180

acacctttca catccagact gagcatcaac aaggacaatt ccaagagcca agttttcttt 240

aaaatgaaca gtctgcaatc taatgacaca gccatatatt actgtgccag agccctcacc 300

tactatgatt acgagtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357

<210> 2

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 2

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 3

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 3

gacatcttgc tgactcagtc tccagtcatc ctgtctgtga gtccaggaga aagagtcagt 60

ttctcctgca gggccagtca gagtattggc acaaacatac actggtatca gcaaagaaca 120

aatggttctc caaggcttct cataaagtat gcttctgagt ctatctctgg gatcccttcc 180

aggtttagtg gcagtggatc agggacagat tttactctta gcatcaacag tgtggagtct 240

gaagatattg cagattatta ctgtcaacaa aataataact ggccaaccac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggagctgaa a 321

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 4

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 5

<211> 315

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 5

cgtacggtggctgcac catctgtctt catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact60

gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc taccccagag aagccaaagt gcagtggaag 120

gtggacaacg ccctgcagag cggaaacagc caggaaagcg tgacagagca ggattccaag 180

gattccacat acagcctgag cagcacactg acactgtcca aggccgacta cgagaagcac 240

aaggtgtacg cctgcgaagt gacacaccag ggactgtcct cccctgtgac aaagagcttc 300

aacagaggag aatgc 315

<210> 6

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 6

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

1 5 10 15

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

20 25 30

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

35 40 45

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

50 55 60

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

65 70 75 80

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

85 90 95

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 7

<211> 990

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 7

gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaacctgt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990

<210> 8

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 8

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 9

<211> 309

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 9

cgtacgacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaacctgt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300

aaatcttgt 309

<210> 10

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 10

Arg Thr Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

100

<210> 11

<211> 1347

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 11

caggtgcagc tgaagcagtc aggacctggc ctagtgcagc cctcacagag cctgtccatc 60

acctgcacag tctctggttt ctcattaact aactatggtg tacactgggt tcgccagtct 120

ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagtg atatggagtg gtggaaacac agactataat 180

acacctttca catccagact gagcatcaac aaggacaatt ccaagagcca agttttcttt 240

aaaatgaaca gtctgcaatc taatgacaca gccatatatt actgtgccag agccctcacc 300

tactatgatt acgagtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgcagct 360

agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420

acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aacctgtgac ggtgtcgtgg 480

aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540

ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 600

atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 660

tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 720

tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780

gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840

gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900

acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960

tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020

gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 1080

accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200

gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260

caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320

aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1347

<210> 12

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 12

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 13

<211> 636

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 13

gacatcttgc tgactcagtc tccagtcatc ctgtctgtga gtccaggaga aagagtcagt 60

ttctcctgca gggccagtca gagtattggc acaaacatac actggtatca gcaaagaaca 120

aatggttctc caaggcttct cataaagtat gcttctgagt ctatctctgg gatcccttcc 180

aggtttagtg gcagtggatc agggacagat tttactctta gcatcaacag tgtggagtct 240

gaagatattg cagattatta ctgtcaacaa aataataact ggccaaccac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggagctgaa agtggctgca ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat 360

gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt ctaccccaga 420

gaagccaaag tgcagtggaa ggtggacaac gccctgcaga gcggaaacag ccaggaaagc 480

gtgacagagc aggattccaa ggattccaca tacagcctga gcagcacact gacactgtcc 540

aaggccgact acgagaagca caaggtgtac gcctgcgaag tgacacacca gggactgtcc 600

tcccctgtga caaagagctt caacagagga gaatgc 636

<210> 14

<211> 212

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 14

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Val Ala Ala Pro Ser

100 105 110

Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala

115 120 125

Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val

130 135 140

Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser

145 150 155 160

Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr

165 170 175

Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys

180 185 190

Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn

195 200 205

Arg Gly Glu Cys

210

<210> 15

<211> 996

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 15

gtggctgcac catctgtctt catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact 60

gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc taccccagag aagccaaagt gcagtggaag 120

gtggacaacg ccctgcagag cggaaacagc caggaaagcg tgacagagca ggattccaag 180

gattccacat acagcctgag cagcacactg acactgtcca aggccgacta cgagaagcac 240

aaggtgtacg cctgcgaagt gacacaccag ggactgtcct cccctgtgac aaagagcttc 300

aacagaggag aatccgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 360

gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 420

acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 480

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 540

tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 600

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 660

atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 720

gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 780

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 840

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 900

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 960

tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 996

<210> 16

<211> 332

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 16

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

1 5 10 15

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

20 25 30

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

35 40 45

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

50 55 60

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

65 70 75 80

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

85 90 95

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

100 105 110

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

115 120 125

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

130 135 140

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

145 150 155 160

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

165 170 175

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

180 185 190

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

195 200 205

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

210 215 220

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

225 230 235 240

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

245 250 255

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

260 265 270

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

275 280 285

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

290 295 300

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

305 310 315 320

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 17

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 17

gggcagcccc gagaaccaaa ggtgtacacc ctgcccccat cccggaagga gctgaccaag 60

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 120

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctgaagtcc 180

gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 240

aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 300

ctctccctgt ctccgggtaa a 321

<210> 18

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 18

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Lys Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Lys

1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 19

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 19

gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccgag 60

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 120

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacgacacca cgcctcccgt gctggactcc 180

gacggctcct tcttcctcta cagcgacctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 240

aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcaggacagc 300

ctctccctgt ctccgggtaa a 321

<210> 20

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 20

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

1 5 10 15

Glu Leu Thr Glu Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Asp Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Asp Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 21

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 21

gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccgag 60

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 120

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacgacacca cgcctcccgt gctggactcc 180

gacggctcct tcttcctcta cagcgacctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 240

aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcaggagagc 300

ctctccctgt ctccgggtaa a 321

<210> 22

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 22

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

1 5 10 15

Glu Leu Thr Glu Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Asp Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 23

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 23

gggcagcccc gagaaccaaa ggtgtacacc ctgcccccat cccggaagga gctgaccaag 60

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 120

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tactgtacca cgcctcccgt gctgaagtcc 180

gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 240

aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 300

ctctccctgt ctccgggtaa a 321

<210> 24

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 24

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Lys Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Lys

1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Cys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 25

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 25

gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccgag 60

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 120

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacgacacca cgcctcccgt gctgtgctcc 180

gacggctcct tcttcctcta cagcgacctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 240

aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcaggacagc 300

ctctccctgt ctccgggtaa a 321

<210> 26

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 26

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

1 5 10 15

Glu Leu Thr Glu Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Asp Thr Thr Pro Pro Val Leu Cys Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Asp Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 27

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 27

gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccgag 60

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 120

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacgacacca cgcctcccgt gctgtgctcc 180

gacggctcct tcttcctcta cagcgacctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 240

aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcaggagagc 300

ctctccctgt ctccgggtaa a 321

<210> 28

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 28

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

1 5 10 15

Glu Leu Thr Glu Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Asp Thr Thr Pro Pro Val Leu Cys Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 29

<211> 1347

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 29

caggtgcagc tgaagcagtc aggacctggc ctagtgcagc cctcacagag cctgtccatc 60

acctgcacag tctctggttt ctcattaact aactatggtg tacactgggt tcgccagtct 120

ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagtg atatggagtg gtggaaacac agactataat 180

acacctttca catccagact gagcatcaac aaggacaatt ccaagagcca agttttcttt 240

aaaatgaaca gtctgcaatc taatgacaca gccatatatt actgtgccag agccctcacc 300

tactatgatt acgagtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgcagct 360

agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420

acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aacctgtgac ggtgtcgtgg 480

aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540

ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 600

atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 660

tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 720

tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780

gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840

gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900

acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960

tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020

gccaaagggc agccccgaga accaaaggtg tacaccctgc ccccatcccg gaaggagctg 1080

accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200

aagtccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260

caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320

aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1347

<210> 30

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 30

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Lys Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Lys Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 31

<211> 996

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 31

gtggctgcac catctgtctt catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact 60

gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc taccccagag aagccaaagt gcagtggaag 120

gtggacaacg ccctgcagag cggaaacagc caggaaagcg tgacagagca ggattccaag 180

gattccacat acagcctgag cagcacactg acactgtcca aggccgacta cgagaagcac 240

aaggtgtacg cctgcgaagt gacacaccag ggactgtcct cccctgtgac aaagagcttc 300

aacagaggag aatccgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 360

gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 420

acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 480

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 540

tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 600

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 660

atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 720

gatgagctga ccgagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 780

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacga caccacgcct 840

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagcg acctcaccgt ggacaagagc 900

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 960

tacacgcagg acagcctctc cctgtctccg ggtaaa 996

<210> 32

<211> 332

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 32

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

1 5 10 15

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

20 25 30

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

35 40 45

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

50 55 60

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

65 70 75 80

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

85 90 95

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

100 105 110

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

115 120 125

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

130 135 140

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

145 150 155 160

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

165 170 175

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

180 185 190

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

195 200 205

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

210 215 220

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

225 230 235 240

Asp Glu Leu Thr Glu Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

245 250 255

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

260 265 270

Glu Asn Asn Tyr Asp Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

275 280 285

Phe Phe Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

290 295 300

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

305 310 315 320

Tyr Thr Gln Asp Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 33

<211> 996

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 33

gtggctgcac catctgtctt catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact 60

gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc taccccagag aagccaaagt gcagtggaag 120

gtggacaacg ccctgcagag cggaaacagc caggaaagcg tgacagagca ggattccaag 180

gattccacat acagcctgag cagcacactg acactgtcca aggccgacta cgagaagcac 240

aaggtgtacg cctgcgaagt gacacaccag ggactgtcct cccctgtgac aaagagcttc 300

aacagaggag aatccgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 360

gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 420

acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 480

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 540

tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 600

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 660

atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 720

gatgagctga ccgagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 780

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacga caccacgcct 840

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagcg acctcaccgt ggacaagagc 900

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 960

tacacgcagg agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 996

<210> 34

<211> 332

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 34

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

1 5 10 15

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

20 25 30

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

35 40 45

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

50 55 60

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

65 70 75 80

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

85 90 95

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

100 105 110

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

115 120 125

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

130 135 140

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

145 150 155 160

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

165 170 175

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

180 185 190

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

195 200 205

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

210 215 220

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

225 230 235 240

Asp Glu Leu Thr Glu Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

245 250 255

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

260 265 270

Glu Asn Asn Tyr Asp Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

275 280 285

Phe Phe Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

290 295 300

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

305 310 315 320

Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 35

<211> 1347

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 35

caggtgcagc tgaagcagtc aggacctggc ctagtgcagc cctcacagag cctgtccatc 60

acctgcacag tctctggttt ctcattaact aactatggtg tacactgggt tcgccagtct 120

ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagtg atatggagtg gtggaaacac agactataat 180

acacctttca catccagact gagcatcaac aaggacaatt ccaagagcca agttttcttt 240

aaaatgaaca gtctgcaatc taatgacaca gccatatatt actgtgccag agccctcacc 300

tactatgatt acgagtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgcagct 360

agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420

acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aacctgtgac ggtgtcgtgg 480

aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540

ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 600

atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 660

tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 720

tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780

gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840

gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900

acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960

tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020

gccaaagggc agccccgaga accaaaggtg tacaccctgc ccccatcccg gaaggagctg 1080

accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactact gtaccacgcc tcccgtgctg 1200

aagtccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260

caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320

aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1347

<210> 36

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 36

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Lys Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Lys Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Cys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 37

<211> 996

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 37

gtggctgcac catctgtctt catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact 60

gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc taccccagag aagccaaagt gcagtggaag 120

gtggacaacg ccctgcagag cggaaacagc caggaaagcg tgacagagca ggattccaag 180

gattccacat acagcctgag cagcacactg acactgtcca aggccgacta cgagaagcac 240

aaggtgtacg cctgcgaagt gacacaccag ggactgtcct cccctgtgac aaagagcttc 300

aacagaggag aatccgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 360

gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 420

acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 480

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 540

tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 600

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 660

atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 720

gatgagctga ccgagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 780

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacga caccacgcct 840

cccgtgctgt gctccgacgg ctccttcttc ctctacagcg acctcaccgt ggacaagagc 900

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 960

tacacgcagg acagcctctc cctgtctccg ggtaaa 996

<210> 38

<211> 332

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 38

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

1 5 10 15

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

20 25 30

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

35 40 45

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

50 55 60

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

65 70 75 80

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

85 90 95

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

100 105 110

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

115 120 125

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

130 135 140

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

145 150 155 160

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

165 170 175

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

180 185 190

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

195 200 205

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

210 215 220

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

225 230 235 240

Asp Glu Leu Thr Glu Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

245 250 255

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

260 265 270

Glu Asn Asn Tyr Asp Thr Thr Pro Pro Val Leu Cys Ser Asp Gly Ser

275 280 285

Phe Phe Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

290 295 300

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

305 310 315 320

Tyr Thr Gln Asp Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 39

<211> 996

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 39

gtggctgcac catctgtctt catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact 60

gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc taccccagag aagccaaagt gcagtggaag 120

gtggacaacg ccctgcagag cggaaacagc caggaaagcg tgacagagca ggattccaag 180

gattccacat acagcctgag cagcacactg acactgtcca aggccgacta cgagaagcac 240

aaggtgtacg cctgcgaagt gacacaccag ggactgtcct cccctgtgac aaagagcttc 300

aacagaggag aatccgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 360

gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 420

acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 480

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 540

tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 600

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 660

atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 720

gatgagctga ccgagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 780

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacga caccacgcct 840

cccgtgctgt gctccgacgg ctccttcttc ctctacagcg acctcaccgt ggacaagagc 900

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 960

tacacgcagg agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 996

<210> 40

<211> 332

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 40

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

1 5 10 15

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

20 25 30

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

35 40 45

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

50 55 60

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

65 70 75 80

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

85 90 95

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

100 105 110

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

115 120 125

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

130 135 140

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

145 150 155 160

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

165 170 175

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

180 185 190

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

195 200 205

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

210 215 220

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

225 230 235 240

Asp Glu Leu Thr Glu Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

245 250 255

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

260 265 270

Glu Asn Asn Tyr Asp Thr Thr Pro Pro Val Leu Cys Ser Asp Gly Ser

275 280 285

Phe Phe Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

290 295 300

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

305 310 315 320

Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

Claims (10)

1.一种异二聚体蛋白，其特征在于，所述异二聚体蛋白包含两个CH3区的相互结合的多肽，其中第一多肽的CH3区和第二多肽的CH3区引入氨基酸突变，在其相互作用面上形成具有极性相互作用的氨基酸对，以形成特异性相互作用的异二聚体蛋白，其中，所述的氨基酸突变包括：

第一多肽的CH3区的D356K、Q347K和D399K与第二多肽CH3区的K439D、K360E、K409D和K392D；

或者第一多肽的CH3区的D356K、Q347K和D399K与第二多肽CH3区的K439E、K360E、K409D和K392D。

2.如权利要求1所述的异二聚体蛋白，其特征在于，所述的氨基酸突变还包括：第一多肽的CH3区的K392C。

3.如权利要求1所述的异二聚体蛋白，其特征在于，所述的氨基酸突变还包括：第二多肽的CH3区的D399C。

4.如权利要求1所述的异二聚体蛋白，其特征在于，所述的氨基酸突变包括：第一多肽的CH3区D356K、Q347K、D399K和K392C与第二多肽的CH3区K439D、K360E、K409D、K392D和D399C；

或所述的氨基酸突变包括：第一多肽的CH3区D356K、Q347K、D399K和K392C与第二多肽的CH3区K439E、K360E、K409D、K392D和D399C。

5.如权利要求1所述的异二聚体蛋白，其特征在于，所述异二聚体的多肽对为选自下组序列所示的多肽对之一：

SEQ ID NO:18所示的第一多肽和SEQ ID NO:20所示的第二多肽；(注：test1-1)

SEQ ID NO:18所示的第一多肽和SEQ ID NO:22所示的第二多肽；(注：test1-2)

SEQ ID NO:24所示的第一多肽和SEQ ID NO:26所示的第二多肽；(注：test1-5)和

SEQ ID NO:24所示的第一多肽和SEQ ID NO:28所示的第二多肽(注：test1-6)。

6.一种制备如权利要求1所述异二聚体蛋白的方法，其特征在于，所述方法中在第一多肽的CH3区和第二多肽的CH3区引入氨基酸突变，在其相互作用面上形成具有极性相互作用的氨基酸对。

7.一种药物组合物或制剂，其特征在于，所述药物组合物或制剂中包含

(i)如权利要求1所述的异二聚体蛋白；

(ii)药学上可接受的载体。

8.一种如权利要求1所述异二聚体蛋白的用途，其特征在于，用于制备治疗肿瘤的药物或抗病毒的药物。

9.一种异二聚体蛋白，包括两个包含CH3区的相互结合的多肽，其中第一多肽的CH3区和第二多肽的CH3区引入氨基酸突变，在其相互作用面上形成具有极性相互作用的氨基酸对，以形成特异性相互作用的异二聚体蛋白。

10.根据权利要求9所述的异二聚体蛋白，其中包括下述氨基酸突变对之一：

1)第一CH3区D356K、Q347K和D399K与第二CH3区K439D、K360E、K409D和K392D；

2)第一CH3区D356K、Q347K和D399K与第二CH3区K439E、K360E、K409D和K392D；

3)第一CH3区D356K、Q347K、D399K和K392C与第二CH3区K439D、K360E、K409D、K392D和D399C；

4)第一CH3区D356K、Q347K、D399K和K392C与第二CH3区K439E、K360E、K409D、K392D和D399C。