KR20180053752A - 항-pd-1 항체 및 조성물 - Google Patents

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KR20180053752A
KR20180053752A KR1020187011821A KR20187011821A KR20180053752A KR 20180053752 A KR20180053752 A KR 20180053752A KR 1020187011821 A KR1020187011821 A KR 1020187011821A KR 20187011821 A KR20187011821 A KR 20187011821A KR 20180053752 A KR20180053752 A KR 20180053752A
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모니카 가드
클라우스 쾨포드
아이반 디. 호라크
토마스 부캉
미첼 크라그
미켈 페데르센
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심포젠 에이/에스
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Abstract

본 발명은 항-PD-1 항체, 및 PD-1 활성과 관련된 질환 및 장애, 예를 들어, 암을 치료하는데 이를 이용하는 방법에 관한 것이다.

Description

항-PD-1 항체 및 조성물
관련 출원의 전후-참조
본 출원은 2015년 10월 2일 출원된 미국 특허 출원 62/236,341호로부터 우선권을 주장하며, 이의 개시내용은 전문이 본원에 참조로서 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 함유하며, 이는 전체가 본원에 참조로서 포함된다. 2016년 9월 28일에 생성된 상기 ASCII 복사본의 명칭은 022675_WO052_SL.txt이고, 크기는 65,000 바이트이다.
발명의 배경
세포예정사 단백질 1 및 CD279로도 알려진 PD-1은 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하는 268개 아미노산 세포 표면 수용체이다. PD-1은 T 세포 조절체의 CD28 패밀리의 구성원이고, T 세포, B 세포 및 포식세포 상에서 발현된다. 이것은 리간드 PD-L1(B7 동족체로도 공지됨) 및 PD-L2(B7-DC로도 공지됨)에 결합한다.
PD-1은 그 구조에 세포외 IgV 도메인, 막통과 영역 및 2개의 인산화 부위를 함유하는 세포내 테일을 포함하는 타입 I 막 단백질이다. 면역 체크포인트 단백질로 공지된 PD-1은 유도성 면역 조절 수용체로서 작용하여, 예를 들어, 항원 자극에 대한 T 세포 반응의 음성 조절에서 역할을 수행한다.
PD-L1은 PD-1의 우세한 리간드이다. PD-1에 대한 PD-L1의 결합은 T 세포 활성을 억제하여, 사이토카인 생산을 감소시키고 T 세포 증식을 억제한다. PD-L1을 발현시키는 암 세포는 PD-1 수용체에 대한 PD-L1의 결합을 통해 T 세포의 항-종양 활성을 불활성화시키는 이 메커니즘을 이용할 수 있다.
PD-1은 이의 면역 반응 조절 특성에 비추어 암 및 자가면역 질환의 치료를 포함하는 면역요법의 잠재적 표적으로서 연구되어 왔다. 2개의 항-PD-1 항체인 펨브롤리주맙(pembrolizumab) 및 니볼루맙(nivolumab)은 특정 암 치료를 위해 미국과 유럽에서 승인되었다.
면역 조절제로서의 PD-1의 결정적인 역할에 비추어, 암 및 면역 시스템의 특정 질환을 치료하기 위해 PD-1을 표적화하는 새롭고 개선된 면역 요법에 대한 필요성이 존재한다.
발명의 개요
본 발명은 PD-1을 표적화하는 신규한 재조합 항체 뿐만 아니라 이러한 항체 중 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물, 및 환자의 면역을 향상시키고, 피부, 폐, 장, 난소, 뇌, 전립선, 신장, 연조직, 조혈 시스템, 두경부, 간, 방광, 유방, 위, 자궁 및 췌장과 같은 조직으로부터 기원한 암의 치료를 위한 항체 및 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다. 항체 치료를 포함하는 상기 암에 대한 현재 이용 가능한 치료와 비교하여, 본 발명의 항체는 단독으로 또는 또 다른 암 치료제, 예를 들어, 또 다른 면역 체크포인트 단백질을 표적화하는 항체와 함께 우수한 임상 반응을 제공할 수 있는 것으로 고려된다.
일 구체예에서, 본 발명은 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공하고, 상기 항체는 인간 PD-1과의 결합에 대해 항체 12819.15384, 12748.15381, 12748.16124, 12865.15377, 12892.15378, 12796.15376, 12777.15382, 12760.15375 및 13112.15380 중 어느 하나와 경쟁하거나, 항체 12819.15384, 12748.15381, 12748.16124, 12865.15377, 12892.15378, 12796.15376, 12777.15382, 12760.15375 및 13112.15380 중 어느 하나와 동일한 인간 PD-1의 에피토프에 결합한다.
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체는 항체 12819.15384, 12748.15381, 12748.16124, 12865.15377, 12892.15378, 12796.15376, 12777.15382, 12760.15375, 또는 13112.15380 각각의 H-CDR1-3 서열을 포함하는 H-CDR1-3을 포함한다.
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체는 아미노산 서열에서 항체 12819.15384, 12748.15381, 12748.16124, 12865.15377, 12892.15378, 12796.15376, 12777.15382, 12760.15375, 또는 13112.15380의 VH 도메인과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 중쇄 가변 도메인(VH)을 갖는다.
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체는 항체 12819.15384, 12748.15381, 12748.16124, 12865.15377, 12892.15378, 12796.15376, 12777.15382, 12760.15375, 또는 13112.15380의 VH 아미노산 서열을 포함하는 VH를 갖는다.
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체는 항체 12819.15384, 12748.15381, 12748.16124, 12865.15377, 12892.15378, 12796.15376, 12777.15382, 12760.15375, 또는 13112.15380의 VH 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 67의 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC)를 갖는다.
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체는 항체 12819.15384, 12748.15381, 12748.16124, 12865.15377, 12892.15378, 12796.15376, 12777.15382, 12760.15375, 또는 13112.15380 각각의 L-CDR1-3 서열을 포함하는 L-CDR1-3을 포함한다.
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체는 아미노산 서열에서 항체 12819.15384, 12748.15381, 12748.16124, 12865.15377, 12892.15378, 12796.15376, 12777.15382, 12760.15375, 또는 13112.15380의 VL 도메인과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 경쇄 가변 도메인(VL)을 갖는다.
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체는 항체 12819.15384, 12748.15381, 12748.16124, 12865.15377, 12892.15378, 12796.15376, 12777.15382, 12760.15375, 또는 13112.15380의 VL 아미노산 서열을 포함하는 VL를 갖는다.
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체는 항체 12819.15384, 12748.15381, 12748.16124, 12865.15377, 12892.15378, 12796.15376, 12777.15382, 12760.15375, 또는 13112.15380의 VL 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 68의 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 갖는다.
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체는 상기 기술된 중쇄 서열 및 임의의 상기 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체는 항체 12819.15384, 12748.15381, 12748.16124, 12865.15377, 12892.15378, 12796.15376, 12777.15382, 12760.15375, 또는 13112.15380의 H-CDR3 및 L-CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체는 항체 12819.15384, 12748.15381, 12748.16124, 12865.15377, 12892.15378, 12796.15376, 12777.15382, 12760.15375, 또는 13112.15380의 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체는 아미노산 서열에서 항체 12819.15384, 12748.15381, 12748.16124, 12865.15377, 12892.15378, 12796.15376, 12777.15382, 12760.15375, 또는 13112.15380 각각의 VH 및 VL과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 갖는다.
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체는 항체 12819.15384, 12748.15381, 12748.16124, 12865.15377, 12892.15378, 12796.15376, 12777.15382, 12760.15375, 또는 13112.15380 각각의 VH 및 VL 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 VH 및 VL을 갖는다.
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체는 항체 12819.15384, 12748.15381, 12748.16124, 12865.15377, 12892.15378, 12796.15376, 12777.15382, 12760.15375, 또는 13112.15380 각각의 HC 및 LC 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 HC 및 LC을 갖는다.
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체는 (1) 항체 12819.15384, 12748.15381, 12748.16124, 12865.15377, 12892.15378, 12796.15376, 12777.15382, 12760.15375, 및 13112.15380로 구성된 군으로부터 선택된 항체의 VH 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 67의 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함하는 HC; 및 (2) 그 선택된 항체의 VL 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 68의 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함하는 LC를 갖는다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분은 하기의 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3 아미노산 서열을 포함한다:
a) 각각 SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 및 23;
b) 각각 SEQ ID NO: 24, 25, 26, 27, 28, 및 29;
c) 각각 SEQ ID NO: 30, 31, 32, 33, 34, 및 35;
d) 각각 SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 및 41;
e) 각각 SEQ ID NO: 42, 43, 44, 45, 46, 및 47;
f) 각각 SEQ ID NO: 48, 49, 50, 51, 52, 및 53;
g) 각각 SEQ ID NO: 54, 55, 56, 57, 58, 및 59; 또는
h) 각각 SEQ ID NO: 60, 61, 62, 63, 64, 및 65.
일부 구체예에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분은 하기의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함한다:
a) 각각 SEQ ID NO: 2 및 3;
b) 각각 SEQ ID NO: 4 및 5;
c) 각각 SEQ ID NO: 4 및 66;
d) 각각 SEQ ID NO: 6 및 7;
e) 각각 SEQ ID NO: 8 및 9;
f) 각각 SEQ ID NO: 10 및 11;
g) 각각 SEQ ID NO: 12 및 13;
h) 각각 SEQ ID NO: 14 및 15; 또는
i) 각각 SEQ ID NO: 16 및 17.
일부 구체예에서, 본 발명의 항-PD-1 항체는 하기를 포함한다:
a) SEQ ID NO: 2 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 SEQ ID NO: 3 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
b) SEQ ID NO: 4 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 SEQ ID NO: 5 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
c) SEQ ID NO: 4 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 SEQ ID NO: 66 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
d) SEQ ID NO: 6 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 SEQ ID NO: 7 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
e) SEQ ID NO: 8 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 SEQ ID NO: 9 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
f) SEQ ID NO: 10 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 SEQ ID NO: 11 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
g) SEQ ID NO: 12 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 SEQ ID NO: 13 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
h) SEQ ID NO: 14 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 SEQ ID NO: 15 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 LC; 또는
i) SEQ ID NO: 16 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 SEQ ID NO: 17 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 LC.
일부 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 부분은 SEQ ID NO: 18-20 및 SEQ ID NO: 21-23의 아미노산 서열을 각각 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함한다. 특정 구체예에서, 항-PD-1 항체는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 구체예에서, 항-PD-1 항체는 SEQ ID NO: 2 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 3 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
본 발명은 또한 아미노산 잔기 K131을 포함하는 PD-1의 에피토프에 결합하는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다(예를 들어, 12819 및 12865 항체, 예를 들어, 표 1, 4-9, 및 11-14에 열거된 것들). 일부 구체예에서, 에피토프는 아미노산 잔기 P130 및 A132를 추가로 포함하고, 아미노산 잔기 V64 및 L128을 추가로 포함할 수 있다(예를 들어, 12819 항체). 일부 구체예에서, 에피토프는 아미노산 잔기 E136을 추가로 포함한다(예를 들어, 12865 항체).
본 발명은 또한 SEQ ID NO: 1의 아미노산 잔기 V44 및 T145를 포함하는 PD-1의 에피토프에 결합하는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다(예를 들어, 13112 항체, 예를 들어, 표 1, 4-7, 9, 및 11-14에 열거된 것들).
특정 구체예에서, 항체 또는 부분은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 잔기 V64, L128, P130, K131, 및 A132(예를 들어, 12819 항체), SEQ ID NO: 1의 아미노산 잔기 K131 및 E136(예를 들어, 12865 항체), 또는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 잔기 V44 및 T145(예를 들어, 13112 항체)를 포함하는 PD-1의 에피토프에 결합한다.
본 발명은 또한 SEQ ID NO: 1의 아미노산 잔기 69-90 및 122-140을 포함하는 PD-1의 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다(예를 들어, 12819 또는 12865 항체). 특정 구체예에서, 모노클로날 항체 또는 항원-결합 부분은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 잔기 56-64, 69-90, 및 122-140을 포함하는 PD-1의 에피토프에 결합한다(예를 들어, 12819 항체). 특정 구체예에서, 항체 또는 부분은 SEQ ID NO: 1의 잔기 69-75(또는 이의 단편)에 결합한다(예를 들어, 12819 또는 12865 항체). 특정 구체예에서, 항체 또는 부분은 SEQ ID NO: 1의 잔기 136-140(또는 이의 단편)에 결합한다(예를 들어, 12819 또는 12865 항체). 일부 구체예에서, 항체 또는 부분은 SEQ ID NO: 1의 잔기 69-75(또는 이의 단편) 및 잔기 136-140(또는 이의 단편)에 결합한다(예를 들어, 12819 또는 12865 항체).
일부 구체예에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분은 하기 특성 중 적어도 하나를 갖는다:
a) 750 pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합함;
b) 7 nM 이하의 KD로 시노몰구스 PD-1에 결합함;
c) 1 nM 이하의 KD로 마우스 PD-1에 결합함;
d) 래트 PD-1에 결합하지 않음;
e) SEB 전혈 검정에서 IL-2 분비 증가시킴;
f) 일원 혼합 림프구 반응 검정에서 IFN-γ 분비 증가시킴;
g) 유세포분석 경쟁 검정에서 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 10 μg/ml의 농도에서 적어도 60%만큼 억제함;
h) 바이오-레이어 간섭굴절측정 분석에 의해 결정되는 PD-1에 대한 PD-L1 및 PD-L2의 결합을 10 μg/ml의 농도에서 적어도 90%만큼 차단함; 및
i) 생체내 종양 성장을 억제함.
그러한 항체의 예는, 비제한적으로, 12819 항체(특성 a-i 지님); 12748, 12892, 및 12777 항체(적어도 특성 a, b, 및 e-h 지님); 12865 및 12796 항체(적어도 특성 a, b, e, f, 및 h 지님), 및 12760 및 13112 항체(적어도 특성 a, b, e, 및 f 지님)를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분은 상기 모든 특성을 지닌다. 일부 구체예에서, 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분은 적어도 특성 a, b, 및 e-h를 지닌다. 일부 구체예에서, 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분은 적어도 특성 a, b, e, f, 및 h를 지닌다. 일부 구체예에서, 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분은 적어도 특성 a, b, e, 및 f를 지닌다.
달리 언급되지 않는 한, 12819, 12748, 12865, 12892, 12796, 12777, 12760 및 13112 각각은 동일한 6개 CDR을 갖고 10-자리 수치 지정 중 처음 다섯 자리를 공유하는 항체의 그룹의 지칭한다. 예를 들어, 12748은 항체 변이체 12748.15381 및 12748.16124를 포함하며, 이들은 동일한 6개 CDR을 갖는다(표 2에 제시됨). 각각의 항체 그룹은 동일하거나 실질적으로 동일한 생물학적 특성을 공유할 것으로 예상된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분은 PD-1과의 결합에 대해 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙과 경쟁하지 않는다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분은 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙과 동일한 에피토프에 결합하지 않는다; 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 부분은 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙에 결합하지 않는 PD-1 상의 하나 이상의 잔기에 결합한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 적어도 하나의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 본원에 기재된 항-PD-1 항체의 중쇄 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 경쇄 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 둘 모두를 포함하는 단리된 핵산 분자를 추가로 제공한다.
본 발명은 또한 그러한 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공하고, 상기 벡터는 발현 조절 서열을 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 항-PD-1 항체의 중쇄 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 경쇄 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 둘 모두를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 생산하는 방법으로서, 본원에 기재된 항-PD-1 항체의 중쇄 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 경쇄 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포를 제공하고, 상기 숙주 세포를 항체 또는 부분의 발현에 적합한 조건 하에 배양시키고, 생성된 항체 또는 부분을 단리시키는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 항-PD-1 항체의 결합 특이성, 및 또 다른 항-PD-1 항체(예를 들어, 본원에 기재된 또 다른 항-PD-1 항체) 또는 또 다른 면역 체크포인트 단백질, 암 항원, 또는 그 활성이 암과 같은 질병 상태를 매개하는 또 다른 세포 표면 분자와 같은 상이한 단백질을 표적화하는 항체의 결합 특이성을 갖는 이중특이적 결합 분자를 제공한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 약학적 조성물, 또는 이중특이적 결합 분자를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 면역성의 향상을 필요로 하는 환자(예를 들어, 인간 환자)에서 면역성을 향상시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 본원에 기재된 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 약학적 조성물, 또는 이중특이적 결합 분자를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자(예를 들어, 인간 환자)에서 암을 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 구체예에서, 암은 피부, 폐, 장, 난소, 뇌, 전립선, 신장, 연조직, 조혈 시스템, 두경부, 간, 방광, 유방, 위, 자궁 및 췌장으로 구성된 군으로부터 선택되는 조직에서 유래한다. 암은, 예를 들어, 진행 또는 전이성 흑색종, 비소세포폐암, 두경부 편평 세포 암, 신세포 암종, 또는 호지킨 림프종일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 화학요법제, 항신생물제, 항혈관형성제, 티로신 키나제 억제제, 또는 PD-1 경로 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명은 상기 언급된 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 항원-결합 부분, 및 상기 언급된 치료를 위한 약제의 제조에서의 본 발명의 항체 또는 항원-결합 부분의 용도를 추가로 제공하며, 즉, 상기 언급된 치료는 그/그녀의 면역 시스템을 향상시킬 필요가 있는 인간의 치료, 및 암, 예를 들어, 상기 언급된 암 중 하나를 지닌 인간의 치료이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 상응하는 인간 중쇄 IgG1-CH1-CH2-CH3 및 인간 경쇄 람다 불변 단편에 의해 각각 인 프레임으로(in-frame) 클로닝된 항-PD-1 항체 AAS-12819의 VH 및 VL 영역(검정색으로 도시됨)을 함유하는 PCR 생성물을 도시한다. 이 클로닝을 위한 제한 부위는 ApaI 및 AvrII이다. 제한 부위 AscI 및 NheI는 VH 및 VL 5'-말단들 사이에 도시된다. 플라스미드 복제 기점은 pUC ori로서 묘사되고, 암피실린-내성을 부여하는 유전자는 AmpR로서 묘사된다.
도 2는 AscI 및 NheI 제한 부위를 이용하여 VH 및 VL의 5'-말단들 사이에 삽입된 이중 CMV 프로모터를 지닌 발현 작제물을 도시한다. VH 및 VL 서열은 검정색으로 묘사되고, 주석이 달린 다른 유전 요소는 흰색으로 묘사된다.
도 3a-3c는 (A) 인간 PD-1-트랜스펙션된 세포에 특이적으로 결합하는 항체 클론, (B) CHO-S 세포에 비특이적으로 결합하는 클론, 및 (C) 스크리닝에 이용된 세포 집단 중 어느 것과도 결합하지 않는 클론에 대한 대표적인 유세포분석 도트 플롯을 도시한다.
도 4는 SEB(스타필로코쿠스(Staphylococcus) 엔테로톡신 B)로의 자극 전과 후에 6개의 도너(D1-D6)에서 PD-1을 발현시키는 림프구의 빈도를 보여준다.
도 5a-i는 SEB 검정에서 후보 항-PD-1 항체의 역가를 보여준다.
도 6a-h는 일원 MLR 검정에서 후보 항-PD-1 항체의 역가를 보여준다.
도 7a-b는 항-PD-1 항체의 존재 하에 PD-1-발현 세포에 대한 PD-L1 결합을 보여준다.
도 8은 시험된 항-PD-1 항체 12866.13188, 12807.13177, 12819.17149, 12865.17150, 12892.13195, 12777.15382, 12760.13169, 13112.15380, 및 니볼루맙 및 펨브롤리주맙 유사체에 대한 확인된 에피토프 그룹(에피토프 빈(bins))의 개요를 보여준다. 검정색 선으로 연결된 항체는 교차 차단 활성을 나타낸다. 항체는 다른 항-PD-1 항체와의 경쟁 패턴에 따라 분류된다. Nivo: 니볼루맙 유사체; Pembro: 펨브롤리주맙 유사체.
도 9(패널 A-G)는 인간 PD-1(PDB 4ZQK 및 2M2D)의 구조 상에서 항체 에피토프의 위치를 보여준다. A) 인간 PD-1 세포외 도메인(ECD)의 밑그림(잔기 33-150). GFCC' 및 ABED β-시트 및 C'-D 루프의 위치가 예시되어 있다. B) (A)에서와 동일한 시야각에서 인간 PD-1:인간 PD-L1 복합체의 밑그림. C) 밀도 지도로서 도시된 펨브롤리주맙 에피토프의 분자 모델로서, 더 어두운 지역은 더 강한 결합을 매개하는 영역을 나타낸다. 검정색 지역은 알라닌 스캐닝에 의해 발견된 접촉 잔기를 나타낸다. D) (C)에서와 같이 표현된 니볼루맙 에피토프의 분자 모델. E) (C)에서와 같이 표현된 12819 항체 에피토프의 분자 모델. F) (C)에서와 같이 표현된 12865 항체 에피토프의 분자 모델. G) (C)에서와 같이 표현된 비-리간드 차단 13112 항체 에피토프의 분자 모델.
도 10(패널 A-D)은 4개의 공통유전자 종양 모델에서 종양 성장에 대한 항-PD-1 항체 12819, 17149 또는 비히클의 치료 효과를 도시한다. A) CT26(결장암). B) C38 (결장암). C) ASB-XIV (폐암). D) Sa1N (섬유육종). 회색 영역은 치료 기간을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM로 제시된다. * P<0.001.
도 11은 반-인간화된 이종이식 종양 모델의 종양 성장에 대한 항-PD-1 항체 12819.17149, 펨브롤리주맙(Keytruda®), 또는 비히클의 치료 효과를 도시하며, 인간 흑색종 세포주 A375는 접종 전에 정제된 인간 CD8+ 및 CD4+ T 세포와 혼합되었다. 회색 영역은 치료 기간을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM로 제시된다. * P<0.001.
발명의 상세한 설명
본 발명은 암 환자와 같은 인간 환자에서 면역 시스템을 향상시키는데 이용될 수 있는 새로운 항-인간 PD-1 항체를 제공한다. 달리 언급되지 않는 한, 본원에서 사용되는 "PD-1"은 인간 PD-1을 지칭한다. 인간 PD-1 폴리펩티드 서열은 Uniprot 수탁 번호 Q15116 (PDCD1_HUMAN) 하에 이용 가능하며, 본원에서 SEQ ID NO: 1로 제시된다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"(Ab) 또는 "면역글로불린"(Ig)은 디설파이드 결합에 의해 상호 연결된 2개의 중쇄(H)(약 50 내지 70 kDa) 및 2개의 경쇄(L)(약 25 kDa)를 포함하는 테트라머를 지칭한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 도메인(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. VH 도메인 및 VL 도메인은 "프레임워크 영역"(FR)으로 지칭되는 더욱 보존적인 영역에 배치된, "상보성 결정 영역"(CDR)으로 지칭되는 과가변성(hypervariability)의 영역으로 추가로 세분화될 수 있다. 각 VH 및 VL은 하기 순서로 아미노-말단에서 카르복실-말단으로 배열된 3개의 CDR(본원에서 H-CDR은 중쇄로부터의 CDR을 명시하며, 본원에서 L-CDR은 경쇄로부터의 CDR을 명시함) 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 또는 경쇄에서의 아미노산 번호의 정렬은 IMGT® 정의[Lefranc et al., Dev Comp Immunol 27(1):55-77 (2003)]; 또는 카바트의 정의[Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987 및 1991); Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); 또는 Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989)]에 따를 수 있다.
용어 "재조합 항체"는 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 세포 또는 세포주로부터 발현되는 항체를 지칭하며, 여기서 상기 뉴클레오티드 서열(들)은 자연적으로 세포와 관련이 없다.
용어 "단리된 단백질," "단리된 폴리펩티드" 또는 "단리된 항체"는 이의 유래 기원 또는 공급원에 의해 (1) 이의 천연 상태에서 수반되는 자연적으로 결합된 성분들과 결합되지 않고/거나, (2) 동일한 종으로부터의 다른 단백질이 존재하지 않고/거나, (3) 상이한 종으로부터의 세포에 의해 발현되고/거나, (4) 자연에서 발생하지 않는 단백질, 폴리펩티드 또는 항체를 지칭한다. 이에 따라, 화학적으로 합성되거나 이것이 자연적으로 유래하는 세포와 상이한 세포 시스템에서 합성된 폴리펩티드는 이의 자연적으로 결합된 성분으로부터 "단리"될 것이다. 단백질은 또한 당해 분야에 널리 공지된 단백질 정제 기술을 이용하여, 단리에 의해 자연적으로 결합된 성분들이 실질적으로 존재하지 않게 제공될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "생식 계열(germline)"은 생식 세포를 통해 부모에서 자식으로 진행됨에 따른 항체 유전자 및 유전자 세그먼트의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 지칭한다. 생식 계열 서열은 성숙한 B 세포에서 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과 구별되며, 이는 B 세포 성숙화의 과정 동안 재조합 및 과돌연변이 사건에 의해 변경되었다. 특정 생식 계열 서열을 "활용"하는 항체는 그 생식 계열 뉴클레오티드 서열, 또는 이것이 임의의 다른 생식 계열 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열보다 더욱 밀접하게 특정하는 아미노산 서열과 정렬되는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 갖는다.
용어 "친화도"는 항원과 항체 간의 인력의 척도를 지칭한다. 항원에 대한 항체의 고유 친화도는 통상적으로 특정 항체-항원 상호작용의 결합 친화도 평형 상수(KD)로서 표현된다. 항체는 KD가 ≤ 1 mM, 바람직하게, ≤ 100 nM일 때, 항원에 특이적으로 결합한다고 한다. KD 결합 친화도 상수는, 예를 들어, 표면 플라스몬 공명(BIAcore™) 또는 바이오-레이어 간섭굴절측정법(Bio-Layer Interferometry)에 의해, 예를 들어, Bio-Rad로부터의 ProteOn™ XPR36 SPR 시스템 또는 Octet™ 시스템을 이용하여 측정될 수 있다.
용어 "koff"는 특정 항체 항원 상호작용의 해리 속도 상수를 지칭한다. koff 해리 속도 상수는, 예를 들어, Octet™ 시스템을 이용한 바이오-레이어 간섭굴절법에 의해 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "에피토프"는 항체 또는 관련된 분자, 예를 들어, 이중특이적 결합 분자에 특이적으로 결합하는 항원의 부분(결정인자)을 지칭한다. 에피토프성 결정 인자는 일반적으로 분자의 화학적 활성 표면 그룹핑, 예를 들어, 아미노산 또는 탄수화물 또는 당 측쇄로 이루어지고, 일반적으로 특정 3차원 구조 특징 뿐만 아니라 특정 전하 특징을 갖는다. 에피토프는 "선형"이거나 "입체구조(conformational)"일 수 있다. 선형 에피토프에서, 단백질(예를 들어, 항원)과 상호작용하는 분자(예를 들어, 항체) 간의 모든 상호작용 지점은 단백질의 일차 아미노산 서열을 따라 선형으로 일어난다. 입체구조 에피토프에서, 상호작용 지점은 일차 아미노산 서열에서 서로 분리되어 있는 단백질 상의 아미노산 잔기를 가로질러 일어난다. 항원 상의 요망되는 에피토프가 결정되면, 당해 분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 그 에피토프에 대한 항체를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 선형 에피토프에 대한 항체는, 예를 들어, 동물을 선형 에피토프의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드로 면역시킴에 의해 생성될 수 있다. 입체구조 에피토프에 대한 항체는, 예를 들어, 동물을 입체구조 에피토프의 관련 아미노산 잔기를 함유하는 미니-도메인으로 면역시킴에 의해 생성될 수 있다. 또한, 특정 에피토프에 대한 항체는, 예를 들어, 동물을 관심 표적 분자 또는 이의 관련 부분(예를 들어, PD-1의 ECD)으로 면역시킨 다음, 에피토프에 대한 결합에 대해 스크리닝함으로써 생성될 수 있다.
경쟁 검정, 에피토프 비닝(epitope binning), 및 알라닌 스캐닝을 비제한적으로 포함하는 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 항체가 본 발명의 항-PD-1 항체와 동일한 에피토프에 결합하거나 결합에 대해 이러한 항체와 경쟁하는지 여부를 결정할 수 있다. 일부 구체예에서, 시험 항체 및 본 발명의 항-PD-1 항체는 PD-1 상의 적어도 하나의 공통 잔기(예를 들어, 적어도 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 공통 잔기)에 결합한다. 추가 구체예에서, PD-1 상의 접촉 잔기는 시험 항체와 본 발명의 항-PD-1 항체 간에 완전히 동일하다. 일 구체예에서, 본 발명의 항-PD-1 항체가 포화 조건 하에 PD-1에 결합하게 한 다음 PD-1에 결합하는 시험 항체의 능력을 측정한다. 시험 항체가 참조 항-PD-1 항체와 동시에 PD-1에 결합할 수 있다면, 시험 항체는 참조 항-PD-1 항체와 상이한 에피토프에 결합한다. 그러나, 시험 항체가 동시에 PD-1에 결합할 수 없다면, 시험 항체는 동일한 에피토프, 중첩 에피토프, 또는 본 발명의 항-PD-1 항체에 의해 결합된 에피토프에 매우 근접한 에피토프에 결합한다. 이 실험은 ELISA, RIA, BIACORE™, 바이오-레이어 간섭굴절측정법 또는 유세포분석을 이용하여 수행될 수 있다. 항-PD-1 항체가 또 다른 항-PD-1 항체와 교차-경쟁하는 지를 시험하기 위해, 상기 기재된 경쟁 방법을 두 방향으로 이용할 수 있고, 즉, 공지된 항체가 시험 항체를 차단하는 지 및 그 반대인 지를 결정할 수 있다. 그러한 교차-경쟁 실험은, 예를 들어, IBIS MX96 SPR 기계 또는 Octet™ 시스템을 이용하여 수행될 수 있다.
용어 "키메라 항체"는 가장 넓은 의미에서, 하나의 항체로부터의 하나 이상의 영역, 및 하나 이상의 다른 항체로부터의 하나 이상의 영역을 함유하는 항체를 지칭하며, 통상적으로, 항체는 일부 인간 기원 및 일부 비-인간 기원이고, 즉, 부분적으로 비-인간 동물, 예를 들어, 마우스, 래트 또는 다른 설치류, 또는 조류, 예를 들어, 닭으로부터 유래된 것이다. 키메라 항체는 인간 항-항체 반응, 예를 들어, 뮤린 항체의 경우 인간 항-마우스 항체 반응의 위험을 감소시키기 위해 비-인간 항체에 비해 바람직하다. 통상적인 키메라 항체의 예는 가변 도메인 서열이 뮤린이고 불변 영역 서열이 인간인 항체이다. 키메라 항체의 경우에, 비-인간 부분은 항체를 인간화하기 위해 추가 변경될 수 있다. 본원에 기술된 키메라 항체는 닭 가변 도메인 서열 및 인간 불변 영역 서열을 갖는다.
용어 "인간화하다"는 항체가 전부 또는 일부 비-인간 기원일 때(예를 들어, 각각 관심 항원을 갖는 마우스 또는 닭의 면역화로부터 수득된 뮤린 또는 닭 항체, 또는 그러한 뮤린 또는 닭 항체에 기반한 키메라 항체), 인간에서 면역 반응을 회피하거나 최소화하기 위해, 특히 중쇄 및 경쇄의 프레임워크 영역 및 불변 영역에서 특정 아미노산을 대체할 수 있다는 사실을 지칭한다. 특정 항체의 면역원성 및 이에 따른 인간 항-항체 반응을 정확하게 예측할 수는 없으나, 비-인간 항체는 인간 항체보다 인간에서 더욱 면역원성을 나타내는 경향이 있다. 외래(예를 들어, 설치류 또는 새) 불변 영역이 인간 기원의 서열로 대체된 경우, 키메라 항체는 완전 외래 기원의 항체에 비해 일반적으로 덜 면역원성인 것으로 나타났고, 치료용 항체에서의 경향은 인간화되거나 완전한 인간 항체 쪽에 있다. 그러므로 키메라 항체 또는 비-인간 기원의 다른 항체는 인간 항-항체 반응의 위험을 감소시키기 위해 인간화될 수 있다.
키메라 항체에 대하여, 인간화는 통상적으로 가변 도메인 서열의 프레임워크 영역의 개질을 포함한다. 상보성 결정 영역(CDR)의 일부인 아미노산 잔기는 가장 자주 인간화와 관련하여 달라지지 않으나, 특정 경우에, 개개 CDR 아미노산 잔기를 변경시키고, 예를 들어, 당화 부위, 탈아미드화 부위, 아스파르테이트 이성질화 부위 또는 요망되지 않는 시스테인 또는 메티오닌 잔기를 제거하는 것이 요망될 수 있다. N-결합된 당화는 트리펩티드 서열 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr에서 아스파라긴 잔기에 대한 올리고당 사슬의 결합에 의해 일어나며, 여기서, X는 Pro 이외의 임의의 아미노산일 수 있다. N-당화 부위의 제거는 바람직하게는 보존적 치환에 의해 Asn 또는 Ser/Thr 잔기 중 어느 하나를 상이한 잔기로 돌연변이화시킴으로써 달성될 수 있다. 아스파라긴 및 글루타민 잔기의 탈아미드화는 pH 및 표면 노출과 같은 인자에 따라 일어날 수 있다. 아스파라긴 잔기는 주로 서열 Asn-Gly에 존재할 때, 그리고 다른 디펩티드 서열, 예를 들어, Asn-Ala에 존재할 때에는 보다 적은 정도로, 특히 탈아미드화되기 쉽다. 이러한 탈아미드화 부위, 특히, Asn-Gly이 CDR 서열에 존재할 때, 이에 따라, 통상적으로 관련된 잔기들 중 하나를 제거하기 위한 보존적 치환에 의해, 그 부위를 제거하는 것이 요망될 수 있다.
항체 서열의 인간화를 위한 여러 방법이 당해 분야에 공지되어 있다; 예를 들어, 문헌[the review by Almagro & Fransson, Front Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조]. 일반적으로 사용되는 한 방법은 CDR 그라프팅인데, 이것은, 예를 들어, 뮤린-유래된 키메라 항체의 경우, 뮤린 가변 도메인 유전자에 대한 인간 생식 계열 유전자 대응물의 동정 및 이러한 프레임워크로의 뮤린 CDR 서열의 그라프팅을 포함한다. 표적 항원 잔기에 대한 항체의 상호작용의 특이성은 주로 중쇄 및 경쇄의 6개의 CDR에 위치한 아미노산 잔기에 존재한다. 따라서, CDR 내의 아미노산 서열은 CDR 외부의 서열보다 개별 항체들 간에 훨씬 더 가변적이다. CDR 서열이 대부분의 항체-항원 상호작용을 책임지므로, 예를 들어, 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열로 그라프팅된 특정 항체로부터의 CDR 서열을 발현시키는 발현 벡터를 작제함으로써, 특정 자연 발생 항체, 또는 보다 일반적으로 주어진 아미노산 서열을 갖는 임의의 특정 항체의 속성을 모방하는 재조합 항체를 발현시킬 수 있다. 결과적으로, 비-인간 항체를 "인간화"하고 또한 실질적으로 원래 항체의 결합 특이성 및 친화도를 유지할 수 있다. CDR 그라프팅은 카바트 CDR 정의에 기반할 수 있으며, 보다 최근의 간행물[Magdelaine-Beuzelin et al., Crit Rev.Oncol Hematol. 64:210-225 (2007)]은 IMGT® 정의(international ImMunoGeneTics information system®, www.imgt.org)가 인간화의 결과를 개선시킬 수 있다고 제안하였다[문헌[Lefranc et al., Dev. Comp Immunol. 27:55-77 (2003)] 참조].
일부 경우에, CDR 그라프팅은 CDR이 수득된 부모 항체와 비교하여 CDR-그라프팅된 비-인간 항체의 결합 특이성 및 친화력을 감소시킬 수 있고, 이에 따라, 이의 생물학적 활성을 감소시킬 수 있다. 역 돌연변이(때때로 "프레임워크 보수(framework repair)"로서 지칭됨)는 부모 항체의 결합 특이성 및 친화도를 재확립시키기 위해, CDR-그라프팅된 항체의 선택된 위치에, 통상적으로 프레임워크 영역에 도입될 수 있다. 가능한 역 돌연변이를 위한 위치의 확인은 문헌 및 항체 데이타베이스에서 입수 가능한 정보를 사용하여 수행될 수 있다. 역 돌연변이를 위한 후보물질인 아미노산 잔기는 통상적으로 항체 분자의 표면에 위치된 것들이며, 매장되거나 낮은 정도의 표면 노출을 갖는 잔기는 일반적으로 변경되지 않을 것이다.
CDR 그라프팅 및 역 돌연변이에 대한 대안적인 인간화 기술이 다시 표면화되었고, 여기서 비-인간 기원의 비-표면 노출된 잔기는 유지되며, 표면 잔기는 인간 잔기로 변경된다.
특정 경우에, 또한, 표적 에피토프에 대한 결합 친화도를 개선시키기 위해 하나 이상의 CDR 아미노산 잔기를 변경시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 "친화도 성숙(affinity maturation)"으로서 알려져 있고, 임의적으로, 예를 들어, 항체의 인간화가 감소된 결합 특이성 또는 친화도를 야기시키고 단지 역 돌연변이에 의해 결합 특이성 또는 친화도를 충분히 개선시키는 것이 가능하지 않은 상황에서 인간화와 관련하여 수행될 수 있다. 다양한 친화도 성숙 방법, 예를 들어, 문헌[Burks et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94:412-417 (1997)]에 의해 기술된 시험관내 스캐닝 포화 돌연변이발생 방법 및 문헌[Wu et al. Proc Natl Acad Sci USA 95:6037-6042 (1998)]의 단계별 시험관내 친화도 성숙화 방법이 당해 분야에 공지되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 항체의 "항원-결합 부분"(또는 단순하게 "항체 부분")은 항원(예를 들어, 인간 PD-1, 또는 이의 부분)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체의 하나 이상의 부분 또는 단편을 지칭한다. 이는 전장 항체의 특정 단편이 항체의 항원-결합 기능을 수행할 수 있다는 것을 나타낸다. 용어 "항원-결합 부분" 내에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) Fab 단편: VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 일가 단편(예를 들어, 하기 기재된 12819.17149 및 12865.17150 Fab 단편);; (ii) F(ab')2 단편: 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편들을 포함하는 이가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편; 및 (vi) 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH는 별개의 유전자에 의해 인코딩되지만, 이들은 일가 분자(단일쇄 Fv(scFv)로서 공지됨)를 형성시키기 위해 VL 및 VH 도메인이 쌍을 이루는 단일 단백질 사슬로서 만들 수 있는 합성 링커에 의해, 재조합 방법을 이용하여, 결합될 수 있다. 또한, 본 발명 내에 VH 및/또는 VL을 포함하는 항원-결합 분자가 있다. VH의 경우에, 분자는 또한 CH1, 힌지, CH2, 또는 CH3 영역 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 이러한 단일쇄 항체는 또한 항체의 용어 "항원-결합 부분" 내에 포함되는 것으로 의도된다. 다른 형태의 단일쇄 항체, 예를 들어, 디아바디(diabody)가 또한 포함된다. 디아바디는 VH 도메인 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 사슬 상에서 발현되지만, 너무 짧아서 동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이에서 쌍을 이룰 수 없는 링커를 이용하여, 도메인이 다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 이루게 하고, 2개의 항원-결합 부위를 생성시키는 이가의 이중특이적 항체이다.
항체 부분, 예를 들어, Fab 및 F(ab')2 단편은 전체 항체의 파파인 또는 펩신 분해와 같은 통상적인 기술을 이용하여 전체 항체로부터 제조될 수 있다. 또한, 항체, 항체 부분 및 면역접합 분자는, 예를 들어, 본원에 기술된 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 수득될 수 있다.
항-PD-1 항체의 부류(아이소형) 및 아부류는 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 항체의 부류 및 아부류는 항체의 특정 부류 및 아부류에 대해 특이적인 항체를 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 항체는 상업적으로 입수 가능하다. 부류 및 아부류는 ELISA, 웨스턴 블롯(Western Blot) 뿐만 아니라 다른 기술들에 의해 결정될 수 있다. 대안적으로, 부류 및 아부류는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 영역 모두 또는 이의 일부를 서열화시키고, 이의 아미노산 서열을 면역글로불린의 다양한 부류 및 아부류의 공지된 아미노산 서열과 비교하고, 항체의 부류 및 아부류를 결정함으로써 결정될 수 있다.
항체 서열의 주어진 위치에서 특정 아미노산 잔기를 언급할 때, 예를 들어, "35S"의 표시는 위치와 잔기를 언급하며, 즉, 이 경우에 세린 잔기(S)가 서열의 위치 35에 존재함을 나타낸다. 유사하게, 예를 들어, "13Q+35S"의 표시는 각각의 위치에 있는 2개의 잔기를 나타낸다.
달리 언급되지 않는 한, 본 개시내용에서 언급되는 모든 항체 아미노산 잔기 번호는 IMGT® 넘버링 체계 하에 있는 것들이다.
항-PD-1 항체
본 발명은 PD-1에 대한 항체 및 이의 항원-결합 부분을 제공한다. 항체는 닭으로부터 유래된 가변 도메인 및 인간 불변 영역을 지닌 키메라일 수 있거나, 인간화될 수 있다. 본원에 기재된 항체는 특히 인간화된 항체이다.
본 발명의 8개의 선택된 인간화된 항-PD-1 항체의 VH 및 VL 아미노산 서열(SEQ ID NO: 2 내지 17)은 하기 표 4에서 추가로 도시된다(실시예 4). 참조를 위해, SEQ ID NO는 하기 표 1에서 제공된다.
본원에 기재된 항-PD-1 항체는 "12819"와 같이 5-자리 숫자 또는 "12819.15384" 와 같이 10-자리 숫자로 표시될 수 있다. 본원에서 사용되는 5-자리 숫자는 표 2에서 그 숫자에 대해 제시된 중쇄 및 경쇄 CDR1-3 서열을 갖는 모든 항체를 지칭하는 반면, 10-자리 숫자의 이용은 특정 인간화된 변이체를 지칭한다. 예를 들어, 12819.15384는 표 2에 제시된 12819 항체의 CDR 서열을 갖는 특정 인간화된 변이체이다. 5-자리 숫자는, 예를 들어, FR에서의 일부 변경을 제외하고 하기 표 1에 제시된 10-자리 변이체와 동일한 항체를 포함한다(예를 들어, 성숙 경쇄의 N-말단에서 잔기 SY의 결여, 또는 SY 대신 잔기 SS를 지님). 이러한 변형은 항체의 기능적(예를 들어, 항원-결합) 특성을 변화시키지 않는다.
표 1 인간화된 항-PD-1 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열에 대한 SEQ ID NO
Figure pct00001
하기 표 2는 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR 아미노산 서열에 대한 SEQ ID NO를 제공한다.
표 2 항-PD-1 항체의 CDR 아미노산 서열에 대한 SEQ ID NO
Figure pct00002
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:
a) H-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 18-20의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
b) 중쇄 가변 도메인(VH)이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
c) VH가 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
d) 중쇄(HC)가 SEQ ID NO: 2 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
e) L-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 21-23의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
f) 경쇄 가변 도메인(VL)이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
g) VL이 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
h) 경쇄(LC)가 SEQ ID NO: 3 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
i) H-CDR1-3 및 L-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 18-23의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
j) VH가 서열에 있어서 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고 VL이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
k) VH가 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하고 VL이 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하는 항체; 및
l) HC가 SEQ ID NO: 2 및 67의 아미노산 서열을 포함하고 LC가 SEQ ID NO: 3 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:
a) H-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 24-26의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
b) 중쇄 가변 도메인(VH)이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
c) VH가 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
d) 중쇄(HC)가 SEQ ID NO: 4 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
e) L-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 27-29의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
f) 경쇄 가변 도메인(VL)이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 5 또는 66의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
g) VL이 SEQ ID NO: 5 또는 66의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
h) 경쇄(LC)가 SEQ ID NO: 5 또는 66의 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 68의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
i) H-CDR1-3 및 L-CDR1-3가 각각 SEQ ID NO: 24-29의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
j) VH가 서열에 있어서 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고 VL이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 5 또는 66의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
k) VH가 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고 VL이 SEQ ID NO: 5 또는 66의 아미노산 서열을 포함하는 항체; 및
l) HC가 SEQ ID NO: 4 및 67의 아미노산 서열을 포함하고 LC가 SEQ ID NO: 5 또는 66 및 SEQ ID NO: 68의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:
a) H-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 30-32의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
b) 중쇄 가변 도메인(VH)이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
c) VH가 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
d) 중쇄(HC)가 SEQ ID NO: 6 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
e) L-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 33-35의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
f) 경쇄 가변 도메인(VL)이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
g) VL이 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
h) 경쇄(LC)가 SEQ ID NO: 7 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
i) H-CDR1-3 및 L-CDR1-3가 각각 SEQ ID NO: 30-35의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
j) VH가 서열에 있어서 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고 VL이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
k) VH가 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하고 VL이 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하는 항체; 및
l) HC가 SEQ ID NO: 6 및 67의 아미노산 서열을 포함하고 LC가 SEQ ID NO: 7 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:
a) H-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 36-38의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
b) 중쇄 가변 도메인(VH)이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
c) VH가 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
d) 중쇄(HC)가 SEQ ID NO: 8 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
e) L-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 39-41의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
f) 경쇄 가변 도메인(VL)이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
g) VL이 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
h) 경쇄(LC)가 SEQ ID NO: 9 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
i) H-CDR1-3 및 L-CDR1-3가 각각 SEQ ID NO: 36-41의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
j) VH가 서열에 있어서 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고 VL이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
k) VH가 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하고 VL이 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 항체; 및
l) HC가 SEQ ID NO: 8 및 67의 아미노산 서열을 포함하고 LC가 SEQ ID NO: 9 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:
a) H-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 42-44의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
b) 중쇄 가변 도메인(VH)이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
c) VH가 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
d) 중쇄(HC)가 SEQ ID NO: 10 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
e) L-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 45-47의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
f) 경쇄 가변 도메인(VL)이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
g) VL이 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
h) 경쇄(LC)가 SEQ ID NO: 11 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
i) H-CDR1-3 및 L-CDR1-3가 각각 SEQ ID NO: 42-47의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
j) VH가 서열에 있어서 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고 VL이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
k) VH가 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하고 VL이 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 항체; 및
l) HC가 SEQ ID NO: 10 및 67의 아미노산 서열을 포함하고 LC가 SEQ ID NO: 11 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:
a) H-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 48-50의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
b) 중쇄 가변 도메인(VH)이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
c) VH가 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
d) 중쇄(HC)가 SEQ ID NO: 12 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
e) L-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 51-53의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
f) 경쇄 가변 도메인(VL)이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
g) VL이 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
h) 경쇄(LC)가 SEQ ID NO: 13 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
i) H-CDR1-3 및 L-CDR1-3가 각각 SEQ ID NO: 48-53의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
j) VH가 서열에 있어서 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고 VL이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
k) VH가 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하고 VL이 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 항체; 및
l) HC가 SEQ ID NO: 12 및 67의 아미노산 서열을 포함하고 LC가 SEQ ID NO: 13 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:
a) H-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 54-56의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
b) 중쇄 가변 도메인(VH)이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
c) VH가 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
d) 중쇄(HC)가 SEQ ID NO: 14 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
e) L-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 57-59의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
f) 경쇄 가변 도메인(VL)이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
g) VL이 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
h) 경쇄(LC)가 SEQ ID NO: 15 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
i) H-CDR1-3 및 L-CDR1-3가 각각 SEQ ID NO: 54-59의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
j) VH가 서열에 있어서 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고 VL이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
k) VH가 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하고 VL이 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 항체; 및
l) HC가 SEQ ID NO: 14 및 67의 아미노산 서열을 포함하고 LC가 SEQ ID NO: 15 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:
a) H-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 60-62의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
b) 중쇄 가변 도메인(VH)이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
c) VH가 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
d) 중쇄(HC)가 SEQ ID NO: 16 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
e) L-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 63-65의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
f) 경쇄 가변 도메인(VL)이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
g) VL이 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
h) 경쇄(LC)가 SEQ ID NO: 17 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
i) H-CDR1-3 및 L-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 60-65의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
j) VH가 서열에 있어서 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고 VL이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
k) VH가 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하고 VL이 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 포함하는 항체; 및
l) HC가 SEQ ID NO: 16 및 67의 아미노산 서열을 포함하고 LC가 SEQ ID NO: 17 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 12819 항체(예를 들어, 항체 12819.15384)의 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 12748 항체(예를 들어, 항체 12748.15381 또는 항체 12748.16124)의 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 12865 항체(예를 들어, 항체 12865.15377)의 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 12892 항체(예를 들어, 항체 12892.15378)의 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 12796 항체(예를 들어, 항체 12796.15376)의 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 12777 항체(예를 들어, 항체 12777.15382)의 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 12760 항체(예를 들어, 항체 12760.15375)의 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 13112 항체(예를 들어, 항체 13112.15380)의 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 아미노산 서열에 있어서 항체 12819.15384, 12748.15381, 12748.16124, 12865.15377, 12892.15378, 12796.15376, 12777.15382, 12760.15375, 및 13112.15380 중 어느 하나의 VH 및 VL과 각각 적어도 90%(예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%) 동일한 VH 및 VL을 갖는다.
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 항체 12819.15384, 12748.15381, 12748.16124, 12865.15377, 12892.15378, 12796.15376, 12777.15382, 12760.15375, 및 13112.15380 중 어느 하나의 VH 및 VL 아미노산 서열을 각각 포함하는 VH 및 VL을 갖는다.
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 하기의 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3 아미노산 서열을 포함한다:
a) 각각 SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 및 23;
b) 각각 SEQ ID NO: 24, 25, 26, 27, 28, 및 29;
c) 각각 SEQ ID NO: 30, 31, 32, 33, 34, 및 35;
d) 각각 SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 및 41;
e) 각각 SEQ ID NO: 42, 43, 44, 45, 46, 및 47;
f) 각각 SEQ ID NO: 48, 49, 50, 51, 52, 및 53;
g) 각각 SEQ ID NO: 54, 55, 56, 57, 58, 및 59; 또는
h) 각각 SEQ ID NO: 60, 61, 62, 63, 64, 및 65.
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 하기의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 VH, 및 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 VL을 포함한다:
a) 각각 SEQ ID NO: 2 및 3;
b) 각각 SEQ ID NO: 4 및 5;
c) 각각 SEQ ID NO: 4 및 66;
d) 각각 SEQ ID NO: 6 및 7;
e) 각각 SEQ ID NO: 8 및 9;
f) 각각 SEQ ID NO: 10 및 11;
g) 각각 SEQ ID NO: 12 및 13;
h) 각각 SEQ ID NO: 14 및 15; 또는
i) 각각 SEQ ID NO: 16 및 17.
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 하기의 아미노산 서열인 VH 및 VL을 포함한다:
a) 각각 SEQ ID NO: 2 및 3;
b) 각각 SEQ ID NO: 4 및 5;
c) 각각 SEQ ID NO: 4 및 66;
d) 각각 SEQ ID NO: 6 및 7;
e) 각각 SEQ ID NO: 8 및 9;
f) 각각 SEQ ID NO: 10 및 11;
g) 각각 SEQ ID NO: 12 및 13;
h) 각각 SEQ ID NO: 14 및 15; 또는
i) 각각 SEQ ID NO: 16 및 17.
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체는 하기를 포함한다:
a) SEQ ID NO: 2 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 SEQ ID NO: 3 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
b) SEQ ID NO: 4 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 SEQ ID NO: 5 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
c) SEQ ID NO: 4 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 SEQ ID NO: 66 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
d) SEQ ID NO: 6 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 SEQ ID NO: 7 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
e) SEQ ID NO: 8 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 SEQ ID NO: 9 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
f) SEQ ID NO: 10 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 SEQ ID NO: 11 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
g) SEQ ID NO: 12 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 SEQ ID NO: 13 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
h) SEQ ID NO: 14 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 SEQ ID NO: 15 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 LC; 또는
i) SEQ ID NO: 16 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 SEQ ID NO: 17 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 LC.
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체는 하기를 포함한다:
a) SEQ ID NO: 2 및 67의 아미노산 서열로 구성된 HC 및 SEQ ID NO: 3 및 68의 아미노산 서열로 구성된 LC;
b) SEQ ID NO: 4 및 67의 아미노산 서열로 구성된 HC 및 SEQ ID NO: 5 및 68의 아미노산 서열로 구성된 LC;
c) SEQ ID NO: 4 및 67의 아미노산 서열로 구성된 HC 및 SEQ ID NO: 66 및 68의 아미노산 서열로 구성된 LC;
d) SEQ ID NO: 6 및 67의 아미노산 서열로 구성된 HC 및 SEQ ID NO: 7 및 68의 아미노산 서열로 구성된 LC;
e) SEQ ID NO: 8 및 67의 아미노산 서열로 구성된 HC 및 SEQ ID NO: 9 및 68의 아미노산 서열로 구성된 LC;
f) SEQ ID NO: 10 및 67의 아미노산 서열로 구성된 HC 및 SEQ ID NO: 11 및 68의 아미노산 서열로 구성된 LC;
g) SEQ ID NO: 12 및 67의 아미노산 서열로 구성된 HC 및 SEQ ID NO: 13 및 68의 아미노산 서열로 구성된 LC;
h) SEQ ID NO: 14 및 67의 아미노산 서열로 구성된 HC 및 SEQ ID NO: 15 및 68의 아미노산 서열로 구성된 LC; 또는
i) SEQ ID NO: 16 및 67의 아미노산 서열로 구성된 HC 및 SEQ ID NO: 17 및 68의 아미노산 서열로 구성된 LC.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 임의의 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분은 하기 특성 중 적어도 하나를 가질 수 있다:
a) 750 pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합함;
b) 7 nM 이하의 KD로 시노몰구스 PD-1에 결합함;
c) 1 nM 이하의 KD로 마우스 PD-1에 결합함;
d) 래트 PD-1에 결합하지 않음;
e) SEB 전혈 검정에서 IL-2 분비 증가시킴;
f) 일원 혼합 림프구 반응 검정에서 IFN-γ 분비 증가시킴;
g) 유세포분석 경쟁 검정에서 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 10 μg/ml의 농도에서 적어도 60%만큼 억제함;
h) 바이오-레이어 간섭굴절측정 분석에 의해 결정되는 PD-1에 대한 PD-L1 및 PD-L2의 결합을 10 μg/ml의 농도에서 적어도 90%만큼 차단함; 및
i) 생체내 종양 성장을 억제함.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 임의의 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분은 적어도 900, 적어도 850, 적어도 800, 적어도 750, 적어도 700, 적어도 650, 적어도 600, 적어도 550, 적어도 500, 적어도 450, 적어도 400, 적어도 350, 적어도 300, 적어도 250, 적어도 200, 적어도 150, 적어도 100, 적어도 50, 적어도 40, 적어도 30, 또는 적어도 20 pM의 KD로 인간 PD-1에 결합할 수 있다. 특정 구체예에서, KD는 표면 플라스몬 공명을 이용하여 결정된다. 특정 구체예에서, 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분은 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 또는 둘 모두보다 높은 친화도로 인간 PD-1에 결합한다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 임의의 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분은 적어도 9000, 적어도 8000, 적어도 7000, 적어도 6000, 적어도 5000, 적어도 4000, 적어도 3000, 적어도 2500, 적어도 2000, 적어도 1500, 적어도 1000, 적어도 900, 적어도 800, 적어도 700, 적어도 600, 적어도 500, 적어도 400, 적어도 300, 적어도 200, 적어도 100, 적어도 75, 적어도 50, 적어도 25, 적어도 20, 적어도 15, 적어도 10, 또는 적어도 5 pM의 KD로 시노몰구스 PD-1(SEQ ID NO: 89)에 결합할 수 있다. 특정 구체예에서, KD는 표면 플라스몬 공명을 이용하여 결정된다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 임의의 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분은 적어도 1000, 적어도 950, 적어도 900, 또는 적어도 850 pM의 KD로 마우스 PD-1(SEQ ID NO: 91)에 결합할 수 있다. 특정 구체예에서, KD는 표면 플라스몬 공명을 이용하여 결정된다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 임의의 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분은 유세포분석 경쟁 검정에서 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 10 μg/ml의 농도에서 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%만큼 억제할 수 있다. 특정 구체예에서, 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분은 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 적어도 83%만큼 억제할 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 임의의 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분은 바이오-레이어 간섭굴절측정 분석에 의해 결정되는 PD-1에 대한 PD-L1 및 PD-L2의 결합을 10 μg/ml의 농도에서 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%만큼 차단할 수 있다. 특정 구체예에서, 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분은 PD-1에 대한 PD-L1 및 PD-L2의 결합을 적어도 90%만큼 차단한다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 임의의 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분은 PD-1과의 결합에 대해 12865, 12892, 및 12777 항체(예를 들어, 항체 12865.15377, 12892.15378, 및 12777.15382)와 경쟁하거나 교차-경쟁할 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 임의의 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분은 PD-1과의 결합에 대해 12819 항체(예를 들어, 항체 12819.15384)와 경쟁하거나 교차-경쟁할 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 임의의 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분은 PD-1과의 결합에 대해 12760 및 13112 항체(예를 들어, 항체 12760.15375 및 13112.15380)와 경쟁하거나 교차-경쟁할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 SEQ ID NO: 1의 하기 잔기 중 적어도 하나(예를 들어, 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개)를 포함하는 PD-1의 에피토프에 결합한다: V44, V64, L128, P130, K131, A132, E136, 및 T145. 특정 구체예에서, 항체 또는 항원-결합 부분은 SEQ ID NO: 1의 잔기 V64, L128, P130, K131, 및 A132를 포함하는 PD-1의 에피토프에 결합한다(예를 들어, 12819 항체, 예를 들어, 항체 12819.15384). 특정 구체예에서, 항체 또는 항원-결합 부분은 SEQ ID NO: 1의 잔기 K131 및 E136을 포함하는 PD-1의 에피토프에 결합한다(예를 들어, 12865 항체, 예를 들어, 항체 12865.15377). 특정 구체예에서, 항체 또는 항원-결합 부분은 SEQ ID NO: 1의 잔기 V44 및 T145를 포함하는 PD-1의 에피토프에 결합한다(예를 들어, 13112 항체, 예를 들어, 항체 13112.15380).
일부 구체예에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 SEQ ID NO: 1의 잔기 56-64, 69-90, 및/또는 122-140을 포함하는 PD-1의 에피토프에 결합한다. 특정 구체예에서, 항체 또는 항원-결합 부분은 SEQ ID NO: 1의 잔기 69-90 및 122-140을 포함하는 PD-1의 에피토프에 결합한다(예를 들어, 12819 및 12865 항체, 예를 들어, 항체 12819.15384 및 12865.15377). 특정 구체예에서, 항체 또는 항원-결합 부분은 SEQ ID NO: 1의 잔기 56-64, 69-90, 및 122-140을 포함하는 PD-1의 에피토프에 결합한다(예를 들어, 12819 항체). 특정 구체예에서, 항체 또는 항원-결합 부분은 SEQ ID NO: 1의 잔기 69-90 및 122-140을 포함하는 PD-1의 에피토프에 결합한다(예를 들어, 12865 항체). 일부 구체예에서, 항체 또는 부분은 SEQ ID NO: 1의 잔기 69-75(또는 이의 단편, 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개 잔기 단편)에 결합한다(예를 들어, 12819 및 12865 항체, 예를 들어, 항체 12819.15384 및 12865.15377). 일부 구체예에서, 항체 또는 부분은 SEQ ID NO: 1의 잔기 136-140(또는 이의 단편, 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 또는 4개 잔기 단편)에 결합한다(예를 들어, 12819 및 12865 항체, 예를 들어, 항체 12819.15384 및 12865.15377). 일부 구체예에서, 항체 또는 부분은 SEQ ID NO: 1의 69-75(또는 이의 단편) 및 잔기 136-140(또는 이의 단편)에 결합한다(예를 들어, 12819 및 12865 항체, 예를 들어, 항체 12819.15384 및 12865.15377). 상기 잔기의 임의의 조합을 지닌 에피토프가 또한 고려된다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 PD-1 에피토프를 포함하는 아미노산 서열은 상기 에피토프에 결합하는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 생성하거나 확인하기 위한 면역원으로서 이용될 수 있다(예를 들어, 동물에 투여되거나 항체 라이브러리를 스크리닝하기 위한 항원으로서 투여됨).
본원에 기술된 방법에 의해 얻어진 항-PD-1 항체의 부류는 또 다른 부류 또는 아부류로 변경되거나 전환될 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, VL 또는 VH를 인코딩하는 핵산 분자는 CL 또는 CH를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않도록 당해 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 단리된다. VL 또는 VH를 인코딩하는 핵산 분자는 이후에 상이한 부류의 면역글로불린 분자로부터의 CL 또는 CH를 각각 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 결합된다. 이는 상술된 바와 같이, CL 또는 CH 사슬을 포함하는 벡터 또는 핵산 분자를 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 본래 IgM인 항-PD-1 항체는 IgG로 부류가 변경될 수 있다. 또한, 부류 변경(class switching)은 하나의 IgG 아부류를 다른 IgG 아부류로, 예를 들어, IgG1에서 IgG2로 전환시키기 위해 사용될 수 있다. κ 경쇄 불변 영역은 λ 경쇄 불변 영역으로 변경될 수 있다. 요망되는 Ig 아이소형을 갖는 본 발명의 항체를 생산하기 위한 바람직한 방법은 항-PD-1 항체의 중쇄를 인코딩하는 핵산 분자 및 항-PD-1 항체의 경쇄를 인코딩하는 핵산 분자를 단리시키는 단계, 중쇄의 가변 도메인을 수득하는 단계, 중쇄의 가변 도메인을 요망되는 아이소형의 중쇄의 불변 영역과 라이게이션시키는 단계, 경쇄 및 라이게이션된 중쇄를 세포에서 발현시키는 단계, 및 요망되는 아이소형을 갖는 항-PD-1 항체를 수집하는 단계를 포함한다.
본 발명의 항-PD-1 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, 또는 IgD 분자일 수 있으나, 전형적으로 IgG 아이소형, 예를 들어, IgG 아부류 IgG1, IgG2a 또는 IgG2b, IgG3 또는 IgG4일 수 있다. 일 구체예에서, 항체는 IgG1이다. 다른 구체예에서, 항체는 IgG4이다.
일 구체예에서, 항-PD-1 항체는 Fc 영역에 적어도 하나의 돌연변이를 포함할 수 있다. 다수의 상이한 Fc 돌연변이가 공지되어 있고, 이러한 돌연변이는 변경된 이펙터 기능을 제공한다. 예를 들어, 많은 경우에, 예를 들어, 리간드/수용체 상호작용이 요망되지 않거나 항체-약물 컨쥬게이트의 경우에, 이펙터 기능을 감소시키거나 제거하는 것이 바람직할 것이다.
일 구체예에서, 항-PD-1 항체는 이펙터 기능을 감소시키는 적어도 하나의 돌연변이를 Fc 영역에 포함한다. 이펙터 기능을 감소시키기 위해 돌연변이되는 것이 바람직할 수 있는 Fc 영역 아미노산 위치는 위치 228, 233, 234 및 235 중 하나 이상을 포함하고, 이 때 아미노산 위치는 IMGT® 넘버링 체계에 따라 넘버링된다.
일 구체예에서, 위치 234 및 235의 아미노산 잔기 중 하나 또는 둘 모두는, 예를 들어, Leu에서 Ala로 돌연변이될 수 있다(L234A/L235A). 이러한 돌연변이는 IgG1 항체의 Fc 영역의 이펙터 기능을 감소시킨다. 추가로 또는 대안적으로, 위치 228의 아미노산 잔기는, 예를 들어, Pro으로 돌연변이될 수 있다. 다른 구체예에서, 위치 233의 아미노산 잔기는, 예를 들어, Pro으로 돌연변이될 수 있고/거나, 위치 234의 아미노산 잔기는, 예를 들어, Val으로 돌연변이될 수 있고/거나, 위치 235의 아미노산 잔기는, 예를 들어, Ala으로 돌연변이될 수 있다. 아미노산 위치는 IMGT® 넘버링 체계에 따라 넘버링된다.
다른 구체예에서, 항체가 IgG4 아부류인 경우, 이것은 돌연변이 S228P를 포함할 수 있고, 즉, 위치 228에 프롤린을 가질 수 있으며, 이 때 아미노산 위치는 IMGT® 넘버링 체계에 따라 넘버링된다. 이러한 돌연변이는 요망되지 않는 Fab 아암 교환을 감소시키는 것으로 공지되어 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 항체 또는 항체 부분과 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비공유 회합에 의해 형성된, 보다 큰 면역접합 분자의 일부일 수 있다. 이러한 면역접합 분자의 예는 테트라머 scFv 분자를 제조하기 위해 스트렙타비딘 코어 영역의 사용[Kipriyanov et al., Human antibody and Hybridomas 6:93-101 (1995)] 및 이가 및 바이오티닐화된 scFv 분자를 제조하기 위해 시스테인 잔기, 마커 펩티드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그의 사용[[Kipriyanov et al., Mol. Immunol. 31:1047-1058 (1994)]을 포함한다. 다른 예는 항체로부터의 하나 이상의 CDR이 관심 항원에 특이적으로 결합하는 면역접합체(immunoadhesin)를 제조하기 위해 분자에 공유적으로 또는 비공유적으로 도입되는 경우를 포함한다. 이러한 구체예에서, CDR(들)은 보다 큰 폴리펩티드 사슬의 일부로서 도입될 수 있거나, 다른 폴리펩티드 사슬에 공유 결합될 수 있거나, 비공유적으로 도입될 수 있다.
다른 구체예에서, 다른 폴리펩티드에 결합된 본 발명의 항-PD-1 항체 모두 또는 일부를 포함하는 융합 항체 또는 면역접합체가 제조될 수 있다. 특정 구체예에서, 단지 항-PD-1 항체의 가변 도메인만이 폴리펩티드에 결합된다. 특정 구체예에서, 항-PD-1 항체의 VH 도메인은 제1 폴리펩티드에 결합되며, 항-PD-1 항체의 VL 도메인은 항원-결합 부위를 형성시키기 위해 VH 도메인 및 VL 도메인이 서로 상호작용할 수 있는 방식으로 제1 폴리펩티드와 회합하는 제2 폴리펩티드에 결합된다. 다른 바람직한 구체예에서, VH 도메인은 VH 도메인 및 VL 도메인이 서로 상호작용할 수 있도록 링커에 의해 VL 도메인으로부터 분리된다(예를 들어, 단일쇄 항체). VH-링커-VL 항체는 이후에 관심 폴리펩티드에 결합된다. 또한, 2개(또는 그 초과)의 단일쇄 항체가 서로 결합된 융합 항체가 생성될 수 있다. 이는 단일 폴리펩티드 사슬 상에 이가 또는 다가 항체를 형성시키고자 하는 경우에 또는 이중특이적 항체를 생성시키고자 하는 경우에 유용하다.
단일쇄 항체(scFv)를 형성시키기 위해, VH- 및 VL-인코딩 DNA 단편은 VH 서열 및 VL 서열이 가요성 링커(flexible linker)에 의해 연결된 VL 도메인 및 VH 도메인을 지닌, 인접한 단일쇄 단백질로서 발현될 수 있도록, 가요성 링커를 인코딩하는, 예를 들어, 아미노산 서열 (Gly4-Ser)3을 인코딩하는 다른 단편에 작동 가능하게 연결된다[예를 들어, 문헌[Bird et al., Science 242:423 426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879 5883 (1988); and McCafferty et al., Nature 348:552 554 (1990)]을 참조]. 단일쇄 항체는 단지 단일 VH 및 VL이 사용되는 경우에 일가, 2개의 VH 및 VL이 사용되는 경우에 이가, 또는 2개 초과의 VH 및 VL이 사용되는 경우에 다가일 수 있다. 예를 들어, 인간 PD-1 및 다른 분자에 특이적으로 결합하는 이중특이적 또는 다가 항체가 발생할 수 있다.
다른 구체예에서, 다른 변형된 항체는 항-PD-1 항체-인코딩 핵산 분자를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, "카파 바디(kappa body)"(Ill et al., Protein Eng. 10:949-57 (1997)), "미니바디(minibody)"(Martin et al., EMBO J. 13:5303-9 (1994)), "디아바디"(Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)), 또는 "자누신(Janusin)"(Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991) 및 Traunecker et al., Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52 (1992))은 본 명세서의 교시에 따라 표준 분자 생물학적 기술을 이용하여 제조될 수 있다.
본 발명의 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분은 다른 분자(예를 들어, 다른 펩티드 또는 단백질)로 유도체화되거나 여기에 결합될 수 있다. 일반적으로, 항체 또는 이의 부분은, PD-1 결합이 유도체화 또는 표지화에 의해 악영향을 받지 않도록 유도체화된다. 이에 따라, 본 발명의 항체 또는 항체 부분은 본원에 기술된 완전한 형태 및 변형된 형태의 인간 항-PD-1 항체 둘 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항체 부분은 하나 이상의 다른 분자 실체, 예를 들어, 다른 항체(예를 들어, 이중특이적 항체 또는 디아바디), 검출제, 약학적 제제, 및/또는 다른 분자(예를 들어, 스트렙타비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그)와 항체 또는 항체 부분의 회합을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩티드에 (화학적 커플링, 유전학적 융합, 비공유 회합 또는 다른 방법에 의해) 기능적으로 결합될 수 있다.
유도체화된 항체의 한 유형은 2개 이상의 항체(예를 들어, 이중특이적 항체를 생성시키기 위해 동일하거나 상이한 유형)를 가교시킴으로써 생산된다. 적합한 가교제는 적절한 스페이서(예를 들어, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스테르)에 의해 분리된 2개의 별개의 반응성 기를 갖는 헤테로이작용성이거나 호모이작용성(예를 들어, 디석신이미딜 수베레이트)인 것을 포함한다. 이러한 링커는, 예를 들어, Pierce Chemical Company(Rockford, Il.)로부터 입수 가능하다.
항-PD-1 항체는 또한 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 메틸 또는 에틸 기, 또는 탄수화물 기와 같은 화학적 기로 유도체화될 수 있다. 이러한 기들은 항체의 생물학적 특징을 개선시키기 위해, 예를 들어, 혈청 반감기를 증가시키기 위해 유용할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 또한 표지될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "표지(label)" 또는 "표지된(labeled)"은 항체에 다른 분자의 혼입을 지칭한다. 일 구체예에서, 표지는 검출 가능한 마커, 예를 들어, 방사선표지된 아미노산의 도입 또는 마킹된 아비딘(예를 들어, 광학적 방법 또는 비색법에 의해 검출될 수 있는 형광 마커 또는 효소적 활성을 함유한 스트렙타비딘)에 의해 검출될 수 있는 바이오티닐 모이어티의 폴리펩티드에 대한 부착이다. 다른 구체예에서, 표지 또는 마커는 치료제, 예를 들어, 약물 컨쥬게이트 또는 독소일 수 있다. 폴리펩티드 및 당단백질을 표지하는 다양한 방법은 당해 분야에 공지되어 있고 사용될 수 있다. 폴리펩티드용 표지의 예는 방사성 동위원소 또는 방사성 핵종(예를 들어, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), 형광 표지(예를 들어, FITC, 로다민, 란타나이드 인광체), 효소 표지(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시페라제, 알칼린 포스파타제), 화학발광 마커, 바이오티닐 기, 2차 리포터(secondary reporter)에 의해 인지되는 사전결정된 폴리펩티드 에피토프(예를 들어, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그), 자성 제제(magnetic agent), 예를 들어, 가돌리늄 킬레이트, 독소, 예를 들어, 백일해 독소, 탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 푸로마이신 및 이들의 유사체 또는 동족체를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, 표지는 잠재적인 입체 장애를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 아암(spacer arm)에 의해 부착된다.
특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 중성 형태(쯔비터 이온 형태를 포함함) 또는 양으로 또는 음으로 하전된 종으로서 존재할 수 있다. 일부 구체예에서, 항체는 약학적으로 허용되는 염을 형성하기 위해 반대이온과 착물화될 수 있다.
용어 "약학적으로 허용되는 염"은 하나 이상의 항체 및 하나 이상의 반대이온을 포함하는 착물을 지칭하며, 여기서, 반대이온은 약학적으로 허용되는 무기 및 유기 산 및 염기로부터 유도된다.
이중특이적 결합 분자
추가 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 항-PD-1 항체의 결합 특이성, 및 또 다른 항-PD-1 항체(예를 들어, 본원에 기재된 또 다른 항-PD-1 항체) 또는 상이한 단백질, 예를 들어, 또 다른 면역 체크포인트 단백질, 암 항원, 또는 그 활성이 암과 같은 질병 상태를 매개하는 또 다른 세포 표면 분자를 표적화하는 항체의 결합 특이성을 갖는 이중특이적 결합 분자를 제공한다. 그러한 이중특이적 결합 분자는 당해 분야에 공지되어 있고, 상이한 유형의 이중특이적 결합 분자의 예는 본원에서 달리 제공된다.
핵산 분자 및 벡터
본 발명은 또한 본원에 기술된 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 핵산 분자 및 서열을 제공한다. 일부 구체예에서, 상이한 핵산 분자는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 인코딩한다. 다른 구체예에서, 동일한 핵산 분자는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 인코딩한다.
뉴클레오티드 서열에 대한 언급은 달리 기술하지 않는 한 이의 보체(complement)를 포함한다. 이에 따라, 특정 서열을 갖는 핵산에 대한 언급은 이의 보체 서열을 갖는 이의 보체 가닥을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 본원에서 지칭되는 용어 "폴리뉴클레오티드"는 길이가 적어도 10개의 염기인 뉴클레오티드의 폴리머 형태, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드 중 어느 하나, 또는 어느 한 유형의 뉴클레오티드의 개질된 형태를 의미한다.이러한 용어는 단일 및 이중 가닥 형태를 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 언급된 하나 이상의 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, SEQ ID NO: 69-88로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 핵산 서열의 맥락에서 용어 "서열 동일성"은 최대 일치(correspondence)를 위해 정렬될 때 2개의 서열에서 동일한 잔기를 지칭한다. 서열 동일성 비교의 길이는 적어도 약 9개의 뉴클레오티드, 대개 적어도 약 18개의 뉴클레오티드, 보다 일반적으로, 적어도 약 24개의 뉴클레오티드, 통상적으로, 적어도 약 28개의 뉴클레오티드, 더욱 통상적으로, 적어도 약 32개의 뉴클레오티드, 및 바람직하게, 적어도 약 36, 48개 이상의 뉴클레오티드의 신장(stretch) 이상일 수 있다. 뉴클레오티드 서열 동일성을 측정하기 위해 사용될 수 있는 당해 분야에 공지된 여러 상이한 알고리즘이 존재한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 서열은 FASTA, Gap 또는 Bestfit를 이용하여 비교될 수 있으며, 이는 Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG)(Madison, Wisconsin)의 프로그램이다. 예를 들어, 프로그램 FASTA2 및 FASTA3을 포함하는 FASTA는 조회 서열과 검색 서열 간의 최상의 중첩 영역의 정렬 및 퍼센트 서열 동일성을 제공한다(예를 들어, 문헌[Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266:227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276:71-84 (1998)] 참조; 본원에서 참고로 포함됨]. 달리 명시하지 않는 한, 특정 프로그램 또는 알고리즘에 대한 기본 파라미터들이 사용된다. 예를 들어, 핵산 서열들 간의 퍼센트 서열 동일성은 이의 기본 파라미터(6의 단어 크기 및 스코어링 매트릭스를 위한 NOPAM 인자)를 갖는 FASTA를 이용하거나 GCG Version 6.1에 제공된 바와 같은 이의 기본 파라미터를 갖는 Gap을 이용하여 결정될 수 있으며, 이들은 본원에 참고로 포함된다.
일 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 69-88로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
임의의 상기 구체예에서, 핵산 분자들은 단리될 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 사슬들 중 하나를 발현시키기에 적합한 벡터를 제공한다. 본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 여기에 연결된 다른 핵산을 이동시킬 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 일부 구체예에서, 벡터는 플라스미드, 즉, 추가적인 DNA 세그먼트가 라이게이션될 수 있는 DNA의 원형의 이중 가닥 조각이다. 일부 구체예에서, 벡터는 바이러스 벡터이며, 여기서 추가적인 DNA 세그먼트가 바이러스 게놈에 라이게이션될 수 있다. 일부 구체예에서, 벡터는 이것이 도입된 숙주 세포(예를 들어, 복제 및 에피솜 포유동물 벡터의 박테리아 기원을 갖는 박테리아 벡터)에서 자율 복제가 가능하다. 다른 구체예에서, 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포에 도입 시에 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있고, 이에 의해, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 이것이 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 단순하게, "발현 벡터")로서 지칭된다.
본 발명은 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 중쇄, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 경쇄, 또는 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 중쇄 및 경쇄 둘 모두를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 융합 단백질, 변형된 항체, 항체 단편, 및 이의 프로브를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 중쇄 및/또는 경쇄를 인코딩하는 핵산 분자는 이러한 항체 또는 부분을 형성하는 임의의 공급원(source)으로부터 단리될 수 있다. 다양한 구체예에서, 핵산 분자는 인간 PD-1 항원으로 면역된 동물로부터 단리된 항-PD-1 항체를 발현시키는 B 세포로부터, 또는 이러한 B 세포로부터 형성된 무한증식 세포로부터 단리된다. 항체를 인코딩하는 핵산을 단리시키는 방법은 당해 분야에서 널리 공지되어 있다. mRNA는 항체 유전자의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 또는 cDNA 클로닝에서 사용하기 위한 cDNA를 생산하기 위해 단리되고 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 단리되기 보다는 합성될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 임의의 공급원으로부터의 중쇄 불변 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 인 프레임으로 결합된 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분으로부터의 VH 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 유사하게, 본 발명의 핵산 분자는 임의의 공급원으로부터의 경쇄 불변 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 인 프레임으로 결합된 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분으로부터의 VL 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 추가 양태에서, 중쇄(VH) 및/또는 경쇄(VL)의 가변 도메인을 인코딩하는 핵산 분자는 전장 항체 유전자로 "전환"될 수 있다. 일 구체예에서, VH 도메인 또는 VL 도메인을 인코딩하는 핵산 분자는, VH 세그먼트가 벡터 내에서 CH 세그먼트(들)에 작동 가능하게 결합되고/거나 VL 세그먼트가 벡터 내에서 CL 세그먼트에 작동 가능하게 결합되도록, 각각 중쇄 불변(CH) 도메인 또는 경쇄 불변(CL) 도메인을 이미 인코딩하는 발현 벡터로의 삽입에 의해 전장 항체 유전자로 전환된다. 다른 구체예에서, VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 인코딩하는 핵산 분자는 표준 분자 생물학적 기술을 이용하여 CH 도메인 및/또는 CL 도메인을 인코딩하는 핵산 분자에 VH 및/또는 VL 도메인을 인코딩하는 핵산 분자를 연결시킴으로써, 예를 들어, 라이게이션시킴으로써 전장 항체 유전자로 전환된다. 전장 중쇄 및/또는 경쇄를 인코딩하는 핵산 분자는 이후에 이들이 도입된 세포로부터 발현될 수 있고, 항-PD-1 항체가 단리될 수 있다.
핵산 분자는 대량의 항-PD-1 항체를 재조합적으로 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 핵산 분자는 또한 본원에 기술된 바와 같은 키메라 항체, 이중특이적 항체, 단일쇄 항체, 면역접합체, 디아바디, 돌연변이된 항체 및 항체 유도체를 생산하기 위해 사용될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 특이적 항체 서열을 위한 프로브 또는 PCR 프라이머로서 사용된다. 예를 들어, 핵산은 그 중에서도 항-PD-1 항체의 가변 도메인을 인코딩하는 추가적인 핵산 분자를 단리시키기 위해 사용될 수 있는 DNA의 영역을 증폭시키기 위한 PCR 프라이머로서 또는 진단 방법에서의 프로브로서 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 올리고뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 관심 항체의 중쇄 및 경쇄의 고도의 가변 도메인으로부터 기인한 것이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 CDR들 중 하나 이상의 모두 또는 일부를 인코딩한다.
다른 구체예에서, 핵산 분자 및 벡터는 돌연변이된 항-PD-1 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 항체는, 예를 들어, 항체의 결합 성질을 변경시키기 위해, 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인에서 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 항-PD-1 항체의 KD를 증가시키거나 감소시키기 위해, koff를 증가시키거나 감소시키기 위해, 또는 항체의 결합 특이성을 변경시키기 위해 CDR들 중 하나 이상에서 이루어질 수 있다. 다른 구체예에서, 하나 이상의 돌연변이는 본 발명의 모노클로날 항체에서의 생식 계열과 비교하여 변경되는 것으로 알려진 아미노산 잔기에서 구성된다. 돌연변이는 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 영역, 또는 불변 영역에서 이루어질 수 있다. 바람직한 구체예에서, 돌연변이는 가변 도메인에서 구성된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 돌연변이는 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 영역에서의 생식 계열과 비교하여 변경되는 것으로 알려진 아미노산 잔기에서 구성된다.
다른 구체예에서, 프레임워크 영역(들)은 얻어진 프레임워크 영역(들)이 상응하는 생식 계열 유전자의 아미노산 서열을 갖도록 돌연변이된다. 돌연변이는 항-PD-1 항체의 반감기를 증가시키기 위해 프레임워크 영역 또는 불변 영역에서 이루어질 수 있다[예를 들어, PCT 공개 WO 00/09560호 참조]. 프레임워크 영역 또는 불변 영역에서의 돌연변이는 또한 항체의 면역원성을 변경시키기 위해 및/또는 다른 분자에 대한 공유 또는 비-공유 결합을 위한 부위를 제공하기 위해 이루어질 수 있다. 본 발명에 따르면, 단일 항체는 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 영역들 중 임의의 하나 이상 또는 불변 영역에서 돌연변이를 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 전사 및 번역 조절 서열과 같은 필수적인 발현 조절 서열에 유전자가 작동 가능하게 결합되도록 발현 벡터에, 상술된 바와 같이 얻어진, 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 DNA를 삽입함으로써 발현된다. 발현 벡터는 플라스미드, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV), 식물 바이러스, 예를 들어, 꽃양배추 모자이크 바이러스, 담배 모자이크 바이러스, 코스미드, YAC, EBV 유래된 에피솜 등을 포함한다. 항체 코딩 서열은 벡터 내의 전사 및 번역 조절 서열이 항체 코딩 서열의 전사 및 번역을 조절하는 이의 의도된 기능을 제공하도록 벡터에 라이게이션될 수 있다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 사용되는 발현 숙주 세포와 양립 가능하도록 선택될 수 있다. 항체 경쇄 코딩 서열 및 항체 중쇄 코딩 서열은 별도의 벡터에 삽입될 수 있고, 동일하거나 상이한 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터)에 작동 가능하게 결합될 수 있다. 일 구체예에서, 둘 모두의 코딩 서열은 동일한 발현 벡터에 삽입되고, 동일한 발현 조절 서열(예를 들어, 공통 프로모터), 별도의 동일한 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터), 또는 상이한 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터)에 작동 가능하게 결합될 수 있다. 항체 코딩 서열은 표준 방법(예를 들어, 항체 유전자 단편 및 벡터의 상보적 제한 부위의 라이게이션, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우, 블런트 단부 라이게이션(blunt end ligation))에 의해 발현 벡터에 삽입될 수 있다.
편리한 벡터는, 상술된 바와 같이, 임의의 VH 서열 또는 VL 서열이 용이하게 삽입되고 발현되도록, 공학처리된 적절한 제한 부위를 갖는 기능적으로 완전한 인간 CH 또는 CL 면역글로불린 서열을 인코딩하는 벡터이다. 그러한 벡터의 HC- 및 LC-인코딩 유전자는 관련 mRNA를 안정화시킴으로써 전체 항체 단백질 수율을 향상시킬 인트론 서열을 함유할 수 있다. 인트론 서열은 스플라이스 도너 및 스플라이스 어셉터 부위의 측면에 있으며, RNA 스플라이싱이 발생할 곳을 결정한다. 인트론 서열의 위치는 항체 사슬의 가변 또는 불변 영역에 있거나, 다중 인트론이 사용되는 경우 가변 및 불변 영역 둘 모두에 있을 수 있다. 폴리아데닐화 및 전사 종결은 코딩 영역의 다운스트림의 고유 염색체 부위에서 일어날 수 있다. 재조합 발현 벡터는 또한 숙주 세포로부터 항체 사슬의 분비를 촉진시키는 신호 펩티드를 인코딩할 수 있다. 항체 사슬 유전자는 신호 펩티드가 면역글로불린 사슬의 아미노 말단에 인 프레임으로 결합되도록 벡터에 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드(즉, 비-면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.
항체 사슬 유전자에 추가하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 항체 사슬 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열을 지닐 수 있다. 조절 서열의 선택을 포함하는 발현 벡터의 설계는 변형되는 숙주 세포의 선택, 요망되는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 좌우될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위한 바람직한 조절 서열은 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 유도하는 바이러스 요소, 예를 들어, 레트로바이러스 LTR, 시토메갈로바이러스(CMV)(예를 들어, CMV 프로모터/인핸서), Simian Virus 40(SV40)(예를 들어, SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(adenovirus major late promoter; AdMLP))로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서, 폴리오마(polyoma) 및 강한 포유동물 프로모터, 예를 들어, 고유 면역글로불린 및 액틴 프로모터를 포함한다. 바이러스 조절 요소 및 이의 서열의 추가 설명을 위하여, 예를 들어, 미국특허 제5,168,062호, 제4,510,245호 및 제4,968,615호가 참조된다. 프로모터 및 벡터의 설명을 포함하는 식물에서 항체를 발현시키는 방법 뿐만 아니라 식물의 형질전환이 당해 분야에 공지되어 있다[예를 들어, 미국특허 제6,517,529호 참조]. 박테리아 세포 또는 진균 세포, 예를 들어, 효모 세포에서 폴리펩티드를 발현시키는 방법이 또한 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
항체 사슬 유전자 및 조절 서열에 추가하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가적인 서열, 예를 들어, 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예를 들어, 복제 기점) 및 선택 가능한 마커 유전자를 지닐 수 있다. 선택 가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다[예를 들어, 미국특허 제4,399,216호, 제4,634,665호 및 제5,179,017호 참조]. 예를 들어, 통상적으로, 선택 가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포 상에 약물, 예를 들어, G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여한다. 예를 들어, 선택 가능한 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선택/증폭을 갖는 dhft-숙주 세포에서 사용하기 위한), neo 유전자(G418 선택을 위한), 및 글루타메이트 합성효소 유전자를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "발현 조절 서열"은 라이게이션되는 코딩 서열의 발현 및 처리를 달성하는데 필수적인 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 발현 조절 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 효율적인 RNA 처리 신호, 예를 들어, 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 향상시키는 서열(즉, Kozak 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 요망될 때, 단백질 분비를 향상시키는 서열을 포함한다. 이러한 조절 서열의 특성은 숙주 유기체에 따라 상이하며, 원핵생물에서, 이러한 조절 서열은 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 부위, 및 전사 종결 서열을 포함하며, 진핵생물에서, 일반적으로 이러한 조절 서열은 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. 용어 "조절 서열"은 최소로, 발현 및 처리를 위해 필수적으로 존재하는 모든 성분들을 포함하도록 의도되고, 또한 존재하는 것이 유리한 추가적인 성분, 예를 들어, 리더 서열(leader sequence) 및 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다.
숙주 세포 및 항체 및 항체 조성물을 생산하는 방법
본 발명의 추가적인 양태는 본 발명의 항체 조성물 및 항체 및 이의 항원-결합 부분을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 양태의 일 구체예는 항체를 발현시킬 수 있는 재조합 숙주 세포를 제공하고, 항체의 발현을 위해 적합한 조건 하에서 상기 숙주 세포를 배양시키고, 얻어진 항체를 단리시키는 것을 포함하는, 본원에서 정의된 바와 같은 항체를 생산하는 방법에 관한 것이다. 이러한 재조합 숙주 세포에서 상기 발현에 의해 형성된 항체는 본원에서 "재조합 항체"로서 지칭된다. 본 발명은 또한 이러한 숙주 세포의 자손 세포, 및 이에 의해 형성된 항체를 제공한다.
본원에서 사용되는 용어 "재조합 숙주 세포"(또는 간단하게 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 의미한다. 본 발명은, 예를 들어, 상술된 본 발명에 따른 벡터를 포함할 수 있는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한, 예를 들어, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 중쇄 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 경쇄 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 둘 모두를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. "재조합 숙주 세포" 및 "숙주 세포"는 특정 대상 세포 뿐만 아니라, 이러한 세포의 자손을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 특정 개질이 돌연변이 또는 환경적 영향 중 어느 하나로 인해 다음 세대에서 일어날 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로, 부모 세포와 일치하지 않지만, 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 여전히 포함된다.
항-PD-1 항체를 인코딩하는 핵산 분자 및 이러한 핵산 분자를 포함하는 벡터는 적합한 포유동물, 식물, 박테리아 또는 효모 숙주 세포의 트랜스펙션(transfection)을 위해 사용될 수 있다. 형질전환은 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하기 위한 임의의 공지된 방법에 의한 것일 수 있다. 이종 폴리뉴클레오티드를 포유동물 세포에 도입하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 덱스트란-매개 트랜스펙션, 칼슘 포스페이트 침전, 폴리브렌-매개 트랜스펙션, 원형질 융합, 전기천공, 리포솜 중에 폴리뉴클레오티드(들)의 캡슐화, 및 핵에 DNA의 직접 미세주입을 포함한다. 또한, 핵산 분자는 바이러스 벡터에 의해 포유동물 세포에 도입될 수 있다. 세포를 형질전환시키는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다[예를 들어, 미국특허 제4,399,216호, 제4,912,040호, 제4,740,461호, 및 제4,959,455호 참조]. 식물 세포를 형질전환시키는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 아그로박테리윰-매개 형질전환, 유전자총법 형질전환, 직접 주입, 전기천공 및 바이러스 형질전환을 포함한다. 박테리아 및 효모 세포를 형질전환시키는 방법이 또한 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
발현을 위한 숙주로서 입수 가능한 포유동물 세포주는 당해 분야에서 널리 공지되어 있고, 미국 표준 균주 배양 수집소(American Type Culture Collection; ATCC)로부터 입수 가능한 다수의 무한증식 세포주를 포함한다. 이러한 것은 다른 것들 중에서, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, NS0 세포, SP2 세포, HEK-293T 세포, 293 Freestyle 세포(Invitrogen), NIH-3T3 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포, 아프리카 그린 몽키 신장 세포(COS), 인간 간세포 암종 세포(예를 들어, Hep G2), A549 세포, 및 다수의 다른 세포주를 포함한다. 특히 바람직한 세포주는 세포주가 높은 발현 수준을 갖는 지를 결정함에 의해 선택된다. 사용될 수 있는 다른 세포주에는 곤충 세포주, 예를 들어, Sf9 또는 Sf21 세포가 있다. 항체 유전자를 인코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포에 도입될 때, 항체는 숙주 세포를, 숙주 세포에서 항체의 발현을 가능하게 하거나 더욱 바람직하게는 숙주 세포가 성장되는 배양 배지에 항체의 분비를 가능하게 하는데 충분한 시간 동안 배양시킴으로써 생산된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 이용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 식물 숙주 세포는 예를 들어, 니코티아나(Nicotiana), 아라비돕시스(Arabidopsis), 좀개구리밥(duckweed), 옥수수, 밀, 감자 등을 포함한다. 박테리아 숙주 세포는 이.콜라이(E.coli) 및 스트렙토마이세스 종을 포함한다. 효모 숙주 세포는 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)를 포함한다.
또한, 생산 세포주로부터의 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 발현은 다수의 공지된 기술을 이용하여 향상될 수 있다. 예를 들어, 글루타민 합성효소 유전자 발현 시스템(GS 시스템)은 특정 조건 하에서 발현을 향상시키기 위한 일반적인 방법이다. GS 시스템은 EP 특허 0 216 846, 0 256 055, 0 323 997 및 0 338 841와 관련하여 전부 또는 일부 논의되어 있다.
상이한 세포주에 의해 또는 트랜스제닉 동물에서 발현된 항체가 서로 상이한 당화 패턴을 가질 가능성이 있다. 그러나, 본원에 제공된 핵산 분자에 의해 코딩되거나 본원에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 모든 항체는 항체의 당화 상태와 무관하게, 그리고, 보다 일반적으로, 번역후 개질(들)의 존재 또는 부재와는 무관하게, 본 발명의 일부이다.
약학적 조성물
본 발명의 다른 양태는 활성 성분으로서(또는 단독 활성 성분으로서) 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분 또는 항-PD-1 항체 조성물을 포함하는 약학적 조성물이다. 약학적 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 임의의 항-PD-1 항체 조성물 또는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물은 PD-1-관련 장애(예를 들어, PD-1의 과발현 또는 과활성을 특징으로 하는 장애) 및/또는 암의 개선, 예방, 및/또는 치료를 위해 의도된다. 일부 구체예에서, 조성물은 면역 시스템의 활성화를 위해 의도된다. 특정 구체예에서, 조성물은 피부, 폐, 장, 난소, 뇌, 전립선, 신장, 연조직, 조혈 시스템, 두경부, 간, 방광, 유방, 위, 자궁 및 췌장과 같은 조직에서 기원한 암의 개선, 예방, 및/또는 치료를 위해 의도된다.
일반적으로, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은, 예를 들어, 상술된 바와 같은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제(들)와 회합하여 제형으로서 투여되기에 적합하다.
본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 하나 이상의 항-PD-1 항체 또는 결합 부분, 예를 들어, 1 또는 2개의 항-PD-1 항체 또는 결합 부분을 포함할 것이다. 일 구체예에서, 조성물은 본 발명의 단일 항-PD-1 항체 또는 이의 결합 부분을 포함한다.
다른 구체예에서, 약학적 조성물은 적어도 하나의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 예를 들어, 하나의 항-PD-1 항체 또는 부분, 및 하나 이상의 관련 세포 표면 수용체, 예를 들어, 하나 이상의 암-관련 수용체를 표적화하는 하나 이상의 추가 항체를 포함할 수 있다.
용어 "부형제"는 본 발명의 화합물(들) 이외의 임의의 성분을 기술하기 위해 본원에서 사용된다. 부형제(들)의 선택은 특정 투여 모드, 용해도 및 안정성에 대한 부형제의 효과, 및 투여 형태의 특성과 같은 인자에 상당히 크게 좌우될 것이다. 본원에서 사용되는 "약학적으로 허용되는 부형제"는 생리학적으로 양립 가능한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적으로 허용되는 부형제의 일부 예로는 물, 염수, 포스페이트 완충된 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 뿐만 아니라 이들의 조합물이 있다. 여러 경우에, 조성물에 등장제, 예를 들어, 당, 폴리알콜, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨, 또는 소듐 클로라이드를 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 약학적으로 허용되는 물질의 추가적인 예로는 습윤제 또는 소량의 보조 물질, 예를 들어, 습윤 또는 에멀젼화제, 보존제 또는 완충제가 있으며, 이는 항체의 저장 수명 또는 효능을 향상시킨다.
본 발명의 약학적 조성물 및 이의 제조 방법은 당업자에게 용이하게 자명할 것이다. 이러한 조성물 및 이의 제조 방법은 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company, 1995)]에서 확인될 수 있다. 약학적 조성물은 바람직하게는 GMP(우수 제조관리 기준(good manufacturing practices)) 조건 하에서 제조된다.
본 발명의 약학적 조성물은 벌크로, 단일 단위 용량으로서, 또는 복수의 단일 단위 용량으로서 제조되거나, 패키징되거나, 판매될 수 있다. 본원에서 사용되는 "단위 용량"은 사전 결정된 양의 활성 성분을 포함하는 약학적 조성물의 개별 양이다. 활성 성분의 양은 일반적으로 피검체에 투여되는 활성 성분의 투여량과 같거나, 이러한 투여량의 편리한 분획, 예를 들어, 이러한 투여량의 1/2 또는 1/3이다.
당해 분야에서 허용되는 펩티드, 단백질 또는 항체를 투여하기 위한 임의의 방법은 본 발명의 항체 및 항원-결합 부분을 위해 적합하게 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 통상적으로 비경구 투여를 위해 적합하다. 본원에서 사용되는 약학적 조성물의 "비경구 투여"는 피검체의 조직의 물리적 블리칭(physical breaching) 및 조직에 브리치(breach)를 통한 약학적 조성물의 투여에 의해 특징되는 임의의 투여 경로를 포함하며, 이에 따라, 일반적으로 혈류에, 근육에 또는 내부 장기에 직접 투여를 발생시킨다. 이에 따라, 비경구 투여는 조성물의 주사에 의해, 외과적 절개를 통한 조성물의 적용에 의해, 조직-침투 비-외과적 상처를 통한 조성물의 적용 등에 의한 약학적 조성물의 투여를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 특히, 비경구 투여는 피하, 복강내, 근육내, 흉골내, 정맥내, 동맥내, 척추강내, 심실내, 요도내, 두개내, 및 활막내 주사 또는 주입; 및 신장 투석 주입 기술을 비제한적으로 포함하는 것으로 고려된다. 국소 관류법이 또한 고려된다. 바람직한 구체예는 정맥내 및 피하 경로를 포함한다.
비경구 투여를 위해 적합한 약학적 조성물의 제형은 통상적으로 약학적으로 허용되는 담체, 예를 들어, 멸균수 또는 멸균 등장성 염수와 조합된 활성 성분을 포함한다. 이러한 제형은 볼루스 투여 또는 연속 투여에 적절한 형태로 제조, 패키징 또는 판매될 수 있다. 주사용 제형은 보존제를 함유하는 앰플 또는 다중-용량 용기와 같은 단위 투여 형태로 제조, 패키징 또는 판매될 수 있다. 비경구 투여용 제형은 현탁액, 용액, 유성 또는 수성 비히클 중의 에멀젼, 페이스트 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 이러한 제형은 현탁화제, 안정화제 또는 분산제가 포함되지만 이에 한정되지 않는 하나 이상의 추가적인 성분을 추가로 포함할 수 있다. 비경구 투여를 위한 제형의 일 구체예에서, 활성 성분은 건조(즉, 분말 또는 과립) 형태로 제공되고, 이는 재구성된 조성물을 비경구 투여하기 전에 적절한 비히클(예를 들어, 발열원이 없는 멸균수)로 재구성된다. 비경구 제형은 부형제, 예를 들어, 염, 탄수화물 및 완충제(바람직하게, 3 내지 9의 pH까지)를 함유할 수 있는 수용액을 포함하지만, 일부 적용을 위하여, 이들은 더욱 적합하게 멸균 비-수용액으로서 또는 적합한 비히클, 예를 들어, 멸균, 무발열원 수와 함께 사용되는 건조된 형태로서 제형화될 수 있다. 예시적인 비경구 투여 형태는 멸균 수용액, 예를 들어, 프로필렌 글리콜 또는 덱스트로스 수용액 중의 용액 또는 현탁액을 포함한다. 이러한 투여 형태는 요망되는 경우에, 적합하게 완충될 수 있다. 유용할 수 있는 다른 비경구적으로 투여 가능한 제형은 미정질 형태 또는 리포솜 제조물에 활성 성분을 포함하는 것을 포함한다. 비경구 투여를 위한 제형은 즉방출 및/또는 변형된 방출이 되도록 제형화될 수 있다. 변형된 방출 제형은 지연된-, 지속된-, 펄스화된-, 조절된-, 표적화된 및 프로그래밍된 방출을 포함한다.
예를 들어, 일 양태에서, 멸균 주사 가능한 용액은 상기 나열된 성분들 중 하나 또는 이의 조합과 함께, 적절한 용매 중에 요구되는 양의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분 또는 항-PD-1 항체 조성물을 혼입시키고, 필요한 경우에, 이후에 여과 멸균화함으로서 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기에 나열된 것으로부터의 요구되는 다른 성분을 함유한 멸균 비히클에 활성 화합물을 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사 가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분의 분말 및 이전의 이의 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가적인 요망되는 성분을 수득하는 진공 건조 및 냉동-건조이다. 용액의 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 주사 가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써, 및/또는 변형된-방출 코팅(예를 들어, 서방출 코팅)을 사용함으로써 초래될 수 있다.
본 발명의 항체는 또한 통상적으로 건조 분말 흡입기로부터의 건조 분말 형태로(단독으로, 혼합물로서, 또는 혼합된 성분 입자로서, 예를 들어, 적합한 약학적으로 허용되는 부형제와 혼합된 입자로서), 적합한 추진제의 사용 유무와 함께, 가압된 용기, 펌프, 스프레이, 분무기(바람직하게는 미세한 미스트를 형성시키기 위한 전기유체역학을 이용한 분무기) 또는 네불라이저로부터의 에어로졸 스프레이로서, 또는 점비액으로서, 비강내 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다.
가압된 용기, 펌프, 스프레이, 분무기, 또는 네불라이저는 일반적으로, 예를 들어, 활성물의 방출물을 분산, 가용화 또는 팽창시키기 위한 적합한 제제, 용매로서 추진제(들)를 포함하는 본 발명의 항체 용액 또는 현탁액을 함유한다.
건조 분말 또는 현탁액 제형에서 사용하기 전에, 약물 제품은 일반적으로 흡입에 의한 전달을 위해 적합한 크기(통상적으로, 5 마이크론 미만)로 미세화된다. 이는 임의의 적절한 분쇄 방법, 예를 들어, 나선형 제트 밀링, 유체층 제트 밀링, 나노입자를 형성시키기 위한 초임계 유체 가공, 고압 균질화 또는 스프레이 건조에 의해 달성될 수 있다.
흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한 캡슐, 블리스터(blister), 및 카트리지는 본 발명의 화합물, 적합한 분말 베이스 및 성능 개질제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화될 수 있다.
미세 미스트를 형성시키기 위해 전기유체역학(electrohydrodynamics)을 이용하는 분무기에서 사용하기 위한 적합한 용액 제형은 1회 구동(actuation) 당 적합한 용량의 본 발명의 항체를 함유할 수 있으며, 구동 부피는 예를 들어, 1 μl 내지 100 μl로 다양할 수 있다.
적합한 풍미제, 예를 들어, 멘톨 및 레보멘톨, 또는 감미제, 예를 들어, 사카린 또는 사카린 소듐이 흡입/비강내 투여를 위해 의도된 본 발명의 제형에 첨가될 수 있다.
흡입/비강내 투여를 위한 제형은 즉시 및/또는 변형된 방출이 되도록 제형화될 수 있다. 변형된 방출 제형은 지연된-, 지속된-, 펄스화된-, 조절된-, 표적화된 및 프로그래밍된 방출을 포함한다.
건조 분말 흡입제 및 에어로졸의 경우에, 투여 유닛은 계량된 양을 전달하는 밸브에 의해 결정된다. 본 발명에 따른 유닛은 통상적으로 계량된 용량 또는 "퍼프(puff)"의 본 발명의 항체를 투여하도록 배열된다. 전체 일일 용량은 통상적으로 단일 용량으로, 또는 보다 일반적으로 나누어진 용량으로서 종일 투여될 것이다.
본 발명의 항체 및 항체 부분은 또한 경구 경로 투여를 위해 제형화될 수 있다. 경구 투여는, 화합물이 위장관으로 진입하도록, 연하(swallowing)를 포함할 수 있고/거나, 협측, 설측 또는 설하 투여는 화합물이 입으로부터 혈류로 직접적으로 진입하게 한다.
경구 투여를 위해 적합한 제형은 고체, 반-고체, 및 액체 시스템, 예를 들어, 정제; 다중- 또는 나노-미립자, 액체 또는 분말을 함유한 연질 캡슐 또는 경질 캡슐; 로젠지(액체 충전을 포함함); 츄(chew); 겔; 속분산 투여 형태; 필름; 오불(ovule); 스프레이; 및 협측/점막접착 패치를 포함한다.
액체 제형은 현탁액, 용액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 이러한 제형은 (예를 들어, 젤라틴 또는 하이드록시프로필메틸셀룰로스로부터 제조된) 연질 캡슐 또는 경질 캡슐 중의 충전제로서 사용될 수 있고, 통상적으로, 담체, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 메틸셀룰로스, 또는 적합한 오일, 및 하나 이상의 에멀젼화제 및/또는 현탁제를 포함한다. 액체 제형은 또한, 예를 들어, 사세(sachet)로부터 고체의 재구성에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 항체 및 조성물의 치료 용도
일 양태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 및 이의 항원-결합 부분, 항-PD-1 조성물, 및 이중특이적 결합 분자는 면역 시스템의 향상 또는 활성화가 필요한 인간에서 면역 시스템을 향상시키거나 활성화시키기 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 환자는 PD-1의 과발현 또는 과활성을 특징으로 하는 질환을 갖는다. 일부 구체예에서, 환자는 면역-억제된 환자이다. 특정 구체예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 조성물, 또는 이중특이적 결합 분자 약학적 조성물은 암, 예를 들어, 피부, 폐, 장, 난소, 뇌, 전립선, 신장, 연조직, 조혈 시스템, 두경부, 간, 방광, 유방, 위, 자궁 및 췌장과 같은 조직에서 기원한 암, 및 PD-1 활성에 좌우되거나 환자가 PD-L1, PD-L2, 또는 둘 모두를 발현하거나 과발현하는 임의의 암 또는 다른 질환의 치료에 사용하기 위한 것이다. 본 발명의 항-PD-1 항체, 이의 항원-결합 부분, 항-PD-1 항체 조성물, 및/또는 이중특이적 결합 분자에 의해 치료되는 암은, 예를 들어, 흑색종(예를 들어, 진행 흑색종, 또는 절제불가능 또는 전이성 흑색종), 비소세포폐암, 방광암, 두경부 편평 세포 암종, 난소암, 직장결장암, 호지킨 림프종, 및 신세포 암종(RCC)을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항-PD-1 항체, 항원-결합 부분, 항-PD-1 조성물, 및/또는 이중특이적 결합 분자에 의해 치료되는 암은, 예를 들어, 흑색종(예를 들어, 진행 또는 전이성 흑색종), 비소세포폐암, 두경부 편평 세포 암, 신세포 암종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 교모세포종, 신경교종, 편평 세포 폐암, 소세포폐암, 간세포 암종, 방광암, 상부요로암, 식도암, 위식도 접합부 암, 위암, 간암, 결장암, 결장직장 암종, 다발성 골수종, 육종, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군, 비인두암, 만성 림프성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 소형 림프성 림프종, 난소암, 위장암, 원발성 복막암, 자궁관암, 요로상피암, HTLV-관련 T-세포 백혈병/림프종, 전립선암, 비뇨생식암, 수막종, 부신겉질암, 신경아교육종, 섬유육종, 신장암, 유방암, 췌장암, 자궁내막암, 피부 기저 세포암, 충수암, 담관암, 침샘암, 진행 메르켈 세포 암, 미만성 거대 B 세포 림프종, 소포 림프종, 중피종, 및 고형 종양을 포함할 수 있다.
"치료하다," "치료하는" 및 "치료"는 생물학적 장애 및/또는 이의 수반되는 증상들 중 적어도 하나를 완화시키거나 제거하는 방법을 지칭한다. 본원에서 사용되는 질병, 장애 또는 질환을 "완화시키는" 것은 질병, 장애 또는 질환의 증상의 중증도 및/또는 발생 횟수를 감소시키는 것을 의미한다. 또한, 본원에서 "치료"에 대한 언급은 치료, 완화 및 예방 치료에 대한 언급을 포함한다.
"치료적 유효량"은 치료되는 질환의 증상들 중 하나 이상을 어느 정도까지 완화시킬 투여되는 치료제의 양을 지칭한다. 항암 치료제의 치료적 유효량은 종양 수축, 생존 증가, 암 세포의 제거, 질병 진행 감소, 전이의 역전, 또는 건강관리 전문가가 원하는 다른 임상적 종말점을 발생시킬 수 있다.
본 발명의 항체 조성물 또는 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 약물 또는 항체와 조합하여(또는 이들의 임의의 조합물로서) 투여될 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 약학적 조성물, 방법 및 용도는 또한, 하기에 상세히 기술되는 바와 같이, 다른 활성제와의 조합(동시-투여)의 구체예를 포함한다.
하나 이상의 다른 치료제와 함께 본 발명의 항체 조성물 및 항체 및 이의 항원-결합 부분을 지칭하는 본원에서 사용되는 용어 "동시-투여", "동시-투여된" 및 "~와 조합하여"는 하기 기술된 것을 의미하는 것으로 의도되고, 이를 지칭하며 이를 포함한다:
- 성분들이 환자에게 실질적으로 동시에 상기 성분들을 방출시키는 단일 투여 형태로 함께 제형화될 때, 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 항체 조성물/항체/항원-결합 부분 및 치료제(들)의 조합물의 동시 투여,
- 성분들이 환자에 의해 실질적으로 동시에 취해지는 별도의 투여 형태로 서로 분리되게 제형화될 때, 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 항체 조성물/항체/항원-결합 부분 및 치료제(들)의 조합물의 실질적인 동시 투여, 여기서 상기 성분들은 상기 환자에게 실질적으로 동시에 방출됨,
- 성분들이 환자에 의해 각 투여 간에 상당한 시간 간격을 갖는 연속적 시간에 취해지는 별도의 투여 형태로 서로 분리되게 제형화될 때, 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 항체 조성물/항체/항원-결합 부분 및 치료제(들)의 조합물의 순차적인 투여, 여기서 상기 성분들은 상기 환자에게 실질적으로 상이한 시간에 방출됨; 및
- 성분이 조절된 방식으로 상기 성분들을 방출하는 단일 투여 형태로 함께 제형화될 때, 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 항체 조성물/항체/항원-결합 부분 및 치료제(들)의 조합물의 순차적인 투여, 여기서 이들은 상기 환자에게 동일한 시간에 및/또는 상이한 시간에 동시에, 순차적으로, 및/또는 중첩되게 방출되며,
여기서 각 부분은 동일한 경로 또는 상이한 경로에 의해 투여될 수 있음.
본 발명의 항체 조성물 및 항체 및 이의 항원-결합 부분은 추가적인 치료학적 치료 없이, 즉, 독립 치료법으로서 투여될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 항체 조성물 및 항체 및 이의 항원-결합 부분으로의 치료는 적어도 하나의 추가적인 치료학적 치료(병용 요법)를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 항체 조성물 또는 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 암 치료를 위한 다른 약물치료/약물과 동시-투여되거나 제형화될 수 있다. 추가적인 치료학적 치료는, 예를 들어, 화학요법제, 항신생물제, 또는 항혈관형성제, 상이한 항암 항체, 및/또는 방사선 요법을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 조성물, 항체 또는 항원-결합 부분을 암세포의 말기 분화를 유도하는 것으로 알려진 제제와 조합함으로써, 효과가 추가로 개선될 수 있다. 이러한 화합물은, 예를 들어, 레티노산, 트랜스-레티노산, 시스-레티노산, 페닐부티레이트, 신경 성장 인자, 디메틸 설폭사이드, 활성 형태의 비타민 D3, 퍼옥시좀 증식체-활성화된 수용체 감마, 12-O-테트라데카노일포르볼 13-아세테이트, 헥사메틸렌-비스-아세트아미드, 형질전환 성장 인자-베타, 부티르산, 환형 AMP 및 베스나리논으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 화합물은 레티노산, 페닐부티레이트, 모든-트랜스-레티노산, 및 활성 형태의 비타민 D로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 항-PD-1 항체 조성물 또는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분 및 적어도 하나의 다른 제제(예를 들어, 화학요법제, 항신생물제, 또는 항혈관형성제)를 포함하는 약학적 물품은 암 치료에서 동시, 분리된 또는 연속적인 투여를 위한 병용 치료로서 사용될 수 있다. 다른 제제는 고려되는 특정 암의 치료를 위해 적합한 임의의 제제, 예를 들어, 알킬화제, 예를 들어, 백금 유도체, 예를 들어, 시스플라틴, 카르보플라틴 및/또는 옥살리플라틴; 식물 알칼로이드, 예를 들어, 파클리탁셀, 도세탁셀, 및/또는 이리노테칸; 항종양 항생제, 예를 들어, 독소루비신(아드리아마이신), 다우노루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미톡산트론, 닥티노마이신, 블레오마이신, 악티노마이신, 루테오마이신, 및/또는 미토마이신; 토포아이소머라제 억제제, 예를 들어, 토포테칸; 및/또는 항대사산물, 예를 들어, 플루오로우라실 및/또는 다른 플루오로피리미딘으로 구성된 군으로부터 선택된 제제일 수 있다.
본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분 또는 항-PD-1 항체 조성물은 또한 백신, 사이토카인, 효소 억제제 및 T 세포 치료제와 같은 다른 항암 치료제와 함께 이용될 수 있다. 백신의 경우, 이것은, 예를 들어, 치료되는 암과 관련된 하나 이상의 항원을 함유하는 단백질, 펩티드 또는 DNA 백신, 또는 항원과 함께 수지상 세포를 포함하는 백신일 수 있다. 적합한 사이토카인은, 예를 들어, IL-2, IFN-감마 및 GM-CSF를 포함한다. 항암 활성을 갖는 효소 억제제 유형의 예는 인돌아민-2,3-디옥시게나제(IDO) 억제제, 예를 들어 1-메틸-D-트립토판(1-D-MT)이다. 입양 T 세포 요법은 종양을 인지하고 공격하기 위해 환자 자신의 T 세포를 확장하거나 공학처리하는 것을 포함하는 다양한 면역요법 기술을 지칭한다.
또한 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분 또는 항-PD-1 항체 조성물은 티로신 키나제 억제제와 함께 보조 치료법에 이용될 수 있는 것으로 고려된다. 이들은 수용체의 세포내 티로신 키나제 도메인과 상호작용하여 세포내 Mg-ATP 결합 부위에 대해 경쟁함으로써 리간드-유도 수용체 인산화를 억제하는 주로 퀴나졸린-유래된 합성 저분자량 분자이다.
일부 구체예에서, 항체 조성물 또는 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 면역 시스템 활성화를 매개하는 또 다른 약물치료/약물과 함께 이용될 수 있고, 이는 A2AR, BLTA, B7-H3, B7-H4, CTLA-4, CD27, CD28, CD40, CD55, CD73, CD122, CD137, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, CTLA-3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1 및/또는 CEACAM-5), GAL9, GITR, HVEM, ICOS, IDO, KIR, LAIR1, LAG-3, OX40, TIGIT, TIM-3, TGFR-베타, VISTA 및/또는 2B4의 발현 또는 활성을 매개하는 제제를 비제한적으로 포함한다. 특정 구체예에서, 제제는 상기 분자 중 하나에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 특정 구체예에서, 본 발명의 항체 조성물 또는 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 CTLA-4 억제제(예를 들어, 항-CTLA-4 항체, 예를 들어, 트레멜리무맙(tremelimumab) 또는 이필리무맙(ipilimumab))와 함께 투여될 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명의 항체 조성물 또는 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 이필리무맙과 함께 투여될 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명의 항체 및 항원-결합 부분은 PD-1 또는 이의 리간드 중 하나 이상을 표적화할 수 있는 PD-1 경로의 또 다른 억제제와 함께 투여될 수 있다. 그러한 억제제의 예는 다른 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 및 항-PD-L2 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항체 조성물, 항체, 및/또는 이의 항원-결합 부분은 펩브롤리주맙 및/또는 니볼루맙과 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 항체 조성물 및 항체 및 이의 항원-결합 부분은 본원에 설명된 바와 같은 치료 방법에서 사용될 수 있고/거나, 본원에 설명된 바와 같은 요법에 사용하기 위한 것일 수 있고/거나, 본원에 설명된 바와 같이 치료를 위한 약제의 제조에서 사용될 수 있는 것으로 이해된다.
투여 용량 및 경로
본 발명의 항체 조성물은 고려되는 질환의 치료를 위한 유효량으로, 즉, 요망되는 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량으로 그러한 시간 동안 투여될 것이다. 치료적 유효량은 치료될 특정 질환, 환자의 연량, 성별 및 체중, 및 항체가 독립 치료로서 또는 하나 이상의 추가적인 항암 치료제와 함께 투여되는 지의 여부와 같은 인자에 따라 달라질 수 있다.
투여 요법은 최적의 요망되는 반응을 제공하기 위해 조절될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 수 개의 나누어진 용량이 시간에 따라 투여될 수 있거나, 용량이 치료 상황의 긴급 사태(exigency)에 의해 지시된 바와 같이 비례적으로 감소되거나 증가될 수 있다. 투여 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태의 비경구 조성물을 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용되는 투여 단위 형태는 환자/치료될 피검체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하는데, 각 단위는 요구되는 약학적 담체와 함께 요망되는 치료 효과를 생성하기 위해 계산된 활성 화합물의 사전결정된 양을 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 사양은 일반적으로 (a) 화학요법제의 독특한 특징 및 달성될 특정 치료 또는 예방 효과, 및 (b) 개체에서 민감성의 치료를 위해 이러한 활성 화합물을 배합하는 분야에서의 고유의 한계에 의해 지시되고 이에 직접적으로 따른다.
이에 따라, 당업자는 본원에 제공된 설명을 기초로 하여, 용량 및 투여 요법이 치료 분야에서 널리 공지된 방법에 따라 조절된다는 것을 인식할 것이다. 즉, 최대 내약 용량이 용이하게 규명될 수 있으며, 환자에 대한 검출 가능한 치료 이득을 제공하는 유효량이 또한, 환자에 대한 검출 가능한 치료 이득을 제공하기 위해 각 제제를 투여하기 위한 일시적 요건일 수 있으므로, 결정될 수 있다. 이에 따라, 특정 용량 및 투여 요법이 본원에 예시되어 있지만, 이러한 예는 어떠한 방식으로도 본 발명을 실행함에 있어서 환자에게 제공될 수 있는 용량 및 투여 요법을 한정하지 않는다.
투여량 값이 개선될 질환의 유형 및 중증도에 따라 달라질 수 있고, 단일 용량 또는 다중 용량을 포함할 수 있다는 것이 주목되어야 한다. 임의의 특정 피검체에 대하여, 특정 투여 요법이 조성물을 투여하거나 조성물의 투여를 감독하는 사람의 전문적인 판단 및 개개 필요에 따라 시간에 따라 조절될 것이며, 본원에 기술된 투여량 범위는 단지 예시적인 것이고 구현된 조성물의 범위 또는 실시를 제한하지 않도록 의도된다는 것이 추가로 이해된다. 또한, 본 발명의 조성물로의 투여 요법은 질병의 유형, 연령, 체중, 성별, 환자의 의학적 상태, 질환의 중중도, 투여 경로, 및 사용되는 특정 항체를 포함하는 다양한 인자를 기초로 할 수 있다. 이에 따라, 투여 요법은 광범위하게 달라질 수 있지만, 관례대로 표준 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 용량은 약동력학 또는 약물역학적 파라미터를 기초로 하여 조절될 수 있으며, 이는 임상 효과, 예를 들어, 독성 효과 및/또는 실험실 수치를 포함할 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 당업자에 의해 결정되는 바와 같은 환자내 용량-상승을 포함한다. 적절한 투여량 및 요법을 결정하는 것은 관련 분야에서 널리 공지되어 있고, 본원에 기술된 교시를 제공한 후에 당업자에 의해 포함될 것으로 이해될 것이다.
본 발명의 항체 조성물의 적합한 용량은 0.1 내지 100 mg/kg, 예를 들어, 약 0.5 내지 50 mg/kg, 예를 들어, 약 1 내지 20 mg/kg 범위일 것으로 고려된다. 항체 조성물은, 예를 들어, 적어도 0.25 mg/kg, 예를 들어, 적어도 0.5 mg/kg, 예를 들어, 적어도 1 mg/kg, 예를 들어, 적어도 1.5 mg/kg, 예를 들어, 적어도 2 mg/kg, 예를 들어, 적어도 3 mg/kg, 예를 들어, 적어도 4 mg/kg, 예를 들어, 적어도 5 mg/kg; 및 예를 들어, 최대 50 mg/kg, 예를 들어, 최대 30 mg/kg, 예를 들어, 최대 20 mg/kg, 예를 들어, 최대 15 mg/kg의 투여량으로 투여될 수 있다. 투여는 대개 적합한 간격으로, 예를 들어, 주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 또는 4주마다 1회, 그리고 필요한 경우에 투여량을 임의적으로 증가시키거나 감소시킬 수 있는 주치의에 의해 적절한 것으로 여겨지는 동안 반복될 것이다.
종양 치료법을 위한 유효량은 환자에서 질병 진행을 안정화시키고/거나 증상을 개선시키는 이의 능력, 및 바람직하게, 질병 진행을 역전시키는 능력에 의해, 예를 들어, 종양 크기가 감소하는 것에 의해 측정될 수 있다. 암을 억제하기 위한 본 발명의 항체 또는 조성물의 능력은 예를 들어, 실시예에 기술된 바와 같은 시험관내 검정 뿐만 아니라, 인간 종양에서의 효능을 예측하는 적합한 동물 모델에 의해 평가될 수 있다. 적합한 투여 요법은 각 특정 상황, 예를 들어, 단일 볼루스로서 또는 연속 주입으로서, 및 각 경우의 경험에 의해 지시되는 바와 같은 투여량의 가능한 조절로 투여되는 상황에서 최적의 치료 반응을 제공하기 위해 선택될 것이다.
진단 용도 및 조성물
본 발명의 항체는 또한 진단 과정(예를 들어, 시험관내, 생체외)에서 유용하다. 예를 들어, 항체는 환자로부터의 샘플(예를 들어, 조직 샘플, 또는 체액 샘플, 예를 들어, 염증 삼출물, 혈액, 혈청, 장액, 타액, 또는 소변)에서 PD-1의 수준을 검출하고/거나 측정하기 위해 사용될 수 있다. 적합한 검출 및 측정 방법은 면역학적 방법, 예를 들어, 유세포분석, 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA), 화학적발광 검정, 방사면역검정, 및 면역조직학을 포함한다. 본 발명은 본원에 기술된 항체를 포함하는 키트(예를 들어, 진단 키트)를 추가로 포함한다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용되는 과학용어 및 기술용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 예시적인 방법 및 물질이 하기에 기술되어 있으며, 본 발명의 실시 또는 시험에서 본원에 기술된 것과 유사하거나 균등한 방법 및 물질들이 또한 사용될 수 있다. 상충하는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다.
일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학, 분석 화학, 합성 유기 화학, 의약 및 약학 화학, 및 단백질 및 핵산 화학 및 하이브리드화의 기술 및 이와 관련하여 사용된 명명법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고 통상적으로 사용된다. 효소적 반응 및 정제 기술은 당해 분야에서 통상적으로 달성되거나 본원에 기술된 바와 같이, 제조업체의 사양에 따라 수행된다.
또한, 문맥에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. 본 명세서 및 구체예 전반에 걸쳐, 단어 "가지다" 및 "포함하다", 또는 변형예, 예를 들어, "갖다", "갖는", "포함" 또는 "포함하는"은 언급된 정수 또는 정수들의 그룹을 포함하지만, 임의의 다른 정수 또는 정수들의 그룹을 배제하지 않는 것을 내포하는 것으로 이해될 것이다.
본원에 언급된 모든 간행물 및 다른 참고문헌은 전문이 참조로서 포함된다. 다수의 문헌들이 본원에 인용되어 있지만, 이러한 인용은 임의의 이러한 문서들이 당해 분야의 공통의 일반적인 지식의 일부를 형성한다는 것을 인정하는 것은 아니다.
본 발명이 보다 잘 이해될 수 있도록, 하기 실시예가 기술된다. 이러한 실시예는 단지 예시를 목적으로 하는 것이며, 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되어선 안된다.
실시예
실시예 1: 닭 B 세포로부터 항-PD-1 항체의 클로닝
항체-분비 B 세포(ASC)로부터 닭-유래된 항체 유전자의 클로닝은 Symplex™ 항체 발견 기술에 의해 수행되었다. 간단히 말해, ASC는 PD-1 항원으로 면역화된 닭의 림프 기관으로부터 가용성 단백질 항원으로서 및/또는 진핵생물 세포 상에 나타난 이의 천연 세포 막-결합된 형태로 단리되었다. 형광 표지된 항체로 ASC를 염색하는 것은 PCR 관으로 분류되기 전에 ASC가 다른 세포(예를 들어 들어, T 세포, 나이브 B 세포, 단핵구 등)로부터 구별되게 하였다. 단일 ASC 분류는 유세포분석에 의해 수행되었다. 후속하여, Symplex™ 절차를 수행하여 이후에 기술되는 바와 같이 각각의 분류된 B 세포에 대한 동족체 VH 및 VL 쌍을 함유하는 PCR 생성물을 생성하였다.
VH 및 VL 코딩 서열의 연결은 분류된 ASC 상에서 수행되어, 서열의 동족체 페어링을 용이하게 하였다. 이 과정은 1-?챨? 멀티플렉스 중첩-연장 RT-PCR 이후에 네스티드(nested) PCR에 기반한 2-단계 PCR 절차를 활용하였다. Symplex™ 기술을 이용한 동족체 VH 및 VL 서열의 연결 원리는 WO 2005/042774호; WO 2008/104184호; WO 2010/022738호, 및 문헌[Meijer et al., J Mol Biol 358(3):764-72 (2006)]에 상세하게 기재되어 있다. 간단히 말해, 동족체 VH 및 VL 증폭된 단편은 소위 네스티드 PCR 단계에서 중첩-연장 PCR에 의해 결합된다. 후속 공정에서, 플라스미드 벡터 내로 클로닝하기 전에 PCR 생성물을 풀링시킨다. 이것은 닭 항체의 가변 도메인을 인코딩하는 클로닝된 DNA 단편이 트랜스펙션된 포유동물 세포에서 단일 플라스미드 발현 작제물로부터 완전한 키메라 항체로 발현될 수 있는 방식으로 수행된다. 결과적으로, PD-1 항원에 대한 특이적 결합을 나타내는 키메라 항체에 대한 세포 상청액을 스크리닝할 수 있다.
재료 및 방법
상기 열거된 간행물에 설명된 Symplex™ 기술은 분류된 닭 B-세포에서 VL 및 VH를 증폭시키도록 변형되었다. 기능적 발현 작제물의 클로닝은 하기 기술된 바와 같이 2단계로 수행되었다.
단계 1. 쌍을 이룬 VH 및 VL 단편을 함유하는 증폭된 PCR 생성물을 네스티드 PCR 반응으로 증폭시켰다. 이것은 각 말단에서 ApaI 및 AvrII에 대한 측접 제한 효소 인지 부위의 추가를 허용하였다. 동족체 VH 및 VL 서열이 각각의 분류된 ASC로부터의 단일 PCR 생성물에서 쌍을 이루었으므로, PCR 생성물의 클로닝은 모든 PCR 단편을 풀링시킨 후에 수행되었다. 상응하는 제한 부위 ApaI 및 AvrII의 분해에 의해 Symplex™ PCR 생성물을 수용하도록 플라스미드 pML392를 작제하였다. 결과로서 풀링된 PCR 생성물 및 pML392의 라이게이션이 도 1에 도시되어 있다. 본원에서 PCR 생성물의 삽입은 인간 CH1-CH2-CH3 및 람다 불변 cDNA 영역 앞에 VH 및 VL 서열을 각각 배치하여, 전장 중쇄 및 경쇄 해독틀이 수득되었다.
단계 2. 초기 작제물에서, 중쇄 및 경쇄 서열을 인코딩하는 2개의 해독틀은 헤드-투-헤드(head-to-head)로 배치되었고 AscI 및 NheI에 대한 제한 효소 인지 부위를 함유한 DNA 서열에 의해 분리되었다. 5'-UTR 및 중쇄와 경쇄 유전자의 2개의 5'-말단들 사이에 신호 펩티드를 포함하는 상응하는 AscI/NheI-분해된 이중 CMV 프로모터 DNA 단편의 삽입에 의해, 도 2에 묘사된 완전한 발현 작제물이 수득되었다.
실시예 2: 항-PD-1 참조 항체 유사체의 클로닝
본 실시예는 항-PD-1 항체 니볼루맙 및 펨브롤리주맙의 기준 유사체가 어떻게 생성되었는 지를 간단하게 설명한다.
니볼루맙 및 펨브롤리주맙의 항체 유사체의 가변 중쇄 및 경쇄 도메인을 인코딩하는 아미노산 서열은 IMGT® 웹사이트 imgt.org/mAb-DB/로부터 입수하였다; 하기 표 3 참조. 단백질 서열은 인간 코돈 사용법에 따라 DNA 서열로 역 번역되었다. 이후 상응하는 DNA 서열을 유전자 합성하고 불변 인간 IgG4 중쇄 또는 카파 경쇄 도메인을 함유하는 발현 벡터로 클로닝하여, 전장 항체를 발현시켰다. Fab 아암 교환을 방지하기 위해, 위치 228의 세린 잔기는 프롤린으로 치환되었다(Angal et al., Mol. Immunol. 30:105-108 (1993)). CHO 세포를 표준 단백질 발현 시스템을 사용하여 상응하는 발현 플라스미드로 트랜스펙션시켰다. 상응하는 항체 상청액을 표준 단백질 A 정제 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
표 3 유전자-합성된 항체 유사체
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실시예 3: 세포 표면-발현된 PD-1과의 결합에 대해 항체 레퍼토리의 스크리닝
항-PD-1 레퍼토리의 클로닝된 항체를 개별적으로 트랜스펙션시키고 384-웰 포맷에서 293fectin™ Transfection 시약(Invitrogen, Cat. No. 12347-019)을 이용하여 HEK293 세포에서 발현시키고, 항체-함유 상청액을 트랜스펙션 6일 후에 수집하였다.
세포-기반 항체 스크리닝을 위해, CHO-S 세포를 FreeStyle™ MAX 시약(Invitrogen, Cat. No. 16447-100)을 이용하여 384-웰 포맷에서 트랜스펙션시켜 전장 인간 PD-1을 발현시키고, 트랜스펙션되지 않은 세포를 음성 대조군으로서 이용하였다. 멀티플렉싱 스크리닝 설정을 허용하기 위해, 트랜스펙션되지 않은 세포를 CFSE를 사용하여 표지하고, 표지되지 않은 PD-1-트랜스펙션된 세포와 1:1의 비율 및 1 ml 당 1E6 세포의 밀도로 각각 혼합시켰다. 384-웰 플레이트에서, 40 μl의 상기 세포 믹스를 10 μl의 항체-함유 상청액과 혼합시키고, 세포-기반 항체를 비-세척 환경에서 염소 항-인간 IgG (H+L) AF647 이차 항체(Molecular Probes, Cat. No. A21445)의 첨가에 의해 확인하였다. 고효율 유세포분석(iQue® Screener, Intellicyt)을 이용하여 샘플을 획득하고, ForeCyt® 소프트웨어를 이용하여 CFSE 대 인간 IgG 결합(AF647)을 플롯팅함에 의해 데이터를 분석하였다. PD-1-특이적 일차 히트를 인간 PD-1-트랜스펙션된 세포(CSFE 음성)에만 결합하고 대조군 세포(CFSE 양성)에는 결합하지 않는 항체 클론으로서 확인하고, 플레이트 번호 및 플레이트 좌표를 히트 피킹(hit picking) 및 후속 서열 분석을 위해 수집하였다.
도 3a-3c는 (A) 인간 PD-1-트랜스펙션된 세포에 특이적으로 결합하는 항체 클론, (B) CHO-S 세포에 비특이적으로 결합하는 클론, 및 (C) 스크리닝에 이용된 세포 집단 중 어느 것과도 결합하지 않는 클론에 대한 대표적인 유세포분석 도트 플롯을 도시한다.
실시예 4: 항-PD-1 항체의 인간화
부모 닭 항체의 특이성 및 친화도를 실질적으로 유지하면서, 인간에게 투여될 때 최소 면역원성을 갖는 항체 분자를 생산하기 위해 닭 항-PD-1 항체의 프레임워크 영역의 인간화를 수행하였다.
재료 및 방법
본래 문헌[Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]에서 기술된 방법인 "CDR 그라프팅" 접근법을 이용하여 닭-유래된 항체의 인간화를 수행하였다. 먼저, 항체의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 인간 IgG 데이터베이스에 대해 블라스팅하여 가장 가까운 인간 생식 계열 유전자를 찾아 내었다. 이에 의해 인간 IGHV3-23*01(M99660) 및 IGLV3-19*01(X56178) 유전자가 닭 VH 및 VL 유전자에 각각 가장 가까운 것으로 확인되었다. 유사하게, J-유전자 영역 인간화를 위해 선택된 인간 아미노산 서열은 VH 및 VL에 대해 각각 IGHJ1*01(J00256) 및 IGLJ6*01(M18338)로부터 유래되었다. 또한, 항체 VH 및 VL 유전자는 항체 기능 및/또는 구조에서 역할을 수행할 수 있는 프레임워크 영역의 체세포 돌연변이를 확인하기 위해 닭 면역글로불린 생식 계열 유전자에 대해 정렬되었다. 그러한 잔기는 소위 "역 돌연변이" 잔기로 최종 인간화된 항체 유전자에 포함될 수 있다. 마지막으로, 항체 구조, 안정성 및 기능에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 소위 "Vernier 잔기"(Foote and Winter, J Mol Biol. 224(2):487-99 (1992))라고 하는 일부 아미노산 위치는 상응하는 생식 계열로부터 인간 또는 닭 잔기를 포함하는 대안적인 인간화된 항체 변이체를 생성하는 것으로 고려되었다.
본원의 CDR 서열은 CDR1 및 CDR2에 대한 IMGT® 정의에 따라 결정되었다. 중쇄 및 경쇄 CDR3의 경우, 본원의 정의는 IMGT-CDR3의 업스트림에 한 여분의 아미노산 잔기(Cys) 및 다운스트림에 한 여분의 아미노산 잔기(VH CDR3의 경우 Trp, VL CDR3의 경우 Phe)를 포함한다.
닭 CDR 및 인간 프레임워크 영역의 어셈블리는 중첩 연장 PCR에 의해 수행되었다. 생성된 인간화된 VH 및 VL PCR 생성물은 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 갖는 발현 벡터(플라스미드)로 클로닝되었다. 람다 사슬의 업스트림에서 신호 펩티드의 정확한 절단을 증가시키기 위해, 람다 유전자 IGLV3.19의 제2 아미노산(Ser)을 다른 인간 생식 계열, 예를 들어 IGLV3.25에 존재하는 또 다른 아미노산(Tyr)으로 대체하였다. 중쇄 서열은 IgG1 항체의 Fc 영역의 이펙터 기능을 감소시키는 것으로 공지된 2개의 "LALA" 돌연변이(L234A/L235A)를 함유한다(Armour et al., Eur J Immunol. 29(8):2613-24 (1999); and Armour et al., Mol Immunol. 40(9):585-93 (2003)). 발현 벡터는 또한 필수 조절 서열을 함유하여, 포유동물 세포의 트랜스펙션 후 전장 항체로 어셈블링되는 경쇄 및 중쇄의 동시 발현을 허용하였다.
결과
최종 인간화된 항체 서열은 하기 표 4에 제시되어 있고, CDR 서열은 따로 표 5에 제시되어 있다. CDR 서열은 표에서 IMGT® 넘버링 체계에 따라 정의된다.
표 4 인간화된 항-PD-1 항체의 V H 및 V L 서열*
Figure pct00004
Figure pct00005
표 5 인간화된 항-PD-1 항체의 H- 및 L-CDR 서열
Figure pct00006
Figure pct00007
모든 인간화된 항체는 하기 제시된 IgG1 "LALA" 변이체의 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함하였다.
중쇄 불변 영역 (SEQ ID NO: 67):
Figure pct00008
경쇄 불변 영역 (SEQ ID NO: 68):
Figure pct00009
실시예 5: 항-PD-1 항체 후보의 스크리닝
PD-1은 활성화된 T-림프구의 표면에서 주로 발현되며, 이는 T-세포 활성을 음성적으로 조절한다. 가장 기능적인 항-PD-1 항체 후보를 선택하기 위해, 스타필로코쿠스 엔테로톡신 B(SEB) 전혈 검정 및 일원 혼합 림프구 반응 검정의 두 가지 상이한 시험관내 스크리닝 시스템이 확립되었다.
재료 및 방법
즉, 실시예 4에 기술된 "LALA" 돌연변이를 갖고, 전술한 바와 같이 클로닝 및 인간화된 IgG1-LALA 스캐폴드 포맷의 69개의 독특한 인간화된 mAb의 레퍼토리를 초기에 SEB 전혈 검정에서 기능적 활성에 대해 스크리닝하였다. SEB는 MHC 클래스 II 분자 및 T 세포 수용체(TCR)의 특이적 Vβ 영역에 결합하여 T-세포의 비특이적 자극을 유도하는 슈퍼-항원이다. 이것은 폴리클로날 T 세포 활성화/증식 및 IL-2 및 IFN-γ를 포함하는 사이토카인의 방출을 발생시킨다.
항-PD-1 활성의 스크리닝에 대한 SEB 검정의 타당성을 조사하기 위해, SEB 자극 전후에 상이한 도너에 대해 PD-1의 발현 수준을 조사하였다. 6개의 다른 도너로부터의 PBMC를 SEB 자극 0일 및 3일 후에 유세포분석에 의해 PD-1 발현에 대해 시험하였다. 관련 림프구 게이트를 추가 분석을 위해 설정하였다.
SEB 전혈 검정에서의 스크리닝에 기반하여, 적어도 3개의 다른 도너로부터의 혈액을 이용하여, 상위 10개의 항-PD-1 항체 선도 후보를 확인하였다. 이후 항-PD-1 항체 선도 후보를 추가로 적정하여 양성 대조군인 항-PD-1 항체 펨브롤리주맙(Merck) 및 니볼루맙(Bristol-Myers Squibb)의 기준 유사체와 비교하여 각각의 개별 항체에 대한 용량-반응 곡선을 수득하였다; 실시예 2 참조.
선택된 상위 10개 항-PD-1 항체의 기능성을 대안적인 시험관내 검정인 일원 혼합 림프구 반응(MLR) 검정에서 입증하였다. 이 검정에서, 한 도너로부터의 수지상 세포(DC)를 또 다른 도너로부터의 CD4+ T-세포와 공동-배양하여 모든 T-세포의 10-15%에서 유도되는 동종항원 특이적 자극을 수득함으로써, T-세포 활성화/증식 및 사이토카인 분비를 유도하였다.
후보 중 하나(12748.15381)에 대한 단백질 안정성 문제로 인해, 이 특정 항체에 대해서는 대안적인 생식 계열 서열이 사용되었다. 결과로 나온 항체 중 하나 인 12748.16124가 하기에 언급된다. 이 변이체는 12748.15381과 상이한 VL 서열을 가지나, 동일한 VH 서열을 갖는다(상기 표 1).
결과
도 4의 데이터는 SEB 자극 후 모든 시험된 도너에서 PD-1을 발현하는 림프구의 빈도가 증가함을 명확하게 보여준다. 이러한 관찰은 항-PD-1 항체 스크리닝에 대한 이 검정의 타당성을 확인시켜 준다.
도 5a-i에 제시된 SEB 검정에서 가장 기능적인 항-PD-1 항체의 적정은 양성 대조군 항체 유사체 펨브롤리주맙 및 니볼루맙과 유사하거나 더 우수한 기능을 지닌 항-PD-1 선도 후보를 확인하였다. 이 검정에서, 표시된 항체의 존재 하에 전혈을 SEB로 48시간 동안 자극하고, 48시간 후에 IL-2 분비를 ELISA에 의해 측정하였다. 각 데이터 포인트는 6회 중복의 평균을 나타내고, 바는 SEM을 나타낸다.
도 5a-h는 인간화된 항-PD-1 항체로 수득된 결과를 보여준다. 항체 중 하나[12748.15381]에 대한 5% 이상의 응집 때문에, 이 항체에 대해서는 대안적인 프레임워크가 시험되었다. 도 5i의 데이터는 원래의 인간화된 항체[12748.15381] 및 이의 생식 계열(프레임워크) 변이체[12748.16124]의 유사한 기능을 보여준다.
항-PD-1 항체의 기능은 일원 MLR 검정으로 입증되었다. 이 검정에서, 2개의 상이한 도너로부터의 수지상 세포 및 CD4+ T 세포(비 1:10)를 공동-배양하고, 5일 후에 MesoScale에 의해 IFN-γ 분비를 측정하였다. 각 데이터 포인트는 6회 중복의 평균을 나타내고, 바는 SEM을 나타낸다. 일원 MLR 검정으로부터 수득되고 도 6a-h에 예시된 데이터는 SEB 검정으로부터 수득된 데이터와 동일한 항-PD-1 항체의 기능 및 순위를 보여준다. 상이한 검정 사이의 데이터의 일관성은 선택된 항체가 기능적이라는 추가 확인을 제공한다.
선택된 항체는 2개의 상이한 주요 에피토프 빈에서 비롯된 것으로, 이들이 2개의 상이한 비-중첩 에피토프에 결합하는 것을 나타낸다. 빈 2에 속하는 12760 및 13112 항체를 제외하고, 표시된 모든 항-PD-1 항체는 빈 1에 속한다. 빈 1로부터의 항-PD-1 항체는 이러한 시험관내 검정에서 가장 높은 기능성을 나타내는 것으로 확인되었다.
실시예 6: PD-L1 리간드 차단 활성에 대한 항-PD-1 항체의 유세포분석법
본 실시예는 세포 표면-발현된 PD-1 및 형광색소-표지된 가용성 PD-L1을 사용한 유세포분석 경쟁 검정을 수행함에 의해 항-PD-1 항체의 패널이 PD-L1 리간드 차단 활성에 대해 어떻게 시험되는 지를 예시한다.
재료 및 방법
PD-L1 리간드 차단 활성을 멀티플렉스 세포 검정으로 조사하였고, 여기서 인간 및 시노몰구스 PD-1은 CHO-S 세포에서 재조합적으로 발현되었고, R-PE(R-피코에리트린) 표지된 인간 PD-L1-Fc 키메라 단백질의 결합은 유세포분석에 의해 분석되었다. 상업적으로 이용 가능한 재조합 PD-L1-Fc 키메라 단백질(R&D Systems, USA)을 Lightning-Link® R-피코에리트린 컨쥬게이션 키트(Innova Biosciences, UK)를 이용하여 R-PE에 컨쥬게이션시켰다. 인간 PD-1을 발현하도록 일시적을 트랜스펙션된 CHO-S 세포를 시노몰구스 PD-1을 일시적으로 발현시키는 CFSE-염색된 CHO-S 세포와 혼합시켰다. 이후 이 세포 혼합물을 20 μg/ml의 50 μl 항-PD-1 항체와 얼음 위에서 인큐베이션시킨 다음, 약 3.4 μg/ml(16.4 nM 최종 농도)의 50 μl R-PE-표지된 PD-L1-Fc를 첨가하고 추가 20분 더 인큐베이션시켰다(최종 항-PD-1 항체 농도: 10 μg/ml). 결합된 항체를 APC(알로피코시아닌) 컨쥬게이션된 항-인간 IgG 경쇄 항체를 이용하여 검출하였다. PD-L1과 항-PD-1 항체의 결합을 각각 R-PE 및 APC 형광을 검출하는 유세포분석에 의해 정량하였다.
결과
경쟁 실험의 결과를 도 7a-b에 제시하고 하기 표 6에 요약한다. 모든 항-PD-1 항체는 10 μg/ml의 최종 항체 농도로 시험되었다(상기 참조). 시험된 항체 중 3개는, 펨브롤리주맙과 동일하고 양성 대조군으로서 포함된 항-PD-1 참조 항체 람브롤리주맙(Merck)과 유사하게, PD-L1 결합을 83% 이상 억제할 수 있었다. 한 항체(12777.13362)만이 결합을 69%만큼 부분적으로 억제하였다. 한 항체(13112.13208)는 PD-1 결합을 차단하지 않았다. 음성 대조군 항-VEGFR2 항체 람무시루맙(Genentech)의 존재 하에 PD-1-발현 세포에 대한 PD-L1의 결합은 0%로 설정되었다.
표 6 항-PD-1 항체의 존재 하에 PD-L1 결합 억제
Figure pct00010
표 6에 제시된 인간화된 변이체는, 표 1의 변이체가 경쇄의 N-말단에 아미노산 잔기 "SY"를 갖는 것을 제외하고는, 이들의 명칭에서 처음 5 자리를 공유하는 표 1의 것들과 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, SY 디펩티드는 항체 경쇄의 발현 동안 신호 펩티드 과정을 개선시킨다. 표 1 및 표 6의 변이체는 동일한 기능적 특성을 가질 것으로 예상된다.
실시예 7: 인간 및 시노몰구스 PD-1 ECD 항원에 대한 PD-1 항체 친화도의 측정
본 실시예는 대부분의 항-PD-1 항체가 인간 및 시노몰구스 PD-1 세포외 도메인(ECD) 둘 모두에 대해 높은 피코몰(pM) 친화도 및 우수한 교차 반응성을 나타냄을 입증한다.
재료 및 방법
정제된 항-PD-1 항체 레퍼토리의 동력학 결합 분석을 XPR-36 표면 플라스몬 공명(SPR) 바이오센서(Bio-Rad, USA) 상에서 수행하였다. His-태깅된 인간 또는 시노몰구스 PD-1 ECD 항원을 Acro Biosystems(UK)로부터 구입하였다. 결합 동력학은 종래 기재된 대로 일가 항원 조건 하에 항-PD-1 항체를 고정시키고, 일가 PD-1 항원을 용해된 상태로 유지함에 의해 측정되었다(Canziani et al., Anal Biochem 325(2):301-307 (2004)). 가능한 가장 낮은 항-PD-1 항체 밀도를 적용시켜 비특이적 결합 및 대량 수송 제한을 방지하였다. 항체 동력학을 측정하기 위해, 항-PD-1 항체는 1.0 μg/ml의 농도로 조정되었고, 약 1000 RU의 모노클로날 항-인간 Fc 항체(Biacore, Denmark)를 고정시킴에 의해 생성된 항-인간 IgG Fc 표면 위에 포집되었다. 항-PD-1 항체는 25 nM 내지 0.31 nM인 3배 농도 범위의 인간 또는 시노몰구스 PD-1 ECD에 결합시킨 다음 3 M MgCl2 재생 완충제(Biacore, Denmark)로 표면을 재생시킴에 의해 시험되었다. 20 μl/min의 높은 유량, 3.33분의 회합 시간 및 1.5시간 내지 2.75시간의 해리 시간이 사용되었다. 기록된 결합 반응은 이중 참조(double referencing)를 이용하여 온-레이트(on-rate)(kon 또는 ka), 오프-레이트(off-rate)(koff 또는 kd) 및 친화도(KD) 상수를 계산하기 위해 단순 Langmuir 1:1 결합 모델에 핏팅되었다.
결과
결합 동력학은 하기 표 7에서 표로 요약되며, 이는 항-PD-1 항체의 패널이 pM 범위의 매우 높은 친화도로 PD-1에 결합함을 예시한다. 모든 항체는 니볼루맙 및 펨브롤리주맙 유사체보다 높은 친화도로 인간 PD-1을 인지하였다. 가장 높은 친화도 항체[12819.15384]는 20 pM의 KD로 인간 PD-1에 결합한다.
표 7 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 측정된 인간 또는 시노몰구스 PD-1 ECD에 대한 항-PD-1 항체의 결합 동력학
Figure pct00011
실시예 8: 항-PD-1 항체의 에피토프 비닝
본 실시예는 PD-1 항체가 쌍을 이룬 경쟁 패턴에 기반하여 에피토프 빈으로 그룹화되는 방식을 예시한다. 상이한 에피토프 빈에 속하는 항체는 PD-1 ECD 상의 상이한 에피토프를 인지한다.
방법
IBIS MX96 SPR 기계(IBIS Technologies, The Netherlands)와 결합된 연속 흐름 미세스포터(CFM)(Wasatch Microfluidics, US)를 사용하여 쌍을 이룬 항체 경쟁에 대한 조사를 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석에 의해 수행하였다. 표면 플라스몬 공명 영상 분석을 E2S SensEye® SPR 센서(Ssens BV, The Netherlands) 상에서 수행하였다. 총 10개의 항-PD-1 항체(인간, IgG1)를 50 mM 소듐 아세테이트 완충제(pH 4.5)에서 10 μg/ml로 희석시켰다. 항체를 E2S SensEye® 상에 스폿팅하고, 연속 흐름 미세스포터를 이용하여 15분 동안 컨쥬게이션시켰다. 스폿팅 후, SensEye®를 IBIS MX96 바이오센서에 배치하고, 1 M 에탄올아민(pH 8.5)으로 10분 동안 탈활성화시켰다. 센서 준비 후, 항체 경쟁 분석을 전통적인 샌드위치 검정을 이용하여 수행하였다. 일가 PD-1 ECD 항원(Sino Biological, China)을 HBS-EP 진행 완충제에서 희석시키고, 50 nM 농도로 주입하고, 항-PD-1 항체의 컨쥬게이션된 어레이에 의해 포집하였다. 다음으로, 항체 경쟁 패턴을 확립하기 위해 HBS-EP 진행 완충제에서 100 nM으로 희석된 10 개의 PD-1 항체 각각의 개별 주입을 수행하였다. 각 경쟁 사이클 후, 센서 표면은 10 mM 글리신 HCl 완충제(pH 2.0)로 재생되었다.
결과
10개의 항-PD-1 항체의 경쟁 패턴을 도 8에 나타낸다. 12866 및 12807은 세포-기반 검정에서 기능적 활성을 갖지 않는 것으로 밝혀졌지만, 이들이 독특한 에피토프를 인지하므로 포함시켰다. 시험된 기능적 항-PD-1 항체는 2개의 비-중첩 에피토프 빈에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 에피토프 빈 1에 속하는 기능적 항체는 모두 서로를 교차 차단하였고, 니볼루맙 유사체("Nivo"), 펨브롤리주맙 유사체 ("Pembro"), 12819, 12892, 12865, 및 12777을 포함하였다. 이러한 항체는 PD-L1 및 PD-L2 결합을 현저하게 차단하는 것으로 나타났다. 12760 및 13112는 분리된 에피토프 빈 2에 결합하는 것으로 밝혀졌는데, 그 이유는 이들이 서로를 교차 차단하지만, 에피토프 빈 1로부터의 임의의 항체의 결합은 차단하지 않았기 때문이다. 결과적으로, 12760 및 13112는 PD-L1 및 PD-L2 리간드 결합 부위와 중첩되지 않는 PD-1 상의 다른 부위에 결합하는 것 같다.
에피토프 빈 1에 속하는 교차 차단성 기능적 항체 12819, 12865, 12892, 12777, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙은 12866 및 12807과의 경쟁에 기반하여 4개의 하위-빈으로 추가로 세분될 수 있었다(도 8). 12819(빈 1C)는 12866 및 12807 둘 모두의 결합을 차단한 유일한 항체였고, 반면 니볼루맙(빈 1D)은 12866만을 차단하고 펨브롤리주맙(빈 1F)은 12807만을 차단하였다. 빈 1E에 속하는 항체 그룹(12865, 12892 및 12777)은 12866 또는 12807의 결합을 차단하지 않았다는 점에서 독특하였다.
마지막으로, 12866(빈 1A) 및 12807(빈 1B)은 독특한 에피토프 빈에 결합하였다. 12866은 12819와 니볼루맙에 의해 차단되었지만 다른 항-PD-1 항체에 의해서는 차단되지 않았고, 12807은 12819와 펨브롤리주맙에 의해 차단되었지만 다른 항-PD-1 항체에 의해서는 차단되지 않았다.
실시예 9: 마우스 및 래트 PD-1 ECD 항원에 대한 PD-1 항체 교차 반응성의 측정
본 실시예는 항-PD-1 항체 12819.15384가 마우스 PD-1과 강하게 교차-반응하지만 래트 PD-1에는 결합하지 않음을 입증한다.
재료 및 방법
His-태깅된 마우스 및 래트 PD-1 ECD를 Sino Biologicals로부터 구입하였다. 실시예 7에 기재된 대로 동력학 결합 분석을 수행하였다.
결과
결합 동력학을 하기 표 8에서 표로 나타낸다. 항-PD-1 항체 12819.15384는 809 pM의 KD로 마우스 PD-1에 결합하지만 래트 PD-1은 인지하지 못한다. 인간 PD-1 ECD에 대한 친화도는 실시예 7에서 측정된 것과 유사하였다. 항체 12865.17150은 마우스 또는 래트 PD-1에 결합하지 않았다. 니볼루맙은 물론 펨브롤리주맙 기준 유사체도 마우스 또는 래트 PD-1과 교차-반응하지 않았다(데이터는 도시되지 않음).
표 8 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 측정된 인간, 마우스 또는 래트 PD-1 ECD에 대한 PD-1 항체 12819.15384의 결합 동력학
Figure pct00012
실시예 10: PD-1 mAb의 PD-L1 및 PD-L2 리간드 차단 활성의 분석
본 실시예는 바이오-레이어 간섭굴절측정법 분석을 이용한 경쟁 검정을 수행함에 의해 항-PD-1 항체의 패널이 PD-L1 또는 PD-L2 리간드 차단 활성에 대해 어떻게 분석되었는 지를 예시한다.
재료 및 방법
PD-L1 또는 PD-L2 리간드 차단 활성의 조사는 Octet QK384 기계(Fortebio, USA)를 이용한 바이오-레이어 간섭굴절측정법(BLI) 분석에 의해 수행되었다. 5 μg/ml 농도의 상업적으로 이용 가능한 인간 PD-1 Fc 융합 단백질(Sino Biological)을 항-인간 Fc 센서 칩(Fortebio, USA) 상에 포집하고, 잔여 항-Fc 부위를 Herceptin® 음성 대조군 항체로 차단하였다. 다음으로 항원 코팅된 표면을 10 μg/ml 농도의 항-PD-1 항체로 포화시켰다. 항-PD-1 항체에 의한 PD-1 포화 후, PD-L1 또는 PD-L2의 리간드 차단 활성을 5 μg/ml로 시험된 인간 PD-L1 또는 PD-L2 Fc 융합 단백질(Sino Biological)과의 인큐베이션에 의해 평가하였다.
결과
경쟁 분석의 결과를 하기 표 9에 나타낸다. PD-L1 또는 PD-L2의 유의하지 않은 차단(각각 26% 및 36%)을 보여준 항체 12760.13169, 및 PD-L1을 차단하지 못하고 PD-L2의 약한 차단(각각 27% 및 53%)을 보여준 13112.13208을 제외한 모든 항체는 PD-L1 또는 PD-L2 리간드 결합 둘 모두를 완전히 차단하였다. 그 결과는, 12760 및 13112를 제외한 모든 항체가 PD-1 상의 PD-L1 및 PD-L2 결합 부위로 맵핑되는 중첩 에피토프에 결합하는 반면, 12760 및 13112 항체가 별도의 PD-1 부위에 결합하고 PD-L1 및 PD-L2와 현저하게 교차 경쟁하지 않음을 보여준, 에피토프 비닝 분석(실시예 8) 및 에피토프 맵핑 분석(실시예 11)과 잘 일치하였다.
표 9 항-PD-1 항체 포화 후 PD-L1 및 PD-L2 억제
Figure pct00013
실시예 11: PD-1 돌연변이발생에 의한 항-PD-1 항체의 에피토프 맵핑
항체 에피토프는 일반적으로 선형 에피토프(연속 에피토프로도 명명됨) 또는 입체구조 에피토프(불연속 에피토프로도 명명됨)로서 특성화될 수 있다. 선형 에피토프는 단일 연속 아미노산 서열에 기반하여 정의되지만, 입체구조 에피토프는 여러 더 작은 불연속 선형 서열 또는 단일 접촉 잔기로 구성될 수 있다. 항체와 항원 사이의 분자간 단백질 계면에서 클러스터링되는 접촉 잔기의 집합체는 또한 핫 스팟(hot spot) 또는 코어 에피토프로서 명명된다(Moreira et al., Proteins 68(4):803-12 (2007)). 대부분의 B-세포 에피토프는 본질적으로 불연속인 것으로 현재 널리 알려져 있고(Sivalingam and Shepherd, Mol Immunol. 51(3-4):304-92012 (2012), Kringelum et al., Mol Immunol. 53(1-2):24-34 (2013)) 평균 에피토프는 15-22개 아미노산 잔기에 걸쳐 있는데, 이 중 2-5개 아미노산이 결합 에너지의 대부분에 기여한다(Sivalingam and Shepherd, supra).
본 실시예는 111개의 상이한 PD-1 돌연변이체에 대한 결합 친화도의 순위를 매김으로써 12819와 12865 항체의 결합 에피토프가 니볼루맙 및 펨브롤리주맙에 의해 인지되는 에피토프와 별개인 선형 에피토프 및 핫스팟으로 어떻게 구분될 수 있는 지를 설명한다.
방법
인간 PD-1 수용체는 268개 아미노산(잔기 21-288)의 세포외 도메인으로 구성된다. 세포외 도메인은 아미노산 21-170에 걸쳐 있고 그 뒤에 막통과 도메인(잔기 171-191) 및 세포질 도메인(잔기 192-288)이 온다. PD-1은 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하고, 한 쪽에 GFCC' β-가닥이 있는 2개의 β-시트로 배열된 8개의 항-평행 β-가닥 및 반대 쪽에 ABED β-가닥의 상호작용으로 만들어진 두 층의 β-샌드위치로 구성된다. 2개의 β-시트는 잔기 C54-C123 사이에서 디설파이드 결합에 의해 안정화된다. 결정 구조는 인간 PD-1:인간 PD-L1 복합체(PDB 4ZQK)에 대해 이용 가능하지만, C'와 D β-가닥 사이의 C'D 루프는 비구조화되었고, 잔기 146 뒤의 C-말단 서열의 일부와 마찬가지로 없어진다(PDB 4ZQK, Zak et al., Structure 23(12):2341-2348 (2015)). 최근에 인간 PD-1:펨브롤리주맙 복합체의 결정 구조가 공개되었다(PDB 5JXE, Na et al., Cell Res. 2016 [Epub ahead of print], PMID: 27325296). 이 구조에서 C'D 루프는 훨씬 더 많이 지시되었고, 펨브롤리주맙 결합에 중요한 접촉 잔기는 이 루프에서 코어 에피토프에 클러스터링되는 것으로 나타났다. 이용될 수 있는 인간 PD-1:인간 PD-L2 복합체의 결정 구조는 없다. 용해된 상태의 인간 PD-1의 NMR 구조는 PDB 4ZQK의 결정 구조와 높은 구조적 유사성을 나타낸다(PDB 2M2D, Cheng et al., J Biol Chem 288(17):11771-85 (2013)). 인간 PD-1은 인간 PD-L1 또는 PD-L2 리간드에 1:1 화학량론으로 결합하고, 결합은 주로 GFCC' β-시트에 의해 매개되는 중첩 결합 부위에서 발생한다(Cheng et al., J Biol Chem 288(17):11771-11785 (2013))(도 9, 패널 A 및 B). 인간 PD-L1은 C β-가닥에 위치한 접촉 잔기 V64, N66, Y68, 및 F 및 G β-가닥에 위치한 G124, I126, L128, A132, I134 및 E136을 통해 인간 PD-1에 결합한다(Zak et. al., Structure 23(12):2341-8 (2015)). 인간 PD-L1 및 PD-L2는 각각 8 μM 및 2 μM의 KD로 인간 PD-1에 결합한다(Cheng et. al., 상술함).
인간 PD-1의 단백질 서열은 Uniprot로부터 다운로드하였다(수탁 번호 Q15116; 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1로 표시된다). 전장 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis) 단백질 서열은 Uniprot로부터 다운로드하였다(수탁 번호 B0LAJ3_MACFA (SEQ ID NO: 89)). 갈루스 갈루스(Gallus gallus), 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 및 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus) PD-1의 전장 단백질 서열은 NCBI로부터 다운로드하였다(각각 XP_422723. (SEQ ID NO: 90), NP_032824.1 (SEQ ID NO: 91) 및 XP_006245633.1 (SEQ ID NO: 92)). 인간 PD-1과 비교하여 상이한 PD-1 세포외 아미노산 서열의 서열 동일성을 하기 표 10에 나타낸다.
표 10 종들 중에서 PD-1 ECD 서열 비교
Figure pct00014
인간 PD-1의 분자 모델은 2.45 Å 분해능에서 결정된 인간 PD-1:인간 PD-L1 복합체(PDB 4ZQK)의 결정 구조 및 APO 인간 PD-1(PDB 2M2D)의 NMR 구조로부터의 구조적 정보를 조합시켜 만들어졌다. 구조 PDB 4ZQK는 NMR 구조로부터 제공된 PD-1의 C'D 루프 및 c-말단 부분이 없는 모델의 기초로서 이용되었다. 다음으로, 표면 노출된 아미노산 잔기가 강조되었고, 83개의 개개 알라닌 치환이 인간 PD-1 ECD 상의 표면 노출된 잔기에 설계되었고(알라닌 스캐닝), 인간, 마우스 및 래트 PD-1 사이에 상이한 5개의 노출 된 잔기 위치가 래트 PD-1 잔기로 역-돌연변이되었다.
천연 인간 PD-1 구조의 맥락에서 선형 항체 에피토프를 맵핑하기 위해, 인간 PD-1 ECD 서열의 10개 아미노산이 5개 아미노산만큼 중첩되는 세그먼트의 닭 서열로 순차적으로 교환된 23개의 키메라 단백질을 생성하였다. 이 세그먼트 밖의 갈루스 갈루스 단백질 서열은 인간 PD-1와 잘 정렬되지 않아서 생략되었으므로, 서열 교환은 아미노산 31-146에 걸쳐 있는 인간 PD-1의 세포외 도메인에서 수행되었다.
인간 PD-1의 세포외 도메인을 코딩하는 PD-1 cDNA를 합성하고 CMV 프로모터 및 인간 IgG1 Fc 서열(잔기 P101 -K330)을 함유하는 벡터로 클로닝시켜 클로닝된 PD-1 ECD에 IgG1 Fc C-말단에 의한 융합을 발생시켰다. 표준 PCR 및 공학처리 기술에 의해 돌연변이된 인간 PD-1 Fc 융합 작제물을 생성하고, ExpiCHO™ 발현 시스템을 이용하여 단백질을 2 ml 배양액에서 일시적으로 발현시켰다. 인간 PD-1 Fc 융합 작제물을 9일 후 수확하고, 상청액을 항-PD-1 Fab에 대한 결합 친화도에 대해 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 시험하였다. PD-1 융합 단백질을 함유하는 배양 상청액을 연속 흐름 미세스포터(CFM, Wasatch Microfluidics, Salt Lake City, US)를 이용하여 G-a-hu-IgG Fc SensEye®(Ssens BV, The Netherlands)에 15분 동안 고정시켰다. 스폿팅 후, SensEye®를 IBIS MX96 바이오센서에 배치하고, 포집된 단백질을 표면에 FixIT 키트(Ssens BV, The Netherlands)를 이용하여 고정시켰다. 소위 동력학 적정 시리즈(Karlsson R. 2006)를 적용시켜 동력학 분석을 수행하였고, 여기서 본 발명의 항체의 단합체 Fab 단편은 각 항원 주입 후에 표면 재생 단계를 적용하지 않고 1 nM 내지 50 nM의 증가하는 농도로 주입되었다. Fab 결합을 15분 동안 수행하고, 항원 해리를 30분 동안 수행하였다. 기록된 결합 반응은 온-레이트(kon 또는 ka), 오프-레이트(koff 또는 kd) 및 친화도(KD) 상수를 계산하기 위해 Scrubber 2 소프트웨어에 의해 단순 Langmuir 1:1 결합 모델에 핏팅되었다.
결과
항-PD-1 Fab 12819.17149 및 12865.17150 및 기준 유사체 니볼루맙 및 펨브롤리주맙의 결합 친화도를 평가하였다. 12819.17149 및 12865.17150은 VH 및 VL 아미노산 서열에서 각각 12819.15384 및 12865.15377과 동일하였으나, 다른 10-자리 숫자에 의해 확인되었는데, 그 이유는 전자인 두 변이체 각각의 중쇄 및 경쇄 서열이 숙주 세포에서 분리된 플라스미드가 아닌 동일한 플라스미드에서 공동-발현되었기 때문이다. Fab 13112.15380 및 Herceptin®을 차단하는 비-PD-L1 및 PD-L2 리간드를 대조군으로 포함시켰다.
111개의 시험된 모든 PD-1 돌연변이체는 잘 발현되었다. 3개의 키메라 작제물만이 시험된 항체 중 어떤 것에도 결합하지 않았는데, 이는 이러한 3개의 작제물에 도입된 돌연변이가 아마도 시험된 모든 PD-1 항체의 결합에 영향을 주는 주요 입체구조 교란을 초래하였음을 시사한다. 야생형과 비교하여 돌연변이된 PD-1 작제물에 결합하는 Fab 항체의 결합 친화도의 변화는 KD 돌연변이체/KD 야생형의 비로서 표현되었다(표준화된 결합 친화도). 인간 PD-1 ECD에 10개 아미노산의 갈루스 갈루스 서열을 삽입하여 수행된 선형 에피토프 스캐닝의 개요를 하기 표 11에 나타낸다. 돌연변이된 PD-1 작제물에 대한 감소된 결합 친화도를 검출하기 위한 컷-오프 기준으로서 적어도 5배 친화도 감소가 사용되었다. 일부 경우에, 특정 항체에 대한 결합이 검출될 수 없었다. 이러한 작제물은 N.B.(결합하지 않음)으로 기재하였다.
또한 단일 접촉 잔기를 83개 알라닌 치환 또는 5개 래트 역-돌연변이를 수행함에 의해 맵핑하였다(하기 표 12).
시험된 항체에 대해 확인된 선형 에피토프 또는 접촉 잔기의 개요는 표 13에 제시되어 있다. 인간 PD-1 ECD의 구조에 대한 밀도 플롯으로 도시된 맵핑된 결합 에피토프의 예시는 도 9에 도시되어 있다.
분석 결과, 12819 및 12865 항-PD-1 항체의 결합 에피토프는 참조 항체 니볼루맙 및 펨브롤리주맙과 비교하여 뚜렷이 달랐다(표 11-13, 도 9). 펨브롤리주맙의 코어 에피토프(도 9, 패널 C)는 C' β-가닥 및 C'-D 루프 상에 위치하였다. 접촉 잔기/선형 에피토프도 PD-L1에 대한 접촉 잔기가 또한 존재하는 C 및 F β-가닥에서 발견되었다. 니볼루맙의 코어 에피토프(도 9, 패널 D)는 인간 PD-L1에 의해 활용되는 것으로 보고된 PD-1 접촉 잔기의 일부를 포함하는 전체 G β-가닥 및 F β-가닥의 말단에 존재하였다. 12819 및 12865의 코어 에피토프(도 9, 패널 E 및 F)는 니볼루맙보다 더 큰 면적을 포함하고 이 영역에서 인간 PD-L1에 대한 모든 보고된 접촉 잔기와 중첩되는 F 및 G β-가닥에 위치하였다. 12865은 또한 잔기 69-75의 돌연변이에 매우 민감하였다. 또한 12819는 인간 PD-L1에 대한 접촉 잔기로 또한 보고된 C β-가닥에서 펨브롤리주맙과 하나의 접촉 잔기(V64)를 공유하였다. 12819 및 12865 둘 모두는 C와 C 'β- 가닥 및 C'D 루프의 일부로 맵핑된 선형 에피토프를 공유하였다. 잔기 V64 외에, 시험된 항체 사이에 다른 접촉 잔기는 공유되지 않았다. 비-리간드 차단 항체 13112는 알라닌 스캐닝에 의해 PD-L1 및 PD-L2 리간드 차단 부위로부터 떨어진 영역으로 맵핑되는 것으로 도시된다(도 9, 패널 G).
요약해 보면, 본 실시예는 12819, 12865, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙이 PD-L1 및 PD-L2 리간드의 결합을 차단할 수 있는 인간 PD-1 상의 중첩 에피토프에 결합하지만, 각각의 항체는, 경쟁 결합 분석에서 입증되고(에피토프 비닝, 실시예 8) 표 13에 요약된 대로 개개 선형 에피토프 및 접촉 잔기를 111개 PD-1 돌연변이체의 패널과 맵핑함에 의해 분자 수준에서 보여진 바와 같이, 별개의 결합 에피토프를 가짐을 예시한다. 또한 12819는 마우스 PD-1 ECD와 교차-반응하는 조사된 항-PD-1 패널의 유일한 항체이며(809 pM의 KD, 실시예 9), 이는 상기 항체의 결합 에피토프가 다른 시험된 PD-1 항체와 비교하여 독특하다는 것을 강조한다.
표 11 갈루스 갈루스 서열 세그먼트가 삽입된 Fab 항체 결합 키메라 PD-1 ECD 작제물에 대한 결합 친화도 분석*
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
표 12 알라닌-스캐닝된 인간 PD-1 ECD 잔기에 대한 Fab 항체 결합 친화도*
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
표 13 돌연변이된 PD-1 Fc 융합 작제물을 이용하여 확인된 항-PD-1 항체 결합 에피토프
Figure pct00022
실시예 12: 4개의 공통유전자 뮤린 종양 모델에서 12819 항체의 생체내 효능
본 실시예는 4개의 공통유전자 뮤린 종양 모델에서 12819 항체의 생체내 효능을 입증한다.
방법
2x105개 Sa1N(섬유육종), 1x106개 CT26(결장 암종), 5x106개 ASB-XIV(폐 암종), 또는 8x106개 MC38(결장 암종) 세포를 6-8주령 암컷 A/J(Sa1N), BALB/cAnNRj(CT26 및 ASB-XIV), 또는 C57BL/6(MC38) 마우스의 옆구리에 피하 접종하였다. 종양을 2차원으로 캘리퍼에 의해 매주 3회 측정하였고 종양 부피를 mm3로 다음 식에 따라 계산하였다: (너비)2 x 길이 x 0.5. 30-50 mm3의 평균 종양 크기에서, 마우스를 10마리 동물의 두 그룹으로 무작위화하고 치료를 개시하였다. 마우스를 비히클 완충제 또는 모노클로날 항체 12819.17149의 복강내 주입에 의해 매주 3회 치료로 총 6회 치료한 다음, 관찰 기간을 가졌다. 항체 치료제는 10 mg/kg으로 투여되었다. Bonferroni의 다중 비교 시험과 함께 이원 ANOVA를 적용시켜 각 시점에 치료 그룹 간에 종양 부피를 비교하였다. 통계 분석은 GraphPad Prism 버전 5.0(GraphPad Software, Inc.)을 이용하여 수행되었다.
결과
결과는 모든 시험된 공통유전자 종양 모델에서 항체 12819.17149의 현저한 종양 억제 효과를 보여준다(P<0.001 대 비히클)(도 10). 항체 12819.17149는 Sa1N 종양 모델에서 종양 성장 퇴행을 유도하였고, CT26, MC38 및 ASB-XIV 종양 모델에서 종양 성장 지연을 발생시켰다.
실시예 13: CD8 + /CD4 + T 세포 및 A375 흑색종 세포의 혼합물에 의해 반-인간화된 이종이식 종양 모델에서 12819 항체의 생체내 효능
본 실시예는 반-인간화된 이종이식 종양 모델에서 12819 항체의 생체내 효능을 입증하였고, 여기서 인간 흑색종 세포주 A375는 정제된 인간 CD8+ 및 CD4+ T 세포와 혼합되었다.
방법
4.5x105개 CD8+ 및 CD4+ T 세포를 인간 PBMC 도너로부터 단리시키고, 2.05x106개 A375(인간 흑색종) 암 세포와 혼합시킨 후 6-8주령 암컷 NODscid 마우스의 옆구리에 피하 접종하였다. 종양 접종 당일에 치료를 개시하였고, 마우스를 비히클 완충제, Keytruda®(펨브롤리주맙)(10 mg/kg), 또는 모노클로날 항체 12819.17149(10 mg/kg)의 복강내 주입에 의해 매주 3회 치료로 총 6회 치료한 다음, 관찰 기간을 가졌다. 종양을 2차원으로 캘리퍼에 의해 매주 3회 측정하였고 종양 부피를 mm3로 다음 식에 따라 계산하였다: (너비)2 x 길이 x 0.5. Bonferroni의 다중 비교 시험과 함께 이원 ANOVA를 적용시켜 각 시점에 치료 그룹 간에 종양 부피를 비교하였다. 통계 분석은 GraphPad Prism 버전 5.0(GraphPad Software, Inc.)을 이용하여 수행되었다.
결과
반-인간화된 종양 모델에서, 항체 12819.17149에 의한 치료는 현저한 종양 성장 지연을 발생시킨 반면(P<0.001 대 비히클), Keytruda®는 종양 성장에서 비히클 치료 그룹에 비해 제한된 효과를 보여주었다(도 11).
표 14 SEQ ID NO의 목록
Figure pct00023
Figure pct00024
서열 목록
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
SEQUENCE LISTING <110> SYMPHOGEN A/S <120> ANTI-PD-1 ANTIBODIES AND COMPOSITIONS <130> 022675.WO052 <140> <141> <150> 62/236,341 <151> 2015-10-02 <160> 92 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 288 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln 1 5 10 15 Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp 20 25 30 Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp 35 40 45 Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val 50 55 60 Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala 65 70 75 80 Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg 85 90 95 Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg 100 105 110 Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu 115 120 125 Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val 130 135 140 Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro 145 150 155 160 Arg Pro Ala 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 74 gctagcctcc tacgagctga ctcaggaccc agcagtgagc gtcgccctgg gccagacagt 60 gagaatcact tgctctggcg gagggtccag ctcttactat ggttggtacc agcagaagcc 120 cggccaggct cctgtgaccg tcatctatga cgatacaaac aggccaagtg gaattcccga 180 tcggttctca ggtagttcat ccggcaatac agcttctctg accatcacag gggcccaggc 240 tgaggacgaa gcagattact attgtggtgg ctatgaagga agctctcacg ccgggatttt 300 tggaagtggg actaaagtca ccgtcctagg 330 <210> 75 <211> 376 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 75 ggcgcgccga ggtgcagctg ctggaaagtg gaggaggact ggtccagcca ggtggaagcc 60 tgagactgtc ttgcgccgct agtggcttcg acttttccag ctacaccatg cagtgggtga 120 ggcaggcacc aggcaaggga ctggagtggg tgggcgtcat ctctagtact ggagggtcta 180 ccggatacgg gcctgctgtg aagggaaggg caacaatttc acgggataac tccaaaaata 240 ctctgtatct gcagatgaac agcctgaggg cagaagacac agccgtgtac tattgcgtga 300 aatcaatctc cggagatgcc 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170 175 Thr Ile Asp Glu Pro Ser Glu Glu Glu Ser Ser Pro Pro Asp His Ile 180 185 190 Lys Ala Val Leu Leu Gly Thr Leu Leu Leu Ala Gly Val Ile Val Leu 195 200 205 Leu Leu Phe Gly Tyr Ile Ile Ile Asn Asn Arg Arg Ala Asp Val Gln 210 215 220 Lys Pro Ser Ser Gly Asn Thr Leu Ala Glu Val Lys Pro Pro Val Val 225 230 235 240 Pro Val Pro Thr Val Asp Tyr Gly Val Leu Glu Phe Gln Arg Asp Pro 245 250 255 His Ser Gln Val Pro Leu Glu Thr Cys Pro Ala Glu Gln Thr Glu Tyr 260 265 270 Ala Thr Ile Val Phe Pro Glu Glu Lys Pro Ile Thr Pro Glu Arg Gly 275 280 285 Lys Arg His Lys Asp Glu Arg Thr Trp Gln Leu Pro Ser Gln Pro Cys 290 295 300 <210> 91 <211> 288 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 91 Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln 1 5 10 15 Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp 20 25 30 Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala 35 40 45 Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met 50 55 60 Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala 65 70 75 80 Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln 85 90 95 Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp 100 105 110 Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu 115 120 125 His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val 130 135 140 Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro 145 150 155 160 Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Gly Met Val Ile Gly Ile Met Ser Ala 165 170 175 Leu Val Gly Ile Pro Val Leu Leu Leu Leu Ala Trp Ala Leu Ala Val 180 185 190 Phe Cys Ser Thr Ser Met Ser Glu Ala Arg Gly Ala Gly Ser Lys Asp 195 200 205 Asp Thr Leu Lys Glu Glu Pro Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Val Ala 210 215 220 Tyr Glu Glu Leu Asp Phe Gln Gly Arg Glu Lys Thr Pro Glu Leu Pro 225 230 235 240 Thr Ala Cys Val His Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Thr Glu Gly 245 250 255 Leu Gly Ala Ser Ala Met Gly Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Leu Gln 260 265 270 Gly Pro Arg Pro Pro Arg His Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu 275 280 285 <210> 92 <211> 288 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 92 Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln 1 5 10 15 Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp 20 25 30 Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala 35 40 45 Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met 50 55 60 Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala 65 70 75 80 Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln 85 90 95 Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp 100 105 110 Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu 115 120 125 His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val 130 135 140 Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro 145 150 155 160 Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Gly Met Val Ile Gly Ile Met Ser Ala 165 170 175 Leu Val Gly Ile Pro Val Leu Leu Leu Leu Ala Trp Ala Leu Ala Val 180 185 190 Phe Cys Ser Thr Ser Met Ser Glu Ala Arg Gly Ala Gly Ser Lys Asp 195 200 205 Asp Thr Leu Lys Glu Glu Pro Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Val Ala 210 215 220 Tyr Glu Glu Leu Asp Phe Gln Gly Arg Glu Lys Thr Pro Glu Leu Pro 225 230 235 240 Thr Ala Cys Val His Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Thr Glu Gly 245 250 255 Leu Gly Ala Ser Ala Met Gly Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Leu Gln 260 265 270 Gly Pro Arg Pro Pro Arg His Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu 275 280 285

Claims (54)

  1. 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 상기 항체가 인간 PD-1과의 결합에 대해 중쇄 및 경쇄 가변 도메인이 하기의 아미노산 서열을 포함하는 항체와 경쟁하거나, 상기 항체가 중쇄 및 경쇄 가변 도메인이 하기의 아미노산 서열을 포함하는 항체와 동일한 인간 PD-1의 에피토프에 결합하는, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분:
    a) 각각 SEQ ID NO: 2 및 3;
    b) 각각 SEQ ID NO: 4 및 5;
    c) 각각 SEQ ID NO: 4 및 66;
    d) 각각 SEQ ID NO: 6 및 7;
    e) 각각 SEQ ID NO: 8 및 9;
    f) 각각 SEQ ID NO: 10 및 11;
    g) 각각 SEQ ID NO: 12 및 13;
    h) 각각 SEQ ID NO: 14 및 15; 또는
    i) 각각 SEQ ID NO: 16 및 17.
  2. 제1항에 있어서, 항-PD-1 항체가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분:
    a) H-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 18-20의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    b) 중쇄 가변 도메인(VH)이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
    c) VH가 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    d) 중쇄(HC)가 SEQ ID NO: 2 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    e) L-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 21-23의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    f) 경쇄 가변 도메인(VL)이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
    g) VL이 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    h) 경쇄(LC)가 SEQ ID NO: 3 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    i) H-CDR1-3 및 L-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 18-23의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    j) VH가 서열에 있어서 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고 VL이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
    k) VH가 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하고 VL이 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하는 항체; 및
    l) HC가 SEQ ID NO: 2 및 67의 아미노산 서열을 포함하고 LC가 SEQ ID NO: 3 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  3. 제1항에 있어서, 항-PD-1 항체가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분:
    a) H-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 24-26의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    b) 중쇄 가변 도메인(VH)이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
    c) VH가 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    d) 중쇄(HC)가 SEQ ID NO: 4 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    e) L-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 27-29의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    f) 경쇄 가변 도메인(VL)이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 5 또는 66의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
    g) VL이 SEQ ID NO: 5 또는 66의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    h) 경쇄(LC)가 SEQ ID NO: 5 또는 66의 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 68의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    i) H-CDR1-3 및 L-CDR1-3가 각각 SEQ ID NO: 24-29의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    j) VH가 서열에 있어서 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고 VL이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 5 또는 66의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
    k) VH가 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고 VL이 SEQ ID NO: 5 또는 66의 아미노산 서열을 포함하는 항체; 및
    l) HC가 SEQ ID NO: 4 및 67의 아미노산 서열을 포함하고 LC가 SEQ ID NO: 5 또는 66 및 SEQ ID NO: 68의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  4. 제1항에 있어서, 항-PD-1 항체가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분:
    a) H-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 30-32의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    b) 중쇄 가변 도메인(VH)이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
    c) VH가 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    d) 중쇄(HC)가 SEQ ID NO: 6 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    e) L-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 33-35의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    f) 경쇄 가변 도메인(VL)이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
    g) VL이 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    h) 경쇄(LC)가 SEQ ID NO: 7 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    i) H-CDR1-3 및 L-CDR1-3가 각각 SEQ ID NO: 30-35의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    j) VH가 서열에 있어서 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고 VL이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
    k) VH가 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하고 VL이 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하는 항체; 및
    l) HC가 SEQ ID NO: 6 및 67의 아미노산 서열을 포함하고 LC가 SEQ ID NO: 7 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  5. 제1항에 있어서, 항-PD-1 항체가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분:
    a) H-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 36-38의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    b) 중쇄 가변 도메인(VH)이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
    c) VH가 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    d) 중쇄(HC)가 SEQ ID NO: 8 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    e) L-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 39-41의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    f) 경쇄 가변 도메인(VL)이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
    g) VL이 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    h) 경쇄(LC)가 SEQ ID NO: 9 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    i) H-CDR1-3 및 L-CDR1-3가 각각 SEQ ID NO: 36-41의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    j) VH가 서열에 있어서 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고 VL이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
    k) VH가 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하고 VL이 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 항체; 및
    l) HC가 SEQ ID NO: 8 및 67의 아미노산 서열을 포함하고 LC가 SEQ ID NO: 9 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  6. 제1항에 있어서, 항-PD-1 항체가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분:
    a) H-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 42-44의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    b) 중쇄 가변 도메인(VH)이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
    c) VH가 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    d) 중쇄(HC)가 SEQ ID NO: 10 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    e) L-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 45-47의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    f) 경쇄 가변 도메인(VL)이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
    g) VL이 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    h) 경쇄(LC)가 SEQ ID NO: 11 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    i) H-CDR1-3 및 L-CDR1-3가 각각 SEQ ID NO: 42-47의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    j) VH가 서열에 있어서 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고 VL이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
    k) VH가 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하고 VL이 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 항체; 및
    l) HC가 SEQ ID NO: 10 및 67의 아미노산 서열을 포함하고 LC가 SEQ ID NO: 11 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  7. 제1항에 있어서, 항-PD-1 항체가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분:
    a) H-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 48-50의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    b) 중쇄 가변 도메인(VH)이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
    c) VH가 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    d) 중쇄(HC)가 SEQ ID NO: 12 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    e) L-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 51-53의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    f) 경쇄 가변 도메인(VL)이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
    g) VL이 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    h) 경쇄(LC)가 SEQ ID NO: 13 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    i) H-CDR1-3 및 L-CDR1-3가 각각 SEQ ID NO: 48-53의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    j) VH가 서열에 있어서 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고 VL이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
    k) VH가 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하고 VL이 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 항체; 및
    l) HC가 SEQ ID NO: 12 및 67의 아미노산 서열을 포함하고 LC가 SEQ ID NO: 13 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  8. 제1항에 있어서, 항-PD-1 항체가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분:
    a) H-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 54-56의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    b) 중쇄 가변 도메인(VH)이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
    c) VH가 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    d) 중쇄(HC)가 SEQ ID NO: 14 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    e) L-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 57-59의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    f) 경쇄 가변 도메인(VL)이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
    g) VL이 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    h) 경쇄(LC)가 SEQ ID NO: 15 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    i) H-CDR1-3 및 L-CDR1-3가 각각 SEQ ID NO: 54-59의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    j) VH가 서열에 있어서 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고 VL이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
    k) VH가 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하고 VL이 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 항체; 및
    l) HC가 SEQ ID NO: 14 및 67의 아미노산 서열을 포함하고 LC가 SEQ ID NO: 15 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  9. 제1항에 있어서, 항-PD-1 항체가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분:
    a) H-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 60-62의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    b) 중쇄 가변 도메인(VH)이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
    c) VH가 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    d) 중쇄(HC)가 SEQ ID NO: 16 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    e) L-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 63-65의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    f) 경쇄 가변 도메인(VL)이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
    g) VL이 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    h) 경쇄(LC)가 SEQ ID NO: 17 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    i) H-CDR1-3 및 L-CDR1-3이 각각 SEQ ID NO: 60-65의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    j) VH가 서열에 있어서 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고 VL이 서열에 있어서 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 항체;
    k) VH가 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하고 VL이 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 포함하는 항체; 및
    l) HC가 SEQ ID NO: 16 및 67의 아미노산 서열을 포함하고 LC가 SEQ ID NO: 17 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  10. 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 상기 항체가 하기의 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3 아미노산 서열을 포함하는, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분:
    a) 각각 SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 및 23;
    b) 각각 SEQ ID NO: 24, 25, 26, 27, 28, 및 29;
    c) 각각 SEQ ID NO: 30, 31, 32, 33, 34, 및 35;
    d) 각각 SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 및 41;
    e) 각각 SEQ ID NO: 42, 43, 44, 45, 46, 및 47;
    f) 각각 SEQ ID NO: 48, 49, 50, 51, 52, 및 53;
    g) 각각 SEQ ID NO: 54, 55, 56, 57, 58, 및 59; 또는
    h) 각각 SEQ ID NO: 60, 61, 62, 63, 64, 및 65.
  11. 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 상기 항체가 하기의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분:
    a) 각각 SEQ ID NO: 2 및 3;
    b) 각각 SEQ ID NO: 4 및 5;
    c) 각각 SEQ ID NO: 4 및 66;
    d) 각각 SEQ ID NO: 6 및 7;
    e) 각각 SEQ ID NO: 8 및 9;
    f) 각각 SEQ ID NO: 10 및 11;
    g) 각각 SEQ ID NO: 12 및 13;
    h) 각각 SEQ ID NO: 14 및 15; 또는
    i) 각각 SEQ ID NO: 16 및 17.
  12. 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 상기 항체가 하기의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분:
    a) 각각 SEQ ID NO: 2 및 3;
    b) 각각 SEQ ID NO: 4 및 5;
    c) 각각 SEQ ID NO: 4 및 66;
    d) 각각 SEQ ID NO: 6 및 7;
    e) 각각 SEQ ID NO: 8 및 9;
    f) 각각 SEQ ID NO: 10 및 11;
    g) 각각 SEQ ID NO: 12 및 13;
    h) 각각 SEQ ID NO: 14 및 15; 또는
    i) 각각 SEQ ID NO: 16 및 17.
  13. a) SEQ ID NO: 2 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 SEQ ID NO: 3 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC);
    b) SEQ ID NO: 4 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 SEQ ID NO: 5 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
    c) SEQ ID NO: 4 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 SEQ ID NO: 66 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
    d) SEQ ID NO: 6 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 SEQ ID NO: 7 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
    e) SEQ ID NO: 8 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 SEQ ID NO: 9 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
    f) SEQ ID NO: 10 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 SEQ ID NO: 11 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
    g) SEQ ID NO: 12 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 SEQ ID NO: 13 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
    h) SEQ ID NO: 14 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 SEQ ID NO: 15 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 LC; 또는
    i) SEQ ID NO: 16 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 SEQ ID NO: 17 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 항-PD-1 항체.
  14. 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 상기 항체가 SEQ ID NO: 18-20 및 SEQ ID NO: 21-23의 아미노산 서열을 각각 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  15. 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 상기 항체가 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  16. SEQ ID NO: 2 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 3 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항-PD-1 항체.
  17. 아미노산 잔기 K131을 포함하는 PD-1의 에피토프에 결합하는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  18. 제17항에 있어서, 에피토프가 PD-1 아미노산 잔기 P130 및 A132를 추가로 포함하는 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분.
  19. 제18항에 있어서, 에피토프가 PD-1 아미노산 잔기 V64 및 L128를 추가로 포함하는 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분.
  20. 제17항에 있어서, 에피토프가 PD-1 아미노산 잔기 E136을 추가로 포함하는 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분.
  21. 아미노산 잔기 V44 및 T145을 포함하는 PD-1의 에피토프에 결합하는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  22. SEQ ID NO: 1의 아미노산 잔기 69-90 및 122-140을 포함하는 PD-1의 에피토프에 결합하는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  23. 제22항에 있어서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO: 1의 아미노산 잔기 56-64를 추가로 포함하는 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분.
  24. SEQ ID NO: 1의 잔기 69-75를 포함하는 PD-1의 에피토프 또는 이의 단편에 결합하는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  25. SEQ ID NO: 1의 잔기 136-140을 포함하는 PD-1의 에피토프 또는 이의 단편에 결합하는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  26. SEQ ID NO: 1의 잔기 69-75를 포함하는 PD-1의 에피토프 또는 이의 단편 및 잔기 136-140을 포함하는 PD-1의 에피토프 또는 이의 단편에 결합하는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  27. 제1항 내지 제12항, 제14항, 제15항, 및 제17항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 IgG인 항-PD-1 항체.
  28. 제27항에 있어서, 항체가 IgG1인 항-PD-1 항체.
  29. 제28항에 있어서, 항체가 Fc 영역에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 항-PD-1 항체.
  30. 제29항에 있어서, 항체가 IMGT 넘버링 체계에 따라 넘버링된 중쇄 아미노산 위치 228, 234 및 235 중 하나 이상에 돌연변이를 포함하는 항-PD-1 항체.
  31. 제30항에 있어서, 위치 234 및 235의 아미노산 잔기 중 하나 또는 둘 모두가 Ala으로 돌연변이되고/거나, 위치 228의 아미노산 잔기가 Pro으로 돌연변이되는 항-PD-1 항체.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 부분이 하기 특성 중 적어도 하나를 갖는 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분:
    a) 750 pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합함;
    b) 7 nM 이하의 KD로 시노몰구스 PD-1에 결합함;
    c) 1 nM 이하의 KD로 마우스 PD-1에 결합함;
    d) 래트 PD-1에 결합하지 않음;
    e) SEB 전혈 검정에서 IL-2 분비 증가시킴;
    f) 일원 혼합 림프구 반응 검정에서 IFN-γ 분비 증가시킴;
    g) 유세포분석 경쟁 검정에서 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 10 μg/ml의 농도에서 적어도 60%만큼 억제함;
    h) 바이오-레이어 간섭굴절측정 분석에 의해 결정되는 PD-1에 대한 PD-L1 및 PD-L2의 결합을 10 μg/ml의 농도에서 적어도 90%만큼 차단함; 및
    i) 생체내 종양 성장을 억제함.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 화학요법제, 항신생물제, 항혈관형성제, 티로신 키나제 억제제, 또는 PD-1 경로 억제제를 추가로 포함하는 약학적 조성물.
  35. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 항-PD-1 항체의 중쇄 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 경쇄 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 둘 모두를 포함하는 단리된 핵산 분자.
  36. 제35항의 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터로서, 상기 벡터가 발현 조절 서열을 추가로 포함하는, 벡터.
  37. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 항-PD-1 항체의 중쇄 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 경쇄 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포.
  38. 제37항의 숙주 세포를 제공하고, 상기 숙주 세포를 항체 또는 부분의 발현에 적합한 조건 하에 배양시키고, 생성된 항체 또는 부분을 단리시키는 것을 포함하는, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 생산하는 방법.
  39. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 항-PD-1 항체의 결합 특이성 및 또 다른 별개의 항체의 결합 특이성을 갖는 이중특이적 결합 분자.
  40. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분, 제33항 또는 제34항에 따른 약학적 조성물, 또는 제39항에 따른 이중특이적 결합 분자를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 면역성의 향상을 필요로 하는 환자에서 면역성을 향상시키는 방법.
  41. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분, 제33항 또는 제34항에 따른 약학적 조성물, 또는 제39항에 따른 이중특이적 결합 분자를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 암을 치료하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 암이 피부, 폐, 장, 난소, 뇌, 전립선, 신장, 연조직, 조혈 시스템, 두경부, 간, 방광, 유방, 위, 자궁 및 췌장으로 구성된 군으로부터 선택되는 조직에서 유래하는 방법.
  43. 제41항에 있어서, 암이 진행 또는 전이성 흑색종, 비소세포폐암, 두경부 편평 세포 암, 신세포 암종, 또는 호지킨 림프종으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  44. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 화학요법제, 항신생물제, 항혈관형성제, 티로신 키나제 억제제, 또는 PD-1 경로 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  45. 환자에서 면역성을 향상시키는 약제의 제조에서의 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분, 제33항 또는 제34항에 따른 약학적 조성물, 또는 제39항에 따른 이중특이적 결합 분자의 용도.
  46. 환자에서 암을 치료하는 약제의 제조에서의 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분, 제33항 또는 제34항에 따른 약학적 조성물, 또는 제39항에 따른 이중특이적 결합 분자의 용도.
  47. 제46항에 있어서, 암이 피부, 폐, 장, 난소, 뇌, 전립선, 신장, 연조직, 조혈 시스템, 두경부, 간, 방광, 유방, 위, 자궁 및 췌장으로 구성된 군으로부터 선택되는 조직에서 유래하는 용도.
  48. 제46항에 있어서, 암이 진행 또는 전이성 흑색종, 비소세포폐암, 두경부 편평 세포 암, 신세포 암종, 또는 호지킨 림프종으로 구성된 군으로부터 선택되는 용도.
  49. 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제가 화학요법제, 항신생물제, 항혈관형성제, 티로신 키나제 억제제, 또는 PD-1 경로 억제제를 추가로 포함하는 용도.
  50. 면역성의 향상을 필요로 하는 환자에서 면역성을 향상시키는데 사용하기 위한 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분, 제33항 또는 제34항에 따른 약학적 조성물, 또는 제39항에 따른 이중특이적 결합 분자.
  51. 환자에서 암을 치료하는데 사용하기 위한 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 부분, 제33항 또는 제34항에 따른 약학적 조성물, 또는 제39항에 따른 이중특이적 결합 분자.
  52. 제51항에 있어서, 암이 피부, 폐, 장, 난소, 뇌, 전립선, 신장, 연조직, 조혈 시스템, 두경부, 간, 방광, 유방, 위, 자궁 및 췌장으로 구성된 군으로부터 선택되는 조직에서 유래하는 항체 또는 항원-결합 부분, 약학적 조성물, 또는 이중특이적 결합 분자.
  53. 제51항에 있어서, 암이 진행 또는 전이성 흑색종, 비소세포폐암, 두경부 편평 세포 암, 신세포 암종, 또는 호지킨 림프종으로 구성된 군으로부터 선택되는 항체 또는 항원-결합 부분, 약학적 조성물, 또는 이중특이적 결합 분자.
  54. 제50항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 부분, 약학적 조성물, 또는 이중특이적 결합 분자가 화학요법제, 항신생물제, 항혈관형성제, 티로신 키나제 억제제, 또는 PD-1 경로 억제제와 함께 투여되는 항체 또는 항원-결합 부분, 약학적 조성물, 또는 이중특이적 결합 분자.
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