ES2881484T3 - Anticuerpos anti-PD-1 - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo aislado que se une a la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1), que comprende una HCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 90 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 96.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-PD-1

Antecedentes de la invención

La modulación de la respuesta inmunitaria adaptativa de los mamíferos (inmunomodulación) es una estrategia terapéutica útil para diversas enfermedades y trastornos. Una forma de lograr dicha inmunomodulación es intervenir en uno o más puntos de control inmunitario, por ejemplo, el punto de control de la muerte programada-1 (PD-1). La función natural de los puntos de control inmunitarios es suprimir la respuesta inmunitaria, según sea necesario, para evitar el daño inmunológico al tejido normal. Dependiendo de la enfermedad o el trastorno, puede ser conveniente aumentar o disminuir la respuesta inmunitaria. Las células tumorales que presentan antígenos no propios pueden eludir el ataque inmunitario mediante la secreción de citocinas o ligandos que activan los puntos de control inmunitarios. Por tanto, en el tratamiento contra el cáncer, generalmente es deseable aumentar la respuesta inmunitaria contra las células tumorales. Por el contrario, en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, generalmente es deseable reducir la respuesta inmunitaria en determinados tejidos.

La proteína "muerte programada-1" (PD-1) (también conocida como proteína de muerte celular programada 1 y CD279) es un receptor transmembrana de tipo I que forma parte de la familia ampliada CD28/CTLA4 de reguladores de linfocitos T. Los ligandos de la PD-1 incluyen el ligando 1 de PD-1 (PD-L1, también conocido como B7-H1) y el ligando 2 de PD-1 (PD-L2, también conocido como B7-DC).

PD-1 se expresa en diversos tipos de células, incluidos los linfocitos T, los linfocitos B y los macrófagos. Los datos experimentales han vinculado las interacciones de PD-1 con sus ligandos en la atenuación de las respuestas inmunitarias centrales y periféricas. La proliferación de los linfocitos T se inhibe en presencia de PD-L1. Los ratones con el gen PD-1 alterado presentan un fenotipo de autoinmunidad. La deficiencia de PD-1 en ratones C57BL/6 causa glomerulonefritis crónica progresiva similar al lupus y artritis (Nishimura et al., J. Exp. Med. 101(5):891-98, 2000). Los compuestos que modulan la actividad de PD-1 tienen potencial como agentes terapéuticos para el tratamiento de diversas enfermedades y trastornos, entre los que se incluyen el cáncer, la inflamación y las enfermedades autoinmunitarias. Existe una importante necesidad no satisfecha de compuestos inmunomoduladores, por ejemplo, anticuerpos, incluidos agonistas de PD-1 y antagonistas de PD-1.

Sumario de la invención

La presente divulgación proporciona anticuerpos que se unen a la PD-1. Parte de la divulgación del presente documento proporciona un anticuerpo aislado que se une a la PD-1, que comprende una región variable de la cadena pesada (HCVR) seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-26 y/o una región variable de la cadena ligera (LCVR) seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 27-53. La divulgación también proporciona un anticuerpo aislado que se une a la PD-1 y que inhibe de manera competitiva la unión de cualquiera de los anticuerpos divulgados en el presente documento a la PD-1.

La divulgación también proporciona un anticuerpo aislado que se une a la PD-1, que comprende una HCVR seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 85-90 y/o una LCVR seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 91-96.

La divulgación proporciona además un anticuerpo aislado que se une a la PD-1, en donde el anticuerpo se une a una secuencia de la PD-1 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 54-84. Un aspecto de la invención proporciona un anticuerpo aislado que se une a la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1) como se expone en la reivindicación 1.

Los anticuerpos pueden usarse como agentes terapéuticos. Para su uso como agentes terapéuticos, los anticuerpos divulgados en el presente documento pueden modificarse por ingeniería genética, por ejemplo, humanizarse, para reducir o eliminar la enfermedad del suero o una respuesta inmunitaria no deseada cuando se administra a un paciente humano. También se divulgan métodos de tratamiento de enfermedades y trastornos en los que la vía de señalización PD-1 desempeña un papel importante ("enfermedades y trastornos mediados por PD-1").

La presente divulgación incluye el sorprendente descubrimiento de que el contacto de los linfocitos T humanos con una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PD-1 que inhibe competitivamente la unión del PD-L1 o el PD-L2 a la PD-1 expresada en la superficie de los linfocitos T, y una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PD-1 que no inhibe competitivamente la unión del PD-L1 o el PD-L2 a la PD-1 expresada en la superficie de los linfocitos T, aumenta la función efectora de los linfocitos T en mayor medida que una cantidad equivalente de cualquiera de los anticuerpos anti-PD-1 por separado. En alguna divulgación del presente documento, la combinación produce un efecto aditivo en la función efectora de los linfocitos T. En alguna divulgación del presente documento, la combinación produce un efecto sinérgico en la función efectora de los linfocitos T.

Por consiguiente, la presente divulgación proporciona un método para aumentar la función efectora de los linfocitos T, que comprende poner en contacto un linfocito T con una combinación de: (a) una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PD-1 que inhibe competitivamente la unión del PD-L1 o el PD-L2 a la PD-1 expresada en la superficie del linfocito T; y (b) una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PD-1 que no inhibe competitivamente la unión del PD-L1 o el PD-L2 a la PD-1 expresada en la superficie del linfocito T.

En alguna divulgación del presente documento, la presente divulgación también proporciona un método para aumentar la función efectora de los linfocitos T, que comprende poner en contacto un linfocito T con un anticuerpo anti-PD-1 que no inhibe competitivamente la unión del PD-L1 o el PD-L2 a la PD-1 expresada en la superficie del linfocito T.

Además, la presente divulgación proporciona un método para aumentar la secreción de linfocitos de una citocina seleccionada del grupo que consiste en IL-6, IL-12, IL-18, TNF-a, IL-1p y GM-CSF en un paciente humano que necesita una función efectora aumentada de los linfocitos T, que comprende la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-PD-1 que no inhibe de manera competitiva la unión del PD-L1 o el PD-L2 a la PD-1 expresada en la superficie de un linfocito T.

La presente divulgación proporciona un método de tratamiento del cáncer en un mamífero, que comprende poner en contacto un linfocito T en un mamífero que lo necesite con una combinación de: (a) una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PD-1 que inhibe competitivamente la unión del PD-L1 o el PD-L2 a la PD-1 expresada en la superficie del linfocito T; y (b) una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PD-1 que no inhibe competitivamente la unión del PD-L1 o el PD-L2 a la PD-1 expresada en la superficie del linfocito T.

La presente divulgación proporciona un método de producción de anticuerpos anti-PD-1 que comprenden una HCVr , una LCVR o una combinación de los mismos. Por consiguiente, en el presente documento también se proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la HCVR y/o la LCVR de la presente divulgación, así como una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico aislado de la presente divulgación.

Los anticuerpos de la presente divulgación también pueden usarse en pruebas diagnósticas. Por ejemplo, la divulgación proporciona un método para diagnosticar una enfermedad o trastorno mediado por PD-1, por ejemplo, resistencia inmunitaria adaptativa, en un paciente que tiene cáncer.

Estos y otros aspectos y ventajas de la invención resultarán evidentes tras tener en cuenta las siguientes figuras, la descripción detallada y las reivindicaciones. Como se usa en el presente documento, "que incluye" significa sin limitación y los ejemplos citados son no limitantes.

Breve descripción de los dibujos

La invención puede comprenderse más plenamente en referencia a las siguientes figuras.

La FIG. 1 es un alineamiento de las secuencias de 26 regiones variables de cadena pesada (HCVR) de anticuerpos que se unen a la PD-1 humana. El segmento inferior de las secuencias es una continuación del segmento superior. Se indican las regiones marco FR1 a FR4. También se muestran las regiones determinantes de la complementariedad CDR1 a CDR3.

La FIG. 2 es un alineamiento de las secuencias de 27 regiones variables de cadena ligera (LCVR) de anticuerpos que se unen a la PD-1 humana. El segmento inferior de las secuencias es una continuación del segmento superior. Se indican las regiones marco FR1 a FR4. También se muestran las regiones determinantes de la complementariedad CDR1 a CDR3.

La FIG. 3 es una gráfica que resume los datos sobre la unión de 32 anticuerpos de ratón anti-PD-1 humana contra la PD-1-HIS. Los emparejamientos de HCVR y LCVR específicos de los 32 anticuerpos se indican en el texto recuadrado. La unión se evaluó mediante ELISA. Los datos representan la media de dos experimentos. La FIG. 4 es un diagrama de barras que resume los resultados de los ensayos para medir la eficacia de los anticuerpos anti-PD-1 para aliviar la inhibición dependiente de PD-L1 de la activación de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas. Los tratamientos de las células se llevaron a cabo en placas de 96 pocillos durante 3-5 días. Todos los tratamientos incluyeron CD3 unido a la placa y CD28 soluble en PBS. Las células se trataron adicionalmente sin nada (control positivo); solo con PD-L1; o con PD-L1 más un anticuerpo anti-PD-L1 (EH12.2H7, pembrolizumab, 246A10 o 244C8). Al final del período de tratamiento, se transfirieron a una matriz de micropocillos para la determinación del IFN^y a nivel de células individuales, con poblaciones celulares de muestra en el intervalo de aproximadamente 50-100 células.

La FIG. 5 es un diagrama de barras que resume los resultados de la activación diferencial de linfocitos T en respuesta al bloqueo de PD-1. Estos resultados indican que los anticuerpos 388D4, 413E1, 246A10 y 244C8 generaron niveles de secreción similares o aumentaron los niveles de secreción de IFN^y y TNFa en comparación con el anticuerpo EH12.2H7 o pembrolizumab, en condiciones de activación subóptima (lograda por el tratamiento con anti-CD3 y anti-CD28), que puede imitar las condiciones de activación que se dan in vivo.

La FIG. 6 es un diagrama de barras que resume los resultados de los ensayos de recuerdo de antígenos utilizando citomegalovirus en PBMC humanas. Estos resultados indican que los anticuerpos anti-PD-1 246A10, 244C8, 413D2, 388D4 y 413E1 inducen mayores niveles de IFN^y en comparación con los controles de isotipo de los anticuerpos.

Las FIG. 7A y 7B resumen los resultados de los ensayos de reacción de linfocitos mixtos utilizando anticuerpos anti-PD-1 y P^b MC humanas. Las versiones humanizadas del clon 388D4 ("D4-HC3+LC1"; "D4-HC1+LC3"; y "D4-HC3+LC3") parecen inducir la liberación de citocinas (FIG. 7A) y el aumento de CD25 (FIG. 7B) de forma similar a nivolumab. Las versiones humanizadas del clon 244C8 ("C8-HC1+LC1"; "C8-HC1+LC3"; y "C8-HC2+LC1") parecen inducir mayores niveles de liberación de citocinas (IFNy) en comparación con 388D4 o nivolumab (FIG. 7A). Los linfocitos T incubados con 244C8 también parecen mostrar un mayor grado de activación, como se deduce a partir de la expresión de CD25 (FIG. 7B).

La FIG. 8 indica las regiones dentro de la secuencia de aminoácidos de PD-1 (SEQ ID NO: 97) a las que se unen ciertos anticuerpos de la presente divulgación (246A10, 244C8, 388D4, 413D2 y 413E1), según lo determinado mediante cartografía peptídica. Las secuencias de aminoácidos de PD-1 correspondientes a las secuencias de los péptidos inhibidores están subrayadas.

Las FIG. 9A-9D muestran la selectividad de los anticuerpos anti-PD-1 por el dominio extracelular de PD-1 frente a otras proteínas inmunomoduladoras de la superficie celular, tales como ICOS (coestimulador inducible de linfocitos T) (FIG. 9A), CD28 (FIG. 9C) o CTLA4 (FIG. 9D). La unión de anticuerpos anti-PD-1 a la PD-1 se muestra en la FIG. 9B (EH12.2H7 es un anticuerpo anti-PD-1 disponible comercialmente como reactivo de laboratorio). Se analizaron los anticuerpos anti-PD-1 388D4 (100388_D4VH3_100389_D4VK5 en la tabla 3), 413E1 (100413_E1VH9_100414_E1VK5 en la tabla 3), 244C8 y 246A10.

Las FIG. 10A y 10B son alineamientos de secuencias de aminoácidos de secuencias de anticuerpos humanizados y de ratón. La FIG. 10A muestra alineamientos de 100388_D4_VH3 (ratón) con regiones variables de cadena pesada humanizadas (100388_D4_HC1; 100388 D4 HC2; y 100388_D4_HC3) y 100389 D4_VK5 (ratón) con regiones variables de cadena ligera humanizadas (100389_D4_LC1; 100389 D4 LC2; y 100389_D4_LC3). La FIG. 10B muestra alineamientos de 100244_C8VH3 (ratón) con regiones variables de cadena pesada humanizadas (100244_C8_HC1; 100244_C8_HC2; y 100244_C8_HC3) y 100245_C8_VK5m1 (ratón) con regiones variables de cadena ligera humanizadas (100245_C8_LC1; 100245_C8_LC2; y 100245_C8_LC3).

Las FIG. 11A-11D son histogramas de citometría de flujo que muestran que el anticuerpo 388D4 bloquea la unión de PD-L1 soluble a las células HEK293 que expresan PD-1, mientras que el anticuerpo 244C8 no lo hace. Se incubaron células HEK293 que expresan PD-1 con 10 pg/ml de un anticuerpo de isotipo (control negativo), el anticuerpo comercial EH12.2H7 (control positivo), el anticuerpo 388D4 o el anticuerpo 244C8. Las células se lavaron y se tiñeron con la proteína soluble PD-L1-Ig marcada fluorescentemente con Alexa-488. Las células se lavaron de nuevo, y se evaluó la unión de PD-L1 (desplazando el anticuerpo previamente unido) mediante un análisis convencional de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). La FIG. 11A muestra datos del análisis mediante FACS del anticuerpo anti-PD-1 EH12.2H7 (control positivo); La FIG. 11B muestra datos del análisis mediante FACS del anticuerpo anti-PD-1 mIgG1K (control negativo); La FIG. 11C muestra datos del análisis mediante FACS del anticuerpo anti-PD-1 388D4; La FIG. 11D muestra datos del análisis mediante FACS del anticuerpo anti-PD-1 244C8.

La FIG. 12 es un histograma que muestra la restauración de la función de los linfocitos T mediante el bloqueo de PD-1 con nivolumab o diferentes formas humanizadas de los anticuerpos 388D4 y 244C8, es decir, 388D4-2, 388D4-3, 244C8-1, 244C8-2 y 244C8-3. Se incubó una población de 3 x 105 células humanas disociadas y suspendidas de un cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), que incluía un 17 % de linfocitos (activados como se ha descrito anteriormente) durante 24 horas con anticuerpos anti-PD-1 a una concentración de 20 pg/ml. El IFNy se midió mediante un ELISA, y los datos se expresan en términos de múltiplo de activación en relación con el tratamiento con el anticuerpo de control de isotipo. Cada uno de los anticuerpos anti-PD-1 restauró la función de los linfocitos T, aumentando la secreción de iFNy entre aproximadamente 7 y 7,5 veces, en relación con el control de isotipo.

La FIG. 13 es un histograma que resume los resultados de un experimento para medir el aumento de la función efectora de los linfocitos T, indicada por la secreción de IFNy, en respuesta al tratamiento con el anticuerpo 244C8-2 solo frente al tratamiento con 244C8-2 más 388D4-2, que se normaliza en relación con la respuesta al tratamiento con nivolumab. Se incubó una población de 3 x 105 células, que incluía un 7,5% de linfocitos activados de manera subóptima como se ha descrito anteriormente, durante 24 horas con anticuerpos anti-PD-1 a una concentración total de anticuerpos de 20 pg/ml. Como se muestra en la FIG. 13, el tratamiento con 244C8-2 solo aumentó el IFN^y 1,77 veces (±0,19 DE), mientras que el tratamiento con 244C8-2 en combinación con 388D4-2 aumentó la secreción de IFNy 2,11 veces (±0,21 DE).

La FIG. 14 es un histograma que resume los resultados de un experimento que muestra que el tratamiento con la combinación de nivolumab y el anticuerpo 244C8-2 dio lugar a una mayor restauración de la función efectora de los linfocitos T que el tratamiento con nivolumab solo, el anticuerpo 244C8-2 solo o el anticuerpo 388D4-2 solo. En cada tratamiento, se incubó una población de 3 x 105 células, que incluía un 9 % de linfocitos activados de manera subóptima como se ha descrito anteriormente, durante 24 horas con anticuerpos anti-PD-1 a una concentración total de 20 pg/ml. Tras el bloqueo de PD-1, se recogieron las células y sobrenadantes para la medición mediante ELISA del IFNy. Los datos se expresan en términos de múltiplo de inducción de la secreción de IFNy, en relación con el tratamiento con el anticuerpo de control de isotipo.

Las FIG. 15A-15F son histogramas que resumen los resultados de un ensayo de reacción de linfocitos mixtos (MLR) realizado en PBMC humanas tratadas con anticuerpos anti-PD-1. El ensayo de MLR se realizó utilizando células dendríticas derivadas de monocitos comerciales como células estimuladoras y linfocitos T CD4+ purificados como células respondedoras de un donante de sangre sano diferente. Los sobrenadantes se recogieron 2,5 días después de comenzar el ensayo. El tratamiento con el anticuerpo 244C8-1 (100244_C8_HC1 100245_C8_LC1) produjo un aumento de la secreción de las citocinas IL-6, IL-l2, IL-18, TNF-a, GM-CSF e IL-1p, en comparación con el anticuerpo 388D4-2 (100388_D4_HC3 100389_D4_LC3) o un control de isotipo de IgG4. (FIG. 15A, IL-6; FIG. 15B, IL-12; FIG. 15C, IL-18; FIG. 15D, TNF-a; FIG. 15E, IL-1P; FIG. 15F, GM-CSF) Las FIG. 16A-16F son histogramas que resumen los resultados de un experimento que muestra la alteración de la función de los linfocitos infiltrantes en tumores (TIL) mediante el bloqueo de PD-1 con los anticuerpos anti-PD-1388D4-2 y 244C8-2. Se incubó una población de 3 x 105 células humanas disociadas y suspendidas de una biopsia de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), que incluía un 7 % de linfocitos infiltrantes en tumores, durante 24 horas con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, junto con un anticuerpo anti-PD-1 o control de isotipo de IgG4 a una concentración de 10|jg/ml. El tratamiento con el anticuerpo 244C8-2 (100244_C8_HC1 100245_C8_LC3) produjo un aumento de la secreción de las citocinas IL-6, Il-12, IL-18, TNF-a, GM-CSF e IL-1p, en comparación con el anticuerpo 388D4-2 (100388_D4_HC3 100389_D4_LC3) o el control de isotipo de IgG4. (FIG. 16A, IL-6; FIG. 16B, IL-12; FIG. 16C, IL-18; FIG. 16D, TNF-a; FIG. 16E, IL-1P; FIG. 16F, GM-CSF). Las FIG. 17A-17C muestran los resultados de un experimento de eficacia in vivo que incluye el crecimiento de xenoinjerto de tumor de pulmón derivado de un paciente (PDX) en ratones humanizados tratados con control de vehículo, anticuerpo 388D4-3, anticuerpo 244C8-2, pembrolizumab o una combinación del anticuerpo 244C8-2 y pembrolizumab. Los animales recibieron un total de seis dosis intraperitoneales de anticuerpo a intervalos de cinco días (Q5D x 6) 5 mg/kg. En los grupos de tratamiento que recibieron 388D4-3, 244C8-2 o pembrolizumab, la primera dosis del anticuerpo se administró como una dosis de 10 mg/kg, seguido de las dosis adicionales a la dosis de 5 mg/kg. El grupo de tratamiento combinado recibió una dosis de cada uno de 5 mg/kg de pembrolizumab y 5 mg/kg de 244C8-2 en cada punto de tiempo de dosificación. Los volúmenes de los tumores se midieron dos veces por semana (días 3, 6, 10, 13, 17, 20, 24 y 28) utilizando un calibre digital para determinar la longitud y la anchura de los tumores. Se sacrificó a todos los animales en el día 28 después de comenzar la administración. Las barras de error representan el intervalo de confianza al 95 % (n = 10). Todos los grupos de tratamiento mostraron una inhibición significativa del crecimiento tumoral en comparación con el grupo de control de vehículo. Como se muestra en la FIG. 17A, no se observó ninguna diferencia significativa en la inhibición del crecimiento tumoral entre el tratamiento con anticuerpo 388D4-3, anticuerpo 244C8-2, pembrolizumab o la combinación de anticuerpo 244C8-2 con pembrolizumab. La FIG. 17B es un diagrama de cajas de los volúmenes tumorales para cada grupo de tratamiento en el día 28 (final del estudio) del experimento descrito en la FIG. 17A. El volumen tumoral de cada grupo de tratamiento fue significativamente menor que el del grupo de vehículo. Los valores de p de la prueba de la T de Student entre cada grupo de tratamiento y el grupo del vehículo fueron: 0,00167 (pembrolizumab), 0,00105 (388D4-3), 0,00277 (244C8-2) y 0,00275 (pembrolizumab+244C8), respectivamente. La FIG. 17C es un histograma que muestra el porcentaje de volumen tumoral de cada grupo de tratamiento en relación con el vehículo el día 28 del experimento descrito en las FIG. 17A y 17B. El porcentaje calculado de inhibición del crecimiento tumoral (% ICT) para cada tratamiento se muestra por encima de cada barra.

Descripción detallada de la invención

Los anticuerpos anti-PD-1 divulgados en el presente documento se basan en los sitios de unión al antígeno de ciertos anticuerpos monoclonales seleccionados basándose en la unión a la proteína de muerte programada-1 (PD-1) humana (UniProt n.° Q15116). Los anticuerpos contienen secuencias de CDR de la región variable de la inmunoglobulina que definen los sitios de unión a la PD-1 humana.

Gracias al bloqueo de la señal de PD-1 o a la actividad neutralizante de PD-1 de algunos de estos anticuerpos, son útiles para tratar diversos tipos de cáncer, lo que incluye la inhibición del crecimiento tumoral. En algunas divulgaciones del presente documento (por ejemplo, cuando se utilizan como agentes terapéuticos), los anticuerpos pueden diseñarse para minimizar o eliminar una respuesta inmunitaria cuando se administran a un paciente humano. Diversas características y aspectos de la invención se analizan con más detalle a continuación.

Como se usa en el presente documento, "anticuerpo aislado" significa un anticuerpo que está sustancialmente libre de su ambiente natural. Por ejemplo, un anticuerpo o ácido nucleico aislado está sustancialmente libre de material celular y de otras proteínas de la fuente celular o tisular de la que procede.

Como se usa en el presente documento, a menos que se indique otra cosa, "anticuerpo" significa un anticuerpo intacto o un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo, incluyendo un anticuerpo intacto o un fragmento de unión al antígeno que se ha modificado o genomanipulado o que es un anticuerpo humano. Algunos ejemplos de anticuerpos modificados o diseñados por ingeniería genética son anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos multiparatópicos (por ejemplo, anticuerpos biparatópicos), y anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos). Algunos ejemplos de fragmentos de unión al antígeno incluyen Fab, Fab', F(ab')², Fv, anticuerpos monocatenarios (por ejemplo, scFv), minicuerpos y diacuerpos.

Los anticuerpos divulgados en el presente documento comprenden: (a) una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la estructura CDRh¹-CDRh²-CDRh³, y (b) una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la estructura CDRli-CDRl²-CDRl³, en donde la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera definen conjuntamente un único sitio de unión para la unión de la proteína PD-1 humana.

En alguna divulgación del presente documento, el anticuerpo aislado que se une a la PD-1 comprende una región variable de la cadena pesada (HCVR) que tiene las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) seleccionadas del grupo que consiste en: las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 1; las CDR 1-3 del SeQ ID NO: 2; las CDR 1­ 3 del SEQ ID NO: 3; las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 4; las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 5; las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 6; las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 7; las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 8; las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 9; las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 10; las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 11; las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 12; las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 13; las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 14; las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 15; las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 16; las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 17; las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 18; las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 19; las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 20; las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 21; las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 22; las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 23; las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 24; las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 25; y las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 26.

En alguna divulgación del presente documento, el anticuerpo aislado que se une a la PD-1 comprende una HCVR seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-26.

En alguna divulgación del presente documento, el anticuerpo aislado que se une a la PD-1 comprende una región variable de la cadena ligera (LCVR) que tiene las CDR seleccionadas del grupo que consiste en:

las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 27 las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 28 las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 29;

las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 30 las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 31 las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 32;

las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 33 las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 34 las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 35;

las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 36 las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 37 las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 38;

las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 39 las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 40 las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 41;

las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 42 las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 43 las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 44;

las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 45 las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 46 las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 47;

las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 48 las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 49 las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 50;

las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 51 las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 52 y las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 53

En alguna divulgación del presente documento, el anticuerpo aislado que se une a la PD-1 comprende una LCVR seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 27-53.

En alguna divulgación del presente documento, el anticuerpo aislado que se une a la PD-1 comprende una HCVR seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-26 y una LCVR seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 27-53. A lo largo de la presente divulgación se proporcionan ejemplos de emparejamientos de HCVR y LCVR, pero se encuentran dentro del alcance de la divulgación emparejamientos funcionales adicionales. En alguna divulgación del presente documento, el anticuerpo comprende una HCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 4 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 28 (denominado 244^c 7 en la tabla 3); una HCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 4 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ iD NO: 27 (244C7m1); una HCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 1 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 28 (244C8); una HCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 1 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID nO: 27 (244C8m1); una HCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 3 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 31 (246F7); una HCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 5 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 44 (258C1); una HCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 2 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 30 (258F6); una HCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 2 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 29 (258F6m); una HCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 6 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 34 (392C4); una HCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 7 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ iD NO: 41 (394D5); una HCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 8 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 35 (394G1); una HCVR que tiene la secuencia expuesta en el ^s E^q ID NO: 12 y una LC^v R que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 39 (388C12A); una HCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 12 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 32 (388C12B); una HCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 13 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID No : 39 (388C16A); una HCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 13 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 32 (388C16B); una HCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 9 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 38 (392C5A); una HcVr que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 9 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 37 (392C5B); una HCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 17 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 40 (392D2); una ^hC^v R que tiene la secuencia expuesta en el S^eQ ID NO: 16 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 43 (392H4); una HCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 20 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 53 (246A10); una HCVR que tiene la secuencia expuesta en el s Eq ID NO: 18 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 47 (388D4); una HCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 19 y una LCVR que tiene la secuencia

expuesta en el SEQ iD NO: 48 (392A6); una HCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 21 y una

LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 52 (411C2); una HCVR que tiene la secuencia expuesta en

el SEQ ID NO: 22 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID No : 51 (413D2); o una HCVR que

tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 25 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 45

(413E1).

En alguna divulgación del presente documento, el anticuerpo comprende una HCVR que tiene la secuencia expuesta

en el SEQ ID NO: 20 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID ⁿO: 53 (246A10); una H^cV^r que

tiene la secuencia expuesta en el ^s E^q ID NO: 25 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 45

(413E1); una HCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 22 y una LCVR que tiene la secuencia

expuesta en el SEQ ID NO: 51 (413D2); una HCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 18 y una

LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 47 (388D4); una HCVR que tiene la secuencia expuesta en

el SEQ ID NO: 1 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 28 (244C8); o una HCVR que tiene

la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 9 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 38

(392C5A).

En alguna divulgación del presente documento, el anticuerpo aislado que se une a la PD-1 se une a una secuencia

de la PD-1 seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 54, el SEQ ID , el SEQ

ID NO: 57, el SEQ ID NO: 58, el SEQ ID NO: 59, el SEQ ID NO: 60, ID NO: 62, el SEQ ID NO: 63, el SEQ I

O: 64, el SEQ ID NO: 65, el S 66, el SEQ ID NO: 69, el SEQ I

70, el SEQ ID NO: 71, el S 72, el SEQ ID NO: 75, el SEQ ID NO: 76, el SEQ ID NO: 77, el S

78, el SEQ ID NO: 81, el SEQ ID NO: 82, el SEQ ID NO: 83 y el SEQ ID NO: 84.

Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo que se une a la PD-1, que comprende" una HCVR o una

LCVR, significa un anticuerpo que comprende la HCVR o la LCVR, a diferencia de una proteína PD-1 que

comprende la HCVR o la LCVR.

En alguna divulgación del presente documento, el anticuerpo se une específicamente a la PD-1. Esto significa que el

anticuerpo se une a la proteína PD-1 en una muestra, con una unión insignificante a otras proteínas presentes en la

muestra, en un conjunto determinado de condiciones de reacción de unión.

Algunos ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, un Fab, Fab', F(ab')², Fv, scFv, dAb y un diacuerpo.

Un "fragmento Fab" comprende una cadena ligera y las regiones C^h1 y variable de una cadena pesada. La cadena

pesada de una molécula Fab no puede formar un enlace disulfuro con otra molécula de cadena pesada.

Una región "Fc" contiene dos fragmentos de cadena pesada que comprenden los dominios CH2 y CH3 de un

anticuerpo. Los dos fragmentos de la cadena pesada se mantienen unidos mediante dos o más enlaces disulfuro y

mediante interacciones hidrófobas de los dominios CH3.

Un "fragmento Fab'" contiene una cadena ligera y una porción de una cadena pesada que contiene el dominio VH y

el dominio CH1 y también la región entre los dominios CH1 y CH2, de manera que puede formarse un enlace de

disulfuro intercatenario entre las dos cadenas pesadas de dos fragmentos Fab' para formar una molécula F(ab')².

Un "fragmento F(ab')²" contiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que contienen una porción de la región

constante entre los dominios C^h1 y C^h2, de manera que se forma un enlace de disulfuro intercatenario entre las dos

cadenas pesadas. Por tanto, un fragmento F(ab')² está compuesto por dos fragmentos Fab' que se mantienen

unidos mediante un enlace de disulfuro entre las dos cadenas pesadas.

La "región Fv" comprende las regiones variables de las cadenas tanto pesada como ligera, pero carece de las

regiones constantes.

Un "anticuerpo Fv monocatenario" o "scFv" se refiere a fragmentos de anticuerpos que comprenden los dominios VH

y VL de un anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. En general, el

polipéptido Fv comprende además un conector polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite al scFv para

formar la estructura deseada para la unión del antígeno. Para una revisión de los scFv, véase Pluckthun (1994) The

Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds. Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269­

315. Véanse también, la Publicación PCT n.° WO 88/01649 y las Patentes de Estados Unidos n.° 4.946.778 y

5.260.203.

Un "diacuerpo" es un pequeño fragmento de anticuerpo con dos sitios de unión al antígeno. Los fragmentos

comprenden una región variable de la cadena pesada (VH) conectada con una región variable de la cadena ligera

(VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL o VL-VH). Usando un conector que sea demasiado corto como para

permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se obliga a los dominios a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión al antígeno. Los diacuerpos se describen en, por ejemplo, los documentos de patente EP 404.097; WO 93/11161; y en Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448.

Un "fragmento de anticuerpo de dominio" es un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional que contiene únicamente la región variable de una cadena pesada o la región variable de una cadena ligera. En algunos casos, dos o más regiones VH se unen covalentemente con un conector peptídico para crear un fragmento de anticuerpo de dominio bivalente. Las dos regiones VH de un fragmento de anticuerpo de dominio bivalente pueden dirigirse al mismo antígeno o a antígenos diferentes.

En alguna divulgación del presente documento, el anticuerpo está modificado o genomanipulado. Algunos ejemplos de anticuerpos modificados o genomanipulados incluyen anticuerpos quiméricos, anticuerpos multiparatópicos (por ejemplo, anticuerpos biparatópicos), y anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos).

Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo multiparatópico" significa un anticuerpo que comprende al menos dos anticuerpos de dominio único, en el que al menos un anticuerpo de dominio único está dirigido contra un primer determinante antigénico de un antígeno, y al menos otro anticuerpo de dominio único está dirigido contra un segundo determinante antigénico del mismo antígeno. Por lo tanto, por ejemplo, un anticuerpo "biparatópico" comprende al menos un anticuerpo de dominio único dirigido contra un primer determinante antigénico de un antígeno, y al menos un anticuerpo de dominio único adicional dirigido contra un segundo determinante antigénico del mismo antígeno.

Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo multiespecífico" significa un anticuerpo que comprende al menos dos anticuerpos de dominio único, en el que al menos un anticuerpo de dominio único está dirigido contra un primer antígeno, y al menos otro anticuerpo de dominio único está dirigido contra un segundo antígeno (diferente del primer antígeno). Por lo tanto, por ejemplo, un anticuerpo "biespecífico" es aquel que comprende al menos un anticuerpo de dominio único dirigido contra un primer antígeno y al menos un anticuerpo de dominio único adicional dirigido contra un segundo antígeno, por ejemplo, diferente del primer antígeno.

En alguna divulgación del presente documento, los anticuerpos divulgados en el presente documento son anticuerpos monoclonales, por ejemplo, anticuerpos monoclonales murinos. En la técnica se conocen métodos para preparar anticuerpos monoclonales. Véase, por ejemplo, Pluckthun (1994) The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds. Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315.

En alguna divulgación del presente documento, los anticuerpos se modifican para reducir la capacidad inmunógena. Cuando los anticuerpos van a administrarse a un ser humano, los anticuerpos pueden ser "humanizados" para reducir o eliminar la capacidad antigénica en los seres humanos. Por consiguiente, en alguna divulgación del presente documento, el anticuerpo comprende una región marco (FR) humanizada o humana.

En alguna divulgación del presente documento, el anticuerpo aislado que se une a la PD-1 comprende una HCVR seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 85-90.

En alguna divulgación del presente documento, el anticuerpo aislado que se une a la PD-1 comprende una LCVR seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 91-96.

En cierta divulgación del presente documento, el anticuerpo aislado que se une a la PD-1 comprende una HCVR seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 85-90 y una LCVR seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 91-96. A lo largo de la presente divulgación se proporcionan ejemplos de emparejamientos de HCVR y LCVR, pero se encuentran dentro del alcance de la divulgación emparejamientos funcionales adicionales. En alguna divulgación del presente documento, el anticuerpo aislado comprende una HCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 90 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 94; una HCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 88 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 96; una HCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 90 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 96; una HCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 85 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 91; una HCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 85 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 93; una HCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 86 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 91.

Los métodos para reducir o eliminar la capacidad antigénica de los anticuerpos y los fragmentos de anticuerpos son conocidos en la técnica. En una estrategia, se modifica un ácido nucleico que codifica un anticuerpo PD-1 descrito en el presente documento, por ejemplo, sustituyendo la región constante de ratón por regiones constantes de la cadena pesada y ligera humana (por ejemplo, Patente de Estados Unidos n.° 4.816.567; Morrison, et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851) para producir lo que comúnmente se denomina anticuerpo quimérico.

Un anticuerpo humanizado tiene generalmente uno o más restos de aminoácidos de una fuente que es no humana.

Los restos de aminoácidos no humanos se denominan a menudo restos "de importación", y normalmente se toman a partir de un dominio variable "de importación". La humanización puede llevarse a cabo generalmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., 1986, Nature 321: 522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332: 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-1536), sustituyendo las CDR no humanas o las secuencias de las CDR por las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. En la práctica, los anticuerpos humanizados normalmente son anticuerpos humanos en los que algunos restos de la CDR y posiblemente algunos restos de la FR están sustituidos por restos procedentes de sitios análogos de anticuerpos no humano, por ejemplo, murinos. Preferentemente, un anticuerpo humanizado tiene la misma o sustancialmente la misma afinidad por el antígeno que el anticuerpo no humano, por ejemplo, de ratón, del que derivó.

En una estrategia conocida como injerto de CDR, se injertan las CDR de las regiones variables de la cadena ligera y pesada en las regiones marco de otra especie. Por ejemplo, las CDR murinas pueden injertarse en las FR humanas. En alguna divulgación del presente documento, las Cd R de las regiones variables de la cadena ligera y pesada de un anticuerpo PD-1 se injertan en FR humanas o FR consenso humanas. Para crear FR consenso humanas, se alinean las FR de varias secuencias de aminoácidos de cadena pesada o de cadena ligera humanas para identificar una secuencia de aminoácidos consenso. El injerto de CDR se describe en, por ejemplo, la Patente de EE.UU n.° 7.022.500 (Queen); la Patente de EE.UU n.° 6.982.321 (Winter); la Patente de EE.UU n.° 6.180.370 (Queen); la Patente de EE.UU n.° 6.054.297 (Carter); la Patente de EE.UU n.° 5.693.762 (Queen); la Patente de EE.UU n.° 5.859.205 (Adair); la Patente de EE.UU n.° 5.693.761 (Queen); la Patente de EE.UU n.° 5.565.332 (Hoogenboom); la Patente de EE.UU n.° 5.585.089 (Queen); la Patente de EE.UU n.° 5.530.101 (Queen); Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534-1536; y Winter (1998) FEBS Lett 430: 92-94.

La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, para usar en la preparación de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la capacidad antigénica. De acuerdo con el método denominado de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba frente a la colección completa de secuencias conocidas de dominios variables humanos. La secuencia humana que es más próxima a la del roedor se acepta entonces como la FR para el anticuerpo humanizado (Sims et al., 1987, J. Immunol. 151: 2296; Chothia et al., 1987, J. Mol. Biol. 196: 901). Otro método usa un marco particular derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. El mismo marco se puede usar para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285; Presta et al., 1993, J. Immunol. 151: 2623).

Es importante que los anticuerpos humanizados conserven la afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas deseables. Para conseguir este resultado, se pueden diseñar anticuerpos humanizados analizando las secuencias precursoras y varios productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias precursoras y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulinas están disponibles habitualmente, y los expertos en la materia estarán familiarizados con ellos. Se dispone de programas informáticos que ilustran y presentan posibles estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias seleccionadas de la inmunoglobulina candidata. La inspección de estas presentaciones permite el análisis del papel probable de los restos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los restos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta manera, los restos de la FR pueden seleccionarse y combinarse a partir de las secuencias receptoras e importadas de tal forma que se logra la característica deseada del anticuerpo, de forma que se consigue una afinidad aumentada por el antígeno o antígenos objetivo.

Otros métodos para reducir la capacidad inmunógena incluyen "remodelación" "hiperquimerización", y "rebarnizado/rechapado". Véase, por ejemplo, Vaswami et al., 1998, Ann. Allergy & Immunol. 81: 105; Roguska et al., 1996, Prot. Engineer. 9: 895-904; y la patente de Estados Unidos n.° 6.072.035 (Hardman). En la estrategia de rebarnizado/rechapado, los restos de aminoácidos accesibles en la superficie del anticuerpo murino se sustituyen por restos de aminoácidos que se encuentran con más frecuencia en las mismas posiciones en un anticuerpo humano. Este tipo de rechapado de anticuerpos se describe, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos n.° 5.639.641 (Pedersen).

Otra estrategia para convertir un anticuerpo de ratón en una forma adecuada para su uso médico en seres humanos se conoce como la tecnología ACTIVMA^b ™ (Vaccinex, Inc., Rochester, Nueva York), que implica el uso de un vector basado en un virus de la variolovacuna para expresar los anticuerpos en células de mamífero. Se dice que se producen unos elevados niveles de diversidad combinatoria de las cadenas pesada y ligera de la IgG. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU n.° 6.706.477 (Zauderer); la Patente de EE.UU n.° 6.800.442 (Zauderer); y la patente de Estados Unidos n.° 6.872.518 (Zauderer).

Otra estrategia para convertir un anticuerpo de ratón en una forma adecuada para su uso en seres humanos es la tecnología comercializada por KaloBios Pharmaceuticals, Inc. (Palo Alto, CA). Esta tecnología implica el uso de una colección patentada de "aceptores" humanos para producir una colección "orientada al epítopo" para la selección de anticuerpos.

Otra estrategia para modificar un anticuerpo de ratón en una forma adecuada para su uso médico en seres humanos es la tecnología HUMAN ENGINEERInG™, que es comercializada por Xo Ma (US) LLC. Véase, por ejemplo, la Publicación PCT n.° WO 93/11794 y la Patente de Estados Unidos n.° 5.766.886 (Studnicka); la Patente de Ee .UU n.° 5.770.196 (Studnicka); la Patente de EE.UU n.° 5.821.123 (Studnicka); y la patente de Estados Unidos n.° 5.869.619 (Studnicka).

La humanización de los anticuerpos es rutinaria en la bioingeniería de proteínas. Casi todos los anticuerpos murinos pueden humanizarse mediante el injerto de CDR, lo que da como resultado la conservación de la unión del antígeno. Véase, por ejemplo, Lo, Benny, K. C., editor, en Antibody Engineering: Methods and Protocols, vol. 248, Humana Press, Nueva Jersey, 2004.

En alguna divulgación del presente documento, los anticuerpos son antagonistas. Como se usa en el presente documento, un "antagonista" en referencia a un anticuerpo anti-PD-1 significa un anticuerpo que inhibe la vía de señalización de la PD-1 en una célula (por ejemplo, una célula inmunitaria). Un anticuerpo anti-PD-1 antagonista podría inhibir la vía de señalización de la PD-1 bloqueando la interacción PD-1/PD-L1 o PD-1/PD-L2, pero no necesariamente lo hace.

En alguna divulgación del presente documento, los anticuerpos son agonistas. Como se usa en el presente documento, un "agonista" en referencia a un anticuerpo anti-PD-1 significa un anticuerpo que activa la vía de señalización de la PD-1 en una célula (por ejemplo, una célula inmunitaria). Un anticuerpo agonista podría influir en la interacción PD-1/PD-L1 y/o PD-1/PD-L2, pero no necesariamente lo hace.

Un anticuerpo que se une a la PD-1 e inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo que contiene una o más secuencias divulgadas en el presente documento está dentro del alcance de la divulgación. En cierta divulgación del presente documento, el anticuerpo inhibe competitivamente la unión del anticuerpo que comprende una HCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 20 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 53 (246A10); una HCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 25 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 45 (413E1); una ^hC^v R que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 22 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 51 (413D2); una HCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 18 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 47 (388D4); una HCVR que tiene la secuencia expuesta en el ^s E^q ID NO: 1 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 28 (244C8). En alguna divulgación del presente documento, el anticuerpo también se une a una secuencia de la PD-1 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 54-84.

Los métodos para determinar si dos o más anticuerpos compiten por unirse al mismo objetivo son conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede usarse un ensayo de unión competitiva, o de competición, para determinar si un anticuerpo bloquea la unión de otro anticuerpo al objetivo. Normalmente, un ensayo de competición implica el uso de un antígeno objetivo purificado (por ejemplo, PD-1) unido a un sustrato sólido o expresado en células, una molécula de unión de ensayo no marcada (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1 de prueba) y una molécula de unión de referencia marcada (por ejemplo, un anticuerpo divulgado en el presente documento). La inhibición competitiva se mide determinando la cantidad de marcador unido al sustrato sólido o a las células en presencia de la molécula de ensayo. Generalmente (pero no necesariamente) la molécula está presente en un exceso de al menos dos veces. Un anticuerpo analítico compite con el anticuerpo o ligando de referencia (por ejemplo, PD-L1 o PD-L2) por la unión específica al antígeno si un exceso de un anticuerpo inhibe la unión del otro anticuerpo o ligando en al menos un 50 %, medido en un ensayo de competición.

En un ensayo de competición ilustrativo, un anticuerpo anti-PD-1 de referencia (por ejemplo, un anticuerpo divulgado en el presente documento) es biotinilado usando reactivos disponibles en el mercado. El anticuerpo de referencia biotinilado se mezcla con diluciones en serie del anticuerpo analítico o del anticuerpo de referencia no marcado (control de autocompetición), dando como resultado una mezcla de diversas proporciones molares del anticuerpo analítico (o anticuerpo de referencia no marcado) con respecto al anticuerpo de referencia marcado. La mezcla de anticuerpos se añade a una placa de ELISA recubierta de PD-1. Después, la placa se lava y se añade peroxidasa de rábano picante (HRP)-estreptavidina a la placa como reactivo de detección. La cantidad de anticuerpo de referencia marcado unido al antígeno objetivo se detecta tras la adición de un sustrato cromógeno (por ejemplo, TMB (3,3',5,5'-tetrametilbencidina) o ABTS (2,2"-azin-di-(3-etilbenztiazolin-6-sulfonato)), que se conocen en la técnica. Las lecturas de la densidad óptica (unidades de DO) se miden usando un espectrofotómetro. Las unidades de DO correspondientes a un porcentaje de inhibición de cero se determinan a partir de los pocillos sin anticuerpo competidor. Las unidades de DO correspondientes a un 100% de inhibición, es decir, la base del ensayo, se determinan a partir de los pocillos sin ningún anticuerpo de referencia marcado ni anticuerpo analítico. El porcentaje de inhibición del anticuerpo de referencia marcado frente a la PD-1 por parte del anticuerpo analítico (o el anticuerpo de referencia no marcado) en cada concentración se calcula como sigue: % de inhibición = (1-(unidades de DO -100 % de inhibición)/(0 % de inhibición - 100 % de inhibición))*100. Las personas expertas en la materia apreciarán que el ensayo de competición puede realizarse usando diversos sistemas de detección conocidos en la técnica. Los anticuerpos identificados mediante el ensayo de competición (por ejemplo, los anticuerpos competidores) incluyen anticuerpos que se unen al mismo epítopo, o a epítopos similares (por ejemplo, solapantes), como anticuerpo de referencia. Además, el ensayo de competición puede identificar los anticuerpos que se unen a un epítopo adyacente lo suficientemente próximo al epítopo unido por el anticuerpo de referencia para que se produzca un impedimento estérico.

Dos anticuerpos se unen el mismo epítopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoácido en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo al antígeno, reducen o eliminan la unión del otro. Dos anticuerpos se unen a epítopos solapantes si únicamente un subconjunto de las mutaciones de aminoácidos que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo al antígeno, reducen o eliminan la unión del otro.

Un ensayo de competición puede realizarse en ambas direcciones para asegurar que la presencia del marcador no interfiere ni inhibe la unión de otro modo. Por ejemplo, en la primera dirección, el anticuerpo de referencia está marcado y el anticuerpo analítico no está marcado, y en la segunda dirección, el anticuerpo analítico está marcado y el anticuerpo de referencia no está marcado.

La presente divulgación proporciona un método para aumentar la función efectora de los linfocitos T, que comprende poner en contacto un linfocito T con una combinación de: (a) una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PD-1 que inhibe competitivamente la unión del PD-L1 o el PD-L2 a la PD-1 expresada en la superficie del linfocito T; y (b) una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PD-1 que no inhibe competitivamente la unión del PD-L1 o el PD-L2 a la PD-1 expresada en la superficie del linfocito T. En alguna divulgación del presente documento, el aumento de la función efectora de los linfocitos T incluye, por ejemplo, un aumento en la secreción de citocinas efectoras, como se demuestra en el presente documento.

En alguna divulgación del presente documento, el linfocito T se pone en contacto con la combinación de anticuerpos in vivo. Por ejemplo, en cierta divulgación del presente documento, el linfocito T se pone en contacto con la combinación en un paciente humano que necesita aumentar la función efectora de los linfocitos T.

En alguna divulgación del presente documento, la presente divulgación también proporciona un método para aumentar la función efectora de los linfocitos T, que comprende poner en contacto un linfocito T con un anticuerpo anti-PD-1 que no inhibe competitivamente la unión del PD-L1 o el PD-L2 a la PD-1 expresada en la superficie del linfocito T. En cierta divulgación del presente documento, el linfocito T se pone en contacto con un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada que tiene regiones determinantes de la complementariedad (CDR) seleccionadas del grupo que consiste en las CdR 1-3 del SEQ ID NO: 85, las CDR 1-3 del s Eq ID NO: 86 y las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 87; y una región variable de la cadena ligera que tiene las CDR seleccionadas del grupo que consiste en las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 91, las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 92 y las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 93. En alguna divulgación del presente documento, el linfocito T se pone en contacto con un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 85, 86 y 87, y una región variable de la cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 91, 92 y 93. En cierta divulgación del presente documento, el linfocito T se pone en contacto con un anticuerpo que se selecciona del grupo que consiste en el anticuerpo 244C8-1, el anticuerpo 244C8-2 y el anticuerpo 244C8-3.

La presente divulgación proporciona un método para aumentar la secreción de linfocitos de una citocina seleccionada del grupo que consiste en IL-6, IL-12, IL-18, TNF-a, IL-1p y GM-CSF en un paciente humano que necesita una función efectora aumentada de los linfocitos T, que comprende la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-PD-1 que no inhibe de manera competitiva la unión del PD-L1 o el PD-L2 a la PD-1 expresada en la superficie de un linfocito T. En cierta divulgación del presente documento, al paciente se le administra un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada que tiene regiones determinantes de la complementariedad (CDR) seleccionadas del grupo que consiste en las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 85, las CDR 1-3 del S^eQ ID NO: 86, y las C^d R 1-3 del SEQ ID NO: 87; y una región variable de la cadena ligera que tiene las CDR seleccionadas del grupo que consiste en las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 91, las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 92 y las CDR 1-3 del SEQ ID NO: 93. En alguna divulgación del presente documento, al paciente se le administra un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 85, 86 y 87, y una región variable de la cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 91, 92 y 93. En cierta divulgación del presente documento, al paciente se le administra un anticuerpo que se selecciona del grupo que consiste en el anticuerpo 244C8-1, el anticuerpo 244C8-2 y el anticuerpo 244C8-3.

En alguna divulgación del presente documento, la presente divulgación también proporciona un método de tratamiento del cáncer en un mamífero, que comprende poner en contacto un linfocito T en un mamífero que lo necesite con una combinación de: (a) una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PD-1 que inhibe competitivamente la unión del PD-L1 o el PD-L2 a la PD-1 expresada en la superficie del linfocito T; y (b) una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PD-1 que no inhibe competitivamente la unión del PD-L1 o el PD-L2 a la PD-1 expresada en la superficie del linfocito T.

El método de tratamiento del cáncer con una combinación de anticuerpos anti-PD-1 divulgado actualmente puede usarse para tratar varios tipos de cáncer. En alguna divulgación del presente documento, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en: melanoma, cáncer de riñón, cáncer de próstata, adenocarcinoma pancreático, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de esófago, carcinoma epidermoide de cabeza y cuello, cáncer de hígado, cáncer de ovario, cáncer de cuello de útero, cáncer de tiroides, glioblastoma, glioma, leucemia y linfoma. En alguna divulgación del presente documento, el anticuerpo anti-PD-1 que inhibe competitivamente la unión del PD-L1 o el PD-L2 a la PD-1 expresada en la superficie de un linfocito T se selecciona del grupo que consiste en: 388D4, nivolumab, pembrolizumab, EH12.2H7 y J105. En alguna divulgación del presente documento, el anticuerpo anti-PD-1 que inhibe competitivamente la unión del PD-L1 o el PD-L2 a la PD-1 expresada en la superficie de un linfocito T es el 388D4.

En alguna divulgación del presente documento, el anticuerpo anti-PD-1 que no inhibe competitivamente la unión del PD-L1 o el PD-L2 a la PD-1 expresada en la superficie de un linfocito T es el 244C8. En alguna divulgación del presente documento, el anticuerpo anti-PD-1 que no inhibe competitivamente la unión del PD-L1 o el PD-L2 a la PD-1 expresada en la superficie del linfocito T se une a una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos: el SEQ ID NO: 74, el SEQ ID NO: 77, el SEQ ID NO: 80, el SEQ ID NO: 83 y el SEQ ID NO: 84. En alguna divulgación del presente documento, el anticuerpo anti-PD-1 se une a todas las siguientes secuencias de aminoácidos: el SEQ ID NO: 74, el SEQ ID NO: 77, el SEQ ID NO: 80, el SEQ ID NO: 83 y el SEQ ID NO: 84. En alguna divulgación del presente documento, el anticuerpo anti-PD-1 que no inhibe competitivamente la unión del PD-L1 o el PD-L2 a la PD-1 expresada en la superficie del linfocito T se une a un epítopo de la PD-1 unido por el 244C8. En alguna divulgación del presente documento, el anticuerpo anti-PD-1 que no inhibe competitivamente la unión del PD-L1 o el PD-L2 a la PD-1 expresada en la superficie del linfocito T compite con el 244C8 por la unión a la PD-1.

El método de tratamiento del cáncer divulgado actualmente con un anticuerpo anti-PD-1 que inhibe competitivamente la unión del PD-L1 o el PD-L2 a la PD-1 expresada en la superficie de los linfocitos T, y una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PD-1 que no inhibe competitivamente la unión del PD-L1 o el PD-L2 a la PD-1 expresada en la superficie de los linfocitos T, aumenta la función efectora de los linfocitos T en mayor medida que una cantidad equivalente de cualquiera de los anticuerpos anti-PD-1 por separado. En alguna divulgación del presente documento, la combinación produce un efecto aditivo en la función efectora de los linfocitos T. En alguna divulgación del presente documento, la combinación produce un efecto sinérgico en la función efectora de los linfocitos T.

La presente divulgación proporciona ácidos nucleicos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una VHCR y/o una LCVR divulgadas en el presente documento, o un fragmento de las mismas. Un ácido nucleico de acuerdo con la presente divulgación puede comprender ADN o ARN y puede ser total o parcialmente sintético. Por ejemplo, Las moléculas de ADN que codifican una HCVR y/o una LCVR divulgadas en el presente documento pueden sintetizarse químicamente. Las moléculas de ADN sintético pueden ser ligadas a otras secuencias de nucleótidos apropiadas, que incluyen, por ejemplo, las secuencias codificantes de la región constante y las secuencias de control de la expresión, para producir construcciones de expresión génica convencionales que codifican los anticuerpos deseados. La producción de construcciones génicas definidas está en la pericia rutinaria de la técnica. Alternativamente, las secuencias de nucleótidos pueden clonarse a partir de hibridomas, por ejemplo, mediante técnicas de hibridación convencionales o técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), usando sondas o cebadores sintéticos de ácidos nucleicos cuyas secuencias se basan en la información de la secuencia proporcionada en el presente documento, o información de la secuencia conocida relativa a los genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos murinos en células de hibridoma.

Las técnicas y los protocolos de la bioingeniería y la producción de ácidos nucleicos son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, segunda edición, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992.

Una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo de la divulgación puede unirse operativamente a un promotor para efectuar la expresión del anticuerpo en una célula hospedadora. La secuencia puede incluir en su extremo 5' una secuencia líder para facilitar la expresión en una célula hospedadora y/o la secreción del anticuerpo desde una célula hospedadora. En la técnica se conocen las secuencias líder adecuadas, y pueden ser seleccionadas por el experto, teniendo en cuenta la célula hospedadora.

En alguna divulgación del presente documento, la molécula de ácido nucleico se incorpora en un vector. Los vectores adecuados que contienen las secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias, según sea apropiado, pueden obtenerse comercialmente o ser construidos por personas expertas en la materia. Para más detalles, véase, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2a edición, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Algunos ejemplos de vectores incluyen plásmidos, fagos, fagémidos y cósmidos, así como casetes de transcripción y de expresión.

Los ácidos nucleicos que codifican una HCVR y/o una LCVR divulgados en el presente documento pueden incorporarse (ligarse) en vectores de expresión, que pueden ser introducidos en células hospedadoras a través de técnicas convencionales de transfección o de transformación. Por consiguiente, una célula hospedadora puede transformarse con un vector de expresión que comprenda una secuencia de nucleótidos que codifique una VHCR y/o una LCVR, o un fragmento de las mismas. Algunos ejemplos de células hospedadoras incluyen células de E. coli, células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñón embrionario humano 293 (HEK 293), células HeLa, células renales de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS) y células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2).

Los métodos para producir una VHCR y/o una LCVR, o un fragmento de las mismas, divulgados en el presente documento, están dentro del alcance de la divulgación. En alguna divulgación del presente documento, el método comprende: (a) cultivar una célula hospedadora que contiene un vector de expresión que codifica la HCVR y/o la LCVR en unas condiciones tales que la célula hospedadora exprese el anticuerpo que comprende la HCVR y/o la LCVR, o un fragmento de las mismas; y (b) aislar el anticuerpo que comprende el VHCR y/o la LCVR, un fragmento de las mismas.

Las condiciones adecuadas para la expresión de anticuerpos y su aislamiento o purificación dependen del sistema de expresión empleado. Por ejemplo, si se va a expresar un gen en E. coli, en primer lugar se clona en un vector de expresión posicionando el gen genomanipulado secuencia abajo de un promotor bacteriano adecuado, por ejemplo, Trp o Tac, y una secuencia señalizadora procariota. La proteína secretada expresada se acumula en cuerpos refringentes o de inclusión, y puede ser recogida después de la disrupción de las células con una prensa francesa o la aplicación de ultrasonidos. Después, los cuerpos refringentes se solubilizan y las proteínas se repliegan y se escinden mediante métodos conocidos en la técnica.

Si el gen genomanipulado va a ser expresado en células hospedadoras eucariotas, por ejemplo, células CHO (de ovario de hámster chino), en primer lugar se inserta en un vector de expresión que contiene un promotor eucariota adecuado, una señal de secreción, una secuencia de poli A y un codón de detención. Opcionalmente, el vector o la construcción génica contienen potenciadores e intrones. Este vector de expresión contiene opcionalmente secuencias que codifican toda o parte de una región constante, permitiendo que la totalidad, o una parte de, una cadena pesada o ligera sea expresada. La construcción génica puede ser introducida en células hospedadoras eucariotas usando técnicas convencionales. Las células hospedadoras expresan fragmentos VL o VH, heterodímeros VL-VH, polipéptidos de cadena simple VH-VL o ^v L-VH, cadenas pesadas o ligeras completas de inmunoglobulinas, o porciones de las mismas, cada una de las cuales puede estar unida a un resto que tiene otra función (por ejemplo, citotoxicidad).

En alguna divulgación del presente documento, una célula hospedadora es transfectada con un único vector que expresa un polipéptido que expresa la totalidad, o parte de, una cadena pesada (por ejemplo, una región variable de la cadena pesada) o una cadena ligera (por ejemplo, una región variable de la cadena ligera). En alguna divulgación del presente documento, una célula hospedadora es transfectada con un único vector que codifica (a) un polipéptido que comprende una región variable de la cadena pesada y un polipéptido que comprende una región variable de la cadena ligera, o (b) una cadena pesada completa de una inmunoglobulina y una cadena ligera completa de una inmunoglobulina. En alguna divulgación del presente documento, una célula hospedadora es cotransfectada con más de un vector de expresión (por ejemplo, un vector de expresión que expresa un polipéptido que comprende la totalidad, o parte de, una cadena pesada o una región variable de la cadena pesada, y otro vector de expresión que expresa un polipéptido que comprende la totalidad, o parte de, una cadena ligera o una región variable de la cadena ligera).

Se puede producir un polipéptido que comprenda una región variable de la cadena pesada de una inmunoglobulina o una región variable de la cadena ligera, por ejemplo, mediante el cultivo de una célula hospedadora transfectada con un vector de expresión que codifica dicha región variable, en unas condiciones que permitan la expresión del polipéptido. Después de la expresión, el polipéptido puede ser recogido y purificado o aislado usando técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo, etiquetas de afinidad como la proteína A, la proteína G, la glutatión-S-transferasa (GST) o etiquetas de histidina.

Los anticuerpos de la presente divulgación se pueden producir cultivando una célula hospedadora transfectada con, por ejemplo: (a) un vector de expresión que codifica una cadena pesada completa o parcial de una inmunoglobulina, y un vector de expresión aparte que codifica una cadena ligera completa o parcial de una inmunoglobulina; o (b) un único vector de expresión que codifica ambas cadenas (por ejemplo, la cadena pesada y ligera completa o parcial), en unas condiciones que permitan la expresión de ambas cadenas. El anticuerpo intacto (o el fragmento de unión al antígeno) puede ser recogido y purificado o aislado usando técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo, la proteína A, la proteína G, etiquetas de afinidad tales como la glutatión-S-transferasa (GST) o etiquetas de histidina. Está en la pericia habitual de la técnica expresar la cadena pesada y la cadena ligera a partir de un único vector de expresión o a partir de dos vectores de expresión individuales.

En alguna divulgación del presente documento, los anticuerpos anti-PD-1 están unidos a una molécula o resto funcional diferente, por ejemplo, un péptido, una proteína, una toxina, un radioisótopo o un agente citostático, para diversos fines, tales como la obtención de imágenes de diagnóstico in vivo o un ensayo de diagnóstico. Los anticuerpos pueden unirse mediante reticulación química o por métodos recombinantes. Los anticuerpos también pueden unirse a cualquiera de los diversos polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera expuesta en las Patentes de Estados Unidos n.° 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192; o 4.179.337. Los anticuerpos pueden modificarse químicamente mediante conjugación covalente con un polímero, por ejemplo, para aumentar su semivida en circulación. Algunos ejemplos de polímeros y de métodos para uniros se describen en los documentos de Patente de Estados Unidos n.° 4.766.106; 4.179.337; 4.495.285; y 4.609.546.

Formulaciones farmacéuticas

En alguna divulgación del presente documento, los anticuerpos se formulan en composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración a un mamífero, por ejemplo, un paciente humano. Las composiciones comprenden normalmente uno o más anticuerpos de la presente divulgación y un excipiente farmacéuticamente aceptable. La expresión "excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye los adecuados disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y agentes antifúngicos, agentes isotónicos y agentes retardantes de la absorción, y similares, que sean compatibles con la administración farmacéutica. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica. Las composiciones también pueden contener otros compuestos activos que proporcionan funciones terapéuticas suplementarias, adicionales o mejoradas. Las composiciones farmacéuticas pueden estar incluidas en un recipiente, un paquete o un dispensador junto con instrucciones para su administración.

Una composición farmacéutica de la divulgación se formula para que sea compatible con su vía de administración prevista. Los métodos para lograr la administración son conocidos en la técnica. La administración puede ser, por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intracavitaria, subcutánea, intradérmica, tópica, por inhalación, transmucosa, rectal o transdérmica.

Las soluciones o suspensiones usadas para aplicación intradérmica o subcutánea incluyen, normalmente, uno o más de los siguientes componentes: un diluyente estéril, tal como agua para inyección, solución salina, aceites no volátiles, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes tales como EDTA; tampones, tales como acetatos, citratos o fosfatos; y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, según sea necesario. Dichas preparaciones pueden introducirse en ampollas, jeringas desechables o viales multidosis hechos de vidrio o plástico. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para inyección incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. La esterilización puede conseguirse, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estéril. Para la administración por vía intravenosa, algunos portadores adecuados incluyen, por ejemplo, solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). Preferentemente, la composición farmacéutica es estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y debe preservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. Se puede evitar la presencia de microorganismos mediante la inclusión de agentes antibacterianos y/o antifúngicos. Algunos ejemplos incluyen: parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, tiomersal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol y cloruro sódico en la composición. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, polioles tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido y similares, y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de una dispersión y/o mediante el uso de tensioactivos. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede lograrse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio o gelatina.

Las composiciones orales incluyen generalmente un diluyente inerte o un portador comestible. Pueden introducirse en cápsulas de gelatina o comprimirse en comprimidos. Para la administración por vía oral, los anticuerpos pueden combinarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, pastillas o cápsulas.

Para la administración por vía transmucosa o transdérmica, en la formulación pueden usarse penetrantes apropiados para la barrera que van a atravesar. Dichos penetrantes se conocen en la técnica, e incluyen, por ejemplo, detergentes, sales biliares y derivados del ácido fusídico. La administración por vía transmucosa puede conseguirse, por ejemplo, mediante el uso de tabletas, aerosoles nasales, inhaladores o supositorios. Por ejemplo, en el caso de los anticuerpos que comprenden la porción Fc, las composiciones pueden ser capaces de transmitirse a través de las membranas mucosas del intestino, la boca o los pulmones (por ejemplo, a través de la vía mediada por el receptor FcRn, como se describe en la Patente de Estados Unidos n.° 6.030.613). Para la administración transdérmica, los compuestos activos pueden formularse en pomadas, bálsamos, geles o cremas, como se conoce generalmente en la técnica. Para la administración por inhalación, los anticuerpos pueden administrarse en forma de pulverización en aerosol desde un recipiente o dispensador presurizado, que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas, tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.

En alguna divulgación del presente documento, los anticuerpos actualmente divulgados se formulan con portadores que protegen al anticuerpo frente a una rápida eliminación del organismo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables y biocompatibles. Algunos polímeros ilustrativos incluyen acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de dichas formulaciones serán evidentes para los expertos en la materia. Las suspensiones liposómicas que contienen los anticuerpos actualmente divulgados también pueden usarse como portadores farmacéuticamente aceptables. Éstos pueden prepararse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos n.° 4.522.811.

En alguna divulgación del presente documento, las composiciones farmacéuticas contienen, además de un anticuerpo de la divulgación, un agente citotóxico, un agente citostático, un agente antiangiogénico, un agente dirigido a un tumor, un agente inmunoestimulante o un agente inmunomodulador, o un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico, citostático o cualquier otro agente tóxico. La composición farmacéutica puede emplearse opcionalmente con otras modalidades terapéuticas, tales como cirugía, quimioterapia y radiación.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de la composición de la divulgación se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o en animales de experimentación, por ejemplo, para determinar la DL⁵⁰ (la dosis letal para el 50 % de la población) y la DE⁵⁰ (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, y puede expresarse como la relación de DL⁵⁰/DE⁵⁰. Se prefieren las composiciones que muestran unos índices terapéuticos grandes.

Se puede estimar inicialmente una dosis terapéuticamente eficaz de un anticuerpo terapéutico, por ejemplo, a partir de ensayos de cultivo celular. Algunos ejemplos de bioensayos adecuados incluyen ensayos de replicación del ADN, ensayos de liberación de citocinas, ensayos basados en transcripción, ensayos de unión PD-1/PD-L1, ensayos de creatina cinasa, ensayos basados en la diferenciación de los preadipocitos, ensayos basados en la captación de glucosa en los adipocitos, ensayos inmunológicos, otros ensayos tales como, por ejemplo, los descritos en los ejemplos. Los datos obtenidos a partir de los ensayos de cultivo celular y de estudios en animales pueden usarse para formular un intervalo de dosificación para usar en seres humanos. Puede formularse una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración plasmática circulante que incluya la CI⁵⁰ (es decir, la concentración del anticuerpo que logra una inhibición semimáxima de los síntomas). Los niveles plasmáticos circulantes pueden medirse, por ejemplo, mediante cromatografía de líquidos de gran rendimiento. Los efectos de cualquier dosis particular pueden ser supervisados mediante un bioensayo adecuado. La posología se encuentra preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes con poca o ninguna toxicidad. La posología puede variar dependiendo de la forma farmacéutica empleada y de la vía de administración.

En general, una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o de una composición descrita en el presente documento está en el intervalo de 0,1 mg/kg a 100 mg/kg, preferentemente de 0,1 mg/kg a 50 mg/kg. La cantidad administrada dependerá de variables tales como el tipo y la magnitud de la enfermedad o la indicación que se va a tratar, el estado de salud general del paciente, la potencia in vivo del anticuerpo, la formulación farmacéutica, la semivida sérica del anticuerpo y la vía de administración.

La frecuencia de administración puede variar, dependiendo de factores tales como la vía de administración, la cantidad de dosis, la semivida sérica del anticuerpo o de la proteína de fusión, y de la enfermedad que se está tratando.

Usos terapéuticos

La divulgación proporciona métodos de tratamiento de enfermedades o trastornos mediados por la PD-1 en un mamífero, por ejemplo, un paciente humano, que comprenden administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo de la presente divulgación a un mamífero que lo necesite. En alguna divulgación del presente documento, el método es un método de tratamiento del cáncer. En alguna divulgación del presente documento, el método es un método de tratamiento de la inflamación. En alguna divulgación del presente documento, el método es un método de tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria, por ejemplo, la enfermedad de Crohn.

Como se usa en el presente documento, "tratar", "tratando" o "tratamiento" significa inhibir o aliviar una enfermedad o un trastorno. Por ejemplo, el tratamiento pueden incluir un aplazamiento del desarrollo de los síntomas asociados a una enfermedad o un trastorno, y/o una reducción de la gravedad de dichos síntomas que se desarrollarán, o se espera que se desarrollen, con dicha enfermedad. Los términos incluyen la mejora de los síntomas existentes, la prevención de síntomas adicionales y el alivio o la prevención de las causas subyacentes de dichos síntomas. Por lo tanto, los términos indican que se está confiriendo un resultado beneficioso a al menos alguno de los mamíferos, por ejemplo, pacientes humanos, que se están tratando. Muchos tratamientos médicos son eficaces para algunos, pero no todos, los pacientes que se someten al tratamiento.

Como se usa en el presente documento, la expresión "cantidad eficaz" significa una cantidad de un anticuerpo anti-PD-1, que, cuando se administra solo o en combinación con un agente terapéutico adicional a una célula, un tejido o un sujeto, es eficaz para lograr el efecto terapéutico o profiláctico deseado en las condiciones de administración. Por ejemplo, una cantidad eficaz es aquella que sería suficiente para aumentar o disminuir la respuesta inmunitaria para lograr la eficacia de una terapia. La eficacia de una terapia (por ejemplo, la activación de una respuesta inmunitaria suprimida o deficiente, el aumento de la actividad citolítica de los linfocitos T, el aumento de la función efectora de los linfocitos T, la alteración de la actividad de la PD-1 asociada a la regulación negativa de la respuesta inmunitaria mediada por los linfocitos T o la reducción del crecimiento tumoral) puede determinarse mediante métodos adecuados conocidos en la técnica.

Cuando se usan para tratar el cáncer, los anticuerpos de la divulgación pueden usarse solos o junto con otro agente terapéutico. Algunos ejemplos de otros agentes terapéuticos incluyen otros inhibidores del punto de control, agentes inmunógenos, células cancerosas atenuadas, antígenos tumorales (por ejemplo, proteínas recombinantes, péptidos y moléculas de carbohidratos), células presentadoras de antígeno, tales como células dendríticas pulsadas con antígeno o ácidos nucleicos derivados de tumores, citocinas inmunoestimulantes (por ejemplo, IL-2, IFNa2, GM-CSF) y células transfectadas con un gen que codifica una citocina inmunoestimulante (por ejemplo, GM-CSF); quimioterapia, radioterapia y cirugía.

En alguna divulgación del presente documento, un anticuerpo de la divulgación se administra a un paciente con cáncer en combinación con otro inhibidor del punto de control. El otro inhibidor del punto de control puede dirigirse contra la PD-1 o contra una molécula del punto de control diferente, por ejemplo, TIM3, CEACAM1, TIGIT, LAG3 o VISTA. El otro inhibidor del punto de control puede ser una molécula pequeña o un anticuerpo monoclonal. Cuando el otro inhibidor del punto de control es un segundo inhibidor de la PD-1, preferentemente, el mecanismo de acción del segundo inhibidor de la PD-1 difiere del mecanismo de acción del primer inhibidor de la PD-1. Por ejemplo, los dos inhibidores de la PD-1 pueden ser dos anticuerpos monoclonales anti-PD-1 que se unen a diferentes epítopos de la molécula PD-1.

Cuando se usan para tratar el cáncer, los anticuerpos de la divulgación pueden usarse solos o en combinación con otros inhibidores del punto de control, agentes antineoplásicos o agentes inmunógenos. Algunos ejemplos incluyen células cancerosas atenuadas, antígenos tumorales (incluyendo, por ejemplo, proteínas recombinantes, péptidos y moléculas de carbohidratos), células presentadoras de antígeno, tales como células dendríticas pulsadas con antígeno o ácidos nucleicos derivados de tumores, citocinas inmunoestimulantes (por ejemplo, IL-2, IFNa2, GM-CSF) y células transfectadas con genes que codifican citocinas inmunoestimulantes (por ejemplo, GM-CSF; tratamientos antineoplásicos, tales como quimioterapia, radioterapia y cirugía).

Para el tratamiento de ciertas enfermedades o trastornos, es deseable disminuir o suprimir la respuesta inmunitaria del paciente, al menos en ciertos tejidos del cuerpo. Dichas enfermedades y trastornos incluyen alergias y diversas enfermedades autoinmunitarias. Algunos ejemplos de enfermedades autoinmunitarias incluyen artritis reumatoide, diabetes sacarina de tipo I, esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn y lupus eritematoso sistémico, tiroiditis de Hashimoto, espondiloartritis anquilosante y enfermedad del injerto contra hospedador (GVHD). También es deseable suprimir la respuesta inmunitaria del paciente para evitar el rechazo del trasplante tras un trasplante de tejido, de piel o de órganos.

En alguna divulgación del presente documento, los anticuerpos anti-PD-1 de la divulgación se administran con uno o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, un agente citotóxico, un agente radiotóxico o un agente inmunosupresor. El anticuerpo puede estar unido al agente (como un inmunocomplejo) o puede administrarse por separado. En alguna divulgación del presente documento, el agente terapéutico adicional es un agente inmunomodulador o un agente anticanceroso (por ejemplo, un antineoplásico). En una administración separada, el anticuerpo se puede administrar antes, después de o simultáneamente con el agente, o puede administrarse conjuntamente con otras terapias conocidas. Las politerapias se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Hardman, et al. (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10a ed, McGraw-Hill, Nueva York, Nueva York; Poole y Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach, Lippincott, Williams y Wilkins, Phila., PA; Chabner y Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams y Wilkins, Filadelfia, PA.

En alguna divulgación del presente documento, un anticuerpo divulgado en el presente documento se usa como agente de direccionamiento para la entrega de una carga farmacoactiva, por ejemplo, una toxina, a una célula que expresa la PD-1. El método incluye la administración de un anticuerpo anti-PD-1 conjugado con un resto de carga farmacoactiva. Los métodos de conjugación adecuados son conocidos en la técnica.

Usos no terapéuticos

En alguna divulgación del presente documento, los anticuerpos de la divulgación se usan con fines no terapéuticos, tales como pruebas y ensayos de diagnóstico. Por ejemplo, la divulgación proporciona un método para diagnosticar una resistencia inmunitaria adaptativa mediada por la PD-1 en un paciente que tiene cáncer. El método comprende poner en contacto un microambiente tumoral del paciente con un anticuerpo divulgado en el presente documento que ha sido marcado con un resto detectable; y la detección de la expresión de la PD-1 en las células inmunitarias, por ejemplo, linfocitos T CD8+; linfocitos B; y macrófagos, dentro del microambiente tumoral.

La resistencia inmunitaria adaptativa incluye la supresión de la respuesta inmunitaria de un hospedador como resultado de la activación de una vía de señalización de la PD-1 en las células inmunitarias del hospedador. Por ejemplo, el tejido canceroso suprime la respuesta inmunitaria de un hospedador mediante la regulación por incremento del PD-L1 y su unión a la PD-1 de las células inmunitarias, en linfocitos T (tales como los linfocitos T CD8+); linfocitos B; y macrófagos.

Un método de diagnóstico que utiliza un anticuerpo de la divulgación para detectar la expresión de la PD-1 también puede comprender un agente para detectar la expresión del PD-L1 en las células inmunitarias dentro del microambiente tumoral. Este método de diagnóstico puede realizarse in vivo o en una muestra de biopsia de un paciente, en donde el microambiente tumoral está presente en una biopsia tumoral.

Las modificaciones de anticuerpos con fines de diagnóstico se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser modificados con un grupo ligando, tal como biotina, o un grupo marcador detectable, tal como un grupo fluorescente, un radioisótopo o una enzima. Los anticuerpos de la divulgación pueden marcarse usando las técnicas convencionales. Algunos marcadores detectables adecuados incluyen: fluoróforos, cromóforos, átomos radiactivos, reactivos densos en electrones, enzimas y ligandos que tienen compañeros de unión específicos. Las enzimas se detectan normalmente por sus productos de reacción. Por ejemplo, la peroxidasa de rábano picante puede detectarse a través de la conversión de la tetrametilbencidina (TMB) en un pigmento azul, cuantificable con un espectrofotómetro. Para la detección, los compañeros de unión adecuados incluyen la biotina y la avidina o la estreptavidina, la IgG y la proteína A, y las numerosas parejas receptor-ligando conocidas en la técnica. Otras permutaciones y posibilidades serán fácilmente apreciables por los expertos habituales en la materia. Los anticuerpos de la divulgación también pueden usarse para detectar la presencia de la PD-1 en muestras biológicas. La cantidad de PD-1 detectada puede correlacionarse con el nivel de expresión de la PD-1, que, a su vez, se correlaciona con el estado de activación de las células inmunitarias, por ejemplo, linfocitos T activados, linfocitos B y monocitos, en el sujeto.

Los métodos de detección que emplean anticuerpos son conocidos en la técnica, e incluyen ELISA, radioinmunoensayo, inmunotransferencia, inmunoelectrotransferencia, inmunofluorescencia y técnicas de inmunoprecipitación. Los anticuerpos de la divulgación pueden proporcionarse en un kit de diagnóstico que incorpore una o más de estas técnicas para detectar la PD-1. Dicho kit puede contener otros componentes, un embalaje, instrucciones o material para ayudar a la detección de la proteína PD-1.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos son meramente ilustrativos y no pretenden limitar el ámbito o el contenido de la invención en modo alguno.

Ejemplo 1. Identificación de anticuerpos PD-1

A. Inmunización de ratones con PD-1

Se inmunizaron ratones hembra Balb/C, C57BL/6 o NZW/B de 4-8 semanas de edad con un régimen convencional de primovacunación/refuerzo empleando mezclas de adyuvantes convencionales. Para las inmunizaciones se usó un dominio extracelular soluble de la PD-1 humana (AA1-167) expresado con una secuencia de polihistidina carboxiterminal (SinoBiological n.° 10377-H08H). Se cebaron cohortes de ratones con 50 |jg de PD-1 recombinante y (1) adyuvante completo de Freund (Sigma-Aldrich n.° 263810) o (2) alhidrogel (Invivogen). Dos o tres semanas después, los animales de cada grupo fueron reforzados con 50 jg de PD-1 soluble con (1) adyuvante de Freund incompleto (Sigma-Aldrich n.° 263910) o (2) alhidrogel. Los títulos séricos se recogieron después de cada refuerzo de antígeno y se analizaron mediante un ELISA para determinar la reactividad y el cambio de clase de isotipo del anticuerpo. La misma proteína utilizada para las inmunizaciones se inmovilizó en placas de ensayo de 96 pocillos (Nunc MAXISORP) a una concentración de 1 jg/ml. A continuación, se analizaron diluciones en serie de los sueros de los animales inmunizados para comprobar su unión a la PD-1.

B. Cribado de anticuerpos según la unión a la PD-1 humana

Se llevaron células, recientes o descongeladas a partir de muestras criopreservadas, de médula ósea, de ganglios linfáticos o del bazo, en un medio de cultivo tisular convencional (RPMI de LifeTech con un 10 % de IgG baja). Las células se examinaron para detectar linfocitos B específicos del antígeno, no estimuladas o estimuladas, usando LPS (Invivogen) a una concentración de 20 ng/ml. Las células, no estimuladas o estimuladas, se cargaron a continuación a una densidad celular estocástica para favorecer la carga de una sola célula por pocillo en las matrices de micropocillos (MWA), como se describe en las Patentes de Estados Unidos n.° 7.776.553 y 8.772.049.

Una superficie de captura funcionalizada, recubierta con dos mezclas de anticuerpos policlonales anti-IgG de ratón (Jackson Immunoresearch n.° 715-005-150, n.° 115-005-146), se usó después para sellar herméticamente la matriz de micropocillos ordenados. Después de dos horas, la o las superficies de captura se extrajeron de los microdispositivos y se procesaron como se ha descrito anteriormente (Ogunnyi et al. Nature Protocols, 2009). La superficie de captura de la micromatriz, que representa una imagen especular de las células en la matriz de micropocillos, contenía la producción secretada por los linfocitos B. Los anticuerpos secretados por los linfocitos B en los nanopocillos y capturados se ensayaron después para determinar la reactividad contra la PD-1 humana, o un antígeno no relacionado, y también se ensayaron para determinar la reactividad de la IgG frente a la IgM (JacksonImmunoresearch n.° 115-005-044, n.° 115-005-164).

Después de escanear las micromatrices de proteínas, los posibles clones de anticuerpos con la especificidad y la clase de isotipo del anticuerpo deseadas se identificaron bioinformáticamente mediante métricas de calidad de datos convencionales. De acuerdo con los métodos descritos anteriormente (Ogunnyi et al., Vaccine 2014), las imágenes de las micromatrices se analizaron usando el programa informático GenePix de Molecular Devices. Se analizaron las características de la micromatriz para detectar falsos positivos, la covarianza y las relaciones señal-ruido. Las características con los atributos correctos, por ejemplo, específico para la PD-1 y la IgG, se seleccionaron para la recuperación celular. Esta lista de selección automatizada se generó entonces a partir de 4 a 12 microdispositivos, y las células que habían secretado anticuerpos con las características deseadas se aislaron a partir de los microdispositivos y se colocaron en placas de ensayo de microtitulación SBS convencionales para un procesamiento adicional.

C. Aislamiento de los anticuerpos que se unen a la PD-1

Las células disociadas productoras de anticuerpos identificadas a partir del cribado se usaron para la biología molecular unicelular con objeto de aislar las secuencias genéticas que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos (Tiller et al, J. Immunol. Methods 350: 183-93 (2009)). Los genes que codifican los anticuerpos específicos que reconocen la PD-1 humana se recuperaron usando una RT-PCR de células disociadas. Las células recuperadas se colocaron en un tampón de transcripción inversa, y se retrotranscribió el ARNm de cada célula individual (LifeTech SuperScript III) en ADNc. Después de generar estos amplicones mediante la o las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) anidadas convencionales, estos amplicones se sometieron a una secuenciación directa. Tras el análisis con el programa informático Phred usando un valor de corte Phred 0,05, las secuencias se subclonaron en PCR 2.1 (LifeTech) o en otros vectores convencionales para una propagación adicional. Phred es un programa informático que lee archivos de trazas de secuenciación de ADN, nombra las bases, y asigna un valor de calidad a cada base nombrada. Véase, por ejemplo, Ewing y Green, Genome Research 8: 186-94 (1998).

A continuación, estas secuencias de ADN se filtraron bioinformáticamente para comprobar la calidad de la secuencia y se organizaron en una base de datos de secuencias para el análisis cladístico (distancia o parsimonia), para identificar cuántos clados de anticuerpos únicos se aislaron que reconocen la PD-1. Estos análisis identificaron aproximadamente 20 clados (grupos) únicos de secuencias que reconocen la PD-1 humana.

D. Construcción del anticuerpo

Las regiones variables completas de los anticuerpos, que comprenden un par de regiones variables de las cadenas pesada y ligera (tablas 1 y 2), se reformularon en plásmidos con los elementos adecuados para la expresión ectópica transitoria en líneas celulares de mamíferos, por ejemplo, HEK293 o CHO, usando técnicas de biología molecular convencionales. Por ejemplo, las secuencias del ADNc de la variable pesada (VH) y de la variable ligera (VL) se subclonaron en el esqueleto vectorial pFUSE-CHIg-mG1 (InVivoGen), que contiene una secuencia señalizadora de la IL2, así como un dominio Fc murino dentro del marco. Se diseñó una secuencia consenso verificada para cada gen de VH y VL del anticuerpo, usando cebadores de la PCR, con sitios de restricción. A continuación, el vector de expresión elegido y los amplicones de la PCR se digirieron con enzimas de restricción y se ligaron juntos para la transformación de E. coli. Se verificó la secuencia de los clones de expresión resultantes. Las secuencias de las regiones variables individuales de la cadena pesada y de la cadena ligera se muestran en la FIG. 1 (HCVR) y en la FIG. 2 (LCVR). Se indican las regiones determinantes de complementariedad (CDR) y las regiones marco (FR). Las tablas 1 y 2 indican cada HCVR o LCVR por el nombre del clon y el correspondiente identificador de secuencia. Las secuencias correspondientes se muestran en las FIG. 1 y 2.

Tabla pesada

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Tabla 2. D in i n i nifi r l ni l r in vri l l n ligera

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Ejemplo 2. Caracterización de anticuerpos

A. Confirmación de aciertos y especificidad

Se usaron sobrenadantes de líneas celulares de mamífero transfectadas temporalmente para comprobar la expresión de las inmunoglobulinas (Ig), la especificidad del antígeno y la afinidad del antígeno. Estos ensayos estaban basados en un ELISA, usando reactivos que reconocen la IgG, así como el ECD soluble de la PD-1 como un Fc-proteína de fusión (SinoBiological "CD279-Fc"). Mientras que el inmunógeno de cribado era la forma soluble de la PD-1, la forma usada para la confirmación de la unión era una proteína de fusión que comprendía el ECD de la PD-1 humana con un dominio Fc humano. Como controles de especificidad se usaron otras proteínas del punto de control inmunitario en las mismas configuraciones bioquímicas, por ejemplo, CD28, GITr . Las proteínas se inmovilizaron en pocillos de una placa de ensayo de 96 pocillos (Nunc mAx ISORB) y se usaron los sobrenadantes de las células HEK293 transfectadas para evaluar la unión de los anticuerpos anti-PD-1 reformateados, producidos como se describió anteriormente. Estos experimentos permitieron determinar la especificidad y la afinidad de la unión.

La FIG. 3 muestra un ejemplo de ensayo de unión basado en un ELISA. Se emparejaron varios VH y VK para obtener 32 clones (los emparejamientos de clones se muestran en el recuadro de la FIG. 3), que se expresaron en células HEK293 y se analizó su unión a la PD-1-HIS(marcador). Los resultados representan un promedio de dos experimentos.

B. Unión celular

También se utilizaron anticuerpos recombinantes procedentes de sobrenadantes cultivados en estudios de unión basados en células. Se transfectaron células HEK293 (Qiagen, SuperFect) con plásmidos de expresión que codificaban las cadenas pesadas y ligeras de Ig de los anticuerpos anti-PD-1. Después de 3-5 días, se recogieron los anticuerpos recombinantes de los sobrenadantes de las células transfectadas. Para los estudios de confirmación de la unión celular se utilizaron células HEK293 estables que expresaban PD-1 humana o células primarias. Se evaluó la unión de los anticuerpos de los sobrenadantes cultivados a la superficie celular de la PD-1 utilizando un anticuerpo IgG de ratón (policlonal) marcado con fluorescencia (Jackson Immunoresearch).

Los estudios de microscopía de fluorescencia revelaron que varios anticuerpos anti-PD-1 obtenidos de los sobrenadantes de transfección se unían a la PD-1 expresada en la superficie de las células HEK293. La unión de cuatro anticuerpos anti-PD-1 de ratón, incluido 100244_C7VH10_100245_C8VK5m1 (que comprende la HCVR correspondiente a el SEQ ID NO: 4 y la LCVR correspondiente a el SEQ ID NO: 27), se detectó con anticuerpo antik-PE de ratón (anticuerpo secundario). De manera similar, en un estudio aparte, la unión de cuatro anticuerpos anti-PD-1 de ratón, incluido 100392_C5VH6_100393_C5VK7, que comprende la HCVR correspondiente a el SeQ ID NO: 9 y la LCVR correspondiente a el SEQ ID NO: 38, se detectaron con anticuerpo anti-IgG1 de ratón-AF488 (anticuerpo secundario). En ambos estudios, se utilizaron como controles el anticuerpo anti-PD-1 de ratón disponible comercialmente y el control de isotipo IgG1 de ratón anti-PD-1. La tabla 3 resume los resultados de las pruebas de unión de varios anticuerpos anti-PD-1 a la PD-1 expresada en la superficie de las células HEK293. La unión fuerte se indica como "+++", la unión media se indica como "++" y la unión débil se indica como "+".

Tabla 3. Resumen de la unión de los mAb de PD-1 a la PD-1 ex resada en la su erficie celular

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C. Actividad basada en células

Se seleccionaron anticuerpos que reconocen a PD-1 con alta afinidad para utilizarlos en ensayos basados en células para probar la actividad agonista y antagonista. Utilizando condiciones estándar de activación ex vivo con células humanas primarias, se utilizaron anticuerpos anti-PD-1 seleccionados para los ensayos basados en células en dispositivos de matriz de micropocillos, usando condiciones que han sido previamente caracterizadas (véase, por ejemplo, Varadarajan et al., 2012, Proc. Nati Acad. Sci. 109:3885-3890) para evaluar los efectos de estos anticuerpos en la función de las células efectoras.

En estos estudios se utilizaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas de donantes no identificados a través de una fuente comercial. Las PBMC se colocaron en pocillos de una placa de ensayo de 96 pocillos previamente recubiertos con anti-CD3 unido a la placa (OKT3) a una concentración de 1 pg/ml. Además de la estimulación mediada por el TCR, las células se trataron con PBS (control), PD-L1 humana recombinante soluble (shPD-L1) (SinoBiological) a 20 pg/ml, o shPD-L1 con anticuerpo anti-PD-1 (10 pg/ml). La proliferación celular se analizó mediante ELISA para lL-2 (R&D Systems, n.° D2050) en el sobrenadante de los cultivos celulares, o mediante la medición directa del IFNy secretado a nivel de una sola célula (Varadarajan, anteriormente citado) utilizando dispositivos de matriz de micropocillos.

La FIG. 4 resume los resultados de los ensayos para medir la eficacia de los anticuerpos anti-PD-1 en el alivio de la inhibición de la activación de las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) dependiente de PD-L1. Los tratamientos de las células se llevaron a cabo en placas de 96 pocillos durante 3-5 días. Todos los tratamientos incluyeron CD3 unido a la placa y CD28 soluble en medios convencionales. Las células se trataron adicionalmente sin nada (control positivo); solo con PD-L1; o con PD-L1 más un anticuerpo anti-PD-1 (EH12.2H7 (BioLegend Products, San Diego, CA), j 105 (eBioscience, San Diego, CA), pembrolizumab, 246A10 o 244C8). Al final del período de tratamiento, se transfirieron a un dispositivo de matriz de micropocillos para la determinación del IFNy a nivel de células individuales, con poblaciones celulares de muestra en el intervalo de aproximadamente 50­ 100 células. Los resultados mostrados en la FIG. 4 ilustran el antagonismo de la actividad de PD-1 por los anticuerpos anti-PD-1. Estos anticuerpos anti-PD-1 bloquearon el efecto inhibidor de PD-L1, disminuyendo de este modo la inhibición de la respuesta inmunitaria celular mediada por PD-1/PD-L1 (o PD-1/PD-L2).

D. Diferencial de activación de linfocitos T

En un primer tipo de ensayo de activación celular, se analizaron células mononucleares de sangre periférica humanas de origen comercial (Research Blood Components, Allston, MA) mediante citometría de flujo para comprobar la activación diferencial de los linfocitos T en respuesta al bloqueo de PD-1 por diferentes anticuerpos anti-PD-1 in vitro. Se utilizaron CD4 y CD8 como marcadores de linfocitos T. El grado relativo de activación de los linfocitos T se dedujo a partir de la medición de la producción de las citocinas efectoras, interferón gamma (IFN^y) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNFa). Los experimentos se llevaron a cabo esencialmente como sigue. Se incubaron entre 500.000 y 750.000 PBMC durante tres días en presencia de 1 pg/ml de anti-CD3 (clon HIT3a), 50 ng/ml de anti-CD28 (clon CD28.2) y 20 pg/ml de anticuerpo anti-PD-1 o control de isotipo. Al final del periodo de incubación de 3 días, se trataron con brefeldina A durante 6 horas y luego se sometieron a una tinción extracelular para CD4, CD8, CD69, CD25, PD-L1 u otros marcadores extracelulares conjugados con fluoróforos. A continuación, las células se fijaron, se permeabilizaron y se tiñeron para los marcadores intracelulares, incluido el IFN^y (clon de anticuerpo 4S.B3). Los datos se recogieron mediante citometría de flujo utilizando un citómetro de flujo FACSCALIBUR™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), y se analizaron con el programa informático FLOW-JO™ (FlowJo, LLC, Ashland, OR). Los anticuerpos probados fueron pembrolizumab, clon EH12.2H7 (BioLegend), y los anticuerpos anti-PD-1 388D4, 413E1, 246A10 y 244C8 de la presente divulgación. En condiciones de activación subóptima (conseguida por el tratamiento con anti-CD3 y anti-CD28), que puede imitar las condiciones de activación que se dan in vivo, los anticuerpos 388D4, 413E1,246A10 y 244C8 en estas pruebas provocaron niveles de secreción similares o aumentaron los niveles de secreción de IFNy y TNFa, en comparación con EH12.2H7 o pembrolizumab (tabla 4). Los datos en la tabla 4 se comparan gráficamente en la FIG. 5.

Tabla 4. Resumen de la activación diferencial de linfocitos T en respuesta al bloqueo de PD-1 por diferentes anticuer os anti-PD-1

En un segundo conjunto de experimentos, las PBMC humanas se sometieron a pruebas de reactividad en ensayos de retirada de antígenos usando CMV (citomegalovirus) (IMMUNOSPOT®, Shaker Heights, OH). Las PBMC se purificaron a partir de sangre total de donantes sanos (Research Blood Components, Allston, MA). Las PBMC se incubaron con soluciones de antígenos péptidos listas para usar (Astarte Biologics, Bothell, WA) sin o con anticuerpos anti-PD-1. Se utilizaron dos anticuerpos anti-PD-1 en fase comercial, pembrolizumab y nivolumab, como puntos de referencia para este experimento. En comparación con los controles de isotipo de los anticuerpos, los anticuerpos anti-PD-1 inducen un aumento de los niveles de IFNy, una citocina efectora clave en la biología del recuerdo antigénico de los linfocitos T (FIG. 6).

En un tercer conjunto de experimentos, los anticuerpos anti-PD-1 se utilizaron con PBMC en ensayos de MLR (reacción de linfocitos mixtos). En estos ensayos, la secreción de IL-2 o IFNy fue la lectura experimental de citocinas (FIG. 7A). También se evaluaron marcadores de activación, tales como el CD25 (FIG. 7B). Los resultados se resumen en las FIG. 7A y 7B. En este ensayo, el clon 388D4 parece inducir la liberación de citocinas y la regulación de CD25 de forma similar al nivolumab. En múltiples ensayos, el clon 244C8 parece inducir mayores niveles de liberación de citocinas (IFNy) en comparación con 388D4 o nivolumab. Los linfocitos T incubados con 244C8 también parecen mostrar un mayor grado de activación, como se deduce de la expresión de CD25 (FIG. 7B).

Estos datos indican que algunos de los anticuerpos anti-PD-1 de la presente divulgación, por ejemplo, 388D4, inducen un aumento de la liberación de citocinas de forma similar a pembrolizumab y nivolumab, mientras que otros anticuerpos, por ejemplo, 244C8, provocan respuestas fisiológicas que son mediblemente diferentes a las respuestas provocadas por pembrolizumab y nivolumab.

E. Cartografiado de epítopos basado en péptidos

Se usaron péptidos sintéticos superpuestos basados en la secuencia de la PD-1 humana (15-meros) (Sigma-Aldrich PEPscreen, Saint Louis, MO) en los experimentos de cartografiado de epítopos. Los péptidos usados se indican en la siguiente Tabla 5.

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Cada péptido se incubó con cada anticuerpo durante una hora, para permitir la formación del complejo péptidoanticuerpo. A continuación, cada una de estas mezclas de anticuerpos y péptidos se utilizó en un ELISA convencional, en el que se inmovilizó la PD-1 humana en placas de 96 pocillos. Las placas de ELISA se recubrieron con 100 ng/pocillo de PD-1-marcador His (Sino Biological, North Wales, PA; n.° 10377-H08H-50) en tampón de carbonato, pH 9,6. Después del lavado, las placas se bloquearon con leche-PBS al 4 %, Tween-PBS al 0,05 % (tampón de bloqueo). Tras el bloqueo y el lavado de las placas, las mezclas péptido-anticuerpo se incubaron con PD-1 humana inmovilizada. Después del lavado, las placas se revelaron mediante incubación durante 1 hora con IgG de cabra anti-ratón conjugada con HRP (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA; n.° 115-035-071) y la adición de 100 pl de solución de TMB (ThermoScientific, Waltham, MA; n.° PI-34022). Las densidades ópticas se midieron a la longitud de onda correspondiente, utilizando un lector de microplacas ELISA. Esto permitió evaluar cuantitativamente qué péptidos formaban complejos con el anticuerpo y luego inhibían la unión del anticuerpo a la PD-1 humana. La FIG. 8 resume los resultados de unión de cinco clones de anticuerpos (246A10, 244C8, 388D4, 413D2 y 413E1).

F. Caracterización biofísica de anticuerpos anti-PD-1

Se analizaron las características biofísicas de ciertos anticuerpos anti-PD-1 mediante interferometría de biocapas (BLI), utilizando el sistema ForteBio Octet Red (Pall Corporation, Menlo Park, CA). Los anticuerpos se inmovilizaron en biosensores BLI y luego se incubaron con el dominio extracelular soluble de la PD-1 humana. Usando métodos biofísicos convencionales, a continuación, se dedujeron las tasas aparentes de activación y desactivación de PD-1 con anticuerpos anti-PD-1. Estos valores se utilizaron para generar valores de afinidad aparente (valores de K^d), que se enumeran en la tabla 6.

Tabla 6.

G. Selectividad de los anticuerpos anti-PD-1

Para evaluar la selectividad de los anticuerpos anti-PD-1, se utilizó ELISA para generar curvas dosis-respuesta para la unión de los anticuerpos anti-PD-1 a varias proteínas inmunomoduladoras de la superficie celular. Los dominios extracelulares (ECD) solubles recombinantes de ICOS (coestimulador inducible de linfocitos T), PD-1, CD28 o CTLA4 (R&D Systems, Minneapolis, MN) se recubrieron en placas de ensayo ELISA. A continuación, se evaluó la unión de cada anticuerpo anti-PD-1 y cada anticuerpo de control a cada proteína objetivo en un rango de concentraciones de anticuerpos (FIG. 9A-9D).

Estos experimentos demostraron que los anticuerpos anti-PD-1 388D4, 413E1,244C8 y 246A10 se unen al ECD de PD-1 con alta especificidad, que no muestra ninguna unión con tres miembros de la superfamilia de proteínas Ig estructuralmente relacionadas

EJEMPLO 3. Humanización de anticuerpos anti-PD-1

Se realizó la humanización de anticuerpos anti-PD-1 seleccionados para reducir la capacidad inmunógena aparente de los anticuerpos basados en ratón. Utilizando información de ingeniería de anticuerpos bien conocida en la técnica, y herramientas bioinformáticas convencionales, se analizaron las secuencias de aminoácidos de ciertos anticuerpos murinos anti-PD-1 de la divulgación y se compararon con secuencias de anticuerpos humanos conocidos. A partir de estos análisis y comparaciones, se eligieron ciertas secuencias humanas para el injerto convencional de CDR murinas y la inclusión de mutaciones posteriores adecuadas. En ensayos de unión a PD-1 humana, estos anticuerpos humanizados se evaluaron con respecto a criterios como la afinidad, la avidez, la cinética de unión y el comportamiento bioquímico, como la agregación, así como los niveles de expresión. Las secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR de ciertos anticuerpos humanizados que muestran características deseables (por ejemplo, unión a PD-1) se muestran en las tablas 7 y 8, respectivamente. Las FIG. 10A y 10B muestran alineamientos de secuencias de aminoácidos de las secuencias de la región variable de la cadena pesada o ligera humanizada con las secuencias de la región variable de la cadena pesada murina indicada (100388_D4_VH3 o 100244_C8_VH3) o de la cadena ligera (100389_D4_VK5 o 100245_C8_Vk5m1).

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T l . ni r in vri l n li r hmniz

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EJEMPLO 4. Competición entre anticuerpos y ligandos por la unión a PD-1

A. Ensayos de unión competitiva

Se observó que aunque algunos de los anticuerpos anti-PD-1 divulgados en el presente documento inhiben competitivamente la unión de los ligandos PD-1, otros no. Por ejemplo, en ensayos de unión competitiva basados en resonancia de plasmones superficiales y en ensayos de unión competitiva basados en citometría de flujo, se observó que el anticuerpo 388D4 inhibe de manera competitiva la unión de PD-L1 a PD-1, pero no inhibe la unión de PD-L2. Por el contrario, se observó que el anticuerpo 244C8 no inhibe competitivamente la unión del PD-L1 o PD-L2.

El análisis de unión competitiva se realizó con los anticuerpos IgG⁴ humanizados 244C8-2 y 388D4-2, utilizando interferometría de biocapas (BLI) de ForteBio. El anticuerpo IgG humanizado se inmovilizó en los biosensores AHC cargando 3 pg/ml de IgG hasta un nivel objetivo de 1,0 nm durante un tiempo de carga de 160 segundos. Una única concentración (100 nM) de PD-1 activa, más un control negativo apropiado para corregir la deriva, se unió a la IgG inmovilizada. Se utilizó un pH de 7,4 para la asociación y disociación. A continuación, la PD-1 unida se expuso a siete concentraciones de PD-L1 (9, 3, 1, 0,333, 0,111, 0,037 y 0 pM) o PD-L2 (2000, 666,7, 222,2, 74,1, 24,7, 8,2 y 0 nM). Se evaluó la asociación/disociación de PD-L1 y PD-L2 al complejo mAb/PD-1 inmovilizado en las puntas del biosensor.

Los materiales utilizados en estos ensayos fueron los siguientes: PD1 (marcador His): ABCAM, n.° de cat. ab174035, n.° de lote GR199119-1, 100 mg; PD-L1 (marcador His): Sino Biological, n.° de cat. 10084-H08H, n.° de lote LC098E0901, 200 mg; PD-L2 (marcador His): Sino Biological, n.° de cat. 10292-H08H, n.° de lote LC07DE3022, 100 mg; PD1-Fc: R&D Systems, n.° de cat. 1086-PD, n.° de lote FVQ0413051, 50 mg; Biosensores de captura de IgG anti-humano-Fc (AH¿): ForteBio, n.° de cat. 18-5060, n.° de lote 1501211; Tampón 1X Kinetic: Fosfato 20 mM, NaCl 150 mM, Tween-20 al 0,02 %, azida de sodio al 0,05 %, BSA a 0,1 mg/ml, pH 7,4; Muestras de prueba: IgG4 humanizada - 244C8-2 (3,04 mg/ml), IgG⁴ humanizada - 388D4-2 (2,89 mg/ml).

Los ensayos de citometría de flujo se llevaron a cabo esencialmente como sigue. Se incubaron células HEK293 que expresan PD-1 con 10 pg/ml de un anticuerpo de isotipo (control negativo), anticuerpo comercial EH12.2H7 (control positivo), anticuerpo 388D4 o anticuerpo 244C8. Las células se lavaron y se tiñeron con la proteína soluble PD-L1-Ig marcada fluorescentemente con Alexa-488. Las células se lavaron de nuevo, y se evaluó la unión de PD-L1 (desplazando el anticuerpo previamente unido) mediante un análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Los resultados representativos se muestran en las FIG. 11A-11D.

EJEMPLO 5. Ensayos basados en células humanas

A. Células humanas

La obtención de tejido tumoral humano y la disociación del tumor fueron como sigue. Las muestras tumorales frescas de pacientes con CPNM sometidos a resección quirúrgica de tumores se obtuvieron de la Red Cooperativa de Tejidos Humanos, National Cancer Institute. El análisis se realizó utilizando suspensiones unicelulares de células tumorales de estas muestras tumorales.

Las muestras de biopsias de tumores sólidos se disolvieron mecánicamente en suspensiones unicelulares utilizando un disociador gentleMACS (Miltenyi Biotec) con enzimas A, H y R. A continuación se prepararon las suspensiones unicelulares para el recuento de células y el análisis de FACS inicial.

Análisis mediante FACS

Para el análisis mediante FACS, se adquirieron los anticuerpos anti-CD45-PerCP-Cy5.5 (clon 2D1), anti-CD4-PE-Cy7 (SK3), anti-CD8-FITC (SKI), anti-BTLA-Biotin (MIH26), anti-CTLA-4-PE (14D3), y anti-LAG-3-APC (3DS223H) de eBioscience. El anti-CD25-BV605 (2A3), el anti-PD-1-BV605 (EH121) y estreptavidina-BV711 se compraron a BD Bioscience. El anti-CD45RABV421 (HI100), el anti-CCR7 AlexaFluor647 (G043H7) y el anti-Tim-3-BV421 (F38-2E2) se adquirieron de Biolegend. Se lavaron las suspensiones celulares heterogéneas preparadas a partir de tumores primarios disociados (como se ha descrito anteriormente), resuspendido en PBS, y bloqueado con un reactivo comercial de bloqueo de Fc (BD Biosciences). Las células viables se identificaron por la falta de positividad a la tinción de células muertas y por la negatividad de la expresión de EpCAM. Las células positivas a CD45 se separaron según la expresión de CD4 o CD8, y luego se evaluó en las células la expresión de PD-1, TIM3, LAG3 o TIGIT. Estos datos de FACS se muestran a continuación, en la tabla 10, con los resultados expresados en porcentaje de células positivas.

Los datos de expresión de los marcadores de superficie de los linfocitos T de la tabla 10 proporcionan una comparación de los perfiles de los receptores inmunomoduladores de los linfocitos infiltrantes de tumores (TILS) de varias muestras de biopsia de tumores humanos de CPNM. Estos datos proporcionaron un contexto biológico útil para los ensayos realizados con las muestras tumorales.

C. Estimulación de los linfocitos infiltrantes del tumor (TIL)

Establecer la estimulación policlonal de TIL entre las células tumorales disociadas, se recubrió una placa de ensayo de 96 pocillos con 0,5 pg/ml de anti-CD3 (OKT3) en tampón de acoplamiento, durante la noche a 4 °C. Se eliminó la solución de recubrimiento de anticuerpos y se lavó la placa. Las suspensiones tumorales se resuspendieron hasta una densidad de aproximadamente 1,5 x 106 células por ml. Se cargaron 200 pl de esto en cada pocillo experimental, junto con 2 pg/ml de anti-CD28 (clon 28.2, eBioscience). En los puntos de tiempo especificados, los sobrenadantes se utilizaron para el análisis ELISA o las células se utilizaron para el análisis FACS o el análisis de células individuales en dispositivos de matriz de micropocillos.

D. Ensayo de inmunoadsorción enzimática

Los sobrenadantes de cultivos tumorales que contienen células tumorales, células estromales y células inmunitarias se recogieron en puntos de tiempo fijos después del tratamiento experimental, y la producción de citocinas se evaluó mediante ELISA. Para comenzar el ELISA, se recubrieron placas de 96 pocillos con el anticuerpo de captura, se bloquearon con tampón diluyente del ensayo y se lavaron, antes de la incubación con diluciones seriadas de sobrenadantes de las células derivadas del tumor cultivadas. Las muestras se incubaron durante una hora y luego se lavaron las placas de ELISA. Después se añadió el anticuerpo de detección-HRP en diluyente de ensayo, se lavó la placa de ensayo y se añadió la solución de sustrato a los pocillos de la placa de ensayo. Después de que la reacción enzimática se detuviera, se midió la densidad colorimétrica a 450 nm en un lector de placas convencional. Las mediciones de la secreción de IFNy, normalizados con respecto a los patrones internos incluidos en cada placa, se utilizaron como lectura experimental de la función efectora de los linfocitos T.

E. Aumento de la función de los TIL por el bloqueo de PD-1

La FIG. 12 resume los resultados de un experimento que muestra la restauración de la función de los linfocitos T mediante el bloqueo de PD-1 con nivolumab o diferentes formas humanizadas de los anticuerpos 388D4 y 244C8, es decir, 388D4-2, 388D4-3, 244C8-1, 244C8-2 y 244C8-3. Se incubó una población de 3 x 105 células, que incluía un 17 % de linfocitos (activados como se ha descrito anteriormente) durante 24 horas con anticuerpos anti-PD-1 a una concentración de 20 pg/ml. El IFNy se midió mediante un ELISA, y los datos se expresaron en términos de múltiplo de activación en relación con el tratamiento con el anticuerpo de control de isotipo. Como se muestra en la FIG. 12, cada uno de los anticuerpos anti-PD-1 restauró la función de los linfocitos T, aumentando la secreción de IFNy entre aproximadamente 7 y 8 veces, en relación con el control de isotipo. Los datos ilustrados en la FIG. 12 se presentan en la tabla 11.

Tabla 11. Restauración de^ la función de los linfocitos T mediante el blo ueo de PD-1

La FIG. 13 resume los resultados de un experimento para medir el aumento de la función efectora de los linfocitos T, indicada por la secreción de IFNy, en respuesta al tratamiento con el anticuerpo 244C8-2 solo frente al tratamiento con 244C8-2 más 388D4-2, que se normaliza en relación con la respuesta al tratamiento con nivolumab. Se incubó una población de 3 x 105 células, que incluía un 7,5% de linfocitos activados de manera subóptima como se ha descrito anteriormente, durante 24 horas con anticuerpos anti-PD-1 a una concentración total de anticuerpos de 20 pg/ml. Como se muestra en la FIG. 13, el tratamiento con 244C8-2 solo aumentó el IFNy 1,77 veces (±0,19 DE), mientras que el tratamiento con 244C8-2 en combinación con 388D4-2 aumentó la secreción de IFN^y 2,11 veces (±0,21 DE). Estos resultados inesperados obtenidos en respuesta al tratamiento con la combinación de un anticuerpo inhibidor competitivo y un anticuerpo inhibidor no competitivo indican que la combinación de estos dos mecanismos de acción diferentes para inhibir PD-1 produce una respuesta mejorada, a pesar de que ambos anticuerpos están dirigidos contra el mismo objetivo. Los datos ilustrados en la FIG. 13 se presentan en la tabla 12.

Tabla 12.. Aumento de la inducción de IFN- or la combinación de anticuer os anti-PD-1

La FIG. 14 muestra los resultados de un experimento similar al que dio los resultados presentados en la figura 12, excepto que se probaron diferentes formas humanizadas de los anticuerpos 388D4 y 244C8, y se probó nivolumab en combinación con 244C8. En cada tratamiento, se incubó una población de 3 x 105 células, que incluía un 9 % de linfocitos activados de manera subóptima como se ha descrito anteriormente, durante 24 horas con anticuerpos anti-PD-1 a una concentración total de 20 pg/ml. Tras el bloqueo de PD-1, y se recogieron los sobrenadantes para el análisis FACS, el análisis por micrograbado en un dispositivo de matriz de micropocillos (Varadarajan, anteriormente citado), o detección de citocinas mediante ELISA. La FIG. 14 muestra la secreción de IFN^y, medida mediante ELISA, y los datos se expresan en términos de múltiplo de inducción de la secreción de IFNy, en relación con el tratamiento con el anticuerpo de control de isotipo. Los datos usados para crear la FIG. 14 se muestran en la tabla 13 a continuación.

Tabla 13. Aumento de la inducción de IFN- or la combinación de anticuer os anti-PD-1

Los datos resumidos en la FIG. 14 muestran un aumento significativo de la respuesta al tratamiento de los TILS procedentes de biopsias de CPNM con la combinación de nivolumab, que es un anticuerpo inhibidor competitivo anti-PD-1, y 244C8-2, que es un anticuerpo anti-PD-1 inhibidor no competitivo. El tratamiento individual con cada uno de los dos anticuerpos anti-PD-1 diferentes que compiten con PD-L1 para unirse a PD-L1, es decir, nivolumab y 388D4-2, aumentó la función efectora de los linfocitos T aproximadamente 2 veces. El tratamiento individual con un anticuerpo anti-PD-1 que no compite con PD-L1 para unirse a PD-L1, es decir, 244C8-2, aumentó la función efectora de los linfocitos T entre 2,5 y 3 veces. El tratamiento con nivolumab más 244C8-2 aumentó la función efectora de los linfocitos T entre 3,5 y 4 veces.

Cuando se realizan experimentos como estos con muestras de biopsia de tumores de pacientes humanos, la magnitud del aumento de la función efectora de los linfocitos T observada en respuesta al mismo tratamiento con anticuerpos puede variar de un experimento a otro en función de la variación entre pacientes. A pesar de esta variación entre pacientes, estos resultados indican que la adición de un tratamiento de anticuerpos anti-PD-1 inhibidores no competitivos a un tratamiento de anticuerpos anti-PD-1 inhibidores competitivos puede producir un mayor aumento de la función efectora de los TIL, en comparación con el tratamiento con el anticuerpo competitivo anti-PD-1 solo.

F. Anticuerpo 244C8 y secreción de citocinas en ensayos de MLR

Se observó un aumento de la secreción de varias citocinas en respuesta al anticuerpo 244C8 en ensayos de reacción de linfocitos mixtos (MLR). Las FIG. 15A-15F resumen los resultados de un ensayo de MLR realizado en PBMC humanas tratadas con anticuerpos anti-PD-1. El ensayo de MLR se realizó utilizando células dendríticas derivadas de monocitos comerciales como células estimuladoras y linfocitos T CD4+ purificados como células respondedoras de un donante de sangre sano diferente. Los sobrenadantes se recogieron a los 2,5 días de comenzar el ensayo. La secreción de citocinas se midió en un inmunoensayo multiplex de captura en sándwich utilizando microesferas MagPlex® (Luminex, Austin, TX) y ProCartaPlex® Human TH1/TH2 Chemokine Panel (Luminex), de acuerdo con las instrucciones del proveedor. La fluorescencia de los distintos marcadores se detectó mediante un sistema de detección de fluorescencia MagPix® (Luminex). Los datos de las FIG. 15A-15F indican que el tratamiento con el anticuerpo 244C8-1 produjo un aumento de la secreción de citocinas IL-6, IL-12, IL-18, TNF-a, GM-CSF e lL-1p, en comparación con el anticuerpo 388D4-2 o el control de isotipo lgG4 (Biolegend). Se observaron resultados similares (datos no mostrados) con células de otros dos donantes de sangre, en dos puntos de tiempo.

Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado que se une a la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1), que comprende una HCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 90 y una LCVR que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 96.

2. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en un método de tratamiento del cáncer en un mamífero, que comprende administrar una cantidad eficaz del anticuerpo a un mamífero que lo necesite.

3. Un método in vitro para diagnosticar una resistencia inmunitaria adaptativa en un paciente que tiene cáncer, que comprende:

poner en contacto un microambiente tumoral en una muestra de biopsia del paciente, con el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, marcado con un resto detectable; y

detectar la expresión de PD-1 en los linfocitos T CD8+ en el microambiente tumoral.

4. El método de la reivindicación 3, que además comprende detectar la expresión de PD-L1 en el microambiente tumoral.

5. El anticuerpo para el uso de la reivindicación 2, en donde el cáncer es cáncer de pulmón.