CN115362167A - Il-10及其用途 - Google Patents

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CN115362167A CN202180025362.4A CN202180025362A CN115362167A CN 115362167 A CN115362167 A CN 115362167A CN 202180025362 A CN202180025362 A CN 202180025362A CN 115362167 A CN115362167 A CN 115362167A
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R·F·格拉齐亚诺
M·古鲁拉詹
K·V·卡特林斯基
J·K·洛伊
P·E·莫林
B·A·普瓦尔松
V·M·斯皮尔
杨峥
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Abstract

本公开文本提供了包含IL‑10多肽和第二多肽例如Fc多肽的融合蛋白。本公开文本的某些方面涉及治疗受试者的方法，所述方法包括施用所述IL‑10融合蛋白。在某些方面，所述受试者患有癌症。

Description

IL-10及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年2月6日提交的美国临时申请序列号62/970,957在35 U.S.C.§119(e)下的权益；将其公开内容通过引用并入本文。
序列表
通过引用以其整体并入本文的是名为“20210205_SEQL_13311WOPCT_ST25.txt”的序列表，所述序列表包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:45，其包括本文公开的核酸和/或氨基酸序列。序列表已经通过EFS-Web以ASCII文本格式随同提交，因此构成了其纸质和计算机可读形式。序列表是在2021年2月3日创建的，并且大小为约104KB。
背景技术
IL-10是由
Figure BDA0003868754360000011
B、NK和T细胞(CD4+、CD8+和Treg)产生的多效性免疫调节细胞因子。IL-10作为具有高亲和力的非共价同二聚体与IL-10受体α(IL-10Rα)结合，导致IL-10受体β(IL-10Rβ)的募集。受体结合激活复杂的信号传导级联，包括STAT3和STAT1的磷酸化。通过此途径的信号传导可以导致对表达受体的各种免疫细胞子集的抗炎和促炎作用。促炎作用包括引发的CD8+T细胞和NK细胞的扩增、激活和细胞溶解增强。相比之下，抗炎作用包括髓样细胞因子产生和引发能力的抑制。用IL-10分子的治疗可以包括肿瘤特异性CD8+T和NK细胞的扩增和激活，从而驱动实体瘤中的IFNγ依赖性肿瘤杀死机制，并且可在与IO药剂或标准护理组合时具有潜在益处(Autio,等人,Current Oncology Reports,2019；2 1:19)。
尽管具有双重免疫调节作用，IL-10仍被鉴定为抗肿瘤药剂。在IL-10敲除小鼠中的早期研究揭示了患上结肠腺癌的品系依赖性患病率(Berg等人,J Clin Invest,1996；98:1010-1020)以及DMBA诱导的皮肤肿瘤的增加的发生率及T细胞减少(Mumm,等人,Cancercell,2011；20:781-796)。类似地，通过IL-10受体中的突变缺乏IL-10信号传导的人会患上具有低得多频率的浸润性细胞溶解T细胞的淋巴瘤(Neven等人,Blood,2013；122:3713-3722)。除遗传证据之外，重组IL-10或聚乙二醇化IL-10的治疗性施用还显示了几种小鼠模型中的抗肿瘤活性，其中功效显示需要CD8+T细胞和肿瘤MHC I类抗原的IFNγ依赖性上调(Mumm,等人,Cancer cell,2011；20:781-796)。然而，在小鼠和人两者中，由于细胞因子的半衰期短，为了治疗活性通常需要重复的每天给药。现在正在临床试验中的聚乙二醇化人IL-10(PEGIL-10)在几种肿瘤适应证中显示出令人鼓舞的临床信号，但是仍需要每天给药以维持活性所需的药代动力学(PK)特征(Naing,等人,Cancer Cell,2018；34:775-791)。此外，用重复的每日给药，在临床上已经观察到了血液毒性，如贫血和血小板减少症(Autio,等人,Current Oncology Reports,2019；2 1:19；Naing,等人,Journal of ClinicalOncology,2016；34,3562-3569；Sosman,等人,British Journal of Haematology,2000；111(1),104-111)。因此，需要采用较低频率的剂量方案而有效的人IL-10激动剂。此类较低频率的给药不仅消除了每日注射的需求，而且还促进了在给药之间从血液毒性中恢复。
发明内容
本公开文本的某些方面涉及一种IL-10融合蛋白，所述IL-10融合蛋白包含(i)IL-10多肽，其包含与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列,；和(ii)第二多肽，其中所述IL-10融合蛋白包含IL-10活性。在一些方面，所述第二多肽包含白蛋白多肽。在一些方面，所述第二多肽包含Fc多肽。在一些方面，所述Fc多肽包含与选自SEQ ID NO:4-12的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列。
本公开文本的某些方面涉及一种IL-10融合蛋白，所述IL-10融合蛋白包含(i)IL-10多肽，其包含与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；和(ii)包含Fc多肽的第二多肽，其中当向有需要的受试者以不超过约一周一次施用所述IL-10融合蛋白时，所述IL-10融合蛋白能够治疗所述受试者的癌症。在一些方面，当向有需要的受试者以不超过约每两周一次施用所述IL-10融合蛋白时，所述IL-10融合蛋白能够治疗所述受试者的癌症。在一些方面，当向有需要的受试者以不超过约每四周一次施用所述IL-10融合蛋白时，所述IL-10融合蛋白能够治疗所述受试者的癌症。
在一些方面，所述第二多肽与所述IL-10多肽的N末端融合。在一些方面，所述第二多与所述IL-10多肽的C末端融合。
在一些方面，所述IL-10多肽通过接头与所述第二多肽融合。在一些方面，所述接头包含至少约4个氨基酸、至少约5个氨基酸、至少约6个氨基酸、至少约7个氨基酸、至少约8个氨基酸、至少约9个氨基酸、至少约10个氨基酸、至少约11个氨基酸、至少约12个氨基酸、至少约13个氨基酸、至少约14个氨基酸、至少约15个氨基酸、至少约16个氨基酸、至少约17个氨基酸、至少约18个氨基酸、至少约19个氨基酸、至少约20个氨基酸、或至少约21个氨基酸。在一些方面，所述接头包含至少约15个氨基酸。在一些方面，所述接头包含至少约20个氨基酸。在一些方面，所述接头包含至少约21个氨基酸。
在一些方面，所述接头包含甘氨酸和丝氨酸。在一些方面，所述接头包含GGGGS(SEQ ID NO:39)基序或GGGS(SEQ ID NO:38)基序。在一些方面，所述接头包含选自SEQ IDNO:38-45的氨基酸序列。
在一些方面，所述IL-10多肽包含与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列具有至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述IL-10多肽包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。
在一些方面，所述Fc多肽包含与选自SEQ ID NO:4-12的氨基酸序列具有至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，Fc多肽包含选自SEQ ID NO:4-12的氨基酸序列。
在一些方面，所述IL-10融合蛋白包含与选自SEQ ID NO:14-32的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述IL-10融合蛋白包含与选自SEQ IDNO:14-32的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述IL-10融合蛋白包含与选自SEQ ID NO:14-32的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述IL-10融合蛋白包含具有3个或更少的取代、插入或缺失的选自SEQ IDNO:14-32的氨基酸序列。在一些方面，所述IL-10融合蛋白包含具有2个或更少的取代、插入或缺失的选自SEQ ID NO:14-32的氨基酸序列。在一些方面，所述IL-10融合蛋白包含具有1个取代、插入或缺失的选自SEQ ID NO:14-32的氨基酸序列。在一些方面，所述IL-10融合蛋白包含选自SEQ ID NO:14-32的氨基酸序列。
在一些方面，所述IL-10融合蛋白包含与选自SEQ ID NO:33-36的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述IL-10融合蛋白包含与选自SEQ IDNO:33-36的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述IL-10融合蛋白包含与选自SEQ ID NO:33-36的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述IL-10融合蛋白包含具有3个或更少的取代、插入或缺失的选自SEQ IDNO:33-36的氨基酸序列。在一些方面，所述IL-10融合蛋白包含具有2个或更少的取代、插入或缺失的选自SEQ ID NO:33-36的氨基酸序列。在一些方面，所述IL-10融合蛋白包含具有1个取代、插入或缺失的选自SEQ ID NO:33-36的氨基酸序列。在一些方面，所述IL-10融合蛋白包含选自SEQ ID NO:33-36的氨基酸序列。
在一些方面，所述IL-10融合蛋白包含含有第一多肽和第二多肽的IL-10二聚体，其中所述第一多肽包含本文公开的IL-10融合蛋白，并且其中所述第二多肽包含第二Fc多肽。在一些方面，所述第二多肽包含与所述第二Fc多肽融合的第二IL-10多肽。
在一些方面，所述IL-10二聚体是同二聚体。在一些方面，所述第一多肽包含SEQID NO:1中所示的氨基酸序列，并且所述第二多肽包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述第一多肽包含选自SEQ ID NO:14-36的氨基酸序列，并且所述第二多肽包含选自SEQ ID NO:14-36的氨基酸序列。
在一些方面，所述IL-10二聚体是异二聚体。
在一些方面，所述第一多肽和所述第二多肽通过共价键连接。在一些方面，所述第一多肽和所述第二多肽通过二硫键连接。在一些方面，所述第一多肽和所述第二多肽通过肽键连接。在一些方面，所述第一多肽和所述第二多肽通过肽接头连接。在一些方面，所述肽接头是可切割接头。
本公开文本的某些方面涉及一种多核苷酸或一组多核苷酸，其编码本文公开的IL-10融合蛋白。
本公开文本的某些方面涉及一种载体或一组载体，其包含本文公开的一种多核苷酸或一组多核苷酸。在一些方面，所述载体是病毒载体。
本公开文本的某些方面涉及一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本文公开的IL-10融合蛋白、本文公开的一种多核苷酸或一组多核苷酸、或本文公开的一种载体或一组载体。在一些方面，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些方面，所述宿主细胞选自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HEK293细胞、BHK细胞、鼠骨髓瘤细胞(NS0和Sp2/0)、猴肾(COS)细胞、VERO细胞、纤维肉瘤HT-1080细胞、和HeLa细胞。
本公开文本的某些方面涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含本文公开的IL-10融合蛋白、本文公开的一种多核苷酸或一组多核苷酸、或本文公开的一种载体或一组载体，和药学上可接受的赋形剂。
本公开文本的某些方面涉及一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文公开的IL-10融合蛋白、本文公开的一种多核苷酸或一组多核苷酸、本文公开的一种载体或一组载体、或本文公开的药物组合物。
本公开文本的某些方面涉及一种杀死有需要的受试者中的癌细胞的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文公开的IL-10融合蛋白、本文公开的一种多核苷酸或一组多核苷酸、本文公开的一种载体或一组载体、或本文公开的药物组合物。
本公开文本的某些方面涉及一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括以至少约7天的给药间隔向所述受试者施用有效量的IL-10融合蛋白，其中所述IL-10融合蛋白包含IL-10多肽和第二多肽，所述第二多肽包含白蛋白多肽或Fc多肽。
本公开文本的某些方面涉及一种杀死有需要的受试者中的癌细胞的方法，所述方法包括以至少约7天的给药间隔向所述受试者施用有效量的IL-10融合蛋白，其中所述IL-10融合蛋白包含IL-10多肽和第二多肽，所述第二多肽包含白蛋白多肽或Fc多肽。
在一些方面，所述第二多肽是白蛋白多肽。在一些方面，所述第二多肽是Fc多肽。在一些方面，所述IL-10融合蛋白进一步包含接头。在一些方面，所述接头包含本文公开的接头。
在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以至少约7天、至少约10天、至少约14天、至少约17天、至少约21天、至少约24天、或至少约28天的给药间隔施用。在一些方面，以不超过一周一次施用所述IL-10融合蛋白。在一些方面，以不超过每2周一次施用所述IL-10融合蛋白。在一些方面，以不超过每3周一次施用所述IL-10融合蛋白。在一些方面，以不超过每4周一次施用所述IL-10融合蛋白。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以至少约7天至至少约28天的给药间隔施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以至少约14天的给药间隔施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以至少约21天的给药间隔施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以至少约28天的给药间隔施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白约每周施用一次。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白约每2周施用一次。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白约每3周施用一次。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白约每4周施用一次。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白约每6周施用一次。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白约每2个月施用一次。
在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以单次剂量施用。在一些方面，所述有效量的IL-10融合蛋白基本上由单次剂量组成或由单次剂量组成。
在一些方面，所述IL-10融合蛋白包含与选自SEQ ID NO:14-32的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列，并且其中将所述IL-10融合蛋白以至少约2周的给药间隔施用。在一些方面，所述IL-10融合蛋白包含选自SEQ ID NO:14-32的氨基酸序列。在一些方面，所述IL-10融合蛋白含SEQ ID NO:14。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白每2周施用一次。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白约每3周施用一次。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白约每4周施用一次。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白每5周施用一次。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白约每6周施用一次。
在一些方面，所述癌症包括肿瘤。在一些方面，所述癌症选自小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、鳞状NSCLC、非鳞状NSCLC、神经胶质瘤、胃肠道癌、肾癌、透明细胞癌、卵巢癌、肝癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肾细胞癌(RCC)、前列腺癌、激素难治性前列腺腺癌、甲状腺癌、神经母细胞瘤、胰腺癌、胶质母细胞瘤(多形性胶质母细胞瘤)、宫颈癌、胃癌、膀胱癌、肝癌(肝细胞癌，HCC)、乳腺癌、结肠癌、头颈癌(或癌)、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、胃癌、生殖细胞肿瘤、小儿肉瘤、鼻窦自然杀伤细胞/T细胞淋巴瘤、黑素瘤、转移性恶性黑素瘤、皮肤或眼内恶性黑素瘤、间皮瘤、骨癌、皮肤癌、子宫癌、肛区癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童期实体瘤、输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑癌、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、包括石棉诱发的癌症在内的环境诱发的癌症、病毒相关的癌症或病毒来源的癌症、人乳头瘤病毒(HPV)相关或来源的肿瘤和所述癌症的组合。
在一些方面，所述癌症选自急性白血病(ALL)、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和慢性髓细胞性白血病(CML)、未分化AML、成髓细胞性白血病、成髓细胞性白血病、早幼粒细胞白血病、髓细胞单核细胞白血病、单核细胞白血病、红白血病、巨核细胞白血病、孤立性粒细胞肉瘤、绿色瘤、霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、单核细胞样B细胞淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤/白血病、套细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤、肠道T细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、前驱T淋巴母细胞性淋巴瘤、T淋巴母细胞性外周T细胞淋巴瘤、淋巴母细胞性淋巴瘤、移植后淋巴增殖性障碍、真性组织细胞性淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴母细胞性淋巴瘤(LBL)、淋系造血系统肿瘤、急性淋巴母细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性组织细胞性淋巴瘤(DHL)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前驱B淋巴母细胞性淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(CTLC)、淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL)伴有华氏巨球蛋白血症；骨髓瘤、IgG骨髓瘤、轻链骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、冒烟型骨髓瘤(惰性骨髓瘤)、孤立性浆细胞瘤、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞淋巴瘤；和所述癌症的任何组合。
在一些方面，所述癌症选自RCC、NSCLC、胃癌、HCC、头颈鳞状细胞癌(SCCHN)、和所述癌症的任何组合。在一些方面，所述癌症选自RCC、NSCLC、胃癌、SCCHN、和所述癌症的任何组合。在一些方面，所述癌症选自黑素瘤、膀胱癌、胰腺癌、结肠癌、SCLC、间皮瘤、肝细胞癌、前列腺癌、多发性骨髓瘤、和所述癌症的组合。
在一些方面，所述方法进一步包括向所述受试者施用第二抗癌疗法。在一些方面，所述第二抗癌疗法包括选自以下的疗法：免疫疗法，化学疗法，放射疗法，手术，激活先天性免疫细胞的药剂，增强NK和/或CD8+T细胞存活的药剂，抑制Treg(T调节细胞)、TAM(肿瘤相关巨噬细胞)、CAF(癌症相关成纤维细胞)、或MDSC(髓系来源的抑制细胞)的药剂，及其任何组合。在一些方面，所述第二抗癌疗法包括有效量的特异性结合选自以下的蛋白质的抗体或其抗原结合片段：诱导型T细胞共刺激物(ICOS)、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、NKG2A、CD27、CD38、CD73、CD96、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)、和疱疹病毒侵入介导物(HVEM)、程序性死亡蛋白-1(PD-1)、程序性死亡蛋白配体-1(PD-L1)、CTLA-4、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域-3(TIM-3)、淋巴细胞激活基因-3(LAG-3)、腺苷A2a受体(A2aR)、杀伤细胞凝集素样受体G1(KLRG-1)、自然杀伤细胞受体2B4(CD244)、CD160、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、以及T细胞激活的V结构域Ig抑制剂的受体(VISTA)、KIR、TGFβ、IL-10、IL-8、B7-H4、Fas配体、CXCR4、间皮素、CEACAM-1、CD52、HER2、SLAMF7、BCMA、MICA、MICB、CCR8及其任何组合。
在一些方面，所述第二抗癌疗法包括特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段(“抗PD-1抗体”)。在一些方面，所述抗PD-1抗体包括纳武单抗或派姆单抗。
在一些方面，所述第二抗癌疗法包括特异性结合PD-L1的抗体或其抗原结合片段(“抗PD-L1抗体”)。在一些方面，所述抗PD-L1抗体选自阿特利珠单抗、度伐鲁单抗和阿维鲁单抗。
在一些方面，所述第二抗癌疗法包括特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合片段(“抗CTLA-4抗体”)。在一些方面，所述抗CTLA-4抗体包括曲美木单抗或伊匹单抗。
在一些方面，所述第二抗癌疗法包括特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合片段(例如曲美木单抗或伊匹单抗)和特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段(例如纳武单抗或派姆单抗)。在一些方面，所述第二抗癌疗法包括特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合片段(例如曲美木单抗或伊匹单抗)和特异性结合PD-L1的抗体或其抗原结合片段(例如阿特利珠单抗、度伐鲁单抗或阿维鲁单抗)。
在一些方面，所述第二抗癌疗法包括选自以下的化学疗法：蛋白酶体抑制剂、IMiD、Bet抑制剂、IDO拮抗剂、基于铂的化学疗法、STING激动剂、NLRP3激动剂、TLR7激动剂、及其任何组合。
在一些方面，所述第二疗法包括选自以下的药剂：多柔比星
Figure BDA0003868754360000051
顺铂、卡铂、硫酸博来霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥
Figure BDA0003868754360000052
环磷酰胺
Figure BDA0003868754360000053
来那度胺
Figure BDA0003868754360000054
硼替佐米
Figure BDA0003868754360000055
地塞米松、米托蒽醌、依托泊苷、阿糖胞苷、苯达莫司汀
Figure BDA0003868754360000056
利妥昔单抗
Figure BDA0003868754360000057
异环磷酰胺、亚叶酸(甲酰四氢叶酸)、氟尿嘧啶(5-FU)、奥沙利铂(乐沙定)、FOLFOX、紫杉醇、多西紫杉醇、长春新碱
Figure BDA0003868754360000058
氟达拉滨
Figure BDA0003868754360000059
沙利度胺
Figure BDA00038687543600000510
阿仑单抗
Figure BDA00038687543600000511
奥法木单抗
Figure BDA00038687543600000512
依罗莫司
Figure BDA00038687543600000513
和卡非佐米(KYPROLISTM)。
在一些方面，所述第二抗癌疗法包括选自以下的增强NK和/或CD8+T细胞存活的药剂：包含IL-2的药剂(如聚乙二醇化IL-2)、IL-18和IL-15。
在一些方面，所述第二抗癌疗法包括CAR-T疗法，如靶向CD19的CAR-T。
在一些方面，所述第二抗癌疗法包括双特异性抗体疗法，如靶向CD3的生物特异性抗体，例如抗CD3/CD20、抗CD3/BCMA生物特异性药剂。
在一些方面，所述第二抗癌疗法包括标准护理疗法(如抗血管生成疗法(例如，贝伐单抗、索拉非尼等))或放射。
本公开文本的某些方面涉及一种制备IL-10融合蛋白的方法，所述方法包括在合适的条件下在宿主细胞中表达本文公开的一种多核苷酸或一组多核苷酸或本文公开的一种载体或一组载体。在一些方面，所述方法进一步包括收集所述IL-10融合蛋白。
附图说明
图1A-图1B示出了包含SEQ ID NO:14的Fc-IL-10的氨基酸序列(1A)和Fc-IL-10的简图模型(1B)，所述模型是野生型人IL-10与人IgG1.3f Fc结构域的c末端的90kDa Fc融合物。
图2A-图2B示出了由预先激活的人原代CD8+T细胞分泌的IFNγ(pg/mL)水平，将所述细胞在有(图2B)或没有IL2(图2A)的情况下用Fc-IL-10、重组IL-10、或PEG-IL-10处理72小时。通过AlphaLISA从上清液中测量IFNγ(pg/mL)。
图2C-图2D示出了由用10nM的重组人IL-10或Fc-IL-10预处理的原代人NK细胞介导的细胞毒性，如通过细胞裂解百分比测量的。以20:1(图2C)或5:1(图2D)的效应物与靶标(E:T)比率添加K562靶细胞。数据代表两个实验，其中每个实验2-3名供体。
图3A-图3F示出了在小鼠(图3A-图3C)和人(图3D-图3F)CRC肿瘤外植体中由Fc-IL-10对颗粒酶B(图3C和图3F)和IFNγ(图3B和图3E)基因表达的诱导。将切成小块的小鼠MC38或人CRC肿瘤在添加或不添加0.1nM(m)Fc-IL-10的含有IL-2的培养基中培养72小时，并且然后进行转录分析。CD8α(图3A和图3D)、FNγ(图3B和图3E)、和颗粒酶B(图3C和图3F)的代表性转录物在下文以相对于对照的倍数变化绘制。每个误差条代表从每次处理的8个孔汇集的样品的4个重复测量结果的SEM。
图4A-图4F示出了在MC38肿瘤模型中在单次剂量逐步调整研究中mFc-mIL-10的单一疗法效果。在第0天，将1E6个MC38肿瘤细胞皮下植入C57BL6雌性小鼠中。将肿瘤进行测量，并且以100mm3肿瘤体积随机分配到治疗组。在第7天(TV＝100mm3)以范围为10-0.1mg/kg的单次逐步调整剂量腹膜内给予mFc-mIL-10。测量肿瘤体积并且追踪无肿瘤(TF)小鼠的数量。将MOPC-21用作同种型对照。“1/10TF”意指总共10只小鼠中有一只是无肿瘤的。
图5A-图5K示出了在MC38肿瘤模型中在单次剂量逐步调整研究中mFc-mIL-10或PEG-mIL-10的单一疗法效果。在第6天，使荷载MC-38肿瘤的C57BL/6NCrl雌性小鼠接受单次IP施用：分别为0.1-10mg/kg mFc-IL-10或等效IL-10摩尔浓度的10kD PEG-mIL10，或同种型对照抗DT mIgG1 D265A。测量肿瘤体积并且追踪无肿瘤(TF)小鼠的数量。
图6A-图6B示出了在MC38肿瘤中给药后第5天肿瘤CD8+T细胞(图6A)和NK细胞(图6B)的增殖和激活，通过流式细胞术测量为Ki67和颗粒酶B的阳性百分比。误差条表示每组的标准偏差。****p<0.0001，10只小鼠/组。
图7A-图7E示出了在CT26肿瘤模型中单次剂量mFc-mIL-10与抗PD-1组合的效果。在第0天，将CT26肿瘤细胞皮下植入BALB/c雌性小鼠中。在第7天开始，将抗PD-1以10mg/kg每4天腹膜内给药3个剂量(Q4Dx3)。在第7天，将范围为从1-0.1mg/kg的mFC-mIL-10以单次逐步调整剂量给予。测量肿瘤并且追踪无肿瘤(TF)小鼠的数量。
图7F示出了在荷载CT26肿瘤的小鼠中观察到的mFc-mIL-10的药物浓度-时间曲线(n＝4-6只小鼠/剂量组)。在所有组中给药后14天的药物水平(平均药物浓度+SD)低于定量下限(LLOQ)。
图7G-图7I示出了在mFc-mIL-10与抗PD-1组合给药后第7(图7G)、14(图7H)和21(图7I)天，所治疗小鼠的CT26肿瘤中肿瘤特异性AH1四聚体阳性CD8+T细胞的百分比。误差条表示每组的标准偏差。第7天表示三个实验，第14天表示两个实验并且第21天表示一个实验。*p<0.05。
图8A-图8H示出了在CT26肿瘤模型中，单次低剂量的mFc-IL-10、单次高剂量的PEG-mIL-10(3.0mg/kg)或25个每日剂量的PEG-mIL-10(0.2或1.0mg/kg 5kD)与抗PD-1组合的效果。在第0天，将1E6个CT26肿瘤细胞皮下(SC)植入BALB/c雌性小鼠中。在第7天开始，将抗PD-1以10mg/kg每4天腹膜内(IP)给药3个剂量(Q4Dx3)。在第7天将与抗PD-1组合的mFC-mIL-10以0.03、0.1或0.3mg/kg的单次剂量给予。在第7天开始，将与抗PD-1组合的5kDaPEGmIL-10以0.2或1mg/kg IP每日给药持续25天，或在第7天以3mg/kg IP的单次剂量给予。
图9A示出了在以0.03、0.1或0.3mg/kg单次剂量IP施用于荷载CT26肿瘤的小鼠后，mFc-mIL-10的药物浓度-时间曲线拟合曲线。图9B示出了以0.2mg/kg每日SC施用持续25天或以3mg/kg的单次SC剂量施用的聚乙二醇化mIL-10的药物浓度-时间曲线拟合曲线。符号表示观察到的数据点，而线是模型拟合结果。
图10A示出了存活百分比，并且图10B-图10E示出了患有氧化偶氮甲烷(AOM)/葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎和结肠肿瘤的小鼠的重量减轻百分比。将小鼠用同种型对照(抗DT mIgG1+抗DT mIgG2a)(图10A和图10B)、抗CTLA4(图10A和图10D)、mFc-IL-10(图10A和图10C)、或抗CTLA4与mFc-IL-10的组合(图10A换入和图10E)治疗。将相对于基线的重量减轻百分比用作结肠炎严重程度的替代量度。
图11A-图11C分别示出了用同种型对照(n＝8)和mFc-IL-10(n＝9)治疗的小鼠中的肿瘤分析。在图11A中，点表示单独病变的大小；在图11B中，每个点表示单独动物的病变数量；并且在图11C中，每个点表示单独动物中所有肿瘤的累积大小。**p值<0.05。
具体实施方式
本公开文本的某些方面涉及一种IL-10融合蛋白，所述IL-10融合蛋白包含(i)IL-10多肽和Fc多肽，其中所述IL-10融合蛋白包含IL-10活性。本公开文本的其他方面涉及治疗有需要的受试者的疾病或病症(例如癌症)的方法，所述方法包括施用本文公开的IL-10融合蛋白。
I.术语
为了可以更容易地理解本公开文本，首先定义某些术语。如本申请所用，除非本文另外明确提供，否则以下术语中的每一个应当具有下文所阐述的含义。另外的定义贯穿本申请进行阐述。
应当理解，本文中无论用语言“包括/包含(comprising)”描述任何方面，还提供了以“由……组成”和/或“本质上由……组成”描述的其他类似方面。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本公开文本所属技术的本领域技术人员通常所理解的相同的含义。例如，Concise Dictionary ofBiomedicine and Molecular Biology,Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC出版社；TheDictionary of Cell and Molecular Biology,第3版,1999,学术出版社；以及OxfordDictionary of Biochemistry And Molecular Biology,修订版,2000,牛津大学出版社，为本领域技术人员提供本公开文本中所使用的许多术语的一般解释。
单位、前缀和符号均以其国际单位制(SI)可接受的形式表示。数值范围包括定义所述范围的数字。除非另外指示，否则核苷酸序列从左至右按5'至3'方向书写。氨基酸序列从左至右按氨基至羧基方向书写。本文提供的标题不是对本公开文本的各个方面的限制，所述各个方面可以通过参考作为整体的说明书而获得。因此，通过从整体上参考说明书，更全面地定义下文紧接着定义的术语。
“施用”是指使用本领域技术人员已知的多种方法和递送系统中的任何一种将包含治疗剂的组合物物理引入至受试者。本文公开的IL-10融合蛋白和IL-10二聚体的施用途径的例子包括静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、脊髓或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用，短语“肠胃外施用”意指除了肠施用和外用施用之外，通常通过注射的施用方式，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眼眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注以及体内电穿孔。其他非肠胃外途径包括口服、外用、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内地、阴道地、直肠地、舌下地或外用地。施用还可以例如进行一次、多次和/或经一个或多个延长的时间段。
“抗体”(Ab)包括而不限于糖蛋白免疫球蛋白(其与抗原特异性结合并包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链)或其抗原结合部分。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。
免疫球蛋白可以源自任何公知的同种型，包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgG和IgM。IgG亚类也是本领域技术人员熟知的，并且包括但不限于人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别或亚类(例如，IgM或IgG1)。举例来说，术语“抗体”包括天然存在的抗体和非天然存在的抗体两者；单克隆抗体和多克隆抗体；嵌合抗体和人源化抗体；人抗体或非人抗体；全合成抗体；和单链抗体。可以通过重组方法将非人抗体人源化以降低其在人体中的免疫原性。在没有明确说明的情况下，除非上下文另有指示，否则术语“抗体”还包括任何上述免疫球蛋白的抗原结合片段或抗原结合部分，并且包括单价和二价片段或部分以及单链抗体。
术语“Fc”、“Fc多肽”、“Fc结构域”、或“Fc区”是指抗体的Fc结构域或其片段。Fc可以是包含与天然发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列的天然Fc区，或包含与天然Fc区的氨基酸序列有至少一个氨基酸不同的氨基酸序列的变体Fc区。对于免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或区域的氨基酸编号的参考均基于Kabat等人1991,Sequences of Proteinsof Immunological Interest,U.S.Department of Public Health,贝塞斯达；马里兰州，将其通过引用以其整体并入本文。Fc可以包含免疫球蛋白的CH2和CH3结构域，其含有或不含有免疫球蛋白的铰链区。示例性Fc变体提供在WO 2004/101740和WO 2006/074199中，将其通过引用以其整体并入本文。
“融合”或“嵌合”蛋白包含连接至第二氨基酸序列的第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列在自然界中并非天然地与所述第二氨基酸序列连接。通常存在于分开的蛋白质中的氨基酸序列可以在融合多肽中聚在一起，或者通常存在于相同蛋白质中的氨基酸序列可以以新的排列方式置于融合多肽(例如，IL-10多肽与Fc多肽蛋白的融合物)中。例如，通过化学合成或通过产生和翻译多核苷酸来产生融合蛋白，在所述多核苷酸中肽区以所需的关系被编码。融合蛋白可以包含第二氨基酸序列，所述第二氨基酸序列与第一氨基酸序列通过肽、多肽或肽键、共价键、非肽键或非共价键连接。
如本文可互换使用的术语“连接”和“融合”是指第一氨基酸序列或核苷酸序列分别与第二氨基酸序列或核苷酸序列共价或非共价地连接。第一氨基酸或核苷酸序列可以与第二氨基酸或核苷酸序列直接连接或并置，或者可替代地，间插序列可以将第一序列与第二序列共价连接。术语“连接”不仅意指第一氨基酸序列与第二氨基酸序列在C末端或N末端融合，还包括将完整的第一氨基酸序列(或第二氨基酸序列)插入第二氨基酸序列(或对应地，第一氨基酸序列)中的任两个氨基酸之间。在一个实施方案中，所述第一氨基酸序列通过肽键或接头与第二氨基酸序列连接。第一核苷酸序列可以通过磷酸二酯键或接头连接至第二核苷酸序列。接头可以是肽或多肽(对于多肽链)或者核苷酸或核苷酸链(对于核苷酸链)或任何化学部分(对于多肽和多核苷酸链两者)。术语“连接”也用连字符(-)表示。
如本文所用，术语“与……缔合”是指在第一氨基酸链与第二氨基酸链之间形成的共价或非共价键。在一个实施方案中，术语“与……缔合”是指共价非肽键或非共价键。这种缔合可以用冒号表示，即(:)。在另一个实施方案中，它指除肽键外的共价键。例如，氨基酸半胱氨酸包含硫醇基，其可与第二个半胱氨酸残基上的硫醇基形成二硫键或二硫桥。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1区域和CL区域通过二硫键缔合，并且这两个重链通过在对应于使用Kabat编号系统的239和242的位置(位置226或229，EU编号系统)处的两个二硫键缔合。
如本文所用，“给药间隔”意指给药之间的时间间隔。给药间隔可以是例如，1天、2天、3天、7天(1周)、2周、3周、4周、6周、8周等。
“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括但不限于脊椎动物，如非人灵长类动物、绵羊、狗和啮齿动物(如小鼠、大鼠和豚鼠)。在优选的方面，受试者是人。术语“受试者”和“患者”在本文可互换使用。
本发明还包括多肽的片段或变体及其任何组合。当提及本公开文本的方法中使用的多肽时，术语“片段”或“变体”包括保留参考多肽的至少一些特性的任何多肽。除了本文其他地方讨论的特定抗体片段之外，多肽的片段还包括蛋白水解片段以及缺失片段，但是不包括天然存在的全长多肽(或成熟多肽)。本公开文本的方法中使用的多肽结合结构域或结合分子的变体包括如上所述的片段，以及由于氨基酸取代、缺失或插入而具有改变的氨基酸序列的多肽。变体可以是天然存在的或非天然存在的。非天然存在的变体可以使用本领域中已知的诱变技术来产生。变体多肽可包含保守或非保守氨基酸取代、缺失或添加。
“保守氨基酸取代”是用具有类似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，这些侧链包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、以及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，如果多肽中的氨基酸被来自相同侧链家族的另一种氨基酸替代，则将取代视为保守的。
术语两个多核苷酸或多肽序列之间的“序列同一性百分比”是指在比较窗口上序列共有的相同匹配位置的数目，其中考虑为实现两个序列的最佳比对必须引入的添加或缺失(即，空位)。匹配位置是在靶序列和参考序列中存在相同核苷酸或氨基酸的任何位置。由于空位不是核苷酸或氨基酸，因此不对靶序列中呈现的空位计数。同样地，由于对靶序列核苷酸或氨基酸而不是对参考序列中的核苷酸或氨基酸计数，因此不对参考序列中呈现的空位计数。
通过以下方式计算序列同一性的百分比：确定在两个序列中出现相同氨基酸残基或核酸碱基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中位置的总数目(靶序列或参考序列)，并且将结果乘以100以得到序列同一性百分比。序列的比较和两个序列之间的序列同一性百分比的确定可以使用容易获得的软件在线使用和下载来完成。合适的软件程序可自各种来源获得，并且可用于比对蛋白质和核苷酸序列。确定序列同一性百分比的一个合适程序是bl2seq，它是可从美国政府的国家生物技术信息中心BLAST网站(blast.ncbi.nlm.nih.gov)获得的BLAST程序套件的一部分。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法进行两个序列之间的比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。其他合适的程序是，例如Needle、Stretcher、Water或Matcher(EMBOSS生物信息学程序套件的一部分)，也可从欧洲生物信息学研究所(EBI)网站www.ebi.ac.uk/Tools/psa上获得。
与多核苷酸或多肽参考序列比对的单个多核苷酸或多肽靶序列内的不同区可各自具有其自身的序列同一性百分比。应注意，将序列同一性百分比值舍入至最接近的十分位。例如，将80.11、80.12、80.13和80.14向下舍入至80.1，而将80.15、80.16、80.17、80.18和80.19向上舍入至80.2。还应注意，长度值将总是整数。
本领域技术人员将理解，用于计算序列同一性百分比的序列比对的产生不限于仅由原始序列数据驱动的二元序列-序列比较。序列比对可以从多序列比对中衍生。产生多序列比对的一个合适的程序是ClustalW2，可从www.clustal.org获得。另一个合适的程序是MUSCLE，可从www.drive5.com/muscle/获得。可替代地，ClustalW2和MUSCLE可从例如EBI获得。
还应当理解，序列比对可以通过将序列数据与来自异质性来源的数据整合来产生，所述来自异质性来源的数据如结构数据(例如，结晶蛋白质结构)、功能数据(例如，突变位置)或系统发育数据。整合异质性数据以生成多序列比对的合适程序是T-Coffee，可从www.tcoffee.org获得，或者可替代地，例如，从EBI获得。还应当理解，用于计算序列同一性百分比的最终比对可以自动或手动选择。
多核苷酸变体可以含有在编码区、非编码区、或两者中的改变。在一个实施方案中，多核苷酸变体含有产生沉默取代、添加、或缺失但不改变编码的多肽的特性或活性的改变。在另一个实施方案中，核苷酸变体由归因于遗传密码的简并性的沉默取代产生。在其他实施方案中，其中5-10、1-5或1-2个氨基酸以任何组合被取代、缺失或添加的变体。可以出于多种原因产生多核苷酸变体，例如，以优化特定宿主的密码子表达(将人mRNA中的密码子改变为其他例如细菌宿主如大肠杆菌(E.coli)的)。
使用已知的蛋白质工程化和重组DNA技术的方法，可以生成变体以改善或改变多肽的特征。例如，可以从分泌蛋白的N末端或C末端缺失一种或多种氨基酸，而不会实质性损失生物学功能。参见Ron等人,J.Biol.Chem.268:2984-2988(1993)和Dobeli等人,J.Biotechnology 7:199-216(1988)，将其两者通过引用以其整体并入本文。此外，充分的证据表明，变体通常保留与天然存在的蛋白质的生物学活性相似的生物学活性。例如，Gayle和同事(J.Biol.Chem 268:22105-22111(1993)，通过引用以其整体并入本文)进行了人细胞因子IL-1a的扩展性突变分析，并且发现“[大部分]分子可以改变而对[结合活性或生物学活性]几乎没有影响”。(参见摘要)。
如上所述，多肽变体包括例如修饰的多肽。修饰包括，例如乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价附接、血红素部分的共价附接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附接、脂质或脂质衍生物的共价附接、磷脂酰肌醇的共价附接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联形成、半胱氨酸形成、焦谷氨酸形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚定形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒酰化(selenoylation)、硫酸化、转移RNA介导的氨基酸向蛋白质的添加(如精氨酰化和泛素化)。
术语“免疫疗法”是指通过包括诱导、增强、抑制或以其他方式修饰免疫应答的方法治疗患有疾病或者有感染疾病或遭受疾病复发风险的受试者。受试者的“治疗”或“疗法”是指对受试者进行的任何类型的干预或处理，或者向受试者施用活性剂，目的是逆转、减轻、改善、抑制、减缓或预防症状、并发症或病症的发作、进展、发展、严重程度或复发或者与疾病相关联的生化指标。
如本文所提及的术语“基于体重的剂量”意指基于患者的体重计算的向患者施用的剂量。关于本公开文本的方法和剂量的术语“平剂量”的使用意指在不考虑患者的体重或体表面积(BSA)的情况下向患者施用的剂量。因此，平剂量不以mg/kg剂量提供，而是以药剂的绝对量提供。关于本公开文本方法的术语“固定剂量”的使用意指在单个组合物中两种或更多种不同的药剂(例如Fc-IL-10和第二治疗剂(例如，抗体))以彼此之间特定(固定)的比率存在于组合物中。在一些方面，所述固定剂量基于药剂的重量(例如，mg)。在某些方面，所述固定剂量基于药剂的浓度(例如，mg/ml)。在一些方面，所述比率是至少约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9、约1:10、约1:15、约1:20、约1:30、约1:40、约1:50、约1:60、约1:70、约1:80、约1:90、约1:100、约1:120、约1:140、约1:160、约1:180、约1:200、约200:1、约180:1、约160:1、约140:1、约120:1、约100:1、约90:1、约80:1、约70:1、约60:1、约50:1、约40:1、约30:1、约20:1、约15:1、约10:1、约9:1、约8:1、约7:1、约6:1、约5:1、约4:1、约3:1、或约2:1mg第一药剂(例如，IL-10融合蛋白):mg第二抗体(例如，另外的抗癌疗法)。
药物或治疗剂的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是药物的当单独地或与另一种治疗剂组合使用时保护受试者免受疾病的发作或促进通过疾病症状的严重程度的降低、无进展期或总存活期的增加、无疾病症状期或无进展期的频率和持续时间的增加或由于疾病困扰引起的损伤或残疾的预防所证实的疾病消退的任何量。可以使用熟练的从业人员已知的多种方法评价治疗剂促进疾病消退的能力，如在临床试验期间的人受试者中，在预测人体中功效的动物模型系统中，或者通过测定药剂在体外测定中的活性进行评价。
举例来说，“抗癌剂”促进受试者的癌症消退。在一些方面，治疗有效量的药物促进癌症消退至消除癌症的程度。“促进癌症消退”意指单独地或与第二抗癌剂组合施用有效量的药物导致肿瘤生长或大小的减小、肿瘤的坏死、至少一种疾病症状的严重程度的降低、无疾病症状期的频率和持续时间的增加或由于疾病困扰引起的损伤或残疾的预防。另外，关于治疗的术语“有效的”和“有效性”包括药理学有效性和生理学安全性。药理学有效性是指药物促进患者中癌症消退的能力。生理学安全性是指由药物的施用引起的在细胞、器官和/或生物水平的毒性、免疫原性水平或其他不利生理效应(不利效应)的水平。
举例来说，对于肿瘤的治疗，相对于未治疗的受试者，治疗有效量的抗癌剂可以将细胞生长或肿瘤生长抑制至少约20％、更优选至少约40％、甚至更优选至少约60％、并且再更优选至少约80％。在本公开文本的其他方面，可以观察到肿瘤消退并持续至少约20天、至少约40天或至少约60天的时间段。在一些方面，治疗有效量的抗癌剂可以杀死肿瘤细胞。
“免疫应答”是如本领域所理解的，并且通常是指脊椎动物内针对外来因子(agent)或异常例如癌细胞的生物学应答，所述应答保护生物免受这些因子和由其引起的疾病的侵害。免疫应答是由免疫系统的一种或多种细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突细胞或嗜中性粒细胞)和通过这些细胞或肝脏中的任何一种产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用介导的，所述作用导致选择性靶向、结合、损伤、破坏和/或消除脊椎动物体中侵入的病原体、感染病原体的细胞或组织、癌性或其他异常细胞，或者在自身免疫性或病理性炎症的情况下导致选择性靶向、结合、损伤、破坏和/或消除正常的人细胞或组织。免疫应答包括例如T细胞(例如效应T细胞、Th细胞、CD4+细胞、CD8+T细胞或Treg细胞)的激活或抑制，或免疫系统的任何其他细胞(例如NK细胞)的激活或抑制。
如本文所用，术语“治疗”(“treat”、“treating”和“treatment”)是指对受试者进行的任何类型的干预或过程，目的是逆转、减轻、缓解、抑制或减缓或防止症状、并发症、病症或与疾病有关的生化指标的进展、发展、严重程度或复发，或提高总存活期。治疗可以是对患有疾病的受试者或没有疾病的受试者(例如，用于预防)。
举例来说，抗癌剂是在受试者中促进癌症消退的药物。在一些方面，治疗有效量的药物促进癌症消退至消除癌症的程度。“促进癌症消退”意指单独地或与第二抗癌剂组合施用有效量的药物导致肿瘤生长或大小的减小、肿瘤坏死、至少一种疾病症状的严重程度降低、无疾病症状期的频率和持续时间的增加、无进展存活期或总存活期的增加、由于疾病困扰引起的损伤或伤残的预防、或者患者中疾病症状以其他方式的改善。
如本文所用，术语“约每周一次”、“约每两周一次”或任何其他类似的剂量方案术语意指近似数。“约每周一次”可以包括每七天±一天，即每六天至每八天。“约每两周一次”可以包括每十四天±三天，即每十一天至每十七天。例如，类似的近似适用于约每三周一次、约每四周一次、约每五周一次、约每六周一次和约每十二周一次。在一些方面，约每六周一次或约每十二周一次的给药频率分别意指可以在第一周的任何日期施用第一剂量，然后可以在第六周或第十二周的任何日期施用下一剂量。在其他方面，约每六周一次或约每十二周一次的给药频率分别意指在第一周的特定日期(例如，星期一)施用第一剂量，然后在第六周或第十二周的相同日期(即星期一)施用下一剂量。
替代方案(例如，“或”)的使用应理解为意指替代方案中的任一者、两者或其任何组合。如本文中所用，不定冠词“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”应被理解为是指任何所述或列举组分的“一个/一种或多个/多种”。
术语“约”或“基本上由……构成”是指在如通过本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分取决于如何测量或确定所述值或组成，即测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”或“基本上由……构成”可以意指在1个或多于1个标准差内。可替代地，“约”或“基本上由……组成”可以意指高达10％的范围。此外，特别是关于生物系统或过程，所述术语可以意指高达值的一个数量级或高达值的5倍。当在本申请和权利要求中提供特定值或组成时，除非另有说明，否则应假定“约”或“基本上由……构成”的含义在该特定值或组成的可接受误差范围内。
如本文所述，除非另有说明，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所列举范围内的任何整数及(在适当时)其分数(如整数的十分之一和百分之一)的值。
II.融合蛋白
本公开文本的某些方面涉及包含IL-10多肽和第二多肽的IL-10融合蛋白。在一些方面，所述第二多肽可以是Fc多肽。在一些方面，所述第二多肽可以是白蛋白。在一些方面，所述IL-10融合蛋白能够诱导干扰素γ(IFNγ)，例如在人CD8+T细胞中。在一些方面，所述IL-10融合蛋白能够诱导人NK细胞的细胞介导的细胞毒性。在一些方面，所述IL-10融合蛋白能够形成二聚体，例如与第二IL-10融合蛋白形成同二聚体或与hIL-10蛋白形成异二聚体。在一些方面，所述IL-10融合蛋白能够结合IL-10受体。在一些方面，所述融合蛋白能够激活Jak1。在一些方面，所述IL-10融合蛋白能够激活Tyk2。在一些方面，所述IL-10融合蛋白能够激活STAT1。在一些方面，所述IL-10融合蛋白能够激活STAT3。在一些方面，所述IL-10融合蛋白能够激活STAT5。在一些方面，所述IL-10融合蛋白能够引发抗炎反应。在一些方面，所述IL-10融合蛋白能够引发促炎反应。在一些方面，所述IL-10融合蛋白是IL-10和Fc多肽融合物。本领域已知的任何IL-10多肽和/或Fc多肽可用于本文公开的融合蛋白中。在一些方面，所述IL-10融合蛋白是IL-10和白蛋白融合物。本领域已知的任何IL-10多肽和/或白蛋白多肽可用于本文公开的融合蛋白中。
II.A.IL-10多肽
如本文所用，除非另有指示，否则“白介素-10”和“IL-10”可以指人IL-10(“hIL-10”；Genbank登录号NP—000563；M37897；NM_000572；UniProt-P22301；或美国专利号6,217,857)或小鼠IL-10(“mIL-10”)。hIL-10表达为178个氨基酸长度的蛋白质，包括18个氨基酸的信号肽。成熟hIL-10蛋白(SEQ ID NO 1；表1)具有160个氨基酸。尽管hIL-10与mIL-10之间存在80％同源性，但是仅hIL-10对人和小鼠细胞起作用，而mIL-10具有物种特异性活性。
表1：IL-10序列。
Figure BDA0003868754360000121
Figure BDA0003868754360000131
同二聚体IL-10与单一类型的细胞表面受体(IL-10R)结合，所述细胞表面受体主要由造血细胞(如B细胞、T细胞、NK细胞、单核细胞和巨噬细胞)表达。发现在造血细胞之外几乎不表达。功能性IL-10R复合物是四聚体，由两个IL-10R1多肽链和两个IL-10R2链组成。IL-10/IL-10R相互作用激活分别与IL-10R1和IL-10R2相关的酪氨酸激酶Jak1和Tyk2。受体接合和酪氨酸磷酸化激活了细胞质局部的非活性转录因子STAT 1、3和5，从而导致转位和基因激活。通过此途径的信号传导可以导致抗炎作用和促炎作用。IL-10与广泛的疾病、障碍和病症(包括炎性病症、免疫相关障碍、纤维性障碍和癌症)有关。
IL-10具有相对短的体内血清半衰期。例如，通过体外生物测定或通过脓毒性休克模型系统中的功效测量的小鼠的半衰期是约2至6小时。IL-10活性的体内丧失可能是由于这样几个因素，包括肾脏清除、蛋白水解降解和血流中的单体化。由于其相对短的半衰期，IL-10与各种配偶体(包括聚乙二醇)缀合。
蛋白质的聚乙二醇化可以通过限制肾脏清除来增加其血清半衰期，因为PEG部分为蛋白质增加了相当大的流体动力半径。然而，常规的聚乙二醇化方法针对单体蛋白质和较大的二硫键合复合物，例如单克隆抗体。除IL-10外，其他细胞因子通常经由单聚乙二醇化(例如，与细胞因子蛋白上的单个残基附接的PEG分子)也被聚乙二醇化。
IL-10的聚乙二醇化存在其他聚乙二醇化蛋白质未遇到的问题，因为IL-10二聚体通过非共价相互作用保持在一起。IL-10的解离(其可以在聚乙二醇化期间增强)产生聚乙二醇化IL-10单体，但是这些单体不保留IL-10的生物学活性。此外，由于亚基改组，一个IL-10亚基上的单聚乙二醇化导致二聚乙二醇化、单聚乙二醇化和非聚乙二醇化IL-10分子的非均匀混合物。此外，允许聚乙二醇化反应进行至完成，还将允许非特异性和多聚乙二醇化靶蛋白，从而降低这些蛋白质的生物活性。因此，相比之下，保留同二聚体结构并且可以容易地均匀地产生的融合蛋白是有利的。
本公开文本的一些方面涉及包含IL-10多肽和Fc多肽的融合蛋白。本领域已知的任何IL-10多肽可用于本文所述的融合蛋白中。在一些方面，所述IL-10多肽包含hIL-10或其变体。在一些方面，所述IL-10多肽包含鼠IL-10或其变体。在一些方面，所述IL-10多肽包含非人灵长类动物IL-10或其变体。
在一些方面，所述IL-10多肽包含与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述IL-10多肽包含与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列具有至少约98％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述IL-10多肽包含与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列具有至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述IL-多肽包含具有10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、或2个或更少的取代、插入或缺失的SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述IL-多肽包含具有2个或更少的取代、插入或缺失的SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。在某些方面，所述IL-10多肽包含SEQ IDNO:1中所示的氨基酸序列。
在一些方面，所述IL-10多肽包含信号肽。在一些方面，所述信号肽与IL-10多肽的N末端融合。在一些方面，所述信号肽包含与SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸。在一些方面，所述信号肽包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列。
II.B.Fc多肽
本公开文本的某些方面涉及包含Fc结构域或其部分以及IL-10多肽的融合蛋白。Fc结构域或其部分可以改善融合蛋白的药代动力学或药效学特性。在某些方面，Fc结构域或其部分延长了与所述Fc结构域或其部分融合的分子的半衰期。
如本文所用，除非另有说明，否则在本文可互换使用的术语“Fc结构域”或“Fc区”是指FcR(例如，FcRn)结合配偶体或其突变型式，例如具有降低的与FcR的结合和/或降低的效应子功能的突变Fc。Fc结构域可以是对应于天然Ig的Fc结构域的多肽的部分，即如由其两条重链的各自的Fc结构域的二聚体缔合形成的。天然Fc结构域与另一个Fc结构域形成同二聚体。
在一些方面，“Fc区”是指单条Ig重链的如下部分，其始于紧邻木瓜蛋白酶切割位点(即，IgG中的残基216，以重链恒定区的第一个残基为114)上游的铰链区并终于抗体的C末端。因此，完整Fc结构域至少包含铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域。
根据Ig同种型，Ig恒定区的Fc区可以包括CH2、CH3和CH4结构域以及铰链区。包含Ig的Fc区的融合蛋白赋予融合蛋白若干种所需特性，包括增加的稳定性、增加的血清半衰期(参见Capon等人,1989,Nature 337:525)以及与Fc受体(如新生儿Fc受体(FcRn))的结合(美国专利号6,086,875、6,485,726、6,030,613；WO 03/077834；US2003-0235536A1)，将上述文献通过引用以其整体并入本文。
可用于本公开文本的Fc区涵盖可以特异性结合FcR的分子，包括完整IgG、IgG的Fc片段和包括FcR的完整结合区的其他片段。已经基于X射线晶体学描述了IgG的Fc部分中与例如FcRn受体结合的区域(Burmeister等人1994,Nature 372:379)。Fc与FcRn的主要接触区域靠近CH2和CH3结构域的接合点。
特异性结合是指两个分子形成在生理条件下相对稳定的复合物。特异性结合的特征在于区分于通常具有低亲和力和中至高容量的非特异性结合的高亲和力和低至中容量。通常，在亲和常数KA高于106M-1或高于108M-1时，将结合视为特异性的。如果需要，可以通过改变结合条件在不显著影响特异性结合的情况下减少非特异性结合。技术人员使用常规技术可以优化适当的结合条件，如分子浓度、溶液的离子强度、温度、允许结合的时间、阻断剂(例如，血清白蛋白、乳酪蛋白)浓度等。
在某些方面，本公开文本的融合蛋白包含一个或多个截短的Fc区，但是其足以给Fc区赋予FcR结合特性。例如，Fc区中结合至FcRn的部分(即，FcRn结合部分)包含IgG1的约氨基酸282-438，采用EU编号(主要接触位点是CH2结构域的氨基酸248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314以及CH3结构域的氨基酸残基385-387、428和433-436)。因此，本公开文本的Fc区可以包含FcRn结合部分或由所述FcRn结合部分组成。
FcR结合部分可以衍生自任何同种型(包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)的重链。在一些方面，使用来自人同种型IgG1的抗体的FcR结合部分。在一些方面，使用来自人同种型IgG2的抗体的FcR结合部分。在一些方面，使用来自人同种型IgG3的抗体的FcR结合部分。在一些方面，使用来自人同种型IgG4的抗体的FcR结合部分。
在另一方面，“Fc区”包括Fc结构域的或衍生自Fc结构域的氨基酸序列。在某些方面，Fc区包含以下中的至少一者：铰链(例如，上部、中间和/或下部铰链区)结构域(根据EU编号的抗体Fc区的约氨基酸216-230)、CH2结构域(根据EU编号的抗体Fc区的约氨基酸231-340)、CH3结构域(根据EU编号的抗体Fc区的约氨基酸341-438)、CH4结构域或其变体、部分或片段。在其他方面，Fc区包含完整的Fc结构域(即，铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域)。在一些方面，Fc区包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：与CH3结构域(或其部分)融合的铰链结构域(或其部分)、与CH2结构域(或其部分)融合的铰链结构域(或其部分)、与CH3结构域(或其部分)融合的CH2结构域(或其部分)、与铰链结构域(或其部分)和CH3结构域(或其部分)两者融合的CH2结构域(或其部分)。在再其他方面，Fc区缺乏CH2结构域的至少一部分(例如，CH2结构域的全部或部分)。在特定方面，Fc区包含对应于EU编号221至447的氨基酸或由其组成。
在一些方面，多肽的Fc区衍生自人Ig。然而，应理解，Fc区可以衍生自另一哺乳动物物种的Ig，所述另一哺乳动物物种包括例如啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、兔或豚鼠)或非人灵长类动物(例如，黑猩猩、猕猴)物种。此外，Fc结构域或其部分的多肽可以衍生自任何Ig类别(包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE)以及任何Ig同种型(包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)。在另一个方面，使用人同种型IgG1。
在某些方面，Fc多肽可以赋予由包含野生型Fc结构域的Fc区赋予的至少一种效应子功能的变化(例如，Fc区结合至Fc受体(例如结合至FcγRI、FcγRII或FcγRIII的改善或降低)、补体蛋白(例如，C1q)或其他Fc结合配偶体(例如，DC-SIGN)的能力的改善或降低，或改变、触发、增强或降低抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、吞噬作用或补体依赖性细胞毒性(CDCC)的能力的改善或降低)。在某些方面，Fc多肽可以具有降低的ADCC。在其他方面，Fc变体提供工程化半胱氨酸残基。
本公开文本的Fc区可以利用本领域公认的Fc变体，已知所述Fc变体可赋予效应子功能和/或FcR或FcRn结合的变化(例如，增强或降低)。具体来说，本公开文本的结合分子可以包括例如在以下文献中披露的一个或多个氨基酸位置处的变化(例如，取代)：国际PCT公开案WO 88/07089、WO 96/14339、WO 98/05787、WO 98/23289、WO 99/51642、WO 99/58572、WO 00/09560、WO 00/32767、WO 00/42072、WO 02/44215、WO 02/060919、WO 03/074569、WO04/016750、WO 04/029207、WO 04/035752、WO 04/063351、WO 04/074455、WO 04/099249、WO05/040217、WO 04/044859、WO 05/070963、WO 05/077981、WO 05/092925、WO 05/123780、WO06/019447、WO 06/047350和WO 06/085967；美国专利公开号US 2007/0231329、US 2007/0231329、US 2007/0237765、US 2007/0237766、US 2007/0237767、US 2007/0243188、US2007/0248603、US 2007/0286859、US 2008/0057056；或美国专利案5,648,260；5,739,277；5,834,250；5,869,046；6,096,871；6,121,022；6,194,551；6,242,195；6,277,375；6,528,624；6,538,124；6,737,056；6,821,505；6,998,253；7,083,784；7,404,956和7,317,091；将其各自通过引用以其整体并入本文。在一些方面，可以在一个或多个所披露的氨基酸位置进行特定变化(例如，本领域中披露的一个或多个氨基酸的特定取代)。在另一个方面，可以在一个或多个所披露的氨基酸位置进行不同变化(例如，本领域中披露的一个或多个氨基酸位置的不同取代)。
Fc区可以根据公认程序(如定点诱变等)来修饰，以产生将由FcγRIIB和/或DC-SIGN结合的经修饰的Fc片段或其部分。此类修饰包括远离FcγRIIB和/或DC-SIGN接触位点的修饰以及在接触位点内的修饰，所述修饰保留或改变与FcγRIIB和/或DC-SIGN的结合。可以将突变单独引入Fc中，从而产生多于一百个与天然Fc不同的Fc区。另外，这些单独突变中的两个、三个或更多个的组合可以一起引入，从而产生另外数百个Fc区。此外，本公开文本的构建体的一个Fc区可以发生突变，并且所述构建体的另一个Fc区完全不突变，或者所述两者可以都发生突变但是突变不同。
某些上述突变可以对Fc区或FcRn结合配偶体赋予新功能。例如，一个方面并入N297A，从而去除高度保守的N糖基化位点。此突变增强了Fc区的循环半衰期，并且使Fc区无法与FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIIA结合，而没有损害对FcRn的亲和力(Routledge等人1995,Transplantation 60:847；Friend等人1999,Transplantation 68:1632；Shields等人1995,J.Biol.Chem.276:6591)。作为从上述突变产生的新功能的另一例子，对FcRn的亲和力可以增加，在一些情况下超过野生型的亲和力。这种增加的亲和力可以反映增加的“缔合”速率、降低的“解离”速率、或增加的“缔合”速率与降低的“解离”速率两者。认为可赋予增加的对FcRn的亲和力的突变的例子包括但不限于T256A、T307A、E380A和N434A(Shields等人2001,J.Biol.Chem.276:6591)。
另外，至少三种人Fcγ受体显现可识别IgG上在下部铰链区内的结合位点，通常是氨基酸234-237。因此，如例如通过将人IgG1的氨基酸233-236“ELLG”替代为来自IgG2的相应序列“PVA”(具有一个氨基酸缺失)，可以从这个区域的突变产生新功能性的另一个例子和可能降低的免疫原性。已经显示，在已经引入此类突变时，介导各种效应子功能的FcγRI、FcγRII和FcγRIII不会结合至IgG1。Ward和Ghetie 1995,Therapeutic Immunology2:77和Armour等人1999,Eur.J.Immunol.29:2613。
在一些方面，Fc结构域或其部分是包括美国专利号5,739,277的SEQ ID NO:3、并且任选地进一步包括选自美国专利号5,739,277的SEQ ID NO:11、1、2和31的序列的多肽。
在某些方面，Fc结构域或其部分是半糖基化的，其中融合蛋白包含至少两个Fc区，并且其中至少一个Fc区是糖基化的(例如，糖基化的CH2区)并且至少一个Fc区是去糖基化的(例如，去糖基化的CH2区)。在一些方面，可以在糖基化Fc区与非糖基化Fc区之间插入接头。在另一方面，Fc区被完全糖基化，即所有的Fc区都被糖基化。在其他方面，Fc区可以是非糖基化的，即，没有Fc部分被糖基化。
在某些方面，本公开文本的融合蛋白包含对Fc结构域或其部分的氨基酸取代(例如，Fc变体)，所述氨基酸取代改变Fc结构域的非抗原依赖性效应子功能，特别是蛋白质的循环半衰期。
当与缺乏这些取代的蛋白质相比时，此类蛋白质展现出增加或减少的与FcR的结合，因此分别具有增加或减少的血清半衰期。具有改善的对FcR的亲和力的Fc变体预期具有较长的血清半衰期，并且此类分子在治疗如下哺乳动物的方法中具有有用的应用，在所述哺乳动物中需要所施用的多肽具有长半衰期例如以治疗慢性疾病或障碍(参见，例如，美国专利7,348,004、7,404,956和7,862,820)。相反，预期具有降低的FcR结合亲和力的Fc变体具有较短的半衰期，并且此类分子也是有用的，例如，用于在缩短的循环时间可能有利的情况下施用于哺乳动物，例如，用于体内诊断成像或者用于当起始多肽在循环中存在延长时间段时具有毒性副作用的情况下。具有降低的FcRn结合亲和力的Fc变体也不太可能穿过胎盘，因此也可用于治疗孕妇的疾病或障碍。另外，可能需要降低的FcRn结合亲和力的其他应用包括需要定位到脑、肾脏和/或肝脏的那些应用。在一个示例性方面，本公开文本的融合蛋白展现出从脉管系统穿过肾小球上皮的运输减少。在另一个方面，本公开文本的融合蛋白展现出从脑穿过血脑屏障(BBB)进入血管空间的转运减少。在一些方面，具有改变的FcR结合的蛋白质包含在Ig恒定区的“FcR结合环”内具有一个或多个氨基酸取代的至少一个Fc区(例如，一个或两个Fc区)。在一些方面，FcR结合环由野生型全长Fc区的氨基酸残基280-299(根据EU编号)构成。在其他方面，本公开文本的嵌合蛋白中具有改变的FcR结合亲和力的Ig恒定区或其部分包含至少一个在
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Figure BDA0003868754360000172
“接触区”内具有一个或多个氨基酸取代的Fc区。改变FcR结合亲和力的示例性氨基酸取代披露于国际PCT公开号WO 05/047327和美国公开号US2012003210(A1)中，将其各自通过引用以其整体并入本文。本公开文本中使用的Fc区还可以包含本领域公认的氨基酸取代，所述氨基酸取代改变融合蛋白的糖基化。例如，融合蛋白中与本文公开的IL-10多肽相连的Fc区可以包含具有突变(所述突变导致改变的糖基化(例如，N或O连接的糖基化))的Fc区，或可以包含改变的效应子功能。
在一些方面，本公开文本的融合蛋白可以包含基因融合的Fc区(即，scFc区)，所述基因融合的Fc区具有两个或更多个其组成型Ig恒定区或所述组成型Ig恒定区的部分(独立地选自本文所述的Ig恒定区或其部分)。在一些方面，二聚体Fc区的Fc区是相同的。在另一方面，Fc区的至少两个是不同的。例如，本公开文本的蛋白质的Fc区包含相同数目的氨基酸残基，或者它们可以在长度方面相差一个或多个氨基酸残基(例如，相差约5个氨基酸残基(例如，1、2、3、4或5个氨基酸残基)、约10个残基、约15个残基、约20个残基、约30个残基、约40个残基或约50个残基)。在又其他方面，本公开文本的蛋白质的Fc区可以在序列方面在一个或多个氨基酸位置处不同。例如，Fc区中的至少两个可以在约5个氨基酸位置(例如，1、2、3、4或5个氨基酸位置)、约10个位置、约15个位置、约20个位置、约30个位置、约40个位置或约50个位置处不同。
多个Fc区基因序列(例如，人Fc基因序列)能以可公开获得的存放物的形式获得。可以选择具有特定效应子功能(或缺少特定效应子功能)或具有特定修饰的Fc序列以降低免疫原性或ADCC。已经公开了许多抗体和抗体编码基因的序列，并且合适的Fc区序列可以使用本领域公认的技术从这些序列衍生。然后可以改变或合成使用任何前述方法获得的遗传物质以获得本公开文本的方法中使用的嵌合蛋白。应进一步了解，本公开文本的范围涵盖恒定区DNA序列的等位基因、变体和突变。
在某些方面，Fc多肽包含一种或多种修饰，所述修饰导致抗体依赖性细胞毒性(ADCC)降低。在一些方面，Fc多肽包含含有一个或多个选自L234A、L235E、G237A、P238K(根据EU编号)及其任何组合的取代的IgG1 Fc区。在一些方面，Fc多肽包含含有L234A取代的IgG1 Fc区。在一些方面，Fc多肽包含含有L235E取代的IgG1 Fc区。在一些方面，Fc多肽包含含有G237A取代的IgG1 Fc区。在一些方面，Fc多肽包含含有P238K取代的IgG1 Fc区。在一些方面，Fc多肽包含含有L234A、L235E和G237A取代的IgG1 Fc区。在一些方面，Fc多肽包含含有末端K残基的IgG1 Fc区。在一些方面，Fc多肽包含缺乏末端K残基的IgG1 Fc区。在一些方面，Fc多肽包含含有末端G残基的IgG1 Fc区。在一些方面，Fc多肽包含含有半胱氨酸桥(例如半胱氨酸桥变体)的IgG1 Fc区。在一些方面，半胱氨酸桥变体包含N末端VEPKSC(SEQ IDNO:13)。在某些方面，Fc多肽包含IgG1.3f Fc区。
在一些方面，Fc多肽包含与选自SEQ ID NO:4-12(表2)的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，Fc多肽包含选自SEQ ID NO:4-12的氨基酸序列。在一些方面，Fc多肽包含与SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，Fc多肽包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列。在一些方面，Fc多肽包含与SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，Fc多肽包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列。在一些方面，Fc多肽包含与SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，Fc多肽包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列。在一些方面，Fc多肽包含与SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，Fc多肽包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列。在一些方面，Fc多肽包含与SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，Fc多肽包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列。在一些方面，Fc多肽包含与SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，Fc多肽包含SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列。在一些方面，Fc多肽包含与SEQ IDNO:10中所示的氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，Fc多肽包含SEQ IDNO:10中所示的氨基酸序列。在一些方面，Fc多肽包含与SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，Fc多肽包含SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列。在一些方面，Fc多肽包含与SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，Fc多肽包含SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列。
表2：示例性Fc多肽序列。
Figure BDA0003868754360000181
Figure BDA0003868754360000191
II.C.接头
在某些方面，所述IL-10多肽通过接头与所述Fc多肽连接。本领域已知的任何接头均可用于本文公开的融合蛋白中。在一些方面，所述接头包含化学接头。在一些方面，所述接头包含共价键。在一些方面，所述接头包含肽键。在一些方面，所述接头包含一个或多个氨基酸。在一些方面，所述接头包含肽接头。
接头可以是任何长度。在一些方面，所述接头包含至少约1至至少约100个氨基酸、至少约1至至少约75个氨基酸、至少约1至至少约50个氨基酸、至少约1至至少约40个氨基酸、至少约1至至少约30个氨基酸、至少约1至至少约25个氨基酸、至少约1至至少约20个氨基酸、至少约1至至少约15个氨基酸、至少约1至至少约10个氨基酸、或至少约1至至少约5个氨基酸。在一些方面，所述接头包含至少约5至至少约100个氨基酸、至少约5至至少约75个氨基酸、至少约5至至少约50个氨基酸、至少约5至至少约40个氨基酸、至少约5至至少约30个氨基酸、至少约5至至少约25个氨基酸、至少约5至至少约20个氨基酸、至少约5至至少约15个氨基酸、或至少约5至至少约10个氨基酸。在一些方面，所述接头包含至少约10至至少约100个氨基酸、至少约10至至少约75个氨基酸、至少约10至至少约50个氨基酸、至少约10至至少约40个氨基酸、至少约10至至少约30个氨基酸、至少约10至至少约25个氨基酸、至少约10至至少约20个氨基酸、或至少约10至至少约15个氨基酸。在一些方面，所述接头包含至少约5至至少约25个氨基酸。在一些方面，所述接头包含至少约10至至少约25个氨基酸。在一些方面，所述接头包含至少约10至至少约20个氨基酸。在一些方面，所述接头包含至少约15至至少约25个氨基酸。
在一些方面，所述接头包含至少约4个氨基酸、至少约5个氨基酸、至少约6个氨基酸、至少约7个氨基酸、至少约8个氨基酸、至少约9个氨基酸、至少约10个氨基酸、至少约11个氨基酸、至少约12个氨基酸、至少约13个氨基酸、至少约14个氨基酸、至少约15个氨基酸、至少约16个氨基酸、至少约17个氨基酸、至少约18个氨基酸、至少约19个氨基酸、至少约20个氨基酸、至少约21个氨基酸、至少约22个氨基酸、至少约23个氨基酸、至少约24个氨基酸、至少约25个氨基酸、或至少约30个氨基酸。在一些方面，所述接头包含约4个氨基酸。在一些方面，所述接头包含约5个氨基酸。在一些方面，所述接头包含约8个氨基酸。在一些方面，所述接头包含约10个氨基酸。在一些方面，所述接头包含约11个氨基酸。在一些方面，所述接头包含约15个氨基酸。在一些方面，所述接头包含约20个氨基酸。在一些方面，所述接头包含约21个氨基酸。在一些方面，所述接头包含约22个氨基酸。
各种肽接头是本领域已知的并且可用于本公开文本的融合蛋白中。在一些方面，所述接头包含甘氨酸-丝氨酸接头，例如包含至少一个甘氨酸残基和至少一个丝氨酸残基的接头。可以使用甘氨酸和丝氨酸残基的任何组合。在一些方面，所述接头包含G-S。在一些方面，所述接头包含G-G-S。在一些方面，所述接头包含GGGS(SEQ ID NO:38)。在一些方面，所述接头包含GGGGS(SEQ ID NO:39)。在一些方面，所述接头包含GGGGGS(SEQ ID NO:40)。在一些方面，所述接头包含至少一个GGGS(SEQ ID NO:38)基序。在一些方面，所述接头包含至少两个GGGS(SEQ ID NO:38)基序。在一些方面，所述接头包含至少三个GGGS(SEQ ID NO:38)基序。在一些方面，所述接头包含至少四个GGGS(SEQ ID NO:38)基序。
在一些方面，所述接头包含至少一个GGGGS(SEQ ID NO:39)基序。在一些方面，所述接头包含至少两个GGGGS(SEQ ID NO:39)基序。在一些方面，所述接头包含至少三个GGGGS(SEQ ID NO:39)基序。在一些方面，所述接头包含至少四个GGGGS(SEQ ID NO:39)基序。
在某些方面，所述接头包含选自SEQ ID NO:41-45的氨基酸序列(表3)。在一些方面，所述接头包含SEQ ID NO:41中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述接头包含SEQ IDNO:42中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述接头包含SEQ ID NO:43中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述接头包含SEQ ID NO:44中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述接头包含SEQ ID NO:45中所示的氨基酸序列。
表3：示例性接头序列。
Figure BDA0003868754360000201
在一些方面，所述接头是可切割接头。在一些方面，所述接头包含酶促切割位点。在一些方面，所述接头能够通过一种或多种存在于靶组织处的酶切割。在一些方面，接头的切割导致IL-10多肽从Fc多肽中释放。本领域已知的任何可切割接头均可单独使用或与一种或多种本文公开的其他接头结合使用。
II.D.IL-10融合蛋白
本公开文本的某些方面涉及包含本文公开的IL-10多肽和本文公开的Fc多肽的融合蛋白。在一些方面，所述融合蛋白具有IL-10功能。在某些方面，所述融合蛋白能够增强干扰素γ(IFNγ)水平。在某些方面，所述融合蛋白能够诱导例如人CD8+T细胞中的IFNγ。在一些方面，所述融合蛋白能够诱导人NK细胞的细胞介导的细胞毒性。在一些方面，所述融合蛋白能够形成二聚体，例如与第二融合蛋白形成同二聚体或与hIL-10蛋白形成异二聚体。在一些方面，所述融合蛋白能够与IL-10受体结合。在一些方面，所述融合蛋白能够激活Jak1。在一些方面，所述融合蛋白能够激活Tyk2。在一些方面，所述融合蛋白能够激活STAT1。在一些方面，所述融合蛋白能够激活STAT3。在一些方面，所述融合蛋白能够激活STAT5。在一些方面，所述融合蛋白能够引发抗炎反应。在一些方面，所述融合蛋白能够引发促炎反应。
本公开文本考虑了IL-10多肽和Fc多肽的任一取向。因此，在一些方面，IL-10多肽的N末端与Fc多肽的C末端连接(直接或间接)，例如Fc-IL-10。在一些方面，IL-10多肽的N末端与Fc多肽的C末端直接连接，例如没有肽接头。在一些方面，IL-10多肽的N末端通过一个或多个氨基酸与Fc多肽的C末端连接。在一些方面，IL-10多肽的N末端通过肽接头，例如通过本文公开的任何肽接头，与Fc多肽的C末端连接。
在一些方面，所述融合蛋白包含与选自SEQ ID NO:14-32(表4)的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列具有至少约96％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列具有至少约97％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列具有至少约98％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列具有至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列。
在一些方面，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:21中所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:23中所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:29中所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:30中所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:31中所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:32中所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
表4：示例性融合蛋白氨基酸序列。
Figure BDA0003868754360000221
Figure BDA0003868754360000231
Figure BDA0003868754360000241
Figure BDA0003868754360000251
在一些方面，所述融合蛋白包含具有10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少的取代、插入或缺失的选自SEQ ID NO:14-32的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含具有10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少的取代、插入或缺失的SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含具有10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少的取代、插入或缺失的SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含具有10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少的取代、插入或缺失的SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含具有10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少的取代、插入或缺失的SEQ IDNO:17中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含具有10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少的取代、插入或缺失的SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含具有10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少的取代、插入或缺失的SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含具有10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少的取代、插入或缺失的SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含具有10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少的取代、插入或缺失的SEQ ID NO:21中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含具有10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少的取代、插入或缺失的SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含具有10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少的取代、插入或缺失的SEQ ID NO:23中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含具有10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少的取代、插入或缺失的SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含具有10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少的取代、插入或缺失的SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含具有10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少的取代、插入或缺失的SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含具有10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少的取代、插入或缺失的SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含具有10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少的取代、插入或缺失的SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含具有10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少的取代、插入或缺失的SEQ ID NO:29中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含具有10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少的取代、插入或缺失的SEQID NO:30中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含具有10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少的取代、插入或缺失的SEQ ID NO:31中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含具有10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少的取代、插入或缺失的SEQ ID NO:32中所示的氨基酸序列。
在一些方面，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含SEQID NO:16中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:21中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:23中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:29中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:30中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:31中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:32中所示的氨基酸序列。
在一些方面，所述融合蛋白包含与选自SEQ ID NO:33-36(表4)的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:33中所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:34中所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:35中所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:36中所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，所述融合蛋白包含具有10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少的取代、插入或缺失的选自SEQ ID NO:33-36的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含具有10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少的取代、插入或缺失的SEQ ID NO:33中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含具有10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少的取代、插入或缺失的SEQ ID NO:34中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含具有10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少的取代、插入或缺失的SEQ ID NO:35中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含具有10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少的取代、插入或缺失的SEQ IDNO:36中所示的氨基酸序列。
在一些方面，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:33中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:34中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含SEQID NO:35中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:36中所示的氨基酸序列。
II.E.IL-10融合蛋白二聚体
在某些方面，所述融合蛋白包含IL-10二聚体。在一些方面，所述IL-10二聚体包含第一多肽和第二多肽，其中所述第一多肽包含本文所述的任何IL-10融合蛋白，并且其中所述第二多肽包含第二Fc多肽。在某些方面，所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽通过共价键连接或缔合。在一些方面，所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽通过肽键连接或缔合。在另一方面，所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽通过二硫键连接或缔合。在一些方面，所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽通过一个或多个氨基酸连接或缔合。在一些方面，所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽通过肽接头连接或缔合。本领域已知和/或本文公开的任何接头可用于连接所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽。在一些方面，所述第一多肽和所述第二多肽通过所述第一Fc多肽与所述第二Fc多肽之间的二硫键连接。在一些方面，所述第一多肽和所述第二多肽通过所述第一Fc多肽的C末端与所述第二Fc多肽的N末端之间的肽接头连接。在一些方面，所述第一多肽和所述第二多肽通过所述第一Fc多肽的N末端与所述第二Fc多肽的C末端之间的肽接头连接。在一些方面，所述第一多肽和所述第二多肽通过所述第一Fc多肽的C末端与所述第二IL-10多肽的N末端之间的肽接头连接。在一些方面，所述第一多肽和所述第二多肽通过所述第一Fc多肽的N末端与所述第二IL-10多肽的C末端之间的肽接头连接。在一些方面，所述第一多肽和所述第二多肽通过单链Fc区连接。在一些方面，所述第一多肽与所述第二多肽之间的接头是可切割接头。
在一些方面，所述第二多肽包含与第二Fc多肽融合的第二IL-10多肽。在一些方面，所述第一多肽的IL-10多肽与所述第二IL-10多肽相同。在一些方面，所述第一多肽的IL-10多肽与所述第二IL-10多肽不同。在一些方面，所述第一多肽的Fc多肽与所述第二Fc多肽相同。在一些方面，所述第一多肽的Fc多肽与所述第二Fc多肽不同。在一些方面，所述IL-10多肽与所述第二IL-10多肽相同，并且所述Fc多肽与所述第二Fc多肽相同。在一些方面，所述IL-10多肽与所述第二IL-10多肽相同，并且所述Fc多肽与所述第二Fc多肽不同。在一些方面，所述IL-10多肽与所述第二IL-10多肽不同，并且所述Fc多肽与所述第二Fc多肽相同。在一些方面，所述IL-10多肽与所述第二IL-10多肽不同，并且所述Fc多肽与所述第二Fc多肽不同。在一些方面，所述二聚体是同二聚体。在一些方面，所述二聚体是异二聚体。
在一些方面，所述IL-10二聚体包含第一多肽和第二多肽，其中所述第一多肽包含本文所述的任何IL-10融合蛋白，并且其中所述第二多肽包含第二IL-10多肽。在一些方面，所述第二多肽不包含第二Fc多肽。
II.F.多核苷酸
在某些方面，本文提供了包含编码本文所述的具有IL-10活性的融合蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，例如DNA或RNA，以及包含此类多核苷酸序列的载体，例如用于在宿主细胞如哺乳动物细胞中有效表达的表达载体。在一些方面，本文提供了编码选自SEQ ID NO:14-36的多肽序列的多核苷酸序列。
如本文所用，“分离的”多核苷酸或核酸分子是与存在于核酸分子的天然来源(例如，在小鼠或人)中的其他核酸分子分离的多核苷酸或核酸分子。例如，“分离的”核酸分子，如cDNA分子，在通过重组技术产生时可以基本上不含其他细胞材料或培养基，或在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品。例如，语言“基本上不含”包括具有小于约15％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％(特别是小于约10％)的其他材料(例如，细胞材料、培养基、其他核酸分子、化学前体和/或其他化学品)的多核苷酸或核酸分子制剂。在具体方面，编码本文所述的融合蛋白的一种或多种核酸分子是分离的或纯化的。
可以通过本领域已知的任何方法获得多核苷酸，并确定多核苷酸的核苷酸序列。可以使用本领域熟知的方法确定编码本文所述的融合蛋白(例如表4中所述的融合蛋白)以及这些融合蛋白的修饰形式的核苷酸序列，即，将已知编码特定氨基酸的核苷酸密码子以产生编码所述融合蛋白的核酸的方式组装。这种编码所述融合蛋白的多核苷酸可以由化学合成的寡核苷酸组装(例如，如在Kutmeier G等人,(1994),BioTechniques 17:242-6中所述)，其简要地涉及合成含有编码所述融合蛋白的序列的部分的重叠寡核苷酸、退火和连接这些寡核苷酸、并且然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。
如果无法获得含有编码特定融合蛋白的核酸的克隆，但是融合蛋白分子的序列是已知的，则可以通过从合适的来源(例如cDNA文库、或从表达目的蛋白的任何组织或细胞(如表达本文所述的融合蛋白的一部分的哺乳动物细胞)产生的cDNA文库、或从所述任何组织或细胞分离的核酸(在一些方面为聚A+RNA))化学合成或通过以下方式获得编码所述融合蛋白的核酸：使用可与所述序列的3’和5’末端杂交的合成引物进行PCR扩增或将对特定基因序列具有特异性的寡核苷酸探针进行克隆以鉴定例如来自cDNA文库的编码所述融合蛋白的至少一部分的cDNA克隆。然后可以使用本领域熟知的任何方法将通过PCR产生的扩增的核酸克隆到可复制的克隆载体中。
编码本文所述的融合蛋白的DNA可以使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合至编码本文所述融合蛋白的基因的寡核苷酸探针)容易地分离并测序。人细胞可以用作这种DNA的来源。一旦分离，可以将DNA置于表达载体中，然后将其转染到宿主细胞(如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如，来自CHO GS SYSTEMTM(Lonza)的CHO细胞)或原本不产生融合蛋白的骨髓瘤细胞)中，以在重组宿主细胞中获得融合蛋白的合成。
进一步认识到，编码本文所述的融合蛋白的多核苷酸可以包含有助于融合蛋白翻译的其他元件。此类序列包括，例如，与编码融合蛋白的多核苷酸的5'末端附接的Kozak序列。
II.G.细胞和载体
在某些方面，本文提供了表达(例如以重组方式)本文所述融合蛋白的细胞(例如宿主细胞)和包含编码本文所述融合蛋白的核苷酸的表达载体。本文提供了包含多核苷酸的载体(例如表达载体)，所述多核苷酸包含编码用于在宿主细胞中重组表达的融合蛋白的核苷酸序列。
在一些方面，所述宿主细胞包含本文所述的核酸。
在一些方面，所述宿主细胞是真核细胞。在一些方面，所述宿主细胞选自哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、转基因哺乳动物细胞和植物细胞。在一些方面，所述宿主细胞是原核细胞。在一些方面，所述原核细胞是细菌细胞。
在一些方面，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。此类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、HeLa、MDCK、HEK293、NIH 3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O和T47D、NS0(不内源产生任何免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系)、CRL7O3O、COS(例如，COS1或COS)、PER.C6、VERO、HsS78Bst、HEK-293T、HepG2、SP2/0、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20、BMT10和HsS78Bst细胞。在某些方面，所述融合蛋白在HEK293细胞中表达。在某些方面，所述融合蛋白在CHO细胞中表达。
如本文所用，表达载体是指任何核酸构建体，其含有用于插入的编码序列的转录和翻译的必需元件，或者在RNA病毒载体的情况下，当引入时合适的宿主细胞时用于复制和翻译的必需元件。表达载体可包括质粒、噬菌粒、病毒及其衍生物。
如本文所用，基因表达控制序列是任何调节核苷酸序列，如启动子序列或启动子-增强子组合，可促进与其可操作地连接的编码核酸的有效转录和翻译。基因表达控制序列可以是，例如哺乳动物或病毒启动子，如组成型启动子或诱导型启动子。
出于本公开文本的目的，可以使用许多表达载体系统。这些表达载体典型地可作为附加体或作为宿主染色体DNA的组成部分在宿主生物中复制。表达载体可包括表达控制序列，包括但不限于启动子(例如天然关联的或异源启动子)、增强子、信号序列、剪接信号、增强子元件和转录终止序列。在一些方面，表达控制序列是在能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统。表达载体还可以利用衍生自动物病毒的DNA元件，所述动物病毒如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)、巨细胞病毒(CMV)或SV40病毒。其他涉及具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统的使用。
一般来说，表达载体含有选择标记(例如氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性或新霉素抗性)以允许检测用所需DNA序列转化的那些细胞(参见例如，Itakura等人，美国专利号4,704,362)。可以通过引入一种或多种标记来选择已将DNA整合至其染色体中的细胞，所述一种或多种标记允许选择经转染的宿主细胞。所述标记可以提供对营养缺陷型宿主的原养性、杀生物剂抗性(例如抗生素)或对重金属如铜的抗性。选择性标记基因可以直接与待表达的DNA序列连接，或通过共转化引入同一细胞中。
在其他方面，使用多顺反子构建体表达本公开文本的多肽。在这些表达系统中，可以从单个多顺反子构建体产生多个目的基因产物，如多聚体结合蛋白的多个多肽。这些系统有利地使用内部核糖体进入位点(IRES)以在真核宿主细胞中提供相对高水平的多肽。相容的IRES序列在美国专利号6,193,980中公开。
更一般地，一旦制备了编码多肽的载体或DNA序列，就可以将所述表达载体引入合适的宿主细胞中。也就是说，所述宿主细胞可被转化。如上所讨论的，可以通过本领域技术人员熟知的各种技术来实现将质粒引入宿主细胞中。转化的细胞在适于产生所述融合蛋白的条件下生长，并进行融合蛋白合成测定。示例性测定技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或荧光激活细胞分选仪分析(FACS)、免疫组织化学等。
II.H.药物组合物
包含IL-10多肽和Fc多肽的本文公开的各种融合蛋白可以掺入到适于施用的药物组合物中。此类组合物通常包含融合蛋白和药学上可接受的载体。如本文所用，语言“药学上可接受的载体”旨在包括与药物施用相容的任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域熟知的。
在一些方面，公开了一种药物组合物，所述药物组合物包含(a)如本文所述的融合蛋白和(b)药学上可接受的赋形剂。
在一些方面，公开了一种药物组合物，所述药物组合物包含(a)如本文所述的一种核酸或一组核酸和(b)药学上可接受的赋形剂。
在一些方面，公开了一种药物组合物，所述药物组合物包含(a)如本文所述的一种载体或一组载体和(b)药学上可接受的赋形剂。
在一些方面，公开了一种药物组合物，所述药物组合物包含(a)如本文所述的宿主细胞和(b)药学上可接受的赋形剂。
配制本公开文本的药物组合物以与其预期的施用途径相容。施用途径的例子包括肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、口服(例如吸入)、透皮(外用)和透粘膜。另外，可能需要向需要治疗的区域局部施用治疗有效量的药物组合物。这可以通过例如在外科手术期间局部或区域输注或灌注、外用施用、注射、导管、栓剂或植入物(例如，由多孔、无孔或凝胶状材料(包括膜，如唾液弹性膜，或纤维)形成的植入物)等来实现。在另一方面，在囊泡(如脂质体)中递送治疗有效量的药物组合物(参见例如，Langer,Science 249:1527-33,1990；和Treat等人,Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer,LopezBerestein和Fidler(编辑),Liss,纽约,第353-65页,1989)。
可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂例如EDTA；糖类，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子例如钠；金属络合物(例如，锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
肠胃外制剂中使用的药学上可接受的载体包括水性媒介物、非水性媒介物、抗微生物剂、等渗剂、缓冲液、抗氧化剂、局部麻醉剂、助悬剂和分散剂、乳化剂、螯合剂(sequestering agent或chelating agent)和其他药学上可接受的物质。水性媒介物的例子包括氯化钠注射剂、林格氏注射剂、等渗右旋糖注射剂、无菌水注射剂、右旋糖和乳酸林格氏注射剂。非水性肠胃外媒介物包括植物来源的不挥发油、棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油。可以将抑制细菌或抑制真菌浓度的抗微生物剂添加到多剂量容器包装的肠胃外制剂中，所述抗微生物剂包括苯酚或甲酚、汞、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。等渗剂包括氯化钠和右旋糖。缓冲液包括磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉剂包括盐酸普鲁卡因。助悬剂和分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包括聚山梨醇酯80(
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80)。金属离子的螯合(sequestering)或螯合(chelating)剂包括EDTA。药物载体还包括用于水混溶性媒介物的乙醇、聚乙二醇和丙二醇；以及用于调节pH的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。
用于肠胃外、真皮内或皮下施加的溶液或悬浮液可包括以下组分中的任一种：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲液(如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐)；以及用于调节张力的药剂，如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱，如盐酸或氢氧化钠调节pH。可以将肠胃外制剂封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适合于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性的)或分散液，以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELS(BASF，帕西帕尼，新泽西州)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且应当是易于注射的程度的流体。其在制造和储存条件下必须稳定并且必须抵抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用而保存。载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其适合的混合物。例如，通过使用包衣(如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需粒度、以及通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。防止微生物的作用可以通过各种抗细菌剂以及抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)、氯化钠。通过在所述组合物中包含延迟吸收的药剂例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。
无菌可注射溶液可以通过以下方式制备：将融合蛋白以所需量掺入视需要具有上文所列举成分中的一种或组合的适当溶剂中，之后过滤灭菌。通常，通过将融合蛋白掺入无菌媒介物中来制备分散体，所述无菌媒介物含有碱性分散介质和来自上文所列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥，这些方法由先前无菌过滤的溶液产生活性成分(例如融合蛋白)和任何其他所需成分的冻干粉末。在一些方面，所述融合蛋白可以被冻干以储存并且在施用于有需要的受试者之前重构。
对于通过吸入施用，可以从加压容器或分配器(其含有合适的推进剂，例如气体(如二氧化碳))或者喷雾器以气溶胶喷雾剂形式递送所述化合物。全身性施用也可以是通过透粘膜或透皮方式。
在一方面，可以用载体制备融合蛋白，所述载体将保护所述融合蛋白免于从身体迅速清除，如控释配制品，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的可生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。此类配制品的制备方法对本领域技术人员而言是清楚的。脂质体悬浮液也可以用作药学上可接受的载体。
以剂量单位形式配制肠胃外组合物是尤其有利的，以便于施用和剂量的均匀。如本文所用，剂量单位形式是指适合作为单位剂量用于待治疗的受试者的物理上离散的单位；每个单位含有经计算与所需的药物载体联合可产生所需治疗效果的预定量的活性化合物。本公开文本的剂量单位形式的规格由融合蛋白的独特特征和要实现的特定治疗效果决定并且直接取决于这些。药物组合物可以与施用说明书一起包含在容器、包装或分配器中。
III.治疗方法
本公开文本的某些方面涉及治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文公开的融合蛋白。本公开文本的一些方面涉及治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文公开的IL-10融合蛋白。本公开文本的一些方面涉及杀死有需要的受试者中的癌细胞的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文公开的IL-10融合蛋白。
本公开文本的某些方面涉及一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括以至少约7天的给药间隔向所述受试者施用有效量的IL-10融合蛋白，其中所述IL-10融合蛋白包含IL-10多肽和第二多肽，所述第二多肽包含白蛋白多肽或Fc多肽。本公开文本的某些方面涉及一种杀死有需要的受试者中的癌细胞的方法，所述方法包括以至少约7天的给药间隔向所述受试者施用有效量的IL-10融合蛋白，其中所述IL-10融合蛋白包含IL-10多肽和第二多肽，所述第二多肽包含白蛋白多肽或Fc多肽。在一些方面，所述第二多肽是白蛋白多肽。在一些方面，所述第二多肽是Fc多肽。在一些方面，所述IL-10融合蛋白进一步包含接头。
在一些方面，当施用于人受试者时，与不与Fc多肽融合的IL-10(例如，野生型人IL-10)相比，本文公开的包含IL-10多肽和Fc多肽的融合蛋白具有更长的半衰期。在一些方面，所述融合蛋白的半衰期是不与Fc多肽融合的IL-10(例如，野生型人IL-10)的至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、或至少约40倍。在一些方面，所述IL-10融合蛋白是Fc-IL-10融合蛋白。在一些方面，所述IL-10融合蛋白是IL-10-Fc融合蛋白。
由于本文公开的IL-10融合蛋白的半衰期比其他IL-10蛋白的半衰期长，因此与其他已知的IL-10蛋白相比受试者所经历的临床益处的持续时间更长。因此，与其他已知的IL-10蛋白相比，本文公开的融合蛋白可以较不频繁地施用，例如，以更高的给药间隔施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以至少约7天至至少约28天、至少约7天至至少约21天、至少约7天至至少约14天、至少约10天至至少约28天、至少约10天至至少约21天、至少约10天至至少约14天、至少约14天至至少约28天、至少约14天至至少约21天、或至少约21天至至少约28天的给药间隔施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以至少约7天至至少约14天的给药间隔施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以至少约14天至至少约28天的给药间隔施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以至少约14天至至少约21天的给药间隔施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以至少约21天至至少约28天的给药间隔施用。
在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天、至少约21天、至少约22天、至少约23天、至少约24天、至少约25天、至少约26天、至少约27天、至少约28天、至少约29天、或至少约30天的给药间隔施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以至少约7天的给药间隔施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以至少约8天的给药间隔施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以至少约9天的给药间隔施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以至少约10天的给药间隔施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以至少约11天的给药间隔施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以至少约12天的给药间隔施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以至少约13天的给药间隔施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以至少约14天的给药间隔施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以至少约15天的给药间隔施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以至少约16天的给药间隔施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以至少约17天的给药间隔施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以至少约18天的给药间隔施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以至少约19天的给药间隔施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以至少约20天的给药间隔施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以至少约21天的给药间隔施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以至少约22天的给药间隔施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以至少约23天的给药间隔施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以至少约24天的给药间隔施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以至少约25天的给药间隔施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以至少约26天的给药间隔施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以至少约27天的给药间隔施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以至少约28天的给药间隔施用。
在一些方面，以不超过一周一次、不超过每两周一次、不超过每三周一次、或不超过每四周一次施用所述IL-10融合蛋白。在一些方面，以不超过一周一次施用所述IL-10融合蛋白。在一些方面，以不超过每两周一次施用所述IL-10融合蛋白。在一些方面，以不超过每三周一次施用所述IL-10融合蛋白。在一些方面，以不超过每四周一次施用所述IL-10融合蛋白。在一些方面，以不超过每月一次施用所述IL-10融合蛋白。
在一些方面，将所述IL-10融合蛋白约一周施用一次、约每两周施用一次、约每三周施用一次、约每四周施用一次、约每五周施用一次、约每六周施用一次、约每七周施用一次、或约每八周施用一次。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白约每周施用一次。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白约每两周施用一次。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白约每三周施用一次。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白约每四周施用一次。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白约每个月施用一次。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白约每两个月施用一次。
可以将本文公开的IL-10融合蛋白以单次剂量或多次剂量施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以单次剂量施用。在一些方面，所述有效量的IL-10融合蛋白基本上由单次剂量组成或由单次剂量组成。
在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以范围为从0.001mg/kg至10.0mg/kg体重的剂量每周施用一次或每2、3、4、5、6、7或8周施用一次，例如，以0.002mg/kg至1.0mg/kg体重每周施用一次或每2、3或4周施用一次。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以范围为从约0.001mg/kg至约0.5mg/kg的剂量施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以范围为从约0.01mg/kg至约0.25mg/kg的剂量施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以范围为从约0.01mg/kg至约0.1mg/kg的剂量施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以范围为从约0.1mg/kg至约0.2mg/kg的剂量施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以范围为从约0.01mg/kg至约0.03mg/kg、从约0.03mg/kg至约0.06mg/kg、从约0.06mg/kg至约0.1mg/kg、从约0.1mg/kg至约0.15mg/kg、从约0.15mg/kg至约0.18mg/kg、从约0.18mg/kg至约0.2mg/kg、从约0.2mg/kg至约0.25mg/kg、从约0.25mg/kg至约0.3mg/kg、或从约0.3mg/kg至约0.5mg/kg的剂量施用。在其他方面，将所述IL-10融合蛋白以约0.005mg/kg、约0.006mg/kg、约0.007mg/kg、约0.008mg/kg、约0.009mg/kg、约0.01mg/kg、约0.02mg/kg、约0.03mg/kg、约0.04mg/kg、约0.05mg/kg、约0.06mg/kg、约0.07mg/kg、约0.08mg/kg、约0.09mg/kg、约0.10mg/kg、约0.11mg/kg、约0.12mg/kg、约0.13mg/kg、约0.14mg/kg、约0.15mg/kg、约0.16mg/kg、约0.17mg/kg、约0.18mg/kg、约0.19mg/kg、约0.20mg/kg、约0.21mg/kg、约0.22mg/kg、约0.23mg/kg、约0.24mg/kg、约0.25mg/kg、约0.26mg/kg、约0.27mg/kg、约0.28mg/kg、约0.29mg/kg、约0.30mg/kg、约0.31mg/kg、约0.32mg/kg、约0.33mg/kg、约0.34mg/kg、约0.35mg/kg、约0.38mg/kg、约0.4mg/kg、约0.5mg/kg、约0.6mg/kg、约0.7mg/kg、约0.8mg/kg、约0.9mg/kg、约1mg/kg、2mg/kg、或3mg/kg体重的剂量每周施用一次或每2、3、4或8周施用一次。
在其他方面，将所述IL-10融合蛋白以约0.005mg/kg、约0.01mg/kg、约0.02mg/kg、约0.03mg/kg、约0.04mg/kg、约0.05mg/kg、约0.06mg/kg、约0.07mg/kg、约0.08mg/kg、约0.09mg/kg、约0.10mg/kg、约0.11mg/kg、约0.12mg/kg、约0.13mg/kg、约0.14mg/kg、约0.15mg/kg、约0.16mg/kg、约0.17mg/kg、约0.18mg/kg、约0.19mg/kg、约0.2mg/kg、约0.21mg/kg、约0.22mg/kg、约0.23mg/kg、约0.24mg/kg、约0.25mg/kg、约0.26mg/kg、约0.27mg/kg、约0.28mg/kg、约0.29mg/kg、约0.3mg/kg、约0.4mg/kg、或约0.5mg/kg体重的剂量每2周施用一次。在其他方面，将所述IL-10融合蛋白以约0.005mg/kg、约0.01mg/kg、约0.02mg/kg、约0.03mg/kg、约0.04mg/kg、约0.05mg/kg、约0.06mg/kg、约0.07mg/kg、约0.08mg/kg、约0.09mg/kg、约0.10mg/kg、约0.11mg/kg、约0.12mg/kg、约0.13mg/kg、约0.14mg/kg、约0.15mg/kg、约0.16mg/kg、约0.17mg/kg、约0.18mg/kg、约0.19mg/kg、约0.2mg/kg、约0.21mg/kg、约0.22mg/kg、约0.23mg/kg、约0.24mg/kg、约0.25mg/kg、约0.26mg/kg、约0.27mg/kg、约0.28mg/kg、约0.29mg/kg、约0.3mg/kg、约0.4mg/kg、或约0.5mg/kg的剂量每3周施用一次。在其他方面，将所述IL-10融合蛋白以约0.05mg/kg、约0.005mg/kg、约0.01mg/kg、约0.02mg/kg、约0.03mg/kg、约0.04mg/kg、约0.05mg/kg、约0.06mg/kg、约0.07mg/kg、约0.08mg/kg、约0.09mg/kg、约0.10mg/kg、约0.11mg/kg、约0.12mg/kg、约0.13mg/kg、约0.14mg/kg、约0.15mg/kg、约0.16mg/kg、约0.17mg/kg、约0.18mg/kg、约0.19mg/kg、约0.2mg/kg、约0.21mg/kg、约0.22mg/kg、约0.23mg/kg、约0.24mg/kg、约0.25mg/kg、约0.26mg/kg、约0.27mg/kg、约0.28mg/kg、约0.29mg/kg、约0.3mg/kg、约0.4mg/kg、或约0.5mg/kg重量的剂量每4周施用一次。在其他方面，将所述IL-10融合蛋白以约0.005mg/kg、约0.01mg/kg、约0.02mg/kg、约0.03mg/kg、约0.04mg/kg、约0.05mg/kg、约0.06mg/kg、约0.07mg/kg、约0.08mg/kg、约0.09mg/kg、约0.10mg/kg、约0.11mg/kg、约0.12mg/kg、约0.13mg/kg、约0.14mg/kg、约0.15mg/kg、约0.16mg/kg、约0.17mg/kg、约0.18mg/kg、约0.19mg/kg、约0.2mg/kg、约0.21mg/kg、约0.22mg/kg、约0.23mg/kg、约0.24mg/kg、约0.25mg/kg、约0.26mg/kg、约0.27mg/kg、约0.28mg/kg、约0.29mg/kg、约0.3mg/kg、约0.4mg/kg、或约0.5mg/kg体重的剂量约每6周施用一次。在一方面，将所述IL-10融合蛋白以约0.1mg/kg体重的剂量约每周施用一次。在一方面，将所述IL-10融合蛋白以约0.1mg/kg体重的剂量约每2周施用一次。在一方面，将所述IL-10融合蛋白以约0.1mg/kg体重的剂量约每3周施用一次。在一方面，将所述IL-10融合蛋白以约0.1mg/kg体重的剂量约每4周施用一次。
可以将可用于本公开文本的IL-10融合蛋白以平剂量施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以从约0.1mg至约1000mg、从约0.5mg至约500mg、从约1mg至约200mg、从约1mg至约100mg、从约1mg至约50mg、从约2mg至约50mg、从约2mg至约40mg、从约2mg至约30mg、从约2mg至约20mg、从约2mg至约15mg、从约2mg至约10mg、从约3mg至约30mg、从约3mg至约20mg、从约3mg至约15mg、从约3mg至约10mg、从约4mg至约30mg、从约4mg至约20mg、从约4mg至约15mg、或从约4mg至约10mg的平剂量施用。
在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以从约0.5mg至约1mg、从约1mg至约2mg、从约2mg至约3mg、从约3mg至约4mg、从约4mg至约5mg、从约5mg至约6mg、从约6mg至约7mg、从约7mg至约8mg、从约8mg至约9mg、从约9mg至约10mg、从约10mg至约11mg、从约11mg至约12mg、从约12mg至约13mg、从约13mg至约14mg、从约14mg至约15mg、从约15mg至约16mg、从约16mg至约17mg、从约17mg至约18mg、从约18mg至约20mg、或从约20mg至约25mg的平剂量施用。
在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以从约0.1mg至约0.8mg、从约0.8mg至约2mg、从约2mg至约5mg、从约5mg至约10mg、从约10mg至约15mg、从约15mg至约20mg、从约20mg至约25mg、从约25mg至约30mg、从约30mg至约35mg、从约35mg至约40mg、从约40mg至约45mg、从约45mg至约50mg、从约50mg至约60mg、从约60mg至约100mg的平剂量施用。
在一方面，将所述IL-10融合蛋白以至少约0.5mg、至少约1mg、至少约2mg、至少约3mg、至少约4mg、至少约5mg、至少约6mg、至少约7mg、至少约8mg、至少约9mg、至少约10mg、至少约11mg、至少约12mg、至少约13mg、至少约14mg、至少约15mg、至少约16mg、至少约17mg、至少约18mg、至少约19mg、至少约20mg、至少约21mg、至少约22mg、至少约23mg、至少约24mg、至少约25mg、至少约26mg、至少约27mg、至少约28mg、或至少约29mg、至少约30mg、至少约35mg、至少约40mg、至少约45mg、至少约50mg、或至少约60mg的平剂量以约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周的给药间隔施用。在一方面，将所述IL-10融合蛋白以约0.5mg、1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约11mg、约12mg、约13mg、约14mg、约15mg、约16mg、约17mg、约18mg、约19mg、约20mg、约21mg、约22mg、约23mg、约24mg、约25mg、约26mg、约27mg、约28mg、或约29mg、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg、约50mg、或约60mg的平剂量以约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周的给药间隔施用。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以平剂量约每2周施用一次。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以平剂量约每3周施用一次。在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以平剂量约每4周施用一次。
在一些方面，将所述IL-10融合蛋白以约1mg的平剂量约每2、3或4周施用一次。在其他方面，将所述IL-10融合蛋白以约5mg的平剂量约每2、3或4周施用一次。在其他方面，将所述IL-10融合蛋白以约10mg的平剂量约每2、3或4周施用一次。在其他方面，将所述IL-10融合蛋白以约15mg的平剂量约每2、3或4周施用一次。在某些方面，将IL-10融合蛋白以约20mg的平剂量约每2、3或4周施用一次。
III.A.治疗癌症的方法
本公开文本的某些方面涉及治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括施用本文公开的IL-10融合蛋白。在一些方面，所述疾病或病症包括癌症。本文公开的组合物和方法可用于治疗本领域已知的任何癌症。在一些方面，所述癌症包括肿瘤。在一些方面，所述癌症包括实体瘤。在一些方面，所述癌症包括基于血液的癌症，例如白血病或淋巴瘤。
在一些方面，所述癌症选自小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、鳞状NSCLC、非鳞状NSCLC、神经胶质瘤、胃肠道癌、肾癌、透明细胞癌、卵巢癌、肝癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肾细胞癌(RCC)、前列腺癌、激素难治性前列腺腺癌、甲状腺癌、神经母细胞瘤、胰腺癌、胶质母细胞瘤(多形性胶质母细胞瘤)、宫颈癌、胃癌、膀胱癌、肝癌(肝细胞癌)、乳腺癌、结肠癌、头颈癌(或癌)、头颈鳞状细胞癌(HNSCC或SCCHN)、胃癌、生殖细胞肿瘤、小儿肉瘤、鼻窦自然杀伤细胞、黑素瘤、转移性恶性黑素瘤、皮肤或眼内恶性黑素瘤、间皮瘤、骨癌、皮肤癌、子宫癌、肛区癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童期实体瘤、输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑癌、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、包括石棉诱发的癌症在内的环境诱发的癌症、病毒相关的癌症或病毒来源的癌症、人乳头瘤病毒(HPV)相关或来源的肿瘤和所述癌症的组合。
在一些方面，所述癌症选自急性白血病(ALL)、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和慢性髓细胞性白血病(CML)、未分化AML、成髓细胞性白血病、成髓细胞性白血病、早幼粒细胞白血病、髓细胞单核细胞白血病、单核细胞白血病、红白血病、巨核细胞白血病、孤立性粒细胞肉瘤、绿色瘤、霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、单核细胞样B细胞淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤/白血病、套细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤、肠道T细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、前驱T淋巴母细胞性淋巴瘤、T淋巴母细胞性；外周T细胞淋巴瘤、淋巴母细胞性淋巴瘤、移植后淋巴增殖性障碍、真性组织细胞性淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴母细胞性淋巴瘤(LBL)、淋系造血系统肿瘤、急性淋巴母细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性组织细胞性淋巴瘤(DHL)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前驱B淋巴母细胞性淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(CTLC)、淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL)伴有华氏巨球蛋白血症；骨髓瘤、IgG骨髓瘤、轻链骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、冒烟型骨髓瘤(惰性骨髓瘤)、孤立性浆细胞瘤、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞淋巴瘤；和所述癌症的任何组合。
在某些方面，所述癌症选自RCC、NSCLC、胃癌、HCC、SCCHN、和所述癌症的任何组合。在一些方面，所述癌症选自黑素瘤、膀胱癌、胰腺癌、结肠癌、SCLC、间皮瘤、肝细胞癌、前列腺癌、多发性骨髓瘤、和所述癌症的组合。在一些方面，所述癌症包括RCC。在一些方面，所述癌症包括NSCLC。在一些方面，所述癌症包括胃癌。在一些方面，所述癌症包括HCC。在一些方面，所述癌症包括SCCHN。在一些方面，所述癌症包括黑素瘤。在一些方面，所述癌症包括淋巴瘤。在一些方面，所述癌症包括白血病。在一些方面，所述癌症包括膀胱癌。在一些方面，所述癌症包括胰腺癌。在一些方面，所述癌症包括结肠癌。在一些方面，所述癌症包括SCLC。在一些方面，所述癌症包括间皮瘤。在一些方面，所述癌症包括肝细胞癌。在一些方面，所述癌症包括前列腺癌。在一些方面，所述癌症包括多发性骨髓瘤。
在一些方面，所述癌症是难治性的。在一些方面，所述癌症是复发性的。在一些方面，所述癌症是转移性的。在一些方面，所述癌症是晚期的。在一些方面，所述癌症是局部晚期的。
在一些方面，所述受试者接受过用于治疗癌症的先前疗法。在一些方面，所述先前疗法是用于治疗特定癌症的标准护理疗法。在一些方面，所述先前疗法包括免疫疗法、化学疗法或其组合。在一些方面，所述先前疗法包括自体干细胞移植。在一些方面，所述先前疗法包括嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)疗法。在一些方面，所述先前疗法包括类固醇、细胞毒性剂、免疫调节剂或其任何组合。
在一些方面，所述受试者接受过至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或至少十种先前疗法。
III.B.组合疗法
在本公开文本的某些方面，所述方法包括向有需要的受试者施用本文公开的IL-10融合蛋白与第二治疗剂(例如，第二抗癌疗法)的组合。在一些方面，所述第二治疗剂可以选自免疫疗法、化学疗法、放射疗法、手术、激活先天性免疫细胞的药剂、增强NK和/或CD8+T细胞存活的药剂、及其任何组合。在一些方面，所述第二治疗剂(例如，第二抗癌疗法)包括有效量的特异性结合选自以下的蛋白质的抗体或其抗原结合片段：诱导型T细胞共刺激物(ICOS)、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、NKG2A、CD27、CD38、CD73、CD96、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)、和疱疹病毒侵入介导物(HVEM)、程序性死亡蛋白-1(PD-1)、程序性死亡蛋白配体-1(PD-L1)、CTLA-4、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域-3(TIM-3)、淋巴细胞激活基因-3(LAG-3)、腺苷A2a受体(A2aR)、杀伤细胞凝集素样受体G1(KLRG-1)、自然杀伤细胞受体2B4(CD244)、CD160、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、以及T细胞激活的V结构域Ig抑制剂的受体(VISTA)、KIR、TGFβ、IL-8、B7-H4、Fas配体、CXCR4、间皮素、CEACAM-1、CD52、HER2、SLAMF7、BCMA、MICA、MICB、CCR8及其任何组合。
在一些方面，所述免疫疗法包括施用免疫调节剂，如检查点抑制剂。本领域已知的任何免疫调节剂可以用于本文公开的方法中。在一些方面，所述检查点抑制剂是调节(即，阻断、抑制、降低、或增加)一种或多种检查点蛋白的活性的任何试剂。在一些方面，所述检查点蛋白选自PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIGIT、TIM3、NKG2a、OX40、ICOS、CD137、KIR、TGFβ、IL-8、IL-2、CD96、VISTA、B7-H4、Fas配体、CXCR4、间皮素、CD27、GITR、及其任何组合。在一些方面，所述检查点抑制剂或激动剂调节PD-1的活性。在一些方面，所述检查点抑制剂调节PD-L1的活性。在一些方面，所述检查点抑制剂调节CTLA-4的活性。在一些方面，所述检查点抑制剂调节LAG3的活性。在一些方面，所述检查点抑制剂调节TIGIT的活性。在一些方面，所述检查点抑制剂调节TIM3的活性。在一些方面，所述检查点抑制剂调节NKG2a的活性。在一些方面，所述检查点抑制剂调节OX40的活性。在一些方面，所述检查点抑制剂调节ICOS的活性。在一些方面，所述检查点抑制剂调节CD137的活性。在一些方面，所述检查点抑制剂调节KIR的活性。在一些方面，所述检查点抑制剂调节TGFβ的活性。在一些方面，所述检查点抑制剂调节IL-8的活性。在一些方面，所述检查点抑制剂调节IL-2的活性。在一些方面，所述检查点抑制剂调节CD96的活性。在一些方面，所述检查点抑制剂调节VISTA的活性。在一些方面，所述检查点抑制剂调节B7-H4的活性。在一些方面，所述检查点抑制剂调节Fas配体的活性。在一些方面，所述检查点抑制剂调节CXCR4的活性。在一些方面，所述检查点抑制剂调节间皮素的活性。在一些方面，所述检查点抑制剂调节CD27的活性。在一些方面，所述检查点抑制剂调节GITR的活性。
任何检查点抑制剂可以用于本文公开的方法中。在一些方面，所述检查点抑制剂是小分子。在一些方面，所述检查点抑制剂是蛋白质。在一些方面，所述检查点抑制剂是抗体或其抗原结合部分。在一些方面，所述检查点抑制剂是特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合部分。在一些方面，所述检查点抑制剂是特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合部分。在一些方面，所述检查点抑制剂是特异性结合LAG3的抗体或其抗原结合部分。在一些方面，所述检查点抑制剂是特异性结合TIGIT的抗体或其抗原结合部分。在一些方面，所述检查点抑制剂是特异性结合TIM3的抗体或其抗原结合部分。在一些方面，所述检查点抑制剂是特异性结合NKG2a的抗体或其抗原结合部分。在一些方面，所述检查点抑制剂是特异性结合OX40的抗体或其抗原结合部分。在一些方面，所述检查点抑制剂是特异性结合ICOS的抗体或其抗原结合部分。在一些方面，所述检查点抑制剂是特异性结合CD137的抗体或其抗原结合部分。在一些方面，所述检查点抑制剂是特异性结合KIR的抗体或其抗原结合部分。在一些方面，所述检查点抑制剂是特异性结合TGFβ的抗体或其抗原结合部分。在一些方面，所述检查点抑制剂是特异性结合IL-8的抗体或其抗原结合部分。在一些方面，所述检查点抑制剂是特异性结合IL-2的抗体或其抗原结合部分。在一些方面，所述检查点抑制剂是特异性结合CD96的抗体或其抗原结合部分。在一些方面，所述检查点抑制剂是特异性结合VISTA的抗体或其抗原结合部分。在一些方面，所述检查点抑制剂是特异性结合B7-H4的抗体或其抗原结合部分。在一些方面，所述检查点抑制剂是特异性结合Fas配体的抗体或其抗原结合部分。在一些方面，所述检查点抑制剂是特异性结合CXCR4的抗体或其抗原结合部分。在一些方面，所述检查点抑制剂是特异性结合间皮素的抗体或其抗原结合部分。在一些方面，所述检查点抑制剂是特异性结合CD27的抗体或其抗原结合部分。在一些方面，所述检查点抑制剂是特异性结合GITR的抗体或其抗原结合部分。在一些方面，所述检查点抑制剂是特异性结合MICA或MICB的抗体或其抗原结合部分。在一些方面，所述检查点抑制剂是特异性结合CCR8的抗体或其抗原结合部分。在一些方面，所述检查点抑制剂是特异性结合BCMA的抗体或其抗原结合部分。
在一些方面，向所述受试者施用组合疗法，例如，其中向所述受试者施用本文公开的IL-10融合蛋白和检查点抑制剂。在一些方面，向所述受试者施用组合疗法，例如，其中向所述受试者施用本文公开的IL-10融合蛋白和抗PD-1抗体。在一些方面，向所述受试者施用组合疗法，例如，其中向所述受试者施用本文公开的IL-10融合蛋白和抗PD-L1抗体。在一些方面，向所述受试者施用组合疗法，例如，其中向所述受试者施用本文公开的IL-10融合蛋白和抗CTLA-4抗体。在一些方面，向所述受试者施用组合疗法，例如，其中向所述受试者施用本文公开的IL-10融合蛋白和抗LAG-3抗体。在一些方面，向所述受试者施用组合疗法，例如，其中向所述受试者施用(i)本文公开的IL-10融合蛋白、(ii)抗PD-1抗体、和(iii)抗CTLA-4抗体。在一些方面，向所述受试者施用组合疗法，例如，其中向所述受试者施用(i)本文公开的IL-10融合蛋白、(ii)抗PD-L1抗体、和(iii)抗CTLA-4抗体。组合疗法中的抗癌疗法可以并行或以任何顺序依序施用。在一些方面，向所述受试者进一步施用另外的抗癌疗法，例如化学疗法、放射疗法、CAR-T疗法、基因疗法和/或手术。
III.B.1.可用于本公开文本的抗PD-1抗体
本领域已知的抗PD-1抗体可以用于本发明所述的组合物和方法中。以高亲和力与PD-1特异性结合的多种人单克隆抗体已经公开在美国专利号8,008,449中。已经证明美国专利号8,008,449中披露的抗PD-1人抗体展现出以下特征中的一种或多种：(a)以1x10-7M或更小的KD与人PD-1结合，如使用Biacore生物传感器系统通过表面等离子体共振确定的；(b)基本上不与人CD28、CTLA-4或ICOS结合；(c)在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中增加T细胞增殖；(d)在MLR测定中增加干扰素-γ产生；(e)在MLR测定中增加IL-2分泌；(f)与人PD-1和食蟹猴PD-1结合；(g)抑制PD-L1和/或PD-L2与PD-1的结合；(h)刺激抗原特异性记忆应答；(i)刺激抗体应答；以及(j)抑制体内肿瘤细胞生长。可用于本公开文本中的抗PD-1抗体包括与人PD-1特异性结合并且展现出前述特征中的至少一种、在一些方面至少五种的单克隆抗体。
其他抗PD-1单克隆抗体已经描述于例如以下中：美国专利号6,808,710、7,488,802、8,168,757和8,354,509，美国公开号2016/0272708，以及PCT公开号WO 2012/145493、WO 2008/156712、WO 2015/112900、WO 2012/145493、WO 2015/112800、WO 2014/206107、WO2015/35606、WO 2015/085847、WO 2014/179664、WO 2017/020291、WO 2017/020858、WO2016/197367、WO 2017/024515、WO 2017/025051、WO 2017/123557、WO 2016/106159、WO2014/194302、WO 2017/040790、WO 2017/133540、WO 2017/132827、WO 2017/024465、WO2017/025016、WO 2017/106061、WO 2017/19846、WO 2017/024465、WO 2017/025016、WO2017/132825和WO 2017/133540，将其每一个均通过引用以其整体并入。
在一些方面，所述抗PD-1抗体选自纳武单抗(也称为
Figure BDA0003868754360000371
5C4、BMS-936558、MDX-1106和ONO-4538)、派姆单抗(Merck；也称为
Figure BDA0003868754360000372
兰洛利珠单抗(lambrolizumab)和MK-3475；参见WO 2008/156712)、PDR001(Novartis；参见WO 2015/112900)、MEDI-0680(AstraZeneca；也称为AMP-514；参见WO 2012/145493)；塞普利单抗(cemiplimab)(Regeneron；也称为REGN-2810；参见WO 2015/112800)、JS001(TAIZHOUJUNSHI PHARMA；也称为特瑞普利单抗(toripalimab)；参见Si-Yang Liu等人,J.Hematol.Oncol.10:136(2017))、BGB-A317(Beigene；也称为替雷利珠单抗(Tislelizumab)；参见WO 2015/35606和美国2015/0079109)、INCSHR1210(JiangsuHengrui Medicine；也称为SHR-1210；参见WO 2015/085847；Si-Yang Liu等人,J.Hematol.Oncol.10:136(2017))、TSR-042(Tesaro Biopharmaceutical；也称为ANB011；参见WO 2014/179664)、GLS-010(Wuxi/Harbin Gloria Pharmaceuticals；也称为WBP3055；参见Si-Yang Liu等人,J.Hematol.Oncol.10:136(2017))、AM-0001(Armo)、STI-1110(Sorrento Therapeutics；参见WO 2014/194302)、AGEN2034(Agenus；参见WO 2017/040790)、MGA012(Macrogenics，参见WO 2017/19846)、BCD-100(Biocad；Kaplon等人,mAbs10(2):183-203(2018)、和IBI308(Innovent；参见WO 2017/024465、WO 2017/025016、WO2017/132825和WO 2017/133540)。
在一个方面，所述抗PD-1抗体是纳武单抗。纳武单抗是完全人IgG4(S228P)PD-1免疫检查点抑制剂抗体，其选择性地阻止与PD-1配体(PD-L1和PD-L2)的相互作用，从而阻断抗肿瘤T细胞功能的下调(美国专利号8,008,449)。
在另一方面，所述抗PD-1抗体是派姆单抗。派姆单抗描述于例如美国专利号8,354,509和8,900,587中。
可用于所公开的组合物和方法中的抗PD-1抗体还包括分离的抗体，其与人PD-1特异性结合并且与本文所公开的任何抗PD-1抗体(例如，纳武单抗)交叉竞争与人PD-1的结合(参见例如，美国专利号8,008,449和8,779,105；WO 2013/173223)。在一些方面，所述抗PD-1抗体与本文所述的任何抗PD-1抗体(例如，纳武单抗)结合相同的表位。在标准PD-1结合测定(如Biacore分析、ELISA测定或流式细胞术)中可以基于交叉竞争抗体与纳武单抗交叉竞争的能力容易地鉴定它们(参见例如，WO 2013/173223)。
在某些方面，与纳武单抗交叉竞争与人PD-1的结合或与纳武单抗结合人PD-1抗体的相同表位区域的抗体是单克隆抗体。对于施用于人受试者，这些交叉竞争抗体是嵌合抗体、工程化抗体或者人源化抗体或人抗体。可用于所公开的公开文本的组合物和方法中的抗PD-1抗体还包括上述抗体的抗原结合部分。
在一些方面，将所述抗PD-1抗体以范围从0.1mg/kg至20.0mg/kg体重的剂量每2、3、4、5、6、7或8周施用一次，例如以0.1mg/kg至10.0mg/kg体重每2、3或4周施用一次。在其他方面，将所述抗PD-1抗体以约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或10mg/kg体重的剂量每2周施用一次。在其他方面，将所述抗PD-1抗体以约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或10mg/kg体重的剂量每3周施用一次。在一个方面，将所述抗PD-1抗体以约5mg/kg体重的剂量约每3周施用一次。在另一方面，将所述抗PD-1抗体例如纳武单抗以约1mg/kg或约3mg/kg体重的剂量约每2周施用一次。在其他方面，将所述抗PD-1抗体(例如，派姆单抗)以约2mg/kg体重的剂量约每3周施用一次。
可以将可用于本公开文本的抗PD-1抗体以平剂量施用。在一些方面，将所述抗PD-1抗体以从约100至约1000mg、从约100mg至约900mg、从约100mg至约800mg、从约100mg至约700mg、从约100mg至约600mg、从约100mg至约500mg、从约200mg至约1000mg、从约200mg至约900mg、从约200mg至约800mg、从约200mg至约700mg、从约200mg至约600mg、从约200mg至约500mg、从约200mg至约480mg或从约240mg至约480mg的平剂量施用。在一个方面，将所述抗PD-1抗体以至少约200mg、至少约220mg、至少约240mg、至少约260mg、至少约280mg、至少约300mg、至少约320mg、至少约340mg、至少约360mg、至少约380mg、至少约400mg、至少约420mg、至少约440mg、至少约460mg、至少约480mg、至少约500mg、至少约520mg、至少约540mg、至少约550mg、至少约560mg、至少约580mg、至少约600mg、至少约620mg、至少约640mg、至少约660mg、至少约680mg、至少约700mg或至少约720mg的平剂量以约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周的给药间隔施用。在另一方面，将所述抗PD-1抗体以约200mg至约800mg、约200mg至约700mg、约200mg至约600mg、约200mg至约500mg的平剂量以约1、2、3或4周的给药间隔施用。
在一些方面，将所述抗PD-1抗体以约200mg的平剂量约每3周施用一次。在其他方面，将所述抗PD-1抗体以约200mg的平剂量约每2周施用一次。在其他方面，将所述抗PD-1抗体以约240mg的平剂量约每2周施用一次。在某些方面，将所述抗PD-1抗体以约480mg的平剂量约每3周施用一次。在某些方面，将所述抗PD-1抗体以约480mg的平剂量约每4周施用一次。
在一些方面，将纳武单抗以约240mg的平剂量约每2周施用一次。在一些方面，将纳武单抗以约240mg的平剂量约每3周施用一次。在一些方面，将纳武单抗以约360mg的平剂量约每2周施用一次。在一些方面，将纳武单抗以约360mg的平剂量约每3周施用一次。在一些方面，将纳武单抗以约480mg的平剂量约每4周施用一次。
在一些方面，将派姆单抗以约200mg的平剂量约每2周施用一次。在一些方面，将派姆单抗以约200mg的平剂量约每3周施用一次。在一些方面，将派姆单抗以约400mg的平剂量约每4周施用一次。
III.B.2.可用于本公开文本的抗PD-L1抗体
在某些方面，在本文所公开的任何方法中，用抗PD-L1抗体替代抗PD-1抗体。本领域已知的抗PD-L1抗体可以用于本公开文本的组合物和方法中。可用于本公开文本的组合物和方法中的抗PD-L1抗体的例子包括美国专利号9,580,507中披露的抗体。已经证明美国专利号9,580,507中披露的抗PD-L1人单克隆抗体展现出以下特征中的一种或多种：(a)以1x10-7M或更小的KD与人PD-L1结合，如使用Biacore生物传感器系统通过表面等离子体共振确定的；(b)在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中增加T细胞增殖；(c)在MLR测定中增加干扰素-γ产生；(d)在MLR测定中增加IL-2分泌；(e)刺激抗体应答；以及(f)逆转T调节细胞对T细胞效应细胞和/或树突细胞的作用。可用于本公开文本中的抗PD-L1抗体包括与人PD-L1特异性结合并且展现出前述特征中的至少一种、在一些方面至少五种的单克隆抗体。
在某些方面，所述抗PD-L1抗体选自BMS-936559(也称为12A4,MDX-1105；参见例如，美国专利号7,943,743和WO 2013/173223)、阿特利珠单抗(Roche；也称为
Figure BDA0003868754360000391
MPDL3280A、RG7446；参见US 8,217,149)、度伐鲁单抗(AstraZeneca；也称为IMFINZITM、MEDI-4736；参见WO 2011/066389)、阿维鲁单抗(Pfizer；也称为
Figure BDA0003868754360000392
MSB-0010718C；参见WO 2013/079174)、STI-1014(Sorrento；参见WO 2013/181634)、CX-072(Cytomx；参见WO 2016/149201)、KN035(3D Med/Alphamab；参见Zhang等人,Cell Discov.7:3(2017年3月)、LY3300054(Eli Lilly Co.；参见例如，WO 2017/034916)、BGB-A333(BeiGene；参见Desai等人,JCO 36(15增刊):TPS3113(2018))和CK-301(Checkpoint Therapeutics；参见Gorelik等人,AACR:Abstract 4606(2016年4月))。
在某些方面，所述PD-L1抗体是阿特利珠单抗
Figure BDA0003868754360000393
阿特利珠单抗是完全人源化IgG1单克隆抗PD-L1抗体。
在某些方面，所述PD-L1抗体是度伐鲁单抗(IMFINZITM)。度伐鲁单抗是人IgG1κ单克隆抗PD-L1抗体。
在某些方面，所述PD-L1抗体是阿维鲁单抗
Figure BDA0003868754360000394
阿维鲁单抗是人IgG1λ单克隆抗PD-L1抗体。
可用于所公开的组合物和方法中的抗PD-L1抗体还包括分离的抗体，其与人PD-L1特异性结合并且与本文所公开的任何抗PD-L1抗体(例如，阿特利珠单抗、度伐鲁单抗和/或阿维鲁单抗)交叉竞争与人PD-L1的结合。在一些方面，所述抗PD-L1抗体与本文所述的任何抗PD-L1抗体(例如，阿特利珠单抗、度伐鲁单抗和/或阿维鲁单抗)结合相同的表位。在标准PD-L1结合测定(如Biacore分析、ELISA测定或流式细胞术)中可以基于交叉竞争抗体与阿特利珠单抗和/或阿维鲁单抗交叉竞争的能力容易地鉴定它们(参见例如，WO 2013/173223)。在某些方面，与阿特利珠单抗、度伐鲁单抗和/或阿维鲁单抗交叉竞争与人PD-L1的结合或与阿特利珠单抗、度伐鲁单抗和/或阿维鲁单抗结合人PD-L1抗体的相同表位区域的抗体是单克隆抗体。对于施用于人受试者，这些交叉竞争抗体是嵌合抗体、工程化抗体或者人源化抗体或人抗体。可用于所公开的公开文本的组合物和方法中的抗PD-L1抗体还包括上述抗体的抗原结合部分。
在一些方面，将所述抗PD-L1抗体以范围为从约0.1mg/kg至约20.0mg/kg体重，约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约11mg/kg、约12mg/kg、约13mg/kg、约14mg/kg、约15mg/kg、约16mg/kg、约17mg/kg、约18mg/kg、约19mg/kg或约20mg/kg的剂量约每2、3、4、5、6、7或8周施用一次。
在一些方面，将所述抗PD-L1抗体以约15mg/kg体重的剂量约每3周施用一次。在其他方面，将所述抗PD-L1抗体以约10mg/kg体重的剂量约每2周施用一次。
在其他方面，可用于本公开文本的抗PD-L1抗体是平剂量。在一些方面，将所述抗PD-L1抗体以约200mg至约1600mg、约200mg至约1500mg、约200mg至约1400mg、约200mg至约1300mg、约200mg至约1200mg、约200mg至约1100mg、约200mg至约1000mg、约200mg至约900mg、约200mg至约800mg、约200mg至约700mg、约200mg至约600mg、约700mg至约1300mg、约800mg至约1200mg、约700mg至约900mg或约1100mg至约1300mg的平剂量施用。在一些方面，将所述抗PD-L1抗体以至少约240mg、至少约300mg、至少约320mg、至少约400mg、至少约480mg、至少约500mg、至少约560mg、至少约600mg、至少约640mg、至少约700mg、至少720mg、至少约800mg、至少约840mg、至少约880mg、至少约900mg、至少960mg、至少约1000mg、至少约1040mg、至少约1100mg、至少约1120mg、至少约1200mg、至少约1280mg、至少约1300mg、至少约1360mg或至少约1400mg的平剂量以约1、2、3或4周的给药间隔施用。在一些方面，将所述抗PD-L1抗体以约1200mg的平剂量约每3周施用一次。在其他方面，将所述抗PD-L1抗体以约800mg的平剂量约每2周施用一次。在其他方面，将所述抗PD-L1抗体以约840mg的平剂量约每2周施用一次。
在一些方面，将阿特利珠单抗以约1200mg的平剂量约每3周施用一次。在一些方面，将阿特利珠单抗以约840mg的平剂量约每2周施用一次。在一些方面，将阿特利珠单抗以约1200mg的平剂量约每3周施用一次。在一些方面，将阿特利珠单抗以约1680mg的平剂量约每4周施用一次。
在一些方面，将阿维鲁单抗以约800mg的平剂量约每2周施用一次。
在一些方面，将度伐鲁单抗以约10mg/kg的剂量约每2周施用一次。在一些方面，将度伐鲁单抗以约800mg/kg的平剂量约每2周施用一次。在一些方面，将度伐鲁单抗以约1200mg/kg的平剂量约每3周施用一次。
III.B.3.抗CTLA-4抗体
本领域已知的抗CTLA-4抗体可以用于本公开文本的组合物和方法中。本公开文本的抗CTLA-4抗体与人CTLA-4结合，从而破坏CTLA-4与人B7受体的相互作用。由于CTLA-4与B7的相互作用转导导致携带CTLA-4受体的T细胞失活的信号，因此相互作用的破坏有效地诱导、增强或延长此类T细胞的激活，从而诱导、增强或延长免疫应答。
以高亲和力与CTLA-4特异性结合的人单克隆抗体已经披露于美国专利号6,984,720中。其他抗CTLA-4单克隆抗体已经描述于例如以下中：美国专利号5,977,318、6,051,227、6,682,736和7,034,121，以及国际公开号WO 2012/122444、WO 2007/113648、WO 2016/196237和WO 2000/037504，将其中的每一个均通过引用以其整体并入本文。已经证明美国专利号6,984,720中披露的抗CTLA-4人单克隆抗体展现出以下特征中的一种或多种：(a)以至少约107M-1、或约109M-1、或约1010M-1至1011M-1或更高的平衡缔合常数(Ka)所反映的结合亲和力与人CTLA-4特异性结合，如通过Biacore分析确定的；(b)动力学缔合常数(ka)为至少约103、约104或约105m-1s-1；(c)动力学解离常数(kd)为至少约103、约104或约105m-1s-1；以及(d)抑制CTLA-4与B7-1(CD80)和B7-2(CD86)的结合。可用于本公开文本的抗CTLA-4抗体包括与人CTLA-4特异性结合并展现出前述特征中的至少一种、至少两种或至少三种的单克隆抗体。
在某些方面，所述CTLA-4抗体选自伊匹单抗(也称为
Figure BDA0003868754360000411
MDX-010、10D1；参见美国专利号6,984,720)、MK-1308(Merck)、AGEN-1884(Agenus Inc.；参见WO 2016/196237)以及曲美木单抗(AstraZeneca；也称为替西木单抗(ticilimumab)，CP-675,206；参见WO 2000/037504和Ribas,Update Cancer Ther.2(3):133-39(2007))。在一些方面，所述抗CTLA-4抗体是伊匹单抗。
在一些方面，所述CTLA-4抗体是用于本文所公开的组合物和方法中的伊匹单抗。
在一些方面，所述CTLA-4抗体是曲美木单抗。
在一些方面，所述CTLA-4抗体是MK-1308。
在一些方面，所述CTLA-4抗体是AGEN-1884。
可用于所公开的组合物和方法中的抗CTLA-4抗体还包括分离的抗体，其与人CTLA-4特异性结合并与本文所公开的任何抗CTLA-4抗体(例如，伊匹单抗和/或曲美木单抗)交叉竞争与人CTLA-4的结合。在一些方面，所述抗CTLA-4抗体与本文所述的任何抗CTLA-4抗体(例如，伊匹单抗和/或曲美木单抗)结合相同的表位。在标准CTLA-4结合测定(如Biacore分析、ELISA测定或流式细胞术)中可以基于交叉竞争抗体与伊匹单抗和/或曲美木单抗交叉竞争的能力容易地鉴定它们(参见例如，WO 2013/173223)。
在某些方面，与伊匹单抗和/或曲美木单抗交叉竞争与人CTLA-4的结合或与伊匹单抗和/或曲美木单抗结合人CTLA-4抗体的相同表位区域的抗体是单克隆抗体。对于施用于人受试者，这些交叉竞争抗体是嵌合抗体、工程化抗体或者人源化抗体或人抗体。可用于所公开的公开文本的组合物和方法中的抗CTLA-4抗体还包括上述抗体的抗原结合部分。
在一些方面，将所述抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分以范围从0.1mg/kg至10.0mg/kg体重的剂量每2、3、4、5、6、7或8周施用一次。在一些方面，将所述抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分以1mg/kg或3mg/kg体重的剂量每3、4、5或6周施用一次。在一方面，将所述抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分以3mg/kg体重的剂量每2、3、4或6周施用一次。在另一方面，将所述抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分以1mg/kg体重的剂量每2、3、4或6周施用一次。在另一方面，将所述抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分以10mg/kg体重的剂量每2、3、4或6周施用一次。
在一些方面，将所述抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分以平剂量施用。在一些方面，将所述抗CTLA-4抗体以从约10至约1000mg、从约10mg至约900mg、从约10mg至约800mg、从约10mg至约700mg、从约10mg至约600mg、从约10mg至约500mg、从约50mg至约1000mg、从约50mg至约900mg、从约50mg至约800mg、从约50mg至约700mg、从约50mg至约100mg、从约50mg至约500mg、从约100mg至约480mg、或从约240mg至约480mg的平剂量施用。在一方面，将所述抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分以至少约60mg、至少约80mg、至少约100mg、至少约120mg、至少约140mg、至少约160mg、至少约180mg、至少约200mg、至少约220mg、至少约240mg、至少约260mg、至少约280mg、至少约300mg、至少约320mg、至少约340mg、至少约360mg、至少约380mg、至少约400mg、至少约420mg、至少约440mg、至少约460mg、至少约480mg、至少约500mg、至少约520mg、至少约540mg、至少约550mg、至少约560mg、至少约580mg、至少约600mg、至少约620mg、至少约640mg、至少约660mg、至少约680mg、至少约700mg、或至少约720mg的平剂量施用。在另一方面，将所述抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分以平剂量约每1、2、3、4、5、6、7或8周施用一次。
在一些方面，将伊匹单抗以约1mg/kg的剂量约每3周施用一次。在一些方面，将伊匹单抗以约3mg/kg的剂量约每3周施用一次。在一些方面，将伊匹单抗以约10mg/kg的剂量约每3周施用一次。在一些方面，将伊匹单抗以约10mg/kg的剂量约每12周施用一次。在一些方面，将伊匹单抗施用四个剂量。
III.B.4.抗LAG-3抗体
如本文所用，LAG-3拮抗剂包括但不限于LAG-3结合剂(例如LAG-3抗体)和可溶性LAG-3多肽(例如包含LAG-3的细胞外部分的融合蛋白)。
在一些方面，LAG-3抑制剂是可溶性LAG-3多肽，例如能够与MHC II类结合的LAG-3-Fc融合多肽。
在一些方面，所述LAG-3拮抗剂包括IMP321(依替莫德α)。
在一些方面，所述LAG-3拮抗剂是与LAG-3特异性结合的抗LAG-3抗体或其抗原结合片段(“抗LAG-3抗体”)。
适用于本文使用的抗LAG-3抗体(或由其衍生的VH/VL结构域)可以使用本领域熟知的方法来生成。可替代地，可以使用本领域公认的抗LAG-3抗体。
在一些方面，所述抗LAG-3抗体是嵌合、人源化或人单克隆抗体或其部分。在其他方面，所述抗LAG-3抗体是双特异性抗体或多特异性抗体。
在一些方面，所述抗LAG-3抗体是瑞拉利单抗，例如PCT/US13/48999(将其传授内容通过引用特此并入)中所述的BMS-986016。
在其他方面，所述抗体具有瑞拉利单抗的重链和轻链CDR或可变区。因此，在一方面，所述抗体包含瑞拉利单抗的VH区的CDR1、CDR2和CDR3结构域和瑞拉利单抗的VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一方面，所述抗体包含瑞拉利单抗的VH和/或VL区。在一些方面，所述抗LAG-3抗体与瑞拉利单抗交叉竞争与人LAG-3的结合。在一些方面，所述抗LAG-3抗体与瑞拉利单抗结合相同的表位。在一些方面，所述抗LAG-3抗体是瑞拉利单抗的生物类似物。在一些方面，所述抗LAG-3抗体是LAG-525、MK-4280、REGN3767、TSR-033、TSR-075、Sym022、FS-118或其任何组合。任何本领域公认的抗LAG-3抗体可以用于本公开文本的治疗方法中。例如，可以使用US2011/0150892A1(将其通过引用并入本文)中所述并且称为单克隆抗体25F7(还称为“25F7”和“LAG-3.1”)的抗人LAG-3抗体。可以使用的其他本领域公认的抗LAG-3抗体包括US 2011/007023中所述的IMP731(H5L7BW)、WO 2016028672中所述的MK-4280(28G-10)、Journal for ImmunoTherapy of Cancer,(2016)第4卷,增刊增刊1摘要编号:P195中所述的REGN3767、WO2017/019894中所述的BAP050、IMP-701(LAG-525)、aLAG3(0414)、aLAG3(0416)、Sym022、TSR-033、TSR-075、XmAb22841、MGD013、BI754111、FS118、P13B02-30、AVA-017和GSK2831781。可用于所要求保护的发明的这些和其他抗LAG-3抗体可以见于例如：US 10,188,730、WO 2016/028672、WO 2017/106129、WO 2017/062888、WO2009/044273、WO 2018/069500、WO 2016/126858、WO 2014/179664、WO 2016/200782、WO2015/200119、WO 2017/019846、WO 2017/198741、WO 2017/220555、WO 2017/220569、WO2018/071500、WO 2017/015560、WO 2017/025498、WO 2017/087589、WO 2017/087901、WO2018/083087、WO 2017/149143、WO 2017/219995、US 2017/0260271、WO 2017/086367、WO2017/086419、WO 2018/034227、WO 18/185046、WO 18/185043、WO 2018/217940、WO 19/011306、WO 2018/208868和WO 2014/140180。将这些参考文献中的每一个的内容全部通过引用以其整体并入本文。也可以使用与本领域公认的任何抗体竞争与LAG-3结合的抗体。在一些方面，所述抗LAG-3抗体与本文所述或本领域已知的抗LAG-3抗体交叉竞争与相同表位的结合，或者所述抗LAG-3抗体是本文所述或本领域已知的抗LAG-3抗体的生物类似物。
在一些方面，将所述抗LAG-3抗体或其抗原结合部分以范围为从约0.1mg/kg至约10.0mg/kg体重的剂量约每1、2、3、4、5、6、7或8周施用一次。在一些方面，将所述抗LAG-3抗体或其抗原结合部分以至少约1mg/kg、至少约2mg/kg、至少约3mg/kg、至少约4mg/kg、至少约5mg/kg、至少约6mg/kg、至少约7mg/kg、至少约8mg/kg、至少约9mg/kg、或至少约10mg/kg体重的剂量约每1、2、3、4、5、6、7或8周施用一次。在一些方面，将所述抗LAG-3抗体或其抗原结合部分以平剂量施用。在一些方面，将所述抗LAG-3抗体以从约20mg至约2000mg的平剂量施用。在一方面，将所述抗LAG-3抗体或其抗原结合部分以至少约80mg或至少约160mg的平剂量施用。在另一方面，将所述抗LAG-3抗体或其抗原结合部分以平剂量约每1、2、3、4、5、6、7或8周施用一次。在一些方面，将所述抗LAG-3抗体或其抗原结合部分以平剂量施用。在一些方面，将所述抗LAG-3抗体或其抗原结合部分以约80mg的平剂量施用。在一些方面，将所述抗LAG-3抗体或其抗原结合部分以约160mg的平剂量施用。
III.B.5.另外的抗癌疗法
在本公开文本的某些方面，所述方法包括施用本文公开的IL-10融合蛋白和另外的抗癌疗法。另外的抗癌疗法可以包括本领域已知用于治疗受试者的肿瘤的任何疗法和/或如本文所公开的任何标准护理疗法。在一些方面，所述另外的抗癌疗法包括手术、放射疗法、化学疗法、免疫疗法或其任何组合。在一些方面，所述另外的抗癌疗法包括化学疗法，包括本文公开的任何化学疗法。在一些方面，所述另外的抗癌疗法包括另外的免疫疗法。在一些方面，所述另外的抗癌疗法包括施用特异性结合以下的抗体或其抗原结合部分：TIGIT、TIM3、NKG2a、OX40、ICOS、MICA、MICB、CD38、CD73、CD96、CD137、KIR、TGFβ、IL-8、B7-H4、Fas配体、CXCR4、间皮素、CD27、GITR、SLAMF7、BCMA、CCR8或其任何组合。
在一些方面，所述第二所述第二抗癌疗法包括化学疗法。在一些方面，所述化学疗法选自蛋白酶体抑制剂、IMiD、Bet抑制剂、IDO拮抗剂、基于铂的化学疗法、及其任何组合。在某些方面，所述第二抗癌疗法包括基于铂的化学疗法。
在一些方面，所述第二抗癌疗法包括选自以下的药剂：多柔比星
Figure BDA0003868754360000431
顺铂、卡铂、硫酸博来霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥
Figure BDA0003868754360000432
环磷酰胺
Figure BDA0003868754360000433
来那度胺
Figure BDA0003868754360000434
硼替佐米
Figure BDA0003868754360000435
地塞米松、米托蒽醌、依托泊苷、阿糖胞苷、苯达莫司汀
Figure BDA0003868754360000436
利妥昔单抗
Figure BDA0003868754360000437
异环磷酰胺、亚叶酸(甲酰四氢叶酸)、氟尿嘧啶(5-FU)、奥沙利铂(乐沙定)、FOLFOX、紫杉醇、纳米颗粒白蛋白结合(nab)紫杉醇
Figure BDA0003868754360000438
多西紫杉醇、长春新碱
Figure BDA0003868754360000439
氟达拉滨
Figure BDA00038687543600004310
沙利度胺
Figure BDA00038687543600004311
阿仑单抗
Figure BDA00038687543600004312
奥法木单抗
Figure BDA00038687543600004313
依罗莫司
Figure BDA00038687543600004314
卡非佐米(KYPROLISTM)、monolimod、玛利佐米、泊马度胺、林罗司他(Linrodostat)、卡介苗、卡赞替尼、Bempegaldesleukin、依洛妥珠单抗、达雷妥木单抗、及其任何组合。在一些方面，所述第二抗癌疗法包括多柔比星
Figure BDA00038687543600004315
在一些方面，所述第二抗癌疗法包括顺铂。在一些方面，所述第二抗癌疗法包括卡铂。在一些方面，所述第二抗癌疗法包括硫酸博来霉素。在一些方面，所述第二抗癌疗法包括卡莫司汀。在一些方面，所述第二抗癌疗法包括苯丁酸氮芥
Figure BDA00038687543600004316
在一些方面，所述第二抗癌疗法包括环磷酰胺
Figure BDA00038687543600004317
Figure BDA00038687543600004318
在一些方面，所述第二抗癌疗法包括来那度胺
Figure BDA00038687543600004319
在一些方面，所述第二抗癌疗法包括硼替佐米
Figure BDA00038687543600004320
在一些方面，所述第二抗癌疗法包括地塞米松。在一些方面，所述第二抗癌疗法包括米托蒽醌。在一些方面，所述第二抗癌疗法包括依托泊苷。在一些方面，所述第二抗癌疗法包括阿糖胞苷。在一些方面，所述第二抗癌疗法包括苯达莫司汀
Figure BDA00038687543600004321
在一些方面，所述第二抗癌疗法包括。在一些方面，所述第二抗癌疗法包括利妥昔单抗
Figure BDA00038687543600004322
在一些方面，所述第二抗癌疗法包括异环磷酰胺。在一些方面，所述第二抗癌疗法包括亚叶酸(甲酰四氢叶酸)。在一些方面，所述第二抗癌疗法包括氟尿嘧啶(5-FU)。在一些方面，所述第二抗癌疗法包括奥沙利铂(乐沙定)。在一些方面，所述第二抗癌疗法包括FOLFOX。在一些方面，所述第二抗癌疗法包括紫杉醇。在一些方面，所述第二抗癌疗法包括多西紫杉醇。在一些方面，所述第二抗癌疗法包括长春新碱
Figure BDA0003868754360000441
在一些方面，所述第二抗癌疗法包括氟达拉滨
Figure BDA0003868754360000442
在一些方面，所述第二抗癌疗法包括沙利度胺
Figure BDA0003868754360000443
在一些方面，所述第二抗癌疗法包括阿仑单抗
Figure BDA0003868754360000444
奥法木单抗
Figure BDA0003868754360000445
在一些方面，所述第二抗癌疗法包括依罗莫司
Figure BDA0003868754360000446
Figure BDA0003868754360000447
在一些方面，所述第二抗癌疗法包括卡非佐米(KYPROLISTM)。
在一些方面，所述第二抗癌疗法包括选自以下的增强NK和/或CD8+T细胞存活的药剂：聚乙二醇化IL-2、IL-18和IL-15。
通过说明的方式而不是通过限制的方式，提供以下实施例。
实施例
实施例1.IL-10和Fc融合物
Fc和IL-10融合蛋白是通过将人IgG1.3f Fc结构域(SEQ ID NO:4)用富含Gly-Ser的多肽接头(GGGGSSGGGGSGGGGSGGGGS，SEQ ID NO:41)在其C末端融合野生型人IL-10(SEQID NO:1)来构建的(Fc-IL-10，SEQ ID NO:14)(图1A和图1B)。还通过将人IgG1.3f Fc结构域用富含Gly-Ser的多肽接头在其N末端融合野生型人IL-10来制得另一种融合蛋白(IL-10-Fc，SEQ ID NO:33)。选择IgG1.3f Fc结构域以提供降低的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能，同时接头用于将IL-10与Fc结构域分开以增加活性并且使IL-10在与Fc附接时形成功能性二聚体。将共价栓系Fc二聚体的两个天然二硫键保留以帮助防止IL-10同二聚体结构域在低浓度和低pH下解离。使用野生型人IL-10序列而不用进一步修饰以使免疫原性风险最小化并且使蛋白质的一种或多种天然功能最大化。
可以使用本领域已知的常规程序表达和制备本文所述的融合蛋白。
实施例2.在原代CD8+T细胞上的IFNγ分泌的诱导和NK细胞毒性
使用Perkin Elmer IFNγAlphaLISA检测试剂盒测量了在原代人CD8+T细胞上的通过Fc-IL-10对IFNγ的诱导。简言之，将PBMC使用密度梯度离心采用Lympholyte H(Ceadarlane)从来自健康供体的人全血中分离。将CD8+T细胞使用CD8+T细胞分离试剂盒(Miltenyi)进行阴性分离。在5％CO2中在37℃下将分离的CD8+T细胞在完全培养基(AIM V培养基(Gibco)+10％胎牛血清(FBS)(Gibco))中用板结合的抗CD3和抗CD28刺激72小时。孵育后，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(Gibco)洗涤，铺板于完全培养基中并且在5％CO2中在37℃下放置3小时，然后用在有或没有20U/mL重组人IL-2(Peprotech)的完全培养基中的Fc-IL-10或对照刺激72小时。使用Perkin Elmer IFNγAlphaLISA检测试剂盒分析上清液的IFNγ。重组人IL-10、聚乙二醇化人IL-10(PEG-IL-10)和Fc-IL-10均诱导原代CD8+T细胞的IFNγ分泌(图2A-图2B)。
使用Perkin Elmer
Figure BDA0003868754360000448
EuTDA细胞毒性试剂(Perkin Elmer)测量在原代人NK细胞上的通过Fc-IL-10对细胞介导的细胞毒性的诱导。简言之，使用密度梯度离心(Lympholyte H(Ceadarlane))从来自健康供体的人全血中分离PBMC。将人原代NK细胞使用NK细胞分离试剂盒(Miltenyi)进行阴性分离。单独地，将K562细胞用配体TDA(PerkinElmer)加载并且用2mM丙磺舒洗涤以防止泄露。将NK细胞用10nM的IL-10或Fc-IL-10预处理48小时，并且然后以20:1或5:1的E:T比率添加到TDA标记的K562靶细胞中。将混合物在37℃下在5％CO2中孵育2小时。将上清液添加到铕溶液(Perkin Elmer)中，并且在时间分辨荧光计(EnVision)中测量荧光。测量的信号与裂解细胞的量直接相关。将细胞毒性进行测量并且绘制为裂解百分比。在K562靶标杀伤测定中，用Fc-IL-10预处理的人NK细胞示出了增加的细胞毒性(图2C-图2D)，这指示Fc-IL-10增强了NK介导的细胞毒性。
实施例3.原代免疫细胞中STAT3的磷酸化
人体外pSTAT3评估：使用流式细胞术测量在人全血中的T细胞(CD3+)和B细胞(CD19+)上通过Fc-IL-10造成的STAT3磷酸化。流式细胞术组套如下：CD3[UCHT1；Biolegend]、CD19[HIB19；Biolegend]和STAT3(pY705)[4/P-STAT3；BD Biosciences]。简言之，将来自健康供体的人全血用Fc-IL-10或对照(hIL-10和5KPEG-hIL-10(与5KD PEG缀合的人IL-10))刺激。通过添加预温热的Phosflow Lyse/Fix缓冲液(BD biosciences)停止刺激，然后将其在FAC缓冲液(杜氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)(Gibco)和0.5％胎牛血清(FBS)(Gibco))中洗涤。将样品用抗体针对表面标记物(CD3和CD19)染色，用Phosflow PermBuffer III[BD Biosciences]透化并且针对内部标记物用pSTAT3抗体染色。30分钟孵育后，将样品洗涤，重悬浮于FACS缓冲液中并且通过FACSCantoXTM流式细胞术系统分析。
小鼠体外pSTAT3评估：使用流式细胞术测量在来自C57BL/6小鼠脾细胞的T细胞(CD3+)和B细胞(CD45R+)中通过mIgG1-D265A-Fc-(G4S)4-mIL-10(“mFc-IL-10”)(SEQ IDNO:37)造成的STAT3磷酸化。流式细胞术组套如下：CD3[17A2；BD Biosciences]、CD45R[RA3-6B2；BD Biosciences]和STAT3(pY705)[4/P-STAT3；BD Biosciences]。简言之，将来自C57BL/6小鼠的脾细胞机械破碎，重悬浮于RPMI-1640[Gibco]中并且通过70μm过滤器过滤。红细胞[Sigma]裂解后，将脾细胞铺板在96孔u形底板中并且用mFc-mIL10或对照刺激。通过将冷FAC缓冲液(杜氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)[Gibco]+0.5％胎牛血清(FBS)[Gibco])添加到每个孔中停止刺激。然后将样品固定(BD Cytofix[BD Biosciences])，用PhosflowPerm缓冲液III[BD Biosciences]透化，封闭非特异性结合(BD小鼠FC封闭液[BDBiosciences])并且用抗体(CD3、CD45R、pSTAT3)染色。30分钟孵育后，将样品洗涤，重悬浮于FACS缓冲液中并且通过FACSCantoXTM流式细胞术系统分析。
用Fc-IL-10处理导致诱导STAT3的磷酸化作为原代免疫细胞中靶标接合与信号传导的近源生物学结果，与聚乙二醇化IL-10的效力可比(表5)。
表5
Figure BDA0003868754360000451
实施例4.小鼠和人CRC肿瘤外植体的转录分析
将汇集的从小鼠收获的小鼠CRC肿瘤(MC38)(n＝3)或获得的人CRC肿瘤(n＝1)切为小块，浸入培养基中并且置于96孔板的孔(每个处理8个孔)中。然后将板在37℃下保持2小时。将100ul的新鲜添加了25ng/ml(对于小鼠MC38肿瘤)或20ng/ml(对于人CRC肿瘤)IL-2的淋巴细胞生长培养基添加到每个孔中。然后将板在37℃下孵育18小时。然后将100ul的具有或没有1nM Fc-IL-10(对于人CRC肿瘤)或0.1nM mFc-IL-10(对于小鼠MC38肿瘤)的培养基添加到适当的孔中，并且将板在37℃下进一步孵育72h。将上清液从孔中去除；将RNA裂解缓冲液(根据RNA Easy试剂盒制备，Qiagen)添加到每个孔中以收获来自组织和细胞的RNA。将RNA Easy试剂盒(Qiagen)用于从每个样品中分离RNA，并且使用定量的RNA用逆转录试剂盒(Invitrogen)来生成cDNA。将所得cDNA用无DNA酶和无RNA酶的水稀释4倍。然后对于每个重复试样将1ul的稀释的cDNA用于定量PCR以测量CD8α、IFNγ、颗粒酶B和GAPDH的基因表达水平。
Fc-IL-10在离体原代小鼠和人肿瘤外植体培养物两者中诱导CD8α、颗粒酶B和IFNγ的表达(参见图3A-图3F)。
实施例5.动物模型中的肿瘤的治疗
从Charles River实验室饲养和转运雌性C57BL/6NCrl小鼠(对于MC38-255、MC38-337)。从Envigo饲养和转运雌性Balb/cAnNHsd小鼠(对于CT26-210、CT26-213)。递送时，小鼠为六至八周龄，并且在到达1个月内植入。
使小鼠通过以下方式接受肿瘤植入：在右侧腹皮下注射在单一细胞悬浮液中浓度为1e7个细胞/mL的1e6个活MC-38或CT-26细胞。植入的那天被指定为研究第0天。将植入的动物通过肿瘤体积分选并且肿瘤达到近似的目标初始尺寸100mm3后，将其随机分配到各组中。将接受所配制的化合物施用的小鼠在每次施用前立即单独称重。对于腹膜内(IP)注射，以10mL/kg体重施用剂量体积，或对于皮下(SC)注射，以5mL/kg体重施用剂量体积。
对于mFc-IL10暴露的药代动力学(PK)分析，经由尾部切口从尾静脉抽取10uL的全血并且将其置于90uL的REXXIP缓冲液A(Gyros)中，并且然后立即放置在湿冰上，并且然后在4℃下以3,000g离心30分钟。将65uL上清液铺板并且在-20℃下储存直到进一步分析。
通过每周两次用卡尺测量肿瘤来确定肿瘤反应。将动物保持在研究中直到个别肿瘤在两次随后测量中达到1cm3的预先确定的目标尺寸。用以下公式计算肿瘤体积[mm3]：
肿瘤体积[mm3]＝(长度[mm]x宽度[mm]2)/2
监测肿瘤达到完全消退(测量为0mm3)的动物的肿瘤复发。进行研究的所有肿瘤完全消退或达到肿瘤负荷后45天，将具有完全消退的动物视为无肿瘤(治愈)。
用单次剂量的mFc-IL-10治疗的MC38：
在第7天，使荷载MC-38肿瘤的C57BL/6NCrl雌性小鼠分别接受单次IP施用(QDx1IP)0、0.1、0.3、1.0、3.0或10mg/kg mFc-IL-10与10、9.9、9.7、9.0、7.0或0mg/kg的平衡同种型对照MOPC-21(鼠IgG1，BioXCell)(总共10mg/kg)。测量并且记录单个肿瘤体积，n＝10/组。分别从接受0、0.1、0.3、1.0、3.0和10mg/kg的mFc-IL-10的组产生0％(0/10)、10％(1/10)、70％(7/10)、90％(9/10)、100％(10/10)和100％(10/10)数量的无肿瘤小鼠(图4A-图4F)。因此用Fc-mIL10的单次剂量单一疗法治疗诱导了剂量依赖性肿瘤功效。
用单次剂量的mFc-IL-10或PEG-mIL-10治疗的MC-38
在第6天，使荷载MC-38肿瘤的C57BL/6NCrl雌性小鼠接受单次IP施用：分别为0.1、0.3、1.0、3.0或10mg/kg mFc-IL-10或等效IL-10摩尔浓度的0.04、0.13、0.43、1.28或4.28mg/kg的10kD PEG-mIL10，或10mg/kg同种型对照抗DT mIgG1 D265A。将接受Fc-mIL10的动物用9.9、9.7、9.0、7.0或0mg/kg的同种型对照抗DT mIgG1 D265A的组合平衡(至总共10mg/kg)。分配每组十只小鼠(n＝10)用于肿瘤体积功效和肿瘤免疫监测。从被分配用于免疫监测的动物取得用于PK微采样的血液。
发现接受低至1.0mg/kg的单次mFc-IL10施用的组具有80％-100％无肿瘤产率(图5A-图5F)；然而，接受单次剂量的10kD PEG-mIL10的任一组中均没有无肿瘤动物(图5G-图5K)。因此，单次低剂量的Fc-IL-10治疗介导了有效的功效，而单次高剂量的PEG-IL-10则是最低有效的。
免疫监测
将在来自MC-38小鼠模型的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中，在有或没有mIgG1,D265A抗PD1的情况下通过mFc-IL-10对CD8+T细胞(CD45+、CD3+、CD8+)、CD4+T细胞(CD45+、CD3+、CD4+)和NK细胞(CD45+、CD3-、NK1.1+)的激活使用流式细胞术测量为Ki67和颗粒酶B的阳性百分比。流式细胞术组套如下：CD45(30-F11；ThermoFisher)、CD3(145-2C11；Biolegend)、CD4(RM4-5；Biolegend)、CD8(53-6.7；ThermoFisher)、NK1.1(PK136；Biolegend)、Ki67(16A8；Biolegend)、颗粒酶B(NGZB；ThermoFisher)、IFNγ(XMG1.2；Biolegend)和活力染料(ThermoFisher)。Ki67水平与TIL中CD8+T细胞和NK细胞的增殖相关，而颗粒酶B水平与所述细胞的激活相关。
简言之，在治疗后5天收集了来自荷瘤小鼠的小鼠CRC肿瘤(MC-38)。将肿瘤使用肿瘤解离试剂盒(Miltenyi)进行酶促消化。将解离的细胞通过70μm过滤器过滤，在布雷菲德菌素A(蛋白质转运抑制剂)的存在下用PMA和离子霉素刺激，用杜氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)(Gibco)洗涤并且用活力染料染色。随后将样品针对非特异性结合封闭(BD小鼠FC封闭液，BD Biosciences)，针对外部标记物(CD45、CD8、NK1.1)染色，固定并且使用FOXp3/转录因子染色缓冲液组(E-Bioscience)透化，并且针对内部标记物(CD3、Ki67、颗粒酶B和IFNγ)染色。30分钟孵育后，将样品洗涤，重悬浮于FACS缓冲液(杜氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)(Gibco)+0.5％胎牛血清(FBS)(Gibco))中，并且通过FACSCantoXTM流式细胞术系统分析。用Fc-IL-10治疗导致TIL中CD8+T细胞和NK细胞的激活和增殖增加(图6A-图6B)。
用mFc-IL-10与抗PD1组合治疗的CT-26：
在第7天，使荷载CT-26肿瘤的Balb/CAnNHsd雌性小鼠接受0.1、0.3或1.0mg/kgmFc-IL-10，QDx1 IP或1.0mg/kg的同种型对照抗白喉毒素(抗DT)mIgG1，QDx1 IP。在第7天开始，还使小鼠组合地接受10mg/kg抗PD1 mIgG1 D265A(“抗PD1”)，IP Q4Dx3(每4天腹膜内给药一次，持续3个剂量)，或10mg/kg的同种型对照抗DT mIgG1，IP Q4Dx3。测量并且记录单个肿瘤体积。
在第14、21和28天(分别为初始剂量后的7、14和21天)，分配每组八只小鼠(n＝8)用于肿瘤体积功效；分配n＝7只/组/收集日用于特定组的肿瘤免疫监测。从被分配用于免疫监测的动物取得用于PK微采样的血液。
分别从对照组产生0％，从接受0、0.1、0.3和1.0mg/kg的mFc-IL10与抗PD1mIgG1D265A组合的组产生0％(0/8)、62.5％(5/8)、100％(8/8)和100％(8/8)数量的无肿瘤小鼠(图7A-图7E)。
在分别用0.1、0.3和1mg/kg mFc-IL-10治疗的荷载CT26肿瘤的小鼠中，循环中可检测的药物浓度在不同剂量水平的给药后14天低于LLOQ(图7F)。
免疫监测
使用流式细胞术测量了在来自用mFc-IL-10+mIgG1,D265A抗PD1(“抗PD1”)治疗的CT26小鼠模型的TIL中抗原特异性CD8+T细胞的百分比。流式细胞术组套如下：CD45(30-F11；ThermoFisher)、CD3(145-2C11；Biolegend)、CD8(53-6.7；ThermoFisher)、AH1四聚体(MBL)和活力染料(ThermoFisher)。
简言之，将来自荷瘤小鼠的CT26肿瘤在治疗后7、14和21天收集，并且使用Miltenyi GentleMAC Octo解离器手动解离。将解离的细胞通过70μm过滤器过滤并且在蛋白质转运抑制剂混合物的存在下用PMA和离子霉素刺激。然后将样品用杜氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)(Gibco)洗涤并且用活力染料染色。将样品针对非特异性结合封闭(BD小鼠FC封闭液，BD Biosciences)，针对AH1四聚体染色，然后与抗体(分别针对CD45、CD3和CD8)一起孵育。30分钟孵育后，将样品洗涤，重悬浮于FACS缓冲液(杜氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)(Gibco)+0.5％胎牛血清(FBS)(Gibco))中，并且通过FACSCantoXTM流式细胞术系统分析。与仅用抗PD1治疗的小鼠相比，在用mFc-IL-10与抗PD1组合治疗的小鼠的CT26肿瘤中，肿瘤特异性AH1四聚体阳性CD8+T细胞增加(图7G-图7I)。
用mFc-IL-10或PEG-mIL10与抗PD1组合治疗的CT-26
在第7天开始，使荷载CT-26肿瘤的Balb/CAnNHsd雌性小鼠接受0.03、0.1或0.3mg/kg mFc-IL10，单次IP施用(QDx1 IP)；或0.2或1.0mg/kg 5kD PEG-mIL10，QDx25 SC(每天施用，持续25天，皮下)；或3.0mg/kg 5kD PEG-mIL10，QDx1 SC(单次皮下施用)。在第7天开始，还使小鼠组合地接受10mg/kg抗PD1 mIgG1 D265A，IP Q4Dx3或10mg/kg同种型对照抗DTmIgG1，IP Q4Dx3。测量并且记录单个肿瘤体积。
在第14天(初始剂量后的7天)，分配每组十只小鼠(n＝10)用于肿瘤体积功效；n＝6只/组用于血液和肿瘤免疫监测。
从对照组产生0％(0/10)并且从仅接受抗PD1 mIgG1 D265A的动物产生30％(3/10)数量的无肿瘤小鼠(图8A-图8E)。
在接受mFc-IL10的组中，在分别接受单次IP施用0.03、0.10和0.30mg/kg Fc-mIL10与抗PD1 mIgG1 D265A的组合后，产生40％(4/10)、80％(8/10)和80％(8/10)产率的无肿瘤小鼠(图8A-图8E)。
相比之下，当将PEG-mIL10以3.0mg/kg的单次皮下剂量与抗PD1 mIgG1 D265A组合施用时，这仅产生20％(2/10)产率的无肿瘤小鼠(图8F)(而在仅接受抗PD1 mIgG1D265A的小鼠的对照组中，30％的动物无肿瘤)。在接受25个每日皮下施用0.20mg/kg PEG-mIL10与抗PD1 mIgG1 D265A的组合后，产生80％(8/10)产率的无肿瘤小鼠(图8G)。在接受1.0mg/kgPEG-mIL10，QDx25 SC与抗PD1 mIgG1 D265A的组合后，导致90％(9/10)无肿瘤的产率，以及还有10％无进展(图8H)。
在上述治疗的小鼠中，mFc-mIL-10和聚乙二醇化mIL-10的药物浓度-时间曲线的比较示于图9A和图9B中。将腹膜内(IP)施用于小鼠后mFc-mIL-10的药代动力学(PK)数据使用SAAM II软件(2.3.1版，The Epsilon Group，夏洛茨维尔，弗吉尼亚州，美国)用与一级吸收偶合的三室模型进行拟合。mFc-mIL-10的药代动力学模型的示意性表示示于下文：
Figure BDA0003868754360000481
用于药代动力学模型的微分方程描述如下：
Figure BDA0003868754360000482
Figure BDA0003868754360000483
Figure BDA0003868754360000484
Figure BDA0003868754360000485
其中Cp是中央室中的药物浓度；Vc是中央室中的分布体积；A注射部位、A外周1和A外周2分别为注射部位、外周室1号和2号中的药物量；ka是吸收速率常数；k12、k21、k13和k31是中央室与外周室之间的转移速率常数；k10是非靶标介导的消除速率常数；Vmax是最大靶标介导的消除速率常数；Km是靶标介导的消除速率常数是Vmax的一半时的米氏(Michaelis-Menten)常数。在时间为零时，A注射部位等于施用的剂量，并且剩余室中的药物量或浓度等于零。为了帮助参数估计，将贝叶斯(Bayesian)估计用于Vmax和Km确定。
将每日皮下(SC)给药后的PEG-mIL-10PK数据使用SAAM II软件用单室模型连同一级吸收拟合。PEG-mIL-10的药代动力学模型的示意性表示示于下文：
Figure BDA0003868754360000491
用于药代动力学模型的微分方程如下列出：
Figure BDA0003868754360000492
Figure BDA0003868754360000493
其中kd是消除速率常数，并且针对0.2mg/kg SC每日剂量组和3mg/kg单次剂量单独拟合。在时间为零时，A注射部位等于施用的剂量，并且中央室中的药物浓度等于零。为了说明每日给药后暴露于PEG-mIL-10的降低，使用以下方程调整剂量：从时间零至两周，每日剂量＝剂量的标称值x e-0.002375x以小时计的时间；从两周开始，每日剂量＝剂量的标称值x e-0.002375x 336 小时。通过目标函数最小化、Akaike和Schwarz-Bayesian信息准则、拟合和残差图的视觉检查以及估计的参数的精度来评估拟合优度。
当将PEG-mIL-10以0.2mg/kg SC每天施用持续25天时PEG-mIL-10具有药理学活性，并且在整个治疗过程中保持循环中的药物浓度；然而，将其以3mg/kg的单次SC剂量施用时没有活性，而到第4天药物浓度下降到低于LLOQ。相比之下，当将mFc-mIL-10以0.1或0.3mg/kg的单次IP剂量施用时具有药理学活性，即使分别在给药后8和12天药物浓度降低到LLOQ。
实施例6.另外的小鼠肿瘤模型
将小鼠替代品Fc-IL-10分子即mFc-IL-10在多个小鼠肿瘤模型中作为单一疗法或与检查点阻断剂组合进行测试。在约100mm3的肿瘤体积时开始治疗性给药，同时在肿瘤植入前1-2天开始预防性给药。除了MC38和CT26模型外，mFc-IL-10还在J558L骨髓瘤和1956肉瘤中作为单一疗法示出了稳健的单次剂量抗肿瘤功效，以及当与检查点阻断剂组合时在更耐药的肿瘤模型(包括B16-F10和4T1)中示出了显著的单次剂量活性(表6)。
表6
Figure BDA0003868754360000494
Figure BDA0003868754360000501
“非常有效”＝60％-100％，以0.3-10.0mg/kg的TF单次剂量，或与抗CTLA4或抗PD1组合；
“有效”＝40％，以0.3-10.0mg/kg的TF单次剂量；
“活性显著”＝肿瘤生长延迟、病变数量减少、但是很少(如果有的话)小鼠变为无肿瘤。
实施例7.在化学诱导的结肠炎模型中的Fc-IL-10和抗CTLA4
将氧化偶氮甲烷(AOM)/葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠用作结肠炎相关结直肠癌的临床前模型(Thaker,A.I.,等人,J Vis Exp.,2012；(67):4100)，以确定在结肠炎的发展中免疫检查点阻断剂(如抗CTLA4)的作用和Fc-IL-10治疗的作用。在此模型中，使AOM/DSS处理的小鼠患上结肠的慢性肠道炎症和腺癌。
为了诱导结肠炎和结肠肿瘤，将8周龄的C57Bl/6小鼠用单次腹膜内剂量的AOM(10mg/kg)处理，然后经10周的时间段进行三个七天周期的口服DSS(在蒸馏水中2.5％)(Thaker,A.I.,等人,J Vis Exp.,2012；(67):4100)。在第70天，将小鼠按体重随机分配并且每5天用生物制剂(同种型对照抗DT mIgG1+抗DT mIgG2a、抗CTLA4、mFc-IL-10或其组合)治疗，总共6次注射。将相对于基线的重量减轻百分比用作结肠炎严重程度的替代量度。将体重减轻大于20％或腹泻和直肠出血2-3天的小鼠视为不满足存活终点并且实施安乐死。在治疗开始后40天收集存活的动物。为了确定治疗的抗肿瘤功效，评价收集的小鼠的结肠中的肿瘤的数量和大小。
用mFc-IL-10治疗的小鼠示出了与同种型对照组相比的相似的存活和重量减轻(图10A)。在抗CTLA4治疗组中，存活百分比迅速降低，并且与同种型对照组相比，更多的小鼠展现出快速重量减轻。相比之下，与用仅抗CTLA4治疗的小鼠相比，用抗CTLA4和mFc-IL-10的组合治疗的小鼠直到第25天才示出了延迟的重量减轻开始和增加的存活率(图10A-图10E)。因此，Fc-IL-10减轻了结肠炎的抗CTLA4恶化。在AOM/DSS诱导的小鼠中，Fc-IL-10治疗还导致与同种型对照相比结肠肿瘤的减少(图11A-图11C)。
实施例8.食蟹猴中的重复施用研究
贫血和血小板减少症是预期的与IL10治疗相关的不良事件(Fedorak,R.N.,等人,Gastroenterology,2000；119:1473-1482)。将培伊洛白介素(Pegilodecakin)(AM0010)(当前临床测试的PEG-IL-10)按照进行5天休息2天的时间表给药以避免3$级血液学不良事件(Hecht,J.R.,等人,J.of Clinical Oncology,2018；36:4_suppl,374-374)。
作为安全性评估的一部分，将Fc-IL-10在重复剂量研究中通过皮下(SC；每周一次x 3，以0.1和0.3mg/kg)或静脉(IV)注射(每2周一次x 3，以0.06和0.18mg/kg或每4周一次x2，以0.06mg/kg)施用于食蟹猴(N＝3/剂量)。将混合性别和大约3岁的研究年龄的食蟹猴(毛里求斯)随机放置在剂量组中，并且通过以下方式接受媒介物(20mM Tris，250mM蔗糖，0.05mM DTPA，0.05％Tween 80，pH 7.5)或Fc-IL-10：SC注射到肩胛骨之间的背中线中或经由留置导管通过缓慢推注静脉内IV施用于隐静脉中。在测试前期间、在给药后第一小时期间和血液收集时间点时和/或每日至少一次观察动物的病症和行为方面的变化。根据表7中的时间表，从股静脉收集血液样品用于药代动力学(在K2EDTA管中0.5mL)、血液学(在K2EDTA管中1.0mL)或血清化学(在血清分离器管中1.5mL)。接受BMS-986333的猴的毒理学观察结果列于表8中并且血液学的关键变化列于表9中。总之，在接受每周一次Fc-IL-10的猴中，在0.1(与给药前相比Hct 0.5×和血小板0.4×)以及以0.3mg/kg(与给药前相比Hct 0.15×和血小板0.06×)的情况下3只动物中有1只存在剂量限制性不良结果发现，以及在0.3mg/kg的情况下死亡。以0.06mg/kg以不太频繁的间隔(每2周或每4周一次)或以0.18mg/kg每2周一次向猴施用的Fc-IL-10是较好耐受的，其中对RBC参数和血小板具有适度的影响(与给药前相比Hct 0.65×和血小板0.22-0.3×)。
表7：收集血液以评估接受Fc-IL-10的食蟹猴的药代动力学、血液学和血清化学的时间表。
Figure BDA0003868754360000511
*CBC＝白细胞、红细胞、血红蛋白、血细胞比容、平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白含量、红细胞分布宽度、血小板和网织红细胞计数及差值
**血清化学＝天冬氨酸转氨酶、丙氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、γ谷氨酰基转移酶、总胆红素、血尿素氮、葡萄糖、钙、甘油三酯、白蛋白、总蛋白质、球蛋白、A/G比、无机磷、肌酸酐、胆固醇、钠、钾和氯。
表8：将Fc-IL-10重复施用于食蟹猴后的毒理学观察结果的总结。
Figure BDA0003868754360000512
Figure BDA0003868754360000521
表9：Fc-IL-10：给药频率对食蟹猴的血细胞比容和血小板计数的影响
Figure BDA0003868754360000522
*数据报告了在剂量组中观察到的最低血细胞比容(Hct)或血小板(Plt)计数。
给药后大约7-14天在用Fc-IL-10给药的所有猴中检测了治疗中出现的ADA反应，所述反应在重复施用研究中限制了Fc-IL-10暴露并且可能低估了Fc-IL-10对血液学参数的影响。
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<400> 1
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Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
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<212> DNA
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<220>
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<220>
<223> 信号肽
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1 5 10 15
Arg Ala
<210> 4
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc(Ig1.3f)
<400> 4
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly
1 5 10 15
Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
<210> 5
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc IgG1f
<400> 5
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 6
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc IgG1a/z
<400> 6
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 7
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc IgG1 (L234A,L235E,G237A)
<400> 7
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly
1 5 10 15
Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 8
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc IgG1 (P238K)
<400> 8
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Leu Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gly Lys Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 9
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc IgG1f sans末端K
<400> 9
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
<210> 10
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1.3f sans末端K
<400> 10
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly
1 5 10 15
Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
<210> 11
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc-IgG1 P238K sans末端K
<400> 11
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Leu Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gly Lys Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
<210> 12
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc - 3半胱氨酸桥变体
<400> 12
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
20 25 30
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
35 40 45
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
50 55 60
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
65 70 75 80
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
85 90 95
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
100 105 110
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
115 120 125
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
130 135 140
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
165 170 175
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
195 200 205
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
210 215 220
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 13
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 半胱氨酸桥
<400> 13
Val Glu Pro Lys Ser Cys
1 5
<210> 14
<211> 407
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc-IL-10
<400> 14
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly
1 5 10 15
Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu
245 250 255
Asn Ser Cys Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp
260 265 270
Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp
275 280 285
Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys
290 295 300
Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu
305 310 315 320
Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala
325 330 335
His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu
340 345 350
Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val
355 360 365
Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr
370 375 380
Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr
385 390 395 400
Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
405
<210> 15
<211> 408
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc-K-IL-10
<400> 15
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly
1 5 10 15
Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser
245 250 255
Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg
260 265 270
Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys
275 280 285
Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe
290 295 300
Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr
305 310 315 320
Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys
325 330 335
Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg
340 345 350
Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala
355 360 365
Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile
370 375 380
Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala
385 390 395 400
Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
405
<210> 16
<211> 406
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FC-wt-hIL10 4xG4s间隔子
<400> 16
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn
245 250 255
Ser Cys Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu
260 265 270
Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln
275 280 285
Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly
290 295 300
Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu
305 310 315 320
Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His
325 330 335
Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg
340 345 350
Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu
355 360 365
Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys
370 375 380
Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met
385 390 395 400
Thr Met Lys Ile Arg Asn
405
<210> 17
<211> 406
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ILFC-301 FC-IL10 G4Sx4
<400> 17
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly
1 5 10 15
Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn
245 250 255
Ser Cys Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu
260 265 270
Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln
275 280 285
Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly
290 295 300
Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu
305 310 315 320
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Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp
275 280 285
Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys
290 295 300
Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu
305 310 315 320
Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala
325 330 335
His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu
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Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val
355 360 365
Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr
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<223> ILFC-302 FC-IL10 N279D G4Sx4
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val
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210 215 220
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
225 230 235 240
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
245 250 255
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
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Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
275 280 285
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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355 360 365
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
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<210> 36
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL10-Fc G4Sx4
<400> 36
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65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Ser Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
180 185 190
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu
195 200 205
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
210 215 220
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
225 230 235 240
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
245 250 255
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
260 265 270
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
275 280 285
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
290 295 300
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
305 310 315 320
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
325 330 335
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
340 345 350
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
355 360 365
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
370 375 380
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
385 390 395 400
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
405 410
<210> 37
<400> 37
000
<210> 38
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 38
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 39
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 39
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 40
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 40
Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 41
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 41
Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser
20
<210> 42
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头 4xG4s
<400> 42
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 43
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头 3xG4s
<400> 43
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 44
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头 2xG4s
<400> 44
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 45
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 45
Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10

Claims (104)

1.一种IL-10融合蛋白，所述IL-10融合蛋白包含(i)IL-10多肽，其包含与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；和(ii)第二多肽，其中所述IL-10融合蛋白包含IL-10活性。
2.根据权利要求1所述的IL-10融合蛋白，其中所述第二多肽包含白蛋白多肽。
3.根据权利要求1所述的IL-10融合蛋白，其中所述第二多肽包含Fc多肽。
4.根据权利要求3所述的IL-10融合蛋白，其中所述Fc多肽包含与选自SEQ ID NO:4-12的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的IL-10融合蛋白，其中所述第二多肽与所述IL-10多肽的N末端融合。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的IL-10融合蛋白，其中所述第二多肽与所述IL-10多肽的C末端融合。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的IL-10融合蛋白，其中所述IL-10多肽通过接头与所述第二多肽融合。
8.根据权利要求7所述的IL-10融合蛋白，其中所述接头包含至少约4个氨基酸、至少约5个氨基酸、至少约6个氨基酸、至少约7个氨基酸、至少约8个氨基酸、至少约9个氨基酸、至少约10个氨基酸、至少约11个氨基酸、至少约12个氨基酸、至少约13个氨基酸、至少约14个氨基酸、至少约15个氨基酸、至少约16个氨基酸、至少约17个氨基酸、至少约18个氨基酸、至少约19个氨基酸、至少约20个氨基酸、或至少约21个氨基酸。
9.根据权利要求7或8所述的IL-10融合蛋白，其中所述接头包含至少约15个氨基酸。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的IL-10融合蛋白，其中所述接头包含至少约20个氨基酸。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的IL-10融合蛋白，其中所述接头包含至少约21个氨基酸。
12.根据权利要求7至11中任一项所述的IL-10融合蛋白，其中所述接头包含甘氨酸和丝氨酸。
13.根据权利要求7至12中任一项所述的IL-10融合蛋白，其中所述接头包含GGGGS(SEQID NO:39)基序或GGGS(SEQ ID NO:38)基序。
14.根据权利要求7至13中任一项所述的IL-10融合蛋白，其中所述接头包含选自SEQID NO:38-45的氨基酸序列。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的IL-10融合蛋白，其中所述IL-10多肽包含与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列具有至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的IL-10融合蛋白，其中所述IL-10多肽包含SEQID NO:1中所示的氨基酸序列。
17.根据权利要求3至16中任一项所述的IL-10融合蛋白，其中所述Fc多肽包含与选自SEQ ID NO:4-12的氨基酸序列具有至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
18.根据权利要求3至17中任一项所述的IL-10融合蛋白，其中所述Fc多肽包含选自SEQID NO:4-12的氨基酸序列。
19.根据权利要求1、3-5和7至18中任一项所述的IL-10融合蛋白，所述IL-10融合蛋白包含与选自SEQ ID NO:14-32的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
20.根据权利要求1、3-5和7至19中任一项所述的IL-10融合蛋白，所述IL-10融合蛋白包含与选自SEQ ID NO:14-32的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
21.根据权利要求1、3-5和7至20中任一项所述的IL-10融合蛋白，所述IL-10融合蛋白包含与选自SEQ ID NO:14-32的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
22.根据权利要求1、3-5和7至21中任一项所述的IL-10融合蛋白，所述IL-10融合蛋白包含具有3个或更少的取代、插入或缺失的选自SEQ ID NO:14-32的氨基酸序列。
23.根据权利要求1、3-5和7至22中任一项所述的IL-10融合蛋白，所述IL-10融合蛋白包含具有2个或更少的取代、插入或缺失的选自SEQ ID NO:14-32的氨基酸序列。
24.根据权利要求1、3-5和7至23中任一项所述的IL-10融合蛋白，所述IL-10融合蛋白包含具有1个或更少的取代、插入或缺失的选自SEQ ID NO:14-32的氨基酸序列。
25.根据权利要求1、3-5和7至24中任一项所述的IL-10融合蛋白，所述IL-10融合蛋白包含选自SEQ ID NO:14-32的氨基酸序列。
26.根据权利要求1、3、4和6至18中任一项所述的IL-10融合蛋白，所述IL-10融合蛋白包含与选自SEQ ID NO:33-36的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
27.根据权利要求1、3、4、6至18和26中任一项所述的IL-10融合蛋白，所述IL-10融合蛋白包含与选自SEQ ID NO:33-36的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
28.根据权利要求1、3、4、6至18和27中任一项所述的IL-10融合蛋白，所述IL-10融合蛋白包含与选自SEQ ID NO:33-36的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
29.根据权利要求1、3、4、6至18和27至28中任一项所述的IL-10融合蛋白，所述IL-10融合蛋白包含具有3个或更少的取代、插入或缺失的选自SEQ ID NO:33-36的氨基酸序列。
30.根据权利要求1、3、4、6至18和26至29中任一项所述的IL-10融合蛋白，所述IL-10融合蛋白包含具有2个或更少的取代、插入或缺失的选自SEQ ID NO:33-36的氨基酸序列。
31.根据权利要求1、3、4、6至18和26至30中任一项所述的IL-10融合蛋白，所述IL-10融合蛋白包含具有1个或更少的取代、插入或缺失的选自SEQ ID NO:33-36的氨基酸序列。
32.根据权利要求1、3、4、6至18和26至31中任一项所述的IL-10融合蛋白，所述IL-10融合蛋白包含选自SEQ ID NO:33-36的氨基酸序列。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的IL-10融合蛋白，其中当向有需要的受试者以不超过一周一次施用所述IL-10融合蛋白时，所述IL-10融合蛋白能够治疗所述受试者的癌症。
34.根据权利要求33所述的IL-10融合蛋白，其中当向有需要的受试者施用所述IL-10融合蛋白约每两周一次时，所述IL-10融合蛋白能够治疗所述受试者的癌症。
35.根据权利要求34所述的IL-10融合蛋白，其中当向有需要的受试者施用所述IL-10融合蛋白约每三周一次时，所述IL-10融合蛋白能够治疗所述受试者的癌症。
36.根据权利要求35所述的IL-10融合蛋白，其中当向有需要的受试者施用所述IL-10融合蛋白约每四周一次时，所述IL-10融合蛋白能够治疗所述受试者的癌症。
37.根据权利要求36所述的IL-10融合蛋白，其中当向有需要的受试者施用所述IL-10融合蛋白约每五周一次时，所述IL-10融合蛋白能够治疗所述受试者的癌症。
38.根据权利要求37所述的IL-10融合蛋白，其中当向有需要的受试者施用所述IL-10融合蛋白约每六周一次时，所述IL-10融合蛋白能够治疗所述受试者的癌症。
39.根据权利要求33至38中任一项所述的IL-10融合蛋白，其中将所述IL-10融合蛋白以范围为从约0.001mg/kg至约0.5mg/kg的剂量施用于所述受试者。
40.根据权利要求33至39中任一项所述的IL-10融合蛋白，其中将所述IL-10融合蛋白以范围为从约0.01mg/kg至约0.05mg/kg的剂量施用于所述受试者。
41.根据权利要求33至40中任一项所述的IL-10融合蛋白，其中将所述IL-10融合蛋白以范围为从约0.05mg/kg至约0.1mg/kg的剂量施用于所述受试者。
42.根据权利要求33至41中任一项所述的IL-10融合蛋白，其中将所述IL-10融合蛋白以范围为从约0.1mg/kg至约0.2mg/kg的剂量施用于所述受试者。
43.根据权利要求33至42中任一项所述的IL-10融合蛋白，其中将所述IL-10融合蛋白以范围为从约0.2mg/kg至约0.3mg/kg的剂量施用于所述受试者。
44.一种多核苷酸或一组多核苷酸，编码根据权利要求1至43中任一项所述的IL-10融合蛋白。
45.一种载体或一组载体，包含根据权利要求44所述的多核苷酸或多核苷酸组。
46.根据权利要求45所述的载体或载体组，是病毒载体。
47.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求1至43中任一项所述的IL-10融合蛋白、根据权利要求44所述的多核苷酸或多核苷酸组、或根据权利要求45或46所述的载体或载体组。
48.根据权利要求47所述的宿主细胞，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
49.根据权利要求47或48所述的宿主细胞，所述宿主细胞选自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HEK293细胞、BHK细胞、鼠骨髓瘤细胞(NS0和Sp2/0)、猴肾(COS)细胞、VERO细胞、纤维肉瘤HT-1080细胞、和HeLa细胞。
50.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至43中任一项所述的IL-10融合蛋白、根据权利要求44所述的多核苷酸或多核苷酸组、或根据权利要求45或46所述的载体或载体组，和药学上可接受的赋形剂。
51.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至43中任一项所述的IL-10融合蛋白、根据权利要求44所述的多核苷酸或多核苷酸组、根据权利要求45或46所述的载体或载体组、或根据权利要求50所述的药物组合物。
52.一种杀死有需要的受试者中的癌细胞的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至43中任一项所述的IL-10融合蛋白、根据权利要求44所述的多核苷酸或多核苷酸组、根据权利要求45或46所述的载体或载体组、或根据权利要求50所述的药物组合物。
53.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括以至少约7天的给药间隔向所述受试者施用有效量的IL-10融合蛋白，其中所述IL-10融合蛋白包含IL-10多肽和第二多肽，所述第二多肽包含白蛋白多肽或Fc多肽。
54.一种杀死有需要的受试者中的癌细胞的方法，所述方法包括以至少约7天的给药间隔向所述受试者施用有效量的IL-10融合蛋白，其中所述IL-10融合蛋白包含IL-10多肽和第二多肽，所述第二多肽包含白蛋白多肽或Fc多肽。
55.根据权利要求53或54所述的方法，其中所述第二多肽是白蛋白多肽。
56.根据权利要求53或54所述的方法，其中所述第二多肽是Fc多肽。
57.根据权利要求53至56中任一项所述的方法，其中所述IL-10融合蛋白进一步包含接头。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述接头包含根据权利要求8至14中任一项所述的接头。
59.根据权利要求51至58中任一项所述的方法，其中将所述IL-10融合蛋白以至少约7天、至少约10天、至少约14天、至少约17天、至少约21天、至少约24天、或至少约28天的给药间隔施用。
60.根据权利要求51至59中任一项所述的方法，其中以不超过一周一次施用所述IL-10融合蛋白。
61.根据权利要求51至60中任一项所述的方法，其中以不超过每2周一次施用所述IL-10融合蛋白。
62.根据权利要求51至61中任一项所述的方法，其中以不超过每3周一次施用所述IL-10融合蛋白。
63.根据权利要求51至62中任一项所述的方法，其中以不超过每4周一次施用所述IL-10融合蛋白。
64.根据权利要求51至63中任一项所述的方法，其中将所述IL-10融合蛋白以至少约7天至至少约28天的给药间隔施用。
65.根据权利要求64所述的方法，其中将所述IL-10融合蛋白以至少约14天的给药间隔施用。
66.根据权利要求64所述的方法，其中将所述IL-10融合蛋白以至少约21天的给药间隔施用。
67.根据权利要求51至58中任一项所述的方法，其中将所述IL-10融合蛋白约每周施用一次。
68.根据权利要求51至58中任一项所述的方法，其中将所述IL-10融合蛋白约每2周施用一次。
69.根据权利要求51至58中任一项所述的方法，其中将所述IL-10融合蛋白约每3周施用一次。
70.根据权利要求51至58中任一项所述的方法，其中将所述IL-10融合蛋白约每4周施用一次。
71.根据权利要求51至58中任一项所述的方法，其中将所述IL-10融合蛋白每约6周施用一次。
72.根据权利要求51至71中任一项所述的方法，其中将所述IL-10融合蛋白以范围为从约0.001mg/kg至约0.5mg/kg的剂量施用。
73.根据权利要求51至71中任一项所述的方法，其中将所述IL-10融合蛋白以范围为从0.01mg/kg至0.2mg/kg的剂量施用。
74.根据权利要求51至58中任一项所述的方法，其中所述IL-10融合蛋白包含与选自SEQ ID NO:14-32的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列，并且其中以不超过一周一次施用所述IL-10融合蛋白。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述IL-10融合蛋白包含选自SEQ ID NO:14-32的氨基酸序列。
76.根据权利要求74或75所述的方法，其中所述IL-10融合蛋白包含SEQ ID NO:14。
77.根据权利要求74至76中任一项所述的方法，其中将所述IL-10融合蛋白约每2周施用一次。
78.根据权利要求74至76中任一项所述的方法，其中将所述IL-10融合蛋白约每3周施用一次。
79.根据权利要求74至76中任一项所述的方法，其中将所述IL-10融合蛋白约每4周施用一次。
80.根据权利要求74至76中任一项所述的方法，其中将所述IL-10融合蛋白约每6周施用一次。
81.根据权利要求51、53和55至80中任一项所述的方法，其中所述癌症包括肿瘤。
82.根据权利要求51至81中任一项所述的方法，其中所述癌症选自小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、鳞状NSCLC、非鳞状NSCLC、神经胶质瘤、胃肠道癌、肾癌、透明细胞癌、卵巢癌、肝癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肾细胞癌(RCC)、前列腺癌、激素难治性前列腺腺癌、甲状腺癌、神经母细胞瘤、胰腺癌、胶质母细胞瘤(多形性胶质母细胞瘤)、宫颈癌、胃癌、膀胱癌、肝癌(肝细胞癌)、乳腺癌、结肠癌、头颈癌(或癌)、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、胃癌、生殖细胞肿瘤、小儿肉瘤、鼻窦自然杀伤细胞、黑素瘤、转移性恶性黑素瘤、皮肤或眼内恶性黑素瘤、间皮瘤、骨癌、皮肤癌、子宫癌、肛区癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童期实体瘤、输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑癌、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、包括石棉诱发的癌症在内的环境诱发的癌症、病毒相关的癌症或病毒来源的癌症、人乳头瘤病毒(HPV)相关或来源的肿瘤和所述癌症的组合。
83.根据权利要求51至81中任一项所述的方法，其中所述癌症选自急性白血病(ALL)、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和慢性髓细胞性白血病(CML)、未分化AML、成髓细胞性白血病、成髓细胞性白血病、早幼粒细胞白血病、髓细胞单核细胞白血病、单核细胞白血病、红白血病、巨核细胞白血病、孤立性粒细胞肉瘤、绿色瘤、霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、单核细胞样B细胞淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤/白血病、套细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤、肠道T细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、前驱T淋巴母细胞性淋巴瘤、T淋巴母细胞性；外周T细胞淋巴瘤、淋巴母细胞性淋巴瘤、移植后淋巴增殖性障碍、真性组织细胞性淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴母细胞性淋巴瘤(LBL)、淋系造血系统肿瘤、急性淋巴母细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性组织细胞性淋巴瘤(DHL)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前驱B淋巴母细胞性淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(CTLC)、淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL)伴有华氏巨球蛋白血症；骨髓瘤、IgG骨髓瘤、轻链骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、冒烟型骨髓瘤(惰性骨髓瘤)、孤立性浆细胞瘤、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞淋巴瘤；和所述癌症的任何组合。
84.根据权利要求51至81中任一项所述的方法，其中所述癌症选自RCC、NSCLC、胃癌、SCCHN、和所述癌症的任何组合。
85.根据权利要求51至81中任一项所述的方法，其中所述癌症选自黑素瘤、膀胱癌、胰腺癌、HCC、结肠癌、SCLC、间皮瘤、肝细胞癌、前列腺癌、多发性骨髓瘤、和所述癌症的组合。
86.根据权利要求51至85中任一项所述的方法，所述方法进一步包括向所述受试者施用第二抗癌疗法。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述第二抗癌疗法包括选自以下的疗法：免疫疗法、化学疗法、CAR-T疗法、基因疗法、放射疗法、手术、激活先天性免疫细胞的药剂、增强NK和/或CD8+T细胞存活的药剂及其任何组合。
88.根据权利要求86或87所述的方法，其中所述第二抗癌疗法包括有效量的特异性结合选自以下的蛋白质的抗体或其抗原结合片段：诱导型T细胞共刺激物(ICOS)、MICA、MICB、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、NKG2A、CD27、CD38、CD73、CD96、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)、SLAMF7、BCMA、CCR8、和疱疹病毒侵入介导物(HVEM)、程序性死亡蛋白-1(PD-1)、程序性死亡蛋白配体-1(PD-L1)、CTLA-4、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域-3(TIM-3)、淋巴细胞激活基因-3(LAG-3)、腺苷A2a受体(A2aR)、杀伤细胞凝集素样受体G1(KLRG-1)、自然杀伤细胞受体2B4(CD244)、CD160、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、以及T细胞激活的V结构域Ig抑制剂的受体(VISTA)、KIR、TGFβ、IL-10、IL-8、B7-H4、Fas配体、CXCR4、间皮素、CEACAM-1、CD52、HER2、及其任何组合。
89.根据权利要求86至88中任一项所述的方法，其中所述第二抗癌疗法包括特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段(“抗PD-1抗体”)。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述抗PD-1抗体包括纳武单抗或派姆单抗。
91.根据权利要求86至90中任一项所述的方法，其中所述第二抗癌疗法包括特异性结合PD-L1的抗体或其抗原结合片段(“抗PD-L1抗体”)。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述抗PD-L1抗体选自阿特利珠单抗、度伐鲁单抗和阿维鲁单抗。
93.根据权利要求86至92中任一项所述的方法，其中所述第二抗癌疗法包括特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合片段(“抗CTLA-4抗体”)。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述抗CTLA-4抗体包括曲美木单抗或伊匹单抗。
95.根据权利要求86至94中任一项所述的方法，其中所述第二抗癌疗法包括选自以下的化学疗法：蛋白酶体抑制剂、IMiD、Bet抑制剂、IDO拮抗剂、基于铂的化学疗法、STING激动剂、NLRP3激动剂、TLR7激动剂及其任何组合。
96.根据权利要求86至95中任一项所述的方法，其中所述第二疗法包括选自以下的药剂：多柔比星
Figure FDA0003868754350000061
顺铂、卡铂、硫酸博来霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥
Figure FDA0003868754350000062
环磷酰胺
Figure FDA0003868754350000063
来那度胺
Figure FDA0003868754350000064
硼替佐米
Figure FDA0003868754350000065
地塞米松、米托蒽醌、依托泊苷、阿糖胞苷、苯达莫司汀
Figure FDA0003868754350000066
利妥昔单抗
Figure FDA0003868754350000067
异环磷酰胺、亚叶酸(甲酰四氢叶酸)、氟尿嘧啶(5-FU)、奥沙利铂(乐沙定)、FOLFOX、紫杉醇、多西紫杉醇、长春新碱
Figure FDA0003868754350000068
氟达拉滨
Figure FDA0003868754350000069
沙利度胺
Figure FDA00038687543500000610
阿仑单抗
Figure FDA00038687543500000611
奥法木单抗
Figure FDA00038687543500000612
依罗莫司
Figure FDA00038687543500000613
和卡非佐米(KYPROLISTM)。
97.根据权利要求86至96中任一项所述的方法，其中所述第二抗癌疗法包括选自以下的增强NK和/或CD8+T细胞存活的药剂：IL-2和聚乙二醇化IL-2。
98.根据权利要求86至97中任一项所述的方法，所述方法进一步包括向所述受试者施用第三抗癌疗法。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述第三抗癌疗法包括特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合片段(“抗CTLA-4抗体”)。
100.根据权利要求99所述的方法，其中所述第二抗癌疗法包括抗PD-1抗体，并且所述第三抗癌疗法包括抗CTLA-4抗体。
101.根据权利要求99或100所述的方法，其中所述抗CTLA-4抗体包括曲美木单抗或伊匹单抗。
102.根据权利要求100或101所述的方法，其中所述抗PD-1抗体是纳武单抗或派姆单抗。
103.一种制备IL-10融合蛋白的方法，所述方法包括在合适的条件下在宿主细胞中表达根据权利要求44所述的多核苷酸或多核苷酸组或根据权利要求45或46所述的载体或载体组。
104.根据权利要求103所述的方法，所述方法进一步包括收集所述IL-10融合蛋白。
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