ES2847311T3

ES2847311T3 - Reactivos inmunológicos que se unen a PD-1

Info

Publication number: ES2847311T3
Application number: ES15750136T
Authority: ES
Inventors: Giuseppe Pantaleo; Craig Fenwick
Original assignee: Mabquest SA
Current assignee: Mabquest SA
Priority date: 2014-08-05
Filing date: 2015-08-05
Publication date: 2021-08-02
Anticipated expiration: 2035-08-05
Also published as: KR102357893B1; AU2015298356B2; CN107074947A; US20170226210A1; KR20170069996A; US9982053B2; EP3177644A2; WO2016020856A2; US11130807B2; SG11201700672YA; PT3177644T; CA2957258C; CN107074947B; WO2016020856A3; DK3177644T3; US20220169733A1; US20190106493A1; JP6629321B2; AU2015298356A1; JP2017531028A

Abstract

Un anticuerpo que se une a PD-1 humano y comprende una combinación de una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL) seleccionada entre el grupo que consiste en: (a) un VH que comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR) 1, 2 y 3 como se establece en las SEQ ID NO: 17, 40 y 63, respectivamente; y una VL que comprende las CDR 1, 2 y 3 como se establece en las SEQ ID NO: 86, 109 y 132, respectivamente; o, (b) un VH que comprende las CDR 1, 2 y 3 como se establece en las SEQ ID NO: 2, 25 y 48, respectivamente; y una VL que comprende las CDR 1, 2 y 3 como se establece en las SEQ ID NO: 71, 94 y 117, respectivamente.

Description

DESCRIPCIÓN

Reactivos inmunológicos que se unen a PD-1

Campo de la divulgación

La presente divulgación se refiere a agentes de unión con especificidad para la muerte celular programada 1 (PD-1) (por ejemplo, PD-1 humana) y al uso de agentes de unión para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un ser humano causada por infección (por ejemplo, por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)), cáncer y/o autoinmunidad.

Antecedentes de la divulgación

Al entrar en la cuarta década de la epidemia del VIH, se han logrado avances significativos en la comprensión de la patogenia del VIH y en el desarrollo de fármacos antivíricos potentes y seguros. Se han registrado más de 30 fármacos antivíricos y el impacto de la terapia antirretroviral combinada (TAR) sobre la morbilidad y la mortalidad ha sido notable. Sin embargo, a pesar de la supresión a largo plazo de la replicación del VIH lograda en pacientes con una adherencia óptima la TAR, el VIH rebota invariablemente después de la interrupción del tratamiento. Asimismo, la terapia exitosa no induce ni permite la restauración/desarrollo de respuestas inmunitarias específicas del virus capaces de controlar la replicación del VIH en ausencia de TAR. Por lo tanto, se necesita una TAR de por vida para controlar la replicación del VIH y la enfermedad asociada en la gran mayoría de los sujetos infectados por el VIH.

Se ha identificado en la sangre una población de linfocitos T CD4 de memoria central de larga vida infectados de forma latente con el VIH como un componente importante del reservorio de células del VIH y como la causa principal de la persistencia del VIH. Se estima que la vida útil de este reservorio de células latentes es de aproximadamente 70 años en presencia de supresión total del VIH con TAR. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que dos poblaciones de linfocitos T CD4 residentes en los ganglios linfáticos sirven como el compartimento primario de linfocitos T CD4 para la infección, replicación y producción del VIH. Estas dos poblaciones de linfocitos T CD4 se definen por la expresión de PD-1 y CXCR5 e incluyen PD-1+CXCR5+, es decir, linfocitos T colaboradores foliculares (Tfh) y poblaciones de linfocitos T PD-1+CXCR5-CD4.

Se han propuesto varios mecanismos responsables del establecimiento y mantenimiento del o los reservorios de células latentes del VIH. Uno de los mecanismos es la persistencia de una replicación mínima del virus con TAR que puede reponer el reservorio de células del VIH. Por lo tanto, la TAR no puede inducir la supresión total de la replicación del VIH y la respuesta inmunitaria específica del VIH-1 "natural" con TAR tampoco puede suprimir por completo y eliminar la replicación residual del virus en curso. Los fracasos del TAR y de la respuesta inmunitaria específica al VIH proporcionan el fundamento para investigar intervenciones alternativas para atacar también el reservorio persistente de células del VIH.

En el pasado se han investigado varias intervenciones inmunológicas y actualmente se están desarrollando con el objetivo de lograr la cura funcional del VIH, en el que la replicación del virus se suprime sin terapia antiviral sostenida (9). Las estrategias de vacunas terapéuticas han sido la estrategia de intervención primaria investigada, pero los resultados han demostrado una eficacia modesta en modelos animales experimentales y pacientes, con la excepción de una vacuna contra el VIH basada en el vector CMV (50 % de eficacia en el modelo de NHP; 10). Estudios recientes han generado resultados interesantes sobre la posibilidad de utilizar anticuerpos neutralizantes amplios anti-envoltura (Acnaev) como agentes terapéuticos en la infección por VIH (11,12). Asimismo, se ha demostrado que los Ac antagonistas de PD-1 restauran las funciones de los linfocitos T en pacientes infectados por el VIH y se ha propuesto la posibilidad de utilizar estos Ac como una estrategia terapéutica para aumentar la potencia de las respuestas de los linfocitos T específicos del VIH (13,14).

Está bien establecido que los linfocitos T CD8 específicas de tumor infiltrantes son disfuncionales con respecto a su capacidad para proliferar y mediar la actividad citotóxica. La gran mayoría de los linfocitos T CD8 específicos de tumor que se infiltran se encuentran en el denominado estado funcional de agotamiento. El mecanismo principal responsable del agotamiento de los linfocitos T CD8 específicos de tumor que se infiltran es el aumento de la expresión de varios receptores reguladores y, en particular, del receptor regulador de PD-1. La observación de que el bloqueo de PD-1/PDL-1/2 (ligandos de PD-1) está asociado con la recuperación de linfocitos T CD8 del agotamiento ha proporcionado la justificación para desarrollar estrategias de intervención dirigidas a la molécula PD-1 expresada por los linfocitos T c D8 agotados. Estudios recientes han mostrado resultados muy prometedores con el uso de anticuerpos PD-1 con actividad antagonista en pacientes con enfermedad avanzada asociada al cáncer. Los estudios han demostrado tasas sustanciales de respuesta, que van del 18 al 40 %, en pacientes con melanoma avanzado, carcinoma de pulmón no microcítico y carcinoma renal. Los anticuerpos anti-PD-1 en estos estudios se han utilizado solos o en combinación con un anticuerpo anti-CTL-A4. Después de estos estudios iniciales, los estudios actuales se están realizando en pacientes con diversos tumores, incluidos también tumores hematológicos.

Existe la necesidad en la técnica de reactivos adicionales dirigidos a PD-1 y procedimientos para usar los mismos. Esta divulgación aborda esas necesidades proporcionando reactivos y procedimientos que pueden usarse para apuntar a PD-1 y células y/o tejidos que expresan el mismo.

Los siguientes documentos describen todos anticuerpos anti-PD-1 que bloquean la interacción entre PD-1 y sus ligandos: WO 2004/056875, WO 2006/121168, WO 2012/145493, WO2013/019906, WO 2013/169693, WO 2014/055648, US 8.735.553, R. Moreira Da Silva "Nivolumab: Anti-PD-1 Monoclonal Antibody Cancer Immunotherapy", DRUGS OF THE FUTURE, vol. 39, no. 1, 1 de enero de 2014 (01-01-2014), páginas 15-24, E Seung y col.: "PD-1 Blockade in Chronically HIV-1-Infected humanized Mice Suppresses Viral Loads", PLoS ONE, vol. 8, No.

10, 21 de octubre de 2013 (21-10-2013), página e77780, y B Siewe y col.: "Regulatory B Cells Inhibit Cytotoxic T Lymphocyte (CTL) Activity and Elimination of Infected CD4 T Cells after In Vitro reactivation of HIV Latent Reservoirs", PLoS ONE, vol. 9, No. 4, 16 de abril de 2014 (16-04-2014), página e92934.

El documento WO 2011/110621 describe anticuerpos anti-PD-1 agonistas definidos por sus CDR que incluyen un anticuerpo anti-PD-1 que no bloquea la interacción entre PD-1 y PD-L1 o PD-L2. El documento WO 2009/114335 describe anticuerpos anti-PD-1, una subpoblación del cual bloquea la interacción entre PD-1 y PD-L1 y otra subpoblación no bloquea dicha interacción.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. A. PD-1 de ratón. B. PD-1 humano.

Figura 2. Ensayo CFSE para evaluar el efecto funcional de los anticuerpos anti-PD1 sobre la proliferación de linfocitos T CD8 específicas del VIH.

Figura 3. Unión de respuesta a la concentración de anticuerpos anti-PD-1 al PD-1 de la superficie celular en linfocitos T CD4 activados.

Figura 4. Clases de anticuerpos.

Figura 5a-f. Proliferación relativa a los controles (NEG y Péptido 8).

Figura 6a-b. Restauración de la proliferación de linfocitos T CD8 específicos del péptido del VIH mediada por anticuerpos anti-PD-1 que se unen a diferentes epítopos en un ensayo de recuperación por agotamiento funcional.

Figura 7. Restauración mejorada de la proliferación de linfocitos T CD8 específicos del péptido del VIH mediada por la combinación de anticuerpos anti-PD-1 que se unen a diferentes epítopos de PD-1 en un ensayo de recuperación de agotamiento funcional.

Figura 8. Sinergia entre un primer agente de unión que bloquea la interacción de PD-1 y PD-L1 con un segundo agente de unión que no bloquea la interacción de PD-1 y PD-L1.

Sumario de la divulgación

La presente divulgación se refiere a agentes de unión con especificidad para la muerte celular programada 1 (PD-1) (por ejemplo, PD-1 humano) y al uso de los mismos para tratar, prevenir y/o mejorar la infección (por ejemplo, por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)), cáncer y/o una enfermedad autoinmune. También se proporcionan ensayos funcionales para identificar agentes de unión que interactúan con PD-1. También se proporcionan combinaciones de agentes de unión, tal como un primer agente de unión que bloquea la interacción de PD-1 y PD-L1 con un segundo agente de unión que no bloquea la interacción de PD-1 y PD-L1, que actúan sinérgicamente para rescatar a los linfocitos T del agotamiento.

Descripción detallada

Esta divulgación se refiere a agentes de unión que se unen a la proteína de muerte celular programada (PD-1) (por ejemplo, SEQ ID NO:1, figura 1A, figura 1B de la patente de Estados Unidos n.° 5,698,520 (Honjo, y col.)) (por ejemplo, PD-1 humano) en la superficie de las células in vitro y/o in vivo. Los agentes de unión también pueden unirse al polipéptido PD-1 aislado (por ejemplo, PD-1 humano) y/o fragmentos y/o derivados del mismo, típicamente in vitro. También se proporcionan anticuerpos y composiciones para su uso en el tratamiento de una o más enfermedades asociadas con la existencia de células que expresan PD-1. Por ejemplo, los agentes de unión pueden ser anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales) que pueden reaccionar con los epítopos de PD-1 y se unen a los mismos. Los "agentes de unión" descritos en el presente documento pueden incluir, por ejemplo, un agonista o un antagonista de PD-1. Un agente agonista de unión es uno que no es típicamente capaz de restablecer la función de los linfocitos T y/o la expresión de PD-1. Un agente agonista de unión a PD-1 puede ser útil para tratar enfermedades autoinmunitarias y otras en las que las células que expresan PD-1 están involucradas en la progresión de la enfermedad. Por el contrario, un agente antagonista de unión es uno capaz de restaurar la función de los linfocitos T y/o la expresión de PD-1. Por ejemplo, un agente de unión a antagonista de PD-1 puede ser capaz de restaurar la función de los linfocitos T que expresan PD-1 del agotamiento funcional como se sabe que ocurre en la infección por VIH y en diversos tumores. La restauración de la función de los linfocitos T puede determinarse, por ejemplo, midiendo la proliferación, la producción de citocinas, la actividad citotóxica u otras características de tales células. Otro uso de los agentes de unión descritos en el presente documento es el direccionamiento selectivo y la eliminación de poblaciones de linfocitos T CD4 infectados con VIH que contienen VIH competente para la replicación (por ejemplo, en un estado latente y/o de replicación). Se sabe que dichas células que expresan PD-1 que expresan PD-1 sirven como un depósito celular principal para el VIH competente en la replicación. Un mecanismo potencial para la eliminación de estas poblaciones de linfocitos T CD4 es la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA) usando los agentes de unión descritos en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos PD-1 mono y/o biespecíficos). Uno o más agentes de unión antagonistas de PD-1 pueden tener, por ejemplo, especificidades diferentes (por ejemplo, que reconocen epítopos diferentes) y se pueden combinar para inducir el rescate de linfocitos T CD8 específicos de antígeno del agotamiento funcional causado por la expresión de PD-1 en dichas células (por ejemplo, restaurando o mejorando la proliferación, la producción de citocinas y/o la actividad citotóxica). Los agentes de unión descritos en el presente documento también pueden proporcionar la eliminación y/o supresión selectiva de células que expresan PD-1. Los agentes de unión agonistas de PD-1 descritos en el presente documento pueden usarse para suprimir y/o eliminar las células que expresan PD-1 para tratar, por ejemplo, enfermedades infecciosas (por ejemplo, VIH), cáncer y/o, especialmente, enfermedades autoinmunitarias. Otras realizaciones, usos y similares se describen a continuación.

Los agentes de unión son anticuerpos tales como anticuerpos monoclonales que comprenden las secuencias de aminoácidos mostradas en la reivindicación 1. Esta divulgación también prevé el uso de dichos anticuerpos monoclonales para aislar, identificar y/o dirigir a las células que expresan PD-1. En determinadas realizaciones, estos anticuerpos monoclonales pueden ser reactivos contra el PD-1 expresado sobre la superficie de las células. El término "anticuerpo"' o "anticuerpos" puede hacer referencia a anticuerpos completos o fragmentados en forma no purificada o parcialmente purificada (por ejemplo, sobrenadante de hibridoma, ascitis, antisueros policlonales) o en forma purificada. Los anticuerpos pueden ser de cualquier origen adecuado o incluyen, por ejemplo, anticuerpos murinos (por ejemplo, producidos por células de hibridoma murino) o expresados como anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanos y similares. Por ejemplo, los anticuerpos pueden derivarse total o parcialmente de anticuerpos humanos (por ejemplo, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA (IgA1 e IgA2), IgD e IgE), caninos (por ejemplo, IgGA, IgGB, IgGC, IgGD), de pollo (por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, IgY), de cabra (por ejemplo, IgG), de ratón (por ejemplo, IgG, IgG2a, IGg2b, IgD, IgE, IgG, IgM) y/o de cerdo (por ejemplo, IgG, IgD, IgE, IgG, IgM), de rata (por ejemplo, IgG, IgD, IgE, IgG, IgM), por ejemplo. Procedimientos de preparación, utilización y almacenamiento de varios tipos de anticuerpos son bien conocidos por los expertos en la técnica y serían adecuados para la práctica de la presente invención (véase, por ejemplo, (Harlow, y col. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; (Harlow, y col. Using Antibodies: A Laboratory Manual, Portable Protocol No. 1, 1998; Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975)); Jones y col. Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann y col. Nature, 332:323-329 (1988); Presta (Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992); Verhoeyen y col. (Science, 239:1534-1536 (1988); Hoogenboom y col., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks y col., J. Mol. Biol., 222:581 (1991); Cole y col., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77 (1985); Boerner y col., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991); Marks y col., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg y col., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-13 (1994); Fishwild y col., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995); así como la patente de Estados Unidos N.° 4.816.567; 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; y, 5.661.016). En ciertas aplicaciones, los anticuerpos pueden estar contenidos en sobrenadante de hibridoma o ascitis y utilizarse directamente como tales o después de la concentración usando técnicas estándar. En otras aplicaciones, los anticuerpos se pueden purificar aún más usando, por ejemplo, fraccionamiento en sal y cromatografía de intercambio iónico o cromatografía de afinidad utilizando ligandos de proteína A, proteína G, proteína A/G y/o proteína L acoplados covalentemente a un soporte sólido como perlas de agarosa, o combinaciones de estas técnicas. Los anticuerpos pueden almacenarse en cualquier formato adecuado., incluso como preparación congelada (por ejemplo, -20 °C o -70 °C), en forma liofilizada o en condiciones normales de refrigeración (por ejemplo, 4 °C). Cuando se almacena en forma líquida, por ejemplo, se prefiere que se utilice un tampón adecuado, tal como solución salina tamponada con Tris (TBS) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En algunas realizaciones, el agente de unión se puede preparar como una preparación inyectable, tal como en suspensión en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable no tóxico. Los vehículos y disolventes adecuados que pueden utilizarse incluyen agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro de sodio, TBS y/o PBS, entre otros. Tales preparaciones pueden ser adecuadas para su uso in vitro o in vivo pueden prepararse como se conoce en la técnica y la preparación exacta puede depender de la aplicación particular.

También se describen agentes de unión que son cualquier compuesto que presente propiedades de unión similares a otro (por ejemplo, un mimético). Por ejemplo, un agente de unión de ejemplo puede ser uno que se une a PD-1 y/o puede competir con un agente de unión que tiene especificidad para el mismo (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal). En algunas realizaciones, el mimético puede exhibir sustancialmente la misma afinidad en los ensayos de unión que el agente de unión (por ejemplo, anticuerpo monoclonal) con el que se está comparando. La afinidad de un agente de unión particular puede medirse mediante cualquier ensayo adecuado que incluye, pero sin limitaciones, la tinción FACS del PD-1 de la superficie celular endógena en linfocitos T CD4 activados como se describe en los Ejemplos. Se puede decir que un agente de unión tiene "sustancialmente la misma afinidad" que otro cuando las medidas (por ejemplo, nm) están dentro de aproximadamente entre 1-20, 1-5, 5-10, 10-15 o 15-20 por ciento el uno del otro. Los miméticos de ejemplo pueden incluir, por ejemplo, compuestos orgánicos que se unen específicamente a PD-1, o un aficuerpo (Nygren, y col., FEBS J. 275 (11): 2668-76 (2008)), afilina (Ebersbach, y col. J. Mol. Biol. 372 (1): 172-85 (2007)), afitina (Krehenbrink, y col. J. Mol. Biol. 383 (5): 1058-68 (2008)), anticalina (Skerra, A. FEBS J. 275 (11): 2677 83 (2008)), avimer (Silverman, y col. Nat. Biotechnol. 23 (12): 1556-61 (2005)), DARPin (Stumpp, y col. Drug Discov. Today 13 (15-16): 695-701 (2008)), Fynomer (Grabulovski, y col. J. Biol. Chem. 282 (5): 3196-3204 (2007)), péptido del dominio Kunitz (Nixon, y col. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 9 (2): 261-8 (2006)) y/o un monocuerpo (Koide, y col. Methods Mol. Biol. 352: 95-109 (2007)). Otros miméticos pueden incluir, por ejemplo, un derivado de un anticuerpo (de, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal 1E4, 1G10 y/o 1G1) tal como, por ejemplo, un Fab, Fab2, anticuerpo Fab' monocatenario, Fv, anticuerpo de un solo dominio, anticuerpo monoespecífico, anticuerpo biespecífico, anticuerpo triespecífico, anticuerpo multivalente, anticuerpo quimérico, anticuerpo quimérico canino-humano, anticuerpo quimérico canino-ratón, anticuerpo que comprende un Fc canino, anticuerpo humanizado, anticuerpo humano, caninizado, anticuerpo con injerto de CDR, anticuerpo de tiburón, anticuerpo de camélido, microcuerpo y/o intracuerpo, o derivado del mismo. En el presente documento también se describen otros agentes de unión como entendería un experto en la técnica.

Puede usarse cualquier procedimiento conocido por los expertos en la técnica para generar agentes de unión que tengan especificidad para (por ejemplo, unirse a) PD-1. Por ejemplo, para generar y aislar anticuerpos monoclonales, se puede administrar un animal tal como un ratón (por ejemplo, inmunizar) con una o más proteínas PD-1 (por ejemplo, proteína de fusión Fc PD-1 y/o proteína marcadora His PD-1). Los animales que exhiben reactividad sérica a PD-1 expresada en linfocitos T humanos activados (según lo determinado por, por ejemplo, citometría de flujo y/o microscopia) pueden seleccionarse después para la generación de líneas celulares de hibridoma anti-PD-1. Esto se puede repetir para varias rondas. Por ejemplo, los criterios principales para la primera ronda de selección del agente de unión pueden incluir, aunque sin limitaciones: i) nivel de tinción de PD-1 en linfocitos T humanos activados por citometría de flujo; (ii) diversidad de secuencias CDR VH y VL en comparación con las de los anticuerpos anti-PD-1 existentes; y, (iii) mapeo de epítopos realizado mediante estudios de unión competitiva con perlas Luminex conjugadas con PD-1 acopladas previamente con PD-L1 o uno de varios anticuerpos anti-PD-1 disponibles comercialmente que se unen a diferentes epítopos en PD-1. Una primera o segunda ronda de selección de ejemplo también puede incluir, por ejemplo, unión por afinidad (no es un criterio principal ya que puede no correlacionarse con el potencial estimulante de los anticuerpos anti-PD-1); y/o caracterización funcional para identificar el agente de unión como agonista o antagonista.

Como se describe en el Ejemplo 1 del presente documento, por ejemplo, se puede utilizar el ensayo de recuperación funcional de agotamiento (EFRA). En este ensayo, los agentes de unión de prueba pueden ensayarse para determinar la capacidad de rescatar del agotamiento a las células inmunitarias, tales como linfocitos T. Esto puede determinarse midiendo la capacidad de un agente de unión para restaurar la proliferación de tales células en presencia de un antígeno, tal como un péptido de prueba derivado de un virus como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). La proliferación se mide en un ensayo CFSE en comparación con un control, tal como el péptido de prueba solo o un anticuerpo anti-PD-1 de control positivo tal como MK-3475 (pembrolizumab). En algunas realizaciones, se determina un agente de unión para restaurar la proliferación cuando la comparación muestra una diferencia significativa (tal como un valor de P de <0,001) en comparación con un control de péptido solo o un péptido con un anticuerpo IgG1 de ratón de control de isotipo. Este ensayo puede usarse para identificar agentes de unión (como anticuerpos) que compiten con otros agentes de unión para unirse a PD-1 (como PD-L1 o PD-L2) y/o conducir a la restauración funcional de las células inmunes. El Ejemplo 1 también describe dos procedimientos de mapeo de epítopos de los anticuerpos enumerados en la Tabla 2 usando ensayos basados en Luminex. En un ensayo bioquímico, una proteína de fusión PD-1 Fc se une a perlas y se realizan estudios de unión competitiva entre los anticuerpos anti-PD-1 descritos en la Tabla 2 y uno de los dos anticuerpos anti-PD-1 disponibles comercialmente diferentes. El Ejemplo 1 describe cuatro clases de anticuerpos monoclonales que se unen a distintos epítopos en PD-1 que fueron: clase 1 (competitiva con un primer anticuerpo monoclonal que bloquea la interacción de PD-1 con PD-L1), clase 2 (competitiva con un segundo anticuerpo monoclonal que se une a PD-1 pero no bloquea la interacción de PD-1 con PD- L1), clase 3 (competitiva con el primer y segundo anticuerpos monoclonales) y clase 4 (no competitiva con el primer o el segundo anticuerpo). En un ensayo separado, se evaluó la competencia por la unión a una proteína PD-1 recombinante para los anticuerpos anti-PD-1 enumerados en la Tabla 2 y una proteína recombinante PD-L1 biotinilada. Los anticuerpos que indujeron la proliferación en EFRA se identificaron a partir de las cuatro clases de unión que se han propuesto para la unión a diferentes epítopos en PD-1. Asimismo, la EFRA permitió la identificación de anticuerpos anti-PD-1 que eran competitivos, parcialmente competitivos o no competitivos con la interacción PD-1/PD-L1 y la función proliferativa restaurada específicamente a los linfocitos T CD8 específicos del VIH.

También se pueden identificar combinaciones de agentes de unión, tales como los descritos en el ejemplo 2. En algunas realizaciones, las combinaciones pueden identificarse para proporcionar diferencias estadísticamente significativas de los resultados obtenidos usando solo uno o más de los agentes de unión y no otros. En algunas realizaciones, se pueden identificar combinaciones que exhiben capacidad sinérgica para restaurar la función de las células inmunitarias. En algunas realizaciones, la combinación puede comprender un primer agente de unión que bloquea la interacción de PD-1 y PD-L1 con un segundo agente de unión que no bloquea la interacción de PD-1 y PD-L1. Los agentes de unión primero y segundo pueden ser entidades diferentes tales como dos o más anticuerpos monoclonales diferentes o derivados de los mismos, o pueden encontrarse en la misma entidad tal como un anticuerpo bifuncional (un solo anticuerpo o derivado del mismo que comprende múltiples especificidades de unión). Por ejemplo, un anticuerpo bifuncional de ejemplo puede comprender una primera región de unión que bloquea la interacción de PD-1 y PD-L1 y una segunda región de unión que no bloquea la interacción de PD-1 y PD-L1. También se contemplan combinaciones que proporcionan múltiples tipos de cada agente de unión. Por ejemplo, la combinación puede comprender múltiples tipos de agentes de unión que bloquean la interacción de PD-1 y PD-L1 con uno o más que no bloquean la interacción de PD-1 y PD-L1. En algunas realizaciones, la combinación puede comprender uno o más agentes de unión que bloquean la interacción de PD-1 y PD-L1 con múltiples agentes de unión que no bloquean la interacción de PD-1 y PD-L1. En algunas realizaciones, la combinación puede comprender múltiples agentes de unión que bloquean la interacción de PD-1 y PD-L1 con múltiples agentes de unión que no bloquean la interacción de PD-1 y PD-L1. Dichas combinaciones como se describen en el presente documento también pueden combinarse con uno o más de otros agentes que pueden afectar a la función de las células inmunitarias tales como anticuerpos contra CTLA-4 y similares. Un experto en la materia reconocería que muchas de estas combinaciones pueden ser adecuadas para su uso como se describe en el presente documento.

El agente de unión es un anticuerpo y puede identificarse con referencia a la secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos correspondiente a las regiones determinantes de la variabilidad y/o complementariedad ("CDR") del mismo. Como se describe generalmente, las secuencias de la región variable/CDR se pueden usar en combinación con una o más de otras secuencias de aminoácidos de la región variable/CDR. Las secuencias de aminoácidos de la región variable/CDR se pueden unir alternativamente y/o también a uno o más tipos de polipéptidos de la región constante de una molécula de anticuerpo. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos de c Dr mostradas en las Tablas 1A y 1B pueden estar unidas o asociadas con las regiones constantes de cualquier molécula de anticuerpo de la misma especie o de una diferente (por ejemplo, ser humano, cabra, rata, oveja, pollo) y/o subtipo de anticuerpo del que se derivó la secuencia de aminoácidos de CDR. Por ejemplo, un agente de unión puede ser, o puede derivarse de, o puede estar relacionado con el anticuerpo monoclonal producido por los hibridomas enumerados en, y/o puede tener aproximadamente la misma afinidad y/o efecto de proliferación, y/o exhibir la misma clase de unión mostrada en la Tabla 2 y/o puede tener una cualquiera o más de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO. 1-138 y/o como se muestra en las Tablas 1A y 1B. El agente de unión puede comprender una cadena pesada y/o ligera de anticuerpo que comprenda cada una de una o más regiones constantes y/o variables. Las regiones variables comprenden normalmente una o más CDR que pueden determinar la especificidad de unión del anticuerpo. Estos anticuerpos monoclonales pueden también identificarse mediante el análisis de las secuencias de aminoácidos de (por ejemplo, que se pueden codificar por dichas secuencias de nucleótidos) las regiones variables. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos de las CDR de cadena pesada de los agentes de unión que se unen a PD-1 pueden incluir uno cualquiera o más que comprenden al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOS. 1-138, y/o cualquier otro mostrado en las Tablas 1A y/o 1B. Cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento y/o cualquier fragmento y/o derivado de las mismas también se puede combinar con cualquier otra región variable y/o CDR en cualquier orden y/o combinación para formar agentes de unión híbridos y/o de fusión y/o insertada en otras regiones variables de cadena pesada y/o ligera usando técnicas estándar. Las combinaciones de CDR (por ejemplo, combinación de secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y/o ligera) que se pueden encontrar en un agente de unión de PD-1 (por ejemplo, PD-1 humano) de esta divulgación pueden incluir, por ejemplo, las secuencias que se muestran en las Tablas 1A y/o 1B, que no forman parte del presente invención.

Tabla 1A

continuación

Tabla 1B

continuación

Además, cualquiera de las SEQ ID NO: 1-69 pueden combinarse con una cualquiera o más de las SEQ ID NO. 70 138 en un agente de unión. Las CDR de cadena pesada de cada clon se combinan con sus respectivas CDR de cadena ligera en un agente de unión. En los ejemplos descritos que no forman parte de la presente invención, el agente de unión puede comprender las CDR de cadena pesada y las CDR de cadena ligera que se muestran a continuación:

122F10 (SEQ ID NOS. 1, 24, 47, 70, 93 y 116);

139D6 (SEQ ID NOS. 2, 25, 48, 71, 94 y 117);

135D1 (SEQ ID NOS. 3, 26, 49, 72, 95 y 118);

134D2 (SEQ ID NOS. 4, 27, 50, 73, 96 y 119);

121G1 (SEQ ID NOS. 5, 28, 51, 74, 97 y 120);

136B5 (SEQ ID NOS. 6, 29, 52, 75, 98 y 121);

127C2 (SEQ ID NOS. 7, 30, 53, 76, 99 y 122);

137F2 (SEQ ID NOS. 8, 31, 54, 77, 100 y 123);

138H5 (SEQ ID NOS. 9, 32, 55, 78, 101 y 124);

140A1 (SEQ ID NOS. 10, 33, 56, 79, 102 y 125);

135H12 (SEQ ID NOS. 11, 34, 57, 80, 103 y 126);

131D11 (SEQ ID NOS. 12, 35, 58, 81, 104 y 127);

132F7 (SEQ ID NOS. 13, 36, 59, 82, 105 y 128);

126E4 (SEQ ID NOS. 14, 37, 60, 83, 106 y 129);

135G1 (SEQ ID NOS. 15, 38, 61, 84, 107 y 130);

136E10 (SEQ ID NOS. 16, 39, 62, 85, 108 y 131);

135C12 (SEQ ID NOS. 17, 40, 63, 86, 109 y 132);

136F4 (SEQ ID NOS. 18, 41, 64, 87, 110 y 133);

136B4 (SEQ ID NOS. 19, 42, 65, 88, 111 y 134);

135E10 (SEQ ID NOS. 20, 43, 66, 89, 112 y 135);

140G5 (SEQ ID NOS. 21, 44, 67, 90, 113 y 136);

122H2 (SEQ ID NOS. 22, 45, 68, 91, 114 y 137); o

139F11 (SEQ ID NOS. 23, 46, 69, 92, 115 y 138).

También pueden ser útiles otras combinaciones, según las pueda comprobar un experto en la técnica.

La presente invención proporciona un anticuerpo que se une a PD-1 humano y comprende una combinación de una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL) seleccionada del grupo que consiste en (a) una VH que comprende regiones determinantes de complementariedad ( CDR) 1, 2 y 3 como se establece en las SEQ ID NO: 17, 40 y 63, respectivamente; y una VL que comprende las CDR 1, 2 y 3 como se establece en las SEQ ID NO: 86, 109 y 132, respectivamente; o (b) un VH que comprende las CDR 1, 2 y 3 como se establece en las SEQ ID NO: 2, 25 y 48, respectivamente; y una VL que comprende las CDR 1,2 y 3 como se establece en las SEQ ID NO: 71, 94 y 117, respectivamente.

Los agentes de unión que comprenden las CDR de las Tablas 1A y/o 1B o las del párrafo inmediatamente anterior, también puede presentar las siguientes características:

Tabla 2

continuación

La afinidad de unión se puede determinar mediante cualquier técnica disponible para los expertos en la técnica. Los datos de afinidad de unión presentados en la Tabla 2 se evaluaron mediante tinción por citometría de flujo de PD-1 de superficie celular endógeno en linfocitos T CD4 que fueron estimulados durante un período de 3 a 6 días con fitohemaglutinina (PHA). La clase de unión también se puede determinar mediante cualquier técnica disponible para los expertos en la técnica. Los datos de la clase de unión presentados en la Tabla 2 se determinaron mediante estudios de unión competitiva del ensayo Luminex. En la Tabla 2 , los anticuerpos AcM de clase 1 de unión son aquellos que se determina que son competitivos con el anticuerpo comercial del clon EH12.2H7 (disponible en BioLegend, San Diego, CA (por ejemplo, n.° cat. 329905)); los anticuerpos de clase 2 son aquellos que se determina que son competitivos con el anticuerpo comercial del clon J116 (disponible en Affymetrix eBioscience, San Diego, CA (por ejemplo, n.° cat. 16-9989-80)); y los anticuerpos de clase 3 son aquellos que se determina que son competitivos con los anticuerpos EH12.2H7 y J l l6 ; y los anticuerpos clones de AcM de clase 4 son aquellos que se determina que se unen a PD-1 en presencia de ambos anticuerpos, EH12.2H7 y J116.

El efecto proliferativo puede determinarse mediante cualquier técnica disponible para los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar el sistema EFRA descrito anteriormente y utilizado en el Ejemplo 1. Dicho ensayo se utilizó para determinar los datos del efecto proliferativo presentados en la Tabla 2. En resumen, un ensayo de carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) en el que se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un sujeto con infección crónica por VIH y se estimularon con un péptido específico del VIH en presencia y ausencia de un anticuerpo anti-PD-1. También se probó un anticuerpo anti-PD1 de control (el anticuerpo de Merck MK-3475) como control positivo. Después de una incubación de seis días, se evaluó la proliferación de linfocitos T CD8 específicos de VIH en las muestras tratadas con anti-PD-1 en relación con el péptido control solo y el resultado se expresó como un porcentaje por encima del control ("Efecto de proliferación").

En algunas realizaciones, las técnicas utilizadas para identificar y caracterizar los agentes de unión a PD-1, tales como anticuerpos, pueden combinarse para proporcionar un sistema para identificar y caracterizar dichos agentes de unión. Por ejemplo, uno o más agentes de unión candidatos, tales como uno o más anticuerpos monoclonales, pueden ensayarse mediante EFRA o un ensayo similar para determinar la capacidad del agente de unión candidato para restaurar la función de las células inmunitarias según se mide mediante, por ejemplo, proliferación en presencia de un péptido inmunogénico. En algunas realizaciones, este tipo de ensayo se puede utilizar como una selección inicial para garantizar que los agentes de unión candidatos que se estudiarán más a fondo sean capaces de restaurar la función de las células inmunitarias. En algunas realizaciones, estos tipos de ensayos pueden ir seguidos de uno para determinar la afinidad de unión a células inmunitarias tales como células mononucleares de sangre periférica activadas (PBMC). En algunas realizaciones, este ensayo puede utilizar una técnica, tal como clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). En algunas realizaciones, el ensayo puede incluir la presencia o ausencia de unión no específica y/o estudios de unión competitiva usando reactivos de unión conocidos como el anticuerpo anti-PD1 (por ejemplo, el anticuerpo de Merck MK-3475, también conocido como pembrolizumab). A continuación, estos ensayos pueden ir seguidos de la secuenciación de las CDR de los agentes de unión candidatos, tal como se proporciona en las Tablas 1A y/o 1B anteriores. En conjunto, a continuación, el EFRA, los estudios de determinación de afinidad, mapeo de epítopos y los procedimientos de identificación de CDR descritos en el presente documento proporcionan un sistema con el que se puede identificar un agente de unión candidato.

Se describe que cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las Tablas 1A y/o 1B (y/o uno o más fragmentos y/o derivados de las mismas) también puede estar sustituida por cualquier otro aminoácido que desee un experto en la materia. Por ejemplo, un experto en la técnica puede realizar sustituciones conservadoras reemplazando aminoácidos particulares por otros como se muestra en la Tabla 3 a continuación. La sustitución de aminoácidos específica seleccionada puede depender de la ubicación del sitio seleccionado. Tales sustituciones de aminoácidos conservadoras pueden implicar una sustitución de un resto de aminoácido nativo por un resto no nativo de modo que haya poco o ningún efecto sobre el tamaño, la polaridad, la carga, la hidrofobicidad o la hidrofilicidad del resto de aminoácido en esa posición y, en particular, no da como resultado una disminución de la unión de PD-1.

Tabla 3

Esta divulgación proporciona agentes de unión con múltiples especificidades de manera que el PD-1 y al menos otro antígeno secundario (por ejemplo, una proteína de la superficie celular) pueden unirse mediante un único agente de unión. El antígeno secundario puede ser uno expresado por células infectadas por un agente infeccioso. Por ejemplo, un antígeno secundario de ejemplo puede ser el antígeno Env del VIH. Dichos agentes de unión pueden unirse al antígeno secundario y/o pueden servir para neutralizar el agente infeccioso. En ciertos ejemplos, tal como para un agente de unión biespecífico que tiene especificidad dual para PD-1 y un antígeno del VIH tal como env y/u otro antígeno. El inmunógeno del v Ih puede derivarse de cualquiera de los subtipos descritos en el presente documento o de cualquier otro. En algunas realizaciones, tales agentes de unión pueden incluir: unión del agonista de PD-1/Env; unión del agonista de PD-1 PD-1/Env y neutralización; unión del antagonista de PD-1/Env; y/o unión y neutralización del antagonista de PD-1/PD-1/Env. Dada la prevalencia de los distintos subtipos, puede ser preferible seleccionar antígenos de los subtipos B y/o C del VIH-1. También puede ser deseable incluir agentes de unión que tengan especificidad por antígenos de múltiples subtipos del VIH (por ejemplo, subtipos B y C del VIH-1, subtipos A y B de VIH-2 o una combinación de los subtipos de VIH-1 y VIH-2) en una única composición. Para tratar una enfermedad, tal como cáncer, puede ser beneficioso obtener agentes de unión con múltiples especificidades de PD-1 (por ejemplo, anticuerpos PD-1 antagonistas de PD-1a/PD1b biespecíficos específicos para dos epítopos diferentes) y/o especificidad tanto para PD-1 como para uno o más tumores antígenos (por ejemplo, antígeno de cáncer de testículo (CT) (es decir, MAGe , NY-ESO-1); antígeno de diferenciación de melanocitos (es decir, Melan A/MART-1, tirosinasa, gp100); antígeno mutacional (es decir, MUM-1, p53, CDK-4); antígeno "propio" sobreexpresado (es decir, HER-2/neu, p53); y/o antígenos víricos (es decir, VPH, VEB)). Los agentes de unión (por ejemplo, anticuerpos monoclonales) se pueden generar como se ha descrito en general anteriormente. Las especificidades de tales agentes de unión pueden recombinarse en un solo agente de unión usando técnicas que están ampliamente disponibles para los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, también se pueden combinar y usar (por ejemplo, administrar) múltiples agentes de unión de especificidad única para proporcionar un reactivo de especificidad múltiple eficaz.

Los agentes de unión descritos en el presente documento pueden conjugarse con agentes activos para apuntar e inhibir la función de y/o eliminar poblaciones de células que expresan PD-1 (y/u otro antígeno en el caso de agentes de unión con múltiples especificidades). Por ejemplo, las poblaciones de linfocitos T CD4+ que contienen VIH competente para la replicación pueden dirigirse y eliminarse utilizando conjugados de agente de unión/fármaco (por ejemplo, conjugados de anticuerpo-fármaco (CAF)). Los agentes de unión candidatos mono y/o biespecíficos pueden conjugarse con uno o más tipos de fármacos (por ejemplo, fármacos que dañan el ADN y se dirigen a los microtúbulos). Los agentes de unión descritos en el presente documento y/o derivados de los mismos también se pueden unir y/o conjugar con agentes funcionales para su uso in vitro y/o in vivo. Por ejemplo, el agente de unión puede estar unido y/o conjugado a restos funcionales tales como fármacos citotóxicos o toxinas, y/o fragmentos activos de los mismos tales como la cadena A de difteria, cadena de exotoxina A, cadena A de ricina, cadena A de la abrina, curcina, crotina, fenomicina, enomicina, entre otros. Los restos funcionales adecuados también pueden incluir radioquímicos. Los agentes de unión, tales como los anticuerpos, se pueden unir y/o conjugar a uno o más agentes funcionales usando técnicas estándar en la técnica.

Los agentes de unión pueden administrarse junto con otros agentes, tales como agentes antiinfecciosos (por ejemplo, antibióticos, medicamentos antivirales). Por ejemplo, los agentes de unión descritos en el presente documento se pueden combinar con anticuerpos monoclonales y/u otros reactivos, como Nivolumab (también conocido como MDX-1106, BMS-936558 (Topalian, y col. N. Eng. J. Med. 2012; 366(26): 2443-2454), MDX-1106, ONO-4538, un AcM IgG4 completamente humano disponible en Bristol-Myers Squibb), lambrolizumab (también conocido como MK-3475 y SCH 900475, un anticuerpo monoclonal IgG4 humanizado disponible de Merck), pidilizumab (un anticuerpo monoclonal IgG1 humanizado disponible en CureTech), AMP-224 (una proteína de fusión B7-DC/IgG1 disponible de GlaxoSmithKline/Amplimmune) y/o un anticuerpo u otro reactivo o procedimiento descrito en cualquiera de las patentes de Estados Unidos N.° 8.354.509B2 (Carven, y col.), patente de Estados Unidos N.° 8.008.449B2 (Korman, y col.), documentos WO 2012/135408A1 (Manoj, y col.), US 2010/026617 (Carven, y col.), WO 2011/110621A1 (Tyson, y col.), patente de Estados Unidos n.° 7.488.802B2 (Collins, y col.), WO 2010/029435A1 (Simon, y col.), w O 2010/089411A2 (Olive, D.), WO 2012/145493A1 (Langermann, y col.), WO 2013/0435569A1 (Rolland, y col.), WO 2011/159877A2 (Kuchroo, y col.), patente de Estados Unidos N.° 7.563.869B2 (Ono Pharm.), patente de Estados Unidos N.° 7.858.746B2 (Honjo, y col.), patente de Estados Unidos N.° 8.728.474B2 (Ono Pharm.), patente de Estados Unidos N.° 9.067.999 (Ono Pharm.) y/o la patente de Estados Unidos N.° 9.067.999.

Como se ha mencionado anteriormente, los agentes de unión a PD-1 descritos en el presente documento (por ejemplo, un antagonista de PD-1) se pueden usar para tratar y/o prevenir y/o mejorar los síntomas de la infección por VIH. Como es bien sabido en la técnica, los aislados de VIH ahora se clasifican en subtipos genéticos discretos. Se sabe que el VIH-1 comprende al menos diez subtipos (A1, A2, A3, A4, B, C, D, E, F1, F2, G, H, J y K) (Taylor y col., NEJM, 359(18):1965-1966 (2008)). Se sabe que el V iH-2 incluye al menos cinco subtipos (A, B, C, D y E). El subtipo B se ha asociado con la epidemia del VIH en hombres homosexuales y usuarios de drogas intravenosas en todo el mundo. La mayoría de los inmunógenos del VIH-1, aislamientos adaptados al laboratorio, reactivos y epítopos mapeados pertenecen al subtipo B. En el África subsahariana, India y China, áreas en las que la incidencia de nuevas infecciones por el VIH es alta, el subtipo B del VIH-1 representa solo una pequeña minoría de infecciones, y el subtipo C del VIH-1 parece ser el subtipo infeccioso más común. Cualquiera de estos tipos de aislados puede tratarse usando los agentes de unión descritos en el presente documento. También se pueden administrar uno o más agentes de unión con o junto con uno o más agentes usados para prevenir, tratar y/o mejorar el VIH como, por ejemplo, un inhibidor de la proteasa, un inhibidor de la entrada del VIH, un inhibidor de la transcriptasa inversa y/o un análogo nucleosídico antirretroviral. Los compuestos adecuados incluyen, por ejemplo, Agenerase (amprenavir), Combivir (Retrovir/Epivir), Crixivan (indinavir), Emtriva (emtricitabina), Epivir (3tc/lamivudina), Epzicom, Fortovase/Invirase (saquinavir), Fuzeon (enfuvirtida), Hivid (ddc/zalcitabina), Kaletra (lopinavir), Lexiva (fosamprenavir), Norvir (ritonavir), Rescriptor (delavirdina), Retrovir/AZT (zidovudina), Reyatax (atazanavir, BMS-232632), Sustiva (efavirenz), Trizivir (abacavir/zidovudina/lamivudina), Truvada (Emtricitabina/Tenofovir DF), Videx (ddl/didanosina), Videx EC (ddl, didanosina), Viracept (nevirapina), Viread (tenofovir disoproxil fumarato), Se pueden utilizar Zerit (d4T/estavudina) y Ziagen (abacavir). Los expertos en la técnica conocen otros agentes adecuados y pueden ser adecuados para su uso como se describe en el presente documento. Dichos agentes pueden usarse antes de, durante o después de la administración de los agentes de unión y/o el uso de los procedimientos descritos en el presente documento.

Como se ha mencionado anteriormente, los agentes de unión a PD-1 descritos en el presente documento (por ejemplo, un antagonista de PD-1) se pueden usar para tratar y/o prevenir y/o mejorar los síntomas del cáncer. Los cánceres de ejemplo pueden incluir, por ejemplo, cualquiera de mama, sangre, colon, estómago, recto, tejido esquelético, piel (por ejemplo, melanoma) cerebro, pulmón, vejiga, riñón, ovario y/o hígado, entre otros. Uno o más de los agentes de unión también pueden combinarse y/o administrarse con o junto con uno o más agentes usados para prevenir, tratar y/o mejorar el cáncer como, por ejemplo, un agente alquilante (por ejemplo, cualquier mostaza nitrogenada, nitrosourea, tetrazina, aziridina, cisplatino y/o derivado del mismo), anti-metabolito (por ejemplo, cualquiera de los metotrexatos, pemetrexeds, fluoropirimidinas y/o derivados de las mismas), agentes anti-microtúbulos (por ejemplo, alcaloides de la vinca, taxanos, podofilotoxina y/o derivado de la misma), inhibidores de la topoisomerasa I y/o II (por ejemplo, una camptotecina, irinotecán, topotecán, etopósido, doxorrubicina, mitoxantrona, tenipósido, novobiocina, merbarona, aclarubicina y/o derivado de la misma) y/o antibiótico citotóxico (por ejemplo, cualquier antraciclina, actinomicina, bleomicina, plicamicina y mitomicina y/o derivado de la misma). El uno o más agentes de unión también pueden, o alternativamente, combinarse con uno o más de otros agentes de unión disponibles para los expertos en la técnica para tratar, prevenir y/o mejorar el cáncer, tal como, por ejemplo, Nivolumab, lambrolizumab, pidilizumab y/u otros agentes similares y/o derivados de los mismos. Los expertos en la técnica conocen otros agentes adecuados y pueden ser adecuados para su uso como se describe en el presente documento. Dichos agentes pueden usarse antes de, durante o después de la administración de los agentes de unión y/o el uso de los procedimientos descritos en el presente documento.

Como se ha mencionado anteriormente, los agentes de unión a PD-1 descritos en el presente documento (por ejemplo, un agonista de PD-1) se pueden usar para tratar y/o prevenir y/o mejorar los síntomas de autoinmunidad. Las afecciones autoinmunitarias de ejemplo pueden incluir, por ejemplo, cualquiera en la que PD-1 esté involucrado en el mantenimiento de la auto-tolerancia y/o uno que involucre linfocitos T inflamatorios (por ejemplo, linfocitos T autorreactivos o autoantígenos específicas) como, por ejemplo, lupus eritematoso sistémico (LES), diabetes de tipo I, artritis reumatoide, glomerulonefritis y esclerosis múltiple. Dichos agentes de unión a PD-1 también se pueden combinar con otros agentes, tales como agentes anti-CTLA-4 (por ejemplo, ipilimumab). Uno o más de los agentes de unión también pueden combinarse y/o administrarse con o junto con uno o más agentes usados para prevenir, tratar y/o mejorar la autoinmunidad como, por ejemplo, glucocorticoides, citostáticos (por ejemplo, agentes alquilantes, antimetabolitos, metotrexato, azatioprina, mercaptopurina, antibióticos citotóxicos (por ejemplo, dactinomicina, antraciclinas, mitomicina C, bleomicina, mitramicina), anticuerpos (por ejemplo, Atgam, timoglobulina, Simulect, Zenapax), fármacos que actúan sobre las inmunofilinas (por ejemplo, ciclosporina, tacrolimus, sirolimus), interferones, opioides, agentes de unión a TNF (por ejemplo, Remicade, Enbrel, Humira), micofenolato, fingolimod, miriocina y/o derivados de la misma. Los expertos en la técnica conocen otros agentes adecuados y pueden ser adecuados para su uso como se describe en el presente documento. Dichos agentes pueden usarse antes de, durante o después de la administración de los agentes de unión y/o el uso de los procedimientos descritos en el presente documento.

Los agentes de unión se pueden unir y/o conjugar a uno o más marcadores detectables. Por ejemplo, los marcadores detectables adecuados pueden incluir, por ejemplo, fluorosceínas (por ejemplo, DyLight, Cy3, Cy5, FITC, HiLyte Fluor 555, HiLyte Fluor 647; 5-carboxi-2,7-diclorofluoresceína; 5-carboxifluoresceína (5-FAM); 5-HAT (hidroxi triptamina); 5-hidroxi triptamina (HAT); 6-JOE; 6-carboxifluoresceína (6-FAM); FITC; 6-carboxi-1,4-dicloro-2',7'-diclorofluoresceína (TET); 6-carboxi-1,4-dicloro-2', 4', 5',7'-tetraclorofluoresceína (HEX); 6-carboxi-4',5'-dicloro-2', 7'-dimetoxifluoresceína (JOE); Alexa flúor (por ejemplo, 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 635, 647, 660, 680, 700, 750); fluoróforos BODIPY (por ejemplo, 492/515, 493/503, 500/510, 505/515, 530/550, 542/563, 558/568, 564/570, 576/589, 581/591,630/650-X, 650/665-X, 665/676, FL, FL ATP, FI-ceramida, R6G SE, TMR, conjugado de TMR-X, TMR-X, SE, TR, TR ATP, TR-X SE)), rodaminas (por ejemplo, 110, 123, B, B 200, BB, BG, B extra, 5-carboxitetrametilrodamina (5-TAMRA), 5 GLD, 6-carboxirodamina 6G, lisamina, lisamina rodamina B, falicidina, faloidina, Rojo, Rhod-2, ROX (6-carboxi-X-rodamina), 5-ROX (carboxi-X-rodamina), sulforrodamina B puede C, sulforrodamina G Extra, TAMRA (6-carboxitetrametilrodamina), tetrametilrodamina (TRITC), WT), rojo Texas y/o rojo-X Texas. También pueden ser adecuados para su uso otros marcadores detectables conocidos en la técnica. Los agentes de unión, tales como los anticuerpos, se puede unir y/o conjugar a uno o más marcadores detectables usando técnicas estándar en la técnica.

En determinadas realizaciones, una molécula de ácido nucleico que codifica uno o más agentes de unión descritos en el presente documento puede insertarse en uno o más vectores de expresión, como se tratará a continuación con mayor detalle. En tales realizaciones, el agente de unión puede estar codificado por nucleótidos correspondientes a la secuencia de aminoácidos. Las combinaciones particulares de nucleótidos (codones) que codifican los diversos aminoácidos (AA) son bien conocidas en la técnica, como se describe en varias referencias utilizadas por los expertos en la técnica (por ejemplo, Lewin, B. Genes V, Oxford University Press, 1994). Las secuencias de nucleótidos que codifican los aminoácidos de dichos agentes de unión se pueden determinar con referencia a la Tabla 4, por ejemplo. Las variantes de ácido nucleico pueden usar cualquier combinación de nucleótidos que codifique el agente de unión.

Tabla 4

Los expertos en la técnica comprenden que la secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos particular puede derivarse fácilmente de la secuencia de aminoácidos y la información presentada en la Tabla 4. Por ejemplo, puede deducirse de la secuencia de aminoácidos DDFLH (SEQ ID NO.: 1) y la información presentada en la Tabla 4 de que la secuencia de aminoácidos puede estar codificada por la secuencia de nucleótidos GAT TTT TTA CAT (SEQ ID NO.:139). Los expertos en la técnica entenderán que las secuencias de nucleótidos según se reivindica pueden deducirse de la misma manera y tales secuencias de nucleótidos se contemplan en el presente documento. Cuando los agentes de unión son anticuerpos, las secuencias de nucleótidos que codifican las regiones variables de las mismas también pueden aislarse del fago y/o las células de hibridoma que expresan las mismas clonadas en vectores de expresión para producir determinadas preparaciones (por ejemplo, anticuerpos humanizados). Los procedimientos para producir tales preparaciones son bien conocidos en la técnica.

Para determinar las secuencias de aminoácidos de las regiones variables (por ejemplo, CDR) de interés, células de hibridoma de ratones inmunizados con un antígeno/inmunógeno de PD-1 pueden seleccionarse usando los ensayos funcionales descritos en el presente documento y técnicas de clonación que están fácilmente disponibles para los expertos en la técnica. Por ejemplo, para aislar y secuenciar ácidos nucleicos que codifican las regiones variables de cadena pesada y ligera de los hibridomas seleccionados, el ARN total se puede extraer de células de hibridoma frescas utilizando reactivo TRIzol de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ADNc se puede sintetizar a partir del ARN usando cebadores antisentido específicos de isotipo o cebadores universales usando técnicas convencionales (por ejemplo, siguiendo el manual técnico de PrimeScript™ 1st Strand cDNA Synthesis Kit). A continuación, se puede realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar los ácidos nucleicos que codifican las regiones variables (cadenas pesada y ligera) del anticuerpo producido por el hibridoma seleccionado, que luego puede clonarse en un vector de clonación estándar por separado y secuenciarse. A continuación, se puede realizar el cribado por PCR de colonias para identificar clones con insertos de tamaños correctos. Preferentemente, se secuencian no menos de cinco colonias individuales con insertos de tamaños correctos para cada región variable de anticuerpo. A continuación, pueden usarse protocolos estándar para la expresión y purificación de los anticuerpos anti-PD-1. Por ejemplo, los clones de hibridoma se pueden cultivar en medio sin suero y el caldo de cultivo celular se centrifuga y luego se filtra. El sobrenadante filtrado que contiene el anticuerpo puede, a continuación, cargarse en una columna de afinidad (por ejemplo, proteína A), lavarse y eluirse con un tampón apropiado (por ejemplo, tampón de elución de IgG de Pierce). A continuación, las fracciones eluidas pueden combinarse e intercambiarse con tampón en PBS, a pH 7,2. El anticuerpo purificado se puede analizar después mediante SDS-PAGE y transferencia Western utilizando protocolos estándar para peso molecular, rendimiento y pureza. A continuación, se puede realizar HPLC de cromatografía de exclusión por tamaño en una columna apropiada (por ejemplo, columna TSK GEL-G3000 SWXL (Tosoh)) para la caracterización biofísica con el fin de garantizar una alta pureza de anticuerpos (generalmente> 90 %) con baja presencia de agregados de proteínas. Estos procedimientos se utilizaron para aislar y secuenciar ácidos nucleicos que codifican las SEQ ID NO. 1-138 de células de hibridoma seleccionadas. Estas técnicas, variaciones de las mismas y/u otras también pueden ser útiles para estos fines, como entenderán los expertos en la técnica.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican uno o más agentes de unión a PD-1 pueden estar contenidas dentro de un vector vírico y/o no vírico. En una realización, se utiliza un vector de ADN para administrar ácidos nucleicos que codifican uno o más agentes de unión a PD-1 al paciente. Al hacerlo, se pueden utilizar varias estrategias para mejorar la eficiencia de dichos mecanismos, que incluyen, por ejemplo, el uso de replicones víricos autorreplicantes (Caley, y col.1999. Vaccine, 17: 3124-2135; Dubensky, y col. 2000. Mol. Med. 6: 723-732; Leitner, y col. 2000. Cancer Res. 60: 51-55), optimización de codones (Liu, y col. 2000. Mol. Ther., 1: 497-500; Dubensky, citado anteriormente; Huang, y col. 2001. J. Virol. 75: 4947-4951), electroporación in vivo (Widera, y col. 2000. J. Immunol. 164: 4635-3640), incorporación de ácidos nucleicos que codifican moléculas coestimuladoras, citocinas y/o quimiocinas (Xiang, y col.

1995. Immunity, 2: 129-135; Kim, y col. 1998. Eur. J. Immunol., 28: 1089-1103; Iwasaki, y col. 1997. J. Immunol. 158: 4591-3601; Sheerlinck, y col. 2001. Vaccine, 19: 2647-2656), incorporación de motivos estimulantes, tales como CpG (Gurunathan, supra; Leitner, supra), secuencias para el direccionamiento de las rutas de procesamiento endocítico o ubiquitina (Thomson, y col.1998. J. Virol. 72: 2246-2252; Velders, y col. 2001. J. Immunol. 166: 5366-5373), regímenes de estimulación y refuerzo (Gurunathan, supra; Sullivan, y col. 2000. Nature, 408: 605-609; Hanke, y col. 1998. Vaccine, 16: 439-445; Amara, y col. 2001. Science, 292: 69-74), sitios de escisión sensibles al proteasoma y el uso de vectores de liberación en la mucosa, tal como Salmonella (Darji, y col. 1997. Cell, 91: 765-775; Woo, y col. 2001. Vaccine, 19: 2945-2954). Otros procedimientos se conocen en la técnica, algunos de los cuales se describen a continuación. Varios vectores víricos que se han utilizado con éxito para introducir un ácido nucleico en un huésped incluyen retrovirus, adenovirus, El virus adenoasociado (VAA), virus del herpes y poxvirus, entre otros. Los vectores pueden construirse usando técnicas recombinantes estándar ampliamente disponibles para un experto en la técnica. Tales técnicas se pueden encontrar en referencias comunes de biología molecular, tales como Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, y col., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene Expression Technology (Methods in Enzymology, Vol. 185, editado por D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, Ca ) y PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, y col.,1990. Academic Press, San Diego, CA). Los vectores plasmídicos "no víricos" también pueden ser adecuados en determinadas realizaciones. Los vectores plasmídicos preferidos son compatibles con células huésped bacterianas, de insectos y/o de mamíferos. Dichos vectores incluyen, por ejemplo, PCR-ii, PCR3 y pcDNA3.1 (Invitrogen, San Diego, CA), pBSii (Stratagene, La Jolla, CA), pet15 (Novagen, Madison, WI), pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), pEGFpn2 (Clontech, Palo Alto, CA), pETI (Bluebacii, Invitrogen), pDSR-alfa (publicación PCT. n.° WO 90/14363) y pFASTBACdual (Gibco-BRL, Grand Island, NY), así como derivados del plásmido Bluescript® (un fagémido basado en COLe1 de alto número de copias, Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), plásmidos de clonación por PCR diseñados para clonar productos de PCR amplificados con TAQ (por ejemplo, Kit TOPO™ TA cloning®, derivados del plásmido PCR2.1®, Invitrogen, Carlsbad, CA). También se pueden usar vectores bacterianos. Estos vectores incluyen, por ejemplo, Shigella, Salmonella, Vibrio cholerae, Lactobacillus, bacilo de Calmette Guerin (BCG) y Streptococcus (véanse, por ejemplo, los documentos WO 88/6626; WO 90/0594; WO 91/13157; WO 92/1796; y WO 92/21376). En la técnica se conocen y se pueden usar muchos otros vectores y sistemas de expresión de plásmidos no víricos. También pueden ser suficientes otras técnicas de administración, que incluyen, por ejemplo, complejos de ADN-ligando, complejos de adenovirus-ligando-ADN, inyección directa de a Dn , precipitación en CaPO4, técnicas de pistola génica, electroporación y sistemas de dispersión coloidal. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas a base de lípidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. El sistema coloidal preferido es un liposoma, que son vesículas de membrana artificial útiles como vehículos de administración in vitro e in vivo. ARN, ADN y los viriones intactos pueden encapsularse dentro del interior acuoso y administrarse a las células en una forma biológicamente activa (Fraley, R., y col., 1981, Trends Biochem. Sci., 6: 77). La composición del liposoma suele ser una combinación de fosfolípidos, particularmente fosfolípidos de alta temperatura de transición de fase, generalmente en combinación con esteroides, especialmente colesterol. También pueden usarse otros fosfolípidos u otros lípidos. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, la fuerza iónica y la presencia de cationes divalentes. Los ejemplos de lípidos útiles en la producción de liposomas incluyen compuestos de fosfatidilo, tales como fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingolípidos, cerebrósidos y gangliósidos. Particularmente útiles son los diacilfosfatidilgliceroles, donde la fracción lipídica contiene de 14-18 átomos de carbono, particularmente de 16-18 átomos de carbono, y está saturada. Los fosfolípidos ilustrativos incluyen fosfatidilcolina de huevo, dipalmitoilfosfatidilcolina y diestearoilfosfatidilcolina.

También se proporciona una célula cultivada que comprende el vector. La célula cultivada puede ser una célula cultivada transfectada con el vector o una progenie de la célula, en la que la célula expresa el polipéptido inmunogénico. Los expertos en la técnica conocen las líneas celulares adecuadas y están disponibles comercialmente, por ejemplo, a través de la Colección Americana de Cultivos tipo (ATCC). Las células transfectadas se pueden usar en un procedimiento para producir un polipéptido inmunogénico. El procedimiento comprende cultivar una célula que comprende el vector en condiciones que permitan la expresión del polipéptido inmunogénico, opcionalmente bajo el control de una secuencia de expresión. El polipéptido inmunogénico se puede aislar de la célula o del medio de cultivo usando procedimientos estándar de purificación de proteínas.

El experto en la técnica tiene muchas técnicas adecuadas para usar los agentes de unión (por ejemplo, anticuerpos) descritos en el presente documento para identificar muestras biológicas que contienen proteínas que se unen a los mismos. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden utilizar para aislar PD-1 usando, por ejemplo, inmunoprecipitación u otro ensayo de tipo captura. Esta técnica bien conocida se realiza uniendo el anticuerpo a un soporte sólido o material cromatográfico (por ejemplo, una perla recubierta con proteína A, proteína G y/o proteína L). A continuación, el anticuerpo unido se introduce en una solución que contiene o se cree que contiene el PD-1 (por ejemplo, un lisado de linfocitos T infectados con VIH). Después, el PD-1 puede unirse al anticuerpo y los materiales que no se unen se eliminan por lavado en condiciones en las que el PD-1 permanece unido al anticuerpo. A continuación, la proteína unida puede separarse del anticuerpo y analizarse según se desee. En la técnica se conocen procedimientos similares para aislar una proteína usando un anticuerpo. Los agentes de unión (por ejemplo, anticuerpos) también se pueden utilizar para detectar PD-1 dentro de una muestra biológica. Por ejemplo, los anticuerpos pueden usarse en ensayos tales como, por ejemplo, análisis de citometría de flujo, ELISA, inmunotransferencia (por ejemplo, transferencia Western), detección in situ, inmunocitoquímica y/o inmunohistoquímica. Los procedimientos para realizar dichos ensayos son bien conocidos en la técnica.

Los agentes de unión descritos en el presente documento también se pueden usar para determinar la presencia de un estado de enfermedad en un paciente, para predecir el pronóstico o para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento quimioterapéutico o de otro tipo. Se pueden usar ensayos de perfil de expresión, realizados como se describe en el presente documento o como se conoce en la técnica, para determinar el nivel relativo de expresión de PD-1. El nivel de expresión puede correlacionarse después con los niveles de base (por ejemplo, control) para determinar si una enfermedad particular está presente en el paciente, el pronóstico del paciente o si un régimen de tratamiento en particular es eficaz. Por ejemplo, si el paciente está siendo tratado con un régimen antiinfeccioso particular, un aumento o disminución del nivel de expresión de PD-1 en los tejidos del paciente (por ejemplo, en sangre periférica, biopsia de tejido mamario) puede indicar que el régimen está empeorando o mejorando la carga del agente infeccioso en ese huésped. El aumento o disminución de la expresión puede indicar que el régimen está teniendo o no el efecto deseado y, por lo tanto, puede seleccionarse otra modalidad terapéutica.

También es posible usar los agentes de unión descritos en el presente documento como reactivos en ensayos de detección selectiva de fármacos para probar, por ejemplo, nuevos candidatos a fármacos. Los reactivos se pueden usar para determinar el efecto de un fármaco candidato sobre la expresión de la diana inmunogénica en una línea celular, o una célula o tejido de un paciente. La técnica de perfil de expresión puede combinarse con técnicas de detección selectiva de alto rendimiento para permitir la identificación rápida de compuestos útiles y controlar la eficacia del tratamiento con un fármaco candidato (véase, por ejemplo, Zlokarnik, y col., Science 279, 84-8 (1998)). Los candidatos a fármacos pueden ser compuestos químicos, ácidos nucleicos, proteínas, anticuerpos o derivados de los mismos, ya sea de origen natural o sintético. Los fármacos candidatos así identificados pueden utilizarse, entre otros usos, como composiciones farmacéuticas para la administración a pacientes o para su uso en ensayos de detección selectiva adicionales.

Los agentes de unión pueden estar en forma purificada. Un agente de unión "purificado" (por ejemplo, Anticuerpo) puede ser uno que esté separado de al menos aproximadamente el 50 % de las proteínas y/u otros componentes con los que se encuentra inicialmente (por ejemplo, como parte de un sobrenadante de hibridoma o preparación de ascitis en el caso de un anticuerpo monoclonal). Un agente de unión purificado (por ejemplo, un anticuerpo) puede ser uno que esté separado de al menos aproximadamente el 50 %, 60 %, 75 %, 90 % o 95 % de las proteínas y/u otros componentes con los que se encuentra inicialmente.

Los polipéptidos y ácidos nucleicos descritos en el presente documento pueden combinarse con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables antes de la administración a un huésped. Un Vehículo farmacéuticamente aceptable es un material que no es indeseable desde el punto de vista biológico, ni de otro modo, por ejemplo, el material se puede administrar a un sujeto, sin causar ningún efecto biológico indeseable o interaccionar de forma perjudicial con cualquiera de los otros componentes de la composición farmacéutica en la que está contenido. El vehículo se seleccionaría de forma natural para minimizar cualquier degradación del principio activo y minimizar cualquier efecto secundario adverso en el sujeto, como sería muy conocido por un experto en la materia. Los vehículos farmacéuticos adecuados y sus formulaciones se describen en, por ejemplo, Remington's: The Science and Practice of Pharmacy, 21a Edición, David B. Troy, ed., Lippicott Williams y Wilkins (2005). Normalmente, en la formulación se usa una cantidad adecuada de una sal farmacéuticamente aceptable para hacer que la formulación sea isotónica. Los ejemplos de los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitación, agua estéril, solución salina, soluciones tamponadas como la solución de Ringer y la solución de dextrosa. El pH de la solución es generalmente de aproximadamente 5 a aproximadamente 8 o de aproximadamente 7 a aproximadamente 7,5. Otros vehículos incluyen preparaciones de liberación sostenida tales como matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen polipéptidos o fragmentos de los mismos. Las matrices pueden estar en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas, liposomas o micropartículas. Será evidente para los expertos en la técnica que ciertos vehículos pueden ser más preferibles dependiendo de, por ejemplo, la vía de administración y la concentración de la composición que se administra. Los vehículos son los adecuados para la administración de polipéptidos y/o fragmentos de los mismos a seres humanos u otros sujetos. Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir vehículos, espesantes, diluyentes, tampones, conservantes, agentes tensioactivos, adyuvantes, inmunoestimulantes, además del polipéptido inmunogénico. Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir uno o más principios activos, tales como agentes antimicrobianos, agentes antiinflamatorios y anestésicos. La composición farmacéutica se puede administrar por vía oral, parenteral, por pulverización de inhalación, rectal, intranodal o tópicamente en formulaciones de unidades de dosificación que contienen vehículos, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables convencionales. La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" o "vehículo fisiológicamente aceptable" como se usa en el presente documento se refiere a uno o más materiales de formulación adecuados para lograr o mejorar la liberación de un ácido nucleico, polipéptido o péptido como composición farmacéutica. Una "composición farmacéutica" es una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un ácido nucleico o polipéptido. Las expresiones "cantidad eficaz" y "cantidad terapéuticamente eficaz" se refieren cada uno a la cantidad de un agente de unión, ácido nucleico o similar utilizado para observar el efecto terapéutico deseado (por ejemplo, restaurar la función de los linfocitos T).

Se proporcionan anticuerpos y composiciones para su uso en el tratamiento de uno o más estados de enfermedad (por ejemplo, VIH o cáncer) en un huésped mamífero. El agente de unión es un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1. El uno o más agentes de unión se pueden administrar en una cantidad de dosificación de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 mg/kg o de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 mg/kg (por ejemplo, aproximadamente cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35 o 40 mg/kg). El uno o más agentes de unión se pueden administrar al mamífero (por ejemplo, por vía intradérmica, intravenosa, oral, rectal) a aproximadamente 10 mg/kg una o más veces. Cuando se administran múltiples dosis, las dosis pueden comprender aproximadamente la misma o diferente cantidad de agente de unión en cada dosis. Las dosis también pueden estar separadas en el tiempo entre sí por intervalos iguales o diferentes. Por ejemplo, las dosis pueden estar separadas por aproximadamente 6, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 o 96 horas, una semana, dos semanas, tres semanas, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses, siete meses, ocho meses, nueve meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, 1,5 años, 2 años, 3 años, 4 años, 5 años o cualquier período de tiempo antes, después y/o entre cualquiera de estos períodos de tiempo. En algunas realizaciones, los agentes de unión pueden administrarse junto con otros agentes (por ejemplo, agentes antiinfecciosos y/o agentes quimioterapéuticos). Dichos otros agentes se pueden administrar aproximadamente simultáneamente con los agentes de unión, o en un momento y/o frecuencia diferente. Otras realizaciones de tales procedimientos también pueden ser apropiadas, ya que un experto en la técnica podría determinar fácilmente.

Para ayudar al experto en la técnica a utilizar los anticuerpos descritos en el presente documento, los mismos pueden proporcionarse en formato de kit. Se proporciona un kit que incluye tales anticuerpos y, opcionalmente, otros componentes necesarios para usar los anticuerpos para detectar células que expresan PD-1. Los anticuerpos del kit se pueden proporcionar en cualquier forma adecuada, incluido congelados, liofilizados o en un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como TBS o PBS. El kit también puede incluir otros reactivos necesarios para la utilización de los anticuerpos in vitro o in vivo, tales como tampones (por ejemplo, TBS, PBS), agentes bloqueantes (soluciones que incluyen leche en polvo desgrasada, sueros normales, detergente Tween-20, BSA o caseína) y/o reactivos de detección (por ejemplo, biotina IgG anti-ratón de cabra, conjugados estreptavidina-HRP, aloficocianina, B-ficoeritrina, R-ficoeritrina, peroxidasa, marcadores detectables y otros marcadores y/o kits de tinción (por ejemplo, kit de tinción ABC, Pierce)). Los kits también pueden incluir otros reactivos y/o instrucciones para el uso de los anticuerpos en los ensayos de uso habitual descritos anteriormente, tales como, por ejemplo, análisis de citometría de flujo, ELISA, inmunotransferencia (por ejemplo, transferencia Western), detección in situ, inmunocitoquímica, inmunohistoquímica. En una realización, el kit proporciona un agente de unión en forma purificada. En otra realización, el agente de unión se puede proporcionar en forma biotinilada de forma individual o junto con un reactivo de detección conjugado con avidina (por ejemplo, anticuerpo). En otra realización, el kit incluye agentes de unión que comprenden uno o más marcadores detectables que pueden usarse para detectar directamente PD-1. Los tampones y similares necesarios para utilizar cualquiera de estos sistemas son bien conocidos en la técnica y/o pueden ser preparados por el usuario final o proporcionados como un componente del kit. El kit también puede incluir un soporte sólido que contiene proteínas de control positivo y negativo y/o muestras de tejido. Por ejemplo, los kits para realizar ensayos de manchas o de tipo transferencia Western pueden incluir lisados de células o tejidos de control para su uso en SDS-PAGE o nailon u otras membranas que contienen muestras de control prefijadas con espacio adicional para muestras experimentales. Los kits para la visualización de PD-1 en células en portaobjetos pueden incluir portaobjetos preformateados que contienen células de control o muestras de tejido con espacio adicional para muestras experimentales. Otras realizaciones de kits también se contemplan en el presente documento como entenderán los expertos en la técnica.

Por lo tanto, la presente divulgación proporciona un agente de unión que se une a PD-1 de forma agonista o antagonista. Se describe un agente de unión que es un polipéptido que comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las s Eq Id NO. 1-138 y/o se muestran en las Tablas 1A y 1B. El agente de unión es un polipéptido que comprende una o más combinaciones de las SEQ ID NO. 1-138 (por ejemplo, como se muestra en las Tablas 1A y/o 1B). De acuerdo con la presente invención, el agente de unión es un anticuerpo. En algunas realizaciones, el agente de unión es un polipéptido tal como un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1. En algunas realizaciones, el agente de unión se deriva o está relacionado con (por ejemplo, por secuencia o derivación) un anticuerpo humano, IgG humana, IgG1 humana, IgG2 humana, IgG2a de ratón, IgG2b de ratón, IgG3 humana, IgG4 humana, IgM humana, IgA humana, IgA1 humana, IgA2 humana, IgD humana, IgE humana, anticuerpo canino, IgGA canina, IgGB canina, IgGC canina, IgGD canina, anticuerpo de pollo, IgA de pollo, IgD de pollo, IgE de pollo, IgG de pollo, IgM de pollo, IgY de pollo, anticuerpo de cabra, IgG de cabra, anticuerpo de ratón, IgG de ratón, anticuerpo de cerdo y/o anticuerpo de rata y/o un derivado de los mismos. En algunas realizaciones, el derivado puede seleccionarse del grupo que consiste en un Fab, Fab2, anticuerpo Fab' monocatenario, Fv, anticuerpo monocatenario monoespecífico, anticuerpo biespecífico, anticuerpo trimérico, anticuerpo multiespecífico, anticuerpo multivalente, anticuerpo quimérico, anticuerpo quimérico canino-humano, anticuerpo quimérico canino-ratón, anticuerpo que comprende un Fc canino, anticuerpo humanizado, anticuerpo caninizado, anticuerpo con injerto de CDR, anticuerpo de tiburón y/o anticuerpo de camélido.

La presente divulgación también proporciona procedimientos para detectar PD-1 en una célula, comprendiendo el procedimiento poner en contacto una muestra biológica de prueba con un agente de unión o derivado descrito en el presente documento y detectar el agente de unión unido a la muestra biológica o componentes de la misma. Tales procedimientos pueden ser un procedimiento in vivo o un procedimiento in vitro. En algunas realizaciones, el procedimiento puede comprender comparar la cantidad de unión con la muestra biológica de prueba o componentes de la misma con la cantidad de unión a una muestra biológica de control o componentes de la misma, en el que el aumento de la unión a la muestra biológica de prueba o componentes de la misma en relación con la muestra biológica de control o componentes de la misma indica la presencia de una célula que expresa PD-1 en la muestra biológica de prueba (por ejemplo, sangre de mamífero). En algunas realizaciones, se proporciona un sistema para identificar un agente de unión al anticuerpo de PD-1 analizando el agente de unión candidato mediante el ensayo de recuperación funcional por agotamiento (EFRA); determinar la afinidad del agente de unión candidato por PD-1; y determinar la secuencia de nucleótidos de la CDR del agente de unión candidato.

En algunas realizaciones, un kit para detectar la expresión de PD-1 en o sobre una célula, comprendiendo el kit un agente de unión o derivado del mismo e instrucciones de uso. En algunas realizaciones, el agente de unión y/o derivado del mismo está en forma liofilizada.

La presente divulgación describe procedimientos para tratar, prevenir y/o mejorar una enfermedad infecciosa, cáncer y/o autoinmunidad en un mamífero que comprende administrar al mamífero al menos una dosis eficaz de una composición farmacéutica que comprende un agente de unión o derivado del mismo. En algunas realizaciones, la enfermedad infecciosa es el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). En algunas realizaciones, el agente de unión y/o derivado del mismo utilizado para tratar enfermedades infecciosas y/o cáncer es un antagonista de PD-1. En algunas realizaciones, el agente de unión y/o derivado del mismo usado para tratar una afección autoinmunitaria es un agonista de PD-1. En algunas realizaciones, se administran múltiples dosis al animal. En algunas realizaciones, el agente de unión y/o derivado del mismo se puede administrar en una cantidad de dosificación de aproximadamente 1 a 50 mg/kg.

La presente divulgación también proporciona combinaciones de agentes de unión a PD-1. En algunas realizaciones, la combinación comprende un primer agente de unión que bloquea la interacción de PD-1 y PD-L1 y un segundo agente de unión que no bloquea la interacción de PD-1 y PD-L1. Dichas combinaciones pueden usarse para cualquier uso descrito en el presente documento o según puedan determinar de otro modo los expertos en la técnica. Por ejemplo, tales combinaciones pueden usarse en los procedimientos para tratar, prevenir y/o mejorar una enfermedad infecciosa, cáncer y/o autoinmunidad en un mamífero descrito en el presente documento.

La presente divulgación también proporciona procedimientos para producir los agentes de unión descritos en el presente documento expresando el agente de unión en una célula y aislando el agente de unión de la célula o un sobrenadante de cultivo de la célula. En algunas realizaciones, dichos procedimientos pueden comprender además expresar un ácido nucleico que codifica dicho agente o agentes de unión. En algunas realizaciones, dichos procedimientos también pueden incluir combinar el o los agentes de unión después del aislamiento con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

Los procedimientos para producir una combinación o combinaciones de agentes de unión, tal como un primer agente de unión que bloquea la interacción de PD-1 y PD-L1 y un segundo agente de unión que no bloquea la interacción de PD-1 y PD-L1, también se describen en la presente divulgación. El segundo agente de unión puede unirse a PD-1. El primero y/o segundo agente de unión son anticuerpos tales como anticuerpos monoclonales o fragmentos o derivados de los mismos. En algunas realizaciones, el segundo agente de unión comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO. 2, 25, 48, 71,94 y 117; o las SEQ ID NOS. 17, 40, 63, 86, 109 y 132. En algunas realizaciones, estos procedimientos pueden incluir además la adición de un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Los términos "aproximadamente", "alrededor de" y similares, cuando precede a una lista de valores numéricos o intervalo, hacen referencia a cada valor individual en la lista o intervalo de forma independiente como si cada valor individual en la lista o intervalo estuviera inmediatamente precedido por ese término. Los términos significan que los valores a los que se refieren los mismos son exactamente, cercanos o similares a los mismos.

Como se utilizan en el presente documento, se pretende que un sujeto o un huésped sea un individuo. El sujeto puede incluir animales domésticos, tales como perros y gatos, ganado (por ejemplo, vacas, caballos, cerdos, ovejas y cabras), animales de laboratorio (por ejemplo, ratones, conejos, ratas, cobayas) y aves. En un aspecto, el sujeto es un mamífero, tal como un primate o un ser humano.

Opcional u opcionalmente significan que el acontecimiento o circunstancia que se describe más adelante puede ocurrir o no y que la descripción incluye los casos en los que dicho acontecimiento o circunstancia se produce y los casos en los que no. Por ejemplo, la expresión opcionalmente la composición puede comprender una combinación significa que la composición puede comprender una combinación de diferentes moléculas o puede no incluir una combinación tal que la descripción incluya tanto la combinación como la ausencia de la combinación (es decir, miembros individuales de la combinación).

Los intervalos pueden expresarse en el presente documento a partir de aproximadamente un valor particular y/o de aproximadamente otro valor particular. Cuando se expresa dicho intervalo, otro aspecto incluye desde un valor particular y/o hasta el otro valor particular. De forma similar, cuando los valores se expresan como aproximaciones, mediante el uso del antecedente aproximadamente o alrededor de, se entenderá que el valor particular constituye otro aspecto. También debe entenderse que los criterios de valoración de cada uno de los intervalos son significativos tanto en relación con el otro criterio de valoración como de forma independiente con el otro criterio de valoración. Los intervalos (por ejemplo, 90-100 %) están destinados a incluir el intervalo per se, así como cada valor independiente dentro del intervalo como si cada valor se enumerara individualmente.

El término "combinado" o "en combinación" o "en conjunto" puede referirse a una combinación física de agentes que se administran juntos o al uso de dos o más agentes en un régimen (por ejemplo, administrarse por separado, físicamente y/o a tiempo) para tratar, prevenir y/o mejorar una enfermedad particular.

Cuando los términos tratar, prevenir y/o mejorar o sus derivados se utilizan en el presente documento en relación con un tratamiento dado para una afección determinada (por ejemplo, prevenir la infección del cáncer por VIH), se pretende transmitir que el paciente tratado no desarrolla en absoluto un nivel clínicamente observable de la afección o lo desarrolla más lentamente y/o en menor grado del que habría tenido sin el tratamiento. Estos términos no se limitan únicamente a una situación en la que el paciente no experimenta ningún aspecto de la afección en absoluto. Por ejemplo, se dirá que un tratamiento ha prevenido la afección si se administra durante la exposición de un paciente a un estímulo que se hubiera esperado que produjera una manifestación determinada de la afección y da como resultado que el paciente experimente menos y/o síntomas más leves de la afección de lo esperado. Por ejemplo, un tratamiento puede "prevenir" la infección al hacer que el paciente muestre solo síntomas leves de la infección; no implica que no deba haber penetrado ninguna célula por el microorganismo infectante.

De forma similar, reducen, reducir y reducción como se usa en el presente documento en relación con la prevención, el tratamiento y/o la mejora de una afección dada mediante un tratamiento particular se refiere típicamente a que un sujeto que desarrolla una infección más lentamente o en menor grado en comparación con un control o nivel basal de desarrollar una infección en ausencia de un tratamiento (por ejemplo, administración de uno o más agentes de unión a PD-1). Una reducción en el riesgo de infección puede dar como resultado en que el paciente presente solo síntomas leves de la infección o síntomas tardíos de la infección; no implica que no deba haber penetrado ninguna célula por el microorganismo infectante.

Ciertas realizaciones se describen adicionalmente en los siguientes ejemplos. Estas realizaciones se proporcionan solo como ejemplos y no pretenden limitar el ámbito de las reivindicaciones de ninguna manera.

Ejemplos

Ejemplo 1

Generación y caracterización de agentes de unión a PD-1

Se han inmunizado cuatro cepas de ratones (un total de 16 ratones) con dos proteínas PD-1, es decir, la proteína de fusión PD-1 Fc humana y una proteína monomérica PD-1 humana. Se han seleccionado ratones que muestran reactividad sérica a PD-1 expresada en linfocitos T humanos activados para la generación de líneas celulares de hibridoma anti-PD-1. Se seleccionó un total de 240 líneas celulares de hibridoma PD-1 para producir anticuerpos que se unen a la proteína PD-1 recombinante. Los criterios principales para la primera ronda de selección de anticuerpos fueron: i) tinción de PD-1 en linfocitos T humanos activados mediante citometría de flujo; ii) diversidad de secuencias CDR de VH y VL en comparación con las de los anticuerpos anti-PD-1 existentes; y iii) mapeo de epítopos realizado mediante estudios de unión competitiva con perlas Luminex conjugadas con PD-1 con dos anticuerpos anti-PD-1 disponibles comercialmente que se unen a diferentes epítopos en PD-1. A continuación, realizaron una segunda ronda de selección: iv) ensayos de unión por afinidad (no es un criterio principal ya que no se correlaciona con el potencial estimulante de los anticuerpos anti-PD-1); v) evaluación de anticuerpos anti-PD-1 que se unen a PD-1 y son competitivos, parcialmente competitivos o no competitivos con la unión de PD-L1 en un ensayo bioquímico Luminex; y vi) caracterización funcional de anticuerpos como agonista (no capaz de restaurar los linfocitos T del agotamiento funcional) o antagonista (capaz de restaurar los linfocitos T del agotamiento funcional). En estos estudios, los anticuerpos se probaron y diferenciaron basándose en su capacidad para rescatar la proliferación en linfocitos T CD8 agotados específicos del VIH.

En una selección primaria de sobrenadantes de anticuerpos de clones de células de hibridoma cultivadas con células individuales, el ensayo EFRA se llevó a cabo para evaluar el efecto funcional de los anticuerpos anti-PD1 sobre la proliferación de linfocitos T CD8 específicos del VIH (Figura 2). Los clones de anticuerpos en el recuadro superior (E8-3, C2-3, E1-3, F3-3, H8-3, C10-2, G2-1, G3-2, h2-1 y H4-2) actúan como antagonistas de PD-1 y estimulan la proliferación, mientras que los clones de anticuerpos en el recuadro inferior (C8-1 y G10-2) son agonistas y estimulan el efecto regulador negativo de PD-1. El nivel de proliferación inducida por el péptido control (Pép. 8) se indica mediante la línea horizontal inferior (justo por debajo del 1 %) y la proliferación inducida por el anticuerpo anti-PD1 de Merck MK-3475 se muestra en la línea horizontal superior (justo encima de 2 %). Los anticuerpos de interés identificados mediante estos procesos se sometieron a una segunda ronda de subclonación y los clones de hibridoma resultantes se utilizaron para la producción y purificación de los anticuerpos de la Tabla 2. Los ensayos de unión se llevaron a cabo con los anticuerpos anti-PD-1 purificados para asegurar que los subclones mantuvieran su afinidad por PD-1. La unión de respuesta a la concentración de anticuerpos anti-PD-1 al PD-1 de la superficie celular se evaluó en linfocitos T CD4 activados (Figura 3).

El ensayo EFRA prevé la selección de agentes de unión que restauran a los linfocitos T del agotamiento funcional, pero no son necesariamente antagonistas, es decir, los agentes de unión que no interfieren necesariamente con la interacción entre PD-1 y su ligando o ligandos biológicos (por ejemplo, PD-L1 o PD-L2). Una realización del EFRA fue identificar tales agentes de unión (anticuerpos) que se unen a PD-1. El mapeo de epítopos del anticuerpo que se une a PD-1 se realizó con dos ensayos bioquímicos separados. En un ensayo, se evaluó la unión competitiva a perlas marcadas con la proteína de fusión PD-1 Fc entre uno de dos anticuerpos anti-PD-1 comerciales (BMS-5C4 y MK3475) y los anticuerpos anti-PD-1 enumerados (también descritos en la Tabla 2). Se identificaron cuatro clases de anticuerpos monoclonales que se unen a distintos epítopos basándose en este ensayo. Estas son: clase 1 (competitivo con el clon de anticuerpo monoclonal comercial EH12.2H7 que bloquea la interacción de PD-1 con PD-L1), clase 2 (competitivo con el clon de anticuerpo monoclonal comercial J116 que se une a PD-1 pero no bloquea eficazmente la interacción de PD-1 con PD-L1), clase 3 (competitivo con los anticuerpos monoclonales comerciales EH12.2H7 y J116) y clase 4 (no competitivo con los anticuerpos comerciales EH12.2H7 o J116). La unión relativa de estos anticuerpos para el PD-1 de superficie celular está representada por la intensidad de fluorescencia media (IMF) relativa a un anticuerpo anti-PD-1 de control en la Figura 4. Estos resultados muestran que se identificaron anticuerpos de unión estrecha de las cuatro clases de unión. Se utilizó un segundo ensayo de unión de Luminex para evaluar directamente si un anticuerpo anti-PD-1 bloquea la interacción entre PD-1 y PD-L1. Este ensayo se llevó a cabo usando perlas recubiertas con proteína de fusión PD-1 Fc que se incubaron en ausencia o presencia de diferentes concentraciones de los anticuerpos anti-PD-1 enumerados en la Tabla 2. Una concentración fija de PD-L1 biotinilado, aproximadamente equivalente a la CI50 de la interacción PD-1/PD-L1, luego se incubó con el complejo PD-1/anticuerpo y se detectó la unión de PD-L1 usando estreptavidina marcada con fluorescencia (curvas de unión representativas mostradas en la Figura 5a-c). Usando este ensayo bioquímico, los anticuerpos se definieron como competitivos, parcialmente competitivos o no competitivos con la interacción PD-1/PD-L1. Se identificaron los anticuerpos competitivos, parcialmente competitivos y no competitivos que se unen a distintos sitios en PD-1 y exhiben una alta afinidad de unión (Tabla 2). Se realizó una evaluación adicional de los anticuerpos que se unen a PD-1 y no son competitivos o parcialmente competitivos con PD-L1 incubando perlas Luminex recubiertas con proteína de fusión PD-1 Fc con 20 nM de un anticuerpo anti-PD-1 de la Tabla 2 seguido de una incubación del complejo PD-1/anticuerpo con diferentes concentraciones de PD-L1 biotinilado. La Figura 5d-f muestra que un anticuerpo anti-PD-1 competitivo bloquea completamente la interacción entre PD-1 y PD-L1. Los anticuerpos anti-PD-1 parcialmente competitivos y no competitivos enumerados en la Tabla 2 dan como resultado un cambio en la afinidad de unión de PD-L1 por PD-1, pero no bloquea la interacción cuando aumenta la concentración de PD-L1. También se demostró que algunos de estos anticuerpos exhiben aumentos estadísticamente significativos en la proliferación en relación con los controles (control del péptido 8 solo o el péptido y el anticuerpo de control de isotipo IgG1 en las Figuras 6a y 6b). Los anticuerpos de clase 1 (competitivos con el anticuerpo monoclonal comercial EH12.2H7 que bloquea la interacción de PD-1 con PD-L1) o competitivos en el ensayo de interacción de PD-1/PD-L1 se determinaron generalmente para proporcionar una restauración proliferativa mejorada. Al combinar los datos de múltiples experimentos EFRA y usando MK-3475 como comparador común, la Figura 7 muestra que los anticuerpos seleccionados descritos en la Tabla 2 exhibieron una actividad equivalente o estadísticamente mejorada (p <0,007) en comparación con el anticuerpo MK-3475 de referencia.

Ejemplo 2

Combinaciones de anticuerpos

Se encontró que las combinaciones de anticuerpos que se unen a diferentes epítopos de PD-1 mejoran la restauración de la proliferación de linfocitos T CD8 específicos del péptido del VIH en un ensayo de recuperación por agotamiento funcional (Figura 8). También se observó sinergia entre los tipos de anticuerpos. Por ejemplo, se determinó que los anticuerpos de clase 1 (MK-3475 en la Figura 8) y clase 2 (139D6 en la Figura 8) son capaces de unirse simultáneamente a PD-1. Si bien la estimulación máxima observada para MK-3475 es consistentemente de aproximadamente 200% en relación con el péptido del VIH, las combinaciones de los anticuerpos monoclonales MK-3475 y 139D6 a 5 pg/ml mostraron sinergia con un aumento del 288 % en la proliferación de linfocitos T CD8 específicos del VIH en relación con el control del péptido del VIH de control solo o un aumento de la proliferación del 144 % en relación con MK-3475 o 139D6 individuales añadido (Figura 8). Este aumento sinérgico de la proliferación se observó en varias pruebas experimentales con un valor de p estadísticamente significativo de 0,007. Como comparación, la adición de 10 pg/ml de MK-3475 o 139D6 de forma individual no dio como resultado un aumento de la proliferación en el EFRA. Por lo tanto, se ha determinado que la combinación de un primer agente de unión que bloquea la interacción de PD-1 y PD-L1 con un segundo agente de unión que no bloquea la interacción de PD-1 y PD-L1 actúa sinérgicamente para rescatar a los linfocitos T del agotamiento.

Aunque se han descrito ciertas realizaciones en términos de las realizaciones preferidas, se entiende que los expertos en la materia idearán variaciones y modificaciones. Por lo tanto, se pretende que las reivindicaciones adjuntas cubran todas las variaciones equivalentes que entran dentro del ámbito de las siguientes reivindicaciones.

Referencias

1. Chun TW y col., Nature 387: 183-188, 1997

2. Chun TW y col. Proc Natl Acad Sci USA 94: 13193-13197, 1997

3. Finzi D y col. Science 278: 1295-1300, 1997

4. Chomont N y col. Nt Med 15:893-900, 2009

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo que se une a PD-1 humano y comprende una combinación de una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL) seleccionada entre el grupo que consiste en:

(a) un VH que comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR) 1, 2 y 3 como se establece en las SEQ ID NO: 17, 40 y 63, respectivamente; y una VL que comprende las CDR 1,2 y 3 como se establece en las SEQ ID NO: 86, 109 y 132, respectivamente; o,

(b) un VH que comprende las CDR 1,2 y 3 como se establece en las SEQ ID NO: 2, 25 y 48, respectivamente; y una VL que comprende las CDR 1, 2 y 3 como se establece en las SEQ ID NO: 71, 94 y 117, respectivamente.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1 que es un anticuerpo humano, IgG humana, IgG1 humana, IgG2 humana, IgG2a de roedor, IgG2b de roedor, IgG3 humana, IgG4 humana, IgM humana, IgA humana, IgA1 humana, IgA2 humana, IgD humana, IgE humana, anticuerpo canino, IgGA canina, IgGB canina, IgGC canina, IgGD canina, anticuerpo de pollo, IgA de pollo, IgD de pollo, IgE de pollo, IgG de pollo, IgM de pollo, IgY de pollo, anticuerpo de cabra, IgG de cabra, anticuerpo de ratón, IgG de ratón, anticuerpo de cerdo, anticuerpo de rata, un Fab, Fab2, anticuerpo Fab' monocatenario, Fv, anticuerpo monocatenario monoespecífico, anticuerpo biespecífico, anticuerpo trimérico, anticuerpo multiespecífico, anticuerpo multivalente, anticuerpo quimérico, anticuerpo quimérico canino-humano, anticuerpo quimérico canino-ratón, anticuerpo que comprende un Fc canino, anticuerpo humanizado, anticuerpo caninizado y anticuerpo injertado con CDR.

3. Una composición que comprende un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

4. Una composición que comprende un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y al menos un segundo anticuerpo competitivo con la interacción de PD-1 y PD-L1, opcionalmente en el que el segundo anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende las CDR 1, 2 y 3 como se establece en las SEQ ID NO: 8, 31 y 54, respectivamente; y una región variable de cadena ligera (VL) que comprende las CDR 1, 2 y 3 como se establece en las SEQ ID NO: 77, 100 y 123, respectivamente, o en el que el segundo anticuerpo comprende pembrolizumab.

5. Un procedimiento para unir PD-1 en una célula in vitro, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto la célula con un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2.

6. Un procedimiento para unir PD-1 en una célula in vitro, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto la célula con una composición de la reivindicación 3 o 4.

7. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un ser humano.

8. Una composición de acuerdo con la reivindicación 3 o 4 para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un ser humano.

9. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en la que la enfermedad es cáncer, en la que dicho cáncer se selecciona opcionalmente del grupo que consiste en cáncer de mama, sangre, colon, estómago, recto, tejido esquelético, piel, cerebro, pulmón, vejiga, riñón, de ovario y de hígado.

10. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en la que la enfermedad es una enfermedad infecciosa y, opcionalmente, en la que dicha enfermedad infecciosa está causada por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).

11. Un polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2.

12. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido de la reivindicación 1 o 2.

13. Una célula huésped que comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un anticuerpo de las reivindicaciones 1 o 2.