KR20170069996A - Pd-1 에 결합하는 면역학적 시약 - Google Patents

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Abstract

본 명세서는 예정된 세포 사멸 1 (PD-1)에 특이성을 가지는 결합 물질 그리고 감염성 질환 (예컨데, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)), 암 및/또는 자가면역을 치료, 예방 및/또는 개선시키기 위하여 이를 이용하는 방법에 관계한다.

Description

PD-1 에 결합하는 면역학적 시약{IMMUNOLOGICAL REAGENTS BINDING TO PD-1}
관련 출원들
이 출원은 2014년 8월 5일자로 제출된 U.S. Ser. No. 62/033,177; 2014년 9월 22일자로 제출된 U.S. Ser. No. 62/053,366; 그리고 2014년 12월 17일자로 제출된 U.S. Ser. No. 62/093,368에 대하여 우선권을 주장하며, 이는 모두 본 명세서의 참고자료에 편입된다.
공개 분야
본 명세서는 예정된 세포 사멸 1 (PD-1) (예컨데, 인간 PD-1)에 특이성을 갖는 결합 물질들(결합 물질들) 및 감염 (예컨데, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)에 의한), 암 및/또는 자가면역을 치료 및/또는 예방하기 위하여 이를 이용하는 방법에 관계한다.
발명의 배경
HIV 유행된 지 40년째 들어가기 때문에, HIV 발병기전을 이해하는데 상당한 진전이 있었으며, 강력하고 안전한 항바이러스 약물들의 개발에도 상당한 진전이 있었다. 30가지 이상의 항바이러스 약물들이 등록되었으며, 이환율과 치사율 모두에서 항레트로바이러스 요법 (ART)의 복합 효과는 주목할만하다. 그러나, ART에 대한 최적의 유착을 가진 환자들에서 이루어진 HIV 복제의 장기적 억제에도 불구하고, 요법 중단후 HIV는 항상 되돌아온다. 더욱이, 성공적인 요법은 ART 없을 때 HIV 복제를 조절할 수 있는 바이러스-특이적 면역 반응의 복원/개발을 유도하거나 또는 허용하지 않는다. 따라서, HIV 감염된 대상들의 상당 부분에서 HIV 복제 및 연합된 질환을 관리하기 위하여 평생동안 ART가 필요하다.
HIV에 잠복 감염된 오래 사는 중추 기억 CD4 T-세포들의 집단은 HIV 세포 저장소의 중요한 성분으로써, 그리고 HIV 지속의 주요 원인으로써 혈액 안에서 확인되었다. 이 잠재적 세포 저장소의 수명은 ART로 완전하게 HIV 억제 존재하에 대략적으로 70년인 것으로 예상된다. 그러나, 최근 연구에서 림프절에 있는 두 집단의 CD4 T-세포들은 HIV 감염, 복제 및 생산의 주요 CD4 T-세포 격실로 작용한다라고 설명되었다. 이들 두 CD4 T-세포 집단은 PD-1 및 CXCR5의 발현에 의해 특징되며, PD-1+CXCR5+, 가령, T 난포 헬퍼 세포들 (Tfh) 및 PD-1+CXCR5- CD4 T-세포 집단들을 포함한다.
HIV 잠재적 세포 저장소(들)의 확립 및 유지를 담당하는 다수의 기전들이 제안되었다. 기전들중 하나는 HIV 세포 저장소를 보충할 수 있는 ART하에 최소 바이러스 복제의 지속이다. 따라서, ART는 HIV 복제를 완전하게 억제하는 것을 유도할 수 없고, 그리고 ART하에 ＂자연적＂ HIV-1 특이적 면역 반응은 진행중인 잔여 바이러스 복제를 총체적으로 억제하고 제거할 수도 없다. ART 및 HIV-특이적 면역 반응의 실패는 지속적인 HIV 세포 저장소를 또한 표적으로 하는 대체 중재방법의 조사에 대한 이론적 근거를 제공한다.
HIV 기능적 치료를 얻는 것으로 목표로 과거와 현재 더 개발에 있어서 다수의 면역학적 중재법이 조사되었고, 이때 바이러스 복제는 지속적인 항바이러스 요법 (9)없이 억제된다. 치료요법적 백신 전략이 조사된 주요 중재 전략이지만, 결과는 CMV-기반의 벡터 HIV 백신 (NHP 모델에서 80% 효과;10)을 제외하고, 실험 동물 모델 및 환자에서 중간 수준의 효과를 나타내었다. 최근 연구에서 항-외피 광역 중화 항체 (bNabs)를 HIV 감염에서 치료요법적 물질로써 이용 가능성에 대하여 흥미로운 결과를 얻었다 (11,12). 더욱이, 길항제 PD-1 Abs는 HIV 감염된 환자들에서 T-세포 기능을 복원시키고, 그리고 HIV-특이적 T-세포 반응의 효능을 증가시키기위한 치료요법적 전략으로 이들 Abs의 이용 가능성이 제안되었다(13,14).
침윤성 종양-특이적 CD8 T-세포들은 증식하는 능력 및 세포독성 활성을 중재하는 이들의 능력에 있어서 이상기능적이라는 것은 잘 확립된 사실이다. 침윤성 종양-특이적 CD8 T-세포들의 대부분은 소위 소모 기능적 상태에 있다. 침윤성 종양-특이적 CD8 T-세포들의 소모를 담당하는 주요 기전은 다수의 조절 수용체들 그리고 특히 PD-1 조절 수용체의 발현 증가이다. PD-1/PDL-1/2 (PD-1 리간드)의 차단은 소모로부터 CD8 T-세포들의 회수와 연합된다는 관찰은 소모된 CD8 T-세포들에 의해 발현된 PD-1 분자를 표적으로 하는 중재 전략 개발의 이론적 근거를 제공하였다. 최근 연구에서 진행된 암-연합된 질환을 가진 환자들에서 길항제 활성을 가진 PD-1 항체들의 이용에 의해 매우 전망이 좋은 결과들이 나타났다. 연구에서 진행된 흑색종, 비-소 세포 폐 암종 및 신장 암종 환자들에서 18 내지 40% 범위로 실질적인 반응율을 보였다. 이들 연구에서 항-PD-1 항체들은 단독으로 사용되거나 또는 항-CTL-A4 항체와 복합되어 이용되었다. 이들 초기 연구 이후, 현재 연구는 혈액학 종양이 또한 포함되는 다양한 종양 환자들에서 실행되고 있다.
PD-1을 표적으로 하는 추가적인 시약 및 이를 이용하는 방법들이 당분야에 필요하다. 본 명세서는 PD-1 그리고 이를 발현시키는 세포들 및/또는 조직들을 표적으로 하는데 이용될 수 있는 시약들과 방법들을 제공함으로써, 이러한 요구를 해결한다.
도 1. A. 마우스 PD-1. B. 인간 PD-1.
도 2. HIV 특이적 CD8 T 세포들의 증식에 있어서 항-PD1 항체들의 기능적 효과를 평가하는 CFSE 분석.
도 3. 활성화된 CD4 T-세포들에서 세포 표면 PD-1에 대한 항-PD-1 항체들의 결합 반응 농도.
도 4. 항체 분류.
도 5a-f. 대조와 비교한 증식 (NEG 및 펩티드 8).
도 6a-b. 기능적 소모 회복 분석에서 상이한 에피토프들에 결합하는 항-PD-1 항체들에 의한 중재로 HIV 펩티드 특이적 CD8 T-세포 증식의 복원
도 7. 기능적 소모 회복 분석에서 상이한 PD-1 에피토프들에 결합하는 항-PD-1 항체들의 조합에 의한 중재로 HIV 펩티드 특이적 CD8 T-세포 증식의 강화된 복원
도 8. PD-1과 PD-L1의 상호작용을 차단하는 제 1 결합 물질과 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 차단하지 않는 제 2 결합 물질의 공조.
발명의 요약
본 명세서는 예정된 세포 사멸 1 (PD-1) (예컨데, 인간 PD-1)에 특이성을 갖는 결합 물질들 및 감염 (예컨데, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)에 의한), 암 및/또는 자가면역 상태를 치료 및/또는 예방 및/또는 개선하기 위하여 이를 이용하는 방법에 관계한다. PD-1과 상호작용하는 결합 물질들을 확인하는 기능적 분석들이 또한 제공된다. 결합 물질들, 이를 테면 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 차단하는 제 1 결합 물질과 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 차단하지 않는 제 2 결합 물질의 조합을 또한 제공하는데, 이들은 소모로부터 T 세포들을 구출하기 위하여 공조적으로 작용한다.
상세한 설명
본 명세서는 시험관내 및/또는 생체내에서 세포들의 표면에서 예정된 세포 사멸 (PD-1) (예컨데, 인간 PD-1) 단백질에 결합하는 결합 물질들 (예컨데, U.S. Pat. No. 5,698,520 (Honjo, et al.)의 서열 번호:1, 도 1A, 도 1B, 이는 본 명세서에서 이의 전문이 참고자료에 편입됨)에 관계한다. 상기 결합 물질들은 전형적으로 시험관내에서 단리된 PD-1 폴리펩티드 (예컨데, 인간 PD-1) 및/또는 이의 단편들 및/또는 이의 유도체들에 또한 결합할 수 있다. PD-1을 발현하는 세포들의 존재와 연합된 하나 또는 그 이상의 질환을 진단, 치료, 예방 및/또는 개선시키기 위하여 이러한 결합 물질을 이용하는 방법들을 또한 제공한다. 예를 들면, 상기 결합 물질들은 PD-1의 에피토프와 반응하거나 및/또는 결합할 수 있는 항체들 (예컨데, 단클론 항체들)일 수 있다. 본 명세서에서 설명된 ＂결합 물질들＂은 예로써, PD-1의 항진제 또는 길항제를 포함할 수 있다. 항진제 결합 물질은 T-세포 기능 및/또는 PD-1의 발현을 회복시킬 수 없는 것들이다. 항진제 PD-1 결합 물질은 자가면역 질환들 및 PD-1 발현시키는 세포들이 질환 진행에 관련된 기타 질환의 치료에 유용할 수 있다. 대조적으로, 길항제 결합 물질은 T-세포 기능 및/또는 PD-1의 발현을 회복시킬 수 없는 것들이다. 예를 들면, PD-1 길항제 결합 물질은 HIV 감염 및 다양한 종양에서 발생하는 것으로 알려진 기능적 소모로부터 PD-1 발현시키는 T-세포들의 기능을 회복시킬 수 있을 것이다. T 세포 기능의 복원은 예를 들면, 증식, 사이토킨 생산, 세포독성 활성 또는 이러한 세포들의 다른 특징들을 측정함으로써 결정될 수 있다. 본 명세서에서 설명된 상기 결합 물질들의 또다른 용도는 복제 컴피턴트 HIV (예컨데, 잠재적 및/또는 복제 상태에서)가 포함된 HIV-감염된 CD4 T-세포 집단의 선택적 표적 및 제거에 있다. 이러한 PD-1 발현시키는 PD-1을 발현시키는 세포들은 복제 컴피턴트 HIV의 주요 세포 저장소 역할을 하는 것으로 알려져있다. 이들 CD4 T-세포 집단의 제거를 위한 효과적인 기전은 본 명세서에서 설명된 상기 결합 물질들 (예컨데, 단일- 및/또는 이중-특이적 PD-1 항체들)을 이용한 항체-의존적 세포의 세포독성 (ADCC)이다. 일부 구체예들에 있어서, 예를 들면, 상이한 특이성 (예컨데, 상이한 에피토프를 인지하는) 하나 또는 그 이상의 PD-1 길항 결합 물질들이 복합되어 이들 세포들에서 PD-1에 의해 야기되는 기능적 소모로부터 항원-특이적 CD8 T-세포들의 구출을 유도할 수 있다 (예컨데, 증식, 사이토킨 생산 및/또는 세포독성 활성의 복원 또는 개선). 일부 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 설명된 결합 물질들은 PD-1 발현시키는 세포들의 선택적 제거 및/또는 억제를 제공할 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 설명된 PD-1 항진제 결합 물질들은 예를 들면, 감염성 질환 (예컨데, HIV), 암, 및/또는 구체적으로, 자가면역 상태를 치료하기 위하여 PD-1 발현시키는 세포들을 억제 및/또는 제거하는데 이용될 수 있다. 다른 구체예들, 용도 및 이와 유사한 것들은 하기에서 설명된다.
상기 결합 물질들은 항체들, 이를 테면 표 1 (및/또는 하나 또는 그 이상의 단편들 및/또는 이의 유도체들)에서 나타낸 아미노산 서열중 임의의 하나 또는 그 이상을 포함하는 단클론 항체들일 수 있다. 본 명세서는 PD-1을 발현시키는 세포들을 단리, 식별 및/또는 표적하는 이러한 단클론 항체들의 용도를 또한 제공한다. 특정 구체예들에 있어서, 이들 단클론 항체들은 세포들의 표면상에 발현된 PD-1에 대항하여 반응성일 수 있다. 용어 ＂항체＂ 또는 ＂항체들＂은 정제안된 또는 부분적으로 정제된 형태 (예컨데, 하이브리도마 상청액, 복수, 다클론 항혈청) 또는 정제된 형태의 전체 또는 단편화된 항체들을 지칭한다. 상기 항체들은 예로써, 뮤린 (예컨데, 뮤린 하이브리도마 세포들에 의해 생산된)이 포함된 임의의 적합한 원천 또는 형태의 것일 수 있거나, 또는 인간화된 항체들, 키메라 항체들, 인간 항체들, 그리고 이와 유사한 것들로 발현된다. 예를 들면, 항체들은 예를 들면, 인간 (예컨데, IgG (IgG1, IgG2, IgG2a, Ig2b, IgG3, IgG4), IgM, IgA (IgA1 및 IgA2), IgD, 그리고 IgE), 개 (예컨데, IgGA, IgGB, IgGC, IgGD), 닭 (예컨데, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, IgY), 염소 (예컨데, IgG), 마우스 (예컨데, IgG, IgD, IgE, IgG, IgM), 및/또는 돼지 (예컨데, IgG, IgD, IgE, IgG, IgM), 렛 (예컨데, IgG, IgD, IgE, IgG, IgM) 항체들로부터 전체적으로 또는 부분적으로 유도될 수 있다. 다양한 항체들의 제조, 이용 및 보관 방법들은 당업자들에게 잘 알려져 있으며, 본 발명의 실행에 적합할 수 있다(예로써, Harlow, et al. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Harlow, et al. Using Antibodies: A Laboratory Manual, Portable Prot℃ol No. 1, 1998; Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)); Jones et al. Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al. Nature, 332:323-329 (1988); Presta (Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992); Verhoeyen et al. (Science, 239:1534-1536 (1988); Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991); Cole et al., Mon℃lonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991); Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995); 뿐만 아니라 U.S. Pat. Nos. 4,816,567; 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016 참고). 특정 응용에 있어서, 상기 항체들은 하이브리도마 상청액 또는 복수 안에 포함될 수 있고, 그 상태로 직접 이용되거나 또는 표준 기술을 이용하여 다음 농도에 따라 이용될 수 있다. 다른 응용에 있어서, 상기 항체들은 예로써, 염 분획화 및 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여, 또는 고형 지지물, 이를 테면 아가로스 비드에 공유적으로 결합된 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G, 및/또는 단백질 L 리간드를 이용한 친화력 크로마토그래피, 또는 이들 기술의 조합을 이용하여 추가 정제될 수 있다. 상기 항체들은 냉동 조제물 (예컨데, -20℃ 또는 -70℃), 동결건조된 형태, 또는 정상적인 냉장 상태 (예컨데, 4℃)가 포함된 임의의 적합한 형태로 보관될 수 있다. 예를 들면, 액체 형태로 저장될 때, 적합한 완충액, 이를 테면 Tris-완충된 염수 (TBS) 또는 인산염 완충된 염수 (PBS)를 이용하는 것이 바람직하다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 결합 물질은 주사가능한 조제물, 이를 테면 비-독성 장관외적으로 수용가능한 희석제 또는 용매에 현탁액으로 조제될 수 있다. 이용될 수 있는 적합한 비이클 및 용매는 그중에서도 물, Ringer 용액, 및 등장성 염화나트륨 용액, TBS 및/또는 PBS를 포함한다. 이러한 조제물들은 시험관내 또는 생체내 사용에 적합하고, 당업계에 공지된 바와 같이 조제될 수 있고, 정확한 조제물은 특정 용도에 따라 달라질 수 있다.
그러나, 설명된 상기 결합 물질들은 임의의 방식으로 항체들에 국한되지 않는다. 예로써, 상기 결합 물질은 유사한 결합 성질을 가지는 임의의 화합물 (예컨데, 모방체)일 수 있다. 예로써, 예시적인 결합 물질은 PD-1에 결합하거나 및/또는 이에 대한 특이성을 가지는 결합 물질 (예컨데, 단클론 항체)과 경쟁하는 것일 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 모방체는 이와 비교되는 상기 결합 물질로써 (예컨데, 단클론 항체) 결합 분석에서 실질적으로 동일한 친화력을 나타낼 수 있다. 특정 결합 물질의 친화력은 실시예들에서 설명된 바와 같이, 활성화된 CD4 T 세포들상에 내생성 세포 표면 PD-1의 FACS 착색이 포함되나, 이에 국한되지 않은 임의의 적합한 분석에 의해 측정될 수 있다. 하나의 결합 물질은 또다른 것과 ＂실질적으로 동일한 친화력＂을 가진다고 말할 수 있는데, 이때 측정 (예컨데, nm)은 서로 약 1-20, 1-5, 5-10, 10-15, 또는 15-20 % 안에 있을 수 있다. 예시적인 모방체들은 예로써, PD-1에 특이적으로 결합하는 유기 화합물, 또는 아피바디(affibody) (Nygren, et al. FEBS J. 275 (11): 2668-76 (2008)), 아필린(affilin) (Ebersbach, et al. J. Mol. Biol. 372 (1): 172-85 (2007)), 아피틴(affitin) (Krehenbrink, et al. J. Mol. Biol. 383 (5): 1058-68 (2008)), 안티칼린(anticalin) (Skerra, A. FEBS J. 275 (11): 2677-83 (2008)), 아비머(avimer) (Silverman, et al. Nat. Biotechnol. 23 (12): 1556-61 (2005)), DARPin (Stumpp, et al. 약물 Discov. Today 13 (15-16): 695-701 (2008)), Fynomer (Grabulovski, et al. J. Biol. Chem. 282 (5): 3196-3204 (2007)), Kunitz 도메인 펩티드 (Nixon, et al. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 9 (2): 261-8 (2006)), 및/또는 모노바디(monobody) (Koide, et al. Methods Mol. Biol. 352: 95-109 (2007))를 포함할 수 있다. 다른 모방체들은 예로써, 항체의 유도체 (예로써, 단클론 항체 1E4, 1G10, 및/또는 1G1의 유도체) 이를 테면, 예로써, Fab, Fab2, Fab＇ 단일쇄 항체, Fv, 단일 도메인 항체, 단일-특이적 항체, 이중-특이적 항체, 삼중-특이적 항체, 다가(multi-valent) 항체, 키메라 항체, 개-인간 키메라 항체, 개-마우스 키메라 항체, 개의 Fc를 포함하는 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 개화된(caninized), CDR-접합된 항체, 상어 항체, 나노바디(nanobody), 카넬리드(canelid) 항체, 마이크로바디(microbody), 및/또는 인트라바디(intrabody), 또는 이의 유도체를 포함할 수 있다. 다른 결합 물질들 또한 본 명세서에서 제공되는데, 이는 당분야의 당업자들이 인지할 수 있을 것이다.
당업자에 공지된 임의의 방법을 이용하여 PD-1에 특이성(예컨데, 결합)을 갖는 결합 물질들을 만들 수 있다. 예를 들면, 단클론 항체들을 만들고, 단리하기 위하여, 동물, 이를 테면 마우스에게 하나 또는 그 이상의 PD-1 단백질 (예컨데, PD-1 Fc 융합 단백질 및/또는 PD-1 His tag 단백질)이 투여될 수 있다(예컨데, 면역주사). 활성화된 인간 T 림프구 상에 발현된 PD-1에 대하여 혈청 반응성을 나타내는(예를 들면, 유동세포분석 및/또는 현미경검사에 의해 측정됨) 동물은 그 다음 항-PD-1 하이브리도마 세포 계통의 생성을 위하여 선택될 수 있다. 이는 여러차례 반복될 수 있다. 예를 들면, 결합 물질 선택의 첫 번째 라운드의 주요 기준은 다음을 포함하나, 이에 국한되지 않을 수 있다: i) 유동세포분석에 의한 활성화된 인간 T 림프구 상에 PD-1의 착색 수준; (ii) 기존의 항-PD-1 항체들과 비교하였을 때, CDR VH 및 VL 서열들의 다양성; 그리고, (iii) 상이한 에피토프 on PD-1 상에 있는 상이한 에피토프에 결합하는 몇 가지 상업적으로 이용가능한 항-PD-1 항체들중 하나 또는 PD-L1으로 미리-결합된 PD-1 접합된 Luminex 비드를 이용한 경쟁 결합 연구에 의해 실행된 에피토프 메핑. 선택의 예시적인 제 1 또는 제 2 라운드는 또한 예를 들면, 친화력 결합 (이는 주요 기준이 아닌데, 그 이유는 항-PD-1 항체들의 자극 효능과 상관없을 수 있기 때문); 및/또는, 상기 결합 물질이 항진제 또는 길항제인지를 확인하기 위한 기능적 특징을 또한 포함할 수 있다.
본 명세서의 실시예 1에서 설명된 바와 같이, 예를 들면, 소모 기능적 회복 분석 (EFRA)이 이용될 수 있다. 이 분석에서, 테스트 결합 물질들은 면역 세포들, 이를 테면 T 세포들을 소모로부터 구출하는 능력에 대하여 분석될 수 있다. 이는 항원, 이를 테면 바이러스, 이를 테면 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)로부터 유도된 테스트 펩티드 존재하에, 이러한 세포들에게 증식을 복원시키는 결합 물질의 능력을 측정함으로써 결정될 수 있다. 증식은 대조, 이를 테면 테스트 펩티드 단독 또는 양성 대조 항-PD-1 항체, 이를 테면 MK-3475 (펨브로리주마브(pembrolizumab))와 비교하여 CFSE 분석에서 측정된다. 일부 구체예들에 있어서, 결합 물질은 증식을 복원시키는 결합물질이 결정되는데, 이때 비교는 펩티드 단독 대조 또는 이소타입 대조 마우스 IgG1 항체와 함께 펩티드와 비교하여 유의적인 차이 (이를 테면 P 값 <0.001)을 나타낸다. 이 분석을 이용하여 PD-1에 결합하는 다른 결합 물질들 (이를 테면 PD-L1 또는 PD-L2)과 경쟁하고 및/또는 면역 세포들의 기능적 복원을 유도하는 결합 물질들(이를 테면 항체들)을 식별할 수 있다. 실시예 1은 또한 Luminex-기반의 분석을 이용하여 표 2에서 열거된 에피토프 메핑 항체들의 두 가지 방법을 설명한다. 한 가지 생화학적 분석에서, PD-1 Fc 융합 단백질은 비드에 결합되며, 경쟁적 결합 연구는 표 2에서 설명된 항-PD-1 항체들과 상이한 상업적으로 이용가능한 항-PD-1 항체 2개중 하나 사이에서 실행된다. 실시예 1은 PD-1 상의 별개의 에피토프에 결합하는 4부류의 단클론 항체를 설명한다: 분류 1 (PD-1과 PD-L1의 상호작용을 차단하는 제 1 단클론 항체와 경쟁), 분류 2 (PD-1에 결합하지만, PD-1과 PD-L1의 상호작용을 차단하지 않는 제 2 단클론 항체와 경쟁), 분류 3 (제 1 및 제 2 단클론 항체 모두와 경쟁), 및 분류 4 (제 1 또는 제 2 항체중 어느 것과도 비-경쟁). 별도 분석에서 재조합 PD-1 단백질에 대한 결합의 경쟁은 표 2에 열거된 항-PD-1 항체들과 바이오티닐화된 PD-L1 재조합 단백질에 대해 평가되었다. PD-1 상에 상이한 에피토프에 결합하는 것으로 제안된 4개 결합 부류 모두로부터 EFRA에서 증식을 유도했던 항체들이 식별되었다. 유사하게, EFRA는 상기 PD-1 /PD-L1 상호작용과 경쟁적, 부분적으로 경쟁적 또는 비-경쟁적이며, HIV 특이적 CD8 T-세포에 특이적으로 증식 기능을 복원시키는 항-PD-1 항체들의 식별을 허용하였다.
결합 물질들의 조합, 이를 테면 실시예 2에서 설명된 바와 같은 것들이 또한 식별될 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 조합들은 오직 하나 또는 그 이상의 상기 결합 물질들을 이용하여 획득된 결과로부터 통계학적으로 유의적인 차이를 제공하는 것을 확인되며, 다른 것들을 이용해서는 차이를 제공하지 못한다. 일부 구체예들에 있어서, 면역 세포 기능을 복원시키는 공조 능력을 나타내는 조합들이 식별될 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 조합은 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 차단하는 제 1 결합 물질과 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 차단하지 않는 제 2 결합 물질을 포함할 수 있다. 제 1 및 제 2 결합 물질들은 상이한 엔터티, 이를 테면 2개 또는 그 이상의 상이한 단클론 항체들 또는 이의 유도체들일 수 있거나, 또는 동일한 엔터티에서 발견될 수 있는데, 이를 테면 이중-기능적 항체 (다중 결합 특이성을 포함하는 단일 항체 또는 이의 유도체)일 수 있다. 예를 들면, 예시적인 이중-기능적 항체는 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 차단하는 제 1 결합 영역과 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 차단하지 않는 제 2 결합 영역을 포함할 수 있다. 각 결합 물질의 다중 유형을 제공하는 조합들이 또한 고려된다. 예를 들면, 상기 조합은 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 차단하는 다중 유형의 결합 물질과 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 차단하지 않는 하나 또는 그 이상의 결합 물질을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 조합은 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 차단하는 하나 또는 그 이상의 1 결합 물질과 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 차단하지 않는 다중 결합 물질을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 조합은 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 차단하는 다중 결합 물질과 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 차단하지 않는 다중 결합 물질을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 설명된 이러한 조합들은 CTLA-4 및 이와 유사한 것들에 대항한 면역 세포 기능, 이를 테면 항체들에게 영향을 줄 수 있는 하나 또는 그 이상의 다른 물질들과 또한 복합될 수 있다. 당업자는 이러한 많은 조합들이 본 명세서에서 설명된 용도에 적합할 수 있음을 인지할 것이다.
상기 결합 물질이 항체인 경우, 이는 가변성 및/또는 이의 상보성 결정 영역 (＂CDRs＂)에 대응하는 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열에 대한 기준으로 식별될 수 있다. 상기 가변 영역/CDR 서열들은 하나 또는 그 이상의 다른 가변 영역/CDR 아미노산 서열들과 조합되어 이용될 수 있다. 상기 가변 영역/CDR 아미노산 서열들은 항체 분자의 하나 또는 그 이상의 유형의 불변 영역 폴리펩티드에 대안으로 및/또는 또한 인접해있을 수 있다. 예를 들면, 표 1A 및 1B에 나타낸 CDR 아미노산 서열은 동일한 또는 상이한 종 (예컨데, 인간, 염소, 렛, 양, 닭)의 임의의 항체분자 및/또는 상기 CDR 아미노산 서열이 유도되었던 항체의 아형의 불변영역에 인접 또는 연합될 수 있다. 예를 들면, 예시적인 결합 물질은 열거된 하이브리도마에 의해 생성된 단클론 항체이거나, 또는 이로부터 유도되거나 또는 관련될 수 있고, 및/또는 표 2에 나타낸 거의 동일한 친화력을 가지거나 및/또는 거의 동일한 증식 효과를 가지거나, 및/또는 동일한 결합 부류를 나타낼 수 있거나, 및/또는 서열 번호. 1-138 및/또는 표 1A 및 1B에 나타낸 아미노산 서열중 임의의 하나 또는 그 이상을 보유할 수 있다. 상기 결합 물질은 항체 중쇄 및/또는 경쇄를 포함할 수 있는데, 이들 각각은 하나 또는 그 이상의 불변 및/또는 가변 영역을 포함한다. 상기 가변 영역은 전형적으로 이 항체의 결합 특이성을 결정하는 하나 또는 그 이상의 CDRs을 포함한다. 상기 단클론 항체들은 이러한 가변 영역의 아미노산 서열들(예컨데, 이러한 뉴클레오티드 서열들에 의해 인코드될 수 있는)의 분석에 의해 또한 확인될 수 있다. 예를 들면, PD-1에 결합하는 결합 물질들의 중쇄 CDRs의 예시적인 아미노산 서열들은 서열 번호. 1-138, 및/또는 표 1A 및/또는 1B에 나타낸 임의의 다른 것들로 구성된 군에서 선택된 최소한 하나의 아미노산 서열을 포함하는 임의의 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 설명된 임의의 아미노산 서열들, 및/또는 이의 임의의 단편들 및/또는 유도체들은 표준 기술을 이용하여 하이브리드 및/또는 융합 결합 물질들을 형성하도록 임의의 다른 가변 영역 및/또는 CDR임의의 순서로 및/또는 조합에 의해 또한 복합되거나 및/또는 다른 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 안으로 또한 삽입될 수 있다. 본 명세서의 PD-1 (예컨데, 인간 PD-1) 결합 물질에서 발견될 수 있는 CDRs의 예시적인 조합들 (예컨데, 중쇄 및/또는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열들의 조합)은 예를 들면, 표 1A 및/또는 1B에 나타낸 구체예들을 포함할 수 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
또한, 서열 번호. 1-69중 임의의 것은 하나 또는 그 이상의 임의의 서열 번호. 70-138와 복합되어 결합 물질이 될 수 있다. 바람직한 구체예들에 있어서, 각 클론의 중쇄 CDRs은 이들의 해당 경쇄 CDRs와 복합되어 결합 물질이 될 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 결합 물질은 하기에서 나타낸 중쇄 CDRs와 경쇄 CDRs를 포함할 수 있다:
122F10 (서열 번호. 1, 24, 47, 70, 93, 및 116);
139D6 (서열 번호. 2, 25, 48, 71, 94, 및 117);
135D1 (서열 번호. 3, 26, 49, 72, 95, 및 118);
134D2 (서열 번호. 4, 27, 50, 73, 96, 및 119);
121G1 (서열 번호. 5, 28, 51, 74, 97, 및 120);
136B5 (서열 번호. 6, 29, 52, 75, 98, 및 121);
127C2 (서열 번호. 7, 30, 53, 76, 99, 및 122);
137F2 (서열 번호. 8, 31, 54, 77, 100, 및 123);
138H5 (서열 번호. 9, 32, 55, 78, 101, 및 124);
140A1 (서열 번호. 10, 33, 56, 79, 102, 및 125);
135H12 (서열 번호. 11, 34, 57, 80, 103, 및 126);
131D11 (서열 번호. 12, 35, 58, 81, 104, 및 127);
132F7 (서열 번호. 13, 36, 59, 82, 105, 및 128);
126E4 (서열 번호. 14, 37, 60, 83, 106, 및 129);
135G1 (서열 번호. 15, 38, 61, 84, 107, 및 130);
136E10 (서열 번호. 16, 39, 62, 85, 108, 및 131);
135C12 (서열 번호. 17, 40, 63, 86, 109, 및 132);
136F4 (서열 번호. 18, 41, 64, 87, 110, 및 133);
136B4 (서열 번호. 19, 42, 65, 88, 111, 및 134);
135E10 (서열 번호. 20, 43, 66, 89, 112, 및 135);
140G5 (서열 번호. 21, 44, 67, 90, 113, 및 136);
122H2 (서열 번호. 22, 45, 68, 91, 114, 및 137); 또는
139F11 (서열 번호. 23, 46, 69, 92, 115, 및 138).
다른 조합들 또한 당업자들이 확신하는 바와 같이 유용할 수 있다.
표 1A 및/또는 1B의 CDRs를 포함하는 결합 물질들, 또는 바로 앞의 단락의 것들을 포함하는 결합 물질들은 다음의 특징들을 또한 나타낼 수 있다:
Figure pct00003
*표 1에 열거된 항체들의 결합 친화력은 활성화된 CD4 T 세포에서 내생 세포 표면 PD-1의 FACS 착색에 의해 평가되었다.
** 결합 분류는 Luminex 분석 경쟁적 결합 연구에 의해 결정되었다. 결합 분류 1 mAb 클론은 EH12.2H7 클론 상업적 항체와 경쟁적이며, 분류 2 mAb 클론은 J116 클론 상업적 항체와 경쟁적이며, 분류 3 mAb 클론은 EH12.2H7 및 J116 항체 모두와 경쟁적이며, 그리고 분류 4 mAb 클론은 EH12.2H7 및 J116 항체 모두 존재하에서 결합한다.
*** 상기 PD-1/PD-L1 상호작용과 항체 경쟁은 제 2 Luminex 결합 분석에 의해 결정되었다. 이 분석에서, PD-1 Fc 융합 단백질 피복된 비드는 표 2의 항-PD-1 항체 부재 또는 20 nM 농도에서 존재하에 항온처리되었다. 상기 PD-1 /PD-L1 상호작용의 IC50에 대략적으로 등가인 고정된 농도 1.25 nM 바이오티닐화된 PD-L1은 상기 PD-1/항체 복합체와 함께 항온처리되었고, 그리고 PD-L1 결합은 피코에리틴 라벨된 스트렙타아비딘으로 형광에 의해 탐지되었다. 상기 PD-1 /항체 복합체에 대한 PD-L1 결합에 근거하여, 항체는 상기 PD-1/PD-L1 상호작용에 대하여 경쟁적, 부분적으로 경쟁적 또는 비-경쟁적으로 특정되었다.
≠ 증식성 효과는 CFSE 분석 (소모 기능적 회복 분석, ＂EFRA＂의 구체예)을 이용하여 평가된다. 만성적으로 감염된 HIV 대상으로부터 단리된 PBMCs는 항-PD-1 항체 존재 및 부재하에서 HIV 특이적 펩티드로 자극되었다. 항온처리 6일 후, HIV 특이적 CD8 T 세포들의 증식은 펩티드 단독 대조군과 비교하여 항-PD-1 처리된 시료에서 평가되었다.
NA=이용불가
결합 친화력은 당업자들이 이용할 수 있는 임의의 기술에 의해 결정될 수 있다. 표 2에서 제시된 결합 친화력 데이터는 3 내지 6 일동안 피토헤마글루티닌 (PHA)으로 자극된 CD4 T 세포에서 내생성 세포 표면 PD-1의 유동세포분석 착색에 의해 평가되었다. 결합 분류 또한 당업자들이 이용할 수 있는 임의의 기술에 의해 결정될 수 있다. 표 2에 제시된 결합 분류 데이터는 Luminex 분석 경쟁적 결합 연구에 의해 결정되었다. 표 2에서, 결합 분류 1 mAb 항체들은 EH12.2H7 클론 상업적 항체 (BioLegend, San Diego, CA (예컨데, Cat. No. 329905)에서 이용가능)와 경쟁적인 것으로 결정된 항체들이며; 분류 2 항체들은 J116 클론 상업적 항체 (Affymetrix eBioscience, San Diego, CA (예컨데, Cat. No. 16-9989-80)에서 이용가능)와 경쟁적인 것으로 결정된 항체들이며; 그리고 분류 3 항체들은 EH12.2H7 및 J116 항체들 모두와 경쟁적인 것으로 결정된 항체들이며; 그리고 분류 4 mAb 클론 항체들은 EH12.2H7 및 J116 항체들 모두 존재하에 PD-1에 결합하는 것으로 결정된 항체들이다.
증식성 효과는 당업자들이 이용할 수 있는 임의의 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상기에서 설명된 그리고 실시예 1에서 이용된 EFRA 시스템이 이용될 수 있다. 이러한 분석은 표 2에서 제시된 증식성 효과 데이터를 결정하는데 이용되었다. 간략하게 설명하자면, 카르복시플로레신 숙시니미딜 에스테르 (CFSE) 분석에서 말초 혈액 단핵 세포들 (PBMCs)은 만성적으로 감염된 HIV 대상으로부터 단리되고, 항-PD-1 항체 존재 및 부재하에 HIV-특이적 펩티드로 자극되었다. 대조 항-PD1 항체 (Merck 항체 MK-3475)는 또한 양성 대조로 테스트되었다. 항온처리 6-일 후, HIV 특이적 CD8 T 세포들의 증식은 펩티드 단독 대조군과 비교하여 항-PD-1 처리된 시료에서 평가되었고, 결과는 대조를 능가한 %로 (＂증식 효과＂)로 표현되었다.
일부 구체예들에 있어서, PD-1 결합 물질들, 이를 테면 항체들을 확인하고 특징화하는데 이용된 기술들이 복합되어, 이러한 결합 물질을 확인하고, 특징화하기 위한 시스템을 제공할 수 있다. 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 후보 결합 물질들, 이러한 하나 또는 그 이상의 단클론 항체들은 EFRA 또는 유사한 분석에 의해 분석되어 상기 후보 결합 물질이 면역 세포의 기능을 복원시키는 능력이 있는지를 결정할 수 있는데, 이는 예를 들면, 면역원성 펩티드 존재 하에 증식에 의해 측정된다. 일부 구체예들에 있어서, 이러한 유형의 분석은 추가 연구되는 후보 결합 물질들이 면역 세포 기능을 복원시킬 수 있는지를 확실하게 하기 위한 초기 스크린으로 이용될 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 이러한 유형의 분석들에 이어 면역 세포들, 이를 테면 활성화된 말초 혈액 단핵 세포들 (PBMCs)에 대한 결합 친화력을 결정하는 분석이 이어질 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 이 분석은 이를 테면, 형광 활성화된 세포 소팅 (FACS) 기술을 이용할 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 분석은 비-특이적 결합의 존재 또는 부재 및/또는 공지의 결합 시약들, 이를 테면 항-PD1 항체 (예컨데, Merck 항체 MK-3475, 또한 펨브로리주마브로도 공지됨)를 이용한 경쟁적 결합 연구를 포함할 수 있다. 이들 분석에 이어서 이를 테면 상기 표 1A 및/또는 1B에서 제공되는 후보 결합 물질의 CDRs의 서열화가 이어질 수 있다. 함께, 그 다음 EFRA, 친화력 결정, 에피토프 메핑 연구 및 본 명세서에서 설명된 CDR 확인은 후보 결합 물질이 확인될 수 있는 시스템을 제공한다.
표 1A 및/또는 1B의 임의의 아미노산 서열들 (및/또는 이의 임의의 하나 또는 그 이상의 단편들 및/또는 유도체들)은 당업자들이 바람직한 것으로 인지하는 임의의 다른 아미노산으로 대체될 수 있다. 예로써, 당업자는 특정 아미노산을 하기 표 3에서 나타낸 다른 아미노산으로 대체함으로써 보존 치환을 만들 수 있다. 선택된 특이적 아미노산 치환은 선택된 부위의 위치에 의존적일 수 있다. 이러한 보존 아미노산 치환은 고유의 아미노산 잔기를 비-고유의 잔기로 치환하는 것과 연관될 수 있는데, 이 위치에 있는 아미노산의 크기, 극성, 전하, 소수성 또는 친수성에 영향이 없거나 또는 거의 없어, PD-1 결합을 감소시키지 않는다.
Figure pct00004
일부 구체예들에 있어서, 본 명세서는 다중 특이성을 가진 결합 물질들을 제공하는데, PD-1 및 최소한 하나의 다른 2차 항원 (예컨데, 세포 표면 단백질)은 단일 결합 물질에 의해 결합될 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 2차 항원은 감염성 물질에 의해 감염된 세포들에 의해 발현되는 것일 수 있다. 예를 들면, 예시적인 2차 항원은 HIV Env 항원일 수 있다. 이러한 결합 물질들은 2차 항원에 결합할 수 있고 및/또는 감염성 물질을 중화시키는 작용을 할 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 이를 테면 이중-특이적 결합 물질은 PD-1 및 HIV 항원, 이를 테면 env 및/또는 예를 들면 또다른 항원에 대한 이중 특이성을 가진다. 상기 HIV 면역원은 본 명세서에서 설명된 임의의 아형 또는 임의의 다른 아형으로부터 유도될 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 이러한 결합 물질들은 다음을 포함할 수 있다: PD-1 항진제/Env 결합; PD-1 항진제 PD-1/Env 결합 및 중화; PD-1 길항제/Env 결합; 및/또는 PD-1 길항제/ PD-1/Env 결합 및 중화. 다양한 아형들이 유포되어있다면, HIV-1 아형 B 및/또는 C로부터 항원을 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 단일 조성물 안에 다중 HIV 아형 (예컨데, HIV-1 아형 B와 C, HIV-2 아형 A와 B, 또는 HIV-1 아형과 HIV-2 아형의 조합)으로부터 항원 특이성을 가지는 결합 물질을 포함하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 질환, 이를 테면 암을 치료하기 위하여, 다중 PD-1 특이성을 가진 결합 물질 (예컨데, 2개의 상이한 에피토프에 특이적인 이중-특이적 PD-1a/PD1b 길항제 PD-1 항체들) 및/또는 PD-1과 하나 또는 그 이상의 종양 항원에 모두 특이성을 가진 결합 물질들 (예컨데, 암-고환 (CT) 항원 (가령, MAGE, NY-ESO-1); 멜라닌세포 분화 항원 (가령, Melan A/MART-1, 티로시나제, gp100); 돌연변이성 항원 (가령, MUM-1, p53, CDK-4); 과다발현된 ＇자가(self)´ 항원 (가령, HER-2/neu, p53); 및/또는 바이러스 항원 (가령, HPV, EBV))에 특이성을 가진 결합 물질이 유익할 수 있다. 상기 결합 물질들 (예컨데, 단클론 항체들)은 일반적으로 상기에서 설명된 것과 같이 생성될 수 있다. 이러한 결합 물질들의 특이성은 당업자들에게 광범위하게 이용되는 기술들을 이용하여 단일 결합 물질 안에 재결합될 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 다중 단일 특이성 결합 물질들은 효과적인 다중 특이성 시약을 제공하기 위하여 복합되고 이용(예컨데, 투여)될 수 있다.
일부 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 설명된 결합 물질들은 PD-1 (및/또는 다중 특이성을 갖는 결합 물질의 경우 또다른 항원)을 발현시키는 세포 집단을 표적으로 하고, 이의 기능을 억제하거나 및/또는 이 집단을 제거하기 위하여 활성 물질들에 접합될 수 있다. 예를 들면, 복제 컴피턴트 HIV가 포함된 CD4+ T-세포 집단이 결합 물질/약물 접합체들 (예컨데, 항체-약물 접합체들 (ADC))을 이용하여 표적이 되고, 제거할 수 있다. 단일- 및/또는 이중-특이적 후보 결합 물질들은 하나 또는 그 이상의 유형의 약물들 (예컨데, DNA 손상 약물들, 미소관 표적 약물들)과 접합될 수 있다. 본 명세서에서 설명된 결합 물질들 및/또는 이의 유도체들은 시험관내 및/또는 생체내 사용을 위하여 기능적 물질에 결합 및/또는 접합될 수 있다. 예를 들면, 상기 결합 물질은 기능적 모이어티, 이를 테면 세포독성 약물들 또는 독소, 및/또는 이의 활성 단편들, 이를 테면 디프테리아 A 쇄, 엑소톡신 A 쇄, 리친 A 쇄, 아브린(abrin) A 쇄, 쿠르친(curcin), 크로틴(crotin), 페노마이신(phenomycin), 에노마이신(enomycin)에 결합 및/또는 접합될 수 있다. 적합한 기능적 모이어티는 방사능화학물질을 또한 포함할 수 있다. 결합 물질들, 이를 테면 항체들은 당분야의 표준 기술을 이용하여 하나 또는 그 이상의 기능적 물질에 결합 및/또는 접합될 수 있다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 결합 물질들은 다른 물질, 이를 테면 항-감염성 물질들 (예컨데, 항생제들, 항-바이러스 의약품)과 함께 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에서 설명된 결합 물질들은 단클론 항체들 및/또는 다른 시약, 이를 테면 Nivolumab (MDX-1106, BMS-936558으로도 알려짐 (Topalian, et al. N. Eng. J. Med. 2012; 366(26): 2443-2454), MDX-1106, ONO-4538, 전장 인간 IgG4 mAb (Bristol-Myers Squibb), Lambrolizumab (MK-3475 및 SCH 900475로도 알려짐, Merck으로부터 이용가능한 인간화된 IgG4 단클론 항체), Pidilizumab (CureTech으로부터 이용가능한 인간화된 IgG1 단클론 항체 ), AMP-224 (GlaxoSmithKline/Amplimmune로부터 이용가능한 B7-DC/IgG1 융합 단백질), 및/또는 U.S. Pat. No. 8,354,509B2 (Carven, et al), U.S. Pat. No. 8,008,449B2 (Korman, et al), WO 2012/135408A1 (Manoj, et al.), US 2010/026617 (Carven, et al.), WO 2011/110621A1 (Tyson, et al), U.S. Pat. No. 7,488,802B2 (Collins, et al.), WO 2010/029435A1 (Simon, et al.), WO 2010/089411A2 (Olive, D.), ,WO 2012/145493A1 (Langermann, et al.), WO 2013/0435569A1 (Rolland, et al.), WO 2011/159877A2 (Kuchroo, et al.), U.S. Pat. No. 7,563,869B2 (Ono Pharm.), U.S. Pat. No. 7,858,746B2 (Honjo, et al.), U.S. Pat. No. 8,728,474B2 (Ono Pharm.), U.S. Pat. No. 9,067,999 (Ono Pharm.), 및/또는 U.S. Pat. No. 9,067,999중 임의의 것에서 설명된 항체 또는 다른 시약 또는 방법과 복합될 수 있으며, 이들 각각은 본 명세서 안에 이의 전문이 편입된다.
상기에서 언급한 바와 같이, 본 명세서에서 설명된 PD-1 결합 물질들 (예컨데, PD-1 길항제)은 HIV에 의한 감염의 증상을 치료 및/또는 예방 및/또는 개선시키는데 이용될 수 있다. 당분야에 공지된 바와 같이, HIV 분리주(isolates)는 별개의 유전적 아평으로 현재 분류된다. HIV-1은 최소한 10개의 아형 (A1, A2, A3, A4, B, C, D, E, F1, F2, G, H, J 및 K) (Taylor et al, NEJM, 359(18):1965-1966 (2008))을 포함하는 것으로 알려져있다. HIV-2는 최소한 5개의 아형 (A, B, C, D, 및 E)을 포함하는 것으로 알려져있다. 아형 B는 전세계적으로 동성애자 남성 및 정맥 약물 사용자들에서 만연되는 HIV와 관련된다. 대부분의 HIV-1 면역원, 실험실 개작된 분리주, 시약 및 메핑된 에피토프는 아형 B에 속한다. 사하라 이남 아프리카, 인도 및 중국 그리고 새로운 HIV 감염 발생이 높은 지역에서 HIV-1 아형 B은 소수의 감염만을 설명하며, 그리고 아형 HIV-1 C는 가장 흔한 감염 아형으로 보인다. 이들 유형의 임의의 분리주는 본 명세서에서 설명된 결합 물질들에 의해 해결될 수 있다. 하나 또는 그 이상의 결합 물질들은 HIV를 방지, 치료 및/또는 개선시키는데 이용되는 하나 또는 그 이상의 물질들, 이를 테면 예로써, 프로테아제 억제제, HIV 진입 억제제, 역전사효소 억제제, 및/또는 항-레트로바이러스 뉴클레오시드 유사체와 함께 또는 병합하여 투여될 수 있다. 적합한 화합물들은 예로써, Agenerase (암프레나비르(amprenavir)), Combivir (레트로비르(Retrovir)/에피비르(Epivir)), Crixivan (인디나비르(indinavir)), Emtriva (엠프리씨타빈(emtricitabine)), Epivir (3tc/라미부딘(lamivudine)), Epzicom, Fortovase/Invirase (사퀴나비르(saquinavir)), Fuzeon (엔푸비르티드(enfuvirtide)), Hivid (ddc/칼씨타빈(zalcitabine)), Kaletra (로피나비르(lopinavir)), Lexiva (포함프레나비르(Fosamprenavir)), Norvir (리토나비르(ritonavir)), Rescriptor (델라비르딘(delavirdine)), Retrovir/AZT (지도부딘(zidovudine)), Reyatax (아타카나비르(atazanavir), BMS-232632), Sustiva (에파비렌스(efavirenz)), Trizivir (아바카비르(abacavir)/지도부틴/라미부딘), Truvada (엠프리씨타민/테노포비르(Tenofovir) DF), Videx (ddI/디다노신(didanosine)), Videx EC (ddI, 디다노신), Viracept (네비라핀(nevirapine)), Viread (테로포비르 디소프록실 푸마레이트(tenofovir disoproxil fumarate)), Zerit (d4T/스타부딘(stavudine)), 그리고 Ziagen (아바카비르(abacavir))를 포함하여, 이들이 이용될 수 있다. 다른 적합한 물질이 당업자들에게 공지되어 있으며, 본 명세서에 설명된 바의 용도에 적합할 수 있다. 이러한 물질들은 본 명세서에서 설명된 결합 물질들의 전, 투여 동안 또는 투여 후 및/또는 본 명세서에서 설명된 방법의 사용전, 사용 동안 또는 사용 후 이용될 수 있다.
상기에서 언급한 바와 같이, 본 명세서에서 설명된 PD-1 결합 물질들 (예컨데, PD-1 길항제)은 암에 의한 감염의 증상을 치료 및/또는 예방 및/또는 개선시키는데 이용될 수 있다. 예시적인 암은 예를 들면, 유방, 혈액, 결장, 위, 직장, 골격 조직, 피부 (예컨데, 흑색종) 뇌, 폐, 방광, 신장, 난소, 및/또는 간의 암을 포함할 수 있다. 하나 또는 그 이상의 상기 결합 물질들은 암을 예방, 치료 및/또는 개선시키는데 이용되는 하나 또는 그 이상의 물질, 이를 테면 예로써, 알킬화 물질 (예컨데, 임의의 질소 무스타드, 니트로소우레아, 테트라진, 아지리딘, 시스플라틴 및/또는 이의 유도체), 항-대사물질 (예컨데, 임의의 메토트렉세이트, 페메트렉세드, 플루오르피리미딘 및/또는 이의 유도체), 항-미소관 물질 (예컨데, 빈카 알킬로이드, 탁산, 포도필라톡신 및/또는 이의 유도체), 토포이소메라제 I 및/또는 II 억제제 (예컨데, 캄포토테신, 이리노테칸, 토포테칸, 에토포시드, 독소루비친, 미토산트론, 테니포시드, 노보비오친, 메르바론, 아클루비친 및/또는 이의 유도체) 및/또는 세포독성 항생제 (예컨데, 임의의 안트라사이클린, 악티노마이신, 블레오마이신, 플리카마이신, 그리고 미토마이신 및/또는 이의 유도체)과 함께 복합되거나, 및/또는 함께 또는 병용하여 투여될 수 있다. 상기 하나 또는 그 이상의 결합 물질들은 또한 또는 대안으로 암을 치료, 예방 및/또는 개선시키기 위하여 당분야의 당업자들이 이용가능한 하나 또는 그 이상의 다른 결합 물질들, 이를 테면, 예로써, 니보루마브(Nivolumab), 람브로리주마브(Lambrolizumab), 피디리주마브(Pidilizumab) 및/또는 다른 유사한 물질들 및/또는 이의 유도체들과 복합될 수 있다. 다른 적합한 물질이 당업자들에게 공지되어 있으며, 본 명세서에 설명된 바의 용도에 적합할 수 있다. 이러한 물질들은 본 명세서에서 설명된 결합 물질들의 전, 투여 동안 또는 투여 후 및/또는 본 명세서에서 설명된 방법의 사용전, 사용 동안 또는 사용 후 이용될 수 있다.
상기에서 언급한 바와 같이, 본 명세서에서 설명된 PD-1 결합 물질들 (예컨데, PD-1 항진제)은 자가면역에 의한 감염의 증상을 치료 및/또는 예방 및/또는 개선시키는데 이용될 수 있다. 예시적인 자가면역 상태는 예를 들면, PD-1가 자가-내성을 유지하는데 관련된, 및/또는 염증성 T 세포들이 관련된 (예컨데, 자가활성 또는 자가 항원-특이적 T 세포들)것들, 이를 테면, 예를 들면, 전신 홍반성 낭창 (SLE), 유형 I 당뇨병, 류마토이드 관절염, 사구체신염, 및 다발성 경화증을 포함할 수 있다. 이러한 PD-1 결합 물질들은 다른 물질들, 이를 테면 항-CTLA-4 물질들 (예컨데, 이피리무마브(ipilimumab))와 또한 복합될 수 있다. 하나 또는 그 이상의 상기 결합 물질들은 자가면역을 예방, 치료 및/또는 개선시키는데 이용되는 하나 또는 그 이상의 물질들, 이를 테면, 예로써, 글루코코르티코이드, 세포정균제 (예컨데, 알킬화 물질, 항-대사물질, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 멀캅토퓨린, 세포독성 항생제들 (예컨데, 닥티노마이신, 안트라사이클린, 미토마이신 C, 블레오마이신, 미트라마이신), 항체들 (예컨데, Atgam, Thymoglobuline, Simulect, Zenapax), 이뮤노필린(immunophilin)에 작용하는 약물들(예컨데, 씨클로스포린, 타크로리무스, 시로리무스), 인터페론, 오피오이드, TNF-결합 물질들 (예컨데, Remicade, Enbrel, Humira), 미코페놀레이트, 핑고리모드(fingolimod), 미리오친(myri℃in), 및/또는 이의 유도체들과 복합되거나, 또는 이들과 함께 또는 병영하여 투여될 수 있다. 다른 적합한 물질이 당업자들에게 공지되어 있으며, 본 명세서에 설명된 바의 용도에 적합할 수 있다. 이러한 물질들은 본 명세서에서 설명된 결합 물질들의 전, 투여 동안 또는 투여 후 및/또는 본 명세서에서 설명된 방법의 사용전, 사용 동안 또는 사용 후 이용될 수 있다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 결합 물질들은 하나 또는 그 이상의 탐지가능한 라벨에 인접하거나 및/또는 접합될 수 있다. 예를 들면, 적합한 탐지가능한 라벨은 예를 들면, 플루오레신 (예컨데, DyLight, Cy3, Cy5, FITC, HiLyte Fluor 555, HiLyte Fluor 647; 5-카르복시-2,7-디클로로플루오레신; 5-카르복시플루오레신 (5-FAM); 5-HAT (히드록시 트립타민); 5-히드록시 트립타민 (HAT); 6-JOE; 6-카르복시플루오레신 (6-FAM); FITC; 6-카르복시-1,4-디클로로-2＇,7＇-디클로로플루오레신 (TET); 6-카르복시-1,4-디클로로-2＇,4＇, 5＇, 7＇-테트라클로로플루오레신 (HEX); 6-카르복시-4＇,5＇-디클로로-2＇, 7＇-di메톡시플루오레신 (JOE); Alexa fluors (예컨데, 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 635, 647, 660, 680, 700, 750); BODIPY 형광단 (예컨데, 492/515, 493/503, 500/510, 505/515, 530/550, 542/563, 558/568, 564/570, 576/589, 581/591, 630/650-X, 650/665-X, 665/676, FL, FL ATP, FI-Ceramide, R6G SE, TMR, TMR-X conjugate, TMR-X, SE, TR, TR ATP, TR-X SE)), 로다민(예컨데, 110, 123, B, B 200, BB, BG, B extra, 5-카르복시테트라메틸로다민 (5-TAMRA), 5 GLD, 6-카르복시로다민 6G, Lissamine, Lissamine 로다민 B, Phallicidine, Phalloidine, Red, Rhod-2, ROX (6-카르복시-X-로다민), 5-ROX (카르복시-X-로다민), 술포로다민 B can C, 술포로다민 G Extra, TAMRA (6-카르복시테트라메틸로다민), 테트라메틸로다민 (TRITC), WT), Texas Red, 및/또는 Texas Red-X를 포함할 수 있다. 당분야에 공지된 다른 탐지가능한 라벨 또한 사용에 적합할 수 있다. 결합 물질들, 이를 테면 항체들은 당분야의 표준 기술을 이용하여 하나 또는 그 이상의 탐지가능한 라벨에 결합 및/또는 접합될 수 있다.
특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 설명된 하나 또는 그 이상의 결합 물질들을 인코드하는 핵산분자는 하나 또는 그 이상의 발현 벡터안에 삽입될 수 있는데, 하기에서 더욱 상세하게 논의된다. 이러한 구체예들에 있어서, 상기 결합 물질은 이 아미노산 서열에 대응하는 뉴클레오티드에 의해 인코드될 수 있다. 다양한 아미노산(AA)를 인코드하는 뉴클레오티드의 특정 조합 (코돈)은 당분야에 공지되어 있으며, 이들은 당업자에 의해 이용되는 다양한 문헌에서 설명된다 (예컨데, Lewin, B. Genes V, Oxford University Press, 1994). 전술한 결합 물질들의 아미노산을 인코드하는 뉴클레오티드 서열들은 예로써 표 4를 참고하면 확인할 수 있다. 핵산 변이체는 상기 결합 물질을 인코드하는 뉴클레오티드의 임의의 조합을 이용할 수 있다.
Figure pct00005
당업자는 특정 아미노산 사열을 인코드하는 뉴클레오티드 서열은 표 4에서 제시된 아미노산 서열 및 정보로부터 용이하게 유도될 수 있음을 인지한다. 예를 들면, 표 4에서 제시된 아미노산 서열 DDFLH (서열 번호.: 1) 및 정보로부터 이 아미노산 서열은 뉴클레오티드 서열 GAT GAT TTT TTA CAT (서열 번호.:139)에 의해 인코드될 수 있음을 추론할 수 있다. 당업자는 서열 번호. 2-138을 인코드하는 뉴클레오티드 서열들을 동일한 방식으로 추론될 수 있으며, 이러한 뉴클레오티드 서열들도 본 명세서에서 고려된다는 것을 인지할 것이다. 상기 결합 물질들이 항체들인 경우, 이의 가변 영역을 인코드하는 뉴클레오티드 서열들은 특정 조제물 (예컨데, 인간화된 항체들)을 만들기 위하여 발현 벡터 안에 클론된 동일한 것을 발현시키는 파아지 및/또는 하이브리도마 세포들로부터 또한 단리될 수 있다. 이러한 조제물들을 만드는 방법은 당분야에 공지되어 있다.
관심 대상의 가변 영역 (예컨데, CDRs)의 아미노산 서열을 결정하기 위하여, PD-1 항원/면역원으로 면역접종된 마우스로부터 하이브리도마 세포들은 본 명세서에 설명된 기능적 분석 및 당분야의 당업자들이 이용가능한 클로닝 기술을 이용하여 선별될 수 있다. 예를 들면, 선택된 하이브리도마의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 인코드하는 핵산을 단리하고 서열화하기 위하여, 총 RNA는 제조업자의 프로토콜에 따라 TRIzol 시약을 이용하여 새로운 하이브리도마 세포들로부터 추출될 수 있다. 　 cDNA는 표준 기술(예컨데, PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit의 기술 메뉴얼에 따라)을 이용하여 이소타입-특이적 항-센스 프라이머 또는 범용 프라이머를 이용하여 RNA로부터 합성될 수 있다 . 그 다음, 선택된 하이브리도마에 의해 생산되는 항체의 가변 영역(중쇄 및 경쇄)을 인코드하는 핵산을 증폭하기 위하여 중합효소 쇄 반응 (PCR)이 실행될 수 있고, 이는 별도로 표준 클로닝 벡터 안으로 클론되고, 서열화될 수 있다. 콜로니 PCR 스크리닝이 실행되어, 정확한 크기의 삽입물을 가진 클론이 식별될 수 있다. 선호적으로, 정확한 크기의 삽입물을 가진 5개 미만의 단일 콜로니가 각 항체 가변 영역에 대하여 서열화된다. 그 다음, 항-PD-1 항체들을 발현 및 정제를 위하여 표준 프로토콜이 이용될 수 있다. 　 예를 들면, 하이브리도마 클론은 혈청-없는 배지에서 성장되고, 세포 배지는 원심분리되고, 그 다음 여과된다. 　 그 다음, 이 항체가 포함된 여과된 상청액은 친화력 컬럼 (예컨데, 단백질 A) 컬럼 상에 로딩되고, 세척된 후, 적절한 완충액 (예컨데, Pierce IgG 용리 완충액)으로 용리될 수 있다.　 용리된 분획은 그 다음 집합되고, PBS, pH 7.2로 완충액-교환될 수 있다. 그 다음, 정제된 항체는 분자량, 수율 및 순도에 대한 표준 프로토콜을 이용하여 SDS-PAGE 및 Western 블랏에 의해 분석될 수 있다.　 그 다음 크기 압출 크로마토그래피 HPLC는 단백질 응집물이 소량 존재하는 높은 항체 순도 (일반적으로 >90%)를 확인하기 위하여 생물물리적 특징을 위하여 적절한 컬럼 (예컨데, TSK GEL-G3000 SWXL 컬럼 (Tosoh)) 상에서 실행될 수 있다. 이 과정들은 선택된 하이브리도마 세포들로부터 서열 번호. 1-138을 인코드하는 핵산들을 단리하고 서열화하는데 이용되었다. 이런 목적을 위하여 이들 기술, 이의 변이, 및/또는 다른 것들 또한 이용될 수 있으며, 이는 당업자들이 인지할 수 있을 것이다.
하나 또는 그 이상의 PD-1 결합 물질들을 인코드하는 핵산 분자는 바이러스 및/또는 비-바이러스 벡터 안에 포함될 수 있다. 한 구체예에서, DNA 벡터를 이용하여 하나 또는 그 이상의 PD-1 결합 물질이 인코드된 핵산을 환자에게 운반할 수 있다. 이렇게 함에 있어서, 이들 기전의 효과를 개선시키기 위하여 다양한 전략이 이용될 수 있는데, 예로써, 자가-복제 바이러스 리플리콘의 이용 (Caley, et al. 1999. Vaccine, 17: 3124-2135; Dubensky, et al. 2000. Mol . Med . 6: 723-732; Leitner, et al. 2000. Cancer Res. 60: 51-55), 코돈 최적화 (Liu, et al. 2000. Mol . Ther ., 1: 497-500; Dubensky, supra; Huang, et al. 2001. J. Virol . 75: 4947-4951), 생체내 전기천공 (Widera, et al. 2000. J. Immunol . 164: 4635-3640), 공동-자극 분자, 사이토킨 및/또는 케모킨이 인코드된 핵산의 통합 (Xiang, et al. 1995. Immunity, 2: 129-135; Kim, et al. 1998. Eur . J. Immunol ., 28: 1089-1103; Iwasaki, et al. 1997. J. Immunol . 158: 4591-3601; Sheerlinck, et al. 2001. Vaccine, 19: 2647-2656), 자극 모티프, 이를 테면 CpG의 통합 (Gurunathan, supra; Leitner, supra), 식작용 또는 유비퀴틴-프로세싱 경로를 표적으로 하는 서열들의 통합 (Thomson, et al. 1998. J. Virol. 72: 2246-2252; Velders, et al. 2001. J. Immunol . 166: 5366-5373), 프라임-부스트 요법(prime-boost regimens) (Gurunathan, supra; Sullivan, et al. 2000. Nature, 408: 605-609; Hanke, et al. 1998. Vaccine, 16: 439-445; Amara, et al. 2001. Science, 292: 69-74), 프로테아좀-민감성 절단 부위의 통합, 그리고 점막 운반 벡터, 이를 테면 살모넬라(Salmonella)의 이용 (Darji, et al. 1997. Cell, 91: 765-775; Woo, et al. 2001. Vaccine, 19: 2945-2954)을 포함한다. 다른 방법들이 또한 당분야에 공지되어 있으며, 이들중 일부는 하기에서 설명된다. 핵산을 숙주로 도입하는데 성동적으로 이용된 다양한 바이러스 벡터에는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연합된 바이러스 (AAV), 헤르페스 바이러스, 및 폭스바이러스가 포함된다. 이들 벡터는 당업자에게 광범위하게 이용되는 표준 재조합 기술을 이용하여 구축될 수 있다. 이러한 기술은 흔한 분자 생물학 자료, 이를 테면 Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene Expression Technology (Methods in Enzymology, Vol. 185, edited by D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, CA), 및 PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, ca)에서 찾아볼 수 있다. ＂비-바이러스＂ 플라스미드 벡터가 특정 구체예들에 있어서 적합할 수 있다. 바람직한 플라스미드 벡터는 박테리아, 곤충, 및/또는 포유동물 숙주 세포들과 양립된다. 이러한 벡터에는 예로써, PCR-ii, PCR3, 및 pcDNA3.1 (Invitrogen, San Diego, CA), pBSii (Stratagene, La Jolla, CA), pet15 (Novagen, Madison, WI), pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), pEGFp-n2 (Clontech, Palo Alto, CA), pETl (Bluebacii, Invitrogen), pDSR-alpha (PCT pub. No. WO 90/14363) 및 pFASTBACdual (Gibco-BRL, Grand island, NY) 뿐만 아니라 Bluescript® 플라스미드 유도체들 (높은 복사체 수 COLe1-기반의 파아지미드, Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), TAQ-증폭된 PCR 산물의 증폭을 위하여 기획된 PCR 클로닝 플라스미드(예컨데, TOPO™ TA 클로닝® 키트, PCR2.1® 플라스미드 유도체들, Invitrogen, Carlsbad, CA)를 포함한다. 박테리아 벡터가 또한 이용될 수 있다. 이들 벡터에는 예로써, 쉬겔라(Shigella ), 살모넬라(Salmonella), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae ), 락토바실러스(Lactobacillus), 칼멧과 게링의 바실러스(Bacille Calmette Guerin (BCG)), 그리고 스트렙토코커스(Streptococcus) (예로써, WO 88/6626; WO 90/0594; WO 91/13157; WO 92/1796; 및 WO 92/21376 참고)가 포함된다. 많은 다른 비-바이러스 플라스미드 발현 벡터 및 시스템들이 당분야에 공지되어 있고, 이용될 수 있다. 다른 전달 기술 또한 적합할 수 있는데, 예로써, DNA-리간드 복합체, 아데노바이러스-리간드-DNA 복합체, DNA의 직접 주사, CaPO4 침전, 유전자 총 기술, 전기천공, 그리고 콜로이드성 분산 시스템이 포함된다. 콜로이드성 분산 시스템은 수중유 에멀션, 미셀, 혼합된 미셀, 그리고 리포좀이 포함된 거대분자 복합체, 나노-캡슐, 미세구, 비드, 그리고 지질-기반 시스템을 포함한다. 바람직한 콜로이드 시스템은 리포좀으로, 이는 생체내 그리고 시험관내 전달 비이클로 유용한 인공적인 막 소포이다. RNA, DNA 및 고유의 비리온이 수성 내부에 포집될 수 있고, 생물학적 활성 상태로 세포로 전달될 수 있다 (Fraley, R., et al., 1981, Trends Biochem . Sci., 6: 77). 리포좀의 조성물은 통상 포스포리피드, 특히 고-상 전이-온도 포스포리피드의 조합, 통상 스테로이드, 구체적으로 콜레스테롤과의 조합이다. 다른 포스포리피드 또는 다른 리피드가 또한 이용될 수 있다. 리포좀의 물리적 성질은 pH, 이온 강도, 이가 양이온의 존재에 따라 달라진다. 리포좀 생산에 유용한 리피드의 예로는 포스파딜 화합물들, 이를 테면 포스파딜글리세롤, 포스파딜콜린, 포스파딜세린, 포스파딜에탄올아민, 스핑고리피드, 세레브로시드, 그리고 강글리오시드가 포함된다. 디아실포스파딜글리세롤이 특히 유용한데, 리피드 모이어티는 14-18개의 탄소 원자를 포함하며, 구체적으로 16-18개의 탄소 원자를 포함하고, 그리고 포화된다. 예시적인 포스포리피드는 난 포스파딜콜린, 디팔리토일포스파딜콜린 및 디스테아로일포스파딜콜린을 포함한다.
벡터를 포함하는 배양된 세포가 또한 제공된다. 상기 배양된 세포는 벡터 또는 세포의 후손으로 형질감염된 배양된 세포일 수 있으며, 상기 세포는 면역원성 폴리펩티드를 발현한다. 적합한 세포 계통은 당업자에게 공지되어 있으며, 상업적으로 이용가능한데, 예로써, American Type Culture Collection (ATCC)로부터 이용가능하다. 형질감염된 세포들은 면역원성 폴리펩티드를 생산하는 방법에 이용될 수 있다. 상기 방법은 면역원성 폴리펩티드의 발현이 허용되는 조건, 임의 선택적으로 발현 서열의 제어하에 벡터를 포함하는 세포를 배양하는 것을 포함한다. 면역원성 폴리펩티드는 세포 또는 배양 배지로부터 표준 단백질 정제 방법을 이용하여 단리될 수 있다.
당업자는 본 명세서에서 설명된 결합 물질들 (예컨데, 항체들)을 이용하여 이에 결합하는 단백질들이 포함된 생물학적 시료를 식별하는 많은 적합한 기술을 가지고 있다. 예를 들면, 항체들은 예로써, 면역침전 또는 다른 포획-유형 분석을 이용하여 PD-1을 단리하는데 이용될 수 있다. 상기 항체를 고형 지지물 또는 크로마토그래피 재료 (예컨데, 단백질 A, 단백질 G 및/또는 단백질 L로 피복된 비드)에 부착시킴으로써 이러한 공지된 기술이 실행된다. 결합된 항체는 그 다음 상기 PD-1 (예컨데, HIV-감염된 T 세포 용해물)이 포함된 또는 포함된 것으로 보이는 용액 안으로 도입된다. 그 다음 PD-1은 이 항체에 결합할 수 있고, 상기 PD-1가 이 항체에 결합이 유지된 상태하에서 비-결합 물질을 씻어낸다. 그 다음 결합된 단백질은 상기 항체로부터 분리될 수 있고, 원하는 경우 분석된다. 항체를 이용한 단백질의 단리시키는 유사한 방법들이 당업계에 잘 공지되어 있다. 상기 결합 물질들 (예컨데, 항체들)은 생물학적 시료 안에 있는 PD-1을 탐지하는데 또한 이용될 수 있다. 예를 들면, 상기 항체들은 분석, 이를 테면, 예로써, 유동 세포분석 분석, ELISA, 면역블랏팅 (예컨데, 웨스턴 블랏), in situ 탐지, 면역세포화학, 및/또는 면역조직화학에 이용될 수 있다. 이러한 분석을 실행하는 방법들은 당분야에 공지되어 있다.
본 명세서에서 설명된 결합 물질들은 환자의 질환 상태 존재를 결정, 예후 예측 또는 화학요법 또는 다른 치료 섭생의 효과를 결정하는데 또한 이용될 수 있다. 본 명세서에서 설명된 바와 같이 또는 당업계에 공지된, 발현 프로파일 분석을 이용하여 PD-1의 상대적 발현 수준을 결정할 수 잇다. 그 다음, 환자에게 특정 질환이 존재하는데, 환자의 예후 또는 특정 치료 섭생이 효과가 있는지를 결정하기 위하여, 이 발현 수준은 기저 (예컨데, 대조군) 수준과 상관관계에 있을 수 있다. 예로써, 만일 환자가 특정 항-감염성 섭생으로 치료를 받는다면, 이 환자의 조직 (예컨데, 말초 혈액, 유방 조직 생검)에서 PD-1의 증가된 또는 감소된 수준은 이 섭생이 해당 숙주에서 해당 감염성 물질의 부하를 악화 또는 개선시키는 지를 나타낼 수 있다. 발현의 증가 또는 감소는 해당 섭생이 원하는 효과를 가지는 지를 나타낼 수 있고, 또다른 치료 방식이 따라서 선택될 수 있다.
또한 예로써, 새로운 약물 후보를 테스트하기 위한 약물 스크리닝 분석에서 본 명세서에서 설명된 결합 물질들이 시약으로 이용되는 것 또한 가능하다. 해당 시약은 세포 계통, 환자의 세포 또는 조직에서 면역원성 표적의 발현에 있어서 약물 후보의 효과를 확인하는데 이용될 수 있다. 발현 프로파일링 기술은 유용한 화합물들의 신속한 확인이 가능하며, 약물 후보의 치료 효과를 모니터하기 위한 고처리량 스크리닝 시술과 복합될 수 있다 (예로써, Zlokarnik, et al., Science 279, 84-8 (1998) 참고). 약물 후보들은 화학적 화합물들, 핵산, 단백질, 항체들, 또는 이로부터 얻은 자연발생적 또는 화학적으로 얻은 유도체들일 수 있다. 따라서, 확인된 약물 후보는 다른 용도들중에서 환자에게 투여하기 위한 약학 조성물로써 이용되거나, 또는 추가 스크리닝 분석에 이용될 수 있다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 결합 물질들은 정제된 형태이다. ＂정제된＂ 결합 물질 (예컨데, 항체)은 처음 발견될 때 있었던 단백질 및/또는 다른 성분들로부터 최소한 약 50%로부터 분리되는 것들 (예컨데, 단클론 항체의 경우 하이브리도마 상청액 또는 복수 조제물의 일부분)일 수 있다. 정제된 결합 물질 (예컨데, 항체)은 이것들이 처음 발견될 때 있었던 단백질 및/또는 다른 성분들의 최소한 약 50%, 60%, 75%, 90%, 또는 95%로부터 분리된 것들일 수 있다.
본 명세서에서 설명된 폴리펩티드 및 핵산은 숙주에게 투여되기 전, 하나 또는 그 이상의 약학적으로 수용가능한 운반체와 복합될 수 있다. 약학적으로 수용가능한 운반체는 생물학적이지 않는 또는 그렇지 않으면 바람직한 물질, 예컨데, 임의의 바람직하지 못한 생물학적 효과를 야기하지 않고, 또는 포함된 약학 조성물 안에 다른 임의의 성분들과 유해한 방식으로 상호작용없이 대상에게 투여되는 물질이다. 상기 운반체는 당연히 활성 성분의 임의의 분해를 최소화시키고, 대상에서 임의의 부작용을 최소화시키는 것으로 선택될 것이며, 이는 당업자들에게 잘 공지된 것이다. 적합한 약학 운반체 및 이들의 제제는 예로써, Remington ＇s: The Science and Practice of Pharmacy, 21 st Edition, David B. Troy, ed., Lippicott Williams & Wilkins (2005)에서 설명된다. 전형적으로, 적절한 양의 약학적으로-수용가능한 염이 등장성 제형을 제공하기 위하여 제형에 이용된다. 약학적으로-수용가능한 운반체의 예로는 멸균수, 염수, 완충된 용액 가령 Ringer 용액, 및 덱스트로스 용액을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 이 용액의 pH는 일반적으로 약 5 내지 약 8 또는 약 7 내지 약 7.5이다. 다른 운반체는 지속-방출 조제물, 이를 테면 폴리펩티드 또는 이의 단편들이 포함된 고형 소수성 폴리머의 반투성 매트릭스를 포함한다. 매트릭스는 형태를 가진 물건, 예컨데, 필름, 리포좀 또는 미립자의 형태일 수 있다. 특정 운반체가 예를 들면, 투여 경로, 및 투여되는 조성물의 농도에 더 바람직할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 운반체는 폴리펩티드 및/또는 이의 단편들을 인간 또는 다른 대상들에게 투여하는데 적합한 것들이다. 면역원성 폴리펩티드에 추가하여, 약학 조성물은 운반체, 농후제, 희석제, 완충액, 보존제, 표면 활성 물질, 어쥬번트, 면역자극제를 또한 포함할 수 있다. 약학 조성물은 또한 하나 또는 그 이상의 활성 성분, 이를 테면 항균 물질, 항염증성 물질 및 마취제를 또한 포함할 수 있다. 약학 조성물은 약학적으로 수용가능한 운반체, 어쥬번트 및 비이클이 포함된 통상의 약학적으로 수용가능한 운반체가 포함된 단위 약형 제형으로 경구, 장관외, 흡압 스프레이, 직장, 림프절내, 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 본 명세서에서 이용된 용어 ＂약학적으로 수용가능한 운반체＂ 또는 ＂생리학적으로 수용가능한 운반체＂는 약학 조성물로써 핵산, 폴리펩티드, 또는 펩티드의 전달을 실현 또는 강화시키는데 적합한 하나 또는 그 이상의 제형 물질을 지칭한다. ＂약학 조성물＂은 치료요법적으로 효과적인 양의 핵산 또는 폴리펩티드가 포함된 조성물이다. 용어 ＂효과적인 양＂ 및 ＂치료요법적으로 효과적인 양＂은 각각 원하는 치료요법적 효과 (예컨데, T 세포 기능의 복원)을 관찰하기 위한 결합 물질, 핵산 또는 이와 유사한 것들의 양을 지칭한다.
포유동물 숙주에서 하나 또는 그 이상의 질환 상태 (예컨데, HIV 또는 암)를 치료하기 위하여 본 명세서에서 설명된 는 방법은 본 명세서에서 최소한 하나 또는 그 이상의 결합 물질들 (및/또는 이의 유도체(들))을 해당 포유류에게 투여하는 것을 포함하는 방법들이 또한 제공된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 결합 물질은 서열 번호. 1-138 및/또는 표 1A 및 1B에서 나타낸 것들이 포함된 하나 또는 그 이상의 단클론 항체 또는 이의 단편 또는 이의 유도체이다. 상기 하나 또는 그 이상의 결합 물질들은 약 1 내지 약 50 mg/kg, 약 1 내지 약 30 mg/kg, 또는 약 5 내지 약 30 mg/kg (예컨데, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 또는 40 mg/kg)의 투여량으로 투여될 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 결합 물질들은 1회 또는 그 이상의 횟수로 약 10 mg/kg의 양으로 포유류에게 투여될 수 있다(예컨데, 피내, 정맥내, 경구, 직장). 다중 분량이 투여될 때, 이 분량은 각 분량에 대략 동일한 또는 상이한 양의 결합 물질을 포함할 수 있다. 다중 투여에서 각 투여는 동일한 또는 상이한 간격을 두고 투여될 수 있다. 예를 들면, 투여는 대략 6, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 또는 96 시간, 1 주, 2 주, 3 주, 1 개월, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 7 개월, 8 개월, 9 개월, 10 개월, 11 개월, 12 개월, 1.5 년, 2 년, 3 년, 4 년, 5 년, 또는 이들 기간중 임의의 시간 전, 또는 시간 후 및/또는 이들 중 임의의 기간 사이를 두고 투여될 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 결합 물질들은 다른 물질 (예컨데, 항-감염성 물질 및/또는 화학치료요법적 물질)과 병용하여 투여될 수 있다. 이러한 다른 물질들은 상기 결합 물질들과 대략 동시에, 상이한 시간 및/또는 빈도로 투여될 수 있다. 이러한 방법들의 다른 구체예들 또한 인지될 수 있는데, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 명세서에서 설명된 항체들의 이용에 있어서 당업자를 지원하기 위하여, 키트 형태로 항체가 제공될 수 있다. 이러한 항체들과 PD-1을 발현시키는 세포들을 탐지하는데 항체의 이용에 필요한 임의선택적 다른 성분들이 포함된 키트가 제공된다. 키드의 항체들은 냉동된, 동결건조된 것이 포함된 임의의 적합한 형태 또는 약학적으로 수용가능한 완충액, 이를 테면 TBS 또는 PBS에 제공될 수 있다. 상기 키트는 시험관내 또는 생체내에서 항체의 이용에 요구되는 다른 시약, 이를 테면 완충액 (예컨데, TBS, PBS), 차단 물질들 (비지방 건유, 정상 혈청, Tween-20 계면활성제, BSA, 또는 카제인이 포함된 용액), 및/또는 탐지 시약 (예컨데, 염소 항-마우스 IgG 비오틴, 스트렙타아비딘-HRP 접합체들, 알로피코시아닌, B-피코에리틴, R-피코에리틴, 과산화효소, 탐지가능한 라벨, 그리고 다른 라벨 및/또는 착색 키트 (예컨데, ABC Staining Kit, Pierce))를 또한 포함할 수 있다. 상기 키트는 분석, 이를 테면, 예로써, 유동 세포분석 분석, ELISA, 면역블랏팅 (예컨데, 웨스턴 블랏), in situ 탐지, 면역세포화학, 면역조직화학에 이들 항체를 이용하기 위한 다른 시약들 및/또는 지시를 또한 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 키트는 결합 물질이 정제된 형태로 제공된다. 또다른 구체예에서, 상기 결합 물질은 바이오티닐화된 형태 단독으로 또는 아비딘-접합된 탐지 시약 (예컨데, 항체)과 함께 제공될 수 있다. 또다른 구체예에서, 상기 키트는 PD-1을 직접적으로 탐지하는데 이용될 수 있는 하나 또는 그 이상의 탐지가능한 라벨이 포함된 결합 물질들을 포함한다. 이들 시스템중 임의의 것을 이용하는데 필요한 완충액 및 이와 유사한 것들은 당업계에 공지된 것이며 및/또는 최종-사용자에 의해 준비되거나 또는 키트 성분으로 제공될 수 있다. 상기 키트는 양성-대조 단백질 및 음성-대조 단백질 및/또는 조직 시료가 포함된 고형 지지물을 또한 포함할 수 있다. 예로써, 스포팅 또는 웨스턴 블랏-유형 분석 실행을 위한 키트는 실험 시료를 위한 추가 공간과 함께, 미리-고정된 대조 시료가 포함된 SDS-PAGE 또는 나일론 또는 다른 막에 이용하기 위하여 대조 세포 또는 조직 용해물을 포함할 수 있다. 슬라이드 상에 있는 세포 안에서 PD-1의 시각화를 위한 키트는 실험 시료를 위한 추가 공간과 함께, 대조 세포 또는 조직 시료가 포함된 사전-형성된 슬라이드를 포함할 수 있다. 키트의 다른 구체예들이 또한 고려될 수 있는데, 당업자들이 인지할 수 있을 것이다.
따라서, 본 명세서는 항진적으로 또는 길항적으로 PD-1에 결합하는 결합 물질을 제공한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 결합 물질은 서열 번호. 1-138 및/또는 표 1A 및 1B에 나타낸 것으로 구성된 군에서 선택된 최소한 하나의 아미노산 서열이 포함된 폴리펩티드다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 결합 물질은 서열 번호. 1-138 (예컨데, 표 1A 및/또는 1B에서 나타낸 것과 같이)의 하나 또는 그 이상의 조합들이 포함된 폴리펩티드다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 결합 물질는 항체다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 결합 물질은 폴리펩티드, 이를 테면 서열 번호. 1-23로 구성된 군에서 선택된 중쇄 CDR1 아미노산 서열이 포함된 항체다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 결합 물질은 폴리펩티드, 이를 테면 서열 번호. 24-46으로 구성된 군에서 선택된 중쇄 CDR2 아미노산 서열이 포함된 항체다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 결합 물질은 폴리펩티드, 이를 테면 47-69로 구성된 군에서 선택된 중쇄 CDR3 아미노산 서열이 포함된 항체다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 결합 물질은 폴리펩티드, 이를 테면 서열 번호. 70-92로 구성된 군에서 선택된 경쇄 CDR1 아미노산 서열이 포함된 항체다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 결합 물질은 폴리펩티드, 이를 테면 서열 번호. 93-115로 구성된 군에서 선택된 중쇄 CDR2 아미노산 서열이 포함된 항체다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 결합 물질은 폴리펩티드, 이를 테면 116-138로 구성된 군에서 선택된 중쇄 CDR3 아미노산 서열이 포함된 항체다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 결합 물질은 표 1A 및/또는 1B에 나타난 CDRs의 조합을 포함하거나 및/또는 표 2에서 설명된 성질을 가진다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 결합 물질은 인간 항체, 인간 IgG, 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG2a, 인간 IgG2b, 인간 IgG3, 인간 IgG4, 인간 IgM, 인간 IgA, 인간 IgA1, 인간 IgA2, 인간 IgD, 인간 IgE, 개 항체, 개 IgGA, 개 IgGB, 개 IgGC, 개 IgGD, 닭 항체, 닭 IgA, 닭 IgD, 닭 IgE, 닭 IgG, 닭 IgM, 닭 IgY, 염소 항체, 염소 IgG, 마우스 항체, 마우스 IgG, 돼지 항체, 및/또는 렛 항체, 및/또는 이의 유도체로부터 유도되거나 또는 관련된다(예컨데, 서열 또는 유도에 의해). 일부 구체예들에 있어서, 상기 유도체는 Fab, Fab2, Fab＇ 단일쇄 항체, Fv, 단일쇄, 단일-특이적 항체, 이중특이적 항체, 삼량체 항체, 다중-특이적 항체, 다가 항체, 키메라 항체, 개-인간 키메라 항체, 개-마우스 키메라 항체, 개의 Fc가 포함된 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 개화된 항체, CDR-접합된 항체, 상어 항체, 나노바디, 및/또는 커넬리드(canelid) 항체로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 결합 물질은 최소한 제 1 및 제 2 특이성을 포함하는데, 상기 제 1 특이성은 PD-1에 대항하는 것이며, 제 2 특이성은 상이한 항원 (예컨데, 감염성 물질 이를 테면 HIV (예컨데, env)의 항원 및/또는 종양 항원)에 대항한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 결합 물질 및/또는 이의 유도체는 이에 고정적으로 부착된 탐지가능한 라벨을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 임의의 하나 및/또는 이의 유도체의 결합 물질은 이에 고정적으로 부착된 작동체 모이어티 (예컨데, 세포독성 약물, 톡신, 디프테리아 A 쇄, 엑소톡신 A 쇄, 리친 A 쇄, 아브린(abrin) A 쇄, 쿠르친(curcin), 크로틴(crotin), 페노마이신(phenomycin), 에노마이신(enomycin), 및 방사능화학물질)을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 하나 또는 그 이상의 결합 물질들을 인코드하는 폴리뉴클레오티드 또한 제공된다 (예컨데, 발현 벡터로써). 이러한 폴리뉴클레오티드의 폴리펩티드 산물을 포함하는 및/또는 이를 발현시키는 숙주 세포 또한 제공된다. 일부 구체예들에 있어서, 최소한 하나의 결합 물질 또는 유도체; 최소한 하나의 단리된 폴리뉴클레오티드; 최소한 하나의 발현 벡터; 및/또는, 최소한 하나의 숙주 세포; 또는 이의 조합; 그리고 약학적으로 수용가능한 운반체가 포함된 조성물 또한 제공된다.
본 명세서는 세포 상에서 PD-1을 탐지하는 방법들을 또한 제공하는데, 상기 방법은 테스트 생물학적 시료에 본 명세서에서 설명된 결합 물질 또는 유도체를 접촉시키고, 그리고 상기 생물학적 시료 또는 이의 성분들에 결합된 결합 물질을 탐지하는 것을 포함한다. 이러한 방법들은 생체내 방법 또는 시험관내 방법일 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 방법은 생물학적 테스트 시료 또는 이의 성분들에 대한 결합량을 생물학적 대조 시료 또는 이의 성분들과 비교하는 것을 포함할 수 있는데, 이때 생물학적 대조 시료 또는 이의 성분들과 비교하여 생물학적 테스트 시료 또는 이의 성분들에 대하여 결합의 증가는 생물학적 테스트 시료 (예컨데, 포유동물 혈액)에서 PD-1을 발현시키는 세포의 존재를 나타낸다. 일부 구체예들에 있어서, 소모 기능적 회복 분석 (EFRA)에 의하여 후보 결합 물질을 분석함으로써 PD-1 항체 결합 물질을 확인하기 위한 시스템; PD-1을 위한 후보 결합 물질의 친화력을 결정하는 시스템; 그리고, 후보 결합 물질의 CDR의 뉴클레오티스 서열을 결정하는 시스템이 제공된다.
일부 구체예들에 있어서, 세포 안에 또는 세포 상에서 PD-1의 발현을 탐지하기 위한 키트, 상기 키트는 결합 물질 또는 이의 유도체 그리고 사용 지침을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 결합 물질 및/또는 이의 유도체는 동결건조된 형태 안에 있다.
일부 구체예들에 있어서, 본 명세서는 포유류에서 감염성 질환, 암 및/또는 자가면역을 치료, 방지 및/또는 개선시키기 위한 방법들을 제공하는데, 이 방법은 결합 물질 또는 이의 유도체가 포함된 약학 조성물의 최소한 하나의 효과적인 투여분량을 상기 포유류에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 감염성 질환은 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)이다. 일부 구체예들에 있어서, 감염성 질환 및/또는 암을 치료하는데 이용된 상기 결합 물질 및/또는 이의 유도체는 PD-1 길항제다. 일부 구체예들에 있어서, 자가면역 상태를 치료하는데 이용되는 상기 결합 물질 및/또는 이의 유도체는 PD-1 항진제다. 일부 구체예들에 있어서, 다중 투여분량이 상기 동물에게 투여된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 결합 물질 및/또는 이의 유도체는 약 1 내지 50 mg/kg의 투여량이 투여될 수 있다.
본 명세서는 또한 PD-1 결합 물질들의 조합들을 제공한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 조합은 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 차단하는 제 1 결합 물질과 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 차단하지 않는 제 2 결합 물질을 포함한다. 이러한 조합들은 본 명세서에서 설명된 임의의 용도에 이용되거나, 그렇지 않으면 당업자에 의해 확인될 수 있다. 예를 들면, 이러한 조합들은 본 명세서에서 설명된 포유류에서 감염성 질환, 암 및/또는 자가면역을 치료, 예방 및/또는 개선시키기 위한 방법들에 이용될 수 있다.
본 명세서는 세포에서 결합 물질을 발현시킴으로써 본 명세서에서 설명된 결합 물질을 생산하고, 세포 또는 세포의 배양 상청액으로부터 상기 결합 물질을 분리시키는 방법들을 또한 제공한다. 일부 구체예들에 있어서, 이러한 방법들은 이러한 결합 물질(들)을 인코드하는 핵산을 발현시키는 것을 더 포함할 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 이러한 방법들은 상기 결합 물질(들)은 분리 후, 하나 또는 그 이상의 약학적으로 수용가능한 부형제와 함께 복합되는 것을 또한 포함할 수 있다.
결합 물질들, 이를 테면 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 차단하는 제 1 결합 물질과 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 차단하지 않는 제 2 결합 물질의 조합을 생산하는 방법들이 본 명세서에서 또한 제공된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 제 2 결합 물질은 PD-1에 결합한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 제 1 및/또는 제 2 결합 물질들은 항체들, 가령 단클론 항체들 또는 이의 단편들 또는 유도체들이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 제 2 결합 물질은 아미노산 서열들, 서열 번호. 2, 25, 48, 71, 94 및 117; 또는 서열 번호. 17, 40, 63, 86, 109, 및 132를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 이들 방법은 약학적으로 수용가능한 부형제의 추가를 더 포함할 수 있다.
수치 또는 범위 목록앞에 용어 ＂약＂, ＂대략적으로＂, 그리고 이와 유사한 것들이 선행될 때, 목록 또는 범위 안에 있는 각 개별 값이 있는 것처럼 목록 또는 범위 안에 개별적으로 각 값을 나타낸다. 이 용어는 동일한 것이 지칭하는 값이 이에 정확하게, 근접하게 또는 이에 유사한 것을 의미한다.
본 명세서에서 이용된 것과 같이, 대상 또는 숙주는 개체를 의미한다. 상기 대상은 가축, 이를 테면 고양이, 개, 가축 (예컨데, 소, 말, 돼지, 양, 및 염소), 실험실 동물 (예컨데, 마우스, 토끼, 렛, 기니아피그) 및 새를 포함할 수 있다. 한 측면에 있어서, 상기 대상은 포유류, 이를 테면 영장류 또는 인간이다.
선택적 또는 임의선택적으로라는 의미는 후속적으로 설명된 사건 또는 환경이 일어날 수 있지만, 반드시 일어날 필요가 있는 것은 아니며, 그리고 이 설명에는 상기 사건 또는 환경이 일어나는 경우와 일어나지 않는 경우를 포함한다는 의미다. 예로써, 상기 조성물이 임의선택적으로 조합을 포함할 수 있다는 구절은 상기 조성물이 상이한 분자의 조합을 포함할 수 있거나, 또는 조합을 포함하지 않을 수 있다는 것은 조합(가령, 조합의 개별 구성원들)을 포함하는 것과 조합을 포함하지 않은 것 모두가 포함된다는 의미이다.
본 명세서에서 범위는 대략 하나의 특정 값에서 및/또는 내지 대략 하나의 또다른 값으로 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현될 때, 또다른 측면은 하나의 특정 값으로부터 및/또는 또다른 특정 값까지를 포함한다. 유사하게, 값이 약 또는 대략적으로라는 선행 문구에 의해 근사치로 표현될 때, 특정 값은 또다른 측면을 형성하는 것으로 이해될 것이다. 범위의 각각의 끝점은 다른 끝점과 관련하여, 그리고 다른 끝점과 독립적에서 모두 유의미하다는 것으로 인지될 것이다. 범위 (예컨데, 90-100%)는 그 자체로 범위를 포함하고, 뿐만 아니라 각 값이 개별적으로 열거된 것처럼 그 범위안에 있는 각각의 개별 값이 독립적으로 포함된다는 것을 의미한다.
용어 ＂복합된(combined)＂ 또는 ＂조합되어(in combination)＂ 또는 ＂병합(in conjunction)＂은 특정 질환을 치료, 예방 및/또는 개선시키기 위하여 함께 투여되는 물질들의 물리적 조합 또는 섭생(예컨데, 물리적으로 및/또는 시간적으로 별도로 투여)에서 두 가지 또는 그 이상의 물질을 이용하는 것을 지칭할 수 있다.
용어 치료, 예방 및/또는 개선 또는 이로부터 유도된 용어들이 특정 상태를 위한 주어진 치료와 관련하여 이용될 때 (예컨데, 암 또는 HIV에 의한 감염), 치료된 환자는 상태의 수준이 임상적으로 관찰가능한 상태로 전혀 발달하지 않거나, 또는 이러한 치료가 없을 때보다 더 낮은 수준으로 또는 더 느리게 발달한다는 것을 의미한다. 이들 용어는 환자가 어떤 상태이건 간에 상태의 어떠한 측면도 경험하지 않는 상황에만 전적으로 국한되지 않는다. 예로써, 치료는 상태의 주어진 현시를 만드는 것으로 기대될 수 있는 자극에 환자가 노출되는 동안 치료가 제공된다면 상태를 예방하는 것으로 말하며, 그리고 기대된 것보다 더 적게 및/또는 더 약한 증상을 경험하는 것으로 결과가 나타나는 것을 말한다. 예를 들면, 치료는 환자가 감염의 단지 약한 명시적인 증상을 나타나게 함으로써 감염을 ＂방지＂할 수 있고; 감염 미생물에 의해 임의의 세포의 침투가 없어야 한다는 것을 의미하는 것은 아니다.
유사하게, 특정 치료에 의해 주어진 상태의 방지, 치료 및/또는 개선과 연관하여 본 명세서에서 이용된 감소시키는, 그리고 감소란 전형적으로 치료가 없을 때(예컨데, 하나 또는 그 이상의 PD-1 결합 물질들의 치료) 감염의 발생의 대조 또는 기저 수준과 비교하였을 때 환자에게서 감염이 더 서서히 또는 덜 한 수준으로 발생되는 것을 말한다. 감염 위험의 감소는 환자가 감염의 단지 약한 명시적인 증상 또는 감염의 지연된 증상만을 나타나게 할 수 있고; 감염 미생물에 의해 임의의 세포의 침투가 없어야 한다는 것을 의미하는 것은 아니다.
본 명세서에서 언급된 모든 자료는 이들의 전문이 참고자료에 편입된다. 다음의 실시예에서 특정 구체예들이 추가 설명된다. 이들 구체예들은 단지 실시예로 제공되며, 임의의 방식으로 청구항의 범위를 제한하려는 의도는 아니다.
실시예
실시예 1
PD-1 결합 물질들의 생성 및 특징화
4마리 마우스 균주 (총 16 마리 마우스)는 2개의 PD-1 단백질, 가령, 인간 PD-1 Fc 융합 단백질 및 인간 PD-1 단량체 단백질로 면역화되었다. 항-PD-1 하이브리도마 세포 계통 생성을 위하여 활성화된 인간 T 림프구에서 발현된 PD-1에 대한 혈청 반응성을 보이는 마우스를 선택하였다. 재조합 PD-1 단백질에 결합하는 항체를 만들기 위하여 총 240개의 PD-1 하이브리도마 세포 계통이 선택되었다. 항체 선택의 첫 번째 라운드의 주요 기준은 다음과 같다: i) 유동세포분석에 의한 활성화된 인간 T 림프구 상에 PD-1의 착색; (ii) 기존의 항-PD-1 항체들과 비교하였을 때, CDR VH 및 VL 서열들의 다양성; 그리고, (iii) PD-1 상에 있는 상이한 에피토프에 결합하는 2가지 상업적으로 이용가능한 항-PD-1 항체들와 함께 PD-1 접합된 Luminex 비드를 이용한 경쟁 결합 연구에 의해 실행된 에피토프 메핑. 선택의 두번째 라운드는 다음에 의해 실행되었다: iv) 친화력 결합 분석 (항-PD-1 항체들의 자극 능력과 관련없기 때문에 주요 기준은 아님); v) PD-1에 결합하고, Luminex 생화학적 분석에서 PD-L1의 결합과 경쟁적, 부분적으로 경쟁적 또는 비-경쟁적인 항-PD-1 항체들의 평가; 그리고, vi) 항체들의 항진제 (기능적 소모로부터 T-세포들을 복귀시킬 수 없는) 또는 길항제 (기능적 소모로부터 T-세포를 복귀시킬 수 있는)의 기능적 특징. 이들 연구에서 상기 항체들은 HIV-특이적 소모된 CD8 T-세포들에서 증식을 구해내는 능력에 근거하여 테스트되고, 분화되었다.
개별 세포 배양된 하이브리도마 세포 클론으로부터 항체 상청액의 일차 스크린에서, HIV-특이적 CD8 T 세포들의 증식에서 항-PD1 항체들의 기능적 효과를 평가하기 위하여 EFRA 분석을 실행하였다 (도 2). 상위 상자에서 항체 클론 (E8-3, C2-3, E1-3, F3-3, H8-3, C10-2, G2-1, G3-2, H2-1, 및 H4-2)은 PD-1 길항제로 작용하며, 그리고 증식을 자극하며, 한편 하위 상자에서 항체 클론 (C8-1 및 G10-2)은 항진성이며, PD-1 음성 조절 효과를 촉진한다. 펩티드 대조 (Pep 8)에 의해 유도된 증식 수준은 하위 수평선(단지 1%이하)에 의해 나타내고, 그리고 Merck MK-3475 항-PD1 항체에 의해 유도된 증식은 상위 수평선 (단지 2% 이상)에 나타낸다. 이 과정에 의해 확인된 관심 항체들은 제2 라운드의 서브클로닝히며, 생성된 하이브리도마 클론은 표 2에 있는 항체의 생산 및 정제에 이용되었다. 결합 분석은 서브클론들이 PD-1에 대한 이들의 친화력을 유지한다는 것을 확인하기 위하여 정제된 항-PD-1 항체과 함께 실행되었다. 세포 표면 PD-1에 대한 항-PD-1 항체들의 농도 반응 결합은 활성화된 CD4 T-세포들에서 평가되었다 (도 3).
기능적 소모로부터 T-세포를 복원시키지만, 반드시 길항은 아닌 결합 물질을 선택하기 위하여 EFRA가 제공된다는 것은 이들 결합 물질들은 PD-1와 이의 생물학적 리간드(들) (예컨데, PD-L1 또는 PD-L2 ) 사이의 상호작용을 반드시 간섭하지 않는다는 것을 의미한다. EFRA의 구체예는 PD-1에 결합하는 이러한 결합 물질들 (항체들)을 확인하는 것이다. 2가지 별도의 생화학적 분석과 함께 PD-1에 대한 항체 결합의 에피토프 메핑이 실행되었다. 한 가지 분석에서, 2개의 상업적 항-PD-1 항체 (BMS-5C4 및 MK3475)중 하나와 열거된 항-PD-1 항체들 (표 2에서 또한 설명된) 사이에서 PD-1 Fc 융합 단백질 라벨된 비드에 대한 경쟁적 결합이 평가되었다. 이 분석에 의해 별개의 에피토프에 대한 4 부류의 단클론 항체 결합이 확인되었다. 분류 1 (PD-L1와 PD-1의 상호작용을 차단하는 EH12.2H7 상업적 단클론 항체 클론과 경쟁적), 분류 2 (PD-1에 결합하지만 PD-L1와 PD-1의 상호작용을 효과적으로 차단하지 않는 J116 상업적 단클론 항체 클론과 경쟁적), 분류 3 (EH12.2H7 및 J116 상업적 단클론 항체 모두와 경쟁적), 그리고 분류 4 (EH12.2H7 또는 J116 상업적 항체들과 비-경쟁적)가 있다. 세포 표면 PD-1에 대한 이들 항체의 상대적 결합은 도 4에서 대조 항-PD-L1 항체와 비교하여 평균 형광 강도 (MFI)에 의해 나타낸다. 이들 결과는 4가지 결합 부류 모두로부터 단단한 결합 항체들이 확인되었음을 보여준다. 제 2 Luminex 결합 분석은 항-PD-1 항체가 PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용을 차단하는지를 직접적으로 평가하기 위하여 이용되었다. 이 분석은 표 2에 열거된 항-PD-1 항체들의 상이한 농도 존재하에 또는 이들 항체 없이 항온처리된 PD-1 Fc 융합 단백질 피복된 비드를 이용하여 실행되었다. 상기 PD-1 /PD-L1 상호작용의 IC50에 대략적으로 등가인 고정된 농도의 바이오티닐화된 PD-L1은 상기 PD-1/항체 복합체와 함께 항온처리되었고, 그리고 PD-L1 결합은 형광 라벨된 스트렙타아비딘으로 형광에 의해 탐지되었다(도 5a-c에서 나타낸 대표적인 결합 곡선). 이 생화학적 분석을 이용하여, 항체는 상기 PD-1/PD-L1 상호작용에 대하여 경쟁적, 부분적으로 경쟁적 또는 비-경쟁적으로 특정되었다. PD-1 상에 별개 부위에 결합하는 경쟁적, 부분적으로 경쟁적 항체들과 비-경쟁적 항체들이 확인되었고, 높은 결합 친화력을 나타낸다 (표 2). PD-1에 결합하고, 그리고 PD-L1와 비-경쟁적 또는 부분적으로 경쟁적인 항체들의 추가 평가는 PD-1 Fc 융합 단백질 피복된 Luminex 비드를 표 2의 20 nM의 항-PD-1 항체와 함께 항온처리하고, 이어서 상기 PD-1/항체 복합체를 상이한 농도의 바이오티닐화된 PD-L1와 함께 항온처리함으로써, 실행되었다. 도 5d-f에서 경쟁적 항-PD-1 항체는 PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용을 완벽하게 차단시킨다는 것을 보여준다. 표 2의 부분적으로 경쟁적 항체들과 비-경쟁적 항-PD-1 항체들은 PD-1에 대한 PD-L1의 결합 친화력에서 변위를 초래하지만, PD-L1의 농도가 증가될 때, 상호작용을 차단시키지 않는다. 이들 항체들중 일부는 대조와 비교하여 증식에 있어서 통계학적으로 유의적인 증가를 나타내었다 (도 6a 및 6b에서 펩티드 8 단독 대조 또는 펩티드와 IgG1 아이소타입 대조 항체). 분류 1 항체들 (PD-1와 PD-L1 사이의 상호작용을 차단하는 EH12.2H7 상업적 단클론 항체와 경쟁적) 또는 상기 PD-1/PD-L1 상호작용 분석에서 경쟁적인)은 일반적으로 개선된 증식성 복원을 제공하는 것으로 측정되었다. 공통적인 비교측정으로 MK-3475을 이용하여 다중 EFRA 실험의 데이터를 복합함에 있어서 도 7은 표 2에 설명된 선택 항체들은 밴치마크 MK-3475 항체와 비교하였을 때 등가의 또는 통계학적으로 개선된 활성 (p < 0.007)을 나타내었다.
실시예 2
항체 조합들
상이한 PD-1 에피토프에 결합하는 항체들의 조합은 기능적 소모 회복 분석에서 HIV 펩티드 특이적 CD8 T-세포 증식의 복원을 강화시키는 것으로 밝혀졌다 (도 8). 항체 유형들 간의 상승 작용 또한 관찰되었다. 예를 들면, 분류 1 (도 8에서 MK-3475) 및 분류 2 (도 8에서 139D6 ) 항체들은 동시에 PD-1에 결합할 수 있는 것으로 판단되었다. MK-3475에 대하여 관찰된 최대 자극은 HIV 펩티드와 비교하여 일관되게 약 200%이지만, 5 μg/ml에서 MK-3475와 139D6 단클론 항체들의 조합은 HIV 펩티드 대조 단독과 비교하여 HIV-특이적 CD8 T 세포 증식에서 288%의 상승작용을 나타내거나 또는 MK-3475 또는 139D6 단독과 비교하여 144% 증가된 증식을 나타낸다 (도 8). 증식에서 이와 같은 상승적 증가는 몇 가지 실험 테스트에서 관찰되었고, 통계학적 유의적 p 값은 0.007이다. 비교를 위하여, 10 μg/ml의 MK-3475 또는 139D6 단독 추가로는 EFRA에서 증식의 증가를 야기하지 못하였다. 따라서, PD-1과 PD-L1의 상호작용을 차단하는 제 1 결합 물질과 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 차단하지 않는 제 2 결합 물질의 조합은 소모로부터 T 세포들을 구출하기 위하여 공조적으로 작용한 것으로 판단되었다.
특정 구체예들은 바람직한 구체예로 설명되었지만, 변화 및 수정은 당업자에게 있을 수 있다는 것을 인지해야 한다. 따라서, 첨부된 청구범위는 다음의 청구범위 안에 있는 이러한 모든 등가의 변이를 포괄한다는 의미를 가진다.
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Thr Asp Tyr Arg Gly Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 66 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Leu Ser His Tyr Tyr Asp Gly Ile Pro Leu Asp Cys 1 5 10 <210> 67 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Val Arg Gln Leu Gly Leu His Arg Ala Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 68 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Gly Phe Asp Phe Val Leu Asp Tyr 1 5 <210> 69 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Gln Ala Ile Tyr Asp Gly His Tyr Val Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 70 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 71 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asp Gly Leu Asn 1 5 10 <210> 72 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Gly Leu Asn 1 5 10 <210> 73 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile Ala 1 5 10 <210> 74 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 75 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Met Ala 1 5 10 <210> 76 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Gly 1 5 10 <210> 77 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser Glu Thr Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 78 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 79 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val His Asn Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 80 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 81 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn Val Ala 1 5 10 <210> 82 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Thr <210> 83 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser Gly Thr Arg Lys Ser Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 84 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp Leu Ser 1 5 10 <210> 85 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85 His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp Leu Ser 1 5 10 <210> 86 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Gly Asp Leu Asn 1 5 10 <210> 87 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87 His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp Leu Ser 1 5 10 <210> 88 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 89 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Ser Gly Val Ser Phe Leu Thr 1 5 10 15 <210> 90 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asp Asp Val Ser 1 5 10 <210> 91 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 92 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92 Arg Thr Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 93 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 94 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94 His Thr Ser Thr Leu His Ser 1 5 <210> 95 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 His Thr Ser Thr Leu His Ser 1 5 <210> 96 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 Tyr Thr Ser Thr Leu Arg Pro 1 5 <210> 97 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Lys Val Ser His Arg Phe Ser 1 5 <210> 98 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 98 Tyr Thr Ser Thr Leu Arg Pro 1 5 <210> 99 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Asn 1 5 <210> 100 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 101 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 101 Ala Ala Thr Ser Leu Ala Asp 1 5 <210> 102 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102 Lys Ile Ser Asn Arg Phe Phe 1 5 <210> 103 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 103 Trp Ala Ser Thr Arg Asp Ser 1 5 <210> 104 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 104 Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Asn 1 5 <210> 105 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 105 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 106 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 106 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Thr 1 5 <210> 107 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 107 Lys Ala Ser Asn Leu His Thr 1 5 <210> 108 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 108 Lys Ala Ser Asn Leu His Thr 1 5 <210> 109 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 109 His Thr Ser Ser Leu His Ser 1 5 <210> 110 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 110 Lys Ala Ser Asn Leu His Thr 1 5 <210> 111 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 111 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 112 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 112 Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser 1 5 <210> 113 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 113 Ser Ala Phe Phe Arg Tyr Pro 1 5 <210> 114 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 114 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 115 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 115 Asn Val Lys Thr Leu Thr Asp 1 5 <210> 116 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 116 His Gln Tyr Leu Ser Ser Tyr Thr 1 5 <210> 117 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 117 Gln Gln Tyr Ser Lys Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 118 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 118 Gln Gln Tyr Ser Lys Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 119 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 119 Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Trp Thr 1 5 <210> 120 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 120 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr 1 5 <210> 121 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 121 Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Trp Thr 1 5 <210> 122 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 122 Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Pro Trp Thr 1 5 <210> 123 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 123 Lys Gln Ser Tyr Thr Leu Arg Thr 1 5 <210> 124 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 124 Gln Gln Leu Tyr Ser Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 125 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 125 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr 1 5 <210> 126 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 126 Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr 1 5 <210> 127 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 127 Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 128 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 128 Gln Ser Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 129 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 129 Met Gln Ser Tyr Asn Leu Arg Thr 1 5 <210> 130 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 130 Gln Gln Gly Gln Ser Trp Pro Leu Thr 1 5 <210> 131 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 131 Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 132 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 132 Gln Tyr Tyr Ser Lys Asp Leu Leu Thr 1 5 <210> 133 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 133 Gln Gln Gly Gln Ser Trp Pro Leu Thr 1 5 <210> 134 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 134 His Gln Tyr Leu Ser Ser Tyr Thr 1 5 <210> 135 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 135 Gln Gln Thr Lys Glu Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 136 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 136 Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Leu Thr 1 5 <210> 137 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 137 Met Gln Ser Phe Asn Leu Arg Thr 1 5 <210> 138 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 138 Gln Gln Phe Trp Ser Ile Pro Trp Thr 1 5 <210> 139 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 139 gatgattttt tacat 15 <210> 140 <211> 288 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 140 Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln 1 5 10 15 Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp 20 25 30 Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala 35 40 45 Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met 50 55 60 Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala 65 70 75 80 Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln 85 90 95 Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp 100 105 110 Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu 115 120 125 His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val 130 135 140 Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro 145 150 155 160 Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Gly Met Val Ile Gly Ile Met Ser Ala 165 170 175 Leu Val Gly Ile Pro Val Leu Leu Leu Leu Ala Trp Ala Leu Ala Val 180 185 190 Phe Cys Ser Thr Ser Met Ser Glu Ala Arg Gly Ala Gly Ser Lys Asp 195 200 205 Asp Thr Leu Lys Glu Glu Pro Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Val Ala 210 215 220 Tyr Glu Glu Leu Asp Phe Gln Gly Arg Glu Lys Thr Pro Glu Leu Pro 225 230 235 240 Thr Ala Cys Val His Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Thr Glu Gly 245 250 255 Leu Gly Ala Ser Ala Met Gly Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Leu Gln 260 265 270 Gly Pro Arg Pro Pro Arg His Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu 275 280 285 <210> 141 <211> 288 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 141 Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln 1 5 10 15 Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp 20 25 30 Asn Pro Pro Thr Phe Phe Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp 35 40 45 Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val 50 55 60 Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala 65 70 75 80 Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg 85 90 95 Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg 100 105 110 Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu 115 120 125 Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val 130 135 140 Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro 145 150 155 160 Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly 165 170 175 Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys 180 185 190 Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro 195 200 205 Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly 210 215 220 Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro 225 230 235 240 Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly 245 250 255 Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg 260 265 270 Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu 275 280 285

Claims (54)

  1. 서열 번호. 1-138 및/또는 표 1A 및/또는 1B에 나타낸 것으로 구성된 군에서 선택된 최소한 하나의 아미노산 서열을 포함하는 예정된 세포 사멸 1 (PD1)에 결합하는 결합 물질.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 결합 물질은 단리된 단클론 항체인, 결합 물질.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 결합 물질은 서열 번호. 1-23로 구성된 군에서 선택된 최소한 하나의 중쇄 CDR1 아미노산 서열을 포함하는, 결합 물질.
  4. 청구항 1-3중 임의의 한 항에 있어서, 상기 결합 물질은 서열 번호. 24-46으로 구성된 군에서 선택된 최소한 하나의 중쇄 CDR2 아미노산 서열을 포함하는, 결합 물질.
  5. 청구항 1-4중 임의의 한 항에 있어서, 상기 결합 물질은 서열 번호. 47-69로 구성된 군에서 선택된 최소한 하나의 중쇄 CDR3 아미노산 서열을 포함하는, 결합 물질.
  6. 청구항 1-5중 임의의 한 항에 있어서, 상기 결합 물질은 서열 번호. 70-92로 구성된 군에서 선택된 최소한 하나의 경쇄 CDR1 아미노산 서열을 포함하는, 결합 물질.
  7. 청구항 1-6중 임의의 한 항에 있어서, 상기 결합 물질은 서열 번호. 93-115로 구성된 군에서 선택된 최소한 하나의 경쇄 CDR2 아미노산 서열을 포함하는, 결합 물질.
  8. 청구항 1-7중 임의의 한 항에 있어서, 상기 결합 물질은 서열 번호. 116-138로 구성된 군에서 선택된 최소한 하나의 경쇄 CDR3 아미노산 서열을 포함하는, 결합 물질.
  9. 청구항 1-8중 임의의 한 항에 있어서, 다음으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열들을 포함하는, 결합물질:
    Figure pct00006

    및/또는, 다음으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열들을 포함하는, 결합물질:
    Figure pct00007

    Figure pct00008
  10. 청구항 9에 있어서, 결합 물질은 아미노산 서열의 조합을 포함하고, 이때 이 조합은 다음으로 구성된 군에서 선택된, 결합물질:
    서열 번호. 1, 24, 47, 70, 93, 및 116;
    서열 번호. 2, 25, 48, 71, 94, 및 117;
    서열 번호. 3, 26, 49, 72, 95, 및 118;
    서열 번호. 4, 27, 50, 73, 96, 및 119;
    서열 번호. 5, 28, 51, 74, 97, 및 120;
    서열 번호. 6, 29, 52, 75, 98, 및 121;
    서열 번호. 7, 30, 53, 76, 99, 및 122;
    서열 번호. 8, 31, 54, 77, 100, 및 123;
    서열 번호. 9, 32, 55, 78, 101, 및 124;
    서열 번호. 10, 33, 56, 79, 102, 및 125;
    서열 번호. 11, 34, 57, 80, 103, 및 126;
    서열 번호. 12, 35, 58, 81, 104, 및 127;
    서열 번호. 13, 36, 59, 82, 105, 및 128;
    서열 번호. 14, 37, 60, 83, 106, 및 129;
    서열 번호. 15, 38, 61, 84, 107, 및 130;
    서열 번호. 16, 39, 62, 85, 108, 및 131;
    서열 번호. 17, 40, 63, 86, 109, 및 132;
    서열 번호. 18, 41, 64, 87, 110, 및 133;
    서열 번호. 19, 42, 65, 88, 111, 및 134;
    서열 번호. 20, 43, 66, 89, 112, 및 135;
    서열 번호. 21, 44, 67, 90, 113, 및 136;
    서열 번호. 22, 45, 68, 91, 114, 및 137; 그리고,
    서열 번호. 23, 46, 69, 92, 115, 및 138.
  11. 청구항 1-10중 임의의 한 항에 있어서, 상기 결합 물질은 인간 항체, 인간 IgG, 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG2a, 인간 IgG2b, 인간 IgG3, 인간 IgG4, 인간 IgM, 인간 IgA, 인간 IgA1, 인간 IgA2, 인간 IgD, 인간 IgE, 개 항체, 개 IgGA, 개 IgGB, 개 IgGC, 개 IgGD, 닭 항체, 닭 IgA, 닭 IgD, 닭 IgE, 닭 IgG, 닭 IgM, 닭 IgY, 염소 항체, 염소 IgG, 마우스 항체, 마우스 IgG, 돼지 항체, 및/또는 렛 항체로부터 유도된, 결합 물질.
  12. 청구항 1-11중 임의의 한 항에 따른 결합 물질의 유도체.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 유도체는 Fab, Fab2, Fab＇ 단일쇄 항체, Fv, 단일쇄, 단일-특이적 항체, 이중특이적 항체, 삼량체 항체, 다중-특이적 항체, 다가 항체, 키메라 항체, 개-인간 키메라 항체, 개-마우스 키메라 항체, 개의 Fc가 포함된 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 개화된 항체, CDR-접합된 항체, 상어 항체, 나노바디, 및/또는 커넬리드(canelid) 항체로 구성된 군에서 선택되는, 유도체.
  14. 청구항 1-13의 상기 결합 물질 또는 유도체, 또는 청구항 38-40중 임의의 한항에 따른 조합은 최소한 제 1 및 제 2 특이성을 포함하는데, 상기 제 1 특이성은 PD-1에 대항하는 것이며, 제 2 특이성은 상이한 항원에 대항하는, 결합 물질 또는 유도체, 또는 조합.
  15. 청구항 14에 있어서, 이때 제 2 특이성은 감염성 물질의 항원 또는 종양 항원에 대항하는 것인, 결합 물질 또는 유도체.
  16. 청구항 15에 있어서 이때 감염성 물질은 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)인, 결합 물질 또는 유도체.
  17. 청구항 16에 있어서 이때 항원은 HIV env인, 결합 물질 또는 유도체.
  18. 청구항 1-17중 임의의 한 항에 있어서, 상기 결합 물질 또는 이의 유도체는 이에 고정적으로 부착된 탐지가능한 라벨을 포함하는, 결합 물질 또는 유도체.
  19. 청구항 18에 있어서, 이때 탐지가능한 라벨은 플루오레신, DyLight, Cy3, Cy5, FITC, HiLyte Fluor 555, HiLyte Fluor 647, 5-카르복시-2,7-디클로로플루오레신, 5-카르복시플루오레신, 5-FAM, 히드록시 트립타민, 5-히드록시 트립타민 (5-HAT), 6-카르복시플루오레신 (6-FAM), FITC, 6-카르복시-1,4-디클로로-2＇,7＇-디클로로플루오레신 (TET), 6-카르복시-1,4-디클로로-2＇,4＇,5＇,7＇-테트라클로로플루오레신 (HEX), 6-카르복시-4＇,5＇-디클로로-2＇,7＇-di메톡시플루오레신 (6-JOE), Alexa fluor, Alexa fluor 350, Alexa fluor 405, Alexa fluor 430, Alexa fluor 488, Alexa fluor 500, Alexa fluor 514, Alexa fluor 532, Alexa fluor 546, Alexa fluor 555, Alexa fluor 568, Alexa fluor 594, Alexa fluor 610, Alexa fluor 633, Alexa fluor 635, Alexa fluor 647, Alexa fluor 660, Alexa fluor 680, Alexa fluor 700, Alexa fluor 750, BODIPY 형광단, BODIPY 492/515, BODIPY 493/503, BODIPY 500/510, BODIPY 505/515, BODIPY 530/550, BODIPY 542/563, BODIPY 558/568, BODIPY 564/570, BODIPY 576/589, BODIPY 581/591, BODIPY 630/650-X, BODIPY 650/665-X, BODIPY 665/676, FL, FL ATP, FI-Ceramide, R6G SE, TMR, TMR-X 접합체, TMR-X, SE, TR, TR ATP, TR-X SE, 로다민, 로다민 110, 로다민 123, 로다민 B, 로다민 B 200, 로다민 BB, 로다민 BG, 로다민 B extra, 5-카르복시테트라메틸로다민 (5-TAMRA), 5 GLD, 6-카르복시로다민 6G, Lissamine, Lissamine 로다민 B, Phallicidine, Phalloidine, 로다민 레드, Rhod-2, 6-카르복시-X-로다민 (ROX), 카르복시-X-로다민 (5-ROX), 술포로다민 B can C, 술포로다민 G Extra, 6-카르복시테트라메틸로다민 (TAMRA), 테트라메틸로다민 (TRITC), 로다민 WT, Texas Red, 및 Texas Red-X로 구성괸 군에서 선택되는, 결합 물질 또는 유도체.
  20. 청구항 1-19중 임의의 한 항에 있어서, 상기 결합 물질 또는 이의 유도체는 이에 고정적으로 부착된 작동체 모이어티를 포함하는, 결합 물질 또는 유도체.
  21. 청구항 20에 있어서, 이때 작동체 모이어티는 세포독성 약물, 톡신, 디프테리아 A 쇄, 엑소톡신 A 쇄, 리친 A 쇄, 아브린(abrin) A 쇄, 쿠르친(curcin), 크로틴(crotin), 페노마이신(phenomycin), 에노마이신(enomycin), 및 방사능화학물질로 구성괸 군에서 선택되는, 결합 물질 또는 유도체.
  22. 청구항 1-17중 임의의 한 항에 따른 결합 물질을 인코드하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  23. 청구항 22에 따른 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  24. 청구항 22의 단리된 폴리뉴클레오티드 및/또는 청구항 23의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  25. 청구항 1-21중 임의의 한 항에 따른 최소한 하나의 결합 물질 또는 유도체; 청구항 22에 따른 최소한 하나의 단리된 폴리뉴클레오티드; 청구항 23에 따른 최소한 하나의 발현 벡터; 및/또는, 청구항 24에 따른 최소한 하나의 숙주 세포; 또는 이의 조합; 및/또는 청구항 39-43중 임의의 한항에 따른 조합; 그리고 약학적으로 수용가능한 운반체를 포함하는 조성물.
  26. 세포 상에 PD-1을 탐지하는 방법에 있어서, 상기 방법은 생물학적 테스트 시료에 청구항 1-21중 임의의 한 항에 따른 결합 물질 또는 유도체, 및/또는 청구항 39-43항중 임의의 한 항에 따른 조합을 접촉시키고, 그리고 생물학적 시료 또는 이의 성분들에 결합된 결합 물질을 탐지하는 것을 포함하는, 방법.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 방법은 상기 방법은 생물학적 테스트 시료 또는 이의 성분들에 대한 결합량을 생물학적 대조 시료 또는 이의 성분들과 비교하는 것을 포함하는데, 이때 생물학적 대조 시료 또는 이의 성분들과 비교하여 생물학적 테스트 시료 또는 이의 성분들에 대하여 결합의 증가는 생물학적 테스트 시료에서 PD-1을 발현시키는 세포의 존재를 나타내는 방법.
  28. 청구항 26 또는 27에 있어서, 이때 생물학적 테스트 시료는 포유동물 혈액인, 방법.
  29. 청구항 26-28중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 방법은 생체내 방법인, 방법.
  30. 청구항 26-28중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 방법은 시험관내 방법인, 방법.
  31. 포유류에서 감염성 질환, 암 및/또는 자가면역을 치료, 방지 및/또는 개선시키기 위한 방법에 있어서, 이 방법은 청구항 1-21중 임의의 한 항에 따른 결합 물질 또는 이의 유도체 및/또는 청구항 39-43중 임의의 한 항에 따른 조합이 포함된 약학 조성물의 최소한 하나의 효과적인 투여분량을 상기 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  32. 청구항 31에 있어서, 이때 감염성 질환은 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)인, 방법.
  33. 청구항 31 또는 32에 있어서, 이때 감염성 질환, HIV 및/또는 암의 치료에 이용된 결합 물질 및/또는 이의 유도체는 PD-1 길항제인, 방법.
  34. 청구항 31에 있어서, 이때 자가면역 상태를 치료하는데 이용되는 상기 결합 물질 및/또는 이의 유도체는 PD-1 항진제인, 방법.
  35. 청구항 31-34중 임의의 한 항에 있어서, 이때 다중 투여분량이 상기 동물에 투여되는, 방법.
  36. 청구항 31-35중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 결합 물질은 약 1 내지 50 mg/kg의 투여량으로 투여되는, 방법.
  37. 세포 안에 또는 세포 상에서 PD-1의 발현을 탐지하기 위한 키트에 있어서, 상기 키트는 청구항 1-21중 임의의 한 항에 따른 결합 물질 또는 이의 유도체 그리고 사용 지침을 포함하는, 키트.
  38. 청구항 37에 있어서, 이때 상기 결합 물질, 항체, 또는 유도체는 동결건조된 형태로 있는, 키트.
  39. PD-1과 PD-L1의 상호작용을 차단하는 제 1 결합 물질과 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 차단하지 않는 제 2 결합 물질이 포함된, 결합 물질들의 조합.
  40. 청구항 39에 있어서, 이때 상기 제 2 결합 물질은 PD-1에 결합하는, 조합.
  41. 청구항 39에 있어서, 이때 제 1 및/또는 제 2 결합 물질들은 항체들인, 조합.
  42. 청구항 40에 있어서, 이때 상기 결합 물질들은 단클론 항체들인, 조합.
  43. 청구항 39에 있어서, 이때 상기 제 2 결합 물질은 서열 번호. 2, 25, 48, 71, 94 및 117; 또는 서열 번호. 17, 40, 63, 86, 109, 및 132의 아미노산 서열들을 포함하는, 조합.
  44. PD-1과 PD-L1의 상호작용을 차단하는 제 1 결합 물질과 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 차단하지 않는 제 2 결합 물질을 복합시키는 것을 포함하는, 청구항 39-43항중 임의의 한 항에 따른 조합을 만드는 방법.
  45. 청구항 44에 있어서, 이때 상기 제 2 결합 물질은 PD-1에 결합하는, 방법.
  46. 청구항 44에 있어서, 이때 제 1 및/또는 제 2 결합 물질들은 항체들인, 방법.
  47. 청구항 44에 있어서, 이때 상기 결합 물질들은 단클론 항체들인, 방법.
  48. 청구항 44에 있어서, 이때 상기 제 2 결합 물질은 서열 번호. 2, 25, 48, 71, 94 및 117; 또는 서열 번호. 17, 40, 63, 86, 109, 및 132의 아미노산 서열들을 포함하는, 방법.
  49. 청구항 44-48중 임의의 한 항에 있어서, 이때 약학적으로 수용가능한 부형제를 추가하는 것을 더 포함하는, 방법.
  50. 면역 세포에 청구항 39-43중 임의의 한 항에 따른 조합을 접촉시킴으로써, 항원 존재하에 면역 세포 증식을 유도하는 방법.
  51. PD-1 항체 결합 물질을 식별해내는 방법에 있어서, 다음을 포함하는 상기 방법:
    a) 소모 기능적 회복 분석 (EFRA)에 의해 후보 PD-1 결합 물질을 분석하고;
    b) PD-1의 후보 결합 물질의 친화력을 측정하고; 그리고,
    c) 후보 결합 물질의 상보성 결정 영역 (CDR)의 뉴클레오티드 서열을 결정한다.
  52. 청구항 1-11중 임의의 한 항에 따른 결합 물질을 만드는 방법에 있어서, 이 방법은 세포 안에서 상기 결합 물질을 발현시키고, 그리고 세포 또는 세포의 배양 상청액으로 부터 상기 결합 물질을 단리시키는 것을 포함하는, 방법.
  53. 청구항 52에 있어서, 숙주 세포 안에서 청구항 1-11중 임의의 한 항에 따른 결합 물질을 인코드하는 핵산을 발현시키는 것을 더 포함하는, 방법.
  54. 청구항 52 또는 53에 있어서, 상기 결합 물질을 단리시킨 후, 약학적으로 수용가능한 부형제와 복합시키는 것을 더 포함하는, 방법.
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