JP7089474B2 - 免疫学的試薬 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、その両方がここに参照することによって全体として本開示に組み込まれる、２０１６年１月２２日出願の米国特許出願第６２／２８６，２６９号、及び２０１６年２月３日出願の米国特許出願第６２／２９０，７４５号の優先権の利益を主張する。
本開示は、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）（例えば、ヒトＰＤ－１）に対する特異性を有する結合剤、並びに感染症（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ））、がん及び／又は自己免疫を治療及び／又は予防するためにそれを使用する方法に関する。
ＨＩＶが流行し始めてから４０年目に入り、ＨＩＶの病因に関する理解が進み、強力で安全な抗ウイルス薬の開発が大きな進歩を遂げてきた。３０種を超える抗ウイルス薬が登録され、組合せ抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）が罹患率及び死亡率に及ぼす影響は顕著なものとなっている。しかしながら、ＡＲＴを最適に順守した患者においてＨＩＶ複製の長期間にわたる抑制が達成されてきたにもかかわらず、治療の中断後にはＨＩＶは常に逆戻りする。さらに、成功した療法は、ＡＲＴの非存在下でＨＩＶ複製を制御できるウイルス特異的免疫応答を誘導せず、或いはその回復／発生を可能にしない。従って、大半のＨＩＶ感染対象においてＨＩＶ複製及び関連疾患を制御するために生涯にわたりＡＲＴが必要とされる。
ＨＩＶに潜伏感染した長寿命のセントラルメモリーＣＤ４ Ｔ細胞集団が、ＨＩＶ細胞リザバーの重要な構成要素として、及びＨＩＶの永続性の主要原因として、血液中において同定されている。この潜伏細胞リザバーの寿命は、ＡＲＴを用いた完全ＨＩＶ抑制の存在下ではおよそ７０年であると推定されている。しかし、近年の試験は、リンパ節内に常在するＣＤ４ Ｔ細胞の２つの集団が、ＨＩＶの感染、複製及び生成のための主要なＣＤ４ Ｔ細胞コンパートメントとして機能することを証明している。これらの２つのＣＤ４ Ｔ細胞集団は、ＰＤ－１及びＣＸＣＲ５の発現によって規定され、ＰＤ－１＋ＣＸＣＲ５＋、すなわち濾胞性ヘルパーＴ細胞（Ｔｆｈ）、及びＰＤ－１＋ＣＸＣＲ５－ＣＤ４ Ｔ細胞集団を含む。
ＨＩＶ潜伏細胞リザバーの確立及び維持を担う多数のメカニズムが提案されている。そのメカニズムの１つは、ＨＩＶ細胞リザバーを補充し得る、ＡＲＴ下での最小ウイルス複製の持続である。従って、ＡＲＴは、ＨＩＶ複製の完全抑制を誘導することができず、ＡＲＴ下での「天然」ＨＩＶ－１特異的免疫応答も、進行中の残留ウイルス複製を完全に抑制及び排除することができない。ＡＲＴ及びＨＩＶ特異的免疫応答の失敗は、永続的なＨＩＶ細胞リザバーをも標的とする代替介入を検討する理論的根拠を提供する。
これまでに多数の免疫学的介入が検討されてきたが、現在でも、持続的な抗ウイルス療法なしにウイルス複製が抑制されるＨＩＶの機能的治癒を達成することを目標として、さらに開発が続けられている（９）。治療的ワクチン戦略は検討された主要な介入戦略であったが、その結果は、実験動物モデル及び患者において、ＣＭＶをベースとするベクターＨＩＶワクチン（ＮＨＰモデルにおいて５０％の有効性；１０）を除いて、わずかな有効性しか示していない。近年の試験は、ＨＩＶ感染症における治療薬として抗エンベロープ広域中和抗体（ｂＮａｂｓ）を使用する可能性に関して興味深い結果をもたらした（１１、１２）。さらに、アンタゴニストＰＤ－１抗体（Ａｂ）は、ＨＩＶ感染患者においてＴ細胞機能を回復させることが示されており、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞応答の効力を増強する治療戦略として、これらの抗体を使用する可能性が提案されている（１３、１４）。
浸潤性腫瘍特異的ＣＤ８ Ｔ細胞が、増殖し及び細胞傷害活性を媒介する能力に関して機能不全であることはよく確証されている。大半の浸潤性腫瘍特異的ＣＤ８ Ｔ細胞は、いわゆる機能的疲弊状態にある。浸潤性腫瘍特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の疲弊を担う主要なメカニズムは、多数の調節受容体及び特にＰＤ－１調節受容体の発現の増加である。ＰＤ－１／ＰＤＬ－１／２（ＰＤ－１リガンド）の遮断（ブロック）がＣＤ８ Ｔ細胞の疲弊からの回復に関連していることの所見は、疲弊ＣＤ８ Ｔ細胞により発現されたＰＤ－１分子を標的とする介入戦略を開発するための理論的根拠を提供している。近年の試験は、進行性がん関連疾患を有する患者における、アンタゴニスト活性を有するＰＤ－１抗体の使用による極めて前途有望な結果を示している。試験は、進行性黒色腫、非小細胞性肺がん及び腎がんの患者において、１８～４０％の範囲の実質的な応答率を示している。これらの試験において、抗ＰＤ－１抗体は、単独で又は抗ＣＴＬ－Ａ４抗体と組み合わせて使用された。これらの初期の試験の後、血液腫瘍も含む様々な腫瘍の患者において、現在の試験が行なわれている。
本技術分野において、ＰＤ－１を標的とするための追加の試薬及びそれを使用する方法に対する要求がある。本開示は、ＰＤ－１及びそれを発現する細胞及び／又は組織を標的とするのに使用できる試薬及び方法を提供することによって、それらの要求に対処する。
本開示は、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）（例えば、ヒトＰＤ－１）に対して特異性を有する結合剤、並びに、例えば、感染症（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）による）、がん及び／又は自己免疫状態及び／又は神経変性状態を治療、予防及び／又は改善するためにそれを使用する方法に関する。ＰＤ－１と相互作用する結合剤を同定するための機能的アッセイも提供される。ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用をブロックする第１結合剤、及びＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用をブロックしない第２結合剤のような、結合剤の組合せも提供され、それらはＴ細胞を疲弊から救済するために相乗的に作用する。
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用の阻害に関する抗体濃度反応曲線（Ａ～Ｃ）。 残基３３～１４９からのＰＤ－１タンパク質のエクトドメインの構造表示。ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２のいずれかとの相互作用に関与するアミノ酸は、残基番号と共に紫の円で示す構造上の位置にある（残基番号は配列番号２７５に対応する（図３Ｈ））。 ＰＤ－１エクトドメインのアミノ酸配列である。アミノ酸置換の標的となる残基を、３１の突然変異（Ｍ１～Ｍ３１）のそれぞれについて示す。紫の文字で記載した残基は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用に関係するアミノ酸に該当し、緑の文字で示すアスパラギン残基はＮ－結合型グリコシル化の候補となる位置である。 改変ＰＤ－１ポリペプチドである。 改変ＰＤ－１ポリペプチドである。 改変ＰＤ－１ポリペプチドである。 改変ＰＤ－１ポリペプチドである。 改変ＰＤ－１ポリペプチドである。 改変ＰＤ－１ポリペプチドである。 ヒトＰＤ－１のアミノ酸配列（配列番号２７５）である。 サルＰＤ－１のアミノ酸配列である。 一過性トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞の表面で発現された改変ＰＤ－１タンパク質Ｍ１３、Ｍ１４及びＭ２３、並びに野生型（ＷＴ）対照（配列番号２７５）に対する、ブロッキング及び非ブロッキング抗ＰＤ－１抗体の結合。 一過性トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞の表面で発現された改変ＰＤ－１タンパク質Ｍ１３、Ｍ２３及びＭ４、並びに野生型（ＷＴ）対照（配列番号２７５）に対する、ブロッキング及び非ブロッキング抗ＰＤ－１抗体の結合。 一過性トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞の表面で発現された改変ＰＤ－１タンパク質Ｍ３１、Ｍ５及びＭ１８、並びに野生型（ＷＴ）対照（配列番号２７５）に対する、ブロッキング及び非ブロッキング抗ＰＤ－１抗体の結合。 一過性トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞の表面で発現された改変ＰＤ－１タンパク質Ｍ１、Ｍ９、Ｍ１３、Ｍ１７、Ｍ１８、Ｍ２３、及びＭ２８、並びに野生型（ＷＴ）対照（配列番号２７５）に対する、ブロッキング及び非ブロッキング抗ＰＤ－１抗体の結合。 一過性トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞の表面で発現された改変ＰＤ－１タンパク質Ｍ１７、Ｍ３０及びＭ２６、並びに野生型（ＷＴ）対照（配列番号２７５）に対する、ブロッキング及び非ブロッキング抗ＰＤ－１抗体の結合。 ＰＤ－１上の異なるエピトープに結合する２つのアンタゴニスト抗ＰＤ－１抗体（ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用に一方はブロッキング性でもう一方は非ブロッキング性）の組合せは、いずれかの抗体単独で達成される程度を超えて、ＨＩＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の機能的疲弊の救済を増強し及びその増殖を高める。 個々のアンタゴニスト抗ＰＤ－１抗体、並びにＰＤ－１上の異なるエピトープに結合する２つのアンタゴニスト抗ＰＤ－１抗体の組合せは、混合リンパ球反応アッセイにおいて、ＰＤ－１＋メモリーＣＤ４ Ｔ細胞の増殖（ａ）及びＩＦＮγ産生（ｂ）を高める。 ＰＤ－１の進化的に保存されたパッチＰ１（ａ）及びＰ２（ｂ）の構造表示。 異なる種由来のＰＤ－１エクトドメインのアミノ酸配列の整列（ｃ）。 活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞上の細胞表面ＰＤ－１に対する抗体競合結合試験。 部位特異的突然変異誘発及び抗体競合結合の結果の両方の組合せを用いた、ＰＤ－１構造に対する抗体結合部位のエピトープマッピング（ａ及びｂ）。 抗ＰＤ－１抗体単独又はＩｇＧ対照抗体と対比した、抗ＰＤ－１ ＡＤＣで処理した際の、ウイルス血症ＨＩＶ感染ドナー由来のＰＤ－１高ＣＤ４ Ｔ細胞における細胞死（Ａｑｕａ染色（ａ））又はアポトーシス（Ａｎｎｅｘｉｎ（アネキシン）Ｖ染色（ｂ））の選択的増加。 抗ＰＤ－１抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）処理は、複数の異なるウイルス血症ＨＩＶ感染ドナー由来のＰＤ－１高ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるアポトーシス（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ染色（ａ））及び／又は細胞死（Ａｑｕａ染色（ｂ））の増加をもたらす。抗ＰＤ－１抗体単独又はＩｇＧ１対照抗体のいずれかで処理した対照サンプルでは、低い細胞死／アポトーシスが観察される。 慢性感染ＨＩＶドナー由来のＰＤ－１陽性感染ＣＤ４＋ Ｔ細胞の抗ＰＤ－１抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）媒介死滅の評価。抗体処理の５日後、細胞を定量的ウイルスアウトグロースアッセイで用いて、様々な処理サンプルでの感染性細胞の数をモニターした。 １３７Ｆ２（ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用の）ブロッキング抗ＰＤ－１抗体由来の重鎖及び軽鎖可変ＣＤＲループを含むヒト化抗体パネル（Ａ３５７９５、Ａ３５７９６、Ａ３５７９７、１３７Ｆ２キメラ）、及び１３５Ｃ１２（ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用の）非ブロッキング抗ＰＤ－１抗体由来の重鎖及び軽鎖可変ＣＤＲループを含むヒト化抗体パネル（Ａ３５７７４、Ａ３５７８３、Ａ３５７８９、Ａ３４６４４３、１３５Ｃ Ｈ２Ｌ２、１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｃ、１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｂ、１３５Ｃ１２キメラ）の機能活性は、機能的疲弊回復アッセイでのＨＩＶペプチド特異的ＣＤ８ Ｔ細胞増殖の回復においてＭＫ３４７５と同等のアンタゴニスト活性を示す ＰＤ－１上の異なるエピトープに結合する２つのアンタゴニスト抗ＰＤ－１抗体（ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用に一方はブロッキング性（ＭＫ３４７５又はＡ３５７９５）でもう一方は非ブロッキング性（Ａ３５７７４））の組合せは、いずれかの抗体単独で達成される程度を超えて、ＨＩＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の機能的疲弊の救済を増強し及びその増殖を高める。 ＰＤ－１上の異なるエピトープに結合する２つのアンタゴニスト抗ＰＤ－１抗体（ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用に一方はブロッキング性（ＭＫ３４７５）でもう一方は非ブロッキング性（１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｂ又は１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｃ））の組合せは、いずれか一方の抗体単独で達成される程度を超えて、ＨＩＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の機能的疲弊の救済を増強し及びその増殖を高める。 ＴＣＲアクチベータ及びＰＤ－Ｌ１タンパク質を発現する一過性トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞株でのＪｕｒｋａｔ ＰＤ－１ ＮＦＡＴレポーター細胞株の刺激。Ａ．ＭＫ３４７５及びＡ３５７７４。Ｂ．ＭＫ３４７５及び１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｃ。 ブロッキング抗ＰＤ－１抗体、非ブロッキング抗ＰＤ－１抗体、又はブロッキング及び非ブロッキング抗ＰＤ－１抗体の組合せのいずれかを、慢性感染ＨＩＶドナー由来のメモリーＴ細胞と共にインキュベートした際の細胞表面ＰＤ－１のインターナリゼーション（内在化）。メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞（ａ、ｃ及びｅ）及びメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（ｂ、ｄ及びｆ）におけるＰＤ－１の細胞表面レベルを抗体処理後の様々な時間に測定した。 ＰＤ－１の高い基底レベルを有するメモリーＴ細胞を保有する慢性感染ＨＩＶドナー由来のＰＢＭＣを、ブロッキング抗ＰＤ－１抗体（ＭＫ３４７５）、非ブロッキング抗ＰＤ－１抗体（Ａ３５７７４）、又はブロッキング及び非ブロッキング抗ＰＤ－１抗体の組合せ（Ａ３５７７４及びＭＫ３４７５）のいずれかと共にインキュベートし、その後、ＰＤ－Ｌ１の存在下又は非存在下においてＴＣＲアクチベータ細胞で２４時間刺激した。ＰＤ－Ｌ１を発現するＴＣＲアクチベータ細胞での刺激において、ブロッキング及び非ブロッキング抗ＰＤ－１抗体の組合せでの処理は、細胞培地中のＩＦＮ－γレベル（Ａ）及びＰＤ－１＋ＣＤ８ Ｔ細胞に関連する細胞内ＩＦＮ－γレベル（Ｂ）を高める。 ｈＰＤ－１／Ｆａｂ Ａ３５７７４複合タンパク質の結晶。Ａ．ヒトＰＤ－１タンパク質と相互作用するＡ３５７７４の重鎖及び軽鎖ＣＤＲループ。Ｂ．ヒトＰＤ－Ｌ１（ＰＤＢ ４ＺＱＫ）を用いたｈＰＤ－１／Ｆａｂ Ａ３５７７４構造のモデリングは、非ブロッキング抗ＰＤ－１抗体が、ＰＤ－Ｌ１と比べてＰＤ－１上の別個のオーバーラップしないエピトープに結合することを確認する。 ヒト化ＩｇＧ４非ブロッキング抗ＰＤ－１抗体（１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｃ）、ブロッキング抗ＰＤ－１抗体キイトルーダ（登録商標）（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））（ＭＫ３４７５）、又は１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｃ＋キイトルーダの組合せの治療有効性を評価するために、ＰＤ－１ ＨｕＧＥＭＭマウスにおいてＩｎ ｖｉｖｏ有効性試験を実施した。（Ａ）ＭＣ３８細胞の平均腫瘍体積を、様々な抗体処置と対比して、ビヒクル対照マウスについて示す。（Ｂ）ビヒクル単独対照に対する、抗体処置した場合の腫瘍増殖の平均パーセント阻害。（Ｃ）移植したＭＣ３８腫瘍の完全寛解を示した、各抗ＰＤ－１処置群におけるマウスの割合（％）。 １３７Ｆ２可変重（ＶＨ）鎖。 １３７Ｆ２可変軽（ＶＬ）鎖。 １３５Ｃ可変重（ＶＨ）鎖。 １３５Ｃ可変軽（ＶＬ）鎖。
本開示は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで、細胞表面上のプログラム細胞死１（ＰＤ－１）タンパク質（例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第５，６９８，５２０号明細書（Ｈｏｎｊｏ，ｅｔ ａｌ．）の配列番号１、図１Ａ、図１Ｂ）（例えば、ヒトＰＤ－１）に結合する結合剤に関する。その結合剤は、単離ＰＤ－１ポリペプチド（例えば、ヒトＰＤ－１）及び／又はその断片及び／又は誘導体にも、典型的にはｉｎ ｖｉｔｒｏで、結合することができる。さらに、ＰＤ－１を発現する細胞の存在に関連する１つ又は複数の疾患を診断、治療、予防及び／又は改善するために、そのような結合剤を使用する方法も提供する。例えば、結合剤は、ＰＤ－１のエピトープと反応できる及び／又はＰＤ－１のエピトープに結合できる抗体（例えば、モノクローナル抗体）であってよい。本明細書に記載される「結合剤」は、例えば、ＰＤ－１のアゴニスト又はアンタゴニストを含んでいてよい。アゴニスト結合剤は、典型的には、Ｔ細胞機能及び／又はＰＤ－１の発現を回復させることのできない結合剤である。アゴニストＰＤ－１結合剤は、ＰＤ－１発現細胞が疾患の進行に関与する、自己免疫疾患等を治療するのに有用となり得る。対照的に、アンタゴニスト結合剤は、Ｔ細胞機能を回復させ及び／又はＰＤ－１の表面発現を低減させることができる結合剤である。例えば、ＰＤ－１アンタゴニスト結合剤は、ＨＩＶ感染症及び様々な腫瘍において生じることが知られている機能的疲弊から、ＰＤ－１発現Ｔ細胞の機能を回復させることができるであろう。Ｔ細胞機能の回復は、例えば、そのような細胞の増殖、サイトカイン産生、細胞傷害活性又はその他の特徴を測定することによって特定することができる。本明細書に記載される結合剤の別の用途は、複製可能なＨＩＶ（例えば、潜伏及び／又は複製状態にある）を含むＨＩＶ感染ＣＤ４＋ Ｔ細胞集団の選択的標的化及び排除である。そのようなＰＤ－１を発現するＰＤ－１発現細胞は、複製可能なＨＩＶのための主要細胞リザバーとして機能することが知られている。これらのＣＤ４＋ Ｔ細胞集団を排除するための１つの可能なメカニズムは、本明細書に記載される結合剤（例えば、単一及び／又は二重特異性ＰＤ－１抗体）を使用する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。一部の実施形態では、ＰＤ－１発現に起因する機能的疲弊からの抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の救済（例えば、増殖、サイトカイン産生及び／又は細胞傷害活性の回復又は改善）をそれらの細胞において誘導するために、例えば、異なる特異性（例えば、異なるエピトープを認識する）を有する１つ又は複数のＰＤ－１アンタゴニスト結合剤を組み合わせてよい。一部の実施形態では、本明細書に記載される結合剤を、ＰＤ－１発現細胞の選択的排除及び／又は抑制のために提供してもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＰＤ－１アゴニスト又はアンタゴニスト結合剤は、例えば、感染性疾患（例えば、ＨＩＶ）、がん、及び／又は特に自己免疫状態を治療するためにＰＤ－１発現細胞を抑制及び／又は排除するために使用してよい。その他の実施形態、使用などについては下記に記載する。
結合剤は、例えば、表１に示すアミノ酸配列の任意の１つ又は複数（及び／又はそれらの１つ又は複数の断片及び／又は誘導体）を含みうる、例えばモノクローナル抗体などの抗体であってよい。本開示はさらに、ＰＤ－１を発現する細胞を単離する、同定する及び／又は標的とするためのそのようなモノクローナル抗体の使用を提供する。ある実施形態では、これらのモノクローナル抗体は、細胞表面に発現されたＰＤ－１に対して反応性であってよい。用語「抗体」は、未精製形態又は部分精製形態（例えば、ハイブリドーマ上清、腹水、ポリクローナル抗血清）、或いは精製形態にある、全抗体又は断片化抗体を意味し得る。抗体は、例えば、マウス（例えば、マウスハイブリドーマ細胞によって生成される）を含む任意の好適な起源又は形態であってよく、或いは、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体などとして発現させてもよい。例えば、抗体は、完全に又は部分的にヒト（例えば、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、Ｉｇ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）、ＩｇＤ及びＩｇＥ）、イヌ（例えば、ＩｇＧＡ、ＩｇＧＢ、ＩｇＧＣ、ＩｇＧＤ）、ニワトリ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＹ）、ヤギ（例えば、ＩｇＧ）、マウス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）及び／又はブタ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）、ラット（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）抗体に由来するものであってよい。様々なタイプの抗体を調製、利用及び保存する方法は当業者に周知であり、本発明を実施するのに好適であろう（例えば、Ｈａｒｌｏｗ， ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９８８； Ｈａｒｌｏｗ， ｅｔ ａｌ． Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｎｏ． １， １９９８； Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５ （１９７５））； Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ， ３２１：５２２－５２５ （１９８６）； Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ， ３３２：３２３－３２９ （１９８８）； Ｐｒｅｓｔａ （Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．， ２：５９３－５９６ （１９９２）； Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ． （Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３９：１５３４－１５３６ （１９８８）； Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２７：３８１ （１９９１）； Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２２：５８１ （１９９１）； Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， ｐ． ７７ （１９８５）； Ｂｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４７（１）：８６－９５ （１９９１）； Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０， ７７９－７８３ （１９９２）； Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３６８ ８５６－８５９ （１９９４）； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３６８ ８１２－１３ （１９９４）； Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４， ８４５－５１ （１９９６）； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４， ８２６ （１９９６）； Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ， Ｉｎｔｅｒｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３ ６５－９３ （１９９５）；並びに米国特許第４，８１６，５６７号明細書；同第５，５４５，８０７号明細書；同第５，５４５，８０６号明細書；同第５，５６９，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；同第５，６６１，０１６号明細書；及び同第９，０９０，９９４号明細書を参照）。ある用途では、抗体は、ハイブリドーマ上清又は腹水中に含まれていてよく、そのまま直接又は標準技術を用いた濃縮後のいずれで使用してもよい。他の用途では、抗体は、例えば、塩析による分画及びイオン交換クロマトグラフィ、或いはアガロースビーズなどの固体支持体に共有結合したプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ及び／又はプロテインＬ、及び／又は他のリガンドを用いたアフィニティークロマトグラフィーを使用して、さらに精製してよい。抗体は、冷凍製剤（例えば、－２０ｏＣ又は－７０ｏＣ）、凍結乾燥形態を含む任意の好適な形態で、又は通常の冷蔵条件（例えば、４℃）下で保存してよい。例えば、液体形態で保存される場合、例えばトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの好適なバッファーを利用するのが好ましい。一部の実施形態では、結合剤は、非毒性の非経口的に摂取可能な希釈剤又は溶剤中の懸濁液のような、注射用製剤として調製することができる。利用できる好適なビヒクル及び溶剤として、特に、水、リンゲル液、及び等張塩化ナトリウム溶液、ＴＢＳ及び／又はＰＢＳが挙げられる。そのような製剤は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで使用するのに好適であり、当技術分野で知られているように調製することができ、正確な製剤は特定の用途に依存するであろう。
しかしながら、本明細書に記載される結合剤は、決して抗体に限定されない。例えば、結合剤は、別のものと類似の結合特性を示す任意の化合物（例えば、模倣物）であってよい。例えば、代表的な結合剤は、ＰＤ－１に結合する、及び／又はそれに対する特異性を有する結合剤（モノクローナル抗体）と競合できる結合剤であってよい。一部の実施形態では、模倣物は、比較される結合剤（例えば、モノクローナル抗体）と、結合アッセイにおいて実質的に同一の親和性を示し得る。特定の結合剤の親和性は、限定はされないが、実施例において記載するような活性化ＣＤ４ Ｔ細胞での内因性細胞表面ＰＤ－１のＦＡＣＳ染色などの、任意の好適なアッセイによって測定することができる。１つの結合剤が、別の結合剤と測定値（例えば、ナノモル親和性での見かけの結合定数）が相互に約１～２０、１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、又は２５０％のいずれかの範囲内にある場合は、別の結合剤と「実質的に同一の親和性」を有すると言うことができる。典型的な模倣物として、例えば、ＰＤ－１に特異的に結合する有機化合物、又はアフィボディ（Ｎｙｇｒｅｎ，ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｊ．２７５（１１）：２６６８－７６（２００８））、アフィリン（Ｅｂｅｒｓｂａｃｈ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７２（１）：１７２－８５（２００７））、アフィチン（Ｋｒｅｈｅｎｂｒｉｎｋ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８３（５）：１０５８－６８（２００８））、アンチカリン（Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．ＦＥＢＳ Ｊ．２７５（１１）：２６７７－８３（２００８））、アビマー（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１２）：１５５６－６１（２００５））、ＤＡＲＰｉｎ（Ｓｔｕｍｐｐ，ｅｔ ａｌ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ １３（１５－１６）：６９５－７０１（２００８））、フィノマー（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２（５）：３１９６－３２０４（２００７））、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド（Ｎｉｘｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．９（２）：２６１－８（２００６））及び／又はモノボディ（Ｋｏｉｄｅ，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５２：９５－１０９（２００７））などが挙げられる。他の模倣物として、例えば、抗体の誘導体、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ’一本鎖抗体、Ｆｖ，単一ドメイン抗体、単一特異性抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、多価抗体、キメラ抗体、イヌ－ヒトキメラ抗体、イヌ－マウスキメラ抗体、イヌＦｃを含む抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、イヌ化、ＣＤＲグラフト化抗体、サメ抗体、ナノボディ、ラクダ抗体、マイクロボディ及び／又はイントラボディ又はそれらの誘導体が挙げられる。当業者に理解されるように、その他の結合剤もこの中で提供される。
ＰＤ－１に対する特異性を有する（例えば、結合する）結合剤を作製するために、当業者に知られている任意の方法を使用してよい。例えば、モノクローナル抗体を作製及び単離するために、マウスなどの動物に１つ又は複数のＰＤ－１タンパク質（例えば、ＰＤ－１ Ｆｃ融合タンパク質及び／又はＰＤ－１ Ｈｉｓタグタンパク質）を投与することができる。次に、抗ＰＤ－１ハイブリドーマ細胞株を作製するために、活性化ヒトＴリンパ球で発現されたＰＤ－１に対して（例えば、フローサイトメトリー及び／又は顕微鏡によって特定されるような）血清反応性を示す動物を選択する。これを、複数回ラウンドにわたり繰り返してよい。例えば、第１ラウンドの結合剤選択のための一次基準は：ｉ）フローサイトメトリーによる活性化ヒトＴリンパ球上のＰＤ－１の染色レベル；（ｉｉ）既存の抗ＰＤ－１抗体と比較したＣＤＲ ＶＨ及びＶＬ配列の多様性；及び（ｉｉｉ）ＰＤ－Ｌ１と又はＰＤ－１上の異なるエピトープに結合する数種の市販されている抗ＰＤ－１抗体結合の１つと事前結合させたＰＤ－１コンジュゲートＬｕｍｉｎｅｘビーズを用いた競合結合試験によって実施されるエピトープマッピング；を含んでいてよいが、それらに限定されない。典型的な第１又は第２ラウンドの選択は、例えば、親和性結合（抗ＰＤ－１抗体の刺激能力と相関しない可能性があるため一次基準ではない）、及び／又は結合剤をアゴニスト又はアンタゴニストとして同定するための機能的特性解析も含んでいてよい。
本明細書の実施例１に記載するように、例えば、機能的疲弊回復アッセイ（Exhaustion Functional recovery assay)（ＥＦＲＡ）を使用できる。このアッセイでは、Ｔ細胞などの免疫細胞を疲弊から救済する能力について試験結合剤をアッセイすることができる。これは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のようなウイルスに由来する試験ペプチドなどの抗原の存在下において、そのような細胞に増殖を回復させる結合剤の能力を測定することによって特定できる。増殖は、例えば試験ペプチド単独のような対照、又は例えばＭＫ－３４７５（ペンブロリズマブ）のような陽性対照である抗ＰＤ－１抗体と比較して、ＣＦＳＥアッセイにおいて測定される。一部の実施形態では、その比較が、ペプチド単独対照又はアイソタイプ対照マウスＩｇＧ１抗体と共にペプチドを使用した場合と比較して、有意差（例えば、＜０．００１のＰ値）を示す場合に、結合剤は増殖を回復させると特定される。このアッセイを用いて、ＰＤ－１への結合について他の結合剤（例えば、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２）と競合する及び／又は免疫細胞の機能的回復をもたらす結合剤（例えば抗体）を同定することができる。実施例１は、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）に基づくアッセイを使用してこの中に記載されている（例えば、表３に列挙した）抗体をエピトープマッピングする２つの方法も記載する。１つの生化学的アッセイでは、ＰＤ－１ Ｆｃ融合タンパク質をビーズに結合させ、表３に記載されている抗ＰＤ－１抗体と２つの異なる市販の抗ＰＤ－１抗体の内の１つとの間で、競合結合試験を実施する。実施例１は、ＰＤ－１上の別個のエピトープに結合するモノクローナル抗体の４つのクラス：クラス１（ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用をブロックする第１モノクローナル抗体と競合的）、クラス２（ＰＤ－１に結合するがＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用をブロックしない第２モノクローナル抗体と競合的）、クラス３（第１及び第２モノクローナル抗体の両方と競合的）及びクラス４（第１及び第２抗体のいずれとも非競合的）を記載する。別個のアッセイにおいて、組換えＰＤ－１タンパク質に対する結合についての競合を、表３に列挙する抗ＰＤ－１抗体とビオチン化ＰＤ－Ｌ１組換えタンパク質について評価した。ＥＦＲＡにおいて増殖を誘導した抗体は、ＰＤ－１上の異なるエピトープに結合するとして提案された４つの結合クラスの全てから同定された。さらに、ＥＦＲＡは、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用にブロッキング性又は非ブロッキング性のいずれかでありかつＨＩＶ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞に対する増殖機能を特異的に回復させた抗ＰＤ－１抗体の同定を可能にした。
結合剤の組合せも同定することができる。一部の実施形態では、１つ又は複数の結合剤のみを使用して他の物質を使用しないで得られた結果と比較して統計的有意差をもたらす組合せを同定することができる。一部の実施形態では、免疫細胞機能を回復させる相乗的又は協働的能力を示す組合せを同定できる。一部の実施形態では、組合せは、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用をブロックする第１結合剤を、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用をブロックしない第２結合剤とともに含んでいてよい。第１及び第２結合剤は、例えば２種以上の異なるモノクローナル抗体又はそれらの誘導体などの異なる構成要素であっても、或いは、例えば二重機能性抗体（複数の結合特異性を有する単一抗体又はその誘導体）のような同一構成要素上に見いだされてもよい。例えば、典型的な二重機能性抗体は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用をブロックする第１結合領域、及びＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用をブロックしない第２結合領域を含んでいてよい。さらに、複数のタイプの各結合剤を提供する組合せも企図されている。例えば、組合せは、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用をブロックしない１つ又は複数の結合剤とともに、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用をブロックする複数のタイプの結合剤を含んでいてよい。一部の実施形態では、組合せは、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用をブロックしない複数の結合剤とともに、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用をブロックする１つ又は複数の結合剤を含んでいてよい。一部の実施形態では、組合せは、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用をブロックする複数の結合剤を、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用をブロックしない複数の結合剤とともに含んでいてもよい。本明細書に記載されているそのような組合せは、ＣＴＬＡ－４などに対する抗体のような、免疫細胞機能に影響し得る１又は複数の他の作用物質と組み合わせてもよい。当業者は、多数のそのような組合せが本明細書に記載される用途に好適となり得ることを認識できるであろう。
結合剤が抗体である場合、その可変領域及び／又は相補性決定領域（「ＣＤＲ」）に対応するヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列に関して、抗体を同定することができる。可変領域／ＣＤＲ配列は、１つ又は複数の他の可変領域／ＣＤＲアミノ酸配列と組み合わせて使用できる。可変領域／ＣＤＲアミノ酸配列は、代りに及び／又はさらに、抗体分子の１つ又は複数のタイプの定常領域ポリペプチドに隣接させることができる。例えば、表１Ａ及び１Ｂに示したＣＤＲアミノ酸配列は、同一又は異なる種（例えば、ヒト、ヤギ、ラット、ヒツジ、ニワトリ）の任意の抗体分子の及び／又はそのＣＤＲアミノ酸配列が由来する抗体サブタイプの、定常領域に隣接又は結合していてよい。例えば、例示的な結合剤は、列挙されているハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体、又はそれに由来する、又はそれに関連するものでよく、及び／又は表３及び１１～１３に示されているのとほぼ同一の親和性及び／又は増殖効果を有する、及び／又は同じ結合クラスを有するものでよく、及び／又は配列番号１～１９０のアミノ酸配列及び／又は表１Ａ及び１Ｂに示すアミノ酸配列のいずれか１つ又は複数を有していてもよい。結合剤は、それぞれが１つ又は複数の定常領域及び／又は可変領域を含む抗体重鎖及び／又は軽鎖を含んでいてよい。可変領域は、典型的には、抗体の結合特異性を決定できる１つ又は複数のＣＤＲを含んでいる。モノクローナル抗体は、そのような可変領域の（例えば、そのようなヌクレオチド配列によってコードされ得る）アミノ酸配列の解析によって同定することができる。例えば、ＰＤ－１に結合する結合剤の重鎖ＣＤＲの典型的なアミノ酸配列は、配列番号１～１９０からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び／又は表１Ａ及び／又は１Ｂに示す任意の他の配列を含む１つ又は複数を含んでいてよい。本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれか及び／又はそれらの任意の断片及び／又は誘導体を、標準技術を使用して、任意の順序及び／又は組合せで任意の他の可変領域及び／又はＣＤＲと結合させてハイブリッド及び／又は融合結合剤を形成する、及び／又は他の重鎖及び／又は軽鎖可変領域内に挿入してもよい。本開示のＰＤ－１（例えば、ヒトＰＤ－１）結合剤内に見られるＣＤＲの典型的な組合せ（例えば、重鎖及び／又は軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３アミノ酸配列の組合せ）として、例えば、表１Ａ及び／又は１Ｂに示す実施形態が挙げられる。
Figure 0007089474000001
Figure 0007089474000002
好ましい実施形態では、各クローンの重鎖ＣＤＲを、それらのそれぞれの軽鎖ＣＤＲと組み合わせて結合剤とする。一部の実施形態では、結合剤は、下記に示す重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲを含んでいてよい：
１２２Ｆ１０（配列番号１、２４、４７、７０、９３、及び１１６）；
１３９Ｄ６ （配列番号２、２５、４８、７１、９４、及び１１７）；
１３５Ｄ１ （配列番号３、２６、４９、７２、９５、及び１１８）；
１３４Ｄ２ （配列番号４、２７、５０、７３、９６、及び１１９）；
１２１Ｇ１ （配列番号５、２８、５１、７４、９７、及び１２０）；
１３６Ｂ５ （配列番号６、２９、５２、７５、９８、及び１２１）；
１２７Ｃ２ （配列番号７、３０、５３、７６、９９、及び１２２）；
１３７Ｆ２ （配列番号８、３１、５４、７７、１００、及び１２３）；
１３８Ｈ５ （配列番号９、３２、５５、７８、１０１、及び１２４）；
１４０Ａ１ （配列番号１０、３３、５６、７９、１０２、及び１２５）；
１３５Ｈ１２（配列番号１１、３４、５７、８０、１０３、及び１２６）；
１３１Ｄ１１（配列番号１２、３５、５８、８１、１０４、及び１２７）；
１３２Ｆ７ （配列番号１３、３６、５９、８２、１０５、及び１２８）；
１２６Ｅ４ （配列番号１４、３７、６０、８３、１０６、及び１２９）；
１３５Ｇ１ （配列番号１５、３８、６１、８４、１０７、及び１３０）；
１３６Ｅ１０（配列番号１６、３９、６２、８５、１０８、及び１３１）；
１３５Ｃ１２（配列番号１７、４０、６３、８６、１０９、及び１３２）；
１３６Ｆ４ （配列番号１８、４１、６４、８７、１１０、及び１３３）；
１３６Ｂ４ （配列番号１９、４２、６５、８８、１１１、及び１３４）；
１３５Ｅ１０（配列番号２０、４３、６６、８９、１１２、及び１３５）；
１４０Ｇ５ （配列番号２１、４４、６７、９０、１１３、及び１３６）；
１２２Ｈ２ （配列番号２２、４５、６８、９１、１１４、及び１３７）；又は
１３９Ｆ１１（配列番号２３、４６、６９、９２、１１５、及び１３８）。

この中に記載されているＣＤＲの１つ又は複数を含む例示的な重鎖及び軽鎖可変領域は、限定はされないが、ヒト化重鎖及び／又は軽鎖可変領域を含んでいてよい。例えば、１３７Ｆ２重鎖ＣＤＲ（配列番号８、３１及び５４）を含む例示的なヒト化「１３７Ｆ２」可変重鎖配列として、下記のものが挙げられる：

ＱＭＱＬＶＱＳＧＰＥＶＫＫＰＧＴＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＦＴＦＴＮＹＷＩＧＷＶＲＱＡＰＧＱＡＬＥＷＭＧＤＩＹＰＧＧＧＹＴＮＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＤＦＶＬＤＲＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（Ａ３５７９０－ＶＨ（配列番号１３９））；

ＱＭＱＬＶＱＳＧＰＥＶＫＫＰＧＴＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＦＴＦＴＮＹＷＩＧＷＶＲＱＡＰＧＱＡＬＥＷＭＧＤＩＹＰＧＧＧＹＴＮＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＤＦＶＬＤＲＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（Ａ３５７９６－ＶＨ（配列番号１４０））；

ＱＭＱＬＶＱＳＧＰＥＶＫＫＰＧＴＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＦＴＦＴＮＹＷＩＧＷＶＲＱＡＰＧＱＡＬＥＷＭＧＤＩＹＰＧＧＧＹＴＮＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＤＦＶＬＤＲＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（Ａ３５７９３－ＶＨ（配列番号１４１））；

ＱＭＱＬＶＱＳＧＰＥＶＫＫＰＧＴＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＦＴＦＴＮＹＷＩＧＷＶＲＱＡＰＧＱＡＬＥＷＭＧＤＩＹＰＧＧＧＹＴＮＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＤＦＶＬＤＲＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（Ａ３５８１８－ＶＨ（配列番号１４２））；

ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＷＩＧＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＤＩＹＰＧＧＧＹＴＮＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＤＦＶＬＤＲＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（Ａ３５７９５－ＶＨ（配列番号１４３））；

ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＨＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＮＹＷＩＧＷＶＲＱＡＴＧＱＧＬＥＷＭＧＤＩＹＰＧＧＧＹＴＮＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＤＦＶＬＤＲＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（Ａ３５７９７－ＶＨ（配列番号１４４））；

ＱＭＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＴＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＷＩＧＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＤＩＹＰＧＧＧＹＴＮＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＤＦＶＬＤＲＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（Ａ３５７９９－ＶＨ（配列番号１４５））；

ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＷＩＧＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＤＩＹＰＧＧＧＹＴＮＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＤＦＶＬＤＲＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（Ａ３５８０５－ＶＨ（配列番号１４６））；

ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＷＩＧＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＤＩＹＰＧＧＧＹＴＮＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＤＦＶＬＤＲＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（１３７Ｆ ＶＨ１（配列番号１４７））；

ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＡＧＹＴＦＴＮＹＷＩＧＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＤＩＹＰＧＧＧＹＴＮＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＭＴＡＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＤＦＶＬＤＲＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（１３７Ｆ ＶＨ２（配列番号１４８））；

ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＷＩＧＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＤＩＹＰＧＧＧＹＴＮＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＭＴＡＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＤＦＶＬＤＲＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（１３７Ｆ ＶＨ１ｂ（配列番号１４９））；及び／又は、

ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＷＩＧＷＩＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＤＩＹＰＧＧＧＹＴＮＹＮＥＫＦＫＧＲＡＴＬＴＡＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＶＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＤＦＶＬＤＲＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（１３７Ｆ ＶＨ１ｃ（配列番号１５０））。

１３７Ｆ２軽鎖ＣＤＲ（配列番号７７、１００及び１２３）を含む例示的なヒト化「１３７Ｆ２」可変軽鎖配列として、下記のものが挙げられる：

ＤＶＶＭＴＱＳＰＡＦＬＳＶＴＰＧＥＫＶＴＩＴＣＫＳＳＱＳＬＦＮＳＥＴＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＫＱＳＹＴＬＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（Ａ３５７９０－ＶＬ（配列番号１５１））；

ＤＶＶＭＴＱＳＰＡＦＬＳＶＴＰＧＥＫＶＴＩＴＣＫＳＳＱＳＬＦＮＳＥＴＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＫＱＳＹＴＬＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（Ａ３５７９６－ＶＬ（配列番号１５２））；

ＤＶＶＭＴＱＳＰＡＦＬＳＶＴＰＧＥＫＶＴＩＴＣＫＳＳＱＳＬＦＮＳＥＴＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＫＱＳＹＴＬＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（Ａ３５７９３－ＶＬ（配列番号１５３））；

ＤＶＶＭＴＱＳＰＡＦＬＳＶＴＰＧＥＫＶＴＩＴＣＫＳＳＱＳＬＦＮＳＥＴＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＫＱＳＹＴＬＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（Ａ３５８１８－ＶＬ（配列番号１５４））；

ＤＶＶＭＴＱＳＰＡＦＬＳＶＴＰＧＥＫＶＴＩＴＣＫＳＳＱＳＬＦＮＳＥＴＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＫＱＳＹＴＬＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（Ａ３５７９５－ＶＬ（配列番号１５５））；

ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＳＳＱＳＬＦＮＳＥＴＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＫＱＳＹＴＬＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（Ａ３５７９７－ＶＬ（配列番号１５６））；

ＤＶＶＭＴＱＳＰＡＦＬＳＶＴＰＧＥＫＶＴＩＴＣＫＳＳＱＳＬＦＮＳＥＴＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＫＱＳＹＴＬＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（Ａ３５７９９－ＶＬ（配列番号１５７））；

ＤＶＶＭＴＱＳＰＡＦＬＳＶＴＰＧＥＫＶＴＩＴＣＫＳＳＱＳＬＦＮＳＥＴＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＫＱＳＹＴＬＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（Ａ３５８０５－ＶＬ（配列番号１５８））；

ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＦＮＳＥＴＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＳＹＴＬＲＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（１３７Ｆ ＶＬ１（配列番号１５９））；

ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＴＣＫＳＳＱＳＬＦＮＳＥＴＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＦＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＬＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＳＹＴＬＲＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（１３７Ｆ ＶＬ２（配列番号１６０））；


ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＦＮＳＥＴＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＳＹＴＬＲＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（１３７Ｆ ＶＬ１ｂ（配列番号１６１））；

ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＴＣＫＳＳＱＳＬＦＮＳＥＴＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＦＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＳＹＴＬＲＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（１３７Ｆ ＶＬ１ｃ（配列番号１６２））；及び／又は、

ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＭＴＣＫＳＳＱＳＬＦＮＳＥＴＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＦＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＳＹＴＬＲＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（１３７Ｆ ＶＬ１ｄ（配列番号１６３））。

３５Ｃ１２重鎖ＣＤＲ（配列番号１７、４０及び６３）を含む例示的なヒト化「１３５Ｃ１２」可変重鎖配列として下記のものが挙げられる：

ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＮＦＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＳＩＹＰＮＹＧＤＴＡＹＮＱＫＦＫＤＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（Ａ３５７７５－ＶＨ（配列番号１６４））；

ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＮＦＹＩＨＷＶＲＱＡＲＧＱＲＬＥＷＩＧＳＩＹＰＮＹＧＤＴＡＹＮＱＫＦＫＤＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（Ａ３５７８３－ＶＨ（配列番号１６５））；

ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＮＦＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＳＩＹＰＮＹＧＤＴＡＹＮＱＫＦＫＤＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（Ａ３５７７４－ＶＨ（配列番号１６６）；

ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＴＶＫＩＳＣＫＶＳＧＹＴＦＴＮＦＹＩＨＷＶＲＱＡＲＧＱＲＬＥＷＩＧＳＩＹＰＮＹＧＤＴＡＹＮＱＫＦＫＤＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（Ａ３６４４３－ＶＨ（配列番号１６７））；

ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＴＶＫＩＳＣＫＶＳＧＹＴＦＴＮＦＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＳＩＹＰＮＹＧＤＴＡＹＮＱＫＦＫＤＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（Ａ３５７７７－ＶＨ（配列番号１６８））；

ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＮＦＹＩＨＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＳＩＹＰＮＹＧＤＴＡＹＮＱＫＦＫＤＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（Ａ３５７８９－ＶＨ（配列番号１６９））；

ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＮＦＹＩＨＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＳＩＹＰＮＹＧＤＴＡＹＮＱＫＦＫＤＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（Ａ３６４４８－ＶＨ（配列番号１７０））；

ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＮＦＹＩＨＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＳＩＹＰＮＹＧＤＴＡＹＮＱＫＦＫＤＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（Ａ３６４３７－ＶＨ（配列番号１７１））；

ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＦＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＳＩＹＰＮＹＧＤＴＡＹＮＱＫＦＫＤＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（１３５Ｃ ＶＨ１（配列番号１７２））；

ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＦＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＳＩＹＰＮＹＧＤＴＡＹＮＱＫＦＫＤＲＶＴＭＴＶＤＫＳＴＳＴＶＹＭＥＬＲＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（１３５Ｃ ＶＨ２（配列番号１７３））；

ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＦＹＩＨＷＶＫＱＡＨＧＱＧＬＥＷＭＧＳＩＹＰＮＹＧＤＴＡＹＮＱＫＦＫＤＲＶＴＭＴＶＤＫＳＴＳＴＶＹＭＥＬＲＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（１３５Ｃ ＶＨ３（配列番号１７４））；

ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＦＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＳＩＹＰＮＹＧＤＴＡＹＮＱＫＦＫＤＲＶＴＭＴＶＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（１３５Ｃ ＶＨ１ｂ（配列番号１７５））；

ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＦＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＳＩＹＰＮＹＧＤＴＡＹＮＱＫＦＫＤＲＡＴＬＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（１３５Ｃ ＶＨ１ｃ（配列番号１７６））；及び／又は、

ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＦＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＳＩＹＰＮＹＧＤＴＡＹＮＱＫＦＫＤＲＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（１３５Ｃ ＶＨ１ｄ（配列番号１７７））。

１３５Ｃ１２軽鎖ＣＤＲ（配列番号８６、１０９及び１３２）を含む例示的なヒト化「１３５Ｃ１２」可変軽鎖配列として下記のものが挙げられる：

ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＧＩＳＧＤＬＮＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＨＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＹＹＳＫＤＬＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（Ａ３５７７５－ＶＬ（配列番号１７８））；

ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＧＩＳＧＤＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＴＰＫＬＬＩＹＨＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＹＹＳＫＤＬＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（Ａ３５７８３－ＶＬ（配列番号１７９））；

ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＧＩＳＧＤＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＨＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＹＹＳＫＤＬＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（Ａ３５７７４－ＶＬ（配列番号１８０））；

ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＧＩＳＧＤＬＮＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＨＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＹＹＳＫＤＬＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（Ａ３６４４３－ＶＬ（配列番号１８１））；

ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＧＩＳＧＤＬＮＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＨＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＹＹＳＫＤＬＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（Ａ３５７７７－ＶＬ（配列番号１８２））；

ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＧＩＳＧＤＬＮＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＨＴＳＳＬＨＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＹＹＳＫＤＬＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（Ａ３５７８９－ＶＬ（配列番号１８３））；

ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＧＩＳＧＤＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＴＰＫＬＬＩＹＨＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＹＹＳＫＤＬＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（Ａ３６４４８－ＶＬ（配列番号１８４））；

ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＧＩＳＧＤＬＮＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＨＴＳＳＬＨＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＹＹＳＫＤＬＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（Ａ３６４３７－ＶＬ（配列番号１８５））；

ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＧＩＳＧＤＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＨＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＹＹＳＫＤＬＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（１３５Ｃ ＶＬ１（配列番号１８６））；

ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＧＩＳＧＤＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＶＫＬＬＩＹＨＴＳＳＬＨＳＧＶＰＬＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＹＹＳＫＤＬＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（１３５Ｃ ＶＬ２（配列番号１８７））；

ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＧＩＳＧＤＬＮＷＹＱＱＫＳＤＧＡＶＫＬＬＩＹＨＴＳＳＬＨＳＧＶＰＬＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＹＹＳＫＤＬＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（１３５Ｃ ＶＬ３（配列番号１８８））；

ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＧＩＳＧＤＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＨＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＹＹＳＫＤＬＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（１３５Ｃ ＶＬ１ｂ（配列番号１８９））；及び／又は、

ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＧＩＳＧＤＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＶＫＬＬＩＹＨＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＹＹＳＫＤＬＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＬＫ（１３５Ｃ ＶＬ１ｃ（配列番号１９０））。

これらのアミノ酸配列をコードする例示的な核酸配列、及び／又はそれを特定する方法もこの中に記載されている（例えば、配列番号１９１～２４３）。上記の或いはこの中に記載されている適合するヒト化可変配列の任意のものを互いに組み合わせて、ＰＤ－１に結合する抗体のような結合剤を提供してもよい。例えば、ある実施形態では、配列番号１４３及び１５５を組み合わせて結合剤にしてよく（例えばモノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ａ３５７９５のように）；配列番号１６６及び１８０を組み合わせて結合剤にしてよく（例えばｍＡｂ Ａ３５７７４のように）；配列番号１９６及び１８９を組み合わせて結合剤にしてよく（例えばｍＡｂ １３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｂのように）；配列番号１９６及び１９０を組み合わせて結合剤にしてよい（例えばｍＡｂ １３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｃのように）。さらに、表２に示すように、可変重鎖及び軽鎖が結合剤内に存在して（例えば結合して）もよい：
Figure 0007089474000003
「ブロッキング」抗体は、限定はされないが、例えばＬｕｍｉｎｅｘ生化学的ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用アッセイ（図１）などの任意の適したアッセイにより特定される、細胞表面上のＰＤ－１への結合に関してＰＤ－Ｌ１と競合するものである。ブロッキング抗ＰＤ－１抗体を用いて実施するエピトープマッピング試験は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用とオーバーラップするＰＤ－１の領域を位置づける。「非ブロッキング」抗体は、限定はされないが、例えばＬｕｍｉｎｅｘ生化学的ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用アッセイ（図１）などの適したアッセイにおいてＰＤ－１への結合に関してＰＤ－Ｌ１と部分的にしか競合しない又は全く競合しないものである。エピトープマッピング試験及び／又はヒトＰＤ－１／Ｆａｂ共結晶化試験は、非ブロッキング抗体が、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用とオーバーラップする部位ではＰＤ－１と結合しないことを確認する。ある実施形態では、結合剤は、例えば、二重特異性抗体中にそのような配列の対を２組以上含んでいてよい（例えば、配列番号１４３及び１５５、並びに配列番号１６６及び１８０を組み合わせて結合剤又は結合剤の組合せにしてよい）。他の組合せも、当業者に確認されるように、有用となりうる。
表１Ａ及び／又は１ＢのＣＤＲを含む結合剤、又はこの中に記載されている（例えば、配列番号１３９～１９０を含む及び／又は表２に示されている）結合剤は、下記の特徴を示し得る：
Figure 0007089474000004
実施例で説明するように、エピトープマッピング試験は、「Ｐ１」及び「Ｐ２」と指定される、この中に記載されている結合剤が結合しうるＰＤ－１上の少なくとも２つの保存されたパッチ（線形及び／又は立体構造エピトープを含む）を示した（例えば、図１１ａ及び１１ｂを参照）。Ｐ１パッチは、進化的に保存されており、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２リガンドとの間の相互作用に関与するＰＤ－１の中心領域に相当し、図２及び図１１ａにおいて紫の円に該当する。第２の「パッチ」Ｐ２も進化的に保存されており、Ｐ１パッチと同様の表面領域であるが異なるアミノ酸配列を占める（図１１ｂ）。Ｐ２は、ＰＤ－１における既に同定された構造的又は機能的役割を有していない。例えば１３５Ｃ１２（配列番号１７、４０、６３、８６、１０９、及び１３２）、１３９Ｄ６（配列番号２、２５、４８、７１、９４、及び１１７）、１３５Ｄ１（配列番号３、２６、４９、７２、９５、及び１１８）、及び１３６Ｂ４（配列番号１９、４２、６５、８８、１１１、及び１３４）のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ－１抗体などの、この中に記載されているＰＤ－１結合剤は、Ｐ２パッチとオーバーラップするエピトープに結合し、それによってＰＤ－１のこの新たに同定された機能的領域の機能的重要性の直接の証拠を提供する。実施例は、図３に示される改変ＰＤ－１ポリペプチド及び配列番号２４４～２７４を用いて実施したエピトープマッピング試験を記載する。これらの試験は、最も高い「機能的能力」又は「アンタゴニスト活性」を有する非ブロッキング抗体が、Ｍ４アミノ酸置換の領域（セリン３８をアラニンへ、プロリン３９をアラニンへ、及びロイシン４１をアラニンへ（図３；配列番号２４７））、及び／又はＭ１７アミノ酸置換の領域（アスパラギン１０２をアラニンへ、及びアルギニン１０４をアラニンへ（図３；配列番号２６０））、及び／又はＭ１８アミノ酸置換の領域（アスパラギン酸１０５をアラニンへ（図３；配列番号２６１））、及び／又はＭ２６アミノ酸置換の領域（アルギニン１３８をアラニンへ、及びグルタミン酸１４１をアラニンへ（図３；配列番号２６９））、及び／又はＭ３１アミノ酸置換の領域（ロイシン４１をアラニンへ、及びバリン４３をロイシンへ（図３；配列番号２７４））とオーバーラップするＰＤ－１の「パッチ」に結合することを示した。この「パッチ」はこの中で「Ｐ２」と称される。これらの試験は、Ｐ２が、そのような非ブロッキング抗体が結合する少なくとも１つのエピトープ（線形エピトープ、立体構造エピトープ、又はそれらの組合せを含む）を含むことを実証する。この領域がＰＤ－１の機能活性に従来の関わりを持たないことを考えると、Ｐ２への結合が、ＰＤ－１へのアンタゴニスト活性が発揮されうるＰＤ－１上の新規部位での新規な作用メカニズムを示すことをここで提案する。ＰＤ－１のＰ２領域と相互作用できる他の抗体、抗体断片、又は他のタンパク質結合剤も、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用の遮断を介して作用する抗ＰＤ－１抗体とは区別されかつそれに相補的な態様で、ＰＤ－１アンタゴニストとして作用し得ることをさらに提案する。この中に記載されている結合剤は、例えば、今はまだ同定されていないリガンドと相互作用する；ＰＤ－１の多量体化を干渉する、誘導する及び／又は増強する；及び／又は、Ｐ２と相互作用する（例えば結合する）ことにより、ＰＤ－１に関連する細胞内シグナル伝達を変化させる；ものであってよい。従って、Ｐ２と相互作用する（例えば結合する）この中に記載されている結合剤は、これらのメカニズム又はまだ同定されるべき任意の他のメカニズムを介してＰＤ－１アンタゴニスト機能を提供しうる。
従って、本開示は、細胞内又は細胞上のＰＤ－１のこのＰ２パッチと相互作用させることによりＰＤ－１の機能に影響を及ぼす方法を提供する。ＰＤ－１のＰ２パッチ内のアミノ酸残基は、トレオニン３６、フェニルアラニン３７、セリン３８、プロリン３９、ロイシン４１、バリン４３、アラニン５０、トレオニン５１、フェニルアラニン５２、トレオニン５３、システイン５４、セリン５５、アスパラギン１０２、アルギニン１０４、アスパラギン酸（アスパラギン酸塩）１０５、フェニルアラニン１０６、ヒスチジン１０７、メチオニン１０８、アルギニン１３８及びグルタミン酸（グルタミン酸塩）１４１を含んでいてよく、ここでアミノ酸の番号付けは配列番号２７５に対応する。ある実施形態では、Ｐ２パッチのアミノ酸残基は、トレオニン３６、フェニルアラニン３７、アラニン５０、トレオニン５１、フェニルアラニン５２、トレオニン５３、システイン５４、セリン５５、アスパラギン酸（アスパラギン酸塩）１０５、フェニルアラニン１０６、ヒスチジン１０７及びメチオニン１０８を含んでいてよく、ここでアミノ酸の番号付けは配列番号２７５に対応する。ある実施形態では、Ｐ２パッチのアミノ酸残基は、アミノ酸残基 セリン３８、プロリン３９、ロイシン４１、バリン４３、アスパラギン１０２、アルギニン１０４、及び／又はアスパラギン酸（アスパラギン酸塩）１０５を含んでいてよい。従って、ある実施形態では、方法は、アミノ酸 トレオニン３６、フェニルアラニン３７、セリン３８、プロリン３９、ロイシン４１、バリン４３、アラニン５０、トレオニン５１、フェニルアラニン５２、トレオニン５３、システイン５４、セリン５５、アスパラギン１０２、アルギニン１０４、アスパラギン酸（アスパラギン酸塩）１０５、フェニルアラニン１０６、ヒスチジン１０７、及び／又はメチオニン１０８と相互作用させることを含んでいてよく、ここでアミノ酸の番号付けは配列番号２７５に対応する。ある実施形態において、その方法は、アミノ酸 トレオニン３６、フェニルアラニン３７、アラニン５０、トレオニン５１、フェニルアラニン５２、トレオニン５３、システイン５４、セリン５５、アスパラギン酸（アスパラギン酸塩）１０５、フェニルアラニン１０６、ヒスチジン１０７及び／又はメチオニン１０８と相互作用させることを含んでいてよい。ある実施形態では、その方法は、アミノ酸 セリン３８、プロリン３９、ロイシン４１、バリン４３、アスパラギン１０２、アルギニン１０４、及び／又はアスパラギン酸（アスパラギン酸塩）１０５と相互作用させることを含んでいてよい。ある実施形態では、その方法は、Ｐ２パッチ（例えば、上記のアミノ酸残基を含むＰＤ－１の部分）内の及び／又はＰ２パッチとオーバーラップする任意のアミノ酸と相互作用させることを含む。そのような方法のある実施形態において、その方法は、配列番号２７５のセリン３８、プロリン３９、及び／又はロイシン４１に対応する１つ又は複数のアミノ酸残基（Ｍ４；図３；配列番号２４７）；及び／又は配列番号２７５に関連してアスパラギン１０２及び／又はアルギニン１０４に対応する１つ又は複数のアミノ酸残基（Ｍ１７；図３；配列番号２６０）；及び／又は配列番号２０４に関連してアスパラギン酸（アスパラギン酸塩）１０５に対応する１つ又は複数のアミノ酸残基（Ｍ１８；図３；配列番号２６１）；及び／又はアルギニン１３８及び／又はグルタミン酸（グルタミン酸塩）１４１に対応する１つ又は複数のアミノ酸残基（Ｍ２６；図３；配列番号２６９）及び／又はロイシン４１及び／又はバリン４３に対応する１つ又は複数のアミノ酸残基（Ｍ３１；図３；配列番号２７４）と相互作用させることを含む。ある実施形態において、相互作用は、そのようなアミノ酸残基の任意の１つ又は複数を改変（例えば、置換、欠失）することにより低減及び／又は排除されうる。ある実施形態において、その方法は、ＰＤ－１の機能に拮抗的に（antagonistically）影響を及ぼすことを含む。ある実施形態において、その方法は、ＰＤ－１結合剤を用いてＰＤ－１と相互作用させることを含む。ある実施形態において、ＰＤ－１結合剤は、例えば、配列番号２７５のロイシン４１及び／又はバリン４３（Ｍ４）に対応するアミノ酸残基の１つ又は複数；及び／又は配列番号２７５に関連してアスパラギン１０２及び／又はアルギニン１０４（Ｍ１７）に対応する１つ又は複数のアミノ酸残基；を含む領域（例えばエピトープ）に特異性を有する。ある実施形態において、相互作用は、ＰＤ－１（配列番号２７５）に結合する能力を有するがＰＤ－１ Ｍ４（配列番号２４７）には結合しない結合剤によって生じうる、及び／又はＰＤ－１（配列番号２７５）に結合する能力を有するがＰＤ－１ Ｍ１７（配列番号２６０）には結合しない結合剤によって生じうる。ある実施形態において、その方法は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２との相互作用に関与する部位（例えばＰ１パッチ）及びＰ２で、ＰＤ－１と相互作用させることを含んでいてよい。表現「配列番号２７５の」アミノ酸「に対応する１つ又は複数のアミノ酸残基」は、配列番号２７５（図３Ｈ）で見られるのと同様の位置にある、別のバージョンのＰＤ－１におけるアミノ酸を称する。しかしながら、当業者は、配列番号２７５（図３Ｈ）以外のＰＤ－１ポリペプチドにおけるあるアミノ酸が、ポリペプチド内のその文脈によって、配列番号２７５（図３Ｈ）における特定のアミノ酸に「対応する」として特定され得ることを理解するであろう。例えば、サルのＰＤ－１（配列番号２７６（図３Ｉ））は、配列番号２７５と同様に位置４１にロイシンを含む。しかし、別のＰＤ－１の番号付けは、その特定のＰＤ－１において「対応する」ロイシンが例えば位置４０又は４３に見られうるように、例えば１つ又は複数の付加、欠失及び／又は置換のせいで、異なっていてよい。しかしながら、そのロイシンは、（例えば、配列番号２７５（図３Ｈ）と同様にそれはアミノ酸ＰＡとＬＶで囲まれるといった）配列番号２７５（図３Ｈ）内のその文脈に関連してロイシン４１に「対応する」ことが当業者に理解されるであろう。ある実施形態において、結合剤は、ＰＤ－１（配列番号２７５）のアミノ酸Ｆ３７、Ｐ３９、Ａ４０、Ｌ４１、Ｖ４３、Ｌ１３８、Ｒ１３９、及びＲ１４３；及び／又はＰＤ－１（配列番号２７５）のアミノ酸Ｐ３４、Ｓ１３７、及びＲ１３９に結合する能力を有する（例えばＡ３５７７４は、ＶＨ ＣＤＲループに関してＦ３７、Ｐ３９、Ａ４０、Ｌ４１、Ｖ４３、Ｌ１３８、Ｒ１３９及びＲ１４３、またＶＬ ＣＤＲループに関してＰ３４、Ｅ１３６、Ｓ１３７及びＲ１３９を含む）。当業者に理解されるように、そのような方法及びアミノ酸（例えば別のものに「対応する」もの）の他の実施形態もこの中で企図されている。
結合親和性は、当業者が利用できる任意の技術によって特定できる。表３に示す結合親和性データは、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を用いて３～６日間にわたり刺激したＣＤ４ Ｔ細胞上の内因性細胞表面ＰＤ－１のフローサイトメトリー染色によって評価した。結合クラスも、当業者が利用できる任意の技術によって特定できる。表３に提示した結合クラスデータは、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ競合結合試験によって特定した。表３において、結合クラス１のモノクローナル抗体は、ＥＨ１２．２Ｈ７クローン市販抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能（例えば、製品番号３２９９０５））と競合的であると特定された抗体である；クラス２の抗体は、Ｊ１１６クローン市販抗体（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能（例えば、製品番号１６－９９８９－８０））と競合的であると特定された抗体である；クラス３の抗体は、ＥＨ１２．２Ｈ７抗体及びＪ１１６抗体の両方と競合的であると特定された抗体である；及びクラス４のモノクローナル抗体クローン抗体は、ＥＨ１２．２Ｈ７抗体及びＪ１１６抗体の両方の存在下でＰＤ－１に結合すると特定された抗体である。
増殖効果は、当業者が利用できる任意の技術によって特定できる。例えば、上述し、及び実施例１で使用したＥＦＲＡシステムを使用できる。そのようなアッセイを使用して、表３に示す増殖効果データを特定した。簡単に説明すると、慢性ＨＩＶ感染した対象から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、その細胞を抗ＰＤ－１抗体の存在下及び非存在下においてＨＩＶ特異的ペプチドで刺激する、カルボキシフルオレセインスクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）アッセイである。対照抗ＰＤ１抗体（Ｍｅｒｃｋ社の抗体ＭＫ－３４７５、ペムブロリズマブ又はキイトルーダ（登録商標）とも称される（米国特許第８、３５４、５０９号明細書、及び同第８、９００、５８７号明細書に記載され、Ｍｅｒｃｋ＆ＣＯ．から入手可能）；及び／又はＲＡＳＫＧＶＳＴＳＧＹＳＹＬＨ（配列番号２８７）、ＬＡＳＹＬＥＳ（配列番号２８８）、ＱＨＳＲＤＬＰＬＴ（配列番号２８９）、ＮＹＹＭＹ（配列番号２９０）、ＧＩＮＰＳＮＧＧＴＮＦＮＥＫＦＫＮ（配列番号２９１）、及び／又はＲＤＹＲＦＤＭＧＦＤＹ（配列番号２９２）を含む））についても陽性対照として試験した。６日間のインキュベーション後、ＨＩＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖を、ペプチド単独対照と比較して抗ＰＤ－１処理サンプルにおいて評価し、対照を超えるパーセンテージとして結果を表わした（増殖効果）。
一部の実施形態では、例えば抗体などのＰＤ－１結合剤を同定及び特性付けるために使用される技術を、そのような結合剤を同定及び特性解析するためのシステムを提供するために組み合わせることができる。例えば、１つ又は複数のモノクローナル抗体のような１つ又は複数の候補結合剤を、免疫原性ペプチドの存在下での増殖等によって測定されるような、免疫細胞に対して機能を回復させる候補結合剤の能力を特定するために、ＥＦＲＡ又は類似のアッセイによってアッセイすることができる。一部の実施形態では、このタイプのアッセイは、さらに検討すべき候補結合剤が免疫細胞機能を回復させることができることを保証するための最初のスクリーンとして使用できる。一部の実施形態では、これらのタイプのアッセイの後に、例えば活性化末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）などの免疫細胞に対する結合親和性を特定するアッセイを実施することができる。一部の実施形態では、このアッセイは、例えばＦＡＣＳ(fluorescence activated cell sorting)などの技術を使用してよい。一部の実施形態では、このアッセイは、非特異的結合の有無及び／又は抗ＰＤ１抗体（例えば、Ｍｅｒｃｋ社の抗体ＭＫ－３４７５）などの公知の結合剤を使用する競合結合試験を含んでいてよい。これらのアッセイに続き、例えば上記の表１Ａ及び／又は１Ｂに提供するような候補結合剤のＣＤＲのシーケシングを行ってよい。この中に記載されているＥＦＲＡ、親和性特定、エピトープマッピング試験、及びＣＤＲ同定法は、一緒に、それらを用いて候補結合剤を同定できるシステムを提供する。
表１Ａ及び／又は１Ｂのアミノ酸配列のいずれか、及び／又は配列番号１３９～１９０のいずれか（及び／又は任意のそれらの１つ又は複数の断片及び／又は誘導体）はさらに、当業者が所望する任意の他のアミノ酸によって置換してよい。例えば、当業者は、特定のアミノ酸を下記の表４に示す他のアミノ酸で置き換えることによって保存的置換を行うことができる。選択される特定のアミノ酸置換は、選択される部位の位置に依存し得る。そのような保存的アミノ酸置換は、その位置でのアミノ酸残基のサイズ、極性、電荷、疎水性又は親水性への効果がほとんど又は全くないように、及び特に、ＰＤ－１結合の低減を生じさせないように、天然アミノ酸残基の非天然残基による置換を含んでいてよい。
Figure 0007089474000005
従って、この中に記載されている結合剤のアミノ酸配列中の、保存的又は非保存的なアミノ酸置換も企図されている。例えば、この中に記載されているヒト化可変重（ＶＨ）鎖及び軽（ＶＬ）鎖のアミノ酸配列（例えば、配列番号１３９～１９０）に対応するアミノ酸置換を行ってよい。例示的な非保存的及び保存的置換（表４を用いて同じものを説明できる）を、下記の表５～８（図２５Ａ～Ｄも参照）に示す：
Figure 0007089474000006
Figure 0007089474000007
Figure 0007089474000008
Figure 0007089474000009
一部の実施形態では、本開示は、ＰＤ－１及び少なくとも１つの他の第２の抗原（例えば、細胞表面タンパク質）に単一結合剤が結合できるように、複数の特異性を有する結合剤を提供する。一部の実施形態では、第２の抗原は、感染性因子に感染した細胞によって発現される抗原であってよい。例えば、典型的な第２の抗原は、ＨＩＶ Ｅｎｖ抗原であってよい。そのような結合剤は、第２の抗原に結合できる及び／又は感染性因子を中和するように機能することができる。ある実施形態では、例えばＰＤ－１及びＨＩＶ抗原（例えばＥｎｖ及び／又は他の抗原など）に対する二重特異性を有する二重特異性結合剤である。ＨＩＶ免疫原は、この中に記載されたサブタイプ又は任意の他のサブタイプのいずれに由来するものであってもよい。一部の実施形態では、そのような結合剤は：ＰＤ－１アゴニスト／Ｅｎｖ結合；ＰＤ－１アゴニストＰＤ－１／Ｅｎｖ結合及び中和；ＰＤ－１アンタゴニスト／Ｅｎｖ結合；及び／又はＰＤ－１アンタゴニスト／ＰＤ－１／Ｅｎｖ結合及び中和を含み得る。様々なサブタイプの有病率を考えると、ＨＩＶ－１サブタイプＢ及び／又はＣ由来の抗原を選択するのが好ましい場合がある。また、単一組成物中に、複数のＨＩＶサブタイプ（例えば、ＨＩＶ－１サブタイプＢ及びＣ、ＨＩＶ－２サブタイプＡ及びＢ、又はＨＩＶ－１及びＨＩＶ－２サブタイプの組合せ）由来の抗原に特異性を有する結合剤を含めるのが望ましい場合もある。がんなどの疾患を治療するために、複数のＰＤ－１特異性（例えば、２つの異なるエピトープに特異的な二重特異性ＰＤ－１ａ／ＰＤ１ｂアンタゴニストＰＤ－１抗体）及び／又はＰＤ－１及び１つ以上の腫瘍抗原（例えば、がん精巣（ＣＴ）抗原（すなわち、ＭＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ－１）；メラノサイト分化抗原（すなわち、Ｍｅｌａｎ Ａ／ＭＡＲＴ－１、チロシナーゼ、ｇｐ１００）；突然変異抗原（すなわち、ＭＵＭ－１、ｐ５３、ＣＤＫ－４）；過剰発現「自己」抗原（すなわち、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ｐ５３）；及び／又はウイルス抗原（すなわち、ＨＰＶ、ＥＢＶ））の両方に対する特異性を有する結合剤を得ることが有益となり得る。結合剤（例えば、モノクローナル抗体）は一般的に、上述したように作製することができる。そのような結合剤の特異性を、当業者に広く利用可能な技術を使用して、単一結合剤に再結合させてよい。一部の実施形態では、効果的な複数の特異性を有する試薬を提供するために、複数の単一特異性結合剤を組み合わせて使用する（例えば、投与する）してもよい。
一部の実施形態では、ＰＤ－１（及び／又は複数の特異性を有する結合剤の場合には別の抗原）を発現する細胞集団の機能を標的化及び阻害する、及び／又はその細胞集団を排除するために、本明細書に記載される結合剤を活性薬剤にコンジュゲートさせてもよい。例えば、複製可能なＨＩＶを含むＣＤ４＋ Ｔ細胞集団を、結合剤／薬物コンジュゲート（例えば、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ））を用いて、標的化及び排除することができる。単一及び／又は二重特異性候補結合剤は、１つ又は複数のタイプの薬物（例えば、ＤＮＡを損傷させる薬物、微小管を標的とする薬物）とコンジュゲートさせてよい。また、本明細書に記載される結合剤及び／又はそれらの誘導体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでの使用のために、機能的薬剤に隣接及び／又はコンジュゲートさせてもよい。例えば、結合剤を、細胞毒性薬又は毒素のような機能的成分、及び／又は例えばジフテリアＡ鎖、外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、エノマイシンのようなそれらの活性断片に、隣接及び／又はコンジュゲートさせてよい。好適な機能的成分は、放射化学薬品を含んでいてよい。抗体のような結合剤は、当技術分野における標準技術を使用して、１又は複数の機能的薬剤に隣接及び／又はコンジュゲートさせることができる。
一部の実施形態では、結合剤は、例えば抗感染剤（例えば、抗生物質、抗ウイルス薬）などの他の薬剤と共に投与することができる。例えば、本明細書に記載される結合剤は、モノクローナル抗体及び／又は他の試薬、例えばニボルマブ（ＭＤＸ－１１０６、ＢＭＳ－９３６５５８（Ｔｏｐａｌｉａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１２；３６６（２６）：２４４３－２４５４）、ＭＤＸ－１１０６、ＯＮＯ－４５３８としても知られている、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ社から入手できる完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体）、ペンブロリズマブ（ＭＫ－３４７５及びＳＣＨ ９００４７５としても知られている、Ｍｅｒｃｋ社から入手できるヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体）、ピジリズマブ（ＣｕｒｅＴｅｃｈ社から入手できるヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体）、ＡＭＰ－２２４（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ／Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ社から入手できるＢ７－ＤＣ／ＩｇＧ１融合タンパク質）、及び／又は米国特許第８，３５４，５０９Ｂ２号明細書（Ｃａｒｖｅｎ，ｅｔ ａｌ．）、米国特許第８，００８，４４９号明細書（Ｋｏｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．）、国際公開第２０１２／１３５４０８Ａ１号（Ｍａｎｏｊ，ｅｔ ａｌ．）、米国特許出願公開第２０１０／０２６６１７号明細書（Ｃａｒｖｅｎ，ｅｔ ａｌ．）、国際公開第２０１１／１１０６２１Ａ１号（Ｔｙｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．）、米国特許第７，４８８，８０２Ｂ２号明細書（Ｃｏｌｌｉｎｓ，ｅｔ ａｌ．）、国際公開第２０１０／０２９４３５Ａ１号（Ｓｉｍｏｎ，ｅｔ ａｌ．）、国際公開第２０１０／０８９４１１Ａ２号（Ｏｌｉｖｅ，Ｄ．）、国際公開第２０１２／１４５４９３Ａ１号（Ｌａｎｇｅｒｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．）、国際公開第２０１３／０４３５５６９Ａ１号（Ｒｏｌｌａｎｄ，ｅｔ ａｌ．）、国際公開第２０１１／１５９８７７Ａ２号（Ｋｕｃｈｒｏｏ，ｅｔ ａｌ．）、米国特許第７，５６３，８６９Ｂ２号明細書（Ｏｎｏ Ｐｈａｒｍ．）、米国特許第７，８５８，７４６Ｂ２号明細書（Ｈｏｎｊｏ，ｅｔ ａｌ．）、米国特許第８，７２８，４７４Ｂ２号明細書（Ｏｎｏ Ｐｈａｒｍ．）、及び／又は米国特許第９，０６７，９９９号明細書（Ｏｎｏ Ｐｈａｒｍ．）のいずれかに記載された抗体又は他の試薬又は方法と組み合わせることができ、上記のそれぞれは参照により本開示に全体として組み込まれる。好ましい実施形態によると、ＰＤ－１結合剤の任意のものを他の結合剤に融合させて、二重特異性結合分子、特に二重特異性抗体を形成してもよい。そのような二重特異性分子は、ＰＤ１結合剤を、別のＰＤ１結合剤と、或いはチェックポイント阻害因子又は調節因子（特に、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＤ１３７、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子）、ＣＤ４０、ＫＩＲ、ＩＤＯＩＬ－２、ＩＬ－２１及びＣＳＦ－１Ｒ（コロニー刺激因子１受容体））を標的とする別の結合剤と、有利に連結する。当業者に理解されるように、他の組合せ及び／又は二重特異性結合分子もこの中で企図されている。
上述のように、本明細書に記載されるＰＤ－１結合剤（例えば、ＰＤ－１アンタゴニスト）を、ＨＩＶによる感染症の症状を治療及び／又は予防及び／又は改善するために使用することができる。当技術分野でよく知られているように、ＨＩＶ単離体は、現在では別個の遺伝子サブタイプに分類される。ＨＩＶ－１は、少なくとも１０のサブタイプ（Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ１、Ｆ２、Ｇ、Ｈ、Ｊ及びＫ）を含むことが知られている（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ，ＮＥＪＭ，３５９（１８）：１９６５－１９６６（２００８））。ＨＩＶ－２は、少なくとも５つのサブタイプ（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ）を含むことが知られている。サブタイプＢは、世界中の男性同性愛者及び静注薬物使用者におけるＨＩＶ流行と関連付けられてきた。大半のＨＩＶ－１免疫原、検査室適応単離体、試薬及びマッピングされたエピトープは、サブタイプＢに属する。新規ＨＩＶ感染症の発生率が高いサハラ以南のアフリカ、インド及び中国領域では、ＨＩＶ－１サブタイプＢはほんのわずかな感染の割合しか占めておらず、サブタイプＨＩＶ－１Ｃが最も一般的な感染サブタイプであると思われる。これらのタイプの単離体はいずれも、本明細書に記載される結合剤を使用して対処できるであろう。１つ又は複数の結合剤を、例えば、プロテアーゼ阻害剤、ＨＩＶ侵入阻害剤、逆転写酵素阻害剤及び／又は抗レトロウイルスヌクレオシドアナログのような、ＨＩＶを予防、治療及び／又は改善するのに使用できる１又は複数の薬剤と一緒に又は共に投与してもよい。好適な化合物として、例えば、Ａｇｅｎｅｒａｓｅ（アンプレナビル）、Ｃｏｍｂｉｖｉｒ（Ｒｅｔｒｏｖｉｒ／Ｅｐｉｖｉｒ）、Ｃｒｉｘｉｖａｎ（インジナビル）、Ｅｍｔｒｉｖａ（エムトリシタビン）、Ｅｐｉｖｉｒ（３ｔｃ／ラミブジン）、Ｅｐｚｉｃｏｍ、Ｆｏｒｔｏｖａｓｅ／Ｉｎｖｉｒａｓｅ（サキナビル）、Ｆｕｚｅｏｎ（エンフビルチド）、Ｈｉｖｉｄ（ｄｄｃ／ザルシタビン）、Ｋａｌｅｔｒａ（ロピナビル）、Ｌｅｘｉｖａ（ホスアンプレナビル）、Ｎｏｒｖｉｒ（リトナビル）、Ｒｅｓｃｒｉｐｔｏｒ（デラビルジン）、Ｒｅｔｒｏｖｉｒ／ＡＺＴ（ジドブジン）、Ｒｅｙａｔａｘ（アタザナビル、ＢＭＳ－２３２６３２）、Ｓｕｓｔｉｖａ（エファビレンツ）、Ｔｒｉｚｉｖｉｒ（アバカビル／ジドブジン／ラミブジン）、Ｔｒｕｖａｄａ（エムトリシタビン／テノホビルＤＦ）、Ｖｉｄｅｘ（ｄｄＩ／ジダノシン）、Ｖｉｄｅｘ ＥＣ（ｄｄＩ、ジダノシン）、Ｖｉｒａｃｅｐｔ（ネビラビン）、Ｖｉｒｅａｄ（テノホビルジソプロキシルフマレート）、Ｚｅｒｉｔ（ｄ４Ｔ／スタブジン）及びＺｉａｇｅｎ（アバカビル）が挙げられる。その他の好適な薬剤は当業者に知られており、本明細書に記載する用途に好適となり得る。そのような薬剤は、本明細書に記載される結合剤の投与及び／又は方法の使用の前、間又は後のいずれに使用してもよい。
上述のように、本明細書に記載されるＰＤ－１結合剤（例えば、ＰＤ－１アンタゴニスト）は、がんの症状を治療及び／又は予防及び／又は改善するために使用することができる。例示的ながんとして、例えば、乳がん、血液がん、大腸がん、胃がん、結腸がん、骨格組織がん、皮膚がん（例えば、黒色腫）、脳腫瘍、肺がん、膀胱がん、腎臓がん、卵巣がん及び／又は肝臓がんなどが挙げられる。さらに、本明細書に記載されるＰＤ－１結合剤は、好ましくはＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用に非ブロッキング性である抗体であり、特に、限定はされないが、１３５Ｃ１２、１３９Ｄ６、１３６Ｂ４及び１３５Ｄ１などの、この中で結合クラス２と称されるものが、単独で、或いはそれらを互いに及び／又は他のＰＤ－１抗体と組み合わせて、様々なタイプの悪性腫瘍、特に、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎臓がん（例えば、明細胞がん）、膀胱がん、前立腺がん（例えば、去勢抵抗性前立腺がん）、膵臓がん、乳がん、結腸がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、食道がん、頭頚部の扁平上皮がん、メルケル細胞がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、甲状腺がん、膠芽細胞腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、肉腫、及び他の新生物性悪性腫瘍などの治療に有用である。上記の好ましいＰＤ－１結合剤は、例えばホジキン病、例えば濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫などの非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、及び骨髄異形成症候群などの血液悪性腫瘍の治療に特に力が注がれている。この中に記載されている結合剤は、当業者に理解されるように、他のタイプのがんを治療するのにも使用してよい。
一部の実施形態において、１つ又は複数のＰＤ－１結合剤は、例えば、アルキル化剤（例えば、任意のナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、テトラジン、アジリジン、シスプラチン及び／又はそれらの誘導体）、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキセート、ペメトレキセド、フルオロピリミジン及び／又はそれらの誘導体）、抗微小管薬（例えば、ビンカアルキロイド、タキサン、ポドフィロトキシン及び／又はそれらの誘導体）、トポイソメラーゼＩ及び／又はＩＩ阻害剤（例えば、カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン、エトポシド、ドキソルビシン、ミトキサントロン、テニポシド、ノボビオシン、メルバロン、アクラルビシン及び／又はそれらの誘導体）及び／又は細胞障害性抗生物質（例えば、任意のアントラサイクリン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン及びマイトマイシン及び／又はそれらの誘導体）などの、がんを予防、治療及び／又は改善するのに使用される１又は複数の薬剤と組み合わせてもよく、及び／又はそれらと一緒に又は共に投与してもよい。さらに又は代りに、１つ又は複数の結合剤を、例えばニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピジリズマブ及び／又はその他の類似の薬剤及び／又はそれらの誘導体などの、がんを治療する、予防する及び／又は改善するのに当業者が入手できる１つ又は複数の他の結合剤と組み合わせてもよい。１つ又は複数のＰＤ－１結合剤を単独で、或いはＰＤ－１、ＰＤＬ－１及び／又は他の免疫チェックポイントエフェクターを標的とする他の結合剤と組み合わせて使用してもよい。これらを、他の抗腫瘍剤又は免疫原性剤（例えば、弱毒化がん細胞、腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチド、及び糖分子など）、例えば腫瘍由来抗原又は核酸でパルスされた樹状細胞のような抗原提示細胞、免疫刺激性サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＦＮａ２、ＧＭ－ＣＳＦ）、及び／又は免疫刺激性サイトカイン（例えば限定はされないが、ＧＭ－ＣＳＦなど）をコードする遺伝子でトランスフェクトした細胞）；標準的がん治療（例えば、化学療法、放射線治療、又は外科手術）；或いはＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＶＥＧＦ受容体、他の成長因子受容体に対する他の薬剤；と組み合わせて使用してもよい。好ましい実施形態によると、１つ又は複数のＰＤ－１結合剤を、ワクチン剤及び／又は、特に、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＤ１３７、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子）、ＣＤ４０、ＫＩＲ、ＩＤＯＩＬ－２、ＩＬ－２１及び／又はＣＳＦ－１Ｒ（コロニー刺激因子１受容体）に作用する免疫チェックポイント調節剤と組み合わせて、治療組成物及び／又は逐次治療投与のためのキットを形成する。その他の好適な薬剤は当業者に知られており、本明細書に記載する用途に好適となり得る。そのような薬剤は、本明細書に記載される結合剤の投与及び／又は方法の使用の前、間又は後のいずれでも使用できる。
上述したように、本明細書に記載されるＰＤ－１結合剤（例えば、ＰＤ－１アゴニスト）は、自己免疫の症状を治療及び／又は予防及び／又は改善するために使用できる。典型的な自己免疫状態には、例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、糸球体腎炎、及び多発性硬化症などの、ＰＤ－１が自己寛容を維持することに関係し及び／又は炎症性Ｔ細胞（例えば、自己反応性又は自己抗原特異的Ｔ細胞）を伴う任意の状態が含まれうる。そのようなＰＤ－１結合剤は、例えば抗ＣＴＬＡ－４薬剤（例えば、イピリムマブ）などの他の薬剤と組み合わせてもよい。１つ又は複数の結合剤を、例えば、グルココルチコイド剤、細胞増殖抑制剤（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗物質、メトトレキセート、アザチオプリン、メルカプトプリン、細胞障害性抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン）、抗体（例えば、Ａｔｇａｍ、Ｔｈｙｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅ、Ｓｉｍｕｌｅｃｔ、Ｚｅｎａｐａｘ）、イムノフィリン（例えば、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス）に作用する薬剤、インターフェロン、オピオイド剤、ＴＮＦ結合剤（例えば、Ｒｅｍｉｃａｄｅ、Ｅｎｂｒｅｌ、Ｈｕｍｉｒａ）、ミコフェノレート、フィンゴリモド、ミリオシン及び／又はそれらの誘導体のような、例えば自己免疫を予防、治療及び／又は改善するために使用できる１又は複数の薬剤と組み合わせる、及び／又は一緒に又は共に投与してもよい。その他の好適な薬剤は当業者に知られており、本明細書に記載する用途に好適となり得る。そのような薬剤は、本明細書に記載される結合剤の投与及び／又は方法の使用の前、間又は後のいずれでも使用できる。
一部の実施形態では、結合剤を、１つ又は複数の検出可能な標識に隣接及び／又はコンジュゲートさせてよい。例えば、好適な検出可能な標識として、例えば、フルオロセイン（例えば、Ｄｙｌｉｇｈｔ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ５５５、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ６４７；５－カルボキシ－２，７－ジクロロフルオレセイン；５－カルボキシフルオレセイン（５－ＦＡＭ）；５－ＨＡＴ（ヒドロキシトリプタミン）；５－ヒドロキシトリプタミン（ＨＡＴ）；６－ＪＯＥ；６－カルボキシフルオレセイン（６－ＦＡＭ）；ＦＩＴＣ；６－カルボキシ－１，４－ジクロロ－２’，７’－ジクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）；６－カルボキシ－１，４－ジクロロ－２’，４’，５’，７’－テトラクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）；６－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）；Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ（例えば、３５０、４０５、４３０、４８８、５００、５１４、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６１０、６３３、６３５、６４７、６６０、６８０、７００、７５０）；ＢＯＤＩＰＹ蛍光体（例えば、４９２／５１５、４９３／５０３、５００／５１０、５０５／５１５、５３０／５５０、５４２／５６３、５５８／５６８、５６４／５７０、５７６／５８９、５８１／５９１、６３０／６５０－Ｘ、６５０／６６５－Ｘ、６６５／６７６、ＦＬ、ＦＬ ＡＴＰ、ＦＩ－セラミド、Ｒ６Ｇ ＳＥ、ＴＭＲ、ＴＭＲ－Ｘコンジュゲート、ＴＭＲ－Ｘ、ＳＥ、ＴＲ、ＴＲ ＡＴＰ、ＴＲ－Ｘ ＳＥ））、ローダミン（例えば、１１０、１２３、Ｂ、Ｂ ２００、ＢＢ、ＢＧ、Ｂ ｅｘｔｒａ、５－カルボキシテトラメチルローダミン（５－ＴＡＭＲＡ）、５ ＧＬＤ、６－カルボキシローダミン６Ｇ、リサミン、リサミンローダミンＢ、ファリシジン、ファロイジン、レッド、Ｒｈｏｄ－２、ＲＯＸ（６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン）、５－ＲＯＸ（カルボキシ－Ｘ－ローダミン）、スルホローダミンＢ ｃａｎ Ｃ、スルホローダミンＧ Ｅｘｔｒａ、ＴＡＭＲＡ（６－カルボキシテトラメチルローダミン）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、ＷＴ）、テキサスレッド及び／又はテキサスレッド－Ｘなどが挙げられる。当技術分野で知られている他の検出可能な標識も使用に好適となり得る。例えば抗体などの結合剤は、当技術分野における標準技術を使用して１又は複数の検出可能な標識に隣接及び／又はコンジュゲートさせることができる。
ある実施形態では、本明細書に記載される１つ又は複数の結合剤をコードする核酸分子を、下記でより詳細に検討するように、１又は複数の発現ベクター内に挿入してよい。そのような実施形態では、結合剤は、アミノ酸配列に対応するヌクレオチドによってコードされ得る。様々なアミノ酸（ＡＡ）をコードするヌクレオチド（コドン）の特定の組合せは、当業者によって使用される様々な参考文献に記載されているように当技術分野においてよく知られている（例えば、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．Ｇｅｎｅｓ Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９４）。前記結合剤のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列は、例えば、表９を参照して確認することができる。核酸変異体は、結合剤をコードするヌクレオチドの任意の組合せを使用してよい。
Figure 0007089474000010
当業者は、特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、表９(及び、一部の実施形態では、表５～８)に示すアミノ酸配列及び情報から容易に導き出せることを理解できる。例えば、アミノ酸配列ＤＤＦＬＨ（配列番号１）及び表９に示す情報から、このアミノ酸配列が、ヌクレオチド配列ＧＡＴ ＧＡＴ ＴＴＴ ＴＴＡ ＣＡＴ（配列番号１９１）によってコードされ得ることを推定することができる。当業者は、配列番号２～１９０のいずれかをコードするヌクレオチド配列も同じやり方で推定することができ、そのようなヌクレオチド配列が本明細書で企図されていることを理解することができる。また、結合剤が抗体である場合、所定の調製物（例えば、ヒト化抗体）を作製するために、その可変領域をコードするヌクレオチド配列を、発現ベクター中にクローン化されたそれを発現するファージ及び／又はハイブリドーマ細胞から単離することができる。配列番号１３９～１９０の可変領域配列をコードする例示の核酸配列を表１０に示す。
Figure 0007089474000011
Figure 0007089474000012
Figure 0007089474000013
Figure 0007089474000014
Figure 0007089474000015
Figure 0007089474000016
Figure 0007089474000017
当業者に理解されるように、上記で用いた配列は、例えば、コドン最適化又は当業界で利用できる他の技術により、使用のために改変してよい。そのような調製物を作製する方法は、この中に記載され及び／又は当業者によく知られ及び利用可能である。
関心のある可変領域（例えば、ＣＤＲ）のアミノ酸配列を特定するために、ＰＤ－１抗原／免疫原で免疫したマウス由来のハイブリドーマ細胞を、本明細書に記載される機能的アッセイ及び当業者が容易に利用可能なクローニング技術を使用して選択する。例えば、選択されたハイブリドーマの重鎖及び軽鎖可変領域をコードする核酸を単離及びシーケンシングするために、製造業者のプロトコルにしたがってＴＲＩｚｏｌ試薬を使用して新鮮なハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出する。ｃＤＮＡは、標準技術を使用してＲＮＡからアイソタイプ特異的アンチセンスプライマー又はユニバーサルプライマーを用いて（例えば、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）１ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キットの技術的マニュアルにしたがって）合成することができる。次に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施して、選択されたハイブリドーマによって産生される抗体の（重鎖及び軽鎖）可変領域をコードする核酸を増幅することができ、次いでそれを標準クローニングベクター内に別個にクローン化してシーケンシングすることができる。次に、コロニーＰＣＲスクリーニングを実施して、正しいサイズのインサートを有するクローンを同定することができる。好ましくは、正しいサイズのインサートを有する少なくとも５個の単一コロニーを、各抗体可変領域に関してシーケンシングする。次に、抗ＰＤ－１抗体の発現及び精製のために標準プロトコルを使用することができる。例えば、ハイブリドーマクローンを、無血清培地中で増殖させ、細胞培養ブロスを遠心し、さらに濾過してよい。次に、抗体を含有する濾過上清を親和性カラム（例えば、プロテインＡカラム）に装填し、洗浄し、さらに適切なバッファー（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ ＩｇＧ溶出バッファー）を用いて溶出させてよい。溶出分画をプールし、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中にバッファー交換してもよい。次に、分子量、収率及び純度に関して、標準プロトコルを使用して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットによって精製抗体を解析することができる。次に、タンパク質凝集体の存在が少ない高抗体純度（通常、＞９０％）を確実にするために、生物物理学的特性解析のための適当なカラム（例えば、ＴＳＫ ＧＥＬ－Ｇ３０００ ＳＷＸＬカラム（Ｔｏｓｏｈ））においてサイズ排除クロマトグラフィＨＰＬＣを実施してよい。これらの手法を、選択された細胞及び他の起源由来の配列番号１～１９０をコードする核酸を単離及びシーケンシングするのに使用した。これらの技術、その変形及び／又は他の技術も、当業者に理解できるようにこれらの目的に使用することができる。
１つ又は複数のＰＤ－１結合剤をコードする核酸分子は、ウイルス及び／又は非ウイルスベクター内に含まれていてよい。１つの実施形態では、ＤＮＡベクターが、１つ又は複数のＰＤ－１結合剤をコードする核酸を患者に送達するために利用される。そうする場合に、そのようなメカニズムの効率を改善するために様々な戦略を利用でき、例えば、自己複製ウイルスレプリコン（Ｃａｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．１９９９．Ｖａｃｃｉｎｅ，１７：３１２４－２１３５；Ｄｕｂｅｎｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．２０００．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６：７２３－７３２；Ｌｅｉｔｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．２０００．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：５１－５５）、コドン最適化（Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．２０００．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１：４９７－５００；Ｄｕｂｅｎｓｋｙ，ｓｕｐｒａ；Ｈｕａｎｇ，ｅｔ ａｌ．２００１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：４９４７－４９５１）、ｉｎ ｖｉｖｏエレクトロポレーション（Ｗｉｄｅｒａ，ｅｔ ａｌ．２０００．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４６３５－３６４０）、共刺激性分子、サイトカイン及び／又はケモカインをコードする核酸分子の組込み（Ｘｉａｎｇ，ｅｔ ａｌ．１９９５．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２：１２９－１３５；Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ．１９９８．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８：１０８９－１１０３；Ｉｗａｓａｋｉ，ｅｔ ａｌ．１９９７．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：４５９１－３６０１；Ｓｈｅｅｒｌｉｎｃｋ，ｅｔ ａｌ．２００１．Ｖａｃｃｉｎｅ，１９：２６４７－２６５６）、例えばＣｐＧなどの刺激性モチーフの組込み（Ｇｕｒｕｎａｔｈａｎ，ｓｕｐｒａ；Ｌｅｉｔｎｅｒ，ｓｕｐｒａ）、エンドサイトーシス又はユビキチンプロセッシング経路をターゲティングするための配列（Ｔｈｏｍｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．１９９８．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２２４６－２２５２；Ｖｅｌｄｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．２００１．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：５３６６－５３７３）、プライム－ブーストレジメン（Ｇｕｒｕｎａｔｈａｎ，ｓｕｐｒａ；Ｓｕｌｌｉｖａｎ，ｅｔ ａｌ．２０００．Ｎａｔｕｒｅ，４０８：６０５－６０９；Ｈａｎｋｅ，ｅｔ ａｌ．１９９８．Ｖａｃｃｉｎｅ，１６：４３９－４４５；Ａｍａｒａ，ｅｔ ａｌ．２００１．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：６９－７４）、プロテアソーム感受性開裂部位の使用、並びに例えばサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）などの粘膜送達ベクターの使用（Ｄａｒｊｉ，ｅｔ ａｌ．１９９７．Ｃｅｌｌ，９１：７６５－７７５；Ｗｏｏ，ｅｔ ａｌ．２００１．Ｖａｃｃｉｎｅ，１９：２９４５－２９５４）などが挙げられる。他の方法は当技術分野において知られており、それらの一部について下記に記載する。宿主に核酸を導入するのにうまく利用されてきた様々なウイルスベクターとして、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス及びポックスウイルスなどが挙げられる。当業者に広く利用可能な標準的な組換え技術を使用してベクターを構築することができる。そのような技術は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８５，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，１９９１．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）及びＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ及びＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．１９９０．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ｃａ）などの一般的な分子生物学参考文献の中に見ることができる。「非ウイルス」プラスミドベクターも、所定の実施形態において好適となり得る。好ましいプラスミドベクターは、細菌、昆虫及び／又は哺乳動物宿主細胞と適合し得る。そのようなベクターとして、例えば、ＰＣＲ－ｉｉ、ＰＣＲ３及びｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ｐＢＳｉｉ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、ｐｅｔ１５（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ｐＥＧＦｐ－ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）、ｐＥＴｌ（Ｂｌｕｅｂａｃｉｉ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＳＲ－α（国際公開第９０／１４３６３号）及びｐＦＡＳＴＢＡＣｄｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ－ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）並びにＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド誘導体（高コピー数ＣＯＬｅ１ベースのファージミド、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、ＴＡＱ増幅ＰＣＲ産物をクローニングするために設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（例えば、ＴＯＰＯ（商標）ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キット、ＰＣＲ２．１（登録商標）プラスミド誘導体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）などが挙げられる。細菌ベクターも使用できる。そのようなベクターとして、例えば、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、カルメット・ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ：ＢＣＧ）及びストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、国際公開第８８／６６２６号；国際公開第９０／０５９４号；国際公開第９１／１３１５７号；国際公開第９２／１７９６号及び国際公開第９２／２１３７６号を参照されたい）などが挙げられる。多数の他の非ウイルスプラスミド発現ベクター及び発現系が当技術分野において知られており、使用できる。例えば、ＤＮＡ－リガンド複合体、アデノウイルス－リガンド－ＤＮＡ複合体、ＤＮＡの直接注入、ＣａＰＯ４沈降、遺伝子銃技術、エレクトロポレーション及びコロイド分散系などの、他の送達技術も差し支えない。コロイド分散系には、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ及び水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む脂質ベース系が含まれる。好ましいコロイド系は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの送達ビヒクルとして有用な人工膜小胞であるリポソームである。ＲＮＡ、ＤＮＡ及び無傷ビリオンを水性内部にカプセル封入し、生物活性形態にある細胞に送達することができる（Ｆｒａｌｅｙ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，６：７７）。リポソームの組成は通常、ステロイド、特にコレステロールと組み合わせた、リン脂質、特に高相転移温度リン脂質の組合せである。その他のリン脂質又は他の脂質も使用できる。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度及び二価カチオンの存在に依存する。リポソーム作製において有用な脂質の例には、ホスファチジル化合物、例えばホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド及びガングリオシドなどが含まれる。特に有用なものは、脂質部分が、１４～１８個の炭素原子、特に１６～１８個の炭素原子を有し、かつ飽和している、ジアシルホスファチジルグリセロールである。例示的なリン脂質として、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン及びジステアロイルホスファチジルコリンが挙げられる。
ベクターを含む培養細胞も提供される。培養細胞は、ベクターでトランスフェクトされた培養細胞又はその細胞の子孫であり、その細胞は免疫原性ポリペプチドを発現する。好適な細胞株は当業者に知られており、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）を通して市販で入手可能である。トランスフェクトされた細胞を、免疫原性ポリペプチドを生成する方法において使用できる。その方法は、任意選択的に発現配列の制御下において、免疫原性ポリペプチドの発現を可能にする条件下でベクターを含む細胞を培養することを含む。免疫原性ポリペプチドは、標準のタンパク質精製法を使用して細胞又は培養培地から単離することができる。
当業者は、本明細書に記載される結合剤（例えば、抗体）を使用して、それに結合するタンパク質を含有する生物学的サンプルを同定するための多数の好適な技術を有する。例えば、免疫沈降法又は他の捕捉タイプのアッセイを使用し、抗体を利用してＰＤ－１を単離することができる。この周知技術は、固体支持体又はクロマトグラフィ材料（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ及び／又はプロテインＬ）に抗体を付着させることによって実施される。次に、結合した抗体を、ＰＤ－１を含有する又は含有すると考えられる溶液（例えば、ＨＩＶ感染Ｔ細胞溶解物）中に導入する。それにより、ＰＤ－１は抗体に結合し、ＰＤ－１が抗体に結合したままである条件下で非結合物質を洗い流す。次に、結合タンパク質を抗体から分離し、所望の解析を行う。抗体を使用してタンパク質を単離する類似の方法は、当技術分野において周知である。結合剤（例えば、抗体）は、生物学的サンプル中のＰＤ－１を検出するためにも利用できる。例えば、フローサイトメトリー解析、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロッティング（例えば、ウェスタンブロット）、ｉｎ ｓｉｔｕ検出、免疫細胞化学及び／又は免疫組織化学などのアッセイにおいて、抗体を使用できる。そのようなアッセイを実施する方法は、当技術分野においてよく知られている。
本明細書に記載される結合剤は、患者における疾患状態の存在を特定する、予後を予測する、或いは化学療法薬又は他の治療計画の有効性を特定するためにも使用できる。本明細書に記載するように又は当技術分野で知られているように実施される、発現プロファイルアッセイを用いて、ＰＤ－１の発現の相対レベルを特定することができる。次に、その発現レベルを基準（例えば、対照）レベルと相関させて、特定疾患が患者の体内に存在するか否か、患者の予後、又は特定の治療計画が有効であるか否かを特定することができる。例えば、患者が特定の抗感染症治療計画により治療されている場合、患者の組織（例えば、末梢血、乳腺組織生検）におけるＰＤ－１の発現レベルの増加又は減少は、その治療計画が宿主内の感染性因子の量を悪化させる又は改善することを表すことができる。発現の増加又は減少は、治療計画が所望の効果を有する又は有さないこと、従って、別の治療法が選択され得ることを表すことができる。
さらに、例えば、新規薬物候補を試験するための薬物スクリーニングアッセイにおける試薬として、本明細書に記載される結合剤を使用することも可能である。その試薬を使用して、細胞株、或いは患者の細胞又は組織における免疫原性標的の発現に対する、候補薬剤の効果を確認することができる。有用な化合物の迅速な同定を可能にし、及び候補薬剤を用いた治療の有効性をモニターするために、発現プロファイリング技術を高スループットスクリーニング技術と組み合わせてもよい（例えば、Ｚｌｏｋａｒｎｉｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９，８４－８（１９９８））。候補薬剤は、化学的化合物、核酸、タンパク質、抗体、又はそれらの誘導体であってよく、天然のもの又は合成由来のもののいずれであってもよい。このように同定された候補薬剤は、例えば、患者に投与するための医薬組成物として、又は他のスクリーニングアッセイにおいて使用するために利用することができる。
一部の実施形態では、結合剤は精製形態にある。「精製」結合剤（例えば、抗体）は、（例えば、モノクローナル抗体の場合、ハイブリドーマ上清又は腹水調製物の一部として）最初に一緒に含まれるタンパク質及び／又は他の成分の少なくとも約５０％から分離されたものであってよい。精製結合剤（例えば、抗体）は、最初に一緒に含まれるタンパク質及び／又は他の成分の少なくとも約５０％、６０％、７５％、９０％又は９５％から分離されたものであってよい。
本明細書に記載されるポリペプチド及び核酸は、宿主に投与する前に１つ又は複数の医薬上許容される担体と組み合わせてよい。医薬上許容される担体は、生物学的又は他の点で望ましくない物質ではなく、例えば、その物質は、いずれの望ましくない生物学的影響も生じることなく、又はそれが含まれる医薬組成物の他の成分のいずれとも有害に相互作用することなく、対象に投与することができる。担体は必然的に、当業者に周知であるように、有効成分の分解を最小限に抑え、及び対象における有害副作用を最小限に抑えるように選択されるであろう。好適な医薬担体及びそれらの調製物は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ及びＰｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｖｉｄ Ｂ．Ｔｒｏｙ，ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５）に記載されている。典型的には、調製物を等張にするために調製物中で適切な量の医薬上許容される塩が使用される。医薬上許容される担体の例には、無菌水、食塩液、リンゲル液及びデキストロース溶液のような緩衝液が含まれるがそれらに限定されない。溶液のｐＨは、一般に約５～８又は約７～約７．５である。その他の担体には、例えばポリペプチド又はそれらの断片を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスのような、徐放性製剤が含まれる。マトリックスは、成形品、例えば、フィルム、リポソーム又は微粒子の形態にあってよい。所定の担体が、例えば、投与経路及び投与される組成物の濃度に依存して、より好ましいものとなり得ることは当業者に明白であろう。担体は、ヒト又は他の対象にポリペプチド及び／又はその断片を投与するのに好適なものである。医薬組成物は、免疫原性ポリペプチドに加えて、担体、増粘剤、希釈剤、保存料、界面活性剤、アジュバント、免疫刺激剤も含んでいてよい。医薬組成物は、抗菌剤、抗炎症剤及び麻酔剤などの１又は複数の有効成分も含んでいてよい。医薬組成物は、従来の医薬上許容される担体、アジュバント及びビヒクルを含有する単位用量調製物において、経口的に、非経口的に、吸入スプレーにより、経直腸により、結節内に又は局所的に投与することができる。本明細書で使用する用語「医薬上許容される担体」又は「生理学上許容される担体」は、医薬組成物として核酸、ポリペプチド又はペプチドの送達を達成又は増強するのに好適な１又は複数の調製物材料を意味する。「医薬組成物」は、治療有効量の核酸又はポリペプチドを含む組成物である。用語「有効量」及び「治療有効量」は、それぞれ所望の治療効果（例えば、Ｔ細胞機能を回復させる）を観察するために使用される結合剤、核酸などの量を意味する。
少なくとも１以上の有効用量の本明細書に記載される１つ又は複数の結合剤（及び／又はその誘導体）を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物宿主において１つ又は複数の疾患状態（例えば、ＨＩＶ又はがん）を治療する方法も提供される。一部の実施形態では、結合剤は、配列番号１～１９０及び／又は表１Ａ及び１Ｂに示す１つ又は複数を含むモノクローナル抗体、或いはその断片又は誘導体である。例えば、ある好ましい実施形態において、結合剤、又は組合せ中の結合剤の少なくとも１つは、配列番号１４３及び１５５（例えば、抗体Ａ３５７９５のように）、配列番号１６６及び１８０（例えば抗体Ａ３５７７４のように）、配列番号１７６及び１８９（例えば抗体１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｂのように）、及び／又は配列番号１７６及び１９０（例えば抗体１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｃのように）、及び／又はその保存的又は非保存的置換変異体を含んでいてよい。好ましくは、そのような結合剤のＣＤＲ領域（すなわち配列番号１～１３８）は置換されていない。その１つ又は複数の結合剤は、約０．１～約５０ｍｇ／ｋｇ、約１～約３０ｍｇ／ｋｇ、又は約５～約３０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．１、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５又は４０ｍｇ／ｋｇのいずれか）の用量で投与することができる。個々の結合剤それぞれの量は同じであっても異なっていてもよい。ある実施形態では、１つ又は複数の結合剤は、約１０ｍｇ／ｋｇで１回又は複数回、哺乳動物に（例えば、皮内、静脈内、経口、経直腸で）投与することができる。複数回投与される場合、用量は各投与でほぼ同一の量又は異なる量の結合剤を含んでいてよい。投与は、同一又は異なる間隔を空けて時間的に分離してよい。例えば、投与は、約６、１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４又は９６時間、１週間、２週間、３週間、１カ月間、２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間、６カ月間、７カ月間、８カ月間、９カ月間、１０カ月間、１１カ月間、１２カ月間、１．５年間、２年間、３年間、４年間、５年間、或いはこれらの期間の任意のものの前、後及び／又は間の期間により、分離することができる。一部の実施形態では、結合剤は、例えば他の薬剤（例えば、抗感染剤及び／又は化学療法薬）と共に投与することができる。そのような他の薬剤は、結合剤とほぼ同時に、又は異なる時点及び／又は頻度で投与することができる。当業者が容易に特定できるように、そのような方法の他の実施形態も適切となり得る。
本明細書に記載される結合剤（例えば抗体など）を使用する際に当業者を助けるために、それをキットの形態で提供してもよい。そのよう結合剤（例えば抗体など）、及び任意選択的にその抗体を使用してＰＤ－１を発現する細胞を検出するのに必要な他の成分を含むキットを提供する。キットの結合剤（例えば抗体など）は、冷凍、凍結乾燥などの任意の好適な形態で、或いはＴＢＳ又はＰＢＳのような医薬上許容されるバッファー中に、提供してよい。キットは、例えば、バッファー（例えば、ＴＢＳ、ＰＢＳ）、ブロッキング剤（脱脂粉乳、正常血清、Ｔｗｅｅｎ－２０界面活性剤、ＢＳＡ、又はカゼインを含む溶液）、及び／又は検出試薬（例えば、ヤギ抗マウスＩｇＧビオチン、ストレプトアビジン－ＨＲＰコンジュゲート、アロフィコシアニン、Ｂ－フィコエリトリン、Ｒ－フィコエリトリン、ペルオキシダーゼ、検出可能な標識及びその他の標識及び／又は染色キット（例えば、ＡＢＣ染色キット、Ｐｉｅｒｃｅ））などの、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで抗体を利用するのに必要とされる他の試薬も含んでいてよい。キットは、例えばフローサイトメトリー解析、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロッティング（例えば、ウェスタンブロット）、ｉｎ ｓｉｔｕ検出、免疫細胞化学、免疫組織化学などの、上述した一般的に利用されるアッセイにおいて抗体を使用するための他の試薬及び／又は取扱説明書も含んでいてよい。１つの実施形態では、キットは、精製形態で結合剤を提供する。また別の実施形態では、結合剤をビオチン化形態で、単独で又はアビジンコンジュゲート検出試薬（例えば、抗体）と共に、提供してよい。また別の実施形態では、キットは、ＰＤ－１を直接検出するのに使用できる１又は複数の検出可能な標識を有する結合剤を含む。これらの系のいずれかを使用するのに必要とされるバッファーなどは、当技術分野において周知であり、及び／又は最終使用者によって準備するか、又はキットの構成成分として提供してもよい。キットは、陽性対照及び陰性対照タンパク質及び／又は組織サンプルを含む、固体支持体も含んでいてよい。例えば、スポッティング又はウェスタンブロットタイプのアッセイを実施するためのキットは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで使用するための対照細胞又は組織溶解物、或いは、実験サンプルのための追加のスペースと共に事前に固定された対照サンプルを含有するナイロン膜又は他の膜を含んでいてよい。スライド上の細胞におけるＰＤ－１を可視化するためのキットは、実験サンプルのための追加のスペースと共に対照細胞又は組織サンプルを含有するフォーマット済みスライドを含んでいてよい。当業者には理解されるように、キットの他の実施形態も本明細書において企図されている。
そこで、本開示は、ＰＤ－１に作動的又は拮抗的に結合する結合剤を提供する。一部の実施形態では、結合剤は、配列番号１～１９０からなる群より選択される及び／又は表１Ａ及び１Ｂに示される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドである。一部の実施形態では、結合剤は、（例えば、表１Ａ及び／又は１Ｂに示されるような）配列番号１～１３８及び／又は配列番号１３９～１９０の１又は複数の組合せを含むポリペプチドである。一部の実施形態では、結合剤は抗体である。一部の実施形態では、結合剤は、配列番号１～２３からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列を含む抗体などのポリペプチドである。一部の実施形態では、結合剤は、配列番号２４～４６からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列を含む抗体などのポリペプチドである。一部の実施形態では、結合剤は、配列番号４７～６９からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む抗体などのポリペプチドである。一部の実施形態では、結合剤は、配列番号７０～９２からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列を含む抗体などのポリペプチドである。一部の実施形態では、結合剤は、配列番号９３～１１５からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列を含む抗体などのポリペプチドである。一部の実施形態では、結合剤は、配列番号１１６～１３８からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む抗体などのポリペプチドである。ある実施形態において、結合剤は、配列番号１６４～１９０の１つ又は複数、及び／又はその保存的又は非保存的置換誘導体を含む抗体などのポリペプチドである。ある実施形態において、結合剤は、配列番号１３９～１５０の内の１つ又は複数、及び配列番号１５１～１６３の内の１つ又は複数を含む抗体などのポリペプチドである。ある実施形態において、結合剤は、配列番号１６４～１７７の内の１つ又は複数、及び配列番号１７８～１９０の内の１つ又は複数を含む抗体などのポリペプチドである。例えば、ある好ましい実施形態において、結合剤又は組合せ中の結合剤の少なくとも１つは、配列番号１４３及び１５５（例えば抗体Ａ３５７９５のように）、配列番号１６６及び１８０（例えば抗体Ａ３５７７４のように）、配列番号１７６及び１８９（例えば抗体１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｂのように）、及び／又は配列番号１７６及び１９０（例えば抗体１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｃのように）、及び／又はその保存的又は非保存的置換誘導体（例えば、表５～８に示すような）を含む抗体であってよい。ある実施形態では、結合剤は、表１Ａ及び／又は１Ｂに示すＣＤＲの組合せを含み、及び／又は表３及び／又は表１１～１３の任意の１つ又は複数に記載する特性を有する。
一部の実施形態では、結合剤は、ヒト抗体、ヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ２ａ、ヒトＩｇＧ２ｂ、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＡ、ヒトＩｇＡ１、ヒトＩｇＡ２、ヒトＩｇＤ、ヒトＩｇＥ、イヌ抗体、イヌＩｇＧＡ、イヌＩｇＧＢ、イヌＩｇＧＣ、イヌＩｇＧＤ、ニワトリ抗体、ニワトリＩｇＡ、ニワトリＩｇＤ、ニワトリＩｇＥ、ニワトリＩｇＧ、ニワトリＩｇＭ、ニワトリＩｇＹ、ヤギ抗体、ヤギＩｇＧ、マウス抗体、マウスＩｇＧ、ブタ抗体及び／又はラット抗体及び／又はそれらの誘導体に由来する、又は（例えば、配列又は起源によって）それらに関連する。一部の実施形態では、誘導体は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ’一本鎖抗体、Ｆｖ、一本鎖（例えばｓｃＦｖ）、ＶＨＨ／ＶＨ、単一特異性抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、多重特異性抗体、多価抗体、キメラ抗体、イヌ－ヒトキメラ抗体、イヌ－マウスキメラ抗体、イヌＦｃを含む抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、イヌ化抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、サメ抗体、ナノボディ及び／又はラクダ抗体からなる群より選択することができる。そのような抗体、断片などは、そのための広く利用可能な技術の任意のものを用いて作製することができる。例えば、ヒト化抗体は、米国特許第９，０９０，９９４号明細書（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．）に記載されている手順を用いて、及び／又は広く利用可能なきっと及び／又はシステム（例えば、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（登録商標）などの民間企業（例えば、ＦＡＳＥＢＡシステム）から入手可能なものなど）を用いて作製することができる。ある実施形態において、結合剤は、配列番号１３９～１９０の（又はそのようなアミノ酸をコードする核酸配列によってコードされる）アミノ酸配列の１つ又は複数、及び／又はその誘導体又は変異体（例えば、その保存的置換誘導体又は変異体）を含むヒト化抗体であってよい。当業者に理解されるように他の実施形態も企図されている。
ある実施形態において、結合剤は、配列番号１３９～１５０の内の少なくとも１つ、及び配列番号１５１～１６３の内の少なくとも１つ、及び／又はその誘導体又は変異体（例えば、その保存的置換誘導体又は変異体）を含むヒト化抗体であってよい。ある実施形態において、結合剤は、表１２に示される、ヒト化抗体Ａ３５７９６（配列番号１４０及び１５２を含む）、ヒト化抗体Ａ３５７９３（配列番号１４１及び１５３を含む）、ヒト化抗体Ａ３５８１８（配列番号１４２及び１５４を含む）、ヒト化抗体Ａ３５７９５（配列番号１４３及び１５５を含む）、ヒト化抗体Ａ３５７９７（配列番号１４４及び１５６を含む）、ヒト化抗体Ａ３５７９９（配列番号１４５及び１５７を含む）、ヒト化抗体Ａ３５８０５（配列番号１４６及び１５８を含む）；ヒト化抗体１３７Ｆ ＶＨ１／ＶＬ１（配列番号１４７及び１５９を含む）、ヒト化抗体１３７Ｆ ＶＨ２／ＶＬ２（配列番号１４８及び１６０を含む）、ヒト化抗体１３７Ｆ ＶＨ１ｂ／ＶＬ１ｂ（配列番号１４９及び１６１を含む）、ヒト化抗体１３７Ｆ ＶＨ１ｃ／ＶＬ１ｃ（配列番号１５０及び１６２を含む）、又はヒト化抗体１３７Ｆ ＶＨ１ｂ／ＶＬ１ｄ（配列番号１４９及び１６３を含む）によって示される、ヒト及びサルのＰＤ－１に対する結合親和性（ｋａ（Ｍ－１／ｓ－１）、ｋｄ（ｓ－１）、及びＫＤ（Ｍ））とほぼ同一の結合親和性（すなわち、その約２５０％、約２００％、約１５０％、約１００％、約７５％、約５０％、約２５％、約２０％、約１５％、又は約１０％のいずれかの範囲内にある；及び／又は最低でも１０ｎＭの親和性（ＫＤ１０－８Ｍ））を示す。ある実施形態において、１３７Ｆ ＶＬ１ｄを任意の他の１３７Ｆ可変重鎖と組み合わせて（又は対にして）よい。
他の実施形態において、結合剤は、配列番号１６４～１７７の内の少なくとも１つ、及び配列番号１７８～１９０の内の少なくとも１つ、及び／又はその誘導体又は変異体（例えば、その保存的置換誘導体又は変異体）を含むヒト化抗体であってよい。ある実施形態では、結合剤は、表１３に示される、ヒト化抗体Ａ３５７７５（配列番号１６４及び１７８を含む）、ヒト化抗体Ａ３５７８３（配列番号１６５及び１７９を含む）、ヒト化抗体Ａ３５７７４（配列番号１６６及び１８０を含む）、ヒト化抗体Ａ３６４４３（配列番号１６７及び１８１を含む）、ヒト化抗体Ａ３５７７７（配列番号１６８及び１８２を含む）、ヒト化抗体Ａ３５７８９（配列番号１６９及び１８を含む）、ヒト化抗体Ａ３６４４８（配列番号１７０及び１８４を含む）、又はヒト化抗体Ａ３６４３７（配列番号１７１及び１８５を含む）；ヒト化抗体１３５Ｃ ＶＨ１／ＶＬ１（配列番号１７２及び１８６を含む）、ヒト化抗体１３５Ｃ ＶＨ２／ＶＬ２（配列番号１７３及び１８７を含む）、ヒト化抗体１３５Ｃ ＶＨ３／ＶＬ３（配列番号１７４及び１８８を含む）、ヒト化抗体１３５Ｃ ＶＨ１ｂ／ＶＬ１ｂ（配列番号１７５及び１８９を含む）、ヒト化抗体１３５Ｃ ＶＨ１ｃ／ＶＬ１ｂ（配列番号１７６及び１８９を含む）、ヒト化抗体１３５Ｃ ＶＨ１ｃ／ＶＬ１ｃ（配列番号１７６及び１９０を含む）、又はヒト化抗体１３５Ｃ ＶＨ１ｄ／ＶＬ１ｃ（配列番号１７７及び１９０を含む）のヒト及びサルのＰＤ－１に対する結合親和性（ｋａ（Ｍ－１／ｓ－１）、ｋｄ（ｓ－１）、及びＫＤ（Ｍ））とほぼ同一の結合親和性（すなわち、それらの約２５％、約２０％、約１５％、又は約１０％のいずれかの範囲内にある；及び／又は最低でも１０ｎＭの親和性（ＫＤ１０－８Ｍ））を示す。
一部の実施形態では、結合剤は少なくとも第１及び第２の特異性を有し、第１の特異性はＰＤ－１に対するものであり、第２の特異性は異なる抗原（例えば、ＨＩＶなどの感染性因子の抗原（例えばＥｎｖ）及び／又は腫瘍抗原）に対するものである。一部の実施形態では、結合剤及び／又はその誘導体は、それに固定可能に付着させた検出可能な標識を含んでいてよい。一部の実施形態では、結合剤及び／又はその誘導体は、それに固定可能に付着させたエフェクター部分（例えば、細胞毒性薬、毒素、ジフテリアＡ鎖、外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、エノマイシン及び放射化学薬品）を含む。一部の実施形態では、１つ又は複数の結合剤をコードするポリヌクレオチド（例えば、発現ベクターとして）も提供する。そのようなポリヌクレオチドのポリペプチド産物を含む及び／又は発現する宿主細胞も提供する。一部の実施形態では、少なくとも１つの結合剤又は誘導体；少なくとも１つの単離ポリヌクレオチド；少なくとも１つの発現ベクター；及び／又は少なくとも１つの宿主細胞；又はそれらの組合せ；並びに医薬上許容される担体を含む組成物も提供する。
本開示はさらに、細胞上のＰＤ－１を検出する方法であって、試験生物学的サンプルを本明細書に記載される結合剤又は誘導体と接触させる工程、及びその生物学的サンプル又はその成分に結合した結合剤を検出する工程を有してなる方法も提供する。そのような方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ法又はｉｎ ｖｉｔｒｏ法であってよい。一部の実施形態では、その方法は、試験生物学的サンプル又はその成分に結合した量を対照生物学的サンプル又はその成分に結合した量と比較する工程を含み、対照生物学的サンプル又はその成分に結合した量と比較した、試験生物学的サンプル又はその成分に結合した量の増加は、試験生物学的サンプル（例えば、哺乳動物血液）におけるＰＤ－１を発現する細胞の存在を示す。一部の実施形態では、機能的疲弊回復アッセイ（ＥＦＲＡ）により候補結合剤をアッセイし；ＰＤ－１に対する候補結合剤の親和性を特定し；さらに候補結合剤のＣＤＲのヌクレオチド配列を特定することにより、ＰＤ－１抗体結合剤を同定するためのシステムを提供する。
一部の実施形態では、細胞内又は細胞上でのＰＤ－１の発現を検出するためのキットであって、結合剤又はその誘導体、及び使用説明書を含むキットを提供する。一部の実施形態では、結合剤及び／又はその誘導体は凍結乾燥形態にある。
一部の実施形態では、本開示は、哺乳動物において、感染性疾患、がん及び／又は自己免疫を治療、予防及び／又は改善する方法であって、結合剤又はその誘導体を含む医薬組成物の少なくとも１有効用量を哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、感染性疾患は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である。一部の実施形態では、感染性疾患及び／又はがんを治療するために使用される結合剤及び／又はその誘導体は、ＰＤ－１アンタゴニストである。一部の実施形態では、自己免疫状態を治療するために使用される結合剤及び／又はその誘導体は、ＰＤ－１アゴニストである。一部の実施形態では、複数用量が動物に投与される。一部の実施形態では、結合剤及び／又はその誘導体は、約０．１～約５０ｍｇ／ｋｇ、約１～約３０ｍｇ／ｋｇ、又は約５～約３０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．１、約０．２、約０．２５、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３５、又は約４０ｍｇ／ｋｇのいずれか）の投与量で投与することができる。
本開示は、さらにＰＤ－１結合剤の組合せも提供する。一部の実施形態では、組合せは、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用をブロックする第１結合剤、及びＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用をブロックしない第２結合剤を含む。例示的な組合せとして、例えば、ブロッキング抗ＰＤ－１抗体の１つ又は複数と、例えば、１３５Ｃ１２（配列番号１７、４０、６３、８６、１０９、及び１３２）、１３９Ｄ６（配列番号２、２５、４８、７１、９４、及び１１７）、１３５Ｄ１（配列番号３、２６、４９、７２、９５、及び１１８）、及び／又は１３６Ｂ４（配列番号１９、４２、６５、８８、１１１、及び１３４）のアミノ酸配列を含むものの任意の１つ又は複数のような、この中に記載されている非ブロッキング結合剤の１つ又は複数と、を含んでいてよい。例示的な実施形態は、ブロッキング抗体ＭＫ３４７５（ペムブロリズマブ）、又は配列番号８、３１、５４、７７、１００、及び１２３（１３７Ｆ２）のアミノ酸配列を含むブロッキング結合剤と、配列番号１７、４０、６３、８６、１０９、及び１３２（１３５Ｃ１２）のアミノ酸配列を含む非ブロッキングＰＤ－１結合剤との組合せを含む。図９Ａ及びＢに示すように、これらの例示的な組合せの両方が、いずれか一方の抗体単独で達成されるよりもさらに、ＨＩＶ－特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能的疲弊の救済を増強し及びその増殖を高める。ブロッキング抗体ＭＫ３４７５又は１３７Ｆ２と組み合わせて有用となりうる他の例示的な非ブロッキング抗体は、非ブロッキングＰ２パッチ特異的（Ｍ４（図３Ａ、Ｂ））結合剤１３５Ｄ１（配列番号３、２６、４９、７２、９５、及び１１８を含む）、及び／又は結合剤１３９Ｄ６（配列番号２、２５、４８、７１、９４、及び１１７を含む）、及び／又は非ブロッキングＰ２パッチ特異的（Ｍ１７（図３Ａ、Ｅ））結合剤１３６Ｂ４（配列番号１９、４２、６５、８８、１１１、及び１３４を含む）である。他の組合せも当業者に特定されるように適切となりうる。
そのような組合せを、本明細書に記載される又は当業者が確認できる任意の用途のために使用できる。例えば、そのような組合せを、本明細書に記載される哺乳動物における感染性疾患、がん及び／又は自己免疫を治療、予防及び／又は改善する方法において使用してよい。ある実施形態では、対象において炎症を治療する方法であって、少なくとも２つのアンタゴニストＰＤ－１結合剤の組合せを投与することを含み、前記結合剤のそれぞれがＰＤ－１上の異なるエピトープに対する特異性を有し、前記結合剤の少なくとも１つはＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用にブロッキング性であり、及び前記結合剤の少なくとも１つはＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用に非ブロッキング性である方法も提供する。本開示はまた、対象において慢性神経変性状態を治療する方法であって、少なくとも２つのアンタゴニストＰＤ－１結合剤の組合せを投与することを含み、前記結合剤のそれぞれがＰＤ－１上の異なるエピトープに対する特異性を有し、前記結合剤の少なくとも１つはＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用にブロッキング性であり、及び前記結合剤の少なくとも１つはＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用に非ブロッキング性である方法も提供する。ある実施形態において、慢性神経変性状態はアルツハイマー病である。本開示はまた、例えばがんの治療におけるような、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えばヒト腫瘍細胞などの腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、少なくとも２つのアンタゴニストＰＤ－１結合剤の組合せを投与することを含み、前記結合剤のそれぞれがＰＤ－１上の異なるエピトープに対する特異性を有し、前記結合剤の少なくとも第１結合剤がＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用にブロッキング性であり、及び前記結合剤の少なくとも第２結合剤がＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用に非ブロッキング性である方法も提供する。ある実施形態において、前記組合せは、例えば、ＲＡＳＫＧＶＳＴＳＧＹＳＹＬＨ（配列番号２８７）、ＬＡＳＹＬＥＳ（配列番号２８８）、ＱＨＳＲＤＬＰＬＴ（配列番号２８９）、ＮＹＹＭＹ（配列番号２９０）、ＧＩＮＰＳＮＧＧＴＮＦＮＥＫＦＫＮ（配列番号２９１）、及び／又はＲＤＹＲＦＤＭＧＦＤＹ（配列番号２９２）の内の少なくとも１つを含む抗体；ＭＫ３４７５；及び／又はキイトルーダなどの、ブロッキング結合剤を含んでいてよい。ある実施形態において、例えば抗体などの非ブロッキング結合剤は、配列番号１７、４０、６３、８６、１０９及び１３２の内の少なくとも１つ、又は配列番号１６４～１９０の内の任意の１つ又は複数（例えば配列番号１７６及び１９０）、及び／又は少なくとも１つのアミノ酸置換を有するその誘導体を含んでいてよい。ある実施形態において、哺乳動物に複数回投与され、それらの投与は、約１週間、約２週間、約３週間、或いは望ましくは約１ヶ月又はそれ以上の間隔をあけて行ってよい。
本開示は、細胞において結合剤を発現させ、さらにその細胞又はその細胞の培養上清から結合剤を単離することにより、本明細書に記載される結合剤を製造する方法も提供する。一部の実施形態では、その方法は、そのような結合剤をコードする核酸を発現させる工程をさらに含んでいてよい。一部の実施形態では、そのような方法は、単離後に結合剤を１又は複数の医薬上許容される賦形剤と組み合わせる工程をさらに含んでいてよい。
本開示によって、例えばＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用をブロックする第１結合剤、及びＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用をブロックしない第２結合剤などの、結合剤の組合せを製造する方法も提供される。一部の実施形態では、第２結合剤はＰＤ－１に結合する。一部の実施形態では、第１及び／又は第２結合剤は、例えばモノクローナル抗体、或いはその断片又は誘導体のような抗体である。一部の実施形態では、第２結合剤は、配列番号１７、４０、６３、８６、１０９、及び１３２（例えば１３５Ｃ１２）；配列番号２、２５、４８、７１、９４及び１１７（例えば１３９Ｄ６）；配列番号３、２６、４９、７２、９５、及び１１８（例えば１３５Ｄ１）；及び／又は配列番号１９、４２、６５、８８、１１１、及び１３４（例えば１３６Ｂ４）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、これらの方法は、医薬上許容される賦形剤の添加をさらに含んでいてよい。
用語「約」、「ほぼ」などは、数値又は範囲のリストに先行する場合は、リスト又は範囲内の各個別値の直前にその用語が置かれているかのように、そのリスト又は範囲内の各個別値に独立して言及する。これらの用語は、それが言及する数値がその数値と正確に同一、それに近い、又はそれに類似することを意味する。
本明細書で使用する「対象」又は「宿主」は、個体であることが意味される。対象は、例えばネコ及びイヌ、家畜類（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ及びヤギ）などの家畜化された動物、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット）及びトリ類を含んでいてよい。１つの態様では、対象は、例えば霊長類又はヒトなどの哺乳動物である。
「任意選択的」又は「任意選択的に」は、続いて記載した事象又は状況が発生しても発生しなくてもよく、その記述が事象又は状況が発生する場合及びそれが発生しない場合を含むことを意味する。例えば、語句の「任意選択的に組成物が組合せを含み得る」は、その記述が組合せと組合せの非存在（すなわち、組合せの個々のメンバー）の両方を含むように、その組成物が、異なる分子の組合せを含んでも又は組合せを含まなくてもよいことを意味する。
本明細書では、「範囲」は、約１つの特定値から、及び／又は約別の特定値までとして表示することができる。そのような範囲が表示される場合、別の態様は、その一方の特定値から、及び／又はその他方の特定値までを含む。同様に、数値が近似値として表示される場合は、先行詞「約」又は「ほぼ」の使用によって、その特定値が別の態様を形成すると理解されるであろう。さらに、範囲のそれぞれの終点は、他の終点に関連して、及び他の終点から独立しての両方で有意であることが理解されるであろう。範囲（例えば、９０～１００％）は、各数値が個別に列挙されているかのように範囲自体、並びにその範囲内の各独立値を含むことが意図されている。
用語「組み合わせる(combined)」、「組み合わせて(in combination)」又は「共に(in conjunction)」は、一緒に投与される薬剤の物理的組合せ、或いは、特定疾患を治療、予防及び／又は改善するための治療計画における２つ以上の薬剤の使用（例えば、物理的及び／又は時間において別個に投与される）を意味することができる。
「治療する」、「予防する」及び／又は「改善する」の用語が、所定の状態のための所定の治療（例えば、がん又はＨＩＶによる感染を予防する）と関連して使用される場合、治療された患者が臨床的に観察可能なレベルのその状態を全く発生しない、又は彼／彼女が治療を受けなかった場合よりも、ゆっくり及び／又は少ない程度までしかその症状を発生しないことを伝えることが意図されている。これらの用語は、患者が全くその状態の態様を経験しない状況のみに限定されるものではない。例えば、「治療」は、状態の所定の発現を生じると予測される刺激物への患者の曝露中に与えられ、それが与えられなかった場合に予測されるよりも少ない及び／又はより軽度の症状をその患者が経験する場合に、その状態を予防したと言われるであろう。例えば、治療は、患者が感染の軽度の明らかな症状しか示さない状態をもたらすことによって、感染を「予防する」ことができる；これは、感染微生物による細胞の侵入があってはならないことを意味するものではない。
同様に、特定の治療による所定の状態の予防、治療及び／又は改善と関連して本明細書に使用される「低減させる」、「低減させること」及び／又は「低減」は、典型的には、治療（例えば、１つ又は複数のＰＤ－１結合剤の投与）の非存在下において感染症を発生する対照又は基底レベルと比較して、よりゆっくり、又はより少ない程度に感染症を対象が発生することを意味する。感染症のリスクの低減は、患者が、感染の軽度の明らかな症状又は感染の遅延された症状のみを示すことを生じさせ得る；これは、感染微生物による細胞の侵入があってはならないことを意味するものではない。
本開示の中で言及したすべての参考文献は、その全体が参照によりここに組み込まれる。下記の実施例では、所定の実施形態についてさらに記載する。これらの実施形態は、例示としてのみ提供され、決して特許請求項の範囲を限定することを意図していない。
実施例１
ＰＤ－１結合剤の作製及び特性解析
４種のマウス系統（マウス計１６匹）を、２種のＰＤ－１タンパク質、すなわちヒトＰＤ－１ Ｆｃ融合タンパク質及びヒトＰＤ－１モノマータンパク質で免疫した。活性化ヒトＴリンパ球上に発現されたＰＤ－１に対して血清反応性を示すマウスを、抗ＰＤ－１ハイブリドーマ細胞株を作製するために選択した。組換えＰＤ－１タンパク質に結合する抗体を作製するために、計２４０のＰＤ－１ハイブリドーマ細胞株を選択した。第１ラウンドの抗体選択のための一次基準は：ｉ）フローサイトメトリーによる活性化ヒトＴリンパ球上のＰＤ－１の染色；ｉｉ）既存の抗ＰＤ－１抗体と比較したＣＤＲ ＶＨ及びＶＬ配列の多様性；及び（ｉｉｉ）ＰＤ－１上の異なるエピトープに結合する２つの市販の抗ＰＤ－１抗体と共にＰＤ－１コンジュゲートＬｕｍｉｎｅｘビーズを用いる競合結合試験によって実施されるエピトープマッピングであった。次に、第２ラウンドの選択を：ｉｖ）親和性結合アッセイ（抗ＰＤ－１抗体の刺激能力とは相関しないので一次基準ではない）；ｖ）ＰＤ－１に結合し、かつＬｕｍｉｎｅｘ生化学的アッセイにおいてＰＤ－Ｌ１の結合にブロッキング性又は非ブロッキング性のいずれかである抗ＰＤ－１抗体の評価；及びｖｉ）アゴニスト（Ｔ細胞を機能的疲弊から回復させることができない）又はアンタゴニスト（Ｔ細胞を機能的疲弊から回復させることができる）としての抗体の機能的特性解析；によって実施した。これらの試験では、抗体を試験して、ＨＩＶ特異的疲弊ＣＤ８ Ｔ細胞において増殖を救済する能力に基づき差別化した。
個々の細胞培養ハイブリドーマ細胞クローンからの抗体上清の一次スクリーニングにおいて、ＨＩＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖に対する抗ＰＤ－１抗体の機能的効果を評価するためにＥＦＲＡアッセイを実施した。抗体クローンＥ８－３、Ｃ２－３、Ｅ１－３、Ｆ３－３、Ｈ８－３、Ｃ１０－２、Ｇ２－１、Ｇ３－２、Ｈ２－１及びＨ４－２は、ＰＤ－１アンタゴニストとして作用して増殖を刺激することが見いだされたが、抗体クローンＣ８－１及びＧ１０－２は、作動性（アゴニスト）で、ＰＤ－１の負の調節作用を促進する。ペプチド対照（Ｐｅｐ ８）によって誘導された増殖のレベルは、１％よりわずかに下であり、Ｍｅｒｃｋ ＭＫ－３４７５抗ＰＤ１抗体により誘導された増殖は２％よりわずかに上である。これらのプロセスによって同定された関心抗体は、第２ラウンドのサブクローニングを受け、その結果得られたハイブリドーマクローンを、表３に示す抗体の産生及び精製のために使用した。サブクローンがＰＤ－１に対する親和性を保持していることを確認するために、精製抗ＰＤ－１を用いて結合アッセイを実施した。抗ＰＤ－１抗体の細胞表面ＰＤ－１への濃度反応結合を、活性化ＣＤ４ Ｔ細胞上で評価した。
ＥＦＲＡは、機能的疲弊からＴ細胞を回復させる結合剤の選択を提供するが、その選択はＰＤ－１とその生物学的リガンド（例えば、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２）との相互作用を妨害しない結合剤に必ずしも限定されない。ＥＦＲＡの実施形態は、ＰＤ－１に結合するそのような結合剤（抗体）を同定するためであった。ＰＤ－１に結合する抗体のエピトープマッピングを、２つの別個の生化学的アッセイを用いて実施した。１つのアッセイでは、ＰＤ－１ Ｆｃ融合タンパク質標識ビーズに対する競合結合を、２種の市販の抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７及びＪ１１６）の内の１つと、列挙した（表３にも記載した）抗ＰＤ－１抗体との間で評価した。別個のエピトープに結合する４つのクラスのモノクローナル抗体をこのアッセイに基づき同定した。それらは：クラス１（ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用をブロックする市販モノクローナル抗体クローンＥＨ１２．２Ｈ７と競合的）、クラス２（ＰＤ－１に結合するがＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用を有効にはブロックしない市販モノクローナル抗体クローンＪ１１６と競合的）、クラス３（市販モノクローナル抗体ＥＨ１２．２Ｈ７及びＪ１１６の両方と競合的）及びクラス４（市販抗体ＥＨ１２．２Ｈ７及びＪ１１６のどちらとも非競合的）である。抗体を４つの結合クラスの内の１つに入れ、細胞表面ＰＤ－１に対するこれら抗体の相対的結合を、対照抗ＰＤ－１抗体に対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって表わした。これらの結果は、堅固な結合抗体が４つ全ての結合クラスから同定されたことを示した。第２のＬｕｍｉｎｅｘ結合アッセイを使用して、抗ＰＤ－１抗体が、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用をブロックするか否かを直接的に評価した。このアッセイは、ＰＤ－１ Ｆｃ融合タンパク質被覆ビーズを用いて実施し、ＰＤ－１ Ｆｃ融合タンパク質被覆ビーズを表３からの抗ＰＤ－１抗体と共にインキュベートし、その後にＰＤ－１／抗体複合体を様々な濃度のビオチン化ＰＤ－Ｌ１とインキュベーションした。結合曲線を、競合抗ＰＤ－１抗体の非存在下でのＰＤ－Ｌ１の結合と比較した。表３からのある抗ＰＤ－１抗体（図１Ａに示されている抗体１３７Ｆ２）は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を完全にブロックできることが分かった。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用の非ブロッキング抗体として表３に列挙した抗体は、ＰＤ－１に対するＰＤ－Ｌ１の結合親和性のシフトをもたらすが、ＰＤ－Ｌ１の濃度が上昇した場合に相互作用をブロックしない（図１Ｂ及びＣにそれぞれ示されている抗体１３５Ｃ１２及び１３６Ｂ４）。１つの解釈において、これらの抗体はＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用と非競合的であるか或いは部分的に競合的であるかのいずれかである。これら抗体の一部は、対照と比較して増殖の統計的に有意な増加をもたらすことも示された。クラス１の抗体（ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用をブロックする市販モノクローナル抗体ＥＨ１２．２Ｈ７と競合的、又はＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用アッセイにおいてブロックする）は、概して、改善された増殖回復をもたらすことが特定された。複数回のＥＦＲＡ実験からのデータを組み合わせ、及び共通コンパレーターとしてのＭＫ－３４７５を使用して、表２に記載した選択抗体は、ベンチマークＭＫ－３４７５抗体と比較して、同等又は統計的に改善された活性（ｐ＜０．００７）を示した。
実施例２
抗体の組合せ
異なるＰＤ－１エピトープに結合する抗体の組合せが、機能的疲弊回復アッセイにおいて、ＨＩＶペプチド特異的ＣＤ８ Ｔ細胞増殖の回復を増強することが見いだされた。抗体タイプ間の相乗作用も観察された。例えば、クラス１（ＭＫ－３４７５）及びクラス２（１３９Ｄ６）の抗体が同時にＰＤ－１に結合できることが特定された。ＭＫ－３４７５について観察された最高の刺激は、ＨＩＶペプチドに対して一貫して約２００％であるが、各５μｇ／ｍｌでのＭＫ－３４７５及び１３９Ｄ６モノクローナル抗体の組合せは、ＨＩＶペプチド対照単独に対して２８８％にＨＩＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞増殖を増加させ、又はＭＫ－３４７５又は１３９Ｄ６添加単独に対して１４４％に増殖を増加させ、相乗作用を示した。増殖におけるこの相乗的増加は、数回の実験による試験において０．００７の統計的有意なｐ値をもって観察された。比較として、ＭＫ－３４７５又は１３９Ｄ６いずれか単独の１０μｇ／ｍｌの添加は、ＥＦＲＡにおける増殖増加を生じさせなかった。従って、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用をブロックする第１結合剤及びＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用をブロックしない第２結合剤のような、結合剤の組合せは、Ｔ細胞を疲弊から救済するために相乗的に作用すると特定された。
実施例３
抗ＰＤ－１抗体のエピトープマッピング
予備的エピトープマッピング評価は、市販の抗ＰＤ－１抗体（ＥＨ１２．２Ｈ３及びＪ１１６）と、この特許で規定される新たに同定された抗ＰＤ－１抗体との間での生化学的競合結合アッセイ試験に基づくものであった。この手順は、上記の２つの市販の抗体のいずれかと競合的に又は非競合的にＰＤ－１に結合することに基づき、抗体を４つの結合クラスの内の１つに分類することを可能にした。ＰＤ－１上のエピトープに結合する抗体を特定するより正確な方法は、溶媒露出残基での慎重なアミノ酸置換を有する異なるＰＤ－１タンパク質との抗体の相互作用をモニターすることである。これらの残基が抗ＰＤ－１抗体の堅固な結合に重要である場合、置換はＰＤ－１タンパク質への結合を低減させる。これらの試験は、ＣＭＶプロモータの制御下において哺乳動物発現ベクターｐＲｅｃｅｉｖｅｒ－Ｍ６７内にコードされたＰＤ－１遺伝子の部位特異的突然変異誘発により行われた。ＰＤ－１タンパク質のための公開された構造データ３ＲＲＱ ＰＤＢを用いて、溶媒露出残基に１つ、２つ又は３つのアミノ酸置換を有する３１の異なるＰＤ－１クローンを設計した。ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１／Ｌ２との間の相互作用に関与する残基を、ヒトＰＤ－１とＰＤ－Ｌ２との複合体の公開結晶構造に基づき特定し（Ｌａｚａｒ－Ｍｏｌｎａｒ、ＰＮＡＳ、２００８、ｐ１０４８３－１０４８８）、さらに図２に示すＰＤ－１構造に番号を記載した球体としてマッピングした（番号付けはヒトＰＤ－１（図２Ｈ、配列番号２７５）のアミノ酸残基に対応する）。置換は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用に関係する残基（Ｍ１０、Ｍ１１、Ｍ１２、Ｍ１４、Ｍ２３、Ｍ２４、Ｍ２５で表される）において、或いはＰＤ－Ｌ１相互作用に直接は関係しないＰＤ－１タンパク質の反対側の又は隣接する表面にある残基（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９、Ｍ１３、Ｍ１５、Ｍ１６、Ｍ１７、Ｍ１８、Ｍ１９、Ｍ２０、Ｍ２１、Ｍ２２、Ｍ２６、Ｍ２７、Ｍ２８、Ｍ２９、Ｍ３０、Ｍ３１で表される）において選択され、図３で規定されている。次に、ＰＤ－１をコードするＤＮＡベクターを用い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００トランスフェクション試薬を用いてＨｅＬａ細胞を一過性トランスフェクトした。細胞を３７℃で３６～４８時間、採用培養インキュベータ中でインキュベートして、ＰＤ－１タンパク質を細胞表面発現させ、次いで細胞を再懸濁させ、０．３～２μｇ／ｍｌの間の表３から選択される所定の抗ＰＤ－１抗体と共に３０分間インキュベートした。洗浄工程の後、細胞をＰＥ標識抗マウスＩｇＧ二次抗体で染色し、その後フローサイトメトリーで解析した。各実験において、野生型ＰＤ－１タンパク質を抗体結合の陽性対照として用い、さらにＰＤ－１上の異なるエピトープに結合するいくつかの抗体（ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用にブロッキング性であるか又は非ブロッキング性であるかによって、或いは市販のＰＤ－１クローンを用いた競合結合試験から特定された）を並行して評価して異なるアミノ酸置換を有するＰＤ－１タンパク質の相対的発現レベルをモニターした。表３からの試験した全ての抗ＰＤ－１抗体が、野生型ＰＤ－１でトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞に特異的に結合したが、空のベクター対照でトランスフェクトした細胞には結合しなかった。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用にブロッキング性であるか又は非ブロッキング性である抗ＰＤ－１抗体を用いて染色したときに、全ての突然変異ＰＤ－１タンパク質が、野生型に近いレベルで発現したか、或いは非トランスフェクト対照と比較して平均蛍光強度において有意なシフトをもたらした。次に、表３からの抗体の選択セットを、トランスフェクトしたＨｅＬａ細胞の細胞表面で発現される野生型又は突然変異体のＰＤ－１タンパク質のいずれかに結合する能力に関して体系的に試験した。これらの結果を、様々な抗ＰＤ－１抗体クローンのそれぞれに関して結合を失効させる又は低減させる突然変異を表示して、表１１に要約する。図４～８に表すフローサイトメトリーヒストグラムは、指示された突然変異ＰＤ－１構築物でトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞に効率的に又は低減された親和性で結合する様々な抗体の例を提供する。予測されるように、生化学的アッセイでＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用にブロッキング性であることが示された抗体（ＭＫ－３４７５、１３７Ｆ２、１４０Ｇ５、及び１３９Ｆ１１）は、その相互作用部位とオーバーラップするＰＤ－１上のエピトープに結合した。生化学的ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用試験と一致して、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用に非ブロッキング性である抗体（１３６Ｂ４、１３５Ｃ１２、１３６Ｅ１０）は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用に関係するアミノ酸残基から遠位の別個のエピトープに結合した。図８において、１３６Ｂ４及び１２２Ｆ１０抗体に関して、Ｍ１７ ＰＤ－１タンパク質への結合に有意なシフトが観察されたが、１３５Ｃ１２抗体に関してはＭ２６ ＰＤ－１タンパクに対して結合のわずかなシフトが観察された。これらの違いは、１３６Ｂ４と１３５Ｃ１２が、別個のファミリーに属するＣＤＲループを有し、図１３に表すように両方がＰ２パッチとオーバーラップするＰＤ－１上の異なるエピトープに結合することをはっきり示す。
Figure 0007089474000018
実施例４
ＰＤ－１の新規なアンタゴニスト作用に関係する非ブロッキング抗体エピトープ
多様なＰＤ－１上のエピトープに結合する抗体を、機能的疲弊回復アッセイにおいてそのアンタゴニスト活性について評価した。これらの試験は、アンタゴニスト抗体が、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用にブロッキング性又は非ブロッキング性のいずれかとなりうることを示した。抗ＰＤ－１抗体の機能活性に起因する作用形態がＰＤ－１の遮断（ブロック）によるものであることを考慮すれば、これらの結果は、非ブロッキングアンタゴニスト抗体によって阻害されているＰＤ－１の新規な機能を暗示する。この主張は、ブロッキング抗ＰＤ－１抗体と非ブロッキング抗ＰＤ－１抗体との組み合わせが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ機能的疲弊回復アッセイにおいてアンタゴニスト活性を増強させたこことにより支持される。この増強された機能活性は、単独で投与した場合にいずれか一方の抗体で達成されうる誘導レベルを超えるものであり、ブロッキング（すなわち、競合的な）抗ＰＤ－１抗体（ＭＫ３４７５又は１３７Ｆ２）の、非ブロッキング（すなわち、生化学的ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用アッセイにおいて非競合的又は部分的に競合的である）抗ＰＤ－１抗体１３５Ｃ１２（図９Ａ）又は１３９Ｄ６（図９Ｂ）との様々な組合せを用いて実証された。それらの機能活性の更なる証拠として、混合リンパ球反応アッセイ（ＭＬＲ）において、抗ＰＤ－１抗体を、単独で、或いはＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ブロッキング及び非ブロッキングアンタゴニスト抗体を組み合わせて試験した。ＭＬＲアッセイは、１人の健康ドナー由来の単球を、第２の健康ドナー由来のＰＤ－１＋メモリーＣＤ４ Ｔ細胞と混合することを含む。磁気ビーズを用いたＣＤ１４ポジティブセレクションにより末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単球を単離した。第２のドナー由来のＰＢＭＣは、まず磁気ビーズを用いてＣＤ４５ＲＡ発現細胞を枯渇させ、次にＣＤ４陽性Ｔ細胞のポジティブセレクションのために異なる磁気ビーズセットを用いた。次に、生存ＰＤ－１＋細胞集団に基づきソートするために、これらのメモリーＣＤ４ Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ－）を、ＡｑｕａＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色キット、並びに１２７Ｃ２抗ＰＤ－１抗体クローン（アンタゴニスト活性を有しておらず、かつＰＤ－１への結合に関してＭＫ３４７５、１３７Ｆ２又は１３５Ｃ１２と競合しないことが示されている）及び二次抗マウスＰＥ抗体を用いて染色した。２人の異なるドナー由来の単球とＣＤ４＋Ｔ細胞を、１：２又は１：５の比率で混合した後、細胞を未処理のままにするか、或いは１μｇ／ｍｌの図１０に示される抗ＰＤ－１抗体で処理した。細胞培養インキュベータ中での５日間のインキュベート後、細胞培養上清の一部を採取し、ＥＬＩＳＡで分泌ＩＦＮγを分析した。細胞培養液にトリチウム標識チミジン（３Ｈ－ＴｄＲ）を添加し、細胞をさらに１８時間インキュベートした。３Ｈ－ＴｄＲ取込みを細胞増殖の指標として用いた。この第２の独立したｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、我々の抗ＰＤ－１抗体の機能活性を確認した。図１０ａにおいて、ＣＤ４＋Ｔ細胞の２倍まで高められた増殖が、抗ＰＤ－１抗体の個々又は組合せにより誘導された。図１０ｂにおいて、個々で試験したときに全ての抗ＰＤ－１抗体についてＩＦＮγ産生の強い増加が観察され、１３７Ｆ２が最も高い誘導レベルをもたらした。ブロッキング抗ＰＤ－１抗体と非ブロッキング抗ＰＤ－１抗体の組合せ（ＭＫ３４７５及び１３５Ｃ１２、又は１３７Ｆ２及び１３５Ｃ１２のいずれか）において、ＰＤ－１＋メモリーＣＤ４ Ｔ細胞の増殖の増加及びＩＦＮγ産生の増加の傾向が観察された。ＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＦＮγ産生の増加が、ＰＤ－１免疫チェックポイント遮断療法で治療した際のアルツハイマー病のマウスモデルにおける病状の軽減及び記憶の改善に関連する（ＢａｒｕｃｈＫ、ＮａｔｕｒｅＭｅｄ、２０１５）ことを考えれば、この中に概要を説明した抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－１抗体の組合せでの治療は、同等の又は向上した治療的利益を有することが予測される。下記にて説明するように、エピトープマッピングは、最も高い能力を有する非ブロッキング抗体は全て、ＰＤ－１の類似のパッチ（この中で「Ｐ２パッチ」と称される）に結合することを示し、そのＰ２パッチは、Ｍ４アミノ酸置換（セリン３８をアラニンへ、プロリン３９をアラニンへ、及びロイシン４１をアラニンへ）（図３；配列番号１４２））の領域、及び／又はＭ１７アミノ酸置換（アスパラギン１０２をアラニンへ及びアルギニン１０４をロイシンへ）（図３；配列番号１５５）の領域、及び／又はＭ１８アミノ酸置換（アスパラギン酸塩１０５をアラニンへ）（図３；配列番号１５６）の領域、及び／又はＭ３１アミノ酸置換（ロイシン４１をアラニンへ及びバリン４３をロイシンへ）（図３；配列番号２０６）の領域と、オーバーラップする。
抗ＰＤ－１抗体のアンタゴニスト活性に関係するＰＤ－１の領域をさらに調べるために、異なる種からの溶媒露出変異アミノ酸残基をヒトＰＤ－１構造にマッピングした。３ＲＲＱ ＰＤＢに基づくこの構造表示は、図１１ａにおいてＰＤ－Ｌ１／Ｌ２と相互作用するＰＤ－１の面を、また図１１ｂにおいてＰＤ－１の反対側を示す。サルとヒトのＰＤ－１間で異なる残基を赤の円で示し、齧歯類（マウス及びラット）のＰＤ－１で見られる他の変異残基を緑の円で表し、イヌのＰＤ－１からの追加の変異残基をオレンジで示す。残基４６、５８、７４及び１１６は、Ｎ－結合型グリコシル化の部位に関係があるとされ、青緑色の円で印している。ヒト、サル、ウマ、イヌ、マウス及びラットのＰＤ－１エクトドメインアミノ酸配列の整列を図１１ｃに示し、ヒトＰＤ－１との対応する相同性はそれぞれ、９６．６％、７９．９％、７３．２％、６２．４％及び６６．４％である。ＰＤ－１のこれらの異種間の変異残基を構造上に示すことにより、図１１ａ及び１１ｂにおいてＰ１及びＰ２として指定されるＰＤ－１上の２つの保存されたパッチがあることが明らかとなる。Ｐ１パッチは、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２リガンドとの間の相互作用に関連する中心領域に該当する（図２において球で印す残基を、図１１ａのものと比較する）。進化中にＰＤ－１に蓄積する変異残基はＰＤ－Ｌ１／Ｌ２リガンドとの相互作用をなお維持する必要があるため、このＰ１パッチの異種間の保存が予想される。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用に関係する残基の選択置換は、マウスの変異（例えば残基６４及び６８）で観察され、ＰＤ－１とそのＰＤ－Ｌ１／Ｌ２リガンドとの共進化に起因し得るが；Ｐ１内のコアの相互作用領域は保存されたままである。進化的に保存されたＰ２パッチは、Ｐ１パッチに類似する表面領域を占めるが、この領域は、構造的にも機能的にもＰＤ－１に関して既に同定されている役割は有していない。Ｐ２パッチが調べた種の中で進化的に保存されていることは、ＰＤ－１がＰ２部位を保存する必要に迫られていたことを示す。この保存は、ＰＤ－１エクトドメインが調べた４つの種において６２．４％～７９．９％しか保存されていないことを考えると、より一層に重要である。ヒトＰＤ－１と比較したこれらの４つの種にわたる全ての変異残基を考慮すると、さらに低い５２．３％の配列保存となる（図１１ｃ、青の矢印は、図１１ａ及び１１ｂに描かれている構造領域を表す）。この機能的な圧力が、Ｐ２パッチが、まだ同定されていないリガンドのための相互作用部位として働くことに起因するのか、高次の複合体形成のための部位として働くことに起因するのか、又はＰＤ－１関連シグナル伝達イベントに関連することに起因するのかは、まだ不明である。しかしながら、Ｐ２パッチとオーバーラップする結合エピトープを有する、１３５Ｃ１２、１３９Ｄ６、１３５Ｄ１及び１３６Ｂ４などのこの中に記載されている抗ＰＤ－１抗体は、この領域の機能的重要性の直接の証拠を提供する。
この領域がＰＤ－１の機能活性における既存の関与を持たないことを考えると、図１１ｂに示されるＰＤ－１上のＰ２パッチとオーバーラップする結合を有する１３５Ｃ１２により代表される抗体が、ＰＤ－１上でアンタゴニスト活性を発揮する新規なメカニズム及び部位を説明することをここに提案する。ＰＤ－１のこのＰ２パッチ領域と相互作用できる他の抗体、抗体断片、又は他のタンパク質結合剤はまた、図９、１０及び１７－２０に実証されるように、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用の遮断を介して作用する抗ＰＤ－１抗体とは区別されかつそれに相補的な態様でＰＤ－１のアンタゴニストとして作用することもさらに提案する。ＰＤ－１におけるＰ２パッチ領域の重要性のさらなる例として、１３６Ｂ４抗体は、同様にＰ２パッチとオーバーラップする抗体１３５Ｃ１２、１３９Ｄ６及び１３５Ｄ１と比較して、ＰＤ－１上の別個のエピトープに結合する。１３６Ｂ４は、Ｐ２パッチの縁(edge)に位置するＭ１７及びＭ１８ ＰＤ－１突然変異（Ｍ１７：アスパラギン１０２をアラニンへ及びアルギニン１０４をアラニンへ、Ｍ１８：アスパラギン酸１０５をアラニンへ）との結合で、強く低減された親和性を示す。１３５Ｃ１２、１３９Ｄ６及び１３５Ｄ１抗体と共に、１３６Ｂ４は、全ての試験した非ブロッキング抗体の中で最も高い機能活性を示した。
実施例５
抗体競合結合試験
表３に列挙する選択抗体の結合エピトープをさらに特徴付けるために、細胞表面ＰＤ－１への結合に関して一連の抗体競合試験を実施した。Ｍａｘｐａｒ（登録商標）抗体ラべリングキット（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）を用いて、ＰＤ－１上の別個のエピトープに結合する抗体（ＭＫ３４７５、１３７Ｆ２、１３５Ｃ１２及び１３４Ｄ２）に化学的にコンジュゲートさせた。この手順において、システイン残基を金属キレートポリマーと結合させるために抗体のジスルフィド結合を部分的に還元する。次に、これらの金属同位体修飾抗体を用いて、表面ＰＤ－１の発現レベルを見るために細胞を標識し、マスサイトメトリーにより解析を実施した。ＰＤ－１の高発現レベルを有するＣＤ４ Ｔ細胞を作製するために、健康なドナー由来の末梢血単核細胞をＰＨＡ及びＩＬ－２で刺激し、さらに５日間インキュベートした。細胞染色後、ゲーティングを実施して生存ＣＤ３＋／ＣＤ４＋細胞を選択し、さらにマスサイトメトリーにより各サンプルについてＰＤ－１の細胞表面レベルを評価した。抗体競合アッセイにおいて、２ｘ１０６細胞のサンプルを、１５μｇ／ｍｌの図１２に示す指示された競合抗体の１つと共に４℃で４０分間インキュベートした。次に、金属同位体で標識した染色抗ＰＤ－１抗体（ＭＫ３４７５、１３７Ｆ２、１３５Ｃ１２、又は１３４Ｄ２）を＜１μｇ／ｍｌで細胞に添加し、さらに２０分間インキュベートし、その後洗浄して非結合抗体を除去し、さらに細胞表面ＰＤ－１のレベルについて解析した。マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体を陰性対照として及び参照（基準）として用いて、抗ＰＤ－１競合抗体クローンと共にインキュベートしたサンプルに関するＰＤ－１陽性細胞の割合（％）を計算した。
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用にブロッキング性であるクラス１抗ＰＤ－１抗体は全て、ＰＤ－１高細胞をＭＫ３４７５又は１３７Ｆ２のいずれかで染色した実験において競合的であった（ＩｇＧ１対照に対して≦２９％のＰＤ－１陽性細胞の染色をもって図１２に示されるように）。いくつかのこれらの抗体のエピトープマッピングが、同一であるか又はオーバーラップする結合部位を有することを考えると、これらの結果は予測される。クラス１抗体は、１３４Ｄ２抗体とも競合的であるか又は部分的に競合的であった（ＩｇＧ１対照に対して３０～５９％の染色をもって図１２に示されるように）。１３４Ｄ２は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用にブロッキング性ではあるが、主にＭ１５突然変異とオーバーラップするがＭ１７突然変異とも程度は低いがオーバーラップするエピトープに結合する。クラス１抗体は、１３５Ｃ１２抗体とは非競合的であることが見いだされ（ＩｇＧ１対照に対して≧６０％のＰＤ－１陽性細胞の染色（標識抗体の結合）をもって図１２に示されるように）、これらの抗体がＰＤ－１上の別個の部位に結合することを示すエピトープ結合試験を裏付けた。
競合相手としてクラス２抗体を用いると、ＭＫ３４７５及び１３７Ｆ２の標識抗体は両方とも、ＩｇＧ１対照と比較して結合のわずかな減少で又は全く減少しないで結合する。１つの例外は、標識１３７Ｆ２のＰＤ－１結合をブロックした１３５Ｄ１抗体である。１３５Ｄ１のエピトープがＭ４突然変異の近くであることを考えると、Ｍ２３突然変異領域における１３７Ｆ２抗体結合に多少の立体障害がありそうに思われる。１３５Ｃ１２及び１３９Ｄ６クローンは、Ｍ４突然変異をコードするＰＤ－１への結合においてシフトを有するが、それらは１３７Ｆ２の結合と競合しないことを考えると、これらのクラス２抗体の結合はＰ２パッチ領域のより中心にある。１３５Ｃ１２抗体はまた、全てがＰ２パッチの縁に見られるＭ１７、Ｍ１８、Ｍ２６、Ｍ２８、及びＭ３１突然変異において小さなシフトを有していた。競合相手として用いた全てのクラス２抗体は、標識１３５Ｃ１２の結合をブロックし、それらがＰＤ－１上のオーバーラップするエピトープに結合していることを確認した。ほとんどのクラス２競合抗体はＰＤ－１への結合に関して標識１３４Ｄ２と競合しない。１３６Ｂ４抗体は、１３４Ｄ２の結合をブロックする、クラス２抗体の例外である。これらの結果は、ＰＤ－１への１３４Ｄ２の結合が、Ｍ１７突然変異によって部分的に妨害されるが、主にＭ１３及びＭ１５突然変異によって妨害される実施例３におけるエピトープ結合試験と一致する。１３６Ｂ４抗体の結合は、Ｐ２パッチの縁又はＰ２パッチ内にあるＭ１７及びＭ１８突然変異によってのみ妨害される。
クラス３抗体は、ＭＫ３４７５及び１３７Ｆ２と競合的又は部分的に競合的であり（図１２に示されるように、ＩｇＧ１対照に対して３０～５９％の染色として規定される）、かつ１３５Ｃ１２とは非競合的にＰＤ－１に結合する。１３５Ｅ１０クラス３抗体は標識１３４Ｄ２と競合的であるが、１４０Ａ１クラス３抗体は標識１３４Ｄ２と非競合的である。エピトープマッピングは、１４０Ａ１が、１３４Ｄ２の結合エピトープ（主にＭ１５で軽度にＭ１７）とは異なるＭ１３突然変異の領域で結合することを示す。
クラス４抗体に関する機能的データの評価において、１３４Ｄ２及び１３６Ｂ５のみが、機能的疲弊回復アッセイにおいてＨＩＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖の増加につながる有意なアンタゴニスト活性を有する（図１２に示されるように＞１５０％の高められた増殖）。これらの抗体も、生化学的アッセイにおいてＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用をブロックし、従って、おそらくＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断を介してアンタゴニストとして機能する。過剰な１３６Ｂ５は、標識１３４Ｄ２でのＰＤ－１＋細胞の染色をブロックするため、これらの抗体は類似の又はオーバーラップするエピトープでＰＤ－１に結合する（図１２）。残りのクラス４抗体を用いた競合結合データは、それら抗体がＰＤ－１上の多様な部位に結合すること、及びこの結合が全般的に１３５Ｃ１２抗体とオーバーラップしないことを示す。１２２Ｆ１０抗体は、１３６Ｂ４と類似の又はオーバーラップするエピトープに結合する例外である。なぜなら、これら２つの抗体は抗体競合試験で類似の結合プロファイルを有し（図１２）、その両方がＭ１７突然変異ＰＤ－１構築物への低減された結合を有する（表１１）。
ＰＤ－１の溶媒露出残基でのアミノ酸置換により実施したエピトープマッピング試験（実施例３）及び抗体競合試験（図１２）からの情報を組み合わせて、様々な抗ＰＤ－１抗体クローンが結合するＰＤ－１上の領域の一貫性のある構造マップを図１３ａ及び１３ｂに示す。これらの結合エピトープは、表１１において、ほとんどのクローンに関して異なる色の円形のパッチで示されている。図１３ａは、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ２相互作用に関連する残基の大部分を有するＰＤ－１の面を示す。例外は、フレキシブルループ領域において、図１３ａの左側に見られる残基８９及び９０である。クローン１３７Ｆ２、１３９Ｆ１１、１４０Ａ１、１４０Ｇ５及びＭＫ３４７５などの、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用と競合的である最初の抗体セットは全て、ＰＤ－１のこの面に結合する。機能的アッセイで最も高いアンタゴニスト活性を有すると同定された２つの抗体（表１１）は両方とも、図１１ａ及び１３ａに示され、ＰＤ－１の残基１２４～１２６に集中する、Ｐ１パッチの中心に結合することに注目されたい。この発見は、１３７Ｆ２と１３９Ｆ１１が、顕著に異なる重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列を有し、かつ本明細書で検討されている抗体クローン全ての配列の整列に基づき別個のファミリーに属するという事実により固められる。抗体クローン１３４Ｄ２と１３６Ｂ５は、生化学的アッセイにおいてＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用と競合的であることが示されたが、それらは、Ｍ１３、Ｍ１５及びＭ１７突然変異とオーバーラップする、図１３ｂに示すＰＤ－１の領域に結合する。このマッピングされたエピトープに基づくと、これらの抗体は、残基８９及び９０を含むＰＤ－１上のループ領域の一部であるＰＤ－１の残基８５及び８６の近くに結合する。残基８９及び９０は、ＰＤ－Ｌ１との相互作用に関連する（図２ａ）ため、このループ領域への結合は、ＰＤ－Ｌ１への結合を阻害するＰＤ－１における構造的変化を誘導しうる。これらの結果と一致して、抗体競合試験は、競合クラス１抗体の添加が、標識１３４Ｄ２抗体の結合を顕著に低減させることを示す（図１２）。
表３に列挙するＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用に非ブロッキング性である抗体は全て、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用に関連する残基から離れたエピトープに結合する。強い機能活性（機能的回復アッセイにおいて＞１５０％に高められたＣＤ８ Ｔ細胞増殖、図１２）を有する抗体は全て、図１３ｂに示されているＰ２パッチとオーバーラップするエピトープにおいて結合する。１３５Ｃ１２（全ての試験突然変異体）、１３９Ｄ６（選択された試験突然変異体）、及び１３５Ｄ１（選択された試験突然変異体）抗体クローンは、関連する重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列を有し、かつＭ４、Ｍ１８及びＭ３１突然変異とオーバーラップする部位に結合する。１３６Ｂ４抗体クローンは、別個のＣＤＲ配列を有し、Ｍ１７及びＭ１８突然変異ＰＤ－１を用いた際に結合親和性に大きなシフトが見られ、それがＰ２パッチの縁にある別個のエピトープに結合することを示す。１３５Ｃ１２抗体は、１３６Ｂ４クローと競合的に結合するが、１３４Ｄ２又は１３６Ｅ１０クローンのいずれとも競合しない。これらの抗体競合結合試験は、Ｐ２パッチとオーバーラップするエピトープへの１３５Ｃ１２、１３９Ｄ６１３５Ｃ１、及び１３６Ｂ４の結合をさらに支持する。１３６Ｅ１０抗体の結合エピトープは、この抗体のＰＤ－１への結合を完全に失効させるＭ１突然変異に限定される。
実施例６
抗体薬物コンジュゲートによる標的細胞殺滅
この中で検討するように、抗体などの結合剤（例えば表３）を、ＰＤ－１発現細胞の標的殺滅（targeted killing）を実施するために毒素とコンジュゲートさせてよい。この戦略の治療的利益の例として、大部分がＰＤ－１陽性であるＨＩＶ感染ＣＤ４＋Ｔ細胞の標的排除が挙げられる。これらの試験を実施するために、２つの異なる抗ＰＤ－１抗体（１４０Ｇ５及び１３６Ｂ５）を、抗体のジスルフィド結合の部分的還元後の利用可能なシステイン基を介してＰＥＧ４－ｖｃ－ＰＡＢ－ＰＮＵ－１５９６８２（以下、ＰＮＵと称する）と化学的にコンジュゲートさせた。抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を、疎水性相互作用クロマトグラフィ及びサイズ排除クロマトグラフィによりプロファイルし、両方のサンプルが＞９５％のＰＮＵコンジュゲート抗体を含むことが分かった。ＡＤＣ殺滅アッセイにおいて、ＨＩＶ－１ウイルスに慢性感染した患者のＰＢＭＣからＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。そのＣＤ４＋Ｔ細胞を、アイソタイプ対照抗体、１４０Ｇ５ ｍＡｂ、１４０Ｇ５－ＰＮＵ ｍＡｂコンジュゲート、１３６Ｂ５ ｍＡｂ、又は１３６Ｂ５－ＰＮＵ ｍＡｂコンジュゲートと共にインキュベートした。抗体濃度は全て１０μｇ／ｍｌであり、細胞は、５％ＣＯ２の細胞培養インキュベータ中、３７℃で５日間インキュベートした。５日目に、細胞生存性のためのＡｑｕａ染色及びアポトーシスを受けている細胞を同定するためのＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ染色に加えて、ＣＤ４及びＰＤ－１の細胞表面レベルをモニターするために、抗体を用いてフローサイトメトリー解析用に細胞を染色した。図１４に示すように、様々な抗体又はＡＤＣで処理した全てのサンプルが、ＰＤ－１の低～中レベルの発現を有するＣＤ４＋Ｔ細胞において、同等のＡｑｕａ陽性（図１４ａ）又はＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性（図１４ｂ）レベルを有する。しかしながら、高レベルのＰＤ－１を有する細胞集団では、抗ＰＤ－１ ＡＤＣ（図１４ａ及び１４ｂにおける１４０Ｇ５－ＰＮＵ及び１３６Ｂ５－ＰＮＵ）で処理したサンプルにおいて、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性細胞及びＡｑｕａ陽性細胞の量の有意な増加がある。
抗ＰＤ－１ ＡＤＣの潜在的な治療的利益のさらなる証拠を提供するために、様々な抗体又はＡＤＣ（アイソタイプ対照抗体、１４０Ｇ５ ｍＡｂ、１４０Ｇ５－ＰＮＵ ｍＡｂコンジュゲート、１３６Ｂ５ ｍＡｂ、又は１３６Ｂ５－ＰＮＵ ｍＡｂコンジュゲート）で５日間処理したＣＤ４＋Ｔ細胞を、定量的ウイルスアウトグロースアッセイを用いてＨＩＶ感染細胞の頻度に関して評価した。このアッセイにおいて、抗体又はＡＤＣで処理したＨＩＶ感染患者由来の細胞を、未刺激のままにするか、又は抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体で刺激し、その後、同種のＣＤ８－枯渇ＰＢＭＣの存在下において、様々な希釈率で培養した。各サンプルからの様々な希釈率のＣＤ４＋Ｔ細胞を用いて試験することにより、抗体又はＡＤＣでの５日間の処理の後に、複製可能なウイルスを含む細胞の頻度を評価することができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞及び同種ＣＤ８－枯渇ＰＢＭＣの１４日間のインキュベートの後、複製可能なウイルスを含む細胞の頻度を特定するために、ｐ２４ ＥＬＩＳＡにおいて、及びＨＩＶ ＲＮＡの存在に関して試験した。図１４に示すＰＤ－１高細胞の特異的枯渇に従い、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性又はＡｑｕａ陽性であるＰＤ－１高細胞の割合（％）の増加が認められ、それぞれアポトーシス及び細胞死を受けている細胞の増加を示す（図１５ａ及び１５ｂ）。図１６に示すウイルスアウトグロースアッセイにおいて、５日間、ＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体、抗ＰＤ－１抗体（１３６Ｂ５又は１４０Ｇ５）で処理された、或いは処理しないままに置かれた、ＨＩＶ感染ドナー由来のＣＤ４＋Ｔ細胞のサンプルは全て、同様の複製可能なウイルスを含む細胞の頻度を有する（１６～２８のＨＩＶ－１ ＲＮＡ陽性細胞／ｍｌ（ＲＵＰＭ））。しかしながら、抗ＰＤ－１ ＡＤＣ（１４０Ｇ５－ＰＮＵ ｍＡｂコンジュゲート、１３６Ｂ５ ｍＡｂ、又は１３６Ｂ５－ＰＮＵ ｍＡｂコンジュゲート）で処理したサンプルでは、感染性ウイルスを産生できる細胞の４～５倍の減少に一致する感染細胞の頻度の顕著な減少がある。これらの結果は、５日間の抗ＰＤ－１ ＡＤＣ処理に関連するＲＵＰＭの１０倍までの減少をもって、いくつかの別の実験で再現されている。従って、これらの試験は、抗ＰＤ－１ ＡＤＣが、ＨＩＶ－１陽性患者から感染細胞を枯渇させるための有効な治療法となりうるという考えのｉｎ ｖｉｔｒｏでの原理証明を提供する。
実施例７
マウス抗ＰＤ－１抗体のヒト化
マウス抗体のものに最も類似する重鎖及び軽鎖フレームワークをみつけるために、選択抗ＰＤ－１クローンのマウスＩｇＧ１抗体配列を、ヒト免疫グロブリン生殖細胞系Ｖ遺伝子データベースに対して比較した。これらのフレームワーク配列を用いて、コンビナトリアルライブラリーを設計し、それを用いて、ヒト化すべき抗体の重鎖及び軽鎖ＣＤＲループを組み込んだファージディスプレイライブラリーを構築した。次に、ファージライブラリーを、Ｆｃ融合構築物において、組換えヒトＰＤ－１に対するパンニング実験で用いた。ファージＥＬＩＳＡを用いて、組換えＰＤ－１に結合するヒト化抗ＰＤ－１アウトプットファージを評価した。陽性クローンからのＦａｂ断片ＤＮＡを、ＦＡＳＥＢＡ（ｆａｓｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ－ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ）ライブラリーに導入し、Ｆａｂタンパク質断片の生成に用いた。これらのＦａｂ断片を、発現レベル、タンパク質の安定性／生物物理学的特性、及びＢｉａｃｏｒｅ試験によって特定されるような組換えヒトＦｃ－ＰＤ－１タンパク質に対する親和性に関して評価した。表３の１３７Ｆ２及び１３５Ｃ１２マウス抗体クローンをこのやり方でヒト化し、所望の発現、安定性及び親和性特性を有するクローンに関して得られたＶＨ及びＶＬ配列を以下に示す。ヒト及びサルＦｃ－ＰＤ－１タンパク質に対する１３７Ｆ２及び１３５Ｃ１２ヒト化ＦａｂクローンのＢｉａｃｏｒｅ親和性測定の結果を表１２及び１３にそれぞれ示す。これらの例示的なヒト化抗体の可変領域アミノ酸配列（指示されているように重鎖及び軽鎖）を以下に示す。
Ａ．ヒト化１３７Ｆ２重鎖配列
１．マウスＶＨ参照配列
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＲＰＧＴＳＶＫＭＳＣＫＡＡＧＹＴＦＴＮＹＷＩＧＷＩＫＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＤＩＹＰＧＧＧＹＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＴＳＳＳＴＡＹＭＱＶＳＳＬＴＳＥＤＴＧＩＹＹＣＡＲＧＹＤＦＶＬＤＲＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号２７７）

２．Ａ３５７９０－ＶＨ
ＱＭＱＬＶＱＳＧＰＥＶＫＫＰＧＴＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＦＴＦＴＮＹＷＩＧＷＶＲＱＡＰＧＱＡＬＥＷＭＧＤＩＹＰＧＧＧＹＴＮＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＤＦＶＬＤＲＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１３９）

３．Ａ３５７９６－ＶＨ
ＱＭＱＬＶＱＳＧＰＥＶＫＫＰＧＴＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＦＴＦＴＮＹＷＩＧＷＶＲＱＡＰＧＱＡＬＥＷＭＧＤＩＹＰＧＧＧＹＴＮＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＤＦＶＬＤＲＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１４０）

４．Ａ３５７９３－ＶＨ
ＱＭＱＬＶＱＳＧＰＥＶＫＫＰＧＴＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＦＴＦＴＮＹＷＩＧＷＶＲＱＡＰＧＱＡＬＥＷＭＧＤＩＹＰＧＧＧＹＴＮＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＤＦＶＬＤＲＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１４１）

５．Ａ３５８１８－ＶＨ
ＱＭＱＬＶＱＳＧＰＥＶＫＫＰＧＴＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＦＴＦＴＮＹＷＩＧＷＶＲＱＡＰＧＱＡＬＥＷＭＧＤＩＹＰＧＧＧＹＴＮＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＤＦＶＬＤＲＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１４２）

６．Ａ３５７９５－ＶＨ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＷＩＧＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＤＩＹＰＧＧＧＹＴＮＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＤＦＶＬＤＲＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１４３）

７．Ａ３５７９７－ＶＨ
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＨＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＮＹＷＩＧＷＶＲＱＡＴＧＱＧＬＥＷＭＧＤＩＹＰＧＧＧＹＴＮＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＤＦＶＬＤＲＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１４４）

８．Ａ３５７９９－ＶＨ
ＱＭＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＴＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＷＩＧＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＤＩＹＰＧＧＧＹＴＮＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＤＦＶＬＤＲＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１４５）

９．Ａ３５８０５－ＶＨ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＷＩＧＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＤＩＹＰＧＧＧＹＴＮＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＤＦＶＬＤＲＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１４６）

１０．１３７Ｆ ＶＨ１
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＷＩＧＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＤＩＹＰＧＧＧＹＴＮＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＤＦＶＬＤＲＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１４７）

１１．１３７Ｆ ＶＨ２
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＡＧＹＴＦＴＮＹＷＩＧＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＤＩＹＰＧＧＧＹＴＮＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＭＴＡＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＤＦＶＬＤＲＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１４８）

１２．１３７Ｆ ＶＨ１ｂ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＷＩＧＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＤＩＹＰＧＧＧＹＴＮＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＭＴＡＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＤＦＶＬＤＲＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１４９）

１３．１３７Ｆ ＶＨ１ｃ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＷＩＧＷＩＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＤＩＹＰＧＧＧＹＴＮＹＮＥＫＦＫＧＲＡＴＬＴＡＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＶＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＤＦＶＬＤＲＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１５０）

Ｂ．ヒト化１３７Ｆ２軽鎖配列
１．マウスＶＬ参照配列
ＤＩＶＭＳＱＳＰＳＳＬＡＶＳＴＧＥＫＶＴＭＴＣＫＳＳＱＳＬＦＮＳＥＴＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＦＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＬＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＶＹＹＣＫＱＳＹＴＬＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号２７８）

２．Ａ３５７９０－ＶＬ
ＤＶＶＭＴＱＳＰＡＦＬＳＶＴＰＧＥＫＶＴＩＴＣＫＳＳＱＳＬＦＮＳＥＴＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＫＱＳＹＴＬＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１５１）

３．Ａ３５７９６－ＶＬ
ＤＶＶＭＴＱＳＰＡＦＬＳＶＴＰＧＥＫＶＴＩＴＣＫＳＳＱＳＬＦＮＳＥＴＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＫＱＳＹＴＬＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１５２）

４．Ａ３５７９３－ＶＬ
ＤＶＶＭＴＱＳＰＡＦＬＳＶＴＰＧＥＫＶＴＩＴＣＫＳＳＱＳＬＦＮＳＥＴＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＫＱＳＹＴＬＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１５３）

５．Ａ３５８１８－ＶＬ
ＤＶＶＭＴＱＳＰＡＦＬＳＶＴＰＧＥＫＶＴＩＴＣＫＳＳＱＳＬＦＮＳＥＴＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＫＱＳＹＴＬＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１５４）

６．Ａ３５７９５－ＶＬ
ＤＶＶＭＴＱＳＰＡＦＬＳＶＴＰＧＥＫＶＴＩＴＣＫＳＳＱＳＬＦＮＳＥＴＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＫＱＳＹＴＬＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１５５）

７．Ａ３５７９７－ＶＬ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＳＳＱＳＬＦＮＳＥＴＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＫＱＳＹＴＬＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１５６）

８．Ａ３５７９９－ＶＬ
ＤＶＶＭＴＱＳＰＡＦＬＳＶＴＰＧＥＫＶＴＩＴＣＫＳＳＱＳＬＦＮＳＥＴＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＫＱＳＹＴＬＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１５７）

９．Ａ３５８０５－ＶＬ
ＤＶＶＭＴＱＳＰＡＦＬＳＶＴＰＧＥＫＶＴＩＴＣＫＳＳＱＳＬＦＮＳＥＴＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＫＱＳＹＴＬＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１５８）

１０．１３７Ｆ ＶＬ１
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＦＮＳＥＴＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＳＹＴＬＲＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１５９）

１１．１３７Ｆ ＶＬ２
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＴＣＫＳＳＱＳＬＦＮＳＥＴＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＦＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＬＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＳＹＴＬＲＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１６０）

１２．１３７Ｆ ＶＬ１ｂ
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＦＮＳＥＴＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＳＹＴＬＲＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１６１）

１３．１３７Ｆ ＶＬ１ｃ
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＴＣＫＳＳＱＳＬＦＮＳＥＴＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＦＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＳＹＴＬＲＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１６２）

１４．１３７Ｆ ＶＬ１ｄ
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＭＴＣＫＳＳＱＳＬＦＮＳＥＴＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＦＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＳＹＴＬＲＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１６３）

Ｃ．ヒト化１３５Ｃ１２重鎖配列
１．マウスＶＨ参照配列
ＥＶＱＬＨＱＳＧＰＥＬＬＫＰＧＡＳＶＲＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＦＹＩＨＷＶＫＱＳＨＧＫＳＩＥＷＩＧＳＩＹＰＮＹＧＤＴＡＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＡＬＲＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＹＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号２７９）

２．Ａ３５７７５－ＶＨ
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＮＦＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＳＩＹＰＮＹＧＤＴＡＹＮＱＫＦＫＤＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１６４）

３．Ａ３５７８３－ＶＨ
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＮＦＹＩＨＷＶＲＱＡＲＧＱＲＬＥＷＩＧＳＩＹＰＮＹＧＤＴＡＹＮＱＫＦＫＤＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１６５）

４．Ａ３５７７４－ＶＨ
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＮＦＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＳＩＹＰＮＹＧＤＴＡＹＮＱＫＦＫＤＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１６６）

５．Ａ３６４４３－ＶＨ
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＴＶＫＩＳＣＫＶＳＧＹＴＦＴＮＦＹＩＨＷＶＲＱＡＲＧＱＲＬＥＷＩＧＳＩＹＰＮＹＧＤＴＡＹＮＱＫＦＫＤＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１６７）

６．Ａ３５７７７－ＶＨ
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＴＶＫＩＳＣＫＶＳＧＹＴＦＴＮＦＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＳＩＹＰＮＹＧＤＴＡＹＮＱＫＦＫＤＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１６８）

７．Ａ３５７８９－ＶＨ
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＮＦＹＩＨＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＳＩＹＰＮＹＧＤＴＡＹＮＱＫＦＫＤＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１６９）

８．Ａ３６４４８－ＶＨ
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＮＦＹＩＨＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＳＩＹＰＮＹＧＤＴＡＹＮＱＫＦＫＤＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１７０）

９．Ａ３６４３７－ＶＨ
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＮＦＹＩＨＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＳＩＹＰＮＹＧＤＴＡＹＮＱＫＦＫＤＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１７１）

１０．１３５Ｃ ＶＨ１
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＦＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＳＩＹＰＮＹＧＤＴＡＹＮＱＫＦＫＤＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１７２）

１１．１３５Ｃ ＶＨ２
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＦＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＳＩＹＰＮＹＧＤＴＡＹＮＱＫＦＫＤＲＶＴＭＴＶＤＫＳＴＳＴＶＹＭＥＬＲＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１７３）

１２．１３５Ｃ ＶＨ３
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＦＹＩＨＷＶＫＱＡＨＧＱＧＬＥＷＭＧＳＩＹＰＮＹＧＤＴＡＹＮＱＫＦＫＤＲＶＴＭＴＶＤＫＳＴＳＴＶＹＭＥＬＲＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１７４）

１３．１３５Ｃ ＶＨ１ｂ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＦＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＳＩＹＰＮＹＧＤＴＡＹＮＱＫＦＫＤＲＶＴＭＴＶＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１７５）

１４．１３５Ｃ ＶＨ１ｃ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＦＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＳＩＹＰＮＹＧＤＴＡＹＮＱＫＦＫＤＲＡＴＬＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１７６）

１５．１３５Ｃ ＶＨ１ｄ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＦＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＳＩＹＰＮＹＧＤＴＡＹＮＱＫＦＫＤＲＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１７７）

Ｄ．ヒト化１３５Ｃ１２軽鎖配列
１．マウスＶＬ参照配列
ＮＩＶＭＴＱＳＰＫＳＭＳＭＳＶＧＥＲＶＴＬＴＣＫＡＳＥＮＶＶＴＹＶＳＷＹＱＱＫＰＥＱＳＰＫＬＬＩＹＧＡＳＮＲＹＴＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＡＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＤＹＨＣＧＱＧＹＳＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号２８０）

２．Ａ３５７７５－ＶＬ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＧＩＳＧＤＬＮＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＨＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＹＹＳＫＤＬＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１７８）

３．Ａ３５７８３－ＶＬ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＧＩＳＧＤＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＴＰＫＬＬＩＹＨＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＹＹＳＫＤＬＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１７９）

４．３５７７４－ＶＬ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＧＩＳＧＤＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＨＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＹＹＳＫＤＬＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１８０）

５．Ａ３６４４３－ＶＬ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＧＩＳＧＤＬＮＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＨＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＹＹＳＫＤＬＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１８１）

６．Ａ３５７７７－ＶＬ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＧＩＳＧＤＬＮＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＨＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＹＹＳＫＤＬＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１８２）

７．Ａ３５７８９－ＶＬ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＧＩＳＧＤＬＮＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＨＴＳＳＬＨＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＹＹＳＫＤＬＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１８３）

８．Ａ３６４４８－ＶＬ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＧＩＳＧＤＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＴＰＫＬＬＩＹＨＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＹＹＳＫＤＬＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１８４）

９．Ａ３６４３７－ＶＬ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＧＩＳＧＤＬＮＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＨＴＳＳＬＨＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＹＹＳＫＤＬＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１８５）

１０．１３５Ｃ ＶＬ１
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＧＩＳＧＤＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＨＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＹＹＳＫＤＬＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１８６）

１１．１３５Ｃ ＶＬ２
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＧＩＳＧＤＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＶＫＬＬＩＹＨＴＳＳＬＨＳＧＶＰＬＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＹＹＳＫＤＬＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１８７）

１２．１３５Ｃ ＶＬ３
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＧＩＳＧＤＬＮＷＹＱＱＫＳＤＧＡＶＫＬＬＩＹＨＴＳＳＬＨＳＧＶＰＬＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＹＹＳＫＤＬＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１８８）

１３．１３５Ｃ ＶＬ１ｂ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＧＩＳＧＤＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＨＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＹＹＳＫＤＬＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１８９）

１４．１３５Ｃ ＶＬ１ｃ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＧＩＳＧＤＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＶＫＬＬＩＹＨＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＹＹＳＫＤＬＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＬＫ（配列番号１９０）。

指示されているヒト化抗体のＢｉａｃｏｒｅ結合親和性測定の結果を下記の表１２及び１３に示す。
Figure 0007089474000019
Figure 0007089474000020
実施例８
抗ＰＤ１抗体及びその組合せを用いたＴ細胞の刺激
ＨＩＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖をもたらす、慢性感染ＨＩＶドナー由来のＰＢＭＣの抗原特異的刺激の結果を図１７～１９に示す。ウイルス血症ドナーにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞の疲弊状態により、抗ＰＤ－１抗体の添加は、ほぼ２００％まで抗原特異的増殖を高める（ｐ値＜０．０００１）。
マウスブロッキング抗ＰＤ－１抗体１３７Ｆ２及びマウス非ブロッキング抗ＰＤ－１抗体１３５Ｃ１２由来のＣＤＲをコードするヒト化抗ＰＤ－１抗体を、ＣＦＳＥ機能的疲弊アッセイにおいて、抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞における機能的疲弊を救済するそれらの能力に関して評価した。ヒト抗体フレームワーク領域中に変形物を有する、１３７Ｆ２及び１３５Ｃ１２クローンのいくつかのヒト化抗体を複数のアッセイで試験し、全てが、ＭＫ３４７５、並びに１３７Ｆ２及び１３５Ｃ１２のマウス／ヒトキメラ抗体（マウス由来のＶＬ及びＶＨ部分、及びＩｇＧ４のヒト定常領域）と比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を促進することに関して同様の活性を示した。ウイルス血症ドナーにおけるＣＤ８ Ｔ細胞の疲弊状態により、抗ＰＤ－１抗体の添加は、ほぼ２００％まで抗原特異的増殖を高める（ｐ値＜０．０００１）（図１７）。マウスブロッキング抗ＰＤ－１抗体（すなわち、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用をブロックする）１３７Ｆ２由来のＣＤＲをコードするヒト化抗ＰＤ－１抗体（すなわち、ヒト化抗体Ａ３５７９５（配列番号１４３及び１５５を含む）、Ａ３５７９６（配列番号１４０及び１５２を含む）及びＡ３５７９７（配列番号１４４及び１５６を含む）、並びにマウス－ヒトキメラ１３７Ｆ２（配列番号８、３１、５４、７７、１００、及び１２３を含む））、並びにマウス非ブロッキング抗ＰＤ－１抗体１３５Ｃ１２由来のＣＤＲをコードするヒト化抗ＰＤ－１抗体（すなわち、ヒト化抗体Ａ３５７７４（配列番号１６６及び１８０を含む）、Ａ３５７８３（配列番号１６５及び１７９を含む）、Ａ３５７８９（配列番号１６９及び１８３を含む）、Ａ３６４４３（配列番号１６７及び１８１を含む）、１３５Ｃ Ｈ２Ｌ２（配列番号１７３及び１８７を含む）、１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｃ（配列番号１７６及び１９０を含む）、１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｂ（配列番号１７６及び１８９を含む）、並びにマウス－ヒトキメラ１３５Ｃ１２（配列番号１７、４０、６３、８６、１０９及び１３２を含む））を、ＣＦＳＥ機能的疲弊アッセイにおいて抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞における機能的疲弊を救済するそれらの能力に関して評価した。ヒト抗体フレームワーク領域中に変形物を有する、１３７Ｆ２（ブロッキング）及び１３５Ｃ１２（非ブロッキング）クローンのいくつかのヒト化抗体を複数のアッセイで試験した。全てが、ＭＫ３４７５、並びに１３７Ｆ２及び１３５Ｃ１２のマウス／ヒトキメラ抗体と比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を促進することに関して同様の活性を示した。
図１８は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用をブロックする抗体（ＭＫ３４７５又はＡ３５７９５）と非ブロッキング抗ＰＤ－１抗体（Ａ３５７７４）との組合せの結果が、いずれかの抗体単独と比較して、統計的に有意な（ｐ値＜０．０００１）増殖の増加をもたらしたことを示す。図１８に示すデータは、ＭＫ３４７５とＡ３５７７４との組合せに関して３回の実験の平均、Ａ３５７９５とＡ３５７７４との組み合わせに関しては４回の実験の平均である。
図１９は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用をブロックする抗体（ＭＫ３４７５）と、非ブロッキング抗ＰＤ－１抗体（１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｃ（配列番号１７６及び１９０を含む）又は１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｂ（配列番号１７６及び１８９を含む））との他の組合せの効果を示す。この中に示すように、ブロッキング抗体ＭＫ３４７５と非ブロッキング抗ＰＤ－１抗体（１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｃ又は１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｂ）との組合せは、いずれかの抗体単独と比較して、増殖の統計的に有意な増加（示されているように、ｐ値＝０．０１８又はｐ値＜０．０００１）をもたらす。図１９に示すデータは、各組合せに関して２回の実験の平均である。
実施例９
ブロッキング抗ＰＤ－１抗体と非ブロッキング抗ＰＤ－１抗体との組合せ処理でのＪｕｒｋａｔＰＤ－１レポーター細胞の活性化
これらの実験では、ＪｕｒｋａｔＰＤ－１ＮＦＡＴレポーター細胞株を、ＴＣＲアクチベータ及びＰＤ－Ｌ１タンパク質を共発現する一過性トランスフェクト２９３Ｔ細胞株で刺激した。抗ＰＤ－１抗体の非存在下では、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用がＪｕｒｋａｔ細胞の刺激を抑制し、ＮＦＡＴの活性化の低減及びより低いレベルのルシフェラーゼ産生をもたらす。ブロッキング抗ＰＤ－１抗体（例えば、ＭＫ３４７５）の添加により、増強されたＮＦＡＴ活性化、より多くのルシフェラーゼ産生、及びルシフェラーゼ基質の添加により生成される化学発光の量の増加をもたらした。大過剰のＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１を用いるこれらの極端なアッセイ条件下において、非ブロッキング抗ＰＤ－１抗体（図２０ＡにおけるＡ３５７７４及び図２０Ｂにおける１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｃにより代表される）は、ブロッキング抗ＰＤ－１抗体と比較して低減された活性を有する。しかしながら、ブロッキング抗ＰＤ－１抗体と非ブロッキング抗ＰＤ－１抗体との組合せは、Ｔ細胞活性化を、ＭＫ３４７５単独で達成されるよりも高いレベルにさらに高める。ブロッキング抗ＰＤ－１抗体及び非ブロッキング抗ＰＤ－１抗体を用いたこのＮＦＡＴ活性化の増強は、各試験抗体の低濃度及び高濃度の両方で見られる。示されたデータは、ブロッキング抗体ＭＫ３４７５＋非ブロッキングＡ３５７７４（図２０Ａ）又はブロッキング抗体ＭＫ３４７５＋非ブロッキング抗体１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｃ（図２０Ｂ）のいずれかの組合せに関して示された、ＮＦＡＴ活性化の統計的に有意な増加を有する３回の繰返し実験の平均である。
実施例１０
抗ＰＤ－１抗体処理での細胞表面ＰＤ－１のインターナリゼーション
ＰＤ－１の高い基底レベルを有するメモリーＴ細胞を持つ慢性感染ＨＩＶドナー由来のＰＢＭＣを、ブロッキング抗ＰＤ－１抗体、非ブロッキング抗ＰＤ－１抗体、又はブロッキング抗ＰＤ－１抗体と非ブロッキング抗ＰＤ－１抗体との組合せのいずれかと共にインキュベートして、ＰＤ－１インターナリゼーションに対する効果を特定した（図２１）。４８時間～７２時間にわたり、フローサイトメトリーによりメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞（図２１ａ、ｃ、及びｅ）並びにＣＤ８＋Ｔ細胞（図２１ｂ、ｄ、及びｆ）においてＰＤ－１の細胞表面レベルをモニターして、抗ＰＤ－１抗体が細胞表面ＰＤ－１インターナリゼーションを誘導するか否かを特定した。Ａ３５７９５（配列番号１４３及び１５５を含む）及びＡ３５７７４（配列番号１６６及び１８０を含む）（図２１ａ、ｂ）；ＭＫ３４７５及びＡ３５７７４（配列番号１６６及び１８０を含む）（図２１ｃ、ｄ）；並びに、Ａ３５７９５（配列番号１４３及び１５５を含む）及び１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｃ（配列番号１７６及び１９０を含む）（図２１、ｅ、ｆ）の抗体の組合せを用いた３つの別個の実験を示す。全ての場合に、ブロッキング抗ＰＤ－１抗体（Ａ３５７９５又はＭＫ３４７５により代表される）と、非ブロッキング抗ＰＤ－１抗体（Ａ３５７７４（配列番号１６６及び１８０を含む）又は１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｃ（配列番号１７６及び１９０）を含む）との組合せは、ＰＤ－１受容体のより迅速及び／又はより著しいインターナリゼーションを誘導することが観察された。各実験において、ＰＢＭＣを、ヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体と共にインキュベートし、それは細胞培養インキュベーションを通してＰＤ－１の高いレベルを維持した未処理Ｔ細胞用の参照としての役割を果たした。ＰＤ－１の細胞表面発現の低減は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を介したＴ細胞の負の調節を制限できるため、メカニズム的に、ＰＤ－１のインターナリゼーションは、抗ＰＤ－１抗体（ブロッキング及び非ブロッキング抗体の単独又は組合せのいずれか）のアンタゴニスト機能活性に寄与しうる。
実施例１１
抗ＰＤ－１抗体処理後のＩＦＮ－γ産生
ＰＤ－１の高い基底レベルを有するメモリーＴ細胞を持つ慢性感染ＨＩＶドナー由来のＰＢＭＣを、ブロッキング抗ＰＤ－１抗体、非ブロッキング抗ＰＤ－１抗体、又はブロッキング抗ＰＤ－１抗体と非ブロッキング抗ＰＤ－１抗体との組合せのいずれかと共にインキュベートした。次に、ＰＢＭＣ／抗体混合物を、抗ＣＤ３ ＴＣＲアクチベータを発現する又は抗ＣＤ３ ＴＣＲアクチベータ及びＰＤ－Ｌ１を共発現するように一過性トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の上に積層した。ＰＤ－Ｌ１の存在下又は非存在下におけるＴＣＲアクチベータ発現細胞での２４時間の刺激の後、上清を採取し、ＥＬＩＳＡでＩＦＮ－γ産生を分析した。抗ＣＤ３ ＴＣＲアクチベータ発現細胞で刺激した場合、抗体処理サンプルの全てにおいて同様のレベルのＩＦＮ－γが検出された（図２２Ａ）。対照的に、抗ＣＤ３ ＴＣＲアクチベータ及びＰＤ－Ｌ１を共発現する細胞で刺激した場合、ＩｇＧ４アイソタイプ対照で処理したサンプルではより低いレベルのＩＦＮ－γが検出され、抗ＰＤ－１抗体で処理したサンプルではＩＦＮ－γ産生が増強された。ブロッキング抗ＰＤ－１抗体（ＭＫ３４７５）及び非ブロッキング抗ＰＤ－１抗体（Ａ３５７７４）の両方で処理したサンプルにおいて最も高いレベルのサイトカイン産生が認められた（＊ｐ＜０．０５）。
別の実験において、ＰＤ－１の高い基底レベルを有するメモリーＴ細胞を持つ慢性感染ＨＩＶドナー由来のＰＢＭＣを、非ブロッキング抗ＰＤ－１抗体（Ａ３５７７４）、ブロッキング抗ＰＤ－１抗体（ＭＫ３４７５）、又はブロッキング抗ＰＤ－１抗体と非ブロッキング抗ＰＤ－１抗体との組合せ（ＭＫ３４７５及びＡ３５７７４）のいずれかと共にインキュベートした（図２２Ｂ）。次に、ＰＢＭＣ／抗体混合物を、抗ＣＤ３ ＴＣＲアクチベータ及びＰＤ－Ｌ１タンパク質を共発現するように一過性トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の上に積層した。ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（商標）タンパク輸送阻害剤を添加し、細胞を約１８時間インキュベートして、細胞内にサイトカインを蓄積させた。フローサイトメトリーにより、各抗体処理条件に関してＩＦＮ－γ産生細胞の割合（％）を評価した（図２２Ｂ）。ＩＦＮ－γの産生は、抗ＰＤ－１処理を受けたＰＤ－１陽性細胞で増加し、ブロッキング抗体（ＭＫ３４７５）と非ブロッキング（Ａ３５７７４）抗体との組合せは、サイトカイン産生の更なる増加をもたらした（ＰＤ－１＋ＣＤ８ Ｔ細胞についてデータを示す）。
実施例１２
結晶構造解析
組換え発現された精製ヒトＰＤ－１タンパク質（受容体エクトドメインの残基３３～１５０（「ｈＰＤ１」））を、ヒト化Ａ３５７７４抗体のＦａｂ断片と共にインキュベートし、複合体をサイズ排除クロマトグラフィにより精製した。ｈＰＤ－１／Ｆａｂ Ａ３５７７４（配列番号１６６及び１８０を含む）複合体に関してタンパク質結晶を作製し、Ｘ線結晶構造解析によりその構造を解明した。図２３Ａの共結晶構造は、ｈＰＤ－１と相互作用するＡ３５７７４（配列番号１６６及び１８０を含み、ＣＤＲは配列番号１７、４０、６３、８６、１０９、及び１３２により表される）の重鎖及び軽鎖ＣＤＲループを示す。そのデータは、Ａ３５７７４のためのＰＤ－１上の結合エピトープとして機能する主要な残基が、ＶＨ ＣＤＲループに関してＦ３７、Ｐ３９、Ａ４０、Ｌ４１、Ｖ４３、Ｌ１３８、Ｒ１３９及びＲ１４３、並びにＶＬ ＣＤＲループに関してＰ３４、Ｅ１３６、Ｓ１３７及びＲ１３９を含むことを示す。これらの構造試験は、実施例３及び５で説明したように、Ａ３５７７４と同じ重鎖及び軽鎖ＣＤＲを持つマウス１３５Ｃ１２抗体を用いて実施したエピトープマッピングと一致する。アミノ酸置換をコードするＰＤ－１を用いたそれらの抗体結合実験において、１３５Ｃ１２抗体と、ＰＤ－１突然変異体Ｍ４（置換Ｓ３６Ａ／Ｐ３７Ａ／Ｌ４１Ａを含む）、Ｍ２６（置換Ｒ１３９Ａ／Ｅ１４１Ａを有する）；及びＰＤ－１突然変異体Ｍ３１（置換Ｌ１４１Ａ／Ｖ１４３Ｌを有する）との間で結合のシフトが認められた。１３５Ｃ１２の結合親和性に小さなシフトをもたらした他のＰＤ－１突然変異（Ｍ１７、Ｍ１８及びＭ２８にある）は、ＰＤ－１上のＡ３５７７４ Ｆａｂの結合部位に極めて近接しており、これらのアミノ酸置換は、これら試験において抗体結合親和性を低減させたＰＤ－１の局所的構造変化を導入しうる。共結晶構造解析、エピトープマッピング、及び抗体競合結合試験は総合して、Ｐ２パッチ領域とオーバーラップする抗体結合が、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断を介して作用する抗体とは区別されるアンタゴニスト機能活性を持つことができることの確証を提供する。Ａ３５７７４により代表される抗体がＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用をブロックしないことの追加の証拠を図２３Ｂに提供する。図２３Ｂでは、我々のｈＰＤ－１／ＦａｂＡ３５７７４共結晶構造と、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１との共結晶構造４ＺＱＫとの間でモデルが作製された。このモデルは、ヒトＰＤ－１に対するＡ３５７７４Ｆａｂ及びＰＤ－Ｌ１タンパク質のオーバーラップしない結合を示す（図２３Ｂ）。
実施例１３
Ｉｎ ｖｉｖｏ有効性試験
キイトルーダ（ＭＫ３４７５）と比較して、非ブロッキング抗ＰＤ－１抗体１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｃ（配列番号１７６及び１９０を含む）の治療的有効性を評価するために、ＰＤ－１ ＨｕＧＥＭＭマウスにおいてｉｎ ｖｉｖｏ有効性試験を行い、それぞれ１０ｍｇ／ｋｇで隔週（bi-weekly）投与した（図２４）。追加の治療的処置は、１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｃ及びキイトルーダを各５ｍｇ／ｋｇで隔週共投与することを含む。ＨｕＧＥＭＭマウスは、受容体エクトドメインの大部分がヒトＰＤ－１タンパク質（ヒトＰＤ－１配列の残基２６～１４６）をコードするヒト／マウスキメラＰＤ－１タンパク質を発現するように遺伝子操作された。ｉｎ ｖｉｖｏ試験の前に、フローサイトメトリー試験により、１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｃ及びキイトルーダ抗ＰＤ－１抗体が、刺激されたＴ細胞の表面でＨｕＧＥＭＭヒト／マウスキメラＰＤ－１に特異的に結合したことを確認した。その試験のための調製において、腫瘍発生のために大腸腺がん由来のＭＣ３８細胞を多数のＰＤ－１ＨｕＧＥＭＭマウスに皮下接種した。腫瘍が約９５ｍｍ３±５０の体積に達したときに、合計４０匹のマウスを、８４ｍｍ３の平均腫瘍サイズを有する４つの群に無作為化し、試験０日目に投与（ビヒクル、１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｃ、キイトルーダ及び１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｃ＋キイトルーダ）を開始した。治療的抗ＰＤ－１抗体を隔週投与し、腫瘍サイズ及びマウスの体重を１週間に２回測定した。未処置ＰＢＳバッファービヒクル対照マウスと対比して腫瘍増殖阻害をモニターし、効果をキイトルーダと比較した。非ブロッキング抗ＰＤ－１抗体１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｃは、キイトルーダに匹敵するレベルで腫瘍増殖の低減を誘導した。１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｃとキイトルーダとの共投与も、１０ｍｇ／ｋｇでのキイトルーダ単独投与と少なくとも同程度の効果である細胞増殖の低減を誘導した。しかしながら、試験中の全ての処理後時点において、１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｃとキイトルーダとの組合せで処置されたマウスは、キイトルーダ陽性対照と比較して、応答の向上及びより小さな平均腫瘍体積の傾向を示した。重要なこととして、１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｃとキイトルーダとの組合せは、（統計解析のためにペアワイズウィルコクソン検定を用いて）試験の４日目（ｐ値＝０．０６７６、統計的限界近く）、７日目（ｐ値＝０．０２６６）、１１日目（ｐ値＝０．００６７）、１４日目（ｐ値＝０．００３７）、及び１７日目（ｐ値＝０．００２１）に、ビヒクル対照と比較して腫瘍体積の統計的に有意な減少を示した。対照的に、キイトルーダ単独の投与は、１１日目（ｐ値＝０．０２０５）、１４日目（ｐ値＝０．０１４５）、１７日目（ｐ値＝０．０１４５）に、ビヒクル対照と比較して腫瘍体積の統計的に有意な低減を示しただけである。１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｃ単独の投与は、試験の１１日目（ｐ値＝０．０２６６）、１４日目（ｐ値＝０．００６２）、及び１７日目（ｐ値＝０．００４４）に、ビヒクル対照と比較して腫瘍体積の統計的に有意な低減を示した（図２４Ａ）。ビヒクル対照と比較したＭＣ３８腫瘍体積の平均阻害パーセンテージ（％）に関するデータの解釈も、単独で投与されたキイトルーダ又は１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｃと比較して、１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｃとキイトルーダとの組合せの抗腫瘍活性の向上の強い傾向を示す（図２４Ｂ）。このプロファイルは、ブロッキング（例えば、キイトルーダ又はＭＫ３４７５）抗ＰＤ－１抗体と非ブロッキング（１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｃ）抗ＰＤ－１抗体との組合せが、Ｔ細胞機能活性（例えば、増殖（実施例２及び８）、並びにサイトカイン産生（実施例１１））の増強を引き起こすことのｉｎ ｖｉｔｒｏの証拠を支持する。更なる所見は、抗体の同じ総量を各試験群に投与した（キイトルーダ：１０ｍｇ／ｋｇ、並びに１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｃと及びキイトルーダ：各５ｍｇ／ｋｇ）にもかかわらず、キイトルーダ単独と比較して、Ｈ１ｃＬ１ｃとキイトルーダとの組合せがかなり早い時点（試験の４又は７日目）で抗腫瘍効果を発揮し始めることである。最後に、ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍モデルデータを、抗体治療中にＭ３８腫瘍の完全寛解を経験したマウスの割合（％）（図２４Ｃ）に関して説明する。１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｃとキイトルーダの組合せで見られた腫瘍阻害（％）の向上と一致して、この試験群（１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｃとキイトルーダとの組合せ）は、移植腫瘍の完全寛解を有したマウスの２倍増加を示した（キイトルーダ又は１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｃのいずれかをそれぞれ／単独で投与した群での２匹のマウスに対して、１３５Ｃ Ｈ１ｃＬ１ｃとキイトルーダとの組合せにおける４匹のマウス）。合わせて、このｉｎ ｖｉｖｏデータは、Ｐ２パッチとオーバーラップするＰＤ－１のエピトープに対する、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用に非ブロッキング性である結合が、腫瘍特異的免疫応答を活性化し、それがＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断を介して作用する抗ＰＤ－１抗体とは区別されかつそれと共働的であることを確認する。
所定の実施形態を好ましい実施形態に関して記載しているが、変形及び修飾が当業者に考え付くことを理解されたい。従って、添付の特許請求の範囲は、請求項の範囲に入る全てのそのような等価の変形をカバーすることが意図されている。
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Claims (16)

  1. ヒトＰＤ－１に結合し、配列番号１７６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号１９０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、ヒト化抗体またはその断片。
  2. 前記断片が、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ'） ２ 、Ｆａｂ’、一本鎖抗体またはＦｖ断片である、請求項１に記載のヒト化抗体またはその断片。
  3. Ｔ細胞の表面からＰＤ－１のインターナリゼーションを誘導するためのものである、請求項１または２に記載のヒト化抗体またはその断片。
  4. 前記Ｔ細胞が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染したヒトＴ細胞である、請求項３に記載のヒト化抗体またはその断片。
  5. 抗原特異的ＣＤ８ + Ｔ細胞の機能的疲弊を救済及びその増殖を高めるためのものである、請求項１または２に記載のヒト化抗体またはその断片。
  6. 前記Ｔ細胞が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に特異的である、請求項５に記載のヒト化抗体またはその断片。
  7. ヒト患者におけるがんを治療するためのものである請求項１または２に記載のヒト化抗体またはその断片。
  8. 抗ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブと併用される、請求項３～７のいずれかに記載のヒト化抗体またはその断片。
  9. 異なる抗原に対する第２の結合特異性を有する結合剤である、請求項１または２に記載のヒト化抗体またはその断片。
  10. 前記ヒト化抗体またはその断片に固定的に付着した検出可能な標識もしくはエフェクター部分とを含む、請求項１または２に記載のヒト化抗体またはその断片の誘導体。
  11. 請求項１～９のいずれかに記載の抗体またはその断片、または請求項１０に記載の誘導体と、少なくとも１つの医薬上許容される担体とを含む組成物。
  12. 請求項１～９のいずれかに記載の抗体またはその断片、または請求項１０に記載の誘導体とともに、または請求項１１に記載の組成物がさらに、抗ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブを含む組成物。
  13. 請求項１に記載のヒト化抗体またはその断片をコードする単離ポリヌクレオチド。
  14. 請求項１３に記載の１または複数のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  15. 請求項１４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  16. 請求項１３に記載の１または複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
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