CN111690070A

CN111690070A - 一种sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白及其应用

Info

Publication number: CN111690070A
Application number: CN202010403144.7A
Authority: CN
Inventors: 吴松; 朱士茂; 王飞; 孙海燕; 雷崎方
Original assignee: Shenzhen Following Precision Medicine Research Institute Technical Director
Current assignee: Shenzhen Following Precision Medicine Research Institute Technical Director
Priority date: 2020-05-13
Filing date: 2020-05-13
Publication date: 2020-09-22

Abstract

本发明公开一种sPD‑1‑Fc‑sTGFβRII融合蛋白及其应用，其中，所述sPD‑1‑sTGFβRII融合蛋白包括Fc片段以及通过连接肽分别连接在所述Fc片段N端和C端的sPD‑1和sTGFβRII。本发明提供的sPD‑1‑Fc‑sTGFβRII融合蛋白可以结合肿瘤微环境中的PD‑L1、PD‑L2及TGF‑β，从而干扰所述PD‑L1、PD‑L2及TGF‑β与免疫细胞表面配体的结合，进而解除PD‑L1、PD‑L2及TGF‑β对免疫细胞活性的抑制，增强免疫细胞在肿瘤微环境中的活性，从而提升免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，更好地发挥肿瘤免疫反应。综上所述，本发明提出sPD‑1‑Fc‑sTGFβRII通过阻断PD‑1/PD‑L1、PD‑1/PD‑L2、PD‑L1/CD80以及TGF‑β信号通路增强免疫系统抗肿瘤反应的模式图。

Description

一种sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白及其应用。

背景技术

肿瘤免疫耐受和逃逸在肿瘤的发生与发展中扮演着重要的角色。目前对于肿瘤细胞免疫逃逸机制研究最透彻的是利用以PD-1/PD-L1为代表的免疫检查点逃避免疫系统杀伤。针对肿瘤细胞这一逃逸机制，通过单克隆抗体，阻断PD-1/PD-L1信号通路，解除免疫检查点的抑制作用，在临床上取得了巨大的成功。然而，尽管PD-1/PD-L1抗体在临床上展示了良好的治疗效果，但仅有部分病人对免疫检查点阻断疗法产生应答或早期有应答但后期肿瘤发生复发，多数患者无法受益。

目前导致患者对PD-1/PD-L1阻断疗法产生耐受的机理尚未完全清楚，一个重要的原因是单一靶向PD-1或PD-L1不能有效激活免疫系统。T细胞上的PD-1不仅与肿瘤细胞中PD-L1结合，还可结合肿瘤微环境中其他免疫细胞表达的PD-L1或者PD-L2，传递抑制性信号。此外，PD-L1除了结合PD-1，还可以通过顺式或反式作用的方式结合T细胞或抗原递呈细胞上的共刺激分子CD80，抑制T细胞活性。综上所述，肿瘤微环境中PD-1/PD-L1、PD-1/PD-L2和PD-L1/CD80均可以抑制T细胞的活性，单独使用PD-1抗体可以阻断PD-1与PD-L1、PD-L2结合，但不能阻断PD-L1与CD80的相互作用，而单独使用PD-L1抗体能阻断PD-L1与PD-1、CD80结合，但不能阻断PD-1与PD-L2的相互作用。

肿瘤微环境中存在多种免疫抑制分子以及其他具有免疫抑制作用的细胞，其中一个重要免疫抑制因子为TGF-β。TGF-β是一种具有多种生物学活性的细胞因子，参与调节细胞的增殖、分化、发育和凋亡等多种生命活动。TGF-β信号由其受体介导，主要包括I、II和III型受体(TGFβRI、TGFβRII和TGFβRIII)。TGF-β首先与TGFβRII结合形成复合物，之后该复合物招募TGFβRI，引起TGFβRI细胞内结构域的磷酸化，进而激活下游信号通路。TGF-β信号具有双重作用，在肿瘤早期可抑制细胞增殖、启动细胞分化并诱导凋亡，但随着肿瘤的进展，肿瘤细胞TGF-β信号通路中生长抑制功能缺失，此时肿瘤细胞利用TGF-β信号通路发生免疫逃逸。

基于PD-1/PD-L1和TGF-β在肿瘤免疫逃逸中发挥的重要作用，已有较多研究同时靶向这两条通路，在阻断PD-1/PD-L1的同时，减少肿瘤微环境中TGF-β抑制信号。目前主流方向是联合使用TGF-β靶向药物和PD-1/PD-L1抗体药物，而进展最快，同时也是设计理念较新的为默克公司设计的双功能融合蛋白M7824，现已经进入II期临床。M7824为融合表达PD-L1抗体和TGFβRII细胞外结构域的融合蛋白，其一端结合PD-L1，另一端捕获TGF-β，同时阻断PD-1/PD-L1信号通路和TGF-β信号转导，从而更好发挥肿瘤免疫反应。然而，尽管M7824提高了客观有效率，但M7824无法阻断PD-L2对T细胞的活性抑制，限制了其临床有效率，仍有进一步改进空间。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白及其应用，旨在解决现有抗体药物易受肿瘤微环境的抑制，导致其对肿瘤细胞的杀伤能力下降的问题。

本发明的技术方案如下：

一种sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白，其中，包括Fc片段以及通过连接肽分别连接在所述Fc片段N端和C端的sPD-1和sTGFβRII。

所述的sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白，其中，所述sPD-1为人sPD-1，所述Fc片段为人IgG1Fc，所述sTGFβRII为人sTGFβRII。

所述的sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白，其中，所述sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID.1所示。

所述的sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白，其中，编码所述sPD-1-Fc-sTGFβR2融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID.2所示。

所述的sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白，其中，所述sPD-1为鼠sPD-1，所述Fc片段为人IgG1Fc，所述sTGFβRII为鼠sTGFβRII。

所述的sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白，其中，所述sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID.3所示。

所述的sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白，其中，编码所述sPD-1-Fc-sTGFβR2融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID.4所示。

进一步地，还提供所述sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白的核苷酸序列的重组载体。

进一步地，还提供一种含有所述重组载体的宿主细胞。

进一步地，还提供一种含有所述sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白的药物组合物。

进一步地，还提供所述sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。

有益效果：本发明提供的sPD-1-sTGFβRII融合蛋白可以结合肿瘤微环境中的PD-L1、PD-L2和TGF-β，从而干扰所述PD-L1、PD-L2和TGF-β介导的信号通路，进而解除介导的信号通路对免疫细胞活性的抑制，增强免疫细胞在肿瘤微环境中的活性，从而提升免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，更好地发挥肿瘤免疫反应。

附图说明

图1为人sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白经HindIII和EcoRI酶切后，通过电泳验证得到的条带分布图。

图2为鼠sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白经NdeI和KpnI酶切后，通过电泳验证得到的条带分布图。

图3为sPD-1-Fc-TGFβRII融合蛋白结合PD-L1后的OD450值测试结果图。

图4为sPD-1-Fc-TGFβRII融合蛋白结合TGF-β后的OD450值测试结果图。

图5为sPD-1-Fc-TGFβRII融合蛋白同时结合PD-L1和TGF-β后的OD450值测试结果图。

图6为验证sPD-1-Fc-TGFβRII融合蛋白对PD-L1信号通路具有抑制作用的结果示意图。

图7为验证sPD-1-Fc-TGFβRII融合蛋白对TGF-β信号通路具有抑制作用的结果示意图。

图8为瘤内注射sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白后肿瘤的生长曲线图。

图9为本发明提出的sPD-1-Fc-sTGFβRII通过阻断PD-1/PD-L1、PD-1/PD-L2、PD-L1/CD80以及TGF-β信号通路增强免疫系统抗肿瘤反应的模式图。

具体实施方式

本发明提供一种sPD-1-sTGFβRII融合蛋白及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

在肿瘤微环境的抑制作用下，免疫细胞的持续作用有限，即使免疫细胞浸润充分，其在发挥治疗效果时仍需要克服免疫抑制的肿瘤环境，肿瘤微环境中有多种抑制免疫细胞活性的机制。例如，肿瘤细胞通过高水平表达PD-L1，与免疫细胞表面的PD-1结合，进而抑制免疫细胞活性。而TGF-β信号通路在胚胎和人体的生长发育过程中扮演着重要的角色，TGF-β在细胞中表达后，会被释放到细胞外内环境中，通过与膜上受体TGFβRII结合，激活TGFβRII，使其与TGFβRI结合形成复合体。正常情况下TGF-β可以抑制细胞增殖，包括免疫细胞，但肿瘤细胞通过突变，改变TGF-β信号通路，从而对TGF-β的抑制不敏感。在肿瘤微环境中，TGF-β可抑制多种免疫细胞在肿瘤组织中增殖分化。因此TGF-β信号的高表达往往与免疫逃避、治疗抵抗和较差的预后相关联。在多种恶性肿瘤样本中，都可以观察到TGF-β信号通路相关因子的表达上升，并且其表达情况和癌症转移乃至患者预后都有着密切的联系。基于此，可通过使用PD-1或PD-L1抗体来提升提升免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，然而这种方式存在抗体半衰期短，要多次给药，以及肿瘤渗透可变和抗体本身的药代动力学问题，全身给药的风险和毒性。此外，因为PD-1配体有两个，PD-L1和PD-L2，因此单用其中一种抗体，仅能解除一种抑制。

基于PD-1/PD-L1和TGF-β在肿瘤免疫逃逸中发挥的重要作用，可靶向这两条通路，在阻断PD-1/PD-L1的同时，减少肿瘤微环境中TGF-β抑制信号。本发明提供了一种sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白，包括Fc片段以及通过连接肽分别连接在所述Fc片段N端和C端的sPD-1和sTGFβRII。

具体来讲，本实施例是通过制备一种sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白来解除肿瘤微环境对免疫细胞的抑制作用，所述sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白既可以结合PD-L1和PD-L2两个配体，干扰其与免疫细胞表面的PD-1结合，从而全面解除PD-1的抑制信号，又可以结合肿瘤微环境中的TGF-β，阻断其对免疫细胞的活性抑制，从而增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。也就是说，所述sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白可单独作为药品使用以改善肿瘤微环境对免疫细胞的活性抑制。

在一些实施方式中，所述sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白中，所述sPD-1为人sPD-1，所述Fc片段为人IgG1Fc，所述sTGFβRII为人sTGFβRII。所述sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID.1所示；编码所述sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白的核苷酸序列如SEQID.2所示。

也就是说，本实施例中的sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白为人sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白，所述人sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白表达质粒的构建包括以下步骤：根据NCBI公布的人PD-1、人IgG1Fc和TGFβRII序列，通过基因重组，合成包含Kozak序列、克隆位点、保护碱基、人抗体重链信号肽序列、人PD-1膜外区、人IgG1Fc和人TGFβRII膜外区的融合基因，其中sPD-1和sTGFβRII分别通过(G4S)3和(SG4)4连接肽融合至Fc的N和C端。HindIII和EcoRI酶切合成的基因，连接至本实验室保存的pCMV-3Flag质粒，筛选获得重组质粒pCMV-sPD-1-Fc-sTGFβRII，并经酶切及测序验证。将本实施例制得的人sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白经HindIII和EcoRI酶切后，通过电泳验证得到的条带分布如图1所示。

在一些实施方式中，将所述重组质粒pCMV-sPD-1-Fc-sTGFβRII转染至293T细胞，并培养预定时间后获取上清液的步骤包括：将处于对数生长期的293T细胞用胰酶消化后，接种到T75培养瓶中培养12-24小时，备用；利用转染试剂将所述重组质粒转染至293T细胞并培养1-4天后，取得上清液。

具体来讲，将处于对数生长期的293T细胞用胰酶消化后，稀释至1x106/mL的密度，接种到T75培养瓶中，培养24小时左右进行转染。利用Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen公司)将重组质粒转染至293T细胞，并在培养1、2、3和4天后取上清液，用酶联免疫吸附法(ELISA)测定上清中融合蛋白表达水平。

在一些实施方式中，将收集的上清液用Protein A亲合层析柱(购自GE公司)进行纯化处理，预先用PBS清洗和平衡纯化柱，上样流速为2ml/min，过10倍柱体积；将上样流速调节至1ml/min，将所述上清液加入纯化柱中，上样结束后用PBS(PH＝7.4)清洗纯化柱，上样速度2ml/min，过10倍柱体积；进液端换上甘氨酸溶液(PH＝2.5)，调节流速至1ml/min洗脱融合蛋白。向收集管中加入一定量的Tris(pH8.0)缓冲液将蛋白调至PH中性。最后融合蛋白透析至PBS(PH＝7.4)中，纯化的sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白经SDS-PAGE和WB检测。

在一些实施方式中，还提供一种sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白，所述sPD-1为鼠sPD-1，所述Fc片段为人IgG1Fc，所述sTGFβRII为鼠sTGFβRII；所述sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID.3所示；编码所述sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID.4所示。

也就是说，本实施例中的sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白为鼠sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白，所述鼠sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白表达质粒的构建包括以下步骤：根据NCBI公布的鼠PD-1、人IgG1Fc和鼠TGFβRII序列，通过基因重组，合成包含Kozak序列、克隆位点、保护碱基、人抗体重链信号肽序列、鼠PD-1膜外区、人IgG1Fc和鼠TGFβRII膜外区的融合基因，其中sPD-1和sTGFβRII分别通过(G4S)3和(SG4)4连接肽连接至Fc的N和C端。NdeI和KpnI酶切合成的基因，连接至本实验室保存的pCMV-3Flag质粒。筛选获得重组质粒pCMV-sPD-1-Fc-sTGFβRII，并经酶切及测序验证。将本实施例制得的鼠sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白经NdeI和KpnI酶切后，通过电泳验证得到的条带分布如图2所示。

下面通过具体实施例对本发明sPD-1-Fc-TGFβRII融合蛋白生物学活性以及肿瘤抑制效果进行分析：

实施例1

确定sPD-1-Fc-TGFβRII融合蛋白结合PD-L1或TGF-β的能力：为检测融合蛋白是否可以结合PD-L1或TGF-β，使用商品化PD-L1或TGF-β1，包被至96孔板，经1％牛血清白蛋白封闭后，加入梯度稀释的sPD-1-Fc-TGFβRII融合蛋白或对照组，之后加入HRP标记的抗人IgG二抗，测定OD450值，结果如图3-图4所示，说明所述sPD-1-Fc-TGFβRII融合蛋白可单独结合PD-L1或TGF-β。

实施例2

确定sPD-1-Fc-TGFβRII融合蛋白同时结合PD-L1和TGF-β的能力：为测定融合蛋白是否可以同时结合PD-L1和TGF-β1，使用商品化PD-L1蛋白，包被至96孔板，经1％牛血清白蛋白封闭后，加入梯度稀释的sPD-1-Fc-TGFβRII融合蛋白或对照组，之后加入生物素标记的TGF-β1，室温孵育2小时后，加入偶联HRP的链霉亲和素，室温放置45分钟后，测定OD450值，结果如图5所示，说明所述sPD-1-Fc-TGFβRII融合蛋白可同时结合PD-L1和TGF-β。

实施例3

sPD-1-Fc-TGFβRII融合蛋白中PD-1生物学活性检测：将梯度稀释的sPD-1-Fc-TGFβRII融合蛋白或对照组包被至96孔板，PBMC细胞复苏后加入超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A，之后加入包被后的96孔板中，37℃孵育72小时后，ELISA测定上清中IL-2含量，测定sPD-1-Fc-TGFβRII拮抗PD-L1抑制的能力，结果如图6所示，说明所述sPD-1-Fc-TGFβRII融合蛋白对PD-L1信号通路具有抑制作用。

实施例4

sPD-1-Fc-TGFβRII融合蛋白中TGFβRII生物学活性检测：构建并筛选稳定表达SMAD-Luc荧光素酶报告基因的293T细胞株，将该细胞株包被至96孔板，加入梯度稀释的sPD-1-Fc-TGFβRII或对照组孵育2小时，之后加入商品化TGF-β1，经过夜处理后，更换含荧光素的培养基，检测上清中荧光的强度，对融合蛋白拮抗TGF-β1的活性进行检测，结果如图7所示，说明所述sPD-1-Fc-TGFβRII融合蛋白对TGF-β信号通路具有抑制作用。

实施例5

sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白抑制肿瘤的生长：

1)、C57BL/6小鼠皮下膀胱癌模型的建立：取对数生长期的小鼠膀胱癌细胞系Mb49细胞，用无菌的生理盐水重悬至5x10 6/ml，取100ul对C57BL/6小鼠进行皮下接种；

2)、瘤内注射sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白抑制肿瘤：接种Mb49细胞后的第10天，将成功建立皮下膀胱癌模型的小鼠，分为三组开展实验：瘤内注射小鼠sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白治疗组以及不做任何处理的空白对照组。对于瘤内注射小鼠sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白治疗组，单次给药小鼠sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白20ug，隔两天给药一次，体积100ul；对照组单次注射100ul生理盐水，时间与蛋白给药同步。每次给药前测量肿瘤的体积，并绘制肿瘤生长曲线，结果如图8所示，从图8可看出在注射sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白后，小鼠的肿瘤生长明显受到抑制，其体积增长较小，而对照组的小鼠肿瘤体积增大明显，说明本发明提供的sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白能够有效抑制肿瘤的生长。

在一些实施方式中，还提供一种sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白的应用，将本发明所述的sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白用于制备抗肿瘤药物。

在一些实施方式中，还提供一种药物组合物，其中，包括本发明所述的sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白。所述的药物组合物中，还包括一种或几种其他的诱导树突状细胞成熟的组分或其它抗肿瘤药物。

综上所述，本发明提供的sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白可以结合肿瘤微环境中的PD-L1、PD-L2和TGF-β，从而干扰所述PD-L1、PD-L2和TGF-β介导的信号通路，进而解除PD-L1、PD-L2和TGF-β对免疫细胞活性的抑制，增强免疫细胞在肿瘤微环境中的活性，从而提升免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，更好地发挥肿瘤免疫反应。本发明提出sPD-1-Fc-sTGFβRII通过阻断PD-1/PD-L1、PD-1/PD-L2、PD-L1/CD80以及TGF-β信号通路增强免疫系统抗肿瘤反应的模式图，如图9所示。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

序列表

<110> 深圳市众循精准医学研究院

<120> 一种sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白及其应用

<160> 4

<210> 1

<211> 587

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<400> 1

Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Glu Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro

20 25 30

Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr

35 40 45

Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp

50 55 60

Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro

65 70 75 80

Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln

85 90 95

Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg

100 105 110

Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys

115 120 125

Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg

130 135 140

Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala

145 150 155 160

Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

165 170 175

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

180 185 190

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

195 200 205

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

210 215 220

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

225 230 235 240

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

245 250 255

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

260 265 270

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

275 280 285

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

290 295 300

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

305 310 315 320

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

325 330 335

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

340 345 350

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

355 360 365

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

370 375 380

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

385 390 400 405

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

410 415 420

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Ile Pro

425 430 435

Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn

440 445 450

Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg

455 460 465

Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile

470 475 480 490

Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg

495 500 505

Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys

510 515 520

Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys

525 530 535

Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser

540 545 550

Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr

550 555 560 565

Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu Leu Leu Val Ile Phe Gln

570 575

<210> 2

<211> 1740

<212> DNA

<213> 人工序列（rengongxulie）

<400> 2

aagcttgcca ccatggagtt ggggctgagc tgggttttcc ttgttgctat tttagaaggt 60

gtccagtgtg agttcttaga ctccccagac aggccctgga acccccccac cttctcccca 120

gccctgctcg tggtgaccga aggggacaac gccaccttca cctgcagctt ctccaacaca 180

tcggagagct tcgtgctaaa ctggtaccgc atgagcccca gcaaccagac ggacaagctg 240

gccgccttcc ccgaggaccg cagccagccc ggccaggact gccgcttccg tgtcacacaa 300

ctgcccaacg ggcgtgactt ccacatgagc gtggtcaggg cccggcgcaa tgacagcggc 360

acctacctct gtggggccat ctccctggcc cccaaggcgc agatcaaaga gagcctgcgg 420

gcagagctca gggtgacaga gagaagggca gaagtgccca cagcccaccc cagcccctca 480

cccaggccag ccggccagtt ccaaaccctg gtgggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc 540

agcggcggcg gcggcagcga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 600

ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 660

cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 720

ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 780

cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 840

aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 900

accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 960

cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1020

agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1080

cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1140

agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1200

cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaaa gtggcggtgg tggctccggc 1260

ggtggtggct ccggcggtgg tggctccggc ggtggtggca cgatcccacc gcacgttcag 1320

aagtcggtta ataacgacat gatagtcact gacaacaacg gtgcagtcaa gtttccacaa 1380

ctgtgtaaat tttgtgatgt gagattttcc acctgtgaca accagaaatc ctgcatgagc 1440

aactgcagca tcacctccat ctgtgagaag ccacaggaag tctgtgtggc tgtatggaga 1500

aagaatgacg agaacataac actagagaca gtttgccatg accccaagct cccctaccat 1560

gactttattc tggaagatgc tgcttctcca aagtgcatta tgaaggaaaa aaaaaagcct 1620

ggtgagactt tcttcatgtg ttcctgtagc tctgatgagt gcaatgacaa catcatcttc 1680

tcagaagaat ataacaccag caatcctgac ttgttgctag tcatatttca ataagaattc 1740

<210> 3

<211> 559

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<400> 3

Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Glu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp Arg Ser Leu Thr

20 25 30

Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala Asn Ala Thr Phe

35 40 45

Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met Leu Asn Trp Asn

50 55 60

Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala Ala Phe Cys Asn

65 70 75 80

Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln Ile Ile Gln Leu

85 90 95

Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp Thr Arg Arg Asn

100 105 110

Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu His Pro Lys Ala

115 120 125

Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val Thr Glu Arg Ile

130 135 140

Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro Gly Gly Gly Gly

145 150 155 160

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr

165 170 175

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

180 185 190

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

195 200 205

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

210 215 220

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

225 230 235 240

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

245 250 255

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

260 265 270

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

275 280 285

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

290 295 300

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

305 315 320 325

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

330 335 340

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

345 350 355

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

360 365 370

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

375 380 385

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly

390 395 400 405

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

410 415 420

Gly Gly Ile Pro Pro His Val Pro Lys Ser Val Asn Ser Asp Val Met

425 430 435

Ala Ser Asp Asn Gly Gly Ala Val Lys Leu Pro Gln Leu Cys Lys Phe

440 445 450

Cys Asp Val Arg Leu Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser

455 460 475

Asn Cys Ser Ile Thr Ala Ile Cys Glu Lys Pro His Glu Val Cys Val

480 485 490 495

Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Lys Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys

500 505 510

His Asp Pro Lys Leu Thr Tyr His Gly Phe Thr Leu Glu Asp Ala Ala

515 520 525

Ser Pro Lys Cys Val Met Lys Glu Lys Lys Arg Ala Gly Glu Thr Phe

530 535 540

Phe Met Cys Ala Cys Asn Met Glu Glu Cys Asn Asp Tyr Ile Ile Phe

545 550 555

Ser Glu Glu Tyr Thr Thr

560 565

<210> 4

<211> 1671

<212> DNA

<213> 人工序列（rengongxulie）

<400> 4

gctagcgcca ccatggagtt ggggctgagc tgggttttcc ttgttgctat tttagaaggt 60

gtccagtgtg agctagaggt ccccaatggg ccctggaggt ccctcacctt ctacccagcc 120

tggctcacag tgtcagaggg agcaaatgcc accttcacct gcagcttgtc caactggtcg 180

gaggatctta tgctgaactg gaaccgcctg agtcccagca accagactga aaaacaggcc 240

gccttctgta atggtttgag ccaacccgtc caggatgccc gcttccagat catacagctg 300

cccaacaggc atgacttcca catgaacatc cttgacacac ggcgcaatga cagtggcatc 360

tacctctgtg gggccatctc cctgcacccc aaggcaaaaa tcgaggagag ccctggagca 420

gagctcgtgg taacagagag aatcctggag acctcaacaa gatatcccag cccctcgccc 480

ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcgacaa aactcacaca 540

tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca 600

aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 660

gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 720

aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 780

ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 840

aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 900

ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg 960

acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1020

cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1080

ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1140

tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 1200

ggtaaaagtg gcggtggtgg ctccggcggt ggtggctccg gcggtggtgg ctccggcggt 1260

ggtggcatcc cgccgcacgt tcccaagtcg gttaacagtg atgtcatggc cagcgacaat 1320

ggcggtgcgg tcaagcttcc acagctgtgc aagttttgcg atgtgagact gtccacttgc 1380

gacaaccaga agtcctgcat gagcaactgc agcatcacgg ccatctgtga gaagccgcat 1440

gaagtctgcg tggccgtgtg gaggaagaac gacaagaaca ttactctgga gacggtttgc 1500

cacgacccca agctcaccta ccacggcttc actctggaag atgccgcttc tcccaagtgt 1560

gtcatgaagg aaaagaaaag ggcgggcgag actttcttca tgtgtgcctg taacatggaa 1620

gagtgcaacg attacatcat cttttcggaa gaatacacca cctaaggtac c 1671

Claims

1.一种sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白，其特征在于，包括Fc片段以及通过连接肽分别连接在所述Fc片段N端和C端的sPD-1和sTGFβRII。

2.根据权利要求1所述的sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白，其特征在于，

所述sPD-1为人sPD-1，所述Fc片段为人IgG1Fc，所述sTGFβRII为人sTGFβRII。

3.根据权利要求2所述的sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白，其特征在于，

所述sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID.1所示。

4.根据权利要求2所述的sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白，其特征在于，

编码所述sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID.2所示。

5.根据权利要求1所述的sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白，其特征在于，

所述sPD-1为鼠sPD-1，所述Fc片段为人IgG1Fc，所述sTGFβRII为鼠sTGFβRII。

6.根据权利要求5所述的sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白，其特征在于，所述sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID.3所示。

7.根据权利要求6所述的sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白，其特征在于，编码所述sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID.4所示。

8.含有如权利要求4或7所述sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白的核苷酸序列的重组载体。

9.含有如权利要求8所述重组载体的宿主细胞。

10.含有如权利要求1-7所述任意一种融合蛋白的药物组合物。

11.含有如权利要求1-7所述任意一种sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。