KR102361632B1 - Baff 및 b7rp1에 특이적인 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

Baff 및 b7rp1에 특이적인 단백질 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본원에 개시된 내용은 BAFF 및 B7RP1에 특이적인 이특이적 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 핵산, 상기 단백질을 제조하는 방법 및 상기 단백질의 용도이다.

Description

BAFF 및 B7RP1에 특이적인 단백질 및 이의 용도{PROTEINS SPECIFIC FOR BAFF AND B7RP1 AND USES THEREOF}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2013년 3월 13일자로 출원된 US 가출원 번호 제61/780,260호 및 2014년 2월 21일자로 출원된 US 가출원 번호 제61/942,776호의 우선권을 주장하고, 상기 출원 각각은 이들의 전문이 본원에 인용된다.
분야
본원에 기재된 상기 이특이적 분자는 단백질 치료학적 분야에 있다.
대부분의 치료학적 단백질은 고특이성으로 단일 표적 단백질에 결합함으로써 이러한 단일 표적 단백질의 활성을 방해한다. 상기 단백질은 치료될 인간 질환을 매개하는 하나 이상의 생물학적 경로 중 일부일 수 있고 따라서 상기 치료학적 단백질은 질환 진행을 억제할 수 있다. 그러나, 치료학적 단백질의 효능은 모든 환자에 대해 드물게 완전하다. 치료학적 단백질의 불완전한 효능은 일부 경우에 질환의 복잡성으로 인한 것일 수 있다. 예를 들어, 일부 질환들은 다수의 생물학적 경로에 의해 매개될 수 있거나 상이한 생물학적 경로가 임상적으로 동일하게 한정된 병태를 갖는 상이한 환자에서 질환 활성을 매개하는데 주요 역할을 할 수 있다. 따라서, 일부 질환에서 적어도 2개의 생물학적 경로를 동시에 억제하는 것이 유리할 수 있다.
요약
본원에서는 인간 B7-관련된 단백질 1 (또한 GL50 및 T-세포 동시-자극자 리간드(ICOSIg)로서 공지된 B7RP1) 및 인간 B-세포 활성화 인자(또한 종양 괴사 인자 슈퍼패밀리, 구성원 13b (TNFSF13B)로서 공지된 BAFF) 둘다에 결합하여 이들의 생물학적 활성을 억제할 수 있는 이특이적 단백질이 제공된다. BAFF는 B 세포 생존에서 역할을 하고 B7RP1은 T 세포 동시자극에서 역할을 한다. 따라서, 단백질 둘다의 활성을 억제하는 단백질은 B 및 T 세포 둘다의 활성을 방해한다.
본원에는 단백질이 인간 B 세포의 BAFF-매개된 증식을 억제할 수 있고 인간 T 세포의 B7RP1-매개된 증식을 억제할 수 있는 이특이적 단백질이 기재되어 있다. 상기 이특이적 단백질은 상이한 아미노산 서열을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄 및 상이한 아미노산 서열을 갖는 2개의 면역글로불린 경쇄를 포함하는 IgG 항체를 포함할 수 있다. 상기 IgG 항체는 인간 B 세포의 BAFF 매개된 증식 및 인간 T 세포의 B7RP1 매개된 증식을 억제할 수 있다 상기 IgG 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체일 수 있고 인간 또는 인간화된 IgG 항체일 수 있다. 상기 이특이적 단백질은 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR1), 서열번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR2), 서열번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR3), 서열번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함할 수 있다. 추가로, 상기 이특이적 단백질은 서열번호: 15를 포함하는 중쇄 가변 영역 또는 이의 변이체 및 서열번호: 14를 포함하는 경쇄 가변 영역 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 상기 변이체 서열은 10개 이하의 결실, 표준 서열과 비교하여 100개의 아미노산 당 단일 아미노산의 치환 삽입을 포함할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 인간 B 세포의 BAFF 매개된 증식을 억제할 수 있고 인간 T 세포의 B7RP1 매개된 증식을 억제할 수 있는 이특이적 단백질은 다음을 포함할 수 있다: (a) 하기식 A-L1-P-L2-P(여기서, A는 IgG 항체의 면역글로불린 중쇄이고, L1은 부재이거나 길이가 3 내지 40개 아미노산인 제1 링커이고, P는 길이가 10 내지 40개 아미노산인 BAFF-결합 펩타이드이고, L2는 부재이거나 길이가 5 내지 50개 아미노산인 펩타이드 링커이다)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 및 (b) 면역글로불린 경쇄. (a)의 면역글로불린 중쇄 및 (b)의 면역글로불린 경쇄는 IgG 항체를 형성할 수 있고, 이는 2개의 (a)의 폴리펩타이드 분자 및 2개의 (b)의 경쇄 분자를 포함하고, 이는 B7RP1에 결합하고/하거나 인간 T 세포의 B7RP1 매개된 증식을 억제할 수 있다. 상기 면역글로불린 중쇄는 L1의 바로 업스트림인 C 말단에서 라이신이 결실일 수 있다. 상기 IgG 항체는 인간 또는 인간화된 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체일 수 있다. 상기 BAFF 결합 펩타이드 P는 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 3의 아미노산 서열을 가질 수 있다. L1은 서열번호: 4, 37, 38, 39, 또는 40의 아미노산 서열을 가질 수 있다. L2는 서열번호: 5, 6 또는 7의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 이특이적 단백질은 서열번호: 8 (RASQGISNWLA)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 9(AASSLQS)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 서열번호: 10(QQYDSYPRT)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3, 서열번호: 11(SYWMS)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호: 12 (YIKQDGNEKYYVDSVKG)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열번호: 13 (EGILWFGDLPTF)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함할 수 있다. 상기 이특이적 단백질은 서열번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역 및/또는 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 상기 이특이적 단백질은 서열번호: 19의 아미노산 서열 또는 이의 변이체 및 서열번호: 17 또는 18의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 상기 변이체 서열은 10개 이하의 결실, 표준 서열과 비교하여 100개의 아미노산 당 단일 아미노산의 치환 삽입을 포함할 수 있다.
추가의 양태에서, 본원에서는 (a) 서열번호: 17 또는 서열번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 이의 변이체; 및 (b) 서열번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 또 다른 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 포함하는 이특이적 단백질이 제공된다. 상기 변이체 서열은 10개 이하의 결실, 표준 서열과 비교하여 100개 아미노산 당 단일 아미노산의 치환 삽입을 포함할 수 있다. 상기 이특이적 단백질은 인간 B 세포의 BAFF 매개된 증식 및 인간 T 세포의 B7RP1 매개된 증식을 억제할 수 있다. 상기 이특이적 단백질은 2개의 (a)의 폴리펩타이드 분자 및 2개의 (b)의 폴리펩타이드 분자를 포함하는 4량체일 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본원에서는 서열번호: 6 또는 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 링커를 포함하는 단백질이 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 단백질은 인간 B 세포의 HAFF 매개된 증식 및/또는 인간 T 세포의 B7RP1 매개된 증식을 억제할 수 있다. 상기 단백질은 서열번호: 1, 서열번호: 14 및/또는 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 단백질은 서열번호: 6 또는 7로 분리된 2개 이상의 카피의 서열번호: 1을 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 추가의 실시형태에서, 상기 단백질은 면역글로불린 경쇄 및 면역글로불린 중쇄를 포함할 수 있고 서열번호: 6 또는 7은 중쇄의 C-말단으로부터 다운스트림에 있을 수 있다. 상기 실시형태에서, 서열번호: 6 또는 7은 중쇄 및 경쇄에 의해 결합된 것 이외의 단백질에 결합하는 폴리펩타이드로 플랭킹될 수 있다.
추가로, 본원에서는 본원에 기재된 임의의 이특이적 단백질 또는 서열번호: 6 또는 7의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 및 생리학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
또한, 본원에서는 본원에 기재된 이특이적 단백질 또는 서열번호: 6 또는 7을 포함하는 단백질 중 하나에 포함된 임의의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산이 제공된다. 이특이적 단백질에 포함된 폴리펩타이드를 암호화하는 예시적인 핵산은 예를 들어, 무엇보다 서열번호: 55, 56, 60, 61, 62, 및 63을 포함한다. 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 상기 백터 및/또는 핵산을 함유하는 숙주 세포가 제공된다. 추가로 본원에서는 본원에 기재된 임의의 이특적 단백질을 암호화하는 핵산을 함유하는 ㅅ숙주 세포를 상기 핵산이 발현되도록 하는 조건하에서 배양하고 상기 단백질을 세포 집단(cell mass) 또는 배양 배지로부터 회수함을 포함하는 이특이적 단백질을 제조하는 방법이 제공된다. 상기 숙주 세포는 포유동물 세포, 예를 들어, CHO 세포, 또는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)와 같은 세균 세포일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에서는 치료학적 유효량의 본원에 기재된 임의의 이특적 단백질 또는 상기 이특이적 단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 낭창성 신염을 포함하는 전신 홍반성 낭창을 치료하는 방법이 제공된다. 또 다른 치료제가 상기 이특이적 단백질 전후 또는 이와 동시에 환자에게 투여될 수 있다. 다른 치료제는 코르티코스테로이드, 항말라리아제, 레티노산, NSAID, 사이클로포스파미드, 데하이드로에피안드로스테론, 마이코페놀레이트, 모페틸, 아자티오프린, 클로람부실, 메토트렉세이트, 타크롤리무스, 다프손, 탈리도미드, 레플루노미드 또는 사이클로스포린일 수 있다.
추가의 양태에서, 본원에서는 본원에 기재된 치료학적 유효량의 임의의 이특이적 단백질 또는 본원에 기재된 이특이적 단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법이 제공되고, 여기서, 상기 환자는 ANCA-양성 혈관염, 류마티스 관절염(RA), 크론 질환, 궤양성 장염, 셀리악 질환, 천포창, 유사천포창, 아급성 피부 홍반성 낭창(SCLE), 다발성 경화증, 만성 염증 탈수초 다발성신경병증(CIDP), 중증 근무력증, 굿파스처 증후군(Goodpasture's syndrome), 사구체신염, 자가면역 용혈성 빈혈(AIHA), 특발성 혈소판감소성 자반병(ITP), 만성 활성 간염, 1차 담도성 경화증, 쇼그렌 증후군, 전신성 경화증, 하시모토 갑상선염, 그레이브 질환(Graves' disease), 애디슨 질환(Addison's disease), 및 다발성 내분비 샘종(MEN)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 질환을 갖는다.
또 다른 양태에서, 본원에서는 본원에 기재된 임의의 이특이적 단백질 또는 서열번호: 6 또는 서열번호: 7을 포함하는 단백질을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 상기 약제학적 조성물은 예를 들어, 전신 홍반성 낭창 또는 낭창성 신염의 치료를 위한 것일 수 있다.
또 다른 양태에서, 약물로서 본원에 제공된 임의의 이특이적 단백질의 용도가 제공된다.
도 1: BAFF 및 B7RP1에 결합하는 이특이적 단백질의 다이아그램. 상부 열을 가로질러 각각의 작제물에 대한 확인자를 열거한다. 제2 열을 가로질러 각각의 작제물의 구조에 관한 간략한 기재가 있다. 바닥 열을 가로질러 각각의 작제물의 구조의 다이아그램이 있다. 채워지지 않은 타원형은 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역을 나타낸다. 수평선으로 채워진 타원형은 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 가변 (VH 또는 VL) 영역을 나타낸다. 작고, 실선으로 채워진 사각형 및 루프는 BAFF-결합 펩타이드를 나타낸다. 힌지 영역은 두꺼운 수직선으로 나타나고, 디설파이드 브릿지는 두꺼운 수평선으로 나타낸다. 도 1에서 "G4S"의 서열은 서열번호: 72에 개시되어 있다.
도 2: 인간 B 세포 증식 검정에서 이특이적 단백질의 활성. 도 2A(상부) 및 도 2B(하부)에 나타낸 데이타는 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행된 B 세포 증식 검정으로부터 기원한다. 2개의 패널에서, 상기 x 축은 검정 혼합물 중에 함유된 이특이적 단백질의 농도(log[nM])를 지적하고 y축은 3H-티미딘 취득량(분당 카운트(cpm))을 지적한다. 각각의 심볼의 의미는 검정된 각각의 단백질에 대한 확인자로 나타낸다. 확인자의 의미는 도 1에 나타내고 실시예 1에서 설명된다.
도 3: 인간 T 세포 증식 검정에서 이특이적 단백질의 활성. 나타낸 데이타는 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행된 T 세포 증식 검정으로부터 기원한다. x 축은 검정 혼합물 중에 이특이적 또는 αB7RP1 항체의 농도(log[nM])를 지적하고, y 축은 B7RP1 억제제 없이 T 세포 3H-티미딘 취득에 상대적으로 (대조군 %), 지정된 농도에서 B7RP1 억제제의 존재하에 T 세포 3H-티미딘 취득의 %를 지적한다. 시험된 각각의 단백질에 대한 확인자를 나타낸다.
도 4: 스타필로코커스 엔테로톡신 B(Staphylococcus enterotoxin B)(SEB)로 자극된 인간 편도 세포에 의한 사이토킨 방출. 방법은 실시예 1에 기재되어 있다. y 축은 제조업자의 지침에 따라 메소 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery) (RockvUle, Maryland) 키트를 사용하여 측정된 다양한 사이토킨에 대해 검출된 시그날 수준을 보여준다. 상기 세포는 αB7RP1(레인 1), P74293(레인 2), CTLA4-Ig (레인 3), 또는 인간 IgG(레인 4)로 처리하였다. 검정된 상기 사이토킨은 도면에 나타낸다.
도 5: 마우스에서 이특이적 작제물의 약리역학적 프로필. 마우스에서 P71617, P71619, P71621, P71622, P74293, 및 P74294의 생체내 약리역학적 성질을 평가하기 위한 방법은 실시예 1에 기재되어 있다. 실시예 1에서 설명된 바와 같이, 상기 이특이적 단백질은 2개의 상이한 검정으로 검출하였고, 이중 하나의 검정은 단백질의 Fc 부분만을 검출하였고(데이타 포인트는 채워진 다이아몬드로 나타낸다: Fc 검정) 상기 검정 중 하나는 단백질의 Fc 및 BAFF-결합 부분 둘다를 검출하였다(데이타 포인트는 채워진 사각형으로 나타낸다: 온전한 검정). 상기 x 축은 주사 후 시점(시간)을 나타내고, y 축은 혈청 중에서 검출된 단백질의 농도(ng/mL)를 나타낸다. 주사된 작제물은 각각의 패널에 나타낸다.
도 6a: BAFF 및 B7RP1에 결합하는 뮤린 대용물 비특이적 분자("뮤린 대용물")에 의한 뮤린 B 세포 증식의 억제. 상기 검정은 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행하였다. 상기 뮤린 대용물은 실시예 2에 설명된 바와 같이 항체의 면역글로불린 중쇄의 C 말단에 부착된 2개 카피의 BAFF-결합 펩타이드를 갖는 항-뮤린 B7RP1 IgG 항체를 포함한다. 상기 양성 대조군은 BAFF-결합 펩티바디("αBAFF")였다. 상기 뮤린 대용물 및 αBAFF 기원의 데이타는 각각 실선으로 채워진 원형 및 사각형에 의해 나타낸다. x 축은 검정에서 이들 시험 단백질의 농도(log[pM])를 지적하고, y 축은 3H-티미딘 혼입(cpm)을 지적한다.
도 6b: 뮤린 대용물에 의한 뮤린 T 세포에 결합하는 B7RP1의 억제. 검정은 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행하였다. 항-뮤린 B7RP1 IgG 항체("항-mB7RP1")는 양성 대조군으로서 사용하였다. 뮤린 대용물 및 항-mB7RP1로부터의 데이타는 각각 실선으로 채워진 원형 및 사각형으로 나타낸다. x 축은 검정에서 이들 시험 단백질의 농도(log[pM])를 나타내고 y 축은 T 세포에 결합된 뮤린 B7RP1-Fc의 %를 지적한다.
도 7: 양 적혈구 세포의 마우스로의 투여의 면역학적 파라미터에 대한 생체내 효과. 본 도면에서 나타낸 모든 결과는 실시예 2에 기재된 검정으로부터 기원한다. 마우스에 처리되는 단백질은 다음과 같이 각각의 막대에서 채워진 것으로 나타낸다: 채워지지 않은 항-mB7RP1; 수직선, αBAFF; 수평선, 항-mB7RP1 플러스 αBAFF; 사선, 뮤린 대용물; 체커보드, mIgG1; 및 실선으로 채워진(바닥 패널에서만). SBRC가 챌린지되지 않은 마우스. 상부 패널, 양 적혈구 세포(SRBC)가 챌린지된 마우스에서 비장 B 세포의 %. y 축은 B 세포인 비장으로부터 기원하는 세포의 %를 지적한다. 중앙 패널, SRBC를 챌린지된 마우스에서 기억 T 세포인 비장 CD4+ T 세포의 %. 바닥 패널, SRBC로 챌린지된 마우스 기원의 혈청에서 항-SRBC 항체 수준.
도 8a: 다양한 단백질로 처리된 NZB/NZW 마우스에서 단백뇨증. 방법은 실시예 2에 기재되어 있다. 마우스의 각각의 그룹에 대한 치료는 하기와 같이 나타낸다: 채워진 원형, 포스페이트 완충 식염수(PBS); 채워진 사각형, 뮤린 IgG1 (이소형 대조군; 5 mg/kg); 채워지지 않은 사각형, 항-mB7RP1 (4.68 mg/kg); 채워진 상향 포인팅 삼각형, αBAFF (1.88 mg/kg); 채워지지 않은 상향 포인팅 삼각형, αBAFF (1.88 mg/kg) 플러스 항-mB7RP1 (4.68 mg/kg); 및 채워지지 않은 하향 포인팅 삼각형, 뮤린 대용물(5 mg/kg). x 축은 마우스의 나이(개월)를 지적하고 y축은 단백뇨(즉, 뇨에서 ≥300mb/dL 단백질)를 나타내는 마우스의 %를 나타낸다.
도 8b: 다양한 단백질로 처리된 8.5개월령의 NZB/NZW 마우스에서 이중 나선 DNA (dsDNA)에 대한 항체 수준. 방법은 실시예 2에 기재되어 있다. x 축은 마우스가 다음과 같이 처리된 분자(들)의 동일성을 지적한다: 1, 항-mB7RP1 (4.68 mg/kg); 2, αBAFF (1.88 mg/kg); 3, αBAFF (1.88 mg/kg) 플러스 항-mB7RP1 (4.68 mg/kg); 4, 쥐 대용물 이특이적 (5 mg/kg); 및 5, m1gG1 (이소형 대조군; 5 mg/kg). y 축은 양성 대조군의 %로서 검출된 항-dsDNA 항체의 수준을 지적한다. 각각의 도트는 단일 마우스로부터의 데이타를 지적한다.
도 9a: NZB/NZW 마우스에서 항-dsDNA IgG의 수준. 방법은 실시예 2에 기재되어 있다. 다양한 그룹의 마우스로부터의 데이타는 다음과 같이 동정된다: 1, 항-mB7RP1(14 mg/kg)을 투여받은 마우스; 2, αBAFF (5.6 mg/kg)을 투여받은 마우스; 3, 항-mB7RP1 (14 mg/kg) 및 αBAFF (5.6 mg/kg)의 배합물을 투여받은 마우스; 4, 뮤린 대용물 (15 mg/kg)을 투여받은 마우스; 5, mIgG 이소형 대조군 (15 mg/kg)을 투여받은 마우스; 및 6, PBS를 투여받은 마우스. 레인 1, 3, 및 4 상의 별표는 상기 레인에서 데이타와 레인 5 기원의 데이타간의 유의적인 차이(*, p <0.05; ***, p<0.0001)를 지적한다.
도 9b: 단백뇨를 갖는 각각의 그룹에서 NZB/W F1 마우스의 %. 방법은 실시예 2에 기재되어 있다. 다양한 그룹의 마우스로부터의 데이타는 다음과 같이 동정된다: 채워지지 않은 사각형, 항-mB7RP1(14 mg/kg)을 투여받은 마우스; 채워진 상향 포인팅 삼각형, αBAFF (5.6 mg/kg)을 투여받은 마우스; 채워지지 않은 상향 포인팅 삼각형, 항-mB7RP1(14 mg/kg) 및 αBAFF (5.6 mg/kg)의 배합물을 투여받은 마우스; 채워지지 않은, 하향 포인팅 삼각형, 뮤린 대용물(15 mg/kg)을 투여받은 마우스; 채워진 사각형, mIgG 이소형 대조군 (15 mg/kg)을 투여받은 마우스; 및 채워진 원형, PBS를 투여받은 마우스. 유의적인 차이는 뮤린 대용물, 대 항-mB7RP1(p<0.01), αBAFF (p <0.0001), 및 mIgG (p<0.0001)간에서 검출되었다. 처리가 발생된 시간 윈도우를 지적한다.
도 10: NZB/W F1 마우스의 신장 스코어. 실시예 2에서 설명된 바와 같이, 연구 종료 전 또는 연구 종료시에, 신장은 마우스가 죽은 경우 수거하였다. 신장 스코어는 실시예 2에 기재된 바와 같이 결정하였고, 보다 높은 스코어는 보다 중증의 신장 질환을 지적한다. 마우스 플러스 적당한 오차 막대의 각각의 그룹에 대한 평균을 나타낸다. 마우스 그룹은 하기의 처리를 받는다: 1) 항-mB7RP1(14 mg/kg), 수직선으로 채워진 막대; 2) αBAFF (5.6 mg/kg), 수평선으로 채워진 막대; 3) 항-mB7RP1 (14 mg/kg) 및 αBAFF (5.6 mg/kg)의 배합물, 창유리 체크로 채워진 막대; 4) 뮤린 대용물(15 mg/kg), 채커보드 패턴으로 채워진 막대; 5) mIgG (15 mg/kg), 검정 배경상에 흰색 도트로 채워진 막대; 및 6) PBS, 굵게 채워진 막대. 별표는 mIgG로 처리된 마우스로부터의 유의적인 차이를 지적하고 p값은 <0.05 (*) 또는 <0.001 (***)이다.
도 11: 뮤린 콜라겐-유도된 관절염에 대한 BAFF 및/또는 B7RP1의 억제 효과. 방법은 실시예 4에 기재되어 있다. 마우스의 5개 그룹은 다음과 같이 지적된 시험 물질로 처리하였다: mIgG, 실선으로 연결된 채워진 사각형; PBS, 점선으로 연결된 채워진 사각형; 항-mB7RP1, 점선으로 연결된 채워진 원형; αBAFF, 실선으로 연결된 개방 원형; 및 항-mB7RP1 및 αBAFF의 배합물, 실선으로 연결된 채워진 원형. 상부 패널은 다양한 그룹의 관절염 % 빈도를 보여주고 바닥 패널은 그룹의 평균 관절 스코어를 보여준다. 각각의 패널에서 수직의 하향 포인팅 화살표는 소 콜라겐으로의 제2 면역화 시점을 지적한다.
서열 목록의 간략한 기재
Figure 112021018786221-pat00001

Figure 112021018786221-pat00002
본원에서는 B 세포 활성화 인자 (BAFF; 또한 BLYS, TALL1, THANK, 또는 TNFSF13B로서 공지된) 및 B7-관련된 단백질 1 (B7RP1; 또한 ICOS 리간드, ICOSL, LICOS, B7 동족체 2, B7H2, 및 GL50로서 공지된) 둘다에 결합하고 이를 억제하는 이특이적 단백질, 이들 이특이적 단백질을 암호화하는 핵산, 및 이들 단백질을 제조하고 사용하는 방법이 제공된다. 상기 이특이적 단백질은 BAFF-매개된 B 증식 및 B7RP1-매개된 T 세포 증식 둘다를 억제할 수 있다. 또 다른 양태에서, 상기 이특이적 단백질은 B7RP1이 T 세포에 결합하는 것을 억제할 수 있다. 상기 이특이적 단백질은 2개의 상이한 면역글로불린 중쇄 및 2개의 상이한 면역글로불린 경쇄를 포함하는 IgG 항체일 수 있고, 여기서, 하나의 중쇄/경쇄 쌍은 BAFF에 결합하고 다른 하나는 B7RP1에 결합한다. 대안적으로, 상기 이특이적 단백질의 B7RP1-결합 부분은 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄를 포함하는 IgG 항체를 포함할 수 있고 이특이적 단백질의 BAFF-결합 부분은 임의로 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄의 N-말단, 면역글로불린 중쇄의 카복시 말단을 통해 및/또는 면역글로불린 중쇄의 CH2 및/또는 CH3 영역내에서 항-B7RP1 항체에 융합될 수 있는 하나 이상의 BAFF-결합 펩타이드를 포함할 수 있다.
정의
본원에서 의미된 바와 같은 "항체"는 중쇄 및/또는 경쇄 면역글로불린 가변 영역을 포함하는 단백질이다.
본원에서 의미된 바와 같은 "이특이적" 단백질은 일부 실시형태에서 단백질인 2개의 상이한 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 이특이적 단백질은 BAFF 및 B7RP1 둘다에 결합할 수 있다.
환자는 환자가 임의로 매우 동일한 시점에서 동일한 일반 기간 동안에 2개 이상의 치료제를 투여받는 경우 2개 이상의 치료제와 "동시" 치료를 받는다. 예를 들어, 환자에게 매일 계속되는 기반으로 하나의 치료제를 투여받고 또한 계속되는 기반상에 1개월에 1회 또 다른 치료제를 투여받는 경우 상기 환자는 이들 2개의 약물을 동시에 투여받는 것이다. 유사하게, 2개의 상이한 치료제를 2주 마다 각각 투여받지만 동일한 날에 투여받지 않는 환자는 2개의 치료제로 동시 치료를 받는다. 추가로, 1주 1회 계속되는 기반상에 하나의 치료제를 투여받고 단지 3일동안 하루에 1회 또 다른 치료제를 투여받는 환자는 짧은 시간 동안 이들 2개의 치료제로 치료를 받는 것이다.
본원에서 의미된 바와 같이, "Fc 영역"은 하나 이상의 디설파이드 결합에 의해 연결된 2개의 폴리펩타이드 쇄로 이루어진 이량체이고, 각각의 쇄는 힌지 도메인 + CH2 및 CH3 도메인의 일부 또는 전부를 포함한다. 폴리펩타이드 쇄 각각은 "Fc 폴리펩타이드 쇄"로서 언급된다. 보다 구체적으로, 본 발명과 함께 사용하기 위해 고려된 Fc 영역은 포유동물, 예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 Fc 영역일 수 있는 IgG Fc 영역이다. 인간 IgG1 Fc 영역 중에서, 2개 이상의 대립형질유전자형은 공지되어 있다. Fc 폴리펩타이드 쇄의 아미노산 서열은 포유동물 Fc 폴리펩타이드 아미노산 서열과 비교하여 20, 15, 12, 10, 8, 5, 또는 3개 이하의 치환, 삽입 또는 단일 아미노산의 결실에 의해 포유동물 Fc 폴리펩타이드 서열로부터 다양할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, Fc 폴리펩타이드 쇄의 아미노산 서열은 10개 이상의 삽입, 결실 또는 서열의 100개 아미노산 당 단일 아미노산의 치환에 의해 공지되거나 천연에 존재하는 Fc 폴리펩타이드 쇄의 서열로부터 다양할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 변이는 동종이량체 보다는 이종이량체의 형성을 촉진시키는 "이종이량체화 변화"일 수 있다. Fc 폴리펩타이드 쇄내 특정 위치들을 언급하는데 있어서, 하기 표 1에서 인간 IgG Fc 폴리펩타이드 쇄의 정렬에서 설명되는 바와 같이 상기 EU 넘버링 시스템(Edelman et al. (1969), Proc. Natl. Acad. Sci. 63: 78-85)이 사용된다.
표 1: 인간 IgG Fc 영역의 아미노산 서열의 정렬
Figure 112021018786221-pat00003
일부 위치에서, 천연의 다형성이 일어날 수 있다. 예를 들어, 상기 소정의 IgG2 서열에서 282번 위치에서 메티오닌은 천연의 IgG2 서열에서는 보다 전형적으로 발린이다. 유사하게, IgG3 서열에서 296번 위치에서의 티로신은 또한 페닐알라닌일 수 있다.
"이종이량체화 변화"는 일반적으로 이종이랑체 중쇄 이량체, 즉 동일한 아미노산 서열을 갖지 않는 이량체화된 중쇄의 형성을 촉진시키는, CH3 영역내에서 2개의 상이한 IgG 중쇄의 변화를 언급한다. 이종이량체화 변화는 비대칭일 수 있고, 즉, 특정 변화를 갖는 하나의 중쇄는 상이한 변화를 갖는 또 다른 중쇄와 쌍을 이룰수 있다. 이들 변화는 이종이량체화를 촉진시키고 동종이량체화가 일어나지 않도록 한다. 상기 쌍을 이룬 이종이량체화 변화의 하나의 예는 소위 "크놉 및 홀" 치환이다. 예를 들어, 문헌[미국 특허 제7,695,936호 및 미국 특허원 공보 제2003/0078385호]를 참조, 상기 돌연변이를 기재하는 이의 일부가 본원에 참조로 인용된다. 본원에 의미된 바와 같이, 1개 쌍의 크놉 및 홀 치환을 함유하는 중쇄-중쇄 쌍은 하나의 중쇄에서는 1개의 치환 및 다른 중쇄에서는 또 다른 치환을 포함한다. 예를 들어, 하기의 크놉 및 홀 치환은 비변형된 중쇄와 함께 발견되는 것과 비교하여 이종이량체 형성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다: 1) 하나의 쇄에서 Y407T 및 다른 쇄에서 T366Y; 2) 하나의 쇄에서 Y407A 및 다른 쇄에서 T366W; 3) 하나의 쇄에서 F405A 및 다른 쇄에서 T394W; 4) 하나의 쇄에서 F405W 및 다른 쇄에서 T394S; 5) 하나의 쇄에서 Y407T 및 다른 쇄에서 T366Y; 6) 하나의 쇄에서 T366Y 및 F405A, 및 다른 쇄에서 T394W 및 Y407T; 7) 하나의 쇄에서 T366W 및 F405W, 및 다른 쇄에서 T394S 및 Y407A; 8) 하나의 쇄에서 F405W 및 Y407A, 및 다른 쇄에서 T366W 및 T394S; 및 9) Fc의 하나의 폴리펩타이드에서 T366W 및 다른 폴리펩타이드에서 T366S, L368A, 및 Y407V. 본원에 의미된 바와 같이, Fc 폴리펩타이드에서 돌연변이는 하기의 방식으로 나타낸다. EU 넘버링 시스템(이는 문헌(참조: Edelman et al. (1969), Proc. Natl. Acad. Sci. 63: 78-85)에서 제공되는)을 사용한 CH3 영역에서 소정의 위치에 정상적으로 존재하는 아미노산(1문자 코드를 사용하는)은 EU 위치 번호가 뒤따르고 상기 위치에 존재하는 또 다른 아미노산이 이어진다. 예를 들어, Y407T는 EU 위치 407에 정상적으로 존재하는 티로신이 트레오닌으로 대체됨을 의미한다. 명백히 하기 위해, 넘버링의 EU 시스템은 하기 표 1에서 설명된다. 대안적으로 또는 상기 변화에 추가로 새로운 디설파이드 브릿지를 생성시키는 치환은 이종이량체 형성을 촉진시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌[미국 특허원 공보 제2003/0078385호, 상기 돌연변이를 기재하는 이의 일부는 본원에 참조로서 인용된다]을 참조. IgG1 Fc 영역내 상기 변화는 예를 들어, 하기의 치환을 포함한다: 하나의 Fc-폴리펩타이드 쇄에서 Y349C 및 다른 쇄에서 S354C; 하나의 Fc-폴리펩타이드 쇄에서 Y349C 및 다른 쇄에서 E356C; 하나의 Fc-폴리펩타이드 쇄에서 Y349C 및 다른 쇄에서 E357C; 하나의 Fc-폴리펩타이드 쇄에서 L351C 및 다른 쇄에서 S354C; 하나의 Fc-폴리펩타이드 쇄에서 T394C 및 다른 쇄에서 E397C; 또는 하나의 Fc-폴리펩타이드 쇄에서 D399C 및 다른 쇄에서 K392C. 유사하게, 예를 들어 CH3-CH3 계면에서 하나 이상의 잔기의 하전을 변화시키는 치환은 상기 치환을 기재하는 부분이 본원에 참조로서 인용되는 WO2009/089004에서 설명된 바와 같이 이종이량체 형성을 증진시킬 수 있다. 상기 치환은 "하전 쌍 치환"으로서 언급되고 하전 쌍 치환들의 한 쌍을 함유하는 Fc 영역은 하나의 중쇄에 하나의 치환 및 다른 중쇄에 상이한 치환을 함유한다. 하전 쌍 치환의 일반적인 예는 다음을 포함한다: 1) 하나의 쇄에서 R409D, R409E, K409D, 또는 K409E + 다른 쇄에서 D399K 또는 D399R; 2) 하나의 쇄에서 N392D, N392E, K392D, 또는 K392E + 다른 쇄에서 D399K 또는 D399R; 3) 하나의 쇄에서 K439D 또는 K439E + 다른 쇄에서 E356K, E356R, D356K, 또는 D356R; 및 4) 하나의 쇄에서 K370D 또는 K370E + 다른 쇄에서 E357K 또는 E357R. 추가로, 양쪽 쇄에서 치환 Q355D, Q355E, R355D, R355E, K360D, 또는 K360R은 다른 이종이량체화 변화와 함께 사용되는 경우 이종이량체를 안정화시킬 수 있다. 특이적 하전 쌍 치환은 단독으로 또는 다른 하전 쌍 치환과 함께 사용될 수 있다. 하전 쌍 치환 및 이의 조합의 단일쌍의 특정 예는 다음을 포함한다: 1) 하나의 쇄에서 K409E + 다른 쇄에서 D399K; 2) 하나의 쇄에서 K409E + 다른 쇄에서 D399R; 3) 하나의 쇄에서 K409D + 다른 쇄에서 D399K; 4) 하나의 쇄에서 K409D + 다른 쇄에서 D399R; 5) 하나의 쇄에서 K392E + 다른 쇄에서 D399R; 6) 하나의 쇄에서 K392E + 다른 쇄에서 D399K; 7) 하나의 쇄에서 K392D + 다른 쇄에서 D399R; 8) 하나의 쇄에서 K392D + 다른 쇄에서 D399K; 9) 하나의 쇄에서 K409D 및 K360D + 다른 쇄에서 D399K 및 E356K; 10) 하나의 쇄에서 K409D 및 K370D + 다른 쇄에서 D399K 및 E357K; 11) 하나의 쇄에서 K409D 및 K392D + 다른 쇄에서 D399K, E356K, 및 E357K; 12) 하나의 쇄에서 K409D 및 K392D, 및 다른 쇄에서 D399K; 13) 하나의 쇄에서 K409D 및 K392D + 다른 쇄에서 D399K 및 E356K; 14) 하나의 쇄에서 K409D 및 K392D + 다른 쇄에서 D399K 및 D357K; 15) 하나의 쇄에서 K409D 및 K370D + 다른 쇄에서 D399K 및 D357K; 16) 하나의 쇄에서 D399K + 다른 쇄에서 K409D 및 K360D; 및 17) 하나의 쇄에서 K409D 및 K439D + 다른 쇄에서 D399K 및 E356K. 이들 임의의 이종이량체화 변화는 본원에 기재된 바와 같이 면역글로불린 IgG 중쇄의 일부일 수 있다.
본원에서 의미된 바와 같은 "인간" 항체 또는 단백질은 인간 기원의 핵산 서열에 의해 암호화된 항체 또는 단백질이다. 인간 항체 또는 단백질은 배양된 비-인간 세포에서 또는 인간 항체 또는 단백질을 암호화하는 핵산 분자가 도입된 유전자전이 유기체에서 생체내 제조될 수 있다. 대안적으로, 인간 항체 또는 단백질은 배양된 인간 세포 또는 인간 생체내에서 제조될 수 있다.
본원에 의미된 바와 같은 "IgG 항체"는 대부분의 천연 IgG 항체에 존재하는 면역글로불린 도메인, 즉, 중쇄 가변 (VH) 영역, 제1 중쇄 불변(CH1) 영역, 힌지 영역, 제2 중쇄 불변(CH2) 영역 및 제3 중쇄 불변(CH3) 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 (VL) 영역 및 경쇄 불변(CL) 영역을 포함하는 경쇄로 필수적으로 이루어진 항체이다. 상기 면역글로불린 도메인의 수많은 서열이 과학적 문헌[참조: 예를 들어, SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, Public Health Service, N.I.H., Bethesda, MD, 1991] 전반에 보고되었다. 본원에 의미된 바와 같은 IgG 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 필수적으로 이루어진 4량체이다. 예를 들어, 낙타 및 상어에서 발견되는 바와 같이 2개의 면역글로불린 중쇄만을 포함하고 어떠한 면역글로불린 경쇄를 포함하지 않는 천연 항체(참조: 예를 들어, Muyldermans et al., 2001, J. Biotechnol. 74:277-302; Desmyter et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:26285-90; Streltsov et al. (2005), Protein Science 14: 2901-2909)는 본원에서 의미된 바와 같은 "IgG 항체"가 아니다. IgG 항체는 인간일 수 있거나 또 다른 종으로부터 기원할 수 있다. 추가로, IgG 항체는 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5개 이하의 치환, 삽입 및/또는 천연 IgG 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노산 서열에 비해 단일 아미노산의 결실을 포함할 수 있다.
"면역글로불린 중쇄"는 IgG, IgA, IgM, IgE, 또는 IgD 항체의 중쇄 또는 40, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5개 이하의 삽입, 결실 또는 천연으로부터 기원하는 핵산 서열에 의해 암호화된 면역글로불린 중쇄에 비해 단일 아미노산의 치환을 포함하는 변이체를 언급한다. "면역글로불린 IgG 중쇄"는 IgG 항체 또는 40, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5개 이하의 삽입, 결실 또는 천연 기원의 핵산 서열에 의해 암호화된 IgG 중쇄의 아미노산 서열에 비해 단일 아미노산의 치환을 포함하는 이의 변이체로 제한된다. 면역글로불린 중쇄는 다수의 독특한 영역들 또는 VH 영역, CH1 영역, 힌지 영역, CH2 영역, 및 CH3 영역을 포함하는 도메인들로 필수적으로 이루어진다. 일부 다른 이소형, 즉, IgM 및 IgA에서, 추가의 영역들은 CH3 영역으로부터 다운스트림에 포함된다. 면역글로불린 중쇄 및 거기에 포함된 영역들은 일반적으로 예를 들어, 본원에 참조로서 인용되는 문헌[참조: Carayannopoulos and Capra, Immunoglobulins: Structure and Function, pp. 283-314 in FUNDAMENTAL I MMUNOLOGY, 3rd Ed, Paul, ed., Raven Press, New York, 1993]에 기재되어 있다. 추가로, 면역글로불린 중쇄의 서브영역의 수많은 서열은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD, 1991]을 참조. 일부 경우에, 면역글로불린 중쇄 + 일부 비-면역글로불린 서열을 포함하는 폴리펩타이드 쇄는 본원에서 "중쇄"로서 언급된다.
본원에 의미된 바와 같은 "면역글로불린 경쇄"는 인간 항체 또는 또 다른 종 기원의 항체로부터 기원하는 카파 또는 람다 쇄이다. 또한 본원에 의미된 바와 같은 면역글로불린 경쇄 중에 포함되는 것은 20, 15, 10, 또는 5개 이하의 삽입, 결실 및/또는 천연 기원의 핵산 서열에 의해 암호화된 면역글로불린 경쇄에 비해 단일 아미노산의 치환을 갖는 단백질이다. 면역글로불린 경쇄는 일반적으로, 예를 들어, 본원에 참조로서 인용되는 문헌[참조: Carayannopoulos and Capra, Immunoglobulins: Structure and Function, pp. 283-314 in FUNDAMENTAL IM MUNOLOGY, 3rd Ed, Paul, ed., Raven Press, New York, 1993]에 기재되어 있다. 면역글로불린 경쇄는 VL 영역 및 CL 영역을 포함한다. 이들 영역 중 수개의 서열은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD, 1991]을 참조. 일부 경우에, 면역글로불린 경쇄 + 일부 비-면역글로불린 서열을 포함하는 폴리펩타이드 쇄는 본원에서 "경쇄"로서 언급된다.
본원에서 의미된 바와 같은 "면역글로불린 가변 영역"은 인간 기원 또는 또 다른 종 기원일 수 있는 VH 또는 VL 영역이다. 면역글로불린 가변 영역들은 일반적으로 예를 들어, 본원에 참조로서 인용되는 문헌[참조: Carayannopoulos and Capra, Immunoglobulins: Structure and Function, pp. 283-314 in FUNDAMENTAL IM MUNOLOGY, 3rd Ed, Paul, ed., Raven Press, New York, 1993]에 기재되어 있다. 또한, 본원에 의미된 바와 같은 면역글로불린 가변 영역 중에 포함되는 것은 20, 15, 10, 또는 5개 이하의 삽입, 결실, 및/또는 천연 기원의 핵산 서열에 의해 암호화된 면역글로불린 가변 영역에 비해 단일 아미노산의 치환을 갖는 단백질이다. 면역글로불린 가변 영역은 상보성 결정 영역 1(CDR1), 상보성 결정 영역 2(CDR2) 및 상보성 결정 영역 3(CDR3)으로서 공지된 3개의 초가변 영역을 함유한다. 이들 영역들은 항체의 항원 결합 부위를 형성한다. 상기 CDR은 덜 가변 골격 영역(FR1-FR4)내에 매립되어 있다. 가변 영역내 이들 서브영역의 순서는 다음과 같다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. 면역글로불린 가변 영역의 수많은 서열은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD, 1991]을 참조.
CDR은 하기의 방식으로 VH 영역 서열에 위치할 수 있다. CDR1은 성숙한 VH 영역의 대략 31번 잔기에서 시작하고 일반적으로 약 5 내지 7개 아미노산 길이이고 여기서 이전의 서열은 거의 항상 Cys-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx (서열번호: 20) (여기서, "Xxx"는 임의의 아미노산이다). 중쇄 CDR1에 뒤따르는 잔기는 거의 항상 트립토판, 흔히 Trp-Val, Trp-Ile, 또는 Trp-Ala이다. 14개의 아미노산들은 거의 항상 CDR1에서의 마지막 잔기와 CDR2에서의 첫번째 잔기 사이에 있고 CDR2는 전형적으로 16개 내지 19개 아미노산을 함유한다. CDR2에 바로 이전에는 Leu-Glu-Trp-Ile-Gly (서열번호: 21)이 있고 바로 다음의 서열은 Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala일 수 있다. 다른 아미노산은 CDR2에 선행하거나 후속적일 수 있다. 32개의 아미노산은 거의 항상 CDR2에서의 마지막 잔기와 CDR3에서의 첫번째 잔기 사이에 있고, CDR3은 약 3 내지 25개 잔기 길이일 수 있고. Cys-Xxx-Xxx는 거의 항상 CDR3에 바로 선행하고, Trp-Gly-Xxx-Gly(서열번호: 22)는 거의 항상 CDR3에 뒤따른다.
경쇄 CDR은 다음의 방식으로 VL 영역에 위치할 수 있다. CDR1은 성숙한 항체의 대략 잔기 24번에서 개시하고 일반적으로 약 10 내지 17개 잔기 길이이다. 여기에서 거의 항상 Cys가 선행한다. CDR1의 마지막 잔기와 CDR2의 첫번째 잔기 사이에는 거의 항상 15개 아미노산 잔기가 있고 CDR2는 거의 항상 7개 잔기 길이이다. CDR2는 전형적으로 Ile-Tyr, Val-Tyr, Ile-Lys, 또는 Ile-Phe이 선행한다. CDR2와 CDR3 사이에는 거의 항상 32개 잔기가 있고, CDR3은 일반적으로 약 7개 내지 10개 아미노산 길이이다. CDR3은 거의 항상 Cys가 선행하고 일반적으로 Phe-Gly-Xxx-Gly (서열번호: 23)가 뒤따른다.
본원에 의미된 바와 같은 "링커"는 2개의 폴리펩타이드를 연결하는 펩타이드이다. 링커는 길이가 1 내지 80개 아미노산 일 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커는 2-40, 3-30, 또는 3-20개 아미노산 길이일 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커는 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 또는 5개 이하의 아미노산 길이의 펩타이드일 수 있다. 다른 실시형태에서, 링커는 5-25, 5-15, 10-20, 또는 20-30개 아미노산 길이일 수 있다. 다른 실시형태에서, 링커는 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 아미노산 길이일 수 있다. 많은 경우에, 링커는 유리된 시스테인 잔기(즉 디설파이드 결합에 관여하지 않는)가 없고 또한 N-당화 부위(즉, Asn-Xxx-Ser/Thr (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산일 수 있다))를 포함하지 않는다.
본원에 의미된 바와 같은 "펩티바디"는 Fc 영역에 융합된 하나 이상의 생물학적 활성 펩타이드이다[문헌참조: Shimamoto et al., (2012), mAbs 4(5): 586-591, 펩티바디의 구조를 설명하고 이의 제조 방법에 관한 기재 부분이 본원에 참조로 인용된다].
본원에 의미된 바와 같은 "펩타이드"는 당화될 수 있거나 없고/없거나 변형된 아미노산 서열을 함유하거나 함유하지 않을 수 있는 짧은 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드이다. 펩타이드는 2 내지 75개 아미노산 길이일 수 있다. 일부 실시형태에서, 펩타이드는 3-60, 3-50, 3-40, 3-30, 또는 3-20개 아미노산 길이이다. 다른 실시형태에서, 펩타이드는 5-25, 5-15, 10-20, 또는 20-30개 아미노산 길이일 수 있다. 다른 실시형태에서, 펩타이드는 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 아미노산 길이일 수 있다.
질환을 치료하기 위해 사용되는 약물의 "치료학적 유효량"은 질환의 중증도를 감소시킬 수 있거나, 질환 또는 이의 치료와 관련된 하나 이상의 증상의 증증도를 감소시키거나 치료된 병태 후 일부 빈도수로 일어날 수 있는 보다 심각한 질환의 발병을 지연시킬 수 있는 양이다.
본원에 언급된 임의의 질환의 "치료"는 질환의 하나 이상의 증상의 완화, 질환의 중증도의 감소 또는 일부 경우에 질환 또는 하나 이상의 다른 질환을 수반할 수 있는 보다 심각한 증상으로의 질환 진행의 지연 또는 예방을 포함한다. 치료는 질환이 총체적으로 치유됨을 의미할 필요는 없다. 유용한 치료제는 단지 질환의 중증도를 감소시키거나, 질환 또는 이의 치료와 관련된 하나 이상의 증상의 중증도를 감소시키거나, 치료된 병태 후 일부 빈도로 일어날 수 있는 보다 심각한 증상 또는 보다 심각한 질환의 발병을 지연시킬 필요가 있다. 예를 들어, 질환의 염증성 장 질환인 경우, 치료로서 사용되는 치료학적 제제는 장내 염증의 특유 부위 수 또는 환부 장의 전체 정도를 감소시킬 수 있다. 이것은 통증 및/또는 종창을 감소시킬 수 있거나, 설사, 변비 또는 구토와 같은 증상을 감소시키고/시키거나 장의 천공을 예방할 수 있다. 환자의 병태는 바륨 관장 또는 고위관장법 후 수행되는 x-선, 내시경, 대장내시경 및/또는 생검과 같은 표준 기술에 의해 평가될 수 있다. 적합한 과정은 환자의 병태 및 증상에 따라 다양하다. 유사하게, 치료된 질환이 전신성 홍반성 낭창(SLE)인 경우, 질환 활성은 하기 설명된 바와 같이 스코어링을 위한 SLEDAI 지수를 사용하여 평가할 수 있다.
BAFF 및 B7RP1에 결합하는 이특이적 단백질
본원에서는 B7RP1 및 BAFF에 결합하고/하거나 시험관내에서 B7RP1-매개된 T 세포 증식 및 BAFF-매개된 B 세포 증식을 억제할 수 있는 이특이적 단백질이 제공된다. 본원에 기재된 바와 같이 이특이적 단백질이 결합하는 BAFF 및 B7RP1 단백질은 인간 단백질일 수 있고/있거나 무엇보다 시노몰구스 몽키, 레서스 몽키, 침팬지, 마우스 및/또는 토끼와 같은 또 다른 종 기원의 단백질일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 이특이적 단백질은 예를 들어, 인간 (호모 사피엔스) 및 시노몰구스 몽키(마카카 파스시쿨라리스(Macaca fascicularis)) B7RP1 및 BAFF 단백질 둘다에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 이들 특이적 단백질은 이특이적 IgG 항체일 수 있고, 여기서, B7RP1-결합 부분 및 BAFF-결합 부분 각각은 면역글로불린 IgG 중쇄 및 면역글로불린 경쇄로 필수적으로 이루어져 있다. 따라서, 상기 이특이적 항체는 2개의 상이한 면역글로불린 중쇄 및 2개의 상이한 면역글로불린 경쇄를 포함한다. 종합하여, 이들 2개 쌍의 면역글로불린 중쇄 및 경쇄는 완전한 이특이적 IgG 항체를 형성한다. 이특이적 IgG 항체는 당업계에 공지되어 있고, 다수의 다른 포맷의 이특이적 항체는 또한 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Kontermann, Bispecific Antibodies: Developments and Current Perspectives, pp. 1-28 in BISPECIFIC ANTIBODIES, Kontermann, ed., Springer-Verlag, Berlin, Heidelburg, 2011, 이들 항체를 기재하는 부분이 본원에 참조로 인용된다]을 참조. 포맷과는 상관없이 BAFF 및 B7RP1에 결합할 수 있는 항체가 본원에서 고려된다. 이특이적 IgG 항체는 인간, 인간화된 또는 키메라일 수 있고 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 이소형일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이특이적 IgG 항체는 다른 모이어티에 접합될 수 있다. 항-BAFF 및 항-B7RP1의 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[미국 특허 제7,737,111호 및 미국 특허원 공보 제US 2011/0117093호]을 참조. 상기 항체를 기재하는 상기 문헌들의 일부는 본원에 참조로서 인용된다. 일부 실시형태에서, 상기 이특이적 항체는 이종4량체 이특이적 IgG 항체의 형성을 촉진시키는 하전 쌍 치환을 포함하는, 상기 정의된 바와 같은 "이종이량체화 변화"를 포함할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 이특이적 단백질은 면역글로불린 IgG 중쇄 및 면역글로불린 경쇄를 포함하는, B7RP1에 결합하는 항체 및 BAFF에 결합하는 펩타이드를 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 상기 BAFF-결합 펩타이드는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 16개 까지의 카피물과 같이 하나 또는 수개의 카피물로 존재할 수 있다. BAFF-결합 펩타이드는 많은 다른 가능한 종 중에서 마우스, 시노몰구스 몽키 및 인간과 같은 종 기원의 BAFF 단백질에 결합할 수 있다. 상기 항체는 항-B7RP1 IgG 항체일 수 있고, 임의로 인간 및/또는 시노몰구스 몽키 B7RP1에 결합하는 인간 또는 인간화된 항체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커는 항-B7RP1 IgG 항체의 중쇄의 C 말단에 부착될 수 있고 이어서, 또 다른 링커인 제1 BAFF-결합 펩타이드 및 제2 BAFF-결합 펩타이드에 부착될 수 있다. 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8 또는 16개까지의 BAFF-결합 펩타이드는 임의로 링커가 산재되어 있는 상기 2개에 후속할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 BAFF-결합 펩타이드는 항-B7RP1 항체의 그밖의 다른 곳, 예를 들어, 면역글로불린 중쇄 또는 면역글로불린 경쇄의 N 말단에서 또는 CH2 또는 CH3 영역의 루프 영역에 삽입될 수 있다. 상기 IgG 항체는 인간 또는 뮤린 항체와 같은 포유동물 항체일 수 있다. 상기 항-B7RP1 항체는 인간 또는 인간화된 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체일 수 있다. 항-B7RP1 IgG 항체를 포함하는 상기 이특이적 융합 단백질에서, 상기 이특이적 단백질은 서열번호: 17 또는 서열번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 포함할 수 있다. 30, 25, 20, 15, 10, 5, 또는 3개 이하의 삽입, 결실, 또는 서열번호: 17 또는 18에 비해 단일 아미노산의 치환을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 변이체가 고려된다. 유사하게, 20, 15, 10, 8, 7, 5, 또는 3개 이하의 삽입, 결실 또는 서열번호: 19에 비해 단일 아미노산의 치환을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄를 포함하는 변이체가 고려된다. 상기 이특이적 단백질은 서열번호: 17 또는 18의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 폴리펩타이드 또는 이의 변이체 및 서열번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄 또는 이의 변이체를 포함하는 4량체일 수 있다.
상기된 바와 같은 이특이적 융합 단백질의 BAFF-결합 펩타이드 부분은 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 BAFF-결합 펩타이드는 미국 특허 제7,737,111호에 기재되어 있고 이의 관련 부분이 본원에 참조로서 인용된다. 일부 실시형태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16개 카피의 상기 BAFF-결합 펩타이드가 이특이적 단백질에 존재할 수 있다. BAFF-결합 펩타이드는 예를 들어, 링커를 통해 항-B7RP1 항체의 카복시 말단에 부착될 수 있다. 예를 들어, 항-B7RP1 IgG 항체의 카복시 말단에 이어서 예를 들어, Gly-Gly-Gly-Gly (서열번호: 4)의 아미노산 서열을 갖는 링커가 후속할 수 있다. 다른 적합한 링커의 예는 무엇보다 Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Ser (서열번호: 37), Gly-Gly-Gly-Pro (서열번호: 38), Gly-Gly-Gly-Gln (서열번호: 39), 및 Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (서열번호: 40)을 포함한다. 상기 링커에 이어서 BAFF-결합 펩타이드가 후속할 수 있다. 상기 BAFF-결합 펩타이드에 이어서 예를 들어, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7 또는 서열번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 또 다른 링커가 후속할 수 있다. 다른 링커가 또한 사용될 수 있다. 상기 링커에 이어서 예를 들어, 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 또 다른 BAFF-결합 펩타이드가 후속할 수 있다.
상기 직전에 기재된 이특이적 융합 단백질에서 또는 상기된 이특이적 이종사량체성 IgG 항체에서, VL 영역은 각각 서열번호: 8, 서열번호: 9 및 서열번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함할 수 있다. VH 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열번호: 11, 서열번호: 12 및 서열번호: 13의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, IgG 항체의 VL 영역은 서열번호: 14의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고, VH 영역은 서열번호: 15의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 상기 변이체 서열은 10개 이하의 결실 또는 표준 서열과 비교하여 100개의 아미노산 당 단일 아미노산의 치환 삽입을 포함할 수 있다.
링커를 포함하는 단백질
본원에서는 링커를 함유하는 단백질상에 바람직한 물리적 성질을 부여하는 서열번호: 5, 6 또는 7의 아미노산 서열을 갖는 링커가 제공된다. 하기 실시예 1에 보여지는 바와 같이, 2개의 특정 링커, 즉, 서열번호: 6 및 서열번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 링커의 사용은 이특이적 분자의 발현, 안정성 및 점성과 같은 성질에 대해 양성 효과를 나타냈다. 따라서, 상기 링커를 함유하는 다양한 단백질은 다른 링커를 함유하는 유사 단백질과 비교하여 상기 바람직한 성질을 가질 수 있다.
이특이적 단백질의 치료학적 용도
본원에 기재된 BAFF 및 B7RP1에 결합하는 이특이적 단백질은 다양한 징후, 특히 자가-항체에 의해 구동되는 병태 및/또는 T 세포 및 B 세포 둘다에 의해 매개되는 병태에 대한 치료제로서 사용될 수 있다. 상기 병태는 예를 들어, SLE, 낭창, 신염, ANCA-양성 혈관염, 류마티스 관절염(RA), 피부근염, 다발성 근염, 크론 질환, 궤양성 장염 및 셀리악 질환과 같은 위장관 질환, 천포창, 유사천포창, 및 아급성 피부 홍반성 낭창(SCLE)과 같은 피부 상태, 다발성 경화증 및 만성 염증 탈수초 다발성신경병증(CIDP)와 같은 신경계 질환, 중증 근무력증과 같은 신경근 질환, 굿파스처 증후군(Goodpasture's syndrome) 및 사구체신염과 같은 신장을 포함하는 질환, 자가면역 용혈성 빈혈(AIHA), 특발성 혈소판감소성 자반병(ITP), 및 자가면역 호중구감소증과 같은 혈액학적 병태, 만성 활성 간염 및 1차 담도성 경화증과 같은 간 병태, 쇼그렌 증후군, 전신성 경화증, 및 하시모토 갑상선염, 그레이브 질환(Graves' disease), 애디슨 질환(Addison's disease), 및 다발성 내분비 자가면역 부전증(통상적으로 당뇨, 갑상선 기능 저하증, 애디슨 질환 및 생식선 부전증)을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 치료학적 유효량의 이특이적 단백질은 상기 병태를 치료하기 위한 임의의 이들 병태를 앓는 환자에게 투여될 수 있다.
하나의 실시형태에서, BAFF-매개된 B 세포 증식 및 B7RP1-매개된 T 세포 증식을 억제할 수 있는 이특이적 단백질은 SLE를 앓는 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다. SLE는 핵 자가 항원에 대한 자가 반응성으로 나타나는 비공지된 병인학의 자가면역 질환이다. 이의 임상적 증상은 너무 다양하여 이것이 진실로 단일 질환인지 또는 관련 병태 그룹인지가 의심스럽다(문헌참조: Kotzin (1996) Systemic lupus erythematosus. Cell 85: 303-306; Rahman and Isenberg (2008), Systemic lupus erythematosus. N. Engl. J. Med. 358: 929-939). 증상은 하기를 포함할 수 있다: 권태감, 피곤, 열병, 식욕부진증 및 체중 손실과 같은 항상성 증상; 성인에서 급성 일시적 안면 발진, 수포성 질환 및 두경부의 만성 및 흉한 발진을 포함하는 다양한 피부 증상; 관절염; 근통 및/또는 쇠약; 심혈관 증상, 예를 들어, 승모판 비후, 식물증식, 구토, 협착증, 심낭염, 및 허혈 심장 질환(이의 일부는 뇌졸중에서 절정기에 이를 수 있는), 색전 질환, 심장 부전증, 감염성 심내막염 또는 판막 부전증; SLE에서 병적 상태의 주요 원인인 신염; 인지 기능부전, 우울증, 정신병, 혼수, 발작 장애, 편두통 및 다른 투통 증후군, 무균성 수막염, 무도증, 뇌졸중 및 두개골 신경병증을 포함하는 신경학적 증상; 백혈구 감소증, 혈소판 감소증, 장막염, 빈혈, 응고 비정성, 비종, 및 임파선염을 포함하는 혈구학적 증상; 및 다양한 위장관 비정상[문헌참조: Id; Vratsanos et al, "Systemic Lupus Erythematosus," Chapter 39 in Samter's Immunological Diseases, 6th Edition, Austen et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Phiiladelphia, PA, 2001]. 증상의 중증도는 질환 과정에서와 같이 광범위하게 다양하다. SLE는 치명적일 수 있다.
SLE 환자는 SLE에 대한 기존 치료제를 사용한 치료 전, 후 또는 이와 동시에 BAFF 및 B7RP1을 억제하는 이특이적 단백질로 치료될 수 있다. SLE에 대한 상기 기존의 치료제는 코르티코스테로이드, 예를 들어, 프레드니손, 프레드니솔론 및 메틸프레드니솔론, 항말라리아제, 예를 들어, 하이드록시클로로퀸, 퀴나크린 및 클로로퀸, 레티노산, 아스피린 및 다른 비스테로이드성 소염 약물(NSAID), 사이클로포스파미드, 데하이드로에피안드로스테론, 미코페놀레이트 모페틸, 아자티오프린, 클로람부실, 메토트렉세이트, 타크롤리무스, 답손, 탈리도미드, 레플루노미드, 사이클로스포린, 벨리무맙, 항-CD20 항체, 예를 들어, 리툭시맙 및 융합 단백질, 예를 들어, 아바타셉트를 포함한다.
SLE 환자들의 질환 활성은 중증도에 따라 가중되는 하기의 증상을 고려하는 질환 활성에 대한 스코어를 제공하는 전신성 홍반 낭창 질환 활성 지수(SLEDAI)와 같은 기구를 사용하여 등급화될 수 있다: 발작, 정신병, 기관 뇌 증후군, 가시적 장애, 두개골 신경 장애, 낭창성 두통, 혈관염, 관절염, 근염, 요원주, 혈뇨, 단백뇨, 농뇨, 새로운 발진, 탈모증, 점막 궤양, 흉막염, 심낭염, 낮은 보체, 증가된 DNA 결합, 열병, 혈소판 감소증, 및 백혈구 감소증[문헌참조: Bombardier et al. (1992), Arthr. & Rheum. 35(6): 630-640, 이의 관련 부분은 본원에 참조로서 인용된다]. 본원에 기재된 치료는 SLEDAI에 의해 측정된 바와 같이 SLE의 증상을 완화시키거나 제거하는데 유용할 수 있다. 본원에 기재된 치료 방법은 본원에 기재된 바와 같이 이특이적 단백질을 사용한 치료 개시 전 동일한 환자에 대한 기준선 값과 비교하여 환자의 SLEDAI 스코어를 개선시킬 수 있다.
SLE에서 질환 활성을 평가하기 위한 또 다른 방법은 치료할 의사의 의도 원칙을 기준으로 SLE 환자에 대한 질환 활성 평가 시스템인 영국 섬 낭창 평가 그룹(BILAG) 지수이다[문헌참조: Stoll et al. (1996), Ann. Rheum Dis. 55: 756-760; Hay et al. (1993), Q. J. Med. 86: 447-458]. BILAG를 기재하는 이들 참조 부분이 참조로서 본원에 인용된다. BILAG 스코어는 8개의 기관 기반 시스템, 일반(예를들어, 열병 및 피곤), 점막(예를 들어, 다른 많은 증상 중에서 발진 및 탈모증), 신경학적(예를 들어, 많은 다른 증상 중에서 발작, 편두통 및 정신병), 근골격(예를 들어, 관절염), 심호흡기(예를 들어, 심장 부전증 및 감소된 폐 기능), 혈관염 및 혈전증, 신장(예를 들어, 신염) 및 혈액학에서 별도의 수치 또는 알파벳 질환 황성 스코어에 의해 할당된다. Id. 본원에 기재된 치료는 본원에 기재된 바와 같은 이특이적 단백질을 사용한 치료의 개시 전에 기준선 값과 비교하여 환자의 BILAG 스코어를 감소시키는데 있어서 또는 BILAG 지수에 의한 측정시 SLE의 증상을 완화시키거나 제거시키는데 유용할 수 있다.
B 세포의 BAFF-매개된 증식 및 T 세포의 B7RP1 매개된 증식을 억제하는 본원에 기재된 이특이적 단백질은 또한 류마티스 관절염(RA)을 치료하기 위해 사용될 수 있다. RA는 전신성 증상, 및 특정적으로 관절과 관련된 증상을 갖는 만성 질환이다. 증상은 통상적으로 윤활막염을 포함하고 이는 통증스럽고 팽윤된 관절 및 다양한 연구실 비정상, ㅇ예를 들어, 정상보다 높은 수준의 류마티스 인자, 항-시트룰린 변형된 단백질(항-CCP) 항체 및 C-반응성 단백질(CRP) 및 상승된 적혈구 침강율(ESR)을 유도한다. 덜 일반적인 증상은 예를 들어, 건, 연골, 혈관, 심장 및 폐를 포함하는 다양한 관절외 증상을 포함한다. 질환 활성은 흔히 다양한 지수를 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 문헌[참조: Anderson et al. (2012), Arthritis care & Res. 64 (5): 640-647]을 참조하고 상기 지수를 논의하는 부분은 본원에 참조. 상기 스코어링 지수에 포함되는 원소들은 건 관절 수, 팽윤된 관절 수, 기능성 평가 및 다양한 연구소 발견, 예를 들어, CRP, ESR 등을 포함한다.
일부 실시형태에서, RA를 앓는 환자는 RA에 대해 현재 사용중인 약물과의 치료 전, 후 또는 이와 동시에 BAFF-매개된 B 세포 증식 및 B7RP1-매개된 T 세포 증식을 억제하는 이특이적 단백질로 치료될 수 있다. 류마티스 관절염(RA)에 대해 현재 사용중인 치료제는 무엇보다 비-스테로이드 소염 약물(NSAIDs)(예를 들어, 아스피린 및 사이클로옥시게나제-2 (COX-2) 억제제), 질환 변형 소염 약물(DMARD, 예를 들어, 메토트렉세이트, 레플루노미드, 및 설파살라진), 항-말라리아제(예를 들어, 하이드록시클로로퀸), 사이클로포스파미드, D-페니실라민, 아자티오프린, 골드 염, 종양 괴사 인자 억제제(예를 들어, 에타너셉트, 인플릭시맙, 아달리무맙, 골리무맙, 및 세르톨리주맙 페골), CD20 억제제, 예를 들어, 리툭시맙, IL-1 길항제, 예를 들어, 아나킨라, IL-6 억제제, 예를 들어, 토실리주맙, 야누스 키나제의 억제제(JAK, 예를 들어, 토파시티니브), 아바타셉트 및 코르티코스테로이드를 포함한다.
B 세포의 BAFF-매개된 증식 및 T 세포의 B7RP1-매개된 증식을 억제하는, 본원에 기재된 치료학적 유효량의 이특이적 단백질을 또한 사용하여 염증 장 질환, 예를 들어, 크론 질환 또는 궤양성 장염을 치료할 수 있다. 크론 질환은 대부분의 환자에서 비정상적 염증이 회결장, 소장 및 결장-항문직장 영역에 국한된다 할지라도 구강에서 항문까지의 소화관 임의의 일부의 비정상적 염증을 포함한다. 전형적으로, 상기 염증은 불연속이다. 통상의 증상은 복통, 식욕부진, 체중 손실, 열병, 설사, 풍만감 및/또는 복강의 우측 하부 사분면에서 유연함, 변비, 구토, 및 항문주위의 가벼운 통증 및 분비를 포함한다. 다른 가능한 증상은 무엇 보다 말초 관절염, 성장 지체, 상공막염, 아프타성 구내염, 결절성 홍반, 괴저성 농피증, 신장 결석, 손상된 뇨 희석 및 알칼린화, 흡수 불량 및 담석증을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Strober et al., Medical Immunology, 10th Edition, Section III, Ch. 35 (2001); Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17th Edition, Section 3, Ch. 31 (1999)]을 참조. 크론 질환을 갖는 환자로부터 분리된 대식세포는 증가된 양의 IL-12, IFNγ, TNFα, 및 다른 염증 사이토킨을 생성한다.
궤양성 장염은 때때로 크론 질환과 구분하기 어렵지만 여러 관점에서 크론 질환과는 대별된다. 첫번째로, 이것은 일반적으로 결장에 제한되고 크론 질환은 소화관 전반에 걸쳐 일어날 수 있다. 두번째로, 궤양성 장염은 주로 염증이 장의 벽을 통해 또는 소화관내 임의의 위치에서 사방으로 침투할 수 있는 크론 질환과는 다르게 장의 상피층에서만의 염증을 포함한다. 최종적으로, 궤양성 장염은 전형적으로 크론 질환에 전형적인 염증의 불연속 부위 보다는 연속적인 염증 영역을 포함한다. 크론 질환과 같이 궤양성 장염은 주로 도시 지역에서 발견된다. 또한, 유전 인자들이 궤양성 장염에서 관여할 가능성이 있는데 이는 이들 사례들이 가족 집합체에서 나타나기 때문이다. 자가항체는 크론 질환 환자 보다는 더 흔하게 궤양성 장염에서 관찰된다. 상기 자가 항체는 흔히 결장 상피 세포 성분들로 지시된다. 대부분 공통된 것 중에서 카탈라제, α-에놀라제 및 락토페린에 대해 특이성을 갖는 항호중구 세포질 항체가 있다. 일부 경우에, 상기 항체는 결장 미생물과 교차 반응한다.
임상적 시험에서, 크론 질환 활성은 흔히 크론 질환 활성 지수(CDAI)를 사용하여 스코어된다. 상기 CDAI는 (1) 하루 액체 또는 묽은 변의 횟수, (2) 하루 복통 양의 환자 등급, (3) 일반적 건강 상태의 환자 등급, (4) 관절염, 회장염, 포도막염, 결절성 홍반, 괴저성 농피증, 아프타성 구내염, 항문 틈, 누관(fitula), 또는 종기 농양, 다른 누관, 또는 열에 대한 환자이 보고, (5) 설사에 대해 로모틸 또는 다른 오피에이트를 복용했는지의 환자의 보고, (6) 복부 통증, (7) 헤마토크릿 및 (8) 체중을 포함하는 8개 인자들을 기준으로 하는 질환 활성 스코어를 제공한다. 예를 들어, 문헌[Best et al. (1976), Gastroenterol. 70: 439-444]을 참조하고 이의 관련 부분은 본원에 참조.
궤양성 장염의 증상은 다양하다. 이들은 설사, 이급후중, 복부 경련, 혈변 및 변내 점액, 열, 및 직장 출혈을 포함할 수 있다. 결장이 약 6cm 넘어 팽창되고 이의 근육 긴장을 상실하고/하거나 천공되어 잠재적으로 생명을 위협하는 병태인 독성 거대결장이 또한 발생할 수 있다. 궤양성 장염을 수반할 수 있는 다른 증상은 말초 관절염, 강직성 척추염, 천장관절염, 전방 포도막염, 결절성 홍반, 괴저성 농피증, 상공막염, 자가면역 간염, 원발 경화성 담관염, 간경변 및 어린이에서 성장 및 발육 지연을 포함한다.
일부 실시형태에서, 염증 장 질환(IBD), 예를 들어, 크론 질환 또는 궤양성 장염을 앓는 환자는 IBD에 대해 기존의 치료제를 사용한 치료 전, 후 또는 이와 동시에 BAFF 및 B7RP1에 결합하는 이특이적 단백질로 치료될 수 있다. IBD에 대한 기존의 치료제는 예를 들어, 설파살라진, 5-아미노살리실산 및 이의 유도체 (예를 들어, 올살라진, 발살라지드, 및 메살라민), 항-TNF 항체(인플릭시맙, 아달리무맙, 골리무맙, 및 세르톨리주맙 페골을 포함하는), 경구 또는 비경구 투여용 코르티코스테로이드(프레드니손, 메틸프레드니손, 부데소니드 또는 하이드로코르티손을 포함하는), 부신 피질 자극 호르몬, 항생제(메트로니다졸, 시프로플록사신 또는 리팍시민을 포함하는), 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 사이클로스포린, 타크롤리무스 및 탈리도미드를 포함한다.
이특이적 단백질을 암호화하는 핵산
본원에서는 B7RP1-매개된 T 세포 증식 및 BAFF-매개된 B 세포 증식을 억제할 수 있는 이특이적 단백질을 암호화하는 핵산이 제공된다. 예를 들어, 서열번호: 52는 서열번호: 14 및 서열번호: 53의 아미노산 서열을 갖는 VL 영역을 암호화하고 서열번호: 53은 서열번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 암호화한다. 유사하게, 서열번호: 55 및 56은 각각 2개의 BAFF-결합 펩타이드에 융합된 항-B7RP1 항체의 중쇄를 포함하는 폴리펩타이드인 서열번호: 17 및 18의 아미노산 서열을 암호화한다. 서열번호: 57은 상기된 바와 같이 이종사량체성 이특이적 IgG 항체 또는 이특이적 융합 단백질의 일부일 수 있는 항-B7RP1 항체의 경쇄를 암호화한다. 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열을 암호화하는 임의의 핵산 서열이 고려된다. 유사하게, 본원에 기재된 서열과 비해 사일런트 돌연변이를 포함하거나 상기된 아미노산 서열 변이체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 변이체는 또한 본 발명의 영역내에 포함된다. 보다 구체적으로, 10개 이하의 삽입, 결실 또는 본원에 기재된 아미노산 서열 기원의 100개 아미노산 당 단일 아미노산의 치환으로 다양한 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 고려된다.
본원에 기재된 이특이적 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 본원에 제공된 아미노산 서열 및 당업계의 지식을 기반으로 당업자에 의해 결정될 수 있다. 특정 아미노산 서열을 암호화하는 클로닝된 DNA 절편을 생성시키는 보다 통상적인 방법에 추가로, 무엇보다 DNA 2.0 (Menlo Park, CA, USA) 및 블루헤론(BlueHeron) (Bothell, WA, USA)과 같은 회사는 현재 통상적으로 임의의 목적하는 서열을 순서대로 정렬된 화학적으로 합성된, 유전자 크기별 DNA를 생성함에 따라서 상기 DNA 제조하는 과정을 간소화하였다. 코돈 용법은 선택된 시스템내에서의 발현을 최적화하기 위해 조정할 수 있다.
BAFF 및 B7RP1에 결합하는 이특이적 단백질을 제조하는 방법
본원에 기재된 이특이적 단백질을 암호화하는 핵산은 핵산이 발현될 숙주 세포에 적당한 벡터내로 삽입할 수 있다. 이들 핵산은 당업계에 널리 공지된 임의의 방법에 의해 숙주 세포로 도입될 수 있다. 사용될 수 있는 숙주 세포는 무엇보다 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)를 포함하는 세균, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 포함하는 효모, 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포를 포함하는 곤충 세포, 식물 세포, 및 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 베이비 햄스터 신장(BHK) 세포, 몽키 신장 세포, HeLa 세포, 인간 간세포 암종 세포 및 293 세포를 포함하는 포유동물 세포를 포함한다. 이들 숙주 세포는 도입된 핵산이 발현되도록 및 이특이적 단백질이 배양 상등액 또는 세포 집단로부터 회수될 수 있도록 하는 조건하에 배양될 수 있다.
일반적으로, 숙주 세포로 핵산을 도입하기 위해 사용되는 과정은 핵산이 도입되어야만 하는 숙주 세포에 의존할 수 있다. 핵산을 세균으로 도입하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 전기천공 또는 염화칼슘 형질전환이 통상적으로 사용된다. 핵산을 효모로 도입하기 위한 방법은 또한 당업계에 널리 공지되어 있고 예를 들어, 리튬 아세테이트 및 폴리에틸렌 글리콜을 사용하는 형질전환 방법을 포함한다. 이종성 폴리뉴클레오타이드를 포유동물 세포로 도입하기 위한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고 덱스트란-매개된 형질감염, 인산칼슘 침전, 폴리브렌 매개된 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 리포좀내 폴리뉴크레오타이드(들)의 캡슐화 및 DNA의 핵으로의 직접 미세주사를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
임의의 숙주 세포에 사용되는 발현 벡터는 DNA 복제, 벡터를 함유하는 숙주 세포의 선택 및 외인성 뉴클레오타이드 서열의 발현에 필요한 서열을 함유할 수 있다. 상기 서열은 전형적으로 하기의 뉴클레오타이드 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 프로모터, 하나 이상의 인핸서 서열, 복제 오리진, 전사 종결 서열, 공여자 및 수용자 스플라이싱 부위를 함유하는 완전한 인트론 서열, 폴리펩타이드 분비를 위해 리더 서열을 암호화하는 서열, 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 서열, 발현될 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 삽입하기 위한 폴리링커 영역, 및 선택가능한 마커 요소. 다양한 숙주 세포내 발현용으로 적당한 많은 발현 벡터는 당업계에 공지되어 있고 시판되고 있다.
약제학적 조성물, 투여 및 투여 방법
본원에 기재된 이특이적 단백질을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 상기 조성물은 하나 이상의 추가의 성분들, 예를 들어, 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 희석제와 함께 치료학적 유효량의 이특이적 단백질을 포함할 수 있다. 상기 추가의 성분들은 무엇 보다 완충제, 탄수화물, 폴리올, 아미노산, 킬레이팅제, 안정화제 및/또는 보존제를 포함할 수 있다. 많은 상기 추가의 성분들은 문헌[참조: 예를 들어, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition, (A. R. Gennaro, ed.), 1990, Mack Publishing Company]에 기재되어 있고, 이의 관련 부분이 본원에 참조로서 인용된다.
본원에 기재된 이특이적 단백질의 투여는 목적하는 효과를 달성하기 위해 조정될 수 있다. 많은 경우에, 반복되는 투여는 치료될 질환의 만성 성질 때문에 요구된다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 이특이적 단백질은 주당 2회, 주당 1회, 2주마다, 3주마다, 4주마다, 5주마다, 6주마다, 7주마다, 8주마다, 9주마다 또는 10주마다 1회, 2개월마다, 3개월마다, 4개월마다, 5개월마다, 6개월마다 1회 투여될 수 있다. 이것이 투여될 각각의 날에 투여되는 이특이적 단백질의 양은 약 0.0036 mg 내지 약 700 mg일 수 있다. 대안적으로, 상기 투여량은 환자의 평가된 피부 표면에 따라 계산될 수 있고 각각의 투여량은 약 0.002㎍/m2 내지 약 350㎍/m2일 수 있다. 또 다른 대안에서, 상기 투여량은 환자의 체중에 따라 계산될 수 있고 각각의 투여량은 약 0. 000051 mg/kg 내지 약 10.0 mg/kg일 수 있다.
이특적 단백질 또는 이들 분자를 함유하는 약제학적 조성물은 임의의 실행가능한 방법에 의해 투여될 수 있다. 일부 특별한 제형 또는 상황 부재하에 경구 투여는 위의 산성 환경에서 단백질의 가수분해를 유도하기 때문에 단백질을 포함하는 치료제는 통상적으로 비경구 경로, 예를 들어, 주사에 의해 투여된다. 피하, 근육내, 정맥내, 동맥내, 병변내 및 복강 볼러스 주사가 가능한 투여 경로이다. 상기 이특이적 단백질은 또한 주입, 예를 들어 정맥내 또는 피하 주입을 통해 투여될 수 있다. 국소 투여는 또한 특히 피부를 포함하는 질환에 대해 가능하다. 대안적으로, 상기 이특이적 단백질은 점막과의 접촉을 통해, 예를 들어, 비강내, 설하, 질내 또는 직장 투여 또는 흡입제로서의 투여에 의해 투여될 수 있다. 대안적으로, 이특이적 단백질을 포함하는 특정 적당한 약제학적 조성물은 경구로 투여될 수 있다.
상기 일반 용어로 발명을 설명한 것은 설명을 위해 제공된 것이고 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 인간 치료학적 용도를 위한 BAFF/B7RP1 이특이적 분자의 디자인 및 시험
본 일련의 실험의 목적은 (1) BAFF-매개된 B 세포 증식 및 B7RP1-매개된 T 세포 증식을 억제하고, (2) 생물학적 검정에서 고도로 활성이고 (3) 바람직한 생물리학적 성질을 갖는 이특이적 분자를 모색하는 것이다. 인간 BAFF를 항-인간 B7RP1 IgG 항체(항-huB7RP1)에 결합하는 펩타이드의 융합을 위한 다수의 계획적 디자인은 도 1에 도시되어 있다. BAFF-결합 펩타이드의 서열은 서열번호: 1로 제공하고 항-huB7RP1의 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 서열은 각각 서열번호: 25 및 서열번호: 19로 제공된다.
디자인이 생물학적 활성을 보유하면서 최상의 생물리학적 성질을 갖는지를 결정하기 위해, 도 1에 다이그램화된 상기 이특적 분자를 제조하고 시험하였다. 하나의 작제물에서, 중재 링커(서열번호: 24의 아미노산 서열을 갖는 "1K 링커")와 함께 BAFF-결합 펩타이드의 2개 반복 카피물을 항-huB7RP1의 면역글로불린 중쇄(P71617) 또는 면역글로불린 경쇄(P71618)의 N-말단에 융합시켰다. 도 1을 참조. P71617 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호: 26으로 제공되고 P71617의 경쇄의 아미노산 서열은 항-huB7RP1의 면역글로불린 경쇄의 아미노산 서열(서열번호: 19)과 동일하다. P71618 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호: 27로 제공되고 P71618의 중쇄의 아미노산 서열은 항-huB7RP1의 면역글로불린 중쇄(서열번호: 25)와 동일하다. BAFF-결합 펩타이드의 2개 반복 카피물은 또한 2개의 BAFF-결합 펩타이드(P71620) 사이에 상기 언급된 1K 링커(서열번호: 24의 아미노산 서열을 갖는; P71619) 또는 5X(G4S) 링커(서열번호: 71)를 사용하여 항-huB7RP1(서열번호: 25의 아미노산 서열을 갖는)의 면역글로불린 중쇄의 C-말단에 융합시켰다. 이들 2개의 융합 작제물의 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호: 16(P71619) 및 서열번호: 28(P71620)로 제공된다. 작제물 P71621에서, 중재 1K 링커와 함께 BAFF-결합 펩타이들의 2개 반복 카피물은 서열번호: 25의 아미노산 서열(항-huB7RP1 항체의 면역글로불린 중쇄의 아미노산 서열)의 잔기 358번과 359번 사이에 항체의 CH3 도메인에 삽입하였다. P71621 작제물의 중쇄의 서열은 서열번호: 29로 제공된다. 작제물 P71622에서, 상기 BAFF-결합 펩타이드는 서열번호: 25의 잔기 358번과 359번 사이의 항-huB7RP1의 면역글로불린 중쇄의 CH3 도메인에 삽입하였고 BAFF-결합 펩타이드의 제2 카피물은 중쇄의 C-말단에 융합시켰다. P71622의 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호: 30으로 제공된다. 작제물 P71623에서, 하나의 BAFF-결합 펩타이드는 서열번호: 25의 잔기 268번과 269번 사이의 CH2 영역에 삽입하였고 제2 BAFF-결합 펩타이드는 서열번호: 25의 잔기 358번과 359번 사이의 CH3 영역에 삽입하였다. 서열번호: 31은 P71623의 중쇄의 아미노산 서열이다. 작제물 P71619-P71623 모두는 항-huB7RP1의 면역글로불린 경쇄(서열번호: 19)를 갖는다.
작제물 P74293 및 P74294에서, 작제물 P71619에서 BAFF-결합 펩타이드의 2개의 반복 카피물 사이의 링커를 변형시켰다. P74293과 P74294의 중쇄의 아미노산 서열은 각각 서열번호: 17 및 서열번호: 18로 제공된다. 이들 작제물의 면역글로불린 경쇄는 또한 서열번호: 19의 아미노산 서열을 갖는다.
상기된 작제물을 암호화하는 핵산은 다음과 같이 제조하였다. BAFF-결합 펩타이드 + 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 가변 영역의 2개의 카피물을 포함하는, N 말단 BAFF 펩타이드 융합체(P71617과 P71618)의 N-말단부를 암호화하는 핵산을 합성하였다. 이들은 적당한 벡터에서 간편한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 통해 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 불변 영역을 암호화하는 핵산에 연결하였다. 중쇄 불변 영역 C-말단 융합체(P71619 및 P71620), Fc-루프 삽입체(P71621 및 P71623) 및 Fc-루프 삽입체/C-말단 융합체(P71622)를 암호화하는 핵산을 모두 합성하고 간편한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 통해 중쇄 가변 영역을 함유하는 벡터에 연결하였다.
상기된 다양한 이특이적 작제물은 일시적으로 형질감염된 293 세포 및 안정하게 형질감염된 CHO 세포 둘다에서 발현시켰다. 상기 융합 단백질을 정제하고 생물학적 활성에 대해 시험하였다. 이들 2개의 상이한 종류의 숙주 세포에서 생성된 단백질에는 어떠한 차이가 관찰되지 않았다.
상기 이특이적 분자들의 BAFF 억제 활성은 BAFF-매개된 인간 1차 B 세포 증식 검정에서 시험하였다. 간략하게, 인간 B 세포는 제조원(Miltei Biotec(Auburn, CA))의 인간 B 세포 키트 II를 사용한 음성 선별을 사용하여 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)로부터 정제하였다. 약 105 정제된 B 세포는 48시간동안 5% CO2에서 37℃에서 50ng/ml의 인간 BAFF 단백질, 2㎍/ml의 염소 F(ab') 2 항-인간 IgM(Jackson ImmunoResearch) 및 다양한 농도의 상기된 이특이적 단백질들 하나의 존재하에 최소 필수 배지(MEM) + 10% 열 불활성화된 태아 소 혈청(FBS) 중의 96웰 미세역가 플레이트에서 배양하였다. 항-BAFF 펩티바디를 양성 대조군(각각 Fc 폴리펩타이드에 융합된 2개의 BAFF-결합 펩타이드를 포함하는, 2개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 동종이량체인 "αBAFF")으로서 사용하였다. 상기 αBAFF 분자는 미국 특허 제7,259,137호에 상세히 기재하고 상기 동종이량체 중 하나의 폴리펩타이드 쇄의 아미노산 서열은 서열번호: 32로 제공된다. αBAFF를 기재하는 미국 특허 제7,259,137호의 일부는 본원에 참조로서 인용된다. 증식은 항온처리 마지막 18시간 동안 방사능활성 3H-티미딘을 취득시켜 측정하였다. 결과는 도 2A 및 2B에 나타낸다.
도 2a에서의 데이타는 2개의 C-말단 융합 작제물(P71619 및 P71620)이 BAFF-매개된 B 세포 증식의 억제에서 서로 상응하고 본 실험에서 실험된 다른 모든 융합 작제물 보다 강력함을 지적한다. P71620은 이것이 치료학적 단백질에서 매우 바람직하지 못한 성질로서 응집하는 경향이 있기 때문에 추구되지 않았다. 도 2b에서의 데이타는 P71619가 BAFF-매개된 B 세포 증식의 억제에서 상기된 상기 작제물(P74293 및 P74294)의 2개의 약간 변형된 버젼과 양성 대조군(αBAFF)에 상응함을 지적한다. 따라서, 시험된 이특이적 작제물 중에서, P71619, P71620, P74293, 및 P74294가 BAFF-매개된 B 세포 증식의 본 검정에서 상응하는 활성을 가졌고 시험된 모든 다른 작제물보다 우수한 활성을 가졌다.
P71619, P74293, 및 P74294의 B7RP1 억제 활성은 인간 B7RP1-Fc-매개된 T 세포 증식 검정을 사용하여 분석하였다. 1차 인간 T 세포는 판(Pan) T 세포 분리 키트(제조원: Milenyi Biotec(Auburn, CA))를 사용하여 건강한 인간 공여자의 PBMC로부터 정제하고 상기된 이특이적 단백질 또는 IgG2 항-인간 B7RP1 항체(본원에서 "αB7RP1"로 언급되는)의 다양한 농도의 존재하에 플레이트 결합된 항-CD3(1㎍/mL) 항체 및 B7RP1-Fc 융합 단백질(3㎍/mL)로 자극시켰다. 3H-티미딘은 48시간 후 세포로 첨가하고 3H-티미딘의 혼입은 24시간 후에 측정하였다. 시험된 모든 이특이적 항체는 유사한 IC50 값을 가졌고 이는 αB7RP1의 값과 유사하였다(도 3). 따라서, 이들 데이타는 BAFF-결합 펩타이드의 항-huB7RP1 항체로의 접합이 B7RP1 활성을 억제하는 항체의 능력에 거의 또는 어떠한 효과를 갖지 않음을 시사한다.
이종이량체성 이특이적 항체 P74293 및 P74294의 BAFF 및 B7RP1에 대한 결합 친화성은 역학적 배제 검정 (KinExA®; Sapidyne Instruments, Boise, Idaho)에 의해측정하였다. 항체 둘다는 인간 BAFF (대략 30pM의 Kd를 가짐) 및 인간 B7RP1(대략 40pM의 Kd를 가짐)에 대해 높은 친화성을 갖는다. 하기 표 2를 참조. 추가로, 이들 이특이적 단백질 둘다는 인간 BAFF와 비교하여 시노몰구스 몽키 BAFF에 대해 유사한 친화성을 갖고 인간 B7RP1과 비교하여 시노몰구스 몽키 B7RP1에 대해 유사한 결합 친화성을 갖는다. 표 2.
표 2: P74293 및 P74294의 결합 친화성 및 세포 효능
Figure 112021018786221-pat00004
인간 세포를 사용하는 시험관내 시스템에서 P74293의 활성을 추가로 평가하기 위해, 스트렙토코커스 엔테로톡신 B(SEB)에 의해 활성화된 인간 편도 세포에 의한 사이토킨 생성은 다양한 시험 분자의 존재하에 평가하였다. 간략하게, 인간 편도 세포는 조직으로부터 분리하고 하기의 분자 중 하나의 존재하에 SEB(1㎍/ml)로 자극하였다: (1) αB7RP1, (2) P74293, (3) CTLA4-Ig (양성 대조군), 또는 (4) 인간 IgG (음성 대조군). 72시간 배양 후, 세포 상등액을 수거하고 사이토킨 수준은 제조업자의 지침에 따라 메소 스케일 디스커버리 기원의 키트를 사용하여 분석하였다. 결과는 도 4에 나타낸다.
도 4의 모든 패널에서 각각 막대 1, 2 및 3인 αB7RP1, P74293, 및 CTLA4-Ig의 3개 모두는 IL-17, IL-10, IL-4, 및 IFNγ의 방출을 억제하였다. IL-2의 방출은 CTLA4-Ig에 의해서만 억제되었다. 따라서, αB7RP1 및 항-BAFF/B7RP1 이특이적 P74293은 SEB-활성화된 인간 편도 세포에 의한 사이토킨 분비에 대해 상당하고 특이적인 효과를 가졌다.
3개의 이종이량체성 이특이적 단백질, 즉, P71619, P74293, 및 P74294는 추가의 성질에 대해 조사하였다. 이들 단백질을 생산하는 숙주 세포의 배양물로부터의 단백질 역가는 P74293 및 P74294가 P71619가 생성된 수준의 약 2배로 생성되었다는 것을 나타내었다. P74293 및 P74294는 또한 크기 배척 크로마토그래피(SEC)에 의한 평가시 40℃에서 2주동안 저장 후 P71619 보다 안정하였다. P74293은 저장 개시에서 및 저장 4주 후 청명한 용액을 형성한 반면, P74394를 함유하는 용액은 모든 시점에서 흐릿하였다. P74293 및 P74294의 용액은 P71619의 용액 보다 덜 점성이었다. 따라서, P74293 및 P74294는 P71619 보다 높은 수준으로 발현하였고 또한 시험된 농도 범위에서 P71619 보다 안정하고 덜 점성이었다. 이들 분자간에 가장 명백한 차이는 2개의 BAFF-결합 펩타이드간의 링커에 있다. 이들 데이타는 P74293 및 P74294 (서열번호: 6 및 7)에서의 링커가 이들 분자상에 개선된 성질을 부여할 수 있음을 시사한다.
기재된 이특이적 분자의 생리역학 성질은 마우스에서 평가하였다. 수컷 CD-1 마우스에 이특이적 융합 단백질 P71617, P71619, P71621, P71622, P74293, 또는 P74294를 단일 정맥내 (IV) 용량(5mg/kg)으로 투여하였다. 혈청 샘플은 투여 전 및 투여 후 0.5, 2, 8, 24, 48, 72, 96, 168, 240, 336, 408, 504 시간째에 수거하였다. 상기 혈청에서 이특이적 분자의 농도는 2개의 ELISA 방법에 의해 결정하고 하나는 Fc 부분의 존재하는 것으로 등록하고 하나는 Fc 부분과 BAFF-결합 펩타이드 부분 둘다가 존재하는 것으로 등록한다. Fc 부분의 측정을 위해, 비오티닐화된 항-Fc 항체는 포획 시약으로서 사용하였고 ALEXA FLUOR® 647-표지된 항-Fc 항체는 검출 시약으로서 사용하였다. 상기 이특이적 단백질의 BAFF-결합 부분 및 Fc 부분을 검출하기 위해, 비오티닐화된 BAFF 단백질은 포획 시약으로서 사용하고 ALEXA FLUOR® 647-표지된 항-Fc 항체는 검출 시약으로서 사용하였다. 중쇄의 N 말단(P71617), C 말단 (P71619, P74293 및 P74294) 또는 CH3 도메인 (P71621)에 융합된 BAFF-결합 펩타이드의 2개 반복 카피물을 갖는 이특이적 단백질은 마우스에서 매우 유사한 PK 프로필을 갖는다. 도 5를 참조한다. CH3 도메인에 삽입된 BAFF-결합 펩타이드의 1개 카피물 및 중쇄의 C-말단으로 융합된 또 다른 카피물을 갖는 이특이적 단백질(P71622)은 다른 이특이적 단백질에 비해 보다 낮은 노출을 가졌다. 도 5를 참조한다. 추가로, 상기 2개의 상이한 ELISA 검정은 유사한 혈청 농도의 이특이적 단백질 생성됨을 밝혔고 이것은 이특이적 단백질에 어떠한 상당한 절단이 생체내에서 발생하지 않음을 시사한다.
P74293 및 P74294 이종이량체성 이특이적 항체의 약리역학적 및 약리동력학적 파라미터는 또한 시노몰구스 몽키에서 단일 투여 연구에 의해 평가하였다. 순수 수컷 시노몰구스 몽키(n=4)에 단일 볼러스 정맥내 또는 피하 투여량의 P74293 (10 mg/kg), 또는 단일 피하 투여량의 P74294 (10 mg/kg)을 투여하였다. 2개의 이특이적 분자들은 IgG 항체의 프로필과 유사한 PK 프로필을 갖는다. 항-huB7RP1에 대한 것 뿐만 아니라 P74293 및 P74294에 대해 관찰된 약리역학적 파라미터는 하기 표 3에 나타낸다.
표 3: 시노몰구스 몽키에서 약동학적 파라미터
Figure 112021018786221-pat00005
표 3에서의 데이타는 P74293 및 P75294의 약리역학적 파라미터가 서로 상응하고 항-huB7RP1 항체의 파라미터에 상응함을 지적한다.
실시예 2: 뮤린 이특이적 대용물 분자의 디자인 및 시험
마우스에서 임상전 연구를 수행하기 위해, 뮤린 B7RP1 및 뮤린 BAFF(이후 "뮤린 대용물")에 결합할 수 있는 뮤린 대용물 이특이적 분자를 작제하였다. 실시예 1에 기재된 이특이적 작제물을 작제하기 위해 사용된 항-huB7RP1 항체는 뮤린 B7RP1에 결합하지 않고, 이들 작제물에 사용된 BAFF-결합 펩타이드는 인간 및 뮤린 BAFF 둘다에 결합한다. 데이타는 나타내지 않음. 상기 뮤린 대용물은 마우스 면역글로불린 불면 영역 및 래트 항-뮤린 B7RP1 면역글로불린 가변 영역의 키메라인 길항성 IgG 항-뮤린 B7RP1 항체(본원에서 "항-mB7RP1"로 불림)를 포함한다. 항-mB7RP1의 사용은 문헌[참조: Hu et al. (2009), J. Immunol. 182: 1421]에 기재되어 있고, 여기서 이것은 1B7-V2로 지정되어 있다. 상기 뮤린 대용물은 짧은 링커(5개 아미노산 길이)를 통해 항-mB7RP1의 면역글로불린 중쇄의 C 말단에 융합된 BAFF-결합 펩타이드(서열번호: 1)의 2개 카피물을 갖는다. 2개 카피물의 BAFF-결합 펩타이드는 23개 아미노산 길이인 또 다른 링커에 의해 분리되어 있다. 뮤린 대용물의 중쇄를 암호화하는 핵산은 αBAFF의 BAFF-결합 부분을 암호화하는 핵산을 1B7-V2, 즉, 항-mB7RP1의 중쇄를 암호화하는 핵산의 다운스트림 말단에 연결시키는 중첩 PCR을 사용하여 제조하였다.
뮤린 대용물에 의한 BAFF 억제는 BAFF-매개된 B 세포 증식 검정에서 평가하였다. 마우스 B 림프구는 제조업자의 지침(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)에 따라 MACS CD43(ly-48) 마이크로비드를 사용한 음성 선택에 의해 C57BL/6 비장으로부터 또는 B 세포 분리 키트(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)를 사용하여 PBMC로부터 분리하였다. 정제된 B 세포는 다양한 농도의 뮤린 대용물 또는 αBAFF의 존재하에 0.1㎍/ml의 항-IgM 및 200 ng/ml의 BAFF로 자극하였다. B 세포 증식은 4일째에 3H-티미딘 혼입에 의해 측정하였다. 뮤린 대용물 및 αBAFF의 IC50은 각각 0.59 nM 및 0.73 nM이었다. 도 6a를 참조. 따라서, 뮤린 대용물은 αBAFF에 상응하는 효능으로 BAFF를 효과적으로 억제하였다.
뮤린 대용물에 의한 이의 수용체에 결합하는 B7RP1의 억제를 측정하기 위해, 마우스 비장 세포를 먼저 활성화하여 이들을 24시간동안 항-CD3(5㎍/ml) 항체로 피복된 미세역가 웰에서 항온처리함에 의해 B7RP1 수용체의 발현을 증진시켰다. 상기 활성화된 비장 세포는 인산 완충 식염수(PBS)로 세척하고 이어서 30분동안 4℃에서 다양한 농도의 뮤린 대용물의 존재하에 5㎍/ml의 비오티닐화된 muB7RP1:Fc로 항온처리하였다. 상기 세포를 세척하고 이어서 추가로 20분동안 알로피코시아닌(APC)-접합된 항-마우스 CD3 항체 및 스트렙타비딘-피코에리트린(스트렙타비딘-PE)으로 염색시켰다. T 세포로의 B7RP1-Fc 결합은 유동 세포측정으로 분석하였다. 뮤린 대용물 및 항-mB7RP1의 IC50은 각각 4.01 pM 및 2.8 pM이었다. 도 6b를 참조. 따라서, 뮤린 대용물의 활성은 상기 검정에서 항-mB7RP1의 활성과 유사하였다. 따라서, 상기 뮤린 대용물은 BAFF 및 B7RP1 둘다를 억제한다.
뮤린 대용물의 생체내 약동학적 효과는 양 적혈구 세포(SRBC)로 면역화된 마우스에서 평가하였다. 간략하게, BALB/c 마우스 (8주령)에 0일째 1차 면역화를 제공하고 , 28일째 복강내 주사를 통해 0.2ml의 PBS 중 2 x 108 SRBC로 부스터 면역화를 제공하였다. 상기 마우스(각각의 분자에 대해 n = 5)는 5mg/kg의 하기의 분자 중 하나로 0일 내지 33일까지 주당 2회 처리하였다: 뮤린 대용물; αBAFF; 항-mB7RP1; 또는 뮤린 IgG1. SBRC로 처리되었지만 또 다른 처리는 받지 않은 마우스는 양성 대조군으로서 사용하였다. 상기 마우스는 34일째에 희생시키고 혈청 및 비장을 수거하였다.
비장에서 B 세포 및 기억 T 세포의 비율을 측정하기 위해, 비장 세포는 비장 조직을 세포 스트레이너를 통해 분쇄함에 의해 수거하였다. 상기 비장 세포는 Fc 감마 수용체(FcγR)로의 항체의 비특이적 결합을 차단하기 위해 비표지된 항-CD16/32와 예비 항온처리하였다. B세포의 비율은 PE-표지된 항-B220 (B 세포상에서 발현되는)으로 염색시킴에 의해 결정하였다. 기억 T 세포 (CD44hiCD62LloCD4 T 세포)의 비율은 FITC-접합된 항-CD44, PE-접합된 항-CD62L, APC-접합된 항-CD4 및 PerCP-접합된 항-CD3으로 염색시킴에 의해 결정하였다. 모든 염색 항체는 제조원(BD Bioscience (San Diego, CA))으로부터 구입하였다. B 및 T 세포 둘다의 결정을 위해, 유동 세포측정은 FACSCALIBUR™ (BD Bioscience, San Jose, CA) 유동 세포측정기로 수행하였고 상기 데이타는 유동 세포측정 데이타의 분석을 위해 FLOWJO® (TreeStar Inc., Ashland, OR) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 결과는 도 7에 나타낸다.
혈청에서 항-SBRC 항체 수준을 측정하기 위해, 10 μg/ml의 가용성 SRBC 항원으로 피복된 미세역가 플레이트는 처리된 마우스 기원의 희석된 혈청과 함께 실온에서 2시간동안 항온처리하였다. 혈청 기원의 결합된 SRBC-특이적 Ig는 HRP-접합된 폴리클로날 염소 항-마우스 IgG 및 IgM 항체(Southern Biotech, Birmingham, AL)로 검출하였다. 상기 기질 반응은 제조업자의 지침에 따라 SUREBLUE™ TMB 마이크로웰 퍼옥시다제 기질 (KPL, Gaithersburg, MD)을 사용하여 수행하고 광학 밀도는 스펙트럼 맥스 미세플레이트 판독기(Molecular Devices)를 사용하여 판독하였다. 양성 대조군으로서, 임의의 처리 없이 SRBC 면역화된 마우스 기원의 혈청 혼합물의 연속 희석액을 각각의 플레이트에 첨가하였고, 표준 곡선은 이들 웰로부터 판독에 의해 작성하였다. 다른 샘플의 항-SBRC 항체의 수준은 상기 양성 대조군의 %로서 도 7에 나타낸다.
B 세포인 비장 세포의 %는 뮤린 IgG1로 처리된 마우스에서 관찰된 %와 비교하여 뮤린 대용물로 처리된 마우스에서 감소하였다. 도 7 (상부 패널)를 참조한다. 유사한 감소는 αBAFF 또는 αBAFF + 항-mB7RP1로 처리된 마우스에서 관찰되었지만, 단독의 항-mB7RP1로 처리된 마우스에서는 관찰되지 않았다. 도 7(상부 패널)을 참조한다. 기억 T 세포와 관련하여, 뮤린 대용물, 항-mB7RP1 또는 항-mB7RP1 + αBAFF로 처리된 마우스는 muIgG1으로 처리된 마우스에서 관찰된 것과 비교하여 기억 T 세포의 비율을 감소시켰다. 도 7(중앙 패널)을 참조한다. 대조적으로, αBAFF를 사용한 처리는 muIgG 처리로 관찰된 것과 비교하여 비장에서 기억 T 세포 집단을 변화시키지 않았다. 도 7(중앙 패널)을 참조한다. 뮤린 대용물은 또한 항-mB7RP1 또는 항-mB7RP1 + αBAFF를 사용한 치료시 또는 SRBC로 주사받지 않은 마우스에서 관찰된 것과 유사하게 혈청에서 항-SRBC 항체 수준의 강력한 감소를 보여주었다. 도 7 (하부 패널)을 참조한다. mIgG1 처리시 관찰된 수준과 비교하여 항-SRBC 항체 수준의 적당한 억제는 단독의 αBAFF로 처리된 마우스에서 관찰되었다. 도 7(바닥 패널)을 참조한다. 이들 데이타는 뮤린 대용물이 생체내 마우스에서 B 세포 및 T 세포 격실에서 이원 억제 효과를 가짐을 지적한다.
질환에 대한 뮤린 대용물의 영향은 시험된 분자의 각각에 대해 2개의 상이한 투여량을 사용한 NZB/W F1 낭창 모델에서 평가하였다. 암컷 NZB/W F1 마우스 (4.5개월령, n=20)은 하기의 투여 용법 각각을 사용하여 18주 동안 복강 주사하여 주마다 2회 처리하였다: 5 또는 15 mg/kg의 뮤린 대용물(MW
Figure 112021018786221-pat00006
160KDa); 4.68 또는 14 mg/kg의 항-mB7RP1 (MW
Figure 112021018786221-pat00007
150KDa); 1.88 또는 5.6 mg/kg의 αBAFF (MW
Figure 112021018786221-pat00008
64KDa); αBAFF (1.88 또는 5.6 mg/kg) 및 항-mB7RP1 (4.68 또는 14 mg/kg)의 배합; 뮤린 IgG1 (15 mg/kg; 이소형 대조군); 또는 포스페이트 완충 식염수(PBS) (음성 대조군). 단백뇨는 5개월 령에서 개시하여 2주 마다 ALBUSTIX® (Bayer, Elkhart, IN)을 사용하여 뇨에서 측정하였다. 단백뇨의 발생빈도는 2개의 연속 측정에서 적어도 300mg/dl의 농도에서 뇨 단백질을 갖는 마우스의 %로서 나타내었다. 혈청 항-dsDNA IgG 수준은 ELISA를 사용하여 측정하였다. 모든 마우스의 신장 질환에 대한 스코어링은 8개의 상이한 병변에 대한 신장 조직 샘플의 조사, 즉 사구체 모세관 증식, 혈관 사이 세포 비대증, 증가된 혈관 사이 매트릭스, 사구체 다발 부착, 체벽 상피 비대증, 간질성 신염, 관형 확대/단백질 캐스트 및 관형 위축증/간질성 섬유증의 조사에 의해 수행하였다. 각각의 유형의 병변에 대해 0 내지 5의 중증 스코어를 제공하였고 최대 가능한 스코어는 32이다. 마우스 각각의 그룹의 스코어는 평균으로 하였다. 생존을 모니터링하였다.
12개월령에, 어느 투여 수준에서도 뮤린 대용물로 처리된 어떠한 마우스도 단백뇨를 발병하지 않았다. 대조적으로, 시험된 양쪽 용량 수준에서 뮤린 IgG1 또는 PBS로 처리된 마우스 100%는 단백뇨를 나타냈다. 도 8a 및 9b를 참조한다. 보다 낮은 용량 수준의 항-mB7RP1 및 αBAFF로 각각 처리된 마우스 약 60% 및 35%, 및 보다 높은 용량 수준의 항-mB7RP1 및 αBAFF로 각각 처리된 마우스의 약 50% 및 25%는 단백뇨를 나타내었다. 도 8a 및 9b를 참조한다. 추가로, 양쪽 용량 수준에서 뮤린 대용물 치료는 muIgG1로 처리된 음성 대조군과 비교하여 항-dsDNA IgG의 혈청 수준에서 상당히 감소하였다. 도 8b 및 9a를 참조한다. 상기 이특이적 치료는 또한 mIgG 및 PBS 대조군 그룹과 비교하여 생존율을 상당히 개선하였다. 데이타는 나티내지 않는다. 그러나, 생존에서 어떠한 명백한 차이가 실험 종결 시점에 이특이적 대 단일 제제 치료간에 관찰되지 않았다.
연구 종결 전에 사망한 마우스를 포함하는 모든 처리된 마우스 기원의 신장은 신장 질환의 중증도에 대해 조직분석 스코어링을 위해 수거하였다. αBAFF, αBAFF + 항-mB7RP1의 배합 또는 뮤린 대용물로 처리된 마우스 그룹은 mIgG1으로 처리된 대조군 그룹과 비교하여 신장 질환에 대해 상당히 낮은 스코어를 가졌다. 도10을 참조한다. 이특이적 대용물 또는 배합물로 처리된 그룹은 또한 단일 제제 치료 그룹과 비교하여 감소된 신장 병리학의 경향을 보여주었고 이것은 상기된 단백뇨 결과와 양호하게 상호 관련 있는 결과이다. 도 10을 도 8a 및 9b와 비교한다. 요약하여, 뮤린 대용물 또는 αBAFF + 항-mB7RP1을 사용한 배합 치료에 의한 BAFF 및 B7RP1의 이원 억제는 NZB/W F1 낭창 모델에서 질환 발병 및 진행의 예방에서 단독의 BAFF(αBAFF) 또는 단독의 B7RP1(항-mB7RP1)의 억제 보다 더 효과적이었다.
BAFF 및 B7RP1 둘다의 억제가 뮤린 콜라겐 유도된 관절염의 증상을 효과적으로 억제할 수 있는지를 결정하기 위해, 하기의 실험을 수행하였다. 수컷 DBA 마우스는 0일째 2 x 완전 프룬트 보조제(CFA)에 유화된 소 II형 콜라겐 100㎍으로 면역화시키고 21일째에 불완전 프룬트 보조제(IFA) 중에서 소 II형 콜라겐으로 부스팅하였다. 마우스는 0일째 개시된 연구의 41주 과정동안에 주당 2회 시험 물질 중 하나로 처리하였다. 관절염 증상을 나타내는 각각의 그룹내 마우스의 % 및 각각 그룹에 대한 평균 관절염 스코어는 각각의 시점에서 평가하였다. 관절염 스코어는 각각의 다리를 조사하고 각각의 다리에 대해 0 내지 3의 스코어를 할당함에 의해 결정하였고 보다 팽윤되고/되거나 염증 발생 다리에 대해서는 보다 높은 스코어를 부여하였다. 따라서 최대 총 관절염 스코어는 12이다. 마우스는 임의의 다리에서 적어도 1의 관절염 스코어를 갖는 경우 관절염을 갖는 것으로서 계수하였다.
결과는 도 11에 나타낸다. 이들 데이타는 αBAFF 및 항-mB7RP1의 배합(실선으로 연결된 채워진 원형)이 단독의 αBAFF (실선으로 연결된 개방된 원형) 또는 항-mB7RP1 (점선에 의해 연결된 채워진 원형) 보다 관절염 증상을 억제하는데 훨씬 더 효과적이었다. mIgG (실선으로 연결된 채워진 사각형) 또는 PBS(점선에 의해 연결된 채워진 사각형)로 처리된 음성 대조군 그룹은 최고 %의 관절염 발생율 및 최고 관절염 스코어를 가졌다. 이들 결과는 이들 경로 중 하나만을 억제하는 것과 반대로 BAFF 및 B7RP1 둘다를 억제하는 것이 류마티스 관절염과 같은 자가면역 및/또는 염증 관절염 병태의 효과적인 치료일 수 있음을 시사한다.
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polynucleotide" <400> 65 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cttctggatt tacctttagt agttattgga tgagttgggt ccgccaggct 120 ccagggaaag ggctggagtg ggtggcctac ataaagcaag atggaaatga gaaatactat 180 gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcattgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagggaaggg 300 atactttggt tcggggactt accgacgttc tggggccagg gaaccctggt caccgtctct 360 agtgcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcgc cctgctccag gagcacctcc 420 gagagcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgctct gaccagcggc gtgcacacct tcccagctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcaactt cggcacccag 600 acctacacct gcaacgtaga tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gacagttgag 660 cgcaaatgtt gtgtcgagtg cccaccgtgc ccagcaccac ctgtggcagg accgtcagtc 720 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 780 tgcgtggtgg tggatgtaag ccatggggga ctgcctggat gcaagtggga tcttctcatt 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Gly Ser 1 5

Claims (22)

  1. (a) IgG 항체의 중쇄 및 하나 이상의 펩타이드 P1을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드로서,
    i. 상기 폴리펩타이드는 서열번호: 16, 17, 및 18로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고,
    ii. P1은 IgG 항체의 중쇄에 공유결합으로 부착되어 있고 10 내지 40개 아미노산 길이인
    폴리펩타이드; 및
    (b) 서열번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 IgG 항체의 면역글로불린 경쇄
    를 포함하고,
    P1은 BAFF에 특이적으로 결합하고, (a)의 면역글로불린 중쇄 및 (b)의 면역글로불린 경쇄는 B7RP1에 특이적으로 결합하는 IgG 항체를 형성하는,
    이특이적 단백질.
  2. 청구항 1에 있어서, 면역글로불린 중쇄가 그 C-말단에 라이신을 결실한 것인, 이특이적 단백질.
  3. 청구항 1에 있어서, IgG 항체가 인간 또는 인간화 IgG1, IgG2, 또는 IgG4 항체인, 이특이적 단백질.
  4. 청구항 3에 있어서, IgG 항체가 인간 또는 인간화 IgG1 항체인, 이특이적 단백질.
  5. 청구항 1에 있어서, P1이 서열번호: 1 (LPGCKWDLLIKQWVCDPL)의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 이특이적 단백질.
  6. 청구항 1에 있어서, 폴리펩타이드 (a)가 링커 L1을 포함하고, L1이
    (a) IgG 중쇄의 C-말단 및 P1의 N-말단에 공유결합으로 결합되어 있고,
    (b) 3 내지 40개 아미노산 길이인,
    이특이적 단백질.
  7. 청구항 6에 있어서, L1이 서열번호: 40 (GGGGG)의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 이특이적 단백질.
  8. 청구항 1에 있어서, 폴리펩타이드 (a)가 펩타이드 P2를 추가로 포함하고, P2가 폴리펩타이드 (a)에 공유결합으로 부착되어 있고 10 내지 40개 아미노산 길이인, 이특이적 단백질.
  9. 청구항 8에 있어서, P2가 P1의 다운스트림의 폴리펩타이드 (a)에 공유결합으로 부착되어 있는 것인, 이특이적 단백질.
  10. 청구항 9에 있어서, 폴리펩타이드 (a)가 링커 L2를 추가로 포함하고, L2가 P1의 C-말단 및 P2의 N-말단에 공유결합으로 결합되어 있는 것인, 이특이적 단백질.
  11. 청구항 8에 있어서, P2가 서열번호: 1 (LPGCKWDLLIKQWVCDPL)의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 이특이적 단백질.
  12. 청구항 8에 있어서, P1 및 P2가 각각 독립적으로 서열번호: 1 (LPGCKWDLLIKQWVCDPL)의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 이특이적 단백질.
  13. 청구항 1에 있어서, (a)의 폴리펩타이드 및 (b)의 면역글로불린 경쇄를 각각 두 분자씩 포함하는 4량체인, 이특이적 단백질.
  14. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항의 이특이적 단백질을 암호화하는 핵산.
  15. 청구항 14의 핵산을 포함하는 벡터.
  16. 청구항 14의 핵산, 또는 청구항 14의 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포.
  17. (a) 핵산이 발현되도록 하는 조건 하에서 청구항 16의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및
    (b) 세포 집단 또는 배양 배지로부터 단백질을 회수하는 단계
    를 포함하는, 이특이적 단백질을 제조하기 위한 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 숙주 세포가 포유동물 세포 또는 에스케리치아 콜라이(Eschericha coli) 세포인, 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 숙주 세포가 CHO 세포인, 방법.
  20. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항의 이특이적 단백질의 치료학적 유효량을 포함하는, 전신성 홍반성 낭창(SLE), 낭창성 신염(LN), ANCA-양성 혈관염, 크론 질환(CD), 궤양성 장염(UC), 셀리악 질환, 천포창, 유사천포창, 다발성 경화증(MS), 만성 염증 탈수초 다발성신경병증(CIDP), 중증 근무력증, 굿파스처 증후군(Goodpasture's syndrome), 사구체신염, 자가면역 용혈성 빈혈(AIHA), 특발성 혈소판감소성 자반병(ITP), 만성 활성 간염, 1차 담도성 경화증, 쇼그렌 증후군, 전신성 경화증, 하시모토 갑상선염, 그레이브 질환(Graves' disease), 애디슨 질환(Addison's disease), 및 다발성 내분비 샘종(MEN)으로부터 선택되는 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 이특이적 단백질의 전, 후 또는 이와 동시에 환자에게 투여되는 다른 치료제와 조합하여 사용하기 위한 것이고, 상기 다른 치료제가 코르티코스테로이드, 항말라리아제, 레티노산, NSAID, 사이클로포스파미드, 데하이드로에피안드로스테론, 마이코페놀레이트 모페틸, 아자티오프린, 클로람부실, 메토트렉세이트, 타크롤리무스, 다프손, 탈리도미드, 레플루노미드, 또는 사이클로스포린인, 약제학적 조성물.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 다른 치료제가 마이코페놀레이트 모페틸, 코르티코스테로이드, 항말라리아제, 메토트렉세이트, 또는 아자티오프린인, 약제학적 조성물.
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