CN105324127A - 对baff和b7rp1具有特异性的蛋白和其用途 - Google Patents

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Abstract

本文描述对BAFF和B7RP1具特异性的双特异性蛋白、编码所述蛋白的核酸、制造所述蛋白的方法以及所述蛋白的用途。

Description

对BAFF和B7RP1具有特异性的蛋白和其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年3月13日提交的美国临时申请号61/780,260和2014年2月21日提交的美国临时申请号61/942,776的权益，所述临时申请各自全文并入本文中。
领域
本文所述的双特异性分子在蛋白治疗剂的领域内。
背景
大多数治疗蛋白以高特异性结合于单一靶标蛋白，由此干扰这种单一靶标蛋白的活性。这种蛋白可为介导所治疗的人类疾病的一种或多种生物途径的一部分，并且所述治疗蛋白可因此抑制疾病进展。然而，治疗蛋白的效力很少对所有患者均完全。治疗蛋白的不完全效力可能在一些情况下归因于疾病的复杂性。例如，一些疾病可通过多种生物途径介导，或不同生物途径可在具有相同的临床上确定的病况的不同患者中在介导疾病活动性方面发挥主要作用。因此，在一些疾病中可能有利的是同时抑制至少两种生物途径。
概述
本文提供可结合于人类B7相关蛋白1(B7RP1，还称作GL50和T细胞共刺激配体(ICOSLG))和人类B细胞激活因子(BAFF，还称作肿瘤坏死因子超家族成员13b(TNFSF13B))并且抑制其生物活性的双特异性蛋白。BAFF在B细胞生存中发挥作用，并且B7RP1在T细胞共刺激中发挥作用。因此，抑制这两种蛋白的活性的蛋白干扰B和T细胞的活性。
本文描述双特异性蛋白，其中所述蛋白可抑制人类B细胞的BAFF介导的增殖并且其中所述蛋白可抑制人类T细胞的B7RP1介导的增殖。所述双特异性蛋白可包含IgG抗体，所述抗体包含具有不同氨基酸序列的两条免疫球蛋白重链和具有不同氨基酸序列的两条免疫球蛋白轻链。所述IgG抗体可抑制人类B细胞的BAFF介导的增殖和人类T细胞的B7RP1介导的增殖。所述IgG抗体可为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体并且可为人类或人源化IgG抗体。所述双特异性蛋白可包含包含氨基酸序列SEQIDNO：8的轻链互补决定区1(CDR1)、包含氨基酸序列SEQIDNO：9的轻链互补决定区2(CDR2)、包含氨基酸序列SEQIDNO：10的轻链互补决定区3(CDR3)、包含氨基酸序列SEQIDNO：11的重链CDR1、包含氨基酸序列SEQIDNO：12的重链CDR2以及包含氨基酸序列SEQIDNO：13的重链CDR3。此外，所述双特异性蛋白可包含包含SEQIDNO：15的重链可变区或其变体和包含SEQIDNO：14的轻链可变区或其变体。所述变体序列相对于参考序列可包含每100个氨基酸不超过10个单一氨基酸的缺失、插入或取代。
在一个替代实施方案中，可抑制人类B细胞的BAFF介导的增殖并且可抑制人类T细胞的B7RP1介导的增殖的双特异性蛋白可包含：(a)包含具有下式的氨基酸序列的多肽：A-L1-P-L2-P，其中A为IgG抗体的免疫球蛋白重链，L1为第一连接体，所述第一连接体不存在或为3至40个氨基酸长，P为10至40个氨基酸长的BAFF结合肽，并且L2为肽连接体，所述肽连接体不存在或为5至50个氨基酸长；以及(b)免疫球蛋白轻链。(a)的所述免疫球蛋白重链和(b)的所述免疫球蛋白轻链可形成可结合B7RP1和/或可抑制人类T细胞的B7RP1介导的增殖的IgG抗体，所述抗体包含(a)的所述多肽的两个分子和(b)的所述轻链的两个分子。所述免疫球蛋白重链可在其C末端刚好L1的上游处缺失赖氨酸。所述IgG抗体可为人类或人源化IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。所述BAFF结合肽P可具有氨基酸序列SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3。L1可具有氨基酸序列SEQIDNO：4、37、38、39或40。L2可具有氨基酸序列SEQIDNO：5、6或7。所述双特异性蛋白可包含包含氨基酸序列SEQIDNO：8(RASQGISNWLA)的轻链CDR1、包含氨基酸序列SEQIDNO：9(AASSLQS)的轻链CDR2、包含氨基酸序列SEQIDNO：10(QQYDSYPRT)的轻链CDR3、包含氨基酸序列SEQIDNO：11(SYWMS)的重链CDR1、包含氨基酸序列SEQIDNO：12(YIKQDGNEKYYVDSVKG)的重链CDR2以及包含氨基酸序列SEQIDNO：13(EGILWFGDLPTF)的重链CDR3。所述双特异性蛋白可包含包含氨基酸序列SEQIDNO：14的免疫球蛋白轻链可变区和/或包含氨基酸序列SEQIDNO：15的免疫球蛋白重链可变区。所述双特异性蛋白可包含氨基酸序列SEQIDNO：19或其变体和氨基酸序列SEQIDNO：17或18或其变体。所述变体序列相对于参考序列可包含每100个氨基酸不超过10个单一氨基酸的缺失、插入或取代。
另一方面，本文描述一种双特异性蛋白，其包含：(a)包含氨基酸序列SEQIDNO：17或SEQIDNO：18或其变体的多肽；以及(b)包含氨基酸序列SEQIDNO：19或其变体的另一种多肽。所述变体序列相对于参考序列可包含每100个氨基酸不超过10个单一氨基酸的缺失、插入或取代。所述双特异性蛋白可抑制人类B细胞的BAFF介导的增殖和人类T细胞的B7RP1介导的增殖。所述双特异性蛋白可为包含(a)的所述多肽的两个分子和(b)的所述多肽的两个分子的四聚体。
在另一实施方案中，本文提供一种包含连接体的蛋白，所述连接体包含氨基酸序列SEQIDNO：6或SEQIDNO：7。在一些实施方案中，这种蛋白可抑制人类B细胞的BAFF介导的增殖和/或人类T细胞的B7RP1介导的增殖。所述蛋白可包含氨基酸序列SEQIDNO：1、SEQIDNO：14和/或SEQIDNO：15。所述蛋白可包含包含由SEQIDNO：6或7分离的SEQIDNO：1的至少两个拷贝的氨基酸序列。在另一实施方案中，所述蛋白可包括免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链，并且SEQIDNO：6或7可在所述重链的C端的下游。在所述实施方案中，SEQIDNO：6或7可侧接结合于除所述重链和轻链所结合的蛋白以外的蛋白的肽。
此外，本文描述包含本文所述的双特异性蛋白或包含氨基酸序列SEQIDNO：6或7的蛋白中的任一者以及生理学上可接受的赋形剂的药物组合物。
本文还描述编码本文所述的双特异性蛋白或包含SEQIDNO：6或SEQIDNO：7的蛋白中的一者中所包括的任何多肽的核酸。编码双特异性蛋白中所包括的多肽的示例性核酸包括例如SEQIDNO：55、56、60、61、62以及63等。描述了包含所述核酸的载体和含有所述载体和/或核酸的宿主细胞。本文进一步描述一种用于制造双特异性蛋白的方法，所述方法包括在使得所述核酸被表达的条件下培养含有编码本文所述的双特异性蛋白中任一者的核酸的宿主细胞，和从细胞团块或培养基回收所述蛋白。所述宿主细胞可为哺乳动物细胞(例如CHO细胞)，或细菌细胞(如大肠杆菌)。
另一方面，本文描述一种用于治疗包括狼疮肾炎在内的全身性红斑狼疮的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的本文所述的双特异性蛋白或包含所述双特异性蛋白的药物组合物中的任一者。另一治疗剂可在所述双特异性蛋白之前、之后或与其并行地施用于所述患者。所述另一治疗剂可为皮质类固醇、抗疟药、视黄酸、NSAID、环磷酰胺、脱氢表雄酮、吗替麦考酚酯、硫唑嘌呤、苯丁酸氮芥、甲氨蝶呤、他克莫司、氨苯砜、沙立度胺、来氟米特或环孢霉素。
另一方面，本文描述一种治疗方法，其包括向患者施用治疗有效量的本文所述的双特异性蛋白或包含本文所述的双特异性蛋白的药物组合物中的任一者，其中所述患者具有选自由以下组成的组的疾病：ANCA阳性血管炎、类风湿性关节炎(RA)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、乳糜泻、天疱疮、类天疱疮、亚急性皮肤红斑狼疮(SCLE)、多发性硬化、慢性发炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、重症肌无力、古德帕斯彻氏综合征、肾小球肾炎、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、干燥综合征、全身性硬化、桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯病、阿狄森氏病以及多发性内分泌腺瘤(MEN)。
另一方面，本文描述包含本文所述的双特异性蛋白或包含SEQIDNO：6或SEQIDNO：7的蛋白中的任一者的药物组合物。所述药物组合物可例如用于治疗全身性红斑狼疮或狼疮肾炎。
另一方面，描述本文所提供的任何双特异性蛋白作为药剂的用途。
附图简述
图1：结合于BAFF和B7RP1的双特异性蛋白的图。在顶行中列出各构建体的标识符。在第二行中为与各构建体的结构有关的简要描述性短语。在底端行中为各构建体的结构图。未填充的椭圆形表示免疫球蛋白重链或轻链的恒定区。由水平线填充的椭圆形表示免疫球蛋白重链或轻链可变(VH或VL)区。小的实心填充的正方形和环表示BAFF结合肽。铰链区以深色垂直线示出，而二硫桥以深色水平线示出。图1中“G4S”的序列以SEQIDNO：72公开。
图2：人类B细胞增殖测定中双特异性蛋白的活性。图2A(顶部)和2B(底部)中所示的数据来自如实施例1中所述执行的B细胞增殖测定。在两个图中，x轴指示测定混合物中所含的双特异性蛋白的浓度(log[nM])，并且y轴指示3H-胸苷摄取的量(每分钟计数(cpm))。各符号的含义由针对所测定的各蛋白的标识符指示。所述标识符的含义在图1中示出并且在实施例1中加以解释。
图3：人类T细胞增殖测定中双特异性蛋白的活性。所示的数据来自如实施例1中所述执行的T细胞增殖测定。x轴指示测定混合物中的双特异性或αB7RP1抗体的浓度(log[nM])，并且y轴指示相对于无B7RP1抑制剂的情况下的T细胞3H-胸苷摄取，在所指示的浓度下的B7RP1抑制剂存在下T细胞3H-胸苷摄取的百分比(占对照的百分比)。指示所测试的各蛋白的标识符。
图4：用葡萄球菌肠毒素B(SEB)刺激的人类扁桃体细胞的细胞因子释放。方法描述于实施例1中。y轴示出使用MesoScaleDiscovery(Rockville，Maryland)试剂盒根据制造商的说明书测量的针对各种细胞因子所检测的信号的水平。细胞用αB7RP1(泳道1)、P74293(泳道2)、CTLA4-Ig(泳道3)或人类IgG(泳道4)处理。本图中指示所测定的细胞因子。
图5：小鼠中双特异性构建体的药物代谢动力学分布。用于评估小鼠中P71617、P71619、P71621、P71622、P74293以及P74294的体内药物代谢动力学特性的方法描述于实施例1中。如实施例1中所解释，所述双特异性蛋白通过两种不同测定来检测，其中一种测定仅检测所述蛋白的Fc部分(由填充菱形指示的数据点；Fc测定)并且其中一种测定检测所述蛋白的Fc和BAFF结合部分(由填充正方形指示的数据点；完整测定)。x轴指示注射后时间(小时)，并且y轴指示在血清中检测的所述蛋白的浓度(ng/mL)。所注射的构建体在各图中指示。
图6A：结合于BAFF和B7RP1的鼠类代替物双特异性分子(“鼠类代替物”)对鼠类B细胞增殖的抑制。所述测定如实施例2中所述执行。所述鼠类代替物包含抗鼠类B7RP1IgG抗体，所述抗体具有连接于所述抗体的免疫球蛋白重链的C端的BAFF结合肽的两个拷贝，如实施例2中所解释。阳性对照为BAFF结合肽体(“αBAFF”)。来自所述鼠类代替物和αBAFF的数据分别由实心填充的圆和正方形指示。x轴指示所述测定中这些测试蛋白的浓度(log[pM])，并且y轴指示3H-胸苷并入(cpm)。
图6B：所述鼠类代替物对结合于鼠类T细胞的B7RP1的抑制。所述测定如实施例2中所述执行。抗鼠类B7RP1IgG抗体(“抗mB7RP1”)用作阳性对照。来自所述鼠类代替物和抗mB7RP1的数据分别由实心填充的圆和正方形指示。x轴指示所述测定中这些测试蛋白的浓度(log[pM])，并且y轴指示结合于T细胞的鼠类B7RP1-Fc的百分比。
图7：向小鼠施用绵羊红细胞对免疫学参数的体内效应。本图中所示的所有结果均来自实施例2中所述的测定。用于处理小鼠的蛋白由如下各条形中的填充指示：未填充，抗mB7RP1；垂直线，αBAFF；水平线，抗mB7RP1加αBAFF；对角线，所述鼠类代替物；棋盘形，mIgG1；以及实心填充(仅在底部图中)，小鼠未用SBRC激发。顶部图，在用绵羊红细胞(SRBC)激发的小鼠中的脾B细胞的百分比。y轴指示来自脾的作为B细胞的细胞的百分比。中间图，在用SRBC激发的小鼠中作为记忆T细胞的脾CD4+T细胞的百分比。底部图，在来自用SRBC激发的小鼠的血清中抗SRBC抗体的水平。
图8A：用多种蛋白处理的NZB/NZW小鼠中的蛋白尿。方法描述于实施例2中。针对各组小鼠的处理如下指示：填充圆，磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)；填充正方形，鼠类IgG1(同型对照；5mg/kg)；未填充正方形，抗mB7RP1(4.68mg/kg)；填充的向上三角形，αBAFF(1.88mg/kg)；未填充的向上三角形，αBAFF(1.88mg/kg)加抗mB7RP1(4.68mg/kg)；以及未填充倒三角形，所述鼠类代替物(5mg/kg)。x轴指示小鼠的年龄(月)，并且y轴指示展现蛋白尿(即尿中≥300mb/dL蛋白)的小鼠的百分比。
图8B：在用多种蛋白处理的8.5月龄的NZB/NZW小鼠中针对双链DNA(dsDNA)的抗体的水平。方法描述于实施例2中。x轴指示如下用于处理小鼠的分子的身份：1，抗mB7RP1(4.68mg/kg)；2，αBAFF(1.88mg/kg)；3，αBAFF(1.88mg/kg)加抗mB7RP1(4.68mg/kg)；4，所述鼠类代替物双特异性(5mg/kg)；以及5，mIgG1(同型对照；5mg/kg)。y轴指示以阳性对照的百分比检测的抗dsDNA抗体的水平。各点指示来自单一小鼠的数据。
图9A：NZB/NZW小鼠中抗dsDNAIgG的水平。方法描述于实施例2中。来自各组小鼠的数据如下鉴定：1，接受抗mB7RP1(14mg/kg)的小鼠；2，接受αBAFF(5.6mg/kg)的小鼠；3，接受抗mB7RP1(14mg/kg)和αBAFF(5.6mg/kg)的组合的小鼠；4，接受所述鼠类代替物(15mg/kg)的小鼠；5，接受mIgG同型对照(15mg/kg)的小鼠；以及6，接受PBS的小鼠。在泳道1、3以及4上方的星号指示在这些泳道中的数据与来自泳道5(mIgG)的数据之间的显著(*，p＜0.05；***，p＜0.0001)差异。
图9B：各组中具有蛋白尿的NZB/WF1小鼠的百分比。方法描述于实施例2中。来自各组小鼠的数据如下鉴定：未填充正方形，接受抗mB7RP1(14mg/kg)的小鼠；填充的向上三角形，接受αBAFF(5.6mg/kg)的小鼠；未填充的向上三角形，接受抗mB7RP1(14mg/kg)和αBAFF(5.6mg/kg)的组合的小鼠；未填充倒三角形，接受所述鼠类代替物(15mg/kg)的小鼠；填充正方形，接受mIgG同型对照(15mg/kg)的小鼠；以及填充圆，接受PBS的小鼠。在所述鼠类代替物相对抗mB7RP1(p＜0.01)、αBAFF(p＜0.0001)以及mIgG(p＜0.0001)之间检测到显著差异。指示其中出现治疗的时间窗。
图10：NZB/WF1小鼠的肾评分。如实施例2中所解释，如果在研究结束之前或在研究结束时小鼠死亡，那么当小鼠死亡时收集肾。如实施例2中所述确定肾评分，其中较高评分指示较严重肾病。示出针对各组小鼠的平均值加适当误差条。各组小鼠接受以下处理：1)抗mB7RP1(14mg/kg)，用垂直线填充的条形；2)αBAFF(5.6mg/kg)，用水平线填充的条形；3)抗mB7RP1(14mg/kg)和αBAFF(5.6mg/kg)的组合，用窗格纹填充的条形；4)所述鼠类代替物(15mg/kg)，用棋盘形图案填充的条形；5)mIgG(15mg/kg)，用黑色背景上的白点填充的条形；以及6)PBS，实心填充的条形。星号指示与用mIgG处理的小鼠的显著差异，其中p值为＜0.05(*)或＜0.001(***)。
图11：BAFF和/或B7RP1的抑制作用对鼠类胶原蛋白诱导的关节炎的效应。方法描述于实施例4中。五组小鼠用如下指示的测试物质处理：mIgG，由实线连接的填充正方形；PBS，由虚线连接的填充正方形；抗mB7RP1，由虚线连接的填充圆；αBAFF，由实线连接的空心圆；以及抗mB7RP1和αBAFF的组合，由实线连接的填充圆。顶部图示出各组的关节炎的发病率百分比，并且底部图示出所述组的平均关节炎评分。各图中的垂直、朝下箭头指示用牛胶原蛋白进行二次免疫的时间。
序列表的简述
详述
本文提供结合于并且抑制B细胞激活因子(BAFF；还称作BLYS、TALL1、THANK或TNFSF13B)和B7相关蛋白1(B7RP1；还称作ICOS配体、ICOSL、LICOS、B7同系物2、B7H2以及GL50)的双特异性蛋白、编码这些双特异性蛋白的核酸以及制造和使用这些蛋白的方法。所述双特异性蛋白可抑制BAFF介导的B增殖和B7RP1介导的T细胞增殖。另一方面，所述双特异性蛋白可抑制结合于T细胞的B7RP1。所述双特异性蛋白可为IgG抗体，所述抗体包含两条不同的免疫球蛋白重链和两条不同的免疫球蛋白轻链，其中一个重链/轻链对结合于BAFF并且另一对结合于B7RP1。或者，所述双特异性蛋白的B7RP1结合部分可包含包括两条同一重链和两条同一轻链的IgG抗体，并且所述双特异性蛋白的BAFF结合部分可包含一种或多种BAFF结合肽，所述肽可任选地经由所述免疫球蛋白重链或轻链的N端、所述免疫球蛋白重链的羧基端和/或在所述免疫球蛋白重链的CH2和/或CH3区内融合至所述抗B7RP1抗体。
定义
如本文意指的“抗体”为包含重链和/或轻链免疫球蛋白可变区的蛋白。
如本文意指的“双特异性”蛋白为可特异性结合于两种不同分子的蛋白，所述分子在一些实施方案中为蛋白。例如，在一些实施方案中，双特异性蛋白可结合于BAFF和B7RP1。
当患者在相同的总时间范围内，任选地在完全同一时间接受两种或更多种治疗剂时，所述患者正在接受所述两种或更多种治疗剂的“并行”治疗。例如，如果患者持续地每天服用一种治疗剂并且还持续地每月一次服用另一治疗剂，那么所述患者将并行地接受这两种药物。同样，服用两种不同的治疗剂(各治疗剂每隔两周施用，但不在同一天)的患者将接受所述两种治疗剂的并行治疗。此外，持续地每周一次接受一种治疗剂并且持续仅三天每天一次接受另一治疗剂的患者将在一段短时间内接受这两种治疗剂的治疗。
如本文意指，“Fc区”为由通过一个或多个二硫键接合的两条多肽链组成的二聚体，各链包含铰链结构域的一部分或全部加CH2和CH3结构域。所述多肽链各称为“Fc多肽链”。更具体说来，预期用于本发明的Fc区为IgGFc区，其可为哺乳动物(例如人类)IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区。在人类IgG1Fc区中，已知至少两种等位基因类型。Fc多肽链的氨基酸序列与哺乳动物Fc多肽的氨基酸序列的不同之处可在于相对于哺乳动物Fc多肽氨基酸序列不超过20、15、12、10、8、5或3个单一氨基酸的取代、插入或缺失。或者或另外，Fc多肽链的氨基酸序列与已知或天然存在的Fc多肽链的序列的不同之处可在于每100个序列氨基酸不超过10个单一氨基酸的插入、缺失或取代。在一些实施方案中，所述变异可为“异质二聚化改变”，其促进异质二聚体超过同型二聚体形成。在提到Fc多肽链内的特定位置时，使用EU编号系统(Edelman等人(1969)，Proc.Natl.Acad.Sci.63：78-85)，如下表1中人类IgGFc多肽链的比对所说明。
表1：人类IgGFc区的氨基酸序列的比对
在一些位置处，可发生天然存在的多态现象。例如，在上文给出的IgG2序列中的位置282处的甲硫氨酸更典型地为天然存在的IgG2序列中的缬氨酸。同样，在IgG3序列中的位置296处的酪氨酸也可为苯丙氨酸。
“异质二聚化改变”一般是指两条不同的IgG重链的CH3区中的改变，所述改变促进形成异质二聚重链二聚体，即，二聚化的不具有同一氨基酸序列的重链。异质二聚化改变可为不对称的，即，一条具有特定改变的重链可与另一条具有不同改变的重链配对。这些改变促进异质二聚化并且不利于同型二聚化。所述配对的异质二聚化改变的一个实例为所谓的“旋钮和孔(knobsandholes)”取代。参见例如美国专利7,695,936和美国专利申请公布2003/0078385，其中描述所述突变的部分以引用的方式并入本文。如本文意指，含有一对旋钮和孔取代的重链-重链对在一条重链中含有一种取代并且在另一条重链中含有另一种取代。例如，已经发现以下旋钮和孔取代如与由未修饰的重链发现的取代相比增加异质二聚体形成：1)一条链中的Y407T和另一条链中的T366Y；2)一条链中的Y407A和另一条链中的T366W；3)一条链中的F405A和另一条链中的T394W；4)一条链中的F405W和另一条链中的T394S；5)一条链中的Y407T和另一条链中的T366Y；6)一条链中的T366Y和F405A和另一条链中的T394W和Y407T；7)一条链中的T366W和F405W和另一条链中的T394S和Y407A；8)一条链中的F405W和Y407A和另一条链中的T366W和T394S；以及9)Fc的一种多肽中的T366W和另一多肽中的T366S、L368A以及Y407V。如本文意指，Fc多肽中的突变以另一种方式指示。使用EU编号系统(其提供于Edelman等人(1969)，Proc.Natl.Acad.Sci.63：78-85中)通常存在于CH3区中的给定位置处的氨基酸(使用单字母代码)之后为EU位置编号，其后为存在于这个位置处的替代氨基酸。例如，Y407T意指通常存在于EU位置407处的酪氨酸由苏氨酸置换。为了清晰起见，所述EU编号系统在下表1中加以说明。或者或除所述改变外，产生新的二硫桥的取代也可促进异质二聚体形成。参见例如美国专利申请公布2003/0078385，其中描述所述突变的部分以引用的方式并入本文。IgG1Fc区中的所述改变包括例如以下取代：一条Fc-多肽链中的Y349C和另一条链中的S354C；一条Fc-多肽链中的Y349C和另一条链中的E356C；一条Fc-多肽链中的Y349C和另一条链中的E357C；一条Fc-多肽链中的L351C和另一条链中的S354C；一条Fc-多肽链中的T394C和另一条链中的E397C；或一条Fc-多肽链中的D399C和另一条链中的K392C。同样，改变例如CH3-CH3界面中的一个或多个残基的电荷的取代可增强异质二聚体形成，如WO2009/089004中所解释，所述文献中描述所述取代的部分以引用的方式并入本文。所述取代在本文中被称为“电荷对取代”并且含有一对电荷对取代的Fc区在一条重链中含有一种取代并且在另一条重链中含有不同取代。电荷对取代的一般实例包括以下：1)一条链中的R409D、R409E、K409D或K409E加另一条链中的D399K或D399R；2)一条链中的N392D、N392E、K392D或K392E加另一条链中的D399K或D399R；3)一条链中的K439D或K439E加另一条链中的E356K、E356R、D356K或D356R；以及4)一条链中的K370D或K370E加另一条链中的E357K或E357R。另外，两条链中的取代Q355D、Q355E、R355D、R355E、K360D或K360R在与其它异质二聚化改变一起使用时可稳定化异质二聚体。特定电荷对取代可单独或与其它电荷对取代一起使用。单对电荷对取代和其组合的特定实例包括以下：1)一条链中的K409E加另一条链中的D399K；2)一条链中的K409E加另一条链中的D399R；3)一条链中的K409D加另一条链中的D399K；4)一条链中的K409D加另一条链中的D399R；5)一条链中的K392E加另一条链中的D399R；6)一条链中的K392E加另一条链中的D399K；7)一条链中的K392D加另一条链中的D399R；8)一条链中的K392D加另一条链中的D399K；9)一条链中的K409D和K360D加另一条链中的D399K和E356K；10)一条链中的K409D和K370D加另一条链中的D399K和E357K；11)一条链中的K409D和K392D加另一条链中的D399K、E356K以及E357K；12)一条链中的K409D和K392D和另一条链中的D399K；13)一条链中的K409D和K392D加另一条链中的D399K和E356K；14)一条链中的K409D和K392D加另一条链中的D399K和D357K；15)一条链中的K409D和K370D加另一条链中的D399K和D357K；16)一条链中的D399K加另一条链中的K409D和K360D；以及17)一条链中的K409D和K439D加另一条链中的D399K和E356K。这些异质二聚化改变中的任一者均可为如本文所述的免疫球蛋白IgG重链的一部分。
如本文意指的“人类”抗体或蛋白为由人类起源的核酸序列编码的抗体或蛋白。人类抗体或蛋白可在培养的非人类细胞中或在已经引入编码所述人类抗体或蛋白的核酸分子的转基因生物体中体内制得。或者，人类抗体或蛋白可在培养的人类细胞中或在人类中体内制得。
如本文意指的“IgG抗体”为主要由存在于大多数天然存在的IgG抗体中的免疫球蛋白结构域组成的抗体，所述结构域即包含重链可变(VH)区、第一重链恒定(CH1)区、铰链区、第二重链恒定(CH2)区以及第三重链恒定(CH3)区的免疫球蛋白重链和包含轻链可变(VL)区和轻链恒定(CL)区的轻链。所述免疫球蛋白结构域的多种序列报告于科学文献中，例如报告于SEQUENCESOFIMMUNOLOGICALINTEREST，PublicHealthService，N.I.H.，Bethesda，MD，1991中。如本文意指的IgG抗体为主要由两条重链和两条轻链组成的四聚体。仅包括两条免疫球蛋白重链而不包括免疫球蛋白轻链的天然存在的抗体，如骆驼和鲨鱼中发现的一些抗体(参见例如Muyldermans等人，2001，J.Biotechnol.74：277-302；Desmyter等人，2001，J.Biol.Chem.276：26285-90；Streltsov等人(2005)，ProteinScience14：2901-2909)并非如本文意指的“IgG抗体”。IgG抗体可为人类的或可来自另一物种。另外，IgG抗体可含有相对于天然存在的IgG抗体的重链或轻链的氨基酸序列不超过40、35、30、25、20、15、10或5个单一氨基酸取代、插入和/或缺失。
“免疫球蛋白重链”是指IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗体或其变体的重链，其含有相对于由自然界起源的核酸序列所编码的免疫球蛋白重链不超过40、30、25、20、15、10或5个单一氨基酸插入、缺失或取代。“免疫球蛋白IgG重链”是限于来自IgG抗体或其变体的重链，其含有相对于由自然界起源的核酸序列所编码的IgG重链的氨基酸序列不超过40、30、25、20、15、10或5个单一氨基酸插入、缺失或取代。免疫球蛋白重链主要由多个不同的区或结构域组成，所述区或结构域包括VH区、CH1区、铰链区、CH2区以及CH3区。在一些其它同型(即IgM和IgA)中，在所述CH3区的下游包括额外区。免疫球蛋白重链和其中所包括的区一般描述于例如Carayannopoulos和Capra，Immunoglobulins：StructureandFunction，FUNDAMENTALIMMUNOLOGY中第283-314页，第3版，Paul编，RavenPress，NewYork，1993中，所述文献以引用的方式并入本文。另外，本领域中已知免疫球蛋白重链的子区的多种序列。参见例如Kabat等人，SEQUENCESOFPROTEINSOFIMMUNOLOGICALINTEREST，PublicHealthServiceN.I.H.，Bethesda，MD，1991。在一些情况下，包括免疫球蛋白重链加一些非免疫球蛋白序列的多肽链将在本文中被称为“重链”。
如本文意指的“免疫球蛋白轻链”为来自人类抗体或来自另一物种的抗体的κ或λ链。如本文意指的免疫球蛋白轻链中还包括具有相对于天然起源的核酸序列所编码的免疫球蛋白轻链不超过20、15、10或5个单一氨基酸插入、缺失和/或取代的蛋白。免疫球蛋白轻链一般描述于例如Carayannopoulos和Capra，Immunoglobulins：StructureandFunction，FUNDAMENTALIMMUNOLOGY中第283-314页，第3版，Paul编，RavenPress，NewYork，1993中，所述文献以引用的方式并入本文。免疫球蛋白轻链含有VL区和CL区。本领域中已知这些区的多种序列。参见例如Kabat等人，SEQUENCESOFPROTEINSOFIMMUNOLOGICALINTEREST，PublicHealthServiceN.I.H.，Bethesda，MD，1991。在一些情况下，包括免疫球蛋白轻链加一些非免疫球蛋白序列的多肽链将在本文中被称为“轻链”。
如本文意指的“免疫球蛋白可变区”为VH或VL区，其可具有人类起源或来自另一物种。免疫球蛋白可变区一般描述于例如Carayannopoulos和Capra，Immunoglobulins：StructureandFunction，FUNDAMENTALIMMUNOLOGY中第283-314页，第3版，Paul编，RavenPress，NewYork，1993中，所述文献以引用的方式并入本文。如本文意指的免疫球蛋白可变区中还包括具有相对于天然起源的核酸序列所编码的免疫球蛋白可变区不超过20、15、10或5个单一氨基酸插入、缺失和/或取代的蛋白。免疫球蛋白可变区含有三个高变区，称为互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)以及互补决定区3(CDR3)。这些区形成抗体的抗原结合位点。所述CDR嵌入较少可变性的构架区(FR1-FR4)内。可变区内这些子区的顺序如下：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。本领域中已知免疫球蛋白可变区的多种序列。参见例如Kabat等人，SEQUENCESOFPROTEINSOFIMMUNOLOGICALINTEREST，PublicHealthServiceN.I.H.，Bethesda，MD，1991。
CDR可以以下方式位于VH区序列中。CDR1在成熟VH区的大致残基31处开始并且通常为约5-7个氨基酸长，并且其前面几乎总是为Cys-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx(SEQIDNO：20)(其中“Xxx”为任何氨基酸)。在重链CDR1后面的残基几乎总是为色氨酸，通常为Trp-Val、Trp-Ile或Trp-Ala。在CDR1中的最后一个残基与CDR2中的第一个残基之间几乎总是有十四个氨基酸，并且CDR2典型地含有16至19个氨基酸。CDR2前面可紧接Leu-Glu-Trp-Ile-Gly(SEQIDNO：21)并且后面可紧接Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala。其它氨基酸可在CDR2之前或之后。在CDR2中的最后一个残基与CDR3中的第一个残基之间几乎总是有三十二个氨基酸，并且CDR3可为约3至25个残基长。CDR3前面几乎总是紧接Cys-Xxx-Xxx，并且Trp-Gly-Xxx-Gly(SEQIDNO：22)几乎总是在CDR3后面。
轻链CDR可以以下方式位于VL区中。CDR1在成熟抗体的大致残基24处开始并且通常为约10至17个残基长。其前面几乎总是为Cys。在CDR1的最后一个残基与CDR2的第一个残基之间几乎总是有15个氨基酸，并且CDR2几乎总是为7个残基长。CDR2前面典型地为Ile-Tyr、Val-Tyr、Ile-Lys或Ile-Phe。在CDR2与CDR3之间几乎总是有32个残基，并且CDR3通常为约7至10个氨基酸长。CDR3前面几乎总是为Cys并且后面通常为Phe-Gly-Xxx-Gly(SEQIDNO：23)。
如本文意指的“连接体”为连接两个多肽的肽。连接体可为1-80个氨基酸长。在一些实施方案中，连接体可为2-40、3-30或3-20个氨基酸长。在一些实施方案中，连接体可为不超过14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个氨基酸长的肽。在其它实施方案中，连接体可为5-25、5-15、10-20或20-30个氨基酸长。在其它实施方案中，连接体可为约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸长。在多种情况下，连接体缺乏游离半胱氨酸残基(即并且因此不涉及二硫键)并且还不含N-糖基化位点(即Asn-Xxx-Ser/Thr，其中x可为除脯氨酸外的任何氨基酸)。
如本文意指的“肽体”为一种或多种融合至Fc区的生物活性肽。Shimamoto等人(2012)，mAbs4(5)：586-591，其中解释肽体的结构和如何制造肽体的部分以引用的方式并入本文。
如本文意指的“肽”为由短氨基酸序列组成的多肽，其可或可不糖基化和/或含有经过修饰的氨基酸。肽可为2至75个氨基酸长。在一些实施方案中，肽为3-60、3-50、3-40、3-30或3-20个氨基酸长。在其它实施方案中，肽可为5-25、5-15、10-20或20-30个氨基酸长。在其它实施方案中，肽可为约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸长。
用于治疗疾病的药物的“治疗有效量”为可降低疾病的严重程度、降低与所述疾病或其治疗有关的一种或多种症状的严重程度或延迟可在所述经过治疗的病况后以一定频率出现的更严重症状或更严重疾病的发作的量。
本文所提到的任何疾病的“治疗”均涵盖所述疾病的至少一种症状的缓解、所述疾病的严重程度的降低或疾病进展至可在一些情况下伴随所述疾病或导致至少一种其它疾病的更严重症状的延迟或预防。治疗无需意指所述疾病完全治愈。适用的治疗剂仅需要降低疾病的严重程度、降低与所述疾病或其治疗有关的一种或多种症状的严重程度或延迟可在所述经过治疗的病况后以一定频率出现的更严重症状或更严重疾病的发作。例如，如果所述疾病为发炎性肠病，那么用作治疗的治疗剂可降低肠中不同发炎位点的数目或受影响的肠的总范围。其可减少疼痛和/或肿胀，减少如腹泻、便秘或呕吐的症状，和/或预防肠穿孔。患者的病况可通过标准技术来评估，如在钡灌肠或灌肠法、内窥镜检查、结肠镜检查和/或活组织检查后执行的x射线。合适的程序根据患者的病况和症状而变化。同样，如果所治疗的疾病为全身性红斑狼疮(SLE)，那么疾病活动性可能使用如下文所解释用于评分的SLEDAI指数来评估。
结合于BAFF和B7RP1的双特异性蛋白
本文公开结合于B7RP1和BAFF和/或可体外抑制B7RP1介导的T细胞增殖和BAFF介导的B细胞增殖的双特异性蛋白。如本文所述的双特异性蛋白所结合的BAFF和B7RP1蛋白可为人类蛋白和/或可为来自另一物种的蛋白，所述物种如食蟹猴、恒河猴、黑猩猩、小鼠和/或兔等。在一些实施方案中，如本文所述的双特异性蛋白可例如结合于人类(智人)和食蟹猴(食蟹猴(Macacafascicularis))B7RP1和BAFF蛋白。
在一些实施方案中，这些双特异性蛋白可为双特异性IgG抗体，其中B7RP1结合部分和BAFF结合部分各自主要由免疫球蛋白IgG重链和免疫球蛋白轻链组成。因此，所述双特异性抗体含有两条不同的免疫球蛋白重链和两条不同的免疫球蛋白轻链。合起来，这两对免疫球蛋白重链和轻链形成完整双特异性IgG抗体。本领域中已知双特异性IgG抗体，并且还已知关于双特异性抗体的多种其它格式。参见例如Kontermann，BispecificAntibodies：DevelopmentsandCurrentPerspectives，BISPECIFICANTIBODIES中第1-28页，Kontermann编，Springer-Verlag，Berlin，Heidelburg，2011，其中描述这些抗体的部分以引用的方式并入本文。无论格式如何，可结合于BAFF和B7RP1的抗体均涵盖于本文中。双特异性IgG抗体可为人类、人源化或嵌合的并且可为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。在一些实施方案中，双特异性IgG抗体可结合于其它部分。本领域中已知抗BAFF和抗B7RP1抗体的氨基酸序列。参见例如美国专利7,737,111和美国专利申请公布US2011/0117093。这些文献中描述所述抗体的部分以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，所述双特异性抗体可包含如上文所定义的促进形成异质四聚双特异性IgG抗体的“异质二聚化改变”，包括电荷对取代。
在其它实施方案中，本文所述的双特异性蛋白可为包含结合于B7RP1的抗体和结合于BAFF的肽的融合蛋白，所述抗体包含免疫球蛋白IgG重链和免疫球蛋白轻链。所述BAFF结合肽可存在于一个或多个拷贝中，如2、3、4、5、6、7、8或多达16个拷贝。所述BAFF结合肽可结合于来自如小鼠、食蟹猴和/或人类的物种和多种其它可能的物种的BAFF蛋白。所述抗体可为抗B7RP1IgG抗体，任选地为结合于人类和/或食蟹猴B7RP1的人类或人源化抗体。在一些实施方案中，连接体可连接于所述抗B7RP1IgG抗体的重链的C端，之后为第一BAFF结合肽、另一连接体以及第二BAFF结合肽。第三、第四、第五、第六、第七、第八或多达第十六BAFF结合肽可在这两种BAFF结合肽之后，任选地散布有连接体。或者或另外，一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种BAFF结合肽可插入所述抗B7RP1抗体中的其它位置，例如免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链的N端或在CH2或CH3区中的环区中。所述IgG抗体可为哺乳动物抗体，如人类或鼠类抗体。所述抗B7RP1抗体可为人类或人源化IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。在包含抗B7RP1IgG抗体的所述双特异性融合蛋白中，所述双特异性蛋白可包含包含氨基酸序列SEQIDNO：17或SEQIDNO：18的重链和包含氨基酸序列SEQIDNO：19的免疫球蛋白轻链。预期包含具有含有相对于SEQIDNO：17或18不超过30、25、20、15、10、5或3个单一氨基酸的插入、缺失或取代的氨基酸序列的重链的变体。同样，预期包含具有含有相对于SEQIDNO：19不超过20、15、10、8、7、5或3个单一氨基酸的插入、缺失或取代的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链的变体。所述双特异性蛋白可为包含两种包含氨基酸序列SEQIDNO：17或18或其变体的多肽和两条包含氨基酸序列SEQIDNO：19或其变体的轻链的四聚体。
如上文所述的双特异性融合蛋白的BAFF结合肽部分可包含氨基酸序列SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3。所述BAFF结合肽描述于美国专利7,737,111中，所述专利的相关部分以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，在所述双特异性蛋白中可存在所述BAFF结合肽的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个拷贝。BAFF结合肽可例如经由连接体连接于所述抗B7RP1抗体的羧基端。例如，抗B7RP1IgG抗体的羧基端后面可为具有例如氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly(SEQIDNO：4)的连接体。其它合适的连接体的实例尤其包括Gly-Gly、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Ser(SEQIDNO：37)、Gly-Gly-Gly-Pro(SEQIDNO：38)、Gly-Gly-Gly-Gln(SEQIDNO：39)以及Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQIDNO：40)。这一连接体后面可为BAFF结合肽。所述BAFF结合肽后面可为包含例如氨基酸序列SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7或SEQIDNO：24的另一连接体。也可能使用其它连接体。这一连接体后面可为包含例如氨基酸序列SEQIDNO：1的另一BAFF结合肽。
在上文刚描述的双特异性融合蛋白中或在上文所述的双特异性异质四聚IgG抗体中，VL区可含有分别包含氨基酸序列SEQIDNO：8、SEQIDNO：9以及SEQIDNO：10的CDR1、CDR2以及CDR3。VH区CDR1、CDR2以及CDR3可分别包含氨基酸序列SEQIDNO：11、SEQIDNO：12以及SEQIDNO：13。在一些实施方案中，所述IgG抗体的VL区可包含氨基酸序列SEQIDNO：14或其变体，并且VH区可包含氨基酸序列SEQIDNO：15或其变体。所述变体序列相对于参考序列可包含每100个氨基酸不超过10个单一氨基酸的缺失、插入或取代。
包含连接体的蛋白
本文提供具有氨基酸序列SEQIDNO：5、6或7的连接体，其对含有其的蛋白赋予有利的物理特性。如下文实施例1中所示，使用两种特定连接体(即具有氨基酸序列SEQIDNO：6和SEQIDNO：7的那些连接体)对双特异性分子的如表达、稳定性以及粘度的特性具有积极作用。因此，多种含有这些连接体的蛋白如与含有其它连接体的类似蛋白相比可具有所述有利的特性。
双特异性蛋白的治疗用途
本文所述的结合于BAFF和B7RP1的双特异性蛋白可用作多种适应症、尤其由自身抗体驱动的病况和/或由T细胞和B细胞介导的病况的治疗剂。所述病况包括例如SLE、狼疮、肾炎、ANCA阳性血管炎、类风湿性关节炎(RA)、皮肌炎、多肌炎、胃肠疾病(如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎以及乳糜泻)、皮肤病况(如天疱疮、类天疱疮以及亚急性皮肤红斑狼疮(SCLE))、神经系统疾病(如多发性硬化和慢性发炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP))、神经肌肉疾病(如重症肌无力)、涉及肾的疾病(如古德帕斯彻氏综合征和肾小球肾炎)、血液学病况(如自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)以及自身免疫性中性粒细胞减少)、肝病况(如慢性活动性肝炎和原发性胆汁性肝硬化)、干燥综合征、全身性硬化以及包括桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯病、阿狄森氏病以及多发性内分泌自身免疫衰竭(通常包括糖尿病、甲状腺机能减退、阿狄森氏病以及性腺衰竭)在内的内分泌病况。治疗有效量的如本文所述的双特异性蛋白可施用于经历这些病况中的任一种的患者以治疗所述病况。
在一个实施方案中，可抑制BAFF介导的B细胞增殖和B7RP1介导的T细胞增殖的双特异性蛋白可用于治疗经历SLE的患者。SLE为未知病因的自身免疫疾病，其特征在于细胞核自身抗原的自身反应性。其临床表现非常多样，使得不能肯定其确切地为单一疾病抑或一组相关病况。Kotzin(1996)Systemiclupuserythematosus.Cell85：303-306；Rahman和Isenberg(2008)，Systemiclupuserythematosus.N.Engl.J.Med.358：929-939。症状可包括以下：全身症状，如不适、疲劳、发热、厌食以及重量减轻；不同皮肤症状，包括成人急性、短暂面部皮疹、大疱病以及头颈部的慢性并且毁容皮疹；关节炎；肌肉疼痛和/或无力；心血管症状，如二尖瓣增厚、增殖体、反流、狭窄、心包炎以及缺血性心脏病，其中一些可最终导致中风、栓塞性疾病、心力衰竭、传染性心内膜炎或瓣膜失效；肾炎，其为SLE发病的主要原因；神经症状，包括认知功能障碍、抑郁、精神病、昏迷、癫痫病症、偏头痛以及其它头痛综合征、无菌性脑膜炎、舞蹈病、中风以及颅神经病变；血液学症状，包括白细胞减少、血小板减少、浆膜炎、贫血、凝血异常、脾肿大以及淋巴结病；以及各种胃肠异常。同上；Vratsanos等人，“SystemicLupusErythematosus，”Samter’sImmunologicalDiseases中第39章，第6版，Austen等人编，LippincottWilliams&Wilkins，Phiiladelphia，PA，2001。症状的严重程度广泛变化，所述疾病的过程也是如此。SLE可为致命的。
SLE患者可在使用SLE的现有疗法治疗之前、之后或与其并行地用抑制BAFF和B7RP1的双特异性蛋白治疗。SLE的所述现有疗法包括皮质类固醇，如泼尼松、泼尼松龙以及甲泼尼龙；抗疟药，如羟氯喹、阿的平以及氯喹；视黄酸、阿斯匹林以及其它非类固醇消炎药(NSAID)、环磷酰胺、脱氢表雄酮、吗替麦考酚酯、硫唑嘌呤、苯丁酸氮芥、甲氨蝶呤、他克莫司、氨苯砜、沙立度胺、来氟米特、环孢霉素、贝利木单抗、抗CD20抗体(如利妥昔单抗)以及融合蛋白(如阿巴西普)。
SLE患者的疾病活动性可使用如全身性红斑狼疮疾病活动性指数(SLEDAI)的手段来评定等级，所述SLEDAI提供关于疾病活动性的评分，所述评分考虑到以下症状，所述症状根据严重程度加以衡量：颠痫、精神病、器质性脑综合征、视力障碍、颅神经病症、狼疮性头痛、血管炎、关节炎、肌炎、尿管型、血尿、蛋白尿、脓尿、新皮疹、脱发、粘膜溃疡、肋膜炎、心包炎、低补体、增加的DNA结合、发热、血小板减少以及白细胞减少。Bombardier等人(1992)，Arthr.&Rheum.35(6)：630-640，其中相关部分以引用的方式并入本文。本文所述的治疗可适用于减轻或消除SLE的症状，如通过SLEDAI所测量。本文所述的治疗方法与同一患者在用如本文所述的双特异性蛋白开始治疗之前的基线值相比可改进患者的SLEDAI评分。
另一种用于评估SLE的疾病活动性的方法为不列颠群岛狼疮评估组(BILAG)指数，其为基于医师的意向治疗原则用于SLE患者的疾病活动性评估系统。Stoll等人(1996)，Ann.RheumDis.55：756-760；Hay等人(1993)，Q.J.Med.86：447-458。这些参考文献中描述BILAG的部分以引用的方式并入本文。BILAG评分是通过在八种基于器官的系统中的每一者中给出各别的数字或字母疾病活动性评分来指定：全身的(如发热和疲劳)、粘膜与皮肤的(如皮疹和脱发，以及多种其它症状)、神经的(如癫痫、偏头痛以及精神病，以及多种其它症状)、肌肉骨骼的(如关节炎)、心肺的(如心力衰竭和降低的肺功能)、血管炎和血栓形成、肾的(如肾炎)以及血液学的。同上。本文所述的治疗可适用于减轻或消除SLE的症状，如通过所述BILAG指数所测量；或如与在用如本文所述的双特异性蛋白开始治疗之前的基线值相比适用于降低患者的BILAG评分。
如本文所述的抑制B细胞的BAFF介导的增殖和T细胞的B7RP1介导的增殖的双特异性蛋白也可能用于治疗类风湿性关节炎(RA)。RA为具有全身性症状以及与关节特定相关的症状的慢性疾病。症状通常包括滑膜炎，导致疼痛并且肿胀的关节；和各种实验异常，如高于正常水平的类风湿因子、抗瓜氨酸修饰蛋白(抗CCP)抗体和C-反应蛋白(CRP)以及提高的红细胞沉降率(ESR)。不太常见的症状包括各种关节外症状，涉及例如腱、韧带、血管、心脏以及肺。疾病活动性通常可使用多种指数来测量。参见例如Anderson等人(2012)，Arthritiscare&Res.64(5)：640-647，其中讨论所述指数的部分以引用的方式并入本文。所述评分指数中所包括的要素包括关节压痛数目、肿胀关节数目、功能评估以及各种实验发现(如CRP、ESR等)。
在一些实施方案中，经历RA的患者可在用目前用于RA的药物治疗之前、之后或与其并行地用抑制BAFF介导的B细胞增殖和B7RP1介导的T细胞增殖的双特异性蛋白治疗。目前用于类风湿性关节炎(RA)的治疗剂包括非类固醇消炎药(NSAID)(如阿斯匹林和环加氧酶-2(COX-2)抑制剂)、疾病修饰消炎药(DMARD，如甲氨蝶呤、来氟米特以及柳氮磺胺吡啶)、抗疟药(如羟氯喹)、环磷酰胺、D-青霉胺、硫唑嘌呤、金盐、肿瘤坏死因子抑制剂(如依那西普、英利昔单抗、阿达木单抗、戈利木单抗以及聚乙二醇化赛妥珠单抗)、CD20抑制剂(如利妥昔单抗)、IL-1拮抗剂(如阿那白滞素)、IL-6抑制剂(如托珠单抗)、Janus激酶的抑制剂(JAK，如托法替尼)、阿巴西普以及皮质类固醇等。
治疗有效量的如本文所述的抑制B细胞的BAFF介导的增殖和T细胞的B7RP1介导的增殖的双特异性蛋白也可用于治疗发炎性肠病，如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎。克罗恩氏病涉及从口腔至肛门的消化道中任何部分的异常发炎，不过在大多数患者中异常发炎限于回肠结肠、小肠以及结肠-肛门直肠区。典型地，发炎为不连续的。常见症状包括腹痛、厌食、重量减轻、发热、腹泻、右下腹部发胀和/或压痛、便秘、呕吐以及肛周不适和有分泌物。其它可能的症状包括外周关节炎、生长阻滞、巩膜外层炎、口疮性口炎、结节性红斑、坏疽性脓皮病、肾结石、受损的尿稀释和碱化、吸收障碍以及胆石等。参见例如Strober等人，MedicalImmunology，第10版，第III节，第35章(2001)；MerckManualofDiagnosisandTherapy，第17版，第3节，第31章(1999)。从具有克罗恩氏病的患者分离的巨噬细胞产生增加的量的IL-12、IFNγ、TNFα以及其它发炎细胞因子。
尽管有时难以与克罗恩氏病区分，溃疡性结肠炎在多个方面与克罗恩氏病不同。首先，其一般限于结肠，而克罗恩氏病可在整个消化道中发生。其次，溃疡性结肠炎主要涉及肠中仅表层的发炎，不同于克罗恩氏病，在克罗恩氏病中发炎可穿透肠壁或消化道中的其它位置。最后，溃疡性结肠炎典型地涉及连续发炎区域，而非克罗恩氏病所特有的不连续发炎位点。不同于克罗恩氏病，渍疡性结肠炎主要在市区中发现。另外，遗传因子可能在溃疡性结肠炎中发挥作用，因为存在家族聚集性病例。与克罗恩氏病患者相比，更通常在溃疡性结肠炎患者中观察到自身抗体。所述自身抗体通常导向结肠上皮细胞组分。最常见对过氧化氢酶、α-烯醇酶以及乳铁蛋白具特异性的抗中性白细胞细胞质抗体。在一些情况下，所述抗体与结肠微生物交叉反应。
在临床试验中，克罗恩氏病活动性通常使用克罗恩氏病活动性指数(CDAI)来评分。所述CDAI基于八种因素提供疾病活动性评分，所述因素包括(1)每天液体或软粪便的数目，(2)每天腹痛的量的患者等级评定，(3)总体幸福感的患者等级评定，(4)其它症状的患者报告，包括关节炎、虹膜炎、葡萄膜炎、结节性红斑、坏疽性脓皮病、口疮性口炎、肛裂、肛瘘或肛门脓肿、其它瘘或发热，(5)针对腹泻服用止泻宁或其它阿片制剂的患者报告，(6)腹部包块，(7)红细胞压积，以及(8)体重。参见例如Best等人(1976)，Gastroenterol.70：439-444，其中相关部分以引用的方式并入本文。
溃疡性结肠炎的症状为可变的。其可包括腹泻、里急后重、腹部绞痛、粪便中带血和粘液、发热以及直肠出血。也可发生中毒性巨结肠，这是一种潜在威胁生命的病况，其中结肠扩张超过约6厘米并且可失去其肌肉紧张和/或穿孔。可伴随溃疡性结肠炎的其它症状包括外周关节炎、强直性脊柱炎、骶髂关节炎、前葡萄膜炎、结节性红斑、坏疽性脓皮病、巩膜外层炎、自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎、肝硬化以及儿童生长和发育阻滞。
在一些实施方案中，经历如克罗恩氏病或渍疡性结肠炎的发炎性肠病(IBD)的患者可在用IBD的现有疗法治疗之前、之后或与其并行地用结合于BAFF和B7RP1的双特异性蛋白治疗。IBD的现有治疗剂包括例如柳氮磺胺吡啶、5-氨基水杨酸和其衍生物(如奥撒拉嗪、巴柳氮以及马沙拉嗪)、抗TNF抗体(包括英利昔单抗、阿达木单抗、戈利木单抗以及聚乙二醇化赛妥珠单抗)、用于口服或肠胃外施用的皮质类固醇(包括泼尼松、甲泼尼龙、布地奈德或氢化可的松)、促肾上腺皮质激素、抗生素(包括甲硝唑、环丙沙星或利福昔明)、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、环孢霉素、他克莫司以及沙立度胺。
编码双特异性蛋白的核酸
本文提供编码可抑制B7RP1介导的T细胞增殖和BAFF介导的B细胞增殖的双特异性蛋白的核酸。例如，SEQIDNO：52编码具有氨基酸序列SEQIDNO：14的VL区，并且SEQIDNO：53编码具有氨基酸序列SEQIDNO：15的VH区。同样，SEQIDNO：55和56分别编码氨基酸序列SEQIDNO：17和18，所述氨基酸序列SEQIDNO：17和18为包含融合至两种BAFF结合肽的抗B7RP1抗体的重链的多肽。SEQIDNO：57编码抗B7RP1抗体的轻链，所述轻链可为如上文所述的异质四聚双特异性IgG抗体或双特异性融合蛋白的一部分。预期编码本文提供的任何氨基酸序列的任何核酸序列。同样，相对于本文所公开的序列包括沉默突变或编码上文所述的氨基酸序列变体的核苷酸序列变体也包括在本发明的范围内。更具体说来，预期编码与本文所公开的氨基酸序列的不同之处在于每100个氨基酸不超过10个单一氨基酸的插入、缺失或取代的氨基酸序列的核苷酸序列。
编码本文所述的双特异性蛋白的核酸序列可由本领域技术人员基于本文所提供的氨基酸序列和本领域中的知识来确定。除了产生编码特定氨基酸序列的克隆的DNA区段的更传统方法以外，如DNA2.0(MenloPark，CA，USA)和BlueHeron(Bothell，WA，USA)等公司现在常规地按定单产生具有任何所需序列的化学合成的基因大小的DNA，因此使产生所述DNA的过程流线化。可调节密码子用法以便优化所选系统中的表达。
制造结合于BAFF和B7RP1的双特异性蛋白的方法
编码本文所述的双特异性蛋白的核酸可插入其中将表达所述核酸的宿主细胞的适当载体中。这些核酸可通过本领域中众所周知的任何方法引入至宿主细胞中。可使用的宿主细胞包括细菌，包括大肠杆菌(Escherichiacoli)；酵母，包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或毕赤酵母(Pichiapastoris)；昆虫细胞，包括草地夜蛾细胞；植物细胞；以及哺乳动物细胞，包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞、HeLa细胞、人类肝细胞癌细胞以及293细胞等。这些宿主细胞可在使得所引入的核酸将表达的条件下培养，并且所述双特异性蛋白可从培养上清液或细胞团块回收。
一般来说，用于将所述核酸引入至宿主细胞中的程序可取决于其中将要引入所述核酸的宿主细胞。将核酸引入至细菌中的方法为本领域中众所周知的。例如，通常使用电穿孔或氯化钙转化。用于将核酸引入至酵母中的方法也为本领域中众所周知的并且包括例如使用乙酸锂和聚乙二醇的转化方法。用于将异源聚核苷酸引入至哺乳动物细胞中的方法为本领域中众所周知的并且包括但不限于葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将所述聚核苷酸封装于脂质体中以及将所述DNA直接微量注射至细胞核中。
用于任何宿主细胞的表达载体均可含有DNA复制、含有所述载体的宿主细胞的选择以及外源核苷酸序列的表达所必需的序列。所述序列可典型地包括以下核苷酸序列中的一者或多者：启动子、一种或多种增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完全内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码将要表达的多肽的核酸的聚连接体区以及可选择标志物元件。适合用于多种宿主细胞中的表达的多种表达载体为本领域中已知的并且为市面上有售的。
药物组合物、给药以及施用方法
提供包含本文所述的双特异性蛋白的药物组合物。所述组合物可包含治疗有效量的双特异性蛋白，以及一种或多种额外组分，如生理学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。所述额外组分可包括缓冲剂、碳水化合物、多元醇、氨基酸、螯合剂、稳定剂和/或防腐剂以及多种可能性。多种所述额外组分描述于例如REMINGTON′SPHARMACEUTICALSCIENCES，第18版，(A.R.Gennaro编)，1990，MackPublishingCompany中，其中相关部分以引用的方式并入本文。
可调节本文所述的双特异性蛋白的给药以实现所需效应。在多种情况下，由于所治疗的疾病的长期性质将需要重复给药。例如，如本文所述的双特异性蛋白可每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次、每八周一次、每九周一次或每十周一次或每两个月一次、每三个月一次、每四个月一次、每五个月一次或每六个月一次给药。在施用所述双特异性蛋白的每一天所施用的双特异性蛋白的量可为约0.0036mg至约700mg。或者，所述剂量可根据患者的估计皮肤表面来校准，并且各剂量可为约0.002μg/m2至约350mg/m2。在另一替代方案中，所述剂量可根据患者的重量来校准，并且各剂量可为约0.000051mg/kg至约10.0mg/kg。
所述双特异性蛋白或含有这些分子的药物组合物可通过任何可行的方法来施用。包含蛋白的治疗剂将通常通过肠胃外途径，例如通过注射来施用，因为在一些特殊制剂或情况不存在下，口服施用将导致所述蛋白在胃的酸性环境中水解。皮下、肌肉内、静脉内、动脉内、病变内以及腹膜团注为可能的施用途径。所述双特异性蛋白也可经由输注，例如静脉内或皮下输注来施用。表面施用也为可能的，尤其对于涉及皮肤的疾病来说。或者，所述双特异性蛋白可通过与粘膜接触来施用，例如通过鼻内、舌下、阴道或直肠施用或作为吸入剂施用。或者，包含双特异性蛋白的某些适当药物组合物可口服施用。
上文已经以通用术语描述了本发明，以下实施例以说明而非限制的方式来提供。
实施例
实施例1：针对人类治疗用途设计和测试BAFF/B7RP1双特异性分子
这一系列实验的目标是发现(1)抑制BAFF介导的B细胞增殖和B7RP1介导的T细胞增殖，(2)在生物测定中具高度活性，以及(3)具有有利的生物物理特性的双特异性分子。图1中说明使结合人类BAFF的肽融合至抗人类B7RP1IgG抗体(抗huB7RP1)的多种示意性设计。所述BAFF结合肽的序列以SEQIDNO：1提供，并且抗huB7RP1的免疫球蛋白重链和轻链的序列分别以SEQIDNO：25和SEQIDNO：19提供。
为了确定何种设计在保持生物活性的同时具有最佳的生物物理特性，制造并且测试图1中图示的所述双特异性分子。在一种构建体中，具有介入连接体(“1K连接体”，具有氨基酸序列SEQIDNO：24)的所述BAFF结合肽的两个串联拷贝融合至抗huB7RP1的免疫球蛋白重链(P71617)或免疫球蛋白轻链(P71618)的N端。参见图1。所述P71617重链的氨基酸序列以SEQIDNO：26提供，并且P71617的轻链的氨基酸序列与抗huB7RP1的免疫球蛋白轻链的氨基酸序列(SEQIDNO：19)相同。所述P71618轻链的氨基酸序列以SEQIDNO：27提供，并且P71618的重链的氨基酸序列与抗huB7RP1的免疫球蛋白重链(SEQIDNO：25)相同。所述BAFF结合肽的两个串联拷贝还在所述两个BAFF结合肽之间使用上文提到的1K连接体(具有氨基酸序列SEQIDNO：24；P71619)或5X(G4S)连接体(SEQIDNO：71)融合至抗huB7RP1(具有氨基酸序列SEQIDNO：25)的免疫球蛋白重链的C末端(P71620)。这两种融合构建体的重链的氨基酸序列以SEQIDNO：16(P71619)和SEQIDNO：28(P71620)提供。在构建体P71621中，具有介入1K连接体的所述BAFF结合肽的两个串联拷贝插入至抗体的CH3结构域中氨基酸序列SEQIDNO：25(抗huB7RP1抗体的免疫球蛋白重链的氨基酸序列)的残基358与359之间。所述P71621构建体的重链的序列以SEQIDNO：29提供。在构建体P71622中，所述BAFF结合肽插入至抗huB7RP1的免疫球蛋白重链的CH3结构域中(在SEQIDNO：25的残基358与359之间)并且所述BAFF结合肽的第二拷贝融合至所述重链的C末端。P71622的重链的氨基酸序列以SEQIDNO：30提供。在构建体P71623中，一个BAFF结合肽插入至CH2区中(在SEQIDNO：25的残基268与269之间)并且第二BAFF结合肽插入至CH3区中(在SEQIDNO：25的残基358与359之间)。SEQIDNO：31为P71623的重链的氨基酸序列。构建体P71619-P71623均具有抗huB7RP1的免疫球蛋白轻链(SEQIDNO：19)。
在构建体P74293和P74294中，对构建体P71619中的所述BAFF结合肽的两个串联拷贝之间的连接体进行修饰。P74293和P74294的重链的氨基酸序列分别以SEQIDNO：17和SEQIDNO：18提供。这些构建体的免疫球蛋白轻链也具有氨基酸序列SEQIDNO：19。
编码上文所述的构建体的核酸制造如下。以合成方式产生编码N端BAFF肽融合体(P71617和P71618)的N端部分的核酸，所述融合体包括所述BAFF结合肽的两个拷贝加免疫球蛋白重链或轻链可变区。这些核酸在适当载体中通过便利的限制性核酸内切酶位点接合至编码免疫球蛋白重链或轻链恒定区的核酸。编码重链恒定区C端融合体(P71619和P71620)、Fc-环插入物(P71621和P71623)以及Fc-环插入物/C端融合体(P71622)的核酸均以合成方式产生并且通过便利的限制性核酸内切酶位点接合至含有所述重链可变区的载体中。
上文所述的各种双特异性构建体在短暂转染的293细胞和稳定转染的CHO细胞中表达。所述融合蛋白经过纯化并且针对生物活性加以测试。在这两个不同种类的宿主细胞中产生的蛋白中未观察到差异。
所述双特异性分子的BAFF抑制活性在BAFF介导的人类原代B细胞增殖测定中进行测试。简单地说，使用阴性选择使用来自MiltenyiBiotec(Auburn，CA)的人类B细胞试剂盒II从外周血单核细胞(PBMC)纯化人类B细胞。约105个经过纯化的B细胞在96孔微量滴定板中在最小必需培养基(MEM)加10％热灭活胎牛血清(FBS)中在50ng/ml人类BAFF蛋白、2g/ml山羊F(ab’)2抗人类IgM(JacksonImmunoResearch)以及变化浓度的上文所述的一种双特异性蛋白存在下在37℃下在5％CO2中培养48小时。抗BAFF肽体用作阳性对照(“αBAFF”，其为含有两条多肽链的同型二聚体，各链包含两种融合至Fc多肽的BAFF结合肽)。所述αBAFF分子详细地描述于美国专利7,259,137中，并且这种同型二聚体的一条多肽链的氨基酸序列以SEQIDNO：32提供。美国专利7,259,137中描述αBAFF的部分以引用的方式并入本文。增殖通过在最后18小时的孵育期间放射性3H-胸苷的摄取来测量。结果在图2A和2B中示出。
图2A中的数据指示两种C端融合构建体(P71619和P71620)在抑制BAFF介导的B细胞增殖方面彼此可相当并且比这项实验中所测试的所有其它融合构建体均有效。P71620不再继续进行，因为其趋向于聚集，这种特性在治疗性蛋白中极不可取。图2B中的数据指示P71619在抑制BAFF介导的B细胞增殖方面与上文所述的这种构建体的两种略微修饰形式(P74293和P74294)和阳性对照(αBAFF)可相当。因此，在所测试的双特异性构建体中，P71619、P71620、P74293以及P74294在BAFF介导的B细胞增殖的这种测定中具有可相当的活性并且具有优于所测试的所有其它构建体的活性。
P71619、P74293以及P74294的B7RP1抑制活性使用人类B7RP1-Fc介导的T细胞增殖测定来测定。原代人类T细胞使用来自MiltenyiBiotec(Auburn，CA)的PanT细胞分离试剂盒从来自健康人类供体的PBMC纯化并且在变化浓度的上文所述的双特异性蛋白或IgG2抗人类B7RP1抗体(本文中称为“αB7RP1”)存在下用板结合的抗CD3(1μg/mL)抗体和B7RP1-Fc融合蛋白(3μg/mL)刺激。48小时后3H-胸苷添加至细胞中，并且24小时后测量3H-胸苷的并入。所有测试的双特异性抗体均具有类似的IC5o，其类似于αB7RP1的IC5o(图3)。因此，这些数据表明所述BAFF结合肽与所述抗huB7RP1抗体的结合对所述抗体抑制B7RP1活性的能力几乎不具有影响。
异质二聚双特异性抗体P74293和P74294对BAFF和B7RP1的结合亲和力通过动力学排阻测定(SapidyneInstruments，Boise，Idaho)测量。两种抗体均对人类BAFF(具有约30pM的Kd)和人类B7RP1(具有约40pM的Kd)具有高结合亲和力。参见下表2。另外，这些双特异性物均与人类BAFF相比对食蟹猴BAFF具有类似的结合亲和力并且与人类B7RP1相比对食蟹猴B7RP1具有类似的结合亲和力。表2。
表2：P74293和P74294的结合亲和力和细胞效力。
＊ND意指未测定。
为了进一步评估P74293在使用人类细胞的体外系统中的活性，在多种测试分子存在下评估由葡萄球菌肠毒素B(SEB)激活的人类扁桃体细胞的细胞因子产生。简单地说，人类扁桃体细胞从组织分离并且在一种以下分子存在下用SEB(1μg/mL)刺激：(1)αB7RP1，(2)P74293，(3)CTLA4-Ig(阳性对照)，或(4)人类IgG(阴性对照)。在72小时培养后，收集细胞上清液，并且使用来自MesoScaleDiscovery的试剂盒根据制造商的说明书测定细胞因子水平。结果在图4中示出。
所有三种αB7RP1、P74293以及CTLA4-Ig(分别为图4中的所有图中的条形1、2以及3)均抑制IL-17、IL-10、IL-4以及IFNγ的释放。IL-2的释放仅由CTLA4-Ig抑制。因此，αB7RP1和抗BAFF/B7RP1双特异性P74293对SEB激活的人类扁桃体细胞的细胞因子分泌具有可相当并且具特异性的效应。
关于额外特性检查三种异质二聚双特异性蛋白，即P71619、P74293以及P74294。产生这些蛋白的宿主细胞的培养物的蛋白效价指示所产生的P74293和P74294约为所产生的P71619的水平的2倍。在40℃下存储两周后，P74293和P74294也比P71619稳定，如通过尺寸排阻色谱法(SEC)所评估。P74293在存储开始时并且在存储4周后形成澄清溶液，而含有P74394的溶液在所有时间点均浑浊。P74293和P74294的溶液的粘性低于P71619的溶液。因此，P74293和P74294的表达水平高于P71619并且在所测试的浓度范围内也比P71619稳定并且粘性较低。这些分子之间的最明显差异在于两种BAFF结合肽之间的连接体。这些数据表明P74293和P74294(SEQIDNO：6和7)中的连接体可对这些分子赋予改进的特性。
所述的双特异性分子的药物代谢动力学特性在小鼠中进行评估。对雄性CD-1小鼠给予单一静脉内(IV)剂量(5mg/kg)的双特异性融合蛋白P71617、P71619、P71621、P71622、P74293或P74294。在给药之前并且在给药之后0.5、2、8、24、48、72、96、168、240、336、408、504小时收集血清样品。所述双特异性分子在血清中的浓度通过两种ELISA方法确定，一种方法记录Fc部分的存在并且一种方法记录Fc部分和BAFF结合肽部分的存在。关于Fc部分测量，生物素标记的抗Fc抗体用作捕捉试剂，并且ALEXA647标记的抗Fc抗体用作检测试剂。为了检测所述双特异性物的BAFF结合部分和Fc部分，生物素标记的BAFF蛋白用作捕捉试剂，并且ALEXA647标记的抗Fc抗体用作检测试剂。具有融合至所述重链的N端(P71617)、C端(P71619、P74293以及P74294)或CH3结构域(P71621)的BAFF结合肽的两个串联拷贝的双特异性蛋白在小鼠中具有极其类似的PK分布。图5。具有插入至CH3结构域中的BAFF结合肽的一个拷贝和融合至所述重链的C末端的另一个拷贝的双特异性蛋白(P71622)与其它双特异性蛋白相比具有较低暴露。图5。另外，所述两种不同的ELISA测定产生所述双特异性蛋白的类似的血清浓度，表明体内未发生所述双特异性蛋白的显著裂解。
P74293和P74294异质二聚双特异性抗体的药物代谢动力学和药效学参数还通过单一剂量研究在食蟹猴中评估。对首次实验的雄性食蟹猴(n＝4)给予单一团注静脉内或皮下剂量的P74293(10mg/kg)或单一皮下剂量的P74294(10mg/kg)。两种双特异性分子的PK分布均类似于IgG抗体的PK分布。关于P74293和P74294以及关于抗huB7RP1所观察到的药物代谢动力学参数报告于下表3中。
表3：食蟹猴中的药物代谢动力学参数
表3中的数据指示P74293和P75294的药物代谢动力学参数可彼此并且与抗huB7RP1抗体的那些药物代谢动力学参数相当。
实施例2：设计并且测试鼠类双特异性代替物分子
为了在小鼠中进行临床前研究，构建可能结合于鼠类B7RP1和鼠类BAFF的鼠类代替物双特异性分子(下文中，“鼠类代替物”)。用于构建实施例1中所述的双特异性构建体的抗huB7RP1抗体不结合于鼠类B7RP1，而用于这些构建体的BAFF结合肽结合于人类和鼠类BAFF。数据未示出。所述鼠类代替物包含拮抗性IgG抗鼠类B7RP1抗体(本文中称为“抗mB7RP1”)，其为小鼠免疫球蛋白恒定区和大鼠抗鼠类B7RP1免疫球蛋白可变区的嵌合体。抗mB7RP1的用途描述于Hu等人(2009)，J.Immunol.182：1421中，其中其被指定为1B7-V2。所述鼠类代替物具有经由短连接体(五个氨基酸长)融合至抗mB7RP1的免疫球蛋白重链的C端的BAFF结合肽(SEQIDNO：1)的两个拷贝。所述BAFF结合肽的两个拷贝由23个氨基酸长的另一连接体分离。编码所述鼠类代替物的重链的核酸使用重叠PCR来制造以将编码αBAFF的BAFF结合部分的核酸接合至编码1B7-V2(即，抗mB7RP1)的重链的核酸的下游末端。
在BAFF介导的B细胞增殖测定中评估所述鼠类代替物的BAFF抑制作用。小鼠B淋巴细胞通过阴性选择用MACSCD43(ly-48)微珠根据制造商说明书(MiltenyiBiotec，Auburn，CA)从C57BL/6脾分离或使用B细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotec，Auburn，CA)从PBMC分离。经过纯化的B细胞在变化浓度的所述鼠类代替物或αBAFF存在下用0.1μg/ml抗IgM和200ng/mlBAFF刺激。在第4天通过3H-胸苷并入测量B细胞增殖。所述鼠类代替物和αBAFF的IC5o分别为0.59nM和0.73nM。参见图6A。因此，所述鼠类代替物以与αBAFF的效力可相当的效力有效地抑制BAFF。
为了测量所述鼠类代替物对B7RP1结合于其受体的抑制，首先通过在涂布有抗CD3(5μg/ml)抗体的微量滴定孔中孵育小鼠脾细胞持续24小时来激活所述细胞以增强其中B7RP1受体的表达。所述激活的脾细胞用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)洗涤并且接着在4℃下在变化浓度的所述鼠类代替物存在下与5μg/ml生物素标记的muB7RP1：Fc一起孵育30分钟。洗涤所述细胞并且接着再用别藻蓝蛋白(APC)缀合的抗小鼠CD3抗体和链霉亲和素-藻红蛋白(链霉亲和素-PE)染色20分钟。通过流式细胞术分析结合于T细胞的B7RP1-Fc。所述鼠类代替物和抗mB7RP1的IC50分别为4.01pM和2.8pM。参见图6B。因此，在这种测定中所述鼠类代替物的活性类似于抗mB7RP1的活性。因此，所述鼠类代替物抑制BAFF和B7RP1。
所述鼠类代替物的体内药效学效应在用绵羊红细胞(SRBC)免疫的小鼠中评估。简单地说，BALB/c小鼠(8周龄)使用含2×108个SRBC的0.2mlPBS经由腹膜内注射在第0天接受初次免疫并且在第28天接受加强免疫。所述小鼠(对于每种分子n＝5)从第0天至第33天每周两次用5mg/kg的一种以下分子处理：所述鼠类代替物；αBAFF；抗mB7RP1；或鼠类IgG1。用SBRC处理但未接受另一处理的小鼠用作阳性对照。所述小鼠在第34天处死，并且收集血清和脾。
为了测量脾中B细胞和记忆T细胞的比例，通过研磨脾组织通过细胞过滤器来收集脾细胞。所述脾细胞用未标记的抗CD16/32预孵育以阻断抗体与Fcγ受体(FcγR)的非特异性结合。B细胞的比例通过用PE标记的抗B220(其在B细胞上表达)染色来确定。记忆T细胞(CD44hiCD62LloCD4T细胞)的比例通过用FITC缀合的抗CD44、PE缀合的抗CD62L、APC缀合的抗CD4以及PerCP缀合的抗CD3染色来确定。所有染色抗体均购自BDBioscience(SanDiego，CA)。关于B和T细胞确定，用FACSCALIBURTM(BDBioscience，SanJose，CA)流式细胞仪执行流式细胞术，并且使用(TreeStarInc.，Ashland，OR)软件来分析数据以分析流式细胞术数据。结果在图7中示出。
为了测量抗SBRC抗体在血清中的水平，用10μg/ml可溶性SRBC抗原涂布的微量滴定板在室温下用来自经过处理的小鼠的经过稀释的血清孵育两小时。来自所述血清的结合的SRBC特异性Ig用HRP缀合的多克隆山羊抗小鼠IgG和IgM抗体(SouthernBiotech，Birmingham，AL)检测。使用SUREBLUETMTMB微孔过氧化物酶底物(KPL，Gaithersburg，MD)根据制造商的说明书执行底物反应，并且使用SpectrumMax微板读取器(MolecularDevices)读取光学密度。作为阳性对照，来自SRBC免疫的小鼠的血清的混合物未经任何处理的连续稀释液添加至各板中，并且由来自这些孔的读数构建标准曲线。其它样品的抗SBRC抗体的水平在图7中以这种阳性对照的百分比形式报告。
作为B细胞的脾细胞的百分比如与用鼠类IgG1处理的小鼠中所观察到的百分比相比在用所述鼠类代替物处理的小鼠中降低。图7(顶部图)。类似降低在用αBAFF或αBAFF加抗mB7RP1处理的小鼠中观察到，但未在用单独抗mB7RP1处理的小鼠中观察到。图7(顶部图)。关于记忆T细胞，用所述鼠类代替物、抗mB7RP1或抗mB7RP1加αBAFF处理的小鼠具有与用muIgG1处理的小鼠中所观察到的记忆T细胞比例相比降低的记忆T细胞比例。图7(中间图)。相比之下，与用muIgG处理所观察到的记忆T细胞群体相比，用αBAFF处理并未改变脾中的记忆T细胞群体。图7(中间图)。所述鼠类代替物还显示血清中抗SRBC抗体水平的有效降低，类似于在用抗mB7RP1或抗mB7RP1加αBAFF处理后或在尚未注射SRBC的小鼠中所观察到的降低。图7(底部图)。在用单独αBAFF处理的小鼠中观察到与用mIgG1处理所观察到的水平相比抗SRBC抗体水平的适度抑制。图7(底部图)。这些数据指示所述鼠类代替物在小鼠中的B细胞和T细胞隔室中体内具有双重抑制效应。
所述鼠类代替物对疾病的影响在NZB/WF1狼疮模型中针对所测试的分子中的每一者使用两种不同剂量来评估。雌性NZB/WF1小鼠(4.5月龄，n＝20)使用以下给药方案中的每一者每周两次通过腹膜内注射进行处理持续18周：5或15mg/kg鼠类代替物(KDa)；4.68或14mg/kg抗mB7RP1(KDa)；1.88或5.6mg/kgαBAFF(KDa)；αBAFF(1.88或5.6mg/kg)和抗mB7RP1(4.68或14mg/kg)的组合；鼠类IgG1(15mg/kg；同型对照)；或磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)(阴性对照)。在5月龄时开始每隔两周使用(Bayer，Elkhart，IN)在尿中测量蛋白尿。蛋白尿的发病率表述为在两次连续测量中具有至少300mg/dl浓度的尿蛋白的小鼠的百分比。通过ELISA测量血清抗dsDNAIgG水平。通过针对八个不同种类的病变(即肾小球毛细血管增生、系膜细胞增生、增加的系膜基质、肾小球丛粘连、壁上皮增生、间质性肾炎、管扩张/蛋白管型以及肾小管萎缩/间质性纤维化)检查肾组织样品来执行所有小鼠的肾病的评分。对病变的各类型给出从0至5的严重程度评分，最大可能评分为32。对各组小鼠的评分求平均值。监测生存率。
在12月龄时，用任一剂量水平的所述鼠类代替物处理的小鼠均未发展蛋白尿。相比之下，用所测试的两种剂量水平的鼠类IgG1或PBS处理的小鼠100％展现蛋白尿。图8A和9B。用较低剂量水平的抗mB7RP1和αBAFF处理的小鼠分别约60％和35％，和用较高剂量水平的抗mB7RP1和αBAFF处理的小鼠分别约50％和25％发展蛋白尿。图8A和9B。另外，在两种剂量水平下的鼠类代替物处理如与用muIgG1处理的阴性对照相比导致抗dsDNAIgG的血清水平的显著降低。图8B和9A。与mIgG和PBS对照组相比，所述双特异性处理还显著改进生存率。数据未示出。然而，在实验终止时在所述双特异性处理对单一试剂处理之间未观察到生存率的明显差异。
从所有经过处理的小鼠(包括在研究结束之前已死的小鼠)收集肾以针对肾病的严重程度进行组织学评分。用αBAFF、αBAFF加抗mB7RP1的组合或所述鼠类代替物处理的各组小鼠如与用mIgG1处理的对照组相比具有显著较低的肾病评分。图10。用所述双特异性代替物或所述组合处理的各组还显示与单一试剂处理组相比倾向于降低的肾病理学，这种结果与上文所述的蛋白尿结果充分相关。比较图10与图8A和9B。总之，所述鼠类代替物或使用αBAFF加抗mB7RP1的组合处理对BAFF和B7RP1的双重抑制在预防NZB/WF1狼疮模型中的疾病开始和进展方面比仅BAFF(αBAFF)或仅B7RP1(抗mB7RP1)的抑制有效。
为了确定BAFF和B7RP1的抑制作用是否可有效地抑制鼠类胶原蛋白诱导的关节炎的症状，进行以下实验。在第0天用在2x完全弗氏佐剂(CFA)中乳化的100μg牛II型胶原蛋白使雄性DBA小鼠免疫并且在第21天用不完全弗氏佐剂(IFA)中的牛II型胶原蛋白加强。小鼠在第0天开始的研究的41周过程期间每周两次用一种测试物质处理。各组中展现关节炎症状的小鼠的百分比和各组的平均关节炎评分在各时间点进行评估。关节炎评分通过检查各肢体并且对各肢体指定0-3的评分来确定，其中较为肿胀和/或发炎的肢体具有较高评分。因此，最大总关节炎评分为12。如果小鼠的任何肢体中的关节炎评分至少为1，那么所述小鼠被认为具有关节炎。
结果在图11中示出。这些数据指示αBAFF和抗mB7RP1的组合(由实线连接的填充圆)在抑制关节炎症状方面比单独αBAFF(由实线连接的空心圆)或抗mB7RP1(由虚线连接的填充圆)有效得多。用mIgG(由实线连接的填充正方形)或PBS(由虚线连接的填充正方形)处理的阴性对照组具有最高的关节炎发病率百分比和最高的关节炎评分。这些结果表明如与仅抑制这些途径之一相对，抑制BAFF和B7RP1可能为自身免疫性和/或发炎性关节炎病况(如类风湿性关节炎)的有效治疗。

Claims (46)

1.一种双特异性蛋白，
其中所述蛋白可抑制人类B细胞的BAFF介导的增殖，且
其中所述蛋白可抑制人类T细胞的B7RP1介导的增殖。
2.如权利要求1所述的双特异性蛋白，其中所述双特异性蛋白包含IgG抗体，所述抗体包含具有不同氨基酸序列的两条免疫球蛋白重链和具有不同氨基酸序列的两条免疫球蛋白轻链。
3.如权利要求2所述的双特异性蛋白，其中所述IgG抗体为IgG1抗体。
4.如权利要求2所述的双特异性蛋白，其中所述IgG抗体为IgG2抗体。
5.如权利要求2所述的双特异性蛋白，其中所述IgG抗体为IgG4抗体。
6.如权利要求1至5中任一项所述的双特异性蛋白，其中所述双特异性蛋白为人类或人源化IgG抗体。
7.如权利要求1至6中任一项所述的双特异性蛋白，其包含包含氨基酸序列SEQIDNO：8的轻链互补决定区1(CDR1)、包含氨基酸序列SEQIDNO：9的轻链互补决定区2(CDR2)、包含氨基酸序列SEQIDNO：10的轻链互补决定区3(CDR3)、包含氨基酸序列SEQIDNO：11的重链CDR1、包含氨基酸序列SEQIDNO：12的重链CDR2以及包含氨基酸序列SEQIDNO：13的重链CDR3。
8.如权利要求7所述的双特异性蛋白，其包含包含SEQIDNO：15的重链可变区和包含SEQIDNO：14的轻链可变区。
9.如权利要求1所述的双特异性蛋白，其包含：
(a)包含具有下式的氨基酸序列的多肽：A-L1-P-L2-P，其中A为IgG抗体的免疫球蛋白重链，L1为第一连接体，所述第一连接体不存在或为3至40个氨基酸长，P为10至40个氨基酸长的BAFF结合肽，并且L2为肽连接体，所述肽连接体不存在或为5至50个氨基酸长，以及
(b)免疫球蛋白轻链。
10.如权利要求9所述的双特异性蛋白，其中(a)的所述免疫球蛋白重链和(b)的所述免疫球蛋白轻链形成可结合B7RP1的IgG抗体，所述抗体包含(a)的所述多肽的两个分子和(b)的所述轻链的两个分子。
11.如权利要求9或10所述的双特异性蛋白，其中所述免疫球蛋白重链在其C末端刚好L1的上游处缺失赖氨酸。
12.如权利要求9至11中任一项所述的双特异性蛋白，其中所述IgG抗体为人类或人源化抗B7RP1IgG1抗体。
13.如权利要求9至11中任一项所述的双特异性蛋白，其中所述抗B7RP1抗体为人类或人源化IgG2抗体。
14.如权利要求9至11中任一项所述的双特异性蛋白，其中所述抗B7RP1抗体为人类或人源化IgG4抗体。
15.如权利要求9至14中任一项所述的双特异性蛋白，其中P具有氨基酸序列SEQIDNO：1(LPGCKWDLLIKQWVCDPL)。
16.如权利要求9至15中任一项所述的双特异性蛋白，其中L1具有氨基酸序列SEQIDNO：40(GGGGG)。
17.如权利要求9至16中任一项所述的双特异性蛋白，其中所述L2具有氨基酸序列SEQIDNO：5。
18.如权利要求17所述的双特异性蛋白，其中L2具有氨基酸序列SEQIDNO：7。
19.如权利要求17所述的双特异性蛋白，其中L2具有氨基酸序列SEQIDNO：6。
20.如权利要求9至19中任一项所述的双特异性蛋白，其包含包含氨基酸序列SEQIDNO：8(RASQGISNWLA)的轻链CDR1、包含氨基酸序列SEQIDNO：9(AASSLQS)的轻链CDR2、包含氨基酸序列SEQIDNO：10(QQYDSYPRT)的轻链CDR3、包含氨基酸序列SEQIDNO：11(SYWMS)的重链CDR1、包含氨基酸序列SEQIDNO：12(YIKQDGNEKYYVDSVKG)的重链CDR2以及包含氨基酸序列SEQIDNO：13(EGILWFGDLPTF)的重链CDR3。
21.如权利要求9至20中任一项所述的双特异性蛋白，其包含包含氨基酸序列SEQIDNO：14的免疫球蛋白轻链可变区。
22.如权利要求9至21中任一项所述的双特异性蛋白，其包含包含氨基酸序列SEQIDNO：15的免疫球蛋白重链可变区。
23.如权利要求15至22中任一项所述的双特异性蛋白，其中(b)的所述免疫球蛋白轻链包含氨基酸序列SEQIDNO：19。
24.如权利要求15至23中任一项所述的双特异性蛋白，其中(a)的所述多肽包含氨基酸序列SEQIDNO：17或18。
25.一种双特异性蛋白，其包含
(a)包含氨基酸序列SEQIDNO：17或SEQIDNO：18的多肽，和
(b)包含氨基酸序列SEQIDNO：19的另一种多肽。
26.如权利要求25所述的双特异性蛋白，其为包含(a)的所述多肽的两个分子和(b)的所述多肽的两个分子的四聚体。
27.如权利要求25或26所述的双特异性蛋白，其中(a)的所述多肽包含氨基酸序列SEQIDNO：17。
28.如权利要求25或26所述的双特异性蛋白，其中(b)的所述多肽包含氨基酸序列SEQIDNO：18。
29.一种包含连接体的蛋白，所述连接体包含氨基酸序列SEQIDNO：6或SEQIDNO：7。
30.如权利要求29所述的蛋白，其中所述蛋白可抑制人类B细胞的BAFF介导的增殖并且其中所述蛋白可抑制人类T细胞的B7RP1介导的增殖。
31.如权利要求30所述的蛋白，其包含氨基酸序列SEQIDNO：1、SEQIDNO：14和/或SEQIDNO：15。
32.一种药物组合物，其包含如权利要求1至28中任一项所述的双特异性蛋白或如权利要求30或31所述的蛋白以及生理学上可接受的赋形剂。
33.一种编码如权利要求1至28中任一项所述的双特异性蛋白或如权利要求30或31所述的蛋白的核酸。
34.一种包含如权利要求33所述的核酸的载体。
35.一种含有如权利要求33所述的核酸和/或如权利要求34所述的载体的宿主细胞。
36.一种用于制造双特异性蛋白的方法，其包括
在使得所述核酸被表达的条件下培养如权利要求35所述的宿主细胞，和
从细胞团块或培养基回收所述蛋白。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述宿主细胞为CHO细胞。
39.如权利要求36所述的方法，其中所述宿主细胞为大肠杆菌细胞。
40.一种用于治疗全身性红斑狼疮的方法，其包括向患者施用治疗有效量的如权利要求1至28中任一项所述的双特异性蛋白、如权利要求30或31所述的蛋白或如权利要求32所述的药物组合物。
41.如权利要求40所述的方法，
其中在所述双特异性蛋白之前、之后或与其并行地向所述患者施用另一治疗剂，和
其中所述另一治疗剂为皮质类固醇、抗疟药、视黄酸、NSAID、环磷酰胺、脱氢表雄酮、吗替麦考酚酯、硫唑嘌呤、苯丁酸氮芥、甲氨蝶呤、他克莫司、氨苯砜、沙立度胺、来氟米特或环孢霉素。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述另一治疗剂为吗替麦考酚酯、皮质类固醇、抗疟药、甲氨蝶呤或硫唑嘌呤。
43.一种治疗方法，其包括向患者施用治疗有效量的如权利要求1至28中任一项所述的双特异性蛋白、如权利要求30或31所述的蛋白或如权利要求32所述的药物组合物，其中所述患者具有选自由以下组成的组的疾病：ANCA阳性血管炎、类风湿性关节炎(RA)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、乳糜泻、天疱疮、类天疱疮、亚急性皮肤红斑狼疮(SCLE)、多发性硬化、慢性发炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、重症肌无力、古德帕斯彻氏综合征、肾小球肾炎、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、干燥综合征、全身性硬化、桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯病、阿狄森氏病以及多发性内分泌腺瘤(MEN)。
44.如权利要求1至28中任一项所述的双特异性蛋白或如权利要求29至31中任一项所述的蛋白作为药剂的用途。
45.一种用于治疗全身性红斑狼疮的药物组合物，其包含如权利要求1至28中任一项所述的双特异性蛋白或如权利要求30或31所述的蛋白。
46.一种用于治疗狼疮肾炎的药物组合物，其包含如权利要求1至28中任一项所述的双特异性蛋白或如权利要求30或31所述的蛋白。
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