CN102369291A - 效应子功能降低的稳定Fc多肽及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种生成含Fc的多肽的方法，如具有稳定的Fc区的抗体。本发明还提供了根据这些方法生成的稳定Fc多肽以及将此类抗体用作治疗剂的方法。

Description

效应子功能降低的稳定Fc多肽及使用方法
相关申请
本专利申请要求2009年1月23日提交的标题为“STABILIZED FcPOLYPEPTIDES WITH REDUCED EFFECTOR FUNCTION ANDMETHODS OF USE”的美国临时专利申请序列号61/146,950的权益。以上提及的临时专利申请的全部内容通过引用的方式并入本文。
发明背景
获得性免疫应答是身体保护自身免受外来生物侵害身体引起感染或疾病的机制。一种机制基于生成的或施用于宿主的抗体通过其可变区结合抗原的能力。一旦抗体结合了抗原，抗原就成为破坏的靶标，通常至少部分通过抗体的恒定区或Fc区介导。
存在若干经抗体的Fc区介导的效应子功能或活性。一种效应子功能是在称为补体依赖性细胞毒作用(CDC)的过程中结合可协助溶解靶抗原(例如，细胞病原体)的补体蛋白的能力。Fc区的另一效应活性为结合免疫细胞表面的Fc受体(例如，FcγRs)或通常所说的效应细胞，该效应细胞具有触发其它免疫作用的能力。这些免疫作用(例如，抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP))通过(例如)释放免疫活化剂和调节抗体生成、胞吞作用、吞噬作用以及细胞杀伤在去除病原体/抗原中起作用。在一些临床应用中，这些应答对于抗体的功效至关重要，而在其它情况下这些应答引起有害的副作用。效应介导的副作用的一个实例为释放引起急性发热反应的炎症性细胞因子。另一个实例是长期缺失抗原携带细胞。
可通过使用缺少Fc区的抗体片段(例如，Fab、F(ab′)2或单链Fv(scFv))避免抗体的效应子功能。然而，由于通过肾脏快速清除，这些片段的半衰期缩短；在Fab和scFv片段仅具有一个抗原结合位点而不是两个由于结合亲合力可能损害任何优点的抗原结合位点的情况下；并且在制造中可能存在挑战。
替代性方法旨在降低全长抗体的效应子功能，同时保持Fc区其它有价值的属性(例如，半衰期延长和异质二聚体化)。降低效应子功能的一种方法是通过去除与Fc区中的特定残基连接的糖生成通常所说的无糖基化抗体。例如，可通过删除或改变与糖连接的残基、通过酶促去除糖、在有糖基化抑制剂存在下培养的细胞中生成抗体，或通过在不能使蛋白质糖基化的细胞(例如，细菌宿主细胞)中表达抗体而生成无糖基化抗体。另一种方法是采用来自IgG4而非IgG1抗体的Fc区。众所周知，IgG4抗体特征在于具有比IgG1更低的补体活化和抗体依赖性细胞毒作用水平。
尽管这些替代性方法有优点，但现已确认从抗体的Fc区去除低聚糖对其构象和稳定性有明显的不利影响。另外，由于IgG4的CH3域与IgG1的CH3域相比缺乏稳定性，所以IgG4抗体的稳定性通常较低。就一切情况而论，抗体稳定性损失或降低可呈现对抗体药物开发有不利影响的工艺开发挑战。
因此，需要改良抗体和其它效应子功能改变或降低、稳定性提高的含Fc的多肽和制备这些分子的方法。
发明概述
本发明通过提供用于提高Fc区稳定性的改进方法解决了现有技术“无效应子”抗体，实际上为任何含Fc的“无效应子”蛋白的问题。例如，本发明提供了稳定性设计的Fc多肽，例如，稳定的IgG抗体或其它含Fc的结合分子，其包含在多肽的Fc区中的稳定氨基酸。在一个实施方案中，本发明提供一种在亲本Fc多肽的Fc区中的特定氨基酸残基处引入导致Fc区稳定性提高的突变的方法。优选地，稳定的Fc多肽的效应子功能改变或降低(与不包含稳定氨基酸的多肽相比)，并且与亲本Fc多肽相比表现出提高的稳定性。
因此，本发明具有包括但不限于以下的若干优点：
-提供包含稳定的无糖基化Fc区的稳定的无糖基化Fc多肽，例如，稳定的融合蛋白或无糖基化IgG抗体，由于其效应子功能降低而适于用作治疗剂；
-提供包含源自IgG4抗体的Fc区的稳定的Fc多肽，例如，稳定的糖基化或无糖基化融合蛋白或IgG4抗体，由于其效应子功能降低为适于用作治疗剂；
-对多肽进行最低限度的改变(例如，通过为不稳定的亲本多肽引入电荷或表达编码稳定的Fc多肽的核酸分子)生成稳定的Fc多肽的有效方法；
-在避免任何免疫原性和/或效应子功能升高的同时提高Fc多肽稳定性的方法；
-提高Fc多肽的可量测性、生产和/或长期稳定性的方法；
-用本发明的稳定的Fc多肽治疗需要治疗的受试者的方法。
一方面，本发明涉及包含嵌合Fc区的稳定多肽，其中所述稳定多肽包含至少一个源自人IgG4抗体的恒定域和至少一个源自人IgG1抗体的恒定域。
在一个实施方案中，Fc区为糖基化Fc区。
在一个实施方案中，Fc区为无糖基化Fc区。
在一个实施方案中，Fc区为包含位于Fc区的位置297的谷氨酰胺(Q)和位置299的丙氨酸(A)(欧盟编号规定)的无糖基化Fc区。
另一方面，本发明涉及包含无糖基化Fc区的稳定多肽，其中所述稳定多肽包含位于所述Fc区的至少一个Fc部分中一个或多个氨基酸位置的一个或多个稳定Fc氨基酸，其中所述氨基酸位置选自297、299、307、309、399、409和427(欧盟编号规定)。
在一个实施方案中，嵌合Fc区包含来自IgG4同种型的IgG抗体的CH2域和来自IgG1同种型的IgG抗体的CH3域。
在一个实施方案中，嵌合Fc区包含来自IgG4同种型的IgG抗体的铰链、CH1和CH2域和来自IgG1同种型的IgG抗体的CH3域，并且其中抗体包含位于氨基酸位置228的脯氨酸(欧盟编号)。
另一方面，本发明涉及包含来自IgG4抗体的Fc区的CH2部分的稳定多肽，其中所述稳定多肽包含位于一个或多个选自240F、262L、264T、266F、297Q、299A、299K、307P、309K、309M、309P、323F、399S和427F(欧盟编号规定)氨基酸位置的一个或多个稳定氨基酸。
在一个实施方案中，稳定多肽包含位于氨基酸位置297的Gln。
一方面，本发明涉及包含来自IgG1抗体的Fc区的CH2部分的稳定多肽，其中所述稳定多肽包含位于一个或多个选自299K和297D(欧盟编号规定)氨基酸位置的一个或多个稳定氨基酸。
在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含位于氨基酸位置299的赖氨酸。
在另一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含位于氨基酸位置299的赖氨酸和位于氨基酸位置297的天冬氨酸。
在一个实施方案中，Fc区为无糖基化Fc区。
在一个实施方案中，IgG抗体为人源抗体。
在一个实施方案中，相对于缺乏稳定氨基酸的亲本多肽，稳定多肽的解链温度(Tm)升高至少1℃。
在一个实施方案中，稳定的Fc多肽的解链温度(Tm)升高约1℃或更多、约2℃或更多、约3℃或更多、约4℃或更多、约5℃或更多、约6℃或更多、约7℃或更多、约8℃或更多、约9℃或更多、约10℃或更多、约15℃或更多以及约20℃或更多。
在一个实施方案中，在中性pH(约6.5至约7.5)下解链温度(Tm)升高。
在另一个实施方案中，在约6.5或更低、约6.0或更低、约5.5或更低、约5.0或更低、约4.5或更低和约4.0或更低的酸性pH下，解链温度(Tm)升高。
在一个实施方案中，相对于缺乏稳定突变的亲本多肽，稳定多肽以更高的产量表达。
在另一个实施方案中，在细胞培养物中，稳定的Fc多肽以约5mg/L或更高、约10mg/L或更高、约15mg/L或更高、约20mg/L或更高的产量表达。
在一个实施方案中，相对于缺乏稳定氨基酸的亲本多肽，稳定多肽的浊度降低。
在另一个实施方案中，浊度降低选自以下各项的倍数：约1倍或更高、约2倍或更高、约3倍或更高、约4倍或更高、约5倍或更高、约6倍或更高、约7倍或更高、约8倍或更高、约9倍或更高、约10倍或更高、约15倍或更高、约50倍或更高和约100倍或更高。
在另一个实施方案中，与缺乏稳定突变的亲本Fc多肽相比，所述稳定多肽的效应子功能降低。
在一个实施方案中，降低的效应子功能为降低的ADCC活性。
在另一个实施方案中，降低的效应子功能为降低的与选自FcγRI、FcγRII和FcγRIII的Fc受体(FcR)的结合。
在一个实施方案中，效应子功能降低选自以下各项的倍数：约1倍或更多、约2倍或更多、约3倍或更多、约4倍或更多、约5倍或更多、约6倍或更多、约7倍或更多、约8倍或更多、约9倍或更多、约10倍或更多、约15倍或更多、约50倍或更多和约100倍或更多。
在一个实施方案中，与亲本Fc多肽相比，所述稳定多肽的半衰期增加。
在另一个实施方案中，半衰期增加归因于与新生儿受体(FcRn)的结合增强。
在一个实施方案中，半衰期增加选自以下各项的倍数：约1倍或更多、约2倍或更多、约3倍或更多、约4倍或更多、约5倍或更多、约6倍或更多、约7倍或更多、约8倍或更多、约9倍或更多、约10倍或更多、约15倍或更多、约50倍或更多和约100倍或更多。
在一个实施方案中，Fc区为二聚Fc区。
在另一个实施方案中，Fc区为单链Fc区。
在一个实施方案中，Fc区的所有Fc部分均被无糖基化。
在一个实施方案中，无糖基化Fc区包含位于Fc区的位置299(欧盟编号规定)的取代。
在另一个实施方案中，无糖基化Fc区由于其在细菌宿主细胞中生成而被无糖基化。在一个实施方案中，无糖基化Fc区由于通过化学或酶促方法的去糖基化作用而被无糖基化。在一个实施方案中，无糖基化Fc区包含嵌合铰链域。
在一个实施方案中，嵌合铰链域包含在氨基酸位置228(欧盟编号规定)用脯氨酸残基进行的取代。
在一个实施方案中，稳定氨基酸独立地选自：(i)位于位置297的不带电氨基酸、(ii)位于位置299带正电的氨基酸、(iii)位于位置307的极性氨基酸、(iv)位于位置309带正电的氨基酸或极性氨基酸、(v)位于位置399的极性氨基酸、(vi)位于位置409带正电的氨基酸或极性氨基酸和(vii)位于位置427的极性氨基酸。
在一个实施方案中，至少一个稳定氨基酸为位于氨基酸位置297(欧盟编号)的谷氨酰胺。
在一个实施方案中，至少一个稳定氨基酸为位于位置299的赖氨酸(K)或酪氨酸(Y)。
在一个实施方案中，至少一个稳定氨基酸为位于位置307的脯氨酸(P)或甲硫氨酸(M)。
在一个实施方案中，至少一个稳定氨基酸为位于位置309的脯氨酸(P)、甲硫氨酸(M)或赖氨酸(K)。
在一个实施方案中，至少一个稳定突变为位于位置399的丝氨酸(S)。
在一个实施方案中，至少一个稳定突变为位于位置240的苯丙氨酸(F)。
在一个实施方案中，至少一个稳定突变为位于位置262的亮氨酸(L)。
在一个实施方案中，至少一个稳定突变为位于位置264的苏氨酸(T)。
在一个实施方案中，至少一个稳定突变为位于位置266的苯丙氨酸(F)。
在一个实施方案中，至少一个稳定突变为位于位置323的苯丙氨酸(F)。
在一个实施方案中，至少一个稳定突变为位于位置409的赖氨酸(K)或甲硫氨酸(M)。
在一个实施方案中，至少一个稳定突变为位于位置427的苯丙氨酸(F)。
在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含两个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括(i)位于位置299的丙氨酸(A)或赖氨酸(K)和(ii)位于位置266的苯丙氨酸(F)。
在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含两个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括(i)位于位置299的丙氨酸(A)或赖氨酸(K)和(ii)位于位置307的脯氨酸(P)。
在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含两个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括(i)位于位置299的赖氨酸(K)和(ii)位于位置399的丝氨酸(S)。
在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含两个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括(i)位于位置299的赖氨酸(K)和(ii)位于位置427的苯丙氨酸(F)。
在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含三个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括(i)位于位置299的丙氨酸(A)或赖氨酸(K)、(ii)位于位置262的亮氨酸(L)和(iii)位于位置264的苏氨酸(T)。
在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含三个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括(i)位于位置299的赖氨酸(K)、(ii)位于位置307的脯氨酸(P)和(iii)位于位置399的丝氨酸(S)。
在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含三个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括(i)位于位置299的赖氨酸(K)、(ii)位于位置309的赖氨酸(K)和(iii)位于位置399的丝氨酸(S)。
在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含三个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括(i)位于位置299的赖氨酸(K)、(ii)位于位置348的苯丙氨酸(F)和(iii)位于位置427的苯丙氨酸(F)。
在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含三个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括(i)位于位置299的赖氨酸(K)、(ii)位于位置399的丝氨酸(S)和(iii)位于位置427的苯丙氨酸(F)。
在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含四个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括(i)位于位置299的丙氨酸(A)或赖氨酸(K)、(ii)位于位置262的亮氨酸(L)、(iii)位于位置264的苏氨酸(T)和(iv)位于位置266的苯丙氨酸(F)。
在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含两个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括(i)位于位置307的脯氨酸(P)和(ii)位于位置276的丝氨酸(S)。
在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含两个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括(i)位于位置307的脯氨酸(P)和(ii)位于位置286的苏氨酸(T)。
在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含两个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括(i)位于位置307的脯氨酸(P)和(ii)位于位置323的苯丙氨酸(F)。
在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含两个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括(i)位于位置307的脯氨酸(P)和(ii)位于位置309的脯氨酸(P)、赖氨酸(K)或甲硫氨酸(M)。
在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含两个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括(i)位于位置307的脯氨酸(P)和(ii)位于位置399的丝氨酸(S)。
在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含两个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括(i)位于位置307的脯氨酸(P)和(ii)位于位置427的苯丙氨酸(F)。
在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含三个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括(i)位于位置307的脯氨酸(P)、(ii)位于位置276的丝氨酸(S)和(iii)位于位置286的苏氨酸(T)。
在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含三个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括(i)位于位置307的脯氨酸(P)；(ii)位于位置309的脯氨酸(P)、赖氨酸(K)或甲硫氨酸(M)和(iii)位于位置399的丝氨酸(S)。
在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含三个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括(i)位于位置307的脯氨酸(P)、(ii)位于位置399的丝氨酸(S)和(iii)位于位置427的苯丙氨酸(F)。
在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含三个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括(i)位于位置309的脯氨酸(P)、赖氨酸(K)或甲硫氨酸(M)和(ii)位于位置308的异亮氨酸(I)。
在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含两个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括(i)位于位置309的脯氨酸(P)、赖氨酸(K)或甲硫氨酸(M)和(ii)位于位置399的丝氨酸(S)。
在一个实施方案中，Fc区可操作地连接至结合位点。
在一个实施方案中，结合位点选自抗原结合位点、受体的配体结合部分或配体的受体结合部分。
在一个实施方案中，结合位点源自选自以下各项的修饰抗体：scFv、Fab、微型抗体、双链抗体、三链抗体、纳米抗体、骆驼抗体和Dab。
在一个实施方案中，稳定多肽为稳定的全长抗体。
在一个实施方案中，抗体选自单克隆抗体、嵌合抗体、人源抗体和人源化抗体。
在一个实施方案中，至少一个结合位点包含六个CDR，重链可变区和轻链可变区或来自选自以下的抗体的抗原结合位点：Rituximab、Daclizumab、Galiximab、CB6、Li33、5c8、CBE11、BDA8、14A2、B3F6、2B8、Lym1、Lym2、LL2、Her2、5E8、B1、MB1、BH3、B4、B72.3、CC49和5E10。
在一个实施方案中，稳定的全长抗体与常规或稳定的scFv分子融合。
在一个实施方案中，稳定多肽为稳定的免疫粘附素。
在一个实施方案中，结合位点覆盖在稳定多肽的Fc区表面。
在一个实施方案中，结合位点源自非免疫球蛋白结合分子。
在一个实施方案中，非免疫球蛋白结合分子选自adnectin、亲合体(affibody)、DARPin和anticalin。
在一个实施方案中，所述受体的配体结合部分源自选自以下各项的受体：免疫球蛋白(Ig)超家族的受体、TNF受体超家族的受体、G蛋白偶联受体(GPCR)超家族的受体、酪氨酸激酶(TK)受体超家族的受体、配体门控(LG)超家族的受体、趋化因子受体超家族的受体、IL-1/Toll样受体(TLR)超家族、神经胶质源性神经营养因子(GDNF)受体家族的受体和细胞因子受体超家族。
在一个实施方案中，所述配体的受体结合部分源自抑制性配体。
在一个实施方案中，配体的所述受体结合部分源自活化配体。
在一个实施方案中，所述配体结合选自以下各项的受体：免疫球蛋白(Ig)超家族的受体、TNF受体超家族的受体、G蛋白偶联受体(GPCR)超家族的受体、酪氨酸激酶(TK)受体超家族的受体、配体门控(LG)超家族的受体、趋化因子受体超家族的受体、IL-1/Toll样受体(TLR)超家族和细胞因子受体超家族。
在一个实施方案中，本发明涉及一种包含本发明的稳定多肽的组合物及药学上可接受的载体。
一方面，本发明涉及一种稳定包含无糖基化嵌合Fc区或其部分的亲本Fc多肽的方法，所述方法包括用稳定氨基酸取代Fc区的至少一个Fc部分中的所选氨基酸从而生成相对于所述起始多肽稳定性增强的稳定Fc多肽，其中对选自位于297、299、307、309、399、409和427(欧盟编号规定)的氨基酸位置的Fc部分的氨基酸进行取代。
在一个实施方案中，嵌合Fc区包含来自IgG4同种型的IgG抗体的CH2域和来自IgG1同种型的IgG抗体的CH3域。
在一个实施方案中，存在于稳定Fc多肽的氨基酸的氨基酸位置选自297Q、299A、299K、307P、309K、309M、309P、323F、399E、399S、409K、409M和427F。
在一个实施方案中，稳定Fc多肽包含位于位置297(欧盟编号)的谷氨酰胺。
另一方面，本发明涉及提高包含Fc区或其部分的亲本Fc多肽的产量的方法，所述方法包括用一个或多个稳定氨基酸取代Fc区的至少一个Fc部分中的所选氨基酸以生成相对于所述亲本多肽产量提高的稳定的Fc多肽，其中稳定氨基酸独立地选自240F、262L、264T、266F、299K、307P、309K、309M、309P、323F、399S和427F(欧盟编号规定)。
在一个实施方案中，起始Fc区为IgG1Fc区。
在一个实施方案中，本发明稳定多肽的起始Fc区为IgG4Fc区。
在一个实施方案中，起始Fc区为无糖基化IgG1Fc区。
在另一个实施方案中，起始Fc区为无糖基化IgG4Fc区。
在一个实施方案中，稳定多肽包含两个或更多个稳定氨基酸。在一个实施方案中，稳定多肽包含三个或更多个稳定氨基酸。
另一方面，本发明涉及包含编码根据前述权利要求中任一项所述的稳定的结合多肽的核苷酸序列的核酸分子。
在一个实施方案中，核酸分子包含编码稳定的结合多肽的多肽链的核苷酸序列。
在一个实施方案中，本发明涉及包含编码稳定的结合多肽或其多肽链的核酸分子的载体。
在一个实施方案中，本发明涉及一种表达载体的宿主细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及一种生成本发明的稳定的Fc多肽的方法，其包括在培养基中培养宿主细胞以便生成稳定的Fc多肽。
一方面，本发明涉及一种大批量制备包含稳定的Fc区的多肽的方法，所述方法包括：
(d)将至少一个稳定的Fc部分基因融合至多肽，以形成稳定的融合蛋白；
(e)用编码所述稳定的融合蛋白的核酸分子转染哺乳动物宿主细胞；
(f)在使得稳定的融合蛋白表达的条件下，在10L或更多的培养基中培养步骤(f)的宿主细胞；
从而生成稳定的融合蛋白。
在一个实施方案中，稳定的Fc区为包含来自IgG4同种型的IgG抗体的CH2域和来自IgG1同种型的IgG抗体的CH3域的嵌合Fc。
在一个实施方案中，稳定的Fc区包含位于氨基酸位置297(欧盟编号)的谷氨酰胺。
在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗或预防受试者疾病或病症的方法，其包括将本发明的结合分子或包含此类结合分子的组合物结合至患有所述疾病或病症的受试者，从而治疗或预防疾病或病症。
在一个实施方案中，所述疾病或病症选自炎症性疾病、神经障碍、自身免疫性疾病和肿瘤性疾病。
从以下的详细描述和权利要求将显而易见本发明的其它特征和优点。
附图简述
图1描述了典型抗原结合多肽(IgG抗体)的结构和抗体的抗原结合和效应子功能(例如，Fc受体(FcR)结合)的功能性质。还示出了抗体CH2域中糖的存在(糖基化)如何改变效应子功能(FcR结合)，但不影响抗原结合。
图2描述了两个来自IgG1的x射线晶体结构(pdb密码1hzh)的相互作用的CH3域(图2A)。突出了IgG1残基K409和D399。图2B描述了使用基于结构的HMM对人IgG1/κ恒定域序列的比对(Wang，N.，Smith，W.，Miller，B.，Aivazian，D.，Lugovskoy，A.，Reff，M.，Glaser，S.，Croner，L.，Demarest，S.(2008)Conserved amino acid networks involved in antibody variable domaininteractions Proteins：Struct.Funct.Bioinform.In Press.)。以灰色突出域间相互作用涉及的CL、CH1和CH3的残基位置和与碳水化合物直接接触的那些氨基酸一起共同强烈变化的氨基酸位置。在比对下方提供了Kabat和EU编号。图2C描述了IgG1-CH2域的结构的带状图(Sondermann等，2000)。标记被N连接碳水化合物隐蔽的缬氨酸残基和CH2域中唯一的6氨基酸环。图2D描述了天然IgG1-CH2序列和经完全修饰的IgG1-CH2序列的比对。经修饰的残基位置以黑色示出。在比对的上面示出修饰位置的EU编号。
图3描述了搅拌之后本发明的示例性IgG Fc构建体的浊度(图A)和％单体含量(图B)。
图4描述了在保持低pH(pH 3.1)时IgG Fc构建体随时间的相对峰高。
图5描述了通过溶液亲合力表面等离子体共振测量的本发明的示例性IgG1和IgG4Fc构建体与Fcγ受体的初始结合率。
图6描述了用于计算本发明的示例性IgG1和IgG4Fc构建体与CD64(FcγRI)(图6A)和CD16(FcγRIIIa V158)(图6B)的结合的IC50的滴定曲线。
图7描述了滴定曲线，突出与IgG1T299A和IgG1野生型相比，IgG1T299K与CD64(FcγRI)的结合降低(图7A)，与其它含有T299A突变的示例性IgG4Fc构建体和IgG1野生型相比含有T299K突变的示例性IgG4Fc构建体与CD64(FcγRI)的结合降低(图7B)。
图8描述了与其它含有T299A突变的示例性IgG4Fc构建体和IgG1野生型相比，含有T299K突变的示例性IgG4Fc构建体与CD16(FcγRIIIa V158)的结合。
图9描述了用于评估本发明示例性IgG1构建体和IgG4Fc构建体与补体因子的结合的滴定曲线。
图10图A和B分别示出用于评估各Fc构建体与CD64和CD16的结合的滴定曲线。图C示出N297Q IgG4-CH2/IgG1-CH3的半衰期与T299A抗体(其比无糖基化IgG1稍短)相同。
图11图A示出用于评估T299X构建体与CD64结合的滴定曲线，并说明带正电的侧链T299R和T299K对CD64的亲合力低。图B示出用于评估CD64与各替代性构建体的结合的滴定曲线。图C和D示出用于评估构建体与CD32aR的结合的滴定曲线，以及图E和F示出构建体与CD16的结合。图G和H示出C1q ELISA的结果。
图12图A示出用于评估构建体与CD64的结合的滴定曲线，以及图B示出用于评估构建体与CD16的结合的滴定曲线。
具体实施方式
已发展了一种方法用于通过将一个或多个稳定氨基酸包含在Fc多肽的Fc区中以生成效应子功能降低的稳定的Fc多肽，例如，无糖基化抗体或IgG4抗体。该方法尤其适于仅通过对多肽进行最低限度的氨基酸改变而在真核细胞中生成含Fc的治疗性多肽。从而本发明的方法避免将氨基酸序列引入可致免疫的多肽中。优选地，稳定氨基酸使多肽的Fc区稳定，而不影响多肽的糖基化和/或效应子功能，且不会显著改变多肽的其它所需功能(例如，抗原结合亲合力或半衰期)。
为了清楚地理解说明书和权利要求书，下文方便地给出了以下定义。
定义
本文所使用的术语“效应子功能”指Fc区或其部分结合免疫系统的蛋白质和/或细胞以及介导各种生物效应的功能性能力。效应子功能可为抗原依赖性或抗原非依赖性。效应子功能降低指一种或多种效应子功能的降低，同时保持抗体(或其片段)可变区的抗原结合活性。效应子功能(例如，与Fc受体或补体蛋白的Fc结合)的升高或降低可用倍数变化(例如，改变1倍、2倍等)来表示，并且可基于例如用本领域熟知的测定而确定的结合活性的变化百分比来计算。
本文所使用的术语“抗原依赖性效应子功能”指通常在抗体结合相应抗原之后诱导的效应子功能。典型的抗原依赖性效应子功能包括结合补体蛋白(如C1q)的能力。例如，补体的C1组分与Fc区的结合可激活典型的补体系统，其引起细胞病原体的调理素作用和溶解，这是称为补体依赖性细胞毒作用(CDCC)的过程。补体的激活也刺激炎症反应并且也可能参与自身免疫超敏反应。
其它抗原依赖性效应子功能由抗体通过其Fc区与细胞上某些Fc受体(″FcR″)结合来介导。存在若干对不同种类抗体的特异的Fc受体，包括IgG(γ受体或IgγRs)、IgE(ε受体或IgεR)、IgA(α受体或IgαR)和IgM(μ受体或IgμR)。抗体与细胞表面上的Fc受体的结合触发若干重要的不同生物反应，包括免疫复合物的胞吞作用、吞没和破坏抗体包被微粒或微生物(也称为抗体依赖性吞噬作用或ADCP)、清除免疫复合物、杀伤细胞溶解抗体包被的靶细胞(也称为抗体依赖性细胞毒作用或ADCC)、释放炎症性介质、调节免疫系统细胞激活、胎盘转移和控制免疫球蛋白生成。
某些Fc受体，Fcγ受体(FcγR)在取消或增强免疫募集中起关键性作用。FcγR在白细胞上表达，并且由三个不同种类组成：FcγRI、FcγRII和FcγRIII(Gessner等，Ann.Hematol.，(1998)，76：231-48)。在结构上，FcγR是免疫球蛋白超家族的所有成员，具有带有由两个或三个Ig样域组成的胞外部分的IgG结合α链。人FcγRI(CD64)在人单核细胞上表达，显示出与单体IgG1、IgG3、IgG4的高亲合力结合(Ka＝108-109M-1)。人FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)对IgG1和IgG3的亲合力低(Ka＜107M-1)，并且可仅结合这些IgG同种型的复合或聚合形式。而且，FcγRII和FcγRIII类包括“A”和“B”两种形式。FcγRIIa(CD32a)和FcγRIIIa(CD16a)通过跨膜域与巨噬细胞、NK细胞和一些T细胞的表面结合，而FcγRIIa(CD32a)和FcγRIIIa(CD16a)通过磷脂酰肌醇聚糖(GPI)锚点选择性地与粒细胞(例如嗜中性粒细胞)的细胞表面结合。人FcγRI、FcγRII和FcγRIII的各鼠科同系物为FcγRIIa、FcγRIIb/1和FcγRlo。
本文所使用的术语“抗原非依赖性效应子功能”指可由抗体诱导的效应子功能，而不管其是否已经结合其相应的抗原。典型的抗原非依赖性效应子功能包括细胞运输、免疫球蛋白的循环半衰期和清除率以及促进提纯。结构独特的Fc受体、“新生儿Fc受体”或“FcRn”(也称为救治受体)在调节半衰期和细胞运输中起关键性作用。从微生物细胞提纯的其它Fc受体(例如，葡萄球菌蛋白A或G)能够以高亲合力结合Fc区并且可用于促进含Fc的多肽的提纯。
与属于免疫球蛋白超家族的FcγR不同，人FcRn在结构上类似于I类主要组织相容性复合体(MHC)的多肽(Ghetie和Ward，Immunology Today，(1997)，18(12)：592-8)。FcRn通常表示为异质二聚体，该异质二聚体由跨膜α或重链与可溶β或轻链(β2微球蛋白)形成的复合物组成。FcRn与I类MHC分子有22-29％的序列同一性，并具有非功能型MHC肽结合沟槽(Simister和Mostov，Nature，(1989)，337：184-7)。如同MHC，FcRn的α链由三个胞外域(α1、α2、α3)组成，且胞质短尾区将蛋白质锚定在细胞表面。α1域和α2域与抗体Fc区中的FcR结合位点相互作用(Raghavan等，Immunity，(1994)，1：303-15)。FcRn在哺乳动物母体胎盘或卵黄囊中表达，并且其参与将IgG从母体转运至胎儿。FcRn也在啮齿动物新生儿的小肠中表达，其中其参与将母体IgG从摄取的初乳或奶中转运通过刷状缘上皮细胞。FcRn还在许多物种的许多其它组织以及各种内皮细胞系中表达。它还在成人血管内皮、肌肉脉管系统和肝窦状隙中表达。认为FcRn通过结合IgG并将其在血清中再利用而在保持IgG的循环半衰期或血清水平中起附加作用。FcRn与IgG分子的结合严格依赖于pH，在pH低于7.0时结合最佳。
本文所使用的术语“半衰期”指体内特定结合多肽的生物半衰期。可用施用于受试者的量的一半从动物体内的循环和/或其它组织清除所需的时间来表示半衰期。当将给定结合多肽的清除曲线构造为时间函数时，该曲线通常为两相，即快速α相和较长的β相。α相通常表示所施用的Fc多肽在血管内外空间之间的平衡，并且部分由多肽的大小确定。β相通常表示结合多肽在血管内空间中的分解代谢。因此，在优选的实施方案中，本文所使用的术语半衰期指在β相中结合多肽的半衰期。人源抗体在人体内的典型β相半衰期为21天。
本文所使用的术语“多肽”指两个或更多个天然氨基酸或非天然氨基酸的聚合物。术语“Fc多肽”指包含Fc区或其部分(例如，Fc部分)的多肽。在优选的实施方案中，根据本发明的方法使Fc多肽稳定。在任选的实施方案中，Fc多肽进一步包含与Fc多肽的Fc区(或其部分)可操作地连接或融合的结合位点。
本文所使用的术语“蛋白质”指多肽(例如，Fc多肽)或包含一个以上多肽的组合物。因此，蛋白质可为单体(例如，单链Fc多肽)或多聚体。例如，在一个实施方案中，本发明的蛋白质为二聚体。在一个实施方案中，本发明的二聚体为包含两个相同单体亚单位或多肽(例如，两个相同的Fc多肽)的同型二聚体。在另一个实施方案中，本发明的二聚体为包含两个不同单体亚单位或多肽(例如，两个不同Fc多肽或一个Fc多肽和另一个不同于所述Fc多肽的多肽)的异质二聚体。二聚体的亚单位可包含一条或多条多肽链，其中至少一条多肽链为Fc多肽。例如，在一个实施方案中，二聚体包含至少两条多肽链(例如，至少两条Fc多肽链)。在一个实施方案中，二聚体包含两条多肽链，其中一条或两条链为Fc多肽链。在另一个实施方案中，二聚体包含三条多肽链，其中一条、两条或所有多肽链为Fc多肽链。在另一个实施方案中，二聚体包含四条多肽链，其中一条、两条、三条或所有多肽链为Fc多肽链。
本文所使用的术语“连接的”、“融合的”或“融合”可交换使用。这些术语指两个以上的元件分或组分通过包括化学共轭或重组方式在内的任何方式连接在一起。本领域已知化学共轭方法(例如，使用异双功能交联剂)。本文所使用的术语“基因融合的”或“基因融合”指通过编码所述蛋白质、多肽或片段的单个多核苷酸分子的基因表达，两个或更多个蛋白质、多肽或其片段经由其各自的肽主链共线、共价连接或附接。这种基因融合引起单个邻接基因序列的表达。优选的基因融合是在框中，即两个或更多个开放阅读框(ORF)按保持原始ORF的正确阅读框的方式融合以形成连续更长的ORF。因此，所得到的重组融合蛋白为单一多肽，其含两个或更多个与由原始ORF编码的多肽相对应的蛋白质片段(实际上该片段通常并非如此连接)。尽管这样使得阅读框在整个融合基因片段上连续，但是可通过(例如)框内多肽连接头在物理上或空间上分离蛋白质片段。
本文所使用的术语“Fc区”应定义为由抗体重链的两个或更多个Fc部分形成的免疫球蛋白的部分。在某些实施方案中，Fc区为二聚Fc区。“二聚Fc区”或“dcFc”指由两条单独的免疫球蛋白重链的Fc部分形成的二聚体。二聚Fc区可为两个相同Fc部分的同型二聚体(例如，天然存在的免疫球蛋白的Fc区)或两个不同Fc部分的异质二聚体。在其它实施方案中，Fc区为单体或“单链”Fc区(即，scFc区)。单链Fc区由单一多肽链中基因连接的Fc部分(即，在单一邻接基因序列中编码的)组成。2008年5月14日提交的PCT申请第PCT/US2008/006260号中公开了示例性scFc区，该申请通过引用的方式并入本文。
本文所使用的术语“Fc部分”指源自免疫球蛋白重链的部分的序列，其从正好位于木瓜蛋白酶裂解位点上游的铰链区开始(即，IgG的216位残基，将重链恒定区的第一个残基移至114位)并在免疫球蛋白重链的C端结束。因此，Fc部分可为完整的Fc部分或其部分(即，域)。完整的Fc部分包含至少一个铰链域、CH2域和CH3域(例如，EU氨基酸位置216-446)。Fc部分的C末端有时存在另外的赖氨酸残基(K)，但往往与成熟抗体分开。Fc区中每个氨基酸位置已根据本领域公认的Kabat的欧盟编号系统编号，见例如1983年和1987年U.S.Dept.Health and Human Services，Kabat等的“Sequences of Proteins of Immunological Interest”。
在某些实施方案中，Fc部分包含以下的至少一个：铰链(例如，上、中和/或下铰链区)域、CH2域、CH3域或其变体、部分或片段。在优选的实施方案中，Fc部分包含至少一个CH2域或CH3域。在某些实施方案中，Fc部分为完整的Fc部分。在其它实施方案中，相对于天然存在的Fc部分，所述Fc部分包含一个或多个氨基酸插入、缺失或取代。例如，可能缺失铰链域、CH2域或CH3域(或其部分)中的至少一个。例如，Fc部分可包含或由以下域组成：(i)与CH2域(或其部分)融合的铰链域(或其部分)、(ii)与CH3域(或其部分)融合的铰链域(或其部分)、(iii)与CH3域(或其部分)融合的CH2域(或其部分)、(iv)CH2域(或其部分)和(v)CH3域或其部分。
如前所述，本领域的普通技术人员应理解可修饰Fc部分以致其在氨基酸序列上与天然存在的免疫球蛋白分子的完整Fc部分不同，同时保持至少一种天然存在的Fc部分赋予的所需功能。例如，Fc部分可至少包含本领域已知的FcRn结合或延长半衰期所需的Fc部分的部分或由其组成。在另一个实施方案中，Fc部分至少包含本领域已知的FcγR结合所需的部分。在一个实施方案中，本发明的Fc区至少包含本领域已知的蛋白质A结合所需的部分。在一个实施方案中，本发明的Fc部分至少包含本领域已知的蛋白质G结合所需的Fc分子的部分。
在某些实施方案中，Fc区的Fc部分为相同的同种型。例如，Fc部分可源自IgG1或IgG4同种型的免疫球蛋白(例如，人免疫球蛋白)。然而，Fc区(或Fc区的一个或多个Fc部分)也可以是嵌合的。嵌合Fc区可包含源自不同免疫球蛋白同种型的Fc部分。在某些实施方案中，二聚或单链Fc区的至少两个Fc部分可来自不同的免疫球蛋白同种型。在另外的或替代性实施方案中，嵌合Fc区可包含一个或多个嵌合Fc部分。例如，嵌合Fc区或部分可包含一个或多个源自第一同种型(例如，IgG1、IgG2或IgG3同种型)的免疫球蛋白的部分，而Fc区或部分的其余部分为不同的同种型。例如，Fc多肽的Fc区或部分可包含源自第一同种型(例如，IgG1、IgG2或IgG4同种型)的免疫球蛋白的CH2域和/或CH3域和来自第二同种型(例如，IgG3同种型)的免疫球蛋白的铰链区。在另一个实施方案中，Fc区或部分包含源自第一同种型(例如，IgG4同种型)的免疫球蛋白的铰链和/或CH2域和来自第二同种型(例如，IgG1、IgG2或IgG3同种型)的免疫球蛋白的CH3域。在另一个实施方案中，嵌合Fc区包含来自第一同种型(例如，IgG4同种型)的免疫球蛋白的Fc部分(例如，完整的Fc部分)和来自第二同种型(例如，IgG1、IgG2或IgG3同种型)的免疫球蛋白的Fc部分。在一个示例性的实施方案中，Fc区或部分包含来自IgG4免疫球蛋白的CH2域和来自IgG1免疫球蛋白的CH3域。在另一个实施方案中，Fc区或部分包含来自IgG4分子的CH1域和CH2域以及来自IgG1分子的CH3域。在另一个实施方案中，Fc区或部分包含来自抗体的特定同种型的CH2域的部分，例如，CH2域的EU位置292-340。例如，在一个实施方案中，Fc区或部分包含源自IgG4部分的CH2的氨基酸位置292-34和源自IgG1部分的CH2的其余部分(或者，CH2的位置292-34可源自IgG1部分，且CH2的其余部分源自IgG4部分)。
在其它实施方案中，Fc区或部分可包含嵌合铰链区。嵌合铰链可部分源自IgG1、IgG2或IgG4分子(例如，上和下中部铰链序列)，而部分源自IgG3分子(例如，中部铰链序列)。在另一个实例中，Fc区或部分可包含部分源自IgG1分子而部分源自IgG4分子的嵌合铰链。在具体的实施方案中，嵌合铰链可包含来自于IgG4分子的上部和下部铰链域和来自于IgG1分子的中部铰链域。可通过在IgG4铰链区的中部铰链域中的EU位置228处引入脯氨酸取代(Ser228Pro)来制备此类嵌合铰链。在另一个实施方案中，嵌合铰链可包含位于EU位置233-236的氨基酸，这些氨基酸来自IgG2抗体和/或Ser228Pro突变，其中铰链的其余氨基酸来自IgG4抗体(例如，序列ESKYGPPCPPCPAPPVAGP的嵌合铰链)。美国专利申请第10/880,320号中描述了另外的嵌合铰链，该专利申请的全部内容通过引用的方式并入本文。
定义“Fc区”特别包括“无糖基化Fc区”。本文所使用的“无糖基化Fc区”为例如在其一个或多个Fc部分中位于EU位置297的N糖基化位点处缺乏共价连接的低聚糖或多糖的Fc区。在某些实施方案中，无糖基化Fc区被完全无糖基化，即，其所有Fc部分均缺乏糖。在其它实施方案中，无糖基化为部分无糖基化(即，半糖基化)。无糖基化Fc区可为去糖基化Fc区，即已通过例如化学或酶促方法除去Fc糖的Fc区。或者，无糖基化Fc区可以是非糖基化的或未糖基化的，即表达抗体而没有Fc碳水化合物，方式例如是使例如位于EU位置297或299的N糖基化位点的编码糖基化模式的一个或多个残基突变，在并非天然地将碳水化合物附接至蛋白质的生物(例如，细菌)中表达，或在通过基因操作或添加糖基化抑制剂(例如，糖基转移酶抑制剂)致使其糖基化机构有缺陷的宿主细胞或生物体中表达。在替代性实施方案中，Fc区为“糖基化Fc区”，即，其在所有可用糖基化位点被完全糖基化。
术语“亲本Fc多肽”包括含有需要稳定的Fc区的多肽(例如，IgG抗体)。优选地，亲本Fc多肽为无效应子Fc多肽。因此，亲本Fc多肽表示对其实施本发明的方法或可用作稳定性比较的参考点的原始Fc多肽。亲本多肽可包含天然的(即天然存在的)Fc区或部分(例如，人IgG4Fc区域或部分)或具有对天然存在的序列进行的预先存在氨基酸序列修饰(如插入、缺失和/或其它改变)，但缺乏一个或多个稳定氨基酸的Fc区。
术语“突变”或“突变的”应理解为包括在物理上对亲本Fc多肽进行突变(例如，通过(例如，通过定点诱变)将编码一个氨基酸的核酸分子的密码子改变为编码不同氨基酸的密码子)或合成具有亲本Fc区中没有的氨基酸的变体Fc区(例如，通过分辨编码亲本Fc区的核酸分子的核苷酸序列和设计合成包含编码亲本Fc区的变体的核苷酸序列的核酸分子，而无需使编码本发明稳定多肽的核酸分子的一个或多个核苷酸突变)。
在一个示例性的实施方案中，亲本Fc多肽包含来自无效应子Fc多肽的Fc区。本文所使用的术语“无效应子Fc多肽”指与IgG1同种型的野生型无糖基化抗体相比，效应子功能改变或降低的Fc多肽。优选地，降低或改变的效应子功能为抗体依赖性效应子功能，例如，ADCC和/或ADCP。在一个实施方案中，由于Fc多肽的Fc区(例如，无糖基化Fc区)中经修饰或降低的糖基化作用，无效应子Fc多肽的效应子功能降低。在另一个实施方案中，由于并入IgG4Fc区或其部分(例如，IgG4抗体的CH2域和/或CH3域)，无效应子Fc多肽的效应子功能降低。
术语“变体Fc多肽”或“Fc变体”包括源自亲本Fc多肽的Fc多肽。Fc变体与亲本Fc多肽不同之处在于：例如，由于引入至少一个Fc稳定突变，Fc变体包括稳定一个或多个稳定氨基酸残基。在某些实施方案中，除存在一个或多个稳定Fc氨基酸外，本发明的Fc变体包含序列与亲本多肽的序列相同的Fc区(或Fc部分)。在优选的实施方案中，与亲本Fc多肽相比，Fc变体稳定性增强，并且与亲本Fc多肽相比，Fc变体的效应子功能任选地相当或降低。
“源自”指定多肽或蛋白质的多肽或氨基酸序列指多肽的来源。优选地，源自特定序列的多肽或氨基酸序列具有基本上与所述序列或其部分相同的氨基酸序列，其中所述部分由至少10-20个氨基酸、优选至少20-30个氨基酸、更优选至少30-50个氨基酸组成，或者本领域的普通技术人员可识别为该序列中具有其起源。在多肽的情况下，“线性序列”或“序列”为多肽中从氨基至羧基末端方向的氨基酸顺序，其中在多肽的一级结构中所述序列中相邻的残基邻接。
相对于原多肽或亲本多肽，源自另一个多肽(例如，亲本Fc多肽)的多肽(例如，变体Fc多肽)可有一个或多个突变，例如，被另一个氨基酸残基取代或有一个或多个氨基酸残基插入或缺失的一个或多个氨基酸残基。优选地，多肽包含非天然存在的氨基酸序列。这种变体与原多肽的序列同一性或相似性必定低于100％。在优选的实施方案中，例如在变体分子的全长或其一部分(例如，Fc区或Fc部分)上，变体的氨基酸序列与原多肽的氨基酸序列将具有约75％至低于100％氨基酸序列同一性或相似性，更优选为约80％至低于100％，更优选为约85％至低于100％，更优选为约90％至低于100％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)和最优选为约95％至低于100％。在一个实施方案中，原多肽序列(例如，亲本Fc多肽的Fc区)和源自原多肽序列的序列(如变体Fc多肽的Fc区)之间有一个氨基酸差异。在其它实施方案中，在原多肽序列和变体多肽之间有介于两个和十个之间的氨基酸差异(例如，约2-20、约2-15、约2-10、约5-20、约5-15、约5-15、约5-10个氨基酸差异)。例如，可能有少于约10个氨基酸差异(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸差异)。本文将相对于该序列的同一性或相似性定义为在比对序列并在必要时引入空隙获得最高百分比序列同一性之后，与原氨基酸残基相同的(即，相同的残基)候选序列中的氨基酸残基百分比。
本发明的优选Fc多肽包含源自人免疫球蛋白序列(例如，来自人IgG分子的Fc区或Fc部分)的氨基酸序列(例如，至少一个Fc区或Fc部分)。然而，多肽可包含一个或多个来自另外的哺乳动物的氨基酸。例如，受试多肽中可包含灵长类Fc部分或灵长类结合位点。或者，Fc多肽中可存在一个或多个鼠类氨基酸。本发明的优选Fc多肽不产生免疫性。
本领域的普通技术人员还应了解可改变本发明的Fc多肽以致与其来源的亲本多肽在氨基酸序列上不同，同时保持亲本多肽的一种或多种所需活性(例如，效应子功能降低)。在具体的实施方案中，进行使Fc多肽稳定的核苷酸或氨基酸取代。在一个实施方案中，可通过对亲本Fc多肽的核苷酸序列引入一个或多个核苷酸取代、添加或缺失而生成编码Fc变体的分离的核酸分子，从而将一个或多个氨基酸取代、添加或缺失引入编码的蛋白质。可通过标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变来引入突变(例如，稳定突变)。
本文所使用的术语“蛋白质稳定性”指本领域公认的蛋白质响应于环境条件(例如，温度升高或降低)的一种或多种物理性质保持性的量度。在一个实施方案中，物理性质为蛋白质共价结构的保持(例如，没有蛋白裂解、有害的氧化或脱酰胺作用)。在另一个实施方案中，物理性质为存在呈适当折叠状态的蛋白质(例如，没有可溶性或不溶性聚集物或沉淀)。在一个实施方案中，通过测定蛋白质的生物物理学性质，如热稳定性、pH解折叠性、稳定的去除糖基化、溶解性、生化功能(例如，结合蛋白质(例如，配体、受体、抗原等)或化学部分等的能力)，和/或其组合来测量蛋白质的稳定性。在另一个实施方案中，用相互作用的结合亲合力证明生化功能。在一个实施方案中，蛋白质稳定性的量度为热稳定性，即，对热激发的抵抗力。可使用本领域已知的方法和/或本文所描述的方法测量稳定性。例如，可测量“Tm”(也称为“转变温度”)。Tm是使50％的大分子(例如，结合分子)变性的温度，并被视为用于描述蛋白质热稳定性的标准参数。
术语“氨基酸”包括丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Gln或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、赖氨酸(Lys或K)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)和缬氨酸(Val或V)。非传统氨基酸也在本发明范围之内，并包括正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸和其它氨基酸残基类似物，如Ellman等，Meth.Enzym.202：301-336(1991)中所描述的那些。为了生成这种非天然存在的氨基酸残基，可使用Noren等，Science 244：182(1989)和Ellman等，上文献中的方法。简言之，这些方法涉及化学激活带非天然存在氨基酸残基的抑制型tRNA，然后在体外转录并翻译RNA。还可使用本领域已知的肽化学法实现非传统氨基酸的引入。本文所使用的术语“极性氨基酸”包括具有零净电荷，但在其侧链的不同部位具有局部非零电荷的氨基酸(例如M、F、W、S、Y、N、Q、C)。这些氨基酸可参与疏水相互作用和静电相互作用。本文所使用的术语“带电氨基酸”包括在其侧链可具有非零净电荷的氨基酸(例如R、K、H、E、D)。这些氨基酸可参与疏水相互作用和静电相互作用。本文所使用的术语“空间体积足够大的氨基酸”包括那些侧链占有较大三维空间的氨基酸。具有足够大空间体积的侧链化学性质的示例性氨基酸包括酪氨酸、色氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和甲硫氨酸或其类似物或模拟物。
“氨基酸取代”指用另一不同的“置换”氨基酸残基置换预定氨基酸序列(原多肽的氨基酸序列)中至少一个现有氨基酸残基。“氨基酸插入”指将至少一个额外的氨基酸并入预定氨基酸序列。虽然插入将通常由插入一个或两个氨基酸残基组成，但可进行当前更大的“肽插入”，例如插入约3个至约5个或甚至多达约10个、15个或20个氨基酸残基。如上所述，插入的残基可为天然存在的或非天然存在的。“氨基酸缺失”指从预定氨基酸序列去除至少一个氨基酸残基。如上所述，这些术语包括现有物理核酸分子的实际变化或在设计过程(例如，在书面上或电脑上)中对现有核酸序列所作的变化。
在某些实施方案中，本发明的多肽为结合多肽。本文所使用的术语“结合多肽”指包含至少一个特异性结合靶分子(如抗原或结合配偶体)的靶结合位点或结合域的多肽(例如，Fc多肽)。例如，在一个实施方案中，本发明的结合多肽包含免疫球蛋白抗原结合位点或负责配体结合的受体分子的部分或负责受体结合的配体分子的部分。本发明的结合多肽包含至少一个结合位点。在一个实施方案中，本发明的结合多肽包含至少两个结合位点。在一个实施方案中，结合多肽包含两个结合位点。在另一个实施方案中，结合多肽包含三个结合位点。在另一个实施方案中，结合多肽包含四个结合位点。在一个实施方案中，结合位点相互连接在一起。在另一个实施方案中，结合位点位于结合多肽的不同位置，例如位于Fc多肽的Fc区的一个或多个N或C端。例如，当Fc区为scFc区时，结合位点可连接至scFc区的N端、C端或其二者。当Fc区为二聚Fc区时，结合位点可连接至一个或两个N端和/或一个或两个C端。
本文所使用的术语“结合域”、“结合位点”或“结合部分”指结合多肽具有生物活性(Fc介导的生物活性除外)的部分、区或位点，例如，介导与靶分子(如抗原、配体、受体、底物或抑制剂)的特异性结合的部分、区或位点。示例性结合域包括生物活性蛋白或部分、抗原结合位点、配体的受体结合域、受体的配体结合域或酶结合域。在另一个实例中，术语“结合部分”指结合生物系统的组分(例如，血清或细胞表面蛋白或细胞基质中的蛋白质)的生物活性分子或其部分，并且这种结合导致生物效应(例如，通过改变与之结合的活性部分和/或组分进行测量(例如，裂解与之结合的活性部分和/或组分，传输信号或加强或抑制细胞或受试者体内的生物反应))。
本文所使用的术语“配体结合域”指保持至少一种定性配体结合能力，并优选保持相应天然受体的生物活性的天然受体(例如，细胞表面受体)或其区或衍生物。本文所使用的术语“受体结合域”指保持至少一种定性受体结合能力，并优选保持相应天然配体的生物活性的天然配体或其区或衍生物。在一个实施方案中，本发明的结合多肽具有至少一个对被靶向减少或消除的分子有特异性的结合域，例如，细胞表面抗原或可溶性抗原。在优选的实施方案中，结合域包含抗原结合位点或由抗原结合位点组成(例如，包含来自置于选择性骨架区(例如，任选包含一个或多个氨基酸取代的人骨架区)的抗体的可变重链序列和可变轻链序列或六个CDR)。
本文所使用的术语“结合亲合力”包括结合相互作用的强度，且因此包括实际结合亲合力以及表观结合亲合力。实际结合亲合力为缔合速率与解离速率的比率。因此，授予或优化结合亲合力包括改变这两个部分之一或其二者以达到所需水平的结合亲合力。表观亲合力可包括例如相互作用的亲合力等。
本文所使用的术语“结合自由能”或“结合的自由能”包括其领域公认的含义，并且尤其适用于溶剂中结合位点-配体或Fc-FcR的相互作用。结合自由能降低使亲合力增强，而结合自由能升高使亲合力下降。
术语“特异性”包括特异性结合给定靶标(例如，与之免疫反应)的潜在结合位点的数量。结合多肽可为单特异性的并含有一个或多个特异性结合相同的靶标(例如，相同的表位)的结合位点，或者结合多肽可为多特异性的并含有两个或更多个特异性结合相同靶标的不同区(例如，不同的表位)或不同靶标的结合位点。在一个实施方案中，可制备对一个以上的靶分子(例如，一个以上的抗原或相同抗原上的一个以上的表位)具有结合特异性的多特异性结合多肽(例如，双特异性多肽)。在另一个实施方案中，多特异性结合多肽具有至少一个对被靶向减少或消除的分子有特异性的结合域和至少一个对细胞上的靶分子有特异性的结合域。在另一个实施方案中，多特异性结合多肽具有至少一个对被靶向减少或消除的分子有特异性的结合域和至少一个对药物有特异性的结合域。在又一个实施方案中，多特异性结合多肽具有至少一个对被靶向减少或消除的分子有特异性的结合域和至少一个对药物前体有特异性的结合域。在又一个实施方案中，多特异性结合多肽为四价抗体，其具有两个对一个靶分子有特异性的结合域和两个对另一靶分子有特异性的结合位点。
本文所使用的术语“价”指结合多肽或蛋白质中潜在结合域的数量。各结合域特异性结合一个靶分子。当结合多肽包含一个以上结合域时，各结合域可特异性结合相同或不同的分子(例如，可结合不同的配体或不同的抗原或相同抗原上的不同表位)。在一个实施方案中，本发明的结合多肽为单价。在另一个实施方案中，本发明的结合多肽为多价。在另一个实施方案中，本发明的结合多肽为二价。在另一个实施方案中，本发明的结合多肽为三价。在又一个实施方案中，本发明的结合多肽为四价。
在某些方面，本发明的结合多肽采用多肽接头。本文所使用的术语“多肽接头”指连接多肽链的线性氨基酸序列中的两个域的肽或多肽序列(例如，合成肽或多肽序列)。例如，多肽接头可用于将结合位点连接到本发明Fc多肽的Fc区(或Fc部分)。优选地，这种多肽接头为多肽分子提供挠性。例如，在一个实施方案中，VH域或VL域与多肽接头融合或连接，且多肽接头的N端或C端与Fc区(或Fc部分)的C端或N端连接，且多肽接头的N端与VH域或VL域的N端或C端连接。在某些实施方案中，多肽接头用于连接(例如，基因融合)scFc多肽的两个Fc部分或域。本文也将这种多肽接头称为Fc连接多肽。本文所使用的术语“Fc连接多肽”尤其指连接(例如，基因融合)两个Fc部分或域的连接多肽。本发明的结合分子可包含一个以上的肽接头。
本文所使用的术语“适当折叠的多肽”包括其中组成多肽的所有功能域均具有明显活性的多肽(例如，本发明的结合多肽)。本文所使用的术语“不当折叠的多肽”包括其中多肽的至少一个功能区无活性的多肽。本文所使用的术语“适当折叠的Fc多肽”或“适当折叠的Fc区”包括其中至少两个Fc组成部分适当折叠以致所得到的Fc区包含至少一种效应子功能的Fc区(例如，scFc区)。
本文所使用的术语“免疫球蛋白”包括具有两条重链和两条轻链的组合而无论其是否具有任何相关特异免疫反应性的多肽。本文所使用的术语“抗体”指这种对目标抗原(例如，肿瘤相关抗原)有显著的已知特异免疫反应活性的集合(例如，全抗体分子、抗体片段或其变体)。抗体和免疫球蛋白包含其间有或无链间共价键的轻链和重链。脊椎动物系统的基本免疫球蛋白结构相对很好理解。
如以下将更详细讨论的，通用术语“抗体”包括五个可用生化方法区别的不同种类的抗体。来自各类抗体的Fc部分明显在本发明的范围之内，以下讨论通常针对IgG类免疫球蛋白分子。对于IgG而言，免疫球蛋白包含两条分子量约为23,000道尔顿的相同多肽轻链和两条分子量为53,000-70,000道尔顿的相同多肽重链。用二硫键将这四条链连接成“Y”构型，其中轻链将起始于“Y”口部并继续通过可变域的重链括在一起。
将免疫球蛋白的轻链归类为κ或λ。每个重链种类可与κ或λ轻链结合。通常，当免疫球蛋白由杂交瘤、B细胞或基因工程宿主细胞生成时，轻链和重链相互共价结合，两条重链的“尾”部通过共价二硫键或非共价键相互结合。在重链中，氨基酸序列从Y构型叉端处的N端至各链底部的C端。本领域的技术人员将了解重链归类为γ、μ、α、δ、ε，其间有许多子类(例如，γ1-γ4)。该链的特性在于将抗体的“种类”分别确定为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白子类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等也是定性清楚的并且已知使之功能特化。由本公开内容来看，这些各种类和同种型的修饰类型对于技术人员是易于辩别的，并因此在本发明范围之内。
轻链和重链均分为结构区和功能同源区。术语“区”指单个免疫球蛋白或抗体单链的局部或部分(术语“Fc区”也是如此)，并包括恒定区或可变区以及所述域的更多的分离局部或部分。例如，轻链可变域包括散布于本文所定义的“骨架区”或“FR”间的“互补决定区”或“CDR”。
在“恒定区”的情况下根据各类成员的区中相对缺乏的序列变体，或在“可变区”的情况下根据各类成员的区中相对缺乏的显著变体，可将免疫球蛋白的某些区定义为“恒定”(C)区或“可变”(V)区。术语“恒定区”和“可变区”在功能上也可用。在这点上，应了解免疫球蛋白或抗体的可变区决定抗原识别和特异性。相反地，免疫球蛋白或抗体的恒定区赋予重要的效应子功能，如分泌、经胎盘移动、Fc受体结合、补体结合等。各种免疫球蛋白种类的恒定区的亚单位结构和三维构型是众所周知的。
免疫球蛋白重链和轻链的恒定区和可变区折叠成域。术语“域”指包含(例如)用β-折叠片和/或链内二硫键稳定的肽环(例如，包括3至4个肽环)的重链或轻链多肽的独立折叠球形区。免疫球蛋白轻链上的恒定区域可交换地称为“轻链恒定区域”、“CL区”或“CL域”。重链上的恒定域(例如，铰链、CH1域、CH2域或CH3域)可交换地称为“重链恒定区域”、“CH区域”或“CH域”。轻链上的可变域可交换地称为“轻链可变区域”、“VL区域”或“VL域”。重链上的可变域可交换地称为“重链可变区域”、“VH区域”或“VH域”。
按照惯例，随着可变区域和恒定区域离免疫球蛋白或抗体的抗原结合位点或氨基末端越远，可变区域和恒定区域的编号增加。各免疫球蛋白重链和轻链的N端为可变区，而C端为恒定区；CH3域和CL域实际上分别包含重链和轻链的羧基端。因此，轻链免疫球蛋白域按VL-CL方向排列，而重链域按VH-CH1-铰链-CH2-CH3方向排列。
本文根据欧盟索引编号系统(见1991年U.S.Dept.Health and HumanServices第5版中，Kabat等的“Sequences of Proteins of Immunological Interest”)对重链恒定区中的氨基酸位置(包括CH1域、铰链域、CH2域和CH3域中的氨基酸位置)进行编号。相反，在本文中，根据Kabat索引编号系统(见如上Kabat等)对轻链恒定区(例如CL域)中的氨基酸位置进行编号。
根据Kabat索引编号系统，本文所使用的术语“VH域”包括免疫球蛋白重链的氨基端可变域，且术语“VL域”包括免疫球蛋白轻链的氨基端可变域。
本文所使用的术语“CH1域”包括例如从EU位置约118-215延伸的免疫球蛋白重链的第一(最氨基端)恒定区域。CH1域邻近VH域和免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端，并未形成免疫球蛋白重链的Fc区的部分。在一个实施方案中，本发明的结合多肽包含源自免疫球蛋白重链分子(例如，人IgG1或IgG4分子)的CH1域。
本文所使用的术语“铰链区”包括将CH1域连至CH2域的重链分子的部分。该铰链区包含约25个残基并且有挠性，从而使两个N端抗原结合区独立移动。铰链区可再分为三个不同的域：上、中、下铰链域(Roux等，J.Immunol.1998，161：4083)
本文所使用的术语“CH2域”包括例如从EU位置约231-340延伸的重链免疫球蛋白分子的部分。CH2域独特之处在于其并未与另外的域紧密配对。相反，两个N连接碳水化合物支链插入完整的天然IgG分子的两个CH2域之间。在一个实施方案中，本发明的结合多肽包含源自IgG1分子(例如人IgG1分子)的CH2域。在另一个实施方案中，本发明的结合多肽包含源自IgG4分子(例如人IgG4分子)的CH2域。在一个示例性实施方案中，本发明的多肽包含CH2域(EU位置231-340)或其部分。
本文所使用的术语“CH3域”包含从CH2域的N端(例如从位置约341-446b(欧盟编号系统))延伸约110个残基的重链免疫球蛋白分子的部分。CH3域通常形成抗体的C端部分。然而，在一些免疫球蛋白中，另外的域可能从CH3域延伸以形成分子的C端部分(例如，IgM的μ链和IgE的ε链中的CH4域)。在一个实施方案中，本发明的结合多肽包含源自IgG1分子(例如，人IgG1分子)的CH3域。在另一个实施方案中，本发明的结合多肽包含源自IgG4分子(例如，人IgG4分子)的CH3域。
本文所使用的术语“CL域”包括例如从Kabat位置约107A-216延伸的免疫球蛋白轻链的第一(最氨基端)恒定区域。CL域邻近VL域。在一个实施方案中，本发明的结合多肽包含源自κ轻链(例如，人κ轻链)的CL域。
如上所示，抗体的可变区使其选择性识别并特异性结合抗原上的表位。即，抗体的VL域和VH域联合形成限定三维抗原结合位点的可变区(Fv)。这种四元抗体结构形成存在于Y的每个臂末端处的抗原结合位点。更具体地说，抗原结合位点由每个重链可变区和轻链可变区上的三个互补决定区(CDR)限定。
本文所使用的术语“抗原结合位点”包括特异性结合(与之免疫反应)抗原(如细胞表面或可溶性抗原)的位点。在一个实施方案中，结合位点包括免疫球蛋白重链和轻链可变区，并且由这些可变区形成的结合位点决定抗体的特异性。抗原结合位点由多肽不同的可变区形成。在一个实施方案中，本发明的结合多肽包含含有抗体分子的至少一个重链或轻链CDR(例如，其序列为本领域已知或如本文所描述)的抗原结合位点。在另一个实施方案中，本发明的结合多肽包含含有至少两个来自于一个或多个抗体分子的CDR的抗原结合位点。在另一个实施方案中，本发明的结合多肽包含含有至少三个来自于一个或多个抗体分子的CDR的抗原结合位点。在另一个实施方案中，本发明的结合多肽包含含有至少四个来自于一个或多个抗体分子的CDR的抗原结合位点。在另一个实施方案中，本发明的结合多肽包含含有至少五个来自于一个或多个抗体分子的CDR的抗原结合位点。在另一个实施方案中，本发明的结合多肽包含含有至少六个来自于一个或多个抗体分子的CDR的抗原结合位点。本领域已知包含至少一个可包括在受试结合多肽内的CDR的示例性抗体分子，且本文描述了示例性分子。
本文所使用的术语“CDR”或“互补决定区”指重链和轻链多肽的可变区内存在的非邻接抗原结合位点。Kabat等在J.Biol.Chem.252，6609-6616(1977)和“Sequences of Proteins of Immunological Interest”(1991)中，Chothia等在J.Mol.Biol.196：901-917(1987)中和MacCallum等在J.Mol.Biol.262：732-745(1996)中已描述了这些特殊区，其中定义包括相互比较时氨基酸残基的重叠或子集。提出包含每个以上所引用的参考文献所定义的CDR的氨基酸残基以便进行比较。优选地，术语“CDR”为由Kabat根据序列比较定义的CDR。
Figure BDA0000093834270000311
Figure BDA0000093834270000321
1残基编号遵照上述Kabat等的命名法
2残基编号遵照上述Chothia等的命名法
3残基编号遵照上述MacCallum等的命名法
本文所使用的术语“骨架区”或“FR区”包含为可变区的一部分而非CDR的一部分的氨基酸残基(例如，使用CDR的Kabat定义)。因此，可变区骨架长度约为100-120个氨基酸，但仅包括CDR外的那些氨基酸。对于重链可变区和Kabat等定义的CDR的具体实例而言，骨架区1与可变区包含氨基酸1-30的域相对应；骨架区2与可变区包含氨基酸36-49的域相对应；骨架区3与可变区包含第氨基酸66-94的域相对应；以及骨架区4与可变区从氨基酸103至可变区末端的域相对应。轻链的骨架区同样被各轻链可变区CDR分开。同样地，使用Chothia等或McCallum等的CDR的定义，骨架区边界被如上所述各CDR末端分开。在优选的实施方案中，CDR如Kabat所定义。
在天然存在的抗体中，当抗体在水相环境中呈其三维构型时，各单体抗体上存在的六个CDR为特异性定位以形成抗原结合位点的短的非邻接氨基酸序列。重链和轻链可变域的其余部分在氨基酸序列上显示较低分子间可变性，并且被称为骨架区。骨架区主要采用β片状构象，且CDR形成相连的环，在某些情况下形成β片状结构的部分。因此，这些骨架区作用为通过链间非共价相互作用形成以正确方向定位六个CDR的支架。由定位的CDR形成的抗原结合位点限定与免疫反应抗原上的表位互补的表面。该互补表面促进抗体与免疫反应抗原表位的非共价结合。本领域的普通技术人员可容易地识别CDR的位置。
在某些实施方案中，本发明的结合多肽包含至少两个使结合多肽与所选抗原结合的抗原结合域(例如，在相同的结合多肽中(例如，在单个多肽的N端和C端)或连接本发明的多聚结合蛋白的各组成结合多肽)。抗原结合域无需源自相同的免疫球蛋白分子。在这点上，可变区可来自或可不来自于可被诱导发生体液反应并生成针对所所需抗原的免疫球蛋白的任何动物类型。同样地，可变区可源自例如哺乳动物，例如可为人、鼠类、非人灵长类(如猕猴、短尾猿等)、狼、骆驼科(如来自骆驼、羊驼和相关物种)。
术语“抗体变体”或“经修饰抗体”包括非天然存在的抗体，并且具有与天然抗体有至少一个氨基酸不同或如本文所述的氨基酸修饰的氨基酸序列或氨基酸侧链化学性质。本文所使用的术语“抗体变体”包括合成形式的抗体、改变为结合两个或更多个不同抗原或单个抗原上的不同表位的多特异形式的抗体(如双特异型、三特异型等)、与scFv分子结合的重链分子、单链抗体、双链抗体、三链抗体、效应子功能改变的抗体等，其中合成形式的抗体被改变为非天然存在的，例如包含至少两个重链部分而非两条完整重链(如域缺失型抗体或微型抗体)的抗体。
本文所使用的术语“scFv分子”包括由一个轻链可变域(VL)或其部分和一个重链可变域(VH)或其部分组成的结合分子，其中各个可变域(或其部分)源自相同或不同的抗体。scFv分子优选地包含插入VH域和VL域之间的scFv接头。scFv分子是本领域已知的，并且描述于1989年Ho等的美国专利第5,892,019号，Gene 77：51；1988年Bird等，Science 242：423；1991年Pantoliano等，Biochemistry 30：10117；1991年Milenic等，Cancer Research51：6363；1991年Takkinen等，Protein Engineering 4：837。
本文所使用“scFv接头”指插入scFv的VL域和VH域之间的部分。scFv接头优选将scFv分子保持为抗原结合构象。在一个实施方案中，scFv接头包含scFv接头肽或由scFv接头肽组成。在某些实施方案中，scFv接头肽包含甘氨酸-丝氨酸多肽接头或由甘氨酸-丝氨酸多肽接头组成。在其它实施方案中，scFv接头包含二硫键。
本文所使用的术语“甘氨酸-丝氨酸多肽接头”指由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。示例性甘氨酸/丝氨酸多肽接头包含氨基酸序列(Gly4Ser)n。在一个实施方案中，n＝1。在一个实施方案中，n＝2。在另一个实施方案中，n＝3，即，(Gly4Ser)3。在另一个实施方案中，n＝4，即，(Gly4Ser)4。在另一个实施方案中，n＝5。在又一个实施方案中，n＝6。在另一个实施方案中，n＝7。在又一个实施方案中，n＝8。在另一个实施方案中，n＝9。在又一个实施方案中，n＝10。另一个示例性甘氨酸/丝氨酸多肽接头包含氨基酸序列Ser(Gly4Ser)n。在一个实施方案中，n＝1。在一个实施方案中，n＝2。在优选的实施方案中，n＝3。在另一个实施方案中，n＝4。在另一个实施方案中，n＝5。在又一个实施方案中，n＝6。
本文所使用的术语“天然半胱氨酸”应指天然存在于多肽的特定氨基酸位置上未经人为修饰、引入或改变的半胱氨酸氨基酸。术语“工程半胱氨酸残基或其类似物”或“工程半胱氨酸或其类似物”应指通过合成方式(例如通过重组技术、体外肽合成，通过肽的酶促或化学偶合或这些技术的若干组合)引入多肽的一个氨基酸位置(在那个位置并非天然含有半胱氨酸残基或其类似物)的非天然半胱氨酸残基或半胱氨酸类似物(例如含巯基的类似物，如噻唑啉-4-羧酸和噻唑烷-4-羧酸(硫代脯氨酸，Th))。
本文所使用的术语“二硫键”包含两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含可与另一巯基形成二硫键或桥的巯基。在最天然存在的的IgG分子中，CH1区和CL区通过天然二硫键连接，且两条重链通过位于与用Kabat编号系统编号的239和242对应的位置(位置226或229，欧盟编号系统)的两个天然二硫键连接。
本文所使用的术语“键合半胱氨酸”应指多肽中与另一个天然或工程半胱氨酸或相同或不同多肽中存在的其它残基形成二硫键或其它共价键的天然或工程半胱氨酸残基。“链内键合半胱氨酸”应指与相同多肽中存在的另一半胱氨酸共价键合(即链内二硫键)的键合半胱氨酸。“链间键合半胱氨酸”应指与不同多肽中存在的另一半胱氨酸共价键合(即链间二硫键)的键合半胱氨酸。
本文所使用的术语“游离半胱氨酸”指多肽序列中以大体还原形式存在的天然或工程半胱氨酸氨基酸残基(和其类似物或模拟物，如噻唑啉-4-羧酸和噻唑烷-4-羧酸(硫代脯氨酸，Th))。游离半胱氨酸优选为能够用本发明的效应部分修饰。
术语“巯基修饰试剂”应指能够选择性与结合多肽中(例如，在结合多肽的多肽接头中)的工程半胱氨酸残基或其类似物的巯基反应，从而提供位点特异性化学添加方式或效应部分与结合多肽的交联，从而形成经修饰的结合多肽。优选地，巯基修饰试剂利用游离半胱氨酸残基中存在的巯基或巯基官能团。示例性巯基修饰试剂包括马来酰亚胺、烷基卤和芳基卤、α-卤代酰基和吡啶基二硫化物。
术语“功能部分”包括优选为结合多肽增加所需功能的部分。优选地，增加所述功能不会明显改变多肽的所需固有活性，例如，分子的抗原结合活性。本发明的结合多肽可包含一个或多个相同或不同功能部分。有用的功能部分的实例包括但不限于效应部分、亲合力部分和阻断部分。
示例性阻断部分包括空间体积足够大和/或电荷足够多以通过阻断糖苷酶使多肽糖基化的能力以致发生糖基化作用降低的部分。阻断部分可另外或选择性地(例如)通过抑制Fc区结合受体或补体蛋白的能力降低效应子功能。优选的阻断部分包括半胱氨酸加合物、半胱氨酸、混合二硫化物加合物和PEG部分。示例性可检测部分包括荧光部分、放射性同位素部分、不透射线部分等。
关于化学部分的缀合，术语“连接部分”包括能够将功能部分连接到结合多肽的其余部分的部分。连接部分可选择为可裂解或不可裂解。不可裂解连接部分通常具有较高系统稳定性，但也可能具有不利的药代动力学性质。
术语“间隔部分”是设计为向分子引入空间的非蛋白质部分。在一个实施方案中，间隔部分可为任选取代的链，具有0至100个选自碳、氧、氮、硫等的原子。在一个实施方案中，间隔部分选择为其可溶于水。在另一个实施方案中，间隔部分为聚亚烷基二醇，如聚乙二醇或聚丙二醇。
术语“聚乙二醇化部分”或“PEG部分”包括用或不用偶合剂或用偶合部分或活化部分(如用硫醇、三氟甲磺酸盐、三氟乙基磺酸酯、氮丙啶、环氧乙烷或优选用马来酰亚胺部分，如PEG-马来酰亚胺)衍生化的聚亚烷基二醇化合物或其衍生物。其它适当的聚亚烷基二醇化合物包括马来酰亚胺单甲氧基PEG、活化PEG聚丙二醇，也包括以下类型的带电或中性聚合物：葡聚糖、多聚乙酰神经氨糖酸、或其它碳水化合物基聚合物、氨基酸聚合物和生物素衍生物。
本文所使用的术语“效应部分”(E)可包括具生物或其它功能活性的诊断剂和治疗剂(例如，蛋白质、核酸、脂类、药物部分及其片段)。例如，包含与结合多肽缀合的效应部分的结合多肽与非缀合多肽相比至少具有另一种功能或性质。例如细胞毒素药部分(例如，效应部分)与结合多肽(例如，通过其多肽接头)的缀合导致形成具有将药物细胞毒性作为第二种功能(即除抗原结合外)的经修饰多肽。在另一个实例中，第二个结合多肽与第一个结合多肽的缀合可赋予另一种结合性质。
一方面，其中效应部分为基因编码的治疗或诊断蛋白或核酸，可通过本领域熟知的肽合成方法或重组DNA方法合成或表达效应部分。另一方面，其中效应子为非基因编码肽或药物部分，可人工合成效应部分或从天然源提纯效应部分。
本文所使用的术语“药物部分”包括抗炎剂、抗癌剂、抗感染剂(例如，抗真菌剂、抗菌剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂等)和麻醉治疗剂。在另一个实施方案中，药物部分为抗癌剂或细胞毒素剂。可配伍的药物部分也可包括前药。
本文所使用的术语“前药”指前体或衍生物形式的药物活性剂，与原药相比该药物活性剂具有较低活性和反应性或易于产生副作用，并且能够在体内酶促激活或转化为更高的活性形式。可与本发明配伍的前药包括但不限于含磷酸盐前药、含氨基酸前药、含硫代磷酸盐前药、含硫酸盐前药、含肽前药，含β内酰胺前药、含任选取代的苯氧乙酰胺的前药或含任选取代的苯乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶和其它可转化为具更高活性的细胞毒素游离药物的5-氟脲嘧啶核苷前药。本领域的技术人员可对所需的药物部分或其前药进行化学修饰以使该化合物反应，以更方便地制备本发明的经修饰的结合蛋白。药物部分还包括本文所述药物部分的衍生物、药学上可接受的盐、酯、酰胺和醚。衍生物包括对本文所鉴定的药物的修饰，这些修饰可使特定药物的所需治疗活性升高或不明显降低。
本文所使用的术语“抗癌剂”包括对赘生性细胞或肿瘤细胞的生长和/或增殖有害并且可发挥作用以减少、抑制或破坏恶性肿瘤的药剂。这种药剂的实例包括但不限于细胞生长抑制剂、烷化剂、抗生素、细胞毒性核苷、微管蛋白结合剂、激素和激素拮抗剂等。发挥作用以阻碍或减缓免疫反应细胞或恶性细胞生长的任何药剂均在本发明范围之内。
“亲和标记物”或“亲合部分”为与结合多肽、多肽接头或效应部分中的一个或多个附接以便在提纯过程中与其它组分分离的化学部分。示例性亲合域包括组氨酸标记物、几丁质结合域、麦芽糖结合域、生物素等。
“亲合树脂”为能够结合具有高亲合力的亲合域以便分离与亲合域结合的蛋白质和反应混合物的其它组分的化学表面。亲合树脂可涂覆在固相支持体或其部分的表面。或者，亲合树脂可包括固相支持体。这种固相支持体可包括适当修饰的层析柱、微量滴定板、小珠或生物芯片(例如玻璃晶片)。示例性亲合树脂由镍、几丁质、淀粉酶等组成。
本文使用术语“载体”或“表达载体”指根据本发明用作将所需多核苷酸引入细胞并在使其在细胞内表达的媒介物的载体。如本领域的技术人员所知，这种载体可易于选自质粒、噬菌体、病毒和反转录病毒。通常，与本发明配伍的载体将包含选择标记、适当的限制性位点促进所需基因的克隆和进入真核细胞或原核细胞和/或在真核细胞或原核细胞中复制的能力。
为了本发明的目的，可采用大量表达载体系统。例如，一类载体利用源自动物病毒的DNA元件，如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、反转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒。其它涉及使用具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统。示例性载体包括美国专利第6,159,730号、第6,413,777号和美国专利申请第20030157641A1号中描述的那些。另外，可通过引入一个或多个允许选择转染宿主细胞的标记选择将DNA整合到其染色体中的细胞。标记可为营养缺陷型宿主提供原营养，提供抗微生物剂抗性(例如，抗生素)或对铜等重金属的抗性。可选择的标记基因可直接连接至待表达的DNA序列或通过共转化引入同一细胞中。在一个实施方案中，可采用可诱导表达系统。为了实现mRNA的最佳合成，可能还需要另外的元件。这些元件可包括信号序列、剪接信号以及转录启动子、增强子和终止信号。在一个实施方案中，分泌信号，例如若干经良好表征的细菌前导肽的任一个(例如，pelB、phoA或ompA)，可在框内与本发明多肽的N端融合以实现多肽的最佳分泌。(Lei等(1988)，Nature，331：543；Better等(1988)Science，240：1041；Mullinax等，(1990).PNAS，87：8095)。
术语“宿主细胞”指经使用重组DNA技术构造的编码至少一个外源基因的载体转化的细胞。在描述从重组宿主分离蛋白质的工艺中，除非另外清楚地说明，术语“细胞”和“细胞培养物”可交换地使用来表示蛋白质来源。换言之，从“细胞”回收蛋白质可指从整个消旋细胞或含培养基和悬浮细胞的细胞培养物中回收蛋白质。用于蛋白质表达的宿主细胞系最优选为源自哺乳动物；相信本领域的技术人员有能力择优确定最适于在其中表达所需基因产物的特定宿主细胞系。示例性宿主细胞系包括但不限于DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢细胞系、DHFR阴性细胞系)、HELA(人宫颈癌细胞系)、CVI(猴肾细胞系)、COS(带SV40抗原的CVI衍生物)、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)、BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾细胞系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤细胞)、P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤细胞)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人淋巴细胞)和293(人肾细胞)。特别优选CHO细胞。宿主细胞系通常可从商业服务机构-American Tissue Culture Collection(美国组织培养物库)或从公开发表的文献获得。本发明的多肽也可在非哺乳动物细胞，如细菌或酵母或植物细胞中表达。在这点上，应了解也可转化各种单细胞非哺乳动物微生物(如细菌)，即能够在培养或发酵过程中生长的那些。易受转化的细菌包括肠杆菌科成员，如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌(Salmonella)菌株；芽胞杆菌菌株(Bacillaceae)，如枯草杆菌；肺炎球菌(Pneumococcus)菌株；链球菌(Streptococcus)菌株和乙型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)菌株。应进一步了解，当在细菌中表达时，多肽通常成为内含体的一部分。必须分离、提纯多肽，然后将其装配成功能分子。
除原核生物外，也可使用真核微生物。尽管包括毕赤酵母(Pichia pastoris)在内的大量其它菌株通常可用，但在真核微生物中最常使用的是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母。为了在酵母(Saccharomyces)中表达，通常使用质粒YRp7，例如(Stinchcomb等，(1979)，Nature，282：39；Kingsman等，(1979)，Gene，7：141；Tschemper等，(1980)，Gene，10：157)。该质粒已含有为缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变菌株(如ATCC第44076号或PEP4-1)提供选择标记的基因TRP1(Jones，(1977)，Genetics，85：12)。作为酵母宿主细胞基因组的特征的trpl损伤的存在，提供了用于检测在缺乏色氨酸生长时转化的有效环境。
体外生产使得按比例增加以产生大量本发明所需改变的结合多肽。本领域已知在组织培养条件下进行哺乳动物细胞培养的技术，该技术包括均质悬浮培养(例如在气升式反应器或连续搅拌反应器中)，或固定化细胞培养或截留细胞培养(例如在空心纤维、微囊剂中，在琼脂糖微珠或陶瓷管壳上)。必要时和/或需要时，可通过传统层析法，例如凝胶过滤、离子交换层析、疏水相互作用层析(HIC，经DEAE-纤维素层析)或亲合层析法提纯多肽溶液。
本文所使用“肿瘤相关抗原”指通常与肿瘤细胞相关的抗原，即与正常细胞相同或比正常细胞略高的程度出现。一般来讲，肿瘤相关抗原包括无论其在非恶性细胞上表达与否，均提供免疫反应抗体在赘生性细胞的定位的任何抗原。此类抗原可具有相对肿瘤特异性，并可限于在恶性细胞表面表达。或者，在恶性细胞和非恶性细胞上均可发现此类抗原。在某些实施方案中，本发明的结合多肽优选结合肿瘤相关抗原。因此，可从与肿瘤相关分子反应的若干抗体的任何一种衍生、生成或制备本发明的结合多肽。
本文所使用的术语“恶性肿瘤”指非良性肿瘤或癌症。本文所使用的术语“癌症”包括特征在于细胞生长不受调节和控制的恶性肿瘤。示例性癌症包括：癌、肉瘤、白血病和淋巴瘤。术语“癌症”包括原发性恶性肿瘤(例如，细胞未移至受试者体内除原肿瘤部位外的其它部位的肿瘤)和继发性恶性肿瘤(例如，由于转移，肿瘤细胞移动至不同于原肿瘤部位的继发部位的那些肿瘤)。
本文所使用的短语“因施用结合多肽而受益的受试者”包括如哺乳动物受试者等的受试者，其因施用用于(例如)检测由本发明结合多肽识别的抗原(例如，用于诊断方法)和/或因用结合多肽治疗以减少或消除由结合多肽识别的靶标而受益。例如，在一个实施方案中，受试者可因减少或消除来自循环或血清的可溶性或微粒分子(例如，毒素或病原体)或因减少或消除表达靶标的细胞群(例如，肿瘤细胞)而受益。如上文所讨论的，可使用非缀合形式的结合多肽，或与例如药物、前药或同位素等缀合形成施用于所述受试者的经修饰的结合多肽。
术语“聚乙二醇化”、“聚乙二醇”或“PEG”包括用或不用偶合剂或用偶合部分或活化部分衍生化的聚亚烷基二醇化合物或其衍生物(例如，用硫醇、三氟甲磺酸盐、三氟乙基磺酸酯、氮丙啶、环氧乙烷或优选用马来酰亚胺部分，例如，PEG-马来酰亚胺)。其它适当的聚亚烷基二醇化合物包括但不限于马来酰亚胺单甲氧基PEG、活化PEG聚丙二醇，也包括以下类型的带电或中性聚合物：葡聚糖、多聚乙酰神经氨糖酸、或其它碳水化合物基聚合物、氨基酸聚合物和生物素衍生物。
(II)亲本Fc多肽
变体Fc多肽可源自本领域已知的亲本或原Fc多肽。在优选的实施方案中，亲本Fc多肽如同抗体，优选IgG免疫球蛋白，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型，且优选IgG1或IgG4亚型的。亲本Fc多肽包含源自免疫球蛋白的Fc区，但可任选进一步包括可操作地与Fc区连接或融合的结合位点。在优选的实施方案中，前述多肽结合抗原，如配体、细胞因子、受体、细胞表面抗原或癌细胞抗原等。尽管本文实施例采用IgG抗体，但是应理解所述方法同样可应用于任何Fc多肽内的Fc区。当Fc多肽为抗体时，该抗体可为合成的、天然的(例如，来自于血清)，由细胞系(例如，杂交瘤)生成或在转基因生物中产生。
在某些实施方案中，本发明的Fc多肽包含Fc区的单一Fc部分。在其它实施方案中，Fc多肽为dcFc多肽。dcFc多肽指包含二聚Fc(或dcFc)区的多肽。在其它实施方案中，本发明的Fc多肽为scFc多肽。本文所使用的术语scFc多肽指包含单链Fc(scFc)区的多肽，例如，包含至少两个(例如)通过插入至少两个Fc部分之间的挠性多肽接头基因融合的Fc部分的scFc多肽。2008年5月14日提交的PCT申请第PCT/US2008/006260号中公开了示例性scFc区，其通过引用并入本文。
在某些实施方案中，本发明的多肽可包含含有序列组成相同或基本上相同的Fc部分(本文称为“同聚Fc区”)的Fc区。在其它实施方案中，本发明的多肽可包含含有至少两个序列组成不同的Fc部分(即，本文所称的“异聚Fc区”)的Fc区。在某些实施方案中，本发明的结合多肽包含含至少一个插入或氨基酸取代的Fc区。在一个示例性的实施方案中，异聚Fc区包含在第一个Fc部分中，而非在第二个Fc部分中的氨基酸取代。
在一个实施方案中，本发明的结合多肽可包含具有两个或更多个构成Fc部分的Fc区，该构成Fc部分独立地选自本文所述的Fc部分。在一个实施方案中，Fc部分相同。在另一个实施方案中，至少有两个Fc部分不同。例如，本发明Fc多肽的Fc部分包含相同数量的氨基酸残基或在长度上相差一个或多个氨基酸残基(例如，约5个氨基酸残基(例如，1、2、3、4或5个氨基酸残基)、约10个残基、约15个残基、约20个残基、约30个残基、约40个残基或约50个残基)。在又一个实施方案中，Fc部分在一个或多个氨基酸位置上有序列不同。例如，至少两个Fc部分有约5个氨基酸位置(例如1、2、3、4或5个氨基酸位置)、约10个位置、约15个位置、约20个位置、约30个位置、约40个位置或约50个位置的氨基酸位置不同。
亲本Fc多肽可装配在一起或与其它多肽装配形成多聚Fc多肽或蛋白质(本文也称为“多聚体”)。本发明的多聚Fc多肽或蛋白质包含至少一个本发明的亲本Fc多肽。因此，亲本多肽包括但不限于单体以及多聚(例如，二聚、三聚、四聚和六聚)Fc多肽或蛋白质等。在某些实施方案中，所述多聚体的组成Fc多肽相同(即同聚多聚体，例如同聚二聚体、同聚三聚体、同聚四聚体)。在其它实施方案中，本发明多聚体蛋白质的至少两个组成Fc多肽不同(即异聚多聚体，如异聚二聚体、异聚三聚体、异聚四聚体)。在某些实施方案中，至少两个Fc多肽能够形成二聚体。
在另一个实施方案中，本发明的Fc多肽包含二聚Fc区(形成二聚体的单链多肽或形成二聚体的双链多肽)，并对于分子中存在的生物活性部分而言是单体的。例如，这种Fc构建体可仅包含一个生物活性部分。例如当不需要交联靶分子时(例如，在为某些抗体(例如抗CD40抗体)的情况下)，单链或双链稳定的Fc单体构建体是合乎需要的。在另一个实施方案中，这种Fc构建体可包含两个不同的生物活性部分。在又一个实施方案中，这种Fc构建体可包含两个相同的生物活性部分。在又一个实施方案中，这种Fc构建体可包含两个以上相同的生物活性部分。
A.Fc部分
用于生成本发明的亲本Fc多肽的Fc部分可从若干不同的来源获得。在优选的实施方案中，结合多肽的Fc部分源自人免疫球蛋白。然而，应理解Fc部分可源自另一种哺乳动物种类的免疫球蛋白，包括例如啮齿动物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)或非人类灵长类(例如黑猩猩、猕猴)。而且，Fc可源自任何种类的免疫球蛋白(包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE)和任何免疫球蛋白同种型(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。在优选的实施方案中，使用人同种型IgG1或IgG4。
可以公共可得的存放的形式获得不同种类的Fc部分基因序列(例如人恒定区基因序列)。包含Fc部分序列的恒定区域可选择为具有特定效应子功能(或缺乏特定效应子功能)或具有特定修饰以降低免疫原性。已公开抗体和抗体编码基因的许多序列，可使用本领域公认的技术从这些序列获得适合的Fc部分序列(例如铰链、CH2和/或CH3序列或其部分)。然后可改变或合成用前述任一种方法获得的遗传物质，以获得本发明的Fc多肽。应进一步了解，本发明的范围涵盖恒定区DNA序列的等位基因、变体和突变。
例如可用聚合酶链式反应和引物克隆Fc部分序列，其中选择该引物以扩增目标域。为了克隆来自抗体的Fc部分序列，可从杂交瘤、脾细胞或淋巴细胞分离mRNA，反转录为DNA，并通过PCR扩增抗体基因。美国专利第4,683,195号、第4,683,202号、第4,800,159号、第4,965,188号和例如“PCRProtocols：A Guide to Methods and Applications”Innis等编著，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Ho等，1989，Gene 77：51；Horton等，1993，MethodsEnzymol.217：270中详细描述了PCR扩增方法。可由恒定区共有引物或基于公开的重链和轻链DNA、氨基酸序列的特异性更高的引物引发PCR。如上所讨论，PCR也可用于分离编码抗体轻链和重链的DNA克隆。在这种情况下，可由共有引物或更大的同源探针(如鼠恒定区探针)筛选文库。本领域已知大量适于抗体基因扩增的引物集(例如，基于纯化抗体N端序列的5′引物(Benhar和Pastan.1994.Protein Engineering 7：1509)、cDNA末端快速扩增(Ruberti，F.等1994.J.Immunol.Methods 173：33)、抗体前导序列(Larrick等1989Biochem.Biophys.Res.Commun.160：1250))。Newman等于1995年1月25日提交的美国专利第5,658,570号中进一步描述了抗体序列的克隆，该专利通过引用的方式并入本文。
本发明的亲本Fc多肽可包含单个Fc部分或多个Fc部分。在有两个或更多个Fc部分(里如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个Fc部分)的情况中，至少两个Fc部分缔合形成适当折叠的Fc区(例如，二聚Fc区或单链Fc区(scFc))。在一个实施方案中，Fc部分可为不同类型。在一个实施方案中，亲本Fc多肽中存在的至少一个Fc部分包含铰链域或其部分。在另一个实施方案中，亲本Fc多肽包含至少一个包含至少一个CH2域或其部分的Fc部分。在另一个实施方案中，亲本Fc多肽包含至少一个包含至少一个CH3域或其部分的Fc部分。在另一个实施方案中，亲本Fc多肽包含至少一个包含至少一个CH4域或其部分的Fc部分。在另一个实施方案中，亲本Fc多肽包含至少一个包含至少一个铰链域或其部分和至少一个CH2域或其部分(例如，按铰链-CH2定向)的Fc部分。在另一个实施方案中，亲本Fc多肽包含至少一个包含至少一个CH2域或其部分和至少一个CH3域或其部分(例如，按CH2-CH3定向)的Fc部分。在另一个实施方案中，亲本Fc多肽包含至少一个包含至少一个铰链域或其部分、至少一个CH2域或其部分和至少一个CH3域或其部分(例如，按铰链-CH2-CH3、铰链-CH3-CH2或CH2-CH3-铰链定向)的Fc部分。
在某些实施方案中，亲本Fc多肽包含至少一个源自一条或多条免疫球蛋白重链的完整Fc区(例如，包含铰链、CH2域和CH3域的Fc部分，尽管无需源自同一抗体)。在其它实施方案中，亲本Fc多肽包含至少两个源自一条或多条免疫球蛋白重链的完整Fc区。在优选的实施方案中，完整Fc部分源自人IgG免疫球蛋白重链(例如，人IgG1或人IgG4)。
在另一个实施方案中，亲本Fc多肽包含至少一个包含完整CH3域(根据欧盟编号，抗体Fc区的约341-438位氨基酸)的Fc部分。在另一个实施方案中，亲本Fc多肽包含至少一个包含完整CH2域(根据欧盟编号，抗体Fc区的约231-340位氨基酸)的Fc部分。在另一个实施方案中，亲本Fc多肽包含至少一个包含至少一个CH3域、铰链区(根据欧盟编号，抗体Fc区的约216-230位氨基酸)和CH2域中至少一个的Fc部分。在一个实施方案中，亲本Fc多肽包含至少一个包含铰链和CH3域的Fc部分。在另一个实施方案中，亲本Fc多肽包含至少一个包含铰链、CH2域和CH3域的Fc部分。在优选的实施方案中，Fc部分源自人IgG免疫球蛋白重链。
组成Fc部分的恒定区域或其部分可源自不同的免疫球蛋白分子。例如，亲本Fc多肽可包含源自IgG4分子的铰链和/或CH2域或其部分和源自IgG1分子的CH3区或其部分。在另一个实施方案中，亲本Fc多肽可包含嵌合铰链域。例如，嵌合铰链可包含部分来自IgG1分子而部分来自IgG3分子的铰链域。在另一个实施方案中，嵌合铰链包含来自IgG1分子的中部铰链域和来自IgG4分子的上部和下部铰链域。
如本文所述，本领域的技术人员应理解亲本Fc部分可与天然存在的免疫球蛋白的相应Fc部分相同或者可改变为在氨基酸序列方面不同。在某些实施方案中，例如通过氨基酸突变(例如，添加、缺失或取代)改变亲本Fc多肽。例如，亲本Fc多肽可为与野生型Fc相比具有至少一个氨基酸取代的Fc部分，其中Fc部分源自野生型Fc。例如，其中Fc部分源自人IgG1抗体，与野生型氨基酸相比，变体包含至少一个在人IgG1Fc区相应位置的氨基酸突变(例如，取代)。
氨基酸取代可位于Fc部分中称为与抗体Fc区中指定残基位置编号“相对应”的位置(如前所述用欧盟编号规定)。本领域的技术人员可易于进行比对以确定与Fc部分中的位置“相对应”的EU编号。
在一个实施方案中，取代在位于铰链域或其部分中的氨基酸位置。在另一个实施方案中，取代在位于CH2域或其部分中的氨基酸位置。在另一个实施方案中，取代在位于CH3域或其部分中的氨基酸位置。在另一个实施方案中，取代在位于CH4域或其部分中的氨基酸位置。
在某些实施方案中，亲本Fc多肽包含一个以上的氨基酸取代。相对于野生型Fc区，亲本Fc多肽可包含例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸取代。优选地，氨基酸取代在空间位置上相互间隔至少1个氨基酸位置或更多，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸位置或更多。更优选地，工程氨基酸在空间位置上相互间隔至少5、10、15、20或25个氨基酸位置或更多。
在某些实施方案中，取代使包含野生型Fc部分的Fc区赋予的至少一种效应子功能改变(例如，降低Fc区结合Fc受体(例如FcγRI、FcγRII或FcγRIII)或补体蛋白(例如C1q)的能力或引发抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)、吞噬作用或补体依赖性细胞毒作用(CDC)的能力)。
亲本Fc多肽可采用本领域公认的取代，已知这些取代使效应子功能改变。具体地，本发明的亲本Fc多肽包含例如位于一个或多个氨基酸位置的变化(例如，取代)，国际PCT公开WO88/07089A1、WO96/14339A1、WO98/05787A1、WO98/23289A1、WO99/51642A1、WO99/58572A1、WO00/09560A2、WO00/32767A1、WO00/42072A2、WO02/44215A2、WO02/060919A2、WO03/074569A2、WO04/016750A2、WO04/029207A2、WO04/035752A2、WO04/063351A2、WO04/074455A2、WO04/099249A2、WO05/040217A2、WO04/044859、WO05/070963A1、WO05/077981A2、WO05/092925A2、WO05/123780A2、WO06/019447A1、WO06/047350A2和WO06/085967A2，美国专利公开第US2007/0231329号、第US2007/0231329号、第US2007/0237765号、第US2007/0237766号、第US2007/0237767号、第US2007/0243188号、第US20070248603号、第US20070286859号、第US20080057056号，或美国专利第5,648,260号、第5,739,277号、第5,834,250号、第5,869,046号、第6,096,871号、第6,121,022号、第6,194,551号、第6,242,195号、第6,277,375号、第6,528,624号、第6,538,124号、第6,737,056号、第6,821,505号、第6,998,253号、第7,083,784号和第7,317,091号中公开了所述氨基酸位置，每个涉及Fc突变的各参考文献的部分通过引用的方式并入本文。在一个实施方案中，可在一个或多个公开的氨基酸位置做特异性改变(例如，本领域公开的一个或多个氨基酸的特异性取代)。在另一个实施方案中，可在一个或多个公开的氨基酸位置做不同改变(例如，本领域公开的一个或多个氨基酸位置的不同取代)。
在优选的实施方案中，亲本Fc多肽可包含在与EU氨基酸位置相对应的氨基酸位置包含氨基酸取代的Fc部分，EU氨基酸位置在Fc部分的“接触带”内。
Figure BDA0000093834270000462
接触带包含位于全长野生型Fc部分的EU位置243至261、275至280、282-293、302至319、336至348、367、369、372至389、391、393、408和424-440的残基。
在另一个实施方案中，亲本Fc多肽包含含有一个或多个截断Fc部分的Fc区，尽管如此，截断Fc部分仍足以赋予Fc区一种或多种功能。例如，Fc部分结合FcRn的部分(即，FcRn结合部分)包含约282-438位氨基酸(欧盟编号)。因此，亲本Fc多肽的Fc部分可包含FcRn结合部分或由FcRn结合部分组成。FcRn结合部分可源自任何同种型的重链，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在一个实施方案中，使用来自人同种型IgG1抗体的FcRn结合部分。在另一个实施方案中，使用来自人同种型IgG4抗体的FcRn结合部分。在某些实施方案中，FcRn结合部分被无糖基化。在其它实施方案中，FcRn结合部分被糖基化。
在某些实施方案中，亲本Fc多肽包含对Fc部分的氨基酸取代，所述取代改变抗体的抗原非依赖性效应子功能，尤其改变抗体的循环半衰期。与缺乏这些取代的多肽相比，这种多肽显示与FcRn的结合增强或减弱，并且因此在血清中的半衰期分别增加或缩短。预料对FcRn的亲合力增强的亲本Fc多肽具有更长的血清半衰期，并且在期望所施用多肽的长半衰期的情况中，这种分子可在治疗哺乳动物的方法中具有有效的应用(例如)以治疗慢性疾病或病症。相反，期望FcRn结合亲合力降低的亲本Fc多肽具有较短的半衰期，当循环时间缩短可能利于(例如)体内诊断显象或当存在于更长期限的循环时原多肽有毒副作用的情况下循环时间缩短可能有利时，这种分子也用于(例如)向哺乳动物施用。FcRn结合亲合力降低的亲本Fc多肽也不太可能穿过胎盘，因此也用于治疗孕妇的疾病或病症。另外，可能需要FcRn结合亲合力降低的其它应用包括需要定位大脑、肾和/或肝的那些应用。在一个示例性实施方案中，亲本Fc多肽显示从脉管系统通过肾脏肾小球的上皮细胞的运输降低。在另一个实施方案中，本发明的结合多肽显示通过血脑屏障(BBB)由大脑至血管空间的运输降低。在一个实施方案中，FcRn结合改变的亲本Fc多肽包含至少一个Fc部分(例如，一个或两个Fc部分)，所述Fc部分在其“FcRn结合环”内有一个或多个氨基酸取代。FcRn结合环由野生型全长Fc部分的氨基酸残基280-299(根据欧盟编号)组成。在其它实施方案中，FcRn结合亲合力改变的亲本Fc多肽包含至少一个在FcRn“接触带”内有一个或多个氨基酸取代的Fc部分(例如，一个或两个Fc部分)。
本文所使用的术语
Figure BDA0000093834270000472
FcRn“接触带”包括位于野生型全长Fc部分的以下位置的残基：243-261、275-280、282-293、302-319、336-348、367、369、372-389、391、393、408、424、425-440(欧盟编号)。在优选的实施方案中，FcRn结合亲合力改变的亲本Fc多肽包含至少一个在与以下任一EU位置相对应的氨基酸位置有一个或多个氨基酸取代的Fc部分(例如一个或两个Fc部分)：256、277-281、283-288、303-309、313、338、342、376、381、384、385、387、434(例如，N434A或N434K)和438。国际PCT公开第WO05/047327号中公开了FcRn结合活性改变的示例性氨基酸取代，其通过引用的方式并入本文。
在其它实施方案中，亲本Fc多肽包含至少一个Fc部分，其具有位于溶剂暴露面的工程半胱氨酸残基或其类似物的Fc部分。优选地，工程半胱氨酸残基或其类似物并不干扰Fc区赋予的效应子功能。在优选的实施方案中，Fc多肽包含含有至少一个工程游离半胱氨酸残基或其类似物的Fc部分，所述工程游离半胱氨酸残基或其类似物基本上不与另一个半胱氨酸残基以二硫键结合。在优选的实施方案中，Fc多肽可包含在CH3域的一个或多个以下位置有工程半胱氨酸残基或其类似物的Fc部分：349-371、390、392、394-423、441-446和446b(欧盟编号)。在更优选的实施方案中，Fc多肽包含在以下任一位置有工程半胱氨酸残基或其类似物的Fc变体：350、355、359、360、361、389、413、415、418、422、441、443和446b(欧盟编号)。其后可用本领域公认的技术使任一上述工程半胱氨酸残基或其类似物与功能部分缀合(例如，用巯基反应性异双功能接头缀合)。
B.无效应子Fc多肽
在某些实施方案中，亲本Fc多肽为效应子功能改变或降低的“无效应子”Fc多肽。优选地，降低或改变的效应子功能为抗原依赖性效应子功能。例如，亲本Fc多肽可包括与野生型Fc多肽相比降低多肽的抗原依赖性效应子功能，尤其是ADCC或补体活化的序列变体(例如，氨基酸取代)。不幸的是，这种亲本Fc多肽的稳定性通常降低，使其成为根据本发明的方法用于稳定化的理想候选物。
期望FcγR结合亲合力降低的Fc多肽降低效应子功能，并且这种分子也用于(例如)治疗无需破坏靶细胞的病状，例如，正常细胞可表达靶分子的病状或长期施用多肽可导致有害的免疫系统激活的病状。在一个实施方案中，与包含野生型Fc区的Fc多肽相比，Fc多肽显示至少一种选自以下各项的抗原依赖性效应子功能降低：调理素作用、吞噬作用、补体依赖性细胞毒作用、抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)或效应细胞调节作用。在一个实施方案中，Fc多肽显示对活化FcγR(例如FcγRI、FcγRIIa或FcγRIIIa)的结合改变。在另一个实施方案中，Fc多肽显示对抑制型FcγR(例如FcγRIIb)的结合亲合力改变。在其它实施方案中，FcγR结合亲合力降低(例如FcγRI、FcγRII或FcγRIIIa结合亲合力降低)的Fc多肽包含至少一个在与以下一个或多个位置相对应的氨基酸位置有氨基酸取代的Fc部分(如一个或两个Fc部分)：234、236、239、241、251、252、261、265、268、293、294、296、298、299、301、326、328、332、334、338、376、378和435(欧盟编号)。在其它实施方案中，补体结合亲合力降低(例如C1q结合亲合力降低)的Fc多肽包含在与以下一个或多个位置相对应的氨基酸位置有氨基酸取代的Fc部分(如一个或两个Fc部分)：239、294、296、301、328、333和376(欧盟编号)。国际改变FcγR或补体结合活性的示例性氨基酸取代公开在PCT公开第WO05/063815号中，其通过引用并入本文。在某些优选的实施方案中，本发明的结合多肽可包含以下一个或多个特异性取代：S239D、S239E、M252T、H268D、H268E、I332D、I332E、N434A和N434K(即在与抗体Fc区中的一个或多个欧盟编号位置相对应的氨基酸位置的一个或多个取代)。
在某些示例性实施方案中，由于亲本Fc多肽内的无糖基化Fc区，亲本‘无效应子’多肽的效应子功能可被改变或降低。在某些实施方案中，通过改变Fc区的糖基化的氨基酸取代产生无糖基化Fc区。例如，Fc区内EU位置297的天冬酰胺可(例如，通过取代、插入、缺失或通过化学修饰)改变以抑制其糖基化。在另一个示例性实施方案中，EU位置299的氨基酸残基(例如，苏氨酸(T))可被取代(例如，用丙氨酸(A)取代)以减少在相邻残基297处的糖基化。减少或改变糖基化的示例性氨基酸取代公开于国际PCT公开第WO05/018572号和美国专利公开第2007/0111281号，其通过引用并入本文。在其它实施方案中，通过酶促或化学去除低聚糖或在不能使Fc区糖基化的宿主细胞(例如，糖基化机构受损的细菌宿主细胞或哺乳动物宿主细胞)中表达Fc多肽而产生无糖基化Fc区。
在某些实施方案中，无糖基化Fc区局部无糖基化或半糖基化。例如，Fc区可包含第一糖基化Fc部分(例如糖基化CH2区)和第二无糖基化Fc部分(例如无糖基化CH2区)。在其它实施方案中，Fc区可完全被无糖基化，即其Fc部分都没有被糖基化。
“无效应子”多肽的无糖基化Fc区可为任一IgG同种型(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。在一个示例性实施方案中，亲本Fc多肽可包含IgG4抗体的无糖基化Fc区，如“agly IgG4.P”。agly IgG4.P为工程形式的IgG4抗体，该IgG4抗体包含在铰链区的脯氨酸取代(Ser228Pro)和在CH2域的Thr299Ala突变以生成无糖基化Fc区(欧盟编号)。已显示agly IgG4.P在体外无可测免疫效应功能。在另一个示例性实施方案中，亲本Fc多肽包含IgG1抗体的无糖基化Fc区，如“agly IgG1”。agly IgG1为无糖基化形式的IgG免疫球蛋白IgG1，其具有赋予低效应子功能性的Thr299Ala突变(欧盟编号)。在不需要免疫效应子功能的情况中，agly IgG4.P抗体和agly IgG1抗体均代表重要种类的治疗试剂。
在某些示例性实施方案中，“无效应子”亲本Fc多肽包含源自IgG4抗体的Fc区。IgG4Fc区可与野生型Fc区相同或者可具有对野生型IgG4序列的一个或多个修饰。由于IgG4抗体结合补体和/或Fc受体的能力固有地降低，所以这种IgG4样Fc多肽的效应子功能降低。IgG4同种型的亲本Fc多肽可被糖基化或无糖基化。而且，IgG4样Fc多肽的Fc区可包含IgG4抗体的整个Fc部分或者可包含嵌合Fc部分，其中Fc部分的一部分来自IgG4抗体，而其余部分来自另一同种型的抗体。在一个示例性实施方案中，嵌合Fc部分包含来自IgG1抗体的CH3域和来自IgG4抗体的CH2域。在另一个实施方案中，IgG4抗体包含嵌合铰链，其中由于铰链区中的脯氨酸取代(Ser228Pro)，上下部铰链域来自IgG4抗体，但中部铰链域来自IgG1抗体。在又一个实施方案中，亲本嵌合IgG4抗体包含嵌合铰链，其中由于铰链区、来自IgG1抗体或IgG4抗体的CH1域、来自IgG4抗体的CH2域(或位置292-340，欧盟编号)和来自IgG1抗体的CH1CH3域中的脯氨酸取代(Ser228Pro)，上下部铰链域来自IgG4抗体，但中部铰链域来自IgG1抗体。
在某些实施方案中，“无效应子”Fc多肽的效应子功能降低是对Fc受体(FcR)(如FcγRI、FcγRII、FcγRIII和/或FcγRIIIb受体)或补体蛋白(例如补体蛋白C1q)的结合降低。这种结合上的变化可为约1倍或更高，例如约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、50或100倍或更高，或其任一区间或范围。根据例如用本文所述试验或本领域已知的试验确定的结合活性降低百分比容易地计算这些效应子功能的降低，例如，对Fc受体或补体蛋白的Fc结合。
在本发明的一个实施方案中，稳定Fc多肽包含单链Fc区。本领域已知这种单链Fc区(见例如WO200801243、WO2008131242、WO2008153954)，并且可使用已知方法制得这种单链Fc区。使用本领域技术人员已知的方法可将本文所教导的稳定氨基酸并入一个或多个这种构建体的Fc部分中。这种单链Fc区或基因融合Fc区为由单条多肽链(即由单个邻接基因序列编码)中基因连接的Fc域(或Fc部分)组成的合成Fc区。因此，由于包含一条多肽链，所以基因融合Fc区(即，scFc区)为单体，而分子的适当部分二聚化形成n Fc区。应理解，本文关于Fc部分的教导适用于双链Fc二聚体和单链Fc二聚体。例如，任一类型的Fc区构建体可源自例如IgG1抗体或IgG4抗体或者可为嵌合抗体(例如，包含嵌合铰链和/或包含来自IgG4抗体的CH2域和来自IgG1抗体的CH3域)。
(III)具稳定Fc区的变体Fc多肽
在某些方面，本发明提供了变体Fc多肽，其包含为上述任一亲本Fc多肽的变体的氨基酸序列。尤其是，本发明的变体Fc多肽包含具有源自亲本Fc多肽的Fc区(或Fc部分)的氨基酸序列的Fc区(或Fc部分)。优选地，变体Fc多肽不同于亲本Fc多肽在于存在至少一个本文所述稳定Fc突变。在某些实施方案中，Fc变体可包含另外的氨基酸序列改变。在优选的实施方案中，与亲本Fc多肽相比，Fc变体具有增强的稳定性，且与亲本Fc多肽相比，具有被任选改变的效应子功能。例如，变体Fc多肽可具有与亲本Fc多肽的抗原依赖性效应子功能(例如，ADCC和/或CDC)相当或更低的抗原依赖性效应子功能。另外或选择性地，相对于亲本Fc多肽，变体Fc多肽可具有抗原非依赖性效应子功能(例如，延长的半衰期)。
在某些实施方案中，变体Fc多肽包含与亲本Fc多肽的Fc区(Fc部分)基本上相同的Fc区(Fc部分)，但相对于原多肽或亲本多肽有约一个或多个突变(例如，约1个至约20个，约1个至约15个，约1个至约10个，约1个至约5个，约1个至约4个，约1个至约3个，约2个至约20个，约2个至约15个，约2个至约10个，约5个至约20个或约5个至约10个)，例如，一个或多个被另一氨基酸残基取代或具有一个或多个氨基酸残基插入或缺失的氨基酸残基。在某些实施方案中，相对于原多肽，变体Fc多肽具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个突变。优选地，变体多肽包含非天然存在的氨基酸序列。
这种变体与原多肽的序列同一性或相似性必定低于100％。在优选的实施方案中，例如在全长变体分子或其部分(例如，Fc区或Fc部分)上，变体与原多肽的氨基酸序列的氨基酸序列同一性或相似性为约75％至低于100％，更优选为约80％至低于100％，更优选为约85％至低于100％，更优选为约90％至低于100％(例如，91-99％、92-99％、93-99％、94-99％、95-99％、96-99％、97-99％、98-99％或99％)，并且最优选为约95％至低于100％。在一个实施方案中，原多肽序列(例如，亲本Fc多肽的Fc区)及其衍生序列(例如，变体Fc多肽的Fc区)之间有一个氨基酸不同。
在某些实施方案中，本发明的变体Fc多肽为稳定的Fc多肽。换言之，稳定多肽包含至少一个序列变体或突变，所述突变为稳定Fc突变。本文所使用的术语“稳定Fc突变”包括变体Fc多肽的Fc区内的突变，与变体Fc多肽所来源的亲本Fc多肽相比，所述突变使变体Fc多肽蛋白质稳定(例如，热稳定性)增强。优选地，稳定突变包括用使Fc区的蛋白质稳定性增强的置换氨基酸(本文的“稳定氨基酸”)取代Fc区内的去稳定氨基酸。在一个实施方案中，本发明的稳定的Fc多肽包含一个或多个氨基酸稳定Fc突变(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个稳定突变)。优选将稳定Fc突变引入Fc区的CH2域、CH3域或其二者。
在某些示例性实施方案中，本发明的变体Fc多肽为前述“无效应子”亲本Fc多肽的稳定变体。换言之，相对于“无效应子亲本Fc多肽”，稳定变体的稳定性增强。在一个示例性实施方案中，变体Fc多肽为包含IgG1抗体的无糖基化Fc区(例如，包含T299A突变(欧盟编号)的无糖基化IgG1Fc区)的亲本Fc多肽的稳定变体。在另一个示例性实施方案中，变体Fc多肽为包含糖基化或无糖基化IgG4抗体的Fc区的亲本Fc多肽的稳定变体。例如，变体Fc多肽可包含源自“agly IgG4.P”抗体的Fc区中的稳定突变。
优选地，在相同测量条件下与变体Fc多肽相比，本发明的稳定Fc多肽显示增强的稳定性。然而，人们公认在选择的测量条件下相对于其亲本Fc多肽，Fc变体多肽的稳定性增强程度可不同。例如，在特定pH(例如，酸性、中性或碱性pH)下可观察到稳定性增强。在一个实施方案中，在低于约6.0(例如，约6.0、约5.5、约5.0、约4.5或约4.0)的酸性pH下观察到稳定性增强。在另一个实施方案中，在约6.0至约8.0(例如，约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0)的中性pH下观察到稳定性增强。在另一个实施方案中，在约8.0至约10.0(例如，约8.0、约8.5、约9.0、约9.5、约10.0)的碱性pH下观察到稳定性增强。
例如可使用以下所述任一方法评估变体Fc多肽增强的热稳定性的增强。在某些实施方案中，稳定Fc多肽有具有热稳定性(例如，解链温度或Tm)的Fc区(或Fc部分)，该热稳定性比所述Fc区所来源的亲本多肽高约0.1℃、约0.25℃、约0.5℃、约0.75℃、约1℃、约1.25℃、约1.5℃、约1.75℃、约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约25℃、约30℃、约40℃或约50℃。
在某些实施方案中，本发明的稳定Fc多肽变体表达为单体可溶性蛋白，其中不超过25％呈二聚体、四聚体或聚集形式(例如，少于约25％、约20％、约15％、约10％或约5％)。
在另一个实施方案中，在热激发测定中(见通过引用并入本文的美国专利申请第11/725,970号以及下文的实施例2)，稳定Fc多肽的T50高于40℃。在更优选的实施方案中，本发明的稳定Fc分子的T50高于50℃(例如，50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃或更高)。在更优选的实施方案中，本发明的稳定的Fc分子的T50高于60℃(例如，60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃或更高)。在更优选的实施方案中，本发明的稳定Fc分子的T50高于65℃(例如，65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃或更高)。在更优选的实施方案中，本发明的稳定Fc分子的T50高于70℃(例如，70℃、71℃、73℃、74℃、75℃或更高)。
在某些实施方案中，本发明的稳定Fc分子的CH2域的Tm值高于约60℃(例如，约61℃、62℃、63℃、64℃、65℃或更高)，高于65℃(例如，65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或更高)或高于约70℃(例如，71℃、72℃、73℃、74℃、75℃或更高)。在其它实施方案中，本发明的稳定Fc分子的CH3域的Tm值高于约70℃(例如，71℃、72℃、73℃、74℃、75℃或更高)，高于约75℃(例如，76℃、77℃、78℃、79℃、80℃或更高)或高于80℃(例如，81℃、82℃、83℃、84℃、85℃或更高)。在具体的实施方案中，所述稳定Fc多肽为包含IgG4抗体(例如，agly IgG4.P)的无糖基化或糖基化Fc区的亲本Fc多肽的变体。在其它实施方案中，所述稳定Fc多肽为包含IgG1抗体(例如，agly IgG1)的无糖基化Fc区的亲本Fc多肽的变体。在其它实施方案中，本发明的稳定Fc分子具有热稳定性大体上与糖基化IgG1抗体相同或更高的Fc区或Fc部分(例如，CH2域和/或CH3域)。
在某些实施方案中，本发明的变体Fc多肽导致与变体Fc多肽所来源的亲本Fc多肽相比，聚集减少。在一个实施方案中，相对于亲本Fc分子，通过本发明的方法生成的稳定Fc分子的聚集减少至少1％。在其它实施方案中，相对于亲本分子，稳定Fc多肽的聚集减少至少2％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少75％或至少100％。
在其它实施方案中，本发明的稳定Fc多肽导致与稳定Fc多肽所来源的亲本Fc多肽相比，长期稳定性或保存期限增加。在一个实施方案中，相对于非稳定性结合分子，通过本发明的方法生成的稳定Fc分子的保存期限至少增加1天。这意味着稳定Fc多肽的制备物的量与前一天存在的生物活性变体Fc多肽的量大体上相同，而且制备物中并无任何明显的变体多肽聚集或分解。在其它实施方案中，相对于不稳定的Fc分子，稳定Fc分子的保存期限增加至少2天、至少5天、至少1周、至少2周、至少1个月、至少2个月、至少6个月或至少1年。
在某些实施方案中，本发明的稳定Fc多肽与其亲本Fc多肽相比，表达产量升高。在一个实施方案中，相对于亲本Fc分子，本发明的稳定Fc多肽产量升高至少1％。在其它实施方案中，相对于亲本Fc分子，稳定Fc多肽产量升高至少2％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少100％。
在示例性实施方案中，本发明的稳定Fc多肽(与其亲本Fc多肽相比)在宿主细胞，例如细菌或真核(例如，酵母或哺乳动物)宿主细胞中的表达产量升高。可用于表达编码本发明的稳定Fc多肽的核酸分子的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HELA(人宫颈癌)细胞、CVI(猴肾细胞系)细胞、COS(带SV40抗原的CVI衍生物)细胞、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)细胞、BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)细胞、HAK(仓鼠肾细胞系)细胞、SP2/O(小鼠骨髓瘤)细胞、BFA-1c1BPT细胞(牛内皮细胞)、RAJI(人淋巴细胞)细胞、
Figure BDA0000093834270000541
(人视网膜衍生细胞系，Crucell，The Netherlands)和293细胞(人肾)。
在其它实施方案中，在大规模(例如，商业规模)条件下，本发明的稳定Fc多肽在宿主细胞中的表达产量升高(相对于其亲本Fc多肽)。在示例性实施方案中，当在至少10升培养基中表达时，稳定Fc分子的产量升高。在其它实施方案中，当在至少20升、至少50升、至少75升、至少100升、至少200升、至少500升、至少1000升、至少2000升、至少5000升、至少10,000升培养基中从宿主细胞表达时，稳定Fc结合分子的产量升高。在示例性实施方案中，每升培养基生成至少10mg(例如，10mg、20mg、50mg或100mg)的稳定Fc分子。
(a)稳定Fc氨基酸
在某些实施方案中，本发明的稳定Fc分子包含以下一个或多个在所示位置的稳定Fc氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8个或更多个稳定Fc突变)，其独立地选自：
a)在EU位置240，例如用苯丙氨酸(240F)取代氨基酸；
b)在EU位置262，例如用亮氨酸(262L)取代氨基酸(例如，缬氨酸)；
c)在EU位置266，例如用苯丙氨酸(266F)取代氨基酸(例如，缬氨酸)；
d)在EU位置299，例如用赖氨酸(299K)取代氨基酸(例如，苏氨酸)；
e)在EU位置307，例如用脯氨酸(307P)取代氨基酸(例如，苏氨酸)；
f)在EU位置309，例如用赖氨酸(309K)、甲硫氨酸(309M)或脯氨酸(309P)取代氨基酸(例如，亮氨酸)；
g)在EU位置323，例如用苯丙氨酸(323F)取代氨基酸(例如，缬氨酸)；
h)在EU位置399，例如用丝氨酸(399S)取代氨基酸(例如，天冬氨酸)；
i)在EU位置409，例如用赖氨酸(409K)或甲硫氨酸(409L)取代氨基酸(例如，精氨酸)；
j)在EU位置427，例如用苯丙氨酸(427F)取代氨基酸(例如，缬氨酸)。
在一个示例性实施方案中，稳定Fc多肽包含稳定Fc突变(a)。在另一个示例性实施方案中，稳定Fc多肽包含稳定Fc突变(b)。在另一个示例性实施方案中，稳定Fc多肽包含稳定Fc突变(c)。在另一个示例性实施方案中，稳定Fc多肽包含稳定Fc突变(d)。在另一个示例性实施方案中，稳定Fc多肽包含稳定Fc突变(e)。在另一个示例性实施方案中，稳定Fc多肽包含稳定Fc突变(f)。在另一个示例性实施方案中，稳定Fc多肽包含稳定Fc突变(g)。在另一个示例性实施方案中，稳定Fc多肽包含稳定Fc突变(h)。在另一个示例性实施方案中，稳定Fc多肽包含稳定Fc突变(i)。在另一个示例性实施方案中，稳定Fc多肽包含稳定Fc突变(j)。
在一个示例性实施方案中，本发明的稳定Fc多肽包含两个或更多个(例如，2、3、4或5个)上述稳定突变(a)-(j)。在某些实施方案中，两个或更多个稳定突变(d)-(j)或(d)-(h)。例如，本发明的稳定Fc多肽包含任一种以下稳定突变组合：(d)和(e)、(d)和(f)、(d)和(g)、(d)和(h)、(d)和(i)、(d)和(j)、(e)和(f)、(e)和(g)、(e)和(h)、(e)和(i)、(e)和(j)、(f)和(g)、(f)和(h)、(f)和(i)、(f)和(j)、(h)和(i)、(h)和(j)、(i)和(j)。在另一个示例性实施方案中，本发明的稳定Fc多肽包含突变(d)、(e)和(f)。在另一个示例性实施方案中，本发明的稳定Fc多肽包含突变(d)、(e)和(g)。在另一个示例性实施方案中，本发明的稳定Fc多肽包含突变(d)、(e)和(h)。在另一个示例性实施方案中，本发明的稳定Fc多肽包含突变(d)、(f)和(g)。在另一个示例性实施方案中，本发明的稳定Fc多肽包含突变(d)、(g)和(h)。在另一个示例性实施方案中，本发明的稳定Fc多肽包含突变(e)、(f)和(g)。在另一个示例性实施方案中，本发明的稳定Fc多肽包含突变(e)、(g)和(h)。在另一个示例性实施方案中，本发明的稳定Fc多肽包含突变(f)、(g)和(h)。在另一个示例性实施方案中，本发明的稳定Fc多肽包含突变(e)、(f)、(g)和(h)。
在另一个实施方案中，本发明的稳定Fc多肽包含IgG4分子的CH2域(或其氨基酸292-340)和来自IgG1分子的CH3域，在位置297有谷氨酰胺(Q)残基。在另一个实施方案中，本发明的稳定Fc多肽包含IgG1分子的CH2域和CH3域和位置299的赖氨酸(K)残基，所述赖氨酸单独存在或与位置297的天冬氨酸(D)残基组合。
(b)示例性稳定Fc部分
可在说明书、实施例和序列表中找到本发明的示例性稳定Fc部分。
在某些示例性实施方案中，本发明的稳定Fc多肽包含含下表1中所列的一个、两个或更多个Fc部分氨基酸序列的稳定IgG4Fc区。以粗斜体加下划线表示稳定Fc突变。
表1：稳定IgG4Fc部分
Figure BDA0000093834270000571
Figure BDA0000093834270000601
Figure BDA0000093834270000611
在其它示例性实施方案中，本发明的稳定Fc多肽包含具有一个、两个或更多个下表2所列的嵌合Fc部分氨基酸序列的稳定嵌合Fc区。
表2：稳定嵌合Fc部分
在其它示例性实施方案中，本发明的稳定Fc多肽包含具有一个、两个或更多个下表3所列的IgG1Fc部分氨基酸序列的稳定无糖基化IgG1Fc区。
表3：稳定无糖基化IgG1Fc部分
Figure BDA0000093834270000631
Figure BDA0000093834270000641
Figure BDA0000093834270000651
(IV)稳定变体Fc多肽的方法
在某些方面，本发明涉及稳定包含Fc区(例如，无糖基Fc区)的多肽的方法，所述方法包括：(a)选择原Fc区的至少一个Fc部分中的一个或多个氨基酸位置进行突变；(b)对所选择进行突变的所述一个或多个氨基酸位置进行突变，从而稳定所述多肽。
在一个实施方案中，原Fc区为IgG1Fc区。在另一个实施方案中，原Fc区为IgG4Fc区。在另一个实施方案中，原Fc区为嵌合Fc区。在一个实施方案中，原Fc区为无糖基化IgG1Fc区。在另一个实施方案中，原Fc区为无糖基化IgG4Fc区。
在一个实施方案中，选择进行突变的氨基酸位置为原IgG分子(例如，IgG4分子)的Fc区中的扩大环。在另一个实施方案中，选择进行突变的氨基酸位置在CH3域之间的交界面上。在另一个实施方案中，选择进行突变的氨基酸位置靠近与1hzh晶体结构(例如，V264、R292或V303)的碳水化合物的接触部位。在其它实施方案中，所述氨基酸位置可靠近CH3/CH2交界面，或靠近CH3/CH2交界面(例如，H310)。在另一个实施方案中，可进行一个或多个改变Fc区的表面总电荷的突变，例如，在一组表面暴露谷氨酰胺残基的一个或多个(Q268、Q274或Q355)中进行。在另一个实施方案中，氨基酸位置为CH2和CH3的“缬氨酸核心”中存在的缬氨酸残基。CH2中的“缬氨酸核心”为五个均朝向CH2域的同一近内部核心的缬氨酸残基(V240、V255、V263、V302和V323)。可观察CH3的类似“缬氨酸核心”(V348、V369、V379、V397、V412和V427)。在另一个实施方案中，选择进行突变的氨基酸位置为预测与氨基酸297氨基酸处的N连接碳水化合物相互作用或与之接触的位置。可通过检验与同源Fc受体(例如，FcγRIIIa)结合的Fc区的晶体结构识别这类氨基酸位置。与N297相互作用的示例性氨基酸包含由残基262-270形成的环。
示例性氨基酸位置包括根据欧盟编号规定的氨基酸位置240、255、262-266、267-271、292-299、302-309、379、397-399、409、412和427。在某些实施方案中，所述一个或多个所选择进行突变的氨基酸位置为选自以下各项的一个或多个氨基酸位置：240、255、262、263、264、266、268、274、292、299、302、303、307、309、323、348、355、369、379、397、399、409、412和427。在某些实施方案中，所述一个或多个选择进行突变的氨基酸位置为选自以下各项的一个或多个氨基酸位置：240、262、264、266、297、299、307、309、399、409和427。在另一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸位置为选自以下各项的一个或多个氨基酸位置：297、299、307、309、409和427。在另一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸位置选自氨基酸残基240、262、264和266。在另一个实施方案中，至少一个所述氨基酸位置位于位置EU297。在另一个实施方案中，至少一个所述氨基酸位置位于位置EU299。在另一个实施方案中，至少一个所述氨基酸位置位于位置EU307。在另一个实施方案中，至少一个所述氨基酸位置位于位置EU309。在另一个实施方案中，至少一个所述氨基酸位置位于位置EU399。在另一个实施方案中，至少一个所述氨基酸位置位于位置EU409。在另一个实施方案中，至少一个所述氨基酸位置位于位置427EU。
在某些实施方案中，Fc区为IgG1Fc区。在某些实施方案中，其中Fc区为IgG1Fc区，所述一个或多个氨基酸位置选自氨基酸残基240、262、264、299、297和266。在其它实施方案中，其中Fc区为IgG4Fc区，所述一个或多个氨基酸位置选自氨基酸残基297、299、307、309、399、409和427。
在一个实施方案中，突变使所述氨基酸位置的氨基酸侧链变小(例如，用丙氨酸(A)、丝氨酸(S)或苏氨酸(T)取代)。在另一个实施方案中，突变为用具有非极性侧链的氨基酸进行取代(例如，用甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)和色氨酸(W)进行的取代)。在另一个实施方案中，突变使CH3界面增加疏水性，例如，增强两个相互作用域(例如，Y349F、T350V和T394V)之间的缔合或增大界面(例如，F405Y)的侧链体积。在另一个实施方案中，用异亮氨酸或苯丙氨酸取代“缬氨酸核心”的一个或多个氨基酸以增强其稳定性。在另一个实施方案中，氨基酸(例如，L351和/或L368)突变成支化度更高的疏水性侧链。
在一个实施方案中，突变为用丙氨酸(A)进行的取代。在一个实施方案中，突变为用苯丙氨酸(F)进行的取代。在另一个实施方案中，突变为用苏氨酸(T)进行的取代。在另一个实施方案中，突变为用赖氨酸(K)进行的取代。在一个实施方案中，突变为用脯氨酸(P)进行的取代。在一个实施方案中，突变为用苯丙氨酸(F)进行的取代。
在一个实施方案中，突变包含以下表1.1、表1.2、表1.3和/或表1.4中所列的一个或多个突变或取代。
在某些实施方案中，突变包含一个或多个选自以下各项的取代：240F、262L、264T、266F、297Q、297S、297D、299A、299K、307P、309K、309M、309P、323F、399S、409M和427F(欧盟编号规定)。在另一个实施方案中，突变包含一个或多个选自以下各项的取代：299A、299K、307P、309K、309M、309P、323F、399E、399S、409K、409M和427F。在另一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸位置选自氨基酸残基240F、262L、264T和266F。在另一个实施方案中，至少一个所述取代为299A。在另一个实施方案中，至少一个所述取代为299K。在另一个实施方案中，至少一个所述取代为307P。在另一个实施方案中，至少一个所述取代为309K。在另一个实施方案中，至少一个所述取代为309M。在另一个实施方案中，至少一个所述取代为309P。在另一个实施方案中，至少一个所述取代为323F。在另一个实施方案中，至少一个所述取代为399S。在另一个实施方案中，至少一个所述取代为399E。在另一个实施方案中，至少一个所述取代为409K。在另一个实施方案中，至少一个所述取代为409M。在另一个实施方案中，至少一个所述取代为427F。
在另一个实施方案中，突变包含两个或更多个取代(例如，2、3、4或5个)。在另一个实施方案中，突变包含三个或更多个取代(例如，3、4、5或6个)。在另一个实施方案中，稳定Fc区包含四个或更多个取代(例如，4、5、6或7个)。
另一方面，本发明涉及制备包含稳定Fc区的稳定结合分子的方法，所述方法包括将包含本发明的稳定Fc区的多肽基因融合至结合部分的氨基端或羧基端。在某些实施方案中，根据本发明的方法稳定所述稳定Fc区。
V.评估蛋白质稳定性的方法
可使用本领域已知的方法分析本发明组合物的稳定性质。可采用本领域人员可接受的稳定性参数。以下更详细地描述了示例性参数。在示例性实施方案中，评估热稳定性。在所提供的实施方案中，评估本发明组合物的表达水平(例如，按产量百分比％测定)。在其它优选的实施方案中，评估本发明组合物的聚集水平。
在某些实施方案中，比较Fc多肽和适合对照的稳定性质。示例性对照包括亲本Fc多肽，如野生型Fc多肽、野生型(糖基化)IgG1或IgG4抗体。另一个示例性对照为无糖基化Fc多肽、无糖基化IgG1或IgG4抗体。
在一个实施方案中，测定以下所述的一个或多个参数。在一个实施方案中，在哺乳动物细胞中表达后测定一个或多个这些参数。在一个实施方案中，在大规模生产条件下(例如，在生物反应器中表达Fc多肽或包含Fc多肽的分子)测定以下所述一个或多个参数。
a)热稳定性
可使用若干本领域已知的非限制性生物物理技术或生物化学技术分析本发明组合物的热稳定性。在某些实施方案中，通过分析光谱法评估热稳定性。
示例性分析光谱法为差示扫描量热法(DSC)。DSC采用对伴随大部分蛋白质或蛋白质域解折叠的热吸收敏感的热量计(见例如Sanchez-Ruiz等，Biochemistry，27：1648-52，1988)。为确定蛋白质的热稳定性，将蛋白质样本插入热量计，升温至Fc多肽(或其CH2域或CH3域)解折叠。蛋白质解折叠的温度表示蛋白质的整体稳定性。
另一种示例性分析光谱法为圆二色(CD)光谱。CD光谱测定随温度升高的组合物旋光性。圆二色(CD)光谱测定由于结构不对称性而引起的左旋偏振光和右旋偏振光吸收差。无序结构或未折叠结构导致CD光谱与有序结构或折叠结构的CD光谱有很大不同。CD光谱反映了蛋白质对温度升高的变性作用的敏感性，因此表示蛋白质的热稳定性(见van Mierlo和Steemsma，J.Biotechnol.，79(3)：281-98，2000)。
另一种测量热稳定性的示例性分析光谱法为荧光发射光谱(见上述vanMierlo和Steemsma)。又一种测量热稳定性的示例性分析光谱法为核磁共振(NMR)光谱(见例例如上述van Mierlo和Steemsma)。
在其它实施方案中，通过生化方法测定本发明组合物的热稳定性。评估热稳定性的示例性生化方法为热激发测定。在“热激发测定”中，本发明的组合物经历设定时间段的一系列升温。例如，在一个实施方案中，包含Fc区的受试Fc多肽经历(例如)1-1.5小时的一系列升温。然后通过相关生物化学测定(例如，ELISA或DELFIA)测定Fc区结合Fc受体(例如，FcγR、蛋白质A或蛋白质G)的能力。以下实施例2中描述了示例性热激发测定。
在一个实施方案中，可以高流量形式进行这种测定。在另一个实施方案中，可使用本领域已知的方法创建Fc变体文库。可诱导Fc表达且可使Fc经历热激发。可测定激发试样的结合，并且那些稳定的Fc多肽可按比例增加并对其进行进一步表征。
在某些实施方案中，通过使用以上任一种技术(例如分析光谱技术)测定本发明组合物的解链温度(Tm)而评估热稳定性。解链温度为热过渡曲线中点处的温度，其中组合物50％的分子呈折叠状态。
在其它实施方案中，通过使用分析量热技术(例如DSC)测定本发明组合物的比热或热容(Cp)而评估热稳定性。组合物的比热为每1mol水温度升高1℃所需的能量(例如，kcal/mol)。大Cp是变性或非活性蛋白质组合物的特点。在某些实施方案中，通过确定组合物在热转化前后的比热而测定组合物的热容变化(ΔCp)。在其它实施方案中，可通过测定或确定包括解折叠的吉布斯自由能(ΔG)、解折叠的焓(ΔH)或解折叠的熵(ΔS)在内的其它热力学稳定性参数而评估热稳定性。
在其它实施方案中，以上一种或多种生物化学测定(如热激发测定)用于确定50％的组合物保持其活性(例如结合活性)的温度(即TC值)。
b)聚集％
在某些实施方案中，通过测定本发明组合物的聚集倾向而确定其稳定性。可通过若干非限制性生物化学技术或生物物理技术测定聚集。例如，可使用色谱法，例如尺寸排阻色谱法(SEC)评估本发明组合物的聚集。SEC根据尺寸分离分子。柱装满将容许离子和小分子进入其内，但大分子不能进入的半固体高分子凝胶珠。当蛋白质组合物施加于柱顶部时，紧密折叠蛋白质(即非聚集蛋白质)通过比大蛋白质聚集物更大的体积的溶剂而分布。因此，大蛋白质聚集物更快地移动通过所述柱，这样可将混合物分离或分级为其组分。当从凝胶洗脱时，可分别(例如通过光散射)量化各组分。因此，通过比较组分浓度和施加于凝胶的蛋白质总浓度可确定本发明组合物的聚集％。稳定组合物以实质上单一组分从柱中洗脱，并且在洗脱图或色谱图中以实质上单个峰出现。
在优选的实施方案中，SEC连同在线光散射(如经典光散射或动态光散射)一起使用以确定组合物的聚集百分比％。在某些优选的实施方案中，采用静态光散射测定各组分的质量或峰，而不依赖于分子的形状或洗脱位置。在其它优选的实施方案中，采用动态光散射测定组合物的流体动力学尺寸。其它评估蛋白质稳定性的示例性方法包括高速SEC(Corbett等，Biochemistry.23(8)：1888-94，1984)。
在优选的实施方案中，通过测定蛋白质样本中蛋白质聚集物的组分确定聚集百分比％。在优选的实施方案中，通过确定蛋白质样本中折叠蛋白质的组分测定组合物的聚集百分比％。
c)产量％
在其它实施方案中，通过测定蛋白质表达(例如重组体表达)后回收的蛋白质的量(本文的“产量％”)而评估本发明组合物的稳定性。例如，可通过确定每1ml宿主培养基回收的蛋白质毫克数而测定产量％(即mg/ml的蛋白质)。在优选的实施方案中，在哺乳动物宿主细胞(例如CHO细胞)中表达后，评估产量％。
d)损失％
在其它实施方案中，通过监测在储存规定时间段后，在一个温度范围内(例如，-80℃至25℃)的蛋白质损失而评估本发明组合物的稳定性。使用本领域已知的任一蛋白质量化方法均可测定所回收蛋白质的量或浓度，并与蛋白质的初始浓度比较。示例性蛋白质量化方法包括SDS-PAGE分析或布拉德福测定(Bradford assay)(Bradford等，Anal.Biochem.72，248，(1976))。评估损失％的优选方法采用以上所述的任一分析SEC法。应了解在任何所需储存条件或储存剂型(包括例如冻干蛋白质制剂)下均可测定损失测定值％。
e)蛋白质水解％
在其它实施方案中，通过测定在标准条件下储存后蛋白质水解的量而评估本发明组合物的稳定性。在示例性实施方案中，通过对蛋白质样本进行SDS-PAGE测定蛋白质水解，其中比较完整蛋白质的量与SDS-PAGE凝胶上出现的低分子量片段的量。在另一个示例性实施方案中，通过质谱分析法(MS)测定蛋白质水解，其中比较预期分子量的蛋白质的量与样本中低分子量蛋白质片段的量。
f)结合亲合力
在其它实施方案中，可通过测定本发明组合物的靶标结合亲合力而评定其稳定性。本领域已知多种测定结合亲合力的方法。测定结合亲合力的示例性方法采用表面等离子共振。表面等离子共振为例如使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden and Piscataway，NJ)允许通过检测生物传感器矩阵中蛋白质浓度的改变而分析实时生物特异性相互作用的光学现象。进一步描述见
Figure BDA0000093834270000721
U.等，(1993)Ann.Biol.Clin.51：19-26；U.等，(1991)Biotechniques 11：620-627；Johnsson，B.等，(1995)J.Mol.Recognit.8：125-131；和Johnnson，B.等l，(1991)Anal.Biochem.198：268-277。
g)其它结合研究
在其它实施方案中，可通过量化标记化合物与结合分子的变性或解折叠部分的结合而评估本发明组合物的稳定性。因为这类分子优选与通常埋藏于天然蛋白质内部，但在变性或解折叠结合分子中暴露的氨基酸大疏水性补丁结合或相互作用，所以这类分子优选为具疏水性。示例性标记化合物为疏水性荧光染料，1-苯胺基-8-萘磺酸盐(ANS)。
(VI)包含稳定Fc区的稳定结合多肽
在某些方面，本发明提供了包含本发明稳定Fc多肽的稳定结合多肽。如上所述，本发明的变体Fc多肽(和/或变体Fc多肽所来源的亲本Fc多肽)可进一步包含结合位点以形成稳定结合多肽。各种替代性设计的结合多肽都在本发明的范围内。例如，一个或多个结合位点可在多个方向与Fc多肽的Fc区融合、连接或并入其中(例如镶，入)。在一个示例性实施方案中，结合多肽包含与Fc区的N端融合的结合位点。在另一个示例性实施方案中，结合多肽包含位于Fc区的C端的结合位点。本发明的结合多肽可包含位于Fc区的C端和N端的结合位点。在其它实施方案中，结合多肽可包含在Fc区的N端和/或C端域间区域(例如，在Fc部分的CH2和CH3域之间)的结合位点。或者，结合位点可并入Fc部分的铰链和CH2域之间的域间区域。在其它实施方案中，其中Fc多肽的Fc区为scFc区，结合多肽可包含接头多肽中的一个或多个结合位点，所述接头多肽将scFc区的两个或更多个Fc部分连接成单一邻接序列。
在其它实施方案中，本发明的稳定结合多肽包含被引入稳定Fc区的Fc部分的结合位点。例如，结合位点可镶入N端CH2域、N端CH3域、C端CH2域和/或C端CH3域。在一个实施方案中，抗体的CDR环镶入scFc区的一个或两个CH3域。例如在国际PCT公开第WO 08/003116号中公开了将CDR环和其它结合部分镶入Fc区的CH2域和/或CH3域的方法，该公开通过引用的方式并入本文。
本领域的技术人员公认稳定结合多肽可包含使用任一方向组合与本发明的Fc多肽的稳定Fc区连接、融合或并入(例如，镶入)其中的两个或更多个结合位点(例如，2个、3个、4个或更多个结合位点)。
在某些实施方案中，本发明的结合多肽包含两个结合位点和至少一个稳定Fc区。例如，结合位点可操作性地连接稳定Fc区的N端和C端。在其它示例性实施方案中，结合位点可操作地连接多个稳定Fc区的N端和C端。当稳定Fc区为scFc区时，两个或更多个scFc区可串联在一起形成串联排列的稳定Fc区。
在其它实施方案中，两个或更多个结合位点相互串联(例如，通过多肽接头)，并且串联排列的结合位点可操作地连接(例如，化学轭合)或基因融合(例如，直接或通过多肽接头))稳定Fc区或串联排列的稳定Fc区(即，串联稳定scFc区)的C端或N端。在其它实施方案中，串联排列的结合位点可操作地连接单个稳定Fc区或串联排列的稳定Fc区的C端和N端。
在其它实施方案中，本发明的稳定结合多肽为包含三个结合位点的三价结合多肽。本发明的示例性三价结合多肽为双特异性的或三特异性的。例如，三价结合多肽可对一种特异性为二价的(即，有两个结合位点)而对另一种特异性为单价的。
在其它实施方案中，本发明的稳定结合多肽为包含四个结合位点的四价结合多肽。本发明的示例性四价结合多肽为双特异性的。例如，四价结合多肽可对每种特异性均为二价的(即，有两个结合位点)。
如上所述，在其它实施方案中，可将一个或多个结合位点插入稳定scFc区的两个Fc部分之间。例如，一个或多个结合位点可形成本发明结合多肽的所有或部分多肽接头。
本发明的优选结合多肽包含抗原结合位点(例如，抗体、抗体变体或抗体片段的抗原结合位点)、配体的受体结合部分或受体的配体结合部分中的至少一个。
在其它实施方案中，本发明的结合多肽包含至少一个结合位点，该结合位点包括以上所讨论的任一个生物相关肽的一个或多个结合位点。
在某些实施方案中，本发明的结合多肽有至少一个对介导生物效应的靶分子有特异性的结合位点。在一个实施方案中，结合位点调节细胞的活化或抑制(例如，通过结合细胞表面受体并引起活化或抑制信号的传输)。在一个实施方案中，结合位点能够发起导致细胞死亡的信号的转导(例如，通过细胞信号诱导途径，通过补体固定或暴露于结合分子上存在的有效负荷(例如，毒性有效负荷))或调节受试者疾病或病症的信号的转导(例如，通过介导或促进细胞杀伤，通过促进纤维蛋白凝块溶解或促进凝块形成，或通过调节可生物利用物质的量(例如，通过增加或减少受试者体内如TNFα等的配体的量))。在另一个实施方案中，本发明的结合多肽有至少一个对被靶向减少或消除的抗原(例如，细胞表面抗原或可溶性抗原)有特异性的结合位点和至少一个基因融合的Fc区(即，scFc区)。
在另一个实施方案中，本发明结合多肽与靶分子(例如抗原)的结合导致靶分子例如从组织或循环减少或消除。在另一个实施方案中，结合多肽有至少一个对靶分子有特异性的结合位点，该结合位点可用于检测靶分子存在与否(例如，检测污染物或诊断病状或病症)。在又一个实施方案中，本发明的结合多肽包含至少一个使分子靶向受试者体内特异性位点(例如，肿瘤细胞、免疫细胞或血块)的结合位点。
在某些实施方案中，本发明的结合多肽可包含两个或更多个结合位点。在一个实施方案中，结合位点相同。在另一个实施方案中，结合位点不同。
在其它实施方案中，本发明的结合多肽可装配在一起或与其它多肽装配形成有两个或更多个多肽的结合蛋白(“结合蛋白”或“多聚体”)，其中多聚体的至少一个多肽为本发明的结合多肽。示例性多聚体形式包括二聚体、三聚体、四聚体和六聚体的改变结合蛋白等。在一个实施方案中，结合蛋白的多肽相同(即同聚的改变结合蛋白，例如同型二聚体、同型四聚体)。在另一个实施方案中，结合蛋白的多肽不同(例如异聚的)。
在一个实施方案中，本发明的多肽包含来自IgG4抗体的CH1域、来自IgG4抗体的CH2域和来自IgG1抗体的CH3域。在一个实施方案中，所述多肽进一步包含Ser228Pro取代。所述多肽进一步包含位于氨基酸297和/或299处的突变，例如，297Q和/或299K或297S和/或299K。所述多肽还可包含来自IgG1抗体或IgG4抗体的CH1域、来自IgG4抗体的CH2域和来自IgG1抗体的CH3域；所述多肽可包含Ser228Pro、297Q或299K取代中的一个或多个。SEQ ID NO：28中提供了由来自IgG4分子的CH1域(具有Ser228Pro取代)、来自IgG4抗体的CH2域和来自IgG1抗体的CH3域组成的Fc区的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的稳定Fc多肽包含SEQID NO：25中所列的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的稳定Fc多肽包含SEQ ID NO：59中所列的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的稳定Fc多肽包含SEQ ID NO：60中所列的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的稳定Fc多肽包含SEQ ID NO：61中所列的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的稳定Fc多肽包含SEQ ID NO：62中所列的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的多肽的Fc区为单链(scFc)。在一个实施方案中，包含本段落所述Fc区的分子为单价。在一个实施方案中，包含本段落所述Fc区的分子为单价，并且所述Fc区为scFc。包含本文所述Fc区的分子也可包含scFv。
i.抗原结合位点
(a)抗体
在某些实施方案中，本发明的结合多肽包含至少一个抗体的抗原结合位点。本发明的结合多肽可包含使用本领域公认方案从抗体获得的可变区或其部分(例如VL域和/或VH域)。例如，可通过用抗原或其片段使哺乳动物免疫而从非人类哺乳动物，例如鼠、豚鼠、灵长类、兔或大鼠体内生成的抗体获得可变域。见上述Harlow&Lane，为了所有目的，将该文献通过引用的方式并入。可通过多次皮下或腹膜内注射相关抗原(例如，纯化的肿瘤相关抗原或包含此类抗原的细胞或细胞提取物)和佐剂生成免疫球蛋白。这种免疫通常会引起免疫反应，该免疫反应包括从活化的脾细胞或淋巴细胞生成抗原反应性抗体。
虽然可变区可源自从经免疫的哺乳动物的血清收获的多克隆抗体，但往往希望从脾、淋巴结或外周血液中分离单个淋巴细胞以提供单克隆抗体(MAb)的均质制剂，其中预期可变区源自所述单克隆抗体。兔或豚鼠通常用于制备多克隆抗体。小鼠通常用于制备单克隆抗体。可通过将抗原片段注入小鼠体内，制备“杂交瘤”并筛选杂交瘤获得特异性结合抗原的抗体从而制得针对片段的单克隆抗体。在这种熟知的方法(Kohler等，(1975)，Nature，256：495)中，来自注射了抗原的小鼠的存活期相对较短或致死的淋巴细胞与永生肿瘤细胞系(例如骨髓瘤细胞系)融合，从而产生永生并且能够生成由B细胞基因编码的抗体的杂交细胞或“杂交瘤”。通过选择、稀释和再生长将所得到的杂种分离为单个的基因菌株，其中各单个菌株包含形成单个抗体的特定基因。单基因菌株生成针对所需抗原的同源抗体，根据其纯基因来源，称为“单克隆”。
接种这样制备的杂交瘤细胞并在适合的培养基中生长，所述培养基优选含一种或多种抑制未融合亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。本领域的技术人员应了解用于形成、选择和生长杂交瘤的试剂、细胞系和培养基可从若干来源商购获得，并且标准方案制定完善。通常，测定杂交瘤细胞生长的培养基针对所需抗原的单克隆抗体的生成。优选地，通过免疫沉淀反应或体外测定，如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。鉴定杂交瘤细胞生成具有所需特异性、亲合力和/或活性的抗体之后，可通过限制稀释方法对克隆进行亚克隆并通过标准方法使其生长(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，第59-103页(Academic Press，1986))。应进一步了解可通过常规提纯方法，例如亲合色谱法(例如，蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L亲合色谱法)、羟磷灰石色谱法、凝胶电泳或透析从培养基、腹水或血清中分离亚克隆分泌的单克隆抗体。
任选地，可筛选抗体用于结合抗原的特异性特定区或所需片段，而不结合抗原的其它非重叠片段。通过确定测定抗体与抗原的一些抗原缺失突变的结合和确定测定哪个些缺失突变与抗体结合来完成实现后来的筛选。例如可通过蛋白质印迹(Western blot)或ELISA评估结合。显示特异性结合抗体的最小片段定义为抗体的表位。或者，可通过竞争分析测定表位特异性，其中在竞争分析中试验参考抗体竞争结合抗原。如果试验参考抗体竞争，则其结合同一表位或足够接近的表位，以致一个抗体的结合干扰其它抗体的结合。
使用任一上述用于分离恒定区域序列的常规方法(例如，通过使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)可容易地分离编码所需单克隆抗体的DNA并对其进行测序。分离的亚克隆杂交瘤细胞用作这种DNA的优选来源。更具体地，分离的DNA(如本文所述可以是合成的)可用于克隆所需的可变区序列，以并入本发明结合多肽。
在其它实施方案中，结合位点源自完全人源抗体。不能生成内源性免疫球蛋白的转基因动物(如小鼠)体内可生成人源抗体或大体上的人源抗体(见例如美国专利第6,075,181、5,939,598、5,591,669和5,589,369号，其各自通过引用的方式并入本文)。例如，已描述嵌合生殖细胞系突变小鼠体内抗体重链连接区的纯合子缺失导致完全抑制内源抗体生成。将人免疫球蛋白基因阵列转移到这种生殖细胞系突变小鼠中将导致一旦抗原激发就生成人源抗体。美国专利第5,811,524号中公开了使用SCID小鼠产生人源抗体的另一优选方法，该专利通过引用并入本文。应了解也可如本文所述分离并操作与这些人源抗体结合的遗传物质。
Newman在Biotechnology，10：1455-1460(1992)中公开了又一种生成重组抗体的高效方法。具体地，这种技术导致生成含猴可变域和人恒定序列的灵长抗体。该参考的全部内容通过引用的方式并入本文。而且，共同受让的美国专利第5,658,570、5,693,780和5,756,096中也描述了这种技术，各个所述专利通过引用的方式并入本文。
在另一个实施方案中，可通过显微操作选择淋巴细胞并分离可变基因。例如，可从免疫哺乳动物分离外周血液单核细胞并在体外培养约7天。可筛选培养物获得满足筛选标准的特异性IgG。可分离来自阳性孔的细胞。通过FACS或通过补体介导的溶血蚀斑测定识别而分离生成Ig的单个B细胞。可对将生成Ig的B细胞进行显微操作装入管中，并且可使用例如RT-PCR扩增VH基因和VL基因。可将VH基因和VL基因克隆至抗体表达载体并转染至细胞中(例如，真核细胞或原核细胞)以进行表达。
或者，可从来自所选动物的可变基因序列的文库获得可变(V)域。可用所需抗原筛选表达随机域组合(例如，VH域和VL域)的文库以识别具有所需结合特征的元件。本领域熟知这种筛选方法。例如，可将抗体基因谱克隆至λ细菌噬菌体表达载体中(Huse，WD等(1989).Science，2476：1275)。另外，可筛选在其表面表达抗体的细胞(Francisco等(1994)，PNAS，90：10444；Georgiou等(1997)，Nat.Biotech.，15：29；Boder和Wittrup(1997)Nat.Biotechnol.15：553；Boder等(2000)，PNAS，97：10701；Daugtherty，P.等(2000)J.Immunol.Methods.243：211)或病毒(例如，Hoogenboom，HR.(1998)，Immunotechnology 4：1；Winter等(1994).Annu.Rev.Immunol.12：433；Griffiths，AD.(1998).Curr.Opin.Biotechnol.9：102)。
本领域的技术人员还应了解还可使用本领域已知的方法从噬菌体、酵母或细菌中表达的抗体文库中获得编码抗体可变域的DNA。例如在EP 368684B1、美国专利第5,969,108号，Hoogenboom等，(2000)Immunol.Today 21：371、Nagy等，(2002)Nat.Med.8：801、Huie等，(2001)，PNAS，98：2682、Lui等，(2002)，J.Mol.Biol.315：1063中陈述了示例性方法，这些文献各自通过引用的方式并入本文。若干出版物(例如，Marks等(1992)，Bio/Technology 10：779-783)已描述了通过链改组生成高亲合力人源抗体，以及组合感染和作为构造大噬菌体文库的策略的体内重组。在另一个实施方案中，核糖体展示可用于代替细菌噬菌体作为展示平台(见例如Hanes等(1998)，PNAS 95：14130；Hanes和Pluckthun.(1999)，Curr.Top.Microbiol.Immunol.243：107；He和Taussig.(1997)，Nuc.Acids Res.，25：5132；Hanes等(2000)，Nat.Biotechnol.18：1287；Wilson等(2001)，PNAS，98：3750；或Irving等(2001)J.Immunol.Methods248：31)。
优选用于筛选的文库为人可变基因文库。也可使用来自非人源的VL域和VH域。文库可为来自经免疫的受试者的天然文库或半合成文库(Hoogenboom和Winter.(1992).J.Mol.Biol.227：381；Griffiths等(1995)EMBO J.13：3245；de Kruif等(1995).J.Mol.Biol.248：97；Barbas等(1992)，PNAS，89：4457)。在一个实施方案中，可对免疫球蛋白域进行突变以创建具有更高异质性的核酸分子文库(Thompson等(1996)，J.Mol.Biol.256：77；Lamminmaki等(1999)，J.Mol.Biol.291：589；Caldwell和Joyce.(1992)，PCR Methods Appl.2：28；Caldwell和Joyce.(1994)，PCR Methods Appl.3：S136)。可使用标准筛选程序选择高亲合力变体。在另一个实施方案中，可例如使用用本领域已知的技术从晶体结构获得的信息对VH序列和VL序列进行改变以增加抗体的亲合力。
而且，用于生成本发明结合多肽的可变区序列可从若干不同来源获得。例如，如以上所讨论的，可以公共可得的存放的形式获得各种人基因序列。已公开许多抗体和编码抗体的基因的序列，并且可使用本领域公认的技术由这些序列化学合成适合的可变区序列(例如VL序列和VH序列)。
在另一个实施方案中，本发明结合多肽中存在的至少一个可变区域有催化作用(Shokat和Schultz.(1990).Annu.Rev.Immunol.8：335)。可使用本领域公认的技术制得有催化结合特异性的可变区域(见例如美国专利第6,590,080号、美国专利第5,658,753号)。催化结合特异性可通过多个类似于鉴定酶类的机制的基本机制起作用以稳定过渡态，从而降低活化自由能。例如，一般酸碱残基可最佳定位以参与催化活性部位内的催化；可形成共价酶-底物中间体；催化抗体也可在反应的适当方向并使反应物的有效浓度至少增加7个数量级(Fersht等，(1968)，J.Am.Chem.Soc.90：5833)，并从而大大降低化学反应的熵。最后，催化抗体可转化在底物结合和/或随后过渡态中间体稳定时获得的能量以驱动反应。
通过将互补带电分子作为免疫原可将酸残基或碱残基引入抗原结合位点。已证明这种技术对于用含带正电的铵离子的半抗原引发抗体颇为有效(Shokat等，(1988)，Chem.Int.Ed.Engl.27：269-271)。在另一种方法中，可将抗体引至大小、形状和电荷类似于所需反应的过渡态中间体的稳定化合物(即，过渡态类似物)中。见美国专利第4,792,446号和美国专利第4,963,355号，其描述了过渡态类似物使动物免疫的用途和催化抗体的产生。这两个专利据此通过引用的方式并入本文。这类分子可作为部分免疫缀合物施用，例如，与免疫原载体分子(如KLH)一起施用。
在另一个实施方案中，本发明改变抗体的可变区域由VH域组成，例如，源自骆驼科动物在VL链不存在时稳定的VH域(Hamers-Casterman等(1993).Nature，363：446；Desmyter等(1996).Nat.Struct.Biol.3：803；Decannier等(1999).Structure，7：361；Davies等(1996).Protein Eng.，9：531；Kortt等(1995).J.Protein Chem.，14：167)。
此外，本发明的结合多肽可包含源自全鼠源抗体、全人源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、非人灵长类抗体或灵长源抗体的可变域或CDR。可使用本领域公认的技术改变非人源抗体或其片段或域以降低其免疫原性。人源化抗体为源自非人源抗体的抗体，这种抗体经修饰以保持或大体上保持亲本抗体的结合性质，但在人体内的免疫原性比亲本非人源抗体低。在人源化靶抗体的情况下，这可通过多种方法实现，包括(a)将整个非人源可变域移植到人源恒定区以产生嵌合靶抗体；(b)将一个或多个非人源互补决定区(CDR)的至少一部分移植到人源骨架区和恒定区内，保留或未保留关键骨架残基；(c)移植整个非人源可变域，但通过置换表面残基用人源样部分“覆盖”非人源可变域。Morrison等，(1984)，PNAS.81：6851-5；Morrison等，(1988)，Adv.Immunol.44：65-92；Verhoeyen等，(1988)，Science 239：1534-1536；Padlan，(1991)，Molec.Immun.28：489-498；Padlan，(1994)，Molec.Immun.31：169-217和美国专利第5,585,089号、第5,693,761号和第5,693,762号中描述了这类方法，所有上述文献和专利的全部内容据此通过引用的方式并入本文。
去免疫化也可用于降低本发明结合多肽的免疫原性。本文所使用的术语“去免疫化”包括修饰T细胞表位(见例如WO9852976A1、WO0034317A2)。例如，分析序列VH和VL序列，并且形成来自各V区显示表位相对于互补决定区(CDR)和序列中其它关键残基的位置的人源T细胞表位“图”。分析来自T细胞表位图的单个T细胞表位以识别具有较低的改变最终抗体活性的风险的替代性氨基酸取代。设计一系列包含氨基酸取代的组合的替代性VH序列和VL序列，并随后将这些序列并入本发明的测试其功能的一系列多肽中。通常，生成并测试介于12和24个之间的变体抗体。然后将包含经修饰V区和人源C区的完整重链和轻链基因克隆至表达载体，并且随后将质粒导入细胞系中以生成全抗体。然后通过适当生物化学和生物测定比较抗体，并识别最佳变体。
在一个实施方案中，可通过至少部分置换一个或多个CDR改变本发明结合多肽中采用的可变域。在另一个实施方案中，例如可通过部分骨架区置换和序列变化任选地改变可变域。在制备人源化可变区时，CDR可源自同类抗体，甚至如同从中获得骨架区的抗体的子类，然而设想CDR源自不同类的抗体，并且优选源自不同物种的抗体。要将一个可变域的抗原结合力转移至另一个可变域，可不必用来自供体可变区的完整CDR置换所有CDR。相反，可只需转移维持结合域活性所必需的那些残基。考虑到美国专利第5,585,089号、第5,693,761号和第5,693,762号中所述的解释，在本领域技术人员能力范围内，可通过进行常规实验或试验和误差检验获得免疫原性降低的功能性抗原结合位点。
在一个实施方案中，本发明的结合多肽包含至少一个来自识别所需靶标的抗体的CDR。在另一个实施方案中，本发明的改变抗体包含至少两个来自识别所需靶标的抗体的CDR。在另一个实施方案中，本发明的改变抗体包含至少三个来自识别所需靶标的抗体的CDR。在另一个实施方案中，本发明的改变抗体包含至少四个来自识别所需靶标的抗体的CDR。在另一个实施方案中，本发明的改变抗体包含至少五个来自识别所需靶标的抗体的CDR。在另一个实施方案中，本发明的改变抗体包含六个来自识别所需靶标的抗体的CDR。
在一个实施方案中，本发明结合多肽中采用的抗原结合位点可与一个或多个肿瘤相关抗原发生免疫反应。例如，为治疗癌症或瘤形成，结合多肽的抗原结合域优选结合所选的肿瘤相关抗原。考虑到所报道的与瘤形成相关的抗原数量和相关抗体的数量，本领域的技术人员应理解本发明的结合多肽可包含源自若干全抗体的任一种的可变区序列或其部分。通常，这种可变区序列可从与所选病状相关抗原或标记反应的任一抗体(包括先前在文献中报道的抗体)获得或得到。被本发明结合多肽结合的示例性肿瘤相关抗原包括例如泛B抗原(例如恶性和非恶性B细胞表面存在的CD20，如非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma))和泛T细胞抗原(例如CD2、CD3、CD5、CD6、CD7)。其它示例性肿瘤相关抗原包括但不限于MAGE-1、MAGE-3、MUC-1、HPV 16、HPV E6&E7、TAG-72、CEA、α-Lewisy、L6-抗原、CD19、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD37、CD44、CD52、CD56、CD80、间皮素、PSMA、HLA-DR、EGF受体、VEGF、VEGF受体、Cripto抗原和HER2受体。
在其它实施方案中，本发明的结合多肽可包含来自先前报道的与肿瘤相关抗原反应的抗体的全抗原结合位点(或其可变区或CDR序列)。能够与肿瘤相关抗原反应的示例性抗体包括：2B8、Lym1、Lym2、LL2、Her2、B1、BR96、MB1、BH3、B4、B72.3、5E8、B3F6、5E10、α-CD33、α-CanAg、α-CD56、α-CD44v6、α-Lewis和α-CD30。更具体地，这些示例性抗体包括但不限于2B8和C2B8(
Figure BDA0000093834270000821
和
Figure BDA0000093834270000822
Biogen Idec，Cambridge)、Lym 1和Lym2(Techniclone)、LL2(Immunomedics  Corp.，New Jersey)、曲妥单抗(Trastuzumab)(Genentech Inc.，South San Francisco)、托西莫单抗(Tositumomab)(
Figure BDA0000093834270000824
Coulter Pharm.，San Francisco)、阿仑单抗(Alemtzumab)(
Figure BDA0000093834270000825
Millennium Pharmaceuticals，Cambridge)、吉妥单抗(Gemtuzumab ozogamicin)(
Figure BDA0000093834270000826
Wyeth-Ayerst，Philadelphia)、阿巴伏单抗(Abagovomab)(Menarini，Italy)、CEA-ScanTM(Immunomedics，MorrisPlains，NJ)、卡罗单抗(Capromab)(
Figure BDA0000093834270000827
Cytogen Corp.)、依决洛单抗(Edrecolomab)(
Figure BDA0000093834270000828
Johnson&Johnson，New Brunswick，NJ)、伊戈伏单抗(Igovomab)(CIS Bio Intl.，France)、米妥莫单抗(Mitumomab)(BEC2，Imclone Systems，Somerville，NJ)、若莫单抗(Nofetumomab)(
Figure BDA0000093834270000829
B oehringer Ingleheim，Ridgefield，CT)、OvaRex(Altarex Corp.，Waltham，MA)、沙妥莫单抗(Satumomab)(
Figure BDA00000938342700008210
Cytogen Corp.)、阿泊珠单抗(Apolizumab)(REMITOGEN TM，Protein Design Labs，Fremont，CA)、拉贝珠单抗(Labetuzumab)(CEACIDE TM，Immunomedics Inc.，Morris Plains，NJ)，帕妥珠单抗(Pertuzumab)(OMNITARG TM，Genentech Inc.，S.San Francisco，CA)、帕尼单抗(Panitumumab)(
Figure BDA00000938342700008211
Amgen，Thousand Oaks，CA)、西妥昔单抗(Cetuximab)(Imclone Systems，New York)、贝伐单抗(Bevacizumab)(
Figure BDA00000938342700008213
Genentech Inc.，South San Francisco)、BR96，BL22，LMB9，LMB2，MB1，BH3，B4，B72.3(Cytogen Corp.)、SS1(NeoPharm)、CC49(National Cancer Institute)、莫坎妥珠单抗(Cantuzumabmertansine)(ImmunoGen，Cambridge)、MNL 2704(Milleneum Pharmaceuticals，Cambridge)、Bivatuzumab mertansine(Boehringer Ingelheim，Germany)、曲妥单抗-DM1(Trastuzumab-DM1)(Genentech，South San Francisco)、My9-6-DM1(ImmunoGen，Cabridge)、SGN-10，-15，-25，和-35(Seattle Genetics，Seattle)和5E10(University of Iowa)。在又一个实施方案中，结合多肽可包含抗CD23抗体(例如，鲁昔单抗(Lumiliximab))、抗CD80抗体(例如，Galiximab)或抗VL5/α5β1整联蛋白抗体(例如，Volociximab)的结合位点。在其它实施方案中，本发明的结合多肽将结合与上文刚列举的抗体相同的肿瘤相关抗原。在特别优选的实施方案中，多肽源自或结合与Y2B8、C2B8、CC49和C5E10相同的抗原。
可并入受试者结合分子的其它结合位点包括存在于以下的结合位点：Orthoclone OKT3(抗CD3)(Johnson&Johnson，Brunswick，NJ)、
Figure BDA0000093834270000831
(抗GpIIb/gIIa)(Centocor，Horsham，PA)，
Figure BDA0000093834270000832
(抗CD25)(Roche，Basel，Switzerland)、
Figure BDA0000093834270000833
(抗TNFα)(Centocor，Horsham，PA)、
Figure BDA0000093834270000834
(抗CD25)(Novartis，Basel，Switzerland)、
Figure BDA0000093834270000835
(抗RSV)(Medimmune，Gaithersburg，MD)、
Figure BDA0000093834270000836
(抗TNF α)(Abbott，Abbott Park，IL)、
Figure BDA0000093834270000837
(抗IgE)(Genentech，South San Francisco，CA)、
Figure BDA0000093834270000838
(抗CD11a)(Genentech)、
Figure BDA0000093834270000839
(BiogenIdec，Cambridge，MA)、
Figure BDA00000938342700008310
(抗VEGF)(Genentech)和
Figure BDA00000938342700008311
(Alexion Pharmaceuticals，Cheshire，CT)。
在一个实施方案中，本发明的结合分子可具有一个或多个源自以下一个或多个抗体的结合位点：
Figure BDA00000938342700008312
莫罗单抗(muromonab)
Figure BDA00000938342700008313
和替伊莫单抗(ibritumomab)
Figure BDA00000938342700008314
西妥昔单抗(ERBITUXTM)、利妥昔单抗(rituximab)
Figure BDA00000938342700008315
英夫利昔单抗(infliximab)
Figure BDA00000938342700008316
阿昔单抗(abciximab)
Figure BDA00000938342700008317
和巴利昔单抗(basiliximab)
Figure BDA00000938342700008318
依法珠单抗(efalizumab)
Figure BDA00000938342700008319
贝伐单抗
Figure BDA00000938342700008320
阿仑单抗(alemtuzumab)
Figure BDA00000938342700008321
曲妥单抗吉姆单抗(gemtuzumab)
Figure BDA00000938342700008323
帕利珠单抗(palivizumab)
Figure BDA00000938342700008324
奥马佐单抗(omalizumab)
Figure BDA00000938342700008325
达利珠单抗(daclizumab)
Figure BDA00000938342700008326
那他珠单抗(natalizumab)
Figure BDA00000938342700008327
和兰尼单抗(ranibizumab)
Figure BDA00000938342700008328
阿达木单抗(adalimumab)和帕尼单抗(panitumumab)
在一个实施方案中，结合多肽将结合与
Figure BDA0000093834270000841
相同的抗原。
Figure BDA0000093834270000842
(也称为利妥昔单抗，IDEC-C2B8和C2B8)是首例FDA批准用于治疗人B细胞淋巴瘤的单克隆抗体(见美国专利第5,843,439号、第5,776,456号和第5,736,137号，所述每个专利通过引用的方式并入本文)。Y2B8(90Y标记的2B8；
Figure BDA0000093834270000843
替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan))是C2B8的鼠科亲本抗体。
Figure BDA0000093834270000844
为嵌合抗CD20单克隆抗体，其为生长抑制型并且据报道使某些淋巴瘤细胞系敏化以在体外受化疗剂作用而细胞凋亡。抗体有效结合人源补体，具有强FcR结合，并且可通过补体依赖性(CDC)机制和抗体依赖性(ADCC)机制在体外有效杀伤人淋巴细胞(Reff等，Blood 83：435-445(1994))。本领域的技术人员应了解本发明的结合多肽可包含C2B8或2B8的可变区或CDR，以便提供治疗患有CD20+恶性肿瘤患者甚至更有效的结合多肽。
在本发明的其它实施方案中，本发明的结合多肽将结合与CC49相同的肿瘤相关抗原。CC49结合与某些人源肿瘤细胞，特别是LS174T肿瘤细胞系的表面结合的人肿瘤相关抗原TAG-72。LS174T是LS180结肠腺癌细胞系的变体。
本发明的结合多肽可包含源自大量鼠单克隆抗体的抗原结合位点，这些单克隆抗体已被开发并对TAG-72有结合特异性。其中一种指定为B72.3的单克隆抗体是杂交瘤B72.3产生的鼠IgG1。B72.3是使用人乳腺癌提取物作为免疫原开发的第一代单克隆抗体(见Colcher等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，78：3199-3203(1981)；和美国专利第4,522,918号和第4,612,282号，每个上述文献和专利的通过引用的方式并入本文)。针对TAG-72的其它单克隆抗体命名为“CC”(结肠癌)。如Schlom等所述(通过引用的方式并入本文的美国专利第5,512,443号)，CC单克隆抗体是使用经B72.3纯化的TAG-72制备的第二代鼠单克隆抗体家族。由于其对TAG-72的结合亲合力相对较好，优选以下CC抗体：CC49、CC 83、CC46、CC92、CC30、CC11和CC15。Schlom等还制备了PCT/US99/25552公开的人源化CC49抗体和美国专利第5,892,019号公开的单链Fv(scFv)构建体的变体，每个所述专利也通过引用的方式并入本文。本领域的技术人员应理解所有前述抗体、构建体或其重组体和变体可以是合成的，并用于提供用于制备根据本发明的结合多肽的结合位点。
除以上讨论的抗TAG-72抗体外，各小组还报道了域缺失的CC49和B72.3抗体的构造和局部特征(例如，Calvo等Cancer Biotherapy，8(1)：95-109(1993)，Slavin-Chiorini等Int.J.Cancer 53：97-103(1993)和Slavin-Chiorini等Cancer.Res.55：5957-5967(1995))。因此，结合多肽可包含同样源自这些抗体的抗原结合位点、可变区或CDR。
在一个实施方案中，本发明的结合多肽包含结合CD23抗原的抗原结合位点(美国专利第6,011,138号)。在优选的实施方案中，本发明的结合多肽结合与5E8抗体相同的表位。在另一个实施方案中，本发明的结合多肽包含至少一个来自抗CD23抗体，例如5E8抗体(例如鲁昔单抗(Lumiliximab))的CDR(例如，1、2、3、4、5或6个CDR)。
在一个实施方案中，本发明的结合多肽结合CRIPTO-I抗原(WO02/088170A2或WO03/083041A2)。在一个更优选的实施方案中，本发明的结合多肽结合与B3F6抗体相同的表位。在再一个实施方案中，本发明的改变抗体包含至少一个来自抗CRIPTO-I抗体，例如B3F6抗体的CDR(例如，1、2、3、4、5或6个CDR)或可变区。
在另一个实施方案中，本发明的结合多肽结合为受体TNF(″TNFR″)超家族成员的抗原。在另一个实施方案中，本发明的结合分子结合至少一个靶标，该靶标例如通过结合细胞表面受体(如TNF家族受体)将信号转导至细胞。“转导信号”意指通过结合至细胞，结合分子例如通过调节信号转导途径将对细胞表面受体的细胞外影响转化为细胞反应。术语“TNF受体”或“TNF受体家族成员”指属于肿瘤坏死因子(″TNF″)受体超家族的任何受体。TNF受体超家族(″TNFRSF″)成员特征在于带两个或更多个半胱氨酸富集域(各～40个氨基酸)的细胞外区域排列成半胱氨酸结(见Dempsey等，CytokineGrowth Factor Rev.(2003).14(3-4)：193-209)。在结合其同源TNF配体后，TINF受体通过与称为TRAF(TNF受体相关因子)的胞质衔接蛋白直接或间接相互作用而转导信号。TRAF可诱导若干激酶级联的活化，最终导致信号传导途径的活化，如NF-κB、JNK、ERK、p38和PI3K，其反过来调节从免疫功能和组织分化到细胞凋亡的细胞过程。若干TNF受体家族成员的核苷酸和氨基酸序列在本领域是已知的并包括至少29个人源基因：TNFRSF1A(TNFR1，也称为DR1、CD120a、TNF-R-I p55、TNF-R、TNFRI、TNFAR、TNF-R55、p55TNFR、p55R或TNFR60，基因库GI第4507575号；同样见US 5,395,760)、TNFRSF1B(CD120b，也称为p75、TNF-R、TNF-R-II、TNFR80、TNFR2、TNF-R75、TNFBR或p75TNFR；基因库GI第4507577号)、TNFRSF3(淋巴毒素β受体(LTβR)，也称为TNFR2-RP、CD18、TNFR-RP、TNFCR或TNF-R-III；GI第4505038号和第20072212号)、TNFRSF4(OX40，也称为ACT35、TXGP1L或CD134抗原；GI第4507579号和第8926702号)、TNFRSF5(CD40，也称为p50或Bp50；GI第4507581号和第23312371号)、TNFRSF6(FAS，也称为FAS-R、DcR-2、DR2、CD95、APO-1或APT1；基因库GI第4507583号、第23510421号、第23510423号、第23510425号、第23510427号、第23510429号、第23510431号和第23510434号)、TNFRSF6B(DcR3、DR3；基因库GI第4507569号、第23200021号、第23200023号、第23200025号、第23200027号、第23200029号、第23200031号、第23200033号、第23200035号、第23200037号和第23200039号)、TNFRSF7(CD27，也称为Tp55或S152；基因库GI第4507587号)、TNFRSF8(CD30，也称为Ki-1或D1S166E；基因库GI第4507589号和第23510437号)、TNFRSF9(4-1-BB，也称为CD137或ILA；GI第5730095号和第728738号)、TNFRSF10A(TRAIL-R1，也称为DR4或Apo2；基因库GI第21361086号)、TNFRSF10B(TRAIL-R2，也称为DR5、KILLER、TRICK2A或TRICKB；基因库GI第22547116号和第22547119号)、TNFRSF10C(TRAIL-R3，也称为DcR1、LIT或TRID；基因库GI第22547121号)、TNFRSF 10D(TRAIL-R4，也称为DcR2或RUNDD)、TNFRSF 11A(RANK；基因库GI第4507565号；见美国专利第6,562,948、6,537,763、6,528,482、6,479,635、6,271,349、6,017,729号)、TNFRSF11B(骨保护素(OPG)，也称为OCIF或TR1；GI第38530116号、第22547122号和第33878056号)、TNFRSF12(转位链相关膜蛋白(TRAMP)，也称为DR3、WSL-1、LARD、WSL-LR、DDR3、TR3、APO-3、Fn14或TWEAKR；基因库GI第7706186号；美国专利申请公开第2004/0033225A1号)、TNFRSF12L(DR3L)、TNFRSF13B(TACI；GI第6912694号)、TNFRSF13C(BAFFR；GI第16445027号)、TNFRSF14(疱疹病毒侵入介体(HVEM)，也称为ATAR、TR2、LIGHTR或HVEA；基因库GI第23200041号、第12803895号和第3878821号)、TNFRSF16(低亲合力神经生长因子受体(LNGFR)，也称为神经营养受体或p75(NTR)；基因库GI第128156号和第4505393号)、TNFRSF17(BCM，也称为BCMA；GI第23238192号)、TNFRSF18(AITR，也称为GITR；基因库GI第4759246、23238194和23238197号)、TNFRSF19(Troy/Trade，也称为TAJ；基因库GI第23238202和23238204号)、TNFRSF20(RELT，也称为FLJ14993；GI  第21361873和23238200号)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(SOBa，也称为Tnfrh2或2810028K06Rik)和TNFRSF23(mSOB，也称为Tnfrh1)。其它TNF家族成员包括EDAR1(外异蛋白A受体，也称为Downless(DL)、ED3、ED5、ED1R、EDA3、EDA1R、EDA-A1R；基因库GI第11641231号；美国专利第6,355,782号)、XEDAR(也称为EDA-A2R；基因库GI第11140823号)和CD39(GI第2135580和765256号)。在另一个实施方案中，本发明的改变抗体结合缺乏死亡域的TNF受体家族成员。在一个实施方案中，缺乏死亡域的TNF受体参与组织分化。在更具体的实施方案中，参与组织分化的TNF受体选自LTβR、RANK、EDAR1、XEDAR、Fn14、Troy/Trade和NGFR。在另一个实施方案中，缺乏死亡域的TNF受体参与免疫调节。在更具体的实施方案中，参与免疫调节的TNF受体家族成员选自TNFR2、HVEM、CD27、CD30、CD40、4-1BB、OX40和GITR。本领域已知可提供对这些受体以及本文所述的其它靶标有特异性的结合位点的示例性抗体。例如，美国专利第6,051,228号和第6,312,693号中可发现示例性抗CD40抗体序列。
在另一个实施方案中，本发明的结合多肽结合属于TNF配体超家族的TNF配体。TNF配体结合TNF受体超家族的不同受体并显示15-25％的相互氨基酸序列同源性(Gaur等，Biochem.Pharmacol.(2003)，66(8)：1403-8)。若干TNF受体(配体)超家族(″TNFSF″)成员的核苷酸和氨基酸序列在本领域是已知的并包括至少16个人源基因：TNFSF1(也称为淋巴淋巴毒素α(LTA)、TNFβ或LT，GI第34444号和第6806893号)、TNFSF2(也称为TNF、TNFα或DIF；GI第25952111号)、TNFSF3(也称为淋巴毒素β(LTB)、TNFC或p33)、TNFSF4(也称为OX-40L、gp34、CD134L或tax转录活化糖蛋白1,34kD(TXGP1)；GI第4507603号)、TNFSF5(也称为CD40LG、IMD3、HIGM1、CD40L、hCD40L、TRAP、CD154或gp39；GI第4557433号)、TNFSF6(也称为FasL或APT1LG1；基因库GI第4557329号)、TNFSF7(也称为CD70、CD27L或CD27LG；GI第4507605号)、TNFSF8(也称为CD30LG、CD30L或CD153；GI第4507607号)、TNFSF9(也称为4-1BB-L或ILA配体；GI第4507609号)、TNFSF10(也称为TRAIL、Apo-2L或TL2；GI第4507593号)、TNFSF11(也称为TRANCE、RANKL、OPGL或ODF；GI第4507595和14790152号)、TNFSF12(也称为Fn14L、TWEAK、DR3LG或APO3L；GI第4507597和23510441号)、TNFSF13(也称为APRIL)、TNFSF14(也称为LIGHT、LTg或HVEM-L；GI第25952144和25952147号)、TNFSF15(也称为TL1或VEGI)或TNFSF16(也称为AITRL、TL6、hGITRL或GITRL；GI第4827034号)。其它TNF配体家族成员包括EDAR1和XEDAR配体(ED1；GI第4503449号；Monreal等(1998)Am J Hum Genet.63：380)、Troy/Trade配体、BAFF(也称为TALL1；GI第5730097号)和NGF配体(如NGF-β(GI第4505391号)、NGF-2/NTF3(GI第4505469号)、NTF5(GI第5453808号))、BDNF(GI第25306267、25306235、25306253、25306257、25306261、25306264号；IFRD1(GI第4504607号))。在更具体的实施方案中，TNF配体(例如，CD40L或TWEAK)参与免疫调节。
在其它实施方案中，本发明的结合多肽结合用于治疗自身免疫性或炎症性疾病或病症的分子。例如，结合多肽可结合免疫细胞(例如，B或T细胞)上存在的抗原或负责自身免疫性疾病或病症的自身抗原。与自身免疫性或炎症性病症相关的抗原可为如上所述肿瘤相关抗原。因此，肿瘤相关抗原也可为自身免疫性或炎症性相关病症。本文所使用的术语“自身免疫性疾病或病症”指受试者体内免疫系统攻击身体固有细胞导致组织破坏的病症或病状。自身免疫性疾病包括一般的自身免疫性疾病，即其中自身免疫反应在若干组织中同时发生；或器官特异性自身免疫疾病，即其中免疫反应靶向单个器官。可通过本发明的方法和组合物诊断、预防和治疗的自身免疫性疾病的实例包括但不限于克罗氏症(Crohn’s disease)、炎症性肠病(IBD)、全身性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、风湿性关节炎、古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture′ssyndrome)、格雷夫斯病(Grave′s disease)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto′sthyroiditis)、寻常型天疱疮、重症肌无力、硬皮病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、多肌炎和皮肌炎、恶性贫血、肖格伦综合征
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强直性脊柱炎、脉管炎、I型糖尿病、神经障碍、多发性硬化和由于自身免疫性疾病引起的继发症。
在其它实施方案中，本发明的结合多肽结合与炎症性疾病或病症相关的靶分子。本文所使用的术语“炎症性疾病或病症”包括由炎症，如血流量增加、水肿、免疫细胞活化(例如，增生、生成细胞因子或吞噬作用增强)至少部分引起或加重的疾病或病症。例如，本发明的结合多肽可以异常的量(例如，以利于改变(例如有益于)受试者的量)结合区域中包含或存在的炎症性因子(例如，基质金属蛋白酶(MMP)、TNFα、白细胞介素、血浆蛋白质、细胞因子、脂质代谢产物、蛋白酶、有毒基团、线粒体蛋白、凋亡蛋白、粘附分子等)。炎症性过程是活组织对损伤的反应。炎症可能是由物理性损伤、化学物质、微生物、组织坏死、癌症或其它因素引起的。急性炎症持续时间短，例如仅持续几天。然而如果持续时间较长，则可称为慢性炎症。
炎症性病症包括急性炎症性病症、慢性炎症性病症和复发性炎症性病症。尽管急性炎症性病症可能持续数周，但急性炎症性病症通常持续时间相对较短，并持续约几分钟至约一至两天。急性炎症性病症的主要特征包括血流量增加、液体和血浆蛋白质(水肿)渗出和白细胞(如嗜中性粒细胞)渗出。慢性炎症性病症通常持续时间较长，例如数周至数月至数年或甚至更长，在组织学上与淋巴细胞和巨噬细胞的存在以及血管和结缔组织的增生有关。复发性炎症性病症包括在一段时间后复发或周期性发作的病症。复发性炎症性病症的实例包括哮喘和多发性硬化。一些病症可属于一个或多个种类。炎症性病症通常特征在于发热、发红、肿胀、疼痛和功能丧失。炎症性病症的起因的实例包括但不限于微生物感染(例如，细菌、病毒和真菌感染)、物理因素(例如，烧伤、辐射和外伤)、化学因素(例如，毒素和腐蚀性物质)、组织坏死和各种免疫反应。炎症性病症的实例包括但不限于骨关节炎、类风湿性关节炎、急性感染和慢性感染(细菌、病毒和真菌)；急性支气管炎和慢性支气管炎、鼻窦炎和其它呼吸道感染，包括普通感冒；急性和慢性肠胃炎和结肠炎；急性和慢性膀胱炎和尿道炎；急性呼吸窘迫综合征；囊肿性纤维化；急性皮炎和慢性皮炎；急性结膜炎和慢性结膜炎；急性浆膜炎和慢性浆膜炎(心包炎、腹膜炎、滑膜炎、胸膜炎和腱炎)；尿毒症性心包炎；急性胆囊炎和慢性胆囊炎；急性阴道炎和慢性阴道炎；急性葡萄膜炎和慢性葡萄膜炎；药物反应；和烧伤(热、化学和电烧伤)。
在一个优选的实施方案中，本发明的结合多肽结合CD40L抗体(例如，与5C8抗体相同的表位(即，与5C8抗体竞争))。在另一个实施方案中，本发明的多肽包含至少一个抗原结合位点、一个或多个CDR(例如，1、2、3、4、5或6个CDR)，或一个或多个来自抗CD40L抗体(例如5C8抗体)的可变区(VH或VL)。跨膜蛋白质CD40L(CD154，gp39)在活化的CD4+T细胞、肥大细胞、嗜碱粒细胞、嗜酸性粒细胞、自然杀伤(NK)细胞和活化血小板上表达。CD40L对于T细胞依赖性B细胞反应很重要。CD40L先天不足的超免疫球蛋白M(IgM)综合征证明了CD40L的显著功能-同种型转换。CD40L-CD40的相互作用(在抗原呈递细胞上，如树突细胞)对于T细胞启动和T细胞依赖性体液免疫反应必不可少。因此，根据以上信息和对动物的研究认为用抗CD40L单克隆抗体(mAb)阻断CD40L-CD40相互作用是人自身免疫性疾病的可能治疗策略。可能是本发明结合多肽来源的示例性抗CD40L抗体包括美国专利第5,474,771号(通过引用的方式并入本文)中公开的鼠抗体5C8以及其人源化形式，例如，实施例中公开的Hu5C8抗体。本领域已知其它抗CD40L抗体(见例如，美国专利第5,961,974号和国际公开第WO96/23071号)。在具体的实施方案中，本发明的抗CD40L结合多肽包含5C8抗体的VH序列和/或VL序列。
在又一个实施方案中，本发明的结合多肽结合用于治疗神经疾病或病症的分子。例如，结合多肽可结合神经细胞(例如，神经元、胶质细胞)上存在的抗原。在某些实施方案中，神经障碍相关的抗原可为以上所述自身免疫性或炎症性病症。本文所使用的术语“神经疾病或病症”包括受试者体内神经系统退化的病症或病状(例如，神经变性病症)以及神经系统不能适当发育或不能在损伤后再生(如脊髓损伤)的病症。可通过本发明的方法和组合物诊断、预防或治疗的神经障碍的实例包括但不限于多发性硬化症、亨丁顿舞蹈症(Huntington’s Disease)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s Disease)、帕金森病(Parkinson’s Disease)、神经性疼痛、外伤性脑损伤、格林-巴利综合征(Guillain-Barrésyndrome)和慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)。
用于治疗神经疾病或病症且针对其可靶向本发明的结合多肽的示例性分子包括LINGO蛋白，例如，LINGO-1和LINGO-4；臂板蛋白，例如臂板蛋白-6A；死亡受体(DR)蛋白，例如DR6、TRAIN(或TAJ)蛋白；TRKA、TRKB；和NOGO蛋白。
(b)抗原结合片段
在其它实施方案中，本发明结合多肽的结合位点可包含抗原结合片段。术语“抗原结合片段”指结合抗原或与完整抗体(即，其来源的完整抗体)竞争抗原结合(即，特异性结合)的免疫球蛋白、抗体或抗体变体的多肽片段。例如，所述抗原结合片段可源自上述任一种抗体或抗体变体。可通过本领域熟知的重组或生物化学方法生成抗原结合片段。示例性抗原结合片段包括单域抗体、Fv、scFv、Fab、Fab’和(Fab’)2。
在示例性实施方案中，本发明的结合多肽包含至少一个抗原结合片段，其与变体Fc多肽的稳定Fc区的C端和/或N端可操作地连接(例如，化学轭合)或基因融合(例如，直接融合或通过多肽接头融合)。在一个示例性实施方案中，本发明的结合多肽包含通过铰链域或其部分(例如，IgG1铰链或其部分，例如，人IgG1铰链)可操作地连接至少一个稳定Fc区的N端(或C端)的抗原结合片段(例如，Fab)。示例性铰链域部分包含序列DKTHTCPPCPAPELLGG。
(c)单链结合分子
在其它实施方案中，本发明的结合分子可包含来自单链结合分子(例如，单链可变区或scFv)的结合位点。所描述用于生成单链抗体的技术(美国专利第4,694,778号；Bird，Science 242：423-442(1988)；Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988)；和Ward等，Nature 334：544-554(1989))可适于生成单链结合分子。通过氨基酸桥连接Fv区的重链片段和轻链片段形成单链抗体，从而产生单链抗体。也可使用用于装配大肠杆菌功能Fv片段的技术(Skerra等，Science 242：1038-1041(1988))。
在某些实施方案中，本发明的结合多肽包含一个或多个包含单链可变区序列或由单链可变区序列(scFv)组成的结合位点或区。单链可变区序列包含具有一个或多个抗原结合位点的单一多肽，例如，由挠性接头连至VH域的VL域。VL域和/或VH域可源自上述任一抗体或抗体变体。scFv分子可按VH-接头-VL方向或VL-接头-VH方向构建。连接构成抗原结合位点的VL域和VH域的挠性接头优选包含约10至约50个氨基酸残基。在一个实施方案中，多肽接头为甘氨酸-丝氨酸多肽接头。示例性甘氨酸/丝氨酸多肽接头为式(Gly4Ser)n，其中n为正整数(例如，1、2、3、4、5或6)。本领域已知其它多肽接头。本领域已熟知具有单链可变区序列的抗体(利如单链Fv抗体)和制备所述单链抗体的方法(见例如Ho等1989.Gene 77：51；Bird等，1988Science242：423；Pantoliano等1991.Biochemistry 30：10117；Milenic等1991.CancerResearch 51：6363；Takkinen等1991.Protein Engineering 4：837)。
在某些实施方案中，本发明的结合多肽中采用的scFv分子为稳定scFv分子。在一个实施方案中，稳定cFv分子可包含插入VH域和VL域之间的scFv接头，其中VH域和VL域通过VH域中的氨基酸和VL域中的氨基酸之间的二硫键连接。在其它实施方案中，稳定scFv分子可包含长度或组成最优化的scFv接头。在其它实施方案中，稳定scFv分子可包含有至少一个稳定氨基酸取代的VH域或VL域。在又一个实施方案中，稳定scFv分子可具有至少两个以上所列的稳定特征。稳定scFv分子具有增强的蛋白质稳定性或使与之可操作连接的结合多肽的蛋白质稳定性增强。本发明的优选scFv接头使本发明结合多肽的热稳定性比常规结合多肽至少提高约2℃或3℃。可例如对本发明的scFv分子进行比较。在某些优选的实施方案中，稳定scFv分子包含(Gly4Ser)4scFv接头和连接VH氨基酸44和VL氨基酸100的二硫键。2006年12月8日提交的美国临时专利申请第60/873,996号或2007年3月19日提交的美国专利申请第11/725,970号中描述了可在本发明结合多肽中采用的其它示例性稳定scFv分子，每个所述专利申请的全部内容通过引用的方式并入本文。
在某些示例性实施方案中，本发明的结合多肽包含至少一个scFv分子，其与基因融合Fc区(即，scFc区)的C端和/或N端可操作地连接(例如，化学轭合)或基因融合(例如，直接融合或通过多肽接头融合)。在一个示例性实施方案中，本发明的结合多肽包含至少一个scFv分子(例如，一个或多个稳定scFv分子)，其通过铰链域或其部分(例如，IgG1铰链或其部分，例如人IgG1铰链)可操作地连接至少一个基因融合Fc区的N端(或C端)。示例性铰链域部分包含序列DKTHTCPPCPAPELLGG。
在某些实施方案中，本发明的结合多肽包含通过融合两个或更多个串联的scFv分子而形成的四价结合位点或区。例如，在一个实施方案中，组合scFv分子以致第一个scFv分子在其N端可操作连接(例如，通过多肽接头(例如，甘氨酸/丝氨酸多肽接头))至少另一个具有相同或不同结合特异性的scFv分子。串联排列的scFv分子可操作地连接至少一个基因融合Fc区(即，scFc区)的N端和/或C端以形成本发明的结合多肽。
在另一个实施方案中，本发明的结合多肽包含通过将scFv分子可操作连接(例如通过多肽接头)至抗原结合片段(例如Fab片段)而形成的四价结合位点或区。所述四价结合位点或区可操作地连接至少一个基因融合Fc区(即，scFc区)的N端和/或C端以形成本发明的结合多肽。
(d)经修饰抗体
在其它方面，本发明的结合多肽可包含源自修饰形式的抗体的抗原结合位点或其部分。示例性的这种形式的抗体包括例如微型抗体、双链抗体、三链抗体、纳米抗体、骆驼抗体、Dab、四价抗体、胞内双链抗体(例如，Jendreyko等，2003.J.Biol.Chem.278：47813)、融合蛋白(例如，抗体细胞因子融合蛋白、与Fc受体的至少一部分融合的蛋白质)和双特异性抗体。其它经修饰抗体例如描述在美国专利第4,745,055号；EP 256,654；Faulkner等，Nature298：286(1982)；EP 120,694；EP 125,023；Morrison，J.Immun.123：793(1979)；Kohler等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：2197(1980)；Raso等，Cancer Res.41：2073(1981)；Morrison等，Ann.Rev.Immunol.2：239(1984)；Morrison，Science 229：1202(1985)；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851(1984)；EP 255,694；EP 266,663；和WO 88/03559。也已知经再分类的免疫球蛋白链。见例如美国专利第4,444,878号、WO 88/03565和EP 68,763及本文所引用的参考文献。
在一个实施方案中，本发明的结合多肽包含抗原结合位点或区，其为微型抗体或源自微型抗体的抗原结合位点。微型抗体为由两条多肽链组成的二聚分子，该两条多肽链各自包含通过多肽接头与CH3域或其部分融合的scFv分子。可通过使用本领域所述的方法连接scFv元件和多肽接头-CH3元件制备微型抗体(见例如美国专利5,837,821或WO 94/09817A1)。可从单独质粒分离这些元件作为限制性片段，然后连接并再克隆至适当载体(例如，表达载体)中。可通过限制性消化和DNA序列分析检验适当的组件(例如，编码单体微型抗体多肽链的开放阅读框(ORF)的组件)。在一个实施方案中，本发明的结合多肽包含微型抗体的scFv元件，其可操作地连接变体Fc多肽的至少一个稳定Fc区。在另一个实施方案中，本发明的结合多肽包括作为结合位点或区的四价微型抗体。可按与微型抗体相同的方式(除了使用多肽接头连接两个scFv分子外)构建四价微型抗体。然后将连接的scFv-scFv构建体可操作地连接至稳定Fc区以形成本发明的结合多肽。
在另一个实施方案中，本发明的结合多肽包含抗原结合位点或区，其为双链抗体或源自双链抗体的抗原结合位点。双链抗体为二聚四价分子，其各自具有多肽类似于scFv分子的多肽，但通常具有连接两可变域的短氨基酸残基接头(例如，少于10个或优选1-5个氨基酸)，以致同一多肽链上的VL域和VH域不能相互作用。相反，多肽链的VL域和VH域与另一多肽链上的VH域和VL域(分别)相互作用(见例如WO 02/02781)。在一个实施方案中，本发明的结合多肽包括双链抗体，其可操作地连接本发明Fc多肽的至少一个稳定Fc区的N端和/或C端。
在某些实施方案中，结合分子包括连接稳定Fc区的单域结合分子(例如单域抗体)。示例性单域分子包含分离的抗体重链可变域(VH)，即，无轻链可变域的重链可变域，和分离的抗体轻链可变域(VL)，即，无重链可变域的轻链可变域。本发明的结合分子中采用的示例性单域抗体包含例如Hamers-Casterman等，Nature 363：446-448(1993)，和Dumoulin等，ProteinScience 11：500-515(2002)中描述的骆驼抗体重链可变域(约118至136个氨基酸残基)。其它示例性单域抗体包含也称为
Figure BDA0000093834270000941
(Domantis Ltd.，Cambridge，UK)的单VH域或VL域。其它单域抗体包括鲨鱼抗体(例如，鲨鱼Ig-NAR)。鲨鱼Ig-NAR包含一个可变域(V-NAR)和五个C形恒定域(C-NAR)的同型二聚体，其中差异集中在延长的CDR3区，长度相差5至23个残基。在骆驼科(例如，羊驼类)中，称为VHH的重链可变区形成整个抗原结合域。骆驼VHH可变区和来自常规抗体的可变区(VH)之间的主要差别包括(a)与VHH的相应区相比，VH轻链接触面上的氨基酸更具疏水性；(b)VHH中CDR3更长；和(c)VHH中CDR1和CDR3之间二硫键出现频繁。美国专利第6.005,079号和第6,765,087号中描述了制备单域结合分子的方法，所述的两个专利通过引用的方式并入本文。包含VHH域的示例性单域抗体包括
Figure BDA0000093834270000951
(Ablynx NV，Ghent，Belgium)。
(e)非免疫球蛋白结合分子
在某些其它实施方案中，本发明的结合多肽包含一个或多个源自非免疫球蛋白结合分子的结合位点。本文所使用的术语“非免疫球蛋白结合分子”为结合位点包含来自除免疫球蛋白外的多肽，但可设计(例如，诱变处理)以赋予所需结合特异性的部分(例如，支架或骨架)的结合分子。
包含并非源自抗体分子的结合位点的结合分子的其它实例包括以下更详细讨论的受体结合位点和配体结合位点。
非免疫球蛋白结合分子可包含源自为非免疫球蛋白的免疫球蛋白超家族成员的结合位点部分(例如T细胞受体或细胞粘附蛋白(例如，CTLA-4、N-CAM、端蛋白))。这类结合分子包含保持免疫球蛋白折叠构象并且能够特异性结合靶分子的结合位点部分。在其它实施方案中，本发明的非免疫球蛋白结合分子还包含蛋白质拓扑结构不基于免疫球蛋白折叠(例如，锚蛋白重复蛋白或纤连蛋白)但仍然能够特异性结合靶标的结合位点。
可通过从具有人工多样化结合位点的结合分子文库中选择或分离靶结合变体而识别非免疫球蛋白结合分子。可使用完全随机的方法(例如，易错PCR、外显子改组或定向进化)或借助本领域公认的设计策略生成多样化文库。例如，可通过在编码结合位点的核酸的相应位置插入简并密码子、三核苷酸、随机肽或整个环随机选择通常在结合位点与其同源靶分子相互作用时涉及的氨基酸位置(见例如美国公开第20040132028号)。可通过研究与靶分子复合的结合位点的晶体结构而识别氨基酸位置的定位。供随机选择的候选位置包括结合位点的环、平面、螺旋和结合腔。在某些实施方案中，可通过与免疫球蛋白折叠的同源性识别结合位点中可能为多样化候选的氨基酸。例如，可随机选择纤连蛋白CDR样环中的残基以生成纤连蛋白结合分子文库(见例如，Koide等，J.Mol.Biol.，284：1141-1151(1998))。可随机选择的其它结合位点的部分包括平面。随机选择之后，可使多样化文库经过选择或筛选程序以获得具有所需结合特征的结合分子。例如，可通过本领域公认的方法(如噬菌体展示、酵母展示或核糖体展示)实现选择。
在一个实施方案中，本发明的结合分子包含来自纤连蛋白结合分子的结合位点。纤连蛋白结合分子(例如，包含I型、II型或III型纤连蛋白域的分子)显示CDR样环，与免疫球蛋白对比，该环并不依赖于链内二硫键。例如在WO 01/64942和美国专利第6,673,901、6,703,199、7,078,490和7,119,171号中描述了制备纤连蛋白结合多肽的方法，所述专利通过引用的方式并入本文。在一个示例性实施方案中，纤连蛋白结合多肽为
Figure BDA0000093834270000961
(AdnexusTherpaeutics，Waltham，MA)。
在另一个实施方案中，本发明的结合分子包含来自
Figure BDA0000093834270000962
(Abcam，Cambridge，MA)的结合位点。亲合体源自萄球菌蛋白A(SPA)的免疫球蛋白结合域(见例如Nord等，Nat.Biotechnol.，15：772-777(1997))。可通过对源自SPA的域(例如，域B)的SPA相关蛋白(例如，蛋白Z)进行诱变处理和选择具有所需结合亲合力的突变SPA相关多肽合成本发明中采用的亲合体结合位点。美国专利第6,740,734号和第6,602,977号以及WO 00/63243中描述了制备亲合体结合位点的其它方法，每个所述专利通过引用的方式并入本文。
在其它实施方案中，本发明的结合分子包含来自
Figure BDA0000093834270000963
(Pieris AG，Friesing，Germany)的结合位点。Anticalin(也称为脂质运载蛋白(lipocalins))是多样化β桶状蛋白家族的成员，其功能是结合其桶/环状区内的靶分子。可通过随机选择连接桶链的环状序列将脂质运载蛋白结合位点设计为结合所需靶标(见例如Schlehuber等，Drug Discov.Today，10：23-33(2005)；Beste等，PNAS，96：1898-1903(1999))。可从脂质运载蛋白家族的多肽开始获得本发明的结合分子中采用的Anticalin结合位点，脂质运载蛋白家族的多肽在与线性多肽序列的序列位置(包括大菜粉蝶(Pieris brassica)胆汁三烯结合蛋白(BBP)的氨基酸位置28至45、58至69、86至99和114至129)相对应的四个区段中突变。WO99/16873和WO 05/019254中描述了制备Anticalin结合位点的其它方法，每个所述专利通过引用的方式并入本文。
在另一个实施方案中，本发明的结合分子包含来自半胱氨酸富集多肽的结合位点。本发明实践中采用的半胱氨酸富集域通常不形成α螺旋、β折叠或β桶状结构。通常，二硫键促进域折叠成三维结构。通常，半胱氨酸富集域具有至少两个二硫键，更常见的是具有至少三个二硫键。示例性半胱氨酸富集多肽为A域蛋白质。A域(有时称“补体型重复序列”)含有约30-50个或30-65个氨基酸。在一些实施方案中，所述域包含约35-45个氨基酸，并且在某些情况下包含约40个氨基酸。在30-50个氨基酸中，存在约6个半胱氨酸残基。在六个半胱氨酸中，通常在以下半胱氨酸之间发现二硫键：C1和C3、C2和C5、C4和C6。A域构成配体结合部分。该域的半胱氨酸残基通过二硫键连接形成紧密稳定的功能独立部分。这些重复序列的集群构成配体结合域，并且差别集群可赋予关于配体结合的特异性。示例性含蛋白质的A域包含例如补体组分(例如，C6、C7、C8、C9和因子I)、丝氨酸蛋白酶(例如，肠肽酶、蛋白裂解酶和corin)、跨膜蛋白质(例如，ST7、LRP3、LRP5和LRP6)和内吞受体(例如，分拣蛋白相关受体、LDL受体、VLDLR、LRP1、LRP2和ApoER2)。例如WO 02/088171和WO 04/044011中公开了制备具有所需结合特异性的A域蛋白的方法，每个所述专利通过引用并入本文。
在其它实施方案中，本发明的结合分子包含来自重复蛋白的结合位点。重复蛋白是含小结构单元(例如，约20至约40个氨基酸残基)的连续拷贝或堆叠在一起形成邻接域的重复序列的蛋白质。可通过调节蛋白质重复序列的数量将重复蛋白修饰为适合特定靶结合位点。示例性重复蛋白包括设计的锚蛋白重复蛋白(即，
Figure BDA0000093834270000971
Molecular Partners，Zurich，Switzerland)(见例如Binz等，Nat.Biotechnol.，22：575-582(2004))或亮氨酸富集重复蛋白(即，LRRP)(见例如Pancer等，Nature，430：174-180(2004))。到目前为止确定的锚蛋白重复单元的所有三级结构共同特征在于均由β发夹、其后的两个反向平行α螺旋和末端连接重复单元和下一个重复单元的环组成。通过将重复单元堆叠成延长且弯曲的结构而形成由锚蛋白重复单元构成的域。通过在淋巴细胞成熟期间重组一系列亮氨酸富集重复基因而形成来自七鳃鳗和其它无颚纲鱼类的部分适应性免疫系统及类似抗体的LRRP结合位点。WO02/20565和WO 06/083275中描述了制备DARpin或LRRP结合位点的方法，每个所述专利通过引用的方式并入本文。
本发明的结合分子中可能采用的其它非免疫球蛋白结合位点包括源自Src同源域(例如SH2域或SH3域)、PDZ域、β内酰胺酶、高亲合力蛋白酶抑制剂或小硫化物结合蛋白支架(如蝎毒素)的结合位点。本领域已公开了制备源自这些分子的结合位点的方法，见例如Silverman等，Nat.Biotechnol.，23(12)：1493-4(2005)；Panni等，J.Biol.Chem.，277：21666-21674(2002)；Schneider等，Nat.Biotechnol.，17：170-175(1999)；Legendre等，Protein Sci.，11：1506-1518(2002)；Stoop等，Nat.Biotechnol.，21：1063-1068(2003)；和Vita等，PNAS，92：6404-6408(1995)。其它结合位点可源自选自以下各项的结合域：EGF样域、Kringle域、PAN域、Gla域、SRCR域、Kunitz/牛胰蛋白酶抑制剂域、Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂域、Trefoil(P型)域、C型血管假性血友病因子域、过敏毒素样域、CUB域、I型甲状腺球蛋白重复序列、A类LDL受体域、Sushi域、连接域、I型血小板反应蛋白域、免疫球蛋白样域、C型外源凝集素域、MAM域、A型血管假性血友病因子域、生长调节素B域、WAP型四二硫化物核心域、F5/8C型域、血液结合素域、层粘连蛋白型EGF样域、C2域、CTLA-4域和本领域普通技术人员已知的这类域以及其衍生物和/或变体。另外的非免疫球蛋白结合多肽包括
Figure BDA0000093834270000981
(Avidia，Inc.，Mountain View，CA-见国际PCT公开第WO 06/055689号和美国专利公开第2006/0234299号)、
Figure BDA0000093834270000982
(Biotech Studio，Cambridge，MA)、
Figure BDA0000093834270000983
(Evogenix，Sydney，Australia-见美国专利第7,166,697号)和
Figure BDA0000093834270000984
(Nascacell Technologies，Munich，Germany)。
ii.受体和配体的结合部分
在其它方面，本发明的结合多肽包含受体的配体结合位点和/或配体的受体结合部分，所述受体的配体结合位点和/或配体的受体结合部分可操作地连接稳定Fc区。
在某些实施方案中，结合多肽为受体的配体结合部分和/或配体的受体结合部分与稳定Fc区的融合。优选在融合之前使结合受体的配体的任何跨膜区或脂类或磷脂锚识别序列失活或将其删除。通过限制性内切酶在或靠近编码所需ORF区段的DNA的5′端和3′端处裂开编码配体或配体结合配偶体的DNA。然后容易地将所得DNA片段插入(例如，框内连接)编码基因融合Fc区的DNA。可根据经验选择进行融合的精确位点以使可溶性融合蛋白的分泌或结合特性最优化。然后将编码融合蛋白的DNA亚克隆至可转染至宿主细胞进行表达的适当表达载体中。
在一个实施方案中，本发明的结合多肽使配体或受体的结合位点(例如受体的胞外域(ECD))与稳定Fc区域结合。在一个实施方案中，配体或受体域的结合域可操作地连接(例如通过多肽接头融合)稳定Fc区的C端。也可能为N端融合。在示例性的实施方案中，可对稳定Fc区的C端或N端与稳定Fc区铰链域直接进行融合。
在某些实施方案中，受体的配体结合部分的结合位点或结合域可源自由如上所述抗体或抗体变体所结合的受体。在其它实施方案中，受体的配体结合部分源自选自以下各项的受体：免疫球蛋白(Ig)超家族的受体(例如，可溶性T细胞受体，例如，(Medigene AG，Munich，Germany))、如上所述TNF受体超家族的受体(例如，免疫粘附素的可溶性TNFα受体，例如，
Figure BDA0000093834270000992
(Wyeth，Madison，NJ))、神经胶质细胞源神经营养因子(GDNF)受体家族的受体(例如，GFRα3)、G蛋白偶联受体(GPCR)超家族的受体、酪氨酸激酶(TK)受体超家族的受体、配体门控(LG)超家族的受体、趋化因子受体超家族的受体、IL-1/Toll样受体(TLR)超家族和细胞因子受体超家族。
在其它实施方案中，配体的受体结合部分的结合位点或结合域可源自由如上所述抗体或抗体变体所结合的配体。例如，配体可结合选自以下各项的受体：免疫球蛋白(Ig)超家族的受体、TNF受体超家族的受体、G蛋白偶联受体(GPCR)超家族的受体、酪氨酸激酶(TK)受体超家族的受体、配体门控(LG)超家族的受体、趋化因子受体超家族的受体、IL-1/Toll样受体(TLR)超家族和细胞因子受体超家族。在一个示例性实施方案中，配体的受体结合部分的结合位点源自属于如上所述TNF配体超家族的配体(例如，CD40L)。在另一个实施方案中，示例性的靶分子为CD200或CD200R。
在其它示例性实施方案中，本发明的结合多肽可包含源自一种或多种以下蛋白质的一个或多个配体结合域或受体结合域：
1.细胞因子和细胞因子受体
细胞因子对淋巴细胞增生、分化和功能激活有多效性影响。可在本发明的融合蛋白中利用各种细胞因子或其受体结合部分。示例性细胞因子包括白细胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13和IL-18)、集落刺激因子(CSF)(例如粒细胞CSF(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)和单核细胞-巨噬细胞CSF(M-CSF))、肿瘤坏死因子(TNF)α和β、细胞毒素T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)和干扰素，如干扰素α、β或γ(美国专利第4,925,793号和第4,929,554号)。
细胞因子受体通常由配体特异性α链和普通β链组成。示例性细胞因子受体包括GM-CSF、IL-3(美国专利第5,639,605号)、IL-4(美国专利第5,599,905号)、IL-5(美国专利第5,453,491号)的受体、IL10受体、IFNγ(EP0240975)和TNF受体家族(例如，TNFα(例如TNFR-1(EP 417,563)、TNFR-2(EP 417,014)淋巴毒素β受体))。
2.粘附蛋白
粘附分子是使细胞相互作用的膜结合蛋白。包括白细胞归巢受体和细胞粘附分子或其受体结合部分在内的各种粘附蛋白可并入本发明的融合蛋白中。白细胞归巢受体在炎症期间在白细胞表面表达，并且包括介导结合胞外基质组分的β-1整联蛋白(例如VLA-1、2、3、4、5和6)和结合血管内皮上的细胞粘附分子(CAM)的β2-整联蛋白(例如LFA-1、LPAM-1、CR3和CR4)。示例性CAM包括ICAM-1、ICAM-2、VCAM-1和MAdCAM-1。其它CAM包括选凝素家族(包括选凝素E、选凝素L和选凝素P)的细胞粘附分子。
3.趋化因子
趋化因子为刺激白细胞向感染部位迁移的趋化蛋白，也可并入本发明的融合蛋白中。示例性趋化因子包括巨噬细胞炎症性蛋白(MIP-1-α和MIP-1-β)、中性粒细胞趋化因子和RANTES(调节表达与分泌的活化正常T细胞的趋化因子)。
4.生长因子和生长因子受体
生长因子或其受体(或其受体结合部分或配体结合部分)可并入本发明的融合蛋白中。示例性生长因子包括血管内皮生长因子(VEGF)及其同种型(美国专利第5,194,596号)；成纤维细胞生长因子(FGF)，包括aFGF和bFGF；心房钠尿因子(ANF)；肝细胞生长因子(HGF；美国专利第5,227,158号和第6,099,841号)、神经营养因子(如骨源性神经营养因子(BDNF)、神经胶质细胞源神经营养因子配体(例如，GDNF、Neuturin、Artemin和Persephin)、神经营养蛋白-3、4、5或6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神经生长因子(如NGF-β血小板来源的生长因子(PDGF)(美国专利第4,889,919、4,845,075、5,910,574和5,877,016号))；转化生长因子(如TGF-α和TGF-β(WO 90/14359))、骨诱导因子(包括骨形态发生蛋白(BMP))；胰岛素样生长因子I和II(IGF-I和IGF-II；美国专利第6,403,764号和第6,506,874号)；促红细胞生成素(EPO)；血小板生成素(TPO；干细胞因子(SCF))、血小板生成素(TPO，c-Mpl配体)和Wnt多肽(美国专利第6,159,462号)。
可用作本发明的靶向受体域的示例性生长因子受体包括EGF受体；VEGF受体(例如Flt1或Flk1/KDR)、PDGF受体(WO 90/14425)；HGF受体(美国专利第5,648,273号和第5,686,292号)和神经营养受体，所述神经营养受体包括结合NGF、BDNF和NT-3的低亲合力受体(LNGFR)(也称为p75NTR或p75)；和为受体酪氨酸激酶trk家族成员的高亲合力受体(例如trkA、trkB(EP 455,460)、trkC(EP 522,530))。
5.激素
用作本发明的融合蛋白中的靶向试剂的示例性生长激素包括肾素、人生长激素(HGH；美国专利第5,834,598号)、N-甲硫氨酰基人生长激素；牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素(PTH)；促甲状腺激素(TSH)；甲状腺素；胰岛素原和胰岛素(美国专利第5,157,021号和第6,576,608号)；促卵泡激素(FSH)；降钙素、促黄体生成激素(LH)、瘦素、胰高血糖素；铃蟾素；促生长激素；苗勒管抑制物质；松弛素和松弛素原；促性腺素关连肽；催乳素；胎盘催乳激素；OB蛋白；或苗勒管抑制物质。
6.凝血因子
用作本发明融合蛋白的靶向试剂的示例性凝血因子包括凝血因子(例如，因子V、VII、VIII、IX、X、XI、XII和XIII、血管假性血友病因子)；组织因子(美国专利第5,346,991、5,349,991、5,726,147和6,596,84号)；凝血酶和凝血酶原；纤维蛋白和纤维蛋白原；纤维蛋白溶酶和纤维蛋白溶酶原；纤维蛋白溶酶原激活物，如尿激酶或人尿或组织型纤维蛋白溶酶原激活剂(t-PA)。
III.多特异性结合多肽
在某些特定方面，本发明的结合多肽为多特异性的，即，具有至少一个结合第一分子或分子的表位的结合位点和至少一个结合第二分子或第一分子的第二表位的第二结合位点。本发明的多特异性结合分子可包含至少两个结合位点，其中至少一个结合位点源自或包括来自一个所述结合分子的结合位点。在某些实施方案中，本发明的多特异性结合分子的至少一个结合位点为抗体的抗原结合区或其抗原结合片段(例如，以上所述抗体或抗原结合片段)。
(a)双特异性分子
在一个实施方案中，本发明的结合多肽为双特异性。双特异性结合多肽可结合例如在相同靶分子或不同靶分子上的两个不同靶位点。例如，在本发明结合多肽的情况下，其双特异性变体可结合例如在相同抗原或两个不同抗原上的两个不同表位。双特异性结合多肽可用在例如诊断和治疗应用中。例如，双特异性结合多肽可用于固定酶类用于免疫测定。例如通过结合肿瘤相关分子和可检测标记二者(例如，紧密结合放射性核素的螯合剂)也可将双特异性结合多肽用于癌症的诊断和治疗中。例如通过将细胞毒性导向特异性靶标(例如通过结合病原体或肿瘤细胞和结合细胞毒素触发分子，如T细胞受体或Fcγ受体)也可将双特异性结合多肽用于人类治疗。双特异性结合多肽也可用作例如纤维蛋白溶解剂或疫苗佐剂。
双特异性结合多肽的实例包括：具有至少两条针对不同肿瘤细胞抗原的臂的双特异性结合多肽；具有至少一条针对肿瘤细胞抗原的臂和至少一条针对细胞毒素触发分子的臂的双特异性改变结合蛋白(如抗FcγRI/抗CD15、抗p185.sup.HER2/FcγRIII(CD16)、抗CD3/抗恶性B细胞(1D10)、上述抗CD3/抗p185.sup.HER2、抗CD3/抗p97、抗CD3/抗肾细胞癌、抗CD3/抗OVCAR-3、抗CD3/L-D1(抗结肠癌)、抗CD3/抗促黑素细胞激素类似物、抗EGF受体/抗CD3、抗CD3/抗CAMA1、抗CD3/抗CD19、抗CD3/MoV18、抗神经细胞粘附分子(NCAM)/抗CD3、抗叶酸结合蛋白(FBP)/抗CD3、抗泛癌相关抗原(AMOC-31)/抗CD3)；具有至少一条特异性结合肿瘤抗原的臂和至少一条结合毒素(如抗皂草毒蛋白/抗Id-1、抗CD22/抗皂草毒蛋白、抗CD7/抗皂素、抗CD38/抗皂草毒蛋白、抗CEA/抗蓖麻毒蛋白A链、抗干扰素α(IFN-α)/抗杂交瘤个体基因型、抗CEA/抗长春花属生物碱)的臂的双特异性结合多肽；用于转化酶活化前药的双特异性结合多肽(如抗CD30/抗碱性磷酸酯酶(其催化丝裂霉素磷酸盐前药转化为丝裂霉素醇))；可用作纤维蛋白溶解剂的双特异性结合多肽(如抗纤维蛋白/抗组织型纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)、抗纤维蛋白/抗尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂(uPA))；将免疫复合物靶向细胞表面受体的双特异性结合多肽(如抗低密度脂蛋白(LDL)/抗Fc受体(例如FcγRI、FcγRII或FcγRIII))；用于治疗传染性疾病的双特异性结合多肽(如抗CD3/抗单纯疱疹病毒(HSV)、抗T细胞受体：CD3复合体/抗流感、抗FcγR/抗HIV)；用于体外或体内肿瘤检测的双特异性结合多肽，如抗CEA/抗EOTUBE、抗CEA/抗DPTA、抗p185HER2/抗半抗原；作为疫苗佐剂的双特异性结合多肽(见以上Fanger等)；以及作为诊断工具的双特异性结合多肽(如抗兔IgG/抗铁蛋白、抗辣根过氧化物酶(HRP)/抗激素、抗生长激素抑制素/抗物质P、抗HRP/抗FITC、抗CEA/β抗半乳糖苷酶(见以上Nolan等))。三特异性多肽的实例包括抗CD3/抗CD4/抗CD37、抗CD3/抗CD5/抗CD37和抗CD3/抗CD8/抗CD37。
在优选的实施方案中，本发明的双特异性结合多肽具有一条结合CRIPTO-I的臂。在另一个优选的实施方案中，本发明的双特异性结合多肽具有一条结合LTβR的臂。在另一个优选的实施方案中，本发明的双特异性结合多肽具有一条结合TRAIL-R2的臂。在另一个优选的实施方案中，本发明的双特异性结合多肽具有一条结合LTβR的臂和一条结合TRAIL-R2的臂。
本发明的多特异性结合多肽对各特异性而言可为单价的或多价的。例如，本发明的结合多肽可包含与第一靶分子反应的一个结合位点和与第二靶分子反应的一个结合位点或本发明的结合多肽可包含两个与第一靶分子反应的结合位点和两个与第二靶分子反应的结合位点。
本发明的结合多肽可具有至少两种来自配体或受体的两个或更多个结合域的结合特异性。其可装配为基本上如同WO 89/02922(1989年4月6日公开)、EP 314,317(1989年5月3日公开)和美国专利第5,116,964号(1992年5月2日公布)中公开的异质二聚体、异质三聚体或异质四聚体。实例包括CD4-IgG/TNF受体IgG和CD4-IgG/L-选凝素IgG。最后提到的分子结合了淋巴细胞归巢受体(LHR，选凝素L)的淋巴结结合功能和CD4的HIV结合功能，并在预防或治疗HIV感染、相关病症获得应用，或用作诊断剂。
(b)含scFv的多特异性结合分子
在一个实施方案中，本发明的多特异性结合分子为包括至少一个scFv分子(例如以上所述scFv分子)的多特异性结合分子。在其它实施方案中，本发明的多特异性结合分子包括两个scFv分子，例如双特异性scFv(双scFv)。在某些实施方案中，scFv分子为常规scFv分子。在其它实施方案中，scFv分子为以上所述稳定scFv分子。在某些实施方案中，通过连接scFv分子(例如，稳定scFv分子)和包括scFc分子的结合分子支架生成多特异性结合分子。在一个实施方案中，原分子选自以上所述结合分子，并且scFc分子和原结合分子具有不同的结合位点。例如，本发明的结合分子可包括与第二scFv分子结合的具有第一结合特异性的scFv分子或赋予第二结合特异性的非scFv结合分子。在一个实施方案中，本发明的结合分子为与稳定scFv分子融合的天然存在的抗体。
当稳定scFv连接亲本结合分子时，稳定scFv分子的连接优选使结合分子的热稳定性升高至少约2℃或3℃。在一个实施方案中，本发明含scFv的结合分子与常规结合分子相比热稳定性升高1℃。在另一个实施方案中，本发明的结合分子与常规结合分子相比热稳定性升高2℃。在另一个实施方案中，本发明的结合分子与常规结合分子相比热稳定性升高4℃、5℃、6℃。
在一个实施方案中，本发明的多特异性结合分子包括至少一个scFv(例如2、3或4个scFv，例如，稳定scFv)。在USSN 11/725,970可发现关于scFv分子的更多详情，该专利通过引用的方式并入本文。
在一个实施方案中，本发明的结合分子为多特异性多价结合分子，其具有至少一个具有第一结合特异性的scFv片段和至少一个具有第二结合特异性的scFv。在优选的实施方案中，至少一个scFv分子是稳定的。
在另一个实施方案中，本发明的结合分子为scFv四价结合分子。在优选的实施方案中，至少一个scFv分子是稳定的。
(c)多特异性结合分子片段
在某些实施方案中，本发明的结合多肽可包含来自多特异性结合分子片段的结合位点。多特异性结合分子片段包含双特异性Fab2或多特异性(如三特异性)Fab3分子。例如，多特异性结合分子片段可包含有不同特异性的化学轭合的Fab多聚体(例如二聚体、三聚体或四聚体)或scFv分子。
(d)串联可变域结合分子
在其它实施方案中，本发明的多特异性结合分子可包括含串联抗原结合位点的结合分子。例如，可变域可包含设计为包含至少两个(例如两个、三个、四个或更多个)直接串联融合或连接的可变重链域(VH域)的抗体重链和设计为包含至少两个(例如两个、三个、四个或更多个)直接串联融合或连接的可变轻链域(VL域)的抗体轻链。VH域与相应VL域相互作用形成一连串抗原结合位点，其中至少两个结合位点结合不同的表位。串联可变域结合分子可包含两条或更多条重链或轻链，并且为高价(例如二价或四价)。本领域已知产生串联可变域结合分子的方法，见例如WO 2007/024715。
(e)双特异性结合分子
在其它实施方案中，本发明的多特异性结合分子可包含具有双结合特异性的单一结合位点。例如，本发明的双特异性结合分子可包含与两个表位交叉反应的结合位点。本领域已知该领域公认的生成双特异性结合分子的方法。例如，可通过筛选结合第一表位的结合分子并反筛选能够结合第二表位的已分离结合分子来分离双特异性结合分子。
(f)多特异性融合蛋白
在另一个实施方案中，本发明的多特异性结合分子为多特异性融合蛋白。本文所使用的短语“多特异性融合蛋白”指有至少两种结合特异性且进一步包含scFc的融合蛋白(如上文定义)。多特异性融合蛋白可装配成基本上如WO 89/02922(1989年4月6日公开)、EP 314,317(1989年5月3日公开)、美国专利第5,116,964号(1992年5月2日公布)中公开的异质二聚体、异质三聚体或异质四聚体。优选的多特异性融合蛋白是双特异性的。在某些实施方案中，多特异性融合蛋白的至少一种特异性包括scFv，例如，稳定scFv。
本领域的技术人员可使用常规重组DNA技术开发各种其它多价抗体构建体，例如如PCT国际申请第PCT/US86/02269号；欧洲专利申请第184,187号；欧洲专利申请第171,496号；欧洲专利申请第173,494号；PCT国际公开第WO 86/01533号；美国专利第4,816,567号；欧洲专利申请第125,023号；Better等(1988)Science 240：1041-1043；Liu等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3439-3443；Liu等(1987)J.Immunol.139：3521-3526；Sun等1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：214-218；Nishimura等(1987)CancerRes.47：999-1005；Wood等(1985)Nature 314：446-449；Shaw等(1988)J.Natl.Cancer Inst.80：1553-1559)；Morrison(1985)Science 229：1202-1207；Oi等(1986)BioTechniques 4：214；美国专利第5,225,539号；Jones等(1986)Nature321：552-525；Verhoeyan等(1988)Science 239：1534；Beidler等(1988)J.Immunol.141：4053-4060；以及Winter和Milstein，Nature，349，第93-99页(1991)中所述。优选通过连接非人源抗原结合域和人源恒定域使非人源抗体“人源化”(例如Cabilly等，美国专利第4,816,567号；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81，第6851-55页(1984))。
以下公开物中描述了可用于制备多价抗体构建体的其它方法：Ghetie，Maria-Ana等(2001)Blood 97：1392-1398；Wolff，Edith A.等(1993)CancerResearch 53：2560-2565；Ghetie，Maria-Ana等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94：7509-7514；Kim，J.C.等(2002)Int.J.Cancer  97(4)：542-547；Todorovska，Aneta等(2001)Journal of Immunological Methods 248：47-66；Coloma M.J.等(1997)Nature Biotechnology 15：159-163；Zuo，Zhuang等(2000)ProteinEngineering(Suppl.)13(5)：361-367；Santos A.D.，等(1999)Clinical CancerResearch 5：3118s-3123s；Presta，Leonard G.(2002)Current PharmaceuticalBiotechnology 3：237-256；van Spriel，Annemiek等(2000)Review ImmunologyToday 21(8)391-397。
(VII).稳定Fc多肽的生成
可在表达编码多肽氨基酸序列的核酸分子的细胞中合成或表达本发明的稳定Fc多肽。可使用遗传密码选择编码序列，并任选地针对所选表达系统对编码序列进行优化。
例如，已选择稳定性增强的变体Fc多肽，例如，嵌合IgG抗体、人源IgG抗体、人源化IgG抗体或合成IgG抗体，多种方法可用于生成此类多肽。由于密码简并性，多种核酸序列将编码各多肽氨基酸序列。可通过从头固相DNA合成或PCR诱变早先制备好的编码Fc多肽的多聚核苷酸生成所需核酸序列。寡核苷酸介导的诱变是一种用稳定突变取代编码多肽氨基酸的密码子的方法。例如，通过杂交编码所需突变的寡核苷酸将靶向多肽DNA变为单链DNA模板。杂交后，用DNA聚合酶合成模板的第二完整互补链，所述互补链合并寡核苷酸引物并编码变体多肽DNA中的所选改变。在一个实施方案中，基因工程，例如基于引物的PCR诱变足以改变如本文定义的用于生成编码多肽的多核苷酸的第一氨基酸，当在真核细胞中表达时所述多肽此时具有稳定Fc区，例如，稳定的无糖基化Fc区。
本发明的变体Fc多肽通常包含抗体恒定区(Fc)的至少一部分，通常为人免疫球蛋白的至少一部分。一般地，抗体将含轻链恒定区和重链恒定区。重链恒定区通常包括源自相同或不同同种型抗体的CH1区、铰链区、CH2区和CH3区。然而，应理解，本文所述抗体包括具有所有类型恒定区的抗体(包括IgM、IgG、IgD和IgE)和同种型的抗体(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。在一个实施方案中，使用人源同种型IgG1。在另一个实施方案中，使用源同种型人IgG4。在一个实施方案中，使用嵌合Fc区。轻链恒定区可为λ或κ。人源化抗体可包含来自不止一种种类或同种型的序列。抗体可表达为含两条轻链和两条重链的四聚体，表达为单独的重链、轻链，表达为Fab、Fab′F(ab′)2和Fv或表达为其中重链和轻链可变域通过间隔区连接的单链Fv抗体(scFv)。
本文描述了测定包含Fc区的多肽(例如抗体)的效应子功能的方法，并且该方法包括基于细胞的桥联测定以测定经修饰Fc区结合Fc受体的能力变化。其它结合测定可用于测定Fc区结合补体蛋白(例如，C1q补体蛋白)的能力。本领域描述了另外测定经修饰Fc区的效应子功能的方法。
VIII.包含功能部分的含Fc的稳定多肽
可进一步修饰本发明含Fc的变体多肽以提供所需效应。例如，可将变体Fc多肽的Fc区连接(例如，共价连接)至另外的部分，即功能部分，例如，阻断部分、可检测部分、诊断部分和/或治疗部分。以下首先描述了示例性功能部分，然后描述了将此类功能部分连接至不同氨基酸侧链的有用化学过程。
有用功能部分的实例包括但不限于阻断部分、可检测部分、诊断部分和治疗部分。
示例性阻断部分包括空间体积足够大和/或电荷足够多的部分，以致例如通过抑制Fc区结合受体或补体蛋白的能力而降低效应子功能。优选阻断部分包括聚亚烷基二醇部分，例如，PEG部分和优选PEG-马来酰亚胺部分。优选聚乙二醇化部分(或相关聚合物)可为例如聚乙二醇(″PEG″)、聚丙二醇(″PPG″)、聚氧烯化丙三醇(″POG″)和其它聚氧烯化多元醇、聚乙烯醇(″PVA″)和其它聚环氧烷、聚氧烯化山梨糖醇或聚氧烯化葡萄糖。只要有至少一个活化砜部分，聚合物可为均聚物、无规或嵌段共聚物、基于以上所列单体的三聚物、直链或支链，被取代的或未被取代的。聚合部分可为任意长度或分子量，但这些特征可影响生物性质。药物应用中尤其对降低清除率有用的聚合物平均分子量为2,000至35,000道尔顿。另外，如果两组连至聚合物，一端一组，聚合物的长度可影响两组之间的有效距离和其它空间关系。因此，本领域的技术人员可改变聚合物长度以优化或赋予所需生物活性。由于种种原因，PEG可用于生物应用。PEG通常澄清、无色、无味、可溶于水、热稳定，对多种化学试剂呈惰性，不水解且无毒。聚乙二醇化可通过增加分子的表观分子量而提高分子的药代动力学性能。皮下或全身施用之后，表观分子量增加使身体的清除率降低。在许多情况下，聚乙二醇化可降低抗原性和免疫原性。另外，聚乙二醇化可提高生物活性分子的溶解性。
通常可使用乙二醇化抗体和抗体片段治疗可通过施用本文所述抗体和抗体片段而缓和或调节的病状。通常，与非乙二醇化无糖基化抗体和抗体片段相比，乙二醇化无糖基化抗体和抗体片段的半衰期延长。乙二醇化无糖基化抗体和抗体片段可单独使用、一起使用或与其它药物组合物使用。
可用于本发明的方法和多肽的可检测部分的实例包括荧光部分、放射性同位素部分、不透辐射部分等，例如可检测标记，如生物素、荧光团、发色团、自旋共振探针或放射性同位素标记。示例性荧光团包括荧光染料(例如荧光素、若丹明等)和其它发光分子(例如鲁米那)。荧光团可对环境敏感以致如果荧光团位于靠近经修饰的蛋白质中的一个或多个残基的位置，则荧光团的荧光改变，其中该经修饰的蛋白质结合物质(如丹酰探针)后经历结构变化。示例性放射性同位素标记包括含具有一个或多个低灵敏核(13C、15N、2H、125I、123I、99Tc、43K、52Fe、67Ga、68Ga、111In等)的原子的小分子。本领域已知其它有用部分。
可用于本发明的方法和多肽的诊断部分的实例包括适于揭示疾病或病症的存在的可检测部分。通常，诊断部分允许测定与疾病或病症相关的分子(例如，靶向肽、蛋白质或蛋白质类)是否存在或其含量。这种诊断方法也适于预测和/或诊断疾病或病症及其进展。
可用于本发明的方法和多肽的治疗部分的实例包括例如抗炎剂、抗癌剂、抗神经变性剂和抗感染剂。功能部分也可具有一种或多种上述功能。
示例性治疗剂包括有高能电离辐射的放射性核素，其能够引起核DNA中多处链断裂，因此适于诱导细胞(例如癌症细胞)死亡。示例性高能放射性核素包括：90Y、125I、131I、123I、111In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re和188Re。这些同种型通常产生路径长度较短的高能α或β微粒。这种放射性核素杀伤与之靠近的细胞，例如缀合物已经附接或进入的赘生性细胞。放射性核素对非定域细胞有很小或没有影响，且基本上无免疫原性。
示例性治疗剂还包括细胞毒性剂，如细胞抑制剂(例如烷化剂、DNA合成抑制剂、DNA嵌入剂或交联剂或DNA-RNA转录调节剂)、酶抑制剂、基因调节剂、细胞毒性核苷、微管蛋白结合剂、激素和激素拮抗剂、抗血管生成剂等。
示例性治疗剂还包括烷化剂，如蒽环霉素家族药物(例如阿霉素、洋红霉素、环孢菌素A、氯喹、甲氨喋吟、光神霉素、泊非罗霉素、链黑菌素、泊非罗霉素、蒽二酮和氮丙啶)。在另一个实施方案中，化学治疗剂部分为细胞生长抑制剂，如DNA合成抑制剂。DNA合成抑制剂的实例包括但不限于氨甲喋呤和二氯氨甲喋吟、3-氨基-1，2，4-苯并三嗪1，4-二氧化物、氨喋呤、胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷、5-氟-5′-脱氧尿苷、5-氟尿嘧啶、丙氧鸟苷(ganciclovir)、羟基脲、放线菌素D和丝裂霉素C。示例性DNA嵌入剂或交联剂包括但不限于博莱霉素、卡铂、卡氮芥、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、顺二氯二氨铂(II)(顺铂)、美法仑、米托蒽醌和奥沙利铂(oxaliplatin)。
示例性治疗剂还包括转录调节剂，如放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、高三尖杉酯碱和脱甲氧柔红霉素。其它与本发明兼容的示例性细胞生长抑制剂包括安莎霉素苯醌、醌型衍生物(例如喹诺酮、染料木黄酮、bactacyclin)、白消安、异环磷酰胺、氮芥、三亚胺醌、地吖醌(diaziquone)、卡波醌、吲哚蒽醌EO9(indoloquinone)、二吖丙啶基-甲基苯醌DZQ、三亚乙基磷酰胺和亚硝基脲化合物(如卡氮芥、洛莫司汀(lomustine)、司莫司汀(semustine))。
示例性治疗剂还包括细胞毒性核苷，例如阿糖腺苷、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、5-氟尿嘧啶、氟达拉滨(fludarabine)、氟脱氧尿苷、呋氟尿嘧啶和6-巯基嘌呤；微管蛋白结合剂，如紫杉烷类(如紫杉醇、紫杉萜(docetaxel)、紫杉烷)、诺考达唑(nocodazole)、利索新(rhizoxin)、多拉司他汀(dolastatin)(如多拉司他汀-10、11或15)、秋水仙碱和秋水仙碱甙(如ZD6126)、考布他汀(combretastatin)(如考布他汀A-4、AVE-6032)和长春花生物碱(如长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨(诺维本))；抗血管生成化合物，如血管抑素K1-3、DL-α-二氟甲基鸟氨酸、内皮抑素、烟曲霉素、染料木黄酮、二甲胺四环素、十字胞碱和(±)-沙利度胺(thalidomide)。
示例性治疗剂还包括激素和激素拮抗剂，如皮质类甾醇(例如强的松)、孕酮(例如羟孕酮或酸甲羟孕酮(medroprogesterone))、雌激素(例如已烯雌酚)、抗雌激素剂(如他莫昔芬(tamoxife))、雄激素(例如睾酮)、芳香酶抑制剂(例如氨鲁米特(aminogluthetimide))、17-(烯丙基氨基)-17-去甲氧格尔德霉素、4-氨基-1，8-萘二甲酰亚胺、洋芹甙、布雷菲德菌素A(brefeldinA)、西咪替丁、二氯亚甲基二膦酸、醋酸亮丙瑞林(leuprolid)(亮丙瑞林(leuprorelin))、促黄体生成激素释放激素、p52抑制素(pifithrin-α)、雷帕霉素、性激素结合球蛋白和毒胡萝卜素(thapsigargin)。
示例性治疗剂还包括酶抑制剂，如S(+)-喜树碱、姜黄色素、(-)-鱼藤素、5，6-二氯苯-咪唑、1-β-D-呋喃核糖苷、依托泊苷、福美坦(formestan)、福司曲星(fostriecin)、hispidin、2-亚氨基-咪唑烯乙酸(环肌酸)、洛伐他汀(mevinolin)、曲古抑菌素A(trichostatin A)、酪氨酸磷酸化抑制剂AG34(tyrphostin AG 34)和酪氨酸磷酸化抑制剂AG 879(tyrphostin AG 879)。
示例性治疗剂还包括基因调节剂，如5-氮杂-2′-脱氧胞苷、5-氮杂胞苷、胆骨化醇(维生素D3)、4-羟基三苯氧胺、褪黑激素、米非司酮(mifepristone)、雷洛昔芬(raloxifene)、反式视黄醛(维生素A醛)、视黄酸、维生素A酸、9-顺式视黄酸、13-顺式视黄酸、视黄醇(维生素A)、他莫昔芬和曲格列酮(troglitazone)。
示例性治疗剂还包括细胞毒性剂，如蝶啶药物家族、diynene和鬼臼毒素(podophyllotoxin)。这些类别中尤其有用的成员包括例如甲氨喋吟、鬼臼毒素或鬼臼毒素衍生物(如依托泊苷或磷酸依托泊苷)、异长春碱、长春地辛、环氧长春碱等。
与本文的教导兼容的其它细胞毒素包括澳瑞他汀(auristatins)(例如澳瑞他汀E和一甲基澳瑞他汀E)、刺孢霉素、短杆菌肽D、美登醇(如美登素)、新制癌菌素、托泊替康(topotecan)、紫杉烷类、细胞松弛素B、溴化乙锭、依米丁(emetine)、替尼泊甙(tenoposide)、秋水仙素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、心得安(propranolol)、嘌呤霉素及其类似物或同系物。
本领域已知其它类型的功能部分，其可易于根据本文所包含的教导用于本发明的方法和组合物。
本领域已知将上述可为小分子、核酸、聚合物、肽、蛋白质、化学治疗剂或其它类型的分子的功能部分连接至特定氨基酸侧链的化学过程(要详细查看特异性接头，见例如Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，AcademicPress(1996))。
IX.稳定Fc多肽的表达
优选通过重组表达编码本发明多肽的核酸分子而生成本发明的变体Fc多肽。在一个实施方案中，载体中存在编码本发明稳定Fc多肽的核酸分子。在抗体的情况下，将编码任选地连接恒定区的轻链可变区和重链可变区的核酸插入表达载体中。可在相同表达载体或不同表达载体中克隆轻链和重链。编码免疫球蛋白链的DNA片断可操作地连接确保免疫球蛋白多肽表达的表达载体中的控制序列。表达控制序列包括但不限于启动子(例如，天然相关启动子或异源启动子)、信号序列、增强子元件和转录终止序列。优选地，表达控制序列为能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统。一旦将载体并入适合宿主，宿主就保持在适于高水平表达核苷酸序列以及收集和提纯交叉反应抗体的条件下。
这些表达载体通常在宿主生物体内可作为附加体或宿主染色体DNA的主要部分而复制。通常，表达载体含有选择标记(例如，氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性或新霉素抗性)以便检测那些经所需DNA序列转化的细胞(见例如Itakura等，美国专利第4,704,362号)。
大肠杆菌是一种尤其可用于克隆本发明的多聚核苷酸(例如DNA序列)的原核宿主。其它适于使用的微生物宿主包括杆菌(如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilus))和其它肠杆菌(如沙门氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia))和各种假单胞菌属(Pseudomonas)。
其它微生物(如酵母)也可用于表达。酵母属(Saccharomyces)和毕赤酵母属(Pichia)为示例性酵母宿主，其中适当载体具有所需的表达控制序列(例如，启动子)、复制起点、终止序列等。典型的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶和其它糖酵解酶。可诱导的酵母启动子还包括来自醇脱氢酶、异细胞色素C和负责利用甲醇、麦芽糖和半乳糖的酶的启动子。
除了微生物外，哺乳动物组织培养物也可用于表达并生成本发明的多肽(例如，编码免疫球蛋白或其片段的多聚核苷酸)。见Winnacker，From Genesto Clones，VCH Publishers，N.Y.，N.Y.(1987)。实际上优选真核细胞，因为本领域已开发了若干能够分泌异源蛋白质(例如，完整免疫球蛋白)的适合宿主细胞系，并且适合的宿主细胞系包括CHO细胞系、各种COS细胞系、海拉(HeLa)细胞、293细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞和杂交瘤。这些细胞的表达载体可包含表达控制序列，如复制起点、启动子和增强子(Queen等，Immunol.Rev.89：49(1986))，和必要的信息处理位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止序列。优选的表达控制序列为源自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒等的启动子。见Co等，J.Immunol.148：1149(1992)。在优选的实施方案中，应理解，本发明的多肽为成熟多肽，即，所述多肽缺乏信号序列。
或者，编码本发明的变体Fc多肽的序列可并入转基因中，以引入转基因动物的基因组并随后在转基因动物乳中表达(见例如，Deboer等，US5,741,957，Rosen，US 5,304,489和Meade等，US 5,849,992)。适合的转基因包括与来自乳腺特异性基因的启动子和增强子可操作连接的轻链和/或重链，如酪蛋白或β乳球蛋白的编码序列。
可通过随细胞宿主类型而不同的熟知方法将含目标多聚核苷酸序列的载体(例如，重链和轻链编码序列和表达控制序列)转移至宿主细胞。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理、电穿孔、脂质转染、基因枪技术或基于病毒的转染可用于其它细胞宿主。(通常见Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press，第2版，1989))。其它用于转化哺乳动物细胞的方法包括使用聚凝胺、原生质体融合、脂质体、电穿孔和显微注射(通常见以上Sambrook等)。为了产生转基因动物，可将转基因显微注射至已受精的卵母细胞中，或可并入胚胎干细胞的基因组和已转移到无核卵母细胞中的这类细胞的核中。
可使用单个载体或两个载体表达本发明的多肽。例如，在单独表达载体上克隆抗体重链和轻链时，共转染载体以获得完整免疫球蛋白的表达和装配。一旦表达，可根据本领域的标准过程提纯全抗体、其二聚体、单个轻链和重链或本发明的其它免疫球蛋白形式，所述标准过程包括硫酸铵沉淀、亲和层析柱、柱层析法、HPLC提纯、凝胶电泳等(通常见Scopes，ProteinPurification(Springer-Verlag，N.Y.，(1982))。优选至少约90-95％同质性、最优选98-99％或更高同质性的大体上纯的免疫球蛋白供制药用途。
因为本发明的稳定Fc分子抵抗生产规模扩大时发生的搅拌，所以本发明的稳定Fc分子特别适于大规模生产。另外，在海运和储存期间，这些分子是稳定的。
在一个实施方案中，本发明涉及大规模生产包含稳定Fc融合蛋白的多肽的方法，所述方法包括：
(a)将至少一个稳定的Fc部分基因融合至多肽，以形成稳定的融合蛋白；
(b)用编码稳定的融合蛋白的核酸分子转染哺乳动物宿主细胞；
(c)在使得稳定的融合蛋白表达的条件下，在10L或更多的培养基中培养步骤(b)中的宿主细胞；
从而生成稳定的融合蛋白。
在另一个实施方案中，所述方法包括：在使得稳定的融合蛋白表达的条件下，在10L或更多的培养基中培养表达编码稳定的融合蛋白的核酸分子的宿主细胞；和从培养基中回收稳定的融合蛋白。任选地，可采用一个或多个提纯步骤获得所需纯度的组合物(例如，其中来自无关蛋白、聚集体、非活性形式的分子的污染物减少)。
X.预防方法、诊断方法和治疗方法
本发明还涉及适于预防、诊断或治疗疾病的稳定Fc多肽的用途，所述疾病包括例如期望使用治疗性抗体结合抗原而抑制引发效应子功能的病症。
因此，在某些实施方案中，本发明的变体Fc多肽用于预防或治疗免疫失调，包括例如肾小球性肾炎、硬皮病、肝硬化、多发性硬化、狼疮性肾炎、动脉粥样硬化、炎症性肠疾病或类风湿性关节炎。在另一个实施方案中，本发明的变体Fc多肽可用于治疗或预防炎症性病症，包括但不限于阿尔茨海默氏病、重症哮喘、特应性皮炎、恶病质、CHF局部缺血、冠状动脉再狭窄、克罗恩氏病(Crohn′s disease)、糖尿病性肾病、淋巴瘤、牛皮癣、纤维变性/辐射诱导、幼年型关节炎、中风、外伤引起的脑部或中枢神经系统炎症和溃疡性结肠炎。
可用本发明的变体Fc多肽预防或治疗的其它炎症性病症包括由于角膜移植、慢性阻塞性肺病、丙型肝炎、多发性骨髓瘤和骨关节炎引起的炎症。
在另一个实施方案中，本发明的变体Fc多肽可用于预防或治疗瘤形成，包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、卡波西肉瘤(Kaposi′s sarcoma)、黑素瘤、卵巢癌、小细胞肺癌、胃癌、白血病/淋巴瘤和多发性骨髓瘤。另外的瘤形成病状包括子宫颈癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、非扁平细胞肺癌和前列腺癌。
在另一个实施方案中，本发明的变体Fc多肽可用于预防或治疗神经变性病症，包括但不限于阿尔茨海默氏病、中风和脑外伤或中枢神经系统损伤。另外的神经变性病症包括ALS/运动神经元疾病、糖尿病周围神经病变、糖尿病性视网膜病、亨丁顿舞蹈病(Huntington′s disease)、黄斑变性和帕金森氏病。
在又一个实施方案中，本发明的变体Fc多肽可用于预防或治疗由病原体(例如，病毒、原核生物或真核生物)引起的感染。
在临床应用中，通过受试者表现出所述疾病或病症的至少一种病征或症状即被鉴定为患有一种上述病状或处于发作一种上述病状的风险。以足够量施用至少一种本发明的变体Fc多肽或包含至少一种变体Fc多肽的组合物以治疗例如上述疾病或病症的至少一种症状。在一个实施方案中，受试者被鉴定为表现出至少一种与有害CD154活性(也称为CD40配体或CD40L；见例如Yamada等，Transplantation，73：S36-9(2002)；Schonbeck等，Cell.Mol.LifeSci.42：4-43(2001)；Kirk等，Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Sci.356：691-702(2001)；Fiumara等，Br.J.Haematol.113：265-74(2001)；和Biancone等，Int.J.Mol.Med.3(4)：343-53(1999))相关的疾病或病症的病征或症状。
因此，在对受试者产生有利治疗反应的条件下，本发明的变体Fc多肽适于作为治疗性免疫药剂对受试者施用，例如，适于预防或治疗如本文所述的疾病或病症。
本发明的治疗剂通常大体上纯净，不含有害污染物。这意味着药剂的纯度通常为至少约50％w/w(重量比)，且基本上不含干扰蛋白和污染物。有时药剂的纯度为至少约80％w/w，更优选为至少90％w/w或约95％w/w。然而，使用例如本文所述常规蛋白质提纯技术可获得至少99％w/w的同质肽。
可对无症状的受试者和当前表现出疾病症状的受试者使用该方法。
另一方面，本发明的特征在于将变体Fc多肽和药物载体一起作为药物组合物施用。或者，可通过施用编码多肽的多聚核苷酸对受试者施用变体Fc多肽。在Fc多肽为抗体时，可表达多聚核苷酸以生成抗体的重链或轻链或其二者。在某些实施方案中，表达多聚核苷酸以在受试者体内生成重链和轻链。在示例性实施方案中，监测受试者血液内所施用的抗体的含量。
因此，本发明满足了对预防或改善免疫病状(例如，CD154相关的免疫病状)的治疗方案的长期需要。
还应理解，本发明的抗体适于诊断或研究应用，尤其适于例如包括其中需要效应子功能降低的基于细胞的测定的诊断或研究应用。
XI.用于测试Fc多肽疗效的动物模型
可对需要例如Fc多肽治疗的非人类哺乳动物施用本发明的抗体，作兽医用或作为人类疾病(例如，以上所述免疫性疾病或病状)的动物模型。关于后者，这种动物模型可用于评估本发明抗体的疗效(例如，测试效应子功能、剂量和施用时程)。
可用于评估本发明Fc多肽用于预防或治疗类风湿性关节炎(RA)的疗效的动物模型的实例包括佐剂性诱导性RA、胶原诱导RA和胶原mAb诱导性RA(Holmdahl等，(2001)Immunol.Rev.184：184；Holmdahl等，(2002)AgeingRes.Rev.1：135；Van den Berg(2002)Curr.Rheumatol.Rep.4：232)。
可用于评估本发明抗体或抗原结合片段用于预防或治疗炎症性肠病(IBD)的疗效的动物模型的实例包括TNBS诱导性IBD、DSS诱导性IBD和(Padol等(2000)Eur.J.Gastrolenterol.Hepatol.12：257；Murthy等(1993)Dig.Dis.Sci.38：1722)。
可用于评估本发明抗体或抗原结合片段用于预防或治疗肾小球性肾炎的疗效的动物模型的实例包括抗GBM诱导性肾小球性肾炎(Wada等(1996)Kidney Int.49：761-767)和抗thy1诱导性肾小球性肾炎(Schneider等(1999)Kidney Int.56：135-144)。
可用于评估本发明变体Fc多肽用于预防或治疗多发性硬化症的疗效的动物模型的实例包括实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)(Link和Xiao(2001)Immunol.Rev.184：117-128)。
动物模型也可用于评估本发明变体Fc多肽用于预防或治疗CD154相关病状(如系统性红斑狼疮(SLE))的疗效，例如可使用MRL-Faslpr小鼠(以上Schneider；Tesch等(1999)J.Exp.Med.190)。
XII.治疗方案和剂量
在预防性应用中，对患有可用具有Fc区的多肽治疗的病症(例如，免疫系统病症)的受试者施用足够量的药物组合物或药剂以消除或降低风险、减轻严重性或推迟病症的发作，包括病症发展期间存在的病症的生物化学、组织学和/或行为症状、其并发症和中间病理表型。在治疗应用中，对怀疑患有或已经患有这种病症的受试者施用足够量的组合物或药剂以治疗或至少部分抑制所述病症的症状(生物化学、组织学和/或行为症状)，包括病症发展期间的并发症和中间病理表型。本发明的多肽尤其可用于调节血液中存在的细胞表面抗原的生物活性，其中所治疗或预防的疾病至少部分因抗原的异常高或低的生物活性引起。
在一些方法中，施用药剂降低或消除免疫病症，例如与CD154活性有关的炎症。将足以实现治疗性或预防性治疗的量定义为治疗或预防有效剂量。在预防方案和治疗方案中，通常施用若干剂量的药剂直至达到足够的免疫反应。
治疗上述病状的本发明组合物的有效剂量因许多不同因素而变化，这些因素包括施用方式、靶位点、受试者的生理状态、受试者为人或动物、施用的其它药剂和治疗是预防性还是治疗性。通常，受试者为人类，但也可治疗包括转基因哺乳动物在内的非人类哺乳动物。
对于用变体Fc多肽的被动免疫法，剂量范围为约0.0001mg/kg至100mg/kg宿主体重，更常为0.01mg/kg至20mg/kg宿主体重。例如，剂量可为1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围内，优选为至少1mg/kg。可对受试者每天、隔天、每周或根据经验分析确定的任何其它时间表施用此剂量。示例性治疗要求长期(例如至少六个月)施用多剂量。另外的示例性治疗方案要求每两周施用一次或每月施用一次或每3至6个月施用一次。示例性剂量施用时间表包括连续数天施用1-10mg/kg或15mg/kg，隔天施用30mg/kg或每周施用60mg/kg。在一些方法中，同时施用具有不同结合特异性的两种或更多种单克隆抗体，在这种情况下，施用的每种抗体的剂量在所示范围之内。
在多种情况下通常施用多肽。单次剂量之间的间隔可为每周、每月或每年。在一些方法中，调整剂量以达到1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，并且在一些方法中为25-300μg/ml。或者，可将多肽作为缓释制剂进行施用，这种情况下，需要低施用频率。剂量和频率因受试者体内抗体的半衰期而不同。通常，人源抗体显示的半衰期最长，其次是人源化抗体、嵌合抗体和非人源抗体。
施用的剂量和频率可因治疗是预防性还是治疗性而不同。在预防性应用中，对未处于疾病状态的受试者施用含现有抗体或其混合物的组合物以增强受试者的抵抗力。这个量定义为“预防有效量”。这样使用时，确切的量也取决于受试者的健康状况和全身免疫状况，但通常范围在0.1至25mg/剂，尤其为0.5至2.5mg/剂。以相对短的时间间隔长期施用相对低的剂量。一些受试者在其余生还继续接受治疗。
在治疗性应用中，有时需要以相对短的时间间隔施用相对高的剂量(例如，约1mg至200mg抗体/剂，更常用的是5mg至25mg的剂量)，直至疾病恶化减少或终止，并且优选直至受试者表现出疾病症状的部分或完全改善。此后，本专利可作为预防性方案施用。
编码抗体的核酸的剂量范围为约10ng至1g、100ng至100mg、1μg至10mg或30至300μgDNA/受试者。感染性病毒载体的剂量为10-100个或更多个病毒粒子/剂量。
可经肠胃外、局部、静脉内、口腔、皮下、动脉内、颅内、腹膜内、鼻内或肌肉内施用治疗剂进行预防性和/或治疗性治疗。尽管其它途径也有效，但最典型的蛋白质类药物施用途径为血管内、皮下或肌肉内。在一些方法中，直接将药剂注入沉积物积聚的特定组织，例如颅内注射。在一些方法中，将抗体作为缓释组合物或装置(如MedipadTM装置)施用。也可例如使用干粉吸入装置，通过呼吸道施用蛋白质类药物。
可任选将本发明的药剂与对治疗免疫性病症至少部分有效的其它药剂组合施用。
XIII.药物组合物
本发明的药物组合物包括药学上可接受的载体中的至少一种本发明的稳定Fc多肽。“药学上可接受的载体”指通常用于施用活性成分的药物制剂的至少一种组分。同样地，载体可含有本领域所使用的任一药物赋形剂和供施用的任何形式的媒介物。组合物可为例如可注射溶液、水性悬浮液或溶液、非水性悬浮液或溶液、固体和液体口服制剂、药膏、凝胶、软膏、皮内贴片、乳膏、洗剂、片剂、胶囊、缓释制剂等。另外的赋形剂可包括例如着色剂、味道掩蔽剂、溶解助剂、悬浮剂、压缩剂、肠溶衣、缓释助剂等。
通常将本发明的药剂作为包含活性治疗剂和多种其它药学上可接受的组分的药物组合物而施用。见Remington′s Pharmaceutical Science(第15版，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania(1980))。优选形式取决于预期的施用模式和治疗应用。根据所需剂型，组合物也可包括药学上可接受的无毒载体或稀释剂，其定义为通常用于配制供动物或人施用的药物组合物的媒介物。选择稀释剂以便不影响组合的生物活性。这种稀释剂的实例为蒸馏水、磷酸盐缓冲生理盐水、林格氏溶液、葡糖糖溶液和Hank′s溶液。此外，药物组合物或制剂也可包含其它载体、佐剂或无毒非治疗性非免疫原性稳定剂等。
可以贮库型注射剂或植入型制剂的形式施用变体Fc多肽，其可以这种方式配制以允许持续释放活性成分。示例性组合物包含于由50mM的L-组氨酸、150mM的NaCl组成并用HCl将pH调至6.0的缓冲液中配制的5mg/mL的单克隆抗体。
通常，将组合物制备为液体溶液或悬浮液形式的可注射剂；也可在注射之前制备适于溶于或悬浮于液体媒介物中的固体形式。也可将制剂乳化于或包封在脂质体中或微粒中，如前面所讨论的用于增强佐剂效应的聚交酯、聚乙交酯或共聚物(见Langer，Science 249：1527(1990)和Hanes，Advanced DrugDelivery Reviews 28：97(1997))。
为了举例说明之目的，将以下实施例包括在内并且不应被解释为对本发明的限制。
实施例
全部实施例中，除非另有说明，均使用以下材料和方法。
材料和方法
通常，除非另有指明，本发明的实践采用常规的化学技术、分子生物学、重组DNA技术、免疫学(尤其例如抗体技术)和标准的电泳技术。见例如Sambrook、Fritsch和Maniatis，Molecular Cloning：Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)；Antibody Engineering Protocols(Methods in MolecularBiology)，510，Paul，S.，Humana Pr(1996)；Antibody Engineering：APracticalApproach(Practical Approach Series，169)，McCafferty，Ed.，Irl Pr(1996)；Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow等，C.S.H.L.Press，Pub.(1999)；Current Protocols in Molecular Biology，eds.Ausubel等John Wiley&Sons(1992)。
亲本抗体
为了生成本发明的稳定抗体，将编码人源抗体模型(例如，hu5c8)、其变体抗体或相应Fc区的多聚核苷酸引入标准表达载体。例如在美国专利第5,474,771号和第6,331,615号中描述了人源抗体hu5c8及其变体。以下分别提供了hu5c8IgG4重链(SEQ ID NO：37)、hu5c8轻链(SEQ ID NO：38)、hu5c8Fab(SEQ ID NO：39)、来自亲本IgG4抗体的完整Fc部分(SEQ ID NO：40)、带有S228P突变的亲本IgG4Fc部分(SEQ ID NO：41)和带有S228P/T299A突变的亲本无糖基化IgG4Fc部分(SEQ ID NO：42)的氨基酸序列。重链的前导序列为MDWTWRVFCLLAVAPGAHS。还提供了亲本IgG1无糖基化hu5c8抗体的重链(SEQ ID NO：43)和Fc部分(SEQ ID NO：44)的序列。
Hu 5c8IgG4重链(EAG1807)(SEQ ID NO：37)
Q V Q L V Q S G A E V V K P G A S V K L S C K A S G Y I F T S Y Y M Y W V K Q A P G Q G L E W I
G E I N P S N G D T N F N E K F K S K A T L T V D K S A S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y Y C T
R S D G R N D M D S W G Q G T L V T V S S A S T K G P S V F P L A P C S R S T S E S T A A L G C L
V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T
K T Y T C N V D H K P S N T K V D K R V E S K Y G P P C P P C P A P E F L G G P S V F L F P P K P K
D T L M I S R T P E V T C V V V D V S Q E D P E V Q F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q F
N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K G L P S S I E K T I S K A K G Q P R E
P Q V Y T L P P S Q E E M T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T
P P V L D S D G S F F L Y S R L T V D K S R W Q E G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L
S L G
Hu 5c8轻链(SEQ ID NO：38)
DIVLTQSPATLSVSPGERATISCRASQRVSSSTYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASNLESGVPARFSGS
GSGTDFTLTISSVEPEDFATYYCQHSWEIPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCL
LNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG
LSSPVTKSFNRGEC
Hu 5c8VH/CH1域(SEQ ID NO：39)
Q V Q L V Q S G A E V V K P G A S V K L S C K A S G Y I F T S Y Y M Y W V K Q A P G Q G L E W I
G E I N P S N G D T N F N E K F K S K A T L T V D K S A S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y Y C T
R S D G R N D M D S W G Q G T L V T V S S A S T K G P S V F P L A P C S R S T S E S T A A L G C L
V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T
K T Y T C N V D H K P S N T K V D K R V
亲本IgG4Fc部分(SEQ ID NO：40)
E S K Y G P P C P S C P A P E F L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S Q
E D P E V Q F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q F N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G
K E Y K C K V S N K G L P S S I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S Q E E M T K N Q V S L T
C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S R L T V D K S
R W Q E G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S L G
带有S228P突变的亲本IgG4Fc部分(SEQ ID NO：41)
E S K Y G P P C P P C P A P E F L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S Q
E D P E V Q F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q F N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G
K E Y K C K V S N K G L P S S I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S Q E E M T K N Q V S L T
C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S R L T V D K S
R W Q E G N V F S C S V M H EA L H N H Y T Q K S L S L S L G
带有S228P/T299A突变(YC407)的亲本IgG4无糖基化Fc部分(SEQ IDNO：42)
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVH
NAKTKPREEQFNSAYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTL
PPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQ
EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
亲本IgG1无糖基化Fc部分(SEQ ID NO：43)
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK
FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSAYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP
APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE
NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
G
带有S228P/N297Q突变(EAG2412)的亲本IgG4无糖基化Fc(SEQ ID NO：44)
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVH
NAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTL
PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ
QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
亲本IgG1(SEQ ID NO：45)
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV
EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV
YTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
实施例1.稳定性增强的IgG Fc突变的合理设计
无糖基化抗体代表一类重要的不需要免疫效应子功能的治疗剂。然而，很明确的是，去除IgG1和IgG4中CH2相关的低聚糖会影响抗体构象和稳定性。失去抗体稳定性可呈现对程序时限和资源有不利影响的工艺过程开发挑战。在此，我们详述了若干用于设计CH2和CH3中氨基酸位置库的方法，以增强IgG Fc的稳定性。
A.无效应子IgG：IgG4CH2域的相关变异和残基频率设计
如先前所述对不同C1类Ig折叠序列数据库进行了相关变异分析(Glaser等，2007；Wang等，2008)。还如先前所述进行C1类Ig折叠序列的编制和结构/基于HMM的比对(Glaser等，2007)。相关变异分析由相关系数的数据集、φ值组成，φ值有关于如何发现一对氨基酸在特定蛋白质序列中共存与否。φ值范围为-1.0至1.0。φ值1.0表示当在序列子集内的一个位置发现氨基酸时，也总是发现不同残基位置的另一个氨基酸存在于该子集内。φ值-1.0表示当在序列子集内的一个位置发现氨基酸时，则不同残基位置的另一个氨基酸从未存在于该序列子集内。人们发现大于0.2的φ绝对值对于所分析的数据集有统计意义(Glaser等，2007；Wang等，2008)。根据对数据集的经验，φ值＞0.25视为有意义(即，可能有氨基酸对共存的生理原因)，而φ值＞0.5视为很可能由于重要的功能或结构原因而共存。
对于该研究，将来自IgG4的CH2序列用作查询序列，将φ值＞0.3用作界限以通过相关变异鉴定突变。根据相关变异分析鉴定的残基列于表1.1(表1.1中列出了实施例1的整个剩余部分的所有详细的后续残基)。在表1.1中，各残基根据欧盟编号系统为该位置上的所需氨基酸取代提供参考。“基本原理”指所采用的设计方法。美国专利申请第11/725,970号中详细描述了相关变异和残基频率。另外的相关变异键数指通过在给定位置突变成所列氨基酸类型而形成的另外的相关变异关系减去因进行该取代而失去的相关变异关系数。另外的相关变异键数意味着所建议的相关变异突变质量的另外测量。在建议多个氨基酸取代没有另外的主要相关变异键数的情况下，在该位置使用文库方法，其中使用Delphia热激发测定筛选20个氨基酸(实施例2中详述)。使用该方法，鉴定六个氨基酸位置有建议的特异性相关变异突变：L242P(意思是在位置242的L变为P)、Q268D、N286T、T307P、Y319F和S330A。另外，鉴定五个残基位置具有多个优选(另外的相关变异正键)取代，并且利用文库方法。这些位置为D270、P271、E294、A299和N315。
已经成功使用了根据蛋白质折叠中单个位置上的残基频率分析来提高稳定性的方法(Steipe，2004；Demarest等，2006)，并且以前在专利申请BGNA242-1“STABILIZED POLYPEPTIDES  AND  METHODS  FOREVALUATING AND INCREASING THE STABILITY OF SAME”中描述了该方法以鉴定抗LTβR抗体BHA10 VH域和VL域内的文库位置。残基频率分析用于鉴定进行稳定性增强突变的五个残基位置：N276S、K288R、V308I、S324N和G327A。另外，在产生相关变异和残基频率突变L309和N325时因PCR误差产生了两个残基。
表1.1.稳定性增强突变的残基和基本原理
Figure BDA0000093834270001241
Figure BDA0000093834270001251
Figure BDA0000093834270001261
B.无效应子IgG的结构分析设计
除了通过相关变异和残基频率分析进行的突变设计外，还有公开的完整人源IgG b.12抗体的晶体结构的结构分析(pdb代码：1hzh；参考文献：Saphire，E.O.等(2001)Crystal structure of a neutralizing human IGG against HIV-1：atemplate for vaccine design.Science 293：1155-1159)。结构分析鉴定了可被修饰以提高IgG分子稳定性的特异性结构质量。为了将IgG4分子的稳定性转换为更接近IgG1的稳定性，进行若干突变以补偿IgG1分子和IgG4分子之间的结构差异。一个这样的突变位于IgG4的扩大环-E269内。使用文库方法筛选可补偿该环的额外长度的残基。该环也经历如本实施例的C部分中详述的另外的变化。
CH3域之间的界面构成IgG分子的Fc域内最大的蛋白质-蛋白质接触区。IgG1和IgG4之间的所述界面上的单个取代差异位于残基409。在IgG1中，赖氨酸位于位置409，而在IgG4分子中，精氨酸位于位置409。设计将IgG4中的R409取代为IgG1K409以引入所观察到的IgG1CH3的较高稳定性质量。还设计了R409M和R409I以测试该理论。为了更好地适应IgG4CH3界面上增加的精氨酸体积，在来自相对CH3域的接触残基D399处进行若干突变：D399E和D399S(图2A)。通过取代在该位置的较小侧链，相对CH3域可更好地适应增加的精氨酸体积并增加CH3域的整体稳定性。另一个方法用于设计增加CH3界面疏水性的突变，以增强两个相互作用的域(Y349F、T350V和394V)之间的结合以及加大界面(F405Y)的侧链体积。还设计了突变以测试靠近与1hzh晶体结构中的碳水化合物接触的接触部位的残基(V264、R292、V303))以及靠近CH3/CH2界面的H310的稳定化。一组外露面谷氨酰胺残基(Q268、Q274和Q355)也是若干突变的焦点以改变表面总电荷。对E419使用相同方法。
最后，一种最常用于解释嗜热蛋白热稳定性增强的机制涉及蛋白质内部核心的更紧密填充(参考文献：Jaenicke，R.和Zavodszky，P.1990.Proteinsunder extreme physical conditions.FEBS Lett.268：344-349)。为了概括这种现象，用异亮氨酸或苯丙氨酸取代CH2和CH3“缬氨酸核心”中存在的缬氨酸残基。由附加分支侧链和更大的结合体积预测稳定性的增强。CH2中“缬氨酸核心”为五个均朝向CH2域的同一近侧内部核心的缬氨酸残基(V240、V255、V263、V302和V323)。观察了CH3的类似“缬氨酸核心”(V348、V369、V379、V397、V412和V427)。另外，L351和L368突变为支化度更高的疏水性侧链。
C.无效应子IgG的相关变异设计：在其它C类Ig域中观察到的基于相关变异模式的靠近CH2糖基化位点的协同突变
IgG CH2域共同存在许多残基以维持与EU位置N297的N连接碳水化合物的相互作用和与各种FcγR形式的CD16、CD32和CD64的相互作用。去除碳水化合物导致IgG-Fc与FcγR结合的显著降低(Taylor和Garber，2005)。对于本文所述设计，通过用发现共同存在于其它C类Ig折叠域中的氨基酸取代研究IgG-Fc内靠近N连接糖的残基的共同可突变性。在N连接碳水化合物存在和不存在下，对这些共同突变对FcγR结合和CH2域的稳定性的影响进行了研究，因为这些修饰在无糖基Fc中可能特别耐受，并且可减少无糖基和糖基化Fc部分中与FcγR的相互作用。
对于可能与N连接碳水化合物相互作用重要的残基为该研究的焦点。使用公开的与FcγRIIIa结合的IgG1-Fc的晶体结构和MOLMOL程序鉴定与N297处的碳水化合物直接接触的IgG1-CH2残基(Sondermann，P.，Huber，R.，Oosthuizen，V.，Jacob，U.(2000)The
Figure BDA0000093834270001281
crystal structure of the human IgG1Fc fragment-FcgRIII complex.Nature，406：267-273；Koradi，R.、Billeter，M.&Wuthrich，K.(1996)MOLMOL：a program for display and analysis ofmacromolecular structures.J.Mol.Graph.14：51-55)。这些氨基酸是相关变异分析和设计的焦点。
如先前所述进行C1类Ig折叠序列的编制和结构/基于HMM的比对(Glaser等，2007)。还如先前所述对不同C1类Ig折叠序列数据库进行了相关变异分析(Glaser等，2007；Wang等，2008)。相关变异分析由相关系数的数据集、φ值组成，φ值有关于如何发现一对氨基酸在特定蛋白质序列中共存与否。φ值范围为-1.0至1.0。φ值1.0表示当在序列子集内的一个位置发现一个氨基酸时，也总是发现不同残基位置的另一个氨基酸存在于该子集内。φ值-1.0表示当在序列子集内的一个位置发现一个氨基酸时，则不同残基位置的另一个氨基酸从未存在于该序列子集内。人们发现大于0.2的φ绝对值对于所分析的数据集有统计意义(Glaser等，2007；Wang等，2008)。根据对数据集的经验，φ值＞0.25视为有意义(即，可能有氨基酸对共存的生理原因)，而φ值＞0.5视为很可能由于重要的功能或结构原因而共存。
根据结构分析，发现疏水性残基V262和V264在CH2域的表面形成疏水性补丁，其通过N连接碳水化合物与溶剂隔绝的。另外，V266为靠近V262和V264的残基并且是CH2域所独有的，尽管V266存在于环中且自身埋于CH2域内部。V262、V264和V266以相互间非常显著的相关系数高度共存于IgG-CH2域内(φ值：V262-V264＝0.44；V262-V26＝0.40；V264-V266＝0.54)。在我们对IgG恒定域的基于结构的序列比对中，突出显示所述残基(图2B)。
所述三个缬氨酸残基(262、264和266)与形成CH2域中独特环结构的残基(残基267-271)也有很强的相关系数。该环比由其它IgG恒定域CL、CH1和CH3形成的共有序列长两个氨基酸。V262与E269和D270(φ值分别等于0.38和0.31)、V264与S267、D268和E269(φ值分别等于0.27、0.44和0.52)和V266与S267(φ值等于0.30)之间也有特异相关性。根据这些相关性，我们猜测该环可能对于定位含N297及其碳水化合物的环以及定位含残基325-330的环而言很重要，已知含残基325-330的环对于与FcγR的相互作用很重要(Sondermann等，2000；Shields等，2001)。
根据这些观察，我们创造设计以研究这些位置上，特别是无糖基IgG上的其它氨基酸类型的耐受性(即，对CH2域的折叠和稳定性的影响)。我们想要观察的另一方面是这些位点上的可能对IgG的FcγR结合性质具有影响的修饰。表1.2中列出了根据这些观察在CH2域内进行的氨基酸变化，且所述氨基酸变化示于图2C的IgG-Fc结构上(Sondermann，P.，Huber，R.、Oosthuizen，V.，Jacob，U.(2000)Thecrystal structure of the human IgG1Fcfragment-FcgRIII complex.Nature，406：267-273)。图2D显示了天然序列与含所有突变的序列(SDE9)的比对。
表1.2.无糖基IgG1CH2域的突变
Figure BDA0000093834270001292
a进行A299K突变以中断N连接糖基化基序，从而产生无糖基IgG。
b图1D中显示了天然序列与经完全修饰序列的比对An。
D.支持突变
为了测试指定残基位置的特定类型突变的特异性，我们已设计了一系列附加突变。这些包括测试显示以增强稳定性的残基位置的不同氨基酸类型(极性、疏水性和带电)。我们还将测试所有稳定性增强的突变对各种IgG同种型和糖基化状态的应用。这些突变列于表1.3中。
表1.3.支持突变
Figure BDA0000093834270001301
E.附加多突变构建体
为了减少由带稳定性突变T299K的肽产生的T细胞潜在表位并利用T307P和D399S稳定性突变以及其它产生无糖基化IgG1和IgG4的突变，我们还将产生以下构建体(表1.4)。
表1.4附加多突变构建体
实施例2.大肠杆菌中生成的IgG Fc抗体域的热稳定性筛选
采用美国专利申请第11/725,970号中描述的经修饰的热激发测定作为稳定性筛选以测定在pH为4.5下的热激发之后，40℃下保留的可溶性IgG Fc蛋白质的量。
在可诱导ara C启动子的控制下，用编码pBRM012(IgG1)和pBRM013(带有S228P、T299A突变的IgG4)Fc的+C端组氨酸标签的质粒转化大肠杆菌菌株W3110(ATCC，Manassas，Va.Cat.#27325)。转化体在30℃下在由补以0.6％的甘氨酸、0.6％的Triton X100、0.02％的阿拉伯糖和50μg/ml的羧苄青霉素的SB(Teknova，Half Moon Bay，Ca.Cat.#S0140)组成的表达培养基中生长过夜。通过离心将细菌制成小球，采集上清液进行进一步处理。
热激发之后，通过离心去除聚集的材料，并通过DELFIA测定测定保留在经处理的澄清上清液中的可溶性Fc样本对蛋白质A(δP7837)的结合。在37℃下用PBS中的0.5μg/ml的蛋白质A涂覆两个96孔板(MaxiSorp，NalgeNunc，Rochester，NY，Cat.#437111)一小时，然后在振荡下于室温下用DELFIA测定缓冲液(DAB，10mM的Tris HCl、150mM的NaCl、20μM的EDTA、0.5％的BSA、0.02％的Tween 20、0.01％的NaN3，pH为7.4)封闭一小时。用不含BSA的DAB(洗涤缓冲液)洗涤板三次，并将10μl的上清液加到90μl的DAB中以达到最终体积100μl(基准板)。紧接着向聚丙烯板内的各上清液中加入10μl的10％HOAc以获得pH为4.5的样本。在40℃下孵育所述孔板90分钟，通过1400x g离心去除变性蛋白质。向另一含90μl补以100mM Tris的DAB、pH为8.0(激发板)的DELFIA板中加入10μl经酸和热处理的上清液。在室温中于振荡下孵育DELFIA板一小时，并如前所述洗涤3次。通过在每个孔中加入100μl含250ng/ml Eu标记的抗His6抗体的DAB来检测结合的Fc(Perkin Elmer，Boston，MA，Cat.#AD0109)并在室温中于振荡下孵育一小时。用洗涤缓冲液洗涤所述板3次，每个孔中加入100μl的DELFIA增强溶液(Perkin Elmer，Boston，MA，Cat.#4001-0010)。孵育15分钟之后，在Victor 2上使用Europium方法来读板(Perkin Elmer，Boston，MA)。通过对40℃下基准板和挑战板之间的Eu荧光比进行排列来对各种构建体分析数据。高于pBRM013的荧光值解释为整个目标构建体(IgG4.P agly)的稳定性增强。数据示于表2.1。
表2.1.Delphia热激发测定结果
Figure BDA0000093834270001321
Figure BDA0000093834270001331
Figure BDA0000093834270001341
实施例3.稳定IgG Fc抗体的生成
A.大肠杆菌中稳定IgG Fc部分的诱变、瞬时表达和提纯
通过使用Stratagene Quik-Change Lightning诱变试剂盒进行定点诱变将稳定性突变并入先前在实施例2中详述的BRM13构建体中。将引物设计为长度为36-40个碱基，在中部两侧10-15个碱基的恰当序列有突变，GC含量为至少40％，起始且终止于一个或多个C/G碱基。以下表3.1列出了所有突变体构建体。
表3.1.由大肠杆菌表达并提纯的IgG-Fc构建体
Figure BDA0000093834270001342
Figure BDA0000093834270001351
使用将引入突变的引物进行PCR之后，在37℃下用DpnI限制性内切酶消化诱变5分钟，以便完全消化亲本质粒。然后将诱变反应转至XL1蓝色大肠杆菌超感受态细胞中。筛选氨苄青霉素耐受菌落，使用DNA测序确认来自诱变反应的正确序列。
通过使用EC3程序进行的电穿孔将序列确定的DNA转化至3110细胞中。挑选独特菌落，并使其在10ml LB-amp的起子培养物中生长过夜。将该预培养物转移至1L表达培养基(SB+0.02％阿拉伯糖+50mg/L的amp/carb)中，并在32℃下生长过夜。细胞在离心机中离心，并完全再悬浮于100ml的原生质球状体缓冲液中(20％的蔗糖、1mM EDTA、10m MpH为8.0的Tris-HCl和溶解酵素(0.01％w/v))。离心细胞，所得到的蛋白质在上清液中。
通过使用蛋白质A琼脂糖FF(GE医疗)进行的分批纯化来提纯IgG-Fc构建体。使用0.1M pH为3.0的甘氨酸从蛋白质A琼脂糖中洗脱Fc分子，用Tris碱中和Fc分子，最后使用Pierce 10ml透析盒(10,000MWCO截留)将Fc分子透析至PBS中。
B.CHO细胞中稳定抗体的诱变、瞬时表达、抗体提纯和表征
通过使用Stratagene Quik-Change Lightning诱变试剂盒进行的定点诱变将稳定性突变并入IgG4.P抗体(已在氨基酸228处含脯氨酸铰链突变的VH构建体)。抗原识别Fab来自抗CD40抗体5c8。将引物设计为长度为36-40个碱基，在中部两侧10-15个碱基的恰当序列有突变，GC含量为至少40％，起始且终止于一个或多个C/G碱基。以下表3.2列出了所有糖基化和无糖基化突变体构建体。
表3.2.通过分析尺寸排阻色谱法测得的1L培养基的蛋白质产量和单体百分比％(以斜体字表示IgG1构建体)
Figure BDA0000093834270001361
在使用将引入突变的引物进行PCR之后，在37℃下用DpnI限制性内切酶消化每个诱变5分钟，以便完全消化亲本质粒。然后将诱变反应转至XL10金色大肠杆菌超感受态细胞中。筛选氨苄青霉素耐受菌落，使用DNA测序确认来自诱变反应的正确序列。
将来自确定序列的DNA扩增并转至TOP10大肠杆菌感受态细胞(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)。筛选转化为氨苄青霉素抗药性的大肠杆菌菌落是否存在插入。然后将菌落在250ml的大规模培养物中培养。使用Qiagen HiSpeed Maxiprep试剂盒提取并纯化来自细菌培养物的DNA进行瞬时转染。使用ε280定量DNA以测定将用于转染的DNA浓度。
然后使用突变体质粒和等量5c8VL质粒共同转染CHO-S细胞以瞬时表达抗体蛋白。用于转染的DNA的量为0.5mg/L的VH和0.5mg/L的VL。制备转染培养基(来自Invitrogen的CHO-S-SFMII和来自SAFC的LONGR4IGF-1)，其中转染体积为5％，含有1mg/ml的PEI(Polysciences Cat.#23966)，PEI与DNA的比例为3mg∶1mg。将DNA加到转染培养基/PEI溶液中并搅拌，然后在室温下静置5分钟。然后在1e6个细胞/ml下将混合物加到500mlCHO-S细胞中。于37℃下置于在5％CO2中4小时后，加入1x体积的增殖用培养基(CHOM37+20g/l PDSF+Penstrep/两性霉素)，最终培养基体积为1L。第1天，加入10ml、200g/L的棉花水解物，并降温至28℃。监测培养物成活率直至成活率降至70％以下(8-12天)。此时还在测量与抗IgG尖端的结合中使用Octet(ForteBio)检测蛋白质表达的滴定度。通过在2400rpm下离心培养物10分钟来收获细胞，然后通过0.2um的超滤器过滤上清液。
使用AKTA(Amersham Biosciences)上的蛋白质A Sepharose FF(GEHealthcare)从上清液捕获5C8抗体。在pH为3.0下用0.1M的甘氨酸从蛋白质A洗脱抗体分子，用Tris碱中和，用Pierce 10ml透析盒(10,000MWCO截留)将抗体分子透析至PBS中，浓缩至最终体积为1ml，并使用预备尺寸排阻色谱法(TOSOHASS，TOSOH Biosciences)进一步提纯。在pH为6.0下将5C8分子透析至20mmol的柠檬酸盐和150mmol的NaCl溶液中。分别通过4-20％的Tris-甘氨酸SDS-PAGE和分析尺寸排阻HPLC测定单体抗体产物的纯度和百分比。
B.用质谱分析确定稳定性设计的抗体的蛋白质序列和翻译后修饰
在还原条件下分析样本。在37℃下，在4M胍HCl存在下于100mM DTT中进行还原1小时。在注射之前，用PBS按1∶1稀释样本。向混合物加入冰醋酸至最终浓度为2％(v/v)。将5μg的各样本注入苯基柱并用ESI-TOF进行分析。使用结合和洗脱法。缓冲液A含水中的0.03％TFA，缓冲液B含乙腈中的0.025％TFA。流量保持为100μl/分钟不变。从分析软件获得光谱并用MaxEnt1解叠。还原分析后，检测其中3个样本为糖基形式，因此对EC323、EC326和EAG2300这3个样本进行去糖基化。在还原条件下进行去糖基化：1mU N-聚糖酶/2μg蛋白质，存在20mM DTT、10mM Tris，pH为7.0。在37℃下对样本去糖基化。2小时后，在2.7M胍HCl存在下向样本中加入额外的30mM的DTT，并且在37℃下再孵育30分钟。向苯基柱中注入经还原的去糖基化样本各5μg，并如以上详述进行分析。
结果确定了所有13个样本与重链的N端谷氨酰胺(Q)转化为焦谷氨酸(PE)的一致性。表3.3列出了获得的所有糖基化和去糖基化样本的质量。所有轻链和重链均含有1％或更低的低水平糖基化。在～20-40％的相对强度下观测各样本中与未修饰的N端谷氨酰胺对应的质量。所有轻链解叠光谱均与预期的一致。
表3.3检测的质量
Figure BDA0000093834270001391
Figure BDA0000093834270001401
样本EC323、EC326和EAG2300含常见的二分支多糖G0F、G1F、G2F，其中G0F为最丰富的种类，其次为G1F、G2F。样本EC323和EC326含有来自G0F峰的-146Da的峰，该峰与缺失核心海藻糖(G0)的G0F聚糖相对应。对于EC323，G0(海藻糖不足)的相对强度百分比为2％，而样本EC326的相对强度百分比为23％。所有3个糖基化样本均在G2F聚糖上含有低水平(＜1％)的唾液酸。
所有样本链均含有-18Da的峰，其已显示为与ESI-TOF的气体温度升高有关的仪器人为结果。用350℃的温度除去TFA加合物。
实施例4.无糖基化IgG Fc抗体的热稳定性
蛋白质稳定性是开发和提高蛋白质治疗剂的中心问题。稳定性不足可导致若干开发问题，包括不适合用生物反应器大规模生产、蛋白质提纯困难和不适于制药和使用。为了生成效应子功能不足的Fc主链，向agly IgG4.P引入突变(S228P)，以提高CH2域和CH3域的整体稳定性。这项研究的目的是研究设计的突变是否提高热稳定性。因此，使用差示扫描量热法(DSC)测定各种构建体的热稳定性。用DSC测定大肠杆菌生成的Fc域构建体和全长抗体构建体。实施例3详述了表达和提纯大肠杆菌生成的Fc域构建体和全长抗体构建体的方法。
在pH为6.0下用25mM柠檬酸钠和150mM NaCl缓冲液透析抗体。浓缩抗体至1mg/mL并用UV吸光度测量。使用自动化毛细管DSC(MicroCal，LLC，Northampton，MA)进行扫描。进行两次缓冲扫描以进行基线减法。在20-105℃下使用中等反馈模式以1℃/min进行扫描。然后使用软件Origin(MicroCal LLC，Northampton，MA)分析扫描。使用三阶多项式校正非零基线，并使用非二态解折叠模型拟合各种抗体的解折叠过渡。为了进一步测定这些构建体的稳定性，在pH为4.5下用25mM磷酸钠、25mM柠檬酸钠、150nM NaCl缓冲液透析全长抗体。如以上详述使用相同的DSC法。
使用大肠杆菌表达的缺乏Fab域的Fc域构建体测试如实施例2详述的Delphia热激发试验中鉴定的突变的稳定性是否增强。表4.1列出了构建体BRM023、BRM030和CR103-119及其解链温度。
表4.1.如通过DSC测定的大肠杆菌表达的IgG Fc构建体的解链温度
Figure BDA0000093834270001411
Figure BDA0000093834270001421
如表4.1所述，对于agly IgG1和IgG4.P(S228P，T299A)Fc部分对照，CH2的解链温度分别为65.9℃和62.3℃，CH3的解链温度分别为82.6℃和71.2℃。在单点突变中，BRM023(T307P)和BRM030(T299K)显示整个aglyIgG4.P(S228P、T299A)对照的CH2解链温度升高3.4-3.9℃。在位置R409用赖氨酸或甲硫氨酸进行的取代显示CH3的解链温度升高12℃和6.6℃。对较小疏水性侧链(Leu和Ile)的取代并未增加CH3的稳定性。该位置代表IgG1和IgG4之间的CH3界面的单个差别。在位置D399进行突变以补偿IgG4CH3界面上位置409增加的精氨酸侧链体积(如实施例1详述)。较小侧链的取代(Ser)促进解链温度升高～4℃。对尺寸相同但缺乏电荷的侧链的取代(Asp)或对带相同电荷的较大侧链的取代(Glu)均未显示稳定性增强。如实施例1详述疏水性缬氨酸核心中的取代显示对解链温度无影响或未降低，除了V427F外，其显示CH3的解链温度升高～4℃。
为了评估单个突变和多个突变的组合，利用全长IgG分子。如实施例3详述将突变并入全长5c8抗体。下表4.2中总结了在pH为6.0和4.5下通过DSC测定的突变对CH2域和CH3域的解链温度的影响。
Figure BDA0000093834270001431
Figure BDA0000093834270001451
如表4.2所述，D399S突变使agly IgG4.P中CH3域的热稳定性在pH为6.0下平均升高2℃而在pH为4.5下升高多达10℃。用突变体T299K产生无糖基化CH2。在位置299的赖氨酸取代使IgG4.P分子比该位置的丙氨酸取代在pH为6.0时的解链温度升高5℃，在pH为4.5时的解链温度升高11℃。T299K突变也使IgG1CH2在pH为6.0下的Tm升高6℃。当与D399S组合使用时，T307P突变显示糖基化IgG4.P CH2域的Tm升高4℃。T307P本身未使糖基化IgG4.P形式的解链温度升高。呈无糖基化形式时，T307P突变使CH2的Tm升高6℃。与T299K突变结合时，CH2的Tm升高8℃。与T307P和T299A结合时，L309K突变使无糖基化IgG4.P稳定性升高1℃。然而，与T307P和T299K结合时，L309K突变使其升高3℃。在糖基化形式的IgG4.P中，L309K突变使CH2的Tm升高2℃。当与T307P和T299A结合时，L309K突变使无糖基化IgG4.P的稳定性升高1℃。然而，在T307P和T299K组合时，L309K突变使Tm在pH为4.5下升高3℃。CH2中的V323F突变显示对CH2域的解链温度没有影响，而V240F突变使解链温度降低13℃。另外，V240F突变也显示使CH2的Tm降低13℃。
在IgG4.P中的T299K、T307P、L309K、D399S组合中观察到解链温度升高最明显。与T299A IgG4.P相比，这种构建体显示CH2的Tm升高11℃(pH6.0)和12℃(pH 4.5)。实际上，与T307P、L309K和D399S结合时，T299K突变使Tm比T299A突变升高2-3℃。另外，向IgG4.P CH2引入T299K结合将IgG4.P同种型的CH3转化为来自IgG1的CH3分别导致CH2域和CH3域的Tm比agly IgG4.P升高6℃和15℃。
CH2糖基化的相关变异研究中鉴定的突变显示对IgG1CH2的Tm无影响或影响很小(V262L和V264T结合V262L，环置换)或降低7℃的影响(V266F、V264T&V266F、环&V264T&V266F)。`观察到V262L、V264T和V266F组合的解链温度Tm大幅下降10-15℃。
总之，T299K、T307P、L309K作为单个突变或相互结合显示出增强CH2域的热稳定性的能力。D399S赋予IgG4.P的CH3域稳定性。
实施例5：IgG Fc抗体的搅拌和pH保持步骤研究
人们非常希望蛋白质治疗剂有较长保存期，其中在生产和储存期间，蛋白质的物理或化学性质变化微小。评估相关应力是制剂开发的重要部分，并且对IgG Fc突变体评估两类相关应力。
A.搅拌应力
生产和处理期间受到的搅拌拟态应力也模仿了实际运输中(即将药品瓶运至试验场地)的应力。因此，48小时全程分析搅拌稳定性，并且使用分析尺寸排阻色谱(SEC)监测蛋白质聚集或沉淀并通过监测320nM下的吸光度测定浊度。浊度是由于聚集和沉淀形成使蛋白质/缓冲液浑浊或甚至在极端情况下使蛋白质/缓冲液不透光而对光散射的测量。在各组实验中一贯使用以下方法：以650rpm振荡于3ml制剂管中各个1ml、0.5mg/ml的样本，用橡皮塞密封并用石蜡膜再次密封。在必要的时间点(0、6、24和48小时)提取100μl样本，以14,000rpm离心5分钟以离心形成聚集物或沉淀。然后使样本经过分析SEC柱并在该分析SEC柱上分析。在SEC洗脱图中，聚集的蛋白质以较短的保留时间洗脱，且蛋白质降解产物以较长的保留时间洗脱。因此，使用单体种类的百分比监测指定时间点的蛋白质的整体稳定性。
选择热稳定性最高的构建体(见实施例4)进行搅拌研究。对于无糖基化IgG4分子而言，选择YC401至YC403(所有无糖基化IgG4.P T299A和D399S[分别加上T307P、L309K和T307P/L309K]、YC404至YC406(所有无糖基化IgG4.P T299K和D399S[分别加上T307P、L309K和T307P/L309K]、YC407(作为野生型IgG4.P无糖基化(T299A)对照)、CN578(无糖基化IgG1A299K)、EC331(其为带IgG1CH3域的无糖基化IgG4.P T299K和T307P)、无糖基化IgG1(T299A)、无糖基化IgG4.P(T299A)和无糖基化IgG1(T299A)进行研究。对于糖基化分子而言，选择EC304(糖基化IgG4.P T307P、D399S)、EC323(糖基化IgG4.P D399S、L309K)、EC326(糖基化IgG4.P T307P、D399S、L309K)、糖基化IgG4.P T299A和糖基化IgG1进行研究。
根据浊度比较无糖基化突变体(见表下表5.1和图3A)，与野生型YC407(无糖基化IgG4.P T299A)相比，YC403(无糖基化IgG4.P T299A、T307P、L309K和D399S)和YC406(无糖基化IgG4.P T299K、T307P、L309K和D399S)显示浊度最低。在每个时间点，与野生型相比，两种构建体一致地显示了三分之一的浊度。两种构建体之间唯一的差别为T299A(YC403)和T299K(YC406)。
表5.1：搅拌期间各时间点的构建体浊度
Figure BDA0000093834270001481
在比较单体百分比％时(见下表5.2和图3B)，所有突变构建体显示随着时间聚集减少。在第24小时的时间点，所有突变构建体均比野生型多，在第48小时的时间点，大多数构建体至少多2倍。然而，单体保留百分比最高的构建体是YC403，其次是YC402(无糖基化IgG4.P T299A、L309K和D399S)，再者是YC406(无糖基化IgG4.P T299K、T307P、L309K和D399S)。这些构建体显示单体百分比％随时间最少的逐渐降低。排列最好的构建体中的常见突变是L309K突变。该数据证明所选突变提高了在机械应力方面的整体稳定性。比较无糖基化IgG4.P构建体的两种搅拌测量法，YC403(无糖基化IgG4.P T299A、T307P、L309K和D399S)和YC406(无糖基化IgG4.PT299K、T307P、L309K和D399S)构建体随时间抵抗机械应力最佳。两种分子均显示能够使热稳定性和结构稳定性提高的添加突变(T307P/L309K)。
表5.2：搅拌期间各时间点的构建体的单体百分比％
Figure BDA0000093834270001491
对于IgG1无糖基化分子，CN578(无糖基化IgG1A299K)显示浊度最低，并且还显示整个实验过程中基本上无聚集。CN578比IgG1T299A表现更好，也比野生型IgG1299T分子表现好，从而表明A299K突变对无糖基化IgG1分子的搅拌影响最小。CN578在浊度研究方面比IgG1T299A好5倍。CN578分子在48小时时间范围内也未显示出聚集，这与无糖基化IgG1T299A和糖基化IgG1299T.EC331的结果相同。与其它构建体相比，EC331(具有IgG1CH3域的无糖基化IgG4.P T299K和T307P)表现良好，因为EC331在整个搅拌研究过程中也保持单体为100％。与IgG4.P agly构建体(YC系列)相比，EC331显示浊度升高2倍。该数据表明IgG1CH3部分非常有助于分子的热稳定性和结构稳定性。
在糖基化分子EC304(糖基化IgG4.P T307P、D399S)、EC323(糖基化gG4.P D399S、L309K)、EC326(糖基化IgG4.P T307P、D399S、L309K)之中，与野生型糖基化IgG4.P分子(见表5.2和图3B)相比，在聚集研究过程中单体百分比％增加。然而，在各个时间点浊度显著升高，甚至高达75倍。一贯地，各分子含D399S，因此如数据显示这种突变可能破坏结构稳定性。
B.低pH保持步骤研究
人们非常希望蛋白质治疗剂具有可制造性和可量测性。对于工艺过程开发而言进行pH保持步骤研究是必要的。pH保持研究模拟蛋白质生产和提纯阶段的工艺过程开发。对于生产阶段，蛋白质的再生产性和一致性对于质量保证是必要的。这种方法可用于测定在高或低pH下的蛋白质稳定性。对于该研究，使用AKTA(Pharmacia Biotech，现为GE Healthcare)将1mg蛋白质加载到蛋白质A柱上并在pH为3.1下用醋酸盐缓冲液洗脱。将蛋白质保持在低pH下2小时至6小时的间隔。取100μl等分试样，然后使其经过分析SEC以测定因降解和聚集损失的蛋白。结果总结于表5.3(见下文)和图4中。
表5.3：保持低pH下的IgG Fc随时间的相对峰高
Figure BDA0000093834270001501
对于这项研究，选择EC304(糖基化IgG4.P T307P、D399S)、EC323(糖基化IgG4.P D399S、L309K)、EC326(糖基化IgG4.P T307P、D399S、L309K)、糖基化IgG4.P T299A、EC331(具有IgG1CH3域的无糖基化IgG4.P T299K和T307P)、无糖基化IgG1(T299A)、无糖基化IgG4.P(T299A)和糖基化IgG1进行研究。从数据上看，显示EC331能够耐受低pH保持至少6h而不会失去太多产量。与进行的无糖基化IgG4野生型对照相比，这有所提高。预计其它无糖基化构建体不会因降解而失去任何蛋白质，因为这种构建体能够耐受低pH保持。EC304和EC326均被糖基化，与糖基化IgG1野生型相比，EC304和EC326也保持了其产量。也被糖基化的EC323并未随时间好转。假设L309K突变仅仅需要与T307P突变一起被稳定，这见于更稳定的EC326构建体。
实施例6.稳定性设计的IgG Fc抗体的Fc受体结合
本发明的无糖基化变体抗体的效应子功能通过其结合Fc受体或补体分子(如Clq)的能力来表征。
A.溶液相竞争Biacore实验
使用溶液亲合力表面等离子体共振分析对Fcγ受体的结合(参考：Day ES，Cachero TG，Qian F，SunY，Wen D，Pelletier M，Hsu YM，Whitty A.Selectivityof BAFF/BLy S and APRIL for binding to the TNF family receptors BAFFR/BR3and BCMA.Biochemistry.2005年2月15日；44(6)：1919-31)。该方法利用通常所说的“受限传质”结合的条件，其中配体结合(蛋白质结合传感器芯片)的初始速率与溶液中配体的浓度成比例(参考：BIApplications Handbook(1994)第6章：Concentration measurement，第6-1-6-10页，Pharmacia BiosensorAB)。在这些条件下，可溶性分析物(溢出芯片表面的蛋白质)与芯片上固定蛋白质的结合比分析物至芯片表面上的葡聚糖基质的扩散要快。因此，溢出芯片表面的溶液中的分析物的扩散性和分析物的浓度决定分析物结合芯片的速率。在该项实验中，溶液中游离Fc受体的浓度由结合含固定IgG1MAb的CM5Biacore芯片的初始速率决定。在这些Fc受体溶液中滴定稳定性设计的构建体(见下表6.1)。这些构建体的半数最大(50％)抑菌浓度(IC50)由其抑制Fc受体结合固定在传感器芯片表面上的固定IgG1抗体的能力表示。从原始传感图数据(图5)获得初始结合速率。用于计算的IC50的滴定曲线示于图6A(CD64(FcγRI))和图6B(CD16(FcγRIIIa V158))。结果示于表6.1中并且报告为两次滴定的平均值。
表6.1.Fc变体的FcγR亲合力表征
Figure BDA0000093834270001521
在CD64结合试验中，IgG1对照抗体的IC50为9.6μM，而IgG1T299A(agly)和IgG4.P T299A(agly)的IC50分别为205μM和739μM。正如所料，IgG1分子对CD64的亲合力比IgG4分子高，并且无糖基化IgG1显示的亲合力比糖基化IgG1低。与稳定性设计的无糖基化IgG4.P分子(EC331和YC400系列)的从440μM至5000μM以上的IC50相比，稳定性设计的糖基化IgG4.P分子(EC300和EC326)的IC50值为约8μM。稳定性设计的IgG4.P糖基化分子(EC300、EC326)的IC50与糖基化IgG1对照相等，并且带有T299A的稳定性设计的无糖基化IgG4.P(YC401、YC403)与无糖基化IgG4.P T299A对照的IC50对数相等。然而，带有T299K的稳定性设计的无糖基化IgG4.P显示亲合力比带T299A取代的等效分子降低1-2个对数(图7A)。对于稳定性设计的无糖基化IgG1T299K(CN578)也观察到这种结果，显示比无糖基化IgG1T299A对照的亲合力降低1个对数(图7B)。实际上，T299K取代将无糖基化IgG1(T299A)分子从对CD64的亲合力比无糖基化IgG4.P T299A对照较高转为对无糖基化IgG1(T299K)的亲合力比无糖基化IgG4.P对照低(图7B)。总之，T299K突变使IgG1分子和IgG4分子中对CD64的亲合力降低。
对于CD16试验，IgG1对照的IC50为105μM，而无糖基化IgG4.P T299A和IgG1T299A的IC50均大于1000μM。糖基化稳定性设计的IgG4.P分子的IC50值与IgG1对照的对数相等，并且所有稳定性设计的无糖基化分子(IgG4.P和IgG1)的IC50大于1000μM。为了研究T299K是否进一步降低对CD16的亲合力，在高抗体浓度(5μM)下测试两组构建体(YC401、YC404和YC403、YC406)，其中这两组构建体的唯一差别在于T299K取代。结合曲线显示在高浓度下T299K突变引起对CD16的亲合力降低(图8)。总之，T299K突变降低对IgG分子中CD16的亲合力。
B.C1q结合ELISA
通过在4℃下用50μl PBS中的10ug/ml重组可溶性人源CD40配体涂覆96孔Maxisorb ELISA板(Nalge-Nunc Rochester，NY，USA)过夜，从而进行Clq结合测定。抽吸孔并用洗涤缓冲液(PBS，0.05％Tween 20)洗涤三次，用200μl/孔的封闭/稀释缓冲液(0.1MNa2HP04、pH 7.0，1MNaCl、0.05％Tween 20、1％明胶)将孔封闭1小时。用封闭/稀释缓冲液将抗体稀释3倍并在室温下孵育2小时。如同上述抽吸和洗涤之后，加入稀释于封闭/稀释缓冲液中的δ人源Clq(C0660)2J凝胶50pl/孔并在室温下孵育1.5h。
如同上述抽吸和洗涤之后，加入用封闭/稀释缓冲液稀释3,560倍的50J孔的羊抗Clq(Serotec AHP033)。室温孵育1h后，如同上述抽吸并洗涤孔。然后加入按1∶10,000稀释于封闭/稀释缓冲液中的50pll/孔驴抗羊IgG HRP缀合物(Jackson ImmunoResearch 713-035-147)，并在室温下将孔孵育1h。
如同上述抽吸和洗涤之后，加入100份TMB底物(420plM TMB、0.1M乙酸钠/柠檬酸缓冲液中的0.004％H2O2，pH为4.9)，孵育2min，之后用100ul的2N硫酸终止反应。在450nm下用仪器Softmax PRO读取吸光度，使用Softmax软件用4-参数拟合确定相对结合亲合力(C值)
实验结果显示CN578(IgG1T299K)和YC406(无糖基化IgG4.P T299K、T307P、L309K和D399S)的C1q结合均不可测(图9)，而IgG1T299A余有一定结合力。
实施例8.IgG1CH3稳定无效应子功能的无糖基化IgG4CH2
除非另外指出，本部分所述蛋白质源自5c8抗体，包含来自IgG4的CH1区、来自IgG4的CH2域和来自IgG1抗体或IgG4抗体的CH3域(如所示)。如实施例3所述生产并提纯蛋白质。在pH为6.0和4.5时通过DSC测定经修饰抗体的CH2域和CH3域的热稳定性(如实施例4详述)。通过分析SEC和通过在A320nm下的浊度测定来测定搅拌应力的影响(实施例5)。本发明无糖基化变体抗体的效应子功能通过其结合Fc受体或补体分子(如Clq)的能力表征。使用溶液亲合力表面等离子体共振分析对Fcγ受体的结合，并通过ELISA分析对补体因子C1q的结合(实施例6)。最后，通过对Sprague-Dawley大鼠进行药代动力学研究而测定血清半衰期(实施例7)。
如实施例3详述，在CHO中表达IgG4-CH2/IgG1-CH3无糖基化构建体，产量为7至14mg/L培养基。引入IgG1-CH3似乎使产量比具有来自IgG4的CH3的相同构建体高(表8.1)。另外，IgG1无糖基化IgG4-CH2/IgG1-CH3的CH3域的热稳定性(Tm＝85℃)比野生型无糖基化IgG4的CH3域的热稳定性(Tm＝74℃，表8.2和4.2)高。因为之前人们认为CH2域中多糖的损失是稳定性的主导因素，有趣的是观察到IgG1CH3对搅拌稳定性起决定性作用(表8.3)。
观察到，与T299A和T299K IgG4-CH2/IgG1-CH3相比，EAG2412构建体(N297Q IgG4-CH2/IgG1-，即，5c8可变区(IgG1骨架)、带N297Q和Ser228Pro取代的IgG4CH1、IgG4CH2、IgG1CH3)显示更好的效应子功能性，其中对CD64和CD32的结合力最低。人们发现IgG1-CH3不影响对Fcγ受体的结合。所有含无糖基化IgG4-CH2域的构建体均不结合C1q。
对Sprague-Dawley大鼠进行药代动力学研究以测定稳定性设计的IgG4/IgG1分子的稳定性和血清半衰期。根据Biogen Idec Institutional AnimalCare和Use Committee以及联邦、国家、城市对实验动物人道处理和管理准则给养大鼠。经静脉内向Sprague-Dawley雄性大鼠单次大剂量注射1mg/kg(1mg/ml)稀释于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的抗体。在注射后第0、0.25、0.5、1、2、6、24、48、96、168、216、264、336个小时处死大鼠。制备血清样本进行分析以量化抗体的水平。将样本稀释于补以5％正常小鼠血清的DAB中(Jackson ImmunoResearch 015-000-120)，并且检测试剂为Eu标记的小鼠抗人Fc抗体(Perkin Elmer 1244-330)，使用时最终浓度为250ng/ml。通过使用Excel的TREND函数与提纯抗体的标准曲线相比进行定量。
N297Q IgG4-CH2/IgG1-CH3的半衰期与T299A IgG4抗体的半衰期相同，正如所料比无糖基化IgG1的半衰期稍短(表8.5)。图10.C中标绘了该数据。
表8.1：1L培养物的蛋白质产量和通过分析尺寸排阻色谱测定的单体百分比％
  最终氨基酸取代   产量(mg)   单体百分比％
  pEAG2296   S228P/T299A/IgG1-CH3   7.24   98％
  pEAG2287   S228P/T299K/IgG1-CH3   14.2   100％
  EAG2412   S228P/N297Q/IgG1-CH3   13.75   99.30％
  YC407   S228P，T299A   4.07   96.90％
  CN579   S228P，T299K   11.55   90％
  EAG2391   N297Q   7.8   100％
表8.2：通过DSC测定的IgG4-CH2/IgG1-CH3构建体的解链温度
表8.3：搅拌期间各时间点的构建体的浊度和单体百分比％
Figure BDA0000093834270001561
表8.4：IgG4/IgG1变体的FcyR亲和力表征(NB表示未结合)
Figure BDA0000093834270001562
a未观察到结合
表8.5：大鼠稳定性设计的构建体的药代动力学
实施例9：T299是稳定性和效应子功能的决定因素
除非另外指出，本部分所述蛋白质源自5c8抗体，包含IgG1抗体的CH1域、CH2域和CH3域。如实施例3所述生产并提纯蛋白质。在pH为6.0和4.5下通过DSC测定突变对CH2域和CH3域的解链温度的影响(如实施例4详述)。本发明的无糖基化变体抗体的效应子功能通过其结合Fc受体或补体分子(如Clq)的能力表征。使用溶液亲合力表面等离子体共振分析对Fcγ受体的结合，并通过ELISA分析对补体因子C1q的结合(实施例6)。
如实施例3详述，在CHO中表达IgG1T299X和N297X/T299K无糖基化构建体，产量为7至30mg/L培养物(表9.1)。在位置N297加入另一突变结合T299K确实使CH2域的热稳定性降低了1.5℃至4.4℃(表9.2)。另外，T299X突变显示精氨酸(T299R)和赖氨酸(T299K)带正电的侧链稳定性升高最多(表9.2)。两个极性侧链-天门冬酰胺(T299N)和谷氨酰胺(T299Q)均显示稳定性比T299A高，但不及带正电的侧链高。脯氨酸(T299P)显示与T299A相比稳定性降低较少，并且较大的疏水性侧链苯丙氨酸(T299F)使CH2域的热稳定性降低2.4℃。最后，带负电的侧链谷氨酸(T299E)对CH2热稳定性影响非常小。这些结果证明了取代位置T299的带正电侧链的新性质以提高CH2域的热稳定性。
可以看出，N297X、T299K突变(CN645、CN646和CN647)均稍微增强了对CD64的亲合力，同时保持极低的对CD32a和CD16的亲合力(图11.B、图11.D和图11.F)。T299X突变显示一贯较低的对CD16的亲合力，然而在T299E的情况下，对CD32a的低亲合力得到提高(表9.3和图11.C、图9.E)。同样有趣的是注意到，仅带正电的侧链T299R和T299K对CD64的亲合力低(表9.3和图11.A)。最后，T299K、T299P和T299Q导致微量的Clq结合；T299N、T299E、T299F显示对C1q的结合稍有升高但仍十分低(图11.G和图11.H)。N297P/T299K、N297D/T299K和N297S/T299K显示不与C1q结合(图11.H)。
表9.1：1L培养物的蛋白质产量和通过分析尺寸排阻色谱测定的单体百分比％
  最终氨基酸取代   产量(mg)   单体百分比％
  CN647   N297D，T299K   7.4   100％
  CN646   N297S，T299K   30.47   98.50％
  CN645   N297P，T299K   9.3   100％
  EAG2389   T299Q   12.6   100％
  EAG2390   T299P   22.3   100％
  EAG2377   T299N   8.7   100％
  EAG2378   T299R   14.1   100.00％
  EAG2379   T299E   10.1   100％
  EAG2380   T299F   12.6   100％
表9.2：通过DSC测定的T299X构建体的解链温度
Figure BDA0000093834270001581
表9.3：T299X变体的FcyR亲合力表征(NB表示未结合)
Figure BDA0000093834270001582
实施例10.稳定Fc构建体显示稳定性突变体的应用与Fab无关
本部分所述蛋白质包含源自5c8抗体的结合位点。EAG2476构建体包含来自IgG4免疫球蛋白分子的Fc部分，并且EAG2478包含来自IgG1分子的Fc部分(EAG2476和EAG2478分别为YC406和CN578构建体的Fc型(无Fab))。
如实施例3所述生产并提纯蛋白质。在pH为6.0下通过DSC测定突变对CH2域和CH3域的解链温度的影响(如实施例4详述)。本发明的无糖基化变体抗体的效应子功能示于图12。通过其结合Fc受体的能力表征抗体。使用溶液亲合力表面等离子体共振分析对Fcγ受体的结合(实施例6)。
如实施例3详述在CHO中表达稳定Fc无糖基化构建体，(表10.1)详述了产量。CH2域内的突变(T299K、T307P和L309K)显示在Fab存在或不存在时热稳定性相同(表10.2)，以及具有相同的Fcγ受体结合亲合力(表10.3)。总之，正如所料本发明详述的稳定突变与Fab无关并且可适用于稳定Fc域，而不论Fab作用如何。
表10.1：4L培养物的蛋白质产量和通过分析尺寸排阻色谱测定的单体百分比％
  最终氨基酸取代   产量(mg)   单体百分比％
  EAG2476   YC406-Fc   207.4   96.50％
  EAG2478   CN578-Fc   184.8   96.30％
表10.2：通过DSC测定的Fc构建体的解链温度
表10.3：T299X变体的FcyR亲合力表征(NB表示未结合)
Figure BDA0000093834270001602
实施例11.通过氢/氘交换质谱分析和X射线晶体学测定的稳定无效应子抗 体的蛋白质构象、动力学和结构
结构和动力学明显有助于蛋白质功能。理解基础结构机制对于解释所观察到的功能性影响是关键的。因此，我们通过氢/氘交换质谱分析(H/DX MS)和x射线晶体学检查了先前详述的稳定性增强突变对蛋白质结构和动力学的影响。
A.氢/氘交换质谱分析
通过质谱分析检测氢/氘交换是一种表征蛋白质动力学和构象的方法。蛋白质动力学/构象影响蛋白质中氘交换为氢的速率，因此测定蛋白质随时间的氘化作用可说明蛋白质结构被修饰(诸如有突变)时构象的变化。因此，我们检查了稳定突变对无糖基化抗体Fc主链氢/氘交换的影响。
用pD为6.0的50mM磷酸钠、100mM氯化钠、D2O稀释抗体(于50mM磷酸钠、100mM氯化钠H2O中，pH 6.0)20倍并在室温下孵育不同时间段(10s、1min、10min、60min和240min)。通过用pH为2.4的200mM磷酸钠、0.5M TCEP和4M胍HCl、H2O按1∶1比例稀释将pH降至2.6来淬灭交换反应。将淬灭的样本消化，脱盐并使用基于nanoACQUITY平台的WatersUPLC系统在线分离。将约20pmole的交换淬灭抗体注入固定的胃蛋白酶柱。在15℃下于含0.05％甲酸的水中以0.1mL/min的流量进行在线消化2min。所得到的胃蛋白酶肽陷入保持在0℃下并用水和0.05％甲酸脱盐的ACQUITYUPLC BEH C181.7μm肽陷阱(Waters，Milford，MA)中。通过开关阀使流动转向，以40μL/min将捕获的肽从陷阱洗脱至保持在0℃下的Waters ACQUITYUPLC BEH C181.7μm、1mm×100mm柱(平均反向压力约为9000psi)。使用6min线性乙腈梯度(8-40％)和0.05％甲酸分离肽。将洗脱液导入具电喷雾离子化和锁定质量校正功能的Waters Synapt质谱仪(使用谷氨酸-纤维蛋白原肽)中。在260-1800m/z范围获得质谱。结合准确质量和MS/MS，辅以WatersIdentityE软件鉴定胃蛋白酶片段。如由Weis等所述的使用基于Excel的HX-Express程序测定肽的氘含量。
如以上所述收集完整IgG4.PvsN297Q IgG4.P、N297Q IgG4.PvsN297QIgG4.P-CH2/IgG1-CH3和T299A IgG4.PvsYC406(T299K、T207P、L309K、D399S)的H/DX-MS数据。比较完整(糖基化)IgG4和无糖基化N297Q IgG4显示其中无糖基化形式显示更多交换的序列区。在肽L235-F241、F241-D249、I253-V262、V263-F275和H310-E318中观察到更多的H/D交换。IgG4肽M358-L365、T411-V422和A431-S442比N297Q IgG4.P-CH2/IgG1-CH3构建体中的相同肽的交换率更高表示IgG1-CH3与N297Q IgG4-CH2结合产生的稳定性增加。这种情况下，来自IgG4的CH3域显示CH3的3个不同区的交换率高于IgG1-CH3。最后，在由于去糖基化特别更易于交换的序列区中，肽L235-F241、F241-M252、V263-F275、V266-F275和V282-F296显示突变构建体YC406的稳定性比无糖基化IgG4(T299A)高。有趣的是，CH3域中的D399S突变在稍微提高热稳定性的同时使交换比野生型序列高。总的说来，H/D交换MS表明稳定性突变部分或完全恢复了由于去糖基化而产生的构象变化。
B.稳定性增强的Fc构建体的X射线晶体学
结晶EAG2476构建体(agly IgG4-Fc T299K、T307P、L309K、D399S)，数据收集为
Figure BDA0000093834270001621
分辨率(总数据完整性为92％；壳分辨率高达66％)。将结构分别构建为电子密度并精确为27.7/33.9％的R/R游离度。结构显露出不对称单元(ASU)中的两条Fc链，这两条链之间可以很小的偏差重叠。环V266-E272，尤其是P291-V302与野生型IgG4晶体结构(pdb 1ADQ)中观察到的完全不同。这可能是突变T299K的直接结果。
EAG2478构建体(agly IgG1Fc T299K)的晶体结构解为
Figure BDA0000093834270001622
分辨率(总数据完整性为92％；壳分辨率高达66％)。将结构分别构建并精确为27.4/35.8％的R/R游离度。与EAG2476结构不同，EAG2478结构中ASU的两条Fc链不同。观察到A链与酶促去糖基化IgG1Fc(pdb 3DNK)的结构更相似。EAG2478结构中的CH2域比酶促去糖基化IgG1Fc(pdb 3DNK)和鼠无糖基化IgG1Fc(pdb 3HKF)中观察到的更紧密。EAG2476结构中CH2域比在EAG2478结构中观察到的开口更大。结构显示两种情况下T299K突变均朝向停驻FcγIII受体的Y129侧链，这可解释观察到的该突变降低受体亲合力的的原因。
等效方案
对于本领域的技术人员而言，仅仅使用常规实验，存在本文所述发明的具体实施方案的等效方案。旨在将这些等效方案涵盖于以下权利要求书中。
Figure IDA0000093834340000011
Figure IDA0000093834340000021
Figure IDA0000093834340000031
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Claims (66)

1.一种包含嵌合Fc区的稳定多肽，其中所述稳定多肽包含至少一个来自IgG4同种型的IgG抗体的CH2域和至少一个来自IgG1同种型的IgG抗体的CH3域，其中所述稳定多肽包含位于一个或多个选自297、299、307、309、399、409和427(欧盟编号规定)的氨基酸位置的一个或多个稳定Fc氨基酸。
2.根据权利要求1所述的稳定多肽，其中所述嵌合Fc区包含铰链、来自IgG4同种型的IgG抗体的CH1域和CH2域和来自IgG1同种型的IgG抗体的CH3域，并且其中所述抗体包含位于氨基酸位置228(欧盟编号)的脯氨酸。
3.一种包含来自IgG4抗体的Fc区的CH2部分的稳定多肽，其中所述稳定多肽包含位于一个或多个选自240F、262L、264T、266F、297Q、299A、299K、307P、309K、309M、309P、323F、399S和427F(欧盟编号规定)的氨基酸位置的一个或多个稳定氨基酸。
4.根据权利要求3所述的稳定多肽，其包含位于氨基酸位置297的谷氨酰胺。
5.一种包含来自IgG1抗体的Fc区的CH2部分的稳定多肽，其中所述稳定多肽包含位于一个或多个选自299K和297D(欧盟编号规定)的氨基酸位置的一个或多个稳定氨基酸。
6.根据权利要求4所述的稳定多肽，其包含位于氨基酸位置299的赖氨酸。
7.根据权利要求5所述的稳定多肽，其包含位于氨基酸位置299的赖氨酸和位于氨基酸位置297的天冬氨酸。
8.根据权利要求4所述的稳定多肽，其中所述Fc区为无糖基化Fc区。
9.根据前述权利要求中任一项所述的稳定多肽，其中IgG抗体为人源抗体。
10.根据前述权利要求中任一项所述的稳定多肽，其中相对于缺乏稳定氨基酸的亲本多肽，所述稳定多肽的解链温度(Tm)至少升高1℃。
11.根据权利要求10所述的稳定多肽，其中所述稳定Fc多肽的解链温度(Tm)升高约1℃或更多、约2℃或更多、约3℃或更多、约4℃或更多、约5℃或更多、约6℃或更多、约7℃或更多、约8℃或更多、约9℃或更多、约10℃或更多、约15℃或更多和约20℃或更多。
12.根据权利要求10所述的稳定多肽，其中在中性pH(约6.5至约7.5)下所述解链温度(Tm)升高。
13.根据权利要求10所述的稳定多肽，其中在约6.5或更低、约6.0或更低、约5.5或更低、约5.0或更低、约4.5或更低和约4.0或更低的酸性pH下，所述解链温度(Tm)升高。
14.根据前述权利要求中任一项所述的稳定多肽，其中相对于缺乏稳定突变的亲本多肽，所述稳定多肽以更高的产量表达。
15.根据权利要求14所述的稳定多肽，其中在细胞培养物中稳定Fc多肽以产量为约5mg/L或更高、约10mg/L或更高、约15mg/L或更高、约20mg/L或更高表达。
16.根据前述权利要求中任一项所述的稳定多肽，其中相对于缺乏所述稳定氨基酸的亲本多肽，所述稳定多肽的浊度降低。
17.根据权利要求16所述的稳定多肽，其中所述浊度以选自以下各项的倍数降低：约1倍或更高、约2倍或更高、约3倍或更高、约4倍或更高、约5倍或更高、约6倍或更高、约7倍或更高、约8倍或更高、约9倍或更高、约10倍或更高、约15倍或更高、约50倍或更高和约100倍或更高。
18.根据前述权利要求中任一项所述的稳定多肽，其中与缺乏所述稳定突变的亲本Fc多肽相比，所述稳定多肽的效应子功能降低。
19.根据权利要求18所述的稳定多肽，其中所述降低的效应子功能为降低的ADCC活性。
20.根据权利要求18所述的稳定多肽，其中所述降低的效应子功能为降低的与选自FcγRI、FcγRII和FcγRIII的Fc受体(FcR)的结合。
21.根据权利要求18所述的稳定多肽，其中所述效应子功能以选自以下各项的倍数降低：约1倍或更多、约2倍或更多、约3倍或更多、约4倍或更多、约5倍或更多、约6倍或更多、约7倍或更多、约8倍或更多、约9倍或更多、约10倍或更多、约15倍或更多、约50倍或更多和约100倍或更多。
22.根据前述权利要求中任一项所述的稳定多肽，其中与亲本Fc多肽相比，所述稳定多肽的半衰期增加。
23.根据权利要求22所述的稳定多肽，其中所述半衰期增加归因于与新生儿受体(FcRn)的结合增强。
24.根据权利要求22所述的稳定多肽，其中所述半衰期以选自以下各项的倍数增加：约1倍或更多、约2倍或更多、约3倍或更多、约4倍或更多、约5倍或更多、约6倍或更多、约7倍或更多、约8倍或更多、约9倍或更多、约10倍或更多、约15倍或更多、约50倍或更多和约100倍或更多。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的稳定多肽，其中所述Fc区为包含两条多肽链的二聚Fc区。
26.根据权利要求1至24中任一项所述的稳定多肽，其中所述Fc区为单链Fc区。
27.根据前述权利要求中任一项所述的稳定多肽，其中所述Fc区的所有Fc部分均被无糖基化。
28.根据权利要求7所述的稳定多肽，其中所述无糖基化Fc区包含位于Fc区的位置299(欧盟编号规定)的取代。
29.根据权利要求7所述的稳定多肽，其中所述无糖基化Fc区由于其在细菌宿主细胞中生成而被无糖基化。
30.根据权利要求7所述的稳定多肽，其中所述无糖基化Fc区由于通过化学或酶促方法的去糖基化作用而被无糖基化。
31.根据权利要求7所述的稳定多肽，其中所述无糖基化Fc区包含嵌合铰链域。
32.根据权利要求31所述的稳定多肽，其中所述嵌合铰链域包含位于氨基酸位置228(欧盟编号规定)用脯氨酸残基进行的取代。
33.根据权利要求1所述的稳定多肽，其中所述稳定氨基酸独立地选自以下氨基酸：(i)位于位置297的不带电氨基酸、(ii)位于位置299的带正电的氨基酸、(iii)位于位置307的极性氨基酸、(iv)位于位置309的带正电的氨基酸或极性氨基酸、(v)位于位置399的极性氨基酸、(vi)位于位置409的带正电的氨基酸或极性氨基酸和(vii)位于位置427的极性氨基酸。
34.根据权利要求1所述的稳定多肽，其中至少一个稳定氨基酸为位于氨基酸位置297(欧盟编号)的谷氨酰胺。
35.根据前述权利要求中任一项所述的稳定多肽，其中至少一个所述稳定氨基酸为位于位置299的赖氨酸(K)或酪氨酸(Y)。
36.根据前述权利要求中任一项所述的稳定多肽，其中至少一个所述稳定氨基酸为位于位置307的脯氨酸(P)或甲硫氨酸(M)。
37.根据前述权利要求中任一项所述的稳定多肽，其中至少一个所述稳定氨基酸为位于位置309的脯氨酸(P)、甲硫氨酸(M)或赖氨酸(K)。
38.根据前述权利要求中任一项所述的稳定多肽，其中至少一个所述稳定突变为位于位置399的丝氨酸(S)。
39.根据前述权利要求中任一项所述的稳定多肽，其中所述Fc区可操作地连接至结合位点。
40.根据权利要求39所述的稳定多肽，其中所述结合位点选自抗原结合位点、受体的配体结合部分或配体的受体结合部分。
41.根据权利要求39所述的稳定多肽，其中所述结合位点源自选自以下各项修饰的抗体：scFv、Fab、微型抗体、双链抗体、三链抗体、纳米抗体、骆驼抗体和Dab。
42.根据权利要求39所述的稳定多肽，其为稳定的全长抗体。
43.根据权利要求39所述的稳定多肽，其中所述抗体选自单克隆抗体、嵌合抗体、人源抗体和人源化抗体。
44.根据权利要求39所述的稳定多肽，其中所述稳定的全长抗体与常规或稳定的scFv分子融合。
45.根据权利要求39所述的稳定多肽，其为稳定的免疫粘附素。
46.根据权利要求39所述的稳定多肽，其中结合位点覆盖在所述稳定多肽的Fc区的表面。
47.根据权利要求39所述的稳定多肽，其中所述结合位点源自非免疫球蛋白结合分子。
48.根据权利要求47所述的稳定多肽，其中所述非免疫球蛋白结合分子选自adnectin、亲合体、DARPin和anticalin。
49.根据权利要求40所述的稳定多肽，其中所述受体的配体结合部分源自选自以下各项的受体：免疫球蛋白(Ig)超家族的受体、TNF受体超家族的受体、G蛋白偶联受体(GPCR)超家族的受体、酪氨酸激酶(TK)受体超家族的受体、配体门控(LG)超家族的受体、趋化因子受体超家族的受体、IL-1/Toll样受体(TLR)超家族、神经胶质源神经营养因子(GDNF)受体家族的受体和细胞因子受体超家族。
50.根据权利要求40所述的稳定多肽，其中所述配体的受体结合部分源自抑制性配体。
51.根据权利要求40所述的稳定多肽，其中所述配体的受体结合部分源自活化配体。
52.根据权利要求50或51所述的结合多肽，其中所述配体结合选自以下各项的受体：免疫球蛋白(Ig)超家族的受体、TNF受体超家族的受体、G蛋白偶联受体(GPCR)超家族的受体、酪氨酸激酶(TK)受体超家族的受体、配体门控(LG)超家族的受体、趋化因子受体超家族的受体、IL-1/Toll样受体(TLR)超家族和细胞因子受体超家族。
53.一种包含根据前述权利要求中任一项所述的稳定多肽的组合物和一种药学上可接受的载体。
54.一种包含编码前述权利要求中任一项所述的稳定结合多肽的核苷酸序列的核酸分子。
55.一种包含编码权利要求25所述的稳定结合多肽的多肽链的核苷酸序列的核酸分子。
56.一种包含权利要求54或55所述的核酸分子的载体。
57.一种表达权利要求56所述的载体的宿主细胞。
58.一种生成本发明的稳定Fc多肽的方法，所述方法包括在培养基中培养权利要求57所述的宿主细胞以便生成所述稳定Fc多肽。
58.一种稳定包含无糖基化嵌合Fc区或其部分的亲本Fc多肽的方法，所述方法包括用稳定氨基酸取代Fc区的至少一个Fc部分中的所选氨基酸从而生成相对于所述原多肽稳定性增强的稳定Fc多肽，其中对选自297、299、307、309、399、409和427(欧盟编号规定)的Fc部分的氨基酸位置进行所述取代。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述嵌合Fc区包含来自IgG4同种型的IgG抗体的CH2域和来自IgG1同种型的IgG抗体的CH3域。
60.根据权利要求58所述的方法，其中存在于所述稳定Fc多肽的氨基酸位置和氨基酸选自297Q、299A、299K、307P、309K、309M、309P、323F、399E、399S、409K、409M和427F。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述稳定Fc多肽包含位于位置297(欧盟编号)的谷氨酰胺。
62.一种大批生产包含稳定Fc区的多肽的方法，所述方法包括：
(a)将至少一个稳定Fc部分基因融合至多肽以形成稳定的融合蛋白；
(b)用编码所述稳定的融合蛋白的核酸分子转染哺乳动物宿主细胞；
(c)在使得稳定的融合蛋白表达的条件下，在10L或更多的培养基中培养步骤(f)的宿主细胞；
从而生成稳定的融合蛋白。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述稳定的Fc区为包含来自IgG4同种型的IgG抗体的CH2域和来自IgG1同种型的IgG抗体的CH3域的嵌合Fc。
64.根据权利要求62所述的方法，其中所述稳定的Fc区包含位于氨基酸位置297(欧盟编号)的谷氨酰胺。
65.一种治疗或预防受试者疾病或病症的方法，所述方法包括对患有所述疾病或病症的受试者施用权利要求53所述的组合物从而治疗或预防疾病或病症。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述疾病或病症选自炎症性疾病、神经障碍、自身免疫性疾病和肿瘤性疾病。
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