TW202322850A

TW202322850A - 抗體最佳化

Info

Publication number: TW202322850A
Application number: TW111129127A
Authority: TW
Inventors: 布萊恩大衛鮑斯; 大衛約翰斯托克爾
Original assignee: 美商美國禮來大藥廠
Priority date: 2021-08-05
Filing date: 2022-08-03
Publication date: 2023-06-16
Also published as: EP4380971A1; WO2023015280A1; JP2024530932A

Abstract

本發明係關於開發、設計及生產治療抗體以改良抗體或抗體藥物共軛物之可開發性的方法。

Description

抗體最佳化

本發明屬於醫學領域。更特定言之，本發明提供開發、設計及生產治療抗體及其共軛物之方法。在特定實施例中，本文所揭示之方法提供抗體或抗體藥物共軛物之可開發性的提高，例如黏度及/或聚集的降低。

已開發出治療抗體來治療多種疾病。治療抗體之開發中面臨的常見挑戰包括例如高黏度、聚集、低溶解度、半衰期延長及免疫原性。此等挑戰中之一些可能影響治療抗體之穩定性，其在調配用於遞送時可能進一步加劇。雖然治療抗體通常經由靜脈內(IV)輸注投與，但皮下投與提供優於IV之若干優點，諸如更有效的藥物動力學概況、自投藥之選擇，其對於需要頻繁長期給藥之慢性疾病很重要。此外，皮下投與實現即用型預填遞送裝置，提供更高患者舒適度、縮短治療時間、潛在地改良順應性、治療結果且降低成本。

然而，適用於皮下投與之治療抗體調配物的開發提出了多重挑戰，特定言之，可用於皮下投與之體積有限，使高度濃縮之抗體溶液成為必要。高度濃縮之抗體溶液可導致黏度增加及/或聚集。高黏度可增加注射時間及注射部位處之疼痛，影響患者順應性，且亦可在生物加工期間使藥物物質不穩定，影響藥物動力學概況、生物活性，增加製造成本且可能阻礙藥物在開發中之進展。類似地，聚集造成重大問題，因為高濃度溶液之趨勢增加蛋白質-蛋白質相互作用之可能性，其轉而有利於聚集。

已研究降低抗體治療劑黏度之方法。此類方法包括修改調配條件，諸如調節pH、緩衝條件、離子強度或添加其他賦形劑。然而，已證實此等方法在解決更廣範圍之抗體治療劑之黏度問題中受到限制。例如，在一些情況下，修改調配條件可能需要額外製造方法步驟，影響穩定性、聚集、免疫原性及/或藥物動力學概況，以上所有者均可能成本高昂且損害抗體治療劑之開發。另外，報導了最佳化IgG1抗體之可變區中之胺基酸序列以降低黏度之嘗試(Tomar等人, Mabs 2016, 8(2): 216-228)。然而，此類方法侷限於經最佳化之特定抗體可變區。因此，仍需要在高濃度下降低治療抗體黏度之額外方法，其中該等方法適用於廣泛範圍之抗體治療劑，諸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體，且不限於所關注之特定治療劑，且其中此類方法不會不利地影響親和力、穩定性、聚集、免疫原性或生物功能，且不需要成本高昂的方法或調配物變化。

已研究改良肽及小蛋白質之半衰期的方法，諸如將肽融合至抗體之Fc部分以延長時間。在一些情況下，此類方法涉及在由鉸鏈、CH2及CH3域構成之抗體Fc的N或C端上表現較小蛋白質或肽。此類型之融合可藉由例如降低腎清除率來改良半衰期。然而，此類融合可導致融合蛋白質之黏度增加或pH穩定性降低，其可能需要顯著的調配物最佳化或肽或蛋白質序列之進一步工程化。

因此，本發明藉由提供用於改良抗體治療劑之可開發性的替代組合物及方法，諸如藉由在高濃度下降低抗體或抗體藥物共軛物之黏度及/或延長半衰期來解決上述需求中之一或多者。具體而言，本發明提供包含修飾抗體之恆定區之組合物及方法，其中該等方法不會不利地影響抗體親和力、聚集及/或穩定性，或諸如效應功能之生物功能，或不需要調配中及下游製造方法中成本高昂的變化。更具體而言，本發明提供包含抗體之IgG重鏈恆定域中之胺基酸取代之組合物及方法，其可適用於抗體治療劑，諸如IgG2、IgG3或IgG4抗體治療劑之廣泛平台。

因此，在特定實施例中，本發明提供具有經修飾之人類IgG重鏈(HC)恆定區之抗體，該恆定區與野生型人類IgG重鏈恆定區相比包含以下胺基酸取代中之一或多者：E137G、D203N、Q274K、Q355R、E419Q (所有位置根據EU編號進行編號)。因此，在特定實施例中，本發明提供一種抗體，其包含具有恆定重鏈1 (CH1)域、恆定重鏈2 (CH2)域及恆定重鏈3 (CH3)域之人類IgG HC恆定區及人類IgG輕鏈(LC)恆定區，其中該人類IgG HC恆定區包含：CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸；CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸；CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸；CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸；CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸及CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸；CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸及CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸；CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸及CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸；CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸及CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸；CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸及CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸及CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸；CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸及CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸及CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸；CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸及CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸及CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸及CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸；CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸及CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸；CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸及CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸及CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸及CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸；CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸及CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸、CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸、CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸；CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸、CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸、CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸、CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸及CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸、CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸及CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸、CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸及CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸；CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸、CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸及CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸、CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸及CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸、CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸及CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸、CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸、CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸及CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；或CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸、CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸、CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸及CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺。

在特定實施例中，本發明提供具有經修飾之人類IgG重鏈(HC)恆定區之抗體，該恆定區與野生型人類IgG重鏈恆定區相比包含以下胺基酸取代中之兩者或更多者：E137G、D203N、Q274K、Q355R、E419Q、R409K (所有位置根據EU編號進行編號)。因此，在特定實施例中，本發明提供具有經修飾之人類IgG重鏈(HC)恆定區之抗體，該恆定區與野生型人類IgG重鏈恆定區相比包含以下胺基酸取代中之三者或更多者：E137G、D203N、Q274K、Q355R、E419Q、R409K (所有位置根據EU編號進行編號)。

根據一些實施例，本發明提供一種抗體，其包含具有CH1、CH2及CH3域之人類IgG HC恆定區及人類IgG輕鏈恆定區，其中該人類IgG HC恆定區包含：CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸；CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸；CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸；CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸及CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸；CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸及CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸；CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸及CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸；或CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸及CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸。

根據其他實施例，本發明提供一種抗體，其包含具有CH1、CH2及CH3域之人類IgG HC恆定區及人類IgG輕鏈恆定區，其中該人類IgG重鏈恆定區包含CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸及CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸。

在其他實施例中，本發明之抗體包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3。

在一些實施例中，本發明之抗體具有人類IgG2、人類IgG3或人類IgG4同型。在一些實施例中，本發明之抗體具有人類IgG4同型。在一些實施例中，如本文所述之抗體包含經修飾之人類IgG4鉸鏈區，該鉸鏈區包含S228P突變(EU編號)，其減少活體內IgG4 Fab臂交換(參見Labrijn等人, Nat. Biotechnol. 2009, 27(8):767)。在一些實施例中，本文所述之抗體具有經修飾之IgG4 Fc區，其具有減少或消除之Fc效應功能(亦即無IgG4 Fc效應子)。此類抗體包含例如IgG4 Fc域中之胺基酸殘基修飾F234A及/或L235A以減少與FcγR之結合(所有殘基根據EU編號進行編號)。在一些實施例中，本文所述之抗體包含在殘基228處包含脯胺酸之IgG4鉸鏈區，及在殘基234及235處包含丙胺酸之IgG4 Fc區(所有殘基根據EU編號進行編號)。

在一些實施例中，本發明之抗體包含人類IgG重鏈恆定區，該恆定區包含SEQ ID NO: 8、9、10、12、13或16中之任一者。

在一些實施例中，本發明亦提供包含本文所揭示之抗體的抗體藥物共軛物。

在一些實施例中，本發明之抗體具有經修飾之人類IgG HC恆定區，其降低抗體之黏度及/或改良其穩定性。在一些實施例中，相較於包含野生型人類IgG重鏈恆定區之野生型抗體，本發明之抗體或抗體藥物共軛物具有降低之黏度。在本發明之其他實施例中，該抗體或抗體藥物共軛物之黏度相較於野生型抗體降低約25%至約80%。在一些實施例中，本發明之抗體具有經修飾之人類IgG4 HC恆定區，該恆定區與野生型人類IgG4 HC恆定區相比包含以下胺基酸取代中之一或多者：E137G、D203N、Q274K、Q355R、E419Q (所有位置根據EU編號進行編號)。在一些實施例中，本發明之抗體具有經修飾之人類IgG4 HC恆定區，該恆定區與野生型人類IgG4 HC恆定區相比包含以下胺基酸取代中之一或多者：Q274K、Q355R、E419Q。在一些實施例中，本發明之抗體或抗體藥物共軛物具有經修飾之人類IgG4 HC恆定區，其將該抗體之黏度降低約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約80%、約85%、約90%或約100%。在一些實施例中，本發明之抗體具有用於遞送至患者之治療學上可接受之黏度。在此等實施例中，黏度係低於14 cP、低於12 cP或低於10 cP。在一些實施例中，藉由皮下投與或藉由靜脈內投與來投與抗體。

在一些實施例中，本發明之抗體具有經修飾之人類IgG2 HC恆定區，其包含以下胺基酸殘基中之一或多者：E137G、D203N、Q274K (所有位置根據EU編號進行編號)。在一些實施例中，本發明之抗體具有經修飾之人類IgG3 HC恆定區，其包含胺基酸殘基Q274K (根據EU編號進行編號)。在此類實施例中，該等人類IgG2及/或人類IgG3抗體相較於包含野生型人類IgG2或人類IgG3重鏈恆定區之各別野生型抗體具有降低之黏度。

在一些實施例中，本發明提供降低人類IgG4抗體之黏度之方法，其包含產生人類IgG4抗體之變異體，該變異體包含具有CH1、CH2及CH3域之經修飾之人類IgG4重鏈恆定區及人類IgG輕鏈恆定區，其中該經修飾之人類IgG4重鏈恆定區包含以下胺基酸殘基：CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸；CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸；CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸；CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸；CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸及CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸；CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸及CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸；CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸及CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸；CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸及CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸；CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸及CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸及CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸；CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸及CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸及CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸；CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸及CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸及CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸及CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸；CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸及CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸；CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸及CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸及CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸及CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸；CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸及CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸、CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸、CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸；CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸、CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸、CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸、CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸及CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸、CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸及CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸、CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸及CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸；CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸、CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸及CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸、CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸及CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸、CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸及CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸、CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸、CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸及CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；或CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸、CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸、CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸及CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺。

在一些實施例中，本發明提供降低人類IgG4抗體之黏度之方法，其包含產生人類IgG4抗體之變異體，該變異體包含具有CH1、CH2及CH3域之經修飾之人類IgG4重鏈恆定區及人類IgG輕鏈恆定區，其中該經修飾之人類IgG4重鏈恆定區包含以下胺基酸殘基：CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸；CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸；CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸；CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸及CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸；CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸及CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸；CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸及CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸；或CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸及CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸。

在一些實施例中，本發明提供降低人類IgG4抗體之黏度之方法，其包含產生人類IgG4抗體之變異體，該變異體包含具有CH1、CH2及CH3域之經修飾之人類IgG4重鏈恆定區及人類IgG輕鏈恆定區，其中該經修飾之人類IgG4重鏈恆定區包含以下胺基酸殘基：CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸及CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸。

在一些實施例中，提供編碼本發明之抗體之核酸序列。在本發明之一些實施例中，提供編碼抗體之HC或LC之核酸。在本發明之一些實施例中，提供編碼抗體之VH或VL之核酸。本發明之一些實施例提供包含編碼抗體HC或LC之核酸序列的載體。本發明之一些實施例提供包含編碼抗體VH或VL之核酸序列的載體。

本發明之核酸可在宿主細胞中表現，例如在核酸已可操作地連接於表現控制序列之後。能夠表現其可操作地連接之核酸的表現控制序列為此項技術中所熟知。表現載體可包括編碼一或多種信號肽之序列，該一或多種信號肽促進多肽自宿主細胞之分泌。含有所關注核酸(例如編碼抗體之重鏈或輕鏈之核酸)之表現載體可藉由熟知方法轉移至宿主細胞中，例如穩定或短暫轉染、轉型、轉導或感染。另外，表現載體可包含一或多種選擇標記，例如四環素、新黴素及二氫葉酸還原酶，以輔助偵測經所需核酸序列轉型之宿主細胞。

在另一態樣中，本文提供包含本文所描之核酸、載體或核酸組合物之細胞，例如宿主細胞。宿主細胞可為經表現本文所述之抗體之全部或一部分的一或多種表現載體穩定或短暫轉染、轉型、轉導或感染的細胞。在一些實施例中，宿主細胞可經表現本發明抗體之HC及LC多肽之表現載體穩定或短暫轉染、轉型、轉導或感染。在一些實施例中，宿主細胞可經表現本文所述抗體之HC多肽之第一載體及表現LC多肽之第二載體穩定或短暫轉染、轉型、轉導或感染。此類宿主細胞，例如哺乳動物宿主細胞可表現特異性結合如本文所述之人類IL-4Rα之抗體。已知能夠表現抗體之哺乳動物宿主細胞包括CHO細胞、HEK293細胞、COS細胞及NS0細胞。

在一些實施例中，細胞，例如宿主細胞包含第一載體及第二載體，該等載體包含編碼如本文所提供之抗體之核酸序列。在其他實施例中，宿主細胞為哺乳動物細胞。

本發明進一步提供一種生產如本文所述之抗體或其抗體結合片段之方法，其藉由在使該抗體表現之條件下培養上文所述之宿主細胞，例如哺乳動物宿主細胞，且自培養基回收經表現之抗體。可藉由習知技術純化已分泌抗體之培養基。可採用各種蛋白質純化方法，且此類方法為此項技術中已知的且描述於例如Deutscher, Method in Enzymology 182: 83-89 (1990)及Scopes, Protein Purification:Principles and Practice, 第3版, Springer, NY (1994)中。

本發明進一步提供藉由本文所述之方法中之任一者生產之抗體或其抗體結合片段。

在另一態樣中，本文提供包含本文所述之抗體、核酸或載體之醫藥組合物。此類醫藥組合物亦可包含一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。醫藥組合物可藉由此項技術中所熟知之方法製備(例如 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第22版. (2012), A. Loyd等人, Pharmaceutical Press)。

在一些實施例中，本發明提供用於治療之抗體及抗體藥物共軛物。在一些實施例中，本發明提供用於治療醫學病況之抗體及抗體藥物共軛物。在一些實施例中，該醫學病況為癌症、心血管疾病、自體免疫疾病或神經退化疾病。

在其他實施例中，本發明提供抗體或抗體藥物共軛物之用途，其用於製造供治療癌症、心血管疾病、自體免疫疾病或神經退化疾病用之藥劑。

在其他實施例中，本發明提供投與治療有效量之如本文所揭示之抗體或抗體藥物共軛物的方法，其中該抗體或抗體藥物共軛物係靜脈內投與。在其他實施例中，本發明提供投與治療有效量之如本文所揭示之抗體或抗體藥物共軛物的方法，其中該抗體或抗體藥物共軛物係皮下投與。

如本文所用，術語「抗體」係指結合抗原之免疫球蛋白分子。抗體之實施例包括單株抗體、多株抗體、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、雙特異性或多特異性抗體，或共軛抗體。抗體可具有任何類別(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA)，及任何子類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。

如本文可互換使用之術語「抗體共軛物」或「共軛抗體」或「抗體藥物共軛物」係指抗體或其片段與非抗體分子之複合物，該片段可包含抗體之抗原結合片段或抗體之恆定域片段。在一個實施例中，抗體與非抗體分子經連接子連接。

如本文所用，術語「非抗體分子」係指不為免疫球蛋白分子之分子。在一個實施例中，非抗體分子為包含2個或更多個胺基酸殘基之肽。在另一實施例中，非抗體分子為小分子藥物。在另一實施例中，非抗體分子為寡核苷酸。

在另一實施例中，寡核苷酸為RNA寡核苷酸。在另一實施例中，寡核苷酸為RNAi寡核苷酸。在另一實施例中，寡核苷酸為雙股寡核苷酸。在另一實施例中，寡核苷酸經化學修飾。

例示性抗體為由四條多肽鏈構成之免疫球蛋白G(IgG)型抗體：經由鏈間二硫鍵交聯之兩條重鏈(HC)及兩條輕鏈(LC)。四條多肽鏈中之各者之胺基端部分包括具有約100-125個或更多個主要負責抗原識別之胺基酸的可變區。四條多肽鏈中之各者之羧基端部分含有主要負責效應功能之恆定區。各重鏈由重鏈可變區(VH)及重鏈恆定區構成。恆定區係指抗體之區域，其包含抗體重鏈之Fc區及CH1域。各輕鏈由輕鏈可變區(VL)及輕鏈恆定區構成。IgG同型可進一步分為子類(例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)。恆定區中之胺基酸殘基之編號係基於如Kabat. Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Bethesda, MD: U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health (1991)中之EU索引。術語EU索引編號或EU編號在本文中可互換使用。

VH及VL區可進一步細分為稱為互補決定區(CDR)之高變區，其穿插有稱為構架區(FR)之更保守區域。CDR暴露於蛋白質表面上，且為抗體之抗原結合特定性的重要區域。各VH及VL由自胺基端至羧基端按以下次序佈置之三個CDR及四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。本文中，重鏈之三個CDR稱為「HCDR1、HCDR2及HCDR3」且輕鏈之三個CDR稱為「LCDR1、LCDR2及LCDR3」。CDR含有與抗原形成特異性相互作用之大部分殘基。胺基酸殘基分配至CDR可根據熟知方案，包括以下各者中所述之彼等方案進行：Kabat (Kabat等人, 「Sequences of Proteins of Immunological Interest,」 National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))、Chothia (Chothia等人, 「Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins」, Journal of Molecular Biology, 196, 901-917 (1987)；Al-Lazikani等人, 「Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins」, Journal of Molecular Biology, 273, 927-948 (1997))、North (North等人, 「A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations」, Journal of Molecular Biology, 406, 228-256 (2011))或IMGT (在www.imgt.org可用之國際ImMunoGeneTics資料庫；參見Lefranc等人, Nucleic Acids Res. 1999; 27:209-212)。North CDR定義係用於特異性結合本文所述之人類IL-4Rα之抗體。

本發明之實施例亦包括抗體片段或抗原結合片段，諸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv、scFab、二硫鍵連接之Fv (sdFv)、Fd片段，其可例如融合至Fc區或IgG重鏈恆定區。

如本文所用，術語「Fc區」係指抗體之區域，其包含抗體重鏈之CH2及CH3域。視情況，Fc區可包括抗體重鏈之鉸鏈區之一部分或整個鉸鏈區。諸如效應功能之生物活性可歸因於Fc區，該等生物活性隨抗體同型變化。抗體效應功能之實例包括Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞介導之吞噬作用(ADCP)、C1q結合、補體依賴性細胞毒性(CDC)、吞噬作用、細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調；及B細胞活化。

如本文中所提及之「野生型」抗體為包含人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體之天然重鏈恆定區(包括天然Fc)及天然輕鏈恆定區之抗體。

除非另外指明，否則如本文所用之術語「結合(bind)」及結合(binds)」欲意謂蛋白質或分子與另一蛋白質或分子形成化學鍵或吸引相互作用之能力，其導致兩種蛋白質或分子接近，如藉由此項技術中已知之常用方法所測定。

如在本文中可互換使用之術語「核酸」或「多核苷酸」係指併有天然核苷酸、經修飾核苷酸及/或核苷酸類似物之核苷酸聚合物，包括單股及/或雙股含核苷酸之分子，諸如DNA、cDNA及RNA分子。本發明之多核苷酸亦可包括例如藉由DNA或RNA聚合酶或合成反應併入其中之受質。

如本文所用之術語「個體」係指哺乳動物，包括但不限於人類、黑猩猩、猿、猴、牛、馬、綿羊、山羊、豬、兔、狗、貓、大鼠、小鼠、天竺鼠及其類似動物。較佳地，個體為人類。

如本文所用之術語「抑制」係指例如生物反應或活性之減低、降低、減緩、減少、停止、破壞、取消、拮抗或阻斷，但未必指示生物反應之完全消除。

如本文所用之術語「治療(treatment)」或「治療(treating)」係指其中可存在減緩、控制、延遲或停止本文所揭示之病症或疾病進展，或改善病症或疾病症狀，但未必指示完全消除所有病症或疾病症狀之所有過程。治療包括投與用於治療患者，尤其人類之疾病或病況之蛋白質或核酸或載體或組合物。

如本文所用，術語「約」意謂在5%內。

如本文所用，除非本文中另外指示或與上下文明顯矛盾，否則本發明之上下文中(尤其在申請專利範圍之上下文中)所用之術語「一(a/an)」、「該」及類似術語應解釋為涵蓋單數及複數兩者。

本申請案根據35 U.S.C. §119(e)主張2021年8月5日申請之美國臨時申請案序號63/229,772及2021年11月5日申請之序號63/276,145的權益；該等申請案之揭示內容以引用之方式併入本文中。

實例 1 ： 抗體產生 及工程化 抗體工程化、表現及純化 ：在重鏈(HC)恆定區中工程化例示抗體分子1、2、3、4、5、6及7以經由電荷平衡改良黏度，從而減少Fab與Fc之間的潛在靜電相互作用。相較於人類IgG1之HC恆定區，人類IgG4抗體之HC CH1、CH2及CH3域由於不均勻電荷分佈而具有更低等電點(pI) (表1)。IgG4之CH1、CH2及CH3域中之五個胺基酸殘基被鑑定為影響電荷平衡：1) E137 (CH1域)，2) D203 (CH1域)，3) Q274 (CH2域)，4) Q355 (CH3域)及5) E419 (CH3域)。人類IgG4 HC恆定區與人類IgG1 HC恆定區之比對(圖1)顯示此等胺基酸殘基之類似位置在人類IgG1 HC恆定區中不同，且發現其影響各域之總體pI。人類IgG1、IgG2、IgG3及IgG4 HC恆定區之比對(圖1)亦顯示GNKRQ胺基酸之類似位置在某些位置處不同。

為使IgG4抗體之CH2及CH3域兩者之pI與IgG1抗體匹配，且為最大限度地減少免疫原性肽之潛在引入，將IgG4 Fc中之五個經鑑定位置中之三者處之殘基轉化為IgG1野生型Fc中發現之對應殘基。胺基酸殘基取代包括：帶正電離胺酸取代位置274處之不帶電麩醯胺酸(Q274K)、帶正電精胺酸取代位置355處之不帶電麩醯胺酸(Q355R)及不帶電麩醯胺酸取代位置419處之帶負電麩胺酸(E419Q)。所得IgG4 Fc稱為「KRQ」。為使IgG4之CH1域之pI與IgG1之pI匹配，將位置137及203處之殘基轉化為IgG1野生型CH1域中發現之對應殘基。胺基酸取代包括：不帶電甘胺酸取代位置137處之帶負電麩胺酸(E137G)及極性天冬醯胺取代位置203處之帶負電天冬胺酸(D203N)。具有全部5種胺基酸取代之所得IgG4 Fc被稱為「GNKRQ」。

另外，亦評估包含Q355R及E419Q胺基酸取代之雙重突變體，其僅集中於稱為「RQ」之CH3域，及包含Q274K胺基酸取代之單一突變體，其集中於CH2域。

為產生分子1至6之變異體，使用兩種形式之IgG4 Fc：1)具有S228P胺基酸殘基取代之IgG4 Fc，其穩定鉸鏈且防止臂交換，稱為「IgG4P」，或2)具有S228P胺基酸殘基取代以及F234A及L235A胺基酸取代之IgG4 Fc，已知其將效應功能降至最低，稱為「IgG4PAA」。將分子1至6中之各者之可變域選殖至IgG4PAA Fc、IgG4PAA KRQ Fc、IgG4PAA GNKRQ Fc及野生型IgG1 Fc中，以產生6個分子中之各者之各別抗體變異體。對於分子7，將可變域選殖至IgG4P Fc、IgG4P KRQ Fc及IgG4PAA KRQ Fc中。分子7變異體亦包括重鏈位置124及378處之工程化半胱胺酸(在本文中被稱為「eCys」)，其在抗體藥物共軛物(ADC)之產生中用作小分子之連接點。對於分子1至7中之各者，人類IgG4及IgG1之野生型CH1域分別用於野生型及KRQ變異體中，而輕鏈可變域選殖至所有分子之人類κ恆定區上，且匹配對經共同表現以產生黏度及生物物理學評估所需之完整抗體(參見圖1 - IgG4P GNKRQ eCys)。

藉由此項技術中熟知之方法合成、表現且純化分子1至7抗體變異體，例如使用預定HC:LC載體比率(若使用兩種載體)或編碼重鏈及輕鏈兩者之單一載體系統，使用用於分泌抗體之表現系統短暫或穩定轉染適當宿主細胞，諸如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)。使用通常已知之技術純化其中分泌抗體之澄清培養基。分子1至7抗體變異體之HC恆定域及鉸鏈序列顯示於表2中。具有及不具有胺基酸取代之各重鏈域的理論pI (pI為當分子淨電荷為中性時之pH)係使用此項技術中熟知之軟體分析方法計算及比較(所有計算均不含C端離胺酸，其通常經歷轉譯後剪切)。

表1中所展示之結果顯示，由於引入至IgG4 HC恆定區中之胺基酸取代，相較於野生型IgG4，hIgG4抗體變異體中之個別重鏈CH1、CH2及CH3域的理論pI增加至與各別IgG1域之pI相似之值。表 1 ： 恆定區胺基酸取代對理論 pI 之影響

同型	pI CH1	pI CH2	pI CH3	pI CH2, CH3	pI CH1, CH2, CH3
hIgG1	9.4	8.0	5.9	6.6	8.5
hIgG4	8.8	7.0	5.2	5.8	6.7
hIgG4 K	8.8	8.0	5.2	6.0	7.2
hIgG4 RQ	8.8	7.0	5.9	6.3	7.7
hIgG4 KRQ	8.8	8.0	5.9	6.6	8.0
hIgG4 GNKRQ	9.3	8.0	5.9	6.6	8.4

表 2 ：分子 1 至 7 之 HC 恆定區之抗體序列

抗體分子編號	抗體同型	重鏈恆定區 ( CH1 - 鉸鏈 - CH2 - CH3 域 ) 序列
抗體分子抗體分子1-6	hIgG1	SEQ ID NO: 4
抗體分子1-6	hIgG4PAA	SEQ ID NO: 7
抗體分子1-6	hIgG4PAA KRQ	SEQ ID NO: 8
抗體分子1-6	hIgG4PAA GNKRQ	SEQ ID NO: 16
抗體分子7	hIgG4P KRQ eCys	SEQ ID NO: 9
抗體分子7	hIgG4P RQ eCys	SEQ ID NO: 10
抗體分子7	hIgG4P eCys	SEQ ID NO: 11
抗體分子7	hIgG4P GNKRQ eCys	SEQ ID NO: 12
抗體分子7	hIgG4P K eCys	SEQ ID NO: 13

實例 2 ： 例示抗體變異體之生物物理學特性評估了分子1至7之例示抗體變異體之生物物理學特性。

固有黏度 ：在5 mM組胺酸、280 mM甘露醇，pH 6緩衝液(H6M)中將例示分子1至6抗體變異體濃縮至130 mg/mL，且將分子7變異體濃縮至125 mg/mL。使用可變路徑長度SoloVPE儀器(CTech)製備且定量純蛋白質濃度。在15℃下使用VROC® initium (RheoSense)用9次重複量測之平均值來量測各抗體之固有黏度。最少35 µL用於27 µL抽樣，將該抽樣注入至B05晶片上，將系統設定為自動測試模式，該模式調整流動速率以獲得全標度之50%的壓力讀數。

表3中所展示之結果顯示，相較於缺乏KRQ胺基酸取代之各別IgG4PAA變異體，分子1、3、4及6之IgG4PAA KRQ抗體變異體之黏度顯著降低，範圍介於約74%至約30%。此外，出人意料地，相較於各別IgG1變異體，6種IgG4PAA KRQ抗體變異體中之5種(分子2、3、4、5、6)展示黏度降低。特定言之，相較於各別IgG1變異體，分子2、3及4之IgG4PAA KRQ變異體顯示約82%至約48%範圍內之黏度降低。相較於缺乏KRQ胺基酸取代之各別IgG4PAA變異體，藉由在CH1域中添加E137G及D204N突變，觀測到分子1、3、4及6之黏度進一步改良。對於在取代之前IgG4PAA上之初始黏度較低的分子2及5，相較於KRQ取代，未觀測到添加CH1取代之益處。然而，出人意料地，相較於各別IgG1變異體，6種IgG4PAA GNKRQ抗體變異體中之5種(分子1、2、3、4、6)展示黏度降低。特定言之，相較於對應IgG1變異體，分子3、4及6之IgG4PAA KRQ變異體顯示約83%至約55%範圍內之黏度降低。

另外，表4中所展示之結果顯示，相較於缺乏GNKRQ胺基酸取代中之任一者之分子7 IgG4P eCys (43 cP)變異體，分子7 IgG4P GNKRQ eCys (9.6 cP)、IgG4P KRQ eCys (11.6 cP)、IgG4P RQ eCys (14.9 cP)及IgG4P K eCys (21.0 cP)抗體變異體之黏度分別降低約78%至約51%，因此顯示突變組合之累加效應。表 3 ：分子 1 至 6 抗體變異體之固有黏度

分子 #	固有黏度 (cP)
	IgG4PAA GNKRQ	IgG4PAA KRQ	IgG4PAA	IgG1
1	8.0	16.94	27.42	8.89
2	12.7	7.23	10.57	14.4
3	9.8	7.74	29.4	41.8
4	9.8	11.36	34.24	21.8
5	18.9	5.42	5.94	6.94
6	14	76.88	167.52	83.76

表 4 ：分子 7 IgG4P 抗體變異體之固有黏度

	固有黏度 (cP)
	IgG4P GNKRQ eCys	IgG4P KRQ eCys	IgG4P RQ eCys	IgG4P K eCys	IgG4P eCys
分子 7	9.6	11.6	14.9	21.0	43

cP=厘泊

抗體藥物共軛物形式之分子 7 抗體變異體之固有黏度 ：以抗體藥物共軛物形式測試分子7抗體變異體IgG4P KRQ eCys、IgG4P GNKRQ及IgG4P eCys之固有黏度。簡言之，分子7 IgG4P eCys、IgG4P KRQ eCys及IgG4P GNKRQ抗體變異體之重鏈位置124及378處之工程化半胱胺酸用於使用具有短連接子之親脂性小分子生成抗體藥物共軛物。在還原劑二硫蘇糖醇存在下，經由短還原進行共軛，隨後進行去鹽步驟以移除還原劑，且在去氫抗壞血酸存在下進行短氧化步驟。還原步驟及後續去鹽步驟移除重鏈之位置124及378處之工程化半胱胺酸上的任何半胱胺酸化，其在細胞培養表現期間發生。氧化步驟重新形成天然二硫鍵，其在鉸鏈中包括兩個二硫鍵對，且在重鏈與輕鏈之間包括1個二硫鍵對。接著使用基於順丁烯二醯亞胺之化學反應將小分子與抗體共軛，該化學反應與工程化半胱胺酸殘基之游離硫醇反應。基本上如上文所述地量測黏度。

表5中所展示之結果顯示，相較於缺乏GNKRQ胺基酸殘基取代之分子7 IgG4P eCys ADC (592 cP)，分子7 IgG4P KRQ eCys ADC (12.2 cP)及分子7 IgG4P GNKRQ eCys ADC (10.2 cP)之黏度分別降低48倍及58倍，因此顯示突變組合之累加效應。表 5 ：分子 7 IgG4P KRQ 抗體藥物共軛物之固有黏度

	固有黏度 (cP)
分子 7 - IgG4P eCys- ADC	592
分子 7 - IgG4P KRQ eCys- ADC	12.2
分子 7 - IgG4P GNKRQ eCys- ADC	10.2

cP=厘泊

熱穩定性 ：差示掃描熱量測定(DSC)用於評估例示分子1至7變異體之熱變性穩定性。使用Malvern MircoCal VP-DSC儀器進行DSC。以60℃/小時之恆定速率將樣品自20℃加熱至110℃。使用MicroCal VP-Capillary DSC自動分析程式進行分析方法。進行基線校正，且確定T起點及TM1。雖然對於IgG4P eCys或IgG4P KRQ eCys，未良好解析展開3個域(包括CH2、CH3及Fab)之轉變溫度，但在PBS，pH 7.2緩衝液中量測了分子7 IgG4P eCys及IgG4P KRQ eCys抗體變異體之熱熔融溫度。

表6及圖2中所展示之結果顯示，將胺基酸殘基KRQ引入至抗體之IgG4恆定域之CH2及CH3中不會不利地影響所得抗體之熱穩定性。

熱聚集起點 ( Tagg ) ：使用裝配有高靈敏度毛細管之Prometheus Panta (Nano Temper Technologies)進行內源螢光(IF)及光散射量測。在PBS，pH 7.2緩衝液中以0.5 mg/mL製備樣品，且使用以1℃/min之恆定速率自20℃至95℃之熱勻變測定聚集起點(Tagg)。使用PR Panta分析(X64)軟體(V1.0.2)，基於385 nm處之背反射信號使用2態擬合測定聚集起點，其中臨限值自基線增加0.5%。

表6中所展示之結果顯示，分子7 IgG4P KRQ eCys與IgG4P eCys抗體變異體之間的聚集起點相當，且因此顯示將胺基酸殘基KRQ引入至抗體之IgG4恆定域的CH2及CH3中不會不利地影響所得抗體之熱穩定性。表 6 . 分子 7 IgG4P KRQ eCys 抗體變異體之熱聚集

	T 起點	TM1	Tagg
分子 7 - IgG4P eCys	59.0	69.8	67.2
分子 7 - IgG4P KRQ eCys	59.1	69.9	67

所有值以攝氏度(℃)為單位

溫度應力下之聚集 ：在含有賦形劑之常用5 mM組胺酸pH 6.0緩衝液中以約100 mg/mL評估例示分子變異體隨時間之溶液穩定性。分別在5℃及35℃下將濃縮樣品培育4週之時段。培育之後，藉由尺寸排阻層析法(SEC)分析樣品之高分子量物種百分比(%HMW)。

表7中所展示之結果顯示，在5℃或35℃下之4週時段內，KRQ胺基酸殘基取代不會顯著影響聚集；具體而言，結果顯示IgG4P KRQ eCys抗體之高濃度溶液穩定性與IgG4P eCys抗體變異體相當。

凍融穩定性 係使用模擬置放於-70℃下之大量散裝藥物物質之凍融條件的3次重複的緩慢、受控溫度循環來評估。在5 mM組胺酸、280 mM甘露醇、0.05% PS80，pH 6 (H6MT)及5 mM組胺酸、280 mM蔗糖、0.05% PS80，pH 6 (H6ST)兩者中評估樣品。在培育之後，藉由分析型尺寸排阻層析法(aSEC)分析樣品之高分子量物種百分比變化(Δ%HMW)。亦目視檢查樣品之相分離或沈澱物形成。

表7中所展示之結果顯示，將胺基酸殘基KRQ引入至抗體之IgG4恆定域之CH2及CH3中不會影響所得抗體之凍融穩定性。具體而言，分子7 IgG4P KRQ eCys抗體變異體在H6MT中展現∆3.4%HMW且在H6ST中展現∆0.5%HMW，其與與在H6MT中展現∆2.5%HMW且在H6ST中展現∆0.3%HMW之IgG4P eCys抗體相當，如在3次凍融循環之後藉由aSEC所量測。目視觀測未顯示IgG4P KRQ eCys或IgG4P eCys抗體變異體之任何相分離或沈澱。

溶解度 ：藉由使用30 kDa分子量截止離心過濾器(例如Amicon U.C.過濾器，Millipore，目錄號UFC903024)將100 mg抗體變異體濃縮至約0.5 mL之體積來評估溶解度。使用Solo VPE分光光度計(C Technologies, Inc)藉由280 nm處之UV吸光度量測樣品之最終濃度。在培育之後，藉由分析型尺寸排阻層析法(aSEC)分析樣品之高分子量物種百分比(%HMW)。亦目視檢查樣品之相分離或沈澱物形成。

表7中所展示之結果顯示，如藉由aSEC所量測，分子7 IgG4P KRQ eCys抗體變異體展現∆0.6%HMW，與展現∆0.4%HMW之分子7 IgG4P eCys抗體相當。目視觀測未顯示IgG4P KRQ eCys或IgG4P eCys之任何相分離或沈澱。表 7 . 分子 7 IgG4P 及 IgG1 抗體變異體之分子參數

	分子7 IgG4P eCys	分子7 IgG4P KRQ eCys
tCHO 滴度(g/L)	1.1	0.9
蛋白質A 層析後之%HMW	1.2	1
在5 ℃ 下培育4 週之後的 %HMW	0.1	0.2
在35 ℃ 下培育4 週之後的 %HMW	2.4	2.2
凍融 H6MT (% Δ HMW )	2.4	3.4
凍融 H6ST ( Δ % HMW )	0.3	0.5
溶解度 ( Δ %HMW )	0.4	0.6

生物物理學分析表明，相較於缺乏KRQ胺基酸取代之IgG4P抗體，將胺基酸殘基KRQ引入至IgG4之CH2及CH3域顯著降低黏度而不會不利地影響抗體之聚集、溶解度或熱穩定性。

實例 3 . 效應功能活性進行活體外Fcγ受體結合、ADCC及CDC分析以評估抗體之Fc區中之胺基酸取代是否改變Fc功能。

人類 Fc γ 受體結合 ：藉由表面電漿子共振(SPR)分析評估分子7 IgG4抗體變異體與人類Fcγ受體之結合親和力。使用Biacore T100 (Cytiva)、Biacore試劑及Scrubber2 Biacore Evaluation Software (Biologics 2008)進行SPR分析。使用製造商之EDC/NHS胺偶合方法(Cytiva P/N BR100050)製備S系列CM5晶片(Cytiva P/N BR100530)。簡言之，所有4個流動細胞(FC)之表面藉由以10 μL/分鐘注射EDC/NHS之1:1混合物7分鐘而活化。在10 mM乙酸鹽，pH 4.5緩衝液中將蛋白質A (Calbiochem P/N 539202)稀釋至100 μg/mL，且藉由以10 μL/分鐘之流動速率注射7分鐘將約4000 RU固定至所有4個FC上。藉由以10 μL/分鐘注射乙醇胺7分鐘阻斷未反應之位點。注射2×10 μL甘胺酸，pH 1.5以移除任何非共價結合的蛋白質。操作緩衝液為1× HBS-EP+ (TEKNOVA, P/N H8022)。FcγR細胞外域(ECD)-FcγRI (CD64)、FcγRIIA_131R及FcγRIIA_131H (CD32a)、FcγRIIIA_158V、FcγRIIIA_158F (CD16a)及FcγRIIb (CD32b)自穩定CHO細胞表現產生，且使用IgG瓊脂糖及尺寸排阻層析法純化。對於FcγRI結合，在操作緩衝液中將抗體稀釋至2.5 μg/mL，且在FC 2至4中捕獲約150 RU各抗體(捕獲之RU)。FC1為參考FC，因此未在FC1中捕獲抗體。在操作緩衝液中將FcγRI ECD稀釋至200 nM，且接著在操作緩衝液中將其兩倍連續稀釋至0.78 nM。以40 μL/分鐘在所有FC上注射各濃度之重複注射120秒，接著為1200秒之解離階段。藉由在所有FC上以30 μL/分鐘注射15 μL之10 mM甘胺酸，pH 1.5進行再生。將減除參考之資料收集為FC2-FC1、FC3-FC1及FC4-FC1，且在25℃下獲得該等量測值。使用以Scrubber 2 Biacore Evaluation Software進行之穩態平衡分析或BIA Evaluation中之「1:1 (朗繆爾(Langmuir))結合」模型來計算親和力(KD)。對於FcγRIIa、FcγRIIb及FcγRIIIa結合，在操作緩衝液中將抗體稀釋至5 μg/mL，且在FC 2至4中捕獲約500 RU各抗體(捕獲之RU)。FC1再次為參考FC。在操作緩衝液中將Fcγ受體ECD稀釋至10 μM，且接著在操作緩衝液中將其2倍連續稀釋至39 nM。以40 μL/分鐘在所有FC上注射各濃度之重複注射60秒，接著為120秒之解離階段。藉由在所有FC上以30 μL/分鐘注射15 μL之10 mM甘胺酸，pH 1.5進行再生。將減除參考之資料收集為FC2-FC1、FC3-FC1及FC4-FC1，且在25℃下獲得該等量測值。使用用Scrubber 2 Biacore Evaluation Software進行之穩態平衡分析來計算親和力(KD)。分析各受體至少兩次。

表8中所展示之結果顯示，分子7 IgG4P KRQ eCys及IgG4P eCys抗體變異體與Fcγ受體中之各者具有相當的結合親和力，因此顯示將胺基酸殘基KRQ引入至抗體之IgG4恆定域之CH2及CH3中不會影響所得抗體之Fc結合活性。表 8 ：分子 7 IgG4P 抗體變異體與人類 Fc ɣ 受體之結合親和力

	分子7 - IgG4P KRQ eCys	分子7 - IgG4P eCys
	平均KD	標準差	平均KD	標準差
Fcγ RI	442.3 pM	21.4	306.0 pM	18.4
Fcγ RIIA_131H	3.75 µM	0.11	3.73 µM	0.04
Fcγ RIIA_131R	1.67 µM	0.06	1.51 µM	0.01
Fcγ RIIb	2.05 µM	0.2	1.69 µM	0.04
Fcγ RIIIA_158V	6.22 µM	0.8	3.93 µM	0.28
Fcγ RIIIA_158F	＞10 µM	-	＞10 µM	-

C1q 結合：藉由Elisa評估分子7 IgG4抗體變異體與人類C1q之結合。96孔微量培養盤用100 μL/孔之在DPBS (Dulbecco's HyClone)中自10 μg/mL稀釋至0.19 μg/mL之分子7 IgG4 KRQ eCys抗體變異體塗覆，且在4℃下培育隔夜。移除塗覆試劑，將培養盤用200 μL/孔之酪蛋白阻斷緩衝液(Thermo)阻斷且在室溫(RT)下培育2小時。將培養盤用洗滌緩衝液(含有0.05% Tween 20之1× TBE)洗滌3次，且以100 μL/孔添加稀釋於酪蛋白阻斷試劑中之10 μg/mL人類C1q (MS Biomedical)且在RT下培育3小時。將人類化IgG1及人類化IgG4P同型對照抗體分別用作陽性及陰性對照。接著將培養盤用洗滌緩衝液洗滌三次，且添加100 µL/孔之綿羊抗人類C1q-HRP (Abcam #ab46191)於酪蛋白阻斷劑中之1:800倍稀釋液且在RT下培育1小時。接著將培養盤用洗滌緩衝液洗滌6次，且向各孔中添加100 μL/孔之TMB受質(Pierce)且培育7分鐘。添加100 μL/孔之1 N HCl以終止反應。立即在450 nm下在比色微量培養盤讀取器上量測光密度。使用SoftMax Pro 7.1資料收集及分析軟體分析資料。

圖3中所展示之結果顯示，分子7 IgG4P KRQ eCys抗體變異體與IgG4P對照具有相當的C1q結合，因此顯示將胺基酸殘基KRQ引入至抗體之IgG4恆定域之CH2及CH3中不會影響所得抗體之補體結合。

抗體依賴性細胞毒性 ( ADCC ) ：用基於報導基因之ADCC分析評估分子7抗體變異體之活體外ADCC分析。

簡言之，使用Daudi細胞( ATCC ，#CCL-213)及人類CD20目標細胞株及作為效應細胞株之表現功能性FcγRIIIa (V158)-NFAT-Luc之Jurkat細胞(Eli Lilly and Company)。在含有RPMI-1640 (無酚紅)與0.1 mM非必需胺基酸(NEAA)、1 mM丙酮酸鈉、2 mM L-麩醯胺酸、500 U/mL青黴素-鏈黴素及0.1% w/v BSA之分析培養基中稀釋所有測試抗體變異體及細胞。首先將測試抗體稀釋至3.3 µg/mL之3X濃度，且接著以1:4比率連續稀釋7倍。將50 µL/孔之各抗體一式兩份地等分於白色不透明底96孔培養盤(Costar，#3917)中。CD20抗體用作陽性對照。接著將Daudi目標細胞在50µL等分試樣中以5×10 ⁴個細胞/孔添加至培養盤，且在37℃下培育1小時。隨後，將Jurkat V158細胞在50 µL等分試樣中以150,000個細胞/孔添加至孔中且在37℃下培育4小時，接著添加100 μL/孔之One-Glo螢光素酶受質(Promega，#E8130)。使用培養盤振盪器以低速混合培養盤之內含物，在室溫下培育5分鐘，且使用0.2 cps積分在BioTek微量培養盤讀取器(BioTek Instruments)上讀取發光信號。使用GraphPad Prism 9分析資料且以抗體濃度相對於相對發光單位(RLU)之分散格式標繪各抗體濃度之RLU。結果代表兩個獨立實驗。

圖4中所展示之結果顯示，分子7抗體變異體IgG4P eCys及IgG4P KRQ eCys在基於報導基因之ADCC分析中具有相當的ADCC活性(亦即，不會誘導ADCC活性)，因此顯示將胺基酸殘基KRQ引入至抗體之IgG4恆定域之CH2及CH3中不會影響所得抗體之效應功能活性。陽性對照CD20抗體顯示有效ADCC活性。

補體依賴性細胞毒性 ( CDC ) ：使用Daudi細胞( ATCC ，#CCL-213)進行分子7 IgG4抗體變異體之活體外CDC分析。在由RPMI-1640 (無酚紅)與0.1 mM非必需胺基酸(NEAA)、1 mM丙酮酸鈉、2 mM L-麩醯胺酸、500 U/mL青黴素-鏈黴素及0.1% w/v BSA組成之分析培養基中稀釋所有測試抗體、補體及細胞。首先將測試抗體稀釋至100 µg/mL之3X濃度，且接著以1:4比率連續稀釋7倍。將50 µL/孔之各抗體一式兩份地等分於白色不透明底96孔培養盤(Costar，#3917)中。接著在50µL等分試樣中以50,000個細胞/孔添加Daudi靶細胞，且在37℃下培育例示抗體及CD20陽性對照抗體1小時。隨後，在37℃水浴中快速解凍之人類血清補體(Quidel，#A113)在分析培養基中以1:6稀釋，且以50 µL/孔添加至分析培養盤。將培養盤在37℃下培育2小時，接著添加100 μL/孔之CellTiter Glo受質(Promega, #G7571)至各孔。使用培養盤振盪器以低速混合培養盤之內含物，在室溫下培育5分鐘，且使用0.2 cps積分在BioTek微量培養盤讀取器(BioTek Instruments)上讀取發光信號。使用GraphPad Prism v9分析資料且以抗體濃度相對於相對發光單位(RLU)之分散格式標繪各抗體濃度之RLU。

圖5中所展示之結果顯示，分子7 IgG4P eCys及IgG4P KRQ eCys抗體變異體在Daudi細胞中具有相當的CDC活性，因此顯示將胺基酸殘基KRQ引入至抗體之IgG4恆定域之CH2及CH3中不會影響所得抗體之CDC活性。CDC分析陽性對照CD20抗體顯示有效CDC活性。

Fcɣ、C1q結合分析及基於細胞之效應功能ADCC及CDC分析結果顯示，將KRQ胺基酸殘基引入至抗體變異體之恆定域中不會影響抗體之Fc功能。

實例 4 . 變異體之細胞結合 與 B 細胞及單核球性細胞之結合 ：在螢光活化細胞分選(FACS)分析中測試例示分子7 IgG4P抗體變異體與B細胞及單核球性細胞之結合。藉由標準Ficoll-Paque ^TMplus (GE HEALTHCARE)密度梯度離心方法自人類血液樣品分離人類PBMC。將新分離之細胞PBMC以2百萬個細胞/mL再懸浮且使其在室溫下靜置15分鐘，接著將其以100 µL/孔接種至圓底96孔培養盤(COSTAR ^®)中且用FACS緩衝液(含有來自Corning ^®之2%胎牛血清的PBS)洗滌。根據製造商之方案(Thermo Fisher Scientific)，將與Alexa Fluor ^®647共軛之例示IgG4P抗體變異體以66.67 nM添加至孔中且一式兩份地稀釋4倍。接著向孔中添加等效體積之2X抗體混合液，其含有：人類TruStain FcX™、FITC抗人類CD3抗體、Alexa Fluor ^®700抗人類CD4抗體(全部來自Biolegend ^®)、CD20單株抗體(2H7)、PerCP-Cyanine5.5 (Thermo Fisher Scientific)及CD14 PE-Cy™7小鼠抗人類CD14 (BD Biosciences)。在4℃下培育細胞30分鐘，接著用FACS緩衝液洗滌兩次且再懸浮於100 μL最終體積之FACS緩衝液中。添加存活染料Sytox ^TMblue (Thermo Fisher Scientific)且經由流式細胞儀(LSRFortessa ^TMX-20；BD BIOSCIENCES)分析樣品。使用FlowJo軟體進行資料分析且使用GraphPad Prism 9進行統計分析。資料表示來自兩個供體之CD20 B細胞及CD3/CD20陰性、CD14陽性單核球性細胞群體之陽性細胞百分比的平均值±SEM。藉由擬合log(Ab濃度)相對於來自個別細胞群體之Ab陽性表現細胞之百分比的S形曲線來產生曲線。

表9以及圖6A及圖6B中所展示之結果顯示，例示分子7抗體變異體IgG4P KRQ eCys、IgG4P RQ eCys及IgG4P eCys以與PBMC分離之B細胞(分別為0.20 nM、0.18 nM及0.17 nM之EC ₅₀)及單核球性細胞(分別為1.04 nM、0.90 nM及1.00 nM之EC ₅₀)相當的親和力結合，因此顯示將胺基酸殘基KRQ或RQ引入至抗體之IgG4恆定域之CH2及CH3中不會影響所得抗體之可變區的結合。表 9 ：分子 7 IgG4P 變異體抗體與 B 細胞及單核球性細胞之結合

抗體	B 細胞EC ₅₀(nM)	單核球性細胞EC ₅₀(nM)
分子7 - IgG4P KRQ eCys	0.20	1.04
分子7 - IgG4P RQ eCys	0.18	0.90
分子7 - IgG4P eCys	0.17	1.00

序列表

SEQ ID NO : 1 人類 κ 恆定 ( 對於分子 1 、 2 、 3 、 4 、 5 、 6 、 7 )

SEQ ID NO : 2 人類 IgG1 CH1 ( 對於分子 1 、 2 、 3 、 4 、 5 、 6 )

SEQ ID NO : 3 人類 IgG1 鉸鏈 ( 對於分子 1 、 2 、 3 、 4 、 5 、 6 )

SEQ ID NO : 4 人類 IgG1 CH1 - 鉸鏈 - CH2 - CH3 ( 對於分子 1 、 2 、 3 、 4 、 5 、 6 )

SEQ ID NO : 5 人類 IgG4 CH1 ( 對於分子 1 、 2 、 3 、 4 、 5 、 6 )

SEQ ID NO : 6 人類 IgG4 ( S228P ) 鉸鏈 ( 對於分子 1 、 2 、 3 、 4 、 5 、 6 、 7 )

SEQ ID NO : 7 人類 IgG4PAA ( S228P 、 F234A 、 L235A ) CH1 - 鉸鏈 - CH2 - CH3 ( 對於分子 1 、 2 、 3 、 4 、 5 、 6 )

SEQ ID NO : 8 人類 IgG4PAA KRQ ( S228P 、 Q274K 、 F234A 、 L235A 、 Q355R 、 E419Q ) CH1 - 鉸鏈 - CH2 - CH3 ( 對於分子 1 、 2 、 3 、 4 、 5 、 6 )

SEQ ID NO : 9 人類 IgG4P KRQ eCys ( S124C 、 S228P 、 Q274K 、 Q355R 、 A378C 、 E419Q ) CH1 - 鉸鏈 - CH2 - CH3 ( 對於分子 7 )

SEQ ID NO : 10 人類 IgG4P RQ eCys ( S124C 、 S228P 、 Q355R 、 A378C 、 E419Q ) CH1 - 鉸鏈 - CH2 - CH3 ( 對於分子 7 )

SEQ ID NO : 11 人類 IgG4P eCys ( S124C 、 S228P 、 A378C ) CH1 - 鉸鏈 - CH2 - CH3 ( 對於分子 7 )

SEQ ID NO : 12 人類 IgG4P GNKRQ eCys ( S124C 、 E137G 、 D203N 、 S228P 、 Q274K 、 Q355R 、 A378C 、 E419Q ) CH1 - 鉸鏈 - CH2 - CH3 ( 對於分子 7 )

SEQ ID NO : 13 人類 IgG4P K eCys ( S124C 、 S228P 、 Q274K 、 A378C ) CH1 - 鉸鏈 - CH2 - CH3 ( 對於分子 7 )

SEQ ID NO : 14 人類 IgG2 CH1 - 鉸鏈 - CH2 - CH3

SEQ ID NO : 15 人類 IgG3 CH1 - 鉸鏈 - CH2 - CH3

SEQ ID NO : 16 人類 IgG4PAA GNKRQ ( S228P 、 E137G 、 D203N 、 Q274K 、 F234A 、 L235A 、 Q355R 、 E419Q ) CH1 - 鉸鏈 - CH2 - CH3 ( 對於分子 1 、 2 、 3 、 4 、 5 、 6 )

圖 1顯示人類IgG1、IgG2、IgG3及IgG4重鏈CH1-CH2-CH3域之胺基酸序列比對，突出顯示GNKRQ胺基酸殘基。圖 2比較HC CH1及CH2域中具有及不具有KRQ胺基酸取代之人類IgG4P抗體變異體的差示掃描熱量測定(DSC)熱分析圖。圖 3顯示相對於缺乏KRQ胺基酸取代之IgG4P抗體，IgG4P抗體之重鏈CH1及CH2域中之KRQ胺基酸取代不影響C1q Elisa結合親和力。圖 4顯示相對於缺乏KRQ胺基酸取代之IgG4P抗體，IgG4P抗體之重鏈CH1及CH2域中之KRQ胺基酸取代不影響ADCC活性。圖 5顯示相對於缺乏KRQ胺基酸取代之IgG4P抗體，IgG4P抗體之重鏈CH1及CH2域中之KRQ胺基酸取代不影響CDC活性。圖 6A - 圖 6B顯示相對於缺乏KRQ胺基酸取代之IgG4P抗體，IgG4P抗體之重鏈CH1及CH2域中之KRQ胺基酸取代不影響B細胞(6A)或單核球性細胞(6B)中之細胞結合。

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Claims

一種抗體，其包含具有CH1、CH2及CH3域之人類IgG重鏈恆定區及人類IgG輕鏈恆定區，其中該人類IgG重鏈恆定區包含：該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸；該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸；該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸；該CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸；該CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸及該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸；該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸及該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸；該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸及該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸；該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸及該CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸；該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸及該CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸及該CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸；該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸及該CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸及該CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸；該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸及該CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；該CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸及該CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸及該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸；該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸及該CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸；該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸及該CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、該CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸及該CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸及該CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸；該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸及該CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸、該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸及該CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸；該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸、該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸及該CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸、該CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸及該CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸、該CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸及該CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸、該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸及該CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸；該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸、該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸及該CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸、該CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸及該CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸、該CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸及該CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸、該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸、該CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸及該CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；或該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸、該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸、該CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸及該CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺。
如請求項1之抗體，其包含具有CH1、CH2及CH3域之人類IgG重鏈恆定區及人類IgG輕鏈恆定區，其中該人類IgG重鏈恆定區包含：該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸；該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸；該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸；該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸及該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸；該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸及該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸；該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸及該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸；或該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸及該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸。
如請求項2之抗體，其中該人類IgG重鏈恆定區包含：該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸及該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸。
如請求項1至3中任一項之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3。
如請求項1至3中任一項之抗體，其中該抗體為人類IgG2、人類IgG3或人類IgG4抗體。
如請求項5之抗體，其中該抗體為人類IgG4抗體。
一種包含人類IgG重鏈恆定區之抗體，其中該恆定區包含SEQ ID NO: 8、9、10、12、13或16中之任一者。
一種抗體藥物共軛物，其包含如請求項1至7中任一項之抗體。
如請求項1至3及7中任一項之抗體或如請求項8之抗體藥物共軛物，其中該抗體或抗體藥物共軛物相較於包含野生型人類IgG重鏈恆定區之野生型抗體具有降低之黏度。
如請求項9之抗體或抗體藥物共軛物，其中該黏度相較於該野生型抗體降低約25%至約80%。
一種降低人類IgG4抗體之黏度之方法，其包含產生該人類IgG4抗體之變異體，該變異體包含具有CH1、CH2及CH3域之經修飾之人類IgG4重鏈恆定區及人類IgG輕鏈恆定區，其中該經修飾之人類IgG4重鏈恆定區包含以下胺基酸殘基：該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸；該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸；該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸；該CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸；該CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸及該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸；該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸及該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸；該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸及該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸；該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸及該CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸；該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸及該CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸及該CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸；該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸及該CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸及該CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸；該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸及該CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；該CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸及該CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸及該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸；該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸及該CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸；該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸及該CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、該CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸及該CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸及該CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸；該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸及該CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸、該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸及該CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸；該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸、該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸及該CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸、該CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸及該CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸、該CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸及該CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸、該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸及該CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸；該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸、該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸及該CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸、該CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸及該CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸、該CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸及該CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸、該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸、該CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸及該CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺；或該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸、該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸、該CH1域之胺基酸殘基137 (EU編號)處之甘胺酸及該CH1域之胺基酸殘基203 (EU編號)處之天冬醯胺。
如請求項11之方法，其中該經修飾之人類IgG4重鏈恆定區包含以下胺基酸殘基：該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸；該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸；該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸；該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸及該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸；該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸及該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸；該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸及該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸；或該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸及該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸。
如請求項11或12之方法，其中該經修飾之人類IgG4重鏈恆定區包含以下胺基酸殘基：該CH2域之胺基酸殘基274 (EU編號)處之離胺酸、該CH3域之胺基酸殘基355 (EU編號)處之精胺酸及該CH3域之胺基酸殘基419 (EU編號)處之麩醯胺酸。
如請求項11或12之方法，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3。
如請求項11或12之方法，其進一步包含產生包含變異體人類IgG4抗體之抗體藥物共軛物。
如請求項11或12之方法，其中該抗體相較於野生型人類IgG4抗體具有降低之黏度。
如請求項16之方法，其中該黏度相較於該野生型人類IgG4抗體降低約25%至約80%。
一種核酸，其包含編碼如請求項1至7中任一項之抗體之重鏈或輕鏈的序列。
一種載體，其包含如請求項18之核酸。
一種細胞，其包含如請求項19之載體。
如請求項20之細胞，其中該細胞為哺乳動物細胞。
一種生產抗體之方法，其包含在使該抗體表現之條件下培養如請求項21之細胞，及自培養基回收經表現之抗體。
一種藉由如請求項22之方法生產之抗體。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至10或23中任一項之抗體或抗體藥物共軛物，及醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。
一種如請求項1至10或23中任一項之抗體或抗體藥物共軛物之用途，其用於製造向有需要之個體皮下投與之藥劑。