BR112013028271B1 - Polipeptideo, acido nucleico, vetor viral, preparação farmaceutica, bem como uso dos mesmos no tratamento de doenqa mediada por complemento - Google Patents

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Abstract

POLIPEPTÍDEO QUE COMPREENDE ANÁLOGO DE PROTEÍNA DE FATOR B DE COMPLEMENTO COMPREENDENDO MUTAÇÃO DE AMINOÁCIDO DE CISTEÍNA LIVRE, ÁCIDO NUCLEICO, VETOR VIRAL, PREPARAÇÃO FARMACÊUTICA, BEM COMO USO DOS MESMOS NO TRATAMENTO DE DOENÇA MEDIADA POR COMPLEMENTO E MÉTODO DE INIBIR ATIVIDADE DE COMPLEMENTO. A presente invenção refere-se aos polipeptídeos compreendendo um análogo de fator B de complemento, o qual apresenta mutação de aminoácido de cisteína livre, ácido nucleico, vetor virai, e preparação farmacêutica. A presente invenção refere-se ainda dos referidos polipeptídeo, ácido nucleico, vetor virai, e preparação farmacêutica no tratamento de doença mediada por complemento e método de inibir atividade de complemento.

Description

ANTECEDENTE DA INVENÇÃO
[0001] O sistema complement© e um component© do sistema imune inato e adaptativo (revisado por Volanakis, J.E., 1998. Capitulo 2. In The Human Complement System in Health and Disease. Edited by J. E. Volanakis, and M.M. Frank. Marcel Dekker, Inc., New York pp 9-32). Complemento desempenha um papel important© em morte microbiana, e para o transporte e liberaQao de complexes imunes. Muitos dos produtos de ativaQao do sistema complementar estao da mesma forma associados com funQoes pro-inflamatorias ou imunorregulatdrias. O sistema complementar consiste em plasma e proteinas associadas a membrana que sao organizados em tres cascatas de ativaQao enzimatica: as classicas, a lectina, e as series de reaQao alternativas (Figura 1). Todos as tres series de reaQao podem levar a formaQao do complexo complementar terminal (TCC) e uma disposiQao de produtos biologicamente ativos.
[0002] Em alguns casos, ativaQao de complemento e iniciada por anticorpos especificos reconhecendo e ligando-se a uma variedade de patogenos e moleculas exogenas, e/ou por interaQao direta de proteinas de complemento com substancias exogenas. Em ativaQao, estas series de reaQao resultam na formaQao de complexes de protease, o C3-convertases. A serie de reaQao classica C3-convertase, C4b2a, e a serie de reaQao alternativa C3-convertase, C3bBb, sao ambas capazes de clivar a cadeia a de C3 gerando C3b. C3b tem o potencial de ligar-se covalentemente a superficies biologicas. LigaQao de C3b leva a opsonizaQao para fagocitose por celulas polimorfonucleares e macrofagos. Quando C3b adicional estiver disponivel, o C3-convertases pode funcionar como C5-convertases, clivando C5 e iniciando a reuniao do TCC, ou complexo de ataque de membrana (MAC) que media lise celular por inserpao de complexos de protefna de formapao de poros em membranas celulares alvos.
[0003] Na serie de reapao classica como mostrado na Figura 1A, C1q, urn subcomponente colagenoso do primeiro componente (C1), liga-se a imunoglobulinas dentro de complexos imunes, e suas serina proteases associadas, C1r e C1s se tornam ativadas. Esta cascata de complemento e iniciada pela clivagem subsequente de C4 e C2, seguido por ativapao de C3. O fragmento de C3b resultante nao apenas age como uma opsonina porem da mesma forma leva a formapao de complexo de ataque de membrana (MAC) na serie de reapao litica. Em imunidade inata, urn complexo composto de uma molecula de reconhecimento (lectina) e serina protease, denominada a serina protease associada a lectina de ligapao de manose (MBL (MASP), ativa C4 e C2 ao ligar-se a carboidratos na superficie de microrganismos pela serie de reapao de lectina. Esta ligapao ocorre na ausencia de imunoglobulinas. Moleculas de reconhecimento da serie de reapao de lectina encontradas em vertebrados com mandibula sao MBLs e ficolinas, ambos dos quais sao caracterizados pela presenpa de urn dominio semelhante a colageno semelhante a C1q, e urn dominio de ligapao de carboidrato tendo uma especificidade de ligapao comum para GIcNAc. MASPs e C1r/C1s compartilham a mesma organizapao de dominio e formam uma subfamflia de serina proteases.
[0004] A serie de reapao de complemento de lectina em imunidade inata esta intimamente relacionada a serie de reapao de complemento classica em imunidade adaptavel, por exemplo, com respeito as estruturas e funpoes de seus componentes. Ambas as series de reapao sao tipicamente iniciadas por complexos consistindo em proteinas colagenosas e serina proteases da serina protease associada a lectina de ligapao de manose (MBL) familia de (MASP)/C1r/C1s. Foi especulado que a serie de reapao classica emergiu evolutivamente depois da serie de reapao de lectina.
[0005] Ativapao da serie de reapao de complemento alternativa, mostrada na Figura 1B, tipicamente comepa quando proteina C3b (ou C3i) liga-se a uma celula e outros componentes de superficie, por exemplo, de microbios. C3b pode da mesma forma ligar-se a anticorpos de imunoglobulina G (IgG). Proteina de Fator B de serie de reapao alternativa em seguida combina com a proteina C3b para formar C3bB. Proteina de Fator D em seguida divide a proteina de Fator B ligada em fragmentos Bb e Ba, formando C3bBb. Properdina em seguida liga-se a Bb para formar C3bBbP que funciona como uma C3-convertase capaz de dividir enzimaticamente tipicamente centenas de moleculas de C3 em C3a e C3b. Alguma da C3b subsequentemente liga-se a alguma da C3bBb para formar C3bBbC3b, uma C5 convertase capaz de dividir moleculas de C5 em C5a e C5b.
[0006] Visto que C3b esta livre no plasma, pode ligar-se a uma celula hospedeira ou superficie de patogeno. Para impedir a ativapao de complemento a partir do procedimento na celula hospedeira, ha varies tipos diferentes de proteinas reguladoras que rompem o processo de ativapao de complemento. Receptor de complemento 1 (CR1 ou CD35) e DAF (da mesma forma conhecido como CD55) compete com Fator B ligando-se com C3b na superficie de celula e pode ainda remover Bb a partir de urn complexo de C3bBb ja formado. A formapao de urn C3-convertase pode da mesma forma ser prevenida quando uma protease de plasma chamada Fator I liga C3b em sua forma inativa, iC3b. Fator I trabalha com co-fatores de proteina de ligapao de C3b tai como CR1 e Co-fator de Membrana de Proteolise (MCP ou CD46). Outra proteina reguladora de complemento e Fator H que compete com fator B, desloca Bb da convertase, age como um co- fator para Fator I, ou preferencialmente liga-se a C3b ligada a celulas vertebradas.
[0007] A fungao precisa do sistema complementar depende de seu regulamento, como ativagao da cascata de complemento leva a produgao de varias proteinas que contribuem a inflamagao. Isto e benefico ao contribuir em uma defesa de hospedeiro, porem pode ser prejudicial se ativado em alto tecido. Tipicamente, ativagao de C3 no sangue e mantida em um baixo nivel, e deposigao de C3b e limitada a superficie de patogenos.
[0008] A proteina de fator B de complemento de tipo selvagem humana e uma glicoproteina de cadeia simples de 764 aminoacidos, (aproximadamente 93-kDa) composta de cinco dominios de proteina (Mole e outro., 1984 J. Biol Chem, 259:6, 3407-3412). Uma proteina de fator B de complemento tipo selvagem humano (fB) e tipicamente expressada com um peptideo de sinal de 25 aminoacidos de N- terminal, por exemplo, veja SEQ ID NO:1. A regiao de terminal amino (Ba) de proteina de fator B de complemento de tipo selvagem humana consiste principalmente em tres repetigoes de consensos curtas. A regiao mediana e um dominio tipo A similar aquele encontrado em fator de von Willebrand (Colombatti e outro, Blod (1991) 77(11):2305- 15). O terminal carboxi e um dominio de serina protease (SP) (Perkins e Smith, Biochem J., (1993) 295 (Pt 1 ):109-14; Hourcade e outro, JBC (1998) 273(40):25996-6000; Hourcade e outro J Immunol. (1999) 162(5):2906-11; Xu e outro, J Biol Chem. 2000 275(1 ):378-85; Milder e outro. Nat Struct Mol Biol (2007) 14(3):224-8).
[0009] Analogos de Fator B de complemento e seu uso para inibir complemento e tratar doengas mediadas por complemento sao descritos em Publicagao PCT No. WO08/106644 e Publicagao de Patente US No. US20100120665. Por exemplo, o analogo da proteina do fator B do complemento humano, hfB3 (descrito em PublicaQao de Patente US No. 20100120665), e uma proteina de fator B humana negativa dominante variante que eficazmente inibe a atividade de complemento alternativa (AP). Proteina hfB3 (SEQ ID NO:4) tern cinco mudanQas de aminoacido comparadas a uma proteina de fator B tipo selvagem humana (SEQ ID NO:1). As cinco mudanQas de aminoacido permitem proteina hfB3 (i) ligaQao muito mais estreita a proteina C3b, (ii) resista a clivagem dependents de C3b por proteina de fator D, e (iii) ligaQao mais estreita a proteina de fator D quando comparado a proteina de fator B tipo selvagem. A ligaQao mais estreita de proteina hfB3 com proteina C3b e proteina de fator D isola dois componentes essenciais da serie de reaQao de complemento alternativa (ACP) em uma C3-convertase inativo (hfB3), bloqueando a atividade de AP. Visto que proteina hfB3 de ligaQao de C3b nao pode ser clivada por proteina de fator D, a mudanQa conformacional de proteina hfB3 nao ocorre e a serina protease no C-terminal de proteina hfB3 nao e ativada.
[0010] Igualmente proteina de fator B de complemento de tipo selvagem humana e hfB3 contem 23 aminoacidos de cisteina. As formas "ativas" de ambos tern todas as cisteinas formando ligaQoes de dissulfeto com um das outras cisteinas, com a exceQao da cisteina correspondendo a C292 de SEQ ID NO:1. A C292 das "formas ativas" de hfB3 e fator B tipo selvagem e uma cisteina gratis (Parkes e outro 1983 Biochem J. 213, 201-209) e e altamente conservada entre varias especies de mamifero, por exemplo, veja Tabela 1, abaixo.
[0011] CitaQao ou discussao de uma referenda aqui nao sera interpretada como uma admissao que tai tecnica anterior a INVENÇÃO presente.
SUMARIO DA INVENÇÃO
[0012] A INVENÇÃO fornece polipeptideos compreendendo um analogo do fator B do complemento. A INVENÇÃO da mesma forma fornece varies analogos do fator B do complemento. Em algumas modalidades, urn analogo do fator B do complemento compreende uma mutagao de urn aminoacido de cisteina livre. A invengao da mesma forma fornece acidos nucleico e vetores virais compreendendo uma sequencia de nucleotideo codificando polipeptideos e analogos de proteina de fator B de complemento da invengao. Algumas modalidades da invengao fornecem celulas, em que as celulas compreendem urn acido nucleico codificando urn analogo da proteina do fator B do complemento da invengao e em que as celulas expressam analogo da proteina do fator B do complemento.
[0013] Adicionalmente, a invengao fornece preparagoes farmaceuticas compreendendo urn polipeptideo ou analogo da proteina do fator B do complemento da invengao, urn acido nucleico da invengao, urn vetor viral da invengao ou qualquer combinagao dos mesmos.
[0014] Da mesma forma fornecido pela presente invengao saometodos de tratar uma doenga mediada por complemento compreendendo administrar a urn paciente uma preparagao farmaceutica da invengao, urn polipeptideo da invengao, urn analogo da proteina do fator B do complemento da invengao, urn acido nucleico da invengao, urn vetor viral da invengao ou qualquer combinagao dos mesmos.
[0015] A invengao da mesma forma fornece metodos de produzir urn polipeptideo compreendendo urn analogo da proteina do fator B do complemento, o metodo compreendendo: expressar em uma celula urn analogo da proteina do fator B do complemento da invengao e purificar o referido analogo da proteina do fator B do complemento.
[0016] Polipeptideos da invengao, analogos de fator B de complemento da invengao, e acidos nucleico e vetores que os codificam, podem ser usados para modular uma serie de reagao de complemento e para o estudo e/ou tratamento de varias condipbes ou doenpas relacionadas a uma serie de reapao de complemento.
[0017] A invengao esta com base nos resultados que mutapao ou remopao de uma cisteina livre (i) melhora o rendimento de um analogo da proteina do fator B do complemento ativo e/ou corretamente dobrado (por exemplo, veja Exemplos 9 e 10); (ii) aumenta a termoestabilidade de um analogo da proteina do fator B do complemento (por exemplo, veja Exemplos 13 e 14); e/ou (iii) reduz agregapao de um analogo da proteina do fator B do complemento (por exemplo, veja Exemplo 6).
[0018] Este sumario da invenpao necessariamente nao descreve todas as caracteristicas ou caracteristicas necessarias da invenpao. A invenpao pode, da mesma forma, residir em uma subcombinapao das caracteristicas descritas.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0019] Para o proposito de ilustrapao da invenpao, sao representadas nos desenhos certas modalidades da invenpao. Entretanto, a invenpao nao e limitada as disposipbes precisas e instrumentos de modalidades descritas nos desenhos.
[0020] Figura 1A descreve as series de reapao de complemento classicas e de lectina. A serie de reapao classica e iniciada atraves de C1 enquanto a serie de reapao de lectina e iniciada atraves de lectina de ligapao de manose (MBL). C4bC2a e uma protease que cliva C3 a C3a e C3b e e denominada C3-convertase. Similarmente, C4bC2aC3b cliva C5 a C5a e C5b e e denominada C5 convertase. C3a, C4a, e C5a tem propriedades inflamatorias e atraem celulas fagocitoticas. C5b6-9 forma o complexo de ataque de membrana (MAC) que cria poros de membrana que matam agentes infecciosos porem podem da mesma forma danificar celulas hospedeiras. MASP e serina protease associada a lectina de ligapao de manana.
[0021] Figura 1B descreve a serie de reagao de complemento alternativa. Esta serie de reapao e constitutivamente ativa em um baixo nivel atraves de clivagem espontanea de C3. Na presen$a de uma superficie apropriada, C3b liga-se a fator B de complemento (fB). Este complexo e em seguida clivado por fator D de complemento (fD) para produzir C3bBb. Dissocia$ao espontanea ("declinio") deste complexo dentro de minutos leva a sua inativa?ao, visto que estabilizagao por properdina gera um complexo que cliva C3; isto e, uma C3-convertase. Varies dos fatores que atenuam as series de reaQao de complemento desse modo acelerando-se o declinio da C3 e C5 convertases. C3b partici pa na C3-convertase para gerar C3b adicional desse modo criando uma retroalimentaQao positiva como mostrado pela seta grande. C3bBb e uma C3-convertase. C3bBbC3b e uma C5 convertase.
[0022] Figura 2 e uma construgao de expressao de hfB3-292S. Promotor precoce de CMV-citomegalovirus imediato; sitio de entrada ribossomico interno de IRES; Gene Neo-neomicina fosfotransferase; polyA SynPolyA-sintetico; gene resistente a Amp-ampicilina. SEQ ID NO:8 e a sequencia de nucleotideo do construtor de expressao de hfB3-292S mostrado na Figura 2.
[0023] Figura 3 mostra analise de Western Blot de sobrenadantes de cultura de celula contendo proteina hfB3 ou hfB3-292S depois de incubaQao de cultura de celula durante 72 horas (2 x 106 cels/mL). Pista 1, um pl de medio de cultura de celula de celulas 293 Freestyle nao transfectadas submetidas a tratamento serviram como um controle negativo; Pista 2, cem ng de fator B tipo selvagem humano (Quidel, Santa Clara, CA) purificado de plasma serviu como um controle positivo; Pista 3, um pl de meio de cultura de celula de celulas de produgao de hfB3; Pista 4, um pl de medio de cultura de celula de celulas de produgao de hfB3-292S. Os marcadores de peso molecular em KDa sao indicados a direita.
[0024] Figura 4 mostra os resultados de um ensaio hemolitico. Estes resultados demonstram atividade hemolitica de serie de reapao de complemento alternativa humana por proteina hfB3 crua ou proteina hfB3-292S produzindo meio de cultura de celula. A atividade hemolitica relativa e marcada por hemoglobina liberada depois da hemolise de rRBCs por atividade de serie de reapao de complemento alternativa humana. Eixo X de da esquerda para direita: soro humano exaurido de fator B suplementado com 0 pg de proteina de fator B humano purificado (controle, nenhuma lise de rRBCs); soro humano exaurido de fator B suplementado em cada reapao com uma mistura de 0,5 pg de proteina de fator B humano purificado e 1,0, 0,5, 0,25 ou 0,125 pg de proteina hfB3 ou proteina hfB3-292S, como indicado, a partir do meio de cultura de celulas de produpao de proteina hfB3 ou proteina hfB3-292S. Nota: 100% de inibipao representou nenhuma lise de rRBCs. O eixo Y representa OD405 medio e Desvio Padrao (SD).
[0025] Figura 5A mostra proteina hfB3 (200 ng), purificada a partir de um processo de cromatografia de tres etapas, submetido a analise de SDS-PAGE e colorapao com prata. Figura 5B mostra inibipao de atividade hemolitica de serie de reapao de complemento alternativa humana pela proteina hfB3 purificada. Eixo X da esquerda para direita: soro humano exaurido de proteina de fator B suplementado com 0 pg de proteina de fator B humano tipo selvagem purificado (wt hfB) (controle, nenhuma lise de rRBCs); soro humano exaurido de proteina de fator B suplementado em cada reapao com uma mistura de 0,5 pg de proteina de fator B humano tipo selvagem purificado e 1,0, 0,5, 0,3, 0,2, 0,1 ou 0,05 pg de hfB3, como indicado. 100% de inibipao representa nenhuma lise de rRBCs. O eixo Y representa OD405 e SD medio.
[0026] Figura 6 mostra atividade biologica de duas populapdes de proteina hfB3. Mostrados sao os resultados para cromatografia de interagao hidrofobica (HIC) proteina hfB3 purificada de Pico I e Pico II para inibigao de atividade hemolitica de serie de reagao de complemento alternativa humana. Eixo X da direita para esquerda: soro humano exaurido de proteina de fator B suplementado com 0 pg de proteina de fator B humano purificado (controle, nenhuma lise de rRBCs); soro humano exaurido de proteina de fator B suplementado em cada reagao com uma mistura de 0,5 pg de proteina de fator B humano tipo selvagem purificada e varias quantidades de proteina hfB3 variando de 1,0 a 0,05 pg. 100% de inibigao representa nenhuma lise de rRBCs. O eixo Y representa OD405 e SD medio.
[0027] Figura 7 mostra cromatografia liquida de alta pressao de fase reversa (HPLC) de sobrenadantes de cultura de celula cru contendo proteina hfB3 ou proteina hfB3-292S depois da incubagao de cultura de tecido durante 72 horas (2x106 cels/mL). A) Sobrenadantes de celulas produtoras de hfB3 ( ), celulas produtoras de proteinahfB3-292S () e celulas 293 submetidas a tratamento ( ),foram aplicadas a um sistema de HPLC Agilent HP1100 usando uma coluna bore Jupiter™ C4 estreita (Phenomenex) e eluido com uma 50 rninutos de gradiente de agua I acetonitrila (25-70% de acetonitrila) contendo 0,1% de TFA. Eluigao foi monitorada em 215 nm com um detector de PDA. A posigao de proteina de choque de calor 70 (HSP70), presente em todas as tres amostras, e da mesma forma mostrada. B)A regiao aumentada do cromatograma mostrada na Figura 7A focalizando na regiao (25-29 rninutos) contendo os Picos I e II de proteina hfB3 e o pico contendo proteina hfB3-292S.
[0028] Figura 8 mostra analise de expressao de proteina hfB3-Fc submetendo-se 2 pl de sobrenadante de cultura de celula contendo proteina hfB3-Fc em uma analise de Western Blot e SDS-PAGE de nao redugao. (Veja Exemplo 12) Duas faixas de proteina hfB3-Fc foram detectadas com marcadores de peso molecular em KDa indicado na esquerda.
[0029] Figura 9 mostra colorapao por H&E representative de sepoes de parafina das articulapdes de pata dianteira direita de camundongos a partir de uma amostragem de estudo hfB3-292S em uma atrite induzida por anticorpo de colageno (CAIA) modelo de camundongo para artrite reumatoide como descrito no Exemplo 16. Grupo 1 e o grupo de controle de veiculo que nao recebeu coquetel de anticorpo de colageno. Grupo 2 e o grupo nao tratado que recebeu o coquetel de anticorpo de colageno. Grupo 3 e o grupo tratado que recebeu o coquetel de anticorpo de colageno e foi tratado com hfB3- 292S.
[0030] Figura 10 mostra medidas de inchapo de articulapao a partir de um teste de estudo hfB3-292S em um modelo de camundongo com artrite induzida por anticorpo de colageno (CAIA) para artrite reumatoide como descrito no Exemplo 16. Os grupos sao os mesmos como aqueles na Figura 8, como descrito no paragrafo. hfB3-292S causou uma redupao estatisticamente significante (p<0,0003) em inchapo de articulapao como comparado ao grupo nao tratado (Grupo 2).
[0031] Figura 11 mostra uma analise de Western Blot de meio de cultura de celula de celulas transfectadas com uma construpao de expressao hfB3-292SN480. Esta analise de Western Blot foi realizada usando um anticorpo monoclonal especffico para hfB3-292S. A pista esquerda contem hfB3-292S e a pista direita e meio de cultura de celula de celulas transfectadas com uma construpao de expressao de hfB3-292SN480. A analise detectou uma faixa de aproximadamente 55 KDa do meio de cultura de celula de linhagem celular hfB3-292SN480 (pista direita).
[0032] Figura 12 mostra uma analise de western blot meio de cultura de celula de celulas transfectadas com uma construpao de expressao de hfB3-292S/Fc-mono como descrito no Exemplo 19, abaixo. Uma faixa de aproximadamente 115 KDa foi detectada por anticorpo de fator B anti-humano de cabra purificado deste SDS-PAGE de nao redupao.
[0033] Figura 13 mostra o sobrenadante de cultura de celula de celulas expressando hfB3-292SN480 inibiu a atividade hemolitica de serie de reapao de complemento alternativa humana de uma maneira dependente de dose.
[0034] Figura 14 mostra o sobrenadante de cultura de celula de celulas expressando hfB3-292S/Fc-mono inibiu a atividade hemolitica de serie de reapao de complemento alternativa humana de uma maneira dependente de dose.
BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUENCIAS
[0035] SEQ ID NO:1 - sequencia de aminoacido de um fator B de complemento humano tipo selvagem
[0036] SEQ ID NO:2 - sequencia de aminoacido de uma proteina analoga de fator de complemento humano B, hfB3 292S, que compreende as seguintes mutapoes: K258A, R259A, K260A, D279G, N285D e C292S.
[0037] SEQ ID NO:3 - sequencia de aminoacido de um analogo de fator B de complemento humano, hfB3 292S-740N, compreendendo as seguintes mutapoes como comparado a SEQ ID NO:1: K258A, R259A, K260A, D279G, N285D, D740N e C292S.
[0038] SEQ ID NO:4 - sequencia de aminoacido de um analogo de fator B de complemento humano, hfB3 compreendendo as seguintes mutapoes quando comparado a SEQ ID NO:1: K258A, R259A, K260A, D279G e N285D.
[0039] SEQ ID NO:5 - sequencia de nucleotideo de uma construpao de expressao de hfB3, a construpao da qual e descrita noExemplo 1.
[0040] SEQ ID NO:6-7 - iniciadores para mutagenese sitio dirigida
[0041] SEQ ID NO:8 - sequencia de nucleotfdeo de uma construqao de expressao de hfB3-292S, a construQao da qual e descrita no Exemplo 2.
[0042] SEQ ID NO:9-14 - sequencias de aminoacido parciais de proteinas de fator B de complemento de um humano, um camundongo, um rato, um porco, um macaco e uma ovelha, respectivamente.
[0043] SEQ ID NO: 15-16 - iniciadores para mutagenese sitio dirigida
[0044] SEQ ID NO: 17 - sequencia de aminoacido de um analogo da proteina do fator B do complemento humano, hfB4.
[0045] SEQ ID NO: 18 - sequencia de nucleotfdeo de uma construQao expressao de hfB3-Fc, a construQao da qual e descrita no Exemplo 12.
[0046] SEQ ID NO:19-20 - iniciadores para mutagenese sitio dirigida.
[0047] SEQ ID NO:21 - sequencia de aminoacido de um analogo de proteina de fator de B de complemento humano, hfB3-Fc.
[0048] SEQ ID NO:22 - sequencia de aminoacido de um analogo de proteina de fator de B de complemento humano, hfB3-292S-Fc.
[0049] SEQ ID NO:23 - sequencia de aminoacido de um analogo de proteina de fator de B de complemento humano, hfB3-292S-740N- Fc.
[0050] SEQ ID NO:24 - sequencia de nucleotfdeo de uma construQao de expressao para expressar hfB3 292SN480.
[0051] SEQ ID NO:25 - construtor de expressao de gene de sequencia de nucleotfdeo para hfB3 292S/Fc mono.
[0052] SEQ ID NO:26 - sequencia de aminoacido de hfB3-292S/Fc-mono.
[0053] SEQ ID NO:27 - sequencia de aminoacido de um dominio Fc.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0054] A pratica da presente invencao utilizara, a menos que de outra maneira indicado, tecnicas convencionais de biologia celular, biologia molecular, cultura de celula, virologia e similar que estao na experiencia de alguem na tecnica. Estas tecnicas sao completamente descritas aqui e/ou na literatura atual, por exemplo, Sambrok, Fritsch e Maniatis eds., "Molecular Cloning", A "Laboratory Manual", 2° Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Celis J. E. "Cell Biology, A Laboratory Handbok" Academic Press, Inc. (1994) and Bahnson e outro, J. of Virol. Methods, 54:131-143 (1995).
[0055] E contemplado que qualquer metodo, preparagao ou composiQao descritos aqui podem ser implementados com respeito a qualquer outro metodo, preparagao ou composigao descritas aqui. O uso da palavra "um" ou "uma" quando usado juntamente com o termo "compreendendo" nas reivindicaçoes e/ou especificagao pode significar "um", porem e da mesma forma consistente com o significado de "um ou mais," "pelo menos um," e "um ou mais do que um." O uso do termo/frase "e/ou" quando usado com uma lista significa um ou mais dos artigos listados pode ser utilizado, por exemplo, nao e limitado a um ou todos os elementos.
[0056] Durante produgao e purificagao do analogo da proteina do fator B do complemento designado hfB3 (SEQ ID NO:4), duas populagoes do analogo da proteina do fator B do complemento foram detectadas. Uma populagao teve a atividade desejada para o analogo da proteina do fator B do complemento (Pico I) enquanto a outra populagao teve substancialmente menos da atividade desejada (Pico II), por exemplo, veja Figura 6 e 7. Os resultados de caracterizagao das duas populagoes sugeriram que as duas populagoes diferidas em seus padroes de ligagao de dissulfeto. Quando a cisteina livre (posigao 292 de SEQ ID NO:4) foi mutada em uma serina, Pico II foi nao detectavel. Figura 6 mostra que a fragao de Pico II exibe alguma habilidade para inibir atividade de complemento/hemolftica, porem muito menos capacidade por ug de proteina quando comparado a fragao de Pico I. E possivel que a atividade inibitoria de complemento/hemolitica vista com Pico II e principalmente ou somente um resultado de Pico II contendo algum hfB3 com uma cisteina livre na posigao 292, possivelmente como um resultado de Pico I e Pico II nao sendo completamente resolvido um do outro.
[0057] A cisteina correspondendo a posigao 292 de SEQ ID NO:1 e altamente conservada entre proteinas de fator B de complemento de especies de mamifero diferentes (por exemplo, veja Tabela 1). Sequencias altamente conservadas sao tipicamente importantes a fungao de uma proteina. "A teoria neutra de evolugao molecular declara que mutagoes em aminoacidos ocorrem de uma maneira estocasticamente constante contanto que as mutagoes nao tenham efeito na fungao do produto de gene [Kimura M: The neutral theory of molecular evolution. Sci Am 1979, 241(5):98-100, 102, 108 passim]. Por outro lado, aminoacidos que sao importantes para fungao de proteina e estrutura nao podem mutar sem um efeito prejudicial em atividade de proteina. Portanto, estes aminoacidos mudarao muito lentamente em uma determinada familia de proteina durante evolugao." (Liu e outro BMC Bioinformatics 2006, 7:37)Tabela 1. Cisteina Conservada em Proteina de ator B de ComplementoHUMANO* IGASNFTGAKKCLVNLIEKVASY (SEQ ID NO:9) CAMUNDONGO IGSSNFTGAKRCLTNLIEKVASY (SEQ ID NO: 10) RATO IGASNFTGAKRCLANLIEKVASY (SEQ ID NO:11)PORCO IGARNFTGAKNCLKDFIEKVASY (SEQ ID NO: 12)MACACO IGAGNFTGAKKCLVNLIEKVASY (SEQ ID NO: 13)OVELHA VGAHNFTGAKNCLRDFIEKVASY (SEQ ID NO:14)*C corresponde a posigao 292 para um fator B humano (SEQ ID NO:1)
[0058] Mutando a cisteina em aminoacido 292 do analogo da proteina do fator B do complemento para uma serina, por exemplo, como mostrado em SEQ ID NO:2 (hfB3-292), muito reduziu, se nao eliminou, a quantidade da populagao de Pico II (substancialmente menos ativo) e o analogo da proteina do fator B do complemento hfB3- 292S reteve sua atividade, neste caso a capacidade de inibir ou reduzir atividade de complemento. (Por exemplo, veja Exemplo 10, abaixo).
[0059] Nao desejando ser ligado por teoria, a populagao menos ativa (fragao de Pico II) de proteina hfB3 poderia ser o resultado de dobramento incorreto de proteina hfB3. E possivel que a geragao da maioria da populagao de Pico II foi devido a combinagao da cisteina livre e as mutagoes introduzidas a proteina hfB3 porque quando celulas foram criadas para expressar uma proteina de fator B de complemento humano (SEQ ID NO:1) de uma maneira similar aquela usada para proteina hfB3, apenas uma populagao da proteina do fator B humano do tipo selvagem foi detectada (dados nao mostrados).
[0060] Esta mutagao de uma cisteina livre permite um rendimento mais alto do analogo de fator B de complemento ativo visto que a maioria, se nao todo, o analogo da proteina do fator B do complemento produzido esta em uma forma ativa. Adicionalmente, mutagao de cisteina livre resulta em uma proteina mais estavel visto que todas as cisteinas nao mutadas restantes sao parte de uma ligagao de dissulfeto e nao ha cisteina livre restante que pode participar em reagdes possivelmente indesejaveis e prejudiciais.Adicionalmente, mutaQao da cisteina livre inesperadamente parece ter reduzido ou eliminado agregagao do analogo da proteina do fator B do complemento, por exemplo, veja Exemplo 6 e Figura 3.
[0061] Os analogos de proteina de fator B de complemento descritos em Publicagao PCT No. WO08/106644 ou Publicagao de Patente US No. US20100120665 (ambos dos quais estao incorporados por referenda em sua totalidade) pode ter sua cisteina livre mutada e ainda retem sua fungao indesejada, enquanto beneficiando-se das vantagens mencionadas acima da mutagao. Portanto, a presente invengao inclui qualquer dos analogos de proteina de fator B de complemento descritos em Publicagao PCT No. WO08/106644 ou Publicagao de Patente US No. US20100120665 com uma mutagao de uma cisteina livre.
[0062] O termo "cisteina livre" refere-se a uma cisteina que faz parte de uma proteina ou um peptideo, em que a cisteina livre nao forma uma ligagao de dissulfeto com outra cisteina na mesma proteina ou peptideo. Em alguns casos um "cisteina livre" de um analogo de proteina nao forma uma ligagao de dissulfeto com outra cisteina (na mesma proteina ou peptideo) quando o analogo de proteina tern uma atividade desejada, porem pode formar uma ligagao de dissulfeto com outra cisteina (na mesma proteina ou peptideo) em uma forma menos ativa ou inativa do analogo de proteina.
[0063] O termo "mediado por complemento" refere-se a um processo ou doenga que envolvem complemento. Tipicamente, uma doenga ou condigao "mediada por complemento" e uma em que atividade de complemento e um das causas subjacentes da doenga ou condigao e em que inibigao ou bloqueio da atividade de complemento diminui a extensao da doenga ou condigao. Exemplos de numerosas doengas ou condigoes mediadas por complemento sao descritos aqui.
[0064] O termo "tipo selvagem" (ou tipo-selvagem) que e alternadamente usado com "nativo", refere-se a uma proteina de ocorrencia natural codificada por um genoma mamifero, um acido nucleico de ocorrencia naturalmente, e assim por diante. Em alguns casos, pode haver atualmente mais do que uma proteina correspondendo a versao tipo selvagem, por exemplo, devido a diferengas alelicas; isoformas diferentes; e/ou variagao genetica entre individuos diferentes de uma especie.
[0065] O termo "analogo" refere-se a um derivado estrutural de uma proteina (proteina parenteral). Um analogo nao necessariamente retem todas as propriedades da proteina parenteral e em alguns casos tem pelo menos uma propriedade alterada quando comparado a proteina parenteral nativa correspondente. Em algumas modalidades, uma proteina parenteral e uma proteina nativa (de ocorrencia natural). Uma proteina analoga ou variante e produzida restituindo-se, substituindo-se, deletando-se, e/ou adicionando-se aminoacidos com respeito a sequencia de aminoacido nativa correspondente da proteina. As substituigoes ou insergbes tipicamente envolvem aminoacidos de ocorrencia natural, porem pode da mesma forma incluir aminoacidos sinteticos ou nao convencionais tambem. Em algumas modalidades, um analogo ou variante e produzido mutando- se uma proteina, por exemplo, mutando um acido nucleico codificando isto. Um analogo tipicamente retera pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5% da sequencia de aminoacido da proteina parenteral nativa correspondente (por exemplo, tem aquele percentual de identidade de sequencia de aminoacido com respeito a proteina parenteral de ocorrencia natural como determinado sobre o comprimento da proteina parenteral inteira ou, em certas modalidades, sobre um dominio especifico ou porgao da proteina parenteral).Analogos da mesma forma incluem fragmentos de analogos de comprimento totals que compreendem uma porgao da sequencia de aminoacido e retem um ou mais atividades biologicas da proteina parenteral ou de um analogo de comprimento total ou inibe uma ou mais destas atividades biologicas.
[0066] O termo "corresponde" ou "correspondendo" ao se referir a um aminoacido em uma proteina particular refere-se ao aminoacido particular naquela proteina particular e da mesma forma a um aminoacido em uma proteina relacionada ou similar e pode fornecer uma fungao similar a proteina. Por exemplo, um aminoacido em um fator B de complemento humano pode ser constatado para corresponder com um aminoacido em um fator B de complemento de murino ou em uma variante alelica humana de fator B, normalmente determinado alinhando-se as duas sequencias de aminoacido. Por exemplo, alguem versado na tecnica podem alinhar duas ou mais sequencias relacionadas, tai como SEQ ID NOs:9-14, para determinar aminoacidos correspondentes, por exemplo, usando um programa de BLAST (por exemplo, veja Tabela 1, acima). Da mesma forma, aminoacidos correspondentes podem ser determinados, por exemplo, alinhando-se motivos (por exemplo, um motivo de clivagem de protease) dentro de proteinas relacionadas ou nao relacionadas. Um tai alinhamento pode da mesma forma ser usado para derivar sequencias de consensos de proteina alvo ou dominios dos mesmos.
[0067] Quando aqui usado, o termo "gene" tipicamente refere-se a uma regiao de codificagao para uma proteina. Entretanto, em alguns contextos aqui estara claro que o termo "gene" esta da mesma forma referindo-se a elementos (por exemplo, elementos reguladores) operativamente ligados a uma regiao de codificagao tai como promotores, realgadores, sitios de uniao (aceptores e/ou doadores), sinais de poliadenilagao, introns, regides nao traduzidas 5', regibesnao traduzidas 3', etc.
[0068] O termo "farmaceuticamente aceitavel" significa aprovado por uma agenda reguladora do govern© Federal ou estadual ou listado na U.S. Pharmacopeia ou outro farmacopeia geralmente reconhecida para uso em humanos.
[0069] Um "beneficio terapeutico" nao e necessariamente uma cura para uma doenga particular ou condigao (incluindo qualquer doenga ou condigao descrita aqui), porem, abrange um resultado que mais tipicamente inclui alivio da doenga ou condigao, eliminagao da doenga ou condigao, redugao de um ou mais sintomas associados com a doenga ou condigao, prevengao ou alivio de uma doenga secundaria ou condigao resultante da ocorrencia de uma doenga primaria ou condigao, diminuindo a probabilidade de desenvolver uma condigao ou doenga, diminuindo a severidade de uma doenga ou condigao, mudando o carater de uma doenga ou condigao, encurtando o curso de uma doenga ou condigao, reduzindo ou prevenindo a progressao ou piora de uma doenga ou condigao, e/ou prevengao da doenga ou condigao.
Analogos do Fator B do complemento
[0070] A presente invengao inclui analogos da proteina do fator B do complemento e polipeptideos compreendendo analogos do fator do complemento e seus usos. Algumas modalidades da invengao incluem um analogo da proteina do fator B do complemento em que uma cisteina livre foi mutada. Em algumas modalidades, esta mutagao de uma cisteina livre pode compreender uma delegao da cisteina livre ou substituigao da cisteina livre com outro(s) aminoacido(s). Uma cisteina livre pode ser substituida com essencialmente qualquer aminoacido, que ainda permite o analogo da proteina do fator B do complemento refer pelo menos alguma da caracteristica(s) desejada(s), tai como a capacidade para sub regular, diminuir ou ablagao de atividade de complemento. Uma substituigao pode ser com um ou mais aminoacidos. Em algumas modalidades, uma cisteina livre e substituida com uma serina. Em algumas modalidades, uma cisteina livre e substituida com um ou mais aminoacidos selecionados a partir do grupo consistindo em alanina, histidina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, tirosina e valina. Em algumas modalidades, uma cisteina livre corresponde a aminoacido 292 de SEQ ID NO:1.
[0071] Em algumas modalidades, a invengao fornece analogos de proteina de fator B de complemento que nao compreendem uma cisteina livre. A invengao da mesma forma fornece metodos de preparar ou produzir um analogo da proteina do fator B do complemento compreendendo mutar uma cisteina livre.
[0072] Mutagao de uma cisteina livre pode ser combinada com outras mutagoes de uma proteina de fator de B de complemento, por exemplo, outras mutagoes como descrito aqui.
[0073] A invengao da mesma forma fornece analogos de proteina de fator B de complemento em que a cisteina correspondendo aminoacido 292 SEQ ID NO:1 e mutada. Esta mutagao pode ser uma delegao, insergao ou substituigao, tai como uma substituigao de serina ou outras mutagoes como descrito aqui.
[0074] Analogos podem incluir vario mutefnas de uma sequencia diferente da sequencia de aminoacido de ocorrencia natural. Por exemplo, unicas ou multiplas substituigdes de aminoacido (por exemplo, substituigdes de aminoacido conservadoras ou nao conservadoras) podem ser feitas na sequencia de ocorrencia natural. Uma substituigao de aminoacido conservadora geralmente nao deveria substancialmente mudar as caracteristicas estruturais da sequencia origem (por exemplo, um aminoacido de substituigao nao deveria tender a quebrar uma helice que ocorre na sequencia origem, ou rompe outros tipos de estrutura secundaria que caracteriza a sequencia origem). Exemplos de estruturas secundarias e terciarias de polipeptideo reconhecidas na tecnica sao descritas em Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); and Thornton et al. Nature 354:105 (1991). Substituigbes conservadoras incluem, porem nao sao limitadas, aquelas dos seguintes agrupamentos: Residues Acidos Asp (D) e Glu (E); Residues Basicos Lys (K), Arg (R), e His (H); Residues Nao Carregados Hidrofflicos Ser (S), Thr (T), Asn (N), e Gin (Q); Residues Nao carregados Alifaticos Gly (G), Ala (A), Vai (V), Leu (L), e lie (I); Residues Nao carregados Nao polares Cys (C), Met (M), e Pro (P); Residues Aromaticos Phe (F), Tyr (Y), e Trp (W); residues contendo grupo alcool S e T; residues alifaticos I, L, V e M; residues associados a Cicloalquenila F, H, W e Y; residues Hidrofobicos A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W e Y; residues Negativamente carregados D e E; residues Polares C, D, E, H, K, N, Q, R, S e T; residues Positivamente carregados H, K e R; residuos Pequenos A, C, D, G, N, P, S, T e V; residues Muito pequenos A, G e S; Residuos envolveram sucessivamente formagao A, C, D, E, G, H, K, N, Q, R, S, P e T; e residuos Flexiveis Q, T, K, S, G, P, D, E e R.
[0075] Em algumas modalidades, uma substituigao nao conservadora e usada.
[0076] Em algumas modalidades, mutagoes incluem, porem nao sao limitadas a substituigbes de um ou mais aminoacidos, delegbes de um ou mais aminoacidos ou insergbes de um ou mais aminoacidos. Mutagoes incluem, porem nao sao limitadas a, aquelas que: (1) reduzem suscetibilidade do analogo de fator B de complemento para proteolise, (2) reduzem suscetibilidade do analogo de fator B de complemento para oxidagao, (3) alteram afinidade de ligaQao do analogo de fator B de complemento para formar complexes de proteina, (4) alterar (por exemplo, aumentar ou diminuir) afinidades de ligaQao do analogo de fator B de complemento, (5) reduzir imunogenicidade do analogo de fator B de complemento; (6) aumentar estabilidade (por exemplo, termoestabilidade) do analogo de fator B de complemento; (7) reduzir agregagao do analogo da proteina do fator B do complemento; ou qualquer combinagao de 1-7.
[0077] Em algumas modalidades, um analogo de fator B de complemento humano da INVENÇÃO compete com ligaQao de fator B de complemento nativo. Por exemplo, fator B de complemento nativo pode ligar com fator C3b de complemento para formar C3bB, por exemplo, veja Figura 1B. Fator B que faz parte do complexo de C3bB pode ligar fator D. Portanto, em algumas modalidades, um analogo de fator B de complemento da INVENÇÃO pode competir com a ligagao de um fator B nativo para (i) ligagao a C3b, (ii) ligagao para fator D ou (iii) ambos.
[0078] Em algumas modalidades, um analogo da proteina do fator B do complemento da invengao, e um analogo de SEQ ID NO:4 tendo aminoacidos de cisteina que formam ligagoes de dissulfeto e um aminoacido de cisteina livre que foi substituido por outro aminoacido, mais do que um aminoacido ou foi deletado sem substituigao.
[0079] Em algumas modalidades da invengao, um analogo da proteina do fator B do complemento aumentou afinidade de ligagao de C3b quando comparado a uma proteina de fator B de complemento nativo correspondente e o analogo da proteina do fator B do complemento compreende (i) diminuir atividade de protease quando comparado a uma proteina de fator B de complemento nativa correspondente; (ii) diminuir capacidade de ser clivada por proteina de fator D quando comparado a uma proteina de fator B de complementonativa correspondente; ou (iii) diminuir atividade de protease quando comparado a uma proteina de fator B de complemento nativa correspondente e capacidade diminufda de ser clivada por uma proteina de fator D quando comparado a uma proteina de fator B de complemento nativa correspondente.
[0080] Em algumas modalidades, um analogo de fator B de complemento compreende uma mutagao no dominio de ligagao de C3b e o analogo da proteina do fator B do complemento exibe afinidade de ligagao aumentada para C3b quando comparado a afinidade de ligagao de uma proteina de fator B de complemento nativa correspondente para C3b. Em algumas modalidades, uma mutagao no dominio de ligagao de C3b compreende (i) uma substituigao ou delegao de um acido aspartico correspondendo a aminoacido 279 de SEQ ID NO:1, uma substituigao ou delegao de uma asparagina correspondendo a aminoacido 285 de SEQ ID NO:1 ou ambos; ou (ii) uma insergao de pelo menos um aminoacido proximo a referido acido aspartico ou referida asparagina. Em algumas modalidades, este acido aspartico, asparagina ou ambos sao substituidos com um ou mais aminoacidos. Em algumas modalidades, um acido aspartico correspondendo a aminoacido 279 de SEQ ID NO:1 e substituido com glicina, alanina ou asparagina. Em algumas modalidades, uma asparagina correspondendo a aminoacido 285 de SEQ ID NO:1 e substituida com glicina, alanina, ou acido aspartico. Em algumas modalidades, um acido aspartico correspondendo a aminoacido 279 de SEQ ID NO:1 e substituido com glicina e uma asparagina correspondendo a aminoacido 285 de SEQ ID NO:1 e substituida com acido aspartico.
[0081] Em algumas modalidades, um analogo da proteina do fator B do complemento e um analogo de proteina de fator de B de complemento humano, com base em uma proteina de fator decomplemento humana.
[0082] A presente INVENÇÃO inclui analogos de proteina de fator B de complemento, por exemplo, que podem ser liberados como protefnas e/ou por meio de transferencia de gene para atenuar a serie de reagao alternativa de ativagao de complemento. Estes analogos podem superar barreiras que impedem o desenvolvimento de alguns inibidores de complemento incluindo, por exemplo: 1) evitar supressao imune sistemica a longo prazo; 2) obtendo eficacia na face de outra maneira proibitivamente niveis altos de fatores de complemento no sangue; 3) obter niveis suficientes e distribuigao do analogo da proteina do fator B do complemento terapeutico na proximidade da retina e a membrana de Bruch para eficacia; 4) obter atividade do analogo da proteina do fator B do complemento terapeutico dentro de drusas; 5) obter duragao suficiente de liberagao terapeutica para tratar uma doenga cronica; 6) obter eficacia sem detri mental mente interferir com as atividades de serie de reagao de classicas na parte de tras do olho; e/ou 7) evitar ou diminuir uma reagao imune (por exemplo, uma reagao imune local) ao terapeutico.
[0083] Atenuar a retroalimentagao positiva na serie de reagao alternativa e um meio de sub-regular a serie de reagao alternativa inteira. Um meio adequado para atenuar a retroalimentagao de serie de reagao alternativa e para interferir com fungao ou niveis de proteina de fator B de complemento (fB). Algumas modalidades da invengao usam um analogo de fator B de complemento para atenuar atividade de complemento.
[0084] Um analogo da proteina do fator B do complemento da invengao pode compreender pelo menos uma mutagao correspondendo a uma mutagao de SEQ ID NO:1 selecionada a partir do grupo consistindo em K258A, R259A, K260A, D279G, N285D e D740N. Em algumas modalidades, compreende mutagoes correspondendo a K258A, R259A, K260A, D279G e N285D de SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, um analogo da proteina do fator B do complemento compreende uma mutagao correspondendo a D740N de SEQ ID NO:1.
[0085] Para propositos exemplares, analogos especfficos de proteina de fator de B de complemento sao descritos aqui. Proteina de Fator B pode ser manipulada de varias maneiras, por exemplo, para inibir ou reduzir ativagao da serie de reagao alternativa. Em algumas modalidades, sftios particulares em fator B podem ser alterados, por exemplo, por mutagenese sit io dirigida, de forma que a molecula ja nao funciona totalmente corretamente. Em algumas modalidades, a porgao de enzima ou dominio, (por exemplo, o dominio de protease, que e uma serina protease) da molecula pode ser alterada de forma que a molecula ja nao tern atividade enzimatica ou atividade enzimatica reduzida (por exemplo, reduzida pelo menos 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 50 vezes ou 100 vezes). Em algumas modalidades, um analogo da proteina do fator B do complemento compreende uma mutagao no sitio ativo do dominio de serina protease, em que a mutagao diminui ou abate a capacidade do analogo da proteina do fator B do complemento clivar fator C3 de complemento quando comparado a um proteina de fator B de complemento nativa correspondente.
[0086] Em algumas modalidades, isto pode ser obtido alterando-se o resfduo correspondente em aminoacido 740 de SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, esta mutagao compreende uma delegao ou uma substituigao de um acido aspartico correspondente a aminoacido 740 de SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, um acido aspartico (D), correspondente a aminoacido 740 de SEQ ID NO:1, e substitufdo com outro aminoacido tai como asparagina (N), alanina (A), acido glutamico (E), serina (S), tirosina(Y), ou glicina (G). A numeragao aminoacidos de fator B particulares aqui se referem ao polipeptideo inteiro incluindo o peptideo de sinal e e refletido em SEQ ID NO:1. Hourcade e outro (JBC (1998) 273(40):25996-6000) nota-se que aminoacidos 739-746 de SEQ ID NO:1 (referido a em Hourcade e outro como aminoacidos 714-721 porque a numerapao de Hourcade e outro nao inclui os 25 sequencia de sinal/peptideo de aminoacido) desempenha um papel na funpao de serina protease de proteina de fator B. Adicionalmente, N693, T694 e D740 podem constituir ou ser fazer parte do sitio de ligapao de substrate e H526, D576 e S699 podem constituir ou ser parte do centro catalitico, por exemplo, veja Xu e outro, J Biol Chem. 2000 275(1 ):378-85. Em algumas modalidades, um analogo de proteina de fator B compreende uma mutapao de pelo menos um dos aminoacidos selecionados de aminoacidos 739-746 de SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, um analogo da proteina do fator B do complemento compreende uma substituipao do aminoacido correspondendo a aminoacido 739 de SEQ ID NO:1 com uma alanina. Em algumas modalidades, um analogo da proteina do fator B do complemento compreende uma substituipao do aminoacido correspondendo a aminoacido 740 de SEQ ID NO:1 com um aminoacido selecionado a partir do grupo consistindo em asparagina, acido glutamico, alanina, serina e tirosina. Em algumas modalidades, um analogo da proteina do fator B do complemento compreende uma substituipao do aminoacido correspondendo a aminoacido 741 de SEQ ID NO:1 com um aminoacido selecionado a partir do grupo consistindo em triptofano e alanina. Em algumas modalidades, um analogo da proteina do fator B do complemento compreende uma substituipao do aminoacido correspondendo a aminoacido 742 de SEQ ID NO:1 com glutamina. Em algumas modalidades, um analogo da proteina do fator B do complemento compreende uma substituipao do aminoacido correspondendo a aminoacido 743 de SEQ ID NO:1 com fenilalanina.Em algumas modalidades, um analogo da proteina do fator B do complemento compreende uma substituigao do aminoacido correspondendo a aminoacido 745 de SEQ ID NO:1 com fenilalanina. Em algumas modalidades, um analogo da proteina do fator B do complemento compreende uma substituigao do aminoacido correspondendo a aminoacido 746 de SEQ ID NO:1 com triptofano ou alanina. Em algumas modalidades, um analogo de proteina de fator B compreende uma mutagao de um ou dois dos aminoacidos 693 e 694 de SEQ ID NO:1, por exemplo, uma substituigao ou delegao. Em algumas modalidades, um analogo de proteina de fator B compreende uma mutagao de um ou dois dos aminoacidos 526, 576 e 699 de SEQ ID NO:1, por exemplo, uma substituigao ou delegao.
[0087] Outros sitios em fator B que podem ser alterados incluem: 1) o sitio de ligagao para properdina (a dominio de ligagao de properdina) tai que ligagao ocorre com afinidade mais baixa (por exemplo, tai como 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 50 vezes ou 100 vezes reduziram afinidade quando comparado a proteina de fator B tipo selvagem) ou com afinidade mais alta (tai como pelo menos 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 50 vezes ou 100 vezes aumentou afinidade quando comparado ao fator B tipo selvagem); 2) o sitio de ligagao para proteina C3b (o dominio de ligagao de C3b) tai que ligagao ocorre com afinidade mais baixa (tai como pelo menos 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 50 vezes ou 100 vezes reduziu afinidade quando comparado a proteina de fator B tipo selvagem) ou com afinidade maior (tai como pelo menos 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 50 vezes ou 100 vezes aumentou afinidade quando comparado a proteina de fator B tipo selvagem, por exemplo, isto pode ser obtido substituindo-se o aminoacido correspondente a posigao 279 e/ou posigao 285 de SEQ ID NO:1 com outros aminoacidos, por exemplo, em que o aminoacido na posigao correspondente a posigao 279 e substituido com asparagina (N), alanina (A) ou glicina (G) e/ou o aminoacido na posigao correspondendo a posigao 285 e substituido com acido aspartico (D) ou alanina (A)); 3) o sitio agiu em por fator D tai que fator D reduziu capacidade de clivar partir ou ja nao cliva fator B para formar Bb (por exemplo, no sitio de clivagem de fator D, pelo menos um dos aminoacidos nas posigoes correspondendo a posigao 258, 259 ou 260 de SEQ ID NO:1, por exemplo, podem ser alterados para alanina (A) ou; uma combinagao de qualquer de 1, 2, e/ou 3 acima).
[0088] Em algumas modalidades, um analogo da proteina do fator B do complemento compreende uma alteragao no sitio de clivagem de fator D de complemento em que a alteragao diminui ou abate clivagem do analogo da proteina do fator B do complemento por proteina de fator D. Em algumas modalidades, uma alteragao no sitio de clivagem de fator D compreende (i) uma substituigao ou delegao de uma arginina correspondendo a aminoacido 259 de SEQ ID NO:1, uma substituigao ou delegao de uma ou ambas lisinas correspondendo a aminoacido 258 ou 260 de SEQ ID NO:1 ou uma substituigao ou delegao da arginina e ambas as lisinas; ou (ii) uma insergao proxima a arginina, proxima a uma ou ambas lisinas, ou proxima a arginina e uma ou ambas lisinas. Em algumas modalidades, um analogo da proteina do fator B do complemento tern aminoacidos correspondendo a aminoacidos 258-260 de SEQ ID NO:1 cada qual substituido com alanina.
[0089] A invengao inclui (i) analogos de proteina de fator B de complemento que ligam-se igualmente a fatores C3b e D; (ii) analogos de proteina de fator B de complemento com ligagao aumentada (quando comparado a sua forma nativa) a ambos os fatores C3b e D; (iii) analogos de proteina de fator B de complemento com ligagao aumentada (quando comparado a sua forma nativa) a proteina de fator D; e (iv) analogos de proteina de fator B de complemento com ligagao aumentada (quando comparado a sua forma nativa) para complexo de C3bB. A invenpao da mesma forma inclui metodos de inibir uma serie de reapao de complemento usando os analogos de proteina de fator B de complemento da invenpao, tai como i-iv, acima.
[0090] Em algumas modalidades, ligapao aumentada e aumentada por cerca de 1.5 a cerca de 10,000, cerca de 10 a cerca de 10,000, cerca de 100 a cerca de 10,000, cerca de 1,000 a cerca de 10,000, cerca de 1.5 a cerca de 1,000, cerca de 1.5 a cerca de 100, cerca de 1.5 a cerca de 10, cerca de 2 a cerca de 5, cerca de 2 a cerca de 10, cerca de 5 a cerca de 10, cerca de 5 a cerca de 20, cerca de 10 a cerca de 20, cerca de 10 a cerca de 30, cerca de 20 a cerca de 30, cerca de 30 a cerca de 50, cerca de 50 a cerca de 100, cerca de 100 a cerca de 500, cerca de 500 a cerca de 1,000, cerca de 1,000 a cerca de 5,000, ou cerca de 5,000 a cerca de 10,000 vezes. Em algumas modalidades, ligapao aumentada e aumentada em mais do que 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000 ou 10,000 vezes. Em algumas modalidades, ligapao aumentada pode ser medida por imunoprecipitapao ou usando um Biacore (Ge Healthcare, Piscataway, NJ), por exemplo, quando comparado a proteina de tipo selvagem. Como um exemplo para (i) acima, ligapao poderia ser medida por imunoprecipitapao da proteina com uma molecula de ligapao para proteina C3b e em seguida detectar proteina de fator D no imunoprecipitado, por exemplo, usando um imunoensaio tai como um ELISA ou Oeste, por exemplo, com ligapao aumentada demonstrada como uma faixa de intensidade aumentada em um Oeste.
[0091] Alguns analogos de proteina de fator B da invenpao podem ter ligapao aumentada a proteina C3b e/ou proteina de fator D por um fator de 2 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 500 vezes, 1000 vezes quando comparado a ligapao de fator B tipo selvagem a C3b e/ou fator D. Em algumas modalidades, ligapao aumentada pode ser medida por imunoprecipitapao ou usando um Biacore (Ge Healthcare, Piscataway, NJ).
[0092] Alguns analogos de proteina de fator B modificados da INVENÇÃO compreendem uma ou mais das alterapoes de aminoacido discutidas aqui e adicionalmente tem uma ou mais substituipoes de aminoacido, inserpoes ou alterapoes (por exemplo, pelo menos ou nao mais do que 1, 2, 5, 8, 10, 15 20, 50, 100, ou 200 alterapoes), quais analogos retem a ligapao aumentada a C3b e/ou fator D ou outra atividade biologica do analogo de proteina de fator B discutida aqui, que media inibipao da serie de reaqao de complemento. Tais analogos podem ter pelo menos 99,9%, 99%, 98%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75% ou 70% de identidade de sequencia de aminoacido com uma proteina de fator B tipo selvagem, por exemplo, a sequencia de aminoacido de SEQ ID NO:1 e retem a ligapao aumentada a C3b e/ou fator D.
[0093] No contexto de terapia de gene e expressao de analogos de proteina de fator B de complemento, as alterapoes/mutapoes serao refletidas no nivel do acido nucleico de codificapao. Desse modo, modificapoes da mesma forma podem ser feitas ao acido nucleico para realpar expressao. Por exemplo, certo codons podem ser preferidos por uma celula hospedeira particular. Desse modo, registro pode ser realizado onde certos codons sao preferidos em, por exemplo, um sistema de expressao mamifero particular ou celula.
[0094] Algumas modalidades da invenpao sao dirigidas a polinucleotideos e celulas hospedeiras (ou organismos multicelulares hospedeiros) uteis na produpao de um analogo da proteina do fator B do complemento e dirigido aos analogos, por exemplo, hfB3-292S (SEQ ID NO:2), hfB3-292S-740N (SEQ ID NO:3), hfB3-292S-Fc (SEQ ID NO:22), hfB3-292S-740N-Fc (SEQ ID NO:23) ou hfB3-292S/Fc- mono (SEQ ID NO:26). Metodos de isolar e testar atividade mediada por complemento destes analogos de proteina B de fator de complemento sao da mesma forma fornecidos. Alguns aspectos da INVENÇÃO sao dirigidos a composiQoes/preparaQoes farmaceuticas em que um analogo da proteina do fator B do complemento e um ingrediente ativo em um contexto terapeutico e/ou profilactico. Algumas modalidades da INVENÇÃO sao da mesma forma dirigidas a metodos de tratar disturbios mediados por complemento usando uma quantidade terapeuticamente eficaz de um analogo da proteina do fator B do complemento.
[0095] Em algumas modalidades da INVENÇÃO, um analogo de fator B de complemento pode compreender padroes de glicosilaQao que sao distintos de padroes de glicosilaQao em um fator B de complemento de ocorrencia natural, ou pode faltar glicosilaQao completamente. Carboidratos podem ser adicionados a e/ou removidos de analogos de fator B compreendendo sequencia de sitio de glicosilaQao para glicosilaQao N- e/ou O- ligada in vitro, tai como com um sistema de microssomo pancreatico canino (por exemplo, veja Mueckler e Lodish (1986) Cell 44:629 e Walter, P., (1983) Meth. Enzymol. 96:84) ou similar. Um analogo de fator B de complemento da INVENÇÃO pode ser produzido compreendendo adicionar ou deletar/mutar uma sequencia de aminoacido correspondendo a um sitio de glicosilaQao, por exemplo, mudar o padrao de glicosilaQao /estado de uma proteina podem mudar caractensticas funcionais de uma proteina. Por exemplo, hfB2, hfB3 (SEQ ID NO:4), hfB3-292S (SEQ ID NO:2), hfB3- 292S-740N (SEQ ID NO:3), hfB3-292S-Fc (SEQ ID NO:22), hfB3- 292S-740N-FC (SEQ ID NO:23) e hfB3-292S/Fc-mono (SEQ ID NO:26) compreende uma substituiQao de N285D, quando comparado a um fator B tipo selvagem (SEQ ID NO:1) que resulta na remoQao de um sitio de N-glicosilaQao. (Igualmente analogos de proteina de fator B de complemento hfB2 e hfB3 sao descritos em detalhes em PublicaQao de Patente US No. US20100120665.) A perda do sitio de N- glicosilapao altera as caracteristicas da proteina. O mesmo efeito pode ser obtido produzindo a proteina em uma celula que tern um padrao de glicosilagao alterado ou que nao faz glicosilar este N285. Por exemplo, um analogo ou proteina de fator B pode ser produzido em uma celula de E. coli que nao faz glicosilar o N285. Em algumas modalidades, um analogo da proteina do fator B do complemento e produzido em uma celula (por exemplo, uma E. coli) isso nao faz glicosilar um aminoacido correspondendo a um proteina de fator B tipo selvagem que e tipicamente glicosilado, por exemplo, correspondendo a aminoacido N285 de SEQ ID NO:1.
[0096] Como demonstrado em Publicagao PCT No. WO08/106644 e Publicagao de Patente US No. US20100120665, em alguns casos uma proteina de fator B nativa de uma especie pode ter atividade em uma reagao/serie de reagao de complemento a partir de outras especies. Portanto, a presente invengao da mesma forma inclui analogos de proteina de fator B de complemento a partir de uma especie para inibir atividade de complemento em outras especies.
[0097] Em algumas modalidades, um analogo da proteina do fator B do complemento da invengao e PEGilado, por exemplo, veja Roberts e outro, Advanced Drug Delivery Reviews 54(4):459-476 (2002); Veronese, Biomaterials 22(5):405-417 (2001); Fee and Alstine, Chemical Engineering Science 61(3):924-939 (2006); Kodera e outro, Progress in Polymer Science 23(7): 1233-1271 (1998); Morar, Biopharm International 19(4):34 (2006); and Veronese and Pasut, Drug Discovery Today 10(21 ):1451 -1458 (2005). Polietileno glicol (PEG) pode ser ligado a um analogo da proteina do fator B do complemento da invengao. Em algumas modalidades, PEG e ligado com ou sem um ligante multifuncional atraves de conjugagao sitio-especifica do PEG (por exemplo, ao N-terminal ou ao C-terminal de um analogo de fator B de complemento) ou por meio de grupos amino epsilon presentes em residues de lisina. Em algumas modalidades, derivatizapao de polimero linear ou ramificada que resulta em perda minima de atividade biologica. O grau de conjugapao pode ser intimamente monitorado por SDS-PAGE e espectrometria de massa para garantir a propria conjugapao de moleculas de PEG a um analogo de fator B de complemento. Em algumas modalidades, PEG nao reagido pode ser separado de conjugados de PEG por exclusao de tamanho e/ou por cromatografia de troca ibnica.
[0098] Em certas modalidades, o terminal carboxi, o terminal amino ou ambos de um analogo de fator B de complemento, sao quimicamente modificados. Modificapoes de terminal amino tai como acilapao (por exemplo, acetilapao) ou alquilapao (por exemplo, metilapao) e modificapoes de terminal carboxi tai como amidapao, bem como outras modificapoes de terminal, incluindo ciclizapao, podem ser incorporadas em varias modalidades da invenpao. Certas modificapoes de terminal amino e/ou terminal carboxi e/ou extensoes de peptideo (tai como fundidas em um polipeptideo heterologo, tai como albumina, imunoglobulina ou porpao do mesmo, tai como um dominio Fc de imunoglobulina) a sequencia de nucleo podem fornecer propriedades fisicas, quimicas, bioquimicas, e farmacologicas vantajosas, tai como: estabilidade realpada, potencia aumentada e/ou eficacia, resistencia a protease de soro, propriedades farmacocinetica desejaveis, e outros.
[0099] Em algumas modalidades, um analogo da proteina do fator B do complemento da invenpao compreende um dominio Fc de imunoglobulina, por exemplo, um dominio Fc de imunoglobulina humano. em algumas modalidades um dominio Fc e C-terminal a sequencia de aminoacido analoga de fator B de complemento. Em algumas modalidades, um dominio Fc compreende ou consiste em aminoacidos 766-990 de SEQ ID NO:21 ou aminoacidos 766-1003 ou 786-1003 de SEQ ID NO:26. Em algumas modalidades, um dominio Fc e aminoacidos 1-239 ou 2-239 de SEQ ID NO:27. Em algumas modalidades, um dominio Fc e um dominio Fc humano. Em algumas modalidades, um dominio Fc e de uma imunoglobulina, por exemplo, um IgG tai como lgG4. Em algumas modalidades, um dominio Fc e capaz de formar um dimero com outro dominio Fc. Em algumas modalidades, um analogo de fator B de complemento da INVENÇÃO e capaz de formar dimeros (por exemplo, dimeros homologos), tai como, porem nao limitado, atraves d interaQoes de dommios de Fc. Em algumas modalidades, um analogo de fator B de complemento nao forma dimeros ou a maioria de uma populaQao/PREPARAÇÃO de analogo de fator B de complemento esta na forma de monomeros. Em algumas modalidades, um analogo de fator B de complemento compreendendo um dominio Fc nao forma dimeros ou a maioria deste populaQao/PREPARAÇÃO de analogo de fator B de complemento esta na forma de monomeros. Em algumas modalidades, um analogo de fator B de complemento compreende um dominio Fc que tern uma ou mutaQoes de uma cisteina(s) na sequencia de dominio Fc, por exemplo, uma cisteina envolvida em dimerizaQao do dominio Fc. Em algumas modalidades, um dominio Fc compreende uma mutaQao de uma ou mais cisteinas correspondendo a aminoacidos 17 e/ou 20 de SEQ ID NO:27. Em algumas modalidades, um analogo de fator B de complemento compreende um dominio Fc que tern uma ou mutaQoes de uma cistefna(s) livre na sequencia de dominio Fc. Em algumas modalidades, uma cisteina(s) e substituida com um aminoacido selecionado a partir do grupo consistindo em histidina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, tirosina, e valina. Em algumas modalidades, uma cisteina e deletada. Em algumas modalidades, um ligante de sequencia de aminoacido e usado entre sequencias de aminoacido para um analogo de fator B de complemento e uma regiao de Fc. Em algumas modalidades, este ligante e um aminoacido, por exemplo, arginina.
[00100] Em algumas modalidades, um polipeptideo compreende igualmente um analogo de fator B de complemento truncado e uma regiao de Fc tai como compreendendo aminoacidos correspondendo a aminoacidos 26-480 de SEQ ID NO:2 e uma regiao de Fc.
[00101] A invengao tambem fornece analogos que sao fragmentos de um proteina de fator de B de complemento ou analogo que contem pelo menos 20, 30, 50, 70, 100, 150, 200, 300, 400, 480, 500, 600 ou 700 porgoes de aminoacido do analogo de proteina de fator de B de complemento e/ou compreende 1, 2 ou 3 dominios da proteina e tem ou retem uma ou mais atividades biologicas da proteina de fator B de complemento de tipo selvagem ou analogo eou age como um inibidor de um aspecto do sistema complementar (ou da serie de reagao classica, serie de reagao alternativa ou ambas). Estes fragmentos podem da mesma forma ser modificados ligando-se ou fundindo-se com outra proteina ou fragmento tai como um Fc para aumentar a estabilidade e/ou meia-vida do analogo. Em algumas modalidades, um analogo e fragmento de uma proteina de fator de B de complemento ou analogo e o fragmento tem pelo menos 99,5%, 99%, 98%, 95%, 90%, 85% ou 62% de identidade com a sequencia de aminoacido correspondente de um fator B de complemento tipo selvagem.
[00102] A invengao fornece proteinas compreendendo um fragmento de um proteina de fator de B de complemento ou analogo, em que o fragmento tem uma truncagao de N-terminal e/ou terminal C. Em algumas modalidades, um analogo de fator B de complemento compreende uma truncagao de C-terminal em que o analogo e truncado em ou depois de (C-terminal a) um aminoacido correspondendo a aminoacido 407, 427, 457, 477, 480, 484, 487, 507 ou 527 de SEQ ID NOs:1, 2 ou 4. Em algumas modalidades, um analogo de fator B de complemento compreende uma truncagao de C- terminal em que o analogo e truncado em um aminoacido entre aminoacidos correspondendo a aminoacidos 407-487, 470-495 ou 477-487 de SEQ ID NOs:1, 2 ou 4. Em algumas modalidades, um analogo de fator B de complemento da invengao nao compreende aminoacidos que correspondem a aminoacidos 408-764, 428-764, 458-764, 478-764, 481-764, 485-764, 488-764, 507-764, 527-764 de SEQ ID NOs:1, 2 ou 4. Em algumas modalidades, truncagao ou fragmentagao de uma proteina de fator B ou analogo pode criar uma cisteina livre. Por exemplo, uma truncagao pode resultar na delegao de uma cisteina de um par de cisteina que forma uma ligagao de dissulfeto em uma proteina de fator B de complemento nativo, desse modo criando um polipeptideo que contem uma cisteina, porem nao contem seu "parceiro" de cisteina nativa. Em algumas destas modalidades, a cisteina restante do par pode ser mutada, por exemplo, substituida com outro aminoacido, tai como uma alanina, histidina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, tirosina e valina ou a cisteina podem ser deletadas, por exemplo, para eliminar possivel ligagao de dissulfeto indesejada.
[00103] Analogos da invengao podem ser preparados por varias tecnicas, incluindo, porem, nao limitado a, sintese quimica ou por expressao do analogo recombinante.
[00104] Sequencias de nucleotideo para genes e regioes de codificagao codificando fator B humano, bem como as sequencias de aminoacido sao conhecidos na tecnica. Por exemplo, um gene codificando fator B humano e encontrado em NCBI Database Accession No. NG_000013. Uma sequencia de codificagao para um fator B humano e encontrada em NCBI Database Accession No. NM_001710 e uma sequencia de aminoacido para uma preproteina de fator B de complemento humano e encontrada em NCBI Database Accession No. NP_001701 ou P00751. Sequencia de outras especies animais sao da mesma forma conhecidas na tecnica. Por meio de comparapao, na sequencia de proteina de fator B de camundongo (por exemplo, veja NCBI Database Accession No. P04186), o terceiro dominio de SCR esta localizado nas posipoes 160-217 desta 761 preproteina de aminoacido, e a proteina de fator B de murino madura abrangem posipoes 23-761. Os primeiros 22 aminoacidos de proteina de fator B de camundongo compreende uma sequencia de sinal.
[00105] Tipicamente, uma preproteina de fator B humana e uma 764 proteina de aminoacido (por exemplo, veja SEQ ID NO:1) com um peptideo de sinal abrangendo 1-25 posipoes de aminoacido. A cadeia madura de fator B corresponde a posipoes 26-764 (por exemplo, veja SEQ ID NO:1). As tres regioes de SCR de fator B humano sao SCR1, da mesma forma conhecidas como Sushi 1, abrangendo de cerca de posipao 35 a cerca de posipao 100, SCR2, da mesma forma conhecido como Sushi 2, abrangendo de cerca de posipao 101 a cerca de posipao 160 e SCR3, da mesma forma conhecido como Sushi 3, abrangendo de cerca de posipao 163 a cerca de posipao 220.
[00106] Publicapao PCT No. WO08/106644 e Publicapao de Patente US No. US20100120665 descrevem, entre outros, tres analogos de proteina de fator B humano negative dominante especifico designado como hfB1, hfB2 e hfB3. O primeiro destes tres analogos, denominado fB1, contem um aminoacido mutado no sitio de protease de fator B (fB). Esta porpao de fB liga-se a C3b com afinidade normal e cineticas, porem quando agiu em fator D (fD) e estabilizado por properdina, nao funciona como uma protease e nao forma um C3- convertase. fB1 contem uma substituipao com N em um aminoacido correspondendo a aminoacido 740 de SEQ ID NO:1 (por exemplo, D740N). O segundo destes analogos de fator B de complemento, denominados fB2, altera o mesmo aminoacido como fB1, porem alem disso, altera dois aminoacidos adicionais no dominio de ligagao de C3b (substituigoes em aminoacidos correspondendo a aminoacidos 279 e 285 de SEQ ID NO:1) que aumenta a afinidade de ligaQao de fB2 para C3b, por exemplo, mudanQas de D279G, N285D e D740N. A substituigao de N285D remove um sitio de N-glicosilagao putative. O terceiro destes analogos de proteina de fator B de complemento, denominado hfB3, combina as mutagoes que aumentam ligaQao de C3b de fB2 com uma mutagao que bate fora do sitio para clivagem por fator D, particularmente com substituiQoes em aminoacidos correspondendo a residues 258, 259 e 260 de SEQ ID NO:1 bem como substituiQoes em aminoacidos correspondendo a residues 279 e 285, por exemplo, mudanQas de K258A, R259A, K260A, D279G e N285D. Clivagem de fB tipo selvagem por fator D ativa o fB protease. Desse modo, hfB3, com suas cinco mudanQas de aminoacido, eficazmente liga C3b porem tem atividade de protease minima.
[00107] hfB1, hfB2 e hfB3 sao exemplos de analogos de fator humano B que podem ser tambem modificados para complementar os analogos de fator B da presente INVENÇÃO transformando uma cisteina livre que corresponde ao aminoacido 292 de SEQ ID NO:1, por exemplo, substituindo a cisteina com uma serina, porem a INVENÇÃO nao esta limitada a estes analogos especificos. Algumas modalidades da INVENÇÃO incluem qualquer analogo de fator B de complemento que modula uma serie de reagoes de complemento e nao compreende uma cisteina livre. Em algumas modalidades, um analogo de fator B de complemento compreende, alem de uma cisteina livre mutada, uma ou mais mutagoes de aminoacidos que correspondem a um ou mais dos seguintes aminoacidos em SEQ ID NO:1: aminoacido 258, 259, 260, 279, 285, 739, 740, 741, 742, 743, 744, 745 e 746. Esta um ou mais mutagoes pode(m) ser uma substituigao ou delegao do aminoacido ou uma adigao de pelo menos um aminoacido proximo a ou dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoacidos dos aminoacidos correspondentes. Em algumas modalidades, esta adigao rompe, muda, aumenta ou inibe a fungao do aminoacido listado, por exemplo, rompe seu papel (i) na clivagem de outra proteina (por exemplo, 740), (ii) como um sitio de divisao por outra proteina (por exemplo, aminoacidos que correspondem aos residues 258, 259 e/ou 260 de SEQ ID NO:1), ou (iii) seu papel na ligagao de outra proteina (por exemplo, aminoacidos que correspondem aos residues 279 ou 285 de SEQIDNO:1).
[00108] Algumas modalidades da invengao compreendem uma substituigao de um aminoacido que corresponde a um ou mais dos aminoacidos que correspondem a 258, 259 e/ou 260 de SEQ ID NO:1, por exemplo, com um aminoacido selecionado a partir do grupo consistindo em alanina, glicina, valina, leucina e isoleucina. Algumas modalidades da invengao compreendem uma delegao de um aminoacido que corresponde a um, dois ou tres de aminoacidos que correspondem aos aminoacidos 258, 259 e/ou 260 de SEQ ID NO:1. Algumas modalidades da invengao compreendem pelo menos uma adigao de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoacidos imediatamente proximos a um aminoacido que corresponde aos aminoacidos 258, 259 e/ou 260 de SEQ ID NO:1.
[00109] Algumas modalidades da invengao compreendem uma substituigao de um aminoacido que corresponde ao aminoacido 739 de SEQ ID NO:1. Algumas modalidades da invengao compreendem uma substituigao de um aminoacido que corresponde ao aminoacido 739 de SEQ ID NO:1, por exemplo, com um aminoacido selecionado a partir do grupo consistindo em alanina, glicina, valina, leucina e isoleucina. Algumas modalidades da invengao compreendem uma delegao de um aminoacido que corresponde ao aminoacido 739 de SEQ ID NO:1.
[00110] Algumas modalidades da INVENÇÃO compreendem uma substituigao de um aminoacido que corresponde ao aminoacido 740 de SEQ ID NO:1, por exemplo, com um aminoacido selecionado a partir do grupo consistindo em acido glutamico, asparagina, alanina, serina, glicina e tirosina. Algumas modalidades da INVENÇÃO compreendem uma substituiQao de um aminoacido que corresponde ao aminoacido 740 de SEQ ID NO:1 com um aminoacido selecionado a partir do grupo consistindo em valina, leucina, isoleucina, treonina, cisteina, metionina, glutamina, fenilalanina, tirosina, triptofano, acido glutamico, asparagina, alanina, serina, glicina e tirosina. Algumas modalidades da INVENÇÃO compreendem uma delegao de um aminoacido que corresponde ao aminoacido 740 de SEQ ID NO:1.
[00111] Algumas modalidades da invengao compreendem uma substituigao de um aminoacido que corresponde ao aminoacido 741 de SEQ ID NO:1, por exemplo, com um aminoacido selecionado a partir do grupo consistindo em triptofano e alanina. Algumas modalidades da invengao compreendem uma substituigao de um aminoacido que corresponde ao aminoacido 741 de SEQ ID NO:1 com um aminoacido selecionado a partir do grupo consistindo em alanina, glicina, valina, leucina e isoleucina. Algumas modalidades da invengao compreendem uma substituigao de um aminoacido que corresponde ao aminoacido 741 de SEQ ID NO:1 com um aminoacido selecionado a partir do grupo consistindo em triptofano, tirosina e fenilalanina. Algumas modalidades da invengao compreendem uma delegao de um aminoacido que corresponde ao 741 aminoacido de SEQ ID NO:1.
[00112] Algumas modalidades da invengao compreendem uma substituigao de um aminoacido que corresponde ao aminoacido 742 de SEQ ID NO:1, por exemplo, com uma glutamina. Algumas modalidades da invengao compreendem uma substituigao de um aminoacido que corresponde ao aminoacido 742 de SEQ ID NO:1 com um aminoacido selecionado a partir do grupo consistindo em glutamina, acido glutamico, asparagina, e acido aspartico. Algumas modalidades da invengao compreendem uma delegao de um aminoacido que corresponde ao aminoacido 742 de SEQ ID NO:1.
[00113] Algumas modalidades da invengao compreendem uma substituigao de um aminoacido que corresponde ao aminoacido 743 e/ou 745 de SEQ ID NO:1, por exemplo, com uma fenilalanina. Algumas modalidades da invengao compreendem uma substituigao de um aminoacido que corresponde ao aminoacido 743 e/ou 745 de SEQ ID NO:1 com um aminoacido selecionado a partir do grupo consistindo em fenilalanina, tirosina e triptofano. Algumas modalidades da invengao compreendem uma delegao de um ou mais de aminoacidos que correspondem aos aminoacidos 743, 744 e/ou 745 de SEQ ID NO:1.
[00114] Algumas modalidades da invengao compreendem uma substituigao de um aminoacido que corresponde ao aminoacido 746 de SEQ ID NO:1, por exemplo, com um aminoacido selecionado a partir do grupo consistindo em triptofano e alanina. Algumas modalidades da invengao compreendem uma substituigao de um aminoacido que corresponde ao aminoacido 746 de SEQ ID NO:1 com um aminoacido selecionado a partir do grupo consistindo em alanina, glicina, valina, leucina e isoleucina. Algumas modalidades da invengao compreendem uma substituigao de um aminoacido que corresponde ao aminoacido 746 de SEQ ID NO:1 com um aminoacido selecionado a partir do grupo consistindo em triptofano, tirosina e fenilalanina. Algumas modalidades da invengao compreendem uma delegao de um aminoacido que corresponde ao aminoacido 746 de SEQ ID NO:1.
[00115] Algumas modalidades da invengao compreendem a insergao ou substituigao de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoacidos imediatamente proximos a ou no lugar de qualquer um ou mais dos aminoacidos que correspondem aos aminoacidos 739, 740, 741, 742, 743, 744, 745 e/ou 746 de SEQ ID NO:1.
[00116] Algumas modalidades da invenpao compreendem uma substituipao de um aminoacido que corresponde ao aminoacido 279 de SEQ ID NO:1, por exemplo, com um aminoacido selecionado a partir do grupo consistindo em glicina, alanina e asparagina. Algumas modalidades da invenpao compreendem uma substituipao de um aminoacido que corresponde ao aminoacido 279 de SEQ ID NO:1 com um aminoacido selecionado a partir do grupo consistindo em glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina. Algumas modalidades da invenpao compreendem uma substituipao de um aminoacido que corresponde ao aminoacido 279 de SEQ ID NO:1 com um aminoacido selecionado a partir do grupo consistindo em asparagina, acido glutamico e glutamina. Algumas modalidades da invenpao compreendem uma delepao de um aminoacido que corresponde ao aminoacido 279 de SEQ ID NO:1. Algumas modalidades da invenpao compreendem a inserpao ou substituipao de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoacidos imediatamente proximos a ou no lugar de um aminoacido que corresponde ao aminoacido 279 de SEQ ID NO:1.
[00117] Algumas modalidades da invenpao compreendem uma substituipao de um aminoacido que corresponde ao aminoacido 285 de SEQ ID NO:1, por exemplo, com um aminoacido selecionado a partir do grupo consistindo em alanina e acido aspartico. Algumas modalidades da invenpao compreendem uma substituipao de um aminoacido que corresponde ao aminoacido 285 de SEQ ID NO:1 com um aminoacido selecionado a partir do grupo consistindo em glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina. Algumas modalidades da invenpao compreendem uma substituipao de um aminoacido que corresponde ao aminoacido 285 de SEQ ID NO:1 com um aminoacido selecionado a partir do grupo consistindo em acido aspartico, acido glutamico e glutamina. Algumas modalidades da INVENÇÃO compreendem uma delegao de um aminoacido que corresponde ao aminoacido 285 de SEQ ID NO:1. Algumas modalidades da INVENÇÃO compreendem a insergao ou substituigao de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoacidos imediatamente proximos a ou no lugar de um aminoacido que corresponde ao aminoacido 285 de SEQ ID NO:1.
[00118] Algumas modalidades da invengao compreendem uma substituigao do um ou mais dos aminoacidos que correspondem aos aminoacidos 279, 282, 283, 284 e 285 de SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, estes aminoacidos sao substituidos com glicina, isoleucina, prolina, histidina e acido aspartico, respectivamente.
[00119] Algumas modalidades da invengao compreendem mutagoes dos aminoacidos que correspondem a 258, 259, 260, 279 e 285 de SEQ ID NO:1 como descrito aqui.
[00120] Em algumas modalidades especificas, a invengao fornece um analogo de proteina de fator B que compreende a sequencia de aminoacido de SEQ ID NO:2, 3, 21, 22, ou 23 (opcionalmente sem qualquer sequencia de sinal, por exemplo, aminoacidos 1-25 contidos nesta). Estes analogos de proteina de fator B podem ser usados nos metodos da invengao.
[00121] A invengao inclui analogos de proteina de fator B de complemento que compreendem uma combinagao das mutagoes (substituigoes, delegoes e adigoes) discutida aqui. Em algumas modalidades, estes analogos de fator B de complemento mantem um ou mais dos atributos dos analogos de hfB1, hfB2, hfB3, hfB3-292S ou hfB3-292S-740N ou qualquer outro analogo de fator B de complemento discutido aqui. A invengao tambem fornece analogos que sao fragmentos (por exemplo compreendendo um ou mais dominios de uma proteina de fator B de complemento tendo uma ou mais das mutagoes de aminoacido mencionadas aqui) destes analogos que tem um ou mais dos atributos dos analogos discutidos acima, por exemplo, hfB3-292SN480. Alem disso, os analogos podem compreender substituigdes, delegoes ou insergoes de aminoacido adicionais (por exemplo, substituigdes de aminoacido conservadoras, truncagoes do N-terminal ou C-terminal, etc.) tai que o analogo tem pelo menos 99,5%, 99%, 98%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75% ou 75% de identidade com o fator B de complemento tipo selvagem correspondente ou, no caso de um analogo compreendendo um fragmento de fator B de complemento, o analogo tem pelo menos 99,5%, 99%, 98%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75% ou 70% de identidade entre as partes correspondentes do analogo e fator B de complemento tipo selvagem.
[00122] As proteinas hfB3-292S e hfB3-292SN480 contem os seguintes aspectos fundamentals de N-terminal para C-terminal: 1) sequencia de sinal nativa de proteina de fator B para secregao eficiente fora das celulas de expressao mamiferas tais como celulas 293 humanas, celulas de CHO, celulas de BHK; 2) um sitio de clivagem de proteina de fator D dependente de C3b mutada (mudando os aminoacidos de K258R259K260 para A258A259A260); 3) um sitio de ligagao de proteina C3b mutada (mudando o aminoacido de D279 para G279; e aminoacido de N285 para D285) para permitir sua ligagao estreita com e captura da proteina C3b; e 4) uma cisteina livre mutada (mudando o aminoacido C292 para S292) para aumentar a quantidade de proteina corretamente duplicada ou "ativa".
[00123] Em algumas modalidades da invengao, um analogo da proteina do fator B do complemento humano e pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% identico a (i) SEQ ID NOs:1, 2, 3, 22 ou 23; (ii) aminoacidos 26-764 de SEQ ID NOs:1, 2 ou 3; (iii) aminoacidos 1-990 ou 26-990 de qualquer uma dentre SEQ ID NOs:22 ou 23; aminoacidos 26-480 de SEQ ID NO:2; e (iv) aminoacidos 1-1003 ou 26-1003 de SEQ ID NO:26. Em algumas modalidades, um analogo da proteina do fator B do complemento humano da invengao compreende (i) SEQ ID NOs:2, 3, 22, 23 ou 26; (ii) aminoacidos 1-480 de SEQ ID NO:2; (iii) aminoacidos 26-480 de SEQ ID NO:2; (iv) aminoacidos 26-764 de SEQ ID NOs:2 ou 3; (v) aminoacidos 26-990 de SEQ ID NOs:22 ou 23; ou (vi) aminoacidos 26- 1003 de SEQ ID NO:26. Em algumas modalidades, um analogo da proteina do fator B do complemento consiste essencialmente em (i) aminoacidos 26-764 de SEQ ID NO:2 ou 3; (ii) aminoacidos 26-480 de SEQ ID NO:2 ou 3; (iii) aminoacidos 26-990 de SEQ ID NOs:22 ou 23; ou (iv) aminoacidos 26-1003 de SEQ ID NO:26.
[00124] Figura 1 descreve a serie de reapoes de complemento classica e de lectina (Figura 1a) e a serie de reapoes de complemento alternativo (Figura 1b). Ambas series de reapoes utilizam C3b. O complexo de C3bBb e uma C3 convertase que converte C3 em C3b. A dissociapao espontanea ("declinio") de C3bBb dentro de minutos leva a sua inativapao, considerando que properdina estabiliza o complexo de C3bBb. C3b participa na C3 convertase para gerar C3b adicional desse modo criando uma alpa de retroalimentapao positiva como mostrado pela seta grande. Varios fatores que atenuam as series de reapoes complementares, tai como fator de acelerapao de declinio (DAF), causam desse modo por acelerapao, a declinio da C3 convertase, C3bBb. Sem desejar estarem ligados por teoria, alguns dos analogos do fator B de complemento descritos aqui ligam C3b no lugar de um fator B de complemento nativo, competindo desse modo com o fator B de complemento nativo para ligapao a C3b. Alguns analogos de fator B de complemento da invenpao ligam C3b para criar um complexo inativo ou um complexo com atividade de C3 convertase significativamente reduzida em comparapao a um complexo de C3bBb nativo.
[00125] A INVENÇÃO da mesma forma fornece analogos de fator B de complemento que compreendem mutagoes de aminoacidos que correspondem aqueles no fator B que interage com fatores/moleculas que aceleram a declinio do complexo de C3bBb. Em algumas modalidades, um analogo de fator B de complemento compreende mutagoes de aminoacidos que interagem com DAF. Estas mutagoes incluem, porem nao estao limitadas a uma ou mais mutagoes de aminoacidos que correspondem aos aminoacidos 290, 291, 323, 363, 364, ou 407 de SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, estas mutagoes sao uma substituigao ou delegao de um ou mais dos aminoacidos que correspondem aos aminoacidos 290, 291, 323, 363, 364, ou 407 de SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, um analogo de fator B de complemento compreende uma ou mais das seguintes mutagoes que correspondem a K323E, K290A, K291A, Y363A, S364A ou D407N de SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, um analogo de fator B de complemento compreende uma das seguintes combinagoes de mutagoes que correspondem a K290A/K291A, Y363A/S364A ou K290A/K291A/Y363A/S364A de SEQ ID NO:1. Sem desejar estarem ligadas por teoria, as mutagoes de aminoacidos em um analogo de fator B de complemento que interage com fatores/moleculas que aceleram a declinio do complexo de C3bBb, podem inibir a declinio dos complexes de C3b e um analogo de fator B de complemento da invengao, desse modo permitindo um analogo de fator B de complemento inibir melhor a atividade complementar.
[00126] Procedimentos exemplares para gerar cDNAs (por exemplo, fB tipo selvagem humano e tres analogos de fator B de complemento bem como quatro sequencias de murino analogos) e sua incorporagao em vetores sao detalhados no Exemplo 8 da Publicagao PCT No. WQ08/106644 e Publicagao de Patente US No. US20100120665.
Acidos Nucleicos
[00127] A invenpao inclui acidos nucleicos que compreendem uma sequencia de nucleotfdeo que codifica um analogo da proteina do fator B do complemento da invenpao e inclui vetores que compreendem estes acidos nucleicos.
[00128] Para garantir a expressao local e a longo prazo de um acido nucleico de interesse, algumas modalidades da invenpao contemplam transduzir uma celula com um acido nucleico ou vetor que codifica um analogo de fator B de complemento da invenpao. A presente invenpao nao deve ser interpretada como limitada a qualquer metodo de liberapao de acido nucleico particular, e qualquer veiculo de liberapao de acido nucleico disponivel com uma estrategia de liberapao de acido nucleico in vivo ou in vitro, ou o uso de celulas manipuladas (tai como a tecnologia de Neurotech, Lincoln, Rl, por exemplo, veja Patente U.S. Nos. 6.231.879; 6.262.034; 6.264.941; 6.303.136; 6.322.804; 6.436.427; 6.878.544) bem como acidos nucleicos da invenpao que codificam um analogo de fator B de complemento de per si (por exemplo, "DNA nu"), podem ser usados na pratica da presente invenpao. Varios veiculos de liberapao, tais como vetores, podem ser usados com a presente invenpao. Por exemplo, vetores virais, lipidios anfitroficos, polimeros cationicos, tais como polietilenimina (PEI) e polilisina, dendrfmeros, tais como moleculas combburst e moleculas starburst, lipidios nao ibnicos, lipidios anionicos, vesfculas, lipossomas e outros meios de acido nucleico sinteticos de liberapao de gene (por exemplo, veja Pat. U.S. Nos. 6.958.325 e 7.098.030; Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat e outro, em "Liposomes" in "The Therapy of Infectious Disease and Cancer"; and Lopez-Berestein & Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 317- 327 e 353-365 (1989); acidos nucleicos "nus" e assim por diante podem ser usados na pratica da presente invenpao.
[00129] Um vetor e um meio pelo qual um acido nucleico de interesse (por exemplo, um acido nucleico terapeutico, por exemplo, que pode codificar uma proteina terapeutica) e introduzido em uma celula alvo de interesse. Um vetor e construido tipicamente ou obtido de um material de partida, tai como um acido nucleico capaz de carregar um gene ou transgene estranho e que e capaz de entrar e ser expresso em uma celula alvo. Materials de partida adequados dos quais um vetor pode ser obtido incluem elementos transponiveis, plasmideos, virus, produtos de PCR, cDNAs, mRNAs e assim por diante, como conhecido na tecnica. Metodos para obter ou construir um vetor de interesse incluem, porem nao estao limitados as tecnicas de manipulapao de gene padrao, reapoes de sequenciamento, sumarios de enzimas de restripao, reapoes de polimerase, PCR, PCR SOEing, ligapoes, reapoes de recombinase (por exemplo, tecnologia Invitrogen’s GATEWAY®) outras enzimas ativas em acidos nucleicos, bacterias e materials e metodos de propagapao de virus, substancias quimicas e reagentes, protocolos de mutagenese direcionada ao sitio e assim por diante, como conhecido na tecnica, veja, por exemplo, o texto de Maniatis e outro, "Molecular Cloning."
[00130] Acidos nucleicos da invenpao compreenderao tipicamente um promotor operativamente ligado a uma sequencia de codificapao de analogo da proteina do fator B do complemento. Um promotor pode ser um promotor especifico de tecido, um promotor especffico de celula, um promotor induzfvel, um promotor reprimfvel, um promotor constitutive, um promotor sintetico ou um promotor hfbrido, por exemplo. Exemplos de promotores uteis nas construpdes da invenpao incluem, porem nao estao limitados a um promotor de lambda de fago (PL); um promotor precoce de SV40; um promotor viral de herpes simples (HSV); um promotor de citomegalovirus (CMV), tai como o promotor precoce imediato de CMV humano; um sistema do promotor responsivo por transativador controlado por tetraciclina (tet); um promotor de repetigao terminal longo (LTR), tai como uma LTR de MoMLV, LTR de BIV ou uma LTR de HIV; um promotor da regiao U3 do virus do sarcoma de murino Moloney; um promotor de Granzyme A; uma(s) sequencia(s) reguladora(s) do gene metalotioneina; um promotor de CD34; um promotor de CD8; um promotor de timidina cinase (TK); um promotor de parvovirus B19; um promotor de PGK; um promotor de glicocorticoide; um promotor da proteina de choque termico (HSP), tais como promotores de HSP65 e HSP70; um promotor de imunoglobulina; um promotor de MMTV; um promotor do virus de sarcoma de Rous (RSV); um promotor de lac; um promotor de CaMV 35S; e um promotor de nopalina sintetase. Em algumas modalidades, um promotor e um promotor de MND (Robbins e outro, 1997, J. Virol. 71:9466-9474), ou um promotor de MNC que e um derivado do promotor de MND no qual os realgadores de LTR sao combinados com um promotor de CMV minimo (Haberman e outro, J. Virol. 74(18):8732-8739, 2000).
[00131] Em algumas modalidades, um vetor da invengao compreende um intron, por exemplo, como parte do gene que codifica para um analogo da proteina do fator B do complemento. Introns heterologos sao conhecidos e exemplos nao limitantes incluem um intron de gene de B-globina humano. Um intron pode ser de um gene de fator B de complemento ou um intron heterologo.
[00132] Sequencias de sinal ou sequencias lider sao conhecidas e podem ser usadas nas construgoes de expressao de analogo de fator B de complemento. As sequencias sinal sao tranduzidas na estrutura como um peptideo ligado a extremidade amino-terminal de um polipeptideo de escolha, a sequencia de sinal secretoria causara a secregao do polipeptideo interagindo-se com a maquinaria da celula hospedeira. Como parte do processo secretbrio, esta sequencia de sinal secretoria sera clivada. A sequencia de sinal secretoria de fosfatase alcalina placentaria humana e um exemplo de uma sequencia de sinal util. A presente INVENÇÃO nao esta limitada por sequencias de sinal secretorias especificos e outras sao conhecidas por aqueles versados na tecnica. O termo "sequencia de sinal" tambem se refere a uma sequencia de acido nucleico que codifica o peptideo secretorio. Se uma sequencia de sinal esta incluida, pode ser uma sequencia de fator B de complemento tipo selvagem, uma sequencia homologa, ou uma sequencia heterologa.
Vetores Virais
[00133] A presente INVENÇÃO inclui vetores virais que codificam um analogo(s) do fator B de complemento da invengao. Exemplos de vetores virais uteis na presente invengao sao descritos na Publicagao PCT No. WO08/106644 e Publicagao de Patente US No. US20100120665. A presente invengao nao esta limitada a um vetor viral particular. Vetores virais incluem, porem nao estao limitados a, vetores retrovirais, vetores lentivirais, vetores adenovirais (veja, por exemplo, Pat. U.S. Nos. 7.045.344), vetores de AAV (por exemplo, veja Pat. U.S. No. 7,105,345), vetores virais de Herpes (por exemplo, veja Pat. U.S. Nos. 5.830.727 e 6.040.172), vetores virais da hepatite (por exemplo, hepatite D) (por exemplo, veja Pat. U.S. No. 5.225.347), vetores de SV40, vetores de EBV (por exemplo, veja Pat. U.S. No. 6.521.449) e infectam vetores da doenga de Newcastle (por exemplo, veja Pat. U.S. Nos. 6.146.642, 7.442.379, 7.332.169 e 6.719.979). Em algumas modalidades, um vetor lentiviral e um vetor de HIV, EIAV, SIV, FIV ou BIV. A invengao da mesma forma fornece uma celula que produz um vetor viral da invengao.
[00134] Exemplos de sistemas de BIV sao descritos, por exemplo, em Matukonis e outro, 2002 Hum. Gene Ther. 13, 1293-1303; Molina e outro, 2002 Virology. 304, 10-23; Molina e outro, 2004 Hum. Gene Ther., 15, 65-877; Pat. U.S. Nos. 6,864,085, 7,125,712, 7,153,512; Publicapao PCT No. WO08/106644 e Publicapao de Patente U.S. No. US20100120665.
[00135] Virions de vetor da invenpao podem ser administrados in vivo ou in vitro as celulas (por exemplo, celulas mamfferas). Vetores (virais ou nao virais) podem ser usados para transduzir ou transformar celulas incluindo, porem nao limitadas as celulas nao diferenciadas, celulas diferenciadas, celulas somaticas, celulas primitivas e/ou celulas tronco. Em algumas modalidades, as celulas tronco sao planejadas para administrapao a um humano e nao para implante em uma mulher adequadamente pseudogravida para diferenciapao e desenvolvimento em uma crianpa.
[00136] Em algumas modalidades, um vetor viral da invenpao compreende um fator de acelerapao de declinio (DAF). Por exemplo, um vetor viral envolvido inclui um DAF na membrana viral. Em algumas modalidades, um DAF e um DAF tipo selvagem. Em algumas modalidades, um DAF faz parte de uma proteina de fusao com uma proteina de envelope, por exemplo, veja Guibinga e outro, Mol Ther. 2005 11(4):645-51. Em algumas modalidades, uma celula produtira de BIV expressa um DAF.
Producao De Analogos de Fator B de Complemento Da Invencao
[00137] Os analogos de proteina de fator B de complemento da invenpao podem ser produzidos de uma celula. Em algumas modalidades, o analogo da proteina do fator B do complemento e em seguida purificado a partir da celula e/ou do meio de cultura da celula.
[00138] A invenpao inclui (i) celulas compreendendo um acido nucleico compreendendo uma sequencia de nucleotideo que codifica um analogo de fator B de complemento da invenpao e/ou (ii) celulas expressando um analogo da proteina do fator B do complemento da invenpao. Em algumas modalidades, uma celula mamifera e utilizada.Em algumas modalidades, uma celula procariotica e utilizada.
[00139] Celulas hospedeiras sao tipicamente transfectadas ou transduzidas com um vetor de expressao ou de clonagem para produgao de proteina e cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados quando apropriado para induzir os promotores, selecionando-se os transformantes, amplificando-se os genes codificando as sequencias desejadas ou para purificagao a jusante e/ou procedimentos de concentragao.
[00140] Celulas hospedeiras adequadas para clonar ou expressar uma regiao de codificagao em um vetor sao celulas procariotas, de levedura, ou eucariotas superiores. Procariotas adequadas para este proposito incluem, porem nao estao limitadas a, eubacterias, tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae tai como Escherichia, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marcescans, e Shigella, bem como Bacilli tais como B. subtilis e B. licheniformis (por exemplo, B. licheniformis 41P), Pseudomonas tais como P. aeruginosa, e Streptomyces. Em algumas modalidades, um hospedeiro de clonagem de E. coli e E. coli 294 (por exemplo, ATCC 31,446), embora outras cepas tais como E. coli B, E. coli X1776 (por exemplo, ATCC 31.537), e E. coli W3110 (por exemplo, ATCC 27,325) possam ser adequadas.
[00141] Alem dos procariotas, microbios eucarioticos tais como fungos filamentosos ou levedura sao hospedeiras de expressao ou de clonagem adequados. Saccharomyces cerevisiae, ou a levedura de padeiro comum, e geralmente usado entre microrganismos hospedeiras eucarioticos inferiores. Entretanto, varios outros generos, especies, e cepas estao geralmente disponiveis e uteis aqui, tai como Schizosaccharomyces pombe; hospedeiras de Kluyveromyces tai como, por exemplo, K. lactis, K. fragilis (por exemplo, ATCC 12,424), K. bulgaricus (por exemplo, ATCC 16,045), K. wickeramii (por exemplo, ATCC 24,178), K. waltii (por exemplo, ATCC 56,500), K. drosophilarum (por exemplo, ATCC 36,906), K. thermotolerans, e K. marxiamis; yarrowia (por exemplo, EP402,226); Pichia pastoris (por exemplo, EP183,070); Candida; Trichoderma reesia (por exemplo, EP244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tai como Schwanniomyces occidentalis; e fungos filamentosos tai como, por exemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, e hospdeiros de Aspergillus tais como A. nidulans e A. niger.
[00142] Celulas hospedeiras adequadas, por exemplo, para a expressao de proteinas glicosiladas, podem ser derivadas de organismos multicelulares. Exemplos de celulas invertebradas incluem planta e celulas de inseto. Numerosas variantes e cepas baculovirais e celulas hospedeiras de inseto permissivas que correspondentes de hospedeiras tais como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca das frutas), e Bombyx mori foram identificados e podem ser usados para expressar proteinas. Uma variedade de cepas virais para transfecQao pode ser usada para expressao de proteina e estao publicamente disponivel, por exemplo, a variante de L-1 de Autographa californica NPV e a cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, e tais virus podem ser usados de acordo com a presente INVENÇÃO, por exemplo, para transfecQao de celulas de Spodoptera frugiperda. Culturas de celula de planta de algodao, milho, batata, soja, petunia, tomate, e tabaco tambem podem ser utilizados como hospedeiras.
[00143] Algumas modalidades da INVENÇÃO utilizam celulas mamiferas ou de vertebrado, e a propagaQao das celulas vertebradas em cultura (cultura de tecido) pode ser um procedimento rotineiro. Exemplos de linhagens celulares hospedeiras de mamifero uteis sao uma linhagem celular de CVI de rim de macaco transformada por SV40 (por exemplo, COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embrionaria humana (por exemplo, celulas 293 ou 293T que incluem a linhagem celular subclonada para crescimento na cultura de suspensao, Graham e outro, J. Gen Virol. 36:59 (1977) tai como 293 Freestyle (Invitrogen, Carlsbad, CA)) ou 293FT; celulas de rim de hamster bebe (por exemplo, BHK, ATCC CCL 10); celulas de ovario de hamster chines; celulas de ovario de hamster Chines/-DHFR (por exemplo, CHO, Urlaub e outro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); celulas de Sertoli de camundongo (por exemplo, TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); celulas de rim de macaco (por exemplo, CVI ATCC CCL 70); celulas de rim de macaco verde Africano (por exemplo, VERO-76, ATCC CRL-1587); celulas de carcinoma cervical humanas (por exemplo, HELA, ATCC CCL 2); celulas de rim canino (por exemplo, MOCK, ATCC CCL 34); celulas CF2TH; celulas de figado de rato Buffalo (por exemplo, BRL 3A, ATCC CRL 1442); celulas pulmonares humanas (por exemplo, W138, ATCC CCL 75); celulas de figado humano (por exemplo, Hep G2, HB 8065); celulas de tumor mamario de camundongo (por exemplo, MMT 060562, ATCC CCL51); celulas de TRI (Mather e outro, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1983)); celulas MRC 5; e celulas FS4.
[00144] Em alguns exemplos, uma celula hospedeira pode ser modificada para diminuir ou eliminar a expressao de uma proteina endogena. Por exemplo, se um analogo da proteina do fator B do complemento deve ser produzido em uma celula hospedeira particular (por exemplo, uma celula de CHO), em seguida a celula hospedeira pode ser modificada de forma que a expressao da proteina de fator B nativa de celula hospedeira (por exemplo, fator B de hamster) seja reduzida ou eliminada. Isto pode ser vantajoso para a purifica^ao a jusante do analogo da proteina do fator B do complemento. Portanto, ainvengao fornece um metodo de produzir um analogo de proteina de complemento da invenpao compreendendo reduzir ou eliminar a expressao da proteina de complemento nativa correspondente na celula hospedeira. Metodos para reduzir, eliminar ou nocautear a expressao de uma proteina de celula hospedeira sao conhecidos na tecnica. Por exemplo, o nivel de expressao de uma proteina pode ser reduzido ou eliminado construindo-se a celula hospedeira para expressar o RNA inibidor (por exemplo, RNAi) especifico para o RNA codificando para a proteina. Por exemplo, Clontech (Mountain View, CA) vende varios vetores e kits, tais como aqueles referidos como parte dos KNOCKOUT™ RNAi Systems, para reduzir a expressao de proteinas em uma celula hospedeira. Outros metodos incluem direcionamento de gene por recombinagao homologa que permite a introdugao de mutagoes especificas em qualquer gene clonado, por exemplo, veja Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1994-1998, Segoes 9.16 e 9.17. Isto pode ser usado para nocautear o gene expressando a proteina de celula hospedeira.
[00145] Outro metodo que pode ser utilizado para reduzir a expressao de uma proteina endogena, envolve usar um fator de transcrigao alvejado que reprime a expressao da proteina endogena. Por exemplo, um dominio repressor de um fator de transcrigao pode ser ligado ou fundido a um dominio de ligagao de DNA tai como um polipeptideo de ligante de zinco. Alguem versado na tecnica pode projetar os polipeptideos de ligante de zinco que ligam as sequencia de DNA especificos, por exemplo, veja Patente U.S. Nos. 6.140.081; e 7.067.617; e Pedidos de Patente Publicados U.S. 20060078880; 20040224385; e 20070213269. Alguem versado na tecnica pode dissociar polipeptideos de ligante de zinco projetados com um dominio repressor transcricional (por exemplo, um dominio de KRAB (caixa associada a Kruppel)). Exemplos de tais moleculas e tecnicas sao descritos em Beerli e outro (Proc Natl Acad Sci USA. 2000 97(4): 1495-1500) e Pedido de Patente Publicado U.S. 20070020627. Em algumas modalidades da invenpao, uma celula hospedeira seria transduzida com um vetor que expressa o repressor transcricional. Este metodo tem uma vantagem sobre o nocaute do gene de interesse usando a recombinapao hombloga porque, na maioria dos casos, uma celula hospedeira sera diploide e seria desejavel nocautear ambas copias de gene. Portanto, a expressao de um repressor transcricional deveria reprimir a expressao de ambas copias de gene.
[00146] A expressao de proteina endogena particular pode da mesma forma ser reduzida usando-se compostos que diretamente ou indiretamente reduzirao a expressao da proteina endogena particular. Usando-se fB como um exemplo, varios compostos podem ser usados para reduzir a expressao da expressao de fB endogena. Por exemplo, a expressao de proteina fB mostrou ser inibida por histamina (Falus & Meretey, Immunology 1987 60:547-551 e Falus & Meretey, Mol Immunol 1988 25(11): 1093-97), butirato de sodio (Andoh e outro, Clin Exp Immuno 1999 118:23-29), um glicocorticoide tai como dexametasona (Dauchel e outro, Eur J Immunol 1990 20(8): 1669-75), fator de crescimento derivado de plaqueta (Circolo e outro, 1990 The Journal of Biol Chem 265(9):5066-5071), fator de crescimento epidermico (Circolo e outro, 1990), e fator de crescimento de fibroblasto (Circolo e outro, 1990). Uma celula hospedeira da invenpao pode ser cultivada na presenpa de qualquer uma ou combinapao destas moleculas para reduzir a expressao endogena da proteina de fator B de complemento. Portanto, em algumas modalidades da invenpao, uma celula hospedeira expressando um analogo da proteina do fator B do complemento e cultivada na presenpa de qualquer um ou mais compostos selecionados a partir do grupo consistindo em uma histamina, um butirato de sodio, um glicocorticoide (por exemplo, dexametasona), um fator de crescimento derivado de plaqueta, um fator de crescimento epidermico, ou um fator de crescimento de fibroblasto.
[00147] Varios compostos e proteinas foram mostrados para superregular ou manter a expressao de proteina de fator B de complemento. Por exemplo, a expressao de proteina de fator B de de complemento mostrou ser super-regulada ou mantida por fator de necrose de tumor (TNF) (Andoh e outro, Clin Exp Immuno 1999 118:23-29), estrogenio (Sheng-Hsiang e outro, Biology of Reproduction 2002 66:322-332), lnterleucina-1 (Dauchel e outro, Eur J Immunol 1990 20(8): 1669-75), dexametasona (Lappin & Whaley, Biochem J 1991 280:117-123), prednisolona (Lappin & Whaley 1991), cortical (Lappin & Whaley 1991), e Interferona-gama (Huang e outro, 2001 Eur J Immunol 31:3676-3686). Uma celula hospedeira da invengao pode ser cultivada na ausencia de qualquer uma ou combinagao destas moleculas para reduzir a expressao endogena da proteina de fator B de complemento. Adicionalmente, uma celula hospedeira pode ser cultivada na presenQa de um inibidor de qualquer um ou mais destes compostos. Portanto, em algumas modalidades da INVENÇÃO, uma celula hospedeira expressando o analogo de proteina de fator B de complemento e cultivada na presenQa de qualquer um ou mais compostos que inibem um composto selecionado a partir do grupo que consiste em um TNF, estrogenio, interleucina-1, dexametasona, prednisolona, cortical, e interferon-gama. Em algumas modalidades, a expressao pela celula hospedeira de um ou mais destes compostos e reduzida, por exemplo, usando metodos como descrito aqui. Exemplos de inibidores de estrogenio incluem, porem nao estao limitados a tamoxifeno. Inibidores da mesma forma incluem os anticorpos que ligam e reduzem a atividade do composto. Por exemplo, varios anticorpos que ligam e inativam o TNF sao conhecidos na tecnica.
[00148] Um analogo da proteina do fator B do complemento contendo composigao preparada de celulas pode ser purificado usando-se, por exemplo, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese em gel, dialise, cromatografia de exclusao de tamanho, cromatografia de afinidade, cromatografia de imunoafinidade, diafiltragao de fluxo tangencial, cromatografia de troca ionica, cromatografia de interagao hidrofobica (HIC), cromatografia de fase reversa, cromatografia de afinidade de sefarose de heparina e outras formas conhecidas de separagao e concentragao. Seguindo qualquer(quaisquer) etapa(s) de purificagao preliminar(es), uma mistura compreendendo um analogo da proteina do fator B do complemento e contaminantes, se houver, pode ser submetida a cromatografia de interagao hidrofobica de baixo pH, por exemplo, usando um tampao de eluigao em um pH entre cerca de 2,5-4,5, em alguns casos realizada em baixas concentragoes de sal (por exemplo, de cerca de 0-0,25M de sal) ou outros procedimentos para outra purificagao.
[00149] Em algumas modalidades, um analogo da proteina do fator B do complemento da invengao e pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,9% puro em relagao a proteina total.
[00150] A invengao da mesma forma fornece metodos de produzir um analogo da proteina do fator B do complemento compreendendo expressar em uma celula um analogo da proteina do fator B do complemento da invengao e purificar o analogo da proteina do fator B do complemento.
Condigoes/Doengas Mediadas por Complemento
[00151] Ha tres series de reagoes da ativagao de complemento, a serie de reagoes classics, a serie de reagoes alternativa, e a serie de reagoes de lectina (Figura 1). Descritos aqui sao exemplos de analogos de proteina de fator B de complemento da invengao. Em algumas modalidades, estes analogos de proteina de fator B de complemento podem atenuar a serie de reapoes alternativa de ativapao de complemento. Entretanto, com base nesta maneira, todos as tres series de reapoes de complemento se dividem, estes analogos podem diminuir a inflamapao causada por quaisquer das tres series de reapoes de complemento e desse modo fornecem terapia para qualquer doenpa cuja etiologia envolve, pelo menos em parte, a ativapao de complemento. Estes incluem, porem nao estao limitados a, AMD precoce, AMD umida, e atrofia geografica. Figuras 1A e 1B esbopam as series de reapoes de complemento. Nota-se que eles dividem-se em C3b.
[00152] A invenpao fornece metodos de tratar uma doenpa mediada por complemento compreendendo administrar a um paciente uma preparapao farmaceutica da invenpao, um analogo de fator B de complemento da invenpao ou um acido nucleico ou vetor codificando um analogo de fator B de complemento da invenpao. A invenpao tambem inclui metodos de inibir a atividade complementar, em que o metodo compreende administrar a um individuo humano um analogo de fator B de complemento humano mutado em uma quantidade suficiente para inibir uma serie de reapoes complementar competindo- se com ligapao do fator B de complemento nativo no individuo, em que o analogo de fator B de complemento humano mutado e um analogo de fator B de complemento ativo de SEQ ID NO:4 tendo aminoacidos de cisteina que formam as ligapoes de dissulfeto e um aminoacido de cisteina livre que foi substituido por um aminoacido selecionado a partir do grupo que consiste em histidina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, tirosina, e valina. Em algumas modalidades, o analogo de fator B de complemento mutado compreende SEQ ID NO:2, 3, 22 ou 23.
[00153] A invenpao da mesma forma fornece metodos de inibir a atividade complementar, em que os metodos compreendem introduzir a um sitio da atividade complementar um analogo de fator B de complemento da INVENÇÃO, um acido nucleico da INVENÇÃO, um vetor viral da INVENÇÃO, uma composiQao/PREPARAÇÃO farmaceutica da INVENÇÃO, ou qualquer combinaQao das mesmas em uma quantidade suficiente para inibir a atividade complementar. Em algumas modalidades, um metodo da INVENÇÃO utiliza um fator B de complemento que e um analogo de SEQ ID NO:4 tendo aminoacidos de cisteina que formam ligaQdes de dissulfeto e um aminoacido de cisteina livre que foi substituido por outro aminoacido.
[00154] A INVENÇÃO fornece metodos de inibir a atividade complementar, em que os metodos compreendem introduzir a um sitio da atividade complementar um analogo do fator B de complemento humano mutado em uma quantidade suficiente para inibir a atividade complementar pelo analogo de fator B de complemento humano mutado competindo-se com a ligaQao do fator B de complemento nativo, em que o analogo de fator B de complemento humano mutado e um analogo de fator B de complemento ativo de SEQ ID NO:4 tendo aminoacidos de cisteina que formam ligaQdes de dissulfeto e um aminoacido de cisteina livre que foi substituido por um aminoacido. Em algumas modalidades, este metodo utiliza um analogo de fator B de complemento compreendendo aminoacidos 26-764 de SEQ ID NO:2, aminoacidos 26-764 de SEQ ID NO:3, aminoacidos 26-990 de SEQ ID NO:22 ou aminoacidos 26-990 de SEQ ID NO:23.
[00155] Series de raQao de complemento sao uma parte do sistema imune conhecido como o sistema imune inato que fornece protegao imediata de infecQao antes da ativagao das ramificagoes mediadas por celula e humoral do sistema imune. Elas sao ativadas e inativadas por reaQoes em cascata que exibem cineticas de ordem alta, porem, sao notavelmente bem reguladas. A serie de reaQoes de complemento alternative, em particular, evoluiu para o ciclo alto com grande rapidez por uma alga de retroalimentagao positiva.
[00156] Os analogos de proteina de fator B de complemento da invengao e/ou vetores que os expressam podem ser usados vantajosamente para administragao local e/ou sistemica a um mamifero e/ou para tratar doengas cronicas. Em algumas modalidades da invengao, um analogo de fator B de complemento inibe uma serie de reagoes complementar competindo-se com a ligagao do fator B de complemento nativo, por exemplo, para proteina C3b e/ou proteina de fator D. Isto pode permitir a atenuagao da atividade complementar ao inves de completar o bloqueio da serie de reagao. Portanto, pode ser possivel sub-regular a atividade complementar a um nivel que e terapeutico (por exemplo, alivia alguns sintomas ou sua severidade) sem bloquear completamente a atividade complementar. Desse modo, evitando ou diminuindo os riscos associados com o bloqueio da atividade complementar, tai como risco aumentado de infeegao. Portanto, a presente invengao fornece metodos para tratar uma doenga mediada por complemento (por exemplo, uma doenga cronica) por administragao local ou sistemica (por exemplo, i.v., intraperitoneal ou oral) de um analogo da proteina do fator B do complemento da invengao.
[00157] Em algumas modalidades, a presente invengao fornece composigoes e metodos para modular, regular, inibir e/ou realgar uma atividade complementar. As series de reagoes relacionadas ao complemento incluem, porem nao estao limitadas as series de reagoes classicas, de lectina e complementares alternativas. Em alguns casos, uma serie de reagoes relacionada ao complemento pode desempenhar um papel em uma condigao, doenga ou doengas particulares. Portanto, algumas modalidades da invengao fornecem metodos de regular, modificar, curar, inibir, prevenir, melhorar, reduzir o progressao e/ou tratar um estado de doenga mediado por uma ou mais serie(s) de reagao relacionada(s) ao complemento administrando-se um analogo de fator B de complemento da invengao ou um acido nucleico ou vetor codificando um analogo de fator B de complemento da invengao. Tais estados de doenga ou condigoes incluem, porem nao estao limitados a, formagao de drusas, degeneragao macular, AMD, olho seco, ulceras corneas, aterosclerose, retinopatia diabetica, vitreorretinopatia (Grisanti e outros, Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 32:2711-2717), inflamagao cornea, hipersensibilidade das vias aerea, doengas imunorrelacionadas, doengas autoimunorrelacionadas, nefrite por lupus, lupus eritematoso sistemico (SLE), artrite (por exemplo, artrite reumatoide), doenga reumatologica, sindrome do anticorpo anti- fosfolipideo, dano de l/R intestinal e renal, asma, sindrome hemolitica- uremica atipica, glomerulonefrite membranoproliferativa Tipo II, glomerulonefrite nao proliferativa, perda fetal (por exemplo, perda fetal espontanea), glaucoma, uveite, hipertensao ocular, lesao cerebral (por exemplo, lesao cerebral traumatica), acidente vascular cerebral (por exemplo, veja Arumugam e outro, PNAS 93(12):5872-6 (1996)), dano ao orgao pos-traumatico, trauma termico (por exemplo, lesao por queimadura) dano ao orgao pos-infarto (por exemplo, cardiaco, neurologico), vasculite, doenga de Kawasaki, angioedema hereditario (HAE), hemoglobinuria noturna paroxistica (PNH, as vezes referida como sindrome de Marchiafava-Micheli), colite, doenga intestinal inflamatoria, metastase de tumor, lesao isquemica-reperfusao, acidente cerebrovascular, doenga de Alzheimer, rejeigao ao transplante (por exemplo, xeno e alo), infecgoes, sepse, choque septico, sindrome de Sjogren, miastenia grave, doengas de pele mediadas por anticorpo, todas doengas especificas de orgao mediadas por anticorpo (incluindo diabetes melito Tipo I e Tipo II, tireoidite, purpura trombocitopenica idiopatica e anemia hemolitica, e neuropatias), smdrome de resistencia a insulina (por exemplo, veja Weyer e outro (2000) Diabetes Care, 23(6):779-785), diabetes gestacional, esclerose multi pla, psonase, lesao de desvio cardiopulmonar, poliarterite nodosa, purpura de Henoch Schonlein, doenQa de soro, doenQa de God pasture, vasculite necrosante sistemica, glomerulonefrite pos-estreptococica, fibrose pulmonar idiopatica (pneumonite intersticial habitual), glomerulonefrite membranosa, miocardite (por exemplo, miocardite autoimune) (Kaya e outro, Nat Immunol. 2001;2(8):739-45), infarto miocardico, distrofia muscular (por exemplo, associada com deficiencia de distrofina), smdrome pulmonar de choque agudo, smdrome da angustia respiratdria do adulto, reperfusao, e/ou uma doenQa mediada por complemento.
[00158] Em algumas modalidades, uma doenQa mediada por complemento e uma doenQa ocular. Em algumas modalidades, um analogo de fator B de complemento ou composiQao farmaceutica e administrado ao olho, por exemplo, por injeQao intravitrea, injeQao subretiniana, injeQao a camara intra-anterior do olho, injeQao ou aplicaQao localmente a cornea, injeQao subconjuntival, injeQao subTenon, ou por colirios. Em algumas modalidades, uma composiQao farmaceutica e administrada ao olho, em que a composiQao farmaceutica compreende pelo menos um analogo de fator B de complemento, por exemplo, selecionado a partir do grupo hfB3-292S (SEQ ID NO:2), hfB3-292S-740N (SEQ ID NO:3), hfB3-292S-Fc (SEQ ID NO:22) e hfB3-292S-740N-Fc (SEQ ID NO:23).
[00159] DegeneraQao macular relacionada a idade (AMD) e a causa mais comum da visao diminuida em individuos com mais de 65 anos de idade no mundo desenvolvido. AMD seca e caracterizada por uma degeneraqao progressiva da macula que causa a perda visual do campo central. Uma AMD debilitante mais aguda inclui a neovascularizapao florid e extravasamento na retina, conhecidos como AMD umida. Nao ha nenhuma terapia eficaz atualmente para AMD.
[00160] Uma caracterfstica de AMD e o acumulo de drusas, situadas entre a lamina basal do epitelio do pigmento retiniano (RPE) e a camada interna da membrana de Bruch (Pauleikhoff e outro, 1990 Am. J. Ophthalmol. 109, 38-43; Bressler e outro, 1990 Arch. Ophthalmol. 108, 1442-1447). Acredita-se que as drusas, bem como outras mudanQas relacionadas a idade que ocorrem proximas a membrana de Bruch, contribuem para a disfunpao e degenerapao de RPE e retina induzindo-se isquemia bem como restringindo-se a troca de nutriente e produtos residuals entre a retina e coroide (revisado por Bird, 1992 Pathophysiology of AMD. In Age-related macular Degeneration: Principles and Practice (Hampton, G., e Nelsen, P.T., eds.) Cap. 3, Raven Press, New York). Varios estudos indicaram processes imunomediados no desenvolvimento de AMD. Importantemente, os autoanticorpos foram detectados nos soros de pacientes com AMD (Penfold e outro, 1990 Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 228, 270-274), como predito pela hipotese que processes mediados inflamatorios e imunes estao envolvidos no desenvolvimento e/ou remopao de drusas.
[00161] A formapao de drusas no olho pode estar associada com varias doenpas tai como degenerapao macular. Em alguns casos, a formapao de drusas e/ou sua associapao com uma doenpa foi comprometida por estar relacionada a atividade complementar. Algumas modalidades da invenpao fornecem composipoes e metodos para modular, regular, inibir, reduzir, retardar e/ou reverter a formapao ou crescimento de drusas em um animal, tai como um humano. Por exemplo, composipoes ou moleculas da invenpao podem ser liberadas as drusas (por exemplo, por injepao direta em drusas (injepao intradrusa), adjacente as drusas ou injepao intravitrea). Algumas modalidades da invenpao podem ser utilizadas para reduzir o progress© da degenerapao macular, possivelmente inibindo a formapao de drusas. Vitronectina, um components abundante de drusas, tambem e um components de depositos extracelulares associados com aterosclerose (Niculescu e outro, 1989 Atherosclerosis, 78, 197-203), amiloidose (Dahlback e outro, 1993 J. Invest. Dermatol. 100, 166-170), elastose (Dahlback e outro, 1988 Acta Derm. VenereoL 68, 107-115), e MPGN tipo II (Jansen e outro, 1993 Am. J. Pathol. 143, 1356-1365). Vitronectina e uma proteina multifuncional que funciona na adesao da celula, manutenpao da hemostasia, e inibipao da lise celular induzida por complemento (Preissner, 1991 Ann. Rev. Cell Biol. 7, 275-310). Alem disso, as placas ateroscleroticas compartilham varies outros componentes com drusas, tais como componentes de complemento e apoliproproteina E. Uma associapao entre AMD avanpada e aterosclerose das arterias carotida foi relatada em um estudo epidemiologico (Vingerling e outro, 1995 Am. J. Epidemiol. 142, 404-409) e outro estudo identificou uma correlapao significante entre a degenerapao elastotica da derme exposta nao solar e neovascularizapao coroidal em pacientes com AMD (Blumenkranz e outro, 1986 Ophthalmology, 93, 552-558). Finalmente, peptfdeo B amiloide, um componente principal de placas neurfticas na doenpa de Alzheimer, tambem e encontrado em drusas (Johnson e outro, 2002 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 11830-11835). O peptfdeo B amiloide foi comprometido como um ativador primario de complemento (Bradt e outro, 1998 J. Exp. Med. 188, 431-438).
[00162] A analise compreensiva da composipao molecular de drusas humanas, bem como das celulas RPE que flanqueiam ou cobrem as drusas, demonstrou imunorreatividade para imunoglobulinas e componentes do sistema complementar que estao associados com a deposiQao de complexo imune (Johnson e outro, 2000 Exp. Eye Res. 70, 441-449). As drusas tambem contem protefnas multifuncionais tais como vitronectina (Hageman e outro, 1999 FASEB J. 13, 477-484) e apolipoprotefna E (Anderson e outro, 2001 Am. J. Ophthalmol. 131, 767-781) que desempenham um papel na modulaQao do sistema imune. Alem disso, as moleculas envolvidas na resposta de fase aguda a inflamaQao, tai como o componente amiloide P e a-i-antitripsina, tambem foram identificados em drusas (Mullins e outro, 2000 The FASEB Journal, 14, 835-846), bem como proteinas envolvidas na coagulagao e fibrinolise (fator X, trombina e fibrinogenio) (Mullins e outro, The FASEB Journal, 14, 835-846). A formaQao de drusas e a patologia de RPE associada foram sugeridas para contribuir a uma resposta inflamatoria cronica que ativa a cascata de complemento (Hageman e outro, 2001 Prog. Retin, Eye Res. 20, 705-732; Johnson e outro, 2001 Exp. Eye Res. 73, 887-896).
[00163] Uma outra forma de um disturbio otico que surge da AMD e que resulta nas perturbaqoes da retina e atrofia geografica, que leva a morte de bastbes e cone bem como das celulas de RPE.
[00164] Aterosclerose foi mostrada para tipicamente envoiver as series de reaqoes relacionadas complementares, por exemplo, veja Niculescu e outro, Immunologic Research, 30(1):73-80(8) (2004) e Niculescu e Horea, Immunologic Research 30(1):73-80 (2004). A ativaqao complementar e deposiQao de C5b-9 tipicamente ocorre igualmente na aterosclerose humano e experimental. C5b-9 pode ser responsavel pela lise celular, e reuniao sublitica de C5b-9 induz a celula do musculo liso (SMC) e proliferaQao e ativagao de celula endotelial (EC). A deficiencia de C6 de complemento tern um efeito protetor sobre a aterosclerose induzida por dieta, sugerindo que a reuniao de C5b-9 seja requerida, ou pelo menos desempenhe um papel significante, no progresso das lesoes ateroscleroticas, por exemplo, veja Niculescu e Horea, Immunologic Research 30(1):73-80 (2004). Algumas modalidades da invengao podem ser usadas para inibir a formagao de C5b-9 e/ou inibir a aterosclerose. Em algumas modalidades, um analogo da proteina do fator B do complemento da invengao e administrado a um sitio ou sitio potencial de aterosclerose. Este analogo da proteina do fator B do complemento inibe uma serie de reagbes (por exemplo, a serie de reagbes de complemento alternativa e/ou classica) que por sua vez inibe a formagao ou ativagao de C5b-9 ou outro composto relacionado a serie de reagbes de complemento envolvido na aterosclerose. Pode haver outras proteinas relacionadas ao complemento envolvidas na aterosclerose cuja formagao e/ou ativagao pode ser inibida ou bloqueada de uma maneira similar.
[00165] Hipersensibilidade das vias aereas (AHR) e caractenstica de varias doengas incluindo, porem nao limitadas a asma (por exemplo, asma alergica). AHR foi mostrada para tipicamente envoiver as series de reagbes relacionadas ao complemento, por exemplo, veja Taube e outro, 2006 PNAS 103(21 ):8084-8089; Park e outro, American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 169:726-732, (2004); Thurman and Holers, J Immunology 176:1305-1310 (2006) e Publicagao de Patente US No. 20050260198. Park e outro, mostrou que Crry-lg administrada por injegao intraperitoneal teve um efeito sobre AHR. Algumas modalidades da invengao fornecem composigbes e metodos para modular, regular, inibir e/ou reduzir AHR em um animal, tai como um humano. Doengas relacionadas a AHR especificas que podem ser tratadas, aliviadas, inibidas e/ou melhorados incluem, porem nao estao limitadas a asma, doenga pulmonar obstrutiva cronica (COPD), aspergilose broncopulmonar alergica, pneumonia por hipersensibilidade, pneumonia eosinofilica, enfisema, bronquite, bronquiectasia por bronquite alergica, fibrose cistica, tuberculose, pneumonite por hipersensibilidade, asma ocupacional, sarcoide, sindrome da doenga das vias aereas reativas, doenpa pulmonar intersticial, sindrome hipereosinofflica, Finite, sinusite, asma induzida por exercicio, asma induzida por poluipao, asma variante da tosse, doenpa pulmonar parasitaria, infecpao por virus sincicial respiratorio (RSV), infecpao por virus parainfluenza (PIV), infecpao por rinovirus (RV), infecQao por virus Hantaan (por exemplo, cepa four-corners) e poradenovirus.
[00166] Doenpas imunorrelacionadas tais como doengas relacionadas autoimune, doenpas inflamatorias associadas a HLA- 627, nefrite por lupus e lupus eritematoso sistemico (SLE) foram mostradas para tipicamente envoiver as series de reapoes relacionadas complementares, por exemplo, veja Thurman e Holers, J Immunology 176:1305-1310 (2006). Nefrite por lupus e uma complicapao de SLE. Esta relacionada ao processo autoimune de lupus onde o sistema imune produz anticorpos (anticorpo antinuclear e outros) contra os componentes do corpo. Complexes destes anticorpos e componentes de complemento acumulam-se tipicamente nos rins e resultam em uma resposta inflamatoria. Algumas modalidades da invenpao fornecem metodos e composipoes para regular, modificar, curar, inibir, prevenir, melhorar e/ou tratar uma doenpa imunorrelacionada, por exemplo, envolvendo ou relacionada a uma serie de reapoes de complemento, tai como SLE.
[00167] Artrite foi mostrada para tipicamente envoiver as series de reapoes relacionadas complementares, por exemplo, veja Thurman e Holers, J Immunology 176:1305-1310 (2006) e Banda e outro, J Immunol. 177(3): 1904-12 (2006). A serie de reapoes de complemento alternativa desempenha um papel significante na indupao da artrite e a serie de reapoes de complemento alternativa pode ainda ser requerida. Algumas modalidades da invenpao fornecem metodos e composiQoes para regular, modificar, curar, inibir, prevenir, melhorar e/ou tratar artrite, por exemplo, artrite reumatica ou artrite inflamatoria.
[00168] Hemoglobinuria noturna paroxfstica (PNH), uma doenga potencialmente ameagadora da vida do sangue caracterizada por anemia hemolftica intravascular induzida por complemento e trombose devido a destruigao intravascular das hemacias (RBCs) por complemento que resulta na amplificagao descontrolada do sistema complementar que leva a destruigao da membrana de RBC. Pessoas com esta doenga tipicamente tern celulas sanguineas que estao perdendo um gene chamado PIG-A. Este gene permite uma substancia chamada glicosil-fosfatidilinositol (GPI) ajudar certas proteinas a aderir as celulas. Sem PIG-A, as protemas de regulagao de complemento nao podem conectar-se a superficie da celula e podem proteger a celula de complemento. Algumas modalidades da invengao fornecem metodos e composigoes para regular, modificar, curar, inibir, prevenir, melhorar e/ou tratar a hemoglobinuria noturna paroxfstica.
[00169] Angioedema hereditario (HAE) e uma condigao genetica potencialmente ameagadora da vida tipicamente causada por uma deficiencia do inibidor C1, uma proteina do sistema complementar. Sintomas incluem episodios de edema (inchago) em varias partes de corpo incluindo as maos, pes, face e vias aereas. Angioedema hereditario (HAE) existe em tres formas, todas das quais sao causadas por uma mutagao genetica que e herdada em uma forma dominante autossomica. Tipos I e II sao causados por mutagoes no gene SERPING1 que resulta em niveis diminuidos ou formas disfuncionais da proteina do inibidor C1 (HAE tipo I). HAE tipo III foi ligado com mutagoes no gene F12 que codifica a proteina de coagulagao Fator XII. Todas as formas de HAE levam a ativagao anormal do sistema complementar. Alguns tratamentos atuais incluem Ecallantide, um inibidor de peptideo de calicreina (por exemplo, veja Publicapao de Patente U.S. No. US20070213275), Icatibant (Firazyr, Jerini) que e um antagonista do receptor de bradicinina seletivo, e Cinryze (Viropharma, Inc.) um inibidor de C1 esterase. Algumas modalidades da invenpao fornecem metodos e composipoes para regular, modificar, curar, inibir, prevenir, melhorar e/ou tratar hemoglobinuria noturna paroxistica.
[00170] Glaucoma e um grupo de doenpas do nervo otico que envolve a perda de celulas do ganglio retiniano em um padrao caracterfstico de neuropatia otica. Aproximadamente 25% de pacientes com glaucoma com perda da celula de ganglio retiniano tern pressao ocular normal. Hipertensao ocular (OHT) e um fator de risco significante para desenvolver o glaucoma e sua diminuipao por farmaceuticos ou cirurgia e atualmente o esteio do tratamento do glaucoma. Hipertensao ocular e glaucoma foram mostrados para tipicamente envoiver as series de reapoes relacionadas complementares, por exemplo, veja Khalyfa e outro, Molecular Vision, 13:293-308 (2007); Stasi e outro IOVS 47(3): 1024-1029 (2007); e Kuehn e outro, Experimental Eye Research 83:620-628 (2006). Expressao e/ou a presenpa de C1q e C3 mostrou(mostraram) ser mais alta(s) na retina submetida a OHT. Algumas modalidades da invenpao fornecem metodos e composipoes para regular, modificar, curar, inibir, prevenir, melhorar e/ou tratar glaucoma.
[00171] Uveite mostrou estar tipicamente associada com a serie de reapoes de complemento, por exemplo, veja Mondino e Rao, Investigative Ophthalmology & Visual Science 24:380-384 (1983) e Jha e outro Molecular Immunology 44:3901-3908 (2007). Mondino e Rao constataram que valores medios de todos os componentes de complemento testados em humor aquoso para medidas de soro foram aumentados em pacientes com uma historia de cirurgias de olho anteriores e foram mais altos em pacientes com uveite anterior.Algumas modalidades da invenpao fornecem metodos e composipoes para regular, modificar, curar, inibir, prevenir, melhorar e/ou tratar uveite.
[00172] Retinopatia diabetica e uma das causas principals da perda de visao em individuos de meia-idade. Acredita-se que a ativapao do sistema de complemento desempenha um papel importante na patogenese da retinopatia diabetica (por exemplo, veja, Jha e outro, Molecular Immunology 44:3901-3908 (2007)). Algumas modalidades da invenpao fornecem metodos e composipoes para regular, modificar, curar, inibir, prevenir, melhorar e/ou tratar retinopatia diabetica.
[00173] Vitreorretinopatia proliferativa (PV) e uma das complicapoes mais comuns de separapao retiniana. PV foi ligada a atividade complementar, por exemplo, veja Grisante e outro, Invest Ophthalmol Vis Sci. 1991 ;32(10):2711-7 e Grisante e outro, Ophthalmologe. 1992; 89(1):50-4. Algumas modalidades da invenpao fornecem metodos e composipoes para regular, modificar, curar, inibir, prevenir, melhorar e/ou tratar PV.
[00174] Sindrome do anticorpo antifosfolipideo, lesao de reperfusao isquemica renal e intestinal l/R, sindrome hemolitica-uremica atipica, glomerulonefrite membranoproliferativa Tipo II, e perda fetal (por exemplo, perda fetal espontanea), foram mostradas para tipicamente envoiver as series de reapoes relacionadas complementares, por exemplo, veja Thurman e Holers, J Immunology 176:1305-1310 (2006).
[00175] Lesao cerebral (por exemplo, lesao cerebral traumatica) foi mostrado para tipicamente envoiver as series de reapoes relacionadas complementares, por exemplo, veja Leinhase e outro, J Neuroinflammation 4:13 (2007) e BMC Neurosci.7:55 (2006). Leinhase 2006, mostrou que apos a lesao cerebral traumatico experimental em camundongos (fB+/+) tipo selvagem, houve uma ativapao complementar sistemica dependente de tempo. Em comparapao, a extensao da ativapao de complemento sistemica foi significativamente atenuada em camundongos fB Algumas modalidades da invenpao fornecem metodos e composipoes para regular, modificar, curar, inibir, prevenir, melhorar e/ou tratar a morte celular neuronal, lesao neural traumatica (por exemplo, cerebro), neuropatologia e/ou neuroinflamapao mediada por complemento.
[00176] Lesao de isquemia-reperfusao pode causar aumentos na produpao de ou oxidapao de varios compostos potencialmente prejudiciais produzidos por celulas e tecidos aos quais podem levar a dano oxidativo ou morte de celulas e tecidos. Por exemplo, lesao de isquemia-reperfusao renal pode resultar no dano histologico aos rins, incluindo dano tubular renal e caractenstica de mudanpas de necrose tubular aguda. A disfunpao renal resultante permite acumulo de residues nitrogenosos ordinariamente excretados pelos rins, tai como nitrogenio ureico de soro (SOL). Isquemia-reperfusao tambem podem causar dano aos orgaos remotos, tai como o pulmao. Algumas modalidades da invenpao utilizam moduladores, tais como inibidores de uma serie de reapoes complementar (por exemplo, inibidores da atividade de fator B), por exemplo, quando administrados a um animal que tern, ou esta em risco de experimentar ou desenvolver, isquemia- reperfusao. Em algumas modalidades, estes moduladores, previnem, reduzem ou inibem um sintoma de lesao pelo menos devido a isquemia-reperfusao. Outros tipos de lesao de isquemia-reperfusao que podem ser prevenidos ou reduzidos usando os metodos e composipoes da invenpao, incluem, porem nao estao limitados a, lesao de isquemia-reperfusao cardiaca tai como infarto miocardico ou cirurgia de desvio coronario, lesao de isquemia-reperfusao de sistema nervoso central, lesao de isquemia-reperfusao dos membros ou dedos, isquemia-reperfusao de orgaos internos tai como o pulmao, figado ou intestino, ou lesao de isquemia-reperfusao de qualquer orgao ou tecido transplantado. Veja, por exemplo, Publicapao PCT No. W003/061765 que discute o infarto miocardico e as series de reagoes complementares.
[00177] A inflamaQao e um determinants etiologico principal do infarto miocardico (Ridker, 2007 Nutr. Rev. 65(12 Pt 2):S253-9). Foi da mesma forma mostrado que a liberaQao (por exemplo, intracoronaria) das celulas da medula ossea (tronco) leva a uma melhoria na funQao sistolica apos o infarto miocardico agudo (Wollert, 2008, Curr. Opin. Pharmacol. Jan 31 [Epub]). Da mesma forma, as celulas tronco da medula ossea podem regenerar o miocardio infartado (Orlic e outro, 2003 Pediatr. Transplant. 7 Suppl 3:86-88). As celulas tronco mesenquimatosas foram mostradas para fornecer um efeito protetor cardiaco na cardiopatia isquemica (Guo e outro 2007 Inflammation 30(3-4):97-104). Na presente INVENÇÃO, a liberaQao das celulas tronco pode ser por quaisquer meios, tais como injeQao intracoronaria, injeQao diretamente no miocardio (por exemplo, no miocardio doente e/ou saudavel (por exemplo, adjacente a area lesionada)). Em algumas modalidades, um mamifero e tratado com citocinas para mobilizar suas celulas tronco de medula ossea na circulaQao permitindo as celulas tronco trafegarem ao infarto miocardico.
[00178] Varias celulas tronco foram usadas in vivo para varias aplicaQoes. Um problema com o uso das celulas tronco in vivo e a sobrevivencia e/ou semeadura mais baixa do que a desejada das celulas tronco, por exemplo, na area de interesse. Uma razao significante para a baixa semeadura e sobrevivencia de celulas troncos pode ser a inflamaQao no sitio. Portanto, a presente INVENÇÃO fornece um metodo de tratamento e/ou um metodo de melhorar a sobrevivencia e/ou semeadura da celula tronco. Em algumas modalidades, estes metodos compreendem a administraQao de uma composiQao da INVENÇÃO antes, durante e/ou depois da administragao ou mobilizagao das celulas tronco. Em algumas modalidades, inibidores de complemento da invengao agem como agentes anti- inflamatorios que criarao um ambiente favoravel para celulas tronco retornaram e sobreviverao na area da semeadura desejada (por exemplo, coragao prejudicado ou medula ossea) e, portanto, repararao ou substituirao o tecido lesionado. As celulas tronco podem ser administradas em uma solugao que tambem contem um analogo da proteina do fator B do complemento da invengao. As celulas tronco podem ser, porem nao estao limitadas a celulas tronco hematopoeticas, celulas tronco embrionarias, celulas tronco mesenquimatosas, celulas tronco neurais, celulas tronco mamarias, celulas tronco olfatorias, celulas tronco de ilhota pancreaticas, celulas tronco totipotentes, celulas tronco multipotentes ou celulas tronco pluripotentes. As celulas tronco podem ser autoIogas, alogenicas ou singenicas.
[00179] A atividade complementar parece estar envolvida na distrofia muscular (por exemplo, associada com deficiencia em distrofina). Por exemplo, veja Publicagao PCT No. W02007130031, Spuler & Engel 1998 Neurology 50:41-46, e Selcen e outro 2001 Neurology 56:1472-1481. Portanto, algumas modalidades da invengao fornecem metodos e composigoes para regular, modificar, curar, inibir, prevenir, melhorar e/ou tratar distrofia muscular.
[00180] A atividade complementar pode contribuir para a inflamagao cornea. Portanto, algumas modalidades da invengao fornecem metodos e composigoes para regular, modificar, curar, inibir, prevenir, melhorar e/ou tratar inflamagao cornea, por exemplo, apos a cirurgia. Em algumas modalidades, um analogo de fator B de complemento da invengao e administrado por colirios ou como de outra maneira descrito aqui.
[00181] Em algumas modalidades, analogos do fator B de complemento da invenpao sao usados para regular, modificar, curar, inibir, prevenir, melhorar e/ou tratar a neovascularizapao cornea.
[00182] Algumas modalidades da invenpao fornecem metodos para realpar a eficacia do enxerto de desvio da arteria periferica ou pos- coronaria ou angioplastia. Em algumas modalidades, um vetor da invenpao que codifica um analogo da proteina do fator B do complemento da invenpao (por exemplo, hfB3-292S ou hfB3-292S- 740N) e usado para transduzir as celulas de um vaso sanguineo (por exemplo, celulas endoteliais). Em algumas modalidades, as celulas de um vaso sanguineo sao transduzidas antes do implante em um animal. Em algumas modalidades, as celulas de um vaso sanguineo sao transduzidas in vivo.
[00183] O alivio da dor e sofrimento e inflamapao em pacientes pos- operatorios e uma area de foco especial na medicina clinica, especialmente com o numero crescente de operapoes em paciente externo realizadas a cada ano. Os analogos de fator B complementar da presente invenpao podem ser utilizados para inibir a inflamapao, por exemplo, inibindo-se uma atividade complementar. Portanto, os analogos do fator B complementar podem ser usados para reduzir a inflamapao, por exemplo, em pacientes pos-operatorios. Em algumas modalidades, um analogo de fator B de complemento e administrado localmente (por exemplo, liberapao perioperatoria) em um sitio de cirurgia para inibir a inflamapao, que em alguns casos reduzira a dor e o sofrimento. Em algumas modalidades, um analogo de fator B de complemento e administrado em uma solupao, por exemplo, em um fluido de veiculo de eletrolito fisiologico. Em algumas modalidades, um analogo de fator B de complemento e liberado por liberapao perioperatoria diretamente a um sitio cirurgico de uma solupao de irrigapao que contem a composipao. Em algumas modalidades, devido ao metodo de liberaQao perioperatoria local da presente INVENÇÃO, um efeito terapeutico desejado pode ser obtido com doses mais baixas de agentes do que sao necessarias ao utilizar outros metodos de liberaQao, tais como intravenosa, intramuscular, subcutanea e oral. Em algumas modalidades, quando usadas de forma perioperatoria, a solugao resultara em uma diminuigao clinicamente significante na dor e/ou inflamaQao do no sitio operatorio, desse modo permitindo uma diminuigao na exigencia do analgesico pbs-operatbrio do paciente (por exemplo, opiato) e, onde apropriado, permitindo a mobilizagao do paciente mais cedo do sitio operatorio. Em algumas modalidades, nenhum esforgo extra por parte do cirurgiao e do pessoal do ambiente operacional e exigido para usar a solugao presente em relaQao aos fluidos de irrigagao convencionais. Em algumas modalidades, uma composigao da INVENÇÃO e usada (por exemplo, no fluido de irrigaQao) para artroscopia, procedimentos diagnosticos e terapeuticos vasculares gerais e cardiovasculares, procedimentos urologicos, ferimentos cirurgicos gerais e ferimentos em geral. ComposiQbes da INVENÇÃO podem ser liberadas por, porem nao limitadas a injeQao (por exemplo, por seringa), por fluido de irrigaQao, como parte de uma bandagem em um ferimento, ou em uma aplicagao tbpica tai como uma solugao, creme, gel ou similares.
[00184] Em algumas modalidades da invengao, um vetor e/ou analogo de fator B de complemento da invengao e/sao administrado(s) em combinagao com um fator de inibigao de complemento, antes de, simultaneamente com, ou apos a administragao do vetor e/ou analogo de fator B de complemento. Um fator de inibigao de complemento inclui, porem nao esta limitados a um Fator H, um Fator 1 semelhante ao H, um MCP, um DAF, ou uma forma soluvel de um MCP.
[00185] Em algumas modalidades da invengao, um vetor ou analogo de fator B de complemento da invengao e administrado em combinagao com um fator antiangiogenico. Fatores antiangiogenicos incluem, porem nao estao limitados a endostatina, uma molecula de ligagao de VEGF, PEDF, T2-TrpRS (por exemplo, veja Patente U.S. No. 7.273.844), sFLT (por exemplo, veja Kong e outro Zumba Gene Ther (1998) 9:823-833), aflibercepte (VEGF Trap), VEGF Trap-eye, quininostatina, ranibizumabe e bevacizumabe.
[00186] Em algumas modalidades, um vetor e/ou analogo de fator B de complemento da INVENÇÃO e/sao administrado(s) em combinagao com LUCENTIS® (ranibizumabe), AVASTIN® (bevacizumabe), VEGF Trap-eye, aflibercepte ou uma molecula(s) que liga(m) VEGF e/ou que inibe(m) a angiogenese. LUCENTIS® e usado para tratar AMD umida. Algumas modalidades da invengao tambem podem ser usadas para tratar AMD umida. Portanto, a presente invengao fornece metodos e composigoes para tratar AMD umida compreendendo administrar, separadamente ou juntamente, uma composigao da invengao em combinagao com LUCENTIS® (ranibizumabe), AVASTIN® (Bevacizumabe) VEGF Trap-eye, aflibercepte e/ou uma molecula(s) que liga VEGF e/ou que inibe a angiogenese. Adicionalmente, a inflamagao intraocular e um das reagbes adversas mais comuns relatadas apos a administragao de LUCENTIS®, por exemplo, veja a "Full Prescribing Information" para LUCENTIS®. A presente invengao fornece um metodo para inibir ou reduzir a inflamagao intraocular (por exemplo, resultante da administragao de LUCENTIS®) compreendendo administrar uma molecula ou composigao da invengao antes de, ao mesmo tempo, e/ou apos a administragao de LUCENTIS®, VEGF Trap-eye ou aflibercepte.
[00187] Em algumas modalidades da invengao, um vetor ou analogo de fator B de complemento da invengao e administrado em combinagao com outro(s) composto(s), tai como um composto que inibe a ativagao de Celula T, celulas B, TNF, interleucina-1 (por exemplo, interleucina-1b) interleucina-6 e/ou interferon-gama. Um vetor ou analogo de fator B de complemento da INVENÇÃO tambem pode ser administrado em combinagao com um composto(s) que inibe a atividade complementar, por exemplo, atividade complementar alternativa. Compostos que podem ser usados e que inibem TNF incluem, porem nao estao limitados a, compostos que ligam TNF, tais como anticorpos (por exemplo, Infliximabe (REMICADE®), Golimumabe (SIMPONI®) e Adalimumabe (HUMIRA®)) ou receptores soluveis que ligam TNF tai como Etanercepte (ENBREL®). Outros compostos que podem ser usados e que inibem a ativagao de Celula T incluem, porem nao estao limitados aos compostos que ligam B7 tai como abatacepte (ORENCIA®). Da mesma forma os compostos que sub-regulam as celulas B podem ser usados incluindo, porem nao limitados a, compostos que ligam CD20 tai como Rituximabe (RITUXAN® e MABTHERA®).
[00188] As series de reagoes complemente que contribuem para e/ou que causam uma doenga podem ser moduladas, reguladas, inibidas e/ou ativadas usando varies metodos e/ou analogos de proteina de fator B de complementam que fazem parte da presente invengao.
Composicoes, Formulacdes e Preparacdes
[00189] Algumas modalidades da invengao fornecem composigoes, por exemplo, composigoes farmaceuticas contendo um analogo de fator B de complemento da invengao, tai como para usos terapeuticos. Em algumas modalidades, uma composigao farmaceutica compreende um analogo de fator B de complemento compreendendo aminoacidos 26-764 de SEQ ID NO:2, aminoacidos 26-764 de SEQ ID NO:3, aminoacidos 26-990 de SEQ ID NO:22 ou aminoacidos 26-990 de SEQ ID NO:23, por exemplo, hfB3-292S (SEQ ID NO:2), hfB3-292S- 740N (SEQ ID NO:3), hfB3-292S-Fc (SEQ ID NO:22) ou hfB3-292S- 740N-Fc (SEQ ID NO:23). Em algumas modalidades, uma composipao farmaceutica compreende um analogo de fator B de complemento consistindo em aminoacidos 26-764 de SEQ ID NO:2, aminoacidos 26- 764 de SEQ ID NO:3, aminoacidos 26-990 de SEQ ID NO:22 ou aminoacidos 26-990 de SEQ ID NO:23. Exemplos de composipoes farmaceuticas e formulapoes que podem ser usadas com os analogos de fator B de complemento da invenpao em Publicapao PCT No. WO08/106644 e Publicapao de Patente US No. US20100120665.
[00190] Algumas modalidades da invenpao incluem preparapoes farmaceuticas compreendendo um analogo da proteina do fator B do complemento da invenpao, um acido nucleico da invenpao, um vetor viral da invenpao ou qualquer combinapao dos mesmos.
[00191] Formulapoes (por exemplo, para injepao) sao geralmente, porem nao necessariamente, solupoes biocompativeis do ingrediente ativo, por exemplo, compreendendo solupao de Hank ou a solupao de Ringer. Formulapoes para administrapao transdermica ou transmucosal geralmente incluem, porem nao sao limitadas a penetrantes tai como acido fusidico ou sais biliares em combinapao com detergentes ou agentes tensoativos. Em algumas modalidades, formulapoes podem ser fabricadas como aerossois, supositorios ou emplastros. Em algumas modalidades, administrapao oral pode nao ser favorecida para proteina ou ingredientes ativos de peptideo; entretanto, este tipo de composipao pode ser adequadamente formulada, por exemplo, em uma forma revestida enterica, em um deposito, em uma capsula e assim por diante, para ser protegido das enzimas digestivas, de forma que administrapao oral pode da mesma forma ser utilizada. Algumas formulapoes da invenpao compreendem solupao de sal balanceada (Alcon Laboratories, Inc., Fort Worth, Texas) ou mais solupao de sal balanceada (Alcon Laboratories, Inc.). Em algumas modalidades, uma formulapao compreende um ou mais do seguinte: citrato, NaCI (por exemplo, 0,64%), cloreto de potassio (KCI) (por exemplo, 0,075%), diidrato de cloreto de calcio (CaCl2-2H2O) (por exemplo, 0,048%), hexaidrato de cloreto de magnesio (MgCh-6H2O) (por exemplo, 0,03%), triidrato de acetato de sodio (CH3CO2Na 3H2O) (por exemplo, 0,39%), diidrato de citrato de sodio (CeHsOyNas ^FW) (por exemplo, 0,17%), sacarose e hidroxido de sodio e/ou acido clondrico (para ajustar pH) e agua. A lista precedente inclui algumas moleculas que sao listadas como hidratos particulares, por exemplo, diidrato, triidrato, hexaidrato, etc. E entendido que varios hidratos destes compostos podem ser usados na presente invengao e a invengao nao esta limitada a estas formas de hidrato particulares das moleculas listadas. Em algumas modalidades, uma formulagao compreende um ou mais do seguinte: NaCI, monoidrato de fosfato monobasico, heptaidrato de fosfato de sodio dibasico e acido clondrico e/ou hidroxido de sodio para ajustar pH e agua. Em algumas modalidades, uma composigao farmaceutica compreende pelo menos um ingrediente selecionado a partir do grupo consistindo em histidina, MgCh, trealose, um polissorbato, polissorbato 20, NaCI, sacarose, arginina e prolina. Em algumas modalidades, uma formulagao compreende um ou mais do seguinte: histidina (por exemplo, cerca de 10 mM); desidrato de a,a-trealose (por exemplo, cerca de 10% ou cerca de 50mM); MgCh (por exemplo, cerca de 10mM); um polissorbato tai como polissorbato 20 (por exemplo, cerca de 0,01%); e NaCI (por exemplo, cerca de 0,1%). Em algumas modalidades, uma formulagao pode compreender um ou mais do seguinte: sacarose, arginina ou prolina. Em algumas modalidades, uma formulagao compreende ou consiste em molecula(s) da presente invengao, 10mM de histidina, 10mM de MgCk, 50mM de trealose e 0,01% de polissorbato 20. Em algumas modalidades, uma formulagao compreende ou consiste em molecula(s) da presente invengao, 1,0% de NaCI e 10mM de MgCh. Em algumas modalidades, uma formulagao compreende ou consiste em molecula(s) da presente invengao, e uma solugao de sal balanceada enriquecida com bicarbonate, dextrose, e glutationa, tai como BSS PLUS®. Em algumas modalidades, uma formulagao nao compreende trealose. Em algumas modalidades, uma formulagao ou composigao esta em um pH de cerca de 5,5. Em algumas modalidades, uma formulagao ou composigao esta em um pH dentre de cerca de 5,0 a 9,0, cerca de 5,0 a 5,5, cerca de 5,3 a 5,7, cerca de 5,5 a 6,0, cerca de 5,8 a 6,2, cerca de 6,0 a 6,5, cerca de 6,3 a 6,7, cerca de 6,5 a 7,0, cerca de 6,8 a 7,2, cerca de 7,0 a 7,5, cerca de 7,3 a 7,7, cerca de 7,5 a 8,0, cerca de 7,8 a 8,2, cerca de 8,0 a 8,5, cerca de 8,3 a 8,7 e cerca de 8,5 a 9,0, qualquer e adequado para reter a atividade biologica e estabilidade do(s) ingrediente(s) ativo(s).
[00192] Algumas formulagoes da invengao podem ser fabricadas como aerossois, supositorios, colirios ou emplastros.
[00193] Exemplos de formulagoes adequadas e metodos formulatorios para um modo desejado de administragao podem ser encontrados em Remington’s Pharmaceutical Sciences, ultima edigao, Mack Publishing Co., Easton, PA e em Patente US No. 7,208,577.
[00194] Em algumas modalidades, uma composigao para uso in vivo contem um "veiculo" ou um "veiculo farmaceuticamente aceitavel. O termo "veiculo" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente, ou veiculo com que o vetor de interesse e administrado. O termo "veiculo1 inclui, porem nao e limitado a, material solido ou liquido, que pode ser inorganico ou organic© e de origem sintetica ou natural, com que um componente(s) ativo(s) da composigao e(sao) misturado(s) ou formulado(s) para facilitar administragao a um individuo.
[00195] Em geral, um 6leo(s) adequado(s), solugao salina, dextrose aquosa (glicose), e solugoes de agucar relacionadas e glicois tais como propileno glicol ou polietileno glicois sao tipicamente veiculos adequados para solugoes parenterais. Em algumas modalidades, solugoes para administragao parenteral contem um sal soluvel em agua do ingrediente ativo, agentes de estabilizagao adequados, e se desejavel ou necessario, substancias de tampao. Agentes antioxidantes tais como bissulfito de sodio, sulfito de sodio, ou acido ascorbico, sozinhos ou combinados, podem ser usados como agentes estabilizantes. Da mesma forma usado sao acido citrico e seus sais e EDTA de sodio. Alem disso, solugoes parenterais podem confer preservatives, tai como cloreto de benzalcbnio, metil- ou propil- parabeno, e clorobutanol.
[00196] Veiculos podem incluir carboidratos tais como trealose, manitol, glutationa, xilitol, sacarose, lactose e sorbitol. Outros ingredientes para uso em formulagoes podem incluir, por exemplo, DPPC (1,2-Didecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DOPE (1,2-Dioleoil-sn- glicero-3-fosfoetanolamina), DSPC (1,2-Distearoil-sn-glicero-3- fosfocolinaz 1,2-Distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina) e DOPC (1,2- Dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina). Tensoativo naturais ou sinteticos podem ser usados. Polietileno glicol pode ser usado (ate mesmo aparte de seu uso em derivatizagao de uma proteina). Dextranas, tai como ciclodextrana podem ser usadas. Em algumas modalidades, ciclodextrina, aminas terciarias e/ou beta-ciclodextrina podem ser usadas. Sais biliares e outros realgadores relacionados podem ser usados. Celulose e derivados de celulose podem ser usados. Aminoacidos podem ser usados, tai como uso em uma formulagao de tampao. Da mesma forma, o uso de lipossomas, microcapsulas ou micro-esferas, complexes de inclusao, ou outros tipos de veiculos e contemplado.
[00197] Excipientes farmaceuticos adequados incluem, porem nao sao limitados a amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, antibioticos, preservatives, malte, arroz, farinha, giz, silica gel, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sodio, leite desnatado seco, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol e similar. Uma composiQao, se desejado, pode da mesma forma confer agentes umectantes e/ou emulsificantes, e/ou agentes de tamponamento de pH. Onde necessario, uma composiQao pode da mesma forma incluir um agente de solubilizaQao e/ou uma anestesia local tai como lignocaina para aliviar dor no sitio da injeQao.
[00198] Da mesma forma contemplado aqui e liberaQao pulmonar de agente ou proteina (ou derivado dos mesmos) da presente INVENÇÃO. Em algumas modalidades, um analogo(s) de fator B de complemento e liberado aos pulmoes de um mamifero enquanto inalando e pode principalmente permanecer nos pulmoes ou em algumas modalidades atravessa atraves do revestimento epitelial pulmonar a corrente sanguinea, (por exemplo, veja Adjei e outro, Pharmaceutical Research 7:565-569 (1990); Adjei e outro, International Journal of Pharmaceutics 63:135-144 (1990); Braquet e outro, Journal of Cardiovascular Pharmacology 13(suppl. 5):s.143-146 (1989); Hubbard e outro, Annals of Internal Medicine 3:206-212 (1989); Smith e outro, J. Clin. Invest. 84:1145-1146 (1989); Oswein e outro, Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colo., March, 1990; Debs e outro, The Journal of Immunology 140:3482-3488 (1988) and Platz e outro, U.S. Pat. No. 5,284,656). Contemplado para uso na pratica desta INVENÇÃO e uma ampla faixa de dispositivos mecanicos projetados para liberaQao pulmonar de produtos terapeuticos, incluindo porem nao limitado a nebulizadores, inaladores com dosimetro, e inaladores de po. Alguns exemplos especificos de dispositivos comercialmente disponiveis adequados para a pratica de algumas modalidades da INVENÇÃO sao o nebulizador ULTRAVENT™, fabricado por Mallinckrodt, Inc., St Louis, Mo.; o nebulizador ACORN II®, fabricado por Marquest Medical Products, Englewod, Colo.; o inalador com dosimetro VENTOLIN, fabricado por Glaxo Inc., Research Triangle Park, N.C.; e o inalador de po SPINHALER, fabricado por Fisons Corp., Bedford, Mass.
[00199] Em algumas modalidades, uma proteina e preparada em forma de particulado. Em algumas modalidades, esta forma de particulado tern um tamanho de particula medio de menos do que 10 pm (ou microns), mais prefer!velmente 0,5 a 5 pm, para liberagao ao pulmao distal.
[00200] Formulagoes adequadas para uso com um nebulizador (por exemplo, jato ou ultrassdnico) tipicamente compreendera um analogo de fator de B de complemento dissolvido em agua, em algumas modalidades, em uma concentragao de cerca de 0,1 a cerca de 25 mg de proteina biologicamente ativa por mL de solugao. Uma formulagao pode da mesma forma incluir tampao e/ou um agucar simples (por exemplo, para estabilizagao de proteina e regulagao de pressao osmotica). Uma formulagao de nebulizador pode da mesma forma confer um tensoativo, para reduzir ou prevenir agregagao induzida por superficie de uma proteina(s) causado por atomizagao da solugao formando-se o aerossol.
[00201] Formulagoes para uso com um dispositive inalador com dosimetro geralmente compreenderao um po finamente dividido contendo um analogo de fator B de complemento da invengao suspense em um propelente, por exemplo, com a ajuda de um tensoativo. Um propelente pode ser qualquer material convencional utilizado para este proposito, tai como um clorofluorocarbono, um hidroclorofluorocarbono, um hidrofluorocarbono, ou um hidrocarbonoeto, incluindo triclorofluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol, e 1,1,1,2-tetrafluoroetano, ou combinagoes dos mesmos. Tensoativo adequados incluem trioleato de sorbitana e lecitina de soja. Acido oleico pode da mesma forma ser util como um tensoativo. Em algumas modalidades, formulagoes para dispensar a partir de um dispositivo inalador de po compreenderao um po seco finamente dividido contendo um analogo de fator B de complemento da INVENÇÃO e podem da mesma forma incluir agente de volume, tai como lactose, sorbitol, sacarose, manitol, trealose, ou xilitol em quantidades que facilitam dispersao do po a partir do dispositivo, por exemplo, 50 a 90% em peso da formulagao.
Administragao e Liberapao
[00202] E entendido que quando introdugao ou administragao de um acido nucleico codificando um analogo da proteina do fator B do complemento e discutido, que a invengao da mesma forma contempla a introdugao ou administragao do analogo da proteina do fator B do complemento ele mesmo. E entendido que quando introdugao de um analogo de fator B de complemento e discutido, que a invengao da mesma forma contempla a introdugao de um acido nucleico codificando o analogo da proteina do fator B do complemento.
[00203] Em algumas modalidades, analogos de fator B de complemento da invengao podem ser administrados localmente ou sistemicamente. Rotinas uteis de administragao sao descritas aqui e conhecidas na tecnica. Metodos de introdugao ou administragao incluem, porem nao sao limitados a, intradermicos, intramusculares, intraperitoneais, intravenosos, subcutaneos, intranasais, intratraqueais, topicos, inalados, transdermicos, retais, rotinas parenterais, epidurals, intracranianos, no cerebro, intraventriculares, subdurais, intra- articulares, intratecais, intracardlacos, intracoronarios, intravitreos, subretinais, camara intra-anterior do olho, particular, localmente na cornea, subconjunctival, injegao subtenoniana, aplicando-se colfrio, rotinas orais, por meio de cateter de balao, por meio de stent ou qualquer combinagao dos mesmos. Em algumas modalidades, uma composiQao ou analogo de fator B de complemento da invenpao e administrado em uma drusa, por exemplo, injetando-se diretamente em uma drusa. Administrapao sistemica pode ser, porem nao e limitada a, por intravenosa ou injepao intra-arterial ou por liberapao transmucosal, subcutanea e/ou transdermica. Em algumas modalidades, uma composipao da invenpao pode ser inicialmente dirigida a um sitio diferente de um sitio doente. Por exemplo relative a AHR que ocorre nos pulmoes de um animal, uma injepao intraperitoneal de uma proteina, vetor ou acido nucleico da invenpao pode resultar em uma mudanpa em AHR nos pulmoes, por exemplo, veja Park e outro, American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 169:726-732, (2004). Em algumas modalidades, uma nivel e/ou modo de dosagem de administrapao de uma composipao pode depender da natureza da composipao, da natureza de uma condipao(oes) a ser tratada, e/ou uma historia de um paciente individual. Em algumas modalidades, celulas expressando para um analogo de fator B de complemento da invenpao sao administradas. Estas celulas podem ser uma linhagem celular, xenogeneica, alogeneica ou autologa.
[00204] Em algumas modalidades, por exemplo, compreendendo administrapao ao olho, um analogo da proteina do fator B do complemento ou vetor da invenpao e administrado cerca de uma vez a cada semana, mes, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 9 meses, ano, 18 meses, 2 anos, 30 meses, 3 anos, 5 anos, 10 anos ou quando necessario. Em algumas modalidades, por exemplo, compreendendo administrapao ao olho, uma molecula ou vetor da invenpao e administrada de cerca cada 1 a 4 semanas, cerca de cada 4 a 8 semanas, cerca de cada 1 a 4 meses, cerca de cada 3 a 6 meses, cerca de cada 4 a 8 meses, cerca de cada 6 a 12 meses, cerca de cada 9 a 15 meses, cerca de cada 12 a 18 meses, cerca de cada 15 a21 meses, cerca de cada 18 a 24 meses, cerca de cada 1 a 2 anos, cerca de cada 1.5 a 3 anos, cerca de cada 2 a 4 anos, cerca de cada 3 a 5 anos, cerca de cada 5 a 7 anos, cerca de cada 7 a 10 anos ou cerca de cada 10 a 20 anos. E esperado que administrapao de um vetor codificando para um analogo da proteina do fator B do complemento fosse menos frequente do que administragao do analogo da proteina do fator B do complemento. Em algumas modalidades da invenpao, uma preparapao farmaceutica compreende um vetor codificando um analogo de fator B de complemento da invenpao e a preparapao farmaceutica e administrada apenas uma vez ao paciente.
[00205] Em algumas modalidades, por exemplo, compreendendo administrapao ao olho, um vetor codificando um analogo de fator B de complemento e administrado 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais vezes a um paciente em sua vida. Em algumas modalidades, por exemplo, compreendendo administrapao ao olho, um vetor lentiviral da invenpao e administrado 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais vezes a um paciente em sua vida.
[00206] Em algumas modalidades, um analogo da proteina do fator B do complemento da invenpao e administrado por injepao intravitrea a um olho humano. Em algumas modalidades, cerca de 15 pg a cerca de 5 mg; cerca de 15 pg a cerca de 500 pg; cerca de 100 pg a cerca de 900 pg; cerca de 300 pg a cerca de 700 pg; cerca de 500 pg a cerca de 1 mg; cerca de 1 mg a cerca de 5 mg; cerca de 1mg; ou cerca de 500 pg de um analogo de proteina de fator de B de complemento e administrado por injepao intravitrea a um olho humano.
[00207] Em algumas modalidades, um analogo da proteina do fator B do complemento da invenpao e administrado por injepao subretiniana ou injepao intravitrea de um vetor vira lentiviral ou adeno associado (AAV). Em algumas modalidades, cerca de 5x106 a cerca de 5x108; cerca de 5x106 a cerca de 5x107; cerca de 5x107 a cerca de 5x108; cerca de 1x107 a cerca de 1x108; cerca de 3x107 a cerca de 5x107; cerca de 2.5x107; cerca de 5x107; cerca de 7.5x107; ou cerca de 1x108 unidades de transduQao de um vetor lentiviral sao administradas por injeQao subretiniana. Em algumas modalidades, cerca de 5x108 a cerca de 1x109; cerca de 5x108 a cerca de 7.5x108; cerca de 7.5x108 a cerca de 1x109; cerca de 6x108 a cerca de 9x108; cerca de 7x108 a cerca de 8x108; cerca de 5x108; cerca de 6x108; cerca de 7x108; cerca de 8x108; cerca de 9x108; ou cerca de 1x109 unidades de transduQao de um vetor AAV sao administradas por injeQao subretiniana.
[00208] Em algumas modalidades, cerca de 5x108 a cerca de 1x1010; cerca de 5x108 a cerca de 5x109; cerca de 5x108 a cerca de 2x109; cerca de 2x109 a cerca de 5x109; cerca de 5x109 a cerca de 1x1010; cerca de 5x108 a cerca de 1x109; cerca de 1x109 a cerca de 3x109; cerca de 3x109 a cerca de 6x109; cerca de 6x109 a cerca de 1x1010; ou cerca de 1x109 a cerca de 1x1O10 unidades de transduQao de um vetor AAV sao administradas por injeQao intravitrea.
[00209] Em algumas modalidades, cerca de 50 pL a cerca de 100 pL, cerca de 50 pL a cerca de 75 pL, cerca de 75 pL a cerca de 100 pL, cerca de 60 pL a cerca de 90 pL, cerca de 70 pL a cerca de 80 pL, cerca de 50 pL; cerca de 60 pL; cerca de 70 pL; cerca de 80 pL; cerca de 90 pL; ou cerca de 100 pL de um analogo da proteina do fator B do complemento ou um vetor codificando um analogo da proteina do fator B do complemento e injetado subretinianamente. Em algumas modalidades, cerca de 50 pL a cerca de 1 ml, cerca de 50 pL a cerca de 500 pL, cerca de 500 pL a cerca de 1 ml, cerca de 250 pL a cerca de 750 pL, cerca de 250 pL a cerca de 500 pL, cerca de 500 pL a cerca de 750 pL, cerca de 400 pL a cerca de 600 pL, ou cerca de 750 pL a cerca de 1 ml de um analogo da proteina do fator B do complemento ou um vetor codificando um analogo da proteina do fator B do complemento e intravitreamete injetado.
[00210] Em algumas modalidades um anti-inflamatorio pode ser liberado em combinagao com um analogo da proteina do fator B do complemento, (por exemplo, hfB3-292S ou hfB3-292S-740N), vetor ou acido nucleico da invengao. Um anti-inflamatorio pode ser liberado antes de, simultaneamente com, e/ou depois da administragao de uma molecula ou vetor da invengao. Em algumas modalidades um anti- inflamatorio e administrado na mesma solugao e/ou mesma seringa como um analogo da proteina do fator B do complemento, acido nucleico ou vetor da invengao. Em algumas modalidades, um analogo da proteina do fator B do complemento ou vetor da invengao e um anti-inflamatorio e co-administrado ao olho, por exemplo, como descrito aqui.
[00211] Muitos farmaco anti-inflamatorios sao conhecidos na tecnica e incluem, porem nao sao limitados a, dexametasona, dexametasona metassulfobenzoato de sodio, fosfato de sodio de dexametasona, fluorometolona, bronfenaco, pranoprofeno, RESTASIS™, emulsao oftalmica de ciclosporina, naproxeno, glicocorticoides, cetorolaco, ibuprofeno, tolmetina, farmacos anti- inflamatorios nao esteroides, farmacos anti-inflamatorios esteroides, diclofenaco, flurbiprofeno, indometacina, e suprofeno.
[00212] Algumas modalidades da invengao incluem administragao de igualmente um analogo da proteina do fator B do complemento e um vetor que codifica isto. Um analogo da proteina do fator B do complemento da invengao pode ser liberado antes de, simultaneamente com, e/ou depois da administragao de um vetor da invengao. Em algumas modalidades, um analogo da proteina do fator B do complemento da invengao e administrado na mesma solugao e/ou mesma seringa como um vetor da invengao. Em algumas modalidades, um analogo da proteina do fator B do complemento da invengao e um vetor da invengao sao co-administrados ao olho, porexemplo, como descrito aqui.
[00213] Adicionalmente, um analogo de fator B de complemento ou um acido nucleico que codifica isto pode ser liberado ou administrado a um animal por meio de uma celula, por exemplo, como terapia de celula. Por exemplo, isto pode ser realizado administrando-se ou liberando-se uma celula(s) expressando analogo(s) de fator B de complemento. Em algumas modalidades, um analogo(s) de fator B de complemento e expressado a partir da celula por meio de um promotor regulavel, induzfvel e/ou reprimivel. Em algumas modalidades, celulas encapsuladas que expressam analogo(s) de fator B de complemento sao liberadas a um animal, por exemplo, veja Publicagao PCT No. WO07078922 relacionado a celulas encapsuladas. Em algumas modalidades, celulas sao administradas localmente (por exemplo, em uma articulagao, intravitreas, intraretinais, intracranianas etc.) ou sistemicamente (por exemplo, i.v.).
[00214] Celulas a ser administradas a um animal podem ser autoIogas, alogenicas ou xenogenicas. Em algumas modalidades, celulas autoIogas sao manipuladas ex vivo para os fazer produzir um analogo da proteina do fator B do complemento da invengao e, em algumas modalidades, as celulas sao introduzidas atras ao animal. Transferencia de um acido nucleico compreendido de uma regiao de codificagao a celulas ex vivo podem ser por qualquer metodo, tai como, electroporagao, microinjegao, fusao de celula, transferencia de gene mediada por cromossomo, transferencia de gene mediada por microcelula, fusao de esferoplasto, lipofecgao, bombardeio de microparticula, transfecgao mediada por fosfato de calcio, infecgao viral e assim por diante. Opcionalmente, um marcador selecionavel pode da mesma forma ser introduzido nas celulas. Se um marcador selecionavel e utilizado, as celulas podem em seguida ser colocadas sob selegao, por exemplo, para realgar expressao e/ou para isolar essas celulas que expressam a regiao de codificapao transferida (veja, por exemplo, Loeffler & Behr, Meth. Enzymol. 217:599-618 (1993); Cohen e outro, Meth. Enzymol. 217:618-644 (1993); e Cline, Pharmac. Ther. 29:69-92 (1985)).
[00215] Celulas recombinantes (por exemplo, autoIogas ou celulas de alogenicas transduzidas in vitro) podem ser liberadas a um paciente por varios metodos conhecidos na tecnica. Por exemplo, celulas podem ser encapsuladas antes da administragao, como conhecido na tecnica. Em algumas modalidades, quando encapsuladas, as celulas nao sao autoIogas. Em algumas modalidades, celulas de sangue recombinante (por exemplo, celulas tronco hematopoieticas e/ou progenitoras) sao administradas intravenosamente. Em algumas modalidades, celulas de olho e/ou celulas pluripotenciais podem ser injetadas diretamente no olho. A quantidade de celulas necessarias depende do efeito desejado, do estado do animal, etc.
[00216] Em algumas modalidades da invengao, um sistema de liberapao de gene pode resultar em transdupao e/ou integrapao estavel de um gene ou regiao de codificapao para um analogo de fator B de complemento em uma celula alvo. Em algumas modalidades, celulas alvo sao celulas de mamifero tai como celulas de primata, e celulas humanas. Em algumas modalidades, celulas alvo sao celulas do olho, tai como celulas epiteliais de pigmento retiniano, celulas retinais, ou celulas pluripotenciais. Celulas alvo podem ser in vitro, ex vivo ou in vivo. Em algumas modalidades, uma celula alvo e uma celula tronco. Celulas tronco incluem, porem nao sao limitadas a celulas tronco pluripotentes, celulas tronco totipotentes, celulas tronco hematopoieticas, celulas tronco de cancer e celulas tronco embrionarias. Em algumas modalidades, celulas pluripotenciais contempladas aqui nao sao aquelas para propagar uma entidade viva de um zigoto ou blastomere. A presente invenpao da mesma forma contempla o uso de uma celula parcialmente nao diferenciada para implante no olho de um paciente em necessidade de tratamento, por exemplo, para regenerar celulas do olho.
Animais Transqenicos
[00217] Algumas modalidades da invenpao fornecem um animal transgenico (por exemplo, nao humano) expressando um analogo de fator B de complemento da invenpao. Metodos para fazer um animal transgenico sao conhecidos na tecnica. Em alguma modalidade, um animal transgenico (tai como um camundongo) da mesma forma compreendera uma mutapao, delepao ou rompimento no gene de Fas, por exemplo, veja Macmicking e outro Cell. 81:641-650 (1995).
EXEMPLOS
[00218] A invenpao e descrita agora com referenda aos seguintes exemplos. Estes exemplos sao apenas fornecidos para o proposito de ilustrapao e a invenpao deveria ser interpretada de nenhuma maneira como sendo limitante a estes exemplos, porem, deveria ser interpretada para abranger qualquer e todas as variapdes que tornam evidente como um resultado dos ensinos fornecidos aqui.
[00219] Visto que, modalidades particulares da invenpao foram descritas aqui para propositos de descripao, sera apreciado por aqueles versados na tecnica que numerosas variapoes dos detalhes podem ser feitas sem partir da invenpao como descrito nas reivindicapdes anexas.
Exemplo 1. Geracao de Construtor de Expressao de hfB3
[00220] Um plasmideo foi designado para incluir a sequencia de codificapao para hfB3 humano com um marcador selecionavel IRES- Neo (hfB3-lres-Neo). O plasmideo foi sintetizado por GENEART AG (Regensburg, Germay, plasmid), uma taxa para organizapao de contrato de prestapao de servipos. Um sitio de restripao Nhe I foi incorporado igualmente na extremidade 5' e 3' da sequencia de codificagao. A sequencia de codificagao de acido nucleico de hfB3 foi aperfeigoada por codon para expressao ideal em celulas de mamifero.
[00221] O plasmideo de expressao de gene, pCI (Promega, Madison, Wl), foi modificado. Primeiro, o BGH (Hormonio de Crescimento Bovino) poliA foi removido de pCI e substituido com um poliA sintetico. Logo, a sequencia de codificaQao de hfB3 com um marcador selecionavel (hfB3-lres-Neo) foi cortada por por Nhe I de um plasmideo e clonada no sitio Sal I do pCI modificado como uma ligagao de extremidade cega para criar uma construgao de expressao de hfB3. O plasmideo foi sequenciado em sua totalidade para confirmar a integridade de sequencia do construtor (SEQ ID NO:5).
Exemplo 2. Gerapao de Construtor de Expressao de hfB3-292S
[00222] Uma outra modificagao foi introduzida a proteina hfB3. Proteina de fator b tipo selvagem humana e proteina hfB3 tern 23 aminoacidos de cisteina (C), sugerindo que ha um pelo menos uma cisteina livre nao pareada presente na proteina. Mapeamento de ligagao de dissulfeto sugere que o C livre em hfB3 biologicamente ativo esta localizado no aminoacido 292. O C em 292 e altamente conservado em proteina de fator B entre especies diferentes (Tabela 1, acima). Neste Exemplo, este C em 292 e mudado para serina (S), gerando hfB3-292S.
[00223] Para criar o construtor de expressao de hfB3-292S, mutagao sitio-especifica foi introduzida no construtor de expressao de hfB3 (SEQ ID NO:5).
[00224] O construtor de expressao de hfB3 foi usado como o modelo para preparar a mutagao de sitio que muda o C em posigao 292 para S usando o Kit de Mutagenese Sitio-Dirigida de Stratagene de acordo com as instrugdes do fabricante, criando o construtor de expressao de hfB3-292S. Dois iniciadores foram usados: iniciador Dianteiro 5’-CACCGGCGCCAAGAAGAGCCTGGTCAACCTGATC-3’ (SEQ ID N0:6) e iniciador Inverso 5’- GATCAGGTTGACCAGGCTCTTCTTGGCGCCGGTG-3’ (SEQ ID NO:7). Os nucleotideos sublinhados indicam o aminoacido mutado de C para S. O cassete de expressao de hfB3-292S inclui, de 5' a 3', um promotor de CMV, um intron quimerico, uma sequencia de codificapao de codon aperfeipoada para hfB3-292S, um marcador selecionavel IRES-Neo, e um poliA sintetico (Figura 2). O construtor total foi sequenciado para confirmar a mutapao e a integridade do construtor (SEQ ID NO:8). A sequencia de aminoacido esperada para hfB3-292S e mostrada em SEQ ID NO:2.
Exemplo 3. Geracao de hfB3 Estavel e Linhaqens Cel u I ares de Expressao de hfB3-292S
[00225] Linhagens celulares estaveis expressando proteina hfB3 ou hfB3-292S foram geradas transfectando-se 293 celulas de Estilo livre (Invitrogen, Cat. No. R79007) com o construtor de expressao de hfB3 ou hfB3-292S. Transfecpao de plasmideo DNA nas 293 celulas de Estilo livre foi mediada por transfecpao com base em PEI (Polyethylenimine, Sigma, Cat. No. 23966). Uma solupao de PEI foi preparada em agua esteril em uma concentrapao final de 1 mg/mL. O pH foi ajustado em 7,0 com 5 N de HCL A solupao foi esterilizada usando um filtro de 0,22 pm. Aliquotas do PEI foram armazenadas congeladas a -80°C ate uso.
[00226] O protocolo de transfecpao era como segue:
[00227] Um dia antes da transfecpao, as celulas foram semeadas a 1 x 106 cels/mL em Meio de Expressao 293F livre de soro (Invitrogen, Cat. No. 12338-018).
[00228] O proximo dia, as celulas foram lavadas com meio de RPMI1640 basal (Invitrogen, Cat. No. 22400-089) suplementadas apenas com Suplemento de HT (Cat. No. 11067-030, Invitrogen), ressuspensas no mesmo meio a 2 x 106 cels/mL e dispensadas emuma nova placa de cavidades com 1 mL em cada cavidade.
[00229] SoluQoes de materia prima de DNA e PEI foram preparadas em 150 mM de NaCI esteril como segue: 2,5 pg de hfB3 ou construtor de expressao de hfB3-292S DNA (em 2,5 pL) foi dilufdo em 47,5 pL de 150 mM de NaCI e misturado com pipetagem (soluQao de DNA). Dez microlitros (10 pL) de solugao de PEI foi diluida em 40 pL de 150 mM de NaCI, seguido por um vortice suave (solugao de PEI). As solugoes de DNA e PEI foram incubadas em temperatura ambiente durante 5 rninutos. A solugao de PEI foi em seguida adicionada a soluQao de DNA e a mistura foi permitida incubar em temperatura ambiente durante um adicional de 10 rninutos e em seguida a mistura de DNA/PEI foi adicionada nas celulas na placa de 6 cavidades e as celulas foram incubadas com agitapao (200 RPM) durante 5 horas a 37°C em uma incubadora com 8% de CO2 e 85% de umidade. Depois de 5 horas, 1,1 mL de Meio de Expressao 293F completo (nenhum aditivo) foi adicionado a cada das cavidades e a incuba?ao foi continuada durante 72 horas.
[00230] As celulas foram em seguida colhidas, lavadas uma vez com o Meio de Expressao 293F, e colocadas em Meio de Expressao 293F fresco contendo 300 pg/mL G418 (Teknova). Como um controle negative, um numero igual de celulas submetidas a tratamento 293F nao transfectadas foram cultivadas no mesmo meio contendo G418. As celulas estavam abaixo da selepao de G418 durante cerca de 3 semanas. Tempo no qual, as celulas nao transfectadas no meio contendo G418 foram mortas. As celulas transfectadas foram passadas em um gradiente de FICOL (Sigma) para remover as celulas mortas ou agonizantes da popula?ao viva resistente a G418. A popula$ao viva resistente a G418 foi tambem ampliada em um periodo de cerca de 2 semanas, durante 0 qual as celulas foram centrifugadas a cada 2-3 dias e ressuspensas em Meio de Expressao 293F frescocontendo 300 pg/mL G418.
Exemplo 4. Producao de hfB3 e hfB3-292S
[00231] As celulas de produgao de hfB3 ou hfB3-292S resistentes a G418 foram semeadas em a uma densidade de 2x106 cels/mL no Meio de Expressao 293F em placas de 6 cavidades com 2 mL de cultura em cada cavidade, em frascos de fiandeiros de 500 mL com 100 mL de cultura em cada frasco, ou em frascos fiandeiros de 3,000 mL com 1,000 mL de cultura em cada frasco. As celulas foram incubadas durante 72 horas com agitagao a 100 rpm em uma batedeira orbital em uma incubadora de 37°C com 8% de CO2 e 80% de umidade.
[00232] O sobrenadante de meio de cultura de celula contendo proteina hfB3 ou proteina hfB3-292S foi em seguida colhido e centrifugado em 2.000 rpm durante 10 minutos para clarear residuos de celula depois que o meio de cultura foi filtrado atraves de um filtro de 0,22 gm.
Exemplo 5. Quantificagao de Proteinas hfB3 e hfB3-292S
[00233] Um ensaio Eletroquimioluminescente (ECL) foi desenvolvido para quantificagao de hfB3 e hfB3-292S com fator B tipo selvagem humano como padrao. O ensaio foi um imunoensaio sanduiche com base na Tecnologia de ECL de BioVeris. Brevemente, o ensaio de ECL e formatado como um sanduiche de placa de 96 cavidades, uma etapa, e nenhum ensaio de lavagem. As amostras controle de qualidade (fator B purificado de plasma humano, Quidel, Cat. No. A408) e amostras de teste foram incubadas com um reagente de mistura mestre contendo anticorpo monoclonal anti-hfB biotinilado (anticorpo monoclonal de fator B anti-humano, R&D Systms, Cat. No. MAB2739), um anticorpo policlonal anti-hfB mais rotulado BV-TAG (anticorpo policlonal de fator B anti-humano, R&D Systems, Cat. No. AF2739), e contas paramagneticas revestidas por estreptavidina. A mistura foi incubada durante 150 minutos. Seguindo a incubagao, uma solugao de parada (Tampao de Borato, 250 mM, pH9,2 contendo 500 mM de cloreto de sodio e 1,6 mg/mL de BSA) foi adicionada e em seguida a placa foi lida em Analisador de M1MR. A faixa dinamica estimada para o ensaio foi 9,0 a 950 ng/mL.
Exemplo 6. Analise de Western Blot para hfB3 e hfB3-292S
[00234] Electroforese de poliacrilamida de proteina hfB3 e proteina hfB3-292S sob denturing porem sem condigoes de redugao (SDS- PAGE) foi realizada misturando-se amostras de proteina hfB3 ou proteina hfB3-292S com tampao de amostra de proteina sem redugao (Pierce). Proteina de fator B humana purificada de plasma (100 ng por amostra, Quidel) foi usada como um controle positivo. Cada gel da mesma forma conteve uma cavidade com marcadores de peso molecular de proteina pre-marcados (15 pL/pista) (Invitrogen). As amostras e os marcadores foram aquecidos a 95°C durante 5 minutos tampao de amostra de proteina sem redugao. As amostras foram carregadas em um mini gel 7,5% de Tris-HCL Precast (Bio-Rad). O gel foi conduzido (10X SDS/Tris/Glycine Running Buffer, Bio-Rad) a 75 V durante 15 minutos ou ate que a frente de tintura passou atraves do gel de empilhamento no gel determinado. Uma vez que a frente de tintura entrou no gel determinado, a voltagem foi aumentada pra 100 V e eletroforese continuou ate que a frente de tintura escapou do gel.
[00235] Analise de Western Blot foi realizada lavando-se e equilibrando-se o gel em tampao de transferencia (10 X Tris/Glycine Transfer Buffer, Bio-Rad) durante 20 minutos enquanto balangando suavemente. Uma membrana de nitrocellulose (Bio-Rad) e papel de blotting foram da mesma forma equilibrados no tampao de transferencia. Protefnas separadas por SDS-PAGE foram transferidas eletroforeticamente sobre uma nitrocelulose usando uma Celula de Transferencia Semi-Seca de Mncha de Transferencia (Bio-Rad) (20V durante 45 minutos). Uma vez que a transferencia foi concluida, a membrana foi bloqueada com uma 1X de solugao de caseina (Vetor Laboratories) durante pelo menos uma hora em temperatura ambiente com agitagao suave em um embalador. A membrana foi sondada com um anticorpo primario (anticorpo monoclonal contra fator B humano, R&D Systems, Cat. No. MAB2739) diluida a 1:10.000 entre 1X de solugao de caseina em temperatura ambiente durante 1 hora com agitagao suave e lavado em 10 mL de 1X de solugao de caseina 3 vezes durante 5 rninutos cada em temperatura ambiente com agitagao suave em um embalador. A membrana foi incubada com um IgG anti- camundongo de cabra biotinilado (anticorpo secundario, R&D Systems, Cat. No. BAF007), diluida a 1:20,000 em 1X de solugao de caseina, durante 1 hora em temperatura ambiente com agitagao suave em um embalador e lavada em 10 mL de 1X de solugao de caseina 3 vezes durante 5 rninutos cada em temperatura ambiente com agitagao suave. A membrana foi incubada em reagente Vectastain ABC-AmP (Vector Laboratories) em 20 mL de 1X de solugao de caseina durante 45 rninutos contendo 40 pL de Reagente A e 40 piL de Reagente B. A membrana foi lavada em 10 mL de 1X de solugao de caseina 3 vezes durante 5 rninutos cada em temperatura ambiente com agitagao suave.
[00236] Para adiquirir o sinal quimioluminescente das macha do Oeste, as membranas foram equilibradas em 20 mL de 0,1 M de Tris pH 9,5 durante 5 rninutos sem agitagao. Tampao em excesso foi removido da membrana sustentando a membrana verticalmente e tocando a extremidade da membrana em um Kimwipe. O lado alvo da membrana foi colocado voltado para cima em um novo recipiente. Substrato Duolox (7 mL, Vector Laboratories) foi colocado diretamente sobre o lado alvo da membrana que foi incubada durante 5 rninutos no escuro. Duolox em excesso foi removido da membrana susentando-se a membrana verticalmente e tocando-se a extremidade da membrana em um Kimwipe. A membrana foi lavada submergindo-se em 20 mL de 0,1 M de Tris pH 9,5 durante 5 minutos com agitagao no escuro. Tampao em excesso fi removido da membrana sustentando-se a membrana verticalmente e tocando a extremidade da membrana em um Kimwipe. A membrana foi colocada em uma folha de plastico dobrado e exposta a pelicula de Raios X Kodak BioMax MS em um cassete de pelicula durante 1 a 5 minutos. A pelicua foi colocada em solugao de Fomentador Kodak (diluir 26 mL da solugao de Fomentador em 92 mL de ddH2O) durante 1 minuto. A pelicula foi removida da solugao de Fomentador e colocada em solugao de Fixador Kodak (diluir 26 mL da solugao de Fixador em 92 mL de ddH2O) durante 1 minuto. Finalmente, a pelicula foi enxaguada com agua de torneira e permitida secar em temperatura ambiente.
[00237] Como mostrado na Figura 3, celulas produtoras de hfB3 e hfB3-292S resistentes a G418 produzidas, no meio de cultura de celula, proteina hfB3 (Pista 3) e proteina hfB3-292S (Pista 4) no tamanho apropriado (cerca de 100 KDa). Estas protemas migraram em aproximadamente a mesma taxa como o fator B humano tipo selvagem de plasma humano (Pista 2). Nenhuma faixa visivel foi detectada no meio de cultura de celula nao transfectdo (controle negative) indicando a especificidade do anticorpo de fator B anti- humano monoclonal (Pista 1). De forma interessante, agregados presumidos em aproximadamente 200-260 KDa foram facilmente detectados em amostras de hfB3 (pista 3), enquanto nenhum agregado foi detectado nas amostras de hfB3-292S (pista 4) produzidos sob as mesmas condigoes experimentais. Agregados poderiam ser causados por populagoes deformadas de hfB3 no meio de cultura de celula. Quando protemas sao deformadas, elas expdem regioes hidrofobicas que sao propensas a formagao de agregados atraves de interagdes hidrofobico-hidrofobicas. Estes dados sugerem que na preparagao de proteina hfB3-292S, deformagao foi eliminada ou significativamente reduzida quando comparado a proteina hfB3.
Exemplo 7. Ensaio de Atividade Hemolitica de Serie de reacao de Complemento Alternative
[00238] Atividade de serie de reagao de complemento alternativa humana pode ser medida usando um ensaio hemolitico como descrito neste Exemplo.
[00239] Um mililitro (1 mL) de suspensao de eritrocitos de coelho (rRBCs) (Lampire Biological Laboratory, Cat. No. 7246408) foi lavado com tampao de Mg2+-EGTA frio feito recentemente. Os eritrocitos foram transferidos em um tubo de centnfuga conico de 50 mL, 30 mL do tampao de Mg2+-EGTA foi adicionado e as celulas foram suavemente misturadas. A rRBCs foi peletizada em uma centrifuga Beckman Allegra 6KR a 1,200 rpm a 4°C sem freio para 5 rninutos e ressuspensa no tampao de Mg2+-EGTA. Esta etapa de lavagem foi repetida duas vezes. A rRBCs fo ressuspensa em 2 mL de tampao de Mg2+-EGTA gelo-frio e uma contagem de celula foi obtida usando um hemocitometro.
[00240] A mistura reacional de atividade hemolitica foi fixa em placas de 96 cavidades em forma de base V colocadas em gelo. Para determinar se proteina hfB3 ou proteina hfB3-292S podem competir com a proteina de fator B humana tipo selvagem e inibe sua atividade hemolitica, um ensaio de competigao foi fixo em um volume total de 40 pL incluindo 500 ng de fator B tipo selvagem humano, quantidades crescentes de proteina hfB3 ou proteina hfB3-292S, e tampao de GVB++ (Sigma, Cat. No. G6415). Cinquenta microlitros (50 pL) de soro humano exaurido de fator B diluido 25 vezes com tampao de Mg2+-EGTA foi adicionado a cada cavidade, seguido por 10 pL de Mg2+-EGTA lavado 5 x 107 rRBCs. Adicionando rRBCs cada amostra foi suavemente misturada na placa de 96 cavidades usando uma pipeta de multi-canal.
[00241] A placa de 96 cavidades foi colocada em uma bandeja de vidro com uma camada de 37°C agua submergindo a base da placa. A bandeja foi em seguida colocada em um banho de agua de 37°C com agitagao orbital em 110 rpm durante 40 minutos. Depois da incubagao, a placa foi colocada em gelo, 150 pL de gelo-frio 0,9% de solugao salina foi adicionada a cada cavidade, e cada reagao suavemente misturada por pipetagem para parar a reagao. A placa de 96 cavidades foi centrifugada em 2,000 rpm em uma centnfuga Eppendorf 581 OR durante 5 minutos (minuto) a 4°C sem freio para pelota o rRBC na base da placa. O sobrenadante (180 pL) foi removido de cada cavidade sem perturbar a pelota e transferido a cavidade correspondente de uma nova placa de 96 cavidades. A absorvencia de cada amostra foi medida a 405 nm em uma leitora de microplaca.
Exemplo 8. Atividade Biologica de hfB3 e hfB3-292S
[00242] A atividade biologica de proteina hfB3 e proteina hfB3-292S foi examinada medindo-se a hemolise mediada por serie de reagao de complemento alternativa de rRBCs. O ensaio descrito no Exemplo 7 foi usado para testar a potencia de proteina hfB3 ou proteina hfB3-292S inibindo-se a serie de reagao de complemento alternativa humana. Cada reagao foi realizada em triplicata. Como mostrado na Figura 4, o meio de cultura de celula cru das celulas produtoras de proteina hfB3- 292S e proteina hfB3 eficazmente inibiu/reduziu a atividade de serie de reagao de complemento alternativa de uma maneira dependente de dose. Embora nao desejando ser ligado por teoria, proteina hfB3 e hfB3-292S podem estar inibindo atividade da serie de reagao de complemento alternativa competindo contra a proteina de fator B de tipo selvagem e/ou isolando-se C3b e/ou fator D de complemento.
Exemplo 9. Purificacao de protefnas hfB3 e hfB3-292S
[00243] Meio de cultura de celula de uma linhagem celular 293 Freestyle humana transfectada e estavelmente expressando e segregando proteina hfB3 ou proteina hfB3-292S foi usado como o material de partida para purificagao de proteina hfB3 ou proteina hfB3- 292S. Proteina HfB3 ou hfB3-292S segregada soluvel foi purificada a partir do sobrenadante de cultura de celula por uma combinagao de troca anibnica (AEX), interagao hidrofobica (HIC) e cromatografia de exclusao de tamanho (SEC) para capturar, purificagao intermediaria e etapas de polimento, respectivamente, usando um Purificador GE AKTA. Dois esquemas de purificagao sao descritos abaixo. Estes dois esquemas diferem em que um usa uma etapa de cromatografia de HIC e o outro usa duas etapas de cromatografia de HIC.
[00244] O sobrenadante de cultura de celula contendo proteina hfB3 foi diluido com agua destilada em relagao de volume de 4:1 de sobrenadante de cultura/agua para diminuir a condutividade em ~8 Milli Siemens por centimetro (mS/cm) e ajustado em pH 7,5 com 50 mM de tampao de fosfato. Este material foi diretamente carregado sobre uma coluna de troca ionica pre-empacotada (POROS HQ 50, ABI) em um purificador de AKTA usando uma bomba de P-960 em uma taxa de fluxo de 30 mL por minuto. A coluna foi previamente equilibrada com tampao A (50 mM de tampao de fosfato (PB), pH7,5, condutividade ~8 mS/cm), em uma taxa de fluxo linear de 600 mL/hr (-1 Coluna Volume/min, CV/min). O efluente foi monitorado para detecgao UV em 280 nm. Depois de lavar o material nao ligado, material retido foi elufdo com um gradiente nao linear de tampao A e tampao B (50 mM de PB e 1 M de NaCI, pH 7,5) para sequencialmente elevar a condutividade da fase movel etapa a etapa de 8 mS/cm (0% de tampao B para 2 CV), para 33 mS/cm (25% de tampao B para 8 CV) e finalmente para 105 mS/cm (100% de tampao B para 5 CV).
[00245] Para tambem facilitar remogao de contaminantes de proteina hospedeiras, um intermediary, interagao hidrofobica (HIC) etapa de cromatografia foi introduzido, que purifica e separa proteinas com base em diferengas em sua hidrofobicidade de superficie. As fragoes principals (da etapa de cromatografia de AEX) contendo proteina hfB3 foram agrupadas e ajustadas para confer cerca de 1,4 M de sulfato de amonio e 47 mM de tampao de fosfato, pH 7,5 (condutividade 216 mS/cm) (1,0 M de sulfato de amonio e 33,7 mM de tampao de fosfato, pH 7,5, condutividade 169 mS/cm para hfB3-292S) adicionando-se tampao C (1,5 M de sulfato de amonio e 50 mM de tampao de fosfato, pH 7,5) para a amostra a cerca de 30:1 relagao de volume do sulfato de amonio/tampao de fosfato vs. a amostra. A amostra agrupada foi filtrada atraves de um filtro de 0,2 pm e aplicado em uma coluna de interagao hidrofobica (HiTrap Phenil HP, GE Healthcare) pre-equilibrado com 1,5 M de sulfato de amonio e 50 mM de tampao de Fosfato, pH 7,5 (tampao C) (1,0 M de sulfato de amonio e 33,7 mM de tampao de fosfato para hfB3-292S) a taxa de fluxo de 300 mL/hr (1 CV/min). O material retido foi eluido diminuindo-se a concentragao de sulfato de amonio de uma maneira nao linear.
[00246] Alternativamente, a etapa de cromatografia de HIC intermediaria pode ser substituida com uma cromatografia de HIC de duas etapas, por exemplo, para tornar o processo e purificagao mais facil de escalonar. Neste processo de purificagao de HIC de duas etapas, a maioria de proteinas de celula hospedeira foram separadas de fB3 ou fB3-292S pela primeira etapa de cromatografia de HIC, selegao negativa de HIC, ligando-se a coluna de HIC (HiTrap Phenyl HP, GE Healthcare) em condigao de sal baixa (0,75 M de sulfato de amonio e 25 mM de tampao de fosfato, pH 7,5 para fB3 e 0,6 M de sulfato de amonio e 20 mM de tampao de fosfato, pH 7,5, condutividade 100 mS/cm para hfB3-292S). A fragao de fluxo continue da etapa de selegao negativa de HIC contendo proteina hfB3 ou fB3- 292S foi em seguida reajustada para confer cerca de 1,5 M de sulfato de amonio e 50 mM de tampao de fosfato, pH 7,5 (condutividade 216 mS/cm) para fB3 ou 1,0 M de sulfato de amonio e 33,7 mM de tampao de fosfato, pH 7,5, (condutividade 169 mS/cm) para hfB3-292S. Para a segunda etapa de cromatografia de HIC, a amostra foi filtrada atraves de um filtro de 0,2 pm e aplicada a uma coluna de interapao hidrofobica (HiTrap Phenyl HP, GE Healthcare) pre-equilibrada com 1,5 M de sulfato de amonio e 50 mM de tampao de Fosfato, pH 7,5 para fB3 e 1,0 M de sulfato de amonio e 33.7 mM de tampao de fosfato para hfB3-292S na taxa de fluxo de 300 mL/hr (1 CV/min). O material retido foi eluido diminuindo-se a concentrapao de sulfato de amonio de uma maneira nao linear para tambem separar proteina fB3 ou fB3-292S das proteinas de celula hospedeira restantes.
[00247] As frapoes contendo proteina hfB3 biologicamente ativa da etapa de cromatografia de HIC foram agrupadas e concentradas com um dispositive de filtro centnfugo (Millipore, Amicon Ultra, Cat. No. 901024, 10,000 MW Cut-off). A amostra concentrada foi submtida a cromatografia de exclusao de tamanho em uma coluna Sephacryl S300 26/60 HR (volume de carregamento maximo: 3% de CV, ~10 ml_), equilibrado em tampao de PBS (4 mM de fosfato, 150 mM de NaCI, pH 7,4, (GIBCO)). A eluipao de proteina hfB3 foi realizada em uma taxa de fluxo linear constante de 60 cm/hr usando PBS, monitorando o efluente por deteepao de UV a 280 nm. A proteina hfB3 purificada foi armazenada a -80°C em alfquotas.
[00248] Este procedimento permitiu separapao quase completa de proteina hfB3 de outros contaminantes. A pureza de proteina hfB3 depois do processo de cromatografia de tres etapas foi bastante alto, como indicado pelo fato que analise de colorapao de prata SDS-PAGE de 0,2 pg de proteina hfB3 purificada apenas produziu uma unica faixa afiada (Figura 5, painel da esquerda). Quando proteina hfB3 purificada processo de cromatografia de tres etapas acima foi submetida a um ensaio de competipao contra fator B tipo selvagem humano em um ensaio hemolitico, suprimiu atividade hemolitica da serie de reaqao de complemento alternativa humana, demonstrando que a proteina hfB3 purificada foi biologicamente ativa (Figura 5, painel direito). Surpreendentemente, duas populapoes de hfB3 foram detecadas por HIC, uma foi biologicamente ativa (designado como Pico I ou populaQao ativa) e a outra teve uma atividade biologica muito reduzida (designada como Pico II ou populagao menos ativa) (Figura 6). Estas duas formas foram facilmente detectadas por HPLC de fase reversa (RP-HPLC) no meio de cultura de celula nao processado de celulas produtoras de proteina hfB3 estavel (Figura 7).
Exemplo 10. Linhaqem Celular de Producao de Proteina hfB3- 292S nao Produz a Populacao de Pico II
[00249] O meio de cultura de celula de proteina hfB3-292S cru contendo um analogo de fator B de complemento com a cisteina livre substituida com serina na posiQao 292 foi submetido a analise de RP- HPLC com meio de cultura de celula 293 Freestyle cru como um controle negative e meio de cultura de celula de proteina hfB3 cru como um controle positive (Figura 7). O meio de cultura de celula de proteina hfB3 292S nao produziu qualquer populaQao de Pico II detectavel, visto que analise de meio de cultura de celula de proteina hfB3 mostrou que 35% de hfB3 estavam na populaQao menos ativa, de Pico II. (Figura 7A & o B.)
Exemplo 11. Geracao e Caracterizacao de Construtor de Expressao de hfB4 e proteina hfB4
[00250] Proteina hfB4 foi designada para mudar o acido aspartico, em aminoacido 740 em hfB3, para uma asparagina. Acredita-se que esta mudanQa atenua ou inibe a funQao da funQao de serina protease deste analogo da proteina do fator B do complemento.
[00251] Para criar a construQao de expressao de hfB4, mutaQao sitio-especifica foi introduzida no construtor de expressao de hfB3.
[00252] O construtor de expressao de hfB3 (SEQ ID NO:5) descrito no Exemplo 1 foi usado como um modelo para preparar uma mutagao mudando o acido aspartico (D) na posigao 740 em SEQ ID NO:4 para asparagina (N) usando o Kit de Mutagenese Sftio-Dirigida de Stratagene (Stratagene, Santa Clara, CA) de acordo com as instrugoes do fabricante, criando o construtor de expressao de hfB4. Dois iniciadores foram usados: iniciador Dianteiro 5’-CACCGGCGCCAAGAAGAGCCTGGTCAACCTGATC-3’ (SEQ ID NO: 15) e iniciador Reverso 5’-GATCAGGTTGACCAGGCTCTTCTTGGCGCCGGTG-3’ (SEQ ID NO: 16). Os nucleotideos sublinhados indicam a mudanga de nucleotfdeo que resulta na mudanga de aminoacido de D para N. Este construtor de expressao de hfB4 inclui, de 5' a 3', um promotor de CMV, um intron quimerico, uma sequencia de codificagao de codon aperfeigoada para hfB4, um marcador selecionavel IRES-Neo, e um poliA sintetico. O construtor inteiro foi sequenciado para confimnar a mutagao e a integridade do construtor. A sequencia de aminoacido esperada para hfB4 e mostrada em SEQ ID NO:17. A unica diferenga entre a sequencia de aminoacido de hfB3 e hfB4 e a mudanga de D740N.
[00253] Uma linhagem celular estavel que expressa proteina de hfB4 foi gerada por transfecgao mediada por PEI e selegao de farmaco de 293 celulas como descrito no Exemplo 3. A concentragao de proteina hfB4 no meio de cultura de celula da populagao de celula selecionada foi medida por ECL como descrito no Exemplo 5.
[00254] Atividade biologica de proteina hfB4, purificada como descrito no Exemplo 9 usando o metodo da etapa de cromatografia de HIC, foi examinada por ensaio de atividade hemolitica como descrito no Exemplo 7. Tabela 2 mostra a atividade hemolitica de serie de reagao de complemento alternativa humana por meio de cultura de celula contendo proteina hfB4. Atividade hemolitica relativa foi marcada por hemoglobina liberada depois da hemolise de rRBC por atividade de serie de reagao de complemento alternativa humana. Como mostrado na Tabela 2, proteina hfB4 eficazmente inibiu a atividade de serie de reagao de complemento alternativa.Tabela 2. Inibigao de hfB4 de atividade hemolitica de serie de reagao de complemento alternative
Figure img0001
Exemplo 12. Geracao e Caracterizacao de uma construcao deExpressao de hfB3-Fc e uma Proteina hfB3-Fc
[00255] hfB3-Fc e uma proteina de fusao entre hfB3 e um IgG Fc. Especificamente, o comprimento total da proteina hfB3 foi fundido com um lgG4 Fc humano.
[00256] Para criar uma construgao de expressao de hfB3-Fc, um produto de PCR foi ampliado a partir do construtor de expressao de hfB3 (SEQ ID NO:5) descrito no Exemplo 1 usando dois iniciadores: o iniciador dianteiro5’-GCGCACCGGTGCTAGCGAATTCGGCGACAAGAAGGGCAGCTG CGA-3’ (SEQ ID NO: 19); e o iniciador reverso 5’- GCGCAGATCTCAGGAAGCCCAGGTCCTCAT-3’ (SEQ ID NO:20). O produto de PCR 377 bp contendo a regiao de codificagao para o C- terminal de hfB3-Fc foi em seguida digerido com Age I e Bgl II e ligado em pFUSE-hlgG4Fc (Invivogen, Cat. Codigo: pfuse-hg4fc1) que foi previamente digerido com Age I e Bgl II, criando o plasmideo phfB3Cterm-Fc. O construtor de expressao de hfB3 (SEQ ID NO:5, descrito no Exemplo 1) foi digerido com EcoR I e EcoR V. O fragmento de EcoR l/EcoR V contendo o N-terminal de hfB3 foi ligado em phfB3Cterm-Fc que foi previamente digerido com EcoR I e EcoR V, criando phfB3-Fc. O plasmideo de phfB3-Fc foi digerido com Nhe I e o fragmento contendo a sequencia de codificaQao de hfB3 e Fc foi ligado no construtor de pCI modificado com IRES-Neo descrito no Exemplo 1, criando o construtor de expressao de hfB3-Fc (SEQ ID NO: 18). Esta construgao de expressao de hfB3-Fc inclui, de 5' a 3', um promotor de CMV, um intron quimerico, uma sequencia de codificagao para hfB3- Fc, um marcador selecionavel IRES-Neo, e um poliA sintetico. O construtor inteiro foi sequenciado para confirmar a integridade do construtor (SEQ ID NO:18). SEQ ID NO:21 e a sequencia de aminoacido da proteina hfB3-Fc.
[00257] Uma linhagem celular estavel que expressa proteina hfB3- Fc foi gerada por transfecgao mediada por PEI e selegao de farmaco de 293 celulas como descrito no Exemplo 3. As celulas selecionadas por farmaco foram cultivadas em 2 x 106 cels/mL durante 72 horas. Em seguida expressao de proteina hfB3-Fc foi examinada submetendo-se 2 pl do sobrenadante de cultura de celula a um SDS-PAGE de nao redugao e analise de Western Blot. Como mostrado na Figura 8, duas faixas de proteina hfB3-Fc foram detectadas por um anticorpo especifico anti-fator B de cabra (R&D Systems, Cat. No. AF2739). Os marcadores de peso molecular em KDa sao indicados na esquerda. Nao desejando ser ligado por teoria, estas duas faixas de proteina hfB3-Fc poderiam representar mondmeros e dimeros da proteina. Atividade biologica de proteina hfB3-Fc (em sobrenadante de cultura de celula) foi examinada por um ensaio de atividade hemolitica como descrito no Exemplo 7. Como mostrado na Tabela 3, proteina hfB3-Fc inibiu a atividade de serie de reagao de complemento alternativa.Tabela 3. inibigao hfB3-Fc de atividade hemolitica de serie de reagao de complemento alternativa humana
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Exemplo 13. Efeito de Congelamento Repetido/Desconqelamentoem Inibicao de Complemento hfB3 292S
[00258] Proteina hfB3-292S foi purificada como descrito no Exemplo 9 usando o um metodo de etapa de cromatografia de HIC. Proteina HfB3 292S purificada em PBS, removido de um congelador de -80°C e descongelado em temperatura ambiente, foi contado como o primeiro ciclo de congelamento e descongelamento. Depois deste descongelamento, a concentragao de proteina hfB3 292S foi ajustada a 2 mg/mL com PBS e uma al [quota de hfB3 292S foi amostrada e guardada em gelo como a primeira amostra de congelamento e descongelamento. O tubo da proteina hfB3 292S foi em seguida congelado mantendo-se o tubo em um banho de gelo de metanol/seo durante 20 rninutos e em seguida descongelando a temperatura de ambiente ate completamente descongelar (o segundo ciclo de congelamento e descongelamento). Uma al (quota da amostra foi amostrada e retirada antes de repetir o proximo ciclo de congelamento e descongelamento. A atividade biologica de amostras de cada ciclo de congelamento e descongelamento (total de 7 vezes) foi analisada medindo-se sua capacidade para competir com fator B tipo selvagem humano no ensaio hemolitico medido por serie de reapao de complemento alternativa como descrito no Exemplo 7. Cada reaqao conteve uma quantidade fixa de fator B tipo selvagem humano (0,5 pg) com quantidades crescentes de hfB3 292S. Os resultados na Tabela 4 representam a porcentagem de inibipao no ensaio hemolitico.
[00259] Estes resultados demonstram que proteina hfB3 292S ainda pode efetivamente inibir hemolise mediada por serie de reapao alternativa ate mesmo depois de sete ciclos de congelamento e descongelamento (Tabela 4). Um nivel similar de inibipao de hemolise foi observado por fora todas as amostras mostrando que congelamento e descongelamento repetidos (ate 7 vezes) nao afeta a capacidade de proteina hfB3 292S inibir hemolise mediada porcomplemento.Tabela 4. hfB3 292S Depois de ciclos deCongelamento/Descongelamento
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Exemplo 14. Maior Termoestabilidade de Proteina hfB3 292S do Que Proteina hfB3
[00260] Proteinas hfB3 e hfB3-292S foram purificadas como descrito no Exemplo 9 usando o um metodo de etapa de cromatografia de HIC. Proteina HfB3 e hfB3 292S purificada, igualmente em PBS, foram removidas de -80°C. Concentragao de proteina foi reajustada para 2 mg/mL em PBS (pH 7,4). Proteinas hfB3 e hfB3 292S foram igualmente aliquotadas em tres tubos Eppendorf de 0,6 mL (40 pL por tubo) e em seguida armazenadas em condigoes de 4°C, -80°C e 37°C durante 7 dias. A atividade biologica (capacidade de inibir hemolise mediada por complemento) de cada uma das amostras armazenadas foi analisada medindo-se sua capacidade de inibir hemolise mediada por serie de reagao de complemento alternativa como descrito no Exemplo 7. Os resultados deste ensaio hemolitico mostraram que armazenamento a 4°C ou -80°C durante 7 dias nao afetou a capacidade de hfB3 ou hfB3 292S inibir hemolise mediada por serie de reagao de complemento alternativa. Entretanto, proteina hfB3 armazenada a 37°C durante 7 dias perdeu essencialmente toda sua atividade biologica em todas as quatro amostras testadas. Notavelmente, hfB3 292S armazenada a 37°C durante 7 dias preservaram sua atividade biologica bem e ainda poderia competir com fator B humano tipo selvagem efetivamente (Tabela 5). Os resultados na Tabela 5 representam a porcentagem de inibigao de atividade de complemento alternativa humana (com desvio-padrao) por hfB3 ou hfB3 292S. Estes resultados indicaram que proteina hfB3 292S tern maior termoestabilidade do que proteina hfB3 a 37°C.
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Tabela 5. Termoestabilidade de hfB3 e hfB3-292S
Exemplo 15. Determinacao de Ponto de Fusao de Proteina de fator B Humano, Proteinas fB3, e fB3-292S
[00261] Temperatura de fusao de proteina (Tm) e uma medida da estabilidade termica de uma proteina e mudangas na sequencia de aminoacido de uma proteina pode afetar, entre outras coisas, a estabilidade termica proteina. Proteina de fator B humano (hfB) contem vinte e tres residuos de cisteina, vinte e dois dos quais ocorrem como pares de ligaQao de dissulfeto (cistina) e um dos quais, C292, esta presente em uma forma de sulfidrila livre nao emparelhada.
[00262] Os perfis de temperatura de fusao de proteina hfB3 (K258A, R259A, K260A, D279G, N285D) e proteina hfB3-292S (o unico residue de cisteina nao pareado de proteina hfB3 foi modificado para serina) foram comparados aquele de proteina hfB incubando-se cada proteina na presenQa de acido 1-anilinonaftaleno-8-sulfbnico (ANS) e medindo o aumento em fluorescencia de ANS a 460 nm. ANS liga-se a regioes hidrofobicas de proteina (Stryer, J., Molecular Biology (1965) 13:482-495,) e foi usado para investigar o efeito de temperatura na hidrofobicidade de superficie de proteina hfB (Takada, e outro, Complement (1985) 2:193-203). Amostras contendo proteina de hfB (35 pg), proteina hfB3 (50 pg) e proteina hfB3-292S (39 pg) foram preparadas em 100 pL de PBS (137 mM de NaCI, 2,7 mM de KCI, 10 mM de fosfato, pH 7,4) tampao contendo 10 mM de ANS (Invitrogen, Catalog # A-47). Amostras de cada proteina (em triplicata) foram incubadas em tubos de polipropileno fechados durante trinta rninutos a 21 °C, 30°C, 37°C, 44°C, 47°C, 50°C, 55°C, 60°C, e 65°C. As amostras foram transferidas em uma microplaca de 96 cavidades clara (Costar, Catalog# 3635) e a fluorescencia foi medida em um espectrofluonmetro de microplaca Perceptive Biosystems Cytofluor 4000 (excitaQao = 60/40 nm, emissao = 460/40 nm). Os resultados foram analisados usando um ajuste de curva nao linear 4PL. Os valores de Tm (media dos resultados de duas experiencias) para proteina hfB de tipo selvagem, proteina hfB3 e proteina hfB3-292S foram determinadas ser46,4°C, 45,1 °C, e 47,0°C, respectivamente. As cinco mudanQas de aminoacido feitas em proteina hfB3 com respeito a proteina hfB tipo selvagem (K258A, R259A, K260A, D279G, N285D) resultou em um ATm = -1,3°C, indicando que proteina hfB3 foi menos termicamente estavel comparada a uma proteina hfB tipo selvagem correspondente. Entretanto, o Tm de proteina hfB3-292S (47,0°C) resultou em um ATm = +1,9°C com respeito a proteina hfB3 e indicou que proteina hfB3-292S foi pelo menos como termicamente estavel como proteina hfB tipo selvagem (46,4°C).
[00263] Portanto, ao contrario dos resultados de Culajay, e outro (Biochemistry (2000) 39:7153-7158) que mostrou que substituigao de um residue de cisteina com serina em fator de crescimento de fibroblasto humano (FGF-1) proteina (C83S ou C117S) diminuiu o Tm em 13°C e 2°C, respectivamente, a substituiQao de serina de hfB3 para aminoacido C292 resultou em hfB3-292S sendo mais termicamente estavel do que hfB3.
Exemplo 16. Proteina hfB3-292S Previne Dano e Inflamacao de Articulacao em um Modelo de Artrite Reumatoide de Camundongo
[00264] Artrite induzida por anticorpo de Colageno (CAIA) e um modelo de camundongo agressivo para artrite reumatoide (Terato K e outro, J. Immunol. (1992) 148(7):2103-8; Terato K e outro, Autoimmunity (1995) 22(3): 137-47). Neste modelo, um coquetel de anticorpo de colageno contendo 4 anticorpos monoclonais contra colageno (Chondrex, Inc., Catalogue Number: 10010) com aumento de LPS foi usado para induzir artrite em camundongos tipo selvagem machos DBA/1J com seis semanas de idade (Jackson Laboratory).
[00265] Quarenta camundongos foram divididos em tres grupos. Grupo 1 teve 10 camundongos servindo como um grupo de controle de veiculo onde 100 pL de PBS (soluQao salina tamponada de fosfato, pH 7,4) foi injetado na veia da cauda no dia 0, uma injepao auxiliar de 25 pg de LPS (List Biological Lab, Campbell, California, Catalogue Number: 421) por camundongo foi administrado intraperitoneal (LPS estava em PBS em uma concentra?ao 500 pg/mL) no dia 3, e 100 pL de PBS pela veia da cauda novamente nos dias 3, 5, 7, e 9. Grupo 2 teve 15 camundongos que foram injetados com o coquetel de anticorpo de colageno (0,25 mg em 100 pL de PBS por camundongo) pela vela da cauda no dia 0, recebeu uma injeQao auxiliar de 25 pg de LPS no dia 3, e foram administrados 100 pL de PBS pela veia da cauda nos dias 3, 5, 7, e 9. Grupo 3 teve 15 camundongos que foram injetados com 0,25 mg do coquetel de anticorpo de colageno e 1 mg de proteina hfB3-292S, ambos juntamente em 100 pL de PBS por camundongo pela veia da cauda no dia 0, administrou uma injeQao auxiliar de 25 pg de LPS no dia 3, e administrou 1 mg de proteina hfB3-292S em 100 pL de PBS pela veia da cauda nos dias 3, 5, 7, e 9.
[00266] Camundongos foram examinados diariamente. Cada peso de camundongo foi registrado quando medida de articulagao ocorreu. Patas dianteiras e articulagoes do membro posterior foram medidos usando calibradores para igualmente largura e espessura nos dias 1, 4, 6, 9 e 11. A sequencia de medida foi membro dianteiro esquerdo, membro posterior esquerdo, membro posterior direito e membro dianteiro direito. No dia 11, todos os animals foram sacrificados e todos os membros (membra dianteiro esquerdo, membra dianteiro direito, membra posterior esquerdo e membra posterior direito) foram coletados e armazenados em cassetes plasticos individualmente rotulados. Cada cassete foi colocado em uma caixa de recipiente de histologia contendo 10% de solugao de formalina tamponada neutra.
[00267] Estes que membros de camundongo foram submetidos a seccionamento de parafina e coloragao H&E para examinar a patogenese nas articulaQoes. Especificamente, seguindo fixagao, cada membra de cada camundongo foi transferido em um cassete plastico separadamente. Os membros foram enxaguados com agua corrente em um bequer durante 30 minutos (min) em temperatura ambiente (RT) para remover solugao fixadora. Em seguida cada cassete foi transferido em um bequer contendo solugao descalcificada (Thermo Scientific, Catalogue Number 8340) por imersao do cassete na soiuqao. Membros dianteiros foram descalcificados durante 8 horas e membros posteriores foram descalcificados durante 9 horas. Depois de 8 horas ou 9 horas, os membros foram enxaguados novamente com agua corrente durante 30 min em RT para remover soiuqao descalcificada. Depois da descalcificaqao, membros foram armazenados em 70% de etanol durante a noite (O/N) para a proxima etapa de desidrataqao. Membros foram desidratados sequencialmente imergindo-se em: 75% de etanol (feito de 100% de etanol) durante duas vezes; 85% de etanol durante duas vezes, 95% de etanol durante duas vezes e 100% de etanol durante duas vezes, cada momento durante 15 min em RT com agitaqao. Logo, os membros foram imersos em uma mistura de 1:1 de 100% de etanol e oleo de madeira de cedro (Fisher, Catalogue Number: 040-1) durante 15 min em RT com agitaqao, e repetido mais duas vezes para um total de tres vezes. Os membros foram em seguida imersos em 100% oleo de madeira de cedro e incubados a 40°C durante 5 horas. Seguindo a incubaqao de 5 horas, membros foram imersos em uma mistura de 1:1 de oleo de madeira de cedro e salicilato de metila (ACROS, Catalogue Number 119-36-8) durante 60 min em RT. Os membros foram em seguida imersos em outra mistura de 1:1 de oleo de madeira de cedro e salicilato de metila O/N em RT. Seguindo a incubaqao de O/N, membros foram imersos em 100% de salicilato de metila durante 40 min em RT, repetido mais uma vez (um total de duas vezes). Finalmente, membros foram incrustados em parafina que foi preparada por incubaqao a 60°C durante 7 horas.
[00268] Seqoes de parafina dos membros de camundongo foram preparadas usando um microtomo e cortadas em uma espessura 7 pm. As seqoes foram incubadas em um banho de agua a 40°C e transferidas em uma lamina de microscopic Superfrost Plus. As laminas foram secas O/N em RT, e tambem secas por incubaqao O/N em uma lamina mais morna. As laminas foram mantidas em RT ate colorapao.
[00269] Sepoes de parafina montadas do membro de camundongo foram submetidas a colorapao H&E. As sepoes foram desparafinizadas e reidratadas por imersao em xileno durante 3 min repetidas 2 vezes por um total de 3 vezes. O xileno em excesso foi em seguida retirado, e sepoes foram imersas em 100% de etanol durante 3 minutos, para um total de 3 vezes, em seguida 95% etanol durante 3 minutos, uma vez, 80% etanol durante 3 minutos, uma vez, e agua deionizada durante 5 minutos, uma vez. Todas as incubapoes estavam em RT. Para a colorapao de hematoxilina, laminas foram imersas em hematoxilina durante 4 minutos, uma vez, e enxaguadas com agua deionizada. As laminas foram imersas em agua de torneira durante 5 minutos uma vez para permitir a colorapao desenvolver. As laminas foram imersas rapidamente, 8-12 vezes, em etanol acido (200 ml 70% etanol mais 150 pL de HCL concentrado) para descorar as sepoes. As laminas foram em seguida enxaguadas duas vezes durante 1 minuto em agua de torneira, e em seguida uma vez durante 2 minutos em agua deionizada. A agua em excesso foi retirada a partir das laminas antes da colorapao de eosina.
[00270] Para a colorapao de eosina, laminas foram imersas uma eosina uma vez durante 20 segundos. Laminas foram em seguida desidratadas por imersao em 95% de etanol 3 vezes durante 5 minutos. Laminas foram incubadas em 100% de etanol 3 vezes durante 5 minutos. O etanol em excesso foi retirado, e as laminas foram incubadas em xileno tres vezes durante 15 minutos. Laminulas foram aderidas as laminas usando o Permount com base em xileno (EMS, Catalogue Number 17986-01) colocando-se uma gota de Permount na lamina usando uma vara de vidro sendo cuidadoso para nao formar bolhas. A laminula foi em seguida angulada sobre a lamina e gotejada suavemente sobre a lamina. 0 Permount foi permitido espalhar em baixo da laminula revestindo a segao inteira. As laminas foram secas O/N em RT em uma capela.
[00271] Como mostrado na Figura 10, o grupo injetado com coquetel de anticorpo de colageno na ausencia de hfB3-292S (Grupo 2) induziu inchagao da pata da frente severa. Camundongos injetados com o coquetel de anticorpo, porem foram tratados com proteina hfB3-292S (Grupo 3) mostrou uma redugao de 65% no tamanho da pata (p<0,0003) (Figura 10). Estes resultados demonstram um efeito inibitorio significante de artrite da articulagao neste modelo por hfB3- 292S. Em 250 pg de dosagem de coquetel de anticorpo de colageno por camundongo para a indugao de CAIA, os membros posteriores dos camundongos nao mostraram inchago obvio. Nenhum efeito adverso significante para tratamento de proteina hfB3-292S em peso de camundongo foi observado. O peso medio de todos os camundongos mantidos continuamente. O peso medio para todos os camundongos em todos os tres grupos foi 20,4±1,1 gramas ao final do estudo.
[00272] Como mostrado na Figura 9, os camundongos no Grupo 1 pareciam ter articulagoes normals, nenhuma infiltragao de celula inflamatoria detectavel na articulagao e a cartilagem e ossos pareceram normals (Figura 9, painel de topo). Os camundongos em Grupo 2 tiveram inflamagao severa nas articulagoes, infiltragao de celula inflamatoria, formagao de pano, dano de cartilagem e erosao ossea (Figura 9, painel mediano). Os camundongos no Grupo 3 tratados com hfB3-292S tiveram estrutura de articulagao normal, nenhuma infiltragao de celula inflamatoria, nenhuma cartilagem ou erosao ossea ou dano (Figura 9, painel de base).
[00273] Estes dados demonstraram que hfB3-292S foi significativamente eficaz prevenindo-se inflamagao de articulagao e dano neste modelo de camundongo CAIA, demonstrando a utilidade terapeutica de proteina hfB3-292S para artrite reumatoide
Exemplo 17. Geracao e Caracterizacao de uma Construcao de Expressao de hfB3-292S-Fc e uma Proteina hfB3-292S-Fc
[00274] Uma linhagem celular estavel que expressa proteina hfB3- 292S-Fc (SEQ ID NO:22) foi gerada por transfecQao mediada por PEI e selegao de farmaco de 293 celulas como descrito no Exemplo 3. As celulas selecionadas por farmaco foram cultivadas em 2 x 106 cels/mL durante 72 horas. Em seguida expressao de proteina hfB3- 292S-Fc foi examinada submetendo-se 2 pL da sobrenadante de cultura de celula em um SDS-PAGE de nao redugao e analise de Western Blot. Duas faixas de proteina hfB3-292S-Fc foram detectadas por um anticorpo especifico antifator B de cabra. (Dados nao mostrados.) Nao desejando ser ligado por teoria, estas duas faixas de proteina hfB3-292S-Fc poderiam representar mondmeros e dimeros da proteina.
[00275] hfB3-292S-Fc foi purificado com uma coluna de Proteina A. Atividade biologica de proteina hfB3-292S-Fc purificada foi examinada por um ensaio de atividade hemolitico como descrito no Exemplo 7. Como mostrado na Tabela 6, proteina hfB3-292S-Fc inibiu a atividade de serie de reagao de complemento alternativa em uma dose maneira dependente.Tabela 6. inibigao de hfB3-292S-Fc de atividade hemolitica de serie de reagao de complemento alternative
Figure img0005
Exemplo 18. hfB3-292S Truncado por terminal C
[00276] Uma construgao de expressao de gene foi feito que expressou uma forma truncada de hfB3-292S com os 284 aminoacidos de C-terminal(o dominio de serina protease) sendo deletado. A molecula e designada como hfB3-292SN480 que e composto dos 480 aminoacidos de N-terminal de hfB3-292S (aminoacidos 1-480 de SEQ ID NO:2 ou aminoacidos 26-480 de SEQ ID NO:2 depois da clivagem do peptideo de secreQao). A sequencia de DNA do construtor de expressao para hfB3-292SN480 e mostrada em SEQ ID NO:24 com nucleotideos 1064-2509 que sao a sequencia de codificaQao para hfB3-292SN480. O construtor de expressao foi transfectado em 293 celulas Freestyle e selecionado com G418 como previamente descrito no Exemplo 3. O meio de cultura de celula nao clonal resistente a G418 foi submetido a analise de Western Blot para expressao de hfB3- 292SN480 usando hfB3-292S de tamanho natural como um controle (pista esquerda). Como mostrado na Figura 11, a analise de Western Blot com um anticorpo monoclonal especificamente para hfB3-292S detectou uma faixa aproximadamente 55 KDa a partir do meio de cultura de celula de linhagem celular hfB3-292SN480 (pista direita), sugerindo que ate mesmo com uma deleQao de 280 aminoacidos a partir do C-terminal de hfB3-292S, os 480 aminoacidos de N-terminal podem ser expressados em um tamanho apropriado.
[00277] Um ensaio de atividade de complemento alternativo foi realizado como previamente descrito, para determinar se hfB3- 292SN480 pode inibir atividade de complemento alternativa. Como mostrado na Figura 13 o sobrenadante de cultura de celula, de celulas que expressam hfB3-292SN480, inibiram a atividade de complemento alternativa de uma maneira dependente de dose. Isto demonstra que fragmentos de hfB3-292S ainda podem reter a capacidade de inibir atividade de complemento, e portanto, pode ser utilizado igual como descrito aqui para hfB3-292S (SEQ ID NO:2)
Exemplo 19. proteina de fusao hfB3-292S/Fc monomerica hfB3- 292S/Fc-mono
[00278] Uma construpao de expressao de gene codificando um hfB3-292S de tamanho natural "fundido" a um lgG4 Fc humano foi criado. hfB3-292S e um monomero quando e produzido em celulas de mamifero, tai como celulas humanas como previamente descrito, por exemplo, veja Figura 3 descrita no Exemplo 6 que mostra que hfB3- 292S foi detectado como uma faixa a cerca de MW 100 KDa sob condipoes de nao redupao, sugerindo que hfB3-292S e um monomero. Duas cisteinas na regiao de articulapao do lgG4 Fc humano para garantir que a proteina de fusao seria monomero e reteria a propriedade biologica de hfB3-292S para inibir atividade de complemento. As duas cisteinas foram mutadas substituindo-se cada com uma serina. Esta proteina de fusao de hfB3-292S e o lgG4 Fc mutado foi designado hfB3-292S/Fc-mono. A sequencia de DNA para este construtor de expressao de proteina de fusao e mostrada em SEQ ID NO:26. A sequencia de aminoacido correspondente para hfB3 292S/Fc mono e mostrada em SEQ ID NO:25 com aminoacidos 1-764 sendo a regiao de hfB3-292S e aminoacidos 765-1003 sendo a regiao de lgG4 Fc humano com aminoacidos 782 e 785 aminoacidos sendo serina que foram substituidos para residues de cisteina encontrados em um lgG4 Fc humano nativo.
[00279] O construtor de expressao de gene de hfB3-292S/Fc-mono (SEQ ID NO:26) foi transfectado em celulas humanas 293 Freestyle. As celulas foram em seguida submetidas a selepao de G418. O meio de cultura do farmaco das celulas resistentes a farmaco foi submetido a analise de Western Blot para a proteina de fusao. Como mostrado na Figura 12, uma faixa em aproximadamente 115 KDa foi detectada por anticorpo de fator B anti-humano de cabra purificado neste SDS- PAGE de nao redupao e analise de Western Blot. As duas faixas mais altas mais provavelmente foram agregadas da proteina de fusao monomerica. Os dados sugeriram que a proteina de fusao monomerica entre hfB3-292S e lgG4 Fc humano (hfB3-292S/Fc-mono) foi bem sucedidamente expressada em celulas de mamifero e que a maioria da proteina de fusao parecia ser monomerica.
[00280] Para examinar se hfB3-292S/Fc-mono preservou a propriedade de hfB3-292S de bloquear atividade de complemento alternativa, um ensaio de atividade de complemento alternative foi realizado como previamente descrito. Como mostrado na Figura 14, o sobrenadante de cultura de celula de celulas produtoras de hfB3 292S/Fc-mono inibiram a atividade de complemento alternativa de uma maneira dependente de dose, sugerindo que a atividade inibitoria de complemento de hfB3-292S nao foi perdida nesta proteina de fusao hfB3-292S/Fc-mono monomerica.
[00281] Todas as publicagoes, patentes e pedidos de patente mencionados nesta especificagao estao aqui incorporados por referenda em sua totalidade na especificagao para a mesma extensao como se cada publicagao individual, patente ou pedido de patente especificamente e individualmente indicaram estar incorporados aqui por referenda.

Claims (9)

1. Polipeptideo, caracterizado pelo fato de que e selecionado do grupo consistindo em hfB3-292S (aminoacidos 1-764 ou 26-764 de SEQ ID NO: 2), hfB3-292SN480 (aminoacidos 1-480 ou 26-480 de SEQ ID NO: 2), and hfB3-292S-Fc (aminoacidos 1-990 ou 26-990 de SEQ ID NO: 22).
2. Acido nucleico, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequencia de nucleotide© que codifica o polipeptideo, como definido na reinvindicação 1.
3. Vetor viral, caracterizado pelo fato de que compreende o acido nucleico, como definido na reinvindicação 2.
4. Preparapao farmaceutica, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptideo, como definido na reinvindicação 1, o acido nucleico, como definido na reinvindicação 2, o vetor viral, como definido na reinvindicação 3, ou qualquer combinapao dos mesmos.
5. Uso do polipeptideo, como definido na reinvindicação 1, o acido nucleico, como definido na reinvindicação 2, o vetor viral, como definido na reinvindicação 3, a preparapao farmaceutica, como definida na reinvindicação 4 ou qualquer combinapao dos mesmos, caracterizado pelo fato de que e na preparapao de um medicamento para tratar uma doenpa mediada por complemento em um paciente, em que o polipeptideo inibe a atividade do complemento.
6. Uso de acordo com a reinvindicação 5, caracterizado pelo fato de que a doenpa mediada por complemento e uma doenpa ocular.
7. Uso de acordo com a reinvindicação 6, caracterizado pelo fato de que o medicamento e formulado para administrapao ocular.
8. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicapbes 5 a 7, caracterizado pelo fato de que a doenpa mediada por complemento e degenerapao macular, degenerapao macular relacionada a idade (AMD), atrofia geografica, AMD umida, infarto do miocardio, AMD seco, formapao de drusas, artrite, acidente vascular cerebral, lesao por reperfusao isquemica, retinopatia diabetica, vitreoretinopatia, lesao de orgao traumatica, inflamapao cornea, neovascularizapao cornea, uveite, hipertensao ocular ou glaucoma.
9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicaçoes 5 a 7, caracterizado pelo fato de que a doenpa mediada por complemento e selecionada do grupo consistindo em ateroesclerose, hiperresponsividade das vias aereas, doenpas relacionadas imunes, doenpas relacionadas autoimunes, nefrite de lupus, lupus eritematoso sistemico (SLE), artrite, doenpas reumatologicas, sindrome de anticorpo antifosfolipideo, lesao intestinal e renal l/R, asma, sindrome hemolftica-uremica atipico, glomerulonefrite membranoproliferativa Tipo II, glomerulonefrite nao proliferativa, perda fetal, lesao cerebral, dano de orgao pos-traumatico, dano de orgao pos infarto, vasculite, angioedema hereditaria, hemoglobinuria paroxismal noturna, acidente cerebrovascular, doenpa de Alzheimer, rejeipao de transplante, infecpoes, sepsis, choque septico, sindrome de Sjogren, miastenia grave, doenpa de pele mediada por anticorpo, diabetes melito Tipo I e Tipo II, sindrome de resistencia a insulina, diabetes gestacional, tireiodite, purpura trombocitopenica idiopatica e anemia hemolitica, neuropatias, esclerose multipla, lesao de circulapao extracorporea, poliarterite nodosa, purpura de Henoch Schonlein, doenpa de soro, a doenpa de Godpasture, vasculite necrosante sistemica, glomerulonefrite pos estreptococico, fibrose pulmonar idiopatica, glomerulonefrite membranoso, sindrome pulmonar de choque agudo, sindrome da angustia respiratoria de adulto, e reperfusao.
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