PL237868B1 - Mutanty punktowe czynnika B oraz białka C2 do zastosowania do wzmacniania aktywności cytotoksycznej przeciwciał w leczeniu chorób nowotworowych - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku są mutanty punktowe ludzkich białek wchodzących w skład konwertaz C3 i C5 układu dopełniacza, dokładniej czynnika B i Białka C2 do zastosowania do wzmacniania aktywności cytotoksycznej przeciwciał w leczeniu chorób nowotworowych.

Wprowadzenie do standardowej terapii przeciwnowotworowej przeciwciał rozpoznającyc h determinanty komórek rakowych przyczyniło się do znacznego wydłużenia czasu przeżycia pacjentów oraz obniżenia tempa progresji nowotworów. Prototypem terapeutycznego przeciwciała antynowotworowego jest rituximab rozpoznający molekułę CD20, stosowany w leczeniu białaczek i chłoniaków.

Rituximab oraz szereg innych przeciwciał dopuszczonych do użytku klinicznego zabija komórki nowotworowe przy współudziale ludzkiego układu odpornościowego. Związanie się przeciwciała do powierzchni komórki nowotworowej aktywuje układ dopełniacza - kaskadę enzymatyczną zlokalizowaną w surowicy krwi, której elementy wskutek aktywacji wbudowują się w błonę komórkową komórki docelowej. Ostatecznym efektem aktywacji układu dopełniacza jest stworzenie porów i liza osmotyczna komórki docelowej. Dodatkowo, opłaszczenie komórki nowotworowej przez składniki dopełniacza ułatwia jej pochłonięcie przez inne komórki układu odpornościowego na drodze fagocytozy.

Jakkolwiek przeciwciała antynowotworowe zrewolucjonizowały leczenie, odpowiedź kliniczna nie dotyczy wszystkich pacjentów, ponadto u części pojawia się oporność na terapię. Jedną z przyczyn oporności na terapeutyki działające za pośrednictwem układu dopełniacza jest nadekspresja inhibitorów tego układu na powierzchni komórek nowotworowych oraz wyczerpanie puli białek dopełniacza zużywanych podczas aktywacji tego układu przez przeciwciała, co skutkuje niewystarczającą ich liczbą przy kolejnych podaniach leku.

Z opisu wynalazku US2011059072 A znany jest sposób otrzymywania i selekcji przeciwciał monoklonalnych za pomocą testu typu ADCC, które to przeciwciała są zdolne do aktywacji receptorów Fcy typu III i mają szczególną strukturę glikanu.

Z opisu wynalazku US2008003646 A znane są ulepszone przeciwciała przeciwko antygenom powierzchni nowotworu i ich zastosowanie w leczeniu nowotworów. Szczególnie interesujące są wysoce stabilne, humanizowane przeciwciała o wysokim powinowactwie do antygenu rakowo-płodowego (CEA), zwłaszcza przeciwciało sm3E, które pochodzi od przeciwciała scFv MFE-23. Takie modyfikacje przeciwciała mogą potencjalnie poprawić skuteczność terapeutyczną.

Przedmiotowy wynalazek proponuje rozwiązanie w postaci suplementacji przeciwciał antynowotworowych zmutowanymi ludzkimi białkami wchodzącymi w skład kompleksów enzymatycznych (konwertaz) odpowiedzialnych za proteolizę białek dopełniacza C3 i C5 do ich aktywnych fragmentów C3b i C5b. Przykładem takich białek są czynnik B budujący konwertazy ścieżki alternatywnej układu dopełniacza oraz białko C2 pełniące analogiczną role w ścieżce klasycznej układu dopełniacza. Odpowiednie mutacje ww. białek to takie, które powodują zniesienie oddziaływania konwertaz z ich inhibitorami, przez co zarówno aktywność jak i czas półtrwania kompleksu enzymatycznego znacznie się wydłuża i zapewnia optymalną dla efektu cytotoksycznego produkcję fragmentów C3b oraz C5b.

Mutanty C2 oraz czynnika B dodane w teście in vitro na komórkach chłoniaka CD20-pozytywnego do ludzkiej surowicy i specyficznego przeciwciała anty-CD20 powodowały całkowitą liżę komórek średnio wrażliwych na działanie przeciwciał anty-CD20. Dodatkowo, mutanty białka C2 powodowały znaczący statystycznie wzrost odsetka śmierci komórek słabo wrażliwych na przeciwciała anty-CD20. Co ważne, wzmożenie efektu cytotoksycznego zarówno w linii średnio- oraz słabo wrażliwej na przeciwciała anty-CD20 nie było możliwe do uzyskania przez zwiększanie stężenia przeciwciał anty-CD20 bez dodatku zmutowanych białek (Fig. 1).

Innymi słowy, suplementacja odpowiednio zmutowanymi białkami C2 i czynnika B wzmaga aktywność cytotoksyczną przeciwciał antynowotworowych działających poprzez układ dopełniacza i jednocześnie uzupełnia pulę zużywalnych składników układu dopełniacza potrzebnych do podtrzymania potencjału cytotoksycznego ludzkiej surowicy.

Mutacje punktowe zapewniające niewrażliwość konwertaz układu dopełniacza na endogenne inhibitory (tzw. mutacje gain of function) takie jak CD55, CD46, CD35, czynnik H a skutkujące zwiększoną aktywnością konwertaz były znane badaczom zjawisk autoimmunologicznych. Mutacje tego typu zlokalizowane w czynniku B zostały określone jako czynnik etiologiczny chorób takich jak glomerulopatie C3 oraz nietypowy zespół hemolityczno-mocznicowy i były w literaturze światowej jednoznacznie kojarzone ze zjawiskami patologicznymi.

PL 237 868 B1

Nowość zaproponowanego rozwiązania polega na zastosowaniu takich potencjalnie patogennych białek jako suplementu immunoterapii znacznie podnoszącego aktywność cytotoksyczną immunoterapeutyków.

Hamowanie konwertaz jest jednym z głównych mechanizmów oporności komórek nowotworowych na terapie wykorzystujące dopełniacz. Badania nad modelowym przeciwdziałaniem mechanizmom oporności nowotworów obejmują wyciszenie ekspresji inhibitorów dopełniacza poprzez transfekcję konstruktami siRNA lub wykorzystanie bispecyficznych przeciwciał rozpoznających determinantę antygenową komórek nowotworowych i jednocześnie blokujących inhibitor dopełniacza (np. CD55).

Wadą i ograniczeniem praktycznym pierwszego rozwiązania jest konieczność precyzyjnego dostarczenia konstruktów siRNA do komórek nowotworowych z uwagi na powszechną ekspresję inhibitorów dopełniacza w ludzkim organizmie. Drugie z wymienionych podejść ogranicza się do jednoczesnego hamowania jedynie jednego, zdeterminowanego przez specyficzność przeciwciała, inhibitora dopełniacza podczas gdy komórki nowotworowe produkują lub przechwytują z otoczenia kilka różnych typów inhibitorów.

Mutanty gain of function zapewniają niewrażliwość konwertaz dopełniacza na więcej niż jeden typ inhibitora a dodatkowo (co wykazano w niniejszych badaniach in vitro) możliwe jest stworzenie wielokrotnego mutanta grupującego cechy fenotypowe kilku pojedynczych mutantów gain of function. Aktywność mutanta wielokrotnego przewyższa aktywność wspomagającą cytotoksyczność immunoterapeutyków pojedynczych mutantów. Ponadto tak skonstruowane białko jest bardziej uniwersalne w stosunku do komórek nowotworowych przejawiających różny wzór ekspresji inhibitorów dopełniacza. Zauważalne wzmożenie aktywności cytotoksycznej przeciwciał in vitro obserwowano przy suplementacji wielokrotnym mutantem gain of function czynnika B w stężeniu odpowiadającym 25% fizjologicznego stężenia tego białka w surowicy (Fig. 2).

C2 jest elementem ścieżki klasycznej, która nie jest aktywowana spontanicznie jak w wypadku ścieżki alternatywnej (w skład której wchodzi czynnik B) ale w odpowiedzi na pojawienie się specyficznego stymulanta, np. przeciwciał antynowotworowych związanych z powierzchnią komórki docelowej. Innymi słowy proces powstawania konwertaz klasycznych z udziałem zmutowanego białka C2 może być kontrolowany poprzez koordynację jego podawania z podaniem immunoterapeutyków. W odróżnieniu od czynnika B na chwilę obecną nie jest znana żadna naturalnie występująca mutacja C2 (ani innego białka typowego dla ścieżki klasycznej dopełniacza) typu gain of function, która została zidentyfikowana jako przyczyna zaburzeń autoimmunologicznych. Inną korzyścią z zastosowania hiperaktywnych mutantów białka C2 jest fizjologiczne stężenie C2 w surowicy wynoszące jedynie 25 gg/ml, co wymagałoby znacznie mniejszej ilości rekombinowanego białka C2 do efektywnej suplementacji niż w przypadku suplementacji czynnikiem B (stężenie fizjologiczne 180 gg/ml).

Zważywszy, iż naturalnie występujące mutanty typu gain of function białka C2 nie są znane ale białka C2 oraz czynnik B wykazują między sobą znaczny stopień homologii, zostały w niniejszym wynalazku stworzone mutanty C2 odpowiadające sekwencji zmutowanych, hiperaktywnych wariantów czynnika B. Pojedyncze oraz wielokrotne mutanty gain of function białka C2 wykazywały analogicznie do zmutowanego czynnika B istotne wzmożenie aktywności cytotoksycznej przeciwciał anty-CD20 (Fig. 3).

Suplementacja takimi mutantami jest postulowaną przez twórców niniejszego wynalazku metodą przeciwdziałania oporności komórek nowotworowych na immunoterapeutyki spowodowaną nadekspresją inhibitorów układu dopełniacza.

Mutanty można podawać jako suplement, albo w postaci farmaceutycznie dopuszczalnej wraz z przeciwciałami dopuszczonymi do użytku klinicznego w terapii przeciwnowotworowej. W takich farmaceutycznych i leczniczych kompozycjach, mutanty są korzystnie stosowane łącznie z jednym albo większą liczbą dopuszczalnych farmaceutycznie nośników i ewentualnie z innymi składnikami leczniczymi. Nośniki muszą być dopuszczalne farmaceutycznie w tym znaczeniu, że pozostają zgodne z innymi składnikami kompozycji i nie są nadmiernie szkodliwe dla ich biorcy. Mutanty są dostarczane w ilości skutecznej dla osiągnięcia pożądanego efektu farmakologicznego, jak opisano powyżej w przykładach. Kompozycje obejmują takie, które są odpowiednie do podawania pozajelitowego, jak i nie-pozajelitowego, a konkretne sposoby podawania obejmują podawanie dożylne.

Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie suplementacji odpowiednio zmutowanymi białkami C2 i/lub czynnika B, która wzmaga aktywność cytotoksyczną przeciwciał antynowotworowych i mogłaby być zastosowana do standardowej terapii przeciwnowotworowej przeciwciałami.

PL 237 868 B1

Istotą wynalazku są mutanty punktowe czynnika B o SEQ. ID 1 wybrane z grupy: D279G, F286L, K323E, Y363A, D279G_ F286L_ K323E_ Y363A - mutant czterokrotny lub mutanty punktowe białka C2 o SEQ.ID 2 wybrane z grupy: C261A, Q.263G, Y347A, L348A; T442Q, podwójne mutanty

C261A_Q263G oraz Y347A_Q263G, potrójny mutant Y347A_Q263G_T442Q do zastosowania do wzmacniania aktywności cytotoksycznej przeciwciał w leczeniu chorób nowotworowych.

Określenia stosowane powyżej oraz w opisie i zastrzeżeniach patentowych, mają następujące znaczenie:

Mutanty typu gain-of-function - oznacza mutacje w białkach budujących konwertazy alternatywne i klasyczne układu dopełniacza, które skutkują większą aktywnością konwertaz i/lub ich dłuższym czasem półtrwania.

Konwertazy - oznacza kompleks enzymatyczny powstający podczas aktywacji kaskady dopełniacza, zbudowany z fragmentów białek C3 i czynnika B, odpowiednio C3bBb (alternatywna konwertaza C3), C3bBbC3b (alternatywna konwertaza C5) lub z fragmentów białek C2, C4 i C3, odpowiednio C4b2a (klasyczna konwertaza C3) i C4b2aC3b (klasyczna konwertaza C5).

Suplementacja - oznacza uzupełnienie terapii przeciwnowotworowej przeciwciałami rozpoznającymi determinanty antygenowe komórek rakowych.

Czynnik wspomagający / suplement tożsamy z suplementacją.

Układ dopełniacza - grupa białek obecnych w surowicy krwi, tworzących kaskadę enzymatyczno-proteolityczną skutkującą powstaniem kompleksu atakującego błonę. Opis układu dopełniacza i jego poszczególnych białek można znaleźć w danych literaturowych, przykładowo w „The Complement FactsBook pod red. Scott Barnum Theresa Schein, wyd. 2, 2017, Academic Press.

Opis figur:

Fig. 1 - przedstawia efekt cytotoksyczny przeciwciał anty-CD20 w zależności od dawki przeciwciał.

Fig. 2 - przedstawia efekt cytotoksyczny przeciwciał anty-CD20 po suplementacji surowicy rekombinowanymi mutantami gain of function czynnika B. Symbolem NHS oznaczono surowicę bez dodatku czynnika B, symbolem WT (wild-type) oznaczono wynik dla suplementacji dzikim (niezmutowanym) typem (ang. wild-type) i do wysokości tego słupka (przerywana linia) odnoszono obliczenia różnic istotnie statystycznych. Oznaczenia mutantów czynnika B odnoszą się do pozycji danego aminokwasu w natywnym białku (numeracja obejmuje sekwencję sygnałową) oraz zmian konkretnego aminokwasu naturalnie występującego w danej pozycji (litera przed numerem pozycji aminokwasu wyrażona przy pomocy tzw. kodu jednoliterowego) na aminokwas będący wynikiem mutacji (litera po numerze pozycji wyrażona przy pomocy tzw. kodu jednoliterowego). Oznaczenie 4x odpowiada czterokrotnemu mutantowi grupującemu mutacje D279G, F286L, K323E i Y363A. Test ANOVA z posttestem Dunnett-a wykazał istotność statystyczną dla suplementacji czterokrotnym mutantem gain of function czynnika B w przypadku komórek Raji na poziomie istotności p<0,05 (*).

Fig. 3A - przedstawia efekt cytotoksyczny przeciwciał anty-CD20 po suplementacji surowicy (w stężeniu optymalnym dla uwidocznienia efektu cytotoksycznego przeciwciał w danej linii komórkowej - odpowiednio 10% dla komórek Raji oraz 20% dla komórek Namalwa) rekombinowanymi mutantami gain of function białka C2. Oznaczenia na wykresie analogicznie jak w przypadku figury nr 2. Istotność statystyczna według test ANOVA z posttestem Dunnett-a na poziomie p < 0,001 oznaczona jest na wykresie symbolem *** natomiast istotność na poziomie p < 0,05 symbolem*.

Fig. 3B - przedstawia całościowe wyniki doświadczenia obejmujące dwa niższe, suboptymalne stężenia surowicy, dla których badano efekt cytotoksyczny przeciwciał anty-CD20 w danej linii komórkowej. Fig. 4 - przedstawia wyniki dodatkowego doświadczenia, w którym porównywano efekt mutantów pojedynczych ((Y347A, Q263G, T442Q), podwójnego (Q263G_Y347A) oraz potrójnego (Q263G_Y347A_T442Q) na komórkach Namalwa w optymalnym stężeniu surowicy (20%, Fig. 4A) oraz przy dodatkowo dwóch suboptymalnych stężeniach surowicy (Fig. 4B). Oznaczenia na wykresach analogicznie jak w figurach 2 oraz 3. Istotność statystyczna według test ANOVA z posttestem Dunnett-a na poziomie p < 0,001 oznaczona jest na wykresie symbolem *** natomiast istotność na poziomie p < 0,01 symbolem**.

Seq. 1 - oznacza sekwencję czynnika B z sekwencją sygnałową (kod aminokwasowy jednoliterowy). Seq. 2 - oznacza sekwencję białka C2 z sekwencją sygnałową (kod aminokwasowy jednoliterowy). Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania, niestanowiące jego ograniczenia.

PL 237 868 B1

P r z y k ł a d 1

Opis metodyki

Sekwencje referencyjne cDNA białek C2 (accession number NM_000063.5) oraz czynnika B (accession number NM_001710) zawierające dodatkowo na końcu 3' kodony dla sześciu reszt histydyny zostały zoptymalizowane pod względem zawartości par GC, obecności niekorzystnych struktur drugorzędowych oraz tzw. rzadkich kodonów (ang. rare codons) poprzez algorytm firmy ThermoFisher Scientific. Zoptymalizowane sekwencje następnie zsyntetyzowano de novo oraz wklonowano do plazmidu ekspresyjnego pCEP4. Konstrukty zostały ponownie zweryfikowane przy pomocy sekwencjonowania DNA. Sprawdzone pod kątem poprawności sekwencji plazmidy wtransformowano do bakterii E. coli szczepu DH5a, z których oczyszczono plazmidowe DNA przy pomocy zestawu MidiPrep Kit (Qiagen) w ilościach potrzebnych do transfekcji komórek eukariotycznych. Przy pomocy 30 μg plazmidowego DNA oraz odczynnika Freestyle Max (ThermoFisher) dokonano transfekcji komórek HEK 293 Freestyle. Komórki hodowano przez 7 dni w pożywce Freestyle 293 Expression Medium (ThermoFisher), przy czym pożywkę zbierano drugiego, czwartego, siódmego dnia po transfekcji, uzupełniając świeżą pożywką. Zebrane medium przechowywano w temperaturze -80°C do etapu oczyszczania białek przy pomocy chromatografii afinitywnej. Do tego celu użyto kolumn, HisTrap FF crude (GE Healthcare). Przemywanie i równoważenie kolumny prowadzono w buforze 20 mM Tris-HCI pH 8,0 z dodatkiem 10 mM imidazolu. Elucja była prowadzona przy użyciu 0,7 M imidazolu w tym samym buforze. Frakcje eluatu zawierające białko połączono, przedializowano na bufor PBS a następnie zagęszczono przy użyciu koncentratora Vivaspin mwco. 10 kDa (Millipore). Na bazie zoptymalizowanej matrycy cDNA utworzono cDNA pojedynczych mutantów czynnika B, kolejno D279G, F286L, K323E, Y363A oraz mutanta wielokrotnego zawierającego wszystkie ww. substytucje (4X), przy czym nie uzyskano ekspresji mutanta F286L. Analogicznie wyprodukowano mutanty białka C2 dopełniacza, odpowiednio R243C, C261A, Q263G,

S307E, Y347A, L348A, T442Q a także podwójne mutanty C261A_Q263G oraz Y347A_ Q263G oraz potrójnego mutanta Y347A_ Q263G_T442Q.

Do doświadczeń zostały użyte linie ludzkich komórek chłoniaka Raji oraz Namalwa eksprymujące marker CD20 na swojej powierzchni. Komórki Raji inkubowane w obecności ludzkiej surowicy cechują się średnią wrażliwością na przeciwciała anty- CD20, maksymalny możliwy do osiągnięcia poziom lizy komórek oscyluje w granicach 50%. Komórki Namalwa cechuje znikoma wrażliwość na przeciwciała anty-CD20 z uwagi na bardziej niekorzystny w stosunku do komórek Raji stosunek ilości molekuł CD20 do ilości powierzchniowych inhibitorów układu dopełniacza takich jak CD46, CD55 i CD59. W zależności od doświadczenia poziom lizy komórek Namalwa w obecności surowicy i przeciwciał anty-CD20 zawierał się w granicach 10-20%. Wpływ rekombinowanego czynnika B oraz białka C2 układu dopełniacza na aktywność antynowotworową przeciwciał anty-CD20 została przebadany w teście cytotoksycznym in vitro. Komórki zawieszone w pożywce RPMI z dodatkiem 10% surowicy bydlęcej inkubowano z 1 mM pochodną kalceiny (calcein-AM), która jest aktywnie pobierana przez żywe komórki i metabolizowana do fluorescencyjnej pochodnej. Inkubacja została przeprowadzona w temperaturze 37°C w środowisku 5% CO2 przez 30 minut.

Następnie komórki przepłukano trzykrotnie buforem PBS, zawieszono w buforze PBS suplementowanym 1 mM CaCl2 i MgCl2 i dodano w ilości 100.000 na dołek płytki wielodokłowej V-kształtnej. Po odwirowaniu i usunięciu supernatantu pellet komórkowy zawieszono w ludzkiej surowicy z dodatkiem przeciwciała anty-CD20 (ofatumumab) w standardowym stężeniu 50 μg/ml. Dla komórek Raji stosowano 10% surowicę jako stężenie do optymalnego uwidocznienia efektu cytotoksycznego przeciwciał anty-CD20, dla komórek Namalwa analogiczne stężenie zwiększono do 20%. Końcowa objętość reakcji wynosiła 50 μg/ml. Komórki inkubowano z surowicą i przeciwciałami anty-CD20 przez 30 minut w termimikserze (Eppendorf) w temperaturze 37°C i przy wytrząsaniu 650 rpm. Po zakończonej inkubacji dodano kolejne 50 μl buforu PBS po czym płytkę z komórkami wirowano przy prędkości 1000 x G przez 2 minuty. 80 μl supernatantu przenoszono do dołków 96-dołkowej płytki płaskodennej i mierzono fluorescencję pobranych supernatantów przy długości fali wzbudzenia / emisji odpowiednio 485 oraz 515 nm. Intensywność fluorescencji była wprost proporcjonalna do ilości fluorescencyjnej pochodnej uwolnionej z komórek wskutek lizy wywołanej przez układ dopełniacza zawarty w surowicy. Komórki inkubowane z surowicą inaktywowaną termicznie (56°C, 30 min) i pozbawioną w ten sposób aktywności dopełniacza traktowano jako kontrolę negatywną czyli lizę niezależną od działania układu dopełniacza.

W pierwszym doświadczeniu wykazano, iż zwiększanie dawki przeciwciał anty- CD20 przy stałym stężeniu surowicy nie podwyższa w sposób znaczący statystycznie odsetka zabitych komórek (Fig. 1).

PL 237 868 B1

Słupek oznaczony symbolem Δ 500 obrazuje efekt dla maksymalnego stężenia przeciwciał (500 μg/ml) i surowicy inaktywowanej termicznie. Jego wysokość obrazuje poziom lizy komórek nowotworowych niezależnej od układu dopełniacza. Test statystyczny ANOVA z posttestem Dunnett-a nie wykazał istotnych statystycznie różnic między stężeniem 50 μg/ml a stężeniami wyższymi.

W przeciwieństwie do zwiększania stężenia przeciwciał podwyższenie efektu cytotoksycznego było możliwe po suplementacji surowicy (NHS) mutantami typu gain of function czynnika B (Fig. 2) oraz analogicznymi mutantami białka C2 dopełniacza (Fig. 3). Stężenie użytych do suplementacji mutantów było równe stężeniu fizjologicznemu białek w surowicy o danym stężeniu. Dla 10% surowicy wynosiły one odpowiednio 2,5 μg/ml C2 i 20 μg/ml czynnika B oraz 5 μg /ml białka C2 dla surowicy 20%.

W przypadku białka C2 stworzono panel pojedynczych mutantów gain of function, dwa mutanty podwójne i jednego mutanta potrójnego. Najlepsze efekty (istotne statystycznie zwiększenie odsetka lizy komórek) w doświadczeniach na komórkach Raji uzyskano dla mutanta Y347A_Q263G - test ANOVA z posttestem Dunnett-a wykazał istotność na poziomie p <0,001 w przypadku komórek Raji. Na podobnym poziomie plasował się pojedynczy mutant Y347A. Należy jednak nadmienić, iż zauważalny efekt podwójnego mutanta Y347A_Q263G wzmacniający cytotoksyczność przeciwciał anty-CD20 występował już w suboptymalnym stężeniu surowicy 5% (Fig. 3B). W przypadku komórek Namalwa istotnie statystycznie różnice względem suplementacji wariantem dzikim białka C2 wykazywały mutanty Q263G, T442Q, Y347A, C261A_Q263G, Y347A_Q263G oraz Y347A_Q263G_T442Q (osobne doświadczenie przedstawione w Fig. 4). Mutant R243C był traktowany jako kontrola negatywna z uwagi na charakter mutacji zaburzający strukturę a co za tym idzie, funkcję białka C2. Mutanty podwójne, których skuteczność na linii Namalwa wykazano zauważalnie przy stężeniu surowicy 20% zauważalne wzmacniały efekt cytotoksyczny również przy suboptymalnym stężeniu surowicy 10% (Fig. 3B). Otrzymany wynik sugeruje, iż mutanty wielokrotne działają wydajniej w warunkach niedoboru pozostałych białek dopełniacza, co może odzwierciedlać sytuację in vivo, w której pula dopełniacza jest uszczuplona wskutek wcześniejszych rund immunoterapii lub pierwotnym tudzież wtórnym niedoborem odporności.

W odrębnym doświadczeniu na komórkach Namalwa porównano efekt cytotoksyczny przeciwciał anty-CD20 przy suplementacji mutantami białka C2 pojedynczymi (Y347A, Q263G, T442Q), podwójnym (Q263G_Y347A) oraz potrójnym (Q263G_Y347A_T442Q) (Fig. 4). Doświadczenie miało na celu wykazanie, iż kumulacja pojedynczych mutacji typu gain of function białka C2 w jednym konstrukcje białkowym nie prowadzi do utraty aktywności białka C2 natomiast może powodować efekt addytywny przejawiający się zarówno wyższą cytotoksycznością przeciwciał przy optymalnym stężeniu surowicy jak i znacznie wyższym odsetkiem zabitych komórek przy suboptymalnym stężeniu surowicy w porównaniu z wynikami uzyskanymi w analogicznych warunkach dla mutantów pojedynczych. Takie działanie jest pożądane z praktycznego punktu widzenia gdyż zapewnia znacznie korzystniejszy efekt suplementacji.

Podsumowanie wyników:

Wykazano, iż niektóre mutacje typu gain of function w białkach C2 oraz czynniku B mogą znacząco podwyższać aktywność cytotoksyczną przeciwciał anty-CD20 takich jak np. ofatumumab. Analogicznego efektu suplementacji ww. mutantami należy spodziewać się dla innych znanych z literatury przeciwciał antynowotworowych (np. rituximab, alemtuzumab) działających za pośrednictwem układu dopełniacza. Wykazano natomiast, iż podobnego efektu nie można odtworzyć zwiększając dawkę samych przeciwciał. Kumulacja wielu mutacji punktowych w jednym białku może przynieść skumulowany efekt, jak w przypadku czterokrotnego mutanta D279G_F286L_K323E_ Y363A czynnika B lub mutantów Y347A_Q263G, C261A_Q263G, Y347A_Q263G_T442Q białka C2. Jako element nowości podkreślamy zastosowanie takich mutantów jako uniwersalnego wspomagacza (suplementu) immunoterapii przeciwciałami antynowotworowymi.

Literatura:

1. Stasilojc G, Osterborg A, Blom AM, Okroj M. New perspectives on complement mediated immunotherapy. Cancer Treat Rev 2016; 45:68-75.

2. Urban A, Borowska A, Felberg A, van den Heuvel L, Stasilojc G, Volokhina E, et al. Gain of function mutant of complement factor B K323E mimics pathogenic C3NeF autoantibodies in convertase assays. Autoimmunity 2018; 51:18-24.

3. Fishelson Z, Donin N, Zell S, Schultz S, Kirschfink M. Obstacles to cancer immunotherapy: expression of membrane complement regulatory proteins (mCRPs) in tumors. Mol Immunol 2003; 40:109-23.

PL 237 868 Β1

4. Mamidi S, Hone S, Teufel C, Sellner L, Zenz T, Kirschfink M. Neutralization of membranę complement regulators improves complement-dependent effector functions of therapeutic anticancer antibodies targeting leukemie cells. Oncoimmunology 2015; 4:e979688.

5. Macor P, Secco E, Mezzaroba N, Żorżet S, Durigutto P, Gaiotto T, et al. Bispecific antibodies targeting tumor-associated antigens and neutralizing complement regulators inerease the efficacy of antibody-based immunotherapy in mice. Leukemia 2015; 29:406-14.

6. Okrój M, Eriksson I, Osterborg A, Blom AM. Killing of CLL and NHL cells by rituximab and ofatumumab under limited availability of complement. Med Oncol 2013; 30:759.

Seq.l mgsnlspglc Impfilglls ggvtttpwsl arpggscsle gveikggsfr llqegqaley 61 vcpsgfypyp vqtrtcrstg swstlktqdq ktvrkaecra ihcprphdfe ngeywprspy 121 ynvsdeisfh cydgytlrgs anrtcqvngr wsgqtaicdn gagycsnpgi pigtrkvgsq 181 yrledsvtyh csrgltlrgs qrrtcqeggs wsgtepscgd sfmydtpqev aeaflsslte 241 tiegvdaedg hgpgeqqkrk ivldpsgsmn iylvldgsds igasnftgak kclvnliekv 301 asygvkpryg lvtyatypki wvkvseadss nadwvtkqln einyedhklk sgtntkkalq 361 avysmmswpd dvppegwnrt rhviilmtdg Ihnmggdpit videirdlly igkdrknpre 421 dyldvyvfgv gplvnqvnin alaskkdneg hvfkvkdmen ledvfyqmid esqslslcgm 4 81 vwehrkgtdy hkqpwqakis virpskghes cmgawseyf vltaahcftv ddkehsikvs 541 vggekrdlei ewlfhpnyn ingkkeagip efydydvali klknklkygq tirpiclpct 601 egttralrlp ptttcqqqke ellpagdika lfvseeekkl trkevyikng dkkgscerda 661 qyapgydkvk disewtprf lctggvspya dpntcrgdsg gplivhkrsr fiqvgviswg 721 vvdvcknqkr qkqvpahard fhinlfqvlp wlkeklgded Igfl

Seq.2 mgplmvlfcl Iflypglads apscpqnvni sggtftlshg wapgslltys cpgglypspa 61 srlckssgąw qtpgatrsls kavckpvrcp apvsfengiy tprlgsypvg gnvsfecedg 121 filrgspvrq crpngmwdge tavcdngagh cpnpgislga vrtgfrfghg dkvryrcssn 181 lvltgssere cqgngvwsgt epicrgpysy dfpedvapal gtsfshmlga tnptgktkes 241 lgrkiqiqrs ghlnlyllld csqsvsendf lifkesaslm vdrifsfein vsvaiitfas 301 epkvlmsvln. dnsrdmtevi sslenanykd hengtgtnty aalnsvylmm nnqmrllgme 361 tmawgeirha iilltdgksn mggspktavd hireilninq krndyldiya igvgkldvdw 421 relnelgskk dgerhafilq dtkalhqvfe hmldvskltd ticgvgnmsa nasdgertpw 481 hvtikpksqe tcrgalisdg wvltaahcfr dgndhslwrv nvgdpksqwg kefliekavi 541 spgfdvfakk nqgilefygd diallklagk vkmstharpi clpctmeanl alrrpqgstc 601 rdhenellnk qsvpahfval ngsklninlk mgvewtscae vvsqektmfp nltdvrevvt 661 dqflcsgtqe despckgesg gavflerrfr ffqvglvswg lynpclgsad knsrkraprs 721 kvppprdfhi nlfrmgpwlr qhlgdvlnfl pl

Claims (1)

1. Mutanty punktowe czynnika B o SEQ. ID 1 wybrane z grupy: D279G, F286L, K323E, Y363A, D279G_ F286L_ K323E_ Y363A - mutant czterokrotny lub mutanty punktowe białka C2 oSEO.ID 2 wybrane z grupy: C261A, O263G, Y347A, L348A; T442O, podwójne mutanty C261 A_Q263G oraz Y347A_Q263G, potrójny mutant Y347A_Q263G_T442Q do zastosowania do wzmacniania aktywności cytotoksycznej przeciwciał w leczeniu chorób nowotworowych.