JP7275095B2 - 補体関連障害を処置するための組成物、方法およびキット - Google Patents

補体関連障害を処置するための組成物、方法およびキット Download PDF

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Description

関連出願
この出願は、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｋｉｔｓ ｆｏ
ｒ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｒｅｌａｔｅｄ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」
との表題の２０１４年８月２８日に出願された連続番号６２／０４３，０８４を有する仮
出願（発明者Ｒａｊｅｎｄｒａ Ｋｕｍａｒ－Ｓｉｎｇｈ、Ｄｅｒｅｋ Ｌｅａｄｅｒｅ
ｒおよびＳｉｏｂｈａｎ Ｃａｓｈｍａｎ）の利益を主張する。この仮出願は、その全体
が参考として本明細書に援用される。
技術分野
本発明は一般に、補体関連障害を処置するための組成物および方法に関する。
政府の支援
この発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ／ＮＥＩに
よって付与された助成金ＥＹ０２１８０５およびＥＹ０１３８３７の下、政府の支援を受
けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
補体系は、侵入する病原体を不活化し、組織恒常性を維持することを担う、先天免疫系
の体液性成分である（Ｔｈｕｒｍａｎ， Ｊ．Ｍ．ら、２０１１年 Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓ
ｔ ９１巻：４～１１頁）。補体系は強力であり、したがって、補体の種々の可溶性阻害
剤および膜結合型阻害剤によって厳重に調節される（Ｔｈｕｒｍａｎ， Ｊ．Ｍ．ら、２
０１１年 Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ ９１巻：４～１１頁、Ｚｉｐｆｅｌ， Ｐ．Ｆ．ら、
２００９年 Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９巻：７２９～７４０頁）。補体の不適
切な活性化は、自己免疫性、炎症性、血液学的、神経変性、がん、虚血／再灌流傷害、臓
器移植および敗血症を含む、広範な種々の遺伝性および後天性疾患と関連付けられてきた
（Ｚｉｐｆｅｌ， Ｐ．Ｆ．ら、２００９年 Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９巻：
７２９～７４０頁、Ｍａｋｒｉｄｅｓ， Ｓ．Ｃ． １９９８年 Ｐｈａｒｍａｃｏｌ
Ｒｅｖ ５０巻：５９～８７頁、Ｈｏｌｅｒｓ， Ｖ．Ｍ． ２００８年 Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ Ｒｅｖ ２２３巻：３００～３１６頁）。医療用インプラント、血液透析フィルター
および遺伝子送達系などの生体材料中に存在する外来表面もまた、補体の活性化を誘発す
る（Ｍａｋｒｉｄｅｓ， Ｓ．Ｃ． １９９８年 Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖ ５０巻
：５９～８７頁）。
補体の急性活性化は、敗血症または移植片拒絶などの疾患において生じる。しかし、補
体の活性化と関連する障害の大部分は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、発作性夜間ヘモグロビ
ン尿症または関節リウマチなど、慢性である（Ｚｉｐｆｅｌ， Ｐ．Ｆ．ら、２００９年
Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９巻：７２９～７４０頁）。補体が関与する慢性疾
患の一部分は、補体の調節因子における欠損によって引き起こされる（Ｚｉｐｆｅｌ，
Ｐ．Ｆ．ら、２００９年 Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９巻：７２９～７４０頁）
。補体調節因子における欠損は、主に第二経路のものであり、遺伝性血管浮腫または全身
性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などでは、古典的経路がこれに関与し得る（Ｍａｙｉｌｙ
ａｎ， Ｋ．Ｒ． ２０１２年 Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ ３巻：４８７～４９６頁）
。
補体の活性化は、細胞膜を破壊し、引き続いて細胞を溶解させる孔である細胞膜傷害複
合体（ＭＡＣ）の形成をもたらす（Ｗａｌｐｏｒｔ， Ｍ．Ｊ． ２００１年 Ｎ Ｅｎ
ｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４４巻：１０５８～１０６６頁）。補体調節因子における多型性ま
たは変異とカップリングされたＭＡＣの上昇したレベルが、ＡＭＤなどの慢性疾患を有す
る患者において見出され、このことは、補体活性化における種々のチェックポイントにお
ける不全が疾患病因と関連することを示している（Ｍｕｌｌｉｎｓ， Ｒ．Ｆ．ら、２０
１１年 Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ ９３巻：５６５～５６７頁）。ＡＭＤを有する個体の
場合、ＭＡＣを形成する低減された能力を有する個体は、顕著な合併症なしに疾患病因か
ら部分的に防御され、このことは、慢性障害に対する、補体活性化の長期減弱が、ＡＭＤ
および他の補体関連の障害、例えば関節リウマチの処置のための実行可能なアプローチで
あり得るという前提を支持している（Ｎｉｓｈｉｇｕｃｈｉ， Ｋ．Ｍ．ら、２０１２年
Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ５３巻：５０８～５１２頁、
Ｐｉｃｃｏｌｉ， Ａ．Ｋ．ら、２０１１年 Ｒｅｖ Ｂｒａｓ Ｒｅｕｍａｔｏｌ ５
１巻：５０３～５１０頁）。
本願の出願の時点では、患者にとって利用可能な、補体のＦＤＡ認可された阻害剤は、
僅かしか存在していない（Ｒｉｃｋｌｉｎ， Ｄ．およびＬａｍｂｒｉｓ， Ｊ．Ｄ．
２０１３年 Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９０巻：３８３９～３８４７頁）。ＡＭＤなどの慢
性障害に関して、これらの治療剤の一部は、眼への補体阻害剤の反復注射を必要とし、こ
れは、顕著な副作用と関連する送達様式である（Ｗｕ， Ｌ．ら、２００８年 Ｇｒａｅ
ｆｅｓ Ａｒｃｈ Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２４６巻：８１～８７頁
、Ｓｈｉｍａ， Ｃ．ら、２００８年 Ａｃｔａ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ８６巻：３７
２～３７６頁）。
Ｒｉｃｋｌｉｎ，Ｄ．およびＬａｍｂｒｉｓ，Ｊ．Ｄ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１３年）１９０巻：３８３９～３８４７頁 Ｗｕ，Ｌ．ら、Ｇｒａｅｆｅｓ Ａｒｃｈ Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ（２００８年）２４６巻：８１～８７頁 Ｓｈｉｍａ，Ｃ．ら、Ａｃｔａ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ（２００８年）８６巻：３７２～３７６頁
ＡＭＤおよび肝臓障害などの補体疾患を処置するための、補体の阻害剤が必要とされて
いる。
本発明の一態様は、組換えキメラタンパク質が、古典的補体経路および第二補体経路を
負にモジュレートするように、ＣＤ４６タンパク質、ＣＤ５５タンパク質およびＣＤ５９
タンパク質の少なくとも２つ由来のアミノ酸配列を有する組換えキメラタンパク質、また
は組換えキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、被験体において補体関
連状態を処置するための医薬組成物を提供する。この組成物の一実施形態では、組換えキ
メラタンパク質は、可溶性活性補体ターミネーターである。この組成物の一実施形態では
、変異が、置換、欠失および付加の少なくとも１つであるように、ＣＤ５９タンパク質の
アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、グリコシルホスファチジルイノシトール
（ＧＰＩ）アンカリングドメインの機能喪失を付与する少なくとも１つの変異を含む。こ
の組成物の一実施形態では、変異が、置換、欠失および付加の少なくとも１つであるよう
に、ＣＤ５５タンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、グリコシルホ
スファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカリングドメインの機能喪失を付与する少なく
とも１つの変異を含む。この組成物の一実施形態では、変異が、置換、欠失および付加の
少なくとも１つを含むように、ＣＤ４６タンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオ
チド配列は、膜貫通ドメインの機能喪失を付与する少なくとも１つの変異を含む。一部の
実施形態では、この組成物は、補体関連状態について被験体を処置するのに有効な用量で
製剤化される。一部の実施形態では、ＣＤ５９タンパク質のアミノ酸配列は、分泌シグナ
ルペプチドを含む。
この組成物の一部の実施形態では、タンパク質は、ＣＤ５９タンパク質およびＣＤ４６
タンパク質のアミノ酸配列；ＣＤ４６タンパク質およびＣＤ５５タンパク質のアミノ酸配
列；ならびにＣＤ５５タンパク質およびＣＤ５９タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも
１つを接続するリンカーをさらに含む。この組成物の別の実施形態では、ヌクレオチド配
列は、少なくとも１つのアミノ酸、例えばグリシン、セリンまたはアラニンを含むリンカ
ーをさらにコードする。この組成物の一実施形態では、ＣＤ４６、ＣＤ５５およびＣＤ５
９タンパク質のアミノ酸配列は、これらのタンパク質の発現が作動可能に連結した転写融
合物および発現と同じリーディングフレームでタンパク質融合物をコードする核酸によっ
てコードされる。
この組成物の一実施形態では、ＣＤ４６タンパク質アミノ酸配列は、ショートコンセン
サスリピートドメインおよびセリン／スレオニン／プロリンリッチドメインの少なくとも
１つを含む、またはＣＤ４６タンパク質アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、
膜貫通ドメインの喪失を生じる少なくとも１つの変異、例えば、置換、欠失もしくは付加
を含む、またはＣＤ５５タンパク質アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、ＣＤ
５５タンパク質のグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカリングドメイ
ンの機能喪失を生じる少なくとも１つの変異を含み、この変異は、置換、欠失もしくは付
加を含む、またはＣＤ５５タンパク質アミノ酸配列は、ショートコンセンサスリピートド
メインおよびセリン／スレオニン／プロリンリッチドメインの少なくとも１つを含む。
この組成物の一実施形態では、組換えキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列
は、プラスミドを構成する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ウイルスベクタ
ーを構成する。この組成物の一実施形態では、ベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴
ウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびレンチウイルスの群より選択され
る少なくとも１つである。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ベータアクチン、
例えばニワトリベータアクチン、ペリフェリン／ＲＤＳ、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ
およびロドプシンからなる群より選択される遺伝子由来のプロモーターを含む。この組成
物の一部の実施形態は、細胞または組織を標的化するように作出（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）さ
れた送達ビヒクルをさらに含み、この送達ビヒクルは、リポソーム、脂質、ポリカチオン
、ペプチド、ナノ粒子、金粒子およびポリマーの群より選択される。この組成物の一実施
形態は、薬学的に許容される塩または軟化薬の少なくとも１つをさらに含む。この組成物
の一実施形態は、抗腫瘍剤、抗凝固剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗マイコバクテリア剤、
抗真菌剤、抗増殖剤および抗アポトーシス剤からなる群より選択される薬剤をさらに含む
。
本発明の一態様は、被験体において補体関連状態を処置する方法であって、ヌクレオチ
ド配列が、ＣＤ５９タンパク質、ＣＤ４６タンパク質およびＣＤ５５タンパク質の各々の
アミノ酸配列をコードするように、または組成物が、ＣＤ４６タンパク質、ＣＤ５５タン
パク質、ＣＤ５９タンパク質もしくは組換えキメラタンパク質をコードするヌクレオチド
配列を保有するベクターを含むように、被験体の細胞を、細胞において組換えキメラタン
パク質の発現を引き起こすプロモーター配列に作動可能に連結したＣＤ４６タンパク質、
ＣＤ５５タンパク質およびＣＤ５９タンパク質または組換えキメラタンパク質を含む組成
物と接触させるステップ；被験体における補体関連状態の症状を測定するステップ；被験
体の症状を、接触させるステップの前の症状と比較するステップ；ならびに被験体におけ
る補体関連状態の症状における減少を測定するステップを含み、それによって補体関連状
態を処置する方法を提供する。この方法の一実施形態では、組換えキメラタンパク質は、
可溶性活性補体ターミネーターである。
この方法の一実施形態では、測定するステップは、補体経路のタンパク質の量および細
胞膜傷害複合体の量の少なくとも１つを測定するステップを含む。一実施形態では、細胞
が、筋肉、上皮、内皮および脈管から選択されるように、または細胞が、眼、心臓、腎臓
、甲状腺、脳、胃、肺、肝臓、膵臓および脈管系の少なくとも１つにおける組織から選択
されるように、細胞膜傷害複合体を測定するステップは、細胞における細胞膜傷害複合体
の量を分析するステップを含む。これらの方法の実施形態では、状態は、黄斑変性、加齢
黄斑変性、炎症性腸疾患、甲状腺炎、クリオグロブリン血症（ｃｒｙｏｇｌｏｂｕｌｉｎ
ａｅｍｉａ）、胎児消失（ｆｅｔａｌ ｌｏｓｓ）、臓器グラフト拒絶（ｏｒｇａｎ ｇ
ｒａｆｔ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）、敗血症、ウイルス感染症、真菌感染症、細菌感染症、
トキシックショック症候群（ＴＳＳ）、膜性増殖性糸球体腎炎、デンスデポジット病（ｄ
ｅｎｓｅ ｄｅｐｏｓｉｔ ｄｉｓｅａｓｅ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ｐｅｒｏ
ｘｉｍａｌ ｎｏｃｔｕｒｎａｌ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｕｒｅａ）、ループス腎炎、膜
性腎炎（ｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、免疫グロブリンＡ腎症、グッド
パスチャー症候群、連鎖球菌感染後糸球体腎炎（ｐｏｓｔ－ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ
ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、全身性エリテマトーデス、非典型溶血性尿
毒症症候群、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏ
ｍａｔｏｓｉｓ）、ループス関節炎（ｌｕｐｕｓ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、関節リウマチ
、シェーグレン症候群、ベーチェット症候群、全身性硬化症、アルツハイマー病、多発性
硬化症、重症筋無力症、ギラン・バレー症候群、大脳ループス（ｃｅｒｅｂｒａｌ ｌｕ
ｐｕｓ）、脳卒中、成人呼吸促迫症候群、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、溶血性貧血
、発作性寒冷ヘモグロビン尿症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、血管炎、天疱瘡、水疱性
類天疱瘡、光毒性反応（ｐｈｏｔｏｔｏｘｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、乾癬、アナフィラ
キシーショック、アレルギー、喘息、心筋梗塞、糖尿病性網膜症、微小脈管障害（ｍｉｃ
ｒｏｖａｓｃｕｌｏｐａｔｈｙ）、皮膚筋炎、Ｂ細胞リンパ増殖性障害、脱髄疾患、急性
腎臓傷害、ＣＯＰＤ、Ｒｈ疾患（Ｒｈ ｄｉｓｅａｓｅ）、免疫性溶血性貧血、免疫性血
小板減少性紫斑病、補体関連糸球体症およびアテローム動脈硬化症の群より選択される。
この方法の一部の実施形態では、細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏまた
はｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕで接触させる。一部の実施形態では、この方法は
、細胞を接触させるステップの前に、組換えキメラタンパク質をコードするヌクレオチド
を保有するベクターを作出するステップをさらに含む。この方法の一部の実施形態では、
作出するステップは、少なくとも１つの変異が、グリコシルホスファチジルイノシトール
（ＧＰＩ）アンカリングドメインの機能喪失を生じるように、ＣＤ５５タンパク質アミノ
酸配列をコードする核酸を変異させるステップを含み、または作出するステップは、少な
くとも１つの変異が、膜貫通ドメインの除去を生じるように、ＣＤ４６タンパク質アミノ
酸配列をコードする核酸を変異させるステップを含み、または作出するステップは、少な
くとも１つの変異が、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカリングド
メインの機能喪失を生じるように、ＣＤ５９タンパク質アミノ酸配列をコードする核酸配
列を変異させるステップを含み、または作出するステップは、ＣＤ４６タンパク質Ｃ末端
をコードする核酸を、ＣＤ５５タンパク質Ｎ末端のアミノ酸をコードする核酸と組換え接
合するステップ、およびＣＤ５５タンパク質Ｃ末端をコードする核酸配列を、ＣＤ５９タ
ンパク質Ｎ末端をコードする核酸と組換え接合するステップを含む。一部の実施形態では
、この変異は、置換、欠失および付加の少なくとも１つを含む。この方法の一部の実施形
態では、細胞を接触させるステップは、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内、粘膜、皮下、舌
下、鼻腔内、経口、眼内、硝子体内、外用（ｔｏｐｉｃａｌ）、経皮、膣および注入から
なる群より選択される少なくとも１つの経路によって組成物を投与するステップを含む。
本発明の一態様は、被験体において補体関連状態を調節するためのキットまたはそれを
処置するキットを提供し、このキットは、その組成物が、古典的補体経路および第二補体
経路を負にモジュレートし、補体関連状態について被験体を処置するのに有効な用量で製
剤化されるように、ＣＤ４６タンパク質、ＣＤ５５タンパク質およびＣＤ５９タンパク質
の各々由来のアミノ酸配列を含む組換えキメラタンパク質、または組換えキメラタンパク
質をコードするヌクレオチド配列を含む組成物；被験体を処置するための指示；ならびに
容器を含む。
本発明の一態様は、被験体において補体関連状態を処置するための医薬組成物であって
、組換えキメラタンパク質が、古典的補体経路および第二補体経路を負にモジュレートす
るように、ＣＤ５５タンパク質およびＣＤ５９タンパク質由来のアミノ酸配列を有する組
換えキメラタンパク質、または組換えキメラタンパク質を発現するヌクレオチド配列を含
む医薬組成物を提供する。
本発明の一態様は、被験体において補体関連状態を処置するための医薬組成物であって
、第１または第２のタンパク質が、古典的補体経路および第二補体経路を負にモジュレー
トするように、ＣＤ４６タンパク質、ＣＤ５５タンパク質およびＣＤ５９タンパク質の少
なくとも２つ由来のアミノ酸配列、またはＣＤ４６タンパク質、ＣＤ５５タンパク質およ
びＣＤ５９タンパク質の各々由来のアミノ酸配列を含む第１の組換えキメラタンパク質、
またはＣＤ５５タンパク質およびＣＤ５９タンパク質由来のアミノ酸配列を有する第２の
組換えキメラタンパク質、または第１の組換えキメラタンパク質を発現するヌクレオチド
配列、または第２の組換えキメラタンパク質を発現するヌクレオチド配列を含む医薬組成
物を提供する。
本発明の一態様は、被験体において補体関連状態を処置するための医薬組成物であって
、第１および第２の組換えキメラタンパク質が、古典的補体経路および第二補体経路を負
にモジュレートするように、ＣＤ４６タンパク質、ＣＤ５５タンパク質およびＣＤ５９タ
ンパク質の各々由来のアミノ酸配列を含む第１の組換えキメラタンパク質、ならびにＣＤ
５５タンパク質およびＣＤ５９タンパク質由来のアミノ酸配列を有する第２の組換えキメ
ラタンパク質、または第１の組換えキメラタンパク質を発現するヌクレオチド配列および
第２の組換えキメラタンパク質を発現するヌクレオチド配列を含む医薬組成物を提供する
。
本発明の一態様は、被験体において補体関連状態を処置する方法であって、ヌクレオチ
ド配列が、ＣＤ５９タンパク質およびＣＤ５５タンパク質の各々のアミノ酸配列をコード
するように、または組成物が、ＣＤ５５タンパク質、ＣＤ５９タンパク質もしくは組換え
キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を保有するベクターを含むように、被験
体の細胞を、細胞において組換えキメラタンパク質の発現を引き起こすプロモーター配列
に作動可能に連結したＣＤ５５タンパク質およびＣＤ５９タンパク質または組換えキメラ
タンパク質を含む組成物と接触させるステップ；ならびに被験体における補体関連状態の
症状を観察するステップ；被験体の症状を、接触させるステップの前の症状と比較するス
テップ；ならびに被験体における補体関連状態の症状における減少を観察するステップを
含み、それによって補体関連状態を処置する方法を提供する。この方法の一実施形態では
、組換えキメラタンパク質は、活性補体の二重ターミネーターである。
この方法の一実施形態では、測定するステップは、補体経路のタンパク質および細胞膜
傷害複合体の量の少なくとも１つを測定するステップを含む。この方法の一実施形態では
、細胞が、筋肉、上皮、内皮および脈管から選択されるように、または細胞が、眼、心臓
、腎臓、甲状腺、脳、胃、肺、肝臓、膵臓および脈管系の少なくとも１つにおける組織か
ら選択されるように、細胞膜傷害複合体を測定するステップは、細胞における細胞膜傷害
複合体の量を分析するステップを含む。これらの方法の実施形態では、状態は、黄斑変性
、加齢黄斑変性、炎症性腸疾患、甲状腺炎、クリオグロブリン血症、胎児消失、臓器グラ
フト拒絶、敗血症、ウイルス感染症、真菌感染症、細菌感染症、トキシックショック症候
群（ＴＳＳ）、膜性増殖性糸球体腎炎、デンスデポジット病、発作性夜間ヘモグロビン尿
症、ループス腎炎、膜性腎炎、免疫グロブリンＡ腎症、グッドパスチャー症候群、連鎖球
菌感染後糸球体腎炎、全身性エリテマトーデス、非典型溶血性尿毒症症候群、全身性エリ
テマトーデス、ループス関節炎、関節リウマチ、シェーグレン症候群、ベーチェット症候
群、全身性硬化症、アルツハイマー病、多発性硬化症、重症筋無力症、ギラン・バレー症
候群、大脳ループス、脳卒中、成人呼吸促迫症候群、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、
溶血性貧血、発作性寒冷ヘモグロビン尿症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、血管炎、天疱
瘡、水疱性類天疱瘡、光毒性反応、乾癬、アナフィラキシーショック、アレルギー、喘息
、心筋梗塞、糖尿病性網膜症、微小脈管障害、皮膚筋炎、Ｂ細胞リンパ増殖性障害、脱髄
疾患、急性腎臓傷害、ＣＯＰＤ、Ｒｈ疾患、免疫性溶血性貧血、免疫性血小板減少性紫斑
病、補体関連糸球体症およびアテローム動脈硬化症の群より選択される。
この方法の代替的実施形態では、細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉ
ｎ ｖｉｖｏで接触させ、ｉｎ ｖｉｖｏの場合、おそらくはｉｎ ｓｉｔｕでも接触さ
せる。一部の実施形態では、この方法は、細胞を接触させるステップの前に、組換えキメ
ラタンパク質をコードするヌクレオチドを保有するベクターを作出するステップをさらに
含む。この方法の一部の実施形態では、作出するステップは、少なくとも１つの変異が、
グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカリングドメインの機能喪失を生
じるように、ＣＤ５５タンパク質アミノ酸配列をコードする核酸を変異させるステップを
含み、または作出するステップは、少なくとも１つの変異が、膜貫通ドメインの除去を生
じるように、ＣＤ４６タンパク質アミノ酸配列をコードする核酸を変異させるステップを
含み、または作出するステップは、少なくとも１つの変異が、グリコシルホスファチジル
イノシトール（ＧＰＩ）アンカリングドメインの機能喪失を生じるように、ＣＤ５９タン
パク質アミノ酸配列をコードする核酸配列を変異させるステップを含み、または作出する
ステップは、ＣＤ４６タンパク質Ｃ末端をコードする核酸を、ＣＤ５５タンパク質Ｎ末端
のアミノ酸をコードする核酸と組換え接合するステップ、およびＣＤ５５タンパク質Ｃ末
端をコードする核酸配列を、ＣＤ５９タンパク質Ｎ末端をコードする核酸と組換え接合す
るステップを含む。一部の実施形態では、この変異は、置換、欠失および付加の少なくと
も１つを含む。この方法の一部の実施形態では、細胞を接触させるステップは、静脈内、
筋肉内、腹腔内、皮内、粘膜、皮下、舌下、鼻腔内、経口、眼内、硝子体内、外用、経皮
、膣および注入からなる群より選択される少なくとも１つの経路によって組成物を投与す
るステップを含む。
本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
被験体において補体関連状態を処置するための医薬組成物であって、ＣＤ４６タンパク
質、ＣＤ５５タンパク質およびＣＤ５９タンパク質の少なくとも２つ由来のアミノ酸配列
を有する組換えキメラタンパク質、または前記組換えキメラタンパク質をコードするヌク
レオチド配列を含み、前記組換えキメラタンパク質が、古典的補体経路および第二補体経
路を負にモジュレートする、医薬組成物。
（項目２）
前記組換えキメラタンパク質が、可溶性活性補体ターミネーターである、項目１に記載
の組成物。
（項目３）
前記ＣＤ５９タンパク質の前記アミノ酸配列をコードする前記ヌクレオチド配列が、グ
リコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカリングドメインの機能喪失を付与
する少なくとも１つの変異を含み、前記変異が、置換、欠失および付加の少なくとも１つ
である、項目１に記載の組成物。
（項目４）
前記ＣＤ５５タンパク質の前記アミノ酸配列をコードする前記ヌクレオチド配列が、グ
リコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカリングドメインの機能喪失を付与
する少なくとも１つの変異を含み、前記変異が、置換、欠失および付加の少なくとも１つ
である、項目１に記載の組成物。
（項目５）
前記ＣＤ４６タンパク質の前記アミノ酸配列をコードする前記ヌクレオチド配列が、膜
貫通ドメインの機能喪失を付与する少なくとも１つの変異を含み、前記変異が、置換、欠
失および付加の少なくとも１つを含む、項目１に記載の組成物。
（項目６）
前記補体関連状態について前記被験体を処置するのに有効な用量で製剤化される、項目
１に記載の組成物。
（項目７）
前記ＣＤ５９タンパク質の前記アミノ酸配列が、分泌シグナルペプチドを含む、項目１
に記載の組成物。
（項目８）
前記タンパク質が、前記ＣＤ５９タンパク質および前記ＣＤ４６タンパク質；前記ＣＤ
４６タンパク質および前記ＣＤ５５タンパク質；ならびに前記ＣＤ５５タンパク質および
前記ＣＤ５９タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも１つを接続するリンカーをさらに含
む、項目１に記載の組成物。
（項目９）
前記ヌクレオチド配列が、少なくとも１つのアミノ酸、例えばグリシン、セリンまたは
アラニンを含むリンカーをさらにコードする、項目１に記載の組成物。
（項目１０）
前記ＣＤ４６タンパク質、前記ＣＤ５５タンパク質および前記ＣＤ５９タンパク質の前
記アミノ酸配列が、前記タンパク質の発現が作動可能に連結した転写融合物および発現と
同じリーディングフレームでタンパク質融合物をコードする核酸によってコードされる、
項目１に記載の組成物。
（項目１１）
前記ＣＤ４６タンパク質アミノ酸配列が、ショートコンセンサスリピートドメインおよ
びセリン／スレオニン／プロリンリッチドメインの少なくとも１つを含むか、または前記
ＣＤ４６タンパク質アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が、膜貫通ドメインの喪
失を生じる少なくとも１つの変異、例えば、置換、欠失もしくは付加を含むか、またはＣ
Ｄ５５タンパク質アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が、前記ＣＤ５５タンパク
質のグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカリングドメインの機能喪失
を生じる少なくとも１つの変異を含み、前記変異が、置換、欠失もしくは付加を含むか、
または前記ＣＤ５５タンパク質アミノ酸配列が、ショートコンセンサスリピートドメイン
およびセリン／スレオニン／プロリンリッチドメインの少なくとも１つを含む、項目１に
記載の組成物。
（項目１２）
前記組換えキメラタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、プラスミドを構成
する、項目１に記載の組成物。
（項目１３）
前記ヌクレオチド配列が、ウイルスベクターを構成する、項目１に記載の組成物。
（項目１４）
前記ベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ポックス
ウイルスおよびレンチウイルスの群より選択される少なくとも１つである、項目１１に記
載の組成物。
（項目１５）
前記ヌクレオチド配列が、ベータアクチン、例えばニワトリベータアクチン、ペリフェ
リン／ＲＤＳ、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼおよびロドプシンからなる群より選択され
る遺伝子由来のプロモーターを含む、項目１に記載の組成物。
（項目１６）
細胞または組織を標的化するように作出された送達ビヒクルをさらに含み、前記送達ビ
ヒクルが、リポソーム、脂質、ポリカチオン、ペプチド、ナノ粒子、金粒子およびポリマ
ーの群より選択される、項目１に記載の組成物。
（項目１７）
薬学的に許容される塩または軟化薬の少なくとも１つをさらに含む、項目１に記載の組
成物。
（項目１８）
抗腫瘍剤、抗凝固剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗マイコバクテリア剤、抗真菌剤、抗増
殖剤および抗アポトーシス剤からなる群より選択される薬剤をさらに含む、項目１に記載
の組成物。
（項目１９）
被験体において補体関連状態を処置する方法であって、
前記被験体の細胞を、細胞において組換えキメラタンパク質の発現を引き起こすプロモ
ーター配列に作動可能に連結したＣＤ４６タンパク質、ＣＤ５５タンパク質およびＣＤ５
９タンパク質または前記組換えキメラタンパク質を含む組成物と接触させるステップであ
って、ヌクレオチド配列が、前記ＣＤ５９タンパク質、前記ＣＤ４６タンパク質および前
記ＣＤ５５タンパク質の各々のアミノ酸配列をコードするか、または前記組成物が、前記
ＣＤ４６タンパク質、前記ＣＤ５５タンパク質、前記ＣＤ５９タンパク質もしくは前記組
換えキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を保有するベクターを含む、ステッ
プ；
前記被験体における前記補体関連状態の症状を測定するステップ；
前記被験体の症状を、接触させるステップの前の症状と比較するステップ；ならびに
前記被験体における前記補体関連状態の症状における減少を測定するステップ
を含み、それによって前記補体関連状態を処置する、方法。
（項目２０）
前記組換えキメラタンパク質が、可溶性活性補体ターミネーターである、項目１９に記
載の方法。
（項目２１）
測定するステップが、補体経路のタンパク質および細胞膜傷害複合体の量の少なくとも
１つを測定するステップを含む、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
細胞膜傷害複合体を測定するステップが、細胞における細胞膜傷害複合体の量を分析す
るステップを含み；前記細胞が、筋肉、上皮、内皮および脈管から選択されるか、または
前記細胞が、眼、心臓、腎臓、甲状腺、脳、胃、肺、肝臓、膵臓および脈管系の少なくと
も１つにおける組織から選択される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記状態が、黄斑変性、加齢黄斑変性、炎症性腸疾患、甲状腺炎、クリオグロブリン血
症、胎児消失、臓器グラフト拒絶、敗血症、ウイルス感染症、真菌感染症、細菌感染症、
トキシックショック症候群（ＴＳＳ）、膜性増殖性糸球体腎炎、デンスデポジット病、発
作性夜間ヘモグロビン尿症、ループス腎炎、膜性腎炎、免疫グロブリンＡ腎症、グッドパ
スチャー症候群、連鎖球菌感染後糸球体腎炎、全身性エリテマトーデス、非典型溶血性尿
毒症症候群、全身性エリテマトーデス、ループス関節炎、関節リウマチ、シェーグレン症
候群、ベーチェット症候群、全身性硬化症、アルツハイマー病、多発性硬化症、重症筋無
力症、ギラン・バレー症候群、大脳ループス、脳卒中、成人呼吸促迫症候群、慢性閉塞性
肺疾患、嚢胞性線維症、溶血性貧血、発作性寒冷ヘモグロビン尿症、発作性夜間ヘモグロ
ビン尿症、血管炎、天疱瘡、水疱性類天疱瘡、光毒性反応、乾癬、アナフィラキシーショ
ック、アレルギー、喘息、心筋梗塞、糖尿病性網膜症、微小脈管障害、皮膚筋炎、Ｂ細胞
リンパ増殖性障害、脱髄疾患、急性腎臓傷害、ＣＯＰＤ、Ｒｈ疾患、免疫性溶血性貧血、
免疫性血小板減少性紫斑病、補体関連糸球体症およびアテローム動脈硬化症の群より選択
される、項目１９に記載の方法。
（項目２４）
前記細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ
ｓｉｔｕで接触させる、項目１９に記載の方法。
（項目２５）
前記細胞を接触させるステップの前に、前記組換えキメラタンパク質をコードする前記
ヌクレオチドを保有する前記ベクターを作出するステップをさらに含む、項目１９に記載
の方法。
（項目２６）
作出するステップが、前記ＣＤ５５タンパク質アミノ酸配列をコードする核酸を変異さ
せるステップを含み、少なくとも１つの変異が、グリコシルホスファチジルイノシトール
（ＧＰＩ）アンカリングドメインの機能喪失を生じるか、または作出するステップが、前
記ＣＤ４６タンパク質アミノ酸配列をコードする核酸を変異させるステップを含み、少な
くとも１つの変異が、膜貫通ドメインの除去を生じるか、または作出するステップが、Ｃ
Ｄ５９タンパク質アミノ酸配列をコードする核酸配列を変異させるステップを含み、少な
くとも１つの変異が、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカリングド
メインの機能喪失を生じるか、または作出するステップが、前記ＣＤ４６タンパク質Ｃ末
端をコードする核酸を、ＣＤ５５タンパク質Ｎ末端のアミノ酸をコードする核酸と組換え
接合するステップ、および前記ＣＤ５５タンパク質Ｃ末端をコードする核酸配列を、前記
ＣＤ５９タンパク質Ｎ末端をコードする核酸と組換え接合するステップを含む、項目２５
に記載の方法。
（項目２７）
前記変異が、置換、欠失および付加の少なくとも１つを含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記細胞を接触させるステップが、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内、粘膜、皮下、舌下
、鼻腔内、経口、眼内、硝子体内、外用、経皮、膣および注入からなる群より選択される
少なくとも１つの経路によって前記組成物を投与するステップを含む、項目１９に記載の
方法。
（項目２９）
被験体において補体関連状態を調節するためのキットまたはそれを処置するキットであ
って、
ＣＤ４６タンパク質、ＣＤ５５タンパク質およびＣＤ５９タンパク質の各々由来のアミ
ノ酸配列を含む組換えキメラタンパク質、または前記組換えキメラタンパク質をコードす
るヌクレオチド配列を含む組成物であって、古典的補体経路および第二補体経路を負にモ
ジュレートし、前記補体関連状態について前記被験体を処置するのに有効な用量で製剤化
される組成物；
前記被験体を処置するための指示；ならびに
容器
を含む、キット。
（項目３０）
被験体において補体関連状態を処置するための医薬組成物であって、ＣＤ５５タンパク
質およびＣＤ５９タンパク質由来のアミノ酸配列を有する組換えキメラタンパク質、また
は前記組換えキメラタンパク質を発現するヌクレオチド配列を含み、前記組換えキメラタ
ンパク質が、古典的補体経路および第二補体経路を負にモジュレートする、医薬組成物。
（項目３１）
被験体において補体関連状態を処置するための医薬組成物であって、ＣＤ４６タンパク
質、ＣＤ５５タンパク質およびＣＤ５９タンパク質の少なくとも２つ由来のアミノ酸配列
、またはＣＤ４６タンパク質、ＣＤ５５タンパク質およびＣＤ５９タンパク質の各々由来
のアミノ酸配列を含む第１の組換えキメラタンパク質、またはＣＤ５５タンパク質および
ＣＤ５９タンパク質由来のアミノ酸配列を有する第２の組換えキメラタンパク質、または
前記第１の組換えキメラタンパク質を発現するヌクレオチド配列、または前記第２の組換
えキメラタンパク質を発現するヌクレオチド配列を含み、前記第１の組換えキメラタンパ
ク質または前記第２の組換えキメラタンパク質が、古典的補体経路および第二補体経路を
負にモジュレートする、医薬組成物。
（項目３２）
被験体において補体関連状態を処置するための医薬組成物であって、ＣＤ４６タンパク
質、ＣＤ５５タンパク質およびＣＤ５９タンパク質の各々由来のアミノ酸配列を含む第１
の組換えキメラタンパク質、ならびにＣＤ５５タンパク質およびＣＤ５９タンパク質由来
のアミノ酸配列を有する第２の組換えキメラタンパク質、または前記第１の組換えキメラ
タンパク質を発現するヌクレオチド配列および前記第２の組換えキメラタンパク質を発現
するヌクレオチド配列を含み、前記第１のタンパク質および前記第２のタンパク質が、古
典的補体経路および第二補体経路を負にモジュレートする、医薬組成物。
（項目３３）
被験体において補体関連状態を処置する方法であって、
前記被験体の細胞を、細胞において組換えキメラタンパク質の発現を引き起こすプロモ
ーター配列に作動可能に連結したＣＤ５５タンパク質およびＣＤ５９タンパク質または前
記組換えキメラタンパク質を含む組成物と接触させるステップであって、ヌクレオチド配
列が、前記ＣＤ５９タンパク質および前記ＣＤ５５タンパク質の各々のアミノ酸配列をコ
ードするか、または前記組成物が、前記ＣＤ５５タンパク質、前記ＣＤ５９タンパク質も
しくは前記組換えキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を保有するベクターを
含む、ステップ；
前記被験体における前記補体関連状態の症状を観察するステップ；
前記被験体の症状を、接触させるステップの前の症状と比較するステップ；ならびに
前記被験体における前記補体関連状態の症状における減少を観察するステップ
を含み、それによって前記補体関連状態を処置する、方法。
（項目３４）
前記組換えキメラタンパク質が、活性補体の二重ターミネーターである、項目３３に記
載の方法。
（項目３５）
測定するステップが、補体経路のタンパク質および細胞膜傷害複合体の量の少なくとも
１つを測定するステップを含む、項目３３に記載の方法。
（項目３６）
細胞膜傷害複合体を測定するステップが、細胞における細胞膜傷害複合体の量を分析す
るステップを含み；前記細胞が、筋肉、上皮、内皮および脈管から選択されるか、または
前記細胞が、眼、心臓、腎臓、甲状腺、脳、胃、肺、肝臓、膵臓および脈管系の少なくと
も１つにおける組織から選択される、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記状態が、黄斑変性、加齢黄斑変性、炎症性腸疾患、甲状腺炎、クリオグロブリン血
症、胎児消失、臓器グラフト拒絶、敗血症、ウイルス感染症、真菌感染症、細菌感染症、
トキシックショック症候群（ＴＳＳ）、膜性増殖性糸球体腎炎、デンスデポジット病、発
作性夜間ヘモグロビン尿症、ループス腎炎、膜性腎炎、免疫グロブリンＡ腎症、グッドパ
スチャー症候群、連鎖球菌感染後糸球体腎炎、全身性エリテマトーデス、非典型溶血性尿
毒症症候群、全身性エリテマトーデス、ループス関節炎、関節リウマチ、シェーグレン症
候群、ベーチェット症候群、全身性硬化症、アルツハイマー病、多発性硬化症、重症筋無
力症、ギラン・バレー症候群、大脳ループス、脳卒中、成人呼吸促迫症候群、慢性閉塞性
肺疾患、嚢胞性線維症、溶血性貧血、発作性寒冷ヘモグロビン尿症、発作性夜間ヘモグロ
ビン尿症、血管炎、天疱瘡、水疱性類天疱瘡、光毒性反応、乾癬、アナフィラキシーショ
ック、アレルギー、喘息、心筋梗塞、糖尿病性網膜症、微小脈管障害、皮膚筋炎、Ｂ細胞
リンパ増殖性障害、脱髄疾患、急性腎臓傷害、ＣＯＰＤ、Ｒｈ疾患、免疫性溶血性貧血、
免疫性血小板減少性紫斑病、補体関連糸球体症およびアテローム動脈硬化症の群より選択
される、項目３３に記載の方法。
（項目３８）
前記細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ
ｓｉｔｕで接触させる、項目３３に記載の方法。
（項目３９）
前記細胞を接触させるステップの前に、前記組換えキメラタンパク質をコードする前記
ヌクレオチドを保有する前記ベクターを作出するステップをさらに含む、項目３３に記載
の方法。
（項目４０）
作出するステップが、前記ＣＤ５５タンパク質アミノ酸配列をコードする核酸を変異さ
せるステップを含み、少なくとも１つの変異が、グリコシルホスファチジルイノシトール
（ＧＰＩ）アンカリングドメインの機能喪失を生じるか、または作出するステップが、Ｃ
Ｄ５９タンパク質アミノ酸配列をコードする核酸配列を変異させるステップを含み、少な
くとも１つの変異が、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカリングド
メインの機能喪失を生じるか、または作出するステップが、前記ＣＤ５５タンパク質Ｃ末
端をコードする核酸を、前記ＣＤ５９タンパク質Ｎ末端をコードする核酸と組換え接合す
るステップを含む、項目３３に記載の方法。
（項目４１）
前記変異が、置換、欠失および付加の少なくとも１つを含む、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記細胞を接触させるステップが、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内、粘膜、皮下、舌下
、鼻腔内、経口、眼内、硝子体内、外用、経皮、膣および注入からなる群より選択される
少なくとも１つの経路によって前記組成物を投与するステップを含む、項目３３に記載の
方法。
図１Ａおよび図１Ｂは、ＳＡＣＴおよびＤＴＡＣの構造を示す模式図およびそれらの発現を示す写真である。図１Ａは、ヒト膜会合型補体調節因子ＣＤ４６、ＣＤ５５およびＣＤ５９ならびに可溶性組換えタンパク質ＳＡＣＴおよびＤＴＡＣの構造の模式図である。ＣＤ５５およびＣＤ４６は共に、各々、４つのショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）ドメインおよびセリン／スレオニン（Ｓ／Ｔ）リッチ領域を含む。ＳＣＲおよびＳ／Ｔドメインは、それぞれ、Ｎ結合型グリコシル化およびＯ結合型グリコシル化の部位である。ＣＤ４６は、疎水性ドメインを介して膜中に挿入し、ＣＤ５５およびＣＤ５９は各々、グリコシルホスファチジルイノシトール（ｇｌｙｃｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）（ＧＰＩ）アンカーを介して膜に結合する。ＣＤ５９は、７６アミノ酸の短い機能的単位を含む。ＳＡＣＴおよびＤＴＡＣは共に、ポリグリシンリンカーによってヒトＣＤ５９の機能的ドメインから分離された、ヒトＣＤ５５の４つのＳＣＲドメインおよびＳ／Ｔ－リッチ領域を含む。ＳＡＣＴは、Ｎ末端において、ポリグリシンリンカーによってＣＤ５５のＳＣＲから分離された、ヒトＣＤ４６の４つのＳＣＲドメインをさらに含む。ＳＡＣＴおよびＤＴＡＣは共に、ヒトＣＤ５９由来の分泌シグナルを含む。組換えタンパク質を作出するとき、ＣＤ４６の膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ５５およびＣＤ５９の各々へのＧＰＩアンカーの結合のためのシグナルは含めなかった。図１Ｂは、ＣＤ４６、ＣＤ５５およびＣＤ５９に対する抗体でプローブした、ｐＤＴＡＣ、ｐＧＦＰまたはｐＳＡＣＴをトランスフェクトした細胞由来の培地を示すウエスタンブロットの写真である。
図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃおよび図２Ｄは、ＳＡＣＴが、Ｃ３ｂの第Ｉ因子媒介性切断のための補因子として作用することを示す、模式図、写真および棒グラフである。図２Ａは、Ｃ３ｂの第Ｉ因子切断の模式図である。Ｃ３ｂは、ジスルフィド連結によって接合された、２つのポリペプチド鎖（α’およびβ）からなる。第Ｉ因子は、不活性断片ｉＣ３ｂＨおよびｉＣ３ｂＬへの、１０４ｋＤａのα’鎖の切断を媒介する。図２Ｂは、不活性ｉＣ３ｂへの第Ｉ因子媒介性切断のための補因子として作用する、細胞膜上に沈着したＣ３ｂのＣＤ４６結合を示す模式図である。図２Ｃは、第Ｉ因子の存在下または非存在下で、ｐＳＡＣＴ、ｐＤＴＡＣまたはｐＧＦＰのいずれかをトランスフェクトした細胞由来の培地中でインキュベートし、Ｃ３に対して特異的な抗体でプローブした、精製されたＣ３ｂのウエスタンブロットの写真である。このウエスタンブロットは、ｐＧＦＰまたはｐＤＴＡＣのいずれかの存在下で生じた切断と比較して、ｐＳＡＣＴをトランスフェクトした細胞由来の培地の存在下でのα’鎖の増加した切断を示す。図２Ｄは、それぞれ、Ｃ３ｂおよび第Ｉ因子を含むｐＧＦＰトランスフェクト細胞およびｐＤＴＡＣトランスフェクト細胞由来の培地と比較した、Ｃ３ｂおよび第Ｉ因子を含むｐＳＡＣＴトランスフェクト細胞由来の培地中のＣ３ｂのα’鎖の量における、５１．８±１０．５％（ｐ＝０．００７）および４６．２±４．８％（ｐ＝０．０００７）の低減を示すウエスタンブロットデータの定量化の棒グラフである。α’鎖についてのシグナル強度を、β鎖のシグナル強度に対して正規化した。
図３Ａ、図３Ｂおよび図３Ｃは、ＳＡＣＴおよびＤＴＡＣが、Ｃ３コンバターゼの分解を促進することを示す、模式図および棒グラフである。図３Ａは、Ｃ３コンバターゼの分解を促進させるための、ＣＤ５５およびＣ３ｂに結合するＢ因子の解離の模式図である。図３Ｂは、Ｂ因子に対する抗体を使用した、アガロース結合したＣ３ｂへのＢ因子結合の免疫染色の定量化の棒グラフである。このグラフは、ｐＤＴＡＣまたはｐＳＡＣＴをトランスフェクトした細胞由来の培地が、ｐＧＦＰトランスフェクト細胞由来の培地（ｎ＝１０）と比較して、Ｃ３ｂ結合したＢ因子における、それぞれ、１６．１±６．４％（ｐ＝０．０２１４、ｎ＝１１）および１６．８±６．１％（ｐ＝０．０１２７、ｎ＝１１）の低減を生じたことを示している。Ｂ因子結合は、ｐＧＦＰトランスフェクト細胞由来の培地の存在下でＣ３ｂに結合したＢ因子の平均染色強度と比較した％染色として示される。図３Ｃは、ＣＤ５５遮断抗体の存在下または非存在下で、ｐＤＴＡＣまたはｐＳＡＣＴのいずれかをトランスフェクトした細胞由来の培地と共にインキュベートしたヒツジ赤血球のヒト補体媒介性溶解の定量化の棒グラフである。細胞溶解に対する保護における有意な低減が、抗体の存在下で、ＤＴＡＣおよびＳＡＣＴの両方について観察された。
図４Ａおよび図４Ｂは、ＳＡＣＴおよびＤＴＡＣが、細胞膜傷害複合体中へのＣ９の取込みを阻害することを示す、模式図および棒グラフである。図４Ａは、ＣＤ５９機能の模式図である。ＣＤ５９は、膜会合型Ｃ５ｂ－８タンパク質複合体に結合して、Ｃ９の取込みおよび細胞膜傷害複合体（ＭＡＣ）の形成を防止する。ＭＡＣは、細胞表面上に孔を形成し、膜の完全性を低減させる。図４Ｂは、ｐＧＦＰ、ｐＤＴＡＣまたはｐＳＡＣＴをトランスフェクトした培地の存在下で、Ｃ９と共にインキュベートしたＣ９枯渇ヒト血清によるヒツジ赤血球の溶解の定量化の棒グラフである。ｐＤＴＡＣトランスフェクト細胞およびｐＳＡＣＴトランスフェクト細胞由来の培地は、ｐＧＦＰトランスフェクト細胞由来の培地の存在下でインキュベートした赤血球と比較して、それぞれ、３４．８±３．６％（ｐ＜０．０００１）および２９．９±４．６％（ｐ＜０．０００１）、赤血球のヒト補体媒介性溶解を低減させた。
図５Ａおよび図５Ｂは、ＳＡＣＴおよびＤＴＡＣが、ヒツジ赤血球およびマウス肝細胞の両方を、ヒト補体媒介性溶解からｉｎ ｖｉｔｒｏで保護することを示す棒グラフである。図５Ａは、ＧＦＰトランスフェクト細胞由来の培地と比較して、それぞれ、ＤＴＡＣおよびＳＡＣＴによる溶解における４７±２．９％（ｐ＜０．０００１）および２１．５±２．８％（ｐ＜０．０００１）の低減を示す、ｐＧＦＰ、ｐＤＴＡＣまたはｐＳＡＣＴをトランスフェクトした細胞由来の培地の存在下でのヒト血清によるヒツジ赤血球の溶解（溶血）の定量化の棒グラフである。図５Ｂは、ｐＧＦＰ、ｐＤＴＡＣまたはｐＳＡＣＴをトランスフェクトした細胞由来の培地の存在下で正常ヒト血清（ＮＨＳ）と共にインキュベートしたマウス肝細胞によるヨウ化プロピジウム（ＰＩ）取込みの定量化のグラフである。ｐＧＦＰトランスフェクト細胞由来の培地の存在下で熱不活化ＮＨＳ（ｈｉＮＨＳ）と共にインキュベートした肝細胞の対照試料もまた示される。ｐＤＴＡＣまたはｐＳＡＣＴをトランスフェクトした細胞由来の培地と共にインキュベートした肝細胞は、ｐＧＦＰトランスフェクト細胞由来の培地と共にインキュベートした肝細胞（ｎ＝７）と比較して、それぞれ、ＰＩ取込みにおける２８．７３％±１０．２１％（ｐ＝０．０１４、ｎ＝８）または２０．８±９．０％（ｐ＝０．０３７、ｎ＝８）の低減を有することが観察された。
図６Ａおよび図６Ｂは、ＤＴＡＣおよびＳＡＣＴがｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞膜傷害複合体の沈着を低減させることを示す、顕微鏡写真および棒グラフである。図６Ａは、ｐＧＦＰ、ｐＤＴＡＣまたはｐＳＡＣＴをトランスフェクトした細胞由来の培地の存在下でＮＨＳと共にインキュベートしたマウス肝細胞の蛍光顕微鏡写真のセットである。細胞を、ＭＡＣに対する抗体またはＤＡＰＩで染色した。図６Ｂは、ＭＡＣ染色強度／面積の定量化をグラフ化するものであり、ｐＧＦＰトランスフェクト細胞由来の培地と共にインキュベートした肝細胞（ｎ＝６）と比較して、ｐＤＴＡＣまたはｐＳＡＣＴをトランスフェクトした細胞由来の培地と共にインキュベートしたマウス肝細胞上のＭＡＣ沈着における、それぞれ５３．８±１０．４％（ｐ＝０．０００４、ｎ＝６）または６７．８±９．２％（ｐ＜０．０００１、ｎ＝６）の低減を示す。ｐＧＦＰトランスフェクト細胞由来の培地の存在下でｈｉＮＨＳと共にインキュベートした肝細胞の対照試料もまた示される。ＤＡＰＩ、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール；ＭＡＣ、細胞膜傷害複合体；ｈｉＮＨＳ、熱不活化正常ヒト血清。
図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃおよび図７Ｄは、ＤＴＡＣが、マウス肝臓脈管構造をヒトＭＡＣ沈着からｉｎ ｖｉｖｏで保護することを示す、顕微鏡写真および棒グラフである。図７Ａは、マウス肝臓のＡＡＶ２／８ＧＦＰ形質導入を示す凍結切片の蛍光顕微鏡写真のセットである。効率的な形質導入が、組織を通じて観察された。四角で囲んだ領域のより高い倍率もまた示されている。図７Ｂは、ＡＡＶ２／８ｐＡまたはＡＡＶ２／８ＤＴＡＣを腹腔内空間中に注射し、ｍＰＥＣＡＭ１抗体およびＮＨＳで灌流したマウスから回収した、抗ＭＡＣ抗体で染色した肝臓凍結切片の蛍光顕微鏡写真のセットである。四角で囲んだ領域のより高い倍率もまた示されている。図７Ｃは、ＡＡＶ２／８ポリＡ注射マウスと比較してＡＡＶ２／８ＤＴＡＣ注射マウスの肝臓脈管構造上のヒトＭＡＣ沈着における５６．７±１６．４％（ｐ＝０．００６１）の低減を示す、肝臓切片のＭＡＣ染色強度（ＩＵ）の定量化の棒グラフのセットである。図７Ｄは、ＡＡＶ２／８ポリＡ注射マウスと比較してＡＡＶ２／８ＤＴＡＣ注射マウスの肝臓におけるヒトＭＡＣ沈着における５５．６±１１．３％（ｐ＝０．０００６）の低減を示す、血管の面積当たりのＭＡＣ染色強度の定量化の棒グラフである。染色強度を、マウス１匹当たり８つの切片から平均した。ＡＡＶ２／８ポリＡ注射マウスについてｎ＝６およびＡＡＶ２／８ＤＴＡＣ注射マウスについてｎ＝６（ＤＩＣ：微分干渉；ＩＵ：強度単位）。
図８Ａ、図８Ｂおよび図８Ｃは、ＳＡＣＴがマウス肝臓脈管構造をヒトＭＡＣ沈着からｉｎ ｖｉｖｏで保護することを示す、顕微鏡写真および棒グラフである。図８Ａは、ＡＡＶ２／８ｐＡまたはＡＡＶ２／８ＳＡＣＴを腹腔内空間中に注射し、ｍＰＥＣＡＭ１抗体およびＮＨＳで灌流したマウスから回収した、抗ＭＡＣ抗体で染色した肝臓凍結切片の蛍光顕微鏡写真のセットである。四角で囲んだ領域のより高い倍率もまた示されている。図８Ｂは、ＡＡＶ２／８ポリＡ注射マウスと比較してＡＡＶ２／８ＳＡＣＴ注射マウスの肝臓脈管構造上のヒトＭＡＣ沈着における６３．２％±２０．５％（ｐ＝０．００７５）の低減を示す、肝臓切片のＭＡＣ染色強度（ＩＵ）の定量化の棒グラフである。図８Ｃは、ＡＡＶ２／８ポリＡ注射マウスと比較してＡＡＶ２／８ＳＡＣＴ注射マウスの血管上のヒトＭＡＣ沈着における６１．１±１８．９％（ｐ＝０．００５６）の低減を示す、血管の面積当たりのＭＡＣ染色強度の定量化の棒グラフである。染色強度を、マウス１匹当たり８つの切片から平均した。ＡＡＶ２／８ポリＡ注射マウスについてｎ＝８およびＡＡＶ２／８ＳＡＣＴ注射マウスについてｎ＝９。
図９は、ヒト膜会合型補体調節因子ＣＤ４６、ＣＤ５５およびＣＤ５９ならびに可溶性組換えタンパク質ＳＴＡＣの構造を示す、活性化された補体の可溶性ターミネーター（ｓｏｌｕｂｌｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）（ＳＴＡＣ）の構造の模式図である。ＳＴＡＣは、ヒトＣＤ５９由来の分泌シグナルを含む。ヒトＣＤ４６の４つのＳＣＲドメインおよびＳ／Ｔ－リッチ領域を、ポリグリシンリンカーを介してＣＤ５９に結合させた。ヒトＣＤ５５の４つのＳＣＲドメインおよびＳ／Ｔ－リッチ領域を、ポリグリシンリンカーによってヒトＣＤ４６の機能的ドメインから分離されるように作出した。
図１０Ａおよび図１０Ｂは、ＳＴＡＣがＣ３ｂの第Ｉ因子媒介性切断のための補因子として作用することを示す、写真および棒グラフである。図１０Ａは、第Ｉ因子の存在下または非存在下で、ｐＡｄＣＡＧＧＦＰまたはｐＡｄＣＡＧＳＴＡＣのいずれかをトランスフェクトした細胞から取得された培地中でインキュベートし、Ｃ３に対する抗体でプローブした、精製されたＣ３ｂのウエスタンブロットの写真である。データは、ｐＡｄＣＡＧＧＦＰの存在下で生じた切断と比較した、ｐＡｄＣＡＧＳＴＡＣをトランスフェクトした細胞由来の培地の存在下でのα’鎖の増加した切断を示す。図１０Ｂは、Ｃ３ｂおよび第Ｉ因子を含むｐＡｄＣＡＧＧＦＰトランスフェクト細胞由来の培地（ｎ＝４）と比較して、Ｃ３ｂおよび第Ｉ因子を含むｐＡｄＣＡＧＳＴＡＣトランスフェクト細胞由来の培地中のＣ３ｂα’鎖の量における３４．３％±３．９％（ｎ＝４；ｐ＝０．０００１）の低減を示すウエスタンブロットデータの定量化のグラフである。α’鎖についてのシグナル強度を、β鎖のシグナル強度に対して正規化した。
図１１は、ＳＴＡＣのＣＤ５５部分が機能性を保持することを示す棒グラフである。このグラフは、ＣＤ５５遮断抗体の存在下または非存在下で、ｐＡｄＣＡＧＧＦＰまたはｐＡｄＣＡＧＳＴＡＣのいずれかをトランスフェクトした細胞由来の培地と共にインキュベートした感作したヒツジ赤血球のヒト補体媒介性溶解の定量化を示す。ｍＡｂ遮断の非存在下でＳＴＡＣ処理した試料は、抗体遮断なしのＧＦＰ処理試料（ｎ＝６）と比較して、細胞溶解において３２．１％±１０．４％の低減（ｎ＝６、ｐ＝０．０１１５）を有することが観察された。ＣＤ５５遮断抗体を含むｐＡｄＣＡＧＳＴＡＣトランスフェクト細胞由来の培地中に懸濁したヒツジ赤血球は、細胞溶解において、１３．４％±９．４％の統計的に有意でない低減を示した（ｎ＝６；ｐ＝０．１８３１）。遮断抗体なしのＧＦＰ培地中で生じた細胞溶解を、１００％細胞溶解に設定した。
図１２は、ＳＴＡＣが、細胞膜傷害複合体中へのＣ９取込みを防止できなかったことを示す棒グラフである。このグラフは、ｐＡｄＣＡＧＧＦＰ、ｐＡｄＣＡＧＳＴＡＣまたはｐＡｄＣＡＧｓＣＤ５９（陽性対照）をトランスフェクトした培地の存在下で、Ｃ９ありまたはなしでインキュベートしたＣ９枯渇ヒト血清によるヒツジ赤血球の溶解の定量化である。ｓＣＤ５９＋Ｃ９で処理した赤血球は、ＧＦＰ＋Ｃ９処理した細胞（ｎ＝１４）と比較して、細胞溶解において２１％±９．１％（ｎ＝８；ｐ＝０．０３３）の低減を有することが観察された。ＳＴＡＣ＋Ｃ９で処理した試料は、細胞溶解における減少を示さなかった（ｎ＝１４；ｐ＝０．４２８）。
種々の障害が補体の活性化と関連している。ＣＤ４６、ＣＤ５５およびＣＤ５９は、ヒ
ト細胞上の、補体の主要な膜会合型調節因子である。遺伝子移入を介したＣＤ５５、ＣＤ
４６またはＣＤ５９の独立した発現は、ヒト補体媒介性攻撃に対してマウス組織を保護す
る。本出願の実施例は、ＣＤ４６、ＣＤ５５およびＣＤ５９の補体調節特性を、可溶性非
膜アンカー型形態でアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターから発現される単一の遺伝子
産物へと組み合わせる可能性を記載している。
補体系の調節不全は、高齢者における失明の主要原因の１つであるＡＭＤの病因に寄与
する主要因子の１つである（Ｇｅｈｒｓら ２０１０年 Ａｒｃｈ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏ
ｌ １２８巻：３４９～３５８頁）。この疾患の最も深刻な形態は、患者のおよそ１０％
を侵しており（Ｋｌｅｉｎ ２００８年 Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ １１５巻：１０
２６～１０３１頁）、脈絡膜脈管構造からブルッフ膜を通って網膜中への、減弱された血
管の成長を含む。これらの「不適格な」血管によって放出される血漿は、光受容体および
他の網膜細胞を損傷し、重症の視力喪失を最終的にもたらす。しかし、ＡＭＤ患者の圧倒
的多数は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）とブルッフ膜との間に生じ、ＲＰＥの萎縮（地図状萎
縮）を最終的にもたらす、ドルーゼンと呼ばれる細胞外沈着物を提示する。
補体タンパク質がＡＭＤ眼のドルーゼンにおいて同定されたので、ＡＭＤにおける補体
の潜在的役割が考慮された（Ｊｏｈｎｓｏｎら ２００１年 Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ
７３巻：８８７～８９６頁；Ｊｏｈｎｓｏｎら ２０００年 Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ
７０巻：４４１～４４９頁；Ｍｕｌｌｉｎｓら Ｅｙｅ （Ｌｏｎｄ）１５巻：３９０～
３９５頁；およびＭｕｌｌｉｎｓら ２０００年 ＦＡＳＥＢ Ｊ １４巻：８３５～８
４６頁）。多型性は、いくつかの補体遺伝子において同定されており、ＡＭＤを強く予測
するかまたはＡＭＤに対して保護的であるかのいずれかであることが観察された。Ｈ因子
における単一のアミノ酸変化Ｙ４０２Ｈが、加齢眼におけるＡＭＤの４０～５０％もの多
くを占める（Ｅｄｗａｒｄｓら ２００５年 Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０８巻：４２１～４２
４頁；Ｈａｇｅｍａｎら ２００５年 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ
１０２巻：７２２７～７２３２頁；およびＨａｉｎｅｓら ２００５年 Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ３０８巻：４１９～４２１頁）。
Ｂ因子および補体成分２（Ｃ２）の両方におけるハプロタイプバリアントは、ＡＭＤを
発症する顕著に低減されたリスクを生じ（Ｇｏｌｄら ２００６年 Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ
３８巻：４５８～４６２頁）、補体成分３（Ｃ３）におけるＲ８０Ｇ置換は、ＡＭＤを
有するリスクを、２２％の高さまで増加させた（Ｙａｔｅｓら ２００７年 Ｎ Ｅｎｇ
ｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５７巻：５５３～５６１頁）。Ｂ因子（３２Ｑ）バリアントは、コン
バターゼを形成する低減された能力と共に、Ｃ３ｂに対する、４分の１の結合親和性を有
することが示されている（Ｍｏｎｔｅｓら ２００９年 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ
Ｓｃｉ ＵＳＡ １０６巻：４３６６～４３７１頁）。さらに、Ｃ２、Ｃ３およびＢ因
子における多型性は、両方の型の進行型ＡＭＤ疾患、脈絡膜新生血管および地図状萎縮へ
の進行と顕著に関連することが示されている（Ｋｌｅｉｎ ２００８年 Ｏｐｈｔｈａｌ
ｍｏｌｏｇｙ １１５巻：１０２６～１０３１頁；Ｍａｌｌｅｒら ２００７年 Ｎａｔ
Ｇｅｎｅｔ ３９巻：１２００～１２０１頁；およびＲｅｙｎｏｌｄｓら ２００９年
Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ５０巻：５８１８～５８２７
頁）。
補体タンパク質の沈着は、糖尿病性網膜症を有する患者の脈絡毛細管において（Ｇｅｒ
ｌら ２００２年 Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ４３巻：１
１０４～１１０８頁）、および糖尿病被験体の網膜血管において（Ｚｈａｎｇら ２００
２年 Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５１巻：３４９９～３５０４頁）観察されている。網膜血管は
、補体調節タンパク質ＣＤ５５およびＣＤ５９の発現における顕著な低減を示した。補体
成分は、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）に罹患している患者の網膜上膜においても観察さ
れ、古典的経路のイニシエータータンパク質Ｃ１ｑの上方調節、およびカスケードの他の
タンパク質の変更された発現が、緑内障眼において観察されている（Ｂａｕｄｏｕｉｎら
１９９０年 Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １１０巻：５９３～５９８頁；Ｓｔａ
ｓｉら ２００６年 Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ４７巻：
１０２４～１０２９頁；およびＴｅｚｅｌら ２０１０年 Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａ
ｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ５１巻（１１号）：５６９７～７０７頁）。
網膜の機能および病理における補体の役割を直接調査するのに有用である動物モデルは
ほとんど存在しない。これらのモデルのほとんどは、マウス網膜におけるレーザー誘導性
脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）の発症における異なる補体タンパク質の影響を分析するために
使用されてきた。他の研究は、古典的経路でもレクチン経路でもなく第二経路に対する、
および細胞膜傷害複合体の形成に対する、網膜病理の依存を実証している（Ｂｏｒａら
２００７年 Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７８巻：１７８３～１７９０頁；Ｂｏｒａら ２０
０６年 Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７７巻：１８７２～１８７８頁；およびＢｏｒａら ２
００５年 Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７４巻：４９１～４９７頁）。以前の研究は、ＣＮＶ
の発症においてアナフィラトキシンＣ３ａおよびＣ５ａによって果たされる顕著な役割を
実証している（Ｎｏｚａｋｉら ２００６年 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
ＵＳＡ １０３巻：２３２８～２３３３頁）。Ｈ因子の欠損を有する高齢マウスは、ブル
ッフ膜、ＲＰＥおよび光受容体における変更された構造、ならびに低減されたＥＲＧを示
し（Ｃｏｆｆｅｙら ２００７年 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １
０４巻：１６６５１～１６６５６頁）、網膜血管の完全性の喪失を呈した（Ｌｕｎｄｈ
ｖｏｎ Ｌｅｉｔｈｎｅｒら ２００９年 Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １７５巻：４１２
～４２１頁）。第二補体経路は、Ｄ因子が欠損したマウスにおいて顕著に低減されること
が示されている、光誘導性網膜変性における主要因子としても暗示されてきた（Ｒｏｈｒ
ｅｒら ２００７年 Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ４８巻：
５２８２～５２８９頁）。Ｃ３欠失マウスの神経節細胞は、一過的ではあるが顕著な、網
膜虚血再灌流に起因する変性からの保護を示した（Ｋｕｅｈｎら ２００８年 Ｅｘｐ
Ｅｙｅ Ｒｅｓ ８７巻：８９～９５頁）。
３つの別個の補体経路（古典的、レクチンまたは第二）の１つが、補体カスケードを開
始させ（Ｍａｒｋｉｅｗｓｋｉら ２００７年 Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １７１巻：７
１５～７２７頁）、これらの経路は、経路中の、Ｃ３ａおよびＣ３ｂへのＣ３の分解の点
において収束する。Ｃ３の分解は、自己または非自己細胞の膜中に挿入してそれらの溶解
を引き起こす孔様構造、細胞膜傷害複合体（ＭＡＣ）の形成で終わる経路の最終部分を開
始させる。オプソニンＣ３ｂの産生による細胞溶解の可能性に加えて、Ｃ３の活性化は、
アナフィラトキシンＣ３ａおよびＣ５ａを生成し、これらは共に、炎症の強力かつ多面的
なエフェクターである。古典的経路またはレクチン経路とは異なり、第二経路は、血清中
で生じる少量のＣ３加水分解およびコンバターゼへの変換を伴って、構成的に活性である
。
ＡＭＤまたは関節リウマチなどの慢性疾患に対する、補体の阻害剤の送達のためのアプ
ローチは、体細胞遺伝子治療の使用である。遺伝子治療は、単一の遺伝子障害の処置のた
めにヒトにおいて効果的であり、関節リウマチなどの複合障害を有する患者もまた、遺伝
子治療アプローチを使用して首尾よく処置されてきた（Ｇｉｎｎ， Ｓ．Ｌ．ら、２０１
３年 Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ １５巻：６５～７７頁）。遺伝子治療の使用は、補体の他
の膜会合型阻害剤の可溶性バージョンを動員させるにあたり独自に効果的であることが見
出されている。例えば、ＣＤ５９（プロテクチン（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎ））は、グリコシ
ルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを介して細胞の膜に係留されて見出さ
れる、ＭＡＣの天然に存在する阻害剤である。膜会合型ＣＤ５９は、ＭＡＣの強力な阻害
剤であり、可溶性膜非依存的ＣＤ５９は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などの遺伝子治
療ベクターを介して送達される場合にのみ、ｉｎ ｖｉｖｏで効果的であることが報告さ
れている（Ｃａｓｈｍａｎ， Ｓ．Ｍ．ら、２０１１年 ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６巻：ｅ１
９０７８頁）。
ＣＤ５５（崩壊促進因子）は、古典的ならびに第二Ｃ３コンバターゼの崩壊を促進する
ことによって補体活性を調節するＧＰＩアンカー型タンパク質である（Ｗａｌｐｏｒｔ，
Ｍ．Ｊ． ２００１年 Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４４巻：１０５８～１０６６頁
）。ＣＤ４６（膜補因子タンパク質）は、Ｃ３ｂおよびＣ４ｂの第Ｉ因子媒介性切断のた
めの補因子として作用し、古典的および第二Ｃ３コンバターゼの形成を防止する、遍在的
に発現される１型膜貫通糖タンパク質である（Ｒｉｌｅｙ－Ｖａｒｇａｓ， Ｒ．Ｃ．ら
、２００４年 Ｉｍｍｕｎｏｌ ２５巻：４９６～５０３頁）。ＣＤ４６は、補体の活性
化の第二経路の増幅ループを調節する。ＣＤ５５およびＣＤ４６は、異なる特性を有し、
各々、補体調節モジュールとして作用するショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）と呼
ばれる一連の６０アミノ酸のリピートモチーフを含む（Ｃｏｙｎｅ， Ｋ．Ｅ．ら、１９
９２年 Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４９巻：２９０６～２９１３頁）。ヒト補体タンパク質
とマウス補体タンパク質との間の種特異性が、ｉｎ ｖｉｖｏでのマウス組織におけるヒ
ト補体阻害剤の試験を制限している（Ｋｉｍ， Ｄ．Ｄ．ら、２００６年 Ｃｌｉｎ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ １１８巻：１２７～１３６頁）。本明細書で提供される方法および組成物
は、補体活性化の最適な阻害のために、新規非膜会合型組換えタンパク質を作出すること
に関する。これは、補体の古典的経路および第二経路の両方、かつ補体カスケードの異な
る点における同時標的化によって達成される。補体の古典的経路および第二経路は、ＣＤ
５５、ＣＤ４６およびＣＤ５９の特性を組み合わせることによって標的化される。本明細
書の実施例は、新規の作出された組換えタンパク質の合成を記載し、細胞培養物において
ヒト補体を阻害するその能力、および遺伝子治療によってマウス組織においてｉｎ ｖｉ
ｖｏでヒト補体を阻害するその能力のメリットを測定する。本明細書の実施例は、ＣＤ５
５およびＣＤ５９の補体阻害特性を組み合わせる組換えタンパク質もまた記載している。
ＣＤ４６、ＣＤ５５およびＣＤ５９の組み合わされた特性を示す非膜会合型組換え分子
ＳＡＣＴが、本明細書で提供される。ＳＡＣＴは、Ｃ３ｂの第Ｉ因子媒介性切断のための
補因子として作用し得、Ｃ３コンバターゼの分解を促進し得、ＭＡＣ中へのＣ９の動員を
減弱させ、ヒト補体媒介性溶解から細胞を保護し得、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉ
ｖｏでマウス細胞上でのヒトＭＡＣの沈着を阻害し得る、分泌型タンパク質である。ＣＤ
５５およびＣＤ５９の組み合わされた特性を有することが観察され、Ｃ３ｂの第Ｉ因子媒
介性切断のための補因子として作用しない組成物ＤＴＡＣもまた、本明細書で提供される
。
補体は、脊椎動物における免疫防御の重要な第一線であり、外来生物および損傷した自
己細胞の脅威の両方に対する保護を提供する（Ｗａｌｐｏｒｔ， Ｍ．Ｊ． ２００１年
Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４４巻：１０５８～１０６６頁）。補体媒介性病理の処
置のための補体調節因子の過剰発現は、リスクならびに利点をもたらす。したがって、Ｃ
３コンバターゼ形成、ならびにＭＡＣの崩壊および形成の組み合わされた点において補体
経路が阻害され、これが、Ｃ１ｑを、改変された自己および非自己表面と相互作用させ、
原因細胞および生物のＣ３ｂ媒介性ファゴサイトーシスを可能にする（Ｔｒｏｕｗら、２
００８年 Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４５巻：１１９９～１２０７頁）。ＣＤ５５、ＣＤ
４６およびＣＤ５９の機能を、単一の作出されたタンパク質ＳＡＣＴへと組み合わせた。
さらに、ＣＤ４６は、Ｃ３ｂ分解のレベルにおいて機能し、ＣＤ５５は、Ｃ３ｂを変更す
ることなしに、コンバターゼの形成を防止し、またはコンバターゼの崩壊を促進するので
、ＣＤ４６は、標的細胞のＣ３ｂ媒介性排除を妨害することが、本明細書で想定される。
これは、アポトーシス細胞の低減されたクリアランスが瀕死の細胞に対する自己免疫性応
答を生じさせ得るループス様疾患の処置のために特に重要であり得る（Ｔｒｏｕｗら、２
００８年 Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４５巻：１１９９～１２０７頁）。ＳＬＥに関与す
る遺伝因子の多様性の研究は、カスケードの上流成分の活性化のための潜在力を維持し、
下流事象を遮断することの重要性の包括的説明を提供している（Ｋａｒｐ， Ｄ．Ｒ．
２００５年 Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ １７巻：５３８～５４２頁）。
したがって、ＣＤ５５およびＣＤ５９機能のみを含む第２の組換え分子ＤＴＡＣを生成し
、試験した。
培養物中の細胞に、またはｉｎ ｖｉｖｏでマウス肝臓に、ＳＡＣＴまたはＤＴＡＣを
送達するために、遺伝子治療アプローチを使用した。遺伝子治療の分野における顕著な進
歩は、これが、遺伝性または後天性疾患の処置のための実行可能なアプローチであること
を示す。補体の活性化は、補体系の慢性疾患、関節リウマチを含む多くの障害において、
顕著な役割を果たす。Ｃ３およびＭＡＣの上昇したレベル、ならびにＣＤ５９の低減され
たレベルが、関節リウマチ患者の滑膜組織において報告されている（Ｋｅｍｐ， Ｐ．Ａ
．ら、１９９２年 Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３７巻：１４７～１６２頁
、Ｋｏｎｔｔｉｎｅｎ， Ｙ．Ｔ．ら、１９９６年 Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ ５５
巻：８８８～８９４頁）。これらの研究は、ＣＤ５９に対するモノクローナル抗体による
ラット膝関節の注射が、膜標的化組換えＣＤ５９の使用によって補正され得る表現型、Ｃ
Ｄ５９－／－マウスにおける、自発的および急性関節炎、ならびに関節病理における増加
を生じるという観察によって、さらに支持されている（Ｋｅｍｐ， Ｐ．Ａ．ら、１９９
２年 Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３７巻：１４７～１６２頁）。Ｃ５を標
的化することによる補体活性化の減弱は、関節リウマチのマウスモデルにおいて有効であ
ることが見出されており、このことは、補体ベースの治療薬のための標的として機能し得
る補体カスケードの複数の点が存在することを示している（Ｋｅｍｐ， Ｐ．Ａ．ら、１
９９２年 Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３７巻：１４７～１６２頁）。した
がって、ＳＡＣＴおよびＤＴＡＣは、補体カスケードの種々の点を同時に標的化および減
弱させるので、これらは各々、補体活性化の特に有効な阻害剤である。関節リウマチを有
する患者中への補体活性化の阻害剤の反復注射が実行可能であっても、遺伝子治療を介し
た長期持続性の単回の注射が、効率のためおよび患者の利便性のために、潜在的に好まし
い。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒトにおいて数年間にわたって、大型動物におい
て十年超にわたって持続することが示されている（Ｃｏｌｅｌｌａ， Ｐ．ら、２００９
年 Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ １５巻：２３～３１頁、Ｊｉａｎｇ， Ｈ．ら、２
００６年 Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １４巻：４５２～４５５頁）。さらに、ＡＡＶは、いずれ
の公知のヒト疾患とも関連していない。
ＡＭＤなどの疾患に対して、遺伝子治療アプローチを介した補体の阻害剤の送達に関す
る強い主張がなされ得る。ＡＭＤに罹患する患者のおよそ５０％は、補体調節因子Ｈ因子
中に多型性を有する（Ｋｌｅｉｎ， Ｒ．Ｊ．ら、２００５年 Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０８
巻：３８５～３８９頁）。Ｈ因子中のＹ４０２Ｈ多型性についてホモ接合性である個体は
、それらの脈絡膜血管および網膜色素上皮（ＲＰＥ）において、およそ７０％多いＭＡＣ
を有する（Ｍｕｌｌｉｎｓ， Ｒ．Ｆ．ら、２０１１年 Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ ９３
巻：５６５～５６７頁）。地図状萎縮として公知のＡＭＤの進行型形態を有する個体は、
それらのＲＰＥ上に、低減されたレベルの補体阻害剤を有する（Ｅｂｒａｈｉｍｉ， Ｋ
．Ｂ．ら、２０１３年 Ｊ Ｐａｔｈｏｌ ２２９巻：７２９～７４２頁）。個体がＭＡ
Ｃを効率的に組み立てることを妨害する、日本人集団においてＣ９中に一般に存在する多
型性は、ＡＭＤの進行に対して保護的であり、このことは、遺伝子治療アプローチを介し
た補体の不活化が、この疾患の処置のための実行可能な手段であり得ることを示唆してい
る（Ｎｉｓｈｉｇｕｃｈｉ， Ｋ．Ｍ．ら、２０１２年 Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌ
ｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ５３巻：５０８～５１２頁）。
しかし、現在臨床試験中の補体活性化の阻害剤は全て、ＡＭＤ患者の眼中に頻繁に再注
射される必要がある、小分子、アプタマーまたは抗体である（Ｋｅａｎｅ， Ｐ．Ａ．ら
、２０１２年 Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２０１２巻：４８３０３４頁）。これらの阻
害剤は、顕著な副作用、例えば、増加した眼内圧、眼内炎および網膜剥離を有する（Ｗｕ
， Ｌ．ら、２００８年 Ｇｒａｅｆｅｓ Ａｒｃｈ Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｏｐｈｔｈａ
ｌｍｏｌ ２４６巻：８１～８７頁、Ｓｈｉｍａ， Ｃ．ら、２００８年 Ａｃｔａ Ｏ
ｐｈｔｈａｌｍｏｌ ８６巻：３７２～３７６頁）。ＳＡＣＴまたはＤＴＡＣの発現を媒
介する、ＡＡＶベクターなどの、延長された時間にわたって局所的に治療タンパク質を産
生し得る単回の注射は、ＡＭＤなどの疾患の処置のために特に魅力的であり得る。補体タ
ンパク質間の種の制限は、マウス補体に関しての、したがって、ＡＭＤのマウスモデルに
おいての、ヒトＣＤ５５およびヒトＣＤ４６の試験を限定する（Ｋｉｍ， Ｄ．Ｄ．ら、
２００６年 Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１８巻：１２７～１３６頁）。本願の発明者
らは、ヒトＣＤ５５またはヒトＣＤ４６が、ＭＡＣ沈着のｅｘ ｖｉｖｏマウスモデルに
おいて、マウス網膜組織上に沈着したヒト補体を効率的に阻害したことを示している（Ｓ
ｗｅｉｇａｒｄ， Ｊ．Ｈ．ら、２０１１年 Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １８巻：６１３～６
２１頁）。
現時点では、補体の活性化の減弱のための、臨床開発および前臨床開発中の２５超の小
分子、抗体またはタンパク質が存在する。これらの分子は、急性腎臓傷害、ＣＯＰＤ、発
作性夜間ヘモグロビン尿症、関節リウマチ、敗血症、ＡＭＤおよび移植を含む、広範な種
々の適応症を目的としている。これらの治療薬の大部分は、Ｃ３またはＣ５のレベルで補
体を標的化する（Ｒｉｃｋｌｉｎ， Ｄ．ら、２０１３年 Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９０
巻：３８３９～３８４７頁）。ＣＤ４６中の変異は、個体を家族性溶血性尿毒症症候群に
罹りやすくすることが示されている（Ｋａｖａｎａｇｈ， Ｄ．ら、２００８年 Ａｎｎ
ｕ Ｒｅｖ Ｍｅｄ ５９巻：２９３～３０９頁）。ＣＤ５５の欠損は、原発性自己免疫
性溶血性貧血、ＳＬＥと、および発作性夜間ヘモグロビン尿症において、関連している（
Ｒｉｃｈａｕｄ－Ｐａｔｉｎ， Ｙ．ら、２００３年 Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ８８
巻：９５～９９頁、Ｉｗａｍｏｔｏ， Ｎ．ら、１９９５年 Ｂｌｏｏｄ ８５巻：２２
２８～２２３２頁）。ＣＤ５５は、虚血再灌流臓器損傷を減弱させることも示されている
（Ｗｅｅｋｓ， Ｃ．ら、２００７年 Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２４巻：３１１～
３２７頁）。ＣＤ５９における変異または欠損は、乳児期における慢性溶血および再発性
末梢脱髄疾患、発作性夜間ヘモグロビン尿症、自己免疫性溶血性貧血またはＳＬＥを生じ
ることが示されている（Ｉｗａｍｏｔｏ， Ｎ．ら、１９９５年 Ｂｌｏｏｄ ８５巻：
２２２８～２２３２頁、Ｎｅｖｏ， Ｙ．ら、２０１３年 Ｂｌｏｏｄ １２１巻：１２
９～１３５頁）。ＳＡＣＴおよびＤＴＡＣなどの補体阻害剤は、これらの障害の処置に有
用であることが、本明細書で想定される。
Ｆｏｄｏｒらは、ＣＤ５５およびＣＤ５９の組み合わされた特性を含む膜会合型組換え
分子を記載している（Ｆｏｄｏｒ， Ｗ．Ｌ．ら、１９９５年 Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １
５５巻：４１３５～４１３８頁）。同様に、Ｋｒｏｓｈｕｓらは、ＣＤ４６およびＣＤ５
５の特性を組み合わせる可溶性分子を記載しており、この分子が、ブタヒト間の移植モデ
ルにおいて急性心組織傷害を低減できたことを実証した（Ｋｒｏｓｈｕｓ， Ｔ．Ｊ．ら
、２０００年 Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６９巻：２２８２～２２８９頁）。Ｃ
Ｒ２およびＨ因子由来の選択されたドメインから構成される組換えタンパク質は、ループ
スのマウスモデルにおいて、増加した生存、低減した自己抗体産生および改善された腎臓
機能を実証した（Ｓｅｋｉｎｅ， Ｈ．ら、２０１１年 Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕ
ｍ ６３巻：１０７６～１０８５頁）。しかし、これらの研究のいずれも、遺伝子治療ア
プローチを介して組換えタンパク質を送達したわけではなかった。
本明細書のｉｎ ｖｉｖｏ実施例のために、ＡＡＶ８カプシドでシュードタイプ化（ｐ
ｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）されたＡＡＶ２（ＡＡＶ２／８）を使用した。このベクターは、
マウスの肝臓の非常に高い効率の形質導入を有することが示されている（Ｐａｎｅｄａ，
Ａ．ら、２００９年 Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０巻：９０８～９１７頁）。大
量のヒトＭＡＣがマウス肝臓上に容易に形成し得るので、このｉｎ ｖｉｖｏ実施例は、
肝臓において一部実施された（Ｇａｎｄｈｉ， Ｊ．ら、２０１１年 ＰＬｏＳ Ｏｎｅ
６巻：ｅ２１６２１頁）。さらに、肝細胞は、補体の血漿成分の８０～９０％の生合成
を担うので、肝臓が一部において選択された（Ｑｉｎ， Ｘ．ら、２００６年 Ｃｅｌｌ
Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３巻：３３３～３４０頁）。最終的に、肝臓は総血流の２５
％を受け、循環系を通じたＤＴＡＣおよびＳＡＣＴの広い分布を可能にし、このことは補
体の活性化が関与する全身障害の処置にとって重要である（Ｍｙｅｒｓ， Ｊ．Ｄ．ら、
１９４８年 Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２７巻：６２０～６２７頁）。ｉｎ ｖｉｖ
ｏでのＤＴＡＣおよびＳＡＣＴの発現は、両方が、ｉｎ ｖｉｖｏ設定におけるヒト補体
の強力な阻害剤であることを示しており、本明細書の実施例に示されるデータは、肝臓か
ら分泌された場合のこれらの分子の治療的価値への支持を与える。
補体調節領域の順序が機能的能力に影響を与えるかどうかを調査するために、本明細書
で提供されるタンパク質を、活性化された補体の可溶性ターミネーター（ＳＴＡＣ）、２
０１４年１１月４日に発行した米国特許第８，８７７，８９６号と比較してアッセイした
。ＳＴＡＣは、以下を含む：ＳＴＡＣのＮ末端は、ヒトＣＤ５９開始コドン、分泌シグナ
ルペプチドおよびＳＣＲドメインを含む；ポリグリシンリンカーは、ヒトＣＤ４６の４つ
のＳＣＲドメインおよびＳ／Ｔ－リッチ領域を、ＣＤ５９のＣ末端に結合させる；ならび
にヒトＣＤ５５の４つのＳＣＲドメインおよびＳ／Ｔ－リッチ領域が、ポリグリシン配列
を介して、ＣＤ４６のＣ末端に連結される（図９）。ＳＴＡＣのｃ－ＤＮＡを調製し、タ
ンパク質を、ＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ－アクチンプロモーター（ＣＡＧ）とウサ
ギグロビンポリアデニル化（ｐＡ）終結配列との間で発現させた（同書）。
ＣＤ４６、ＣＤ５５およびＣＤ５９成分の各々の機能性を、本明細書の実施例に記載さ
れるように、ＳＴＡＣにおいて個々に測定した。ＳＴＡＣ中のＣＤ５９部分は非機能的で
あったことが観察された。ＣＤ５９は、補体系の最終経路の強力な阻害剤である（Ｒｏｌ
ｌｉｎｓ ＳＡら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９０年；１４４巻（９号）：３４７８～
８３頁）。ＣＤ５９は、細胞膜傷害複合体（ＭＡＣ）中へのＣ９取込みを遮断し、それに
よって細胞膜における孔形成を遮断することによって機能する（Ｒｏｌｌｉｎｓ ＳＡら
、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９０年；１４４巻（９号）：３４７８～８３頁）。ＳＴＡ
ＣのＣＤ５９部分は、Ｃ９取込みを防止することができないことが観察された。したがっ
て、ＳＴＡＣのＣＤ５９部分は、非機能的であり、したがって、ＳＴＡＣのこの部分は、
補体の阻害剤としての機能に寄与しない。
本明細書の本発明は、ＣＤ４６、ＣＤ５５およびＣＤ５９の組合せ特性を示す機能的な
非膜会合型組換えタンパク質ＳＡＣＴを提供し、ＣＤ５５およびＣＤ５９の組合せ特性を
有する組換えタンパク質ＤＴＡＣもまた提供する。これらのタンパク質の各々は、それら
のモジュラー成分の特性および機能を驚くべきことに示すことが観察され、これらのタン
パク質の各々は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで、補体の活性化の強力な阻害
剤である。ＳＡＣＴタンパク質およびＤＴＡＣタンパク質の成分の各々は、ＳＴＡＣとは
対照的に、それらの生物学的機能を示すことが観察された。
ＳＡＣＴタンパク質
膜結合型ＣＤ５９は、細胞を補体媒介性疾患から保護することが以前に観察されたが、
この調節因子の発現の部位は、ＲＰＥなどの眼組織における保護の「パッチ」のみを生じ
た。したがって、網膜を介して拡散することが可能であり、罹患領域全体に対する保護を
提供する、ＣＤ５９の分泌型調節因子（ｓＣＤ５９またはｒｍｉＣＤ５９）を、本明細書
で作出する（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００９年２月１３日出願
の、Ｋｕｍａｒ－Ｓｉｎｇｈら、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０９／００９４７）。
可溶性ｓＣＤ５９は、膜標的化部分と融合させない限り、ｉｎ ｖｉｖｏでの補体の非
効率的な調節因子と以前にみなされた（Ｍｉｚｕｎｏら ２００１年 Ａｒｔｈｒｉｔｉ
ｓ Ｒｈｅｕｍ ４４巻：２４２５～２４３４頁；Ｂｏｒａ ２０１０年 Ｊ Ｂｉｏｌ
Ｃｈｅｍ ２８５巻：３３８２６～３３８３３頁；Ｓｏｎｇら ２００３年 Ｊ Ｃｌ
ｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１１巻：１８７５～１８８５頁；およびＺｈａｎｇら １９９９
年 Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０３巻：５５～６１頁）。アデノウイルスまたはＡ
ＡＶベクターを介してマウス眼組織においてｉｎ ｖｉｖｏで発現させた膜非依存的ｓＣ
Ｄ５９は、新生血管ＡＭＤのマウスモデルにおいて、ＭＡＣ沈着およびレーザー誘導性脈
絡膜新生血管を顕著に低減させた（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃａ
ｓｈｍａｎら ２０１１年 ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６巻（４号）：ｅ１９０７８頁）。アデ
ノウイルス送達されたｓＣＤ５９は、マウス肝臓脈管構造上でも、ヒトＭＡＣ沈着を阻害
することが観察された。
任意の特定の理論にも作用機構にも限定されることなく、ＣＤ５９タンパク質、ＣＤ４
６タンパク質およびＣＤ５５タンパク質の少なくとも２つを含む組換え融合タンパク質が
、いくつかの補体経路およびタンパク質の強力な調節因子であることが、本明細書で想定
される。本明細書の実施例は、補体カスケードをモジュレートすることによって補体関連
状態を処置するのに有効である、ＣＤ４６タンパク質、ＣＤ５５タンパク質およびＣＤ５
９タンパク質の各々の小さい機能的単位を有する新規可溶性活性補体ターミネーター（Ｓ
ＡＣＴ）を作出するための方法を提供し、そしてその組成物を提供する。得られたＳＡＣ
Ｔタンパク質組成物は、ある特定の実施形態では作動可能に連結した、ＣＤ４６タンパク
質、ＣＤ５５タンパク質およびＣＤ５９タンパク質の機能的単位を含む。例えば、これら
の機能的単位は、成分の機能にもタンパク質の構造的安定性にも影響を与えないアミノ酸
の配列であるリンカーによって接続される。さらに、このタンパク質は、ある特定の実施
形態では、タンパク質膜アンカーをコードする配列を除去または欠失するために変異させ
る。関連する実施形態では、例示的なＳＡＣＴタンパク質は、Ｎ末端に分泌シグナルを含
む。このＳＡＣＴタンパク質は、およそ１３０ＫＤａであり、補体調節に関与する各成分
タンパク質の単位／ドメインのみを保持するものが取得された。他の可溶性補体調節因子
、例えば、Ｈ因子（１５０ｋＤａ）およびｓＣＲ１（２００ｋＤａ）はより大きく、これ
らは、補体を調節するために使用されてきた（Ｒｉｐｏｃｈｅら １９８４年 Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ Ｊ ２２１巻：８９～９６頁；およびＹｏｏｎら １９８５年 Ｊ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ １３４巻：３３３２～３３３８頁）。
本明細書で作出された組換えＳＡＣＴタンパク質は、ＣＤ５９、ＣＤ４６およびＣＤ５
５タンパク質の異なる組合せ由来の複数の補体調節ドメインを含み、膜非依存的であるの
で、天然に存在する調節因子とは異なる。したがって、ＳＡＣＴタンパク質は、一度の単
回の投与の後に、拡散し、処置のために罹患細胞または組織の大きい群を覆うことが可能
である。例えば、このＳＡＣＴタンパク質は、ＣＤ４６タンパク質、ＣＤ５５タンパク質
およびＣＤ５９タンパク質の少なくとも２つ由来のアミノ酸配列を含む。例えば、このＳ
ＡＣＴタンパク質は、ＣＤ４６タンパク質およびＣＤ５９タンパク質、ＣＤ４６タンパク
質およびＣＤ５５タンパク質、ならびにＣＤ５５タンパク質およびＣＤ５９タンパク質の
少なくとも１つを含む。あるいは、このＳＡＣＴタンパク質は、作動可能に連結した、例
えば、可溶性形態で発現される、ＣＤ５９タンパク質、ＣＤ４６タンパク質およびＣＤ５
５タンパク質の各々を含む。種々の実施形態では、このＣＤ４６タンパク質、ＣＤ５５タ
ンパク質およびＣＤ５９タンパク質は、哺乳動物タンパク質（例えば、ヒト、マウスおよ
びウサギ）由来である。例えば、このＳＡＣＴタンパク質は、ヒトタンパク質であるＣＤ
４６タンパク質およびＣＤ５９タンパク質、ならびにマウスタンパク質であるＣＤ５５タ
ンパク質を含み、またはヒトタンパク質であるＣＤ４６、ＣＤ５５およびＣＤ５９の各々
を含む。したがって、種々の実施形態では、このＳＡＣＴタンパク質は、同じ哺乳動物型
由来であるタンパク質、または異なる型の哺乳動物由来であるタンパク質を含む。
任意の特定の理論にも作用機構にも限定されることなく、ＳＡＣＴタンパク質が、ＣＤ
５９タンパク質、ＣＤ４６タンパク質およびＣＤ５５タンパク質の各々によって調節され
る補体経路の各々を含む、補体経路中の複数のステップにおいて、補体活性化を相乗的に
遮断することが、本明細書で想定される。このＳＡＣＴタンパク質は、アデノウイルスベ
クターによって送達された場合にＭＡＣ沈着をｉｎ ｖｉｖｏで阻害したことが、本明細
書の実施例において観察され、したがって、補体関連の疾患または状態を処置するためま
たはさらには予防するための抗補体治療として、潜在的に有効である。
種々の実施形態では、ＳＡＣＴタンパク質または組成物は、シグナル配列および疎水性
膜貫通ドメインのアミノ酸配列を除去するように改変されたＣＤ４６の全長核酸によって
コードされるＣＤ４６タンパク質を含む。あるいは、ＣＤ４６タンパク質の核酸配列は、
得られたタンパク質が細胞膜に結合できないように、疎水性膜貫通ドメイン中に位置する
改変を有する改変されたアミノ酸配列をコードする核酸配列を取得するために、点変異、
置換または欠失によって改変される。
本明細書で使用される用語「膜非依存的ＣＤ４６」とは、疎水性膜貫通ドメインを欠く
、または細胞膜もしくは細胞膜会合型構造、例えば膜結合型タンパク質に結合する機能的
能力を欠く改変された疎水性膜貫通ドメインを有する、ＣＤ４６アミノ酸配列を指す。本
明細書のＣＤ４６タンパク質の範囲は、本明細書に記載された、欠失、置換および付加を
含む保存的配列改変を含むと想定される。
本明細書で使用する場合、用語「保存的配列改変」とは、そのアミノ酸配列を含むＣＤ
４６タンパク質の特徴に顕著には影響を与えない、またはかかる特徴を顕著には変更させ
ないアミノ酸改変を指し、即ち、アミノ酸配列中の同じ相対的位置において側鎖を提示す
るＣＤ４６タンパク質のアミノ酸配列は、ヒトＣＤ４６タンパク質と類似の様式で機能す
る。かかる保存的改変には、アミノ酸の置換、付加および欠失が含まれる。ＣＤ４６タン
パク質のアミノ酸配列の改変は、当該分野の任意の公知の技術、例えば、部位特異的変異
誘発またはＰＣＲベースの変異誘発を使用して達成される。かかる技術は、Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ
、１９８９年およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ、ＮＹ、１９８９年に記載されている。
保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、機能的に類似の側鎖を有するアミノ酸残基で
置き換えられるアミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、
当該分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例
えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパ
ラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アス
パラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）
、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、
プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば
、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チ
ロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。
ある特定の実施形態では、ＣＤ４６アミノ酸配列は、野生型配列のものと実質的に同一
であるアミノ酸配列である。用語「実質的に同一な」は、第１および第２のアミノ酸配列
が、共通の構造的ドメインおよび／または共通の機能的活性を有し得るように、第２のア
ミノ酸配列中の整列されたアミノ酸残基と同一である、十分なまたは最小の数のアミノ酸
残基を含む第１のアミノ酸配列を指すために、本明細書で使用される。例えば、少なくと
も約６０％の同一性、または少なくとも７５％、８５％、９５％、９６％、９８％もしく
は９９％の同一性を有する共通の構造的ドメインを含むアミノ酸配列は、実質的に同一で
ある。
配列間の配列同一性の計算は、以下のように実施される。２つのアミノ酸配列のパーセ
ント同一性を決定するために、これらの配列は、最適な比較目的のために整列される（例
えば、ギャップが、最適なアラインメントのために、第１および第２のアミノ酸配列の一
方または両方中に導入され得る）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位
置におけるアミノ酸残基が比較される。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する
位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められる場合、これらのタンパク
質は、その位置において同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の
最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長
さを考慮に入れた、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。
２つの配列間の配列の比較およびパーセント同一性の決定は、数学アルゴリズムを使用
して達成される。２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、デフォルトパラメーター
を使用するアラインメントソフトウェアプログラムを使用して決定される。適切なプログ
ラムには、例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２
２巻：４６７３頁、１９９４年によるＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ
／ｃｌｕｓｔａｌｗ）、ＴａｔｕｓｏｖａおよびＭａｄｄｅｎ、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． １７４巻：２４７頁、１９９９年によるＢＬ２ＳＥＱ（ｗｗｗ．
ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌ）、
ＮｏｔｒｅｄａｍｅおよびＨｉｇｇｉｎｓ、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
２４巻：１５１５頁、１９９６年によるＳＡＧＡ（ｉｇｓ－ｓｅｒｖｅｒ．ｃｎｒｓ－ｍ
ｒｓ．ｆｒ／～ｃｎｏｔｒｅｄ）、ならびにＭｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎら、Ｂｉｏｉｎｆｏ
ｒｍａｔｉｃｓ １４巻：２９０頁、１９９８年によるＤＩＡＬＩＧＮ（ｂｉｂｉｓｅｒ
ｖ．ｔｅｃｈｆａｋ．ｕｎｉ－ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ．ｄｅ／ｄｉａｌｉｇｎ）が含まれる
。
種々の実施形態では、ＳＡＣＴタンパク質または組成物は、ＣＤ５５タンパク質および
／またはＣＤ５９タンパク質を含む。種々の実施形態では、このＣＤ５５タンパク質は、
ＣＤ５５の全長核酸を含む。あるいは、このＣＤ５５タンパク質は、本明細書に記載され
る全長核酸配列またはアミノ酸配列の一部分またはホモログである。ある特定の実施形態
では、このＣＤ５５タンパク質は、ＣＤ５９タンパク質の保存的配列改変を含む。
成熟ヒトＣＤ５９タンパク質は、７７アミノ酸から構成され、約１８ｋＤ～約２１ｋＤ
の分子量を有する。前駆体ヒトＣＤ５９タンパク質は、２５アミノ酸のアミノ末端シグナ
ルペプチド、および膜アンカーの結合を可能にする、２６アミノ酸のカルボキシル末端ペ
プチドを含む。前駆体ヒトＣＤ５９タンパク質、成熟ヒトＣＤ５９タンパク質、ならびに
他の哺乳動物、例えば、ヒヒ、アフリカミドリザル、ヨザル、マーモセット、ＨＶＳ－１
５、ブタ、ウサギ、ラットおよびマウスのＣＤ５９タンパク質のアミノ酸配列は、その全
体が参照により本明細書に組み込まれる、２００７年１月２３日に発行した、Ｓｉｍｓら
、米国特許第７，１６６，５６８号に示されている。
ＣＤ５９のタンパク質構造は、３つのループおよび小さい４番目のらせんループと共に
疎水性コアを有する単一のシステイン－リッチドメインとして特徴付けられる（Ｙｕら、
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１８５巻（４号
）：７４５～７５３頁、１９９７年）。ジスルフィド結合したシステイン対が、これらの
ループの各々を接続する（Ｙｕら、１９９７年）。
ＣＤ５９をコードする遺伝子の構造は、特徴付けられている（１９９７年４月２９日に
発行した、Ｆｏｄｏｒら、米国特許第５，６２４，８３７号）。この遺伝子は、ヒトにお
ける第１１染色体の短腕、特に、染色体１１ｐ１３および１１ｐ１４上に位置し（Ｏｎｌ
ｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ受託番号１０７２
７１）、２０ｋｂに及ぶ４つのエクソンからなる（Ｐｅｔｒａｎｋａら Ｐｒｏｃ． Ｎ
ａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８９巻：７８７６～７８７９頁、１９９２年）。翻訳さ
れない１番目のエクソンには、コンセンサスＴＡＴＡまたはＣＡＡＴモチーフを欠くＧお
よびＣ－リッチプロモーター領域が先行する。２番目のエクソンは、タンパク質の疎水性
リーダー配列をコードし、３番目のエクソンは、成熟タンパク質のＮ末端部分をコードす
る。４番目のエクソンは、細胞膜へのグリコシルホスファチジルイノシトール（ｇｌｙｃ
ｏｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔａｌ）アンカー結合のための疎水性配列を含む、成熟タン
パク質の残部をコードする。
ＣＤ５９は、ヒト末梢血白血球、赤血球および多くの細胞株上で発現されるグリコシル
ホスファチジルイノシトールアンカー型糖タンパク質である。このタンパク質は、造血細
胞および非造血細胞の両方の上に、例えば、内皮細胞、末梢神経線維、ニューロン、ミク
ログリア、乏突起神経膠細胞、星状細胞、上衣細胞、上皮細胞、唾液腺の腺房細胞、気管
支上皮、腎尿細管および扁平上皮の上に発現される。Ｎｏｓｅ， Ｍ．ら １９９０年
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７０巻（２号）：１４５～１４９頁；Ｖｅｄｅｌｅｒ， Ｃ．ら
１９９４年 Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８２巻（４号）：５４２～５４７頁；およびＨｉ
ｄｅｓｔｉｍａ， Ｔ．ら １９９０年 Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６９巻（３号）：３９
６：４０１頁を参照のこと。ＣＤ５９をコードするｃＤＮＡは、Ｓａｗａｄａ， Ｒ．ら
１９８９年 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １７巻（１６号）６７２８頁によ
って報告された。ＣＤ５９をコードするｃＤＮＡは、ヒトＴ細胞白血病（ＹＴ）細胞株お
よびヒト赤白血病（Ｋ５６２）細胞株からもクローニングされており、ＣＤ５９は、ＣＯ
Ｓ細胞において一過的に発現されている（Ｗａｌｓｈ， Ｌ．Ａ．ら １９９０年 Ｅｕ
ｒ Ｊ． Ｉｍｍｏｌ ２１巻（３号）：８４７～８５０頁）。核酸配列によってコード
されるヒトＣＤ５９は、７７位のアミノ酸アスパラギンにおけるＧＰＩアンカーの結合の
ためのシグナル配列を含む、Ｃ末端に位置する２６アミノ酸を含む。ＣＤ５９の全長ｃＤ
ＮＡのアミノ酸配列は、１９９７年４月２９日に発行した、Ｆｏｄｏｒら、米国特許第５
，６２４，８３７号に示されている。
ＣＤ５９とＭＡＣの成分との物理的会合の分析は、ＣＤ５９に対する別々の結合部位が
、ヒトＣ８およびヒトＣ９の各々のα鎖内に含まれていることを示している（Ｋｉｍｂｅ
ｒｌｅｙら ２００７年 Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４４巻：７３～８１頁を参照のこと
）。ヒトＣＤ５９とヒトＣ９との相互作用のための結合部位は、成熟ヒトＣＤ５９の配列
中のアミノ酸残基４２～５８として同定されており、そのタンパク質のヒトアミノ酸残基
３３４～４１８に対応するヒトＣ９の領域、より詳細には、Ｃ９の予測された膜挿入ドメ
インのすぐＣ末端側のヒトＣ９アミノ酸残基３５９～３８４に結合する（その全体が参照
により本明細書に組み込まれる、１９９６年１１月８日に発行した、Ｓｉｍｓら、ＰＣＴ
／ＵＳ９６／１７９４０）。
公開されたＮＭＲデータからの成熟ヒトＣＤ５９の溶液構造およびＣＤ５９分子の活性
部分の知識から同定された、Ｃ８／Ｃ９に結合するのに利用可能である、活性な表面曝露
されたアミノ酸残基側鎖は、４４位のヒスチジン、４８位のアスパラギン、４９位のアス
パラギン酸、５１位および５２位のスレオニン、５５位のアルギニン、ならびに５８位の
グルタミン酸である。ＣＤ５９のＮＭＲ構造は、Ｋｉｅｆｆｅｒらによる寄託、Ｈｕｍａ
ｎ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＣＤ５９（Ｅｘｔ
ｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｒｅｇｉｏｎ、Ｒｅｓｉｄｕｅｓ １ ７０；ＮＭＲ、１０ Ｓ
ｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）、ＭＭＤＢ Ｉｄ：８９１、ＰＤＢ Ｉｄ：１ＥＲＨ；Ｋｉｅｆｆ
ｅｒらによる寄託、Ｈｕｍａｎ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ ＣＤ５９（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｒｅｇｉｏｎ、Ｒｅｓｉｄｕｅｓ
１ ７０；ＮＭＲ、Ｒｅｓｔｒａｉｎｅｄ）、ＭＭＤＢ Ｉｄ：８９０、ＰＤＢ Ｉｄ：
１ＥＲＧ；Ｆｌｅｔｃｈｅｒらによる寄託、ＣＤ５９ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ Ｗｉｔｈ
Ｇｌｃｎａｃ－Ｂｅｔａ－１，４－（Ｆｕｃ－Ａｌｐｈａ－１，６）－Ｇｌｃｎａｃ－Ｂ
ｅｔａ－１（ＮＭＲ、１０ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）、ＭＭＤＢ Ｉｄ：４９８、ＰＤＢ
Ｉｄ：１ＣＤＳ；Ｆｌｅｔｃｈｅｒらによる寄託、ＣＤ５９ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ Ｗ
ｉｔｈ Ｇｌｃｎａｃ－Ｂｅｔａ－１，４－Ｇｌｃｎａｃ－Ｂｅｔａ－１（ＮＭＲ、１０
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）、ＭＭＤＢ Ｉｄ：４９７、ＰＤＢ Ｉｄ：１ＣＤＲに記載さ
れている。Ｆｌｅｔｃｈｅｒらによる１ＣＤＳおよび１ＣＤＲ寄託。同じ相対的位置にお
いてこれらの側鎖を提示するＣＤ５９のアミノ酸配列は、ヒトＣＤ５９と類似の様式で機
能し（Ｓｉｍｓら）、かかるバリアントは、本明細書の方法、キットおよび医薬組成物の
範囲内である。
本明細書のＳＡＣＴタンパク質の構築において使用されるある特定の実施形態における
ＣＤ５９タンパク質は、機能的ＧＰＩアンカーのための一次アミノ酸配列を欠く。機能的
に等価なタンパク質である一実施形態は、機能的に欠損し、膜を標的化する能力を欠く、
改変されたＧＰＩアンカードメインアミノ酸配列を含む。膜非依存的ＣＤ５９タンパク質
を有するＳＡＣＴタンパク質を取得するさらなる方法には、膜会合の阻害剤を提供するこ
と、例えば、ＧＰＩアンカーが欠如するようにＣＤ５９をｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖ
ｉｔｒｏで合成することなどの、非組換え法が含まれる。膜非依存的ＣＤ５９を取得する
方法は、本明細書の実施例に示されている。分子の核酸配列およびアミノ酸配列を変更す
るためのさらなる組換え技術は、遺伝学および分子生物学の分野で周知である。
種々の実施形態では、この組成物は、７７位のアミノ酸アスパラギンをコードするヌク
レオチドにおけるＧＰＩアンカーの結合のためのシグナル配列を除去するように改変され
たＣＤ５９タンパク質の全長核酸を有するＣＤ５９タンパク質のアミノ酸配列を含む。あ
るいは、ＣＤ５９の核酸配列は、このタンパク質が細胞の膜に結合できないように、ＧＰ
Ｉアンカー位置において改変されたアミノ酸配列を有するアミノ酸配列をコードする核酸
配列を取得するために、１または複数の点変異、置換または欠失によって改変される。本
明細書で使用する用語「膜非依存的ＣＤ５９」とは、ＧＰＩアンカーを欠く、または機能
を欠く、即ち、細胞膜もしくは細胞膜会合型構造、例えば膜結合型タンパク質に結合する
能力を欠く改変されたＧＰＩアンカーを有する、ＣＤ５９アミノ酸配列を指す。
ＧＰＩアンカリングには、多数の遺伝子産物の相互作用を含む、小胞体中の複数ステッ
プの経路が関与する。ＣＤ５９を含む多くのタンパク質が、細胞表面においてＧＰＩが発
現され、有効に機能することを必要とする。タンパク質シグナル中の構造がＧＰＩアンカ
ーの結合をコードする機構は、Ｏｒｌｅａｎ， Ｐ．ら ２００７年 ＪＬＲ ４８巻：
９９３～１０１１頁によって概説されている。ＧＰＩ結合には一般に、タンパク質をＥＲ
に標的化する疎水性Ｎ末端分泌シグナルおよびＣ末端ＧＰＩシグナルアンカー配列を含む
アミノ酸配列が関与する。ＧＰＩが連結されるアミノ酸は、オメガ（ω）残基と称され、
オメガ残基に対してＮ末端側のアミノ酸は、オメガ－マイナス（ω－）と称され、オメガ
残基に対してＣ末端側のアミノ酸は、オメガ－プラス（ω＋）と称される。ＧＰＩアンカ
ー配列は、可撓性リンカー領域を形成する約１０個の極性アミノ酸（即ち、ω－１０～ω
－１）、例えば、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、
またはグルタミン酸のストレッチを含む。このω残基は、グリシン、アラニン、セリン、
アスパラギン、アスパラギン酸またはシステインの１つであることが観察されている。オ
メガ位置のアミノ酸をコードする核酸の置換および欠失を含む変異は、ＧＰＩアンカーの
結合を低減もしくは排除するため、またはＧＰＩアンカーの有効な機能性を低減もしくは
排除するために使用される。例えば、かかるバリエーションは、疎水性ロイシンをコード
する核酸（例えば、核酸ＣＴＧ）およびアラニンをコードする核酸（例えば、核酸ＧＣＡ
）を、より疎水性が低い（即ち、より親水性が高い）アミノ酸であるグリシンをコードす
る核酸（例えば、核酸ＣＡＧ）およびグルタミン酸をコードする核酸（例えば、核酸ＧＡ
Ａ）で置換することを含む。あるいは、バリエーションは、ω残基を別のアミノ酸で置換
すること、例えば、チロシンをグリシンに置換することを含む。
ＧＰＩアンカリングに関与しないタンパク質の他の部分中に、本明細書のＳＴＡＣタン
パク質は、保存的配列改変を有するＣＤ５９タンパク質由来のアミノ酸配列を含む。本明
細書で使用する場合、用語「保存的配列改変」とは、そのアミノ酸配列を含むＣＤ５９タ
ンパク質もしくは膜非依存的ＣＤ５９の特徴に顕著には影響を与えない、またはかかる特
徴を顕著には変更させないアミノ酸改変を指し、即ち、同じ相対的位置においてこれらの
側鎖を提示するＣＤ５９のアミノ酸配列は、ヒトＣＤ５９と類似の様式で機能する。かか
る保存的改変には、アミノ酸の置換、付加および欠失が含まれる。ＣＤ５９のアミノ酸配
列の改変は、当該分野の任意の公知の技術、例えば、部位特異的変異誘発またはＰＣＲベ
ースの変異誘発を使用して達成される。かかる技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ、１９８９年および
Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９
８９年に記載されている。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有する
アミノ酸残基で置き換えられるアミノ酸置換であり、例えば、小さいアミノ酸を異なる小
さいアミノ酸で置き換える、親水性アミノ酸を異なる親水性アミノ酸で置き換えるなどで
ある。
本明細書の実施例は、ＳＡＣＴが、古典的補体経路および第二補体経路を負にモジュレ
ートし、補体関連状態を処置するように、ＣＤ４６タンパク質、ＣＤ５５タンパク質およ
びＣＤ５９タンパク質の各々由来のアミノ酸配列を有する、キメラの、活性化された補体
の可溶性ターミネーター（ＳＡＣＴ）タンパク質、ならびにこの組換えＳＡＣＴタンパク
質をコードおよび発現するように作出された核酸を有する、方法、組成物およびキットを
含む。あるいは、このＳＡＣＴタンパク質は、ＣＤ４６タンパク質、ＣＤ５５タンパク質
およびＣＤ５９タンパク質の少なくとも２つ由来のアミノ酸配列を含む。本明細書および
特許請求の範囲で使用する語句「補体関連（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－ｒｅｌａｔｅｄ）」
は、限定なしに「補体関連の（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）」を含み
、補体経路によって影響される任意の細胞または組織を指す。補体関連障害または状態の
例には、黄斑変性、ループス腎炎、シェーグレン症候群、臓器グラフト拒絶、喘息および
慢性閉塞性肺疾患が含まれる。
ベクター
補体関連障害を処置または予防するための本明細書の方法は、細胞を、Ｃ３タンパク質
、ＣＤ４６タンパク質、ＣＤ５５タンパク質、ＳＡＣＴタンパク質またはＤＴＡＣタンパ
ク質を含む医薬組成物と接触させるステップを含み、タンパク質は組換え産生される。用
語「組換え」とは、遺伝子改変された生物、例えば微生物の操作によって産生されたタン
パク質を指す。
タンパク質の例示的な供給源には、タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が含
まれ、例えば、タンパク質をコードするヌクレオチド配列または機能的等価物は、適切な
発現ベクター、即ち、組換えタンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に
作動可能に連結した挿入されたコード配列の転写および翻訳を調節するエレメントをコー
ドする必要な核酸を含むベクター中に挿入される。
当業者に周知である方法が、適切な転写および翻訳制御エレメントに作動可能に連結し
た、タンパク質をコードする配列を含む発現ベクターを構築するために使用される。これ
らの方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術およびｉｎ ｖｉｖｏ組換
えまたは遺伝子組換えが含まれる。かかる技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ、１９８９年に記載され
ている。
種々の市販の発現ベクター／宿主系が、タンパク質コード配列を保有および発現するた
めに有用である。これらには、微生物、例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミド
またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌；酵母発現ベクターで形質転換
された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）と接触させた昆虫細胞
系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコ
モザイクウイルス、ＴＭＶ）でトランスフェクトされた、もしくは細菌発現ベクター（例
えば、Ｔｉ、ｐＢＲ３２２またはｐＥＴ２５ｂプラスミド）で形質転換された植物細胞系
；または動物細胞系が含まれるがこれらに限定されない。Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗ
ｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９８９年を参照のこと。
ウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随
伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターおよびヘルパー依存的アデノウイルスベクターが含まれる
がこれらに限定されない。例えば、ウイルスベクターは、補体関連状態を本明細書で示さ
れるように処置するＳＡＣＴタンパク質またはＤＴＡＣタンパク質をコードする核酸配列
を送達する。アデノウイルスパッケージングベクターは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から
市販されている。アデノウイルスベクターを構築する方法およびアデノウイルスベクター
を使用する方法は、Ｋｌｅｉｎら、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ、１１４巻：２５３～２
６２頁、２００７年およびｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｅｐｉｄｅｍｉ
ｏｌ．、１８巻：８４５～８５４頁、２００３年に示されている。
アデノウイルスベクターは、真核生物遺伝子発現（Ｌｅｖｒｅｒｏら、Ｇｅｎｅ、１０
１巻：１９５～２０２頁、１９９１年）およびワクチン開発（Ｇｒａｈａｍら、Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ
ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ７、（Ｍｕｒｒａｙ編）、Ｈｕｍ
ａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｌｉｆｔｏｎ、ＮＪ、１０９～１２８頁、１９９１年）において
使用されてきた。さらに、組換えアデノウイルスベクターは、遺伝子治療のために使用さ
れる（Ｗｕら、米国特許第７，２３５，３９１号）。
組換えアデノウイルスベクターは、例えば、シャトルベクターとプロウイルスベクター
との間の相同組換えから生成される（Ｗｕら、米国特許第７，２３５，３９１号）。本明
細書のアデノウイルスベクターは、複製欠損であり、例えば、条件的に欠損であり、アデ
ノウイルス領域を欠き、そしてペプチドまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチド
は、コード配列が除去された位置に導入される。あるいは、目的の遺伝子をコードするポ
リヌクレオチドは、別の領域中に挿入される。
ヘルパー細胞株は、ヒト細胞、例えば、２９３ヒト胚腎臓細胞、筋肉細胞、造血細胞ま
たは他のヒト胚間葉系もしくは上皮細胞から誘導され得る。あるいは、ヘルパー細胞は、
ヒトアデノウイルスに対して許容的な他の哺乳動物種の細胞、例えば、Ｖｅｒｏ細胞また
は他のサル胚間葉系もしくは上皮細胞から誘導され得る。ヘルパー細胞株を使用するこれ
らの複製欠損アデノウイルスベクターの生成および繁殖は、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ． Ｇｅ
ｎ． Ｖｉｒｏｌ．、３６巻：５９～７２頁、１９７７年に記載されている。
レンチウイルスベクターパッケージングベクターは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）から市販されている。レンチウイルスベクタ
ーの産生のためのＨＩＶベースのパッケージングシステムは、Ｎａｌｄｉｎｉら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２７２巻：２６３～２６７頁、１９９６年；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、Ｎａｔｕｒ
ｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５巻：８７１～８７５頁、１９９７年；およびＤｕｌｌ
ら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２巻：８４６３～８４７１頁、１９９８年中の構築物を使用
して調製される。
いくつかのベクター構築物は、第３世代レンチウイルスＳＩＮベクター骨格に基づくシ
ステムを使用してパッケージングされるのに利用可能である（Ｄｕｌｌら、Ｊ． Ｖｉｒ
ｏｌ． ７２巻：８４６３～８４７１頁、１９９８年）。例えば、ベクター構築物ｐＲＲ
ＬｓｉｎＣＭＶＧＦＰｐｒｅは、ＨＩＶプロモーター配列がラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ
）のもので置き換えられた５’ＬＴＲ、Ｕ３プロモーター領域中に欠失を含む自己不活化
性３’ＬＴＲ、ＨＩＶパッケージングシグナル、ＣＭＶプロモーターによって駆動される
ＡｅｑｕｏｒｅａクラゲＧＦＰからなるマーカー遺伝子カセットに連結されたＲＲＥ配列
、および核外輸送を増強すると考えられるウッドチャック肝炎ウイルスＰＲＥエレメント
を含む。ＧＦＰマーカー遺伝子は、ＵＶ蛍光顕微鏡法またはフローサイトメトリーの直接
観察による、トランスフェクションまたは形質導入効率の定量化を可能にする（Ｋａｆｒ
ｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．、１７巻：３１４～３１７頁、１９９７年およびＳａ
ｋｏｄａら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｃａｒｄｉｏｌ．、３１巻：２０３７～２０
４７頁、１９９９年）。
ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を含むレトロウイルスベクターを構築す
るためのレトロウイルス核酸の操作、およびパッケージング細胞の操作は、当該分野にお
いて公知の技術を使用して達成される。Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９２年、１巻、ＩＩＩ節
（ユニット９．１０．１～９．１４．３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年． Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． 第２版
． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ． ７巻：９８１～９９０頁、１９８９年；Ｅｇｌｉｔｉｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ． ６巻：６０８～６１４頁、１９８８年；米国特許第４，６５０，７６４号
、同第４，８６１，７１９号、同第４，９８０，２８９号、同第５，１２２，７６７号お
よび同第５，１２４，２６３号；ならびにＰＣＴ特許公開番号ＷＯ８５／０５６２９、Ｗ
Ｏ８９／０７１５０、ＷＯ９０／０２７９７、ＷＯ９０／０２８０６、ＷＯ９０／１３６
４１、ＷＯ９２／０５２６６、ＷＯ９２／０７９４３、ＷＯ９２／１４８２９およびＷＯ
９３／１４１８８を参照のこと。
レトロウイルスベクターが構築され、広宿主性パッケージングシステムを使用して非感
染性形質導入性ウイルス粒子（ビリオン）中にパッケージングされる。かかるパッケージ
ングシステムの例は、例えば、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６巻
：２８９５～２９０２頁、１９８６年；Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６
２巻：１１２０～１１２４頁、１９８８年；Ｃｏｓｓｅｔら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６４
巻：１０７０～１０７８頁、１９９０年；米国特許第４，６５０，７６４号、同第４，８
６１，７１９号、同第４，９８０，２８９号、同第５，１２２，７６７号および同第５，
１２４，２６３号、ならびにＰＣＴ特許公開番号ＷＯ８５／０５６２９、ＷＯ８９／０７
１５０、ＷＯ９０／０２７９７、ＷＯ９０／０２８０６、ＷＯ９０／１３６４１、ＷＯ９
２／０５２６６、ＷＯ９２／０７９４３、ＷＯ９２／１４８２９およびＷＯ９３／１４１
８８中に見出される。
「産生細胞」の生成は、本明細書で「形質導入する」、「トランスフェクトする」また
は「感染する」と称される接触させるプロセスである、パッケージング細胞中にレトロウ
イルスベクターを導入することによって達成される。かかるレトロウイルスベクターの例
は、例えば、Ｋｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ
． ８４巻：２１５０～２１５４頁、１９８７年；Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎら、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８巻：３５８７～３５９６頁、１９９０年；米国特許
第４，４０５，７１２号、同第４，９８０，２８９号および同第５，１１２，７６７号；
ならびにＰＣＴ特許公開番号ＷＯ８５／０５６２９、ＷＯ９０／０２７９７およびＷＯ９
２／０７９４３中に見出される。
ヘルペスウイルスパッケージングベクターは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａ
ｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から市販されている。例示的なヘルペスウイルスは
、α－ヘルペスウイルス、例えば、水痘帯状疱疹ウイルスまたは仮性狂犬病ウイルス；単
純ヘルペスウイルス、例えば、ＨＳＶ－１またはＨＳＶ－２；およびヘルペスウイルス、
例えば、エプスタイン・バーウイルスである。ほとんどのヘルペスウイルスにとって有能
であるヘルパーウイルスの非存在下で、所望のヌクレオチドセグメント、例えばヌクレオ
チドまたはポリヌクレオチド配列を伴ってパッケージングされ得る空のヘルペスウイルス
粒子を調製するための方法は、Ｆｒａｅｆｅｌら（１９９９年１２月７日に発行した、米
国特許第５，９９８，２０８号）に示されている。
ヘルペスウイルスＤＮＡベクターは、当業者に知られた技術を使用して構築され得る。
例えば、ヘルペスウイルスのゲノム全体をコードするＤＮＡセグメントは、大きいＤＮＡ
セグメントを保有することが可能ないくつかのベクター、例えば、コスミド（Ｅｖａｎｓ
ら、Ｇｅｎｅ ７９巻、９～２０頁、１９８９年）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）（Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋ， Ｊ．ら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯ
ＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年）またはＥ．ｃｏｌｉ Ｆ
エレメントプラスミド（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４巻：１３０７～１
３１３頁、１９８９年）間で分割される。
例えば、エプスタイン・バーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、仮性狂犬病ウイルスお
よびＨＳＶ－１を含む種々のヘルペスウイルスのゲノム全体を提示する重複するクローン
を含むコスミドのセットが、単離されている。Ｍ． ｖａｎ Ｚｉｊｌら、Ｊ． Ｖｉｒ
ｏｌ． ６２巻、２１９１頁、１９８８年；Ｃｏｈｅｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａ
ｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０巻、７３７６頁、１９９３年；Ｔｏｍｋｉｎｓ
ｏｎら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７巻、７２９８頁、１９９３年；およびＣｕｎｎｉｎｇ
ｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９７巻、１１６頁、１９９３年を参照のこと。
ＡＡＶは、培養細胞における増殖性感染を受けるために、別のウイルス（アデノウイル
ス、またはヘルペスウイルスファミリーのメンバーのいずれか）との共感染に依存すると
いう点で、依存的パルボウイルスである（Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５８巻：９７ １２９頁、１９９２年）。例えば、組
換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルスは、目的の遺伝子、例えば、２つのＡＡＶ末端反復（Ｍ
ｃＬａｕｇｈｌｉｎら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、６２巻（６号）：１９６３ １９７３頁、
１９８８年；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ、６３巻：３８２２ ３８２８頁、
１９８９年）が隣接した目的の遺伝子を含むプラスミド、および末端反復なしの野生型Ａ
ＡＶコード配列を含む発現プラスミドを共トランスフェクトすることによって作製される
。また、細胞をアデノウイルス、またはＡＡＶヘルパー機能に必要なアデノウイルス遺伝
子を保有するプラスミドと接触させるまたは細胞にそれらをトランスフェクトする。かか
る様式で作製された組換えＡＡＶウイルスストックは、組換えＡＡＶ粒子から（例えば、
塩化セシウム密度遠心分離によって）物理的に分離されなければならないアデノウイルス
を含む。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）パッケージングベクターは、ＧｅｎｅＤｅｔｅｃｔ（Ａ
ｕｃｋｌａｎｄ、Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ）から市販されている。ＡＡＶは、高頻度の組
込みを有し、非分裂細胞に感染することが示されており、これが、ＡＡＶを、組織培養物
中の哺乳動物細胞中への遺伝子の送達のために有用なものにしている（Ｍｕｚｙｃｚｋａ
、Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５８巻：９７ １２９頁
、１９９２年）。ＡＡＶは、感染性に関して広い宿主範囲を有する（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ
ら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、４巻：２０７２ ２０８１頁、１９８４年；Ｌ
ａｕｇｈｌｉｎら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、６０巻（２号）：５１５ ５２４頁、１９８６
年；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、８巻（１０号）：３９
８８ ３９９６頁、１９８８年；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、６２巻
（６号）：１９６３ １９７３頁、１９８８年）。
ＡＡＶベクターを構築する方法およびＡＡＶベクターを使用する方法は、例えば、米国
特許第５，１３９，９４１号および同第４，７９７，３６８号に記載されている。遺伝子
送達におけるＡＡＶの使用は、ＬａＦａｃｅら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１６２巻（２号）：
４８３ ４８６頁、１９８８年；Ｚｈｏｕら、Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ、２１巻：９２
８ ９３３頁、１９９３年；Ｆｌｏｔｔｅら、Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｅｌｌ
Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、７巻（３号）：３４９ ３５６頁、１９９２年；およびＷａｌ
ｓｈら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ、９４巻：１４４０ １４４８頁、１９９４年
にさらに記載されている。
組換えＡＡＶベクターは、マーカー遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで
の形質導入（Ｋａｐｌｉｔｔら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．、８巻（２号）：１４８ ５４頁
、１９９４年；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、８巻（１０
号）：３９８８ ３９９６頁、１９８８年；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１０
巻：３９４１ ３９５０頁、１９９１年；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ、Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ、１巻：１６５ １６９頁、１９９４年；Ｙｏｄｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、
８２巻（補遺）：１巻：３４７Ａ頁、１９９４年；Ｚｈｏｕら、Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏ
ｌ、２１巻：９２８ ９３３頁、１９９３年；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌ
ｌ． Ｂｉｏｌ．、５巻：３２５８ ３２６０頁、１９８５年；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら
、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、６２巻（６号）：１９６３ １９７３頁、１９８８年）、ならび
にヒト疾患に関与する遺伝子の形質導入（Ｆｌｏｔｔｅら、Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ
． Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、７巻（３号）：３４９ ３５６頁、１９９２年；
Ｏｈｉら、Ｇｅｎｅ、８９巻（２号）：２７９ ２８２頁、１９９０年；Ｗａｌｓｈら、
Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ、９４巻：１４４０ １４４８頁、１９９４年；および
Ｗｅｉら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１巻：２６１ ２６８頁、１９９４年）のために
、首尾よく使用されてきた。
ある特定の実施形態では、本明細書のベクターは、ウイルス粒子と関連せず、標的細胞
または組織に遺伝子材料を特異的に送達する、非ウイルスベクター、例えば、合成遺伝子
送達ビヒクルまたはベクターである。非ウイルスベクターの例には、リポソーム、ペプチ
ド、ナノ粒子、エマルジョン、もしくはカプセル化された２つまたはそれ超の相系、また
は他の適切な調製物が含まれる。したがって、ある特定の実施形態では、方法、キットま
たは組成物は、ロードされ、組織または細胞に接触させる核酸を有する非ウイルスベクタ
ーを含む。例えば、タンパク質をコードする裸のＤＮＡを含むリポソームは、リポソーム
中にカプセル化され、このリポソームは、核酸が、補体関連疾患の処置のために組織また
は細胞に有効に送達されるように、組織または細胞に接触させる。
医薬組成物
本発明の一態様は、補体タンパク質または経路を負にモジュレートすることによって補
体関連障害を処置するための、ＣＤ４６タンパク質、ＣＤ５５タンパク質、ＤＴＡＣタン
パク質およびＳＡＣＴタンパク質、またはそのタンパク質をコードおよび発現する核酸の
少なくとも１つを含む医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態では、この医薬組成物
は、被験体への全身送達のために構成され、例えば、この組成物は、注射剤として製剤化
される。この組成物は、別の一実施形態では、眼への投与のための眼科学的製剤として製
剤化され、眼底への送達のため、もしくは網膜における局所的放出のために構成され得、
または眼組織に負に影響を与える補体障害に関与する血管および／もしくは組織の有効な
処置を提供するために他の方法で製剤化される。関連の実施形態では、この医薬組成物は
、ヒト被験体への、例えば、ヒト被験体の脈管系または内皮系への投与のために、十分に
純粋で製剤化される。ある特定の実施形態では、これらの組成物は、任意選択で、１また
は複数のさらなる治療剤をさらに含む。ある特定の実施形態では、このさらなる治療剤（
単数または複数）は、増殖因子、抗炎症剤、一酸化窒素およびカルシウムチャネルブロッ
カーが含まれるがこれらに限定されない血管収縮剤、コラゲナーゼ阻害剤、外用ステロイ
ド、マトリクスメタロプロテイナーゼ阻害剤、アスコルベート、アンジオテンシンＩＩ、
アンジオテンシンＩＩＩ、カルレティキュリン、テトラサイクリン、フィブロネクチン、
コラーゲン、トロンボスポンジン、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、ケラチノ
サイト増殖因子（ＫＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インスリン様増殖因子（Ｉ
ＧＦ）、ＩＧＦ結合性タンパク質（ＩＧＦＢＰ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来
増殖因子（ＰＤＧＦ）、ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、脈管内
皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ヘパリン結合性ＥＧＦ（ＨＢＥＧＦ）、トロンボスポンジン、
フォン・ヴィルブランド因子－Ｃ、ヘパリンおよびヘパリン硫酸、ならびにヒアルロン酸
からなる群より選択される。
ある特定の実施形態では、複数の治療剤が、同じ、同時発生的なまたは関連の症状、状
態または疾患を処置するために、医薬組成物中に含まれる。一部の実施形態では、この治
療剤は、抗凝固剤、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗マイコバクテリア剤、抗真菌剤
、抗増殖剤または抗アポトーシス剤が限定なしに含まれ得る薬物である。本発明の組成物
中に含まれる薬物は、当該分野で周知である。例えば、それらの全体が参照により本明細
書にその内容が組み込まれる、Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａ
ｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第９版、Ｈ
ａｒｄｍａｎら編、ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ、１９９６年を参照のこと。
本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容される担体」には、所望の特定の剤形に
適した、ありとあらゆる溶媒、希釈剤または他の液体ビヒクル、分散または懸濁助剤、表
面活性剤、等張剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ ａｇｅｎｔ）、増粘または乳化剤、防腐剤、固体
結合剤、滑沢剤などが含まれる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ
ｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｅａｓｔ
ｏｎ、ＰＡ、１９９５年は、医薬組成物を製剤化する際に使用される種々の担体、および
その調製のための公知の技術を提供している。薬学的に許容される担体として機能し得る
材料の一部の例には、糖、例えば、グルコースおよびスクロース；賦形剤、例えば、カカ
オ脂および坐剤ワックス；油、例えば、ピーナツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリ
ーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油；グリコール、例えば、プロピレングリコール；
エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；寒天（ａｇａｒ）；緩衝
剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；アルギン酸；発熱物質を含
まない水；等張性食塩水；リンゲル溶液；エチルアルコール；ならびにリン酸塩緩衝溶液
が含まれるがこれらに限定されず、他の非毒性の適合性滑沢剤、例えば、ラウリル硫酸ナ
トリウムおよびステアリン酸マグネシウム、ならびに着色剤、放出剤（ｒｅｌｅａｓｉｎ
ｇ ａｇｅｎｔ）、コーティング剤、防腐剤および抗酸化剤もまた、この組成物中に存在
し得、薬剤および非刺激性濃度の選択は、処方者の判断に従って決定される。
治療有効用量
本明細書で提供される方法は、細胞または組織を医薬組成物と接触させるステップ、例
えば、補体関連状態の徴候の低減または予防を含む所望の結果を達成するために必要な量
で、そのような時間にわたって、それを必要とする被験体に、ＣＤ４６タンパク質、ＣＤ
５５タンパク質、ＤＴＡＣタンパク質およびＳＡＣＴタンパク質、タンパク質をコードす
る核酸またはこのタンパク質の発現の供給源の少なくとも１つを活性薬剤として有する医
薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む。
本発明の方法に従う組成物は、補体関連障害を処置するために有効な任意の量および任
意の投与経路を使用して投与され得る。したがって、表現「補体関連疾患または状態を処
置するために有効な量」とは、本明細書で使用する場合、その疾患または状態の症状を有
益に予防または改善するのに十分な組成物の量を指す。
正確な投薬量は、処置される患者を考慮して個々の医師によって選択される。投薬量お
よび投与は、十分なレベルの活性薬剤（複数可）を提供するため、または所望の効果を維
持するために調整される。考慮され得るさらなる因子には、疾患状態の重症度、例えば、
中間段階または進行段階の黄斑変性；患者の年齢、体重および性別；食餌、投与の時間お
よび頻度；投与経路；薬物組合せ；反応感受性；ならびに治療に対する耐性／応答が含ま
れる。長時間作用性の医薬組成物は、特定の組成物の半減期およびクリアランス速度に依
存して、毎時、１時間に２回、３～４時間毎、毎日、１日２回、３～４日毎、毎週、また
は２週間に１回投与され得る。
本発明の活性薬剤は、好ましくは、投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、投薬
単位形態で製剤化される。本明細書で使用する表現「投薬単位形態」とは、処置される患
者に適切な活性薬剤の、物理的に分離した単位を指す。しかし、本発明の組成物の合計１
日使用量は、健全な医学的判断の範囲内で、担当医によって決定されることが理解される
。任意の活性薬剤のために、治療有効用量は、細胞培養アッセイ、または本明細書で提供
されるような、通常はマウスであるが、潜在的にはラット、ウサギ、イヌもしくはブタ由
来の動物モデルのいずれかにおいて、最初に推定され得る。本明細書で提供される動物細
胞モデルおよびｉｎ ｖｉｖｏモデルは、所望の濃度および合計投薬範囲および投与経路
を達成するためにも使用される。次いで、かかる情報は、ヒトでの投与のために有用な用
量および経路を決定するために使用され得る。
治療有効用量とは、症状もしくは状態を改善する、または疾患もしくは状態の進行を予
防する、活性薬剤の量を指す。活性薬剤の治療効力および毒性、例えば、ＥＤ５０（この
用量は、集団の５０％において治療的に有効である）およびＬＤ５０（この用量は、集団
の５０％にとって致死である）は、細胞培養物または実験動物において標準的な製薬手順
によって決定され得る。毒性効果対治療効果の用量比は、治療指数であり、比ＬＤ５０／
ＥＤ５０として表現され得る。大きい治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養ア
ッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒト使用のための一定範囲の投薬量を製剤
化する際に使用される。
製品の１日投薬量は、成人ヒト１人当たり１日に０．００１から１０００ｍｇ（１グラ
ム）までなどの、広い範囲にわたって変動し得る。眼投与のために、これらの組成物は、
例えば、処置される患者への投薬量の対症的調整のために、０．００１、０．０１、０．
０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０
．０、１００．０、２５０．０または５００．０マイクログラムの活性成分を含む溶液の
形態で提供される。
単位用量は、典型的には、約０．００１マイクログラムから約５００マイクログラムま
での活性成分、好ましくは約０．１マイクログラムから約１００マイクログラムまでの活
性成分、より好ましくは約１．０マイクログラムから約１０マイクログラムまでの活性成
分を含む。薬物の有効量は、通常、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重／日から約２５ｍｇ／
ｋｇ体重／日までの投薬量レベルで供給される。例えば、この範囲は、約０．００１ｍｇ
／ｋｇ体重／日から１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、または約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重／日か
ら１ｍｇ／ｋｇ体重／日までである。これらの組成物は、例えば、１日に１～４回または
それ超のレジメンで、投与され得る。単位用量は、分割され得、例えば、２またはそれ超
の分割された用量で投与され得る。
タンパク質の発現の供給源の投与は、ある用量のウイルスベクターまたは核酸ベクター
の投与であり、例えば、この用量は、処置される細胞１つ当たり、少なくとも約５０、１
００、５００、１０００または少なくとも約５０００の粒子を含む。あるいは、ウイルス
ベクターまたは核酸ベクターの用量は、少なくとも約１０４～約１０５；約１０５～約１
０６；１０６～約１０７；１０７～約１０８；約１０８～約１０９；約１０９～約１０１
０；または少なくとも約１０１０～約１０１１である。細胞数を処置するのに有効な用量
は、当業者に公知の方法によって、処置を必要とする面積から計算され得る。
医薬組成物の投与
所望の投薬量で、適切な薬学的に許容される担体を用いて製剤化される場合、本明細書
で提供される医薬組成物は、予防または治療目的、ならびに補体関連障害または状態の重
症度および性質に依存して、ヒトおよび他の哺乳動物に、例えば、外用（粉末、軟膏また
は液滴などによって）、経口、直腸、粘膜、舌下、非経口、槽内、腟内、腹腔内、頬側、
舌下、眼に、または鼻腔内で投与される。
注射には、静脈内注射、または房水もしくは硝子体液中への眼内注射、あるいは結膜下
注射もしくはテノン嚢下（ｓｕｂｔｅｎｏｎ）注射などによる、眼の外層中への注射が含
まれる。
例えば、静脈内、眼、粘膜または他の投与のための液体剤形には、薬学的に許容される
エマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁物、シロップ剤およびエリキシル剤が
含まれるがこれらに限定されない。活性薬剤（複数可）に加えて、液体剤形は、当該分野
で一般に使用される不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤（
ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ）、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エ
チル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１
，３－ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、ラッカセイ油（
ｇｒｏｕｎｄｎｕｔ ｏｉｌ）、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油および
ゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール
、およびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物などを含み得る。不活性
希釈剤に加えて、眼、経口または他の全身送達される組成物は、アジュバント、例えば、
湿潤剤、ならびに乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｙｉｎｇ ａｇｅｎｔ）および懸濁化剤もまた
含み得る。
本発明の医薬組成物の外用または経皮投与のための剤形には、軟膏、ペースト、クリー
ム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入剤またはパッチが含まれる。活性薬
剤は、無菌条件下で、薬学的に許容される担体、および必要とされ得る場合には、任意の
必要な防腐剤または緩衝液と混合される。例えば、眼または皮膚の投与経路は、水性液滴
、ミスト、エマルジョンまたはクリームを用いて達成される。投与は、治療的であり得る
か、または予防的であり得る。本発明は、開示された組成物を含む眼科学的デバイス、外
科的デバイス、聴能学的デバイスまたは製品（例えば、ガーゼ包帯またはストリップ）、
およびかかるデバイスまたは製品を作製または使用する方法を含む。これらのデバイスは
、本明細書に記載される組成物でコーティングされ得、組成物に含浸され得、組成物に結
合され得、または組成物で他の方法で処理され得る。
経皮パッチは、眼および身体への活性成分の制御された送達を提供するという追加的な
利点を有する。かかる剤形は、適切な媒体中に化合物を溶解または分配させることによっ
て作製され得る。吸収増強剤もまた、皮膚を横断する化合物のフラックスを増加させるた
めに使用され得る。速度は、速度制御性メンブレンを提供すること、またはポリマーマト
リクスもしくはゲル中に化合物を分散させることのいずれかによって、制御され得る。
注射可能な調製物、例えば、無菌の注射可能な水性または油性懸濁物は、適切な分散ま
たは湿潤剤および懸濁化剤を使用して、公知の技術に従って製剤化され得る。無菌の注射
可能な調製物は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌の注射可能な
溶液、懸濁物またはエマルジョン、例えば、１，３－ブタンジオール中の溶液でもあり得
る。使用され得る許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンゲル溶液、Ｕ．Ｓ．
Ｐ．および等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌の不揮発性油が、溶媒または懸
濁媒体として慣習的に使用される。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリ
セリドが含まれる、任意の無刺激の不揮発性油が使用され得る。さらに、脂肪酸、例えば
オレイン酸が、注射物（ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ）の調製において使用される。注射可能な
製剤は、例えば、細菌保持フィルターを介した濾過によって、または使用前に無菌の水も
しくは他の無菌の注射可能な媒体中に溶解もしくは分散され得る無菌の固体組成物の形態
の滅菌剤を取り込むことによって、滅菌され得る。活性薬剤の効果を延長させるために、
皮下または筋肉内注射からの薬剤の吸収を緩徐化することがしばしば望ましい。非経口投
与された活性薬剤の遅延された吸収は、油ビヒクル中に薬剤を溶解または懸濁させること
によって達成され得る。注射可能なデポー形態は、ポリラクチド－ポリグリコリドなどの
生分解性ポリマー中に薬剤のマイクロカプセルマトリクスを形成することによって作製さ
れる。活性薬剤対ポリマーの比および使用される特定のポリマーの性質に依存して、活性
薬剤放出の速度が制御され得る。他の生分解性ポリマーの例には、ポリ（オルトエステル
）およびポリ（無水物）が含まれる。デポー注射可能な製剤は、身体組織と適合性である
リポソームまたはマイクロエマルジョン中に薬剤を封入することによっても調製される。
直腸または膣投与のための組成物は、好ましくは、本発明の活性薬剤（複数可）を、周
囲温度において固体であるが体温において液体であり、したがって、直腸または膣腔中で
融解して活性薬剤（複数可）を放出する、適切な非刺激性の賦形剤または担体、例えば、
カカオ脂、ポリエチレングリコールまたは坐剤ワックスと混合することによって調製され
得る坐剤である。
経口投与のための固体剤形には、カプセル、錠剤、丸剤、粉末および顆粒が含まれる。
かかる固体剤形では、活性薬剤は、少なくとも１種の不活性な薬学的に許容される賦形剤
または担体、例えば、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸水素カルシウム、ならびに／ま
たはａ）充填剤もしくは増量剤、例えば、デンプン、スクロース、グルコース、マンニト
ールおよびケイ酸、ｂ）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、
ゼラチン、ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏｎｅ）、
スクロースおよびアラビアゴムなど、ｃ）保水剤（ｈｕｍｅｃｔａｎｔ）、例えばグリセ
ロール、ｄ）崩壊剤、例えば、寒天（ａｇａｒ－ａｇａｒ）、炭酸カルシウム、ジャガイ
モもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のシリケートおよび炭酸ナトリウム、ｅ
）溶解遅延剤（ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｒｅｔａｒｄｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、例えばパラフィ
ン、ｆ）吸収促進剤、例えば、四級アンモニウム化合物、ｇ）湿潤剤、例えば、セチルア
ルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなど、ｈ）吸収剤、例えば、カオリンおよ
びベントナイト粘土、ならびにｉ）滑沢剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、
ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、な
らびにそれらの混合物と混合される。
類似の型の固体組成物は、乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤
を使用した、充填された軟および硬ゼラチンカプセルにおいて、充填剤としても使用され
得る。錠剤、糖衣錠、カプセル、丸剤および顆粒の固体剤形は、コーティングおよびシェ
ル、例えば、腸溶コーティング、放出制御コーティング、および医薬品製剤化の分野にお
いて周知の他のコーティングを用いて調製され得る。かかる固体剤形では、活性薬剤（複
数可）は、少なくとも１種の不活性希釈剤、例えば、スクロースまたはデンプンと混合さ
れ得る。かかる剤形は、通常の実施と同様、不活性希釈剤以外のさらなる物質、例えば、
錠剤化滑沢剤および他の錠剤化助剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムおよび微結晶性
セルロースもまた含み得る。カプセル、錠剤および丸剤の場合、剤形は、緩衝剤もまた含
み得る。これらは、任意選択で不透明化剤を含み得、任意選択で遅延された様式で、腸管
の特定の一部にのみまたは優先的に活性薬剤（複数可）を放出する組成物のものであり得
る。使用され得る埋め込み組成物の例には、ポリマー性物質およびワックスが含まれる。
以下の実施例および特許請求の範囲は、例示に過ぎず、さらなる限定としては解釈され
ない。当業者は、本明細書に記載される具体的手順に対する多数の等価物を、慣用的に過
ぎない実験を使用して認識するまたは確認できる。かかる等価物は、本発明および特許請
求の範囲の範囲内である。本出願において引用される、発行された特許および公開された
特許出願を含む全ての参考文献の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書の実施形態の一部分は、共著者Ｒａｊｅｎｄｒａ Ｋｕｍａｒ－Ｓｉｎｇｈ、
Ｄｅｒｅｋ ＬｅａｄｅｒｅｒおよびＳｉｏｂｈａｎ Ｍ． Ｃａｓｈｍａｎと共に、そ
の全体が本明細書に組み込まれる、「Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ
ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｒｏｔｅ
ｉｎ ｔｈａｔ ｃｏｍｂｉｎｅｓ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏ
ｒｙ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ＣＤ４６， ＣＤ５５ ａｎｄ ＣＤ５９」として
、Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ． ２０１５年６月；１７巻（６～７号）：１０１～１５頁に公
開された。
ここまで本発明を完全に記載してきたが、本発明は、以下の実施例および特許請求の範
囲によってさらに例示される。
（実施例１：細胞株）
Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７およびＨＥＫ２９３細胞株を、ＡＴＣＣから取得し、それぞれ、１
０％ＦＢＳを補充したαＭＥＭおよびＤＭＥＭ中で維持した。ヒト胚網膜芽細胞９１１細
胞株を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で維持した（Ｆａｌｌａｕｘ， Ｆ．Ｊ．、
１９９６年 Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ７巻：２１５～２２２頁）。細胞培養試薬を
、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入し、細胞を、５
％ＣＯ２を含む３７℃の加湿インキュベーター中で維持した。
（実施例２：ＳＡＣＴおよびＤＴＡＣの構造および合成）
ｃＤＮＡは、ヒトＣＤ５９（ＡＴＣＣ ｃａｔ．１０６５８２０４）分泌ペプチドをコ
ードする配列と、その後の、ＣＤ４６の４つのＳＣＲドメインをコードするヒトＣＤ４６
（ＡＴＣＣ ｃａｔ．７４９１４６３）のアミノ酸３４～２９６のコード配列とを含む、
可溶性活性補体ターミネーター（ＳＡＣＴ）をコードするように、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（
Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）により合成された（Ｌｕｂｌｉｎ， Ｄ．Ｍ．ら、１９８
８年 Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６８巻：１８１～１９４頁）。ヒトＣＤ４６配列は、５グ
リシンリンカーをコードする配列を介して、ＣＤ５５のＳＣＲドメインおよびＳＴＰ領域
を含むヒトＣＤ５５（ＡＴＣＣ ｃａｔ．５８３０４８８）のアミノ酸３３～３５６をコ
ードする配列に結合させる（Ｃｏｙｎｅ， Ｋ．Ｅ．ら、１９９２年 Ｊ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ １４９巻：２９０６～２９１３頁）。５グリシンリンカーをコードするさらなる配列
は、ＣＤ５５のＳＴＰ領域を、ヒトＣＤ５９の７６アミノ酸の機能的ドメインをコードす
る配列に結合させる。活性補体の二重ターミネーター（ＤＴＡＣ）をコードするｃＤＮＡ
もまた、ヒトＣＤ５９分泌ペプチドをコードする配列と、その後のヒトＣＤ５５のアミノ
酸３３～３５６のコード配列とを含むように、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより合成された（上
記のとおり）。ＣＤ５５配列のＳＴＰ領域をコードする配列を、５グリシンリンカーをコ
ードする配列を介して、ヒトＣＤ５９の７６アミノ酸の機能的ドメインをコードする配列
に結合させた。ＳＡＣＴおよびＤＴＡＣをコードするｃＤＮＡを、ニワトリβ－アクチン
プロモーター／ＣＭＶエンハンサー（ＣＡＧ）およびウサギグロビンポリアデニル化シグ
ナルを含むｐＡＡＶ－ＭＣＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の改変されたバージョン、ｐＡＡ
ＶＣＡＧ（Ｃ．ＣｅｐｋｏおよびＭａｔｓｕｄａの厚意による提供）のＸｈｏＩおよびＥ
ｃｏＲＶ部位中にクローニングして、それぞれ、ｐＡＡＶ２ＣＡＧＳＡＣＴおよびｐＡＡ
Ｖ２ＣＡＧＤＴＡＣを生成した。
ＳＡＣＴのヌクレオチド配列（配列番号１）は以下に示される：
Figure 0007275095000001

Figure 0007275095000002

ＳＡＣＴのアミノ酸配列（配列番号２）は以下に示される：
Figure 0007275095000003

ＤＴＡＣのヌクレオチド配列（配列番号３）は以下に示される：
Figure 0007275095000004

ＤＴＡＣのアミノ酸配列（配列番号４）は以下に示される：
Figure 0007275095000005
（実施例３：アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）構築物の構築）
組換えＡＡＶを、ｐＡＡＶ２ＣＡＧＳＡＣＴ、ｐＡＡＶ２ＣＡＧＤＴＡＣおよびｐＡＡ
Ｖ２ＣＡＧＧＦＰの各々、ｐＨｅｌｐｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ならびにｐＡＡＶ２
／８Ｒｅｐ／Ｃａｐによる、２９３細胞の三重トランスフェクションを介して生成した（
Ｃａｓｈｍａｎ， Ｓ．Ｍ．ら、２０１１年 ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６巻：ｅ１９０７８頁
）。得られたＡＡＶベクター、ＡＡＶ２／８ＳＡＣＴ、ＡＡＶ２／８ＤＴＡＣおよびＡＡ
Ｖ２／８ＧＦＰを、イオジキサノール勾配によって精製し、乳酸リンゲル緩衝液中で透析
した（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ， Ｓ． ２００５年 Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １６
巻：５５１～５５７頁）。ウイルスゲノムを、（Ｆａｇｏｎｅ， Ｐ．ら、２０１２年
Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３巻：１～７頁）に記載されるように
、ＡＡＶ２逆位末端反復（ＩＴＲ）を標的化するプライマーを使用してリアルタイム定量
的ＰＣＲによって力価決定（ｔｉｔｅｒ）した。
（実施例４：ウエスタンブロット分析）
ヒト胚網膜芽細胞９１１細胞株に、製造業者のプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を使用して、ｐＡＡＶ２ＣＡＧＤＴＡＣ
、ｐＡＡＶ２ＣＡＧＳＡＣＴまたはｐＡＡＶ２ＣＡＧＧＦＰをトランスフェクトした。ト
ランスフェクションの７２時間後、培地を収集し、遠心分離し、１０％のＴｒｉｓ－ＨＣ
ｌゲル上で電気泳動し、引き続いて、タンパク質をニトロセルロースメンブレンに移し、
１：１０，０００希釈のマウス抗ヒトＣＤ４６抗体（ＭＥＭ２５８、Ｓｅｒｏｔｅｃ）；
１：２０，０００希釈のヤギ抗ヒトＣＤ５５抗体（ＡＦ２００９、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ
ｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ ＭＮ）または１：５，０００希釈のウサギ抗ヒトＣＤ５９
抗体（ａｂ１２４３９６、Ａｂｃａｍ）でプローブした。ＩＲＤｙｅ連結された二次抗体
を使用し、その後Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｂｉｏ
ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ ＮＢ）を用いて検出した。
（実施例５：Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞を用いた補体アッセイ）
ＦＡＣＳ分析のために、ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞を、５０％のコンフルエンシーで、フ
ェノールレッドなしのαＭＥＭ／２％ＦＢＳ中にプレートした。３日後、ｈｅｐａ１ｃ１
ｃ７細胞を、トリプシン処理（０．２５％ＥＤＴＡ）によって収集し、０．５％ＦＢＳを
含む１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁した。５×１０５細胞を、１２００ＲＰ
Ｍ／４℃で遠心分離し、ｐＤＴＡＣ、ｐＳＡＣＴまたはｐＧＦＰをトランスフェクトした
９１１細胞由来の培地５００μｌ中に再懸濁した。正常ヒト血清（ＮＨＳ；Ｃｏｍｐｌｅ
ｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｔｙｌｅｒ、ＴＸ）または熱不活化（ｈｉ；５６℃で
１時間）ＮＨＳを、１％の最終濃度になるように各試料に添加し、試料を、３７℃で１時
間にわたって一定の回転運動でインキュベートした。細胞溶解を、１μｌのＰＩ（２ｍｇ
／ｍｌ）を各試料に添加し、２５，０００細胞をＰＩ取込みについてＦＡＣＳ（ＦＡＣＳ
Ｃａｌｉｂｕｒ）によって計数する（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏソフトウェア、Ｂｅ
ｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）排除法を使用して決定し
た。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＭＡＣ沈着について、１ウェル当たり３５，０００のｈｅｐａ１ｃ
１ｃ７細胞を、αＭＥＭ／２％ＦＢＳ中で８ウェルチャンバースライド（Ｂｅｃｔｏｎ
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中に播種した。２４時間後、培地を除去し、細胞を、１×ＰＢＳで
３回洗浄し、細胞を、ｐＤＴＡＣ、ｐＳＡＣＴまたはｐＧＦＰをトランスフェクトした９
１１細胞由来の培地中に再懸濁した１０％のＮＨＳまたはｈｉＮＨＳと共に、３７℃で１
０分間インキュベートした。次いで、細胞を、冷１×ＰＢＳで２回洗浄し、３．７％ホル
ムアルデヒドを用いて１５分間固定した。細胞を、本明細書の実施例に記載されるように
、ＭＡＣ沈着について染色した。
（実施例６：溶血アッセイ）
感作したヒツジ赤血球（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、ゼラチン
ベロナール緩衝液（ＧＶＢ２＋）で２回洗浄し、５×１０８細胞／ｍｌの濃度になるよう
に懸濁し、次いで、２５μｌの赤血球懸濁物を、１回の反応当たりに使用した。０．３％
の最終濃度になるようにＮＨＳを含む、ｐＧＦＰ、ｐＤＴＡＣまたはｐＳＡＣＴのいずれ
かをトランスフェクトした９１１細胞由来の培地１２５μｌを、赤血球懸濁物に添加した
。赤血球を、３７℃で１時間インキュベートし、５００×ｇで４℃で４分間遠心分離し、
得られた上清の吸光度を、４０５ｎｍで読み取った（Ｆｉｌｔｅｒ Ｍａｘ Ｆ５マルチ
モードマイクロプレートリーダー、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ；Ｓｕｎｎｙｖ
ａｌｅ、ＣＡ）。
ＣＤ５５遮断アッセイのために、室温で３０分間にわたって抗ＣＤ５５抗体（ａｂ３３
１１１、Ａｂｃａｍ；Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）ありまたはなしでインキュベートした、ｐＧ
ＦＰ、ｐＤＴＡＣまたはｐＳＡＣＴをトランスフェクトした９１１細胞由来の培地を、０
．３％ＮＨＳと共に、赤血球に添加した。３７℃で１時間のインキュベーション後、本明
細書の実施例に記載されるように、上清を収集し、吸光度を読み取った。
Ｃ９取込みアッセイのために、懸濁した赤血球を、０．１％Ｃ９枯渇血清（Ｃｏｍｐｌ
ｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に３７℃で１時間インキュベートして、Ｃ５ｂ
－８複合体を形成させた。ＧＶＢ２＋で２回洗浄した後、０．０４μｇ／ｍｌのＣ９（Ｃ
ｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の存在下または非存在下で３０分間氷上で
事前インキュベートした、ｐＧＦＰ、ｐＤＴＡＣまたはｐＳＡＣＴをトランスフェクトし
た９１１細胞由来の培地を添加した。３７℃で３０分間のインキュベーション後、試料を
遠心分離し、吸光度を、４９）に記載されたように決定した。溶血アッセイからのデータ
を、ｐＧＦＰトランスフェクト細胞由来の培地中の赤血球の溶解の量（１００％溶解に設
定した）に対して正規化した。
（実施例７：第Ｉ因子補因子活性）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ補因子活性を、（Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｊ．Ｂ．ら、２００９年 Ｊ
Ｖｉｒｏｌ ８３巻：７６０２～７６１１頁）に記載されるようにアッセイした。ｐＧＦ
Ｐ、ｐＤＴＡＣまたはｐＳＡＣＴをトランスフェクトした９１１細胞由来の培地を、２０
μｌの総体積中、３μｇのＣ３ｂおよび１００ｎｇの第Ｉ因子と共に、３７℃で４時間イ
ンキュベートした。反応を、β－メルカプトエタノールを含むＳＤＳ－ＰＡＧＥ試料緩衝
液５μｌを添加し、煮沸することによって終結させた。Ｃ３ｂ反応産物を、１０％ＳＤＳ
－ＰＡＧＥゲルを使用してウエスタンブロットによって分析した。ゲルをメンブレンに移
し、このメンブレンを、１：１，０００希釈のポリクローナルヤギ抗ヒトＣ３（Ａ２１３
、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でプローブした。データを、Ｃ３ｂの
未切断のβ鎖のシグナル強度を使用して正規化した。
（実施例８：第二経路Ｃ３コンバターゼの分解）
マイクロタイタープレートを、水中０．１％のアガロースでコーティングし、３７℃で
３６時間乾燥させ、次いで、ウェルを、（Ｈａｐｐｏｎｅｎ， Ｋ．Ｅ．ら、２０１２年
Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８７巻：８０９２～８１００頁）に記載されるように、Ｐ
ＢＳ中１％のウシ血清アルブミンで室温で２時間ブロッキングした。Ｍｇ２＋ＥＧＴＡ中
に希釈したＮＨＳを、アガロースコーティングしたプレートに添加し、３７℃で１時間イ
ンキュベートした。洗浄後、ｐＧＦＰ、ｐＤＴＡＣまたはｐＳＡＣＴをトランスフェクト
した９１１細胞由来の培地をプレートに添加し、プレートを、３７℃で１時間インキュベ
ートした。プレートに結合したままのＢ因子を、Ｂ因子（Ａ２３５、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎ
ｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）特異的抗体とその後のＨＲＰ結合体化二次抗体とを使用
して検出した。
（実施例９：ｉｎ ｖｉｖｏ肝臓ＭＡＣ沈着アッセイ）
この方法は、Ｇａｎｄｈｉ， Ｊ．ら、２０１１年 ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６巻：ｅ２１
６２１頁に記載されたプロトコールであった。被験体は、６～１０週齢のＣ５７ＢＬ／６
Ｊマウスであり、それらに、３．３×１０１１ゲノムコピーのＡＡＶ２／８ＤＴＡＣ、Ａ
ＡＶ２／８ＳＡＣＴまたはＡＡＶ２／８ポリＡを腹腔内注射した。３週間後、マウスに、
２００μｇの抗マウスＰＥＣＡＭ抗体（クローン２Ｈ８、１．４ｍｇ／ｍＬ、本明細書の
実施例に記載したように調製した）を心臓内注射した。４～６時間のインキュベーション
後、マウスは、１ｍｌのゼラチンベロナール緩衝液（ＧＶＢ２＋）と、その後のＧＶＢ２
＋中９０％のＮＨＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．、Ｔｙｌ
ｅｒ ＴＸ）１．５ｍｌとによる心灌流を受けた。３７℃で１５分間のインキュベーショ
ン後、肝臓の中葉を回収し、４℃で４％パラホルムアルデヒド中で一晩固定した。８μｍ
の凍結切片を取得し、本明細書の実施例に記載したように、ＭＡＣについて染色した。画
像化を、Ｒｅｔｉｇａ ２０００ｒカメラを備えたＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ５１顕微鏡を使
用して実施した。切片全体上および血管周囲のＭＡＣ染色の強度を、ＩｍａｇｅＪソフト
ウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ；Ｂｅｔｈｅｓ
ｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）を使用して定量化した。大血管は、２細胞の幅よりも大きい直径を
有する血管として規定され、動脈、細動脈、静脈および細静脈を含み、毛細血管および洞
様毛細血管を除く。大血管の外部および内部境界を、フリーハンドの選択ツールを使用し
てトレースし、総強度および総面積を、測定機能を使用して各々について計算した。平均
血管強度を計算するために、以下の方程式を利用した：Ｘ＝［Ｉ外部－Ｉ内部］／［Ａ外
部－Ａ内部］。
（実施例１０：免疫組織化学）
ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞上のＭＡＣ沈着を検出するために、細胞を、６％正常ヤギ血清
（ＮＧＳ）を含む０．０５％ｔｒｉｔｏｎ中のマウス抗ヒトＣ５ｂ－９（１：１００）（
ａｂ６６７６８、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）と共に室温で２．５時間イン
キュベートした。室温で１時間にわたる、３％ＮＧＳを含む０．０５％ｔｒｉｔｏｎ中の
Ｃｙ３結合体化ヤギ抗マウス（１：２００）を、二次検出に使用した。肝臓脈管構造上の
ＭＡＣ沈着の検出のために、肝臓切片を、０．５％ｔｒｉｔｏｎ中のウサギ抗ヒトＣ５ｂ
－９（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｔｙｌｅｒ ＴＸ）（１：４００
）と共に室温で２．５時間インキュベートし、その後、６％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）およ
び０．５％ｔｒｉｔｏｎを用いて１時間ブロッキングした。Ｃｙ３結合体化ヤギ抗ウサギ
（１：２００）を、二次検出のために、室温で１時間使用した。
画像を、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ５１顕微鏡を使用して捕捉し、ＩｍａｇｅＪソフトウェ
アを使用して、蛍光を定量化した。生の蛍光単位を測定し、各画像についてのバックグラ
ウンドを差し引いた。全ての統計分析を、Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ５．０ａ（Ｇ
ｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使
用して実施した。
（実施例１１：ＳＡＣＴおよびＤＴＡＣの設計および合成）
可溶性活性補体ターミネーター（ＳＡＣＴ）のための発現カセットを含むプラスミドを
生成した。ＳＡＣＴは、ポリグリシンリンカーによってヒトＣＤ５５の４つのＳＣＲドメ
インおよびセリン／スレオニン（Ｓ／Ｔ）－リッチ領域から分離された、ヒトＣＤ４６の
４つのショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）ドメインから構成されるタンパク質を発
現するように設計された、作出されたＤＮＡ配列を含む。さらなるポリグリシンリンカー
が、ヒトＣＤ５９の機能的ドメイン（アミノ酸１～７６）から、ＣＤ５５のＳ／Ｔ－リッ
チ領域を分離する（図１Ａ）。ＳＡＣＴのＮ末端は、ネイティブヒトＣＤ５９由来の分泌
シグナルを含む。ＣＤ４６の膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ５５およびＣＤ５９の各々へ
のＧＰＩアンカーの結合のためのシグナルは、組換えタンパク質中には含まれず、したが
って、ＳＡＣＴは、原形質膜にアンカリングしない（図１Ａ）。
ポリグリシンリンカーによってヒトＣＤ５９の機能的ドメイン（本明細書の実施例に記
載されるとおり）から分離された、ヒトＣＤ５５の４つのＳＣＲドメインおよびＳ／Ｔ－
リッチ領域を含むように作出されたタンパク質である、より小さい組換えタンパク質、活
性補体の二重ターミネーター（ＤＴＡＣ）もまた生成した。ＤＴＡＣは、ヒトＣＤ５９の
分泌ペプチドを含む（図１Ａ）。ＤＴＡＣは、ＧＰＩアンカーの結合のための、ＣＤ５５
およびＣＤ５９のシグナルペプチドを省くようにタンパク質を作出することによって、膜
非依存的にされる。
遺伝子治療アプローチを使用してｉｎ ｖｉｖｏでＳＡＣＴを発現させるために、ＳＡ
ＣＴをコードするｃＤＮＡを、アデノ随伴ウイルス血清型２（ＡＡＶ２）逆位末端反復を
含むプラスミドｐＡＡＶＣＡＧ中に挿入して、ｐＳＡＣＴを生成した（Ｃａｓｈｍａｎ，
Ｓ．Ｍ．ら、２０１１年 ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６巻：ｅ１９０７８頁）。陰性対照とし
て、ＳＡＣＴ ｃＤＮＡを欠く同じ構築物を使用し、これをｐＡＡＶＣＡＧと称した。Ｄ
ＴＡＣをコードするｃＤＮＡを、ＡＡＶ２ウイルスからの発現のためにｐＡＡＶＣＡＧ中
に挿入して、ｐＤＴＡＣを生成した。
（実施例１２：ＳＡＣＴおよびＤＴＡＣは、分泌型タンパク質である）
ＳＡＣＴおよびＤＴＡＣタンパク質の予測された分子量は、それぞれ、７６ｋＤａおよ
び４７ｋＤａである（Ｓｅｒｉａｌ Ｃｌｏｎｅｒ ２．６．１；Ｓｅｒｉａｌ Ｂａｓ
ｉｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）。ＣＤ４６およびＣＤ５５は共に、ＮおよびＯ結合型グリコシ
ル化部位を含む（Ｃｏｙｎｅ， Ｋ．Ｅ．ら、１９９２年 Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４９
巻：２９０６～２９１３頁、Ｂａｌｌａｒｄ， Ｌ．Ｌ．ら、１９８８年 Ｊ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ １４１巻：３９２３～３９２９頁）。これらの改変は、ＣＤ４６およびＣＤ５５
の分子量を、それぞれ約８ｋＤａ（Ｂａｌｌａｒｄ， Ｌ．Ｌ．ら、１９８８年 Ｊ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ １４１巻：３９２３～３９２９頁）および約２９ｋＤａ（Ｃｏｙｎｅ，
Ｋ．Ｅ．ら、１９９２年 Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４９巻：２９０６～２９１３頁）増加
させる。ＳＡＣＴおよびＤＴＡＣによって保持されるグリコシル化部位の数を考慮すると
、ＳＡＣＴおよびＤＴＡＣの予測された分子量は、それぞれ、およそ１０５～１１３ｋＤ
ａおよび７６ｋＤａであることが決定された。ｐＳＡＣＴをトランスフェクトしたヒト胚
９１１網膜芽細胞（ＨＥＲ）由来の培地のウエスタンブロット分析のために、ＣＤ４６、
ＣＤ５５またはＣＤ５９に対する抗体でプローブしたところ、グリコシル化されたＳＡＣ
Ｔの予測された分子量と一致するおよそ１１０ｋＤａのタンパク質バンドが観察された。
この１１０ｋＤａバンドは、ｐＧＦＰまたはｐＤＴＡＣをトランスフェクトした細胞由来
の培地中には存在しなかった（図１Ｂ）（Ｆａｌｌａｕｘ， Ｆ．Ｊ．、１９９６年 Ｈ
ｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ７巻：２１５～２２２頁）。ｐＤＴＡＣトランスフェクト細
胞のウエスタンブロット分析のために、上記抗体でプローブしたところ、データは、グリ
コシル化されたＤＴＡＣの予測された分子量と一致する、約７６ｋＤａのバンドの存在を
示した。このバンドは、ｐＧＦＰまたはｐＳＡＣＴをトランスフェクトした細胞由来の培
地中には存在しなかった（図１Ｂ）。この７６ｋＤａタンパク質は、ＣＤ５５およびＣＤ
５９に対する抗体でプローブしたメンブレンについてのみ観察され、ＣＤ４６に対する抗
体に対する反応性は示さなかった（図１Ｂ）。したがって、ＳＡＣＴおよびＤＴＡＣは分
泌型であり、これらのタンパク質は各々、補体調節ドメインおよびグリコシル化部位の予
測された組合せを含む。
（実施例１３：ＳＡＣＴは、Ｃ３ｂの第Ｉ因子媒介性切断のための補因子として作用す
る）
補体系の第二経路の自発的「アイドリング（ｔｉｃｋｏｖｅｒ）」は、細胞表面上での
Ｃ３ｂの形成を生じる（Ｗａｌｐｏｒｔ， Ｍ．Ｊ． ２００１年 Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ
Ｍｅｄ ３４４巻：１０５８～１０６６頁）。存在するＣ３ｂの量は、セリンプロテアー
ゼ第Ｉ因子によるＣ３ｂのタンパク質分解性切断によって調節される。第Ｉ因子は、Ｃ３
ｂの１０４ｋＤａのα’鎖を、それぞれ、不活化された６７ｋＤａのｉＣ３ｂＨ鎖および
４２ｋＤａのｉＣ３ｂＬ鎖へと切断する（図２Ａ）（Ｒｉｌｅｙ－Ｖａｒｇａｓ， Ｒ．
Ｃ．ら、２００４年 Ｉｍｍｕｎｏｌ ２５巻：４９６～５０３頁）。ＣＤ４６は、第Ｉ
因子のための補因子として機能し、ｉＣ３ｂＨおよびｉＣ３ｂＬの形成を促進する（図２
Ｂ）。
ＳＡＣＴが、ＣＤ４６と類似の補因子特性を示すかどうかを試験するために、３μｇの
Ｃ３ｂを、ｐＳＡＣＴ、ｐＤＴＡＣまたはｐＧＦＰをトランスフェクトした９１１細胞か
ら調製した培地中でインキュベートした。インキュベーションを、１００ｎｇの第Ｉ因子
の存在下または非存在下で実施した（Ｃａｓｈｍａｎ， Ｓ．Ｍ．ら、２０１１年 ＰＬ
ｏＳ Ｏｎｅ ６巻：ｅ１９０７８頁）。４時間のインキュベーション後に残存するＣ３
ｂの１０４ｋＤａのα’鎖の相対的な量を、ポリクローナル抗Ｃ３抗体を使用する定量的
ウエスタンブロットによって測定した（図２Ｃ）。Ｃ３ｂの未切断のβ鎖を使用して、デ
ータを正規化した。
Ｃ３ｂおよび第Ｉ因子を含むｐＳＡＣＴトランスフェクト細胞由来の培地は、Ｃ３ｂお
よび第Ｉ因子を含むｐＧＦＰトランスフェクト細胞由来の培地と比較して、Ｃ３ｂの１０
４ｋＤａのα’鎖の量における５１．８±１０．５％（ｐ＝０．００７）の低減、ならび
にＣ３ｂおよび第Ｉ因子を含むｐＤＴＡＣトランスフェクト細胞由来の培地と比較して、
４６．２±４．８％（ｐ＝０．０００７）の低減を有したことが観察された（図２Ｄ）。
Ｃ３ｂおよび第Ｉ因子を含むｐＧＦＰトランスフェクト細胞およびｐＤＴＡＣトランスフ
ェクト細胞の培地に曝露されたＣ３ｂの１０４ｋＤａのα’鎖の量の間では、有意差は存
在しなかった（ｐ＝０．３４）（図２Ｄ）。したがって、ＳＡＣＴは、Ｃ３ｂの第Ｉ因子
媒介性切断のための補因子として作用できる。
（実施例１４：ＳＡＣＴおよびＤＴＡＣは、Ｃ３コンバターゼの分解を促進する）
膜会合型Ｃ３ｂへのＢ因子の結合は、Ｃ３コンバターゼの形成を生じる（Ｗａｌｐｏｒ
ｔ， Ｍ．Ｊ． ２００１年 Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４４巻：１０５８～１０６
６頁）。ＣＤ５５は、Ｃ３ｂへのＢ因子の結合を防止し得、Ｃ３ｂからのＢ因子の解離を
引き起こし得、それによって、補体のさらなる活性化のために利用可能なＣ３コンバター
ゼの量を低減させる（図３Ａ）（Ｗａｌｐｏｒｔ， Ｍ．Ｊ． ２００１年 Ｎ Ｅｎｇ
ｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４４巻：１０５８～１０６６頁）。ＳＡＣＴまたはＤＴＡＣが、Ｃ３
ｂからＢ因子を解離させ、Ｃ３コンバターゼ活性を低減させることができるかどうかを決
定するために、ＳＡＣＴまたはＤＴＡＣの存在下でインキュベーションしたアガロース上
に固定化されたＣ３ｂと会合したままのＢ因子の量を定量化した。アガロースコーティン
グしたマイクロタイタープレートを、Ｍｇ２＋ＥＧＴＡの存在下で正常ヒト血清（ＮＨＳ
）と共にインキュベートして、第二経路Ｃ３コンバターゼを形成させた。ウェルを、ｐＳ
ＡＣＴ、ｐＤＴＡＣまたはｐＧＦＰをトランスフェクトした９１１細胞由来の培地と共に
引き続いてインキュベートした。３７℃で１時間の後のアガロース結合したＣ３ｂと会合
したＢ因子の量を、未結合のＢ因子を除去するための多数回の洗浄後に、Ｂ因子に対する
抗体染色によって決定した。Ｂ因子染色の定量化により、ｐＧＦＰトランスフェクト９１
１細胞由来の培地と比較して、ｐＤＴＡＣまたはｐＳＡＣＴをトランスフェクトした細胞
由来の培地が、Ｃ３ｂ結合したＢ因子において、それぞれ、１６．１±６．４％（ｐ＝０
．０２１４）および１６．８±６．１％（ｐ＝０．０１２７）の低減を生じたことが示さ
れた（図３Ｂ）。したがって、ＤＴＡＣおよびＳＡＣＴは、Ｃ３コンバターゼの崩壊を促
進する。
（実施例１５：ＣＤ５５遮断抗体は、ＳＡＣＴおよびＤＴＡＣが補体媒介性細胞溶解に
対して保護する能力を低減させる）
ＳＡＣＴおよびＤＴＡＣ中のＣＤ５５由来のＳＣＲの機能を分析するために、ＣＤ５５
遮断抗体の存在下で、ｐＳＡＣＴまたはｐＤＴＡＣのいずれかをトランスフェクトした９
１１細胞由来の培地の存在下での、感作したヒツジ赤血球のヒト補体媒介性溶解を定量化
した。１ｍｇ／ｍｌの抗体濃度で、ｐＤＴＡＣトランスフェクト細胞およびｐＳＡＣＴト
ランスフェクト細胞由来の培地がヒツジ赤血球をヒト補体から保護する能力は、遮断抗体
なしのトランスフェクト９１１細胞由来の培地と比較して、それぞれ、４０．４％±１．
８４％（ｐ＜０．０００１）および１４．２％±２．８８％（ｐ＝０．０００６）低減さ
れたことが観察された（図３Ｃ）。より低い濃度（２５０ｎｇ／ｍｌ）の遮断抗体では、
ｐＤＴＡＣトランスフェクト細胞およびｐＳＡＣＴトランスフェクト細胞由来の培地がヒ
ツジ赤血球を溶解から保護する能力は、遮断抗体なしのトランスフェクト細胞由来の培地
と比較して、それぞれ、７．３３％±２．６６％（ｐ＝０．０２）および１１．２％±３
．０９％（ｐ＝０．００４６）低減されたことが観察された（図３Ｃ）。したがって、Ｓ
ＡＣＴおよびＤＴＡＣ中のＣＤ５５由来のＳＣＲは、機能的に活性であった。
（実施例１６：ＳＡＣＴおよびＤＴＡＣは、細胞膜傷害複合体中へのＣ９の動員を減弱
させる）
細胞膜傷害複合体（ＭＡＣ）の形成は、細胞膜上でのＣ５ｂ－８複合体の組み立てで始
まり、複数単位のＣ９の動員および重合が後に続いて、ＭＡＣとして公知の溶解性孔を形
成する（Ｗａｌｐｏｒｔ， Ｍ．Ｊ． ２００１年 Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４４
巻：１０５８～１０６６頁）。ＣＤ５９は、Ｃ９の動員および重合を防止することによっ
て、ＭＡＣ形成の阻害剤として作用する（図４Ａ）（Ｚｉｐｆｅｌ， Ｐ．Ｆ．ら、２０
０９年 Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９巻：７２９～７４０頁）。
ＳＡＣＴまたはＤＴＡＣのＣＤ５９モジュールが、ＭＡＣ中へのＣ９の動員を減弱させ
ることができるかどうかを決定するために、抗体感作したヒツジ赤血球を、Ｃ９枯渇ＮＨ
Ｓと共にインキュベートして、細胞表面上でＣ５ｂ－８複合体を組み立てた。引き続いて
、精製されたＣ９タンパク質を、ｐＤＴＡＣまたはｐＳＡＣＴをトランスフェクトした９
１１細胞由来の培地に添加し、ＭＡＣの形成を、ヒツジ赤血球の溶解に起因して放出され
たヘモグロビンの定量化によって測定した。ｐＤＴＡＣトランスフェクト９１１細胞およ
びｐＳＡＣＴトランスフェクト９１１細胞由来の培地は、ｐＧＦＰトランスフェクト細胞
由来の培地の存在下でＮＨＳと共にインキュベートした赤血球と比較して、それぞれ、３
４．８±３．６％（ｐ＜０．０００１）および２９．９±４．６％（ｐ＜０．０００１）
、ヒツジ赤血球からのヘモグロビンの放出を低減させたことが観察された（図４Ｂ）。し
たがって、ＤＴＡＣおよびＳＡＣＴは、機能的ＣＤ５９の存在と一致する特性、ＭＡＣ中
へのＣ９の動員を減弱させる。
（実施例１７：ＳＡＣＴおよびＤＴＡＣは、肝細胞のヒト補体媒介性溶解をｉｎ ｖｉ
ｔｒｏで減弱させる）
ＤＴＡＣまたはＳＡＣＴがヒツジ赤血球をＮＨＳ媒介性細胞溶解から保護するかどうか
を決定するために、ＩｇＧ感作したヒツジ赤血球を、ｐＤＴＡＣ、ｐＳＡＣＴまたはｐＧ
ＦＰをトランスフェクトした９１１細胞由来の培地で事前馴化したＮＨＳ中でインキュベ
ートした。ｐＤＴＡＣトランスフェクト培地およびｐＳＡＣＴトランスフェクト培地は、
ｐＧＦＰトランスフェクト培地と比較して、それぞれ、４７±２．９％（ｐ＜０．０００
１）および２１．５±２．８％（ｐ＜０．０００１）、ヒツジ赤血球のＮＨＳ媒介性溶解
を低減させたことが観察された（図５Ａ）。これらのデータは、ＤＴＡＣおよびＳＡＣＴ
が、ＮＨＳ媒介性細胞溶解を減弱させることを示している。
肝臓および腎臓などの移植された臓器の補体媒介性攻撃は、移植片拒絶の主要原因とみ
なされている（Ｓａｔｏｈ， Ｓ．、１９９７年 Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６
４巻：１１１７～１１２３頁）。ＳＡＣＴおよびＤＴＡＣが肝細胞をヒト補体攻撃から保
護できるかどうかを決定するために、マウスｈｅｐａ－１ｃ１ｃ７細胞を、１％の最終濃
度までＮＨＳまたは熱不活化ＮＨＳ（ｈｉＮＨＳ）を含む、ｐＤＴＡＣ、ｐＳＡＣＴまた
はｐＧＦＰをトランスフェクトした９１１細胞由来の培地中でインキュベートした。細胞
溶解を、ヨウ化プロピジウム取込みのＦＡＣＳ分析によって定量化した。合計で７３．５
±３．７９％の細胞が、ｐＧＦＰトランスフェクト細胞由来の培地で事前馴化したＮＨＳ
と共にインキュベートしたｈｅｐａ－１ｃ１ｃ７細胞において溶解されたことが観察され
た（図５Ｂ）。対照的に、細胞の４９．３±５．７％および５５．５±４．８％が、それ
ぞれＤＴＡＣまたはＳＡＣＴ由来の培地で事前馴化したＮＨＳにおいて溶解されたことが
観察され、それぞれＤＴＡＣおよびＳＡＣＴに起因する、ＮＨＳ媒介性細胞溶解における
２８．７％±１０．２％（ｐ＝０．０１４）または２０．８±９．０％（ｐ＝０．０３７
）の低減を生じた（図５Ｂ）。この結果は、ＤＴＡＣおよびＳＡＣＴが、マウス肝細胞を
ヒト補体媒介性攻撃から保護することを示している。
（実施例１８：ＤＴＡＣおよびＳＡＣＴは、細胞膜傷害複合体の形成をｉｎ ｖｉｔｒ
ｏで低減させる）
肝細胞の溶解におけるＤＴＡＣまたはＳＡＣＴ媒介性の低減が、細胞膜上でのＭＡＣの
形成における低減と一致していたかどうかを決定するために、マウスｈｅｐａ１ｃ１ｃ７
細胞を、１０％ＮＨＳを含む、ｐＧＦＰ、ｐＤＴＡＣまたはｐＳＡＣＴをトランスフェク
トした９１１細胞由来の培地中でインキュベートした。引き続いて、細胞を固定し、ヒト
Ｃ５ｂ－９に対する抗体で染色し、染色強度を、Ｉｍａｇｅ Ｊを使用して定量化した（
図６Ａ）。ｐＤＴＡＣトランスフェクト細胞およびｐＳＡＣＴトランスフェクト細胞由来
の培地は、ｐＧＦＰトランスフェクト細胞由来の培地と比較して、マウス肝細胞上のＭＡ
Ｃ沈着において、それぞれ５３．８±１０．３７％（ｐ＝０．０００４）および６７．８
±９．１５％（ｐ＜０．０００１）の低減を有することが観察された（図６Ｂ）。したが
って、細胞溶解のＤＴＡＣおよびＳＡＣＴ媒介性の低減は、細胞の表面上でのＭＡＣの低
減された形成を引き起こす。
（実施例１９：ＳＡＣＴおよびＤＴＡＣは、マウス肝臓をヒトＭＡＣ沈着からｉｎ ｖ
ｉｖｏで保護する）
臓器移植片拒絶を含むいくつかの補体媒介性病理には、内皮細胞が関与することが示さ
れている（Ｚｉｐｆｅｌ， Ｐ．Ｆ．ら、２００９年 Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ
９巻：７２９～７４０頁、Ｓａｔｏｈ， Ｓ．、１９９７年 Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａ
ｔｉｏｎ ６４巻：１１１７～１１２３頁、Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｄ．Ｈ．ら、２０１０
年 Ｐｒｏｇ Ｒｅｔｉｎ Ｅｙｅ Ｒｅｓ ２９巻：９５～１１２頁）。ヒト補体調節
因子がマウス内皮を補体攻撃からｉｎ ｖｉｖｏで保護する能力を試験することの制限を
克服するために、ｉｎ ｖｉｖｏモデルを、マウス肝臓脈管内皮上でのヒトＭＡＣ沈着の
ために開発した（Ｇａｎｄｈｉ， Ｊ．ら、２０１１年 ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６巻：ｅ２
１６２１頁）。このモデルでは、マウス脈管内皮は、マウス血小板／細胞接着分子に対す
る抗体（ｍＰＥＣＡＭ－１）の心臓内注射によって、補体攻撃のためにプライムされる。
この注射の後に、血液を置き換えるためのＰＢＳによる灌流および９０％ＮＨＳによる引
き続く灌流が続く。このモデルを使用して、ヒト可溶性ＣＤ５９のアデノウイルス媒介性
発現が、マウス肝臓上でのヒトＭＡＣの沈着を阻害できることが示されている（Ｇａｎｄ
ｈｉ， Ｊ．ら、２０１１年 ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６巻：ｅ２１６２１頁）。
ＳＡＣＴまたはＤＴＡＣがマウス肝臓脈管構造をヒトＭＡＣ沈着から保護できるかどう
かを試験するために、ｐＳＡＣＴ、ｐＤＴＡＣおよびｐＧＦＰプラスミドの各々を使用し
て、各組換えタンパク質について、ＡＡＶ血清型８カプシドでシュードタイプ化した組換
えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型２を生成した。導入遺伝子を欠くＡＡＶ２／８構
築物は、Ｃａｓｈｍａｎ， Ｓ．Ｍ．ら、２０１１年 ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６巻：ｅ１９
０７８頁に記載されている。これらのベクターは、それぞれ、ＡＡＶ２／８ＳＡＣＴ、Ａ
ＡＶ２／８ＤＴＡＣ、ＡＡＶ２／８ＧＦＰおよびＡＡＶ２／８ポリＡと称される。
マウス肝臓におけるＡＡＶ２／８の親和性（ｔｒｏｐｉｓｍ）を試験するために、３．
３×１０１１ゲノムコピーのＡＡＶ２／８ＧＦＰを、６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウ
スの腹膜中に注射した。３週間後、マウスを屠殺し、肝臓を回収し、凍結切片をＧＦＰ発
現について試験した。ＡＡＶ２／８ＧＦＰからのＧＦＰ発現は、血管および洞様毛細血管
に対して近位の細胞を含め、肝臓の至る所にあることが観察された（図７Ａ）。これらの
結果は、ＧＦＰ発現が、ベクターの腹腔内送達後に、ほぼ排他的に肝臓被膜中であったこ
とが観察された、同じＣＡＧプロモーターからＧＦＰを発現するアデノウイルスベクター
を利用した以前の研究とは対照的である（Ｇａｎｄｈｉ， Ｊ．ら、２０１１年 ＰＬｏ
Ｓ Ｏｎｅ ６巻：ｅ２１６２１頁）。
ＡＡＶ２／８ＧＦＰによるマウス肝臓の効率的な形質導入が観察されたので、マウスに
、類似の力価のＡＡＶ２／８ＤＴＡＣ、ＡＡＶ２／８ＳＡＣＴまたはＡＡＶ２／８ポリＡ
を腹腔内注射した。ＡＡＶによる注射の３週間後、マウスに、ｍＰＥＣＡＭ－１の心臓内
注射を投与し、その約４～６時間後に、９０％ＮＨＳで灌流した。約１５分後、肝臓を、
凍結切片化のために回収し、Ｃ５ｂ－９に対する抗体を使用して、ヒトＭＡＣについて染
色した（図７Ｂ；８Ａ）。ＭＡＣ染色は、ＡＡＶ２／８ポリＡを注射したマウスの肝臓の
血管および洞様毛細血管において観察された（図７Ｂ；８Ａ）。ＡＡＶ２／８ＤＴＡＣま
たはＡＡＶ２／８ＳＡＣＴのいずれかを注射したマウスは、対照（ＡＡＶ２／８ポリＡ）
注射マウスと比較して、肝臓血管および洞様毛細血管の両方上に、有意に低いＭＡＣ沈着
を有した（図７Ｃ；８Ｂ）。ＩｍａｇｅＪを使用したＭＡＣ染色強度の定量化により、Ａ
ＡＶ２／８ポリＡ注射マウスと比較して、ＡＡＶ２／８ＤＴＡＣ注射マウスの肝臓脈管構
造上のヒトＭＡＣ沈着における５６．７±１６．４％（ｐ＝０．００６１）の低減が示さ
れた（図７Ｃ）。同様に、ＡＡＶ２／８ＳＡＣＴ注射動物は、ＡＡＶ２／８ポリＡ注射マ
ウスと比較して、それらの肝臓脈管構造におけるヒトＭＡＣ沈着における６３．２％±２
０．５％（ｐ＝０．００７５）の低減を示した（図８Ｂ）。洞様毛細血管および血管の両
方の内皮細胞が、ＭＡＣの沈着を示した。肝臓のより大きい（非毛細血管）血管の定量化
により、ＡＡＶ２／８ポリＡ注射動物と比較して、ＡＡＶ２／８ＤＴＡＣ注射動物および
ＡＡＶ２／８ＳＡＣＴ注射動物について、ヒトＭＡＣ沈着におけるそれぞれ５６．０±１
１．３％（ｐ＝０．０００６）および６１．１±１８．９％（ｐ＝０．００５６）の有意
な低減が示された（図７Ｄ；８Ｃ）。したがって、ＤＴＡＣおよびＳＡＣＴは、活性化さ
れたヒト補体からの、マウス肝臓脈管構造に対する有意な保護を、ｉｎ ｖｉｖｏで提供
する。
（実施例２０：ＳＴＡＣの合成）
異なる順序の補体調節領域を有する組換え分子の機能性を比較するために、米国特許第
８，８７７，８９６号に記載される活性化された補体の可溶性ターミネーター（ＳＴＡＣ
）を利用した。ＳＴＡＣのＮ末端は、ヒトＣＤ５９開始コドン、分泌シグナルペプチドお
よびＳＣＲドメインを含む。ポリグリシンリンカーは、ヒトＣＤ４６の４つのＳＣＲドメ
インおよびＳ／Ｔ－リッチ領域を、ＣＤ５９のＣ末端に結合させる。次いで、ヒトＣＤ５
５の４つのＳＣＲドメインおよびＳ／Ｔ－リッチ領域が、ポリグリシン配列を介して、Ｃ
Ｄ４６のＣ末端に連結される（図９）。ＳＴＡＣのｃ－ＤＮＡを、ＣＭＶエンハンサー／
ニワトリβ－アクチンプロモーター（ＣＡＧ）とウサギグロビンポリアデニル化（ｐＡ）
終結配列との間で、ｐＳｈｕｔｔｌｅ中に挿入した。
ＳＴＡＣのアミノ酸配列（配列番号５）は以下に示される：
Figure 0007275095000006
（実施例２１：ＳＴＡＣは、Ｃ３ｂの第Ｉ因子媒介性分解のための補因子として機能す
る）
ＣＤ４６は、Ｃ３ｂおよびＣ４ｂの第Ｉ因子媒介性タンパク質分解性切断のための補因
子として機能する（Ｓｅｙａ Ｔら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． １９８６年；１６３巻（４
号）：８３７～５５頁）。Ｃ３ｂは、Ｃ３コンバターゼの成分であり、それによって、そ
れ自身の形成を促進する。その不活性形態へのＣ３ｂの切断を増強することによって、Ｃ
Ｄ４６は、Ｃ３コンバターゼ形成および補体系の負の調節因子として作用する（Ｓｅｙａ
Ｔら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． １９８６年；１６３巻（４号）：８３７～５５頁）。Ｓ
ＴＡＣがＣＤ４６の機能性を保持するかどうかを試験するために、３μｇのＣ３ｂを、１
００ｎｇの第Ｉ因子の存在下または非存在下で、ｐＡｄＣＡＧＧＦＰまたはｐＡｄＣＡＧ
ＳＴＡＣをトランスフェクトした培地中でインキュベートした。４時間のインキュベーシ
ョン後、試料を、ポリクローナル抗Ｃ３抗体を使用する定量的ウエスタンブロットによっ
て試験して、Ｃ３ｂβ鎖と比較して、存在するＣ３ｂα’鎖の量を評価した（図１０Ａ）
。ＳＴＡＣを含む培地中でインキュベートした試料は、Ｃ３ｂおよび第Ｉ因子を含むｐＧ
ＦＰトランスフェクト細胞由来の培地と比較して、第Ｉ因子の存在下で、Ｃ３ｂα’鎖シ
グナル強度における３４．３％±３．９％の低減（ｐ＝０．０００１）を有することが観
察された（図１０Ｂ）。Ｃ３ｂの第Ｉ因子分解のこの増強は、ＳＴＡＣがＣＤ４６の機能
性を示すことを示している。
（実施例２２：ＳＴＡＣはＣＤ５５の機能性を示す）
ＣＤ５５の機能性を評価するために、溶血アッセイを、ＣＤ５５の機能的部位に対する
抗体の存在下または非存在下で事前インキュベートしたＧＦＰトランスフェクト培地およ
びＳＴＡＣトランスフェクト培地を使用して実施した。ＳＴＡＣトランスフェクト培地中
に懸濁した赤血球は、ＧＦＰ培地対照と比較して、細胞溶解における３２．１％±１０．
４％（ｎ＝６；ｐ＝０．０１１５）の低減を有することが観察された（図１１）。１００
０ｎｇ／ｍｌの抗体との事前インキュベーションは、対照と比較して、１３．４％±９．
４％の、細胞溶解における統計的に有意でない低減を生じた（ｎ＝６；ｐ＝０．１８３）
（図１１）。ＧＦＰトランスフェクト培地への抗体の添加は、細胞溶解における統計的に
有意な変化を生じず、このことは、この抗体が、固有の毒性効果を有さないことを示して
いる。合わせると、これらのデータは、ＳＴＡＣのＣＤ５５部分が機能的に活性であるこ
とを示している。
（実施例２３：ＳＴＡＣは、細胞膜傷害複合体中へのＣ９の取込みを阻害しない）
ＣＤ５９は、補体系の最終経路の強力な阻害剤である（Ｒｏｌｌｉｎｓ ＳＡら、Ｊ
Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９０年；１４４巻（９号）：３４７８～８３頁）。ＣＤ５９は、
細胞膜傷害複合体（ＭＡＣ）中へのＣ９取込みを遮断し、それによって細胞膜における孔
形成を遮断することによって機能する（Ｒｏｌｌｉｎｓ ＳＡら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１９９０年；１４４巻（９号）：３４７８～８３頁）。ＳＴＡＣがＣＤ５９機能を保持
したかどうかを試験するために、感作したヒツジ赤血球を、０．２％のＣ９枯渇正常ヒト
血清中でインキュベートして、Ｃ５ｂ－８複合体を形成させた。次いで、これらの細胞を
、Ｃ９ありまたはなしで事前インキュベートしたｐＡｄＣＡＧＧＦＰ、ｐＡｄＣＡＧＳＴ
ＡＣまたはｐＡｄＣＡＧｓＣＤ５９培地で処理した。ｓＣＤ５９の陽性対照は、Ｃ９を含
むＧＦＰ培地と比較して、細胞溶解において２１％±９．２％（ｎ＝８；ｐ＝０．０３３
）の低減を有することが観察された（図１２）。Ｃ９を含むＳＴＡＣ培地は、細胞溶解に
おいて低減を有さないことが観察され（ｎ＝１４；ｐ＝０．４２８）、このことは、ＳＴ
ＡＣのＣＤ５９部分が、Ｃ９取込みを防止できず、したがって、非機能的であることを示
している（図１２）。
ＳＴＡＣの機能性をＳＡＣＴおよびＤＴＡＣと比較すると、本明細書で提供される組換
えタンパク質は、タンパク質成分ＣＤ５９、ＣＤ４６およびＣＤ５５の順序が、ＳＡＣＴ
中と同様のこの順序で、これら３つの成分の個々の機能を可能にすることを示している。

Claims (16)

  1. 補体関連状態の処置における使用のための遺伝子療法組成物であって、該組成物が、少なくともＣＤ５５およびＣＤ５９由来のアミノ酸配列を有する組換えキメラタンパク質をコードするウイルス発現ベクターを含み、ＣＤ５９タンパク質由来のアミノ酸配列が、ＣＤ５５タンパク質のアミノ酸配列に対してＣ末端側にある、組成物。
  2. 前記組換えキメラタンパク質をコードする前記ウイルス発現ベクターが、
    （ｉ）アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびレンチウイルスの群より選択される少なくとも１つである、および／または
    （ｉｉ）ベータアクチンであって、必要に応じてニワトリベータアクチンである、ベータアクチン；ペリフェリン／ＲＤＳ；ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ；およびロドプシンからなる群より選択される遺伝子由来のプロモーターを含む、
    請求項１に記載の使用のための組成物。
  3. 前記ウイルス発現ベクターが、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）、またはＡＡＶ血清型８カプシドでシュードタイプ化されたＡＡＶ２（ＡＡＶ２／８）である、請求項１または２に記載の使用のための組成物。
  4. （ｉ）前記ＣＤ５９タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列が、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカリングドメインの機能喪失を付与する少なくとも１つの変異を含み、該機能喪失変異が、置換、欠失および付加の少なくとも１つである、または
    （ｉｉ）前記ＣＤ５５タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列が、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカリングドメインの機能喪失を付与する少なくとも１つの変異を含み、該機能喪失変異が、置換、欠失および付加の少なくとも１つであるか、またはショートコンセンサスリピートドメインおよびセリン／スレオニン／プロリンリッチドメインの少なくとも１つを含む、または
    （ｉｉｉ）ヌクレオチド配列が、膜貫通ドメインの機能喪失を付与する少なくとも１つの変異を含むＣＤ４６タンパク質のアミノ酸配列をさらにコードし、該機能喪失変異が、置換、欠失および付加の少なくとも１つである、
    請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
  5. 前記ウイルス発現ベクターが、配列番号１および配列番号３からなる群より選択される核酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
  6. 前記核酸配列が、少なくとも１つのアミノ酸を含むリンカーをさらにコードし、必要に応じて、該少なくとも１つのアミノ酸が、グリシン、セリン、またはアラニンである、請求項１～５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
  7. 前記組成物が、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内、粘膜、皮下、舌下、鼻腔内、経口、眼内、硝子体内、外用、経皮、膣および注入からなる群より選択される少なくとも１つの経路による投与のために製剤化される、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
  8. 前記補体関連状態が、黄斑変性、加齢黄斑変性、炎症性腸疾患、甲状腺炎、クリオグロブリン血症、胎児消失、臓器グラフト拒絶、敗血症、ウイルス感染症、真菌感染症、細菌感染症、トキシックショック症候群（ＴＳＳ）、膜性増殖性糸球体腎炎、デンスデポジット病、発作性夜間ヘモグロビン尿症、ループス腎炎、膜性腎炎、免疫グロブリンＡ腎症、グッドパスチャー症候群、連鎖球菌感染後糸球体腎炎、全身性エリテマトーデス、非典型溶血性尿毒症症候群、全身性エリテマトーデス、ループス関節炎、関節リウマチ、シェーグレン症候群、ベーチェット症候群、全身性硬化症、アルツハイマー病、多発性硬化症、重症筋無力症、ギラン・バレー症候群、大脳ループス、脳卒中、成人呼吸促迫症候群、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、溶血性貧血、発作性寒冷ヘモグロビン尿症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、血管炎、天疱瘡、水疱性類天疱瘡、光毒性反応、乾癬、アナフィラキシーショック、アレルギー、喘息、心筋梗塞、糖尿病性網膜症、微小脈管障害、皮膚筋炎、Ｂ細胞リンパ増殖性障害、脱髄疾患、急性腎臓傷害、ＣＯＰＤ、Ｒｈ疾患、免疫性溶血性貧血、免疫性血小板減少性紫斑病、補体関連糸球体症、およびアテローム動脈硬化症からなる群より選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
  9. 前記組成物が、１回の単一投与のために製剤化される、請求項１～８のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
  10. 前記組成物が、静脈内注射、房水もしくは硝子体液中への眼内注射、眼の外層中への注射、結膜下注射、またはテノン嚢下注射などの注射のために製剤化される、請求項９に記載の使用のための組成物。
  11. 培養物中で哺乳動物細胞のゲノムを改変する方法であって、該方法が、該哺乳動物細胞を少なくともＣＤ５５およびＣＤ５９由来のアミノ酸配列を有する組換えキメラタンパク質をコードするウイルス発現ベクターと接触させるステップを含み、ＣＤ５９タンパク質由来のアミノ酸配列が、ＣＤ５５タンパク質のアミノ酸配列に対してＣ末端側にある、方法。
  12. 前記組換えキメラタンパク質をコードする前記ウイルス発現ベクターが、
    （ｉ）アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびレンチウイルスの群より選択される少なくとも１つである、および／または
    （ｉｉ）ベータアクチンであって、必要に応じてニワトリベータアクチンである、ベータアクチン；ペリフェリン／ＲＤＳ；ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ；およびロドプシンからなる群から選択される遺伝子由来のプロモーターを含む、
    請求項１１に記載の方法。
  13. 前記ウイルス発現ベクターが、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）、またはＡＡＶ血清型８カプシドでシュードタイプ化されたＡＡＶ２（ＡＡＶ２／８）である、請求項１１または１２に記載の方法。
  14. （ｉ）前記ＣＤ５９タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列が、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカリングドメインの機能喪失を付与する少なくとも１つの変異を含み、該機能喪失変異が、置換、欠失および付加の少なくとも１つである、または
    （ｉｉ）前記ＣＤ５５タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列が、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカリングドメインの機能喪失を付与する少なくとも１つの変異を含み、該機能喪失変異が、置換、欠失および付加の少なくとも１つであるか、またはショートコンセンサスリピートドメインおよびセリン／スレオニン／プロリンリッチドメインの少なくとも１つを含む、または
    （ｉｉｉ）前記ヌクレオチド配列が、膜貫通ドメインの機能喪失を付与する少なくとも１つの変異を含むＣＤ４６タンパク質のアミノ酸配列をさらコードし、該機能喪失変異が、置換、欠失および付加の少なくとも１つである、
    請求項１１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記ウイルス発現ベクターが、配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記核酸配列が、少なくとも１つのアミノ酸を含むリンカーをさらにコードし、必要に応じて、該少なくとも１つのアミノ酸が、グリシン、セリン、またはアラニンである、請求項１１～１５のいずれか一項に記載の方法。
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