ES2872537T3 - Composiciones, métodos y kits para el tratamiento de trastornos relacionados con el complemento - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende una proteína quimérica recombinante que tiene secuencias de aminoácidos de al menos, CD55 y CD59; o un ácido nucleico que codifica la proteína quimérica recombinante, en la que el orden de las secuencias que comprenden la proteína quimérica recombinante es CD55 y CD59, en la que las secuencias de aminoácidos de la proteína CD59 tienen terminal C para las secuencias de aminoácidos de la proteína CD55.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones, métodos y kits para el tratamiento de trastornos relacionados con el complemento

Campo técnico

La presente invención se relaciona en general a composiciones y métodos para tratar trastornos relacionados con el complemento.

Antecedentes

El sistema del complemento es un componente humoral del sistema inmunitario innato, que es responsable de inactivar patógenos invasores y mantener la homeostasis de tejido. Thurman, J.M., et al. 2011 Lab Invest 91: 4-11). El sistema del complemento es potente y, por lo tanto, está estrechamente regulado por una variedad de inhibidores solubles y unidos a la membrana (Thurman, J.M., et al. 2011 Lab Invest 91: 4-11, Zipfel, P.F., et al. 2009 Nat Rev Immunol 9: 729-740). La activación inapropiada del complemento se ha asociado con una amplia variedad de enfermedades heredadas y adquiridas, que incluyen autoinmunitarias, inflamatorias, hematológicas, neurodegenerativas, cancerosas, por isquemia/reperfusión, trasplante de órganos y sepsis (Zipfel, P.F., et al. 2009 Nat Rev Immunol 9: 729-740, Makrides, S.C. 1998 Pharmacol Rev 50: 59-87, Holers, V.M. 2008 Immunol Rev 223: 300-316). Las superficies extrañas presentes en biomateriales tales como implantes médicos, filtros de hemodiálisis y sistemas de suministro de genes también desencadenan la activación del complemento (Makrides, S.C. 1998 Pharmacol Rev 50: 59-87).

La activación aguda del complemento se produce en enfermedades tales como sepsis o el rechazo de trasplantes. Sin embargo, la mayoría de los trastornos asociados con la activación del complemento son crónicos, por ejemplo degeneración macular relacionada con la edad (AMD), hemoglobinuria paroxística nocturna o artritis reumatoide (Zipfel, P.F., et al. 2009 Nat Rev Immunol 9: 729-740). Una porción de las enfermedades crónicas que involucran al complemento son provocadas por deficiencias en los reguladores del complemento (Zipfel, P.F., et al. 2009 Nat Rev Immunol 9: 729-740). Las deficiencias en el regulador del complemento son principalmente de la ruta alternativa y pueden involucrar la ruta clásica, tal como en el angioedema hereditario o en el lupus eritematoso sistémico (SLE) (Mayilyan, K.R. 2012 Protein Cell 3: 487-496).

La activación del complemento conduce a la formación del complejo de ataque a la membrana (MAC), un poro que rompe la membrana celular y posteriormente lisa la célula (Walport, M.J. 2001 N Engl J Med 344: 1058-1066). Los niveles elevados de MAC junto con polimorfismos o mutaciones en los reguladores del complemento se encuentran en pacientes con enfermedades crónicas tales como la AMD, lo que indica que la falla en una variedad de puntos de control en la activación del complemento está asociada con la patogénesis de la enfermedad (Mullins, R.F., et al. 2011 Exp Eye Res 93: 565-567). En los casos de personas con AMD, las personas con una capacidad reducida para formar m Ac están parcialmente protegidas de la patogénesis de la enfermedad sin complicaciones significativas, lo que respalda la premisa de que la atenuación a largo plazo de la activación del complemento para trastornos crónicos puede ser un enfoque viable para el tratamiento de AMD y otros trastornos asociados al complemento tales como la artritis reumatoide (Nishiguchi, K.M., et al. 2012 Invest Ophthalmol Vis Sci 53: 508-512, Piccoli, A.K., et al. 2011 Rev Bras Reumatol 51: 503-510).

En el momento en que se presenta la presente solicitud, solo hay unos pocos inhibidores del complemento aprobados por la FDA disponibles para los pacientes (Ricklin, D. and Lambris, J.D. 2013 J Immunol 190: 3839-3847). En el contexto de trastornos crónicos tales como la AMD, algunos de estos agentes terapéuticos requerirían inyecciones repetidas del inhibidor del complemento en el ojo, un modo de suministro asociado con efectos secundarios significativos (Wu, L., et al.2008 Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 246: 81-87, Shima, C., et al.2008 Acta Ophthalmol 86: 372-376).

El documento US 2013/0149373 describe métodos, composiciones y kits para prevenir o tratar afecciones relacionadas con el complemento utilizando proteína CD46, la proteína CD55 o un terminador soluble recombinante de la proteína del complemento activado (STAC). Sin embargo, el orden de los componentes de fusión es diferente al de los componentes de fusión dentro de las composiciones descritas en el presente documento.

Subsiste la necesidad de inhibidores del complemento para tratar enfermedades del complemento tales como AMD y trastornos hepáticos.

Resumen

La invención es como se define en las presentes reivindicaciones. En un aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína quimérica recombinante que tiene secuencias de aminoácidos de al menos, CD55 y CD59; o un ácido nucleico que codifica la proteína quimérica recombinante, en el que el orden de las secuencias que comprenden la proteína quimérica recombinante es CD55 y CD59, en el que las secuencias de aminoácidos de la proteína CD59 tienen terminal C para las secuencias de aminoácidos de la proteína CD55.

De forma adecuada, la composición de acuerdo con la invención, puede tener la secuencia de aminoácidos de la proteína CD59 que comprende al menos una mutación que confiere pérdida de función de un dominio de anclaje de glicosil fosfatidil inositol (GPI), en la que la mutación es al menos una de una sustitución, una supresión, y una adición.

Alternativamente, la secuencia de aminoácidos de la proteína CD55 puede comprender al menos una mutación que confiere pérdida de función de un dominio de anclaje de glicosil fosfatidil inositol (GPI), en la que la mutación es al menos una de una sustitución, una supresión, y una adición.

Alternativamente, la composición de la invención puede comprender un vehículo de suministro diseñado por ingeniería para dirigirse a una célula o un tejido, en el que el vehículo de suministro se selecciona del grupo de: un liposoma, un lípido, un policatión, un péptido, una nanopartícula, una partícula de oro, y un polímero.

Alternativamente, la proteína en la composición de la invención puede comprender adicionalmente un ligador que conecta al menos un par de secuencias de aminoácidos seleccionadas de la proteína CD55 y la proteína CD59.

Alternativamente, el ácido nucleico en la composición de la invención puede codificar adicionalmente un ligador que contiene al menos un aminoácido, opcionalmente en el que al menos un aminoácido es una glicina, una serina, o una alanina.

Alternativamente, el ácido nucleico en la composición de la invención puede codificar adicionalmente la secuencia de aminoácidos de la proteína CD55 que comprende al menos una mutación que resulta en pérdida de función de un dominio de anclaje de glicosil fosfatidil inositol (GPI) de la proteína CD55, en la que la mutación comprende una sustitución, una supresión, o una adición, o en la que la secuencia de aminoácidos de la proteína CD55 comprende al menos uno de: un dominio de repetición de consenso corto y un dominio rico en serina/treonina/prolina.

Alternativamente, el ácido nucleico que codifica la proteína quimérica recombinante en la composición de la invención se podría:

(i) codificar en un plásmido o un vector viral, opcionalmente en el que el vector viral es al menos uno seleccionado del grupo de: un adenovirus, un virus adenoasociado, un virus del herpes, un poxvirus, y un lentivirus, y/o

(ii) comprender un promotor de un gen seleccionado del grupo que consiste en: una beta actina, opcionalmente en la que la beta actina es una beta actina de pollo; una periferina/RDS; una fosfodiesterasa cGMP; y una rodopsina.

Alternativamente, la composición de la invención podría comprender adicionalmente un agente seleccionado del grupo que consiste en: antitumoral, anticoagulante, antivírico, antibacteriano, antimicobacteriano, antifúngico, antiproliferativo, y antiapoptótico.

Alternativamente, la proteína quimérica recombinante en la composición de la invención puede tener una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias que se muestran en la SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4.

Alternativamente, la composición puede comprender: una proteína quimérica recombinante que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 2, que comprende las secuencias de cada una de una proteína CD46, una proteína CD55, y una proteína CD59; o una proteína quimérica recombinante que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 4 que comprende las secuencias de cada una de una proteína CD55 y una proteína CD59.

En otro aspecto, la composición farmacéutica de la invención es para uso en el tratamiento de una afección relacionada con el complemento, en el que la afección relacionada con el complemento se selecciona del grupo de: degeneración macular, degeneración macular relacionada con la edad, enfermedad inflamatoria del intestino, tiroiditis, crioglobulinemia, pérdida fetal, rechazo de injerto de órgano, septicemia, infección viral, infección fúngica, infección bacteriana, síndrome de choque tóxico (TSS), glomerulonefritis membranoproliferativa, enfermedad de depósitos densos, hemoglobinuria paroxística nocturna, nefritis lúpica, nefritis membranosa, nefropatía por inmunoglobulina A, Síndrome de Goodpasture, glomerulonefritis posestreptocócica, lupus eritematoso sistémico, síndrome urémico hemolítico atípico, lupus eritematoso sistémico, artritis lúpica, artritis reumatoide, síndrome de Sjogren, síndrome de Behget, esclerosis sistémica, enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple, miastenia gravis, síndrome de Guillain-Barré, lupus cerebral, apoplejía, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis quística, anemia hemolítica, hemoglobinuria paroxística por frío, hemoglobinuria paroxística nocturna, vasculitis, pénfigo, penfigoide ampolloso, reacciones fototóxicas, soriasis, choque anafiláctico, alergia, asma, infarto de miocardio, retinopatía diabética, microvasculopatía, dermatomiositis, trastornos linfoproliferativos de células B, enfermedad desmielinizante, lesión renal aguda, COPD, enfermedad Rh, anemia hemolítica inmunitaria, púrpura trombocitopénica inmunitaria, glomerulopatías asociadas al Complemento, y aterosclerosis.

Un aspecto que no cae dentro del alcance de la invención proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento de una afección relacionada con el complemento en un sujeto que incluye una proteína quimérica recombinante que tiene secuencias de aminoácidos de al menos dos de una proteína CD46, una proteína CD55 y una proteína CD59, o una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína quimérica recombinante, de tal manera que la proteína quimérica recombinante modula negativamente las rutas del complemento clásicas y alternativas. En una realización de la composición, la proteína quimérica recombinante es un terminador del complemento activo soluble. En una realización de la composición, la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína CD59 incluye al menos una mutación que confiere pérdida de función de un dominio de anclaje de glicosil fosfatidil inositol (GPI), de tal manera que la mutación es al menos una de una sustitución, una supresión, y una adición. En una realización de la composición, la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína CD55 incluye al menos una mutación que confiere pérdida de función de un dominio de anclaje de glicosil fosfatidil inositol (GPI), de tal manera que la mutación es al menos una de una sustitución, una supresión, y una adición. En una realización de la composición, la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína CD46 incluye al menos una mutación que confiere pérdida de función de dominio que atraviesa la membrana, de tal manera que la mutación comprende al menos una de una sustitución, una supresión, y una adición. En algunas realizaciones, la composición se formula en una dosis efectiva para tratar el sujeto para la afección relacionada con el complemento. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la proteína CD59 comprende un péptido de señal secretor.

En algunas realizaciones de la composición, la proteína incluye adicionalmente un ligador que conecta al menos una de: secuencias de aminoácidos de la proteína CD59 y la proteína CD46; secuencias de aminoácidos de la proteína CD46 y la proteína CD55; y secuencias de aminoácidos de la proteína CD55 y la proteína CD59. En otra realización de la composición, la secuencia de nucleótidos codifica adicionalmente un ligador que incluye al menos un aminoácido por ejemplo una glicina, una serina, o una alanina. En una realización de la composición, las secuencias de aminoácidos de las proteínas CD46, CD55 y CD59 se codifican mediante ácido nucleico que codifica una proteína de fusión en el mismo marco de lectura que una expresión una fusión de transcripción en la que la expresión de las proteínas está operativamente ligada y la expresión.

En una realización de la composición, la secuencia de aminoácidos de la proteína CD46 incluye al menos uno de: un dominio de repetición de consenso corta y un dominio rico en serina/treonina/prolina, o de tal manera que secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína CD46 incluye al menos una mutación, por ejemplo una sustitución, una supresión o una adición que resulta en pérdida de dominio que atraviesa la membrana, o de tal manera que secuencia de nucleótidos que codifica proteína CD55 secuencia de aminoácidos incluye al menos una mutación que resulta en pérdida de función de un dominio de anclaje de glicosil fosfatidil inositol (GPI) de la proteína CD55, la mutación incluye una sustitución, una supresión, o una adición, o de tal manera que la secuencia de aminoácidos de la proteína CD55 incluye al menos uno de: un dominio de repetición de consenso corto y un dominio rico en serina/treonina/prolina.

En una realización de la composición, la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína quimérica recombinante comprende un plásmido. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos incluye un vector viral. En una realización de la composición, el vector es al menos uno seleccionado del grupo de: un adenovirus, un virus adenoasociado, un virus del herpes, un poxvirus, y un lentivirus. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos incluye un promotor de un gen seleccionado del grupo que consiste en: una beta actina por ejemplo una beta actina de pollo, una periferina/RDS, fosfodiesterasa cGMP, y una rodopsina. Algunas realizaciones de la composición incluyen adicionalmente un vehículo de suministro diseñado por ingeniería para dirigirse a una célula o un tejido, el vehículo de suministro se selecciona del grupo de: un liposoma, un lípido, un policatión, un péptido, una nanopartícula, una partícula de oro, y un polímero. Una realización de la composición incluye adicionalmente al menos uno de: una sal o emoliente farmacéuticamente aceptable. Una realización de la composición incluye adicionalmente un agente seleccionado del grupo que consiste en: antitumoral, anticoagulante, antivírico, antibacteriano, antimicobacteriano, antifúngico, antiproliferativo y antiapoptótico.

Un aspecto que no cae dentro del alcance de la invención proporciona un método para el tratamiento de una afección relacionada con el complemento en un sujeto que incluye: poner en contacto una célula del sujeto con una composición que incluye una proteína CD46, una proteína CD55, y una proteína CD59 o una proteína quimérica recombinante ligada operativamente a una secuencia promotora que provoca la expresión de la proteína quimérica recombinante en una célula, de tal manera que la secuencia de nucleótidos codifica las secuencias de aminoácidos de cada una de la proteína CD59, la proteína CD46, y la proteína CD55, o la composición incluye un vector que lleva una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína c D46, la proteína CD55, la proteína CD59 o la proteína quimérica recombinante; medir los síntomas de la afección relacionada con el complemento en el sujeto; comparar los síntomas del sujeto con los síntomas antes de la puesta en contacto; y medir una disminución en los síntomas de la afección relacionada con el complemento en el sujeto, tratando de esta manera la afección relacionada con el complemento. En una realización del método que no cae dentro del alcance de la invención, la proteína quimérica recombinante es un terminador del complemento activo soluble.

En una realización del método que no cae dentro del alcance de la invención, medir incluye medir al menos una de: una cantidad de una proteína de una ruta del complemento, y una cantidad del complejo de ataque a Membrana.

Medir el complejo de ataque a Membrana incluye analizar una cantidad del complejo de ataque a membrana en una célula de tal manera que la célula se selecciona de: muscular, epitelial, endotelial, y vascular, o de tal manera que la célula se selecciona de un tejido en al menos uno de: ojo, corazón, riñón, tiroides, cerebro, estómago, pulmón, hígado, páncreas, y sistema vascular. En las realizaciones de los métodos descritos en el presente documento que no caen dentro del alcance de la invención, la afección se selecciona del grupo de: degeneración macular, degeneración macular relacionada con la edad, enfermedad inflamatoria del intestino, tiroiditis, crioglobulinemia, pérdida fetal, rechazo de injerto de órgano, septicemia, infección viral, infección fúngica, infección bacteriana, síndrome de choque tóxico (TSS), glomerulonefritis membranoproliferativa, enfermedad de depósitos densos, hemoglobinuria paroxística nocturna, nefritis lúpica, nefritis membranosa, nefropatía por inmunoglobulina A, Síndrome de Goodpasture, glomerulonefritis posestreptocócica, lupus eritematoso sistémico, síndrome urémico hemolítico atípico, lupus eritematoso sistémico, artritis lúpica, artritis reumatoide, síndrome de Sjogren, síndrome de Behget, esclerosis sistémica, enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple, miastenia gravis, síndrome de Guillain-Barré, lupus cerebral, apoplejía, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis quística, anemia hemolítica, hemoglobinuria paroxística por frío, hemoglobinuria paroxística nocturna, vasculitis, pénfigo, penfigoide ampolloso, reacciones fototóxicas, soriasis, choque anafiláctico, alergia, asma, infarto de miocardio, retinopatía diabética, microvasculopatía, dermatomiositis, trastornos linfoproliferativos de células B, enfermedad desmielinizante, lesión renal aguda, COPD, enfermedad Rh, anemia hemolítica inmunitaria, púrpura trombocitopénica inmunitaria, glomerulopatías asociadas al Complemento, y aterosclerosis.

En algunas realizaciones del método que no cae dentro del alcance de la invención, la célula se pone en contacto in vitro o ex vivo o in vivo o in situ. En algunas realizaciones del método que no cae dentro del alcance de la invención, antes de poner en contacto la célula, el método incluye adicionalmente diseñar por ingeniería el vector que lleva el nucleótido que codifica la proteína quimérica recombinante. En algunas realizaciones del método, diseñar por ingeniería incluye mutar el ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína CD55 de tal manera que al menos una mutación resulte en pérdida de función de dominio de anclaje de glicosil fosfatidil inositol (GPI), o de tal manera que diseñar por ingeniería incluye mutar el ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína CD46 de tal manera que al menos una mutación resulte en la eliminación de un dominio que atraviesa la membrana, o de tal manera que diseñar por ingeniería incluye mutar la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína CD59 de tal manera que al menos una mutación resulte en pérdida de función de dominio de anclaje de glicosil fosfatidil inositol (GPI), o de tal manera que diseñar por ingeniería incluye unir de forma recombinante el ácido nucleico que codifica el terminal C de la proteína CD46 con el ácido nucleico que codifica los aminoácidos del terminal N de la proteína CD55, y unir de forma recombinante la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el terminal C de la proteína CD55 con el ácido nucleico que codifica el terminal N de la proteína CD59. En algunas realizaciones, la mutación incluye al menos una de: una sustitución, una supresión, y una adición. En algunas realizaciones del método que no cae dentro del alcance de la invención, poner en contacto la célula incluye administrar la composición mediante al menos una ruta seleccionada del grupo que consiste en: intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, mucosa, subcutánea, sublingual, intranasal, oral, intraocular, intravítrea, tópica, transdérmica, vaginal e infusión.

Un aspecto que no cae dentro del alcance de la invención proporciona un kit para la regulación o de tratamiento de una afección relacionada con el complemento en un sujeto, el método incluye: una composición que comprende una proteína quimérica recombinante que incluye secuencias de aminoácidos de cada una de una proteína CD46, una proteína CD55, y una proteína CD59, o una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína quimérica recombinante, de tal manera que la composición modula negativamente las rutas del complemento clásicas y alternativas y se formula en una dosis efectiva para tratar el sujeto para la afección relacionada con el complemento; instrucciones para el tratamiento del sujeto; y, un recipiente.

Un aspecto que no cae dentro del alcance de la invención proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento de una afección relacionada con el complemento en un sujeto que incluye una proteína quimérica recombinante que tiene secuencias de aminoácidos de una proteína CD55, y una proteína CD59, o una secuencia de nucleótidos que expresa la proteína quimérica recombinante, de tal manera que la proteína quimérica recombinante modula negativamente las rutas del complemento clásicas y alternativas.

Otro aspecto que no cae dentro del alcance de la invención proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento de una afección relacionada con el complemento en un sujeto que incluye secuencias de aminoácidos de al menos dos de una proteína CD46, una proteína CD55, y una proteína CD59, o una primera proteína quimérica recombinante que incluye secuencias de aminoácidos de cada una de una proteína CD46, una proteína CD55, y una proteína CD59, o una segunda proteína quimérica recombinante que tiene secuencias de aminoácidos de una proteína CD55, y una proteína CD59, o una secuencia de nucleótidos que expresa la primera proteína quimérica recombinante, o una secuencia de nucleótidos que expresa la segunda proteína quimérica recombinante, de tal manera que la primera o la segunda proteína modula negativamente las rutas del complemento clásicas y alternativas.

Aún otro aspecto que no cae dentro del alcance de la invención proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento de una afección relacionada con el complemento en un sujeto que incluye una primera proteína quimérica recombinante que comprende secuencias de aminoácidos de cada una de una proteína CD46, una proteína CD55, y una proteína CD59, y una segunda proteína quimérica recombinante que tiene secuencias de aminoácidos de una proteína CD55, y una proteína CD59, o una secuencia de nucleótidos que expresa la primera proteína quimérica recombinante y una secuencia de nucleótidos que expresa la segunda proteína quimérica recombinante, de tal manera que la primera y la segunda proteínas quiméricas recombinantes modulan negativamente las rutas del complemento clásicas y alternativas.

Un aspecto que no cae dentro del alcance de la invención proporciona un método para el tratamiento de una afección relacionada con el complemento en un sujeto que incluye: poner en contacto una célula del sujeto con una composición que incluye una proteína CD55, y una proteína CD59 o una proteína quimérica recombinante ligada operativamente a una secuencia promotora que provoca la expresión de la proteína quimérica recombinante en una célula, de tal manera que la secuencia de nucleótidos codifica las secuencias de aminoácidos de cada una de la proteína CD59, y la proteína CD55, o la composición incluye un vector que lleva una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína CD55, la proteína CD59 o la proteína quimérica recombinante; y, observar los síntomas de la afección relacionada con el complemento en el sujeto; comparar los síntomas del sujeto con los síntomas antes de la puesta en contacto; y observar una disminución en los síntomas de la afección relacionada con el complemento en el sujeto, tratar de esta manera la afección relacionada con el complemento. En una realización del método que no cae dentro del alcance de la invención, la proteína quimérica recombinante es un terminador doble del Complemento Activo.

En una realización del método que no cae dentro del alcance de la invención, medir incluye medir al menos una de una cantidad de una proteína de una ruta del complemento, y complejo de ataque a Membrana. En una realización del método que no cae dentro del alcance de la invención, medir complejo de ataque a Membrana incluye analizar una cantidad del complejo de ataque a membrana en una célula; de tal manera que la célula se selecciona de: muscular, epitelial, endotelial, y vascular, o de tal manera que la célula se selecciona de un tejido en al menos uno de: ojo, corazón, riñón, tiroides, cerebro, estómago, pulmón, hígado, páncreas, y sistema vascular. En las realizaciones de los métodos descritos en el presente documento que no caen dentro del alcance de la invención, la afección se selecciona del grupo de: degeneración macular, degeneración macular relacionada con la edad, enfermedad inflamatoria del intestino, tiroiditis, crioglobulinemia, pérdida fetal, rechazo de injerto de órgano, septicemia, infección viral, infección fúngica, infección bacteriana, síndrome de choque tóxico (TSS), glomerulonefritis membranoproliferativa, enfermedad de depósitos densos, hemoglobinuria paroxística nocturna, nefritis lúpica, nefritis membranosa, nefropatía por inmunoglobulina A, Síndrome de Goodpasture, glomerulonefritis posestreptocócica, lupus eritematoso sistémico, síndrome urémico hemolítico atípico, lupus eritematoso sistémico, artritis lúpica, artritis reumatoide, síndrome de Sjogren, síndrome de Behcet, esclerosis sistémica, enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple, miastenia gravis, síndrome de Guillain-Barre, lupus cerebral, apoplejía, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis quística, anemia hemolítica, hemoglobinuria paroxística por frío, hemoglobinuria paroxística nocturna, vasculitis, pénfigo, penfigoide ampolloso, reacciones fototóxicas, soriasis, choque anafiláctico, alergia, asma, infarto de miocardio, retinopatía diabética, microvasculopatía, dermatomiositis, trastornos linfoproliferativos de células B, enfermedad desmielinizante, lesión renal aguda, COPD, enfermedad Rh, anemia hemolítica inmunitaria, púrpura trombocitopénica inmunitaria, glomerulopatías asociadas al Complemento, y aterosclerosis.

En realizaciones alternativas del método que no cae dentro del alcance de la invención, la célula se pone en contacto in vitro, ex vivo, o in vivo, y si es in vivo, posiblemente también en situ. En algunas realizaciones del método que no cae dentro del alcance de la invención, antes de poner en contacto la célula, el método incluye adicionalmente diseñar por ingeniería el vector que lleva el nucleótido que codifica la proteína quimérica recombinante. En algunas realizaciones del método que no cae dentro del alcance de la invención, diseñar por ingeniería incluye mutar el ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína CD55 de tal manera que al menos una mutación resulte en pérdida de función de dominio de anclaje de glicosil fosfatidil inositol (GPI), o de tal manera que diseñar por ingeniería incluye mutar el ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína CD46 de tal manera que al menos una mutación resulte en la eliminación de un dominio que atraviesa la membrana, o de tal manera que diseñar por ingeniería incluye mutar la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína CD59 de tal manera que al menos una mutación resulte en pérdida de función de dominio de anclaje de glicosil fosfatidil inositol (GPI), o de tal manera que diseñar por ingeniería incluye unir de forma recombinante el ácido nucleico que codifica el terminal C de la proteína CD46 con el ácido nucleico que codifica los aminoácidos del terminal N de la proteína CD55, y unir de forma recombinante la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el terminal C de la proteína CD55 con el ácido nucleico que codifica el terminal N de la proteína CD59. En algunas realizaciones, la mutación incluye al menos una de: una sustitución, una supresión, y una adición. En algunas realizaciones del método que no cae dentro del alcance de la invención, poner en contacto la célula incluye administrar la composición mediante al menos una ruta seleccionada del grupo que consiste en: intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, mucosa, subcutánea, sublingual, intranasal, oral, intraocular, intravítrea, tópica, transdérmica, vaginal e infusión.

Breve descripción de figuras

La Figura 1A y la Figura 1B son un dibujo esquemático y una fotografía que muestra la estructura y expresión de SACT y DTAC.

La Figura 1A es un dibujo esquemático de la estructura de los reguladores del complemento asociados a membrana humanos CD46, CD55 y CD59 y las proteínas recombinantes solubles SACT y DTAC. Tanto CD55 como CD46 contienen cada uno cuatro dominios de repetición consenso cortos (SCR) y una región rica en serina/treonina (S/T). Los dominios SCR y S/T son sitios de glicosilación ligada a N y O, respectivamente. CD46 se inserta en la membrana a través de un dominio hidrófobo, y CD55 y CD59 se unen cada uno a la membrana a través de un anclaje de glicofosfatidilinositol (GPI). CD59 contiene una unidad funcional corta de 76 aminoácidos. Tanto SACT como DTAC contienen los cuatro dominios SCR y la región rica en S/T del CD55 humano separados por un ligador de poliglicina del dominio funcional del CD59 humano. SACT contiene adicionalmente los cuatro dominios SCR de CD46 humano en el terminal N separados por un ligador de poliglicina de los SCR de CD55. Tanto SACT como DTAC contienen una señal secretora derivada de CD59 humano. En la ingeniería de las proteínas recombinantes, no se incluyeron el dominio que atraviesa la membrana de CD46 y las señales para la unión de un anclaje de GPI a cada uno de CD55 y CD59.

La Figura 1B es una fotografía de una transferencia de Western que muestra medios de células transfectadas con pDTAC, pGFP o pSACT sondeadas con anticuerpos contra CD46, CD55 y CD59.

La Figura 2A, Figura 2B, Figura 2C y Figura 2D son dibujos esquemáticos, una fotografía y un gráfico de barras que muestra que SACT actúa como un cofactor para la escisión mediada por el Factor I de C3b.

La Figura 2A es un dibujo esquemático de la escisión del Factor I de C3b. C3b consiste en dos cadenas polipeptídicas (a' y p), unidas por un enlace disulfuro. El Factor I media la escisión de la cadena a' de 104 kDa en fragmentos inactivos, iC3bH e iC3bL.

La Figura 2B es un dibujo esquemático que muestra la unión de CD46 de C3b depositado sobre la membrana celular para actuar como cofactor para la escisión mediada por el Factor I a iC3b inactivo.

La Figura 2C es una fotografía de una transferencia Western de C3b purificado incubado en medio de células transfectadas con pSACT, pDTAC o pGFP en presencia o ausencia del Factor I y sondeado con un anticuerpo específico para C3. La transferencia western muestra una mayor escisión de la cadena a' en presencia de medios de células transfectadas con pSACT en comparación con la escisión que se produce en presencia de pGFP o pDTAC. La Figura 2D es un gráfico de barras de la cuantificación de los datos de transferencia de Western que muestra una reducción del 51.861 ± 10.5 % (p = 0.007) y del 46.2 ± 4.8 % (p = 0.0007) en la cantidad de la cadena a' de C3b en medios de células transfectadas con pSACT que contienen C3b y Factor I en comparación con medios de células transfectadas con pGFP y células transfectadas con pDTAC que contienen C3b y Factor I, respectivamente. Las intensidades de la señal para la cadena a' se normalizaron a la intensidad de la señal de la cadena p.

La Figura 3A, Figura 3B y Figura 3C son un dibujo esquemático y gráficos de barras que muestran que SACT y DTAC aceleran la degradación de la convertasa C3.

La Figura 3A es un dibujo esquemático de la disociación de CD55 y la unión del factor B a C3b para acelerar la degradación de la convertasa C3.

La Figura 3B es un gráfico de barras de la cuantificación de inmunotinción del factor B que se une a C3b unido a agarosa utilizando un anticuerpo para el Factor B. El gráfico muestra que los medios de las células transfectadas con pDTAC o pSACT dieron como resultado una reducción de 16.1 ± 6.4 % (p = 0.0214, n = 11) y 16.8 ± 6.1 % (p = 0.0127, n = 11) en el Factor B unido a C3b, respectivamente, en comparación con los medios de células transfectadas con pGFP (n = 10). La unión del factor B se presenta como % de tinción con respecto a la intensidad de tinción media del Factor B unido a C3b en presencia de medios de células transfectadas con pGFP.

La Figura 3C es un gráfico de barras de la cuantificación de la lisis mediada por complemento de eritrocitos de oveja humana que se incubaron con medio de células transfectadas con pDTAC o pSACT en presencia o ausencia de anticuerpo de bloqueo de CD55. Se observó una reducción significativa en la protección contra la lisis celular tanto para DTAC como para SACT en presencia de anticuerpo.

La Figura 4A y Figura 4B son un dibujo esquemático y un gráfico de barras que muestra que SACT y DTAC inhiben la incorporación de C9 en el complejo de ataque a membrana.

La Figura 4A es un dibujo esquemático de la función CD59. CD59 se une al complejo proteico C5b-8 asociado a membrana, evitando la incorporación de C9 y la formación del complejo de ataque a membrana (MAC). MAC forma un poro en la superficie celular, reduciendo la integridad de la membrana.

La Figura 4B es un gráfico de barras de la cuantificación de la lisis de eritrocitos de oveja por suero humano agotado en C9 incubado con C9 en presencia de medio transfectado con pGFP, pDTAC o pSACT. Los medios de células transfectadas con pDTAC y pSACT redujeron la lisis mediada por complemento de eritrocitos humana en un 34.8 ±3.6 % (p < 0.0001) y un 29.9 ± 4.6 % (p < 0.0001), respectivamente, en comparación con los eritrocitos incubados en presencia de medios de células transfectadas con pGFP.

La Figura 5A y Figura 5B son gráficos de barras que muestran que SACT y DTAC protegen tanto a los eritrocitos de oveja como a los hepatocitos murinos de la lisis mediada por complemento humano in vitro.

La Figura 5A es un gráfico de barras de cuantificación de la lisis de eritrocitos de oveja (hemólisis) mediante suero humano en presencia de medio de células transfectadas con pGFP, pDTAC o pSACT que muestra una reducción de 47 ± 2.9 % (p < 0.0001) y un 21.5 ± 2.8 % (p < 0.0001) en la lisis por Dt AC y sAc T, respectivamente, en comparación con los medios de las células transfectadas con GFP.

La Figura 5B es un gráfico de cuantificación de la captación de yoduro de propidio (PI) por hepatocitos murinos incubados con suero humano normal (NHS) en presencia de medio de células transfectadas con pGFP, pDTAC o pSACT. También se muestra una muestra de control de hepatocitos incubados con NHS inactivado por calor (hiNHS) en presencia de medio de células transfectadas con pGFP. Se observó que los hepatocitos incubados con medio de células transfectadas con pDTAC o pSACT tenían una reducción de 28.73 % ± 10.21 % (p = 0.014, n = 8) o 20.8 ± 9.0 % (p = 0.037, n = 8) en la captación de PI, respectivamente en comparación a hepatocitos incubados con medio de células transfectadas con pGFP (n = 7).

La Figura 6A y Figura 6B son micrografías y un gráfico de barras que muestra que DTAC y SACT reducen el depósito del Complejo de Ataque a Membrana in vitro.

La Figura 6A es un conjunto de micrografías fluorescentes de hepatocitos murinos incubados con NHS en presencia de medio de células transfectadas con pGFP, pDTAC o pSACT. Las células se tiñeron con un anticuerpo para MAC o para DAPI.

La Figura 6B representa gráficamente la cuantificación de la intensidad/área de tinción de MAC y muestra una reducción del 53.8 ± 10.4 % (p = 0.0004, n = 6) o 67.8 ± 9.2 % (p < 0.0001, n = 6) en el depósito de MAC en hepatocitos murinos incubados con medio de células transfectadas con pDTAC o pSACT, respectivamente, en comparación con hepatocitos incubados con medio de células transfectadas con pGFP (n = 6). También se muestra una muestra de control de hepatocitos incubados con hiNHS en presencia de medio de células transfectadas con pGFP. DAPI, 4',6-diamidino-2-fenilindol; MAC, complejo de ataque a membrana; hiNHS, suero humano normal inactivado por calor. La Figura 7A, Figura 7B, Figura 7C y Figura 7D son micrografías y gráficos de barras que muestran que DTAC protege la vasculatura hepática murina del depósito de MAC humano in vivo.

La Figura 7A es un conjunto de micrografías fluorescentes de criosecciones que muestran la transducción de AAV2/8GFP de hígado murino. Se observó una transducción eficaz en todo el tejido. También se muestra un mayor aumento de la región enmarcada.

La Figura 7B es un conjunto de micrografías fluorescentes de criosecciones de hígado teñidas con anticuerpo anti-MAC recolectado de ratones inyectados en el espacio intraperitoneal con AAV2/8pA o AAV2/8DTAC y perfundidos con anticuerpo mPECAM1 y NHS. También se muestra un mayor aumento de las regiones enmarcadas.

La Figura 7C es un conjunto de gráficos de barras de cuantificación de la intensidad de tinción de MAC (IU) de secciones de hígado, que muestra una reducción del 56.7 ± 16.4 % (p = 0.0061) en el depósito de MAC humano sobre la vasculatura hepática de ratones inyectados con AAV2/8DTAC en relación con ratones inyectados con AAV2/8polyA. La Figura 7D es un gráfico de barras de cuantificación de la intensidad de tinción de MAC por área de vasos sanguíneos que muestra una reducción del 55.6 ±11.3 % (p = 0.0006) en el depósito de MAC humano en hígados de ratones inyectados con AAV2/8DTAC en comparación con los inyectados con AAV2/8polyA. La intensidad de la tinción se promedió a partir de 8 secciones por ratón. n = 6 para ratones inyectados con AAV2/8polyA y n = 6 para ratones inyectados con AAV2/8DTAC. (DIC: contraste de interferencia diferencial; IU: unidad de intensidad).

La Figura 8A, Figura 8B y Figura 8C son micrografías y gráficos de barras que muestran que SACT protege la vasculatura hepática murina del depósito de MAC humano in vivo.

La Figura 8A es un conjunto de micrografías fluorescentes de criosecciones de hígado teñidas con anticuerpo anti-MAC recolectado de ratones inyectados en el espacio intraperitoneal con AAV2/8pA o AAV2/8SACT y perfundidos con anticuerpo mPECAM1 y NHS. También se muestra un mayor aumento de las regiones enmarcadas.

La Figura 8B es un gráfico de barras de la cuantificación de la intensidad de tinción de MAC (IU) de secciones de hígado que muestra una reducción del 63.2 % ± 620.5 % (p = 0.0075) en el depósito de MAC humano sobre la vasculatura hepática de ratones inyectados con AAV2/8SACT en comparación con ratones inyectados con AAV2/8polyA.

La Figura 8C es un gráfico de barras de cuantificación de la intensidad de tinción de MAC por área de vasos sanguíneos que muestra una reducción del 61.1 ± .9 % (p = 0.0056) en el depósito de MAC humano sobre los vasos sanguíneos de ratones inyectados con AAV2/8SACT en relación con ratones inyectados con AAV2/8polyA. La intensidad de la tinción se promedió a partir de 8 secciones por ratón. n = 8 para ratones inyectados con AAV2/8polyA y n = 9 para ratones inyectados con AAV2/8SACT.

La Figura 9 es un dibujo esquemático de estructuras del terminador soluble del complemento activado (STAC) que muestra la estructura de los reguladores del complemento humanos asociados a membrana, CD46, CD55 y CD59 y la proteína recombinante soluble STAC. STAC contiene una señal secretora derivada de CD59 humano. Los cuatro dominios SCR y la región rica en S/T de CD46 humano se adhirieron mediante un ligador de poliglicina a CD59. Los cuatro dominios SCR y la región rica en S/T de CD55 humano se diseñaron para ser separados por un ligador de poliglicina del dominio funcional de CD46 humano.

La Figura 10A y la Figura 10B son una fotografía y un gráfico de barras que muestra que STAC actúa como un cofactor para la escisión mediada por el Factor I de C3b.

La Figura 10A es una fotografía de una transferencia Western de C3b purificado incubado en medio obtenido de células transfectadas con pAdCAGGFP o con pAdCAGSTAC en presencia o ausencia de Factor I y sondeado con un anticuerpo para C3. Los datos muestran una mayor escisión de la cadena a' en presencia de medios de células transfectadas con pAdCAGSTAC en comparación con la escisión que se produjo en presencia de pAdCAGGFP. La Figura 10B es un gráfico de cuantificación de datos de transferencia Western que muestra una reducción del 34.3 % ± 3.9 % (n = 4; p = 0.0001) en la cantidad de la cadena a' de C3b en medios de células transfectadas con pAdCAGSTAC que contienen C3b y Factor I en comparación a medios de células transfectadas con pAdCAGGFP que contienen C3b y Factor I (n = 4). Las intensidades de la señal para la cadena a' se normalizaron a la intensidad de la señal de la cadena p.

La Figura 11 es un gráfico de barras que muestra que la porción CD55 de STAC conserva la funcionalidad. El gráfico ilustra la cuantificación de la lisis mediada por complemento humano de eritrocitos de oveja sensibilizados que se incubaron con medio de células transfectadas con pAdCAGGFP o pAdCAGSTAC en presencia o ausencia de anticuerpo de bloqueo de CD55. Se observó que las muestras tratadas con STAC en ausencia de bloqueo de mAb tenían una reducción del 32.1 % ± 10.4% en la lisis celular (n = 6, p = 0.0115) en comparación con las muestras tratadas con GFP (n = 6) sin bloqueo de anticuerpos. Los eritrocitos de oveja suspendidos en medio de células transfectadas con pAdCAGSTAC que contienen anticuerpo de bloqueo CD55 mostraron una reducción no estadísticamente significativa del 13.4 % ± 69.4 % en la lisis celular (n = 6; p = 0.1831). La lisis celular que tuvo lugar en el medio GFP sin el anticuerpo de bloqueo se estableció en 100 % de lisis celular.

La Figura 12 es un gráfico de barras que muestra que STAC no pudo evitar la incorporación de C9 en el complejo de ataque a membrana. El gráfico es una cuantificación de la lisis de eritrocitos de oveja por suero humano agotado en C9 incubado con o sin C9 en presencia de medios transfectados con pAdCAGGFP, pAdCAGSTAC o pAdCAGsCD59 (control positivo). Se observó que los eritrocitos tratados con sCD59+C9 tenían una reducción del 21 % ± 9.1 % (n = 8; p = 0.033) en la lisis celular en comparación con las células tratadas con GFP+C9 (n = 14). Las muestras tratadas con STAC C9 no mostraron disminución en la lisis celular (n = 14; p = 0.428).

Descripción detallada

Hay una variedad de trastornos asociados con la activación del complemento. CD46, CD55 y CD59 son los principales reguladores del complemento asociados a membrana en las células humanas. La expresión independiente de CD55, CD46 o CD59 a través de la transferencia de genes protege los tejidos murinos contra el ataque mediado por el complemento humano. El ejemplo de la presente solicitud describe el potencial de combinar las propiedades reguladoras del complemento de CD46, CD55 y CD59 en productos de un solo gen expresados a partir de un vector de virus adenoasociado (AAV) en una forma soluble no anclada a membrana.

La desregulación del sistema del complemento es uno de los principales factores que contribuyen a la etiología de la AMD, una de las principales causas de ceguera en los ancianos (Gehrs et al. 2010 Arch Ophthalmol 128: 349-358). La forma más devastadora de la enfermedad afecta aproximadamente al 10% de los pacientes (Klein 2008 Ophthalmology 115: 1026-1031) e implica el crecimiento de vasos sanguíneos atenuados desde la vasculatura coroidea a través de la membrana de Bruch hasta la retina. El plasma liberado por estos vasos “mal formados” daña los fotorreceptores y otras células de la retina, lo que finalmente conduce a una pérdida grave de la visión. Sin embargo, la gran mayoría de los pacientes con AMD presentan depósitos extracelulares que se producen entre el epitelio pigmentario de la retina (RPE) y la membrana de Bruch, denominada drusas, y que finalmente conducen a la atrofia del RPE (atrofia geográfica).

Se consideró una función potencial del complemento en la AMD porque se identificaron proteínas del complemento en las drusas de los ojos con AMD (Johnson et al. 2001 Exp Eye Res 73: 887-896; Johnson et al. 2000 Exp Eye Res 70: 441-449; Mullins et al. Eye (Lond) 15: 390-395; y Mullins et al. 2000 FASEB J 14: 835-846). Se han identificado polimorfismos en varios genes del complemento y se ha observado que son fuertemente predictivos o protectores contra la AMD. Un solo cambio de aminoácido, Y402H, en el factor H representa hasta el 40-50 % de la AMD en ojos envejecidos (Edwards et al. 2005 Science 308: 421-424; Hageman et al. 2005 Proc Natl Acad Sci USA 102: 7227­ 7232; y Haines et al. 2005 Science 308: 419-421).

Las variantes de haplotipo tanto en el factor B como en el componente 2 del complemento (C2) dan como resultado un riesgo significativamente reducido de desarrollar AMD (Gold et al. 2006 Nat Genet 38: 458-462), y una sustitución de R80G en el componente 3 del complemento (C3) aumentó el riesgo de tener AMD hasta en un 22 % (Yates et al.

2007 N Engl J Med 357: 553-561). Se ha demostrado que la variante del factor B (32Q) tiene una afinidad de unión 4 veces menor por C3b, con una capacidad reducida para formar la convertasa (Montes et al. 2009 Proc Natl Acad Sci USA 106: 4366-4371). Además, se ha demostrado que los polimorfismos en C2, C3 y el factor B se relacionan significativamente con la progresión a ambos tipos de enfermedad de AMD avanzada, neovascularización coroidea y atrofia geográfica (Klein 2008 Ophthalmology 115: 1026-1031; Maller et al.2007 Nat Genet 39: 1200-1201; y Reynolds et al.2009 Invest Ophthalmol Vis Sci 50: 5818-5827).

Se ha observado el depósito de proteínas del complemento en la coriocapilar de pacientes con retinopatía diabética (Gerl et al. 2002 Invest Ophthalmol Vis Sci 43: 1104-1108), y en vasos retinianos de sujetos diabéticos (Zhang et al.

2002 Diabetes 51: 3499-3504). Los vasos retinianos mostraron una reducción significativa en la expresión de las proteínas reguladoras del complemento CD55 y CD59. También se han observado componentes del complemento en las membranas epirretinianas de pacientes que padecen vitreorretinopatía proliferativa (PVR), y se ha observado una regulación al alza de la proteína iniciadora de la ruta clásica, C1q, y una expresión alterada de otras proteínas de la cascada en ojos glaucomatosos (Baudouin et al. 1990 Am J Ophthalmol 110: 593-598; Stasi et al. 2006 Invest Ophthalmol Vis Sci 47: 1024-1029; y Tezel et al. 2010 Invest Ophthalmol Vis Sci 51(11): 5697-707).

Hay pocos modelos animales que sean útiles para investigar directamente el papel del complemento en la función y patología de la retina. La mayoría de estos modelos se han utilizado para analizar el impacto de diferentes proteínas del complemento en el desarrollo de la neovascularización coroidea (CNV) inducida por láser en la retina del ratón. Otros estudios han demostrado la dependencia de la patología retiniana sobre la ruta alternativa, en lugar de la ruta clásica o de lectina, y sobre la formación del complejo de ataque a membrana (Bora et al. 2007 J Immunol 178: 1783­ 1790; Bora et al. 2006 J Immunol 177: 1872-1878; y Bora et al. 2005 J Immunol 174: 491-497). Estudios previos han demostrado una función significativa de las anafilatoxinas, C3a y C5a, en el desarrollo de CNV (Nozaki et al. 2006 Proc Natl Acad Sci USA 103: 2328-2333). Los ratones envejecidos con deficiencia de factor H exhibieron una arquitectura alterada en la membrana de Bruch, RPE y fotorreceptores, y ERG reducidos (Coffey et al.2007 Proc Natl Acad Sci USA 104: 16651-16656), y manifestaron una pérdida de integridad de los vasos retinianos (Lundh von Leithner et al. 2009 Am J Pathol 175: 412-421). La ruta alternativa del complemento también se ha implicado como un factor principal en la degeneración de la retina inducida por la luz que se ha demostrado que se reduce significativamente en un ratón deficiente en Factor D (Rohrer et al. 2007 Invest Ophthalmol Vis Sci 48: 5282-5289).

Las células ganglionares de ratones con eliminación de C3 exhibieron una protección transitoria, pero significativa, de la degeneración debida a la reperfusión de isquemia retiniana (Kuehn et al. 2008 Exp Eye Res 87: 89-95).

Una de las tres rutas del complemento distintas (clásica, de lectina o alternativa) inicia la cascada del complemento (Markiewski et al. 2007 Am J Pathol 171: 715-727) y estas rutas convergen en el punto de la ruta de descomposición de C3 en C3a y C3b. La descomposición de C3 inicia la parte final de la ruta que culmina en la formación del complejo de ataque a membrana (MAC), una estructura en forma de poro que se inserta en las membranas de las células propias o no propias provocando su lisis. Además del potencial de lisis celular por la producción de la opsonina C3b, la activación de C3 genera las anafilatoxinas, C3a y C5a, las cuales son efectores potentes y pleiotrópicos de la inflamación. A diferencia de las rutas clásicas o de lectina, la ruta alternativa es constitutivamente activa con pequeñas cantidades de hidrólisis de C3 y conversión a convertasa que se produce en el suero.

Un enfoque para el suministro de inhibidores del complemento para enfermedades crónicas tales como AMD o artritis reumatoide es el uso de terapia génica somática. La terapia génica es eficaz en humanos para el tratamiento de trastornos de un solo gen y los pacientes con trastornos complejos tales como artritis reumatoide también se han tratado con éxito utilizando un enfoque de terapia génica (Ginn, S.L., et al. 2013 J Gene Med 15: 65-77). Se ha encontrado que el uso de la terapia génica es excepcionalmente eficaz para movilizar versiones solubles de inhibidores del complemento que de otro modo estarían asociados a membrana. Por ejemplo, CD59 (protectina) es un inhibidor natural de MAC que se encuentra unido a las membranas de las células a través de un anclaje de glicosilfosfatidilinositol (GPI). El CD59 asociado a membrana es un potente inhibidor de MAC y se ha informado que el CD59 soluble independiente de membrana es eficaz in vivo solo cuando se administra a través de un vector de terapia génica como el virus adenoasociado (AAV) (Cashman, S.M., et al.2011 PLoS One 6: e19078).

CD55 (factor de aceleración de la degradación) es una proteína anclada a GPI que regula la actividad del complemento al acelerar la degradación de la convertasa C3 clásica y alternativa (Walport, M.J. 2001 N Engl J Med 344: 1058-1066). CD46 (proteína cofactor de membrana), es una glicoproteína transmembrana de tipo 1 expresada de forma ubicua que actúa como cofactor para la escisión mediada por el factor I de C3b y C4b y previene la formación de la convertasa C3 clásica y alternativa (Riley-Vargas, R.C., et al.2004 Immunol 25: 496-503). CD46 regula el bucle de amplificación de la ruta alternativa de activación del complemento. CD55 y CD46 tienen propiedades diferentes y cada uno contiene una serie de motivos de repetición de 60 aminoácidos llamados repeticiones de consenso cortas (SCR) que actúan como módulos reguladores del complemento (Coyne, K.E., et al. 1992 J Immunol 149: 2906-2913). La especificidad de especie entre las proteínas del complemento humano y de ratón limita la prueba de inhibidores del complemento humano en tejidos murinos in vivo (Kim, D.D., et al. 2006 Clin Immunol 118: 127-136). Los métodos y composiciones proporcionados en el presente documento se refieren diseñar por ingeniería una nueva proteína recombinante no asociada a membrana para una inhibición óptima de la activación del complemento. Esto se logra mediante el direccionamiento simultáneo de las rutas clásica y alternativa del complemento y en diferentes puntos de la cascada del complemento. Las rutas clásicas y alternativas del complemento se dirigen al combinar las propiedades de CD55, CD46 y CD59. Los ejemplos del presente documento describen la síntesis de la nueva proteína recombinante manipulada y miden los méritos de su capacidad para inhibir el complemento humano en cultivo celular y el complemento humano en tejidos murinos in vivo mediante terapia génica. Los ejemplos del presente documento también describen una proteína recombinante que combina las propiedades inhibidoras del complemento de CD55 y CD59.

En el presente documento se proporciona una molécula recombinante no asociada a membrana, SACT, que exhibe las propiedades combinatorias de CD46, CD55 y CD59. SACT es una proteína secretada que puede actuar como cofactor para la escisión mediada por el Factor I de C3b, acelerar la degradación de la convertasa C3, atenuar el reclutamiento de C9 en el MAC, proteger las células de la lisis mediada por complemento humana e inhibir el depósito de MAC humano sobre células de ratón in vitro e in vivo. También se proporciona en el presente documento una composición DTAC que se observó que tenía las propiedades combinadas de CD55 y CD59, y que no actúa como un cofactor para la escisión mediada por el Factor I de C3b.

El complemento es una primera línea crítica de defensa inmunitaria en vertebrados, que brinda protección contra organismos extraños y la amenaza de células propias dañadas (Walport, M.J. 2001 N Engl J Med 344: 1058-1066). La sobreexpresión de los reguladores del complemento para el tratamiento de patologías mediadas por complemento posee riesgos y beneficios. Por lo tanto, se inhibió la ruta del complemento en los puntos combinados de formación y degradación de la convertasa C3 y la formación de MAC, lo que permite que C1q interactúe con superficies modificadas propias y no propias, lo que permite la fagocitosis mediada por C3b de células y organismos ofensivos (Trouw, et al. 2008 Mol Immunol 45: 1199-1207). Las funciones de CD55, CD46 y CD59 se combinaron en una sola proteína diseñada por ingeniería, SACT. Adicionalmente, debido a que CD46 funciona al nivel de la degradación de C3b y CD55 previene la formación o acelera la degradación de convertasas sin alterar C3b, se prevé en el presente documento que CD46 interfiere con la eliminación de células objetivo mediada por C3b. Esto puede ser especialmente importante para el tratamiento de enfermedades similares al lupus donde la depuración reducida de células apoptóticas puede resultar en una respuesta autoinmunitaria para las células moribundas (Trouw, et al. 2008 Mol Immunol 45: 1199-1207). Los estudios de la diversidad de factores genéticos implicados en SLE proporcionan una ilustración completa de la importancia de mantener el potencial de activación de los componentes dirección ascendente de la cadena de la cascada y bloquear los eventos dirección descendente de la cadena (Karp, D.R. 2005 Curr Opin Rheumatol 17: 538-542). Por lo tanto, se generó y probó una segunda molécula recombinante que incluye solo las funciones CD55 y CD59, DTAC.

Se utilizó un enfoque de terapia génica para suministrar SACT o DTAC a células en cultivo o hígados murinos in vivo. El progreso significativo en el campo de la terapia génica indica que este es un enfoque viable para el tratamiento de enfermedades heredadas o adquiridas. La activación del complemento cumple una función importante en muchos trastornos, que incluyen la artritis reumatoide, una enfermedad crónica del sistema del complemento. Se han documentado niveles elevados de C3 y MAC y niveles reducidos de CD59 en el tejido sinovial de pacientes con artritis reumatoide (Kemp, P.A., et al. 1992 J Clin Lab Immunol 37: 147-162, Konttinen, Y.T., et al. 1996 Ann Rheum Dis 55: 888-894). Estos estudios están respaldados adicionalmente por la observación de que la inyección de las articulaciones de la rodilla de rata con anticuerpo monoclonal contra CD59 produce artritis espontánea y aguda y un aumento de la patología articular en ratones c D59 -/-, un fenotipo que puede corregirse mediante el uso de un CD59 recombinante dirigido a membrana (Kemp, P.A., et al. 1992 J Clin Lab Immunol 37: 147-162). Se descubrió que la atenuación de la activación del complemento al dirigirse a C5 es eficaz en un modelo murino de artritis reumatoide, lo que indica que hay múltiples puntos de la cascada del complemento que pueden servir como objetivos para terapias basadas en el complemento (Kemp, P.A., et al. 1992 J Clin Lab Immunol 37: 147-162). Por lo tanto, SACT y d Ta C son cada uno inhibidores particularmente efectivos de la activación del complemento porque concomitantemente se dirigen y atenúan varios puntos de la cascada del complemento. Aunque es factible la repetición de inyecciones de inhibidores de la activación del complemento en pacientes con artritis reumatoide, se prefiere potencialmente una inyección única de larga duración mediante terapia génica por motivos de eficacia y conveniencia para el paciente. Se ha mostrado que el virus adenoasociado (AAV) persiste en humanos durante años y durante más de una década en animales grandes (Colella, P., et al. 2009 Trends Mol Med 15: 23-31, Jiang, H., et al. 2006 Mol Ther 14: 452-455). Adicionalmente, AAV no está asociado con ninguna enfermedad humana conocida.

Se puede presentar un caso sólido para el suministro de inhibidores del complemento a través de un enfoque de terapia génica para enfermedades tales como AMD. Aproximadamente el 50 % de los pacientes que padecen AMD tienen polimorfismos en el Factor H regulador del complemento (Klein, R.J., et al. 2005 Science 308: 385-389). Los individuos que son homocigotos para un polimorfismo Y402H en el Factor H tienen aproximadamente un 70 % más de MAC en sus vasos sanguíneos coroideos y en el epitelio pigmentario de la retina (RPE) (Mullins, R.F., et al. 2011 Exp Eye Res 93: 565-567). Los individuos con una forma avanzada de AMD conocida como atrofia geográfica tienen niveles reducidos de inhibidores del complemento sobre su RPE (Ebrahimi, K.B., et al. 2013 J Pathol 229: 729-742). Un polimorfismo que ocurre comúnmente en C9 en la población japonesa que evita que esos individuos que ensamblan MAC de manera eficiente se protejan contra la progresión de AMD, lo que sugiere que la inactivación del complemento a través de un enfoque de terapia génica puede ser una vía viable para el tratamiento de esta enfermedad (Nishiguchi, K. M., et al. 2012 Invest Ophthalmol Vis Sci 53: 508-512).

Sin embargo, todos los inhibidores de la activación del complemento que se encuentran actualmente en ensayos clínicos son moléculas pequeñas, aptámeros o anticuerpos que tendrían que volver a inyectarse con frecuencia en el ojo de los pacientes con AMD (Keane, P.A., et al. 2012 J Ophthalmol 2012: 483034). Estos inhibidores tienen efectos secundarios importantes tales como aumento de la presión intraocular, endoftalmitis y desprendimiento de retina (Wu, L. , et al. 2008 Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 246: 81-87, Shima, C., et al. 2008 Acta Ophthalmol 86: 372-376). Una sola inyección que puede producir una proteína terapéutica localmente durante un tiempo prolongado, tal como un vector AAV, que media la expresión de SACT o DTAC, puede ser particularmente atractiva para el tratamiento de enfermedades tales como la AMD. La restricción de especies entre las proteínas del complemento limita la prueba de CD55 humana y CD46 humana con respecto al complemento murino y, por tanto, en modelos murinos de AMD (Kim, D.D., et al. 2006 Clin Immunol 118: 127-136). Los inventores de la presente solicitud han mostrado que el CD55 humano o el CD46 humano inhiben eficazmente el complemento humano depositado en tejidos retinianos murinos sobre modelos murinos ex vivo de depósito de MAC (Sweigard, J.H., et al. 2011 Gene Ther 18: 613-621).

En la actualidad, existen más de 25 moléculas pequeñas, anticuerpos o proteínas bajo desarrollo clínico y preclínico para la atenuación de la activación del complemento. Estas moléculas están dirigidas a una amplia variedad de indicaciones que incluyen lesión renal aguda, COPD, hemoglobinuria paroxística nocturna, artritis reumatoide, sepsis, AMD y trasplantes. La mayoría de estas terapias se dirigen al complemento al nivel de C3 o C5 (Ricklin, D., et al. 2013 J Immunol 190: 3839-3847). Se ha mostrado que las mutaciones en CD46 predisponen a los individuos al síndrome urémico hemolítico familiar (Kavanagh, D., et al. 2008 Annu Rev Med 59: 293-309). La deficiencia de CD55 se ha asociado con anemia hemolítica autoinmunitaria primaria, SLE y hemoglobinuria paroxística nocturna (Richaud-Patin, Y., et al. 2003 Immunol Lett 88: 95-99, Iwamoto, N., et al. 1995 Blood 85: 2228-2232). También se ha demostrado que CD55 atenúa el daño de los órganos por reperfusión isquémica (Weeks, C., et al. 2007 Clin Immunol 124: 311-327). Se ha mostrado que las mutaciones o deficiencias en CD59 provocan hemólisis crónica y enfermedad desmielinizante periférica recidivante en la infancia, hemoglobinuria paroxística nocturna, anemia hemolítica autoinmunitaria o SLE (Iwamoto, N., et al. 1995 Blood 85: 2228-2232, Nevo, Y., et al. 2013 Blood 121: 129-135). Se prevé en el presente documento que los inhibidores del complemento tales como SACT y DTAC serán útiles para el tratamiento de estos trastornos.

Fodor et al. han descrito una molécula recombinante asociada a membrana que contiene las propiedades combinatorias de CD55 y CD59 (Fodor, W.L., et al. 1995 J Immunol 155: 4135-4138). Del mismo modo, Kroshus et al.

han descrito una molécula soluble que combina las propiedades de CD46 y CD55 y han demostrado que esta molécula podría reducir la lesión aguda del tejido cardíaco en un modelo de trasplante de cerdo a humano (Kroshus, T.J., et al.

2000 Transplantation 69: 2282-2289). Una proteína recombinante compuesta de dominios seleccionados de CR2 y factor H demostró una mayor supervivencia, una producción reducida de autoanticuerpos y una función renal mejorada en un modelo murino de lupus (Sekine, H., et al. 2011 Arthritis Rheum 63: 1076-1085). Sin embargo, ninguno de estos estudios suministró la proteína recombinante mediante un enfoque de terapia génica.

Para los ejemplos in vivo del presente documento se utilizó un AAV2 pseudotipado con la cápside de AAV8 (AAV2/8). Se ha mostrado que este vector tiene una eficacia muy alta de transducción del hígado de ratones (Paneda, A., et al.

2009 Hum Gene Ther 20: 908-917). Los ejemplos in vivo se realizaron en el hígado en parte porque se pueden formar fácilmente grandes cantidades de MAC humana en el hígado murino (Gandhi, J., et al. 2011 PLoS One 6: e21621). Adicionalmente, se seleccionó el hígado en parte porque los hepatocitos son responsables de la biosíntesis del 80­ 90 % de los componentes plasmáticos del complemento (Qin, X., et al. 2006 Cell Mol Immunol 3: 333-340). Finalmente, el hígado recibe el 25 % del flujo sanguíneo total, lo que permite una amplia distribución de DTAC y SACT en todo el sistema circulatorio, lo que sería relevante para el tratamiento de trastornos sistémicos que involucran la activación del complemento (Myers, J.D., et al. 1948 J Clin Invest 27: 620-627). La expresión de DTAC y SACT in vivo indicó que ambos son potentes inhibidores del complemento humano en un entorno in vivo y los datos mostrados en los ejemplos del presente documento apoyan el valor terapéutico de estas moléculas si se secretan desde el hígado.

Para investigar si el orden de las regiones reguladoras del complemento afecta la capacidad funcional, las proteínas proporcionadas en el presente documento se ensayaron en comparación con el terminador soluble del complemento activado (STAC), patente de Estados Unidos número 8,877,896 emitida el 4 de noviembre de 2014. STAC contiene lo siguiente: El terminal N de STAC contiene el codón de inicio CD59 humano, el péptido de señal secretora y el dominio SCR; un ligador de poliglicina une los cuatro dominios SCR y la región rica en S/T de CD46 humano al terminal C de CD59; y cuatro dominios SCR y la región rica en S/T de CD55 humano están unidos al terminal C de CD46 mediante una secuencia de poliglicina (Figura 9). Se preparó el ADNc para STAC, la proteína se expresó entre un mejorador de CMV/promotor de p-actina de pollo (CAG) y una secuencia de terminación de poliadenilación de globina de conejo (pA). (Ibid.)

La funcionalidad de cada uno de los componentes CD46, CD55 y CD59 se midió individualmente en STAC como se describe en los ejemplos del presente documento. Se observó que la porción de CD59 en STAC no era funcional. CD59 es un potente inhibidor de la ruta terminal del sistema del complemento (Rollins SA, et al., J Immunol. 1990; 144 (9): 3478-83). CD59 funciona al bloquear la incorporación de C9 en el complejo de ataque a membrana (MAC), bloqueando de esta manera la formación de poros en las membranas celulares (Rollins SA, et al., J Immunol. 1990; 144 (9): 3478-83). Se observó que la porción CD59 de STAC no podía evitar la incorporación de C9. Por lo tanto, la porción CD59 de STAC no es funcional y, por tanto, esta porción de STAC no contribuye a la función como inhibidor del complemento.

La invención en el presente documento proporciona una proteína recombinante funcional no asociada a membrana, SACT, que exhibe las propiedades combinatorias de CD46, CD55 y CD59, y también proporciona una proteína recombinante DTAC, que tiene las propiedades combinatorias de CD55. y CD59. Se observó que cada una de estas proteínas exhibía sorprendentemente propiedades y funciones de sus componentes modulares y cada una de estas proteínas es un potente inhibidor de la activación del complemento in vitro e in vivo. Se observó que cada uno de los componentes de la proteína SACT y la proteína DTAC exhibían su función biológica en contraste con STAC.

Proteína SACT

Se observó previamente que una CD59 unida a la membrana protegía a las células de la enfermedad mediada por el complemento, sin embargo, el sitio de expresión del regulador produjo solo un “parche” de protección en el tejido ocular tal como el RPE. Por lo tanto, en el presente documento se diseña por ingeniería un regulador secretado de CD59 (sCD59 o rmiCD59), que era capaz de difundirse a través de la retina y ofrecer protección a toda la región afectada (Kumar-Singh et al., Publicación PCT número WO/2009/102488).

El sCD59 soluble se consideraba anteriormente un regulador ineficaz del complemento in vivo a menos que se fusionara con una fracción dirigida a la membrana (Mizuno et al. 2001 Arthritis Rheum 44: 2425-2434; Bora 2010 J Biol Chem 285: 33826-33833; Song et al. 2003 J Clin Invest 111: 1875-1885; y Zhang et al. 1999 J Clin Invest 103: 55-61). Un sCD59 independiente de membrana expresado in vivo en tejido ocular murino a través de un adenovirus o vector AAV redujo significativamente el depósito de MAC y la neovascularización coroidea inducida por láser en un modelo de ratón de AMD neovascular (Cashman et al. 2011 PLoS ONE 6(4): e19078).

Se observó que el sCD59 suministrado por adenovirus inhibía el depósito de MAC humano incluso sobre la vasculatura hepática murina.

Sin estar limitado por ninguna teoría o mecanismo de acción particular, se contempla en el presente documento que una proteína de fusión recombinante que contiene al menos dos de la proteína CD59, la proteína CD46 y la proteína CD55 es un potente regulador de varias rutas y proteínas del complemento. Los ejemplos en el presente documento proporcionan métodos para diseñar un nuevo Terminador de Complemento Activo Soluble (SACT) que tiene pequeñas unidades funcionales de cada proteína CD46, proteína CD55 y proteína CD59 que son efectivas para tratar afecciones relacionadas con el complemento al modular la cascada del complemento, y proporcionar la composición. La composición de proteína SACT resultante incluye unidades funcionales de proteína c D46, proteína CD55 y proteína CD59 que, en determinadas realizaciones, se ligan operativamente. Por ejemplo, las unidades funcionales están conectadas por un ligador, que es una secuencia de aminoácidos que no afecta la función de los componentes o la estabilidad estructural de la proteína. Adicionalmente, la proteína en determinadas realizaciones se muta para retirar o eliminar una secuencia que codifica un anclaje de membrana de proteína. En una realización relacionada, una proteína SACT de ejemplo incluye una señal secretora en el terminal N. La proteína SACT es de aproximadamente 130 KDa y se obtuvo conservando solo las unidades/dominios de cada componente de proteína que están involucrados en la regulación del complemento. Otros reguladores del complemento soluble tales como el factor H (150 kDa) y el sCR I (200 kDa) son más grandes y se han utilizado para regular el complemento (Ripoche et al. 1984 Biochem J 221: 89-96; y Yoon et al. 1985 J Immunol 134: 3332-3338).

La proteína SACT recombinante diseñada por ingeniería en el presente documento se diferencia de los reguladores de origen natural porque incluye múltiples dominios reguladores del complemento de diferentes combinaciones de proteínas CD59, CD46 y CD55 y es independiente de membrana. Por tanto, la proteína SACT es capaz de difundir y cubrir un gran grupo de células o tejidos afectados para su tratamiento después de una sola administración a la vez. Por ejemplo, la proteína SACT incluye una secuencia de aminoácidos de al menos dos de una proteína CD46, una proteína CD55 y una proteína CD59. Por ejemplo, la proteína SACT incluye al menos una de: la proteína CD46 y la proteína CD59, la proteína CD46 y la proteína CD55, y la proteína CD55 y la proteína CD59. Alternativamente, la proteína SACT incluye cada una de la proteína CD59, proteína CD46 y proteína CD55, ligadas operativamente y expresadas, por ejemplo, en una forma soluble. En varias realizaciones, la proteína CD46, la proteína CD55 y la proteína CD59 se derivan de proteínas de mamíferos (por ejemplo, de humano, ratón y conejo). Por ejemplo, la proteína SACT comprende una proteína CD46 y una proteína CD59 que son proteínas humanas y una proteína CD55 que es una proteína murina, o comprende cada una de las CD46, CD55 y CD59 que son proteínas humanas. Por tanto, en diversas realizaciones, la proteína SACT comprende proteínas que son del mismo tipo de mamífero o de diferentes tipos de mamíferos.

Sin estar limitado por ninguna teoría o mecanismo de acción particular, se prevé en el presente documento que la proteína SACT bloquea sinérgicamente la activación del complemento en múltiples etapas en la ruta del complemento, que incluyen cada una de las rutas del complemento reguladas por cada proteína c D59, proteína CD46. y proteína CD55. En los Ejemplos del presente documento, se observó que la proteína SACT inhibía el depósito de MAC in vivo cuando se suministraba mediante un vector de adenovirus y, por lo tanto, es potencialmente eficaz como terapia anticomplemento para tratar o incluso prevenir enfermedades o afecciones asociadas al complemento.

En diversas realizaciones, la proteína o composición SACT incluye una proteína CD46 codificada por un ácido nucleico de longitud completa de CD46 que se modificó para eliminar las secuencias de aminoácidos para la secuencia señal y los dominios que atraviesan la transmembrana hidrófobos. Alternativamente, la secuencia de ácidos nucleicos de la proteína CD46 se modifica mediante mutaciones puntuales, sustituciones o supresiones para obtener una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de aminoácidos modificada con la modificación ubicada en el dominio que atraviesa la transmembrana hidrófobo, de modo que la proteína resultante no se adhiere a membranas celulares.

El término “CD46 independiente de membrana”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a una secuencia de aminoácidos de c D46 que carece de un dominio que atraviesa la transmembrana hidrofóbico o tiene un dominio que atraviesa la transmembrana hidrofóbico modificado que carece de capacidad funcional para unirse a una membrana celular o una estructura asociada a membrana celular, tal como una proteína unida a la membrana. Se prevé que el alcance de la proteína CD46 en el presente documento incluya modificaciones de secuencia conservadoras que incluyen supresiones, sustituciones y adiciones como se ha descrito en el presente documento.

Como se utiliza en el presente documento, el término “modificaciones de secuencia conservadora” se refiere a modificaciones de aminoácidos que no afectan o alteran significativamente las características de la proteína CD46 que contiene la secuencia de aminoácidos, es decir, secuencias de aminoácidos de la proteína CD46 que presentan las cadenas laterales en las mismas posiciones relativas en la secuencia de aminoácidos funcionarán de manera similar a la proteína CD46 humana. Dichas modificaciones conservadoras incluyen sustituciones, adiciones y supresiones de aminoácidos. La modificación de la secuencia de aminoácidos de la proteína CD46 se logra utilizando cualquier técnica conocida en el arte, por ejemplo, mutagénesis dirigida a sitio o mutagénesis basada en PCR. Dichas técnicas se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, 1989 y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1989.

Las sustituciones de aminoácidos conservadoras son aquellas en las que el residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral funcionalmente similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

En determinadas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de CD46 es una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a la de la secuencia de tipo silvestre. El término “sustancialmente idéntico” se utiliza en el presente documento para referirse a una primera secuencia de aminoácidos que contiene un número suficiente o mínimo de residuos de aminoácidos que son idénticos a los residuos de aminoácidos alineados en una segunda secuencia de aminoácidos de tal manera que la primer ya segunda secuencias de aminoácidos puedan tener un dominio estructural común y/o una actividad funcional común. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos que contienen un dominio estructural común que tiene al menos aproximadamente un 60 % de identidad, o al menos un 75 %, 85 %, 95 %, 96 %, 98 % o 99 % de identidad son sustancialmente idénticas.

Los cálculos de identidad de secuencia entre secuencias se realizan como sigue. Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos, las secuencias se alinean con fines de comparación óptimos (por ejemplo, se pueden introducir espacios en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos para una alineación óptima). A continuación, se comparan los residuos de aminoácidos en las correspondientes posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las proteínas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de espacios y la longitud de cada espacio, que deben introducirse para una alineación óptima de las dos secuencias.

La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se logra utilizando un algoritmo matemático. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando un programa de software de alineación utilizando los parámetros predeterminados. Los programas adecuados incluyen, por ejemplo, CLUSTAL W por Thompson et al., Nuc. Acids Research 22:4673, 1994 (www.ebi.ac.uk/clustalw), BL2SEQ por Tatusova y Madden, FEMS Microbiol. Lett. 174:247, 1999

(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html), SAGA por Notredame and Higgins, Nuc. Acids Research 24:1515, 1996 (igs-server.cnrs-mrs.fr/~cnotred), y DIALIGN por Morgenstern et al., Bioinformatics 14:290, 1998 (bibiserv.techfak.unibielefeld.de/dialign).

En varias realizaciones, la proteína o composición de SACT incluye una proteína CD55 y/o una proteína CD59. En varias realizaciones, la proteína CD55 incluye un ácido nucleico de longitud completa de CD55. Alternativamente, la proteína CD55 es una porción u homólogo de la secuencia de ácidos nucleicos de longitud completa o secuencia de aminoácidos como se describe en el presente documento. En determinadas realizaciones, la proteína CD55 incluye modificaciones de secuencia conservadoras de la proteína CD59.

La proteína CD59 humana madura está compuesta por 77 aminoácidos y tiene un peso molecular de aproximadamente 18 kD a aproximadamente 21 kD. La proteína CD59 humana precursora incluye un péptido de señal de terminal amino de 25 aminoácidos y un péptido de terminal carboxilo de 26 aminoácidos que permite la unión de un anclaje de membrana. Se muestran las secuencias de aminoácidos de la proteína CD59 humana precursora, una proteína CD59 humana madura y la proteína CD59 de otros mamíferos, por ejemplo, babuino, mono verde africano, mono búho, tití, HVS-15, cerdo, conejo, rata y ratón en Sims et al. número de patente de Estados Unidos 7,166,568 emitida el 23 de enero de 2007.

La estructura de la proteína de CD59 se caracteriza como un único dominio rico en cisteína, que tiene un núcleo hidrófobo con tres bucles y un pequeño cuarto bucle helicoidal (Yu et al., Journal of Experimental Medicine, 185 (4): 745-753, 1997). Los pares de cisteínas con enlaces disulfuro conectan cada uno de estos bucles (Yu et al., 1997).

Se ha caracterizado la estructura del gen que codifica CD59 (Fodor et al. patente de Estados Unidos número 5,624,837, expedida el 29 de abril de 1997). El gen se encuentra en el brazo corto del cromosoma 11 en humanos, específicamente en los cromosomas 11p13 y 11p14 (número de acceso de Herencia Mendeliana En Línea en Hombre y 107271), y consiste en cuatro exones que abarcan 20 kb (Petranka et al. Proc. Nat. Acad. Sci. 89: 7876-7879, 1992). Un primer exón no traducido está precedido por una región promotora rica en G y C que carece de un motivo TATA o CAAT de consenso. El segundo exón codifica la secuencia líder hidrófoba de la proteína y el tercer exón codifica la porción de terminal N de la proteína madura. El cuarto exón codifica el resto de la proteína madura, que incluye la secuencia hidrófoba para la adhesión del anclaje del glucofosfoinosital a la membrana celular.

CD59 es una glicoproteína anclada a glicosilfosfatidilinositol que se expresa en leucocitos, eritrocitos y muchas estirpes celulares de sangre periférica humana. La proteína se expresa tanto sobre células hematopoyéticas como no hematopoyéticas, por ejemplo sobre células endoteliales, fibras nerviosas periféricas, neuronas, microglia, oligodendrocitos, astrocitos, células ependimarias, células epiteliales, células acinares de las glándulas salivales, epitelio bronquial, túbulos renales y epitelio epidermoide. Véase Nose, M. et al. 1990 Immunology 70(2): 145-149; Vedeler, C. et al. 1994 Immunology 82(4): 542-547; y Hidestima, T. et al. 1990 Immunology 69(3): 396:401. Un ADNc que codifica CD59 fue informado por Sawada, R. et al. 1989 Nucleic Acids Res 17 (16) 6728. El ADNC que codifica CD59 también se ha clonado a partir de estirpes celulares de leucemia de células T humanas (YT) y eritroleucemia humana (K562), y CD59 se ha expresado transitoriamente en células COS (Walsh, L.A. et al. 1990 Eur J. Immol 21 (3): 847-850). El CD59 humano, que está codificado por una secuencia de ácidos nucleicos, incluye 26 aminoácidos ubicados en el terminal C, que contiene una secuencia señal para la adhesión de un anclaje de GPI al aminoácido asparagina en la posición 77. La secuencia de aminoácidos del ADNc de longitud completa de CD59 es mostrado en Fodor et al., patente de Estados Unidos número 5,624,837 expedida el 29 de abril de 1997.

El análisis de la asociación física de CD59 con componentes de MAC muestra que los sitios de unión separados para CD59 están contenidos dentro de las cadenas a de cada C8 humano y C9 humano (véase Kimberley et al. 2007 Mol Immunol 44: 73-81). El sitio de unión para las interacciones de CD59 humana con C9 humana se ha identificado como los residuos de aminoácidos 42 a 58 en la secuencia de CD59 humana madura, que se unen a la región de C9 humana correspondiente a los residuos de aminoácidos 334 a 418 de esa proteína, más particularmente los residuos de aminoácidos C9 humanos 359 a 384, inmediatamente al terminal C al dominio de inserción de membrana predicho de C9 (Sims et al. publicación PCT número WO/1997/017987).

Las cadenas laterales de residuos de aminoácidos expuestos a la superficie activa que están disponibles para unirse a C8/C9, identificadas a partir de la estructura de la solución de c D59 humano maduro a partir de datos de RMN publicados y el conocimiento de la porción activa de la molécula de CD59, son histidina en la posición 44, asparagina en la posición 48, ácido aspártico en la posición 49, treonina en las posiciones 51 y 52, arginina en la posición 55 y ácido glutámico en la posición 58. Las estructuras de RMN para c D59 se describen en depósitos de Kieffer et al., Proteína reguladora del complemento humano CD59 (Región extracelular, residuos 170; RMN, 10 estructuras), Id de MMDB: 891, Id de PDB: 1ERH; Kieffer et al., Proteína reguladora del complemento humano CD59 (región extracelular, residuos 170; RMN, restringida), Id de MMDB: 890, Id de PDB: 1ERG; Fletcher et al., CD59 complejado con Glcnac-Beta-1.4-(Fuc-Alpha-1.6)-Glcnac-Beta-1 (RMN, 10 estructuras), Id de MMDB: 498, Id de PDB: 1CDS; Fletcher et al., CD59 complejado con Glcnac-Beta-1.4-Glcnac-Beta-1 (RMN, 10 estructuras), ID de MMDB: 497, Id de PDB: 1CDR. Los depósitos 1CDS e ICDR de Fletcher et al. Las secuencias de aminoácidos de CD59 que presentan estas cadenas laterales en las mismas posiciones relativas funcionan de manera similar a la CD59 humana (Sims et al.), y dichas variantes están dentro del alcance de los métodos, kits y composiciones farmacéuticas del presente documento.

Una proteína CD59 en ciertas realizaciones utilizada en la construcción de la proteína SACT en el presente documento carece de la secuencia de aminoácidos primaria para un anclaje GPI funcional. Una realización que es una proteína funcional equivalente incluye una secuencia de aminoácidos del dominio de anclaje de GPI modificada que es funcionalmente defectuosa y carece de la capacidad de dirigirse a una membrana. Los métodos adicionales para obtener una proteína SACT que tiene una proteína CD59 independiente de membrana incluyen métodos no recombinantes tales como proporcionar un inhibidor de la asociación de membranas, por ejemplo, sintetizar CD59 in vivo o in vitro de tal manera que falte el anclaje GPI. Los métodos para obtener el CD59 independiente de membrana se muestran en los ejemplos del presente documento. Las técnicas recombinantes adicionales para alterar la secuencia de ácidos nucleicos y la secuencia de aminoácidos de una molécula son bien conocidas en el arte de la genética y la biología molecular.

En varias realizaciones, la composición incluye una secuencia de aminoácidos de una proteína CD59 que tiene un ácido nucleico de longitud completa de la proteína CD59 que se modificó para eliminar la secuencia señal para la adhesión del anclaje de GPI en los nucleótidos que codifican el aminoácido asparagina en la posición 77. Alternativamente, la secuencia de ácidos nucleicos de CD59 se modifica mediante una o más mutaciones puntuales, sustituciones o supresiones para obtener una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una secuencia de aminoácidos modificada en la ubicación de anclaje de GPI, de tal manera que la proteína es incapaz de adherirse a la membrana de una célula. El término “CD59 independiente de membrana”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a una secuencia de aminoácidos de CD59 que carece de un anclaje GPI o tiene un anclaje GPI modificado que carece de función, es decir, que carece de la capacidad de unirse a una membrana celular o una estructura asociada a la membrana celular, tal como una proteína unida a la membrana.

El anclaje de GPI implica una ruta de múltiples etapas en el retículo endoplásmico que incluye la interacción de numerosos productos génicos. Muchas proteínas, que incluyen la CD59, requieren que GPI se exprese en la superficie celular y funcionen eficazmente. El mecanismo por el cual la estructura en una señal de proteína codifica la unión de anclajes GP es revisado por Orlean, P. et al. 2007 JLR 48: 993-1011. La adhesión de g P i generalmente implica una secuencia de aminoácidos que contiene: una señal de secreción de terminal N hidrófoba que dirige la proteína al ER, y una secuencia de anclaje de señal de GPI terminal C. El aminoácido al que se une el GPI se denomina residuo omega (w), con los aminoácidos de terminal N del residuo omega denominados omega-menos (w-) y con los aminoácidos de terminal C del omega residuo denominados omega-más (w+). La secuencia de anclaje GPI incluye un tramo de aproximadamente diez aminoácidos polares (es decir, w-10 a w-1), por ejemplo, arginina, lisina, aspartato, glutamato, asparagina o glutamato, que forman una región ligadora flexible. Se ha observado que el residuo w es uno de: glicina, alanina, serina, asparagina, ácido aspártico o cisteína. La mutación que incluye la sustitución y supresión de ácidos nucleicos que codifican aminoácidos en posiciones omega se utiliza para reducir o eliminar la adhesión del anclaje de GPI o reducir o eliminar la funcionalidad eficaz del anclaje de GPI. Por ejemplo, dicha variación incluye la sustitución de los ácidos nucleicos que codifican leucina hidrófoba (por ejemplo, ácidos nucleicos CTG) y alanina (por ejemplo, ácidos nucleicos GCA) por ácidos nucleicos que codifican glicina (por ejemplo, ácidos nucleicos CAG) y glutamato (por ejemplo, ácidos nucleicos GAA), que son aminoácidos menos hidrófobos (es decir, más hidrófilos).

Alternativamente, una variación incluye sustituir el residuo u> con otro aminoácido, por ejemplo sustituyendo una glicina por una tirosina.

En otras porciones de la proteína que no participan en el anclaje de GPI, la proteína STAC del presente documento incluye secuencias de aminoácidos de una proteína CD59 que tiene modificaciones de secuencia conservadoras. Como se utiliza en el presente documento, el término “modificaciones de secuencia conservadora” se refiere a modificaciones de aminoácidos que no afectan o alteran significativamente las características de la proteína CD59 o CD59 independiente de membrana que contiene la secuencia de aminoácidos, es decir, secuencias de aminoácidos de CD59 que presentan estas cadenas laterales en las mismas posiciones relativas funcionarán de manera similar a la CD59 humana. Dichas modificaciones conservadoras incluyen sustituciones, adiciones y supresiones de aminoácidos. La modificación de la secuencia de aminoácidos de CD59 se logra utilizando cualquier técnica conocida en el arte, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis basada en PCR. Dichas técnicas se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, 1989 y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1989. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras son aquellas en las que el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar, tal como al reemplazar un aminoácido pequeño con un aminoácido pequeño diferente, un aminoácido hidrófilo con un aminoácido hidrófilo diferente, etc.

Ejemplos en el presente documento incluyen métodos, composiciones y kits que tienen un terminador soluble quimérico de la proteína del complemento activado (SACT) con secuencias de aminoácidos de cada una de una proteína CD46, una proteína CD55, y una proteína CD59, y un ácido nucleico diseñados por ingeniería para codificar y expresar la proteína SACT recombinante, de tal manera que la SACT modula negativamente las rutas del complemento clásicas y alternativas y trata las afecciones relacionadas con el complemento. Alternativamente, la proteína SACT incluye secuencias de aminoácidos de al menos dos de una proteína CD46, una proteína CD55, y una proteína CD59. La frase “relacionada con el complemento”, como se utiliza en el presente documento y en las reivindicaciones, incluye, sin limitación, “asociada con el complemento”, y se refiere a cualquier célula o tejido que se vea afectado por una ruta del complemento. Ejemplos de trastornos o afecciones relacionados con el complemento incluyen degeneración macular, nefritis lúpica, síndrome de Sjogren, rechazo de injerto de órgano, asma, y enfermedad pulmonar obstructiva crónica.

Vectores

Los métodos en el presente documento para tratar o prevenir un trastorno relacionado con el complemento incluyen poner en contacto células con una composición farmacéutica que incluye una proteína C3, una proteína CD46, una proteína CD55, una proteína SACT o una proteína DTAC en la que la proteína se produce de forma recombinante. El término “recombinante” se refiere a proteínas producidas mediante la manipulación de organismos modificados genéticamente, por ejemplo, microorganismos.

Una fuente de ejemplo de la proteína incluye una secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína, o equivalente funcional, se inserta en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos de codificación de ácido nucleico necesarios que regulan la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada, operativamente enlazada a la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína recombinante.

Los métodos que son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica se utilizan para construir vectores de expresión que contienen una secuencia que codifica una proteína ligada operativamente a elementos de control de la transcripción y traducción apropiados. Estos métodos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación in vivo o recombinación genética. Dichas técnicas se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, 1989.

Una variedad de sistemas anfitrión/vector de expresión disponibles comercialmente son útiles para transportar y expresar una secuencia que codifica una proteína. Estos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófagos, plásmidos o cósmidos recombinantes; levadura transformada con vectores de expresión de levadura; sistemas de células de insectos en contacto con vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus); sistemas de células vegetales transfectados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, plásmido Ti, pBR322 o pET25b); o sistemas de células animales. Véase Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, NY, 1989.

Los vectores de virus incluyen, pero no se limitan a, vectores de adenovirus, vectores de lentivirus, vectores de virus adenoasociado (AAV) y vectores de adenovirus dependientes de auxiliares. Por ejemplo, los vectores de virus suministran una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína SACT o una proteína DTAC que, como se muestra en el presente documento, trata afecciones relacionadas con el complemento. Los vectores de empaquetamiento de adenovirus están disponibles comercialmente en American Type Tissue Culture Collection (Manassas, VA). Los métodos para construir vectores de adenovirus y utilizar vectores de adenovirus se muestran en Klein et al., Ophthalmology, 114: 253-262, 2007 y van Leeuwen et al., Eur. J. Epidemiol., 18: 845-854, 2003.

Se han utilizado vectores de adenovirus en la expresión génica eucariota (Levrero et al., Gene, 101: 195-202, 1991) y el desarrollo de vacunas (Graham et al., Methods in Molecular Biology: Gene Transfer and Expression Protocols 7, (Murray, Ed.), Humana Press, Clifton, Nueva Jersey, 109-128, 1991). Adicionalmente, los vectores de adenovirus recombinantes se utilizan para terapia génica (Wu et al., Patente de Estados Unidos número 7,235,391).

Los vectores de adenovirus recombinantes se generan, por ejemplo, a partir de la recombinación homóloga entre un vector lanzadera y un vector provirus (Wu et al., Patente de Estados Unidos número 7,235,391). Los vectores de adenovirus del presente documento tienen defectos de replicación, por ejemplo, son condicionalmente defectuosos, carecen de una región de adenovirus, y se introduce un polinucleótido que codifica un péptido o proteína en la posición de la que se han eliminado las secuencias codificantes. El polinucleótido que codifica el gen de interés se inserta alternativamente en otra región.

Las estirpes celulares auxiliares se pueden derivar de células humanas, tales como células de riñón embrionario humano 293, células musculares, células hematopoyéticas u otras células mesenquimatosas o epiteliales embrionarias humanas. Alternativamente, las células auxiliares se pueden derivar de las células de otras especies de mamíferos que son permisivas para el adenovirus humano, por ejemplo, células Vero u otras células mesenquimales o epiteliales embrionarias de mono. La generación y propagación de estos vectores de adenovirus defectuosos en la replicación utilizando una estirpe celular auxiliar se describe en Graham et al, J. Gen. Virol., 36: 59-72, 1977.

Los vectores de empaquetamiento de vectores lentivirales están disponibles comercialmente en Invitrogen Corporation (Carlsbad CA). Se prepara un sistema de empaquetamiento basado en VIH para la producción de vectores lentivirales utilizando construcciones en Naldini et al., Science 272: 263-267, 1996; Zufferey et al., Nature Biotechnol., 15: 871­ 875, 1997; y Dull et al., J. Virol. 72: 8463-8471, 1998.

Están disponibles una serie de construcciones de vector para empaquetar utilizando un sistema basado en la estructura del vector SIN lentiviral de tercera generación (Dull et al., J. Virol. 72: 8463-8471, 1998). Por ejemplo, la construcción de vector pRRLsinCMVGFPpre contiene una LTR 5' en la que la secuencia promotora del VIH se ha reemplazado por la del virus del sarcoma de Rous (RSV), una LTR 3' autoactivante que contiene una supresión en la región promotora U3, la señal de empaquetamiento del VIH, secuencias RRE ligadas a un casete de gen marcador que consiste en la GFP de medusa Aequora impulsada por el promotor CMV, y el elemento PRE del virus de la hepatitis de la marmota, que parece mejorar la exportación nuclear. El gen marcador GFP permite la cuantificación de la transfección o la eficacia de la transducción mediante observación directa de microscopía de fluorescencia UV o citometría de flujo (Kafri et al., Nature Genet., 17: 314-317, 1997 y Sakoda et al., J. Mol. Cell. Cardiol., 31: 2037-2047, 1999).

La manipulación de ácidos nucleicos retrovíricos para construir un vector retrovírico que contiene el gen que codifica un péptido o proteína y células de empaquetamiento se logra utilizando técnicas conocidas en el arte. Véase Ausubel, et al., 1992, Volume 1, Section III (units 9.10.1-9.14.3); Sambrook, et al., 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Miller, et al., Biotechniques.

7:981-990, 1989; Eglitis, et al., Biotechniques. 6:608-614, 1988; números de patente de Estados Unidos 4,650,764, 4,861,719, 4,980,289, 5,122,767, y 5,124,263; y publicaciones de patente PCT números WO 85/05629, WO 89/07150, WO 90/02797, WO 90/02806, WO 90/13641, WO 92/05266, WO 92/07943, WO 92/14829 y WO 93/14188.

Se construye un vector retrovírico y se empaqueta en partículas virales transductoras no infecciosas (viriones) utilizando un sistema de empaquetamiento anfotrópico. Se encuentran ejemplos de dichos sistemas de empaquetamiento, por ejemplo, en Miller, et al., Mol. Cell Biol. 6: 2895-2902, 1986; Markowitz et al., J. Virol. 62: 1120­ 1124, 1988; Cosset et al., J. Virol. 64: 1070-1078, 1990; números de patente de Estados Unidos 4,650,764, 4,861,719, 4,980,289, 5,122,767 y 5,124,263, y publicaciones de patente PCT números WO 85/05629, WO 89/07150, WO 90/02797, WO 90/02806, WO 90/13641, WO 92/05266, WO 92/07943, WO 92/14829 y WO 93/14188.

La generación de “células productoras” se logra mediante la introducción de vectores retrovirales en las células de empaquetamiento, un proceso de contacto al que se hace referencia en el presente documento como “transducción”, “transfección” o “ infección”. Se encuentran ejemplos de dichos vectores retrovirales en, por ejemplo, Korman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84: 2150-2154, 1987; Morgenstern et al., Nucleic Acids Res. 18: 3587-3596, 1990; números de patente de Estados Unidos 4,405,712, 4,980,289 y 5,112,767; y publicaciones de patente PCT números WO 85/05629, WO 90/02797 y WO 92/07943.

Los vectores de empaquetamiento de herpesvirus están disponibles comercialmente en Invitrogen Corporation, (Carlsbad, CA). Los herpesvirus de ejemplo son un a-herpesvirus, tal como el virus de la Varicela-Zoster o el virus de la pseudorrabia; un virus del herpes simple como HSV-1 o HSV-2; y un herpesvirus como el virus de Epstein-Barr. Un método para preparar partículas vacías de herpesvirus que se pueden empaquetar con un segmento de nucleótidos deseado, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos, en ausencia de un virus auxiliar que sea más capaz que la mayoría de los herpesvirus, se muestra en Fraefel et al. (patente de Estados Unidos número 5,998,208, expedida el 7 de diciembre de 1999).

El vector de ADN de herpesvirus se puede construir utilizando técnicas familiares para el experto en la materia. Por ejemplo, los segmentos de ADN que codifican el genoma completo de un herpesvirus se dividen entre varios vectores capaces de transportar grandes segmentos de ADN, por ejemplo, cósmidos (Evans, et al., Gene 79, 9-20, 1989), cromosomas artificiales de levadura (YACS) (Sambrook, J. et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATOr Y MANUAL, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) o plásmidos del elemento F de E. coli (O'Conner, et al., Science 244: 1307-1313, 1989).

Por ejemplo, se han aislado conjuntos de cósmidos que contienen clones superpuestos que representan los genomas completos de una variedad de herpesvirus, que incluyen el virus de Epstein-Barr, el virus de la varicela-Zoster, el virus de la pseudorrabia y HSVEP 1. Véase M. van Zijl et al., J. Virol. 62, 2191, 1988; Cohen, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 90, 7376, 1993; Tomkinson, et al., J. Virol. 67, 7298, 1993; y Cunningham et al., Virology 197, 116, 1993.

El AAV es un parvovirus dependiente en el sentido de que depende de la coinfección con otro virus (ya sea adenovirus o un miembro de la familia del virus del herpes) para sufrir una infección productiva en células cultivadas (Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158: 97). 129, 1992). Por ejemplo, el virus AAV recombinante (rAAV) se elabora al cotransfectar un plásmido que contiene el gen de interés, por ejemplo, el gen a de interés, flanqueado por las dos repeticiones terminales de Aa V (McLaughlin et al., J. Virol., 62(6): 1963 1973, 1988; Samulski et al., J. Virol, 63: 3822 3828, 1989) y un plásmido de expresión que contiene las secuencias codificantes de AAV de tipo silvestre sin las repeticiones terminales. Las células también se ponen en contacto o se transfectan con adenovirus o plásmidos que llevan los genes de adenovirus necesarios para la función auxiliar de AAV. Las reservas de virus AAV recombinantes preparadas de esta manera incluyen adenovirus que se deben separar físicamente de las partículas AAV recombinantes (por ejemplo, mediante centrifugación por densidad de cloruro de cesio).

Los vectores de empaquetamiento de virus adenoasociados (AAV) están disponibles comercialmente en GeneDetect (Auckland, Nueva Zelanda). Se ha mostrado que el AAV tiene una alta frecuencia de integración e infecta células que no se dividen, lo que lo hace útil para la administración de genes en células de mamífero en cultivo de tejidos (Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158: 97 129, 1992). El AAV tiene una amplia gama de anfitriones para la infectividad (Tratschin et al., Mol. Cell. Biol., 4: 2072 2081, 1984; Laughlin et al., J. Virol., 60(2): 515 524, 1986; Lebkowski et al. al., Mol. Cell. Biol., 8(10): 39883996, 1988; McLaughlin et al., J. Virol., 62(6): 1963 1973, 1988).

Los métodos para construir vectores de AAV y utilizar vectores de AAV se describen, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos números 5,139,941 y 4,797,368. El uso de AAV en el suministro de genes se describe adicionalmente en LaFace et al., Virology, 162(2): 483 486, 1988; Zhou et al., Exp. Hematol, 21: 928 933, 1993; Flotte et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 7(3): 349356, 1992; y Walsh et al., J. Clin. Invest, 94: 1440 1448, 1994.

Se han utilizado con éxito vectores de AAV recombinantes para la transducción in vitro e in vivo de genes marcadores ((Kaplitt et al., Nat Genet., 8(2):14854, 1994; Lebkowski et al., Mol. Cell. Biol., 8(10):39883996, 1988; Samulski et al., EMBO J., 10:3941 3950,1991; Shelling and Smith, Gene Therapy, 1: 165 169, 1994; Yoder et al., Blood, 82 (Supp.): 1:347A, 1994; Zhou et al., Exp. Hematol, 21:928 933, 1993; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol., 5:3258 3260, 1985; McLaughlin et al., J. Virol., 62(6):1963 1973, 1988) y transducción de genes implicados en enfermedades humanas (Flotte et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 7(3):349356, 1992; Ohi et al., Gene, 89(2):279282, 1990; Walsh et al., J. Clin. Invest, 94:1440 1448, 1994; y Wei et al., Gene Therapy, 1:261 268, 1994).

En determinadas realizaciones, los vectores de la presente son vectores no virales, por ejemplo, vehículos o vectores de suministro de genes sintéticos que no están relacionados con una partícula de virus y que suministran específicamente el material génico a las células o tejido objetivo. Ejemplos de vectores no virales incluyen liposomas, péptidos, nanopartículas, emulsiones o sistemas de dos o más fases encapsulados u otra preparación adecuada. Por tanto, en determinadas realizaciones, una composición implica un vector no viral con ácido nucleico que se carga y se pone en contacto con un tejido o célula. Por ejemplo, un liposoma que contiene ADN desnudo que codifica una proteína se encapsula en el liposoma y el liposoma se pone en contacto con el tejido o la célula de tal manera que el ácido nucleico se suministra eficazmente al tejido o la célula para el tratamiento de una enfermedad relacionada con el complemento.

Composiciones farmacéuticas

Un aspecto que no cae dentro del alcance de la invención proporciona composiciones farmacéuticas que incluyen al menos una proteína CD46, una proteína CD55, una proteína DTAC y una proteína SACT o un ácido nucleico que codifica y expresa la proteína, para tratar un trastorno relacionado con el complemento al modular negativamente las proteínas o rutas del complemento. En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica se combina para el suministro sistémico a un sujeto, por ejemplo, la composición se formula como una inyección. La composición en otra realización se formula como una formulación oftalmológica para la administración en el ojo y se puede combinar para el suministro en el fondo de ojo, o para la liberación localmente en la retina o formulada de otra manera para proporcionar un tratamiento eficaz de los vasos y/o tejidos involucrados en trastornos del complemento que afectan negativamente a los tejidos oculares. En realizaciones relacionadas, la composición farmacéutica se formula suficientemente pura para la administración a un sujeto humano, por ejemplo, al sistema vascular o al sistema endotelial de un sujeto humano. En determinadas realizaciones, estas composiciones incluyen opcionalmente adicionalmente uno o más agentes terapéuticos adicionales. En determinadas realizaciones, el agente o agentes terapéuticos adicionales se seleccionan del grupo que consiste en factores de crecimiento, agentes antiinflamatorios, agentes vasopresores que incluyen, pero no se limitan a, óxido nítrico y de bloqueadores de los canales de calcio, inhibidores de colagenasa, esteroides tópicos, inhibidores de metaloproteinasas de matriz, ascorbatos, angiotensina. II, angiotensina III, calreticulina, tetraciclinas, fibronectina, colágeno, trombospondina, factores de crecimiento transformantes (TGF), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factores de crecimiento similares a la insulina (IGF), proteínas de unión a IGF (IGFBP), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de diferenciación neu (NDF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), EGF de unión a heparina (HBEGF), trombospondinas, von Factor-C de Willebrand, heparina y sulfatos de heparina y ácido hialurónico.

En determinadas realizaciones, se incluye una pluralidad de agentes terapéuticos en la composición farmacéutica para tratar el mismo, un síntoma, afección o enfermedad concurrente o relacionado. En algunas realizaciones, el agente terapéutico es un fármaco que puede incluir, sin limitación, agentes anticoagulantes, antitumorales, antivirales, antibacterianos, antimicobacterianos, antifúngicos, antiproliferativos o antiapoptóticos. Los fármacos que se incluyen en las composiciones de la invención son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman, et al., eds., McGraw-Hill, 1996

Como se utiliza en el presente documento, el término “portador farmacéuticamente aceptable” incluye todos y cada uno de los solventes, diluyentes u otros vehículos líquidos, auxiliares de dispersión o suspensión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubricantes. y similares, según sea adecuado para la forma de dosificación particular deseada. Remington's Pharmaceutical Sciences Ed. por Gennaro, Mack Publishing, Easton, PA, 1995 proporciona varios portadores utilizados en la formulación de composiciones farmacéuticas y técnicas conocidas para preparación de los mismos. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, azúcares tales como glucosa y sacarosa; excipientes tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; aceites tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; glicoles tales como propilenglicol; ésteres tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes tamponadores tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; Solución de Ringer; alcohol etílico; y soluciones tampón de fosfato, así como otros lubricantes compatibles no tóxicos como lauril sulfato de sodio y estearato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, conservantes y antioxidantes también pueden estar presentes en la composición, la elección de agentes y concentraciones no irritantes que se determinarán de acuerdo con el criterio del formulador.

Dosis terapéuticamente eficaz

Los métodos proporcionados en el presente documento implican poner en contacto células o tejidos con una composición farmacéutica, por ejemplo, administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que tiene como agente activo al menos una proteína CD46, una proteína CD55, una proteína DTAC y una proteína SACT, un ácido nucleico que codifica una proteína o una fuente de expresión de la proteína, a un sujeto que lo necesita, en las cantidades y durante el tiempo que sea necesario para lograr el resultado deseado, que incluye la reducción o prevención de indicios de la afección relacionada con el complemento.

Las composiciones para uso de acuerdo con la presente invención se pueden administrar utilizando cualquier cantidad y cualquier ruta de administración eficaz para tratar el trastorno relacionado con el complemento. Por tanto, la expresión “cantidad eficaz para tratar una enfermedad o afección relacionada con el complemento”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a una cantidad suficiente de composición para prevenir o mejorar de manera beneficiosa los síntomas de la enfermedad o afección.

La dosificación exacta la elige el médico individual en vista del paciente que se va a tratar. La dosificación y la administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes del agente o agentes activos o para mantener el efecto deseado. Los factores adicionales que pueden tenerse en cuenta incluyen la gravedad del estado de la enfermedad, por ejemplo, etapa intermedia o avanzada de la degeneración macular; edad, peso y sexo del paciente; dieta, tiempo y frecuencia de administración; ruta de administración; combinaciones de fármacos; sensibilidades de reacción; y tolerancia/respuesta a la terapia. Las composiciones farmacéuticas de acción prolongada se pueden administrar cada hora, dos veces cada hora, cada tres a cuatro horas, diariamente, dos veces al día, cada tres a cuatro días, cada semana o una vez cada dos semanas, dependiendo de la vida media y la tasa de depuración de la composición particular.

Los agentes activos de la invención se formulan preferiblemente en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. La expresión “forma de unidad de dosificación”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a una unidad físicamente discreta de agente activo apropiado para el paciente que se va a tratar. Sin embargo, se entenderá que el médico tratante decidirá el uso diario total de las composiciones de la presente invención dentro del alcance del buen juicio médico. Para cualquier agente activo, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente en ensayos de cultivo celular o en modelos animales, como se proporciona en el presente documento, habitualmente ratones, pero también potencialmente de ratas, conejos, perros o cerdos. El modelo de células animales y el modelo in vivo proporcionados en el presente documento también se utilizan para lograr una concentración deseable y un rango de dosificación total y una ruta de administración. Luego, dicha información se puede utilizar para determinar dosis y rutas útiles para la administración en humanos.

Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad de agente activo que mejora los síntomas o afección o previene la progresión de la enfermedad o afección. La eficacia terapéutica y la toxicidad de los agentes activos se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, ED50 (la dosis es terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población) y LD50 (la dosis es letal para el 50 % de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como la relación LD50/ED50. Se prefieren las composiciones farmacéuticas que presentan grandes índices terapéuticos. Los datos obtenidos de ensayos de cultivos celulares y estudios en animales se utilizan para formular un rango de dosificación para uso humano.

La dosificación diaria de los productos se puede variar en un amplio rango, tal como de 0.001 a 1000 mg (1 gramo) por humano adulto por día. Para administración ocular, las composiciones se proporcionan por ejemplo en la forma de una solución que contiene 0.001, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0, 50.0, 100.0, 250.0, o 500.0 microgramos del ingrediente activo para el ajuste sintomático de la dosis al paciente a tratar.

Una dosis unitaria normalmente contiene de aproximadamente 0.001 microgramos a aproximadamente 500 microgramos del ingrediente activo, preferiblemente de aproximadamente 0.1 microgramos a aproximadamente 100 microgramos de ingrediente activo, más preferiblemente de aproximadamente 1.0 microgramos a aproximadamente 10 microgramos de ingrediente activo. Una cantidad eficaz del fármaco se suministra de forma ordinaria a un nivel de dosificación de aproximadamente 0.0001 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal por día. Por ejemplo, el rango es de aproximadamente 0.001 a 10 mg/kg de peso corporal por día, o de aproximadamente 0.001 mg/kg a 1 mg/kg de peso corporal por día. Las composiciones se pueden administrar sobre un régimen de, por ejemplo, uno a cuatro o más veces por día. Una dosis unitaria se puede dividir por ejemplo, administrada en dos o más dosis dividida.

La administración de una fuente de expresión de una proteína es la administración de una dosis de un vector viral o un vector de ácido nucleico, por ejemplo la dosis contiene al menos aproximadamente 50, 100, 500, 1000, o al menos aproximadamente 5000 partículas por célula que se va a tratar. Alternativamente, la dosis de un vector viral o un vector de ácido nucleico es al menos aproximadamente 104 a aproximadamente 105; aproximadamente 105 a aproximadamente 106; 106 a aproximadamente 107; 107 a aproximadamente 108; aproximadamente 108 a aproximadamente 109; aproximadamente 109 a aproximadamente 1010; o al menos aproximadamente 1010 a aproximadamente 1011. La dosis efectiva para el tratamiento de un número de células puede calcularse a partir del área que necesita tratamiento mediante métodos conocidos por un experto en la técnica.

Administración de composiciones farmacéuticas.

Como se formula con un portador farmacéuticamente aceptable apropiado en una dosificación deseada, la composición farmacéutica proporcionada en el presente documento se puede administrar a humanos y otros mamíferos, por ejemplo, por vía tópica (como mediante polvos, ungüentos o gotas), oral, rectal, mucosal, sublingual, parenteral, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, bucal, sublingual, ocular o intranasal, dependiendo de los objetivos preventivos o terapéuticos y la gravedad y naturaleza de un trastorno o afección relacionada con el complemento.

Las inyecciones incluyen inyección intravenosa o inyección intraocular en el humor acuoso o vítreo, o inyección en las capas externas del ojo, tal como inyección subconjuntival o inyección subtenoniana.

Las formas de dosificación líquidas, por ejemplo, para administración intravenosa, ocular, mucosa u otra, incluyen, pero no se limitan a, emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además de agente(s) activo(s), las formas de dosificación líquidas pueden contener diluyentes inertes comúnmente utilizados en la técnica tales como, por ejemplo, agua u otros solventes, agentes solubilizantes y emulsionantes tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, maní, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán y mezclas de los mismos. Además de los diluyentes inertes, las composiciones oculares, orales u otras composiciones suministradas sistémicamente también pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes y agentes emulsionantes y de suspensión.

Las formas de dosificación para la administración tópica o transdérmica de una composición farmacéutica inventiva incluyen pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, polvos, soluciones, aerosoles, inhalantes o parches. El agente activo se mezcla bajo condiciones estériles con un portador farmacéuticamente aceptable y cualquier conservante o tampón necesario, según se requiera. Por ejemplo, las rutas de administración ocular o cutánea se logran con gotas acuosas, una niebla, una emulsión o una crema. La administración puede ser terapéutica o profiláctica. Las composiciones de la invención pueden estar contenidas en dispositivos oftalmológicos, dispositivos quirúrgicos, dispositivos o productos audiológicos (por ejemplo, vendas o tiras de gasa). En el presente documento se describen métodos para fabricar o utilizar dichos dispositivos o productos. Estos dispositivos se pueden recubrir con, impregnar con, unir a o tratar de otro modo con una composición como se describe en el presente documento.

Los parches transdérmicos tienen la ventaja añadida de proporcionar un suministro controlado de los ingredientes activos al ojo y al cuerpo. Dichas formas de dosificación se pueden preparar al disolver o distribuir el compuesto en el medio apropiado. También se pueden utilizar mejoradores de la absorción para aumentar el flujo del compuesto a través de la piel. La tasa se puede controlar al proporcionar una membrana de control de tasa o al dispersar el compuesto en una matriz de polímero o gel.

Las preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles se pueden formular de acuerdo con la técnica conocida utilizando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución, suspensión o emulsión inyectable estéril en un diluyente o solvente parenteralmente aceptable no tóxico, por ejemplo, como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y solventes aceptables que se pueden emplear están agua, solución de Ringer, U.S.P. y solución de cloruro de sodio isotónica. Además, los aceites fijos estériles se emplean convencionalmente como solvente o medio de suspensión. Para este propósito, se puede emplear cualquier aceite fijo suave, que incluye mono o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos como el ácido oleico se utilizan en la preparación de inyectables. Las formulaciones inyectables se pueden esterilizar, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias o al incorporar agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que se pueden disolver o dispersar en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes de uso. Para prolongar el efecto de un agente activo, a menudo es deseable ralentizar la absorción del agente por inyección subcutánea o intramuscular. La absorción retardada de un agente activo administrado por vía parenteral se puede lograr al disolver o suspender el agente en un vehículo oleoso. Las formas de depósito inyectables se preparan al formar matrices microencapsuladas del agente en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicólido. Dependiendo de la relación de agente activo a polímero y la naturaleza del polímero particular empleado, se puede controlar la tasa de liberación del agente activo. Ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones inyectables de depósito también se preparan al atrapar el agente en liposomas o microemulsiones que son compatibles con los tejidos corporales.

Las composiciones para administración rectal o vaginal son preferiblemente supositorios que se pueden preparar al mezclar el(los) agente(s) activo(s) de esta invención con excipientes o portadores no irritantes adecuados tales como manteca de cacao, polietilenglicol o una cera para supositorios que son sólidos en temperatura ambiente pero líquida a la temperatura corporal y, por lo tanto, se funde en el recto o en la cavidad vaginal y libera el(los) agente(s) activo(s).

Las formas de dosificación sólidas para administración oral incluyen cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos y gránulos. En dichas formas de dosificación sólidas, el agente activo se mezcla con al menos un excipiente o portador inerte, farmacéuticamente aceptable, tal como citrato de sodio o fosfato de dicalcio y/o a) rellenos o extensores tales como almidones, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico, b) aglutinantes tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidinona, sacarosa y goma arábiga, c) humectantes tales como glicerol, d) agentes desintegrantes tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de papa o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos y carbonato de sodio, e) agentes retardadores de solución tales como parafina, f) aceleradores de la absorción tales como compuestos de amonio cuaternario, g) agentes humectantes tales como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol, h) absorbentes tales como caolín y arcilla de bentonita, e i) lubricantes tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, lauril sulfato de sodio y mezclas de los mismos.

También se pueden emplear composiciones sólidas de un tipo similar como rellenos en cápsulas de gelatina rellenas blandas y duras utilizando excipientes tales como azúcar de leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares. Las formas de dosificación sólidas de comprimidos, grageas, cápsulas, píldoras y gránulos se pueden preparar con recubrimientos y cubiertas tales como recubrimientos entéricos, recubrimientos de control de liberación y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de formulación farmacéutica. En dichas formas de dosificación sólidas, el(los) agente(s) activo(s) se pueden mezclar con al menos un diluyente inerte, tal como sacarosa o almidón. Dichas formas de dosificación también pueden comprender, como es práctica normal, sustancias adicionales distintas de los diluyentes inertes, por ejemplo, lubricantes para comprimidos y otros coadyuvantes de formación de comprimidos tales como estearato de magnesio y celulosa microcristalina. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, las formas de dosificación también pueden comprender agentes tamponadores. Pueden contener opcionalmente agentes opacificantes y también pueden ser de una composición que libera el agente(s) activo(s) solo(s), o preferentemente, en una determinada parte del tracto intestinal, opcionalmente, de manera retardada. Ejemplos de composiciones de incorporación que se pueden utilizar incluyen sustancias poliméricas y ceras.

Una porción de las realizaciones del presente documento se publicó en J Gene Med. 2015 Jun; 17 (6-7): 101-15 como “Adenoassociated virus mediated delivery of an engineered protein that combines the complement inhibitory properties of CD46, CD55 and CD59 con coautores Rajendra Kumar-Singh, Derek Leaderer and Siobhan M. Cashman.

Habiendo sido descrita ahora completamente la invención, se ejemplifica adicionalmente mediante los siguientes ejemplos y reivindicaciones.

Ejemplos

Los ejemplos proporcionados en el presente documento que no estén incluidos en las reivindicaciones adjuntas se incluyen solo como ejemplos de referencia.

Ejemplo 1: Estirpes celulares

Las estirpes celulares Hepalclc7 y HEK293 se obtuvieron de ATCC y se mantuvieron en aMEM y DMEM, respectivamente, suplementadas con FBS al 10%. La estirpe celular de retinoblasto embrionario humano, 911, se mantuvo en DMEM suplementado con FBS al 10 % (Fallaux, F.J., 1996 Hum Gene Ther 7: 215-222). Los reactivos de cultivo celular se adquirieron de Invitrogen Life Technologies y las células se mantuvieron en una incubadora humidificada a 37 °C con CO2 al 5 %.

Ejemplo 2: Estructura y síntesis de SACT y DTAC

Se sintetizó un ADNc por GenScript (Piscataway, NJ) para codificar el Terminador de Complemento Activo Soluble (SACT) que contiene la secuencia que codifica el péptido secretor de CD59 humana (ATCC cat. 10658204) seguido de la secuencia de codificación de los aminoácidos 34-296 de CD46 humano (ATCC cat. 7491463) que codifica los cuatro dominios SCR de CD46 (Lublin, D.M. et al. 1988 J Exp Med 168: 181-194). La secuencia de Cd 46 humana se une mediante una secuencia que codifica un ligador de cinco glicina a una secuencia que codifica los aminoácidos 33­ 356 de CD55 humana (ATCC cat. 5830488) que comprende los dominios SCR y la región STP de CD55 (Coyne, K.E., et al. 1992 J Immunol 149: 2906-2913). Una secuencia adicional que codifica un ligador de cinco glicinas une la región STP de CD55 a una secuencia que codifica el dominio funcional de 76 aminoácidos de CD59 humana. GenScript también sintetizó un ADNc que codifica el Terminador Doble del Complemento Activo (DTAC) para contener la secuencia que codifica el péptido secretor de CD59 humano seguido de la secuencia de codificación de los aminoácidos 33-356 de CD55 humana (como se describió anteriormente). La secuencia que codifica la región STP de la secuencia de CD55 se adhirió a través de una secuencia que codifica un ligador de cinco glicina a una secuencia que codifica el dominio funcional de 76 aminoácidos de CD59 humana. Los ADNc que codifican SACT y DTAC se clonaron en los sitios Xhol y EcoRV de pAAVCAG, una versión modificada de pAAV-MCS (Stratagene) que contiene un promotor de p-actina de pollo/CMVenhancer (CAG) y una señal de poliadenilación de globina de conejo (generosamente proporcionada por C.Cepko and Matsuda), para generar pAAV2CAGSACT y pAAV2CAGDTAC, respectivamente.

La secuencia de nucleótidos de SACT (SEQ ID NO: 1) se muestra a continuación:

ATGGGAATCCAAGGAGGGTCTGTCCTGTTCGGGCTGCTGCTCGTCCTGC3CT GTCTTCTGCC ATT C AGG1C ATAG C GG ATGTG A GG A GCC ACC A A C A TTTGA AGC T A TGGAGC TC ATTOGT A A ACCAA AACCCTACTATG AG A TT G GTG A AC GAGTAGATTATAAGTGTAAAAAAGGATACTTCTATATACCTCCTCTTGCCA CCC A T A C T ATTTGTG A TCGGAATCATACATG GCTACCTGTCTC AG ATG A CG CCTGTT AT AG A G A A AC ATGTCC A T ATATA C GGG ATCCTTT A A ATGG C C A A GCAGTCCCTGCAAATGGGACTTACGAGTTTGGTTATCAGATGCACTTTATT TGTA ATG AGGGTTATTAC TT A ATTGG TGA AGA A ATTCTATATTGTG AACTT A A AGG ATC A GTAGC A ATTTGG AGC GG T A AG CCCCC A A T ATGTG A A A AG C ¡ T TTTGTGTACACCACCTCCAAAAATAAAAAATGGAAAACACACCITTAGTG A A GT AG A A ü T A TTTG AGT A TC TTG ATG C AGT A ACTT A T AGTTGTG ATCCTG C ACCTGG A CC A G A TC CA TTrFC AC TT ATTG GAGA G AG C A CG ATTT A TTGTG GTG AC AATTCAGTG TGGAGTCGTGCT G CTCC AGAGTGT AA AGT GGT CAAA TGTC G ATTTCC AG T AGTCG A A A ATGC A A A AC AG ATATC A G G A '1TTGG A A A AAAATTTTACTACAAAGCAACAGT I ATG'nTGAATGCG ATAAGGGT n TI A c c t c g a t g g c a g c g a c a c a a t t g t c t g t g a c a g t a a c a g t a c t t g g g a t c CCCCAGTTCCAAAGTGTCTTAAAGTGGGAGGCGGAGGTGGAGGTGACTGT G GCCTTCCCCC A G ATGT ACCT A A TG CCC AGCC AGCTTTCjG A AGGCCGTAC

A AGTTTTCCCG AG GATACTGTA AT AACG TAC AAATGTG AAG A AAG CTTTG

TG A A A ATTCC TG GCG AG A A GG ACTCAG' IG ATCTG CCTT A AG GGCAGTC A A

TGGTCAG ATATTGA AGA GTTCTGC AATCGTAGCTGCGAGGTGCCAACAAG

GCTA A ATTCTGCATCCCTC AAACAG CCTTATATCACTCAGAATTATTTTC C

AG TCGGT ACTG TTG TG G A ATATGAGTG C CGTCCAGGTl AC AGA AGAGA AC

CTTCTCTATCACC AA A ACTAACTTGOCTTC AG AATTTA A A ATGGT CC A C AG

C AG TCG A ATTTTGT A A A AAG A A ATC A T G CCCT A ATCCGG G AG A A A T ACG A

AATGGTC AGATTOATOTAOC AGGTGGC ATATT A TTTGGTGC A ACCATCTCC

TTCTC ATGTAA C AC AGGG TAC A A ATT ATTTGG CTCGACTTC T AGTTTTTGT

CTTATrrCAGGCAGCTCTGTCCAGTGGAGTGACCCGTTGCCAGAGTGCAG

AG A A ATTTATTGTCC AGC ACCACC AC A A ATTGACAATGG A A T AATTCA AG

G GG A ACGTG ACC ATTATG G AT AT AG AC AGTC TGT A ACGT ATG C ATGT A AT

A A AG G ATTC ACC A TG ATTGG A G AGC ACTCTATTTATTGTACTG T G A ATA A l

G ATG A AG G A G A G TG G AG TGG CCC ACC A CCTG A ATG C AG A G G A A A ATCTG

T AACTTCC A AGGTCCC ACC A AC AG TTC AG A A ACCT ACC AC AGTAA ATGTT

CC A ACTA C AG A A GTC TC A CC A ACTTCTC AG A A A ACC A CC AC A A A A AC C AC

C ACACC A AATGCTC AAGC A ACAOGG AGTACACCTGTTTCCAGG AC A ACCA

AGC ATTTTC ATGAAACAACCCC AA ATA A AGG AAGTGG A ACCACTTC AGG T

ACTACCGGCGGAGGTGGAGGTCTGCAGTGCTACAACTGTCCTAACCCAAC

TGC T GACTGC A A A AC AGCC GTCAATTGTI'C ATCTGATTTTGATGCGT GTCT

C A J11'ACC A A AGCTGGGTTAC A AG TGT ATA AC A A GTGTT GG A AG TTT G A G C

ATTGCAATTTCAACGACGTCACAACCCGCTTGAGGGAAAATGAGCTAACG

TACTACTGCTGG AAG A AGGACCTGTGT A ACTTTA ACGAAC AGCTTGAATG

ATG A

La secuencia de aminoácidos de SACT (SEQ ID NO: 2) se muestra a continuación:

MGIQGGSV LFGLLLVLA VFCHSG HSGC E EPPTFEAMELiG lí PKPY YElG £R V D

YKCKKGYFYIPPLATI ITICDRNIITWLPVSDDACYRETCPYIRDPLNGQAVPA

NGTYEF GYQM HFICN EGYYLIGEEILYCELKGSVA [ WSGKPP1C EKVLGTPPPK

IKNGK.HTFSEVE VFEYLDA VT Y SCD PAPGPDPFSLl GíiSTI YCG DNS V WSRAA P

ECK W K CRFPV VENGKQISGFGKKFY YKATVMF ECDKGFY í - DGSDTIVCDSN

STWDPP VP KC LX VGGGG G GDCG LPPD VPNAQP ALEO RTSFPEDT VITYKC E E

S FVK1PG EKDSVÍCLKGSQ WSD1EEFCNRSC E VPTR LNS AS LKQPYITQNYFPV

G TW EY EC RPG YRBEPSLSPK LTC LQNLKWSTA VEFCKKKSCPNPG El RNGQ J

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C RG K S LTSK V PPTVQK PTTVNV PTT E VSPTSQ KTTTKXITPN AQ A T RS TP VS R

TT1GH FH ETTPNKG SüTTSGTTGG GGG LQC YNC PN PT A DC K T A VNCSS D F D AC

L !TK AGLQ V YNKC WKF E HCN FNDVTTRLRBNE LTV YCCKKDLCNFNEQLE

La secuencia de nucleótidos de DTAC (SEQ ID NO: 3) se muestra a continuación:

ATG GGAATCCAAGGAGGG TCTGTCCTGTTCGGG CTGCTGCTCG [’OCTGGCT

GTCTTCTG CCATTCAGG TC ATAGCGG AG GTG ACTGTGGCCTTCCCCC AG AT

GTACC T A ATGCCCAGCC AGCTTTGG A AGGCCGTAC A AGTTTTCCCG AG C A

T ACTGTA ATAACGT AC A AATGT GA AGAAAGCTTTG T GA A A A1TCCTG GCG

AG A AG G ACT C AG T G ATCTG CC T I A AG GG C AG T C A ATG G TC AG AT ATTG A A

G AG TTC TGC A A TC G T AGC TGCG A GG TG CC A AC A A GGCT A A ATTCTG C ATC

CCTCAAACAGCCTTATATCACTCAGAATTATTTTCCAGTCGGTACTGTTGT

GG A AT A T G A GTGCCG T CC AGGTT AC AG A A G A G A ACCTTCTC T A TC ACC A A

A ACT A ACTTGCCTTC AG A ATTT A A A ATGG TC C AC AGC AG TC G A ATTTTGTA

A A A AGAAATC ATGCCCTA ATCCGGG AGAAATACGAAATGGTCAG ATTG A I

GT ACC AGGTG ü C AT ATTATTTGGTÜ C A ACC ATC TCC1TCTC A TÜT A AC AC A

GGG T AC A A ATT ATTTGGCTC ü ACTTCT A GTTTTTG I CI TATTTC AGGC AG CT

CT GTCC AGTGG AGTGACCCGTTGCC AG AGTGCAGAG A A ATTTATT G T CCA

G C ACC ACC AC A A ATTG AC A A TOGA ATA A TTCA AGGG GAACG TG AC C ATT A

TGGATATAGACAGTCTGTAACGTATGCATGTAATAAAGGATTCACCATGA

TTG GAGAGC ACT CTATTTATTGTACTGT GAATA ATGATG A AG G AG AGT G G

AGTGGCCCACC ACCTG AATGC AG AGGA A AATCTCT AACTTCC A AGGTCCC

ACCAACAGTTCAGAAACCTACCACAGTAAATGTTCCAACTACAGAAGl’C r

C A CC A ACTTCTC AGAAA ACC ACC ACAA A AACCACC ACACC A A ATGCTCA A

G C A AC A C GG AGT AC ACC TGTTTCC AGG AC A A CC A A GC A TTTTC A TG A A AC

A ACC OC A AATAA AGG A AG TGG A ACCACTT C AGGT ACTACCG GCGG AGGT

GG AGGTCTGCAG TGCTAC A ACTGTCCTAACCCA ACTG CTG ACTGC A A A AC

AG CCGTC A ATTG'i’TC ATCTG ATTTTG ATG CG TG TCTCATTACC A A AGCTG G

GTTAC AAGTGT AT AAC AAGTGTTGG AAG TTTG AGC ATTGC A ATTTC AACG

ACGTCACAACCC GCTTG AC GGAAAATGAGCTAACGTACTACTGCTGCAAG

AAGGACCTGTGTA ACTTTAA CG A AC AGCTTG A ATG ATG A

La secuencia de aminoácidos de DTAC (SEQ ID NO: 4) se muestra a continuación:

MG [QGGS VLFO LLLVL A VFC H SO H SGODCGT .P P D VFN AQ P A LEORTSFPEDT

VITYKC EESFVKIPGEKDS VECLKG SQ WSDfEEFCNRSCE VPTRLN SASLK.QP VI

TQNYFP VGT V VEYECRPG YRREPSLSPKLTC LQN LK WSTA VEFCKKKSC PNP

GEI RNGQIDVPGG! LFGATISFSCNTGYKLPGSTSSFCLlSüSSVQWSDPLPECR

El YC P A P PQIDNG11QG ERD H YG Y RQS VT Y A CN KG FTM í G EH SIYCT VNN DEG

E WSGPPPEC RGKS LTSKVPPTV QKPTT VN V PTrBYSPTSQ KTTTKTTTPN AQ A

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CSS DFDAC LITKAG LQV YNKC WKFEHCN FN DVTTRLREN BLT YYCCftK DLC

NFNEQLS

Ejemplo 3: Construcción de construcciones de virus adenoasociado (AAV)

Se generó AAV recombinante mediante transfección triple de células 293 con cada uno de pAAV2CAGSACT, pAAV2CAGDTAC y pAAV2CAGGFP, pHelper (Stratagene) y pAAV2/8Rep/Cap (Cashman, S.M., et al. 2011 PLoS One 6: e19078). Los vectores AAV resultantes, AAV2/8SACT, AAV2/8Dt Ac y a Av 2/8GFP se purificaron mediante gradiente de iodixanol y se dializaron en tampón de lactato de Ringer (Zolotukhin, S. 2005 Hum Gene Ther 16: 551­ 557). Los genomas virales se titularon mediante PCR cuantitativa en tiempo real utilizando cebadores dirigidos a las repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV2 como se describe en (Fagone, P., et al. 2012 Hum Gene Ther Methods 23: 1-7).

Ejemplo 4: Análisis de transferencia de Western

La estirpe celular de retinoblasto embrionario humano, 911, se transfectó con pAAV2CAGDTAC, pAAV2CAGSACT o pAAV2CAGGFP utilizando Lipofectamine 2000 según el protocolo del fabricante (Invitrogen). 72 horas después de la transfección, se recolectó el medio, se centrifugó y se sometió a electroforesis en un gel de Tris-HCl al 10 % y las proteínas se transfirieron posteriormente a una membrana de nitrocelulosa, se sondaron con un anticuerpo anti-CD46 humano de ratón (MEM258, Serotec) a una dilución de 1:10.000; un anticuerpo de cabra anti-CD55 humano (AF2009, R&D systems, Minneapolis MN) a una dilución de 1:20.000 o un anticuerpo de conejo anti-CD59 humano (ab124396, Abcam) a una dilución de 1:5.000. Se utilizó un anticuerpo secundario ligado a IRDye seguido de detección con el Odyssey Li-Cor System (Li-Cor Biosciences, Lincoln NB).

Ejemplo 5: Ensayos de complemento con células Hepalclc7

Para los análisis FACS, se sembraron células hepa1c1c7 en aMEM/FBS al 2 % sin rojo fenol al 50 % de confluencia. Después de tres días, las células hepa1c1c7 se recolectaron mediante tripsinización (EDTA al 0.25%) y se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) IX que contenía FBS al 0.5 %. Se centrifugaron 5x105 células a 1200 RPM/4 °C y se resuspendieron en 500 pl de medio de células 911 transfectadas con pDTAC, pSACT o pGFP. Se agregó suero humano normal (NHS; Complement Technology, Tyler, TX) o NHS inactivado por calor (hi; 56 °C durante una hora) a cada muestra hasta una concentración final del 1 % y las muestras se incubaron con movimiento rotatorio constante a 37 °C durante una hora. La lisis celular se determinó utilizando el método de exclusión de yoduro de propidio (PI) en el que se agregó 1 pl de PI (2 mg/ml) a cada muestra y se contaron 25.000 células mediante FACS (FACS Calibur) para la absorción de PI (software CellQuest Pro, Becton Dickinson).

Para el depósito de MAC in vitro, se sembraron 35.000 células hepa1c1c7 por pozo en un portaobjetos de cámara de ocho pozos (Becton Dickinson) en aMEM/FBS al 2 %. 24 horas más tarde, se retiró el medio y las células se lavaron tres veces con 1XPBS y las células se incubaron con NHS al 10 % o hiNHS resuspendidas en medio de células 911 transfectadas con pDTAC, pSACT o pGFP durante 10 minutos a 37 °C. A continuación, las células se lavaron dos veces con 1XPBS frío y se fijaron durante 15 minutos con formaldehído al 3.7 %. Las células se tiñeron para el depósito de MAC como se describe en los ejemplos del presente documento.

Ejemplo 6: Ensayos hemolíticos

Los eritrocitos de oveja sensibilizados (Complement Technology) se lavaron dos veces con Tampón Veronal de Gelatina (GVB2+) y se suspendieron a una concentración de 5 x 108 células/ml, luego se utilizaron 25 pl de suspensión de eritrocitos por reacción. Se agregaron a la suspensión de eritrocitos 125 pl de medio de células 911 transfectadas con pGFP, pDTAC o pSACT que contenían NHS hasta una concentración final del 0.3 %. Los eritrocitos se incubaron durante una hora a 37 °C, se centrifugaron a 500 xg durante cuatro minutos a 4 °C y se leyó la absorbancia del sobrenadante resultante a 405 nm (lector de microplacas multimodo Filter Max F5, Molecular Devices; Sunnyvale, CA).

Para los ensayos de bloqueo de CD55, se agregó medio de células 911 transfectadas con pGFP, pDTAC o pSACT que se habían incubado con o sin anticuerpo anti-CD55 (ab33111, Abcam; Boston, MA) a temperatura ambiente durante 30 min. a los eritrocitos junto con NHS al 0.3 %. Después de una hora de incubación a 37 °C, se recolectó el sobrenadante y se leyó la absorbancia como se describe en los ejemplos del presente documento.

Para los ensayos de incorporación de C9, los eritrocitos suspendidos se incubaron con suero agotado en C9 al 0.1 % (Complement Technology) durante una hora a 37 °C para permitir la formación del complejo C5b-8. Después de lavar dos veces con GVB2+, se agregó medio de células 911 transfectadas con pGFP, pDTAC o pSACT que se habían preincubado en hielo durante 30 minutos en presencia o ausencia de 0.04 pg/ml de C9 (Complement Technology). Después de una incubación de 30 minutos a 37 °C, las muestras se centrifugaron y se determinó la absorbancia, como se describe en 49). Los datos de los ensayos hemolíticos se normalizaron a la cantidad de lisis de eritrocitos en medio de células transfectadas con pGFP (establecido en 100 % de lisis).

Ejemplo 7: Actividad del cofactor del Factor I

La actividad del cofactor in vitro se ensayó como se describe en (Johnson, J.B., et al. 2009 J Virol 83: 7602-7611). Se incubó medio de células 911 transfectadas con pGFP, pDTAC o pSACT con 3 pg de C3b, más 100 ng de factor I en un volumen total de 20 pl a 37 °C durante cuatro horas. Las reacciones se terminaron al agregar 5 pl de tampón de muestra SDS-PAGE que contenía p-mercaptoetanol y hervir. Los productos de reacción de C3b se analizaron mediante transferencia Western utilizando un gel SDS-PAGE al 10%. El gel se transfirió a una membrana y la membrana se sondeo con C3 policlonal antihumano de cabra (A213, Complement Technology) a una dilución de 1: 1.000. Los datos se normalizaron utilizando la intensidad de la señal de la cadena p no escindida de C3b.

Ejemplo 8: Degradación de la convertasa C3 de la ruta alternativa

Se recubrieron placas de microtitulación con agarosa al 0.1 % en agua y se secaron durante 36 horas a 37 °C, luego se bloquearon los pozos con albúmina de suero bovino al 1 % en PBS durante dos horas a temperatura ambiente como se describe en (Happonen, K.E., et al., 2012 J Biol Chem 287: 8092-8100). Se agregó NHS diluido en Mg2+EGTA a la placa recubierta de agarosa y se incubó a 37 °C durante una hora. Después del lavado, se agregaron a la placa medios de células 911 transfectadas con pGFP, pDTAC o pSACT y las placas se incubaron a 37 °C durante una hora. El Factor B que quedaba unido a la placa se detectó utilizando un anticuerpo específico de factor B (A235, Complement Technologies) seguido de un anticuerpo secundario conjugado con HRP.

Ejemplo 9: Ensayo de depósito de MAC hepático in vivo

El método fue un protocolo descrito en Gandhi, J., et al. 2011 PLoS One 6: e21621. Los sujetos eran ratones C57BL/6J de 6-10 semanas de edad y se inyectaron por vía intraperitoneal con 3.3 x 1011 copias del genoma de AAV2/8DTAC, AAV2/8 SACT o AAV2/8polyA. Después de tres semanas, los ratones se inyectaron por vía intracardial con 200 pg de anticuerpo PECAM anti-ratón (clon 2H8, 1.4mg/ml, preparado como se describe en los ejemplos del presente documento). Después de 4-6 horas de incubación, los ratones se sometieron a una perfusión cardíaca de 1 ml de tampón veronal de gelatina (GVB2+) seguido de 1.5 ml de NHS al 90 % (Complement Technology Inc., Tyler TX) en GVB2+. Después de una incubación de 15 minutos a 37 °C, se recogió el lóbulo medio del hígado y se fijó durante la noche en paraformaldehído al 4 % a 4 °C. Se obtuvieron criosecciones de 8 pm y se tiñeron para MAC como se describe en los ejemplos del presente documento. La formación de imágenes se realizó utilizando un microscopio Olympus IX51 equipado con una cámara Retiga 2000r. La intensidad de la tinción de MAC en toda la sección y alrededor de los vasos se cuantificó utilizando el software ImageJ (National Institutes of Health; Bethesda, MD, EE. UU.). Los vasos sanguíneos grandes se definieron como aquellos con un diámetro superior a dos anchos de células e incluyen arterias, arteriolas, venas y vénulas y excluyen capilares y sinusoides. Los límites externos e internos de los vasos sanguíneos grandes se trazaron utilizando la herramienta de selección manual y se calculó la intensidad total y el área total para cada uno utilizando la función de medición. Para calcular la intensidad del vaso promedio, se utilizó la siguiente ecuación: X = [Iexterior- Iinterior]/[Aexterior - Anterior].

Ejemplo 10: Inmunohistoquímica

Para detectar el depósito de MAC sobre células hepa1c1c7, las células se incubaron durante 2.5 horas a temperatura ambiente con C5b-9 antihumano de ratón (1:100) (ab66768, Abcam, Cambridge MA) en tritón al 0.05 % que contenía suero de cabra normal al 6 % (NGS). Para la detección secundaria se utilizó anti-ratón de cabra conjugado con Cy3 (1:200) en tritón al 0.05 % que contenía NGS al 3 % durante una hora a temperatura ambiente. Para la detección del depósito de MAC en la vasculatura del hígado, las secciones de hígado se incubaron durante 2.5 horas a temperatura ambiente con C5b-9 antihumano de conejo (Complement Technology, Tyler TX) (1:400) en tritón al 0.5 %, después de un bloqueo de una hora con Suero normal de cabra (NGS) al 6 % y tritón al 0.5 %. Se utilizó anticonejo de cabra conjugado con Cy3 (1: 200) durante una hora a temperatura ambiente para la detección secundaria.

Las imágenes se capturaron utilizando un microscopio Olympus IX51 y se utilizó el software ImageJ para cuantificar la fluorescencia. Se midieron las unidades de fluorescencia brutas y se restó el fondo de cada imagen. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando Prism Software 5.0a (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EE. UU.).

Ejemplo 11: Diseño y síntesis de SACT y DTAC

Se generó un plásmido que contenía un casete de expresión para Terminador de Complemento Activo Soluble (SACT). SACT incluye una secuencia de ADN diseñada por ingeniería para expresar una proteína compuesta de los cuatro dominios de repetición consenso corta (SCR) de CD46 humana separados por un ligador de poliglicina de los cuatro dominios SCR y la región rica en serina/treonina (S/T) de CD55 humana. Un ligador de poliglicina adicional separa la región rica en S/T de CD55 del dominio funcional (aminoácidos 1-76) de CD59 humana (Figura 1A). El terminal N de SACT contiene una señal secretora derivada de CD59 humana nativa. El dominio que atraviesa la membrana de CD46 y las señales para la unión de un anclaje de GPI a cada una de CD55 y c D59 no se incluyen en la proteína recombinante, por lo tanto, SACT no se ancla a la membrana plasmática (Figura 1A).

También se generó un Terminador Dual de proteína recombinante más pequeña del Complemento Activo (DTAC) que es una proteína diseñada para contener los cuatro dominios SCR y la región rica en S/T de CD55 humana separada por un ligador de poliglicina del dominio funcional (como se describe en los ejemplos en el presente documento) de CD59 humana. DTAC contiene el péptido secretor de CD59 humana (Figura 1A). El DTAC se vuelve independiente de la membrana al diseñar por ingeniería la proteína para omitir los péptidos de señal CD55 y CD59 para adhesión de un anclaje GPI.

Para expresar SACT in vivo utilizando un enfoque de terapia génica, se insertó un ADNc que codifica SACT en el plásmido, pAAVCAG, que contiene repeticiones terminales invertidas del virus adenoasociado de serotipo 2 (AAV2) para generar pSACT (Cashman, S.M., et al. 2011 PLoS One 6: e19078). Como control negativo, se utilizó la misma construcción desprovista de ADNc de SACT y se denominó pAAVCAG. Se insertó un ADNc que codifica DTAC en pAAVCAG para la expresión de un virus AAV2, generando pDTAC.

Ejemplo 12: SACT y DTAC son proteínas secretadas

El peso molecular predicho de las proteínas SACT y DTAC es de 76 kDa y 47 kDa respectivamente (Serial Cloner 2.6.1; Serial Basic Software). Tanto CD46 como CD55 contienen sitios de glicosilación ligados a N y O (Coyne, K.E., et al. 1992 J Immunol 149: 2906-2913, Ballard, L.L., et al. 1988 J Immunol 141: 3923-3929). Estas modificaciones aumentan el peso molecular de CD46 y CD55 en ~8 kDa (Ballard, L.L., et al. 1988 J Immunol 141: 3923-3929) y ~29 kDa respectivamente (Coyne, K.E., et al. 1992 J Immunol 149: 2906-2913). Dado el número de sitios de glicosilación retenidos por SACT y DTAc , se determinó que el peso molecular esperado de SACT y DTAC era aproximadamente 105-113 kDa y 76 kDa, respectivamente. Para los análisis de transferencia Western de medios de retinoblastos 911 embrionarios humanos (HER) transfectados con pSACT se sondearon con anticuerpos para CD46, CD55 o CD59 y se observó una banda de proteína de aproximadamente 110 kDa, que es consistente con el peso molecular predicho de SACT glicosilado. Esta banda de 110 kDa estaba ausente en el medio de las células transfectadas con pGFP o pDTAC (Figura 1B) (Fallaux, F.J., 1996 Hum Gene Ther 7: 215-222). Para los análisis de transferencia de Western de células transfectadas con pDTAC se sondearon con los anticuerpos anteriores y los datos indicaron la presencia de una banda de ~76 kDa, consistente con el peso molecular predicho de DTAC glicosilada. Esta banda estaba ausente en los medios de las células transfectadas con pGFP o pSACT (Figura 1B). Esta proteína de 76 kDa se observó solo para la membrana sondeada con anticuerpos contra CD55 y CD59 y no mostró reactividad con el anticuerpo para CD46 (Figura 1B). Por lo tanto, se secretan SACT y DTAC, y cada una de estas proteínas contiene la combinación esperada de dominios reguladores del complemento y sitios de glicosilación.

Ejemplo 13: SACT actúa como un cofactor para la escisión mediada por el Factor I de C3b

El “cambio” espontáneo de la ruta alternativa del sistema del complemento da como resultado la formación de C3b sobre las superficies celulares (Walport, M.J. 2001 N Engl J Med 344: 1058-1066). La cantidad de C3b presente está regulada por la escisión proteolítica de C3b por el Factor I de serina proteasa. El Factor I escinde la cadena a' de 104 kDa de C3b en cadenas de iC3bH de 67 kDa e iC3bL de 42 kDa inactivadas, respectivamente (Figura 2A) (Riley-Vargas, R.C., et al. 2004 Immunol 25: 496-503). CD46 funciona como un cofactor para el Factor I y acelera la formación de iC3bH e iC3bL (Figura 2B).

Para examinar si SACT exhibe propiedades de cofactor similares a CD46, se incubaron 3 |jg de C3b en medio preparado a partir de células 911 transfectadas con pSACT, pDTAC o pGFP. Las incubaciones se realizaron en presencia o ausencia de 100 ng de Factor I (Cashman, S.M., et al. 2011 PLoS One 6: e19078). La cantidad relativa de cadena a' de 104 kDa de C3b que quedaba después de cuatro horas de incubación se midió mediante transferencia de Western cuantitativa utilizando un anticuerpo policlonal anti-C3 (Figura 2C). La cadena p no escindida de C3b se utilizó para normalizar los datos.

Se observó que los medios de las células transfectadas con pSACT que contenían C3b y el Factor I tenían una reducción del 51.8 ± 10.5 % (p = 0.007) en la cantidad de la cadena a' de 104 kDa de C3b en relación con los medios de las células transfectadas con pGFP que contenían C3b y Factor I, y una reducción del 46.2 ± 4.8 % (p = 0.0007) con respecto al medio de células transfectadas con pDTAC que contienen C3b y Factor I (Figura 2D). No hubo diferencia significativa (p = 0.34) entre la cantidad de cadena a' de 104 kDa de C3b expuesta al medio de pGFP y células transfectadas con pDTAC que contienen C3b y Factor I (Figura 2D). Por lo tanto, SACT puede actuar como cofactor para la escisión mediada por el Factor I de C3b.

Ejemplo 14: SACT y DTAC aceleran la degradación de la C3-convertasa

La unión del factor B al C3b asociado a membrana da como resultado la formación de la convertasa C3 (Walport, M.J.

2001 N Engl J Med 344: 1058-1066). CD55 puede prevenir la unión del Factor B al C3b y provocar la disociación del Factor B del C3b, reduciendo de esta manera la cantidad de convertasa C3 disponible para una activación adicional del complemento (Figura 3A) (Walport, M.J. 2001 N Engl J Med 344: 1058-1066). Para determinar si SACT o DTAC podrían disociar el Factor B de C3b y reducir la actividad de convertasa de C3, se cuantificó la cantidad de Factor B que quedaba en asociación con C3b inmovilizado en agarosa en incubación en presencia de SACT o DTAC. Se incubaron placas de microvaloración recubiertas de agarosa con suero humano normal (NHS) en presencia de Mg2+EGTA para permitir la formación de la ruta alternativa C3 convertasa. Los pozos se incubaron posteriormente con medio de células 911 transfectadas con pSACT, pDTAC o pGFP. La cantidad de Factor B asociado con C3b unido a agarosa después de una hora a 37 °C se determinó mediante tinción de anticuerpos para el Factor B después de numerosos lavados para eliminar el Factor B no unido. La cuantificación de la tinción de Factor B indicó que en relación con los medios de células 911 transfectados con pGFP, los medios de las células transfectadas con pDTAC o pSACT dieron como resultado una reducción del 16.1 ± 6.4 % (p = 0.0214) y del 16.8:1:6.1 % (p = 0.0127) en el Factor B unido a C3b, respectivamente (Figura 3B). Por lo tanto, DTAC y SACT aceleran la degradación de la convertasa C3.

Ejemplo 15: Un anticuerpo de bloqueo de CD55 reduce la capacidad de SACT y DTAC para proteger contra la lisis celular mediada por complemento

Para analizar la función de los SCR derivados de CD55 en SACT y DTAC, se cuantificó la lisis mediada por complemento humano de eritrocitos de oveja sensibilizados en presencia de medio de células 911 transfectadas con pSACT o pDTAC en presencia de anticuerpo de bloqueo de c D55. En una concentración de anticuerpo de 1 mg/ml, se observó que la capacidad de los medios de células transfectadas con pDTAC y pSACT para proteger los eritrocitos de oveja del complemento humano se redujo en un 40.4 % ± 1.84 % (p < 0.0001) y un 14.2 % ± 2.88 % (p = 0.0006) respectivamente en relación con los medios de células 911 transfectadas sin anticuerpo de bloqueo (Figura 3C). A concentraciones más bajas (250 ng/ml) de anticuerpo de bloqueo, se observó que la capacidad de los medios de células transfectadas con pDTAC y pSACT para proteger los eritrocitos de oveja de la lisis se redujo en un 7.33 % ± 2.66 % (p = 0.02) y un 11.2 % ± 3.09 % (p = 0.0046) respectivamente en relación con los medios de las células transfectadas sin anticuerpo de bloqueo (Figura 3C). Por lo tanto, los SCR derivados de CD55 en SACT y DTAC son funcionalmente activos.

Ejemplo 16: SACT y DTAC atenúan el reclutamiento de C9 en el complejo de ataque a membrana

La formación del complejo de ataque a membrana (MAC) comienza con el ensamblaje del complejo C5b-8 sobre la membrana celular, seguido del reclutamiento y polimerización de múltiples unidades de C9 para formar el poro lítico conocido como MAC (Walport, M.J. 2001 N Engl J Med 344: 1058-1066). CD59 actúa como un inhibidor de la formación de MAC al prevenir el reclutamiento y la polimerización de C9 (Figura 4A) (Zipfel, P.F., et al. 2009 Nat Rev Immunol 9: 729-740).

Para determinar si el módulo CD59 de SACT o DTAC puede atenuar el reclutamiento de C9 en MAC, se incubaron eritrocitos de oveja sensibilizados con anticuerpos con NHS agotado en C9 para permitir el ensamblaje del complejo C5b-8 sobre la superficie celular. Posteriormente se agregó proteína C9 purificada con medio de células 911 transfectadas con pDTAC o pSACT y se midió la formación de la MAC mediante la cuantificación de la hemoglobina liberada debido a la lisis de los eritrocitos de oveja. Se observó que los medios de células 911 transfectadas con pDTAC y pSACT redujeron la liberación de hemoglobina de los eritrocitos de oveja en un 34.8 ± 3.6 % (p < 0.0001) y un 29.9 ± 4.6 % (p < 0.0001) respectivamente en relación con los eritrocitos incubados con NHS en la presencia de medios de células transfectadas con pGFP (Figura 4B). Por tanto, DTAC y SACT atenúan el reclutamiento de C9 en el MAC, una propiedad que es consistente con la presencia de CD59 funcional.

Ejemplo 17: SACT y DTAC atenúan la lisis de hepatocitos mediada por complemento humano in vitro

Para determinar si DTAC o SACT protege a los eritrocitos de oveja de la lisis celular mediada por NHS, se incubaron eritrocitos de oveja sensibilizados con IgG en NHS preacondicionado con medio de células 911 transfectadas con pDTAC, pSACT o pGFP. Se observó que los medios transfectados con pDTAC y pSACT habían reducido la lisis de eritrocitos de oveja mediada por NHS en un 47 ± 2.9 % (p < 0.0001) y un 21.5 ± 2.8 % (p < 0.0001) respectivamente (Figura 5A), en comparación con los medios transfectados con pGFP. Estos datos indican que DTAC y SACT atenúan la lisis celular mediada por NHS.

El ataque de órganos trasplantados mediado por el complemento, tal como el hígado y el riñón, se considera una causa principal de rechazo del trasplante (Satoh, S., 1997 Transplantation 64: 1117-1123). Para determinar si SACT y DTAC pueden proteger a los hepatocitos del ataque del complemento humano, se incubaron células hepa-1c1c7 murinas en medio de células 911 transfectadas con pDTAC, pSACT o pGFP que contenían NHS o NHS inactivado por calor (hiNHS) hasta una concentración final de 1 %. La lisis celular se cuantificó mediante análisis FACS de la captación de yoduro de propidio. Se observó que un total del 73.5 ± 3.79 % de las células se lisaron en células hepa-1c1c7 incubadas con NHS preacondicionado con medio de células transfectadas con pGFP (Figura 5B). Por el contrario, se observó que el 49.3 ± 5.7 % y el 55.5 ± 4.8 % de las células estaban lisadas en el NHS que se acondicionó previamente con medios de DTAC o SACt respectivamente, lo que resultó en una reducción del 28.7 % ± 10.2 % (p = 0.014) o 20.8 ± 9.0 % (p = 0.037) en la lisis celular mediada por NHS atribuible a DTAC y SACT, respectivamente (Figura 5B). Este resultado indica que DTAC y SACT protegen a los hepatocitos murinos del ataque mediado por el complemento humano.

Ejemplo 18: DTAC y SACT reducen la formación del complejo de ataque a membrana in vitro

Para determinar si la reducción mediada por DTAC o SACT en la lisis de hepatocitos era consistente con una reducción en la formación de MAC sobre la membrana celular, se incubaron células hepa1c1c7 murinas en medio de células 911 transfectadas con pGFP, pDTAC o pSACT que contenían NHS al 10 %. Posteriormente, las células se fijaron y se tiñeron con anticuerpo contra C5b-9 humano y se cuantificó la intensidad de la tinción utilizando la Imagen J (Figura 6A). Se observó que los medios de las células transfectadas con pDTAC y pSACT tenían una reducción del 53.8 ± 10.37 % (p = 0.0004) y del 67.8 ± 9.15 % (p < 0.0001) en el depósito de MAC en los hepatocitos murinos, respectivamente, en comparación con los medios de las células transfectadas con pGFP (Figura 6B). Por lo tanto, la reducción de la lisis celular mediada por DTAC y SACT provoca una formación reducida de MAC sobre la superficie de las células.

Ejemplo 19: SACT y DTAC protegen el hígado murino del depósito de MAC humano in vivo

Se ha demostrado que una serie patologías mediadas por el complemento, que incluyen el rechazo de trasplantes de órganos, implican células endoteliales (Zipfel, P.F., et al. 2009 Nat Rev Immunol 9: 729-740, Satoh, S., 1997 Transplantation 64: 1117-1123, Anderson, D.H., et al. 2010 Prog Retin Eye Res 29: 95-112). Para superar la limitación de probar la capacidad de los reguladores del complemento humano para proteger el endotelio murino del ataque del complemento in vivo, se desarrolló un modelo in vivo para el depósito de MAC humano en el endotelio vascular del hígado murino (Gandhi, J., et al. 2011 PLoS One 6: e21621). En este modelo, el endotelio vascular murino se prepara para el ataque del complemento mediante la inyección intracardial de un anticuerpo contra la molécula de adhesión celular/plaqueta murina (mPECAM-1). A la inyección le sigue una perfusión con PBS para reemplazar la sangre y una perfusión posterior con NHS al 90 %. Utilizando este modelo, se ha demostrado que la expresión mediada por adenovirus de CD59 soluble humano puede inhibir el depósito de MAC humano sobre hígado murino (Gandhi, J., et al. 2011 PLoS One 6: e21621).

Para examinar si SACT o DTAC pueden proteger la vasculatura hepática murina del depósito de MAC humano, se utilizaron cada uno de los plásmidos pSACT, pDTAC y pGFP para generar un virus adenoasociado recombinante (AAV) serotipo 2 pseudotipado con cápside de serotipo 8 de AAV. para cada proteína recombinante. Una construcción AAV2/8 desprovista de un transgén se describió en Cashman, S.M., et al. 2011 PLoS One 6: e19078. Estos vectores se denominan como AAV2/8SACT, AAV2/8DTAC, AAV2/8GFP y AAV2/8polyA, respectivamente.

Para examinar el tropismo de AAV2/8 en hígado murino, se inyectaron 3.3 x 1011 copias del genoma de AAV2/8GFP en el peritoneo de ratones C57BL/6J de 6 a 8 semanas de edad. Después de 3 semanas, se sacrificaron los ratones, se recogieron los hígados y se examinaron las criosecciones para determinar la expresión de GFP. Se observó que la expresión de GFP de AAV2/8GFP estaba en todo el hígado, incluidas las células proximales a los vasos sanguíneos y sinusoides (Fig. 7A). Estos resultados contrastan con estudios previos que utilizan un vector de adenovirus que expresa GFP del mismo promotor CAG, en los que se observó que la expresión de GFP estaba casi exclusivamente en la cápsula del hígado después de la administración intraperitoneal del vector (Gandhi, J., et al. 2011 PLoS One 6: e21621).

Habiendo observado una transducción eficaz de hígado murino con AAV2/8GFP, se inyectó a los ratones por vía intraperitoneal un título similar de AAV2/8DTAC, AAV2/8SACT o AAV2/8polyA. Tres semanas después de la inyección con AAV, se administró a los ratones una inyección intracardial de mPECAM-1 y se siguió una perfusión con NHS al 90 % después de aproximadamente 4-6 horas. Después de aproximadamente 15 minutos, se recolectaron los hígados para criosección y se tiñeron para MAC humana utilizando anticuerpo contra C5b-9 (Fig. 7B; 8A). Se observó tinción de MAC en los vasos sanguíneos y sinusoides de los hígados de ratones inyectados con AAV2/8polyA (Figuras 7B; 8A). Los ratones inyectados con AAV2/8DTAC o AAV2/8SACT tenían un depósito de MAC significativamente menor tanto en los vasos sanguíneos del hígado como en los sinusoides en relación con los ratones inyectados (AAV2/8polyA) de control (Figuras 7C; 8B). La cuantificación de la intensidad de tinción de MAC utilizando ImageJ indicó una reducción del 56.7 ± 16.4 % (p = 0.0061) en el depósito de MAC humano sobre la vasculatura hepática de ratones inyectados con AAV2/8DTAC en relación con ratones inyectados con AAV2/8polyA (Figura 7C). De manera similar, los animales inyectados con AAV2/8SACT mostraron una reducción del 63.2 % ± 20.5 % (p = 0.0075) en el depósito de MAC humano en su vasculatura hepática en relación con los ratones inyectados con AAV2/8polyA (Figura 8B). Las células endoteliales tanto de los vasos sinusoides como de los sanguíneos indicaron el depósito de MAC. La cuantificación de los vasos sanguíneos más grandes (no capilares) del hígado indicó una reducción significativa del 56.0 ± 11.3 % (p = 0.0006) y del 61.1 ± 18.9 % (p = 0.0056) en el depósito de MAC humano para animales inyectados con AAV2/8DTAC y AAV2/8SACT-, respectivamente, en relación con los animales inyectados con AAV2/8polyA (Figuras 7D; 8C). Por tanto, DTAC y SACT proporcionan una protección significativa a la vasculatura hepática murina del complemento humano activado in vivo.

Ejemplo 20: Síntesis de STAC (ejemplo de referencia)

Para comparar la funcionalidad de moléculas recombinantes que tienen diferente orden de las regiones reguladoras del complemento, se utilizó el terminador soluble del complemento activado (STAC), descrito en la patente de Estados Unidos número 8,877,896. El terminal N de STAC contiene el codón de inicio CD59 humano, el péptido de señal secretora y el dominio SCR. Un ligador de poliglicina une los cuatro dominios SCR y la región rica en S/T de CD46 humano al terminal C de CD59. Los cuatro dominios SCR y la región rica en S/T de CD55 humano se ligan luego al terminal V de CD46 mediante una secuencia de poliglicina (Figura 9). El ADN cpara STAC se insertó en pShuttle entre un mejorador de CMV/promotor de p-actina de pollo (CAG) y una secuencia de terminación de poliadenilación de globina de conejo (pA).

La secuencia de aminoácidos de STAC (SEQ ID NO: 5) se muestra a continuación:

m g iq g g s v l f g l l l v l a v f c h s g h s l q c y n c p n p t a d c k t a v n c s s d f d a c l

ITKAG LQVYNKCWKFÉHCNFNDVTTRLRENELTYYCCKKDLCNFNJiQLÜGG

GGGCEEPPTFEAMELIGKPSCPY YEIGERVDYKCKKGYFY i PPLATKTJCDRNII

TWLP VSDDAC YRETC PYIRDPLNGQAV P ANGTYEFG YQMH FICNEG Y YLFGE

E ] L YC ELKG S V AI WSG KPPÍCEKVLCTPPPKIKNGKHTFSBV EVFEYLDA VTYS

CDPAPGPDPFSLIGESTIYCGDNSVWSRAAPECKVVKCRFPW ENGKQISGFG

KKF Y YK AT V M FEC DKG F Y LDG SDTÍVCDSN STW D PP VPK CLK V GGGGGGDC

GLP PD VPN AQPALEü RTSFP EDTVJTY KC EESFVK ] PG EK DS V IC LKG SQ W3 DI

EEFCNRSCEVPTRLNSASLKQPYITQNYFPVGTVVEYECRPGYRREPSLSPKLT

C LQM LK W ST A V E FC KKK S C PN PG El RNGQ1D V PGGILFG ATI S FSCN LG Y K L FG

STSSFCLÍSGSSVQWSDPLPECREIYCPAPPQIDNGHQGERDHYGYRQSVTYAC

N KGFTMIGEHSIYCT VNNDEG E WSG PPPECRGKSLTSKVPPT VQKPTTVNVPT

TtiV SPl 'SQ K T T T lO T rpN AQATR STP V SR TTK H FU ETTPN KGSGTTS GTT

Ejemplo 21: STAC funciona como un cofactor para la degradación mediada por el Factor I (de C3b ejemplo de referencia)

El CD46 funciona como un cofactor para la escisión proteolítica mediada por el Factor I de C3b y C4b (Seya T, et al., J Exp Med. 1986; 163(4): 837-55). C3b es un componente de C3-convertasa y, por lo tanto, promueve su propia formación. Al mejorar la escisión de C3b a su forma inactiva, CD46 actúa como un regulador negativo de la formación de C3-convertasa y el sistema del complemento (Seya T, et al., J Exp Med. 1986; 163(4):837-55). Para probar si STAC retiene la funcionalidad de CD46, se incubaron 3 |jg de C3b en medio transfectado pAdCAGGFP o pAdCAGSTAC en presencia o ausencia de 100 ng de Factor I. Después de una incubación de 4 horas, las muestras se examinaron mediante transferencia Western cuantitativa utilizando un anticuerpo anti-C3 policlonal para evaluar la cantidad de cadena a' de C3b presente en relación con la cadena p de C3b (Figura 10A). Se observó que las muestras incubadas en medios que contenían STAC tenían una reducción del 34.3 % ± 3.9 % en la intensidad de la señal de la cadena a' de C3b (p = 0.0001) en presencia de Factor I en relación con los medios de células transfectadas con pGFP que contienen C3b y Factor I (Figura 10B). Esta mejora de la degradación del Factor I de C3b indica que STAC exhibe funcionalidad CD46.

Ejemplo 22: STAC muestra la funcionalidad CD55 (ejemplo de referencia)

Para evaluar la funcionalidad de CD55, se realizó un ensayo hemolítico utilizando medios transfectados con GFP y STAC que se habían preincubado en presencia o ausencia de un anticuerpo contra el sitio funcional de CD55. Se

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende una proteína quimérica recombinante que tiene secuencias de aminoácidos de al menos, CD55 y CD59; o un ácido nucleico que codifica la proteína quimérica recombinante, en la que el orden de las secuencias que comprenden la proteína quimérica recombinante es CD55 y CD59, en la que las secuencias de aminoácidos de la proteína CD59 tienen terminal C para las secuencias de aminoácidos de la proteína CD55.

2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que:

(i) la secuencia de aminoácidos de la proteína CD59 comprende al menos una mutación que confiere pérdida de función de un dominio de anclaje de glicosil fosfatidil inositol (GPI), en la que la mutación es al menos una de una sustitución, una supresión, y una adición; o

(ii) la secuencia de aminoácidos de la proteína CD55 comprende al menos una mutación que confiere pérdida de función de un dominio de anclaje de glicosil fosfatidil inositol (GPI), en la que la mutación es al menos una de una sustitución, una supresión, y una adición.

3. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende un vehículo de suministro diseñado por ingeniería para dirigirse a una célula o un tejido, el vehículo de suministro se selecciona del grupo de: un liposoma, un lípido, un policatión, un péptido, una nanopartícula, una partícula de oro, y un polímero.

4. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la proteína comprende adicionalmente un ligador que conecta al menos un par de secuencias de aminoácidos seleccionadas de la proteína CD55 y la proteína CD59.

5. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el ácido nucleico codifica adicionalmente un ligador que contiene al menos un aminoácido, opcionalmente en la que el al menos un aminoácido es una glicina, una serina, o una alanina.

6. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína CD55 comprende al menos una mutación que resulta en pérdida de función de un dominio de anclaje de glicosil fosfatidil inositol (GPI) de la proteína CD55, la mutación comprende una sustitución, una supresión, o una adición, o en la que la secuencia de aminoácidos de la proteína CD55 comprende al menos uno de: un dominio de repetición de consenso corto y un dominio rico en serina/treonina/prolina.

7. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el ácido nucleico que codifica la proteína quimérica recombinante:

(i) se codifica en un plásmido o un vector viral, opcionalmente en el que el vector viral es al menos uno seleccionado del grupo de: un adenovirus, un virus adenoasociado, un virus del herpes, un poxvirus, y un lentivirus, y/o

(ii) comprende un promotor de un gen seleccionado del grupo que consiste en: una beta actina, opcionalmente en la que la beta actina es una beta actina de pollo; una periferina/RDS; una fosfodiesterasa cGMP; y una rodopsina.

8. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, comprende adicionalmente un agente seleccionado del grupo que consiste en: antitumoral, anticoagulante, antivírico, antibacteriano, antimicobacteriano, antifúngico, antiproliferativo, y antiapoptótico.

9. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la proteína quimérica recombinante tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias que se muestran en la SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4.

10. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, la composición comprende: una proteína quimérica recombinante que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 2, que comprende secuencias de cada una de una proteína CD46, una proteína CD55, y una proteína CD59; o una proteína quimérica recombinante que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 4 que comprende las secuencias de cada una de una proteína CD55 y una proteína CD59.

11. Una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para uso en el tratamiento de una afección relacionada con el complemento, en la que la afección relacionada con el complemento se selecciona del grupo de: degeneración macular, degeneración macular relacionada con la edad, enfermedad inflamatoria del intestino, tiroiditis, crioglobulinemia, pérdida fetal, rechazo de injerto de órgano, septicemia, infección viral, infección fúngica, infección bacteriana, síndrome de choque tóxico (TSS), glomerulonefritis membranoproliferativa, enfermedad de depósitos densos, hemoglobinuria paroxística nocturna, nefritis lúpica, nefritis membranosa, nefropatía por inmunoglobulina A, Síndrome de Goodpasture, glomerulonefritis posestreptocócica, lupus eritematoso sistémico, síndrome urémico hemolítico atípico, lupus eritematoso sistémico, artritis lúpica, artritis reumatoide, síndrome de Sjogren, síndrome de Behget, esclerosis sistémica, enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple, miastenia gravis, síndrome de Guillain-Barré, lupus cerebral, apoplejía, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis quística, anemia hemolítica, hemoglobinuria paroxística por frío, hemoglobinuria paroxística nocturna, vasculitis, pénfigo, penfigoide ampolloso, reacciones fototóxicas, soriasis, choque anafiláctico, alergia, asma, infarto de miocardio, retinopatía diabética, microvasculopatía, dermatomiositis, trastornos linfoproliferativos de células B, enfermedad desmielinizante, lesión renal aguda, COPD, enfermedad Rh, anemia hemolítica inmunitaria, púrpura trombocitopénica inmunitaria, glomerulopatías asociadas al Complemento, y aterosclerosis.