JP7444968B2 - Ｄａｆ－ｍｃｐキメラタンパク質、その製造方法及び補体系が関係する病的状態を処置するためのキメラタンパク質の使用 - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は、一般的にバイオテクノロジーの分野に関する。特に本発明は、二重活性制御作用を有する新規な遺伝子改変４ドメインＤＡＦ－ＭＣＰキメラタンパク質（キメラタンパク質ＤＣＰ）であって、Ｉ因子に対する親和性及びＣ３ｂ／Ｃ４ｂに対するアビディティーを増強するためにさらに改変されたキメラタンパク質並びに新規な遺伝子改変４ドメインＤＡＦ－ＭＣＰキメラタンパク質を製造するための方法に関する。
本発明は、一般的にバイオテクノロジーの分野に関する。特に本発明は、二重活性制御作用を有する新規な遺伝子改変４ドメインＤＡＦ－ＭＣＰキメラタンパク質（キメラタンパク質ＤＣＰ）であって、Ｉ因子に対する親和性及びＣ３ｂ／Ｃ４ｂに対するアビディティーを増強するためにさらに改変されたキメラタンパク質並びに新規な遺伝子改変４ドメインＤＡＦ－ＭＣＰキメラタンパク質を製造するための方法に関する。
発明の背景
補体系は、病原体特異的適応免疫応答をブーストする病原体に対するその直接作用、細胞分化及び極性化の過程への寄与、組織再生、脂質代謝、免疫複合体の除去及びアポトーシス、その他などの役割が知られている自然免疫系の一部である。補体活性化の制御の欠如又は不適切な活性化は、宿主組織に損傷をもたらすため、補体系は一連のタンパク質によって緊密に制御されている。これらのうち、補体活性化制御因子（ＲＣＡ）ファミリータンパク質が主として補体制御を担っている。ＲＣＡタンパク質は、膜タンパク質、例えば崩壊促進因子（ＤＡＦ；ＣＤ５５）、メンブレンコファクタープロテイン（ＭＣＰ；ＣＤ４６）、及び補体受容体１（ＣＲ１；ＣＤ３５）並びに液相タンパク質、例えばＨ因子（ＦＨ）及びＣ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）を含む。構造的に、ＲＣＡタンパク質は、２～４つの連続するモジュールが崩壊促進活性（ＤＡＡ）及び補因子活性（ＣＦＡ）と名付けられる制御機能に寄与している補体制御タンパク質（ＣＣＰ）繰り返しモジュールから構成される。ＲＣＡタンパク質は、補体経路の中心的酵素であるＣ３／Ｃ５コンバターゼを標的付けることによって機能する。これらの酵素の不活性化のために、ＲＣＡタンパク質は、これらのコンバターゼ又はそれらの非触媒サブユニットに結合し、それらを不活性化する。ＤＡＡでは、ＲＣＡタンパク質はコンバターゼに結合し、コンバターゼをそのサブユニットに不可逆的に解離させるのに対し、ＣＦＡでは、ＲＣＡタンパク質はコンバターゼの非触媒サブユニット（Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ）に結合し、セリンプロテアーゼＩ因子（ＦＩ）を動員してＣ３ｂ／Ｃ４ｂを切断及び不活性化することで、それがＣ３コンバターゼを形成する能力を止める。
補体系は、病原体特異的適応免疫応答をブーストする病原体に対するその直接作用、細胞分化及び極性化の過程への寄与、組織再生、脂質代謝、免疫複合体の除去及びアポトーシス、その他などの役割が知られている自然免疫系の一部である。補体活性化の制御の欠如又は不適切な活性化は、宿主組織に損傷をもたらすため、補体系は一連のタンパク質によって緊密に制御されている。これらのうち、補体活性化制御因子（ＲＣＡ）ファミリータンパク質が主として補体制御を担っている。ＲＣＡタンパク質は、膜タンパク質、例えば崩壊促進因子（ＤＡＦ；ＣＤ５５）、メンブレンコファクタープロテイン（ＭＣＰ；ＣＤ４６）、及び補体受容体１（ＣＲ１；ＣＤ３５）並びに液相タンパク質、例えばＨ因子（ＦＨ）及びＣ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）を含む。構造的に、ＲＣＡタンパク質は、２～４つの連続するモジュールが崩壊促進活性（ＤＡＡ）及び補因子活性（ＣＦＡ）と名付けられる制御機能に寄与している補体制御タンパク質（ＣＣＰ）繰り返しモジュールから構成される。ＲＣＡタンパク質は、補体経路の中心的酵素であるＣ３／Ｃ５コンバターゼを標的付けることによって機能する。これらの酵素の不活性化のために、ＲＣＡタンパク質は、これらのコンバターゼ又はそれらの非触媒サブユニットに結合し、それらを不活性化する。ＤＡＡでは、ＲＣＡタンパク質はコンバターゼに結合し、コンバターゼをそのサブユニットに不可逆的に解離させるのに対し、ＣＦＡでは、ＲＣＡタンパク質はコンバターゼの非触媒サブユニット（Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ）に結合し、セリンプロテアーゼＩ因子（ＦＩ）を動員してＣ３ｂ／Ｃ４ｂを切断及び不活性化することで、それがＣ３コンバターゼを形成する能力を止める。
補体系の活性化は、Ｃ３コンバターゼ（Ｃ４ｂ２ａ又はＣ３ｂＢｂ）の形成で収束するレクチン経路、古典的経路及び代替経路と名付けられる３つの主経路によって開始される。これらの酵素は、補体の下流のエフェクター機能すべての開始に必要な補体成分Ｃ３を切断する。Ｃ３コンバターゼは、２つのサブユニットから構成され、その際、触媒サブユニット（Ｂｂ／Ｃ２ａ）がＭｇ＋＋依存的に非触媒（Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ）サブユニットに結合している。
自己補体の攻撃から宿主細胞を防御する、ＲＣＡファミリータンパク質の広く発現される膜制御因子は、ＤＡＦ及びＭＣＰである。ＤＡＦは、そのＤＡＡを通じてＣ３コンバターゼを解離させるのに対し、ＭＣＰはそのＣＦＡを介してＣ３コンバターゼの形成を阻止する。ＤＡＦ及びＭＣＰは、それぞれ広く並んだ４つのＣＣＰモジュールから構成される。ＤＡＦのＣＣＰ２－４の各ドメインは、ＭＣＰのＣＣＰ１－３とそれぞれ類似することが知られている。ＤＡＦにおけるドメイン欠失及び部位特異的変異誘発研究によって、ＤＡＦのＣＣＰ２－３はそれが古典的／レクチン経路Ｃ３コンバターゼを崩壊させる能力（ＣＰ－ＤＡＡ）に必要とされ、ＣＣＰ２－４は、代替経路Ｃ３コンバターゼの崩壊（ＡＰ－ＤＡＡ）に不可欠であることが実証された。ＭＣＰでは、ドメイン欠失及び部位特異的変異誘発データによって、ＣＣＰ２－４はＣ３ｂに対するＣＦＡ（Ｃ３ｂ－ＣＦＡ）及びＣ４ｂに対するＣＦＡ（Ｃ４ｂ－ＣＦＡ）に関係付けられた。さらに、Ｃ３ｂと複合体を形成したＤＡＦ及びＭＣＰの最近の結晶構造によって、それらが共通の結合様式で結合し、これらのタンパク質のＣＣＰ３－４がＣ３ｂと接触を形成することが明らかにされた。しかし、ＤＡＡを付与するために必要とされるＤＡＦの最小構造ユニット、並びにＤＡＡにおけるその各ドメインの機能的重要性、並びに同じくＣ３ｂ及びＣ４ｂに対するＣＦＡを付与するために不可欠なＭＣＰ上の最小ＦＩ相互作用部位は、今のところ不明である。また、これらのタンパク質に機能的モジュール性が存在するか、すなわち、個別のＣＣＰ又は複数ＣＣＰのユニットがタンパク質に特定の機能を付与することができるか、及びそれらを連結することで新しい機能的能力が加わるかは、不明である。
先行技術の文書、例えば米国特許第５８６６４０２号は、ＭＣＰ及びＤＡＦ由来のキメラタンパク質の配列を、グリコサミノグリカンと結合することが可能なペプチド配列と共に請求している。さらに、先行技術の文書ＥＰ８９３２６０１Ｂ２は、第１の機能（Ｆｎ）ユニット－スペーサー－第２のＦｎユニット－スペーサー－第３のＦｎユニットという構造を有するハイブリッドを開示しており、その際、補体Ｆｎユニットは、ＤＡＦ並びに／又はＭＣＰ並びに／又はＣＲ１並びに／又は非補体機能的ユニット、例えば動物細胞への結合を増強するためのＩｇ及び／若しくはタンパク質のいずれかであることができる。この文書はまた、いくつかのハイブリッド、例えばＤＡＦ－ＣＲＩＢ、ＤＡＦ－ＣＲ１ ＢＢ、及びＤＡＦ－ＩｇＧ４、並びに（ＤＡＦ ＣＣＰ１，２，３，４－ＣＲ１ ＣＣＰ４，５，６，７－ＭＣＰ ＣＣＰ１，２，３，４＋ＭＣＰ ＳＴＰ領域の２アミノ酸（ＶＳ）＋６×Ｈｉｓ）を有するＤＡＦ－ＭＣＰハイブリッドについても言及している。米国特許第５，８５１，５２８号は、補体活性を阻害するポリペプチドを開示している。米国特許第５，８５１，５２８号は、前記ペプチドの制御活性又は作用機序の様式を特定していない。
しかし、どの先行技術も、Ｉ因子に対する親和性及びＣ３ｂ／Ｃ４ｂに対するアビディティーを増強することによって達成される二重活性制御作用を有する、親タンパク質と同等のＤＡＡ及びＣＦＡを含む４ドメインＤＡＦ－ＭＣＰキメラ変異体を開示していない。
これらのＲＣＡタンパク質の機能における欠陥は、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、及びデンスデポジット病（ＤＤＤ）などの様々な疾患に関連することが知られている。本発明は、Ｉ因子に対する親和性及びＣ３ｂ／Ｃ４ｂに対するアビディティーを増強することによって達成された二重活性制御作用を有する、親タンパク質と同等のＤＡＡ及びＣＦＡを含む４ドメインＤＡＦ－ＭＣＰキメラ変異体（ＤＣＰ）に関する。ＤＣＰは、補体系が関係する病的状態を処置するためのＲＣＡベースの治療薬を開発するためのリード分子として役立ち得る。
したがって、上記の未知の因子を試験するために、４ＣＣＰ ＤＡＦ－ＭＣＰキメラを生成し、生化学的に特徴付けた。さらに、４ＣＣＰ ＤＡＦ－ＭＣＰキメラの部位特異的変異体を生成し、生化学的に特徴付けた。結果としての実験及びそれらのデータによって、４連続ＣＣＰの構造フレームワーク中の個々のＤＡＦ及びＭＣＰモジュールの機能的役割が実証された。追加的に、親タンパク質と同等のＤＡＡ及びＣＦＡを含むＤＡＦ－ＭＣＰキメラ変異体を構築し、それにより、ＲＣＡタンパク質に機能的モジュール性が存在することを明らかにした。
さらに、実験データはまた、両方の制御活性への機構的洞察を提供する。
発明の目的
本発明の目的は、補体経路の阻害のための操作キメラタンパク質を提供することである。本発明の別の目的は、二重活性制御のための改変４ドメインＤＡＦ－ＭＣＰキメラタンパク質並びにＩ因子に対する親和性及びＣ３ｂ／Ｃ４ｂに対するアビディティーを増強する（すなわち、ＤＣＰの作製）ためのそのさらなる改変、新規な遺伝子改変４ドメインＤＡＦ－ＭＣＰキメラタンパク質を製造する方法並びにＤＣＰの使用を提供することである。
本発明の目的は、補体経路の阻害のための操作キメラタンパク質を提供することである。本発明の別の目的は、二重活性制御のための改変４ドメインＤＡＦ－ＭＣＰキメラタンパク質並びにＩ因子に対する親和性及びＣ３ｂ／Ｃ４ｂに対するアビディティーを増強する（すなわち、ＤＣＰの作製）ためのそのさらなる改変、新規な遺伝子改変４ドメインＤＡＦ－ＭＣＰキメラタンパク質を製造する方法並びにＤＣＰの使用を提供することである。
発明の概要
補体系は、自然免疫系になくてはならない部分である。補体系は、補体活性化制御因子（ＲＣＡ）ファミリーに属する制御タンパク質によって高度に制御され、制御の欠如は、宿主細胞に損傷を与え、制御の不足は、疾患、例えば加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、及びデンスデポジット病（ＤＤＤ）に関連する。現在、二重制御活性を効果的に有する効率的な４ドメインＤＡＦ－ＭＣＰキメラはなく、頑健な分子／キメラタンパク質の必要性がある。ＲＣＡタンパク質は、膜に係留された補体制御因子である崩壊促進因子（ＤＡＦ；ＣＤ５５）、メンブレンコファクタープロテイン（ＭＣＰ；ＣＤ４６）、及び補体受容体１（ＣＲ１；ＣＤ３５）並びに液相制御因子、例えばＨ因子（ＦＨ）及びＣ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）を含む。構造的に、これらのタンパク質は、２～４つの連続ドメインが崩壊促進活性（ＤＡＡ）及び補因子活性（ＣＦＡ）と名付けられる制御機能に貢献する、繰り返し補体制御タンパク質（ＣＣＰ）ドメインから構成され、二重活性を有する現在のＤＡＦ－ＭＣＰキメラは８つのＣＣＰドメインを有する。しかし現在のところ、強いＤＡＡ及び強いＣＦＡの両方を有する４ドメインキメラタンパク質はない。したがって本発明は、Ｉ因子との増強した親和性／相互作用及びＣ３ｂ／Ｃ４ｂに対するアビディティーと共に二重活性制御（すなわち、ＤＡＡ及びＣＦＡ）を有するように作製された４ドメインキメラタンパク質ＤＣＰ（すなわち二重活性制御因子）、新規な遺伝子改変４ドメインＤＡＦ－ＭＣＰキメラタンパク質を製造する方法及びＤＣＰの使用及び商業的使用のためのＤＣＰの使用に関する。
補体系は、自然免疫系になくてはならない部分である。補体系は、補体活性化制御因子（ＲＣＡ）ファミリーに属する制御タンパク質によって高度に制御され、制御の欠如は、宿主細胞に損傷を与え、制御の不足は、疾患、例えば加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、及びデンスデポジット病（ＤＤＤ）に関連する。現在、二重制御活性を効果的に有する効率的な４ドメインＤＡＦ－ＭＣＰキメラはなく、頑健な分子／キメラタンパク質の必要性がある。ＲＣＡタンパク質は、膜に係留された補体制御因子である崩壊促進因子（ＤＡＦ；ＣＤ５５）、メンブレンコファクタープロテイン（ＭＣＰ；ＣＤ４６）、及び補体受容体１（ＣＲ１；ＣＤ３５）並びに液相制御因子、例えばＨ因子（ＦＨ）及びＣ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）を含む。構造的に、これらのタンパク質は、２～４つの連続ドメインが崩壊促進活性（ＤＡＡ）及び補因子活性（ＣＦＡ）と名付けられる制御機能に貢献する、繰り返し補体制御タンパク質（ＣＣＰ）ドメインから構成され、二重活性を有する現在のＤＡＦ－ＭＣＰキメラは８つのＣＣＰドメインを有する。しかし現在のところ、強いＤＡＡ及び強いＣＦＡの両方を有する４ドメインキメラタンパク質はない。したがって本発明は、Ｉ因子との増強した親和性／相互作用及びＣ３ｂ／Ｃ４ｂに対するアビディティーと共に二重活性制御（すなわち、ＤＡＡ及びＣＦＡ）を有するように作製された４ドメインキメラタンパク質ＤＣＰ（すなわち二重活性制御因子）、新規な遺伝子改変４ドメインＤＡＦ－ＭＣＰキメラタンパク質を製造する方法及びＤＣＰの使用及び商業的使用のためのＤＣＰの使用に関する。
発明の詳細な説明
本出願は、PATENTINで提出された配列表を含み、その全体で参照により本明細書に組み入れられる。前記PATENTIN-3.5バージョンはSequence listing.txtの名称で作成され、サイズが２０キロバイトである。
本出願は、PATENTINで提出された配列表を含み、その全体で参照により本明細書に組み入れられる。前記PATENTIN-3.5バージョンはSequence listing.txtの名称で作成され、サイズが２０キロバイトである。
本発明は、ＤＡＦのタンパク質配列番号（配列番号１）及びＭＣＰのタンパク質配列番号（配列番号２）を提供する。本発明は、ＣＰ－ＤＡＡの阻害を実証したＤ２Ｄ３に属するタンパク質配列番号３もまた提供する。Ｄ２Ｄ３はＡＰ－ＤＡＡにおいて十分な効果を提供しないことが観察された。このタンパク質は、必要に応じて実施例に対照として使用されており、本明細書に開示されている。
本発明は、キメラタンパク質Ｄ２Ｍ２－４（配列番号４）；Ｄ２Ｍ２－４（ＭＬ）（配列番号５）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（配列番号６）；Ｄ２Ｄ３Ｄ４Ｍ４（配列番号７）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｔ１９２Ｅ）（配列番号８）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｋ１９５Ｙ）（配列番号９）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｆ１９７Ｉ）（配列番号１０）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｓ１９９Ｋ））（配列番号１１）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｔ２００Ｙ））（配列番号１２）；（Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｌ２０５Ｋ））（配列番号１３）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｐ２１６Ｋ）（配列番号１４）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｍｕｌｔｉ－１）（配列番号１５）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｍｕｌｔｉ－２）（配列番号１６）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｍｕｌｔｉ－３）（配列番号１７）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｍｕｌｔｉ－４）（配列番号１８）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｍｕｌｔｉ－５）又はＤＣＰ（配列番号１９）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｅ１３６Ｑ）（Ｄ２）（配列番号２０）；（Ｄ２Ｍ２－４（Ｙ１０１Ｎ）（配列番号２１）；（Ｄ２Ｍ２－４（Ｅ１１８Ｌ）（配列番号２２）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｉ１３４Ａ）（配列番号２３）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｅ１３６Ｋ）（配列番号２４）；（Ｄ２Ｍ２－４（Ｅ１３７Ｙ））（配列番号２５）；（Ｄ２Ｍ２－４（Ｅ１４２Ｋ）（配列番号２６）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｇ１５２Ｄ）（配列番号２７）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｌ１６１Ｋ）（配列番号２８）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｔ１６３Ａ）（配列番号２９）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｖ１７８Ｒ）（配列番号３０）；（Ｄ２Ｍ２－４（Ｖ１８０Ｆ）（配列番号３１）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｌ１８４Ｒ）（配列番号３２）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｔｅｔｒａ）（配列番号３３）もまた提供する。
本発明の操作キメラタンパク質は、崩壊促進因子（ＤＡＦ）のＤ１、Ｄ２、Ｄ３及びＤ４ドメインより選択されるドメイン並びにメンブレンコファクタープロテイン（ＭＣＰ）のＭ１、Ｍ２、Ｍ３及びＭ４より選択されるドメインを任意でリンカーと共に含む。
本発明は、キメラタンパク質Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｍｕｌｔｉ－５）又はＤＣＰ（配列番号１９）を開示する。
操作キメラタンパク質Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｍｕｌｔｉ－５）又はＤＣＰ（配列番号１９）は、崩壊促進因子（ＤＡＦ）のＤ２及びＤ３ドメイン並びにメンブレンコファクタープロテイン（ＭＣＰ）のＭ３及びＭ４をリンカー及び特定の変異と共に有する。
本発明は、二重活性制御を有する新規な改変４ドメインＤＡＦ－ＭＣＰキメラタンパク質であって、Ｉ因子及びＣ３ｂ／Ｃ４ｂ及び配列番号１９（ＤＣＰ）との相互作用を増強するためにさらに改変されたキメラタンパク質を開示する。図１（Ａ）及び（Ｂ）に、ＤＡＦ、ＭＣＰ及びＤＡＦ－ＭＣＰキメラ並びにＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を図表示する。
本発明は、ヒトＤＡＦタンパク質由来のドメインＤ２、Ｄ３及び／又はＤ４並びにヒトＭＣＰタンパク質由来のＭ２、Ｍ３、及び／又はＭ４ドメインを有する操作４ドメインタンパク質であって、タンパク質／変異体／キメラＤ２Ｍ２－４、ＭＣＰリンカーを有するＤ２Ｍ２－４、Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４、Ｄ２Ｄ３Ｄ４Ｍ４をもたらす４ドメインタンパク質；単一アミノ酸置換、多アミノ酸置換並びに単一及び多アミノ酸残基の組み合わせを用いるドメイン中の機能獲得型変異によりさらに改変された操作タンパク質Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４；並びにドメインＤ３中の２つの変異（Ｆ１９７Ｉ及びＰ２１６Ｋ）及び１つの多残基変異（ｍｕｌｔｉ－１、すなわち、リンカー置換変異、２１９ＥＣＲＥＩＹ２２４→ＩＣＥＫＶＬ）がまとめて置換されたＭｕｌｔｉ－５（ＤＣＰ）を作製した改変Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４を開示する。ＤＣＰでは、ＤＡＦの２つのＮ末端モジュールの両方が置換されていた。
ＤＣＰを得るために、Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４におけるＩ因子との相互作用を増加させるためにＴ１９２Ｅ、Ｋ１９５Ｙ、Ｆ１９７Ｉ、Ｓ１９９Ｋ、Ｔ２００Ｙ、Ｌ２０５Ｋ及びＰ２１６Ｋ並びに３種の多残基Ｍｕｌｔｉ－１、Ｍｕｌｔｉ－２及びＭｕｌｔｉ－３より選択されるさらなる変異を行った。
実施形態では、本発明は、組み換え技術及び変異の導入を用いて二重活性制御並びにＩ因子及びＣ３ｂ／Ｃ４ｂとの増強した相互作用を有する４ドメインＤＡＦ－ＭＣＰキメラタンパク質（ＤＣＰ）を操作および入手し、変異体Ｍｕｌｔｉ－５（ＤＣＰ）をもたらす方法であって：
ｉ． ＲＣＡタンパク質ＤＡＦ及びＭＣＰのドメイン並びにそれらのそれぞれのリンカーをスワップして、機能的態様を研究および同定し、キメラタンパク質を得た工程；
ｉｉ． Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４キメラを選択し、さらなる改変及び変異を導入して増加したＣＦＡを有する変異体を作製した工程；
ｉｉｉ． 増加したＤＡＡ及びＣＦＡの両方を有するＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４変異体を作製した工程；
ｉｖ． キメラ変異体Ｄ２Ｍ２－４、Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４及びＤ２Ｄ３Ｄ４Ｍ４、並びにＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４の単一及び多残基変異体、並びにＤ２Ｍ２－４がもたらされた工程
ｖ． 細菌発現ベクター及び／又は酵母発現ベクターにおいて工程（ｉｖ）の変異体を発現させた工程
を含む方法を開示する。
ｉ． ＲＣＡタンパク質ＤＡＦ及びＭＣＰのドメイン並びにそれらのそれぞれのリンカーをスワップして、機能的態様を研究および同定し、キメラタンパク質を得た工程；
ｉｉ． Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４キメラを選択し、さらなる改変及び変異を導入して増加したＣＦＡを有する変異体を作製した工程；
ｉｉｉ． 増加したＤＡＡ及びＣＦＡの両方を有するＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４変異体を作製した工程；
ｉｖ． キメラ変異体Ｄ２Ｍ２－４、Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４及びＤ２Ｄ３Ｄ４Ｍ４、並びにＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４の単一及び多残基変異体、並びにＤ２Ｍ２－４がもたらされた工程
ｖ． 細菌発現ベクター及び／又は酵母発現ベクターにおいて工程（ｉｖ）の変異体を発現させた工程
を含む方法を開示する。
さらにまた本発明の方法は、Ｄ２Ｍ２－４（配列番号４）；Ｄ２Ｍ２－４（ＭＬ）（配列番号５）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（配列番号６）；Ｄ２Ｄ３Ｄ４Ｍ４（配列番号７）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｔ１９２Ｅ）（配列番号８）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｋ１９５Ｙ）（配列番号９）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｆ１９７Ｉ）（配列番号１０）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｓ１９９Ｋ））（配列番号１１）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｔ２００Ｙ））（配列番号１２）；（Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｌ２０５Ｋ））（配列番号１３）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｐ２１６Ｋ）（配列番号１４）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｍｕｌｔｉ－１）（配列番号１５）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｍｕｌｔｉ－２）（配列番号１６）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｍｕｌｔｉ－３）（配列番号１７）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｍｕｌｔｉ－４）（配列番号１８）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｍｕｌｔｉ－５）又はＤＣＰ（配列番号１９）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｅ１３６Ｑ）（Ｄ２）（配列番号２０）；（Ｄ２Ｍ２－４（Ｙ１０１Ｎ）（配列番号２１）；（Ｄ２Ｍ２－４（Ｅ１１８Ｌ）（配列番号２２）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｉ１３４Ａ）（配列番号２３）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｅ１３６Ｋ）（配列番号２４）；（Ｄ２Ｍ２－４（Ｅ１３７Ｙ））（配列番号２５）；（Ｄ２Ｍ２－４（Ｅ１４２Ｋ）（配列番号２６）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｇ１５２Ｄ）（配列番号２７）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｌ１６１Ｋ）（配列番号２８）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｔ１６３Ａ）（配列番号２９）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｖ１７８Ｒ）（配列番号３０）；（Ｄ２Ｍ２－４（Ｖ１８０Ｆ）（配列番号３１）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｌ１８４Ｒ）（配列番号３２）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｔｅｔｒａ）（配列番号３３）を含む群より選択される、補体経路の阻害のための操作キメラタンパク質をもたらした。
本発明の方法は、タンパク質Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｍｕｌｔｉ－５）又はＤＣＰ（番号１９）を提供した。
理論に縛られることなく、本発明の方法かＣＦＡ、ＡＰ－ＤＡＡ及びＣＰ－ＤＡＡ活性を増加させるために改変及び変異を導入することが提起されている。
ｉ． 本発明の改変４ドメインＤＡＦ－ＭＣＰキメラタンパク質（ＤＣＰ）を製造する方法は本明細書において開示される：ＲＣＡタンパク質ＤＡＦ及びＭＣＰのドメイン及びそれらのそれぞれのリンカーをスワップして機能的態様を研究及び同定した － ドメインスワップ技術を用いてＤＡＦ及びＭＣＰのドメイン及びそれぞれのリンカーをスワップして、最良のＤＡＡ（ＣＰ－ＤＡＡ及びＡＰ－ＤＡＡ）及びＣＦＡ（Ｃ３ｂ－ＣＦＡ及びＣ４ｂ－ＣＦＡ）活性に不可欠なドメイン及びリンカーを同定した。ＤＡＦのＣＣＰ２－３がＣＰ－ＤＡＡ及びＡＰ－ＤＡＡの両方を誘導するのに対し、ＣＣＰ４はＣ３ｂ結合ドメインとして役立つことによって助けとなること；並びにＣＣＰ２－３はＤＡＦにおけるＤＡＡに必要とされることが見出された。また、ＭＣＰがＤＡＡを欠如するので、ＭＣＰのドメイン（Ｍ１－Ｍ３）の１つ又は複数及びリンカーをＤＡＦの相同ドメイン（Ｄ２－Ｄ４）及び結合リンカーとスワップした。もたらされたタンパク質／変異体を機能獲得について試験した；次のドメインをスワップする前にＤＡＡにおけるＤ２－Ｄ３の間のリンカー（すなわち、ＫＫＫＳ；正の実効電荷＋３）の重要性を試験した。Ｄ２Ｄ３タンパク質がＤ２Ｄ３ドメインをＤ２Ｄ３リンカーと共に有するようなタンパク質／変異体を作製した。Ｄ２ドメインをＤ２－Ｄ３リンカーと共に有し、Ｍ２Ｍ３Ｍ４ドメインをそれらのそれぞれのＭ２Ｍ３Ｍ４リンカーと共に有するＤ２Ｍ２－４タンパク質を作製した。この置換単独でＣＰ－ＤＡＡを付与するために十分であったが、このタンパク質／変異体はＤＡＦと比較して活性が３０倍低かった。しかし、このタンパク質は低下したＡＰ－ＤＡＡを示した。これは、活性に他のモジュールの役割が重要であることを強調していた。Ｄ２Ｍ２－４中のＤ２－Ｄ３リンカーがＭＣＰの中性リンカー（ＹＲＥＴ）と置き換えられたＤ２Ｍ２－４（ＭＬ）タンパク質／変異体を作製した；その結果、もたらされた変異体／タンパク質（Ｄ２Ｍ２－４－ＭＬ）は、Ｄ２Ｍ２－４と異なり、ＣＰ－ＤＡＡに増加を示さなかった。ＭＣＰリンカーを有するＤ２Ｍ２－４タンパク質（Ｄ２Ｍ２－４－ＭＬ）はまた、ＤＡＦリンカーを有するＤ２Ｍ２－４タンパク質（Ｄ２Ｍ２－４）と比較してＣ３ｂ及びＣ４ｂとの結合にかなりの減少を示した。Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４では、ＤＡＦの２つのＮ末端モジュール（Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４）を結合リンカーと共にＭＣＰ中に置換し、このタンパク質のＤＡＡを評価し、このタンパク質がＤＡＦと等しいＣＰ－ＤＡＡ及びＡＰ－ＤＡＡを示したこと、並びにＤＡＦの３つのドメインをリンカーと共にＭＣＰ中に置換（Ｄ２Ｄ３Ｄ４Ｍ４）してもＤＡＡにさらなる増加がもたらされなかったことが観察された。さらにデータによって、ＡＰ Ｃ３コンバターゼ複合体について、より遅い解離速度が制御因子のリサイクル速度に影響し、それが低減したＡＰ－ＤＡＡをもたらすことが示唆された。これらは、ＤＡＦのＣＣＰ２－３によってのみ崩壊が誘導されることを示していた；ＤＡＦ中のＤ４モジュールがＣ３ｂ結合ドメインの役割だけを果たし、その機能をＭ３－Ｍ４で代用できると判定された；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４キメラ中のＤ２Ｄ３モジュールとＡＰ Ｃ３コンバターゼサブユニット（すなわち、Ｃ３ｂ及びＢｂ）との相互作用の可能性が研究され、Ｃ３ｂ－Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４－Ｂｂ複合体がモデル化された。さらに、界面解析によって、Ｄ２及びＤ３がＣ３ｂ及びＢｂの両方と相互作用すること、並びにＤ２及びＤ２－Ｄ３リンカーがＢｂ中のフォンビルブランド因子Ａ型（ＶＷＡ）ドメインのα７ヘリックスと接触を形成したのに対し、Ｄ３がＢｂ中のＶＷＡドメインのα７ヘリックス並びにα６－βＦ及びα５－βＥループと接触を形成したことが示された。このモデル化データは、Ｄ２及びＤ３が主にα７ヘリックスに加えてα６－βＦ及びα５－βＥループと相互作用し、したがって、Ｄ２－Ｄ３とこれらのループとの相互作用が、Ｃ３ｂからのＢｂの崩壊をもたらすＭＩＤＡＳ部位におけるアロステリック変化に重要であることを示している；ＭＣＰの最適なＣＦＡに必要とされるＭ２及びＭ３上のＩ因子相互作用部位が決定され、Ｍ３上に存在するＦＩ相互作用部位単独が、ＣＦＡに機能的に寄与できることが見出された；特にＣＦＡに増加を示したキメラにおけるこれらのＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４変異体のＤＡＡを評価した。４ＣＣＰの構造フレームワーク中での強いＣＦＡ及びＤＡＡの共存が達成可能であると判定された。ＣＦＡの増加を提供する残基が様々なＲＣＡタンパク質の配列アライメントによって決定された；親分子と同じように頑健なＤＡＡ及びＣＦＡを示している４ＣＣＰ ＤＡＦ－ＭＣＰタンパク質を操作した。ドメインＤ２Ｄ３Ｄ４のそれぞれのリンカー及びドメインＤ４とＭ４との間のＭ４リンカーを有するＤ２Ｄ３Ｄ４Ｍ４タンパク質／変異体を作製した。作製されたタンパク質をそれらのＤＡＡ及びＣＦＡについて試験及び研究した。変異体／キメラタンパク質の制御活性を増加させるためにさらなる変異を導入、試験及び研究した。
ｉｉ． Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４キメラを選択し、さらなる改変及び変異を導入して、増加したＣＦＡを有する変異体を研究及び作製した － このＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４タンパク質／変異体のＣＦＡは、Ｄ３ドメイン中のＦＩ相互作用部位（Ｍ２に相同）及びＤ３－Ｍ３リンカーを置換することによって増加したが、そのＤＡＡは影響されなかった。Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４タンパク質中のＤ３及び付属するリンカー（Ｄ３－Ｍ３リンカー）における推定上のＦＩ相互作用残基の置換を、ウイルス及びヒトＲＣＡタンパク質に関する初期の変異誘発研究に基づき行った。Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４の合計７種の単一残基（Ｔ１９２Ｅ、Ｋ１９５Ｙ、Ｆ１９７Ｉ、Ｓ１９９Ｋ、Ｔ２００Ｙ、Ｌ２０５Ｋ及びＰ２１６Ｋ）並びに３種の多残基（Ｍｕｌｔｉ－１、Ｍｕｌｔｉ－２及びＭｕｌｔｉ－３）変異体を生成した。これらの変異は、Ｄ３のＣｙｓ２－Ｃｙｓ４領域とＤ３－Ｍ３リンカー（ＥＣＲＥＩＹ）との間にある。それは、ＤＡＦのこの領域とＭＣＰの相同領域との初期のスワッピングが、ＤＡＦ中へのＣＦＡの組み入れをもたらしたからである。単一及び多残基変異体生化学分析によって、様々な結果（ＣＦＡにおける完全喪失から２８倍の増加まで）が示された。Ｃ３ｂ ＣＦＡに＞２倍の増加を示した置換は、Ｓ１９９Ｋ及びＰ２１６Ｋのような単一アミノ酸変異体、並びにｍｕｌｔｉ－１（リンカー置換変異体２１９ＥＣＲＥＩＹ２２４→ＩＣＥＫＶＬ）、ｍｕｌｔｉ－２（リンカー置換＋Ｓ１９９Ｋ）及びｍｕｌｔｉ－３（２１５ＤＰＬ２１７→ＰＫＡ）のような多残基変異体を含んでいた。同様に、Ｃ４ｂ ＣＦＡに＞２倍の増加を示した変異は、Ｆ１９７Ｉ、Ｓ１９９Ｋ、Ｐ２１６Ｋ、ｍｕｌｔｉ－２及びｍｕｌｔｉ－３を含んでいた。増加したＣＦＡを有する変異体（３種の単一残基変異体（Ｆ１９７Ｉ、Ｓ１９９Ｋ、Ｐ２１６Ｋ）及び１種の多残基変異体（ｍｕｌｔｉ－１、すなわち、リンカー置換変異体）を選択した。
ｉｉｉ． 増加したＣＦＡを有するＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４変異体／タンパク質をさらに研究及び改変して、無傷のＤＡＡを有する変異体／タンパク質を作製した － 特にＣＦＡに増加を示した変異体において、これらのＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４変異体のＤＡＡをＤＡＡの減少について研究した。ＣＦＡに増加を示したいくつかの変異体は、ＤＡＡに減少を示した。しかし、３種の変異体（Ｆ１９７Ｉ、Ｐ２１６Ｋ及びｍｕｌｔｉ－１）は、ＡＰ－ＤＡＡにほとんど又はまったく減少を示さず、ＣＦＡ変異体における増加のどれもＣＰ－ＤＡＡに＞２倍の減少を示さなかった。したがってこのデータによって、４ＣＣＰの構造フレームワーク中での強いＣＦＡ及びＤＡＡの共存が達成可能であるという前提が裏付けられた。様々なＲＣＡタンパク質の配列アライメントを行って、ＣＦＡに増加を提供した残基が、ＣＦＡを示す他のＲＣＡタンパク質で保たれているかを調べた。活性における増加と関連する１０個の残基のうち５つは、ＣＦＡを有する他のタンパク質中で位置が保たれていることが観察された。
ｉｖ． 増加したＤＡＡ及びＣＦＡの両方を有するＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４変異体を作製した － Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４変異体がＤ３ドメイン中に３種の単一残基変異（Ｆ１９７Ｉ、Ｓ１９９Ｋ、Ｐ２１６Ｋ）及びＤ３Ｍ３リンカー中に１種の多残基変異（ｍｕｌｔｉ－１、すなわち、リンカー置換変異体）を有するように置換されたときに、変異体Ｍｕｌｔｉ－４が作製された。Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４変異体がＤ３ドメイン中に２種の単一残基変異（Ｆ１９７Ｉ及びＰ２１６Ｋ）及びＤ３Ｍ３リンカー中に１種の多残基変異（ｍｕｌｔｉ－１、すなわち、リンカー置換変異体）を有するように置換されたときに、Ｍｕｌｔｉ－５が作製された。ｍｕｌｔｉ－４及びｍｕｌｔｉ－５変異体を研究し、レクチン経路及び代替経路の阻害にＬＨＲ－Ａ（ＣＣＰ１－３）よりも効力が高く、代替経路の阻害にＬＨＲ－Ａｍｕｔよりも効力が高い、効率的なＣＦＡ及びＤＡＡを有する４ＣＣＰ分子（ＤＣＰ）の成功した設計を作製した。この分子は、古典的経路及びレクチン経路を阻害することがＬＨＲ－Ａｍｕｔと類似する。Ｃ３ｂ－ｍｕｌｔｉ－４変異体－ＦＩ複合体の分子動力学シミュレーションを研究した。実験は、キメラ中の変異された残基とＦＩとの相互作用に関する情報を明らかにした。全体的にキメラ／タンパク質のリンカー及び関連領域とＦＩとの相互作用パターンは実験研究およびデータと合致する。また、ドメイン特異的相互作用はＤＡＦ及びＭＣＰに類似することが見出された。
ｖ． キメラタンパク質を細菌及び酵母発現ベクターで発現させ、研究した － ヒトＤＡＦ、ＭＣＰ、ＤＡＦ－ＭＣＰキメラ／タンパク質及びＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４の置換変異体並びにＣＲ１ ＬＨＲ－Ａ（ＣＣＰ１－３）及びその変異体をそれらのｃＤＮＡからそれぞれ増幅させることによって構築し、酵母発現ベクターｐＰＩＣＺα及び／又は細菌発現ベクターｐＥＴ－２８ｂのいずれかにクローニングした。遺伝子スプライシング及びオーバーラップ伸長法を用いてＤＡＦ－ＭＣＰタンパク質を構築し、次いで酵母発現ベクターｐＰＩＣＺα又は細菌発現ベクターｐＥＴ－２８ｂのいずれかにクローニングした。ＣＲ１ ＬＨＲ－Ａ（ＣＣＰ１－３）をＣＲ１ ｃＤＮＡから増幅させ、その発現のためにｐＥＴ－２８ｂにクローニングした。プライマーセットを使用して、ＤＡＦ、ＭＣＰ及びＣＲ１の所望の領域を増幅した；Quick-change site-directed mutagenesis kit IIを使用してＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４の置換変異体及びＣＲ１ ＬＨＲ－Ａ（ＣＣＰ１－３）を構築し、それを細菌発現ベクターｐＥＴ－２８ｂにクローニングし、ＤＡＦ欠失変異体Ｄ２－Ｄ３をＤＡＦ ｃＤＮＡから増幅させ、それをｐＥＴ－２８ｂにクローニングした；クローニング後、すべての構築物をＤＮＡシークエンシングによって検証し、クローニングされた変異体をピキア パストリス（Pichia pastoris）中に発現させ、ｐＥＴ－２８ｂ中にクローニングされた変異体を大腸菌ＢＬ２１細胞内に形質転換した。
ヒトＤＡＦ、ＭＣＰ、ＤＡＦ－ＭＣＰタンパク質／変異体、すなわちＤ２Ｍ２－４（Ｄ２－Ｄ３の間にＤＡＦリンカーを含むキメラ／タンパク質）及びＤ２Ｍ２－４－ＭＬ（Ｍ１－Ｍ２の間にリンカーを含むキメラ／タンパク質）の発現および精製。これらをＰ．パストリスにおいて発現させ、精製、透析及び濃縮した；同様に、ＤＡＦ変異体Ｄ２Ｄ３、ＤＡＦ－ＭＣＰ変異体／タンパク質Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４及びＤ２Ｄ３Ｄ４Ｍ４、並びにＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４の置換変異体、ＣＲ１ ＬＨＲ－Ａ（ＣＣＰ１－３）及びその変異体ＣＲ１ ＬＨＲ－Ａｍｕｔ（ＣＣＰ１－３、Ｄ１０９Ｎ／Ｅ１１６Ｋ）を含む他の変異体に加えてヒトＤＡＦ及びＭＣＰを大腸菌中にも発現させた。それらを精製及びリフォールディングした。
溶血アッセイを用いて、ＤＡＦ、ＤＡＦ－ＭＣＰキメラ及びＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４の変異体の古典的／レクチン経路及び代替経路Ｃ３コンバターゼ崩壊促進活性を測定した。制御因子の存在下で酵素を崩壊させ、残ったコンバターゼ活性を推定した；液相切断アッセイによってＭＣＰ、ＤＡＦ－ＭＣＰキメラ及びＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４の変異体の補因子活性を測定した；BiacoreアッセイによってＤＡＦ、ＭＣＰ、ＤＡＦ－ＭＣＰキメラ及びＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４の置換変異体のＣ３ｂ及びＣ４ｂへの結合測定を行い、特異的結合応答を導き出した；Wieslab総補体ＥＬＩＳＡアッセイによってｍｕｌｔｉ－５変異体の相対補体経路特異的阻害活性をＭＣＰ、ＤＡＦ、ＣＲ１ ＬＨＲ－Ａ（ＣＣＰ１－３）及びＣＲ１ ＬＨＲ－Ａｍｕｔ（ＣＣＰ１－３、Ｄ１０９Ｎ／Ｅ１１６Ｋ）の活性に対して試験し、制御タンパク質の存在下の血清活性レベルを、タンパク質の非存在下で測定された活性に対するパーセントとして表現した；ＤＡＦ及びＭＣＰの配列をUniProtから検索し（ＤＡＦのＩＤ：Ｐ０８１７４及びＭＣＰのＩＤ：Ｐ１５５２９）、Modeller 9.11を用いて、Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４タンパク質／変異体配列をＤＡＦ及びＭＣＰのテンプレート構造（それぞれのPDB id: 5FOA及び5FO8）に基づくホモロジーモデリングに供した；ＤＯＰＥスコアに基づき単一の最良モデルを選択した；キメラの天然残基を、実験的証拠から得られた変異体残基を有するように変異させた；キメラの個別の変異体構造の変異エネルギー及びその安定性を計算した；三元ＤＡＡ複合体（Ｃ３ｂ－Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４－Ｂｂ）を構築し、その界面を解析した；三元複合体（Ｃ３ｂ－ｍｕｌｔｉ－４変異体－ＦＩ）を構築し、それをＭＤシミュレーションのために使用した。
本発明は、二重活性制御及びＩ因子に対する増強した親和性及びＣ３ｂ／Ｃ４ｂに対するアビディティーを有し、変異体Ｍｕｌｔｉ－５（ＤＣＰ）をもたらす、４ドメインＤＡＦ－ＭＣＰキメラタンパク質（ＤＣＰ）を開示する。ＤＣＰは、補体系が関係する病的状態を処置するためのさらなるＲＣＡベースの治療薬を設計するためのリード分子として使用されることができる。
本発明は、二重活性制御を有し、さらにＩ因子及びＣ３ｂ／Ｃ４ｂ及び配列ＩＤ １９（ＤＣＰ）との相互作用を増強するように改変された、新規な改変４ドメインＤＡＦ－ＭＣＰキメラタンパク質を開示する。
本発明の別の実施形態は、キメラ／変異体／タンパク質であるＤＡＦリンカーを有するＤ２Ｍ２－４、ＭＣＰリンカーを有するＤ２Ｍ２－４、Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４、及びＤ２Ｄ３Ｄ４Ｍ４をもたらす、ヒトＤＡＦタンパク質由来のドメインＤ２Ｄ３Ｄ４及びＭＣＰタンパク質由来のＭ２Ｍ３Ｍ４ドメインを有するキメラタンパク質をもたらすＤＡＦドメインとＭＣＰドメインとの異なる組み合わせを有する操作ＤＡＦ－ＭＣＰキメラを開示する；Ｉ因子の相互作用のために操作タンパク質Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４は機能獲得型変異によりさらに改変された。導入された変異は、２１９ＥＣＲＥＩＹ２２４→２１９ＩＣＥＫＶＬ２２４並びに単一アミノ酸置換Ｆ１９７Ｉ及びＰ２１６Ｋであった。
配列番号４～３３の操作キメラタンパク質は、二重活性制御、すなわちＤＡＡ及びＣＦＡの両方を有する。
本発明は、頑健なＣＰ－ＤＡＡ及びＡＰ－ＤＡＡ並びにＣ３ｂ－ＣＦＡ及びＣ４ｂ－ＣＦＡ活性、したがって古典的経路（ＣＰ）、代替経路（ＡＰ）及びレクチン経路（ＬＰ）に対する強力な阻害活性を有する二重活性タンパク質のための最適なフレームワークを提供する。
追加的に、本明細書において生成される二重活性制御因子（ＤＣＰ、配列番号１９）は、補体系が関係する病的状態を処置するための補体活性化制御因子（ＲＣＡ）ベースの治療薬を開発するためのリード分子として役立ち得る。二重活性タンパク質及び本発明のキメラの有効性により、それらはまた、インビトロ及びエクスビボアッセイ系でＣＰ、ＡＰ及びＬＰ活性化を阻害するために試薬として使用することもできる。加えて、ＡＰ、ＣＰ及びＬＰに対するこれらのキメラの特異性は、異なる病状における異なる経路の重要性をインビボでさらに解明することに、及びこれらの経路によって媒介される病態を阻害することに、したがって、二重活性並びにそれによってＣＰ、ＡＰ及びＬＰに対する効果を提供するために必要とされる特異的立体構造特徴を解明及び同定することにそれを使用するために、これらのキメラを非常に有用にする。
キメラタンパク質は、異なる病状における異なる経路をインビトロ及びインビボで解明することに、並びにこれらの経路によって媒介される病態を阻害することに使用することができる。本発明のキメラタンパク質、特に配列番号：４～３３は、二重活性を提供するために必要とされる特定の立体構造特徴を同定し、それにより、ＣＰ、ＡＰ及びＬＰへの効果を同定するために有用であり得る。
ＣＰ、ＡＰ及びＬＰの二重阻害のために必要とされる特定の主鎖立体構造及び側鎖官能基を提供するために、ポリペプチド模倣物が等しく良好に役立ち得ることが当業者によって認識されている。したがって、連結されて適切な主鎖立体構造を形成することが可能な天然アミノ酸、アミノ酸誘導体、類似体又は非アミノ酸分子のいずれかの使用を通じて二重阻害剤を産生することは、本発明の範囲内であると考えられる。例示されるポリペプチドと補体活性化の阻害が十分に類似するように同じ主鎖立体構造の特徴及び他の官能基を有する、本発明のペプチドの置換又は誘導を呼ぶために、非ペプチド類似体、又はペプチド及び非ペプチド成分を含む類似体は、時に、本明細書において「ペプチド模倣体」又は「アイソスター模倣体」と称される。
実施形態では、本発明の操作タンパク質は、ペプチドへのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）成分の付加により改変することができる。当技術分野において周知のように、ＰＥＧ化は、治療用ペプチド及びタンパク質のインビボ半減期を増加させることができる。一実施形態において、ＰＥＧは、約１，０００～約５０，０００の平均分子量を有する。別の実施形態において、ＰＥＧは、約１，０００～約２０，０００の平均分子量を有する。別の実施形態において、ＰＥＧは、約１，０００～約１０，０００の平均分子量を有する。例示的な実施形態において、ＰＥＧは、約５，０００の平均分子量を有する。ポリエチレングリコールは、分岐鎖又は直鎖の場合があり、好ましくは直鎖である。本発明の操作タンパク質は、連結基を介してＰＥＧに共有結合されることができる。
態様では、ポリペプチドは、当技術分野において周知のような生理学的に許容し得るエステル若しくは塩の形態で、又は生理学的に許容し得る陽イオン若しくは陰イオンとの組み合わせなどのいずれかで医薬組成物中に存在し得る。ポリペプチドはまた、それを組成物中に入れて製剤化する前に誘導体化される場合がある。
実施形態では、本発明の組成物は、組成物として投与される場合がある。そのような医薬組成物は、対象への投与に適した形態の本発明の操作ポリペプチドのみからなる場合があり、又は医薬組成物は、活性成分及び１つ若しくは複数の薬学的に許容し得る担体、１つ若しくは複数の追加的な成分、又はこれらの何らかの組み合わせを含む場合がある。
本発明の組成物は、静脈内、経口、腹腔内、皮内、筋肉内、鼻腔内、皮下、鼻腔内、脊髄内、気管内及び頭蓋内などの経路のうち任意の１つで投与される場合がある。
医薬組成物の製剤は、薬理学の分野において公知の又は将来的に開発される任意の方法によって調製される場合がある。一般に、そのような調製方法は、活性成分を担体又は１つ若しくは複数の他の副成分と混合し、次いで、必要又は所望により、産物を所望の単回単位量又は多回単位量に形づくる又はパッケージングする工程を含む。
実施形態では、本発明の新規な操作タンパク質は、補体媒介性損傷が関係する疾患における治療薬として有用である。補体媒介性疾患の例は、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、及びデンスデポジット病（ＤＤＤ）、自己免疫疾患、例えば実験的アレルギー性神経炎、ＩＩ型コラーゲン誘導関節炎、重症筋無力症、溶血性貧血、糸球体腎炎、及び免疫複合体誘導血管炎、成人呼吸促迫症候群、脳卒中、心臓発作、異種移植、多発性硬化症、熱傷、体外透析及び血液酸素化を含むが、それに限定されるわけではない。
別の実施形態では、本明細書に記載されるキメラタンパク質は、患者（ヒト又は動物）の血清、組織又は臓器中の補体活性化を阻害するために使用される場合があり、このキメラタンパク質は、加齢性黄斑変性、関節リウマチ、脊髄損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、癌、及び呼吸障害、例えば喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー性炎症、肺気腫、気管支炎、気管支拡張症、嚢胞性線維症、結核、肺炎、呼吸促迫症候群（ＲＤＳ－新生児及び成人）、鼻炎及び副鼻腔炎を含むが、それに限定されるわけではないある特定の疾患又は状態の処置を促進することができる。本発明の操作タンパク質はまた、様々な疾患における補体媒介性病態の阻害、異種移植の間のヒト補体媒介性損傷に対する抵抗性を付与するための非ヒト細胞及び組織上での発現、体外循環の間の補体の阻害、癌治療のための補体の阻害、ヒト補体からの防御のための遺伝子治療ベクター（例えば、アデノ随伴ウイルスベクター）での発現のために使用される場合がある。
本発明のタンパク質は、細胞若しくは臓器移植の間又は人工臓器若しくは挿入物の使用の際に発生する補体活性化を阻害するために（例えば、細胞、臓器、人工臓器又は挿入物を本発明のペプチドでコーティングする又はその他の方法で処理することによって）使用される場合がある。本発明のタンパク質は、生理液の体外シャントの間に発生する補体活性化を阻害するために使用される場合がある。
本明細書下記の実施例は、本発明をより十分に理解するために提供されるのであって、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１． ＤＡＦのＣＣＰ２－３は崩壊を誘導するのに対し、ＣＣＰ４はＣ３ｂ結合ドメインとして役立つことによって助けとなる － ドメインスワップ戦略を用いて、ＤＡＦの各ドメインの役割を決定し、変異体を作製及び試験した。ＤＡＦは、４つのＣＣＰモジュールから構成され、ＣＣＰ２－４がＤＡＡのために必要とされる。さらに、ＭＣＰはＤＡＡを欠如するので、１つ又は複数のＭＣＰドメイン（Ｍ１－Ｍ３）及びリンカーと、ＤＡＦの相同ドメイン（Ｄ２－Ｄ４）及び結合リンカーとのスワッピングを行った［図１参照、ドメインに番号を付け、境界を縦線で印する。縦線に付いた番号は境界の残基を表し、uniprotナンバリングに従う。ＤＡＦドメインを連結しているリンカーを赤色で印するのに対し、ＭＣＰドメインを連結しているリンカーを青色で印する；同じ色スキームを用いてＤＡＦ－ＭＣＰキメラ中のリンカーを表す。Ｄ２Ｍ２－４（ＭＬ）は、Ｍ１－Ｍ２ドメイン間リンカーを有するキメラを表す］）。もたらされた変異体を機能獲得について試験した（図２参照）。最初に、Ｍ１及び付属するモジュール間リンカーをＤ２及び結合リンカー（変異体Ｄ２Ｍ２－４）とスワップした。興味深いことに、ＣＰ－ＤＡＡを付与するためにこの置換だけで十分であったが、この変異体はＤＡＦと比較して約３０倍活性が低かった。さらにこの変異体は、低下したＡＰ－ＤＡＡを示した。これは、活性に果たす他のモジュールの重要な役割を強調していた（図２Ａ及びＢ、左のパネル参照）。図２Ａにおいて、Ｉｎｈ．’は、阻害剤濃度を意味する。示したデータは、表Ｓ１に要約された３つの独立した実験の平均±ＳＤである。点線は５０％活性を意味する。
さらに、次のドメインをスワップする前にＤ２－Ｄ３の間のリンカー（すなわち、ＫＫＫＳ；正の実効電荷＋３）のＤＡＡにおける重要性を試験した。また、最近のＤＡＦ－Ｃ３ｂ複合体構造により、リンカー残基がＣ３ｂと相互作用することが説明された。なおまた、Ｎ末端ＣＣＰ周辺の正の静電ポテンシャルがＣ３ｂ／Ｃ４ｂの初期認識を増強することも示されている。したがって、Ｄ２Ｍ２－４中のＤ２－Ｄ３リンカーを相同位置に存在するＭＣＰの中性リンカー（ＹＲＥＴ）と置換したが、もたらされた変異体（Ｄ２Ｍ２－４－ＭＬ）はＣＰ－ＤＡＡに増加を示さなかった（図２Ａ、左のパネル参照）。さらに、ＭＣＰリンカーを有するＤ２Ｍ２－４変異体（Ｄ２Ｍ２－４－ＭＬ）はまた、ＤＡＦリンカーを有するＤ２Ｍ２－４変異体（Ｄ２Ｍ２－４）と比較してＣ３ｂ及びＣ４ｂとの結合にかなりの減少を示した（図２Ｃ及び図６Ａ参照［棒グラフは、それぞれのタンパク質（１μM）のＣ３ｂ及びＣ４ｂへの結合後の定常状態で達成されたRUを表す。固定化されたＣ３ｂ及びＣ４ｂ－ビオチンの量は、それぞれ３３３０RU及び１６３０RUであった。データを３つの独立した実験の平均±ＳＤとして表現する］。図２Ｃ中のグラフは、ｙ軸に応答単位として示す結合相互作用のセンソグラムの重ね合わせを表す。ストレプトアビジンチップ上に固定化されたＣ３ｂ－ビオチン（フローセル－２）及びＣ４ｂ－ビオチン（フローセル－３）の上に１μMの各タンパク質を流すことによって結合を測定した。図中に示したデータは、図６Ａに示す３つの独立した実験の１つである。
ＤＡＦの２つのＮ末端モジュールを結合リンカーと共にＭＣＰ中に置換した次の変異体（Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４）を製造し、この変異体のＤＡＡを評価した。変異体がＤＡＦと等しいＣＰ－ＤＡＡ及びＡＰ－ＤＡＡを示したことが観察された。ＤＡＦの３つのドメインをリンカーと共にＭＣＰ中に置換（Ｄ２Ｄ３Ｄ４Ｍ４）しても、ＤＡＡにさらなる増加は生じず、逆に、ＤＡＦと比較してＡＰ－ＤＡＡに約１０倍の減少があった（図２Ｂ、右のパネル参照）。ＳＰＲデータによって、Ｃ３ｂに関するこの変異体の解離速度がＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４よりもずっと低いことが示された；Ｃ４ｂに関してそれの解離速度は変化しなかった［図６Ｂ参照（図中に示すデータは、パネル６Ｃに示す３つの独立した実験の１つである）］。データによって、より低い解離速度がＡＰ Ｃ３コンバターゼ複合体に関する制御因子のリサイクル速度に影響し、そのことがそのＡＰ－ＤＡＡの減少をもたらすことが示唆された。まとめると、上記実施例は、崩壊がＤＡＦのＣＣＰ２－３によってのみ誘導されることを示している。したがって、ＤＡＦ中のＤ４モジュールはＣ３ｂ結合ドメインの役割だけを果たし、その機能をＭ３－Ｍ４が代用できることが明らかである。
Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４キメラ中のＤ２Ｄ３モジュールとＡＰ Ｃ３コンバターゼサブユニット（すなわち、Ｃ３ｂ及びＢｂ）との相互作用の可能性をさらに洞察するために、Ｃ３ｂ－Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４－Ｂｂ複合体をモデル化した。界面解析により、Ｄ２及びＤ３がＣ３ｂ及びＢｂの両方と相互作用することが見出された。すなわちＤ２及びＤ３は、Ｃ３ｂのα’Ｎ末端領域（α’－ＮＴ）及びマクログロブリン－６（ＭＧ６）ドメインと界面を形成した（図７Ａ参照）。加えて、Ｄ２及びＤ２－Ｄ３リンカーは、Ｂｂ中のフォンビルブランド因子Ａ型（ＶＷＡ）ドメインのα７ヘリックスと接触を形成したのに対し、Ｄ３は、Ｂｂ中のＶＷＡドメインのα７ヘリックス、α６－βＦループ及びα５－βＥループと接触を形成した（図７Ｂ参照）。金属イオン依存性接着部位（ＭＩＤＡＳ部位；βＡ－α１、α３－α４及びβＤ－α５ループによって形成）の安定な立体構造が、ＶＷＡの高親和性立体構造の維持及びＡＰ Ｃ３コンバターゼの安定性に重要であることが、それを示唆する以前の研究から知られている。さらに、α７ヘリックスがＭＩＤＡＳ部位にアロステリックに結合されることも提唱された。本モデル化データは、Ｄ２及びＤ３が、α７ヘリックスに加えて主にα６－βＦ及びα５－βＥループと相互作用することを示している。したがって、Ｄ２－Ｄ３とこれらのループとの相互作用がＭＩＤＡＳ部位内のアロステリック変化に重要であり、Ｃ３ｂからのＢｂの崩壊につながる可能性がある。図７は、モデル化構造Ｃ３ｂ－Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４－Ｂｂ複合体中のキメラとＣ３ｂ及びＢｂとの界面を示し、これを、タンパク質界面解析プログラムPISA、www.ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/pistart.htmlによって分析した。Ｃ３ｂ（Ａ）及びＢｂ（Ｂ）の界面にあるＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４キメラのＤ２－Ｄ３ドメイン中の残基を縦線（埋没表面積（ＢＳＡ）スコアを示す）として示し、表示する。キメラのこれらの残基と相互作用するＢｂ及びＣ３ｂの領域もまた縦線の上に印する。星印は、変異誘発によってＤＡＡに重要であると以前に同定された残基を表す。
実施例２． Ｍ２及びＭ３上のＩ因子相互作用部位はＭＣＰの最適なＣＦＡに必要とされる
ヒトＣ３ｂ、ｍｉｎｉ ＦＨ、及びＦＩの複合体の最近解明された結晶構造によって、Ｃ３ｂと共にＦＨのＣＣＰ２及びＣＣＰ３の両方（ＭＣＰのＭ２及びＭ３モジュールと相同）はＦＩと接触することが示された。さらに、ウイルスＲＣＡ制御因子（Kaposica及びＨＶＳ ＣＣＰＨ）のＣＣＰ２－３がＣＦＡを推進することが示されている。これらのデータは、ＦＩ相互作用部位がヒト及びウイルスＲＣＡタンパク質のＣＣＰ２及びＣＣＰ３で保存されている可能性が高いことを示唆していた。しかし、ＣＦＡにおけるこれらの部位の相対的な重要性は明らかでなかった。Ｍ３上のＦＩ部位だけでＭＣＰにおけるＣＦＡを推進するために十分であるかは検討されなかった。したがって、ＭＣＰのＭ２ドメインを欠如するＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４キメラのＣＦＡを調べた。注目すべきことに、該キメラはＣ３ｂ及びＣ４ｂに対するＣＦＡを表したが、Ｃ３ｂ及びＣ４ｂに対するＣＦＡは、ＭＣＰのそれと比較してそれぞれ３４及び３５倍低かった［図３Ａ及び図８（それらをＣ３ｂ（Ａ）又はＣ４ｂ（Ｂ）及びＩ因子と共にＰＢＳ中３７℃で表示時間インキュベートすることによってこれらのタンパク質の補因子活性を測定した。それらを還元条件下のＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｃ３ｂについて９％及びＣ４ｂについて１０％）上で泳動することによってＣ３ｂ／Ｃ４ｂの切断産物を観察した。Ｃ３ｂ－ＣＦＡでは、α’鎖はＮ末端６８kDa断片及びＣ末端４６kDa断片に切断され、そのうち４６kDa断片は４３kDa鎖断片にさらに切断される。Ｃ４ｂ－ＣＦＡでは、α’鎖はＮ末端２７kDa断片、中央Ｃ４ｄ断片及びＣ末端１６kDa断片に切断され；Ｃ末端断片はゲル上に見えない）］。したがって、これらの結果は、Ｍ３上に存在するＦＩ相互作用部位が単独でＣＦＡに機能的に寄与できることを示している。
ヒトＣ３ｂ、ｍｉｎｉ ＦＨ、及びＦＩの複合体の最近解明された結晶構造によって、Ｃ３ｂと共にＦＨのＣＣＰ２及びＣＣＰ３の両方（ＭＣＰのＭ２及びＭ３モジュールと相同）はＦＩと接触することが示された。さらに、ウイルスＲＣＡ制御因子（Kaposica及びＨＶＳ ＣＣＰＨ）のＣＣＰ２－３がＣＦＡを推進することが示されている。これらのデータは、ＦＩ相互作用部位がヒト及びウイルスＲＣＡタンパク質のＣＣＰ２及びＣＣＰ３で保存されている可能性が高いことを示唆していた。しかし、ＣＦＡにおけるこれらの部位の相対的な重要性は明らかでなかった。Ｍ３上のＦＩ部位だけでＭＣＰにおけるＣＦＡを推進するために十分であるかは検討されなかった。したがって、ＭＣＰのＭ２ドメインを欠如するＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４キメラのＣＦＡを調べた。注目すべきことに、該キメラはＣ３ｂ及びＣ４ｂに対するＣＦＡを表したが、Ｃ３ｂ及びＣ４ｂに対するＣＦＡは、ＭＣＰのそれと比較してそれぞれ３４及び３５倍低かった［図３Ａ及び図８（それらをＣ３ｂ（Ａ）又はＣ４ｂ（Ｂ）及びＩ因子と共にＰＢＳ中３７℃で表示時間インキュベートすることによってこれらのタンパク質の補因子活性を測定した。それらを還元条件下のＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｃ３ｂについて９％及びＣ４ｂについて１０％）上で泳動することによってＣ３ｂ／Ｃ４ｂの切断産物を観察した。Ｃ３ｂ－ＣＦＡでは、α’鎖はＮ末端６８kDa断片及びＣ末端４６kDa断片に切断され、そのうち４６kDa断片は４３kDa鎖断片にさらに切断される。Ｃ４ｂ－ＣＦＡでは、α’鎖はＮ末端２７kDa断片、中央Ｃ４ｄ断片及びＣ末端１６kDa断片に切断され；Ｃ末端断片はゲル上に見えない）］。したがって、これらの結果は、Ｍ３上に存在するＦＩ相互作用部位が単独でＣＦＡに機能的に寄与できることを示している。
Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４キメラにおけるＣＦＡが分かったので、Ｄ３ドメイン（Ｍ２と相同）中のＦＩ相互作用部位を置換することによってそのＤＡＡに影響せずにこのキメラのＣＦＡを増強できるかを研究した。言い換えると、古典的経路及び代替経路の両方のＣ３コンバターゼに対する強力なＤＡＡ及びＣＦＡが４つのＣＣＰ制御因子に共存することができるかを研究した。これに答えるために、ウイルス及びヒトＲＣＡタンパク質に関する初期の変異誘発研究に基づき、Ｄ３中の推定上のＦＩ相互作用残基及びＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４変異体に付属するリンカーの置換を行った。［図９（ＤＣＰ（ｍｕｌｔｉ－５変異体）のＣＣＰ１－４と様々な補体制御因子の相同ドメインとの構造ベースの配列アライメント。PROMALS3Dツール（http://prodata.swmed.edu/promals3d/）を使用して、ＤＣＰのモデル化構造を、ＤＡＦ（ＰＤＢ：１ＯＪＶ）、ＭＣＰ（ＰＤＢ：３Ｏ８Ｅ）、Ｈ因子（ＰＤＢ：２ＷＩＩ）、ＣＲ１（ＰＤＢ：１ＧＫＧ）、及びＳＰＩＣＥ（ＰＤＢ：５ＦＯＢ）の実験的構造、並びにKaposica及びＣＲＲＹに基づくＨＶＳ ＣＣＰＨ（ＰＤＢ：２ＸＲＢ）のモデル化構造とアライメントした。青色の矢印は、Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４キメラにおけるＣＦＡを増強した変異（Ｆ１９７Ｉ、Ｓ１９９Ｋ、Ｐ２１６Ｋ、２１９ＥＣＲＥＩＹ２２４→ＩＣＥＫＶＬ）を示し、オレンジ色の矢印は、ＣＦＡを増強しなかった変異（Ｔ１９２Ｅ、Ｋ１９５Ｙ、Ｔ２００Ｙ、Ｌ２０５Ｋ）を示す。ハイライトした残基は、それぞれのタンパク質とＣ３ｂ及びＩ因子との界面を示す。赤色の四角は、ＣＦＡに減少をもたらした以前の変異を示し、紫色の四角は、ＤＡＡに減少をもたらした変異を示す。ドメインの番号（各ＣＣＰ配列の始めに示す）は、uniprotナンバリングに従って付ける）］。ここで、Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４の合計で７種の単一残基変異体及び３種の多残基変異体［図３Ｂ（Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４並びに大腸菌に発現されたそれの単一及び多残基変異体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析）］を生成した。これらの変異は、Ｄ３のＣｙｓ２－Ｃｙｓ４領域とＤ３－Ｍ３リンカー（ＥＣＲＥＩＹ）の間にある。それは、ＤＡＦのこの領域とＭＣＰの相同領域との初期のスワップが、ＤＡＦにおけるＣＦＡの組み入れをもたらしたからである。単一残基変異体及び多残基変異体の生化学分析によって、ＣＦＡにおける完全喪失から２８倍の増加までの様々な結果が示された［図３Ｃ（上から下へのシンボルキーの順序は、線の順序（すなわち、活性が最低から最高）に対応する。グラフに示すデータは、表Ｓ１にまとめた３つの独立した実験の平均である）］。Ｃ３ｂ ＣＦＡに＞２倍の増加を示した置換は、Ｓ１９９Ｋ及びＰ２１６Ｋのような単一アミノ酸変異体並びにｍｕｌｔｉ－１（リンカー置換変異体２１９ＥＣＲＥＩＹ２２４→ＩＣＥＫＶＬ）、ｍｕｌｔｉ－２（リンカー置換＋Ｓ１９９Ｋ）及びｍｕｌｔｉ－３（２１５ＤＰＬ２１７→ＰＫＡ；図１０Ａ）のような多残基変異体を含んでいた。同様に、Ｃ４ｂ ＣＦＡに＞２倍の増加を示した変異は、Ｆ１９７Ｉ、Ｓ１９９Ｋ、Ｐ２１６Ｋ、ｍｕｌｔｉ－２及びｍｕｌｔｉ－３を含んでいた（図３Ｃ、図１０Ｂ及び表Ｓ１）。
次に、これらのＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４変異体のＤＡＡを評価し、特にＣＦＡに増加を示した変異体でのＤＡＡにおける減少を探した［図１１（（Ａ）それぞれのタンパク質が予め形成したＣＰ Ｃ３コンバターゼ（Ｃ４ｂ２ａ）を崩壊させる能力を評価することによって、それぞれのタンパク質のＣＰ－ＤＡＡを測定した。（Ｂ）それぞれのタンパク質が予め形成したＡＰ Ｃ３コンバターゼ（Ｃ３ｂＢｂ）を崩壊させる能力を評価することによって、それらのＡＰ－ＤＡＡを測定した。１００％ Ｃ３コンバターゼ活性が阻害剤（Ｉｎｈ）の非存在下の活性に等しいと見なすことによってデータを規準化した。示したデータは、３つの独立した実験の平均±ＳＤである）及び表Ｓ１］。本発明者らの結果によって、ＣＦＡに増加を示した３種の変異体がＤＡＡに減少を示したことが実証された。例えば、ＡＰ－ＤＡＡにおける＞２倍の減少がＳ１９９Ｋ並びにｍｕｌｔｉ－２及びｍｕｔｉ－３変異体で観察された。他の３種の変異体（Ｆ１９７Ｉ、Ｐ２１６Ｋ及びｍｕｌｔｉ－１）は、ＡＰ－ＤＡＡにほとんど又はまったく減少を示さなかった。その上、ＣＦＡに増加を示した変異体のどれもＣＰ－ＤＡＡに＞２倍の減少を示さなかった。したがって、これらのデータによって、４ＣＣＰの構造フレームワーク中での強いＣＦＡ及びＤＡＡの共存が達成可能であるという前提が裏付けられる。
ＣＦＡに増加を提供した残基がＣＦＡを示す他のＲＣＡタンパク質で保存されているかを調べるために、様々なＲＣＡタンパク質の配列アライメントを行った（図９）。活性における増加を伴う１０個の残基のうち５つは、ＣＦＡを有する他のタンパク質で位置が保存されていることが観察された。例えば、ＤＡＦのＦ１９７及びＥ２１９と同等の位置に、保存されたイソロイシンが見られた。同様に、ＤＡＦのＰ２１６及びＥ２２２と同等の位置に、正荷電残基が存在し、ＤＡＦのＲ２２１と類似の位置に、負荷電残基が存在した。これらの残基のうち、ＤＡＦのＥ２１９と共線的な位置にあるＭＣＰにおけるイソロイシン（１９）並びにＤＡＦのＰ２１６及び／又はＥ２２２に対応する位置にあるＣＲ１、ＳＰＩＣＥ、Kaposica及びＣＣＰＨにおける正荷電残基の変異は、ＣＦＡに減少を示した（図９）。
実施例３． 親分子と同じように頑健なＤＡＡ及びＣＦＡを表す４ＣＣＰ ＤＡＦ－ＭＣＰキメラの分子エンジニアリング
上記の演習では、３種の単一残基変異体（Ｆ１９７Ｉ、Ｓ１９９Ｋ、Ｐ２１６Ｋ）及び１種の多残基変異体（ｍｕｌｔｉ－１、すなわちリンカー置換変異体）がＣＦＡに中等度～かなり大きい増加を示した（図３Ｃ及び表Ｓ１、図１０Ａ及び１０Ｂ）。したがって、Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４キメラにおけるこれらの残基の共同置換がＤＡＦ及びＭＣＰと同じくらい強いＤＡＡ及びＣＦＡを有する分子の生成をもたらす可能性があると考えられた。したがって、上記変異のすべてがＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４に組み入れられたもの（ｍｕｌｔｉ－４）、及びＳ１９９ＫがＣＦＡを増加させるが、ＡＰ－ＤＡＡを減少させることからＳ１９９Ｋ以外のすべてがＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４に組み入れられたもう１つ（ｍｕｌｔｉ－５）というＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４の２種の多重バリアントを生成した（表Ｓ１）。これら２種の変異体のＣＦＡの調査によって、両方の変異体が良好なＣ３ｂ ＣＦＡを有するが、ｍｕｌｔｉ－５がＭＣＰと等価であったことが示された（図４Ａ及び図１２Ａ）。しかし、両方の変異体は、ＭＣＰと比較して良好なＣ４ｂ ＣＦＡ（約２～３倍）を示した（図４Ｂ及び図１２Ｂ［図１２（Ａ）は、ＭＣＰ、ｍｕｌｔｉ－４及びｍｕｌｔｉ－５のＣ３ｂ補因子活性（Ｃ３ｂ－ＣＦＡ）を示し、（Ｂ）は、ＭＣＰ、ｍｕｌｔｉ－４及びｍｕｌｔｉ－５のＣ４ｂ補因子活性（Ｃ４ｂ－ＣＦＡ）を示す］。これらの変異がこれらの変異体のＤＡＡに効果を及ぼすかも決定した。ｍｕｌｔｉ－４変異体は、ＡＰ－ＤＡＡに完全喪失及びＣＰ－ＤＡＡに約２．５倍の減少を示したのに対し、ｍｕｌｔｉ－５は、ＤＡＦと等しいＡＰ－ＤＡＡ及びＣＰ－ＤＡＡを表した（図４Ｃ及びＤ並びに表Ｓ１）。ｍｕｌｔｉ－４変異体のＡＰ－ＤＡＡにおける減少と一致して、Ｃ４ｂではなくＣ３ｂに対するその結合が、Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４と比較して撹乱されることが見出された［図６Ｃ（データは３つの独立した実験の平均±ＳＤである）］。
上記の演習では、３種の単一残基変異体（Ｆ１９７Ｉ、Ｓ１９９Ｋ、Ｐ２１６Ｋ）及び１種の多残基変異体（ｍｕｌｔｉ－１、すなわちリンカー置換変異体）がＣＦＡに中等度～かなり大きい増加を示した（図３Ｃ及び表Ｓ１、図１０Ａ及び１０Ｂ）。したがって、Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４キメラにおけるこれらの残基の共同置換がＤＡＦ及びＭＣＰと同じくらい強いＤＡＡ及びＣＦＡを有する分子の生成をもたらす可能性があると考えられた。したがって、上記変異のすべてがＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４に組み入れられたもの（ｍｕｌｔｉ－４）、及びＳ１９９ＫがＣＦＡを増加させるが、ＡＰ－ＤＡＡを減少させることからＳ１９９Ｋ以外のすべてがＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４に組み入れられたもう１つ（ｍｕｌｔｉ－５）というＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４の２種の多重バリアントを生成した（表Ｓ１）。これら２種の変異体のＣＦＡの調査によって、両方の変異体が良好なＣ３ｂ ＣＦＡを有するが、ｍｕｌｔｉ－５がＭＣＰと等価であったことが示された（図４Ａ及び図１２Ａ）。しかし、両方の変異体は、ＭＣＰと比較して良好なＣ４ｂ ＣＦＡ（約２～３倍）を示した（図４Ｂ及び図１２Ｂ［図１２（Ａ）は、ＭＣＰ、ｍｕｌｔｉ－４及びｍｕｌｔｉ－５のＣ３ｂ補因子活性（Ｃ３ｂ－ＣＦＡ）を示し、（Ｂ）は、ＭＣＰ、ｍｕｌｔｉ－４及びｍｕｌｔｉ－５のＣ４ｂ補因子活性（Ｃ４ｂ－ＣＦＡ）を示す］。これらの変異がこれらの変異体のＤＡＡに効果を及ぼすかも決定した。ｍｕｌｔｉ－４変異体は、ＡＰ－ＤＡＡに完全喪失及びＣＰ－ＤＡＡに約２．５倍の減少を示したのに対し、ｍｕｌｔｉ－５は、ＤＡＦと等しいＡＰ－ＤＡＡ及びＣＰ－ＤＡＡを表した（図４Ｃ及びＤ並びに表Ｓ１）。ｍｕｌｔｉ－４変異体のＡＰ－ＤＡＡにおける減少と一致して、Ｃ４ｂではなくＣ３ｂに対するその結合が、Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４と比較して撹乱されることが見出された［図６Ｃ（データは３つの独立した実験の平均±ＳＤである）］。
次に、Wieslab補体スクリーニングＥＬＩＳＡを使用して補体の３つの主経路すべてに対するｍｕｌｔｉ－５変異体の制御活性を試験し、それをＤＡＦ及びＭＣＰと比較した。ｍｕｌｔｉ－５は、様々な経路の阻害においてＤＡＦよりも活性が２～７．５倍高く、ＭＣＰよりも３５～２２５倍高かった（図１２Ｃ及び表Ｓ２Ａ）。したがって、効率的なＣＦＡ及びＤＡＡを有する４ＣＣＰ分子の成功した設計を説明した。ｍｕｌｔｉ－５の強いＣＦＡ及びＤＡＡに基づき、この分子をＤＣＰ（崩壊補因子タンパク質）と名付ける。ＬＨＲ－Ａ（ＣＣＰ１－３）及びその改良型バリアントＬＨＲ－Ａｍｕｔ（ＣＣＰ１－３、Ｄ１０９Ｎ／Ｅ１１６Ｋ）などのＣＲ１阻害剤によるＤＣＰの阻害潜在性の比較によって、ＤＣＰがレクチン経路及び代替経路の阻害にＬＨＲ－Ａ（ＣＣＰ１－３）よりも高い効力があり、代替経路の阻害にＬＨＲ－Ａｍｕｔよりも高い効力があったことが示された（図１２Ｃ及び表Ｓ２Ｂ）。しかしこれは、古典的経路及びレクチン経路の阻害にＬＨＲ－Ａｍｕｔにより大きく類似していた。
実施例４． Ｃ３ｂ－ｍｕｌｔｉ－４変異体－ＦＩ複合体の分子動力学シミュレーションはキメラ中の変異型残基とＦＩとの相互作用に関する情報を明らかにする
上に詳述した演習によって、Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４変異体において置換された場合にＣＦＡに増加を付与する残基が明確に同定された。ＦＩ及びＣ３ｂとの分子相互作用へのこれらの残基の影響を調べるために、Ｃ３ｂ－ＦＨ－ＦＩ構造内のＦＨをキメラと置換することによってＣ３ｂ－ｍｕｌｔｉ－４変異体－ＦＩの三元複合体の構造モデルを生成した。予測された三元複合体を分子動力学シミュレーションに供して（５０ns間）、安定性へのこれらの変異の効果並びにＦＩ及びＣ３ｂとの相互作用に果たすそれらの役割を強調した（図５参照）。ＲＭＳＤを計算して、シミュレーションの全期間にわたりタンパク質における構造多様性を特徴付けた（図１３Ａｉ参照）。ＲＭＳＤは、小さなドリフト及びプラトーを有するもののシミュレーションの全期間にわたり安定であることが見出された。キメラについてＲＭＳＦプロットを計算して、残基毎のゆらぎを理解した。ＲＭＳＦプロットによって、Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４キメラとｍｕｌｔｉ－４変異体構造との間の類似したゆらぎパターンが明らかとなった（図１３Ａｉｉ及び図１３Ａｉｉｉ）（（ｉ）５０nsのシミュレーションの間のＣ３ｂ－ｍｕｌｔｉ４－ＦＩ複合体の主鎖ＲＭＳＤ。（ｉｉ）全シミュレーション時間のキメラ残基の根平均二乗ゆらぎ（ＲＭＳＦ）。（ｉｉｉ）機能獲得型変異が同定された領域に位置するｍｕｌｔｉ－４変異体残基のＲＭＳＦを示すプロット）。
上に詳述した演習によって、Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４変異体において置換された場合にＣＦＡに増加を付与する残基が明確に同定された。ＦＩ及びＣ３ｂとの分子相互作用へのこれらの残基の影響を調べるために、Ｃ３ｂ－ＦＨ－ＦＩ構造内のＦＨをキメラと置換することによってＣ３ｂ－ｍｕｌｔｉ－４変異体－ＦＩの三元複合体の構造モデルを生成した。予測された三元複合体を分子動力学シミュレーションに供して（５０ns間）、安定性へのこれらの変異の効果並びにＦＩ及びＣ３ｂとの相互作用に果たすそれらの役割を強調した（図５参照）。ＲＭＳＤを計算して、シミュレーションの全期間にわたりタンパク質における構造多様性を特徴付けた（図１３Ａｉ参照）。ＲＭＳＤは、小さなドリフト及びプラトーを有するもののシミュレーションの全期間にわたり安定であることが見出された。キメラについてＲＭＳＦプロットを計算して、残基毎のゆらぎを理解した。ＲＭＳＦプロットによって、Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４キメラとｍｕｌｔｉ－４変異体構造との間の類似したゆらぎパターンが明らかとなった（図１３Ａｉｉ及び図１３Ａｉｉｉ）（（ｉ）５０nsのシミュレーションの間のＣ３ｂ－ｍｕｌｔｉ４－ＦＩ複合体の主鎖ＲＭＳＤ。（ｉｉ）全シミュレーション時間のキメラ残基の根平均二乗ゆらぎ（ＲＭＳＦ）。（ｉｉｉ）機能獲得型変異が同定された領域に位置するｍｕｌｔｉ－４変異体残基のＲＭＳＦを示すプロット）。
シミュレーションされた構造において評価されたキメラとＣ３ｂ及びＦＩとの相互作用によって、キメラのＩ１９７及びＩ２１９が残基Ｗ３９３、Ｐ４０２、Ｌ４０４、Ｉ４０７、Ｖ４０８、Ｉ４０９、及びＹ４１１によって形成されるＦＩの疎水性ポケット中に収容されていることが示された。同様に、Ｌ２２４（リンカー残基）は、残基Ｉ３５７、Ｇ３６２、Ｉ３６３、Ａ３６０、Ｖ３９６、Ｖ３９７、Ｗ３９９、及びＩ４００によって形成されるＦＩの隣接疎水性ポケット中に位置する（図５Ｂ参照（左のパネル：Ｉ１９７及びＩ２１９は、残基Ｗ３９３、Ｐ４０２、Ｌ４０４、Ｉ４０７、Ｖ４０８、Ｉ４０９、及びＹ４１１によって形成される上側の疎水性ポケット中に位置するのに対し、Ｌ２２４は、残基Ｉ３５７、Ｇ３６２、Ｉ３６３、Ａ３６０、Ｖ３９６、Ｖ３９７、Ｗ３９９及びＩ４００によって形成される下側の疎水性ポケット中に位置する。右のパネル：左のパネルに示される疎水性ポケットを再表示し、丸印を付ける））。したがって、これらの残基の疎水性相互作用は、ＦＨ－ＦＩについて以前に報告されたようにキメラ及びＦＩの安定性を増強するために重要なように見える。さらに、リンカー領域に位置する残基Ｋ２１６及びＧｌｕ２２１は、塩橋相互作用を経由してＦＩの残基Ｄ４３８及びＫ３５８と相互作用する。側鎖の配向がＦＩ界面から離れているので、変異体残基Ｋ１９９及びＫ２２２は相互作用を示さない。これは、Ｋ１９９からＳｅｒへの復帰（ｍｕｌｔｉ－５における）がなぜＣＦＡに有意な効果を及ぼさないかを説明している。しかし、Ｓ１９９残基は、ＢｂのＶＷＡドメインのα７－βＦループ及びα６－βＦループとの接触に関して高いＢＳＡスコアを有する（図７Ｂ参照）。モデル化構造Ｃ３ｂ－Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４－Ｂｂ複合体中のキメラとＣ３ｂ及びＢｂとの界面を、タンパク質界面解析プログラムPISA、www.ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/pistart.htmlによって分析した。Ｃ３ｂ（Ａ）及びＢｂ（Ｂ）の界面にある、Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４キメラのＤ２－Ｄ３ドメイン中の残基を、縦線（埋没表面積（ＢＳＡ）スコアを示す）で示す。キメラのこれらの残基と相互作用するＢｂ及びＣ３ｂの領域もまた縦棒の上に印する。星印は、変異誘発によってＤＡＡに重要であると以前に同定され、したがってＫ１９９Ｓ復帰後のＡＰ－ＤＡＡにおける大きな増加を説明している可能性がある残基を表す。興味深いことに、ＦＩのＤ４０３は、Ｄ３のＫ１９５及びＭ３のＳ２１４と水素結合を形成することによって架橋残基として作用するが、キメラのＤ３－Ｍ３ドメインの配位に関与し得る（図１４Ｃ参照（注：Ｌｙｓ１９５はＦＩのＡｓｐ４０３と電荷相互作用を示し、この相互作用は、それとＭ３ドメインのＳｅｒ２１４との水素結合によって助けとなる。Ｖ１７８は、ＦＩのＴｒｐ３９９とπ－アルキル結合を示す））。そのうえ、残基Ｅ１７９及びＥ１７７はＦＩの残基Ｒ４８０と塩橋ネットワークを形成する。キメラの残基Ｖ１７８は、ＦＩのＷ３９９とπ－アルキル相互作用を形成する（図１４Ｃ参照）。全体的に見て、キメラのリンカー及び関連領域とＦＩとの相互作用パターンは、本発明者らの実験研究と一致する。ｍｕｌｔｉ－４変異体とＣ３ｂドメインとの相互作用を図１４Ａ（拡大図は、α’－ＮＴ、ＭＧ６、ＭＧ２、ＣＵＢ、ＭＧ１、及びＴＥＤドメイン中の相互作用残基を示す）及び図１４Ｂ（ｍｕｌｔｉ－４変異体のＣ３ｂ相互作用残基は、それが相互作用するＣ３ｂドメインに従う）に示す。ドメイン特異的相互作用は、ＤＡＦ及びＭＣＰに類似していることが見出された。
実施例５． ＤＡＦ、ＭＣＰ、ＤＡＦ－ＭＣＰキメラ並びにＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４及びＣＲ１ ＬＨＲ－Ａ（ＣＣＰ１－３）の置換変異体の構築 － ヒトＤＡＦ（Ｄ１－Ｄ４）及びＭＣＰ（Ｍ１－Ｍ４）をそれらの各ｃＤＮＡから増幅させ、酵母発現ベクターｐＰＩＣＺα（Invitrogen, Carlsbad, CA）及び細菌発現ベクターｐＥＴ－２８ｂ中にクローニングした。記載された遺伝子スプライシング及びオーバーラップ伸長法を用いてＤＡＦ－ＭＣＰキメラを構築し、次いで酵母発現ベクターｐＰＩＣＺα又は細菌発現ベクターｐＥＴ－２８ｂ中にクローニングした。ＣＲ１ ＬＨＲ－Ａ（ＣＣＰ１－３）をＣＲ１ ｃＤＮＡから増幅させ、その発現のためにｐＥＴ－２８ｂ中にクローニングした。ＤＡＦ、ＭＣＰ及びＣＲ１の必要領域を増幅させるために使用されるプライマーセットを表Ｓ３に示す。Quick-change site-directed mutagenesis kit II（Stratagene, La Jolla, CA）を使用してＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４及びＣＲ１ ＬＨＲ－Ａ（ＣＣＰ１－３）の置換変異体を構築し、細菌発現ベクターｐＥＴ－２８ｂ中にクローニングした。部位特異的変異誘発のために利用された変異原性プライマーを表Ｓ３及びＳ４に挙げる。ＤＡＦ ｃＤＮＡからＤＡＦ欠失変異体Ｄ２－Ｄ３を増幅させ、ｐＥＴ－２８ｂ中にクローニングした；使用したプライマーセットを表Ｓ３に挙げる。クローニング後、ＤＮＡシークエンシング（1st Base Laboratories Sdn Bhd, Malaysia）によってすべての構築物を検証した。発現のために、ｐＰＩＣＺα中にクローニングされたタンパク質／変異体を製造業者のプロトコルによりピキア パストリスに組み入れ、一方、ｐＥＴ－２８ｂ中にクローニングされたものを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中に形質転換した。
実施例６． ＤＡＦ、ＭＣＰ、ＤＡＦ－ＭＣＰキメラ及びＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４の置換変異体の発現及び精製
記載のようにヒトＤＡＦ、ＭＣＰ及びＤＡＦ－ＭＣＰキメラ、すなわちＤ２Ｍ２－４（Ｄ２－Ｄ３の間のＤＡＦリンカーを含むキメラ）及びＤ２Ｍ２－４－ＭＬ（Ｍ１－Ｍ２の間のリンカーを含むキメラ）をP.パストリスに発現させ、下記のように精製した。最初に、発現されたタンパク質をすべて限外濾過によって濃縮し、８０％硫酸アンモニウムを使用して氷上で沈殿させた。次いで、得られたペレットをＰＢＳ中に溶解させ、さらに処理した。ＤＡＦの精製のために、ＰＢＳ中に溶解されたペレットを５００mM ＮａＣｌと混合し、５００mM ＮａＣｌを含有するＰＢＳで予め平衡化したDEAE-Sephacelカラム（Sigma, St. Louis, Mo.）上に負荷した。次いで、得られた通過液を緩衝液交換のためにPD-10カラム（GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA）に通し、２０mMトリス、ｐＨ８．０中のMono Qカラムに負荷した。０～５００mM ＮａＣｌの直線勾配に通すことによって、結合したＤＡＦの溶出を達成した。ＭＣＰ及びキメラ（Ｄ２Ｍ２－４－ＤＬ及びＤ２Ｍ２－４－ＭＬ）の精製のために、ＰＢＳ中に溶解したペレットを１０mMリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４との緩衝液交換に供し、同じ緩衝液中のDEAE-Sephacelカラムに負荷した。０～５００mM ＮａＣｌの直線勾配をかけて、結合したタンパク質を溶出させた。ＭＣＰ又はそれぞれのキメラを含有する画分をプールし、２０mM Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０に交換し、Mono Qカラムに負荷し、０～５００mM ＮａＣｌの直線勾配をかけて溶出させた。上記精製のすべての溶出画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び適切な抗体を使用するウエスタンブロット分析に供した（図１５Ａ及び１５Ｂ参照）。精製されたタンパク質すべてをＰＢＳ中で透析し、限外濾過によって濃縮し；すべてのタンパク質の純度はＳＤＳ－ＰＡＧＥによる決定で９５％を超えた（図１５Ａ中、（ｉ）ＤＡＦ、ＭＣＰ及びＤＡＦ－ＭＣＰキメラ。（ｉｉ）Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４の単一残基変異体。（ｉｉｉ）Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４の多残基変異体 － ｍｕｌｔｉ－１、ｍｕｌｔｉ－２、ｍｕｌｔｉ－３、ｍｕｌｔｉ－４及びｍｕｌｔｉ－５と共にＣＲ１ ＬＨＲ－Ａ（ＣＣＰ１－３）及びその二重変異体ＣＲ１ ＬＨＲ－Ａ（ＣＣＰ１－３ Ｄ１０９Ｎ／Ｅ１１６Ｋ）（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で予め平衡化したSuperose-12カラム（GE Healthcare Life Sciences）にタンパク質を負荷した。使用したゲル濾過標準（Bio-Rad）は、ａ、サイログロブリン（６７０，０００Da）；ｂ、ガンマグロブリン（１５８，０００Da）；ｃ、卵白アルブミン（４４，０００Da）；ｄ、ミオグロビン（１７，０００Da）；ｅ、ビタミンＢ－１２（１，３５０Da）であった）、図１５Ｂ中、（ｉ）ＤＡＦ、ＭＣＰ及びＤＡＦ－ＭＣＰキメラ。（ｉｉ）Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４の単一及び多残基（ｍｕｌｔｉ－１）変異体。（ｉｉｉ）Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４の多残基変異体。（ｉｖ）ＣＲ１ ＬＨＲ－Ａ ＣＣＰ（１－３）及びその二重変異体ＣＲ１ ＬＨＲ－Ａ（ＣＣＰ１－３ Ｄ１０９Ｎ／Ｅ１１６Ｋ）（タンパク質はすべて、還元（Ｒ）及び非還元（ＮＲ）条件下で９％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上を泳動させ、クマシーブルー染色した））。
記載のようにヒトＤＡＦ、ＭＣＰ及びＤＡＦ－ＭＣＰキメラ、すなわちＤ２Ｍ２－４（Ｄ２－Ｄ３の間のＤＡＦリンカーを含むキメラ）及びＤ２Ｍ２－４－ＭＬ（Ｍ１－Ｍ２の間のリンカーを含むキメラ）をP.パストリスに発現させ、下記のように精製した。最初に、発現されたタンパク質をすべて限外濾過によって濃縮し、８０％硫酸アンモニウムを使用して氷上で沈殿させた。次いで、得られたペレットをＰＢＳ中に溶解させ、さらに処理した。ＤＡＦの精製のために、ＰＢＳ中に溶解されたペレットを５００mM ＮａＣｌと混合し、５００mM ＮａＣｌを含有するＰＢＳで予め平衡化したDEAE-Sephacelカラム（Sigma, St. Louis, Mo.）上に負荷した。次いで、得られた通過液を緩衝液交換のためにPD-10カラム（GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA）に通し、２０mMトリス、ｐＨ８．０中のMono Qカラムに負荷した。０～５００mM ＮａＣｌの直線勾配に通すことによって、結合したＤＡＦの溶出を達成した。ＭＣＰ及びキメラ（Ｄ２Ｍ２－４－ＤＬ及びＤ２Ｍ２－４－ＭＬ）の精製のために、ＰＢＳ中に溶解したペレットを１０mMリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４との緩衝液交換に供し、同じ緩衝液中のDEAE-Sephacelカラムに負荷した。０～５００mM ＮａＣｌの直線勾配をかけて、結合したタンパク質を溶出させた。ＭＣＰ又はそれぞれのキメラを含有する画分をプールし、２０mM Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０に交換し、Mono Qカラムに負荷し、０～５００mM ＮａＣｌの直線勾配をかけて溶出させた。上記精製のすべての溶出画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び適切な抗体を使用するウエスタンブロット分析に供した（図１５Ａ及び１５Ｂ参照）。精製されたタンパク質すべてをＰＢＳ中で透析し、限外濾過によって濃縮し；すべてのタンパク質の純度はＳＤＳ－ＰＡＧＥによる決定で９５％を超えた（図１５Ａ中、（ｉ）ＤＡＦ、ＭＣＰ及びＤＡＦ－ＭＣＰキメラ。（ｉｉ）Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４の単一残基変異体。（ｉｉｉ）Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４の多残基変異体 － ｍｕｌｔｉ－１、ｍｕｌｔｉ－２、ｍｕｌｔｉ－３、ｍｕｌｔｉ－４及びｍｕｌｔｉ－５と共にＣＲ１ ＬＨＲ－Ａ（ＣＣＰ１－３）及びその二重変異体ＣＲ１ ＬＨＲ－Ａ（ＣＣＰ１－３ Ｄ１０９Ｎ／Ｅ１１６Ｋ）（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で予め平衡化したSuperose-12カラム（GE Healthcare Life Sciences）にタンパク質を負荷した。使用したゲル濾過標準（Bio-Rad）は、ａ、サイログロブリン（６７０，０００Da）；ｂ、ガンマグロブリン（１５８，０００Da）；ｃ、卵白アルブミン（４４，０００Da）；ｄ、ミオグロビン（１７，０００Da）；ｅ、ビタミンＢ－１２（１，３５０Da）であった）、図１５Ｂ中、（ｉ）ＤＡＦ、ＭＣＰ及びＤＡＦ－ＭＣＰキメラ。（ｉｉ）Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４の単一及び多残基（ｍｕｌｔｉ－１）変異体。（ｉｉｉ）Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４の多残基変異体。（ｉｖ）ＣＲ１ ＬＨＲ－Ａ ＣＣＰ（１－３）及びその二重変異体ＣＲ１ ＬＨＲ－Ａ（ＣＣＰ１－３ Ｄ１０９Ｎ／Ｅ１１６Ｋ）（タンパク質はすべて、還元（Ｒ）及び非還元（ＮＲ）条件下で９％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上を泳動させ、クマシーブルー染色した））。
ヒトＤＡＦ及びＭＣＰをまた大腸菌に発現させた。大腸菌に発現させた他の変異体は、ＤＡＦ変異体Ｄ２Ｄ３、ＤＡＦ－ＭＣＰキメラＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４及びＤ２Ｄ３Ｄ４Ｍ４、並びにＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４の置換変異体を含む。ＣＲ１ ＬＨＲ－Ａ（ＣＣＰ１－３）及びその変異体ＣＲ１ ＬＨＲ－Ａｍｕｔ（ＣＣＰ１－３、Ｄ１０９Ｎ／Ｅ１１６Ｋ）もまた大腸菌に発現させた。本質的に以前に記載されたようにこれらのタンパク質の発現を行った。これらのタンパク質は封入体中に存在したので、簡潔には、尿素の存在下でNi-NTAカラムを使用してこれらのタンパク質を精製した。次いで、迅速希釈法によってそれらをリフォールディングに供し、ゲル濾過カラム（Superose 12；GE Healthcare Life Sciences）に通過させた。サイズ排除クロマトグラフィープロファイルでの単分散集団の存在並びに還元及び非還元条件下のＳＤＳ－ＰＡＧＥでの移動度の差（ジスルフィド結合形成の指標）により判定されたように、すべてのタンパク質は適正にリフォールディングした（図１５Ａ及び１５Ｂ）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって判定したとき、大腸菌に発現されたすべてのタンパク質の純度は９５％を超えた。
実施例７． ＣＰ及びＡＰ Ｃ３コンバターゼ崩壊促進活性のアッセイ
以前に記載されたように溶血アッセイを使用してＤＡＦ、ＤＡＦ－ＭＣＰキメラ及びＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４の変異体の古典的／レクチン及び代替経路Ｃ３コンバターゼ崩壊促進活性を測定した。簡潔には、精製補体成分を使用して赤血球上にそれぞれのコンバターゼを形成させ、制御因子の存在下又は非存在下で崩壊させた。赤血球を、４０mM ＥＤＴＡを含有するモルモット血清（Ｃ３～Ｃ９の供給源）と共にインキュベートし、溶解を測定することによって残りのコンバターゼの活性を推定した。阻害剤の非存在下で起こった溶解と等しいＣ３コンバターゼ活性を１００％と見なすことによって、得られたデータを規準化した。次いで、得られた活性を濃度に対してプロットして、酵素活性の５０％を阻害するために必要とされる阻害剤濃度（ＩＣ５０）を決定した。各阻害剤を様々な濃度で試験して、それが阻害する濃度範囲を決定し、次いで、３つの特定濃度で各阻害剤を試験して、以前に行ったようにＩＣ５０を決定した（図２、４、１１）。
以前に記載されたように溶血アッセイを使用してＤＡＦ、ＤＡＦ－ＭＣＰキメラ及びＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４の変異体の古典的／レクチン及び代替経路Ｃ３コンバターゼ崩壊促進活性を測定した。簡潔には、精製補体成分を使用して赤血球上にそれぞれのコンバターゼを形成させ、制御因子の存在下又は非存在下で崩壊させた。赤血球を、４０mM ＥＤＴＡを含有するモルモット血清（Ｃ３～Ｃ９の供給源）と共にインキュベートし、溶解を測定することによって残りのコンバターゼの活性を推定した。阻害剤の非存在下で起こった溶解と等しいＣ３コンバターゼ活性を１００％と見なすことによって、得られたデータを規準化した。次いで、得られた活性を濃度に対してプロットして、酵素活性の５０％を阻害するために必要とされる阻害剤濃度（ＩＣ５０）を決定した。各阻害剤を様々な濃度で試験して、それが阻害する濃度範囲を決定し、次いで、３つの特定濃度で各阻害剤を試験して、以前に行ったようにＩＣ５０を決定した（図２、４、１１）。
実施例８． Ｃ３ｂ及びＣ４ｂ補因子活性のアッセイ
各制御因子をＣ３ｂ（記載されたように精製）又はＣ４ｂ（Complement Technology, Inc., Tyler, TX）及びセリンプロテアーゼＩ因子と共にＰＢＳ中でインキュベートし、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂの切断を測定することによってＭＣＰ、ＤＡＦ－ＭＣＰキメラ及びＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４の変異体の補因子活性を測定した。簡潔には、合計反応体積７５μl中、Ｃ３ｂ（１０μｇ）又はＣ４ｂ（１５μｇ）を、１μM（Ｃ３ｂについて）又は２μM（Ｃ４ｂについて）制御因子及びＩ因子 ２５０ng（Ｃ３ｂについて）又は５００ng（Ｃ４ｂについて）と混合し、３７℃でインキュベートした。次いで、表示の期間に１５μlのアリコットを採取し、ＤＴＴを含有する試料緩衝液と混合し、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂのα’鎖の切断を決定するために９％（Ｃ３ｂについて）又は１０％（Ｃ４ｂについて）のいずれかのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で泳動させた。Quantity oneソフトウェア（Bio-Rad）を使用するデンシトメトリー分析によって、切断されたα’鎖のパーセンテージを計算した；α’鎖の量をβ鎖（負荷対照）に対して規準化した。時間に対するＣ３ｂ／Ｃ４ｂのα’鎖の切断パーセントのプロットは、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂのα’鎖の５０％切断を提供した。≧３倍の活性差を有意と見なした。表Ｓ１）。
各制御因子をＣ３ｂ（記載されたように精製）又はＣ４ｂ（Complement Technology, Inc., Tyler, TX）及びセリンプロテアーゼＩ因子と共にＰＢＳ中でインキュベートし、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂの切断を測定することによってＭＣＰ、ＤＡＦ－ＭＣＰキメラ及びＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４の変異体の補因子活性を測定した。簡潔には、合計反応体積７５μl中、Ｃ３ｂ（１０μｇ）又はＣ４ｂ（１５μｇ）を、１μM（Ｃ３ｂについて）又は２μM（Ｃ４ｂについて）制御因子及びＩ因子 ２５０ng（Ｃ３ｂについて）又は５００ng（Ｃ４ｂについて）と混合し、３７℃でインキュベートした。次いで、表示の期間に１５μlのアリコットを採取し、ＤＴＴを含有する試料緩衝液と混合し、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂのα’鎖の切断を決定するために９％（Ｃ３ｂについて）又は１０％（Ｃ４ｂについて）のいずれかのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で泳動させた。Quantity oneソフトウェア（Bio-Rad）を使用するデンシトメトリー分析によって、切断されたα’鎖のパーセンテージを計算した；α’鎖の量をβ鎖（負荷対照）に対して規準化した。時間に対するＣ３ｂ／Ｃ４ｂのα’鎖の切断パーセントのプロットは、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂのα’鎖の５０％切断を提供した。≧３倍の活性差を有意と見なした。表Ｓ１）。
実施例９． 表面プラズモン共鳴測定
ＤＡＦ、ＭＣＰ、ＤＡＦ－ＭＣＰキメラ及びＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４の置換変異体のＣ３ｂ及びＣ４ｂに対する結合測定をBiacore 2000（Biacore AB, Uppsala, Sweden）で行った。最初に、EZ-Link ＰＥＯ－マレイミド活性化ビオチン（Pierce, Rockford, IL）を使用して標的タンパク質の遊離ＳＨ基でビオチン化された標的タンパク質Ｃ３ｂ及びＣ４ｂを、ストレプトアビジンチップ（Sensor Chip SA；Biacore AB）のフローセル２及び３に固定化した。ビオチン化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が固定化されたフローセル－１は、対照フローセルとして役立てた。次に、ＰＢＳ－Ｔ中の各分析物（ＤＡＦ、ＭＣＰ及びＤＡＦ－ＭＣＰキメラ及びＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４の変異体）を５０μl/min及び２５℃でチップ上に流して結合を測定した。分析物の結合及び解離をそれぞれ１２０及び１８０秒間測定し、０．２Ｍ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．５の３０ｓパルスによってチップの再生を達成した。標的タンパク質が固定化されたフローセルデータから対照フローセルデータを差し引くことによって特異的結合応答を導出した（図２Ｃ及び６Ｂ）。
ＤＡＦ、ＭＣＰ、ＤＡＦ－ＭＣＰキメラ及びＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４の置換変異体のＣ３ｂ及びＣ４ｂに対する結合測定をBiacore 2000（Biacore AB, Uppsala, Sweden）で行った。最初に、EZ-Link ＰＥＯ－マレイミド活性化ビオチン（Pierce, Rockford, IL）を使用して標的タンパク質の遊離ＳＨ基でビオチン化された標的タンパク質Ｃ３ｂ及びＣ４ｂを、ストレプトアビジンチップ（Sensor Chip SA；Biacore AB）のフローセル２及び３に固定化した。ビオチン化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が固定化されたフローセル－１は、対照フローセルとして役立てた。次に、ＰＢＳ－Ｔ中の各分析物（ＤＡＦ、ＭＣＰ及びＤＡＦ－ＭＣＰキメラ及びＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４の変異体）を５０μl/min及び２５℃でチップ上に流して結合を測定した。分析物の結合及び解離をそれぞれ１２０及び１８０秒間測定し、０．２Ｍ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．５の３０ｓパルスによってチップの再生を達成した。標的タンパク質が固定化されたフローセルデータから対照フローセルデータを差し引くことによって特異的結合応答を導出した（図２Ｃ及び６Ｂ）。
実施例１０． ＣＰ、ＡＰ及びＬＰに対する効果の測定のためのＥＬＩＳＡ
Wieslab補体系スクリーニングＥＬＩＳＡアッセイ（Euro-Diagnostica, Malmo, Sweden）を採用して、ＭＣＰ、ＤＡＦ、ＣＲ１ ＬＨＲ－Ａ（ＣＣＰ１－３）及びＣＲ１ ＬＨＲ－Ａｍｕｔ（ＣＣＰ１－３、Ｄ１０９Ｎ／Ｅ１１６Ｋ）と比べたｍｕｌｔｉ－５変異体の相対的補体経路特異的阻害活性を試験した。ここで、各被験タンパク質の段階濃度を経路特異的な希釈剤中に製造し、マニュアルに詳述されるように正常ヒト血清濃度の一定パーセンテージと混合した。次いで、経路特異的な活性化因子でコーティングされたマイクロタイターウェルに反応混合物（１００μl）を添加し、３７℃で６０分間保った。その後、キット内に供給される洗浄溶液でウェルを３回洗浄し、アルカリホスファターゼで標識されたＣ５ｂ－９に対する抗体（１００μl）と共に室温で３０分間インキュベートした。ウェルを洗浄溶液でさらに３回洗浄し、基質（１００μl）と共に室温で３０分間インキュベートした。マイクロプレートリーダーを用いて４０５nmで吸光度を読み取った。制御タンパク質の存在下の血清活性レベルを、タンパク質非存在下で測定された活性に対するパーセントとして表現した（図１２Ｃ）。
Wieslab補体系スクリーニングＥＬＩＳＡアッセイ（Euro-Diagnostica, Malmo, Sweden）を採用して、ＭＣＰ、ＤＡＦ、ＣＲ１ ＬＨＲ－Ａ（ＣＣＰ１－３）及びＣＲ１ ＬＨＲ－Ａｍｕｔ（ＣＣＰ１－３、Ｄ１０９Ｎ／Ｅ１１６Ｋ）と比べたｍｕｌｔｉ－５変異体の相対的補体経路特異的阻害活性を試験した。ここで、各被験タンパク質の段階濃度を経路特異的な希釈剤中に製造し、マニュアルに詳述されるように正常ヒト血清濃度の一定パーセンテージと混合した。次いで、経路特異的な活性化因子でコーティングされたマイクロタイターウェルに反応混合物（１００μl）を添加し、３７℃で６０分間保った。その後、キット内に供給される洗浄溶液でウェルを３回洗浄し、アルカリホスファターゼで標識されたＣ５ｂ－９に対する抗体（１００μl）と共に室温で３０分間インキュベートした。ウェルを洗浄溶液でさらに３回洗浄し、基質（１００μl）と共に室温で３０分間インキュベートした。マイクロプレートリーダーを用いて４０５nmで吸光度を読み取った。制御タンパク質の存在下の血清活性レベルを、タンパク質非存在下で測定された活性に対するパーセントとして表現した（図１２Ｃ）。
実施例１１． Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４キメラのモデル化
ＤＡＦ（UniProt ID: P08174）及びＭＣＰ（UniProt ID: P15529）の配列をUniProtタンパク質配列データベースから検索した。ＤＡＦからＤ２Ｄ３の配列を抽出し、ＭＣＰからＭ３Ｍ４の配列を抽出して、キメラ配列を構築した。ＤＡＦ及びＭＣＰの構造座標をそれぞれＣ３ｂ－ＤＡＦ（PDB id: 5FOA）及びＣ３ｂ－ＭＣＰ（PDB id: 5FO8）の共晶構造から分離した。Discovery Studio v 3.5; Dassault Systemes BIOVIA 2016）に実装されるModeller 9.11を使用して、ＤＡＦ及びＭＣＰのテンプレート構造に基づくキメラ（Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４）の構造をモデル化した。その後、ループモデル化オプションを使用して、ループ領域をモデル化した。ＤＯＰＥスコアに基づいて唯一の最良のモデルを選択した。PROCHECK及びPROSA-Webサーバーを使用して、予測されたモデルの立体化学的品質を評価した。次いで、Discoveryスタジオを使用して、キメラの天然残基を本文に記載される実験的証拠から得られた変異体残基に変異させた。次いで、キメラの個別の変異体構造を変異エネルギー及びその安定性の計算に供した（図５）。
ＤＡＦ（UniProt ID: P08174）及びＭＣＰ（UniProt ID: P15529）の配列をUniProtタンパク質配列データベースから検索した。ＤＡＦからＤ２Ｄ３の配列を抽出し、ＭＣＰからＭ３Ｍ４の配列を抽出して、キメラ配列を構築した。ＤＡＦ及びＭＣＰの構造座標をそれぞれＣ３ｂ－ＤＡＦ（PDB id: 5FOA）及びＣ３ｂ－ＭＣＰ（PDB id: 5FO8）の共晶構造から分離した。Discovery Studio v 3.5; Dassault Systemes BIOVIA 2016）に実装されるModeller 9.11を使用して、ＤＡＦ及びＭＣＰのテンプレート構造に基づくキメラ（Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４）の構造をモデル化した。その後、ループモデル化オプションを使用して、ループ領域をモデル化した。ＤＯＰＥスコアに基づいて唯一の最良のモデルを選択した。PROCHECK及びPROSA-Webサーバーを使用して、予測されたモデルの立体化学的品質を評価した。次いで、Discoveryスタジオを使用して、キメラの天然残基を本文に記載される実験的証拠から得られた変異体残基に変異させた。次いで、キメラの個別の変異体構造を変異エネルギー及びその安定性の計算に供した（図５）。
実施例１２． 三元ＤＡＡ複合体（Ｃ３ｂ－Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４－Ｂｂ）の構築及びその界面解析
ＤＡＦ－Ｃ３ｂ（PDB id: 5FOA）及びＣ３ｂＢｂ（PDB id: 2WIN）のテンプレート構造をキメラＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４の上記モデル化構造と共に使用することによって、制御因子としてのキメラＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４とのＤＡＡ三元複合体をモデル化した。簡潔には、Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４キメラをＣ３ｂ－ＤＡＦ構造中のＤＡＦと重ね合わせて、Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４－Ｃ３ｂ複合体を作った。次いで、Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４－Ｃ３ｂ及びＣ３ｂＢｂをＣ３ｂ分子と一緒に重ね合わせて、Ｃ３ｂ－Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４－Ｂｂの三元モデルを生成した。最急降下法によって最終的な三元複合体をエネルギー最小化に供した。Ｃ３ｂとＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４との間及びＢｂとＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４との間の相互作用を理解するために、PISA（タンパク質界面解析プログラム、www.ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/pistart.html）によって三元複合体の界面解析を行った（図７）。
ＤＡＦ－Ｃ３ｂ（PDB id: 5FOA）及びＣ３ｂＢｂ（PDB id: 2WIN）のテンプレート構造をキメラＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４の上記モデル化構造と共に使用することによって、制御因子としてのキメラＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４とのＤＡＡ三元複合体をモデル化した。簡潔には、Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４キメラをＣ３ｂ－ＤＡＦ構造中のＤＡＦと重ね合わせて、Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４－Ｃ３ｂ複合体を作った。次いで、Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４－Ｃ３ｂ及びＣ３ｂＢｂをＣ３ｂ分子と一緒に重ね合わせて、Ｃ３ｂ－Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４－Ｂｂの三元モデルを生成した。最急降下法によって最終的な三元複合体をエネルギー最小化に供した。Ｃ３ｂとＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４との間及びＢｂとＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４との間の相互作用を理解するために、PISA（タンパク質界面解析プログラム、www.ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/pistart.html）によって三元複合体の界面解析を行った（図７）。
実施例１３． 三元複合体（Ｃ３ｂ－ｍｕｌｔｉ－４変異体－ＦＩ）の構築及びＭＤシミュレーション
Ｃ３ｂ－ＦＨ－ＦＩ（PDB id: 5O32）の三元複合体をＰＤＢから検索し、ｍｕｌｔｉ－４変異体のモデルを複合体のＦＨ分子と重ね合わせた。ＦＨの座標を取り出し、ＵＣＳＦキメラを使用してＣ３ｂ－ｍｕｌｔｉ－４変異体－ＦＩの三元複合体を生成した。次いで、生成したＣ３ｂ－ｍｕｌｔｉ－４変異体－ＦＩの三元複合体を、GROMACS 5.0.4パッケージを使用してＯＰＬＳ－ＡＡ力場を用いたＭＤシミュレーションに供した。単一点電荷（ＳＰＣ）水モデルを用いてタンパク質を溶媒和させ、それをＮＡ＋対イオンで中和した。位置拘束をタンパク質に適用して最急降下エネルギー最小化に続くＮＶＴアンサンブルにおける５００ps平衡化によって溶媒和構造を最小化した。続いて、ＮＰＴアンサンブルを用いてシステムを２nsの間平衡化した。最後に、各三元複合体系をＮＰＴアンサンブルでの５０nsの生産運転に供した。周期的境界条件を用いるシミュレーション全体で２fsの時間ステップを使用した。LINCSアルゴリズムを使用して、水素原子へのすべての結合を拘束して２fsのタイムステップを許した。PMEアルゴリズムをカットオフ距離１．２nmで使用して長距離静電相互作用を計算した。GROMACSに実装されたg_clusterツールを使用してＲＭＳＤカットオフ２．０Åで軌道全体に構造クラスタリングを行った。単一の代表的な立体構造を各システムの最多クラスターから抽出した。ＶＭＤを使用して軌道を解析し、Discovery Studio；Dassault Systemes BIOVIA 2016）を使用してシミュレーション画像を生成した（図５及び１３Ａ）。
Ｃ３ｂ－ＦＨ－ＦＩ（PDB id: 5O32）の三元複合体をＰＤＢから検索し、ｍｕｌｔｉ－４変異体のモデルを複合体のＦＨ分子と重ね合わせた。ＦＨの座標を取り出し、ＵＣＳＦキメラを使用してＣ３ｂ－ｍｕｌｔｉ－４変異体－ＦＩの三元複合体を生成した。次いで、生成したＣ３ｂ－ｍｕｌｔｉ－４変異体－ＦＩの三元複合体を、GROMACS 5.0.4パッケージを使用してＯＰＬＳ－ＡＡ力場を用いたＭＤシミュレーションに供した。単一点電荷（ＳＰＣ）水モデルを用いてタンパク質を溶媒和させ、それをＮＡ＋対イオンで中和した。位置拘束をタンパク質に適用して最急降下エネルギー最小化に続くＮＶＴアンサンブルにおける５００ps平衡化によって溶媒和構造を最小化した。続いて、ＮＰＴアンサンブルを用いてシステムを２nsの間平衡化した。最後に、各三元複合体系をＮＰＴアンサンブルでの５０nsの生産運転に供した。周期的境界条件を用いるシミュレーション全体で２fsの時間ステップを使用した。LINCSアルゴリズムを使用して、水素原子へのすべての結合を拘束して２fsのタイムステップを許した。PMEアルゴリズムをカットオフ距離１．２nmで使用して長距離静電相互作用を計算した。GROMACSに実装されたg_clusterツールを使用してＲＭＳＤカットオフ２．０Åで軌道全体に構造クラスタリングを行った。単一の代表的な立体構造を各システムの最多クラスターから抽出した。ＶＭＤを使用して軌道を解析し、Discovery Studio；Dassault Systemes BIOVIA 2016）を使用してシミュレーション画像を生成した（図５及び１３Ａ）。
実施例１４． Ｄ２Ｍ２－４の機能獲得型変異体の構築及びクローニング
Ｄ２Ｍ２－４キメラ（ＤＡＦ－リンカーを有する）の構築及びその生化学特徴付けによって、この分子が補助因子及び崩壊促進活性の両方を有することが示された。さらに、この分子は最適なＣ３ｂ－ＣＦＡ及びＣ４ｂ－ＣＦＡを示したものの、部分的なＣＰ－ＤＡＡ及び低下したＡＰ－ＤＡＡだけを示した。しかし全体的に見て、この分子は３つの経路すべて（ＡＰ／ＣＰ／ＬＰ）に作用し、その阻害活性は、ＬＰ及びＡＰについてＤＡＦと同等であり；この分子はＣＰについてＤＡＦと比較して約３．７倍低い阻害活性を示した。したがって、Ｄ２Ｍ２－４分子はまた、最適なＣＦＡ及びＤＡＡを有する分子を生成するための優れた候補であった。
Ｄ２Ｍ２－４キメラ（ＤＡＦ－リンカーを有する）の構築及びその生化学特徴付けによって、この分子が補助因子及び崩壊促進活性の両方を有することが示された。さらに、この分子は最適なＣ３ｂ－ＣＦＡ及びＣ４ｂ－ＣＦＡを示したものの、部分的なＣＰ－ＤＡＡ及び低下したＡＰ－ＤＡＡだけを示した。しかし全体的に見て、この分子は３つの経路すべて（ＡＰ／ＣＰ／ＬＰ）に作用し、その阻害活性は、ＬＰ及びＡＰについてＤＡＦと同等であり；この分子はＣＰについてＤＡＦと比較して約３．７倍低い阻害活性を示した。したがって、Ｄ２Ｍ２－４分子はまた、最適なＣＦＡ及びＤＡＡを有する分子を生成するための優れた候補であった。
したがって、Ｄ２Ｍ２－４キメラのＡＰ－ＤＡＡの最適化を探究した。ここで暗黙の仮定は、ＣＦＡ及びＤＡＡについての機能的部位が非重複的に４－ＣＣＰ構造にわたり空間的に保存されていることであった。キメラのＤ２、Ｍ２及びＭ３ドメイン中の１３残基を置換した。これらの残基は、ＤＡＦ及び他のＲＣＡ制御因子におけるＡＰ－ＤＡＡに重要であることが示された（図１６）。具体的には、ヒト制御因子及びウイルス制御因子における変異誘発が本発明者らの変異誘発研究を指導した（図１６Ｃ）。単一アミノ酸置換変異体の生成を部位特異的変異誘発アプローチによって達成した。１３個の置換の位置及び変異の基盤を図１６Ａに示す。
変異体を生成するために、ｐＧＥＭＴにクローニングされたＤ２Ｍ２－４構築物に最初に変異を導入した。Stratageneから市販されているQuick-change site-directed mutagenesis kit（Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４変異体の生成のために利用されたものと同じもの）を使用することによってこれらの変異を導入した。制限消化及びシークエンシングによって所望の変異を有するｐＧＥＭＴクローンを確認した。検証後、すべてのクローンをｐＥＴ－２８ｂ発現ベクター中にサブクローニングし、制限消化及びシークエンシングによって再検証した。
実施例１５． Ｄ２Ｍ２－４変異体の発現、精製およびリフォールディング
大腸菌ＢＬ２１細胞中にＤ２Ｍ２－４の機能獲得型変異体のｐＥＴクローンを形質転換し、発現のために誘導した。次いで、Ni-NTAカラムクロマトグラフィーに供することによって、尿素を使用する変性条件で発現された変異体を封入体から精製した。精製されたタンパク質を迅速希釈法によってリフォールディングし、ゲル濾過クロマトグラフィーに負荷して凝集物を除去し、それらの単分散集団を得た。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析から観察されたように、すべての変異体の純度は９５％を超えた（図１６Ｂ）。リフォールディングされた変異体のゲル濾過後、精製されたタンパク質は単分散集団を有すると予想され、それを検証するために、Superose 12ゲル濾過カラム（GE Healthcare Life Sciences）での分析運転を行った。すべてのタンパク質はゲル濾過で単分散集団を示した（プロファイルを図１７に示す）。
大腸菌ＢＬ２１細胞中にＤ２Ｍ２－４の機能獲得型変異体のｐＥＴクローンを形質転換し、発現のために誘導した。次いで、Ni-NTAカラムクロマトグラフィーに供することによって、尿素を使用する変性条件で発現された変異体を封入体から精製した。精製されたタンパク質を迅速希釈法によってリフォールディングし、ゲル濾過クロマトグラフィーに負荷して凝集物を除去し、それらの単分散集団を得た。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析から観察されたように、すべての変異体の純度は９５％を超えた（図１６Ｂ）。リフォールディングされた変異体のゲル濾過後、精製されたタンパク質は単分散集団を有すると予想され、それを検証するために、Superose 12ゲル濾過カラム（GE Healthcare Life Sciences）での分析運転を行った。すべてのタンパク質はゲル濾過で単分散集団を示した（プロファイルを図１７に示す）。
実施例１６ Ｄ２Ｍ２－４置換変異体の古典的経路崩壊促進活性の特徴付け
Ｄ２Ｍ２－４の上記単一アミノ酸置換変異体は、ＡＰ－ＤＡＡを増加させると予想された。しかし以前のデータから、本発明者は、ＤＡＦにおけるＡＰ－ＤＡＡに重要であると示されている残基のいくつかがＣＰ－ＤＡＡにも重要であることを知っている。したがって、いくつかの変異体でＣＰ－ＤＡＡ及びＡＰ－ＤＡＡにおける増加が予想された。１３個すべてのＤ２Ｍ２－４変異体のＣＰ－ＤＡＡを測定し、２つの変異体（Ｉ１３４Ａ及びＬ１６１Ｋ）が活性に約２倍の増加を示した。Ｉ１３４Ａ変異は、この位置でのＦからＡへの変異がそのＣＰ－ＤＡＡを１８３％増加させたことを示したＤＡＦ変異データに基づいた。他方、Ｌ１６１Ｋ変異は、この位置での正電荷の除去がそのＣＰ－ＤＡＡを低下させることを明らかにしたＤＡＦ及びKaposica変異データに基づいた（図１８）。これらの機能獲得型変異体とは別に、ＣＰ－ＤＡＡに増加を示さなかった又は減少を示したいくつかの変異体もまた存在し、これは、局所環境が相互作用に有意に影響することを示唆している。
Ｄ２Ｍ２－４の上記単一アミノ酸置換変異体は、ＡＰ－ＤＡＡを増加させると予想された。しかし以前のデータから、本発明者は、ＤＡＦにおけるＡＰ－ＤＡＡに重要であると示されている残基のいくつかがＣＰ－ＤＡＡにも重要であることを知っている。したがって、いくつかの変異体でＣＰ－ＤＡＡ及びＡＰ－ＤＡＡにおける増加が予想された。１３個すべてのＤ２Ｍ２－４変異体のＣＰ－ＤＡＡを測定し、２つの変異体（Ｉ１３４Ａ及びＬ１６１Ｋ）が活性に約２倍の増加を示した。Ｉ１３４Ａ変異は、この位置でのＦからＡへの変異がそのＣＰ－ＤＡＡを１８３％増加させたことを示したＤＡＦ変異データに基づいた。他方、Ｌ１６１Ｋ変異は、この位置での正電荷の除去がそのＣＰ－ＤＡＡを低下させることを明らかにしたＤＡＦ及びKaposica変異データに基づいた（図１８）。これらの機能獲得型変異体とは別に、ＣＰ－ＤＡＡに増加を示さなかった又は減少を示したいくつかの変異体もまた存在し、これは、局所環境が相互作用に有意に影響することを示唆している。
実施例１７． Ｄ２Ｍ２－４置換変異体の代替経路崩壊促進活性の特徴付け
以前に述べたように、これらの変異体を設計するための理論的根拠は、ＡＰ－ＤＡＡを増加させることであり、したがって、上に計画された部位特異的変異体はすべて、Ｄ２Ｍ２－４キメラのＡＰ－ＤＡＡの増強のためのものであった。これらの変異体のＡＰ－ＤＡＡを評価し、変異体のうち４種、すなわちＥ１３６Ｑ（Ｄ２）、Ｙ１０１Ｎ、Ｉ１３４Ａ及びＬ１６１Ｋは、ＡＰ Ｃ３コンバターゼ崩壊活性に有意な改善を示した（図１９）。したがって、Ｄ２Ｍ２－４キメラにおけるＡＰ－ＤＡＡの機能獲得を達成した。Ｅ１３６Ｑ（Ｄ２）及びＹ１０１Ｎ変異は、Ｄ２Ｍ２－４と比較してＡＰ－ＤＡＡに５．６倍及び７．２倍の増加を示した。類似の位置でのＤＡＦにおけるＥ／Ｑ交換がＤＡＡに１５４％の増加につながったので、ＤＡＦに基づいてＥ１３６Ｑ（Ｄ２）変異を作製した。これらのタンパク質における共線位置でのＮの存在がそれらのＡＰ－ＤＡＡに重要であることが示されたので、ＤＡＦ及びＣＲ１に関する変異誘発データに基づきＹ１０１Ｎ変異を作った。ＡＰ－ＤＡＡ変異におけるその他の２つの増加、Ｉ１３４Ａ及びＬ１６１Ｋもまた、Ｄ２Ｍ２－４と比較してＡＰ－ＤＡＡに６．７倍及び３．４倍の増加を示した。ＤＡＦ／Kaposicaに基づきこれらの変異を設計した。重要なことに、これらの変異もまたＣＰ－ＤＡＡに増加を示した。要約すると、これらの演習は、Ｄ２Ｍ２－４のＡＰ－ＤＡＡを有意に増強する４つの残基の同定をもたらした。しかし、これらの変異のどれも、ＤＡＦ分子のＡＰ－ＤＡＡに匹敵する強い増加を示さなかった。
以前に述べたように、これらの変異体を設計するための理論的根拠は、ＡＰ－ＤＡＡを増加させることであり、したがって、上に計画された部位特異的変異体はすべて、Ｄ２Ｍ２－４キメラのＡＰ－ＤＡＡの増強のためのものであった。これらの変異体のＡＰ－ＤＡＡを評価し、変異体のうち４種、すなわちＥ１３６Ｑ（Ｄ２）、Ｙ１０１Ｎ、Ｉ１３４Ａ及びＬ１６１Ｋは、ＡＰ Ｃ３コンバターゼ崩壊活性に有意な改善を示した（図１９）。したがって、Ｄ２Ｍ２－４キメラにおけるＡＰ－ＤＡＡの機能獲得を達成した。Ｅ１３６Ｑ（Ｄ２）及びＹ１０１Ｎ変異は、Ｄ２Ｍ２－４と比較してＡＰ－ＤＡＡに５．６倍及び７．２倍の増加を示した。類似の位置でのＤＡＦにおけるＥ／Ｑ交換がＤＡＡに１５４％の増加につながったので、ＤＡＦに基づいてＥ１３６Ｑ（Ｄ２）変異を作製した。これらのタンパク質における共線位置でのＮの存在がそれらのＡＰ－ＤＡＡに重要であることが示されたので、ＤＡＦ及びＣＲ１に関する変異誘発データに基づきＹ１０１Ｎ変異を作った。ＡＰ－ＤＡＡ変異におけるその他の２つの増加、Ｉ１３４Ａ及びＬ１６１Ｋもまた、Ｄ２Ｍ２－４と比較してＡＰ－ＤＡＡに６．７倍及び３．４倍の増加を示した。ＤＡＦ／Kaposicaに基づきこれらの変異を設計した。重要なことに、これらの変異もまたＣＰ－ＤＡＡに増加を示した。要約すると、これらの演習は、Ｄ２Ｍ２－４のＡＰ－ＤＡＡを有意に増強する４つの残基の同定をもたらした。しかし、これらの変異のどれも、ＤＡＦ分子のＡＰ－ＤＡＡに匹敵する強い増加を示さなかった。
実施例１８ Ｃ３コンバターゼサブユニットＣ３ｂ及びＣ４ｂへのＤ２Ｍ２－４変異体のリアルタイム結合の特徴付け
ＤＡＦがＣ３コンバターゼの両方のサブユニット、すなわちＣ３ｂ／Ｃ４ｂ及びＢｂ／Ｃ２ａと相互作用することが以前に立証されている。さらに、ＤＡＦのそのような二重相互作用はそれがＣ３コンバターゼを崩壊させる能力に重要であることも示唆された。ＳＰＲアッセイを採用することによってＤ２Ｍ２－４変異体のＣ３ｂ／Ｃ４ｂへの結合を測定した。このアッセイでは、Ｃ３ｂ又はＣ４ｂの遊離ＳＨ基をビオチンで標識することによってＣ３ｂ又はＣ４ｂをストレプトアビジンセンサーチップ上に固定化した。そのような標識は、チップ上のそれらを生理学的配向に向けた。次に、１μM Ｄ２Ｍ２－４及びその各変異体をチップ上に流して、結合を測定した。結合応答を応答単位（RU）として測定した。それを時間に対してプロットして（センソグラム）、比較した。ＭＣＰ及びＤＡＦのＣ３ｂ及びＣ４ｂへの結合は、Ｄ２Ｍ２－４変異体と比較して低く、それに結合するリンカーと一緒のＤ２ドメインの置換がＭＣＰのＣ３ｂ及びＣ４ｂへの結合を有意に増強することを示していた。次に、変異体の結合応答を分析したとき、ＡＰ－ＤＡＡ（Ｅ１３６Ｑ（Ｄ２）、Ｙ１０１Ｎ、Ｉ１３４Ａ及びＬ１６１Ｋ）又はＣＰ－ＤＡＡ（Ｉ１３４Ａ及びＬ１６１Ｋ）のいずれかに増加を示した変異体のどれも、Ｄ２Ｍ２－４分子と比較してＣ３ｂ又はＣ４ｂへの結合に増加を示さなかった（図２０）。したがって、これらの変異体のＤＡＡにおける増加は、コンバターゼの他のサブユニット、すなわちＢｂ／Ｃ２ａとのより良好な結合のおかげである可能性がある。
ＤＡＦがＣ３コンバターゼの両方のサブユニット、すなわちＣ３ｂ／Ｃ４ｂ及びＢｂ／Ｃ２ａと相互作用することが以前に立証されている。さらに、ＤＡＦのそのような二重相互作用はそれがＣ３コンバターゼを崩壊させる能力に重要であることも示唆された。ＳＰＲアッセイを採用することによってＤ２Ｍ２－４変異体のＣ３ｂ／Ｃ４ｂへの結合を測定した。このアッセイでは、Ｃ３ｂ又はＣ４ｂの遊離ＳＨ基をビオチンで標識することによってＣ３ｂ又はＣ４ｂをストレプトアビジンセンサーチップ上に固定化した。そのような標識は、チップ上のそれらを生理学的配向に向けた。次に、１μM Ｄ２Ｍ２－４及びその各変異体をチップ上に流して、結合を測定した。結合応答を応答単位（RU）として測定した。それを時間に対してプロットして（センソグラム）、比較した。ＭＣＰ及びＤＡＦのＣ３ｂ及びＣ４ｂへの結合は、Ｄ２Ｍ２－４変異体と比較して低く、それに結合するリンカーと一緒のＤ２ドメインの置換がＭＣＰのＣ３ｂ及びＣ４ｂへの結合を有意に増強することを示していた。次に、変異体の結合応答を分析したとき、ＡＰ－ＤＡＡ（Ｅ１３６Ｑ（Ｄ２）、Ｙ１０１Ｎ、Ｉ１３４Ａ及びＬ１６１Ｋ）又はＣＰ－ＤＡＡ（Ｉ１３４Ａ及びＬ１６１Ｋ）のいずれかに増加を示した変異体のどれも、Ｄ２Ｍ２－４分子と比較してＣ３ｂ又はＣ４ｂへの結合に増加を示さなかった（図２０）。したがって、これらの変異体のＤＡＡにおける増加は、コンバターゼの他のサブユニット、すなわちＢｂ／Ｃ２ａとのより良好な結合のおかげである可能性がある。
実施例１９． ＡＰ－ＤＡＡについてのＤ２Ｍ２－４キメラの活性の最適化
推定上の機能獲得型変異体のＡＰ－ＤＡＡの調査によって、活性に増加を有する４種のＤ２Ｍ２－４変異体が同定された。これらの変異体は、Ｅ１３６Ｑ（Ｄ２）、Ｙ１０１Ｎ、Ｉ１３４Ａ及びＬ１６１Ｋであった。しかし、これらの変異体は活性に増加を示し、それらの活性はＤＡＦの活性と比較してずっと低かった。したがって、Ｄ２Ｍ２－４のＡＰ－ＤＡＡを最適化するために、その中に４種の変異すべてを包含する四重変異体を構築した。四重変異体のＡＰ－ＤＡＡの評価によって、Ｄ２Ｍ２－４と比較して活性に頑健な１２．５倍の増加が示されたが；そのＣＰ－ＤＡＡは、全く増加を示さなかった（図２１）。上に述べたように、四重変異体のＡＰ－ＤＡＡはＤＡＦ分子と比較して依然として１３８倍低かった。したがって結果は、ＤＡＦ分子におけるＡＰ－ＤＡＡに重要な他の残基が、Ｄ２Ｍ２－４四重変異体から失われていることを示している。
推定上の機能獲得型変異体のＡＰ－ＤＡＡの調査によって、活性に増加を有する４種のＤ２Ｍ２－４変異体が同定された。これらの変異体は、Ｅ１３６Ｑ（Ｄ２）、Ｙ１０１Ｎ、Ｉ１３４Ａ及びＬ１６１Ｋであった。しかし、これらの変異体は活性に増加を示し、それらの活性はＤＡＦの活性と比較してずっと低かった。したがって、Ｄ２Ｍ２－４のＡＰ－ＤＡＡを最適化するために、その中に４種の変異すべてを包含する四重変異体を構築した。四重変異体のＡＰ－ＤＡＡの評価によって、Ｄ２Ｍ２－４と比較して活性に頑健な１２．５倍の増加が示されたが；そのＣＰ－ＤＡＡは、全く増加を示さなかった（図２１）。上に述べたように、四重変異体のＡＰ－ＤＡＡはＤＡＦ分子と比較して依然として１３８倍低かった。したがって結果は、ＤＡＦ分子におけるＡＰ－ＤＡＡに重要な他の残基が、Ｄ２Ｍ２－４四重変異体から失われていることを示している。
理論によって限定されることなく、本発明は、ＤＡＡ及びＣＦＡについて機能的部位が空間的に保存され、重複していないことを示唆している。本発明はまた、四重変異体がそのＣＦＡを保持したかを決定している。そのＣＦＡの測定によって、そのＣ３ｂ－ＣＦＡ及びＣ４ｂ－ＣＦＡがＤ２Ｍ２－４キメラと同等であることが示された（図２２）。したがって、本明細書においてＣＦＡ（Ｃ３ｂ－ＣＦＡ及びＣ４ｂ－ＣＦＡ）及びＤＡＡ（ＣＰ－ＤＡＡ及びＡＰ－ＤＡＡ）の両方が単一の４ＣＣＰ分子に共存できることが示された。しかし、この分子は最適なＣ３ｂ－ＣＦＡ、Ｃ４ｂ－ＣＦＡ及びＣＰ－ＤＡＡを有したが、ＤＣＰで観察されたＡＰ－ＤＡＡを有しなかった。
本発明のキメラタンパク質を変異させてその効力を増加させる場合があることが提唱されている。さらに補体活性化部位へのタグ、ＣＣＰ又は標的化のためのペプチド／タンパク質の付加；そのインビトロ及びインビボ半減期を増加させるための改変、膜又は細胞内標的化のための改変によって、本発明のキメラタンパク質がさらに改変される場合がある。
［配列表］
［配列表］
Claims (28)
- Ｄ２Ｍ２－４（配列番号４）；Ｄ２Ｍ２－４（ＭＬ）（配列番号５）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（配列番号６）；Ｄ２Ｄ３Ｄ４Ｍ４（配列番号７）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｔ１９２Ｅ）（配列番号８）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｋ１９５Ｙ）（配列番号９）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｆ１９７Ｉ）（配列番号１０）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｓ１９９Ｋ）（配列番号１１）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｔ２００Ｙ）（配列番号１２）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｌ２０５Ｋ）（配列番号１３）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｐ２１６Ｋ）（配列番号１４）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｍｕｌｔｉ－１）（配列番号１５）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｍｕｌｔｉ－２）（配列番号１６）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｍｕｌｔｉ－３）（配列番号１７）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｍｕｌｔｉ－４）（配列番号１８）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｍｕｌｔｉ－５）（配列番号１９）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｅ１３６Ｑ）（Ｄ２）（配列番号２０）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｙ１０１Ｎ）（配列番号２１）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｅ１１８Ｌ）（配列番号２２）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｉ１３４Ａ）（配列番号２３）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｅ１３６Ｋ）（配列番号２４）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｅ１３７Ｙ）（配列番号２５）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｅ１４２Ｋ）（配列番号２６）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｇ１５２Ｄ）（配列番号２７）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｌ１６１Ｋ）（配列番号２８）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｔ１６３Ａ）（配列番号２９）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｖ１７８Ｒ）（配列番号３０）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｖ１８０Ｆ）（配列番号３１）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｌ１８４Ｒ）（配列番号３２）；及びＤ２Ｍ２－４（Ｔｅｔｒａ）（配列番号３３）からなる群より選択される、補体経路の阻害のための操作キメラタンパク質。
- 崩壊促進因子（ＤＡＦ）のＤ１、Ｄ２、Ｄ３及びＤ４ドメインより選択されるドメイン並びにメンブレンコファクタープロテイン（ＭＣＰ）のＭ１、Ｍ２、Ｍ３及びＭ４より選択されるドメインを任意でリンカーと共に含む、請求項１記載の操作キメラタンパク質。
- Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｍｕｌｔｉ－５）（配列番号１９）である、請求項１記載の補体経路の阻害のための操作キメラタンパク質。
- 崩壊促進因子（ＤＡＦ）のＤ２及びＤ３ドメイン並びにメンブレンコファクタープロテイン（ＭＣＰ）のＭ３及びＭ４ドメインをリンカー及び特定の変異と共に含み、前記特定の変異がＣ３ｂ／Ｃ４ｂ及びＩ因子との相互作用を増強するための変異である、請求項３記載の操作キメラタンパク質。
- 操作キメラタンパク質（ＤＣＰ）が、ＤＡＦタンパク質由来のドメインＤ２Ｄ３及びＭＣＰタンパク質由来のＭ３Ｍ４ドメインを含み；ドメインがリンカーと共にスワップされ；ＤＡＦの２つのＮ末端モジュールが結合リンカーと共にＭＣＰ中に置換され；変異２１９ＥＣＲＥＩＹ２２４→２１９ＩＣＥＫＶＬ２２４（ｍｕｌｔｉ－１）並びに単一アミノ酸置換Ｆ１９７Ｉ及びＰ２１６Ｋを含む機能獲得型変異（Ｉ因子相互作用のため）が導入された、請求項３記載の操作キメラタンパク質（ＤＣＰ）。
- ＭＣＰのＭ１、Ｍ２が、ＤＡＦの２つのＮ末端モジュールが結合リンカーと共にＭＣＰ中に置換されてＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４となった、請求項３記載の操作キメラタンパク質（ＤＣＰ）。
- Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４におけるＩ因子との相互作用を増加させるための変異が、Ｔ１９２Ｅ、Ｋ１９５Ｙ、Ｆ１９７Ｉ、Ｓ１９９Ｋ、Ｔ２００Ｙ、Ｌ２０５Ｋ及びＰ２１６Ｋ並びに３種の多残基Ｍｕｌｔｉ－１、Ｍｕｌｔｉ－２及びＭｕｌｔｉ－３より選択される、請求項３記載の操作キメラタンパク質（ＤＣＰ）。
- ｉ． ＲＣＡタンパク質ＤＡＦ及びＭＣＰのドメイン並びにそれらのそれぞれのリンカーをスワップして、機能的態様を研究及び同定し、キメラタンパク質を得た工程；
ｉｉ． Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４キメラを選択し、さらなる改変及び変異を導入して増加したＣＦＡを有する変異体を作製した工程；
ｉｉｉ． 増加したＤＡＡ及びＣＦＡの両方を有するＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４変異体を作製した工程；
ｉｖ． キメラ変異体Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４及びＤ２Ｄ３Ｄ４Ｍ４、並びにＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４及びＤ２Ｍ２－４の単一及び多残基変異体がもたらされた工程；
ｖ． 細菌発現ベクター及び／又は酵母発現ベクターにおいて工程（ｉｖ）の変異体を発現させた工程
を含む、請求項１記載の操作キメラタンパク質を得るための方法。 - Ｄ２Ｍ２－４（配列番号４）；Ｄ２Ｍ２－４（ＭＬ）（配列番号５）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（配列番号６）；Ｄ２Ｄ３Ｄ４Ｍ４（配列番号７）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｔ１９２Ｅ）（配列番号８）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｋ１９５Ｙ）（配列番号９）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｆ１９７Ｉ）（配列番号１０）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｓ１９９Ｋ）（配列番号１１）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｔ２００Ｙ）（配列番号１２）；（Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｌ２０５Ｋ）（配列番号１３）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｐ２１６Ｋ）（配列番号１４）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｍｕｌｔｉ－１）（配列番号１５）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｍｕｌｔｉ－２）（配列番号１６）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｍｕｌｔｉ－３）（配列番号１７）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｍｕｌｔｉ－４）（配列番号１８）；Ｄ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｍｕｌｔｉ－５）（配列番号１９）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｅ１３６Ｑ）（Ｄ２）（配列番号２０）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｙ１０１Ｎ）（配列番号２１）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｅ１１８Ｌ）（配列番号２２）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｉ１３４Ａ）（配列番号２３）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｅ１３６Ｋ）（配列番号２４）；（Ｄ２Ｍ２－４（Ｅ１３７Ｙ））（配列番号２５）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｅ１４２Ｋ）（配列番号２６）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｇ１５２Ｄ）（配列番号２７）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｌ１６１Ｋ）（配列番号２８）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｔ１６３Ａ）（配列番号２９）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｖ１７８Ｒ）（配列番号３０）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｖ１８０Ｆ）（配列番号３１）；Ｄ２Ｍ２－４（Ｌ１８４Ｒ）（配列番号３２）；及びＤ２Ｍ２－４（Ｔｅｔｒａ）（配列番号３３）からなる群より選択される、補体経路の阻害のための操作キメラタンパク質を得るための、請求項８記載の方法。
- タンパク質がＤ２Ｄ３Ｍ３Ｍ４（Ｍｕｌｔｉ－５）（配列番号１９）である、請求項８記載の方法。
- 変異体が、ＣＦＡ、ＡＰ－ＤＡＡ及びＣＰ－ＤＡＡ活性を増加させた、請求項８記載の方法。
- 二重活性制御及びＩ因子に対する増強した親和性及びＣ３ｂ／Ｃ４ｂに対するアビディティーのための、請求項１記載の操作キメラタンパク質。
- 頑健なＣＰ－ＤＡＡ及びＡＰ－ＤＡＡ並びにＣ３ｂ－ＣＦＡ及びＣ４ｂ－ＣＦＡ活性、したがって古典的経路（ＣＰ）、代替経路（ＡＰ）及びレクチン経路（ＬＰ）に対する阻害活性を有する二重活性タンパク質のための、請求項１記載の操作キメラタンパク質。
- 補体系が関係する病的状態を処置するための補体活性化制御因子（ＲＣＡ）ベースの治療薬を開発するためのリード分子としてのその使用のための、請求項３記載の操作キメラタンパク質。
- インビトロアッセイ系においてＣＰ、ＡＰ及びＬＰ活性化を阻害するための試薬としてのその使用のための、請求項１記載の操作キメラタンパク質。
- 二重活性並びにそれによってＣＰ、ＡＰ及びＬＰに対する効果を提供するために必要とされる特異的立体構造特徴を解明及び同定することにおけるその使用のための、請求項１記載の操作キメラタンパク質。
- 請求項１記載の操作キメラタンパク質を薬学的に許容し得る賦形剤と共に含む組成物。
- 静脈内、経口、腹腔内、皮内、筋肉内、鼻腔内、皮下、脊髄内、気管内及び頭蓋内などの経路のうち任意の１つで投与することができる、請求項１７記載の組成物。
- 異なる病状における異なる経路をインビトロ及びインビボで解明すること並びにこれらの経路によって媒介される病態を阻害することにおけるその使用のための、請求項１７記載の組成物。
- 発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、デンスデポジット病（ＤＤＤ）、自己免疫疾患、成人呼吸促迫症候群、脳卒中、心臓発作、異種移植、多発性硬化症、熱傷、体外透析並びに血液酸素化におけるそれの使用のための、請求項１７記載の組成物。
- 請求項１記載の操作キメラタンパク質を含むアッセイ。
- 人工臓器又は挿入物の使用の間に補体活性化を阻害するために用いられる、請求項１７に記載の組成物。
- 患者における補体活性化を阻害するために用いられる、請求項１７に記載の組成物。
- 患者における補体媒介性組織傷害を処置するために用いられる、請求項１７に記載の組成物。
- 加齢性黄斑変性、関節リウマチ、脊髄損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、癌、及び呼吸障害からなる群より選択される補体媒介性疾患及び障害の処置のため、並びに異種移植の間のヒト補体媒介性損傷に対する抵抗性を付与するため、体外循環の間の補体の阻害のため、癌治療のための補体の阻害のために用いられる請求項１７に記載の組成物。
- ヒト補体からの防御のための遺伝子治療ベクターであって、請求項１に記載の操作キメラタンパク質をコードする遺伝子を含むことを特徴とする、遺伝子治療ベクター。
- 上記自己免疫疾患が、実験的アレルギー性神経炎、ＩＩ型コラーゲン誘導関節炎、重症筋無力症、溶血性貧血、糸球体腎炎及び免疫複合体誘導血管炎から成る群より選択される、請求項２０に記載の組成物。
- 上記呼吸障害が、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー性炎症、肺気腫、気管支炎、気管支拡張症、嚢胞性線維症、結核、肺炎、呼吸促迫症候群（ＲＤＳ － 新生児及び成人）、鼻炎及び副鼻腔炎からなる群より選択される、請求項２５に記載の組成物。
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Citations (3)
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