KR20210151918A - Daf-mcp 키메라 단백질, 이의 제조 방법 및 보체계 관련 병리학적 상태 치료를 위한 상기 키메라 단백질의 용도 - Google Patents

Abstract

보체계는 선천 면역계의 일부이며, 보체 활성화 조절인자 (RCA) 패밀리에 속하는 조절 단백질에 의해 고도로 조절된다. 조절 부족은 숙주 세포에 손상을 일으키고, 조절 결핍은 또한 예컨대, 연령-관련 황반 변성, 비정형 용혈성 요독 증후군, 및 고밀도 침착병과 같은 질환과도 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 조절 단백질은 주로 붕괴 촉진 인자 (DAF; CD55), 막 보조인자 단백질 (MCP; CD46), 보체 수용체 1 (CR1; CD35), 인자 H (FH) 및 C4b-결합 단백질 (C4BP)을 포함한다. 구조적으로, 이러한 단백질은 2-4개의 연속적인 도메인이 붕괴-촉진 활성 (DAA) 및 보조인자 활성 (CFA)이라는 조절 기능에 기여하는 반복 보체 제어 단백질 (CCP) 도메인으로 구성된다. 그러나, 현재 강력한 DAA (CP-DAA 및 AP-DAA) 및 강력한 CFA (C3b-CFA 및 C4b-CFA) 둘 모두 갖는 4개 도메인 키메라 단백질은 존재하지 않는다. 따라서, 키메라 단백질 DCP (즉, 이중 활성 조절자)가 생성되었다.

Description

DAF-MCP 키메라 단백질, 이의 제조 방법 및 보체계 관련 병리학적 상태 치료를 위한 상기 키메라 단백질의 용도

본 발명의 기술분야

본 발명은 일반적으로 생명공학 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 이중 활성 조절 작용을 갖고, 인자 I에 대한 친화도(affinity) 및 C3b/C4b (키메라 단백질 DCP)에 대한 항원항체항원항체결합력(avidity)을 증진시키기 위해 추가로 변형된 신규한 유전적으로 변형된 4개의 도메인 DAF-MCP 키메라 단백질, 및 신규한 유전적으로 변형된 4개의 도메인 DAF-MCP 키메라 단백질(chimeric protein)을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 배경

보체계(complement system)는 예컨대, 병원체에 대한 이의 직접적인 작용, 병원체 특이적 적응 면역 반응 증강, 세포 분화 및 분극화 과정에 기여, 조직 재생, 지질 대사, 면역 복합체 제거 및 아폽토시스 등의 역할로 알려진 선천 면역계의 일부이다. 보체 활성화의 조절 부족 또는 부적절한 활성화는 숙주 조직을 손상시키는 바, 따라서, 보체계는 일련의 단백질에 의해 엄격하게 조절된다. 이들 중, 보체 활성화 조절인자(Regulators of Complement Activation: RCA) 패밀리 단백질은 보체 조절을 주로 담당한다. RCA 단백질은 막 단백질, 예컨대, 붕괴 촉진 인자 (DAF; CD55), 막 보조인자 단백질 (MCP; CD46), 및 보체 수용체 1 (CR1; CD35) 뿐만 아니라, 체액 상 단백질, 예컨대, 인자 H (FH) 및 C4b-결합 단백질 (C4BP)을 포함한다. 구조적으로, RCA 단백질은 2-4개의 연속적인 모듈이 붕괴-촉진 활성 (DAA) 및 보조인자 활성 (CFA)이라는 조절 기능에 기여하는 반복 보체 제어 단백질 (CCP) 모듈로 구성된다. RCA 단백질은 보체 경로의 중심 효소인 C3/C5-컨버타제(convertase)를 표적화함으로써 작용한다. 이들 효소의 불활성화를 위해, RCA 단백질은 이들 컨버타제 또는 이의 비촉매성 서브유닛(subunit)에 결합하고, 그를 불활성화시킨다. DAA에서, RCA 단백질은 컨버타제에 결합하여 그를 이의 서브유닛로 비가역적으로 해리시키는 반면, CFA에서, RCA 단백질은 컨버타제의 비촉매성 서브유닛 (C3b/C4b)에 결합하여 세린 프로테아제 인자 I (FI)를 동원하여 그를 절단하고, 불활성화시켜 C3 컨버타제를 형성하는 이의 능력을 중단시킨다.

보체계의 활성화는 C3 컨버타제 (C4b2a 또는 C3bBb) 형성에서 수렴하는 렉틴, 고전적 및 대체 경로로 명명된 세 가지 주요 경로에 의해 개시된다. 이 효소는 보체의 모든 하류 이펙터 기능의 개시에 필요한 보체 성분 C3을 절단한다. C3 컨버타제는 촉매성 서브유닛 (Bb/C2a)이 Mg⁺⁺에 의존하는 방식으로 비촉매성 (C3b/C4b) 서브유닛에 결합된 2개의 서브유닛으로 구성된다.

자가 보체 공격으로부터 숙주 세포를 보호하는 RCA 패밀리 단백질의 널리 발현되는 막 조절인자는 DAF 및 MCP이다. DAF는 이의 DAA를 통해 C3 컨버타제를 해리하시키는 반면, MCP는 이의 CFA를 통해 C3 컨버타제 형성을 막는다. DAF 및 MCP는 각각 확장된 방식으로 배열된 4개의 CCP 모듈로 구성된다. DAF의 CCP2-4 도메인은 MCP의 CCP1-3과 순차적으로 유사한 것으로 알려져 있다. DAF에서의 도메인 결실 및 부위 지정 돌연변이유발 연구에 따르면 DAF의 CCP2-3은 고전적/렉틴 경로 C3 컨버타제 (CP-DAA)를 붕괴시키는 이의 능력에 필요하고, CCP2-4는 대체 경로 C3 컨버타제 (AP-DAA)의 붕괴에 필수적이다. MCP에서, 도메인 결실 및 부위 지정 돌연변이유발 데이터에서는 C3b (C3b-CFA) 및 C4b (C4b-CFA)에 대한 CFA의 CCP2-4와 관련이 있었다. 추가로, 최근 C3b와 복합체를 형성한 DAF 및 MCP의 결정 구조는 이들이 공통 결합 모드를 통해 결합하고, 이들 단백질의 CCP3-4가 C3b와 접촉을 형성함을 보여주었다. 그러나, DAA를 부여하는 데 필요한 DAF의 가장 작은 구조 단위, DAA에서 각 도메인의 기능적 중요성, 유사하게 C3b 및 C4b에 대한 CFA를 부여하는 데 필수적인 MCP의 최소 FI 상호작용 부위는 현재 알려져 있지 않다. 또한, 이러한 단백질에 기능적 모듈성의 존재 여부, 즉, 개별 CCP 또는 다중 CCP 단위가 단백질에 특정 기능을 부여할 수 있는지 여부, 및 그와의 결합을 통해 새로운 기능적 기능이 추가될 수 있는지 여부는 알려져 있지 않다.

미국 특허 US5866402와 같은 선행 기술 문헌은 글리코사미노글리칸에 결합할 수 있는 펩티드 서열과 함께 MCP 및 DAF로부터의 키메라 단백질 서열을 청구한다. 추가로, 선행 기술 문헌 EP 8932601B2는 제1 기능 (Fn) 단위 - 스페이서 - 제2 Fn 단위 - 스페이서 - 제3 Fn 단위 구조를 갖는 하이브리드로서, 여기서, 보체 Fn 단위는 DAF 및/또는 MCP 및/또는 CR1 및/또는 비-보체 기능 단위, 예컨대, Ig 및/또는 동물 세포에의 결합을 증진시키기 위한 단백질일 수 있는 하이브리드를 개시하고 있다. 이는 또한 여러 하이브리드, 예컨대, DAF-CRIB, DAF-CR1 BB, 및 DAF-IgG4 및 (DAF CCP 1,2,3,4-CR1 CCP 4,5,6,7-MCP CCP 1,2,3,4+ MCP STP 영역의 2개의 아미노산 (VS) +6xHis)를 갖는 DAF-MCP 하이브리드도 언급한다. 특허 US 5,851,528은 보체 활성을 억제하는 폴리펩티드를 개시한다. US'528은 상기 펩티드의 조절 활성 유형 및 작용 기전을 명시하지는 않는다.

그러나, 어느 선행 기술에서도 인자 I에 대한 친화도 및 C3b/C4b에 대한 항원항체결합력을 증진시킴으로써 달성되는 이중 활성 조절 작용을 갖는, 모체 단백질의 것과 등가인 DAA 및 CFA를 함유하는 4-도메인 DAF-MCP 키메라 돌연변이체를 개시된 바 없다.

이러한 RCA 단백질의 기능 결함은 각종 질환, 예컨대, 연령-관련 황반 변성(age-related macular degeneration: AMD), 비정형 용혈성 요독 증후군(atypical hemolytic uremic syndrome: aHUS), 및 고밀도 침착병(dense deposit disease: DDD)과 연관이 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명은 인자 I에 대한 친화도 및 C3b/C4b에 대한 항원항체결합력을 증진시킴으로써 달성된 이중 활성 조절 작용을 갖는 모체 단백질의 것과 등가인 DAA 및 CFA를 함유하는 4-도메인 DAF-MCP 키메라 돌연변이체 (DCP)에 대한 것이다. DCP는 보체계 관련 병리학적 상태를 치료하기 위한 RCA 기반 치료제를 개발하기 위한 선도 분자로서의 역할을 할 수 있다.

그러므로, 상기 알려지지 않은 요소를 시험하기 위해, 4개의 CCP DAF-MCP 키메라를 생성하고, 생화학적으로 특성화하였다. 추가로, 4개의 CCP DAF-MCP 키메라의 부위 지정 돌연변이체를 생성하고, 생화학적으로 특성화하였다. 생성된 실험 및 데이터는 4개의 인접한 CCP의 구조적 프레임워크에서 DAF 및 MCP의 개별 모듈의 기능적 역할을 보여주었다. 추가로, 모체 단백질의 것과 등가인 DAA 및 CFA를 함유하는 DAF-MCP 키메라 돌연변이체를 구축함으로써 RCA 단백질의 기능적 모듈성의 존재를 밝혀냈다.

또한 실험 데이터는 또한 두 조절 활성 모두에 대한 기계론적 통찰력도 제공한다.

본 발명의 목적

본 발명의 목적은 보체 경로의 억제를 위한 조작된 키메라 단백질을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 이중 활성 조절을 위해 변형되고, 인자 I에 대한 친화도 및 C3b/C4b에 대한 항원항체결합력을 증진시키기 위해 그에 대해 추가 변형된 4개의 도메인 DAF-MCP 키메라 단백질 (즉, DCP의 생성), 신규한 유전적으로 변형된 4개의 도메인 DAF-MCP 키메라 단백질 제조 방법 및 DCP의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 요약

보체계는 선천 면역계의 필수적인 부분이다. 이는 보체 활성화 조절인자 (RCA) 패밀리에 속하는 조절 단백질에 의해 고도로 조절되고, 조절 부족은 숙주 세포에 손상을 일으키고, 조절 결핍은 예컨대, 연령-관련 황반 변성 (AMD), 비정형 용혈성 요독 증후군 (aHUS), 및 고밀도 침착병 (DDD)과 같은 질환과 연관이 있다. 현재, 이중 조절 활성을 효과적으로 갖는 효율적인 4개의 도메인 DAF-MCP 키메라는 없으며, 강력한 분자/키메라 단백질이 요구되고 있다. RCA 단백질은 막-테더링된 보체 조절인자 붕괴 촉진 인자 (DAF; CD55), 막 보조인자 단백질 (MCP; CD46), 및 보체 수용체 1 (CR1; CD35) 및 체액-상 조절인자 예컨대, 인자 H (FH) 및 C4b-결합 단백질 (C4BP)을 포함한다. 구조적으로, 이러한 단백질은 2-4개의 연속적인 도메인이 붕괴-촉진 활성 (DAA) 및 보조인자 활성 (CFA)이라는 조절 기능에 기여하는 반복 보체 제어 단백질 (CCP) 도메인으로 구성되고, 이중 활성을 갖는 본DAF-MCP 키메라는 8개의CCP 도메인을 갖는다. 그러나, 현재 강력한 DAA 및 강력한 CFA 둘 모두 갖는 4개 도메인 키메라 단백질은 존재하지 않는다. 따라서, 본 발명은 인자 I과의 친화도/상호작용 및 C3b/C4b에 대한 항원항체결합력이 증진된, 이중 활성 조절 (즉, DAA 및 CFA)을 갖도록 생성된 4개의 도메인 키메라 단백질 DCP (즉, 이중 활성 조절인자), 신규한 유전적으로 변형된 4개의 도메인 DAF-MCP 키메라 단백질 제조 방법 및 DCP의 용도, 및 상업적 용도를 위한 DCP 용도에 대한 것이다.

도면의 간단한 설명
도 1은 다양한 DAF-MCP 키메라의 구축을 도시한 것이다. 도 1a는 DAF, MCP 및 DAF-MCP 키메라를 다이어그램으로 나타낸 대표도이다. 적색 링커는 DAF 도메인을 연결하는 링커를 나타내고, 청색 링커는 MCP 도메인을 연결하는 링커를 나타내고; 동일한 색상 스킴은 DAF-MCP 키메라의 링커를 도시하는 데 사용된다. 도 1b에서 상단 패널은 피치아(Pichia)에서 발현된 DAF, MCP 및 DAF-MCP 키메라의 SDS-PAGE 분석을 도시한 것이고, 하단 패널은 E. 콜라이(E. coli)에서 발현된 DAF, DAF 돌연변이체 D2D3 및 DAF-MCP 키메라 - D2D3M3M4, D2D3D4M4의 SDS-PAGE 분석을 도시한 것이다. MW, 분자 질량.
도 2는 DAF-MCP 키메라의 붕괴-촉진 활성 및 결합 분석을 도시한 것이다. 도 2a는 DAF, MCP, D2D3 돌연변이체 및 명시된 DAF-MCP 키메라의 고전적 경로 붕괴-촉진 활성 (CP-DAA)을 도시한 것이다. 도 2b는 DAF, MCP, D2D3 돌연변이체 및 명시된 DAF-MCP 키메라의 대체 경로 붕괴-촉진 활성 (AP-DAA)을 도시한 것이다. 도 2c는 DAF, MCP, D2D3 돌연변이체 및 명시된 DAF-MCP 키메라의 C3b (좌측 패널) 및 C4b (우측 패널)에의 결합 분석을 도시한 것이다.
도 3은 D2D3M3M4 및 이의 치환 돌연변이체의 보조인자 활성 (CFA)을 도시한 것이다. 도 3a는 MCP 및 D2D3M3M4의 상대적인 C3b-CFA 및 C4b-CFA를 도시한 것이다. 도 3b는 E. 콜라이에서 발현된 D2D3M3M4 및 이의 단일 및 다중 잔기 돌연변이체의 SDS-PAGE 분석을 도시한 것이다. 도 3c는 D2D3M3M4 및 이의 단일 및 다중 잔기 돌연변이체의 상대적인 C3b-CFA 및 C4b-CFA를 도시한 것이다.
도 4는 D2D3M3M4의 D3 도메인 중 추정 인자 I 상호작용 부위의 치환이 CP- 및 AP-DAA, 및 C3b- 및 C4b-CFA를 갖는 분자를 생성한다는 것을 도시한 것이다. 도 4a는 D2D3M3M4의 D3 도메인 중 추정 인자 I 상호작용 부위의 치환이 C3b-CFA를 갖는 분자 (멀티-4 & -5)를 생성한다는 것을 도시한 것이다. 도 4b는 D2D3M3M4의 D3 도메인 중 추정 인자 I 상호작용 부위의 치환이 C4b-CFA를 갖는 분자 (멀티-4 & -5)를 생성한다는 것을 도시한 것이다. 도 4c는 DAF 및 DAF-MCP 키메라 D3D3M3M4와의 비교로 D3D3M3M4 치환 돌연변이체 (멀티-4 & -5)의 대체 경로 붕괴-촉진 활성을 도시한 것이다. 도 4d는 DAF 및 DAF-MCP 키메라 D3D3M3M4와의 비교로 D3D3M3M4 치환 돌연변이체 (멀티-4 & -5)의 고전적 경로 붕괴-촉진 활성을 도시한 것이다.
도 5는 C3b-멀티-4 돌연변이체-FI 삼분자 복합체 중의 인자 I 상호작용 부위의 맵핑(mapping)을 도시한 것이다. 도 5a는 C3b-멀티-4 돌연변이체-FI 삼분자 복합체의 모델을 도시한 것이다. 도 5b는 FI와의 기능 획득 잔기로 제시되는 상호작용의 확대/축소 뷰를 보여주는 것이다. 도 5c는 FI와 기능 획득 잔기의 전하 및 소수성 상호작용을 도시한 것이다.
도 6은 DAF, MCP 및 DAF-MCP 키메라의 C3b 및 C4b에의 결합 분석을 도시한 것이다. 도 6a는 DAF, MCP 및 명시된 DAF-MCP 키메라의 C3b (좌측 패널) 및 C4b (우측 패널)에의 상대적인 결합을 보여주는 것이다. 도 6b는 D2D3M3M4, D2D3D4M4 및 D2D3M3M4 (멀티-4 & -5)의 다중 잔기 돌연변이체의 C3b (좌측 패널) 및 C4b (우측 패널)에의 결합 센서그램을 보여주는 것이다. 도 6c는 D2D3M3M4, D2D3D4M4 및 D2D3M3M4 (멀티-4 & -5)의 다중 잔기 돌연변이체의 C3b (좌측 패널) 및 C4b (우측 패널)에의 상대적인 결합을 보여주는 것이다.
도 7은 C3b-D2D3M3M4-Bb 복합체 중 C3b 및 Bb와의 D2D3M3M4 키메라의 계면 분석을 도시한 것이다. 도 7a는 C3b와 D2D3M3M4 중 DAF 도메인의 상호작용을 도시한 것이다. 도 7b는 Bb 중 VWA 도메인과 D2D3M3M4 중 DAF 도메인의 상호작용을 도시한 것이다.
도 8은 MCP 및 DAF-MCP 키메라 D2D3M3M4의 보조인자 활성 측정을 도시한 것이다.
도 9는 다양한 보체 조절인자의 상동성 도메인과 DCP (멀티-5 돌연변이체)의 CCP1-4의 구조 기반 서열 정렬을 도시한 것이다. 청색 화살표 표시는 CFA 돌연변이 획득을 나타내는 반면, 오렌지색 화살표 표시는 CFA를 획득하지 않은 돌연변이를 나타낸다.
도 10a는 D2D3M3M4와 D2D3M3M4의 점 돌연변이체 및 다중 잔기 돌연변이체의 C3b 보조인자 활성 (C3b-CFA) 비교를 보여주는 것이다. 도 10b는 D2D3M3M4와 D2D3M3M4의 점 돌연변이체 및 다중 잔기 돌연변이체의 C4b 보조인자 활성 (C4b-CFA) 비교를 보여주는 것이다.
도 11은 DAF, D2D3M3M4, 및 D2D3M3M4의 단일 및 다중 잔기 돌연변이체의 CP-DAA 및 AP-DAA 측정을 도시한 것이다.
도 12는 MCP와 D2D3M3M4의 다중 잔기 돌연변이체의 보조인자 활성, 및 고전적, 대체 및 렉틴 경로에 대한 그들의 효과 비교를 도시한 것이다. 도 12a는 C3b-CFA를 보여주는 것이다. 도 12b는 C4b-CFA를 보여주는 것이다. 도 12c는 DAF, MCP, CR1 LHR-A (CCP1-3), CR1 LHR-A^mut (CCP1-3 D109N/E116K) 및 D2D3M3M4의 다중 잔기 돌연변이체가 고전적, 대체 및 렉틴 경로에 미치는 상대적인 효과를 보여주는 것이다.
도 13은 C3b-멀티4-FI 복합체의 RMSD 및 RMSF 플롯 (13a)을 도시하고, D2D3M3M4 키메라 모델의 검증을 추가로 도시한 것이다 (13b). 도 13a: (i) 50 ns 자극에 대한 C3b-멀티4-FI 복합체의 백본 RMSD. (ii) 전체 시뮬레이션 시간 동안 키메라 잔기의 제곱 평균 제곱근 변동 (RMSF). (iii) 기능 획득 돌연변이가 확인된 영역에 위치하는 멀티-4 돌연변이체 잔기의 RMSF를 보여주는 플롯. 도 13b는 D2D3M3M4 키메라 및 다중 4 돌연변이체에 대한 라마찬드란(Ramachandran) 플롯을 사용하여 D2D3M3M4 키메라 모델의 검증을 예시한다.
도 14는 C3b-멀티-4 돌연변이체-FI 복합체 중의 C3b 및 FI와 멀티-4 돌연변이체의 상호작용의 맵핑을 도시한 것이다. 도 14a는 멀티-4 돌연변이체의 DAF (D2-D3) 뿐만 아니라, MCP 도메인 (M3-M4))은 C3b와의 상호작용을 나타낸다는 것을 도시한 것이다. 도 14b는 멀티-4 돌연변이체의 C3b 상호작용 잔기를 도시한 것이다. 도 14c는 FI와 M3 도메인 잔기의 상호작용을 도시한 것이다. Glu177 및 Glu179는 FI의 Arg480과 강력한 전하 상호작용을 나타낸다.
도 15a는 DAF, MCP, D2D3, DAF-MCP 키메라 D2D3M3M4 및 D2D3D4M4, D2D3M3M4의 단일 및 다중 잔기 돌연변이체의 크기 배제 크로마토그래피 분석을 도시한 것이다. 도 15b는 정제된 DAF, MCP, DAF-MCP 키메라 D2D3M3M4 및 D2D3D4M4, 및 D2D3M3M4의 단일 및 다중 잔기 돌연변이체의 SDS-PAGE 분석을 보여주는 것이다.
도 16은 D2M2-4 키메라의 추정 기능 획득 돌연변이체를 보여주는 것이다. (a) 모든 CCP 도메인 및 링커 (밑줄체로 표시)를 보여주는 D2M2-4의 서열. 불변 시스테인 잔기는 황색으로 강조표시되어 있다. AP-DAA 획득을 위해 돌연변이화된 잔기는 화살표 표시로 마킹되어 있다 (잔기는 적색으로, 및 청색 화살표 표시로 마킹). (b) D2M2-4의 단일 아미노산 치환 돌연변이체의 SDS-PAGE 분석. (c) 표는 모든 돌연변이 및 이의 위치 목록을 보여주는 것이다. 이들 돌연변이는 인간 (DAF, CR1) 뿐만 아니라, 바이러스 조절인자 (SPICE, sCCPH, 및 카포시카(Kaposica))에 관한 선행의 돌연변이유발 데이터에 기초하였다.
도 17은 D2M2-4, 및 D2M2-4의 추정 기능 획득 돌연변이체의 크기 배제 크로마토그래피 분석을 도시한 것이다. D2M2-4 키메라 및 D2M2-4의 단일 아미노산 치환 돌연변이체를 PBS (pH 7.4)로 미리 평형화된 슈퍼로스(Superose)-12 칼럼 (GE 헬쓰케어 라이프 사이언시스(GE Healthcare Life Sciences)) 상에 로딩하였다. 사용된 겔 여과 표준 (바이오-래드(Bio-Rad))은 a, 티로글로불린 (670,000 Da); b, 감마 글로불린 (158,000 Da); c, 오브알부민 (44,000 Da); d, 미오글로빈 (17,000 Da); e, 비타민 B-12 (1,350 Da)였다.
도 18은 DAF, D2M2-4, 및 이의 추정 기능 획득 돌연변이체의 CP-DAA 측정을 도시한 것이다. 각 단백질의 CP-DAA는 미리 형성된 CP C3-컨버타제 (C4b2a)를 붕괴시킬 수 있는 이의 능력을 평가함으로써 측정하였다. 억제제 부재하의 활성을 100% C3-컨버타제 활성으로 간주하여 데이터를 정규화하였다. 화살표 표시는 CP-DAA 획득 돌연변이체를 나타낸 것이다. 제시된 데이터는 3회의 독립 실험의 평균 ± SD이다.
도 19는 DAF, D2M2-4, 및 이의 추정 기능 획득 돌연변이체의 AP-DAA 측정을 도시한 것이다. 각 단백질의 AP-DAA는 미리 형성된 AP C3-컨버타제 (C3bBb)를 붕괴시킬 수 있는 이의 능력을 평가함으로써 측정하였다. 억제제 부재하의 활성을 100% C3-컨버타제 활성으로 간주하여 데이터를 정규화하였다. 화살표 표시는 AP-DAA 획득 돌연변이체를 나타낸 것이다. 제시된 데이터는 3회의 독립 실험의 평균 ± SD이다.
도 20은 DAF, D2M2-4 및 이의 추정 기능 획득 돌연변이체의 C3b 및 C4b에의 결합을 도시한 것이다. DAF, D2M2-4 및 이의 돌연변이체와 C3b (a) 및 C4b (b)와의 상호작용을 보여주는 센소그램 오버레이 플롯. 간략하면, 모든 단백질을 고정화된 비오틴 표지된 C3b/C4b 위에 1 μM 농도로 유동시켰다. CP-DAA 및 AP-DAA에 영향을 미치는 잔기는 적색 글꼴로 강조 표시되어 있다.
도 21은 DAF, D2M2-4 및 D2M2-4의 테트라 돌연변이체의 CP-DAA 및 AP-DAA 측정을 도시한 것이다. (a) 각 단백질의 CP-DAA는 미리 형성된 CP C3-컨버타제 (C4b2a)를 붕괴시킬 수 있는 이의 능력을 평가함으로써 측정하였다. (b) 각 단백질의 AP-DAA는 미리 형성된 AP C3-컨버타제 (C3bBb)를 붕괴시킬 수 있는 이의 능력을 평가함으로써 측정하였다. 억제제 부재하의 활성을 100% C3-컨버타제 활성으로 간주하여 데이터를 정규화하였다. 제시된 데이터는 3회의 독립 실험의 평균 ± SD이다.
도 22는 D2M2-4, 및 D2M2-4의 테트라 돌연변이체의 보조인자 활성 측정을 도시한 것이다. 이들 단백질을 PBS에서 C3b (a) 또는 C4b (n) 및 인자 I와 함께 37℃에서 인큐베이션시킴으로써 상기 단백질의 보조인자 활성을 측정하였다. C3b/C4b의 절단 생성물은 이를 환원 조건하에서 SDS-PAGE 상에 (C3b의 경우, 9% 및 C4b의 10%) 전개시킴으로써 관찰하였다. C3b-CFA에서, α'-쇄는 N-말단 68 kDa 및 C-말단 46 kDa 단편으로 전단되고, 그 중 46 kDa 단편은 43 kDa 단편으로 추가로 절단된다. C4b-CFA에서, α'-쇄는 N-말단 27 kDa, 중심 C4d 및 C-말단 16 kDa 단편으로 절단되고; C-말단 단편은 겔 상에서 시각화되지 않는다.

본 발명의 상세한 설명

본 출원은 PATENTIN으로 제출된 서열 목록을 포함하고그, 이는 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다. 상기 PATENTIN-3.5 버전은 Sequence listing.txt라는 명칭으로 작성되고, 크기는 20 킬로바이트이다.

본 발명은 DAF (서열 번호: 1), 및 MCP (서열 번호: 2)의 단백질 서열 ID를 제공한다. 본 발명은 또한 CP-DAA의 억제를 입증하는 D2D3에 속하는 단백질 서열 번호: 3을 제공한다. D2D3는 AP-DAA에서 적절한 효과를 제공하지 않는 것으로 관찰되었다. 이 단백질은 적절하고, 본원에 개시된 바와 같이 실시예(들)에서 대조군으로 사용되었다.

본 발명은 또한 키메라 단백질 D2M2-4 (서열 번호: 4); D2M2-4 (ML) (서열 번호: 5); D2D3M3M4 (서열 번호: 6); D2D3D4M4 (서열 번호: 7); D2D3M3M4 (T192E) (서열 번호: 8); D2D3M3M4 (K195Y) (서열 번호: 9); D2D3M3M4 (F197I) (서열 번호: 10); D2D3M3M4 (S199K)) (서열 번호: 11); D2D3M3M4 (T200Y)) (서열 번호: 12); (D2D3M3M4 (L205K)) (서열 번호: 13); D2D3M3M4 (P216K) (서열 번호: 14); D2D3M3M4 (멀티-1) (서열 번호: 15); D2D3M3M4 (멀티-2) (서열 번호: 16); D2D3M3M4 (멀티-3) (서열 번호: 17); D2D3M3M4 (멀티-4) (서열 번호: 18); D2D3M3M4 (멀티-5) 또는 DCP (서열 번호: 19); D2M2-4 (E136Q) (D2) (서열 번호: 20); (D2M2-4 (Y101N) (서열 번호: 21); (D2M2-4 (E118L) (서열 번호: 22); D2M2-4 (I134A) (서열 번호: 23); D2M2-4 (E136K) (서열 번호: 24); (D2M2-4 (E137Y)) (서열 번호: 25); (D2M2-4 (E142K) (서열 번호: 26); D2M2-4 (G152D) (서열 번호: 27); D2M2-4 (L161K) (서열 번호: 28); D2M2-4 (T163A) (서열 번호: 29); D2M2-4 (V178R) (서열 번호: 30); (D2M2-4 (V180F) (서열 번호: 31); D2M2-4 (L184R) (서열 번호: 32); D2M2-4 (테트라) (서열 번호: 33)을 제공한다.

본 발명의 조작된 키메라 단백질은 임의적으로, 링커와 함께, 붕괴 촉진 인자 (DAF)의 D1, D2, D3 및 D4 도메인으로부터 선택되는 도메인 및 막 보조인자 단백질 (MCP)의 M1, M2, M3 및 M4로부터 선택되는 도메인을 포함한다.

본 발명은 키메라 단백질 D2D3M3M4 (멀티-5) 또는 DCP (서열 번호: 19)를 개시한다.

조작된 키메라 단백질 D2D3M3M4 (멀티-5) 또는 DCP (서열 번호: 19)는 링커 및 특정 돌연변이와 함께, 붕괴 촉진 인자 (DAF)의 D2 및 D3 도메인, 및 막 보조인자 단백질 (MCP)의 M3, 및 M4를 갖는다.

본 발명은 이중 활성 조절을 갖고, 인자 I 및 C3b/C4b와의 상호작용 증진을 위해 추가로 변형되고, 서열 ID 19를 갖는, 신규한 변형된 4개의 도메인 DAF-MCP 키메라 단백질 (DCP)을 개시한다. DAF, MCP 및 DAF-MCP 키메라를 다이어그램으로 나타낸 대표도 및 SDS-PAGE 분석이 도 1(a) 및 (b)에 있다.

본 발명은 인간 DAF 단백질로부터의 도메인 D2, D3 및/또는 D4, 및 인간 MCP 단백질로부터의 M2, M3, 및/또는 M4 도메인을 갖고, 이로써, 단백질/돌연변이체/키메라 D2M2-4, MCP 링커를 포함하는 D2M2-4, D2D3M3M4, D2D3D4M4를 생성하는 조작된 4개의 도메인 단백질을 개시하고; 조작된 단백질 D2D3M3M4는 단일 아미노산 치환, 다중 아미노산 치환 및 단일 및 다중 아미노산 잔기의 조합을 갖는, 도메인 중 기능 획득 돌연변이로 추가로 변형되고; 도메인 D3 중 2개의 돌연변이 (F197I 및 P216K) 및 하나의 다중 잔기 돌연변이 (멀티-1, 즉, 링커 치환 돌연변이 - 219ECREIY224에서 ICEKVL로)로 변형된 D2D3M3M4는 집합적으로 치환되어 멀티-5 (DCP)를 생성하였다. DCP에서, DAF의 두 N-말단 모듈 모두 치환되었다.

DCP를 수득하기 위해, T192E, K195Y, F197I, S199K, T200Y, L205K 및 P216K 및 3개의 다중 잔기 멀티-1, 멀티-2 및 멀티-3으로부터 선택되는 D2D3M3M4 중의 인자 I과의 상호작용을 증가시키기 위해 추가 돌연변이를 수행하였다.

한 실시양태에서, 본 발명은

i. RCA 단백질 DAF 및 MCP의 도메인 및 이의 각 링커를 스와핑하여 기능적 측면을 연구 및 확인하고, 키메라 단백질을 수득하는 단계;

ii. D2D3M3M4 키메라를 선택하고, 추가 변형 및 돌연변이를 도입하여 CFA가 증가된 돌연변이체를 생성하는 단계;

iii. DAA 및 CFA, 둘 모두가 증가된 D2D3M3M4 돌연변이체를 생성하는 단계;

iv. 키메라 돌연변이체 D2M2-4, D2D3M3M4 및 D2D3D4M4, 및 D2D3M3M4, 및 D2M2-4의 단일 및 다중 잔기 돌연변이체를 생성하는 단계.

v. 박테리아 및/또는 효모 발현 벡터에서 단계 (iv)의 돌연변이체를 발현시키는 단계를 포함하는, 재조합 기술 및 돌연변이 도입을 사용하여 이중 활성 조절을 갖고, 인자 I 및 C3b/C4b와의 상호작용이 증진된 수득된 4개의 도메인 DAF-MCP 키메라 단백질 (DCP)을 조작하여 돌연변이체 멀티-5 (DCP)를 생성하는 방법을 개시한다.

이어서, 본 발명의 방법을 통해 D2M2-4 (서열 번호: 4); D2M2-4 (ML) (서열 번호: 5); D2D3M3M4 (서열 번호: 6); D2D3D4M4 (서열 번호: 7); D2D3M3M4 (T192E) (서열 번호: 8); D2D3M3M4 (K195Y) (서열 번호: 9); D2D3M3M4 (F197I) (서열 번호: 10); D2D3M3M4 (S199K)) (서열 번호: 11); D2D3M3M4 (T200Y)) (서열 번호: 12); (D2D3M3M4 (L205K)) (서열 번호: 13); D2D3M3M4 (P216K) (서열 번호: 14); D2D3M3M4 (멀티-1) (서열 번호: 15); D2D3M3M4 (멀티-2) (서열 번호: 16); D2D3M3M4 (멀티-3) (서열 번호: 17); D2D3M3M4 (멀티-4) (서열 번호: 18); D2D3M3M4 (멀티-5) 또는 DCP (서열 번호: 19); D2M2-4 (E136Q) (D2) (서열 번호: 20); (D2M2-4 (Y101N) (서열 번호: 21); (D2M2-4 (E118L) (서열 번호: 22); D2M2-4 (I134A) (서열 번호: 23); D2M2-4 (E136K) (서열 번호: 24); (D2M2-4 (E137Y)) (서열 번호: 25); (D2M2-4 (E142K) (서열 번호: 26); D2M2-4 (G152D) (서열 번호: 27); D2M2-4 (L161K) (서열 번호: 28); D2M2-4 (T163A) (서열 번호: 29); D2M2-4 (V178R) (서열 번호: 30); (D2M2-4 (V180F) (서열 번호: 31); D2M2-4 (L184R) (서열 번호: 32); D2M2-4 (테트라) (서열 번호: 33)을 포함하는 군으로부터 선택되는, 보체 경로 억제를 위한 조작된 키메라 단백질을 수득하였다.

본 발명의 방법은 단백질 D2D3M3M4 (멀티-5) 또는 DCP (번호 19)를 제공하였다.

이론으로 제한하지 않으면서, 본 발명의 방법은 CFA, AP-DAA 및 CP-DAA 활성을 증가시키기 위해 변형 및 돌연변이를 도입한다고 기술된다.

i. 본원에서는 본 발명의 변형된 4개의 도메인 DAF - MCP 키메라 단백질 ( DCP )을 제조하는 방법을 개시한다: RCA 단백질 DAF 및 MCP의 도메인 및 이의 각 링커를 스와핑하 여 기능적 측면을 연구 및 확인하였다 - 도메인 스왑(domain swap) 기술을 이용하여 DAF 및 MCP의 도메인 및 각 링커를 스와핑하여 최상의 DAA (CP-DAA 및 AP-DAA) 및 CFA (C3b-CFA 및 C4b-CFA) 활성에 필수 도메인 및 링커를 확인하였다. DAF의 CCP2-3은 CP-DAA 및 AP-DAA, 둘 모두를 유도하는 반면, CCP4는 C3b 결합 도메인으로 작용함으로써 지원하는 것으로 밝혀졌고; CCP2-3은 DAF의 DAA에 필요하고, MCP에는 DAA가 없기 때문에, MCP의 도메인 (M1-M3) 중 하나 이상의 것 및 DAF의 상동성 도메인 (D2-D4)과의 링커 및 연관된 링커를 스와핑하였고, 성된 단백질/돌연변이체를 기능 획득에 대해 시험하였고; 다음 도메인을 스와핑하기 전에 DAA에서 D2-D3 사이의 링커 (즉, KKKS; 순 양전하 +3)의 중요성을 시험하였다. D2D3 단백질이 D2D3 링커와 함께 D2D3 도메인을 갖는 단백질/돌연변이체를 생성하였다. D2D3 단백질이 D2D3 링커와 함께 D2D3 도메인을 갖는 단백질/돌연변이체를 생성하였다. D2-D3 링커와 함께 D2 도메인, M2M3M4 도메인을 이의 각 M2M3M4 링커와 함께 갖는 D2M2-4 단백질을 생성하였고, 이러한 치환은 단독으로 비록 단백질/돌연변이체가 DAF와 비교하여 활성이 30배 더 적기는 하였지만, CP-DAA를 부여하는 데에는 충분하였다. 그러나, 상기 단백질은 활성에서 다른 모듈의 중요한 역할을 강조하면서, 감소된 AP-DAA를 나타내었다. D2M2-4 중 D2-D3 링커가 MCP의 중성 링커 (YRET)로 대체된 D2M2-4 (ML) 단백질/돌연변이체를 생성하였고; 따라서, 생성된 돌연변이체/단백질 (D2M2-4-ML)은 D2M2-4의 것과 달리 CP-DAA 획득을 보이지 않았다. MCP 링커를 포함하는 D2M2-4 단백질 (D2M2-4-ML)은 또한 DAF 링커를 포함하는 D2M2-4 단백질 (D2M2-4)과 비교하여 C3b 및 C4b에의 결합에서 상당한 손실을 보였다. MCP 중의 연관된 링커와 함께 DAF의 2개의 N-말단 모듈 (D2D3M3M4)이 치환된 D2D3M3M4 돌연변이체/단백질을 상기 단백질의 DAA를 평가하였고, 상기 단백질은 DAF의 것과 동일한 CP-DAA 뿐만 아니라, AP-DAA를 보인 것으로 관찰되었고, MCP 중의 링커와 함께 DAF의 3개의 도메인을 치환하였을 때에는 DAA의 추가 증가는 없는 것으로 나타났다. 추가로, 본 데이터는 더 느린 오프-속도가 AP C3 컨버타제 복합체에 대한 조절인자의 재순환 속도에 영향을 주고, 이는 이의 AP-DAA를 감소시키는 결과를 초래한다는 것을 제안하였고, 이는 붕괴는 오직 DAF의 CCP2-3에 의해서만 유도된다는 것을 시사하였고; DAF 중의 D4 모듈은 단지 C3b 결합 도메인의 역할만을 할 뿐이며, 이의 기능은 M3-M4에 의해 치환될 수 있는 것으로 확인되었고; D2D3M3M4 키메라 중의 D2D3 모듈과 AP C3 컨버타제 서브유닛 (즉, C3b 및 Bb)과의 가능한 상호작용을 연구하였고, C3b-D2D3M3M4-Bb 복합체를 추가로 모델링하였고, 계면 분석 결과, D2 및 D3은 C3b 뿐만 아니라, Bb, 둘 모두와 상호작용하고, D2 및 D2-D3 링커는 Bb에서 폰 빌레브란트 인자 A형 (VWA) 도메인의 α7-나선과 접촉을 형성한 반면, D3은 Bb에서 VWA 도메인의 α7-나선, 및 α6-βF 및 α5-βE 루프와 접촉을 형성하는 것으로 나타났고, 본 모델링 데이터에서는 D2 및 D3은 α7-나선에 추가로 α6-βF 및 α5-βE 루프와 극도로 상호작용하고, 따라서, D2-D3과 이들 루프와의 상호작용이 C3b로부터 Bb의 붕괴를 유도하는, MIDAS 부위에서의 알로스테릭 변화에 중요한 것으로 보이고; MCP의 최적의 CFA에 필요한 M2 뿐만 아니라, M3 상의 인자 I 상호작용 부위를 확인하였고; 단독으로 M3 상에 존재하는 FI 상호작용 부위가 CFA에 기능적으로 기여할 수 있는 것으로 밝혀졌고; 이들 D2D3M3M4 돌연변이체의 DAA를 특히 CFA 획득을 보인 키메라에서 평가하였고; 4개의 CCP의 구조적 프레임워크에 강력한 CFA 및 DAA가 공존하는 것이 달성가능한 것으로 확인되었고, CFA 획득을 제공하는 잔기는 다양한 RCA 단백질의 서열 정렬에 의해 결정하였고; 모체 분자만큼 강건한 DAA 및 CFA를 보인 4개의 CCP DAF-MCP 단백질을 조작하였다. 도메인 D2D3D4의 각 링커, 및 도메인 D4 및 M4 사이의 M4의 링커를 갖는 D2D3D4M4 단백질/돌연변이체를 생성하였다. 생성된 단백질을 시험하고, 이의 DAA 및 CFA에 대해 연구하였고, 돌연변이체/키메라 단백질의 조절 활성을 증가시키기 위해 추가 돌열변이를 도입하고, 시험하고, 연구하였다.

ii. D2D3M3M4 키메라를 선택하고, 추가 변형 및 돌연변이를 도입하여 CFA가 증가된 돌연변이체를 생성하였다 - 이의 DAA에는 영향을 주지 않으면서, (M2에 상동성인) D3 도메인 중 FI 상호작용 부위 및 D3-M3 링커를 치환함으로써 상기 D2D3M3M4 단백질/돌연변이체의 CFA를 증가시켰다. 바이러스 및 인간 RCA 단백질에 관한 조기의 돌연변이유발 연구에 기초하여 D2D3M3M4 단백질의 D3 중 추정 FI 상호작용 잔기 및 부착된 링커 (D3-M3 링커) 치환을 수행하였다. D2D3M3M4의 총 7개의 단일 (T192E, K195Y, F197I, S199K, T200Y, L205K 및 P216K) 및 3 다중 잔기 (멀티-1, 멀티-2 및 멀티-3) 돌연변이체를 생성하였다. DAF의 상기 영역과 MCP의 상동성 영역의 조기 스와핑 결과로 DAF에 CFA가 도입되었는 바, 상기 돌연변이는 D3의 Cys2-Cys4 영역과 D3-M3 링커 (ECREIY) 사이에 존재한다. 단일 및 다중 잔기 돌연변이체의 생화학적 분석을 통해 다양한 결과 - CFA 획득이 28배까지 완전히 손실된 것으로 나타났다. >2배의 C3b CFA 획득을 보인 치환으로는 단일 아미노산 돌연변이체, 예컨대, S199K, 및 P216K, 및 다중 잔기 돌연변이체, 예컨대, 멀티-1 (링커 치환 돌연변이체 - 219ECREIY224에서 ICEKVL로), 멀티-2 (링커 치환 + S199K) 및 멀티-3 (215DPL217에서 PKA로)을 포함하였다. 유사하게, >2배의 C4b CFA 획득을 보인 돌연변이로는 F197I, S199K, P216K, 멀티-2 및 멀티-3을 포함하였다. CFA가 증가된 돌연변이체 (3개의 단일 잔기 돌연변이체 (F197I, S199K, P216K) 및 1개의 다중 잔기 돌연변이체 (멀티-1, 즉, 링커 치환 돌연변이체)를 선택하였다.

iii. CFA가 증가된 D2D3M3M4 D2D3M3M4 돌연변이체/단백질을 추가로 연구하고, 변형시켜 무손상 DAA를 갖는 돌연변이체/단백질을 생성하였다 - 특히, CFA 획득을 보인 돌연변이에서 상기 D2D3M3M4 돌연변이체의 DAA를 DAA 손실에 대해 연구하였다. CFA 획득을 보인 일부 돌연변이체는 DAA 손실을 나타내었다. 그러나, 3개의 돌연변이체 (F197I, P216K 및 멀티-1)는 AP-DAA 손실을 거의 보이지 않거나, 또는 손실을 전혀 보이지 않았고, CFA 획득을 보인 돌연변이체 중 어느 것도 >2배의 CP-DAA 손실을 보이지 않았다. 그러므로, 본 데이터는 4개의 CCP의 구조적 프레임워크에 강력한 CFA 및 DAA가 공존하는 것이 달성가능하다는 전제를 뒷받침하였다. 다양한 RCA 단백질의 서열 정렬을 수행하여 CFA 획득을 제공한 잔기가 CFA를 보이는 다른 RCA 단백질에서 보존되는지 여부를 조사하였다. 활성 획득과 연관된 10개의 잔기 중 5개가 CFA가 있는 다른 단백질 중 제자리에서 보존되는 것으로 관찰되었다.

iv. DAA 및 CFA, 둘 모두가 증가된 D2D3M3M4 돌연변이체를 생성하였다 - D2D3M3M4 돌연변이체를 D3 도메인 중 3개의 단일 잔기 돌연변이 (F197I, S199K, P216K) 및 D3M3 링커 중 하나의 다중 잔기 돌연변이 (멀티-1, 즉, 링커 치환 돌연변이체)로 치환하였을 때 돌연변이체 멀티-4가 생성되었다. D2D3M3M4 돌연변이체를 D3 도메인 중 2개의 단일 잔기 돌연변이 (F197I 및 P216K) 및 D3M3 링커 중 하나의 다중 잔기 돌연변이 (멀티-1, 즉, 링커 치환 돌연변이체)로 치환하였을 때, 멀티-5가 생성되었다. 멀티-4 및 멀티-5 돌연변이체를 연구하였고, 렉틴 및 대체 경로를 억제시키는 데 있어 LHR-A (CCP1-3)보다 더욱 강력하고, 대체 경로를 억제시키는 데 있어 LHR-A^mut보다 더욱 강력하며, 효율적인 CFA 및 DAA를 갖는 4개의 CCP 분자 (DCP)의 성공적인 디자인을 생성하였다. C3b-멀티-4 돌연변이체-FI 복합체의 분자 역학 시뮬레이션이 연구되었으며, 실험을 통해 FI와 키메라 중 돌연변이화된 잔기의 상호작용에 관한 정보가 밝혀졌고, 전반적으로, FI와 키메라/단백질의 링커 및 연관된 영역의 상호작용 패턴은 실험 연구 및 데이터와 일치하고, 도메인 특이적 상호작용은 DAF 및 MCP와 유사한 것으로 나타났다.

v. 키메라 단백질을 박테리아 및 효모 발현 벡터에서 발현시키고, 연구하였다 - 인간 DAF, MCP, DAF-MCP 키메라/단백질 및 D2D3M3M4 및 CR1 LHR-A (CCP1-3) 및 이의 돌연변이체의 치환 돌연변이체는, 이의 각 cDNA로부터 증폭시켜 구축하고, 효모 발현 벡터 pPICZα 및/또는 박테리아 발현 벡터 pET-28b에 클로닝하였다. DAF-MCP 단백질은 유전자 스플라이싱 및 중첩 확장 방법을 사용하여 구축한 후, 이어서, 효모 발현 벡터 pPICZα에서, 또는 박테리아 발현 벡터 pET-28b에 클로닝하였다. CR1 LHR-A (CCP1-3)을 CR1 cDNA로부터 증폭시키고, 이의 발현을 위해 pET-28b에 클로닝하였다. 프라이머 세트를 이용하여 DAF, MCP 및 CR1의 원하는 영역을 증폭시키고, D2D3M3M4 및 CR1 LHR-A (CCP1-3)의 치환 돌연변이체는 퀵-체인지(Quick-change) 부위 지정 돌연변이유발 키트 II를 이용하여 구축하고, 박테리아 발현 벡터 pET-28b에 클로닝하고, DAF 결실 돌연변이체 D2-D3을 DAF cDNA로부터 증폭시키고, pET-28b에 클로닝하고; 클로닝 후, 구축물 모두 DNA 서열분석에 의해 검증하고, 클로닝 돌연변이체를 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 발현시키고, pET-28b에 클로닝된 돌연변이체를 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) BL21 세포에 형질전환시켰다.

인간 DAF, MCP, DAF-MCP 단백질/돌연변이체, 즉, D2M2-4 (D2-D3 사이 DAF 링커를 함유하는 키메라/단백질) 및 D2M2-4-ML (M1-M2 사이 링커를 함유하는 키메라/단백질)의 발현 및 정제. 이들을 P. 파스토리스(P. pastoris)에서 발현시키고, 정제하고, 투석시키고, 농축시키고; 유사하게, DAF 돌연변이체 D2D3, DAF-MCP 돌연변이체/단백질 D2D3M3M4 및 D2D3D4M4, 및 D2D3M3M4의 치환 돌연변이체, CR1 LHR-A (CCP1-3) 및 이의 돌연변이체 CR1 LHR-A^mut (CCP1-3, D109N/E116K)를 비롯한 다른 돌연변이체와 함께 인간 DAF 및 MCP 또한 E. 콜라이에서 발현시켰다. 이를 정제하고, 리폴딩(refolding)하였다.

용혈성 검정법을 이용하여 DAF, DAF-MCP 키메라 및 D2D3M3M4의 돌연변이체의 고전적/렉틴 및 대체 경로 C3-컨버타제 붕괴-촉진 활성을 측정하였다. 상기 효소는 조절인자의 존재하에서 붕괴시킬 수 있었고, 남은 컨버타제의 활성을 추정하였으며; MCP, DAF-MCP 키메라 및 D2D3M3M4의 돌연변이체의 보조인자 활성은 체액 상 절단 검정법에 의해 측정하였고; DAF, MCP, DAF-MCP 키메라 및 D2D3M3M4의 치환 돌연변이체의 C3b 및 C4b에의 결합 측정을 비아코어(Biacore) 검정법에 의해 수행하였고, 특이적 결합 반응이 도출되었고; MCP, DAF, CR1 LHR-A (CCP1-3) 및 CR1 LHR-A^mut (CCP1-3, D109N/E116K)의 것과의 멀티-5 돌연변이체의 상대적인 보체 경로 특이적 억제 활성을 위스랩(Wieslab) 전체 보체 ELISA 검정법에 의해 시험하였고, 조절 단백질 존재하의 혈청 활성 수준을 단백질 부재하에서 측정된 활성 대비의 비율(%)로서 표시하였고; DAF 및 MCP의 서열은 유니프로트(UniProt)로부터 검색하고 (DAF ID: P08174 및 MCP ID: P15529), D2D3M3M4 단백질/돌연변이체 서열에 대해 Modeller 9.11을 사용하여 DAF 및 MCP 주형 구조 (각각 PDB id: 5FOA 및 5FO8)에 기초하여 상동성 모델링을 수행하였고; DOPE 점수에 기초하여 단일 최상의 모델을 선택하였고, 키메라의 자연적으로 발생된 잔기를 실험 증거로부터 도출된 돌연변이체 잔기로 돌연변이화시키고; 키메라의 개별 돌연변이체 구조의 돌연변이 에너지 및 이의 안정성을 계산하였고; 3원 DAA 복합체 (C3b-D2D3M3M4-Bb)를 구축하고, 이의 계면을 분석하였고; 3원 복합체 (C3b-멀티-4 돌연변이체-FI)를 구축하고, MD 시뮬레이션을 위해 사용하였다.

본 발명은 이중 활성 조절을 갖고, 인자 I에 대한 친화도 및 C3b/C4b에 대한 항원항체결합력이 증진된, 돌연변이체 멀티-5 (DCP)를 생성하는 4개의 도메인 DAF-MCP 키메라 단백질 (DCP)를 개시한다. DCP는 보체계 관련 병리학적 상태를 치료하기 위한 추가의 RCA 기반 치료제를 디자인하기 위한 선도 분자로서 사용될 수 있다.

본 발명은 이중 활성 조절을 갖고, 인자 I 및 C3b/C4b와의 상호작용 증진을 위해 추가로 변형되고, 서열 ID 19 (DCP)를 갖는 신규한 변형된 4개의 도메인 DAF-MCP 키메라 단백질을 개시한다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 인간 DAF 단백질로부터의 도메인 D2D3D4 및 MCP 단백질로부터의 M2M3M4 도메인을 가짐으로써 DAF 링커를 갖는 D2M2-4, MCP 링커를 갖는 D2M2-4, D2D3M3M4, 및 D2D3D4M4인 키메라/돌연변이체/단백질을 결과물로서 수득하는 키메라 단백질을 생성하는, DAF 및 MCP 도메인의 상이한 조합을 갖는 조작된 DAF-MCP 키메라로서; 조작된 단백질 D2D3M3M4는 인자 I 상호작용을 위해 기능 획득 돌연변이로 추가로 변형된 것인, 조작된 DAF-MCP 키메라를 개시한다. 도입된 돌연변이는 219ECREIY224에서 219ICEKVL224로의 돌연변이, 및 단일 아미노산 치환 F197I 및 P216K였다.

서열 번호: 4 내지 33의 조작된 키메라 단백질은 이중 활성 조절, 즉, DAA 및 CFA, 둘 모두를 갖는다.

본 발명은 강건한 CP- 및 AP-DAA 뿐만 아니라, C3b- 및 C4b-CFA 활성, 및 따라서, 고전적 경로 (CP), 대체 경로 (AP) 및 렉틴 경로 (LP)에 대해 강력한 억제 활성을 갖는 이중 활성 단백질에 최적인 프레임워크를 제공한다.

추가로, 본원에서 생성된 이중 활성 조절인자 (DCP, 서열 번호: 19)는 보체계 관련 병리학적 상태를 치료하기 위한 보체 활성화 조절인자 (RCA) 기반 치료제를 개발하기 위한 선도 분자로서의 역할을 할 수 있다. 본 발명의 키메라의 이중 활성 단백질 및 효과에 기인하여, 이들은 또한 시험관내 및 생체외 검정 시스템에서 CP, AP 및 LP 활성화를 억제시키는 시약으로 사용될 수 있다. 추가로, AP, CP 및 LP에 대한 상기 키메라의 특이성에 기인하여 키메라는 생체내에서 상이한 질환 병태에서의 상이한 경로의 중요성을 추가로 설명하고, 이들 경로에 의해 매개되는 병리를 억제하는 데 매우 유용하며, 따라서, 이중 활성을 제공하는 데 필요한 특이적인 구조적 특징 및 이로써, CP, AP 및 LP에 미치는 효과를 설명하고, 확인하는 데 있어 이는 유용하다.

키메라 단백질은 시험관내 및 생체내에서 상이한 질환 병태에서 상이한 경로를 설명하고, 이들 경로에 의해 매개되는 병리를 억제시키는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 키메라 단백질, 특시, 설명 번호: 4 내지 33은 이중 활성을 제공하는 데 필요한 특이적인 구조적 특징 및 이로써, CP, AP 및 LP에 미치는 효과를 설명하고, 확인하는 데 사용될 수 있다.

폴리펩티드 모방체(mimic)가 CP, AP 및 LP의 이중 억제에 필요한 특이적 백본 구조 및 측쇄 관능성을 제공할 목적으로 동등하게 잘 작용할 수 있다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다. 따라서, 자연 발생 아미노산, 아미노산 유도체, 유사체 또는 적절한 백본 구조를 형성하기 위해 결합될 수 있는 비-아미노산 분자의 사용을 통해 이중 억제제를 생성하는 것이 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 고려된다. 비-펩티드 유사체, 또는 펩티드 및 비-펩티드 성분을 포함하는 유사체는 보체 활성화를 억제시키는 예시된 폴리펩티드와 충분히 유사하도록 동일한 백본 구조적 특징 및/또는 다른 관능성을 갖는 것으로, 본 발명의 펩티드의 치환 또는 유도를 지정하기 위해 본원에서 종종 "펩티도모방체" 또는 "이소스테릭 모방체"로 지칭된다.

한 실시양태에서, 본 발명의 조작된 단백질은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 성분을 펩티드에 첨가함으로써 변형될 수 있다. 당업계에 널리 알려진 바와 같이, PEG화는 생체내에서 치료 펩티드 및 단백질의 반감기를 증가시킬 수 있다. 한 실시양태에서, PEG의 평균 분자량은 약 1,000 내지 약 50,000이다. 또 다른 실시양태에서, PEG의 평균 분자량은 약 1,000 내지 약 20,000이다. 또 다른 실시양태에서, PEG의 평균 분자량은 약 1,000 내지 약 10,000이다. 예시적인 실시양태에서, PEG의 평균 분자량은 약 5,000이다. 폴리에틸렌 글리콜은 분지쇄 또는 직쇄일 수 있으며, 바람직하게는 직쇄이다. 본 발명의 조작된 단백질은 연결기를 통해 PEG에 공유 결합될 수 있다.

한 측면에서, 당업계에 널리 알려져 있는 바와 같이, 폴리펩티드는 생리학적으로 허용되는 에스테르 또는 염의 형태로, 또는 임의의 것과 같은 생리학적으로 허용되는 양이온 또는 음이온과 조합된 형태로 제약 조성물에 존재할 수 있다. 폴리펩티드는 또한 그를 조성물로 제제화하기 전에 유도체화될 수 있다

한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 조성물로서 투여될 수 있다. 상기 제약 조성물은 대상체에게 투여하기에 적합한 형태로 본 발명의 조작된 폴리펩티드 단독으로 구성될 수 있거나, 또는 제약 조성물은 활성 성분 및 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 하나 이상의 추가 성분, 또는 이들의 일부 조합을 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 예컨대, 정맥내, 경구, 복강내, 진피내, 근육내, 비강내, 피하, 비강내, 척수내, 기관내 및 두개내와 같은 경로 중 어느 하나로 투여될 수 있다.

제약 조성물의 제제는 약리학 분야에 공지되어 있거나, 또는 추후 개발될 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법에는 활성 성분을 담체 또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 결합시킨 후, 이어서, 필요하거나, 또는 원하는 경우, 생성물을 원하는 단일 또는 다회 용량 단위로 성형하거나, 또는 패키징하는 단계를 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 신규한 조작된 단백질은 보체 매개 손상과 관련된 질환에서 치료제로서 유용하다. 보체 매개 질환의 예로는 발작성 야간 혈색소뇨증(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: PNH), 연령-관련 황반 변성 (AMD), 비정형 용혈성 요독 증후군 (aHUS), 및 고밀도 침착병 (DDD), 자가면역 질환, 예컨대, 실험 알레르기성 신경염(experimental allergic neuritis), II형 콜라겐 유발 관절염(type II collagen-induced arthritis), 중증 근무력증(myasthenia gravis), 용혈성 빈혈(hemolytic anemia), 사구체신염(glomerulonephritis), 및 면역 복합체 유발 혈관염(immune complex-induced vasculitis), 성인 호흡 곤란 증후군, 뇌졸중, 심장마비, 이종이식, 다발성 경화증, 화상, 체외 투석 및 혈액 산소 공급을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 키메라 단백질은 환자 (인간 또는 동물)의 혈청, 조직 또는 기관에서 보체 활성화를 억제시키는 데 사용될 수 있으며, 이는 연령-관련 황반 변성, 류마티스 관절염, 척수 손상, 파킨슨병, 알츠하이머병, 암, 및 호흡기 장애, 예컨대, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환(chronic obstructive pulmonary disease : COPD), 알레르기성 염증, 폐기종(emphysema), 기관지염, 기관지확장증(bronchiecstasis), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 결핵, 폐렴, 호흡 곤란 증후군(respiratory distress syndrome: RDS―신생아 및 성인), 비염 및 부비동염을 포함하나, 이에 제한되지 않는 특정 질환 또는 병태 치료를 촉진시킬 수 있다. 본 발명의 조작된 단백질은 또한 다양한 질환에서 보체 매개 병리의 억제, 이종이식 동안 인간 보체 매개 손상에 대한 저항성을 부여하기 위한 비인간 세포 및 조직에서의 발현, 체외 순환 동안 보체 억제, 암 요법을 위한 보체 억제, 인간 보체로부터 유전자 요법 벡터를 보호하기 위한 유전자 요법 벡터 (예컨대, 아데노 연관 바이러스 벡터) 상의 발현을 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 단백질을 세포 또는 장기 이식 동안 발생하는 보체 활성화를 억제시키는 데, 또는 인공 장기 또는 임플란트의 사용에서 (예컨대, 세포, 장기, 인공 장기 또는 임플란트를 본 발명의 펩티드로 코팅하거나, 또는 다르게 처리함으로써) 사용될 수 있다. 본 발명의 단백질은 생리학적 체액의 체외 단락 동안 발생하는 보체 활성화를 억제시키는 데 사용될 수 있다.

실시예

본원의 하기 실시예는 본 발명을 더욱 잘 이해할 수 있도록 하기 위해 제공되며, 이는 본 발명의 범주를 제한하지 않는다.

실시예 1. DAF의 CCP2 -3은 붕괴를 유도하는 반면, CCP4는 C3b 결합 도메인으로 작용함으로써 지원한다 - 도메인 스왑 전략법을 이용하여 DAF의 각 도메인의 역할을 측정하고, 돌연변이체를 생성하고, 시험하였다. DAF는 4개의 CCP 모듈로 구성되고, CCP2-4는 DAA를 위해 요구된다. 추가로, MCP에는 DAA가 없기 때문에, MCP 도메인 (M1-M3) 중 하나 이상의 것 및 링커와 DAF (D2-D4)의 상동성 도메인 및 연관된 링커의 스와핑 [도 1 참조, 도메인은 넘버링되어 있고, 경계는 수직선으로 마킹되어 있다. 수직선과 연관된 번호는 경계 잔기를 나타내고, 이는 유니프로트 넘버링에 따른 것이다. DAF 도메인을 연결하는 링커는 적색으로 마킹되어 있는 반면, MCP 도메인을 연결하는 링커는 청색으로 마킹되어 있고; 동일한 색상 스킴을 사용하여 DAF-MCP 키메라 중의 링커를 도시한다. D2M2-4 (ML)는 M1-M2 도메인간 링커를 포함하는 키메라를 나타낸다])을 스와핑하였다. 생성된 돌연변이체를 기능 획득에 대하여 시험하였다 (도 2 참조). 먼저, M1 및 부착된 모듈간 링커와 D2 및 연관된 링커를 스와핑하였다 (돌연변이체 D2M2-4). 흥미롭게도, 이러한 치환은 단독으로 비록 돌연변이체가 DAF와 비교하여 활성이 ~30배 더 적기는 하였지만, CP-DAA를 부여하는 데에는 충분하였다. 추가로, 돌연변이체는 활성에서 다른 모듈의 중요한 역할을 강조하면서, 감소된 AP-DAA를 나타내었다 (도 2a & b, 좌측 패널 참조). 도 2a에서, Inh.'는 억제제 농도를 나타낸다. 제시된 데이터는 표 S1에 요약되어 있는 3회의 독립 실험의 평균 ± SD이다. 점선 표시는 50% 활성을 나타낸다.

[표 S1]

추가로, 다음 도메인을 스와핑하기 전에 DAA에서 D2-D3 사이의 링커 (즉, KKKS; 순 양전하 +3)의 중요성을 시험하였다. 또한, 최근의 DAF-C3b 복합 구조는 링커 잔기가 C3b와 상호작용하고, 게다가, N-말단 CCP 주변의 양의 정전기 전위는 C3b/C4b의 초기 인식을 증진시키는 것으로 나타났다는 것을 보여주었다. 따라서, D2M2-4 중의 D2-D3 링커를 상동 위치에 존재하는 MCP의 중성 링커 (YRET)로 대체하였고, 생성된 돌연변이체 (D2M2-4-ML)는 어떤 CP-DAA 획득도 보이지 않았다 (도 2a, 좌측 패널 참조). 추가로, MCP 링커를 포함하는 D2M2-4 돌연변이체 (D2M2-4-ML) 또한 DAF 링커를 포함하는 D2M2-4 돌연변이체 (D2M2-4)와 비교하여 C3b 및 C4b에의 결합에서 상당한 손실을 보였다 (도 2c 및 도 6a 참조 [막대 그래프는 각 단백질 (1 μM)의 C3b 및 C4b에의 결합 후 정상 상태에서 달성된 RU를 나타낸다. 고정화된 C3b 및 C4b-비오틴의 양은 각각 3330 RU 및 1630 RU였다. 데이터는 3회의 독립 실험의 평균 ± SD이다]. 도 2c의 그래프는 y축에 반응 단위로 제시된 결합 상호작용의 센소그램 오버레이를 나타낸 것이다. 결합은 스트렙타비딘 칩에 고정화된 C3b-비오틴 (플로우 셀(Flow cell)-2) 및 C4b-비오틴 (플로우 셀-3) 상에 1 μM의 각 단백질을 가함으로써 측정하였다. 본원에 제시된 데이터는 도 6a에 제시된 3회의 독립 실험 중 하나이다.

제조된 다음 돌연변이체는 MCP 중의 연관된 링커와 함께 DAF의 2개의 N-말단 모듈 (D2D3M3M4)이 치환된 것이었고, 상기 돌연변이체의 DAA를 평가하였다. 돌연변이체는 DAF의 것과 동일한 CP-DAA 뿐만 아니라, AP-DAA를 보인 것으로 관찰되었다. MCP 중의 링커와 함께 DAF의 3개의 도메인을 치환하였을 때에는 DAA의 추가 증가는 없는 것으로 나타났고, 그에 반해, DAF와 비교하여 AP-DAA는 ~10배 감소된 것으로 나타났다 (도 2b, 우측 패널 참조). SPR 데이터에서는 C3b에 대한 상기 돌연변이체의 오프-속도가 D2D3M3M4보다 훨씬 더 느린 것으로 나타났고; 이의 오프-속도는 C4b에 대해서는 변함이 없었다 [도 6b를 참조한다 (본원에 제시된 데이터는 패널 6c에 제시된 3회의 독립 실험 중 하나이다)]. 본 데이터는 더 느린 오프-속도가 AP C3 컨버타제 복합체에 대한 조절인자의 재순환 속도에 영향을 주고, 이는 이의 AP-DAA를 감소시키는 결과를 초래한다는 것을 제안하였다. 종합하면, 상기 실시예는 붕괴는 오직 DAF의 CCP2-3에 의해서만 유도된다는 것을 시사한다. 그러므로, DAF 중의 D4 모듈은 단지 C3b 결합 도메인의 역할만을 할 뿐이며, 이의 기능은 M3-M4에 의해 치환될 수 있는 것은 자명하다.

D2D3M3M4 키메라 중 D2D3 모듈과 AP C3 컨버타제 서브유닛 (즉, C3b 및 Bb)의 가능한 상호작용에 관한 추가의 식견을 갖기 위해, C3b-D2D3M3M4-Bb 복합체를 모델링하였다. 계면 분석시, D2 및 D3은 C3b 뿐만 아니라, Bb, 둘 모두와 상호작용하는 것으로 관찰되었다. 즉, D2 및 D3은 C3b의 α' N-말단 영역 (α'-NT) 및 마크로글로불린-6 (MG6) 도메인과 계면을 형성하였다 (도 7a 참조). 추가로, D2 및 D2-D3 링커는 Bb 중 폰 빌레브란트 인자 A형 (VWA) 도메인의 α7-나선과 접촉을 형성한 반면, D3은 Bb 중 VWA 도메인의 α7-나선, 및 α6-βF 및 α5-βE 루프와 접촉을 형성하였다 (도 7b 참조). 이는 금속 이온 의존성 부착 부위 (MIDAS 부위, βA-α1, α3-α4 및 βD-α5 루프에 의해 형성)의 안정적인 구조가 VWA의 고친화성 구조 및 AP C3 컨버타제의 안정성 유지에 중요하다는 것을 제안하는 이전 연구에 공지되어 있다. 추가로, 이는 또한 α7-나선이 MIDAS 부위에 알로스테릭 방식으로 커플링되어 있다고 제안되었다. 본 모델링 데이터에서는 D2 및 D3은 α7-나선에 추가로 α6-βF 및 α5-βE 루프와 극도로 상호작용하는 것으로 나타났다. 따라서, 가능하게는 D2-D3과 이들 루프와의 상호작용이 C3b로부터 Bb의 붕괴를 유도하는, MIDAS 부위에서의 알로스테릭 변화에 중요한 것으로 보인다. 도 7은, 단백질 계면 분석 프로그램 PISA, www.ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/pistart.html에 의해 분석된, 모델링된 구조 C3b-D2D3M3M4-Bb 복합체 중 키메라와 C3b 및 Bb와의 계면을 도시한 것이다. C3b (a) 및 Bb (b)의 계면에 존재하는 D2D3M3M4 키메라의 D2-D3 도메인 중의 잔기는 (매립 표면적 (BSA) 점수를 나타내는) 수직 막대로 제시되어 있고, 명시되어 있다. 키메라의 상기 잔기와 상호작용하는 Bb 및 C3b의 영역 또한 수직 막대 위에 마킹되어 있다. 별표 마크는 앞서 돌연변이유발에 의해 DAA에 중요한 것으로 확인된 잔기를 나타낸다.

실시예 2. M2 뿐만 아니라, M3 상의 인자 I 상호작용 부위가 MCP의 최적의 CFA에 필요하다

최근 해결된 인간 C3b, 미니 FH 및 FI 복합체의 결정 구조는 C3b와 함께 FH의 CCP2 및 CCP3 (MCP의 M2 및 M3 모듈과 상동성)이 FI와 접촉하는 것으로 나타났다. 추가로, 바이러스 RCA 조절인자 (카포시카 및 HVS CCPH)의 CCP2-3이 CFA를 유도하는 것으로 나타났다. 이들 데이터는 FI 상호작용 부위가 인간 및 바이러스 RCA 단백질의 CCP2 및 CCP3에서 보존될 가능성이 있음을 제안하였다. 그러나, CFA에서 이러한 부위의 상대적인 중요성은 명확하지 않았다. 단독으로 M3 상의 FI 부위가 MCP에서 CFA를 구동하기에 충분한지 여부는 연구되지 않았다. 따라서, MCP의 M2 도메인에는 결여되어 있는 D2D3M3M4 키메라의 CFA를 조사하였다. 놀랍게도, 키메라는, 비록 C3b 및 C4b에 대한 CFA가 MCP의 것과 비교하였을 때, 각각 34배 및 35배 더 작기는 하였지만, C3b 뿐만 아니라, C4b에 대해 CFA를 보였다 [도 3a 및 도 8 (이들 단백질의 보조인자 활성은 상기 단백질을 C3b (a) 또는 C4b (b) 및 인자 I와 함께 PBS 중에서 37℃에서 명시된 시간 동안 인큐베이션시킴으로써 측정하였다. C3b/C4b의 절단 생성물은 환원 조건하에서 그를 SDS-PAGE (C3b의 경우, 9%, 및 C4b의 경우, 10%) 상에 전개시킴으로써 관찰하였다. C3b-CFA에서, α'-쇄는 N-말단 68 kDa 및 C-말단 46 kDa 단편으로 절단되고, 그 중 46 kDa 단편은 43 kDa 단편으로 추가로 절단된다. C4b-CFA에서, α'-쇄는 N-말단 27 kDa, 중심 C4d 및 C-말단 16 kDa 단편으로 절단되고; C-말단 단편은 겔 상에서 시각화되지 않는다)]. 따라서, 본 결과는 단독으로 M3 상에 존재하는 FI 상호작용 부위가 CFA에 기능적으로 기여할 수 있다는 것을 나타낸다.

D2D3M3M4 키메라에서 CFA 관찰 후, 상기 키메라의 CFA가 이의 DAA에는 영향을 주지 않으면서, (M2에 상동성인) D3 도메인 중의 FI 상호작용 부위를 치환함으로써 증진될 수 있는지 여부를 연구하였다. 다시 말해,, 고전적 및 대체 경로 C3 컨버타제, 둘 모두에 대한 강력한 DAA 및 CFA가 4개의 CCP 조절인자에 공존할 수 있을까? 이에 대한 해답을 얻기 위해, D3 중 추정 FI 상호작용 잔기의 치환을 수행하였고, 이전 돌연변이유발에 기초한 D2D3M3M4 돌연변이체의 부착된 링커를 바이러스 및 인간 RCA 단백질에서 연구하였다 [도 9 (다양한 보체 조절인자의 상동성 도메인과 DCP (멀티-5 돌연변이체)의 CCP1-4의 구조 기반 서열 정렬). DCP의 모델링된 구조를 PROMALS3D 도구 (http://prodata.swmed.edu/promals3d/)를 이용하여 DAF (PDB:1OJV), MCP (PDB:3O8E), 인자 H (PDB:2WII), CR1 (PDB:1GKG), 및 SPICE (PDB:5FOB)의 실험 구조, 및 CRRY에 기초하여 카포시카 및 HVS CCPH의 모델링된 구조 (PDB:2XRB)와 정렬시켰다. 청색 화살표 표시는 D2D3M3M4 키메라에서 CFA를 증진시킨 돌연변이 (F197I, S199K, P216K, 219ECREIY224에서 ICEKVL로)를 나타내고, 오렌지색 화살표 표시는 CFA를 증진시키지 않은 돌연변이 (T192E, K195Y, T200Y, L205K)를 나타낸다. 강조 표시된 잔기는 C3b 및 인자 I와 각 단백질의 계면을 나타낸다. 적색 박스는 CFA 손실을 초래한 이전의 돌연변이를 나타내고, 보라색 박스는 DAA 손실을 초래한 돌연변이를 나타낸다. (각 CCP 서열 시작시 제시된)) 도메인의 넘버링은 유니프로트 넘버링에 따라 이루어졌다)]. 본원에서, D2D3M3M4의 총 7개의 단일 잔기 돌연변이체 및 3개의 다중 잔기 돌연변이체 [도 3b (E. 콜라이에서 발현된 D2D3M3M4 및 이의 단일 잔기 및 다중 잔기 돌연변이체)]가 생성되었다. DAF의 상기 영역과 MCP의 상동성 영역의 조기 스와핑 결과로 DAF에 CFA가 도입되었는 바, 상기 돌연변이는 D3의 Cys2-Cys4 영역과 D3-M3 링커 (ECREIY) 사이에 존재한다. 단일 및 다중 잔기 돌연변이체의 생화학적 분석을 통해 다양한 결과 - CFA 획득이 28배까지 완전히 손실된 것으로 나타났다 [도 3c (상단에서부터 하단으로 기호 키의 순서는 라인 순서 (즉, 최저 활성부터 최고 활성까지)에 상응한다. 그래프에 제시된 데이터는 표 S1에 요약된 3회의 독립 실험의 평균이다)]. >2배의 C3b CFA 획득을 보인 치환으로는 단일 아미노산 돌연변이체, 예컨대, S199K, 및 P216K, 및 다중 잔기 돌연변이체, 예컨대, 멀티-1 (링커 치환 돌연변이체 - 219ECREIY224에서 ICEKVL로), 멀티-2 (링커 치환 + S199K) 및 멀티-3 (215DPL217에서 PKA로; 도 100a)를 포함하였다. 유사하게, >2배의 C4b CFA 획득을 보인 돌연변이로는 F197I, S199K, P216K, 멀티-2 및 멀티-3을 포함하였다 (도 3c, 도 10b 및 표 S1).

이어서, 이들 D2D3M3M4 돌연변이체의 DAA를 평가하고, 특히, CFA 획득을 보인 돌연변이에서 DAA 손실에 대해 살펴보았다 [도 11 ((a) 각 단백질의 CP-DAA는 미리 형성된 CP C3-컨버타제 (C4b2a)를 붕괴시킬 수 있는 이의 능력을 평가함으로써 측정하였다. (b) 각 단백질의 AP-DAA는 미리 형성된 AP C3-컨버타제 (C3bBb)를 붕괴시킬 수 있는 이의 능력을 평가함으로써 측정하였다. 억제제 (Inh) 부재하의 활성을 100% C3-컨버타제 활성으로 간주하여 데이터를 정규화하였다. 데이터는 3회의 독립 실험의 평균 ± SD이다) 및 표 S1]. 본 발명자들의 결과를 통해 CFA 획득을 보인 3개의 돌연변이체가 DAA 손실을 보인 것으로 입증되었다. 예를 들어, S199K, 및 멀티-2 및 멀티-3 돌연변이체에서 >2배의 AP-DAA 손실이 관찰되었다. 나머지 다른 3개의 돌연변이체 (F197I, P216K 및 멀티-1)는 AP-DAA 손실을 거의 보이지 않거나, 또는 전혀 보이지 않았다. 추가로, CFA 획득을 보인 돌연변이체 중 어느 것도 >2배의 CP-DAA 손실을 보이지 않았다. 그러므로, 본 데이터는 4개의 CCP의 구조적 프레임워크에 강력한 CFA 및 DAA가 공존하는 것이 달성가능하다는 전제를 뒷받침한다.

CFA 획득을 제공한 잔기가 CFA를 보이는 다른 RCA 단백질에서 보존되는지 여부를 조사하기 위해, 다양한 RCA 단백질의 서열 정렬을 수행하였다 (도 9). 활성 획득과 연관된 10개의 잔기 중 5개가 CFA가 있는 다른 단백질 중 제자리에서 보존되는 것으로 관찰되었다. 예를 들어, 보존된 이소류신은 DAF의 F197 및 E219와 유사한 위치에서 관찰되었다. 유사하게, 양으로 하전된 잔기는 DAF의 P216 및 E222에 필적하는 위치에 존재하였고, 음으로 하전된 잔기는 DAF의 R221과 유사한 위치에 존재하였다. 이들 잔기 중 DAF의 E219와 동일 선상의 위치에 있는 MCP(19)의 이소류신 돌연변이, 및 DAF의 P216 및/또는 E222에 상응하는 위치의 CR1, SPICE, 카포시카 및 CCPH의 양으로 하전된 잔기의 돌연변이는 CFA 손실을 보였다 (도 9).

실시예 3. 모체 분자만큼 강건한 DAA 및 CFA를 보이는 4개의 CCP DAF - MCP 키메라의 분자 조작

상기 실시예에서, 3개의 단일 잔기 돌연변이체 (F197I, S199K, P216K) 및 1개의 다중 잔기 돌연변이체 (멀티-1, 즉, 링커 치환 돌연변이체)는 중간 정도 내지 상당한 CFA 증가를 보였다 (도 3c 및 표 S1, 도 10a 및 10b). 그러므로, D2D3M3M4 키메라에서 이들 잔기의 집합적 치환은 DAF 및 MCP만큼 강력한 DAA 및 CFA를 갖는 분자를 생성할 수 있는 가능성이 있다고 생각할 수 있었다. 따라서, 상기 돌연변이 모두 D2D3M3M4에 도입된 것 (멀티-4), 및 S199K 돌연변이는 CFA를 증가시키지만, AP-DAA를 감소시키기 때문에, AP-DAA를 제외한 모든 돌연변이가 D2D3M3M4에 도입된 것 (멀티-5)인, D2D3M3M4의 다중 변이체 2개를 생성하였다 (표 S1). 상기의 두 돌연변이체의 CFA 연구 결과, 두 돌연변이체 모두 우수한 C3b CFA를 갖지만, 멀티-5는 MCP와 등가인 것으로 나타났다 (도 4a 및 도 12a). 그러나, 두 돌연변이체는 모두 MCP와 비교하여 더 우수한 C4b CFA (~2배 내지 3배)를 보였다 (도 4b 및 도 12b [도 12 (a)는 MCP, 멀티-4 및 멀티-5의 C3b 보조인자 활성 (C3b-CFA)을 도시한 것이고, (b)는 MCP, 멀티-4 및 멀티-5의 C4b 보조인자 활성 (C4b-CFA)을 도시한 것이다]. 상기 돌연변이가 이들 돌연변이체의 DAA에 영향을 주는지 여부에 대해서도 또한 측정하였다. 멀티-4 돌연변이체는 완전한 AP-DAA 손실 및 ~2.5배의 CP-DAA 손실을 보인 반면, 멀티-5는 DAF와 등가인 AP- 및 CP-DAA를 나타내었다 (도 4c & d 및 표 S1). 멀티-4 돌연변이체의 AP-DAA 손실과 일관되게, C4b가 아니나 C3b에의 이의 결합은 D2D3M3M4와 비교하여 동요된 것으로 나타났다 [도 6c (데이터는 3회의 독립 실험의 평균 ± SD이다)].

이어서, 위스랩 보체 스크린 ELISA를 이용하여 3가지 주요 보체 경로 모두에 대해 멀티-5 돌연변이체의 조절 활성을 시험하고, 이를 DAF 및 MCP와 비교하였다. 다양한 경로를 억제시키는 데 있어서 멀티-5가 DAF보다 2 내지 7.5배 활성이 더 컸고, MCP보다는 35 내지 225배 활성이 더 컸다 (도 12c 및 표 S2a). 따라서, 효율적인 CFA 및 DAA를 갖는 4개의 CCP 분자의 성공적인 디자인을 기술하였다. 멀티-5의 강력한 CFA 및 DAA에 기초하여, 상기 분자를 DCP (붕괴-보조인자 단백질)로 명명한다. CR1 억제제, 예컨대, LHR-A (CCP1-3) 및 이의 개선된 변이체 LHR-A^mut (CCP1-3, D109N/E116K)와 DCP를 억제 잠재능에 대해 비교한 결과, 렉틴 및 대체 경로를 억제시키는 데 있어 DCP가 LHR-A (CCP1-3)보다 더 강력하였고, 대체 경로를 억제시키는 데 있어 LHR-A^mut보다 더 강력한 것으로 나타났다 (도 12c 및 표 S2b). 그러나, 고전적 및 렉틴 경로를 억제시키는 데 있어서는 LHR-A^mut와 더 유사하였다.

[표 S2]

실시예 4. C3b -멀티-4 돌연변이체- FI 복합체의 분자 역학 시뮬레이션을 통해 FI와 키메라 중 돌연변이화된 잔기의 상호작용에 관한 정보를 밝힌다.

상기에서 설명된 실시예에서는 D2D3M3M4 돌연변이체에서 치환되었을 때, CFA 획득을 부여하는 잔기가 확인되었다. 이들 잔기가 FI 및 C3b와의 분자적 상호작용에 미치는 영향을 이해하기 위해, C3b-FH-FI 구조에서 키메라로 FH를 대체함으로써 C3b-멀티-4 돌연변이체-FI의 3원 복합체의 구조적 모델을 생성하였다. 예측된 3원 복합체에 대해 (50 ns 동안) 분자 역학 시뮬레이션을 수행하여 이들 돌연변이가 안정성, 및 FI 및 C3b와의 상호작용에서의 이의 역할에 미치는 영향을 강조하였다 (도 5 참조). RMSD를 계산하여 전체 시뮬레이션 기간 동안 단백질에서의 구조 변이를 특성화하였다 (도 13ai 참조). RMSD는 작은 변화 및 평탄부를 보이며, 전체 시뮬레이션 기간 동안 안정적인 것으로 나타났다. 잔기별 변동을 이해하기 위해 키메라에 대해 RMSF 플롯을 계산하였다. RMSF 플롯 결과, D2D3M3M4 키메라 및 멀티-4 돌연변이체 구조 사이의 변동 패턴을 유사한 것으로 나타났다 (도 13aii & 도 13aiii) ((i) 50 ns 시뮬레이션 동안 C3b-멀티4-FI 복합체의 백본 RMSD. (ii) 전체 시뮬레이션 시간 동안 키메라 잔기의 제곱 평균 제곱근 변동 (RMSF). (iii) 기능 획득 돌연변이가 확인된 영역에 위치하는 멀티-4 돌연변이체 잔기의 RMSF를 보여주는 플롯).

시뮬레이션된 구조에서 평가된 C3b 및 FI와 키메라의 상호작용은 키메라의 I197 및 I219가 잔기 W393, P402, L404, I407, V408, I409, 및 Y411에 의해 형성된 FI의 소수성 포켓에 수용된다는 것을 보여주었다. 유사하게, L224 (링커 잔기)는 잔기 I357, G362, I363, A360, V396, V397, W399 및 I400에 의해 형성된 FI의 인접한 소수성 포켓에 위치한다 (도 5b 참조 (좌측 패널, I197 및 I219는 잔기 W393, P402, L404, I407, V408, I409, 및 Y411에 의해 형성된 상부 소수성 포켓에 위치하는 반면, L224는 잔기 I357, G362, I363, A360, V396, V397, W399 및 I400에 의해 형성된 하부 소수성 포켓에 위치한다. 좌측 패널에 제시된 소수성 포멧이 다시 제시되어 있고, 원으로 마킹되어 있다)). 따라서, FH-FI에 대해 앞서 보고된 바와 같이, 상기 잔기의 소수성 상호작용은 키메라 및 FI의 안정성을 증진시키는 데 중요한 것으로 보인다. 추가로, 링커 영역에 위치하는 잔기 K216 및 Glu221은 염 다리 상호작용을 통해 FI의 잔기 D438 및 K358과 상호작용한다. 돌연변이체 잔기 K199 및 K222는 측쇄 방향이 FI 계면에서 멀어지기 때문에 어떠한 상호작용도 나타내지 않는다. 이는 (멀티-5에서) K199를 Ser로 역전시키는 것이 CFA에 큰 영향을 미치지 않는 이유를 설명한다. 그러나, S199 잔기는 Bb의 VWA 도메인의 α7 및 α6-βF 루프와의 접촉과 관련하여 높은 BSA 점수를 가진다 (도 7b 참조). 모델링된 구조 C3b-D2D3M3M4-Bb 복합체에서 C3b 및 Bb와 키메라의 계면을 단백질 계면 분석 프로그램 PISA, www.ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/pistart.html에 의해 분석하였다. C3b (a)와 Bb (b)의 계면에 있는 D2D3M3M4 키메라의 D2-D3 도메인 중의 잔기는 (매립 표면적 (BSA) 점수를 나타내는) 수직 막대로 제시되어 있다. 키메라의 상기 잔기와 상호작용하는 Bb 및 C3b의 영역 또한 수직 막대 위에 마킹되어 있다. 별표 마크는 앞서 돌연변이유발에 의해 DAA에 중요한 것으로 확인되었고, 그러므로, 가능하게는 K199S 역전 후 AP-DAA 획득의 주요부를 차지하는 잔기를 나타낸다. 흥미롭게도, FI의 D403은 D3의 K195 및 M3의 S214와 수소 결합을 형성함으로써 가교 잔기로 작용하고, 키메라의 D3-M3 도메인 배위에 관여할 수 있다 (도 14c 참조 (주의 - Lys195는 M3 도메인의 Ser214와 이의 수소 결합에 의해 지원을 받는 FI의 Asp403과의 전하 상호작용을 나타낸다. V178은 FI의 Trp399와 파이-알킬 결합을 나타낸다)). 추가로, 잔기 E179 및 E177은 FI의 잔기 R480과 염 다리 네트워크를 형성한다. 키메라의 잔기 V178은 FI의 W399와 파이-알킬 상호작용을 형성한다 (도 14c 참조). 전반적으로, FI와 키메라의 링커 및 연관된 영역의 상호작용 패턴은 본 발명자들의 실험 연구 및 데이터와 일치한다. C3b 도메인과 멀티-4 돌연변이체의 상호작용은 도 14a (확대/축소 뷰는 α'-NT, MG6, MG2, CUB, MG1, 및 TED 도메인 중의 상호작용 잔기를 나타낸다) & 도 14b (멀티-4 돌연변이체의 C3b 상호작용 잔기는 그와 상호작용하는 C3b 도메인에 따른 것이다)에 도시되어 있다. 도메인-특이적 상호작용은 DAF 및 MCP와 유사한 것으로 나타났다.

실시예 5. DAF , MCP , DAF - MCP 키메라 및 D2D3M3M4의 치환 돌연변이체 및 CR1 LHR-A ( CCP1 - 3)의 구축 - 인간 DAF (D1-D4) 및 MCP (M1-M4)를 이의 각 cDNA로부터 증폭시키고, 효모 발현 벡터 pPICZα (인비트로겐(Invitrogen: 미국 캘리포니아주 칼즈배드)) 뿐만 아니라, 박테리아 발현 벡터 pET-28b에 클로닝하였다. 본원에 기술된 바와 같이 유전자 스플라이싱 및 중첩 확장 방법을 사용하여 DAF-MCP 키메라를 구축한 후, 이어서, 효모 발현 벡터 pPICZα에서, 또는 박테리아 발현 벡터 pET-28b에 클로닝하였다. CR1 LHR-A (CCP1-3)을 CR1 cDNA로부터 증폭시키고, 이의 발현을 위해 pET-28b에 클로닝하였다. DAF, MCP 및 CR1의 필요한 영역을 증폭시키는 데 사용된 프라이머 세트는 표 S3에 열거되어 있다. 퀵-체인지 부위 지정 돌연변이유발 키트 II (스트라타진(Stratagene: 미국 캘리포니아주 라호야)를 사용하여 D2D3M3M4 및 CR1 LHR-A (CCP1-3)의 치환 돌연변이체를 구축하고, 박테리아 발현 벡터 pET-28b에 클로닝하였다. 부위 지정 돌연변이유발에 사용된 돌연변이유발 프라이머는 표 S3 및 S4에 열거되어 있다. DAF 결실 돌연변이체 D2-D3을 DAF cDNA로부터 증폭시키고, pET-28b에 클로닝하였고; 사용된 프라이머 세트는 표 S3에 열거되어 있다. 클로닝 후, 구축물 모두 DNA 서열분석 (퍼스트 베이스 라보라토리즈 Sdn Bhd(1st Base Laboratories Sdn Bhd: 말레이시아))에 의해 검증하였다. 발현을 위해, pPICZα에 클로닝된 단백질/돌연변이체를 제조사의 프로토콜에 따라 피치아 파스토리스 내로 통합시킨 반면, pET-28b에 클로닝된 것은 에스케리키아 콜라이 BL21 (DE3) 세포로 형질전환시켰다.

[표 S3]

실시예 6. DAF , MCP , DAF - MCP 키메라 및 D2D3M3M4의 치환 돌연변이체의 발현 및 정제

인간 DAF, MCP 및 DAF-MCP 키메라, 즉, D2M2-4 (D2-D3 사이의 DAF 링커를 함유하는 키메라) 및 D2M2-4-ML (M1-M2 사이의 DAF 링커를 함유하는 키메라)을 기술된 바와 같이 P. 파스토리스에서 발현시키고, 하기와 같이 정제하였다. 먼저, 발현된 모든 단백질을 한외여과에 의해 농축하고, 얼음 상의 80% 황산암모늄을 사용하여 침전시켰다. 이어서, 수득된 펠릿을 PBS에 용해시키고, 추가로 프로세싱하였다. DAF의 정제를 위해, PBS에 용해된 펠릿을 500 mM NaCl과 혼합하고, 500 mM NaCl을 함유하는 PBS로 미리 평형화된 DEAE-세파셀(Sephacel) 칼럼 (시그마(Sigma: 미국 미주리주 세인트루이스))에 로딩하였다. 수득된 통과액을 완충제 교환을 위해 PD-10 칼럼 (GE 헬쓰케어 라이프 사이언시스: 미국 펜실베이니아주 피츠버그)에 통과시키고, 20 mM 트리스(Tris), pH 8.0 중 모노 Q(Mono Q) 칼럼에 로딩하였다. 결합된 DAF의 용출은 0 내지 500 mM NaCl의 선형 구배를 통과시킴으로써 달성하였다. MCP 및 키메라(D2M2-4-DL 및 D2M2-4-ML)의 정제를 위해, PBS에 용해된 펠릿에 대하여 10 mM 인산나트륨, pH 7.4에 대한 완충제 교환을 수행하고, 동일한 완충제 중 DEAE-세파셀 칼럼에 로딩하였다. 결합된 단백질은 0-500 mM NaCl의 선형 구배로 용출시켰다. MCP 또는 각각의 키메라를 함유하는 분획을 풀링하고, 20 mM 트리스, pH 8.0으로 교환하고, 모노 Q 칼럼에 로딩하고, 0-500 mM NaCl의 선형 구배로 용출시켰다. 상기 모든 정제에서 용출된 분획에 대해 적절한 항체를 사용하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다 (도 15a 및 15b 참조). 모든 정제된 단백질을 PBS에서 투석하고, 한외여과에 의해 농축시켰고; SDS-PAGE에 의해 측정된 바, 단백질은 모두 순도가 95%를 초과한 것으로 나타났다 (도 15a에서, (i) DAF, MCP 및 DAF-MCP 키메라. (ii) D2D3M3M4의 단일 잔기 돌연변이체. (iii) D2D3M3M4의 다중 잔기 돌연변이체 - 멀티-1, 멀티-2, 멀티-3, 멀티-4 및 멀티-5와 CR1 LHR-A (CCP1-3) 및 이의 이중 돌연변이체 CR1 LHR-A (CCP1-3 D109N/E116K) 및 (PBS (pH 7.4)로 미리 평형화된 슈퍼로스-12 칼럼 (GE 헬쓰케어 라이프 사이언시스) 상에 로딩하였다. 사용된 겔 여과 표준 (바이오-래드)은 a, 티로글로불린 (670,000 Da); b, 감마 글로불린 (158,000 Da); c, 오브알부민 (44,000 Da); d, 미오글로빈 (17,000 Da); e, 비타민 B-12 (1,350 Da)였다) 및 15b (i) DAF, MCP 및 DAF-MCP 키메라. (ii) D2D3M3M4의 단일 및 다중 잔기 (멀티-1) 돌연변이체. (iii) D2D3M3M4의 다중 잔기 돌연변이체. (iv) CR1 LHR-A CCP(1-3) 및 이의 이중 돌연변이체 CR1 LHR-A (CCP1-3 D109N/E116K) 및 (모든 단백질은 환원 조건 (R) 및 비환원 조건 (NR)하에 9% SDS-PAGE 상에서 전개시키고, 쿠마시 블루(Coomassie blue)로 염색하였다).

인간 DAF 및 MCP를 또한 E. 콜라이에서도 발현시켰다. E. 콜라이에서 발현된 다른 돌연변이체로는 DAF 돌연변이체 D2D3, DAF-MCP 키메라 D2D3M3M4 및 D2D3D4M4, 및 D2D3M3M4의 치환 돌연변이체를 포함한다. CR1 LHR-A (CCP1-3) 및 이의 돌연변이체 CR1 LHR-A^mut (CCP1-3, D109N/E116K) 또한 E. 콜라이에서 발현시켰다. 상기 단백질의 발현은 본질적으로 앞서 기술된 바와 같이 수행하였다. 간략하면, 단백질은 봉입체에 존재하는 바, 요소 존재하에 Ni-NTA 칼럼을 사용하여 단백질을 정제하였다. 이어서, 고속 희석 방법으로 리폴딩하고, 겔 여과 칼럼 (슈퍼로스 12; GE 헬쓰케어 라이프 사이언시스)을 통과시켰다. 모든 단백질은 크기 배제 크로마토그래피 프로파일에서 단분산 집단의 존재 및 환원 및 비환원 조건 (이황화 결합 형성 표시)하에 SDS-PAGE에서의 이동성 차이에 의해 판단되는 바와 같이 적절하게 리폴딩되었다 (도 15a 및 15b). E. 콜라이에서 발현된 모든 단백질의 순도는 SDS-PAGE에 의해 측정된 바, 95%를 초과하였다.

실시예 7. CP 및 AP C3- 컨버타제 붕괴 촉진 활성 검정

앞서 기술된 용혈성 검정법을 이용하여 DAF, DAF-MCP 키메라 및 D2D3M3M4의 돌연변이체의 고전적/렉틴 및 대체 경로 C3-컨버타제 붕괴-촉진 활성을 측정하였다. 간략하면, 정제된 보체 성분을 이용하여 적혈구 상에서 각 컨버타제를 형성하고, 조절인자의 존재 또는 부재하에 붕괴를 허용하였다. 적혈구를 40 mM EDTA를 함유하는 기니피그 혈청 (C3-C9의 공급원)과 함께 인큐베이션시키고, 용해를 측정함으로써 남은 컨버타제의 활성을 추정하였다. 수득한 데이터는 억제제 부재하에 발생한 용혈을 100% C3-컨버타제 활성으로 간주하여 정규화하였다. 이어서, 수득한 활성을 농도에 대해 플롯팅하여 효소 활성을 50% 억제시키는 필요한 억제제 농도 (IC₅₀)를 측정하였다. 각 억제제를 다양한 농도에서 시험하여 억제가 이루어지는 농도 범위를 결정한 후, 3개의 특정 농도에서 시험하여 앞서 이전에 수행된 것과 같이 IC₅₀을 측정하였다 (도 2, 4, 11).

실시예 8. C3b 및 C4b 보조인자 활성 검정

각각의 조절인자를 (기술된 바와 같이 정제된) C3b 또는 C4b (컴플리먼트 테크놀로지, 인크.(Complement Technology, Inc.: 미국 텍사스주 타일러)) 및 세린 프로테아제 인자 I와 함께 인큐베이션시키고, C3b/C4b 절단을 측정하여 MCP, DAF-MCP 키메라 및 D2D3M3M4의 돌연변이체의 보조인자 활성을 측정하였다. 간략하면, C3b (10 ㎍) 또는 C4b (15 ㎍)를 1 μM (C3b의 경우) 또는 2 μM (C4b의 경우)의 조절인자 및 250 ng (C3b의 경우) 또는 500 ng (C4b의 경우)의 인자 I와 총 반응 부피 75 ㎕로 혼합하고, 37℃에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 명시된 시점에 15 ㎕의 분취물을 취하고, DTT를 함유하는 샘플 완충제와 혼합하고, C3b/C4b의 α'-쇄 절단을 측정하기 위해 9% (C3b의 경우) 또는 10% (C4b의 경우) SDS-PAGE 겔 상에서 전개시켰다. α'-쇄의 비율(%)은 퀀티티 원(Quantity one) 소프트웨어 (바이오- 래드)를 이용하여 밀도계 분석에 의해 계산하였고; α'-쇄의 양은 β-쇄 (로딩 대조군)로 정규화하였다. 시간 대비 α'-쇄 of C3b/C4b의 절단율(%) 플롯은 C3b/C4b의 α'-쇄의 50% 절단을 제공하였다. 활성 차이가 ≥3배인 것은 유의적인 것으로 간주하였다 (표 S1).

실시예 9. 표면 플라즈몬 공명 측정

DAF, MCP, DAF-MCP 키메라 및 D2D3M3M4의 치환 돌연변이체의 C3b 및 C4b에의 결합 측정을 비아코어 2000 (비아코어 AB: 스웨덴 웁살라)에서 수행하였다. 먼저, EZ-링크 PEO-말레이미드 활성화 비오틴 (피어스(Pierce: 미국 일리노이주 록퍼드))을 이용하여 이의 유리 -SH 기에서 비오티닐화된 표적 단백질 C3b 및 C4b를 스트렙트아비딘 칩 (센서 칩 SA(Sensor Chip SA); 비아코어 AB)의 플로우 셀 2 및 3상에 고정화시켰다. 비오티닐화된 소 혈청 알부민 (BSA)으로 고정화된 플로우 셀-1이 대조군 플로우 셀로 작용하였다. 이어서, PBS-T 중의 각 분석물 (DAF, MCP 및 DAF-MCP 키메라 및 D2D3M3M4의 돌연변이체)을 25℃에서 50 ㎕/min의 속도로 칩 위로 유동시켜 결합을 측정하였다. 분석물의 결합 및 해리는 각각 120 s 및 180 s 동안 측정하였고, 칩 재생은 0.2 M 탄산나트륨, pH 9.5의 30 s 펄스에 의해 달성되었다. 특이적 결합 반응은 표적 단백질 고정화된 플로우 셀 데이터에서 대조군 플로우 셀 데이터를 감산함으로써 도출되었다 (도 2c 및 6b).

실시예 10. CP, AP 및 LP에 미치는 효과 측정을 위한 ELISA

위스랩 보체계 스크린 ELISA 검정법 (유로 디아그노스티카(Euro-Diagnostica: 스웨덴 말뫼))을 사용하여 MCP, DAF, CR1 LHR-A (CCP1-3) 및 CR1 LHR-A^mut (CCP1-3, D109N/E116K)의 억제 활성을 이용하여 멀티-5 돌연변이체의 상대적인 보체 경로 특이적 억제 활성을 시험하였다. 본원에서, 각 시험 단백질을 경로 특이적 희석제 중에 등급화된 농도로 제조하고, 매뉴얼에 상세히 설명된 바와 같이 고정된 비율의 정상 인간 혈청 농축물과 혼합하였다. 이어서, 반응 혼합물 (100 ㎕)을 경로 특이적 활성인자로 코팅된 마이크로타이터 웰에 첨가하고, 37℃에서 60 min 동안 유지시켰다. 이어서, 웰을 키트에 제공된 세척액으로 3회 세척하고, 알칼리성 포스파타제로 표지된 C5b-9에 대한 항체 (100 ㎕)와 함께 실온에서 30 min 동안 인큐베이션시켰다. 웰을 다시 세척 용액으로 3회 세척하고, 기질 (100 ㎕)과 함께 실온에서 30 min 동안 인큐베이션시켰다. 흡광도는 마이크로플레이트 판독기에서 405 nm에서 판독하였다. 조절 단백질의 존재하의 혈청 활성의 수준을 단백질 부재하에 측정된 활성 대비의 비율(%)로 표시하였다 (도 12c).

실시예 11. D2D3M3M4 키메라의 모델링

DAF (유니프로트 ID: P08174) 및 MCP (유니프로트 ID: P15529)의 서열을 유니프로트 프로테인(UniProt Protein) 서열 데이터베이스로부터 검색하였다. D2D3의 서열을 DAF로부터 추출하고, MCP로부터 M3M4를 추출하여 키메라 서열을 구축하였다. 각각 C3b-DAF (PDB id: 5FOA) 및 C3b-MCP (PDB id: 5FO8)의 공-결정 구조로부터 DAF 및 MCP의 구조적 좌표를 분리하였다. DAF 및 MCP 주형 구조에 기초하여 키메라 (D2D3M3M4)의 구조를 디스커버리 스튜디오 v 3.5(Discovery Studio v 3.5; 다쏘 시스템즈 바이오비아 2016(Dassault Systemes BIOVIA 2016)에서 실행된 Modeller 9.11을 사용하여 모델링하였다. 이어서, 루프 모델링 옵션을 사용하여 루프 영역을 모델링하였다. DOPE 점수에 기초하여 단일 최상의 모델을 선택하였다. 예측된 모델의 입체화학적 품질은 PROCHECK 및 PROSA-Web 서버를 사용하여 평가하였다. 이어서, 디스커버리 스튜디오를 사용하여, 키메라의 자연 발생 잔기를 본문에 설명된 대로 실험적 증거에서 도출된 돌연변이체 잔기로 돌연변이화하였다. 이어서, 키메라의 돌연변이체 구조에 대해 이의 돌연변이 에너지와 이의 안정성을 계산하였다 (도 5).

실시예 12. 3원 DAA 복합체 ( C3b - D2D3M3M4 -Bb) 구축 및 이의 계면 분석

상기 모델링된 키메라 D2D3M3M4 구조와 함께 DAF-C3b (PDB id: 5FOA) 및 C3bBb (PDB id: 2WIN)의 주형 구조를 이용하여 조절인자로서 키메라 D2D3M3M4를 포함하는 DAA 3원 복합체를 모델링하였다. 간략하면, D2D3M3M4 키메라를 C3b-DAF 구조 중 DAF에 중첩시켜 D2D3M3M4-C3b 복합체를 제조하였다. 이어서, C3b 분자를 참조로 하여 함께 D2D3M3M4-C3b 및 C3bBb를 중첩시켜 C3b-D2D3M3M4-Bb인 3원 모델을 생성하였다. 경사 하강법에 의해 최종 3원 복합체에 대하여 에너지 최소화를 수행하였다. PISA (단백질 계면 분석 프로그램(Protein interface analysis program), www.ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/pistart.html)에 의해 3원 복합체의 계면 분석을 수행하여 C3b와 D2D3M3M4 뿐만 아니라, Bb와 D2D3M3M4 사이의 상호작용을 이해하였다 (도 7).

실시예 13. 3원 복합체 ( C3b -멀티-4 돌연변이체- FI ) 구축 및 MD 시뮬레이션

C3b-FH-FI의 삼원 복합체 (PDB id: 5O32)는 PDB에서 검색되었고, 멀티-4 돌연변이체의 모델을 복합체의 FH 분자에 대해 중첩시켰다. FH의 좌표를 제거하고, UCSF 키메라를 사용하여 C3b-멀티-4 돌연변이체-FI의 3원 복합체를 생성했다. 이어서, GROMACS 5.0.4 패키지를 이용하여 OPLS-AA 역장을 이용함으로써 C3b-멀티-4 돌연변이체-FI의 생성된 3원 복합체에 대해 MD 시뮬레이션을 수행하였다. 단일 점 전하 (SPC) 물 모델을 이용하여 단백질을 용매화시키고, NA+ 카운터 이온을 이용하여 중화시켰다. 경사 하강 에너지 최소화에 의해 용매화된 구조를 최소화화한 후, 이어서, 단백질에 적용된 위치 제한하에 NVT 앙상블에서 500 ps 평형을 수행하였다. 이어서, NPT 앙상블을 사용하여 2 ns 동안 시스템을 평형화시켰다. 마지막으로 각 3원 복합체 시스템에 대해 NPT 앙상블에서 50 ns 제조 실행을 수행하였다. 주기적인 경계 조건하에 시뮬레이션 전반에 걸쳐 2 fs의 시간 단계를 사용하였다. 2 fs의 시간 단계를 허용하면서 LINCS 알고리즘을 사용하여 수소 원자에 대한 모든 결합을 제한하였다. 컷오프 거리가 1.2 nm하에 PME 알고리즘을 사용하여 장거리 정전기 상호작용을 사용하여 계산하였다. GROMACS에서 실행된 g_클러스터 도구를 사용하여 RMSD 컷오프 2.0 Å하에 전체 궤적에서 구조적 클러스터링을 수행하였다. 각 시스템의 최고 조밀 클러스터로부터 단일 대표 구조를 추출하였다. VMD를 사용하여 궤적을 분석하고, 디스커버리 스튜디오(다쏘 시스템즈 바이오비아 2016)를 사용하여 시뮬레이션 이미지를 생성하였다(도 5 및 13a).

실시예 14. D2M2 -4의 기능 획득 돌연변이체 구축 및 클로닝 - D2M2-4 키메라 (DAF-링커 포함)의 구축 및 이의 생화학적 특성화 결과, 상기 분자는 보조인자 활성 뿐만 아니라, 붕괴 촉진 활성, 둘 모두를 가지는 것으로 나타났다. 추가로, 최적의 C3b-CFA 및 C4b-CFA를 나타내었지만, 단지 부분적인 CP-DAA 및 감소된 AP-DAA만을 나타내었다. 그러나, 전반적으로, 분자는 3개의 경로 (AP/CP/LP) 모두에 작용하였고, 이의 억제 활성은 LP 및 AP에 대한 DAF와 유사하였는데; CP에 대한 DAF와 비교하여 ~3.7배 더 낮은 억제 활성을 보였다. 따라서, D2M2-4 분자는 또한 최적의 CFA 및 DAA를 갖는 분자 생성할 수 있는 우수한 후보였다. 따라서, D2M2-4 키메라의 AP-DAA 최적화를 모색하였다. 본원에서 암묵적인 가정은 CFA 및 DAA에 대한 기능 부위가 비-중첩 방식으로 4-CCP 구조에 걸쳐 공간적으로 보존된다는 것이다. 키메라의 D2, M2 및 M3 도메인의 13개 잔기가 치환되었다. 상기 잔기는 DAF 및 다른 RCA 조절인자에서 AP-DAA에 중요한 것으로 나타났다 (도 16). 구체적으로, 본 발명자들의 돌연변이유발 연구는 인간 조절인자 및 바이러스 조절인자에서의 돌연변이유발에 의해 가이드되었다 (도 16c). 단일 아미노산 치환 돌연변이체의 생성은 부위 지정 돌연변이유발 접근법에 의해 달성되었다. 13개의 치환 위치 및 돌연변이의 근거는 도 16a에 제시되어 있다.

돌연변이체를 생성하기 위해, 돌연변이를 먼저 먼저 pGEMT에 클로닝된 D2M2-4 구축물에 도입하였다. 이러한 돌연변이는 (D2D3M3M4 돌연변이체 생성에 사용된 것과 동일한) 스트라타진으로부터 입수한 상업적으로 이용가능한 퀵-체인지 부위 지정 돌연변이유발 키트를 사용하여 도입하였다. 원하는 돌연변이를 갖는 pGEMT 클론을 제한 분해 및 서열분석에 의해 확인하였다. 검증 후, 모든 클론을 pET-28b 발현 벡터에 서브클로닝하고, 제한 분해 및 서열분석에 의해 재검증하였다.

실시예 15. D2M2 -4 돌연변이체의 발현, 정제, 및 리폴딩

D2M2-4의 기능 획득 돌연변이체의 pET 클론을 에스케리키아 콜라이 BL21 세포에 형질전환시키고, 발현을 유도하였다. 이어서, 발현된 돌연변이체에 대해 Ni-NTA 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 요소를 사용하여 변성 조건하에 봉입체로부터 정제하였다. 정제된 단백질을 고속 희석 방법으로 리폴딩하고, 겔 여과 크로마토그래피에 로딩하여 응집체를 제거하고, 이의 단분산 집단을 수득하였다. SDS-PAGE 분석으로부터 관찰되는 바와 같이, 모든 돌연변이체의 순도는 95%를 초과하였다 (도 16b). 리폴딩된 돌연변이체의 겔 여과 후, 정제된 단백질은 단분산 집단을 가질 것으로 예상되었고, 이러한 예상 내용을 검증하기 위해, 슈퍼로스 12 겔 여과 칼럼 (GE 헬쓰케어 라이프 사이언시스) 상에서의 분석 실행을 수행하였다. 단백질은 모두 겔 여과에서 단분산 집단을 나타내었다 (프로파일은 도 17에 제시된 바와 같다).

실시예 16. D2M2 -4 치환 돌연변이체의 고전적 경로 붕괴 촉진 활성의 특성화

D2M2-4의 상기 단일 아미노산 치환 돌연변이체는 AP-DAA를 획득한 것으로 예상되었다. 그러나, 이전 데이터로부터 본 발명자들은 DAF에서 AP-DAA에 중요한 것으로 나타난 일부 잔기가 CP-DAA에도 중요하다는 것을 알고 있다. 따라서, 일부 돌연변이체에서는 AP-DAA 뿐만 아니라, CP-DAA 획득도 예상되었다. 13개의 D2M2-4 돌연변이체 모두의 CP-DAA를 측정하였고, 2개의 돌연변이체 (I134A 및 L161K)가 약 2배의 활성 증가를 보였다. I134A 돌연변이는 이 위치에서 F에서 A로의 돌연변이가 이의 CP-DAA를 183%만큼 증가시켰다는 것을 보여주는 DAF 돌연변이 데이터를 기반으로 하였다. 한편, L161K 돌연변이는 상기 위치에서의 양전하 제거가 이의 CP-DAA를 감소시킨다고 밝힌 DAF 및 카포시카 돌연변이 데이터에 기초하였다 (도 18). 이러한 기능 획득 돌연변이체 외에도, CP-DAA 획득을 보이지 않았거나, 또는 CP-DAA 손실을 보인 일부 돌연변이체 또한 존재하였고, 이는 국소 환경이 상호작용에 크게 영향을 미친다는 것을 시사한다.

실시예 17. D2M2 -4 치환 돌연변이체의 대체 경로 붕괴 촉진 활성의 특성화 .

앞서 언급한 바와 같이, 이러한 돌연변이체를 디자인하기 위한 이유는 AP-DAA를 획득하고자 하는 것이었고, 따라서, 상기에서 계획된 모든 부위 지정 돌연변이체는 D2M2-4 키메라의 AP-DAA의 증진을 위한 것이었다. 이들 돌연변이체의 AP-DAA를 평가하였고, 돌연변이체 중 4개, 즉, E136Q (D2), Y101N, I134A 및 L161K는 AP C3-컨버타제 붕괴 활성에서 상당한 개선을 나타내었다 (도 19). 따라서, D2M2-4 키메라에서 AP-DAA의 기능 획득이 달성되었다. E136Q (D2) 및 Y101N 돌연변이는 D2M2-4와 비교하여 AP-DAA에서 5.6배 및 7.2배 증가를 보였다. 유사한 위치에서 DAF의 E/Q 변이가 DAA를 154% 증가시킴에 따라 이어짐에 따라 DAF에 기초하여 E136Q (D2) 돌연변이를 생성하였다. 이러한 단백질의 동일선상 위치에 N의 존재가 이의 AP-DAA에 중요한 것으로 나타났는 바, DAF 및 CR1에 대한 돌연변이유발 데이터를 기반으로 Y101N 돌연변이가 이루어졌다. AP-DAA 돌연변이의 다른 두 가지 획득, I134A 및 L161K 또한 D2M2-4와 비교하여 AP-DAA에서 6.7베 및 3.4배 획득을 보였다. 이러한 돌연변이는 DAF/카포시카를 기반으로 디자인되었다. 중요하게도, 이러한 돌연변이 또한 CP-DAA 획득을 보였다. 요약하면, 본 실시예를 통해 D2M2-4의 AP-DAA를 유의적으로 증진시키는 4개의 잔기가 확인되었다. 그러나, 어떤 돌연변이도 DAF 분자의 AP-DAA와 비교할 수 있는 강건한 획득을 나타내지 않았다.

실시예 18. D2M2 -4 돌연변이체의 C3 컨버타제 서브유닛 C3b 및 C4b에의 실시간 결합에 대한 특성화.

DAF가 C3 컨버타제의 두 서브유닛, 즉, C3b/C4b및 Bb/C2a 모두와 상호작용한다는 것이 이전에 문서로 입증되었다. 추가로, DAF의 이러한 이중 상호작용이 C3-컨버타제를 붕괴시킬 수 있는 이의 능력에 중요하다는 것도 제안되었다. C3b/C4b에 대한 D2M2-4 돌연변이체의 결합은 SPR 검정법을 사용하여 측정하였다. 이 검정법에서, 비오틴으로 이의 유리 -SH 기를 표지화하여 스트렙트아비딘 센서 칩 상에 C3b 또는 C4b를 고정화시켰다. 상기 표지화는 칩 상에서 그를 생리학적 방향으로 배향시켰다. 이어서, 1 μM의 D2M2-4를 유동시키고, 이의 돌연변이체를 각각 칩 위로 유동시켜 결합을 측정하였다. 결합 반응은 반응 단위 (RU)로 측정되었다. 시간 (센소그램)에 대해 플롯팅하고고, 비교하였다. C3b 및 C4b에 대한 MCP 및 DAF의 결합은 D2M2-4 돌연변이체와 비교하여 낮았으며, 이는 이의 연관된 링커와 함께 D2 도메인의 치환이 C3b 및 C4b에 대한 MCP의 결합을 유의적으로 증진시킨다는 것을 나타낸다. 이어서, 돌연변이체의 결합 반응을 분석했을 때, D2M2-4 분자와 비교하여, AP-DAA (E136Q (D2), Y101N, I134A 및 L161K) 또는 CP-DAA (I134A 및 L161K)에서 획득을 보인 돌연변이체 중 어느 것도 결합 증가를 보이지 않았다 (도 20). 그러므로, 이러한 돌연변이체의 DAA 증가는 컨버타제의 다른 서브유닛, 즉, Bb/C2a에 더 잘 결합하기 때문일 가능성이 있다.

실시예 19. AP- DAA에 대한 D2M2 -4 키메라 활성의 최적화

추정 기능 획득 돌연변이체의 AP-DAA를 조사함으로써 활성이 획득된 4개의 D2M2-4 돌연변이체가 확인되었다. 이들 돌연변이체는 E136Q (D2), Y101N, I134A 및 L161K였다. 이들 돌연변이체는 비록 활성 획득을 나타내기는 하였지만, 그들의 활성은 DAF의 것과 비교하여 비해 훨씬 낮았다. 따라서, D2M2-4의 AP-DAA를 최적화시키기 위해, 4개의 돌연변이를 모두 그 안에 포함하는 테트라 돌연변이체를 구축하였다. 테트라 돌연변이체의 AP-DAA의 평가 결과, D2M2-4와 비교하여 활성이 강건한 12.5배 증가를 보였지만; 그러나, 이의 CP-DAA는 어떤 증가도 보이지 않았다 (도 21). 상기에서 언급한 바와 같이, 테트라 돌연변이체의 AP-DAA는 DAF 분자와 비교하여 138배 훨씬 더 적었다. 그러므로, 본 결과는 DAF 분자에서 AP-DAA에 중요한 다른 잔기가 D2M2-4 테트라 돌연변이체에는 누락되어 있다는 것을 시사한다.

이론으로 제한하지 않으면서, 본 발명은 DAA 및 CFA에 대한 기능적 부위가 공간적으로 보존되고, 중첩되지 않다는 것을 제안한다. 본 발명은 또한 테트라 돌연변이체가 이의 CFA를 보유하는지 여부를 결정한다. 테트라 돌연변이체의 CFA를 측정한 결과, 이의 C3b-CFA 및 C4b-CFA가 D2M2-4 키메라의 것과 유사한 것으로 나타났다 (도 22). 그러므로, 본원에서는 CFA (C3b-CFA 및 C4b-CFA) 및 DAA (CP-DAA 및 AP-DAA), 둘 모두 단일 4개의 CCP 분자에 공존할 수 있다고 밝혀졌다. 그러나, 분자는 DCP에서는 관찰된 AP-DAA를 제외한, 최적의 C3b-CFA, C4b-CFA 및 CP-DAA를 보였다.

본 발명의 키메라 단백질은 이의 효능을 증가시키기 위해 돌연변이화될 수 있다고 제안된다. 본 발명의 키메라 단백질은 보체 활성화 부위를 표적화하한 태그, CCP 또는 펩티드/단백질의 첨가에 의해; 이의 시험관내 및 생체내 반감기를 증가시키기 위한 변형에 의해, 막 또는 세포내 표적화를 위한 변형을 위해 추가로 변형될 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> NATIONAL CENTRE FOR CELL SCIENCE <120> <120> Title : DAF-MCP CHIMERIC PROTEINS, PROCESS TO MANUFACTURE THE SAME AND USE OF THE CHIMERIC PROTEIN FOR TREATING PATHOLOGICAL CONDITIONS INVOLVING THE COMPLEMENT SYSTEM <130> AppFileReference : <140> CurrentAppNumber : <141> CurrentFilingDate : <150> IN 201921014960 <151> 2019-04-13 Sequence -------- <213> OrganismName : Homsapiens <400> PreSequenceString : CGLPPDVPNA QPALEGRTSF PEDTVITYKC EESFVKIPGE KDSVICLKGS QWSDIEEFCN 60 RSCEVPTRLN SASLKQPYIT QNYFPVGTVV EYECRPGYRR EPSLSPKLTC LQNLKWSTAV 120 EFCKKKSCPN PGEIRNGQID VPGGILFGAT ISFSCNTGYK LFGSTSSFCL ISGSSVQWSD 180 PLPECREIYC PAPPQIDNGI IQGERDHYGY RQSVTYACNK GFTMIGEHSI YCTVNNDEGE 240 WSGPPPECRG KS 252 <212> Type : PRT <211> Length : 252 SequenceName : Sq. 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No. 13 (D2D3M3M4 (L205K)) SequenceDescription : Sequence -------- <213> OrganismName : Homo sapiens <400> PreSequenceString : CEVPTRLNSA SLKQPYITQN YFPVGTVVEY ECRPGYRREP SLSPKLTCLQ NLKWSTAVEF 60 CKKKSCPNPG EIRNGQIDVP GGILFGATIS FSCNTGYKLF GSTSSFCLIS GSSVQWSDKL 120 PECREIYCTP PPKIKNGKHT FSEVEVFEYL DAVTYSCDPA PGPDPFSLIG ESTIYCGDNS 180 VWSRAAPECK VVKCRFPVVE NGKQISGFGK KFYYKATVMF ECDKGFYLDG SDTIVCDSNS 240 TWDPPVPKCL KVL 253 <212> Type : PRT <211> Length : 253 SequenceName : Sq. No. 14 (D2D3M3M4 (P216K)) SequenceDescription : Sequence -------- <213> OrganismName : Homo sapiens <400> PreSequenceString : CEVPTRLNSA SLKQPYITQN YFPVGTVVEY ECRPGYRREP SLSPKLTCLQ NLKWSTAVEF 60 CKKKSCPNPG EIRNGQIDVP GGILFGATIS FSCNTGYKLF GSTSSFCLIS GSSVQWSDPL 120 PICEKVLCTP PPKIKNGKHT FSEVEVFEYL DAVTYSCDPA PGPDPFSLIG ESTIYCGDNS 180 VWSRAAPECK VVKCRFPVVE NGKQISGFGK KFYYKATVMF ECDKGFYLDG SDTIVCDSNS 240 TWDPPVPKCL KVL 253 <212> Type : PRT <211> Length : 253 SequenceName : Sq. No. 15 (D2D3M3M4 (Multi-1)) SequenceDescription : Sequence -------- <213> OrganismName : Homo sapiens <400> PreSequenceString : CEVPTRLNSA SLKQPYITQN YFPVGTVVEY ECRPGYRREP SLSPKLTCLQ NLKWSTAVEF 60 CKKKSCPNPG EIRNGQIDVP GGILFGATIS FSCNTGYKLF GSTSSFCLIS GSSVQWSPKA 120 PECREIYCTP PPKIKNGKHT FSEVEVFEYL DAVTYSCDPA PGPDPFSLIG ESTIYCGDNS 180 VWSRAAPECK VVKCRFPVVE NGKQISGFGK KFYYKATVMF ECDKGFYLDG SDTIVCDSNS 240 TWDPPVPKCL KVL 253 <212> Type : PRT <211> Length : 253 SequenceName : Sq. No. 16 (D2D3M3M4 (Multi-2)) SequenceDescription : Sequence -------- <213> OrganismName : Homo sapiens <400> PreSequenceString : CEVPTRLNSA SLKQPYITQN YFPVGTVVEY ECRPGYRREP SLSPKLTCLQ NLKWSTAVEF 60 CKKKSCPNPG EIRNGQIDVP GGILFGATIS FSCNTGYKLF GKTSSFCLIS GSSVQWSDPL 120 PICEKVLCTP PPKIKNGKHT FSEVEVFEYL DAVTYSCDPA PGPDPFSLIG ESTIYCGDNS 180 VWSRAAPECK VVKCRFPVVE NGKQISGFGK KFYYKATVMF ECDKGFYLDG SDTIVCDSNS 240 TWDPPVPKCL KVL 253 <212> Type : PRT <211> Length : 253 SequenceName : Sq. No. 17 (D2D3M3M4 (Multi-3)) SequenceDescription : Sequence -------- <213> OrganismName : Homo sapiens <400> PreSequenceString : CEVPTRLNSA SLKQPYITQN YFPVGTVVEY ECRPGYRREP SLSPKLTCLQ NLKWSTAVEF 60 CKKKSCPNPG EIRNGQIDVP GGILFGATIS FSCNTGYKLI GKTSSFCLIS GSSVQWSDKL 120 PICEKVLCTP PPKIKNGKHT FSEVEVFEYL DAVTYSCDPA PGPDPFSLIG ESTIYCGDNS 180 VWSRAAPECK VVKCRFPVVE NGKQISGFGK KFYYKATVMF ECDKGFYLDG SDTIVCDSNS 240 TWDPPVPKCL KVL 253 <212> Type : PRT <211> Length : 253 SequenceName : Sq. No. 18 (D2D3M3M4 (Multi-4)) SequenceDescription : Sequence -------- <213> OrganismName : Homo sapiens <400> PreSequenceString : CEVPTRLNSA SLKQPYITQN YFPVGTVVEY ECRPGYRREP SLSPKLTCLQ NLKWSTAVEF 60 CKKKSCPNPG EIRNGQIDVP GGILFGATIS FSCNTGYKLI GSTSSFCLIS GSSVQWSDKL 120 PICEKVLCTP PPKIKNGKHT FSEVEVFEYL DAVTYSCDPA PGPDPFSLIG ESTIYCGDNS 180 VWSRAAPECK VVKCRFPVVE NGKQISGFGK KFYYKATVMF ECDKGFYLDG SDTIVCDSNS 240 TWDPPVPKCL KVL 253 <212> Type : PRT <211> Length : 253 SequenceName : Sq. No. 19 (D2D3M3M4 (Multi-5) or (DCP)) SequenceDescription : Sequence -------- <213> OrganismName : Homo sapiens <400> PreSequenceString : CEVPTRLNSA SLKQPYITQN YFPVGTVVEY ECRPGYRRQP SLSPKLTCLQ NLKWSTAVEF 60 CKKKSCPYIR DPLNGQAVPA NGTYEFGYQM HFICNEGYYL IGEEILYCEL KGSVAIWSGK 120 PPICEKVLCT PPPKIKNGKH TFSEVEVFEY LDAVTYSCDP APGPDPFSLI GESTIYCGDN 180 SVWSRAAPEC KVVKCRFPVV ENGKQISGFG KKFYYKATVM FECDKGFYLD GSDTIVCDSN 240 STWDPPVPKC LKVL 254 <212> Type : PRT <211> Length : 254 SequenceName : Sq. No. 20 (D2M2-4 (E136Q) (D2)) SequenceDescription : Sequence -------- <213> OrganismName : Homo sapiens <400> PreSequenceString : CEVPTRLNSA SLKQPYITQN YFPVGTVVEY ECRPGYRREP SLSPKLTCLQ NLKWSTAVEF 60 CKKKSCPNIR DPLNGQAVPA NGTYEFGYQM HFICNEGYYL IGEEILYCEL KGSVAIWSGK 120 PPICEKVLCT PPPKIKNGKH TFSEVEVFEY LDAVTYSCDP APGPDPFSLI GESTIYCGDN 180 SVWSRAAPEC KVVKCRFPVV ENGKQISGFG KKFYYKATVM FECDKGFYLD GSDTIVCDSN 240 STWDPPVPKC LKVL 254 <212> Type : PRT <211> Length : 254 SequenceName : Sq. No. 21 (D2M2-4 (Y101N)) SequenceDescription : Sequence -------- <213> OrganismName : Homo sapiens <400> PreSequenceString : CEVPTRLNSA SLKQPYITQN YFPVGTVVEY ECRPGYRREP SLSPKLTCLQ NLKWSTAVEF 60 CKKKSCPYIR DPLNGQAVPA NGTYLFGYQM HFICNEGYYL IGEEILYCEL KGSVAIWSGK 120 PPICEKVLCT PPPKIKNGKH TFSEVEVFEY LDAVTYSCDP APGPDPFSLI GESTIYCGDN 180 SVWSRAAPEC KVVKCRFPVV ENGKQISGFG KKFYYKATVM FECDKGFYLD GSDTIVCDSN 240 STWDPPVPKC LKVL 254 <212> Type : PRT <211> Length : 254 SequenceName : Sq. No. 22 (D2M2-4 (E118L)) SequenceDescription : Sequence -------- <213> OrganismName : Homo sapiens <400> PreSequenceString : CEVPTRLNSA SLKQPYITQN YFPVGTVVEY ECRPGYRREP SLSPKLTCLQ NLKWSTAVEF 60 CKKKSCPYIR DPLNGQAVPA NGTYEFGYQM HFICNEGYYL AGEEILYCEL KGSVAIWSGK 120 PPICEKVLCT PPPKIKNGKH TFSEVEVFEY LDAVTYSCDP APGPDPFSLI GESTIYCGDN 180 SVWSRAAPEC KVVKCRFPVV ENGKQISGFG KKFYYKATVM FECDKGFYLD GSDTIVCDSN 240 STWDPPVPKC LKVL 254 <212> Type : PRT <211> Length : 254 SequenceName : Sq. No. 23 (D2M2-4 (I134A) ) SequenceDescription : Sequence -------- <213> OrganismName : Homo sapiens <400> PreSequenceString : CEVPTRLNSA SLKQPYITQN YFPVGTVVEY ECRPGYRREP SLSPKLTCLQ NLKWSTAVEF 60 CKKKSCPYIR DPLNGQAVPA NGTYEFGYQM HFICNEGYYL IGKEILYCEL KGSVAIWSGK 120 PPICEKVLCT PPPKIKNGKH TFSEVEVFEY LDAVTYSCDP APGPDPFSLI GESTIYCGDN 180 SVWSRAAPEC KVVKCRFPVV ENGKQISGFG KKFYYKATVM FECDKGFYLD GSDTIVCDSN 240 STWDPPVPKC LKVL 254 <212> Type : PRT <211> Length : 254 SequenceName : Sq. No. 24 (D2M2-4 (E136K)) SequenceDescription : Sequence -------- <213> OrganismName : Homo sapiens <400> PreSequenceString : CEVPTRLNSA SLKQPYITQN YFPVGTVVEY ECRPGYRREP SLSPKLTCLQ NLKWSTAVEF 60 CKKKSCPYIR DPLNGQAVPA NGTYEFGYQM HFICNEGYYL IGEYILYCEL KGSVAIWSGK 120 PPICEKVLCT PPPKIKNGKH TFSEVEVFEY LDAVTYSCDP APGPDPFSLI GESTIYCGDN 180 SVWSRAAPEC KVVKCRFPVV ENGKQISGFG KKFYYKATVM FECDKGFYLD GSDTIVCDSN 240 STWDPPVPKC LKVL 254 <212> Type : PRT <211> Length : 254 SequenceName : Sq. No. 25 (D2M2-4 (E137Y)) SequenceDescription : Sequence -------- <213> OrganismName : Homo sapiens <400> PreSequenceString : CEVPTRLNSA SLKQPYITQN YFPVGTVVEY ECRPGYRREP SLSPKLTCLQ NLKWSTAVEF 60 CKKKSCPYIR DPLNGQAVPA NGTYEFGYQM HFICNEGYYL IGEEILYCKL KGSVAIWSGK 120 PPICEKVLCT PPPKIKNGKH TFSEVEVFEY LDAVTYSCDP APGPDPFSLI GESTIYCGDN 180 SVWSRAAPEC KVVKCRFPVV ENGKQISGFG KKFYYKATVM FECDKGFYLD GSDTIVCDSN 240 STWDPPVPKC LKVL 254 <212> Type : PRT <211> Length : 254 SequenceName : Sq. No. 26 (D2M2-4 (E142K) ) SequenceDescription : Sequence -------- <213> OrganismName : Homo sapiens <400> PreSequenceString : CEVPTRLNSA SLKQPYITQN YFPVGTVVEY ECRPGYRREP SLSPKLTCLQ NLKWSTAVEF 60 CKKKSCPYIR DPLNGQAVPA NGTYEFGYQM HFICNEGYYL IGEEILYCEL KDSVAIWSDK 120 PPICEKVLCT PPPKIKNGKH TFSEVEVFEY LDAVTYSCDP APGPDPFSLI GESTIYCGDN 180 SVWSRAAPEC KVVKCRFPVV ENGKQISGFG KKFYYKATVM FECDKGFYLD GSDTIVCDSN 240 STWDPPVPKC LKVL 254 <212> Type : PRT <211> Length : 254 SequenceName : Sq. No. 27 (D2M2-4 (G152D) ) SequenceDescription : Sequence -------- <213> OrganismName : Homo sapiens <400> PreSequenceString : CEVPTRLNSA SLKQPYITQN YFPVGTVVEY ECRPGYRREP SLSPKLTCLQ NLKWSTAVEF 60 CKKKSCPYIR DPLNGQAVPA NGTYEFGYQM HFICNEGYYL IGEEILYCEL KGSVAIWSGK 120 PPICEKVKCT PPPKIKNGKH TFSEVEVFEY LDAVTYSCDP APGPDPFSLI GESTIYCGDN 180 SVWSRAAPEC KVVKCRFPVV ENGKQISGFG KKFYYKATVM FECDKGFYLD GSDTIVCDSN 240 STWDPPVPKC LKVL 254 <212> Type : PRT <211> Length : 254 SequenceName : Sq. No. 28 (D2M2-4 (L161K) ) SequenceDescription : Sequence -------- <213> OrganismName : Homo sapiens <400> PreSequenceString : CEVPTRLNSA SLKQPYITQN YFPVGTVVEY ECRPGYRREP SLSPKLTCLQ NLKWSTAVEF 60 CKKKSCPYIR DPLNGQAVPA NGTYEFGYQM HFICNEGYYL IGEEILYCEL KGSVAIWSGK 120 PPICEKVLCA PPPKIKNGKH TFSEVEVFEY LDAVTYSCDP APGPDPFSLI GESTIYCGDN 180 SVWSRAAPEC KVVKCRFPVV ENGKQISGFG KKFYYKATVM FECDKGFYLD GSDTIVCDSN 240 STWDPPVPKC LKVL 254 <212> Type : PRT <211> Length : 254 SequenceName : Sq. No. 29 (D2M2-4 (T163A) ) SequenceDescription : Sequence -------- <213> OrganismName : Homo sapiens <400> PreSequenceString : CEVPTRLNSA SLKQPYITQN YFPVGTVVEY ECRPGYRREP SLSPKLTCLQ NLKWSTAVEF 60 CKKKSCPYIR DPLNGQAVPA NGTYEFGYQM HFICNEGYYL IGEEILYCEL KGSVAIWSGK 120 PPICEKVLCT PPPKIKNGKH TFSEREVFEY LDAVTYSCDP APGPDPFSLI GESTIYCGDN 180 SVWSRAAPEC KVVKCRFPVV ENGKQISGFG KKFYYKATVM FECDKGFYLD GSDTIVCDSN 240 STWDPPVPKC LKVL 254 <212> Type : PRT <211> Length : 254 SequenceName : Sq. No. 30 (D2M2-4 (V178R) ) SequenceDescription : Sequence -------- <213> OrganismName : Homo sapiens <400> PreSequenceString : CEVPTRLNSA SLKQPYITQN YFPVGTVVEY ECRPGYRREP SLSPKLTCLQ NLKWSTAVEF 60 CKKKSCPYIR DPLNGQAVPA NGTYEFGYQM HFICNEGYYL IGEEILYCEL KGSVAIWSGK 120 PPICEKVLCT PPPKIKNGKH TFSEVEFFEY LDAVTYSCDP APGPDPFSLI GESTIYCGDN 180 SVWSRAAPEC KVVKCRFPVV ENGKQISGFG KKFYYKATVM FECDKGFYLD GSDTIVCDSN 240 STWDPPVPKC LKVL 254 <212> Type : PRT <211> Length : 254 SequenceName : Sq. No. 31 (D2M2-4 (V180F)) SequenceDescription : Sequence -------- <213> OrganismName : Homo sapiens <400> PreSequenceString : CEVPTRLNSA SLKQPYITQN YFPVGTVVEY ECRPGYRREP SLSPKLTCLQ NLKWSTAVEF 60 CKKKSCPYIR DPLNGQAVPA NGTYEFGYQM HFICNEGYYL IGEEILYCEL KGSVAIWSGK 120 PPICEKVLCT PPPKIKNGKH TFSEVEVFEY RDAVTYSCDP APGPDPFSLI GESTIYCGDN 180 SVWSRAAPEC KVVKCRFPVV ENGKQISGFG KKFYYKATVM FECDKGFYLD GSDTIVCDSN 240 STWDPPVPKC LKVL 254 <212> Type : PRT <211> Length : 254 SequenceName : Sq. No. 32 (D2M2-4 (L184R) ) SequenceDescription : Sequence -------- <213> OrganismName : Homo sapiens <400> PreSequenceString : CEVPTRLNSA SLKQPYITQN YFPVGTVVEY ECRPGYRRQP SLSPKLTCLQ NLKWSTAVEF 60 CKKKSCPNIR DPLNGQAVPA NGTYEFGYQM HFICNEGYYL AGEEILYCEL KGSVAIWSGK 120 PPICEKVKCT PPPKIKNGKH TFSEVEVFEY LDAVTYSCDP APGPDPFSLI GESTIYCGDN 180 SVWSRAAPEC KVVKCRFPVV ENGKQISGFG KKFYYKATVM FECDKGFYLD GSDTIVCDSN 240 STWDPPVPKC LKVL 254 <212> Type : PRT <211> Length : 254 SequenceName : Sq. No. 33 (D2M2-4 (Tetra) ) SequenceDescription :

Claims (27)

1. D2M2-4 (서열 번호: 4), D2M2-4 (ML) (서열 번호: 5), D2D3M3M4 (서열 번호: 6), D2D3D4M4 (서열 번호: 7), D2D3M3M4 (T192E) (서열 번호: 8); D2D3M3M4 (K195Y)) (서열 번호: 9); D2D3M3M4 (F197I) (서열 번호: 10); D2D3M3M4 (S199K)) (서열 번호: 11); D2D3M3M4 (T200Y)) (서열 번호: 12); (D2D3M3M4 (L205K)) (서열 번호: 13); D2D3M3M4 (P216K) (서열 번호: 14); D2D3M3M4 (멀티(Multi)-1) (서열 번호: 15); D2D3M3M4 (멀티-2) (서열 번호: 16); D2D3M3M4 (멀티-3) (서열 번호: 17); D2D3M3M4 (멀티-4) (서열 번호: 18); D2D3M3M4 (멀티-5) 또는 DCP (서열 번호: 19); D2M2-4 (E136Q) (D2) (서열 번호: 20); (D2M2-4 (Y101N) (서열 번호: 21); (D2M2-4 (E118L) (서열 번호: 22); D2M2-4 (I134A) (서열 번호: 23); D2M2-4 (E136K) (서열 번호: 24); (D2M2-4 (E137Y)) (서열 번호: 25); (D2M2-4 (E142K) (서열 번호: 26); D2M2-4 (G152D) (서열 번호: 27); D2M2-4 (L161K) (서열 번호: 28); D2M2-4 (T163A) (서열 번호: 29); D2M2-4 (V178R) (서열 번호: 30); (D2M2-4 (V180F) (서열 번호: 31); D2M2-4 (L184R) (서열 번호: 32); 및 D2M2-4 (테트라) (서열 번호: 33)를 포함하는 군으로부터 선택되는, 보체 경로(complement pathway)의 억제를 위한 조작된 키메라 단백질(engineered chimeric protein).
2. 제1항에 있어서, 임의적으로, 링커(linker)와 함께, 붕괴 촉진 인자 (Decay-accelerating factor; DAF)의 D1, D2, D3 및 D4 도메인(domain)으로부터 선택되는 도메인 및 막 보조인자 단백질 (MCP)의 M1, M2, M3 및 M4로부터 선택되는 도메인을 포함하는, 조작된 키메라 단백질.
3. 제1항에 있어서, 단백질이 D2D3M3M4 (멀티-5) 또는 DCP (서열 번호: 19)인 것인, 보체 경로의 억제를 위한 조작된 키메라 단백질.
4. 제3항에 있어서, 링커 및 특정 돌연변이와 함께, 붕괴 촉진 인자 (DAF)의 D2 및 D3 도메인, 및 막 보조인자 단백질 (MCP)의 M3, 및 M4 도메인를 포함하는 조작된 키메라 단백질.
5. 제3항에 있어서, DCP가 DAF 단백질로부터의 도메인 D2D3 및 MCP 단백질로부터의 M3M4 도메인을 포함하고; 여기서, 링커와 함께 도메인은 스와핑(swapping)된 것이고; 여기서, 연관된 링커와 함께 DAF의 두 N-말단 모듈은 MCP에서 치환된 것이고; 여기서, (인자 I 상호작용을 위한) 돌연변이 219ECREIY224에서 219ICEKVL224 (멀티-1) 및 단일 아미노산 치환 F197I 및 P216K를 포함하는 기능 획득 돌연변이(Gain-function mutation)가 도입된 것인, 조작된 키메라 단백질 (DCP).
6. 제3항에 있어서, DAF의 두 N-말단 모듈이 치환된 것인 조작된 키메라 단백질 (DCP).
7. 제3항에 있어서, D2D3M3M4에서 인자 I와의 상호작용을 증가시키기 위한 돌연변이가 T192E, K195Y, F197I, S199K, T200Y, L205K 및 P216K 및 3개의 다중 잔기 멀티-1, 멀티-2 및 멀티-3으로부터 선택되는 것인 조작된 키메라 단백질 (DCP).
8. i. RCA 단백질 DAF 및 MCP의 도메인 및 이의 각 링커를 스와핑하여 기능적 측면을 연구 및 확인하고, 키메라 단백질을 수득하는 단계;
   ii. D2D3M3M4 키메라를 선택하고, 추가 변형 및 돌연변이를 도입하여 CFA가 증가된 돌연변이체(mutant)를 생성하는 단계;
   iii. DAA 및 CFA, 둘 모두가 증가된 D2D3M3M4 돌연변이체를 생성하는 단계;
   iv. 키메라 돌연변이체 D2D3M3M4 및 D2D3D4M4, 및 D2D3M3M4 및 D2M2-4의 단일 및 다중 잔기 돌연변이체를 생성하는 단계;
   v. 박테리아 및/또는 효모 발현 벡터에서 단계 (iv)의 돌연변이체를 발현시키는 단계를 포함하는,
   제1항의 조작된 키메라 단백질을 수득하는 방법.
9. 제8항에 있어서, D2M2-4 (서열 번호: 4), D2M2-4 (ML) (서열 번호: 5), D2D3M3M4 (서열 번호: 6), D2D3D4M4 (서열 번호: 7), D2D3M3M4 (T192E) (서열 번호: 8); D2D3M3M4 (K195Y)) (서열 번호: 9); D2D3M3M4 (F197I) (서열 번호: 10); D2D3M3M4 (S199K)) (서열 번호: 11); D2D3M3M4 (T200Y)) (서열 번호: 12); (D2D3M3M4 (L205K)) (서열 번호: 13); D2D3M3M4 (P216K) (서열 번호: 14); D2D3M3M4 (멀티-1) (서열 번호: 15); D2D3M3M4 (멀티-2) (서열 번호: 16); D2D3M3M4 (멀티-3) (서열 번호: 17); D2D3M3M4 (멀티-4) (서열 번호: 18); D2D3M3M4 (멀티-5) 또는 DCP (서열 번호: 19); D2M2-4 (E136Q) (D2) (서열 번호: 20); (D2M2-4 (Y101N) (서열 번호: 21); (D2M2-4 (E118L) (서열 번호: 22); D2M2-4 (I134A) (서열 번호: 23); D2M2-4 (E136K) (서열 번호: 24); (D2M2-4 (E137Y)) (서열 번호: 25); (D2M2-4 (E142K) (서열 번호: 26); D2M2-4 (G152D) (서열 번호: 27); D2M2-4 (L161K) (서열 번호: 28); D2M2-4 (T163A) (서열 번호: 29); D2M2-4 (V178R) (서열 번호: 30); (D2M2-4 (V180F) (서열 번호: 31); D2M2-4 (L184R) (서열 번호: 32); 및 D2M2-4 (테트라) (서열 번호: 33)를 포함하는 군으로부터 선택되는, 보체 경로의 억제를 위한 조작된 키메라 단백질을 수득하는 방법.
10. 제8항에 있어서, 단백질이 D2D3M3M4 (멀티-5) 또는 DCP (서열 번호: 19)인 것인 방법.
11. 제8항에 있어서, 돌연변이가 CFA, AP-DAA 및 CP-DAA 활성을 증가시킨 것인 방법.
12. 제1항에 있어서, 이중 활성 조절을 위한, 및 인자 I에 대한 친화도(affinity) 및 C3b/C4b에 대한 항원항체결합력 증진을 위한, 조작된 키메라 단백질.
13. 제1항에 있어서, 강건한(robust) CP- 및 AP-DAA 뿐만 아니라, C3b- 및 C4b-CFA 활성을 갖고, 따라서, 고전적 경로 (CP), 대체 경로 (AP) 및 렉틴 경로 (LP)에 대해 억제 활성을 갖는 이중 활성 단백질을 위한, 조작된 키메라 단백질.
14. 제3항에 있어서, 보체계 관련 병리학적 상태를 치료하기 위한 보체 활성화 조절인자 (RCA) 기반 치료제를 개발하기 위한 선도 분자(lead molecule)로서의 이의 용도를 위한, 조작된 키메라 단백질.
15. 제1항에 있어서, 시험관내 검정 시스템에서 CP, AP 및 LP 활성화를 억제시키는 시약(reagent)으로서의 이의 용도를 위한, 조작된 키메라 단백질.
16. 제1항에 있어서, 시험관내 및 생체내에서 상이한 질환 병태(disease condition)에서 상이한 경로를 설명하고, 이들 경로에 의해 매개되는 병리를 억제시키는 데 사용하기 위한 이의 용도를 위한, 조작된 키메라 단백질.
17. 제1항에 있어서, 이중 활성을 제공하는 데 필요한 특이적인 구조적 특징 및 이로써, CP, AP 및 LP에 미치는 효과를 설명하고, 확인하는 데 사용하기 위한 이의 용도를 위한, 조작된 키메라 단백질.
18. 제1항에 있어서, 발작성 야간 혈색소뇨증 (PNH), 연령-관련 황반 변성 (AMD), 비정형 용혈성 요독 증후군 (aHUS), 및 고밀도 침착병 (DDD), 자가면역 질환 예컨대, 실험 알레르기성 신경염, II형 콜라겐 유발 관절염, 중증 근무력증, 용혈성 빈혈, 사구체신염, 및 면역 복합체 유발 혈관염, 성인 호흡 곤란 증후군, 뇌졸중, 심장마비, 이종이식, 다발성 경화증, 화상, 체외 투석 및 혈액 산소 공급(blood oxygenation)에 사용하기 위한 이의 용도를 위한, 조작된 키메라 단백질.
19. 제약상 허용되는 부형제와 함께, 제1항의 조작된 키메라 단백질을 포함하는 조성물.
20. 제19항에 있어서, 조성물이 예컨대, 정맥내, 경구, 복강내, 진피내, 근육내, 비강내, 피하, 비강내, 척수내, 기관내 및 두개내(intracranial)와 같은 경로 중 어느 하나의 경로로 투여될 수 있는 것인 조성물.
21. 제1항의 조작된 키메라 단백질을 포함하는 검정법(assay).
22. 제1항의 조작된 키메라 단백질의 투여에 의해 인공 장기 또는 임플란트(implant)에 사용되는 생체물질(biomaterial)의 표면을 코팅하는 단계를 포함하는, 인공 장기 또는 임플란트 사용 동안 보체 활성화(complement activation)를 억제시키는 방법.
23. 환자에게 제1항의 조작된 키메라 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 보체 활성화를 억제시키는 방법.
24. 환자에게 제3항의 조작된 키메라 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 보체 활성화를 억제시키는 방법.
25. 제1항의 조작된 키메라 단백질을 이용하여 환자에서 보체 매개 조직 손상(complement-mediated tussue injury)을 치료하는 방법.
26. 제1항의 조작된 키메라 단백질과 함께 생리학적 체액(physiological fluid)이 통해 흐르는 코팅된 튜빙(coated tubing)을 사용하여 상기 체액의 체외 단락(extracorpreal shunting) 동안 보체 활성화를 억제시키는 방법.
27. 이종이식(xeno-transplatation) 동안 인간 보체 매개 손상에 대한 저항성을 부여하기 위하여, 체외 순환 동안 보체 억제를 위하여, 암 요법을 위한 보체 억제를 위하여, 인간 보체로부터 유전자 요법 벡터를 보호하기 위한 유전자 요법 벡터 (예컨대, 아데노 연관 바이러스 벡터) 상의 발현을 위하여, 연령-관련 황반 변성, 류마티스 관절염, 척수 손상, 파킨슨병, 알츠하이머병, 암, 및 호흡기 장애 예컨대, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 알레르기성 염증, 폐기종, 기관지염, 기관지확장증, 낭포성 섬유증, 결핵, 폐렴, 호흡 곤란 증후군 (RDS―신생아 및 성인), 비염 및 부비동염을 포함하는 군으로부터 선택되는 보체 매개 질환 및 장애를 치료하는 방법.

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