JP6162102B2 - 補体ｂ因子アナログおよびその用途 - Google Patents

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Description

発明の背景
補体系は、先天免疫系および適応免疫系の構成要素である（非特許文献１（Ｖｏｌａｎａｋｉｓ，Ｊ．Ｅ．，による概説、１９９８、Ｊ．Ｅ．Ｖｏｌａｎａｋｉｓ，ａｎｄ Ｍ．Ｍ．Ｆｒａｎｋ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ｐｐ９−３２のＴｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅの第２章））。補体は、微生物の殺傷において、そして免疫複合体の輸送およびクリアランスに重要な役割を果たしている。補体系の活性化産物の多くはまた、プロ炎症性または免疫調節の機能にも関連している。補体系は、３つの酵素活性化カスケード：古典経路、レクチン経路、および代替経路において組織化されている血漿および膜結合タンパク質からなる（図１）。３つの経路全てが、終末補体複合体（ＴＣＣ）および生物学的に活性な産物のアレイの形成をもたらすことができる。
いくつかの場合は、補体活性化は、様々な病原体および外来分子を認識してそれらに結合する特定の抗体により、および／または、外来物質との補体タンパク質の直接の相互作用によるかのいずれかで開始される。活性化されれば、これらの経路はプロテアーゼ複合体であるＣ３コンバターゼの形成を生じる。古典経路のＣ３コンバターゼであるＣ４ｂ２ａ、および代替経路のＣ３コンバターゼであるＣ３ｂＢｂはいずれも、Ｃ３のα鎖を切断してＣ３ｂを生じることができる。Ｃ３ｂは生物学的表面に共有結合する潜在能力を有する。Ｃ３ｂの結合は多形核細胞およびマクロファージによる貪食作用のためのオプソニン作用をもたらす。さらにＣ３ｂが利用できる場合は、Ｃ３コンバターゼはＣ５コンバターゼとして機能することができ、Ｃ５を切断してＴＣＣまたは膜攻撃複合体（ＭＡＣ）の組み立てを開始し、これがターゲティングされた細胞膜内への細孔形成タンパク質複合体の挿入により細胞溶解を媒介する。
図１Ａに示すように古典的経路においては、第１の補体（Ｃ１）のコラーゲン性の亜成分であるＣ１ｑが免疫複合体の中の免疫グロブリンに結合し、そしてその関連するセリンプロテアーゼであるＣ１ｒおよびＣ１ｓが活性化される。この補体カスケードは、続くＣ４およびＣ２の切断によって開始され、Ｃ３の活性化が続く。生じるＣ３ｂ断片はオプソニンとしての役割を果たすだけではなく、溶解経路において膜攻撃複合体（ＭＡＣ）の形成ももたらす。先天免疫においては、認識分子（レクチン）とセリンプロテアーゼからなる、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）−結合性セリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ）と呼ばれる複合体が、レクチン経路を介して微生物の表面上の炭水化物に結合する際に、Ｃ４およびＣ２を活性化する。この結合は免疫グロブリンの非存在下で起こる。顎のある脊椎動物において見られるレクチン経路の認識分子はＭＢＬおよびフィコリンであり、これらは両方ともＣ１ｑのようなコラーゲン様ドメインおよびＧｌｃＮＡｃに対して共通の結合特異性を有している炭水化物結合ドメインの存在を特徴とする。ＭＡＳＰおよびＣ１ｒ／Ｃ１ｓは同じドメイン構成を共有しており、セリンプロテアーゼのサブファミリーを形成している。
先天免疫におけるレクチン補体経路は、適応免疫における古典的補体経路と、例えば、それらの成分の構造および機能に関して密接に関連している。いずれの経路とも典型的には、コラーゲン性タンパク質およびマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）結合性セリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ）／Ｃ１ｒ／Ｃ１ｓファミリーのセリンプロテアーゼからなる複合体により開始される。古典的経路はレクチン経路の後に進化的に出現すると推定されている。
図１Ｂに示す代替補体経路の活性化は、典型的には、Ｃ３ｂタンパク質（またはＣ３ｉ）が、例えば微生物の細胞および他の表面成分に結合すると開始する。Ｃ３ｂはまた、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体にも結合できる。次に、代替経路のＢ因子タンパク質がＣ３ｂタンパク質と結合してＣ３ｂＢを形成する。次に、Ｄ因子タンパク質が、結合したＢ因子タンパク質を断片ＢｂとＢａに分割し、Ｃ３ｂＢｂを形成する。次にプロペルジンがＢｂに結合して、典型的には数百のＣ３分子を酵素的に分割してＣ３ａとＣ３ｂにすることができるＣ３コンバターゼとして機能するＣ３ｂＢｂＰを形成する。Ｃ３ｂの一部はその後Ｃ３ｂＢｂの一部に結合して、Ｃ５分子をＣ５ａとＣ５ｂに分割することができるＣ５コンバターゼであるＣ３ｂＢｂＣ３ｂを形成する。
Ｃ３ｂは血漿中で遊離しているために、これは宿主細胞または病原体の表面のいずれかに結合できる。宿主細胞に対して補体活性化が進行しないようにするためには、補体活性化の過程を中断させるいくつかの異なる種類の調節タンパク質がある。補体受容体１（ＣＲ１またはＣＤ３５）およびＤＡＦ（ＣＤ５５としても知られている）は細胞表面上のＣ３ｂとの結合においてＢ因子と競合し、そしてなおさらに、既に形成されたＣ３ｂＢｂ複合体からＢｂを取り外すこともできる。Ｃ３コンバターゼの形成はまた、第Ｉ因子と呼ばれる血漿プロテアーゼがＣ３ｂを切断してその不活性型であるｉＣ３ｂにする場合にも妨げられ得る。第Ｉ因子はＣ３ｂ結合タンパク質コファクター、例えば、ＣＲ１およびタンパク質分解の膜コファクター（ＭＣＰまたはＣＤ４６）と共に作用する。別の補体調節タンパク質は、Ｂ因子と競合するか、コンバターゼからＢｂにとって代わるか、第Ｉ因子のコファクターとして機能するか、または脊椎動物細胞に結合したＣ３ｂに優先的に結合するかのいずれかである因子Ｈである。
補体系の正確な機能は、補体カスケードの活性化が炎症に寄与する多数のタンパク質の生産をもたらすため、その調節に依存している。これは宿主の防御に寄与する場合は有益であるが、自己組織上で活性化されれば有害となり得る。典型的には、血液中のＣ３の活性化は低いレベルで維持され、そしてＣ３ｂの付着は病原体表面に限定される。
ヒトの野生型補体Ｂ因子タンパク質は、５つのタンパク質ドメインから構成されている７６４個のアミノ酸の一本鎖の糖タンパク質（およそ９３ｋＤａ）である（非特許文献２（Ｍｏｌｅら、１９８４ Ｔｈｅ Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２５９：６，３４０７−３４１２））。ヒト野生型補体Ｂ因子タンパク質（ｆＢ）は典型的には、Ｎ末端の２５個のアミノ酸の一本鎖ペプチドを伴って発現される（例えば、配列番号１を参照のこと）。ヒト野生型補体Ｂ因子タンパク質のアミノ末端領域（Ｂａ）は、主として３つの短鎖コンセンサスリピートからなる。中央の領域は、フォン・ビルブラント因子中に見られるものと類似するＡ型ドメインである（非特許文献３（Ｃｏｌｏｍｂａｔｔｉら、Ｂｌｏｏｄ（１９９１）７７（１１）：２３０５−１５））。カルボキシ末端はセリンプロテアーゼ（ＳＰ）ドメインである（非特許文献４（Ｐｅｒｋｉｎｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．（１９９３）２９５（Ｐｔ １）：１０９−１４）；非特許文献５（Ｈｏｕｒｃａｄｅら、ＪＢＣ（１９９８）２７３（４０）：２５９９６−６０００）；非特許文献６（Ｈｏｕｒｃａｄｅら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）１６２（５）：２９０６−１１）；非特許文献７（Ｘｕら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０００ ２７５（１）：３７８−８５）；非特許文献８（Ｍｉｌｄｅｒら、Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２００７）１４（３）：２２４−８））。
補体Ｂ因子アナログ、ならびに補体の阻害および補体媒介疾患の処置のためのそれらの使用は、特許文献１（国際公開第０８／１０６６４４号）および特許文献２（米国特許出願公開第２０１０／０１２０６６５号）に記載されている。例えば、ヒト補体Ｂ因子タンパク質アナログであるｈｆＢ３（特許文献２（米国特許出願公開第２０１００１２０６６５号）に記載されている）は、代替補体（ＡＰ）活性を効率的に阻害する優性阻害ヒトＢ因子タンパク質バリアントである。ｈｆＢ３タンパク質（配列番号４）は、ヒト野生型Ｂ因子タンパク質（配列番号１）と比較して５個のアミノ酸変化を有している。これらの５個のアミノ酸変化が、ｈｆＢ３タンパク質が（ｉ）Ｃ３ｂタンパク質に対してはるかに強く結合すること、（ｉｉ）Ｄ因子タンパク質によるＣ３ｂ依存性切断に耐えること、および（ｉｉｉ）野生型Ｂ因子タンパク質と比較してＤ因子タンパク質に対してより強く結合することを可能にする。Ｃ３ｂタンパク質およびＤ因子タンパク質とのｈｆＢ３タンパク質のより強い結合は、不活性なＣ３コンバターゼ（ｈｆＢ３）中の代替補体経路（ＡＣＰ）の２つの必須の成分を隔離して、ＡＰ活性を遮断する。Ｃ３ｂが結合したｈｆＢ３タンパク質はＤ因子タンパク質によっては切断することができないため、ｈｆＢ３タンパク質の立体構造の変化は起こらず、ｈｆＢ３タンパク質のＣ末端のセリンプロテアーゼは活性化されない。
ヒト野生型補体Ｂ因子タンパク質およびｈｆＢ３は両方とも、２３個のシステインアミノ酸を含む。両方の「活性」形態が、配列番号１のＣ２９２に対応するシステインを除く、他のシステインのうちの１つとジスルフィド結合を形成するシステインを全て有する。ｈｆＢ３および野生型Ｂ因子の「活性形態」のＣ２９２は遊離のシステインであり（非特許文献９（Ｐａｒｋｅｓら、１９８３ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２１３，２０１−２０９））、様々な哺乳動物種の間で高度に保存されている（例えば、以下の表１を参照のこと）。
本明細書に記載する参考文献の引用および考察は、それが本発明の先行技術であることの受け入れとは解釈されるべきではない。
国際公開第０８／１０６６４４号 米国特許出願公開第２０１０／０１２０６６５号明細書
Ｖｏｌａｎａｋｉｓ，Ｊ．Ｅ．，による概説、１９９８、Ｊ．Ｅ．Ｖｏｌａｎａｋｉｓ，ａｎｄ Ｍ．Ｍ．Ｆｒａｎｋ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ｐｐ９−３２のＴｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅの第２章 Ｍｏｌｅら、１９８４ Ｔｈｅ Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２５９：６，３４０７−３４１２ Ｃｏｌｏｍｂａｔｔｉら、Ｂｌｏｏｄ（１９９１）７７（１１）：２３０５−１５ Ｐｅｒｋｉｎｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．（１９９３）２９５（Ｐｔ １）：１０９−１４ Ｈｏｕｒｃａｄｅら、ＪＢＣ（１９９８）２７３（４０）：２５９９６−６０００ Ｈｏｕｒｃａｄｅら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）１６２（５）：２９０６−１１ Ｘｕら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０００ ２７５（１）：３７８−８５ Ｍｉｌｄｅｒら、Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２００７）１４（３）：２２４−８ Ｐａｒｋｅｓら、１９８３ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２１３，２０１−２０９
本発明は、補体Ｂ因子アナログを含有するポリペプチドを提供する。本発明はまた、様々な補体Ｂ因子アナログも提供する。いくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子アナログは遊離のシステインアミノ酸の変異を含む。本発明はまた、本発明のポリペプチドおよび補体Ｂ因子タンパク質アナログをコードするヌクレオチド配列を含む核酸ならびにウイルスベクターも提供する。本発明のいくつかの実施形態は、本発明の補体Ｂ因子タンパク質アナログをコードする核酸を含有し、補体Ｂ因子タンパク質アナログを発現する細胞を提供する。
さらに、本発明は、本発明のポリペプチドまたは補体Ｂ因子タンパク質アナログ、本発明の核酸、本発明のウイルスベクター、あるいはこれらの任意の組み合わせを含有している薬学的製剤を提供する。
本発明の薬学的製剤、本発明のポリペプチド、本発明の補体Ｂ因子タンパク質アナログ、本発明の核酸、本発明のウイルスベクター、またはこれらの任意の組み合わせを患者に投与する工程を含む、補体媒介疾患を処置する方法もまた、本発明により提供される。
本発明はまた、補体Ｂ因子タンパク質アナログを含有するポリペプチドを生産する方法を提供し、この方法は、細胞の中で本発明の補体Ｂ因子タンパク質アナログを発現させる工程、および上記補体Ｂ因子タンパク質アナログを精製する工程を含む。
本発明のポリペプチド、本発明の補体Ｂ因子アナログ、ならびにそれらをコードする核酸およびベクターは、補体経路をモジュレートするため、ならびに補体経路に関連する様々な症状または疾患の研究および／あるいは処置に使用することができる。
本発明は、遊離のシステインの変異または除去が（ｉ）活性なおよび／または適切に折り畳まれた補体Ｂ因子タンパク質アナログの収率を改善する（例えば、実施例９および１０を参照のこと）；（ｉｉ）補体Ｂ因子タンパク質アナログの熱安定性を高める（例えば、実施例１３および１４を参照のこと）；ならびに／あるいは（ｉｉｉ）補体Ｂ因子タンパク質アナログの凝集を減少させる（例えば、実施例６を参照のこと）という発見に基づく。
本発明のこの概要は、本発明の全ての特徴または必須の特徴を必ずしも記載しているものではない。本発明はまた記載する特徴の部分的組み合わせにおいても固有であり得る。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
補体Ｂ因子タンパク質アナログを含有しているポリペプチドであって、ここでは、該補体Ｂ因子アナログが遊離のシステインアミノ酸の変異を含む、ポリペプチド。
（項目２）
前記変異が前記遊離のシステインの置換を含む、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３）
前記遊離のシステインが２つ以上のアミノ酸で置換されている、項目２に記載のポリペプチド。
（項目４）
前記補体Ｂ因子タンパク質アナログが配列番号４のアナログであり、該補体Ｂ因子タンパク質アナログがジスルフィド結合を形成するシステインアミノ酸を有しており、そして遊離のシステインアミノ酸が別のアミノ酸で置換されている、項目１に記載のポリペプチド。
（項目５）
前記遊離のシステインが、アラニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸で置換されている、上記項目のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目６）
前記ヒト補体Ｂ因子アナログがネイティブの補体Ｂ因子の結合と競合する、上記項目のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目７）
前記変異が前記遊離のシステインの欠失を含む、項目１に記載のポリペプチド。
（項目８）
前記補体Ｂ因子タンパク質アナログがヒト補体Ｂ因子タンパク質アナログである、上記項目のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目９）
前記遊離のシステインが配列番号１のアミノ酸２９２に対応する、上記項目のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目１０）
前記補体Ｂ因子タンパク質アナログが、Ｋ２５８Ａ、Ｒ２５９Ａ、Ｋ２６０Ａ、Ｄ２７９Ｇ、Ｎ２８５Ｄ、およびＤ７４０Ｎからなる群より選択される配列番号１の変異に対応する少なくとも１つの変異を含む、上記項目のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目１１）
前記補体Ｂ因子タンパク質アナログが、配列番号１のＫ２５８Ａ、Ｒ２５９Ａ、Ｋ２６０Ａ、Ｄ２７９Ｇ、およびＮ２８５Ｄに対応する変異を含む、上記項目のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目１２）
前記補体Ｂ因子タンパク質アナログが配列番号１のＤ７４０Ｎに対応する変異を含む、上記項目のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目１３）
前記補体Ｂ因子タンパク質アナログが配列番号２のアミノ酸２６〜４８０を含む、項目１に記載のポリペプチド。
（項目１４）
前記補体Ｂ因子タンパク質アナログが配列番号２のアミノ酸４８１〜７６４を含まない、項目１に記載のポリペプチド。
（項目１５）
前記補体Ｂ因子タンパク質アナログが、対応するネイティブの補体Ｂ因子タンパク質と比較して増大したＣ３ｂ結合親和性を有しており、該補体Ｂ因子タンパク質アナログが以下を含む、項目１〜９のいずれかに記載のポリペプチド：
（ｉ）対応するネイティブの補体Ｂ因子タンパク質と比較して低下したプロテアーゼ活性；
（ｉｉ）対応するネイティブの補体Ｂ因子タンパク質と比較して低下した、Ｄ因子タンパク質により切断される能力；または
（ｉｉｉ）対応するネイティブの補体Ｂ因子タンパク質と比較して低下したプロテアーゼ活性、および対応するネイティブの補体Ｂ因子タンパク質と比較して低下した、Ｄ因子タンパク質により切断される能力。
（項目１６）
前記補体Ｂ因子タンパク質アナログがＣ３ｂ結合ドメイン中に変異を含み、該補体Ｂ因子タンパク質アナログが、対応するネイティブの補体Ｂ因子タンパク質のＣ３ｂに対する結合親和性と比較して増大した、Ｃ３ｂに対する結合親和性を示す、上記項目のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目１７）
前記Ｃ３ｂ結合ドメイン中の変異が以下を含む、項目１６に記載のポリペプチド：
（ｉ）配列番号１のアミノ酸２７９に対応するアスパラギン酸の置換もしくは欠失、配列番号１のアミノ酸２８５に対応するアスパラギンの置換もしくは欠失、またはこれらの両方；あるいは
（ｉｉ）前記アスパラギン酸または前記アスパラギンの隣への少なくとも１つのアミノ酸の挿入。
（項目１８）
前記アスパラギン酸、前記アスパラギン、または両方が１つ以上のアミノ酸で置換されている、項目１７に記載のポリペプチド。
（項目１９）
前記アスパラギン酸が、グリシン、アラニン、またはアスパラギンで置換されている、項目１７または１８に記載のポリペプチド。
（項目２０）
前記アスパラギンがグリシン、アラニン、またはアスパラギン酸で置換されている、項目１７、１８、または１９に記載のポリペプチド。
（項目２１）
前記置換が、前記アスパラギン酸をグリシンで置き換えること、および前記アスパラギンをアスパラギン酸で置き換えることを含む、項目１７に記載のポリペプチド。
（項目２２）
前記補体Ｂ因子タンパク質アナログが、補体Ｄ因子切断部位中に変化を含み、ここでは、該変化が、Ｄ因子タンパク質による補体Ｂ因子タンパク質アナログの切断を減少させるかまたは取り除く、項目１５に記載のポリペプチド。
（項目２３）
前記Ｄ因子切断部位中の変化が以下を含む、項目２２に記載のポリペプチド：
（ｉ）配列番号１のアミノ酸２５９に対応するアルギニンの置換もしくは欠失、配列番号１のアミノ酸２５８もしくは２６０に対応する一方もしくは両方のリジンの置換もしくは欠失、またはアルギニンおよび両方のリジンの置換または欠失；あるいは
（ｉｉ）アルギニンの隣、１つもしくは両方のリジンの隣、またはアルギニンおよび１つもしくは両方のリジンの隣への挿入。
（項目２４）
配列番号１のアミノ酸２５８〜２６０に対応する前記アミノ酸がそれぞれアラニンで置換されている、項目２３に記載のポリペプチド。
（項目２５）
前記補体Ｂ因子タンパク質アナログが、前記セリンプロテアーゼドメインの活性部位の中に変異を含み、ここで、該変異が、対応するネイティブの補体Ｂ因子タンパク質と比較して補体Ｂ因子タンパク質アナログが補体因子Ｃ３を切断する能力を低下させるかまたは取り除く、上記項目のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目２６）
前記変異が、配列番号１のアミノ酸７４０に対応するアスパラギン酸の欠失または置換を含む、項目２５に記載のポリペプチド。
（項目２７）
前記配列番号１のアミノ酸７４０に対応するアスパラギン酸が、セリン、チロシン、グリシン、アラニン、またはグルタミン酸で置換されている、項目２６に記載のポリペプチド。
（項目２８）
前記置換が前記アスパラギン酸のアスパラギンでの置換を含む、項目２６に記載のポリペプチド。
（項目２９）
前記ヒト補体Ｂ因子タンパク質アナログが、配列番号１、２、３、２２、２３、または２６に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である、上記項目のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目３０）
前記ヒト補体Ｂ因子タンパク質アナログが、配列番号１、２、もしくは３のアミノ酸２６〜７６４に対して；配列番号２２もしくは２３のアミノ酸２６〜９９０に対して；配列番号２のアミノ酸２６〜４８０に対して；または配列番号２６のアミノ酸２６〜１００３に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である、項目１〜２８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目３１）
前記補体Ｂ因子タンパク質アナログが、配列番号２、３、２２、２３、２６、または配列番号２のアミノ酸１〜４８０を含む、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３２）
前記補体Ｂ因子タンパク質アナログが、配列番号２のアミノ酸２６〜７６４、配列番号３のアミノ酸２６〜７６４、配列番号２のアミノ酸２６〜４８０、配列番号２２のアミノ酸２６〜９９０、配列番号２３のアミノ酸２６〜９９０、または配列番号２６のアミノ酸２６〜１００９を含む、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３３）
前記補体Ｂ因子タンパク質アナログが、配列番号２のアミノ酸２６〜７６４、配列番号３のアミノ酸２６〜７６４、配列番号２のアミノ酸２６〜４８０、配列番号２２のアミノ酸２６〜９９０、配列番号２３のアミノ酸２６〜９９０、または配列番号２６のアミノ酸２６〜１００９から本質的になる、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３４）
前記ポリペプチドが免疫グロブリンＦｃドメインを含む、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３５）
前記Ｆｃドメインが前記補体Ｂ因子アナログに対してＣ末端側にある、項目３４に記載のポリペプチド。
（項目３６）
前記Ｆｃドメインが前記Ｆｃドメインの配列中にシステインの１つ以上の変異を有しており、ここでは、該１つ以上の変異が二量体の形成を阻害する、項目３４または３５に記載のポリペプチド。
（項目３７）
Ｆｃドメインが、配列番号２７のアミノ酸１７または２０に対応する１つ以上のシステインの変異を含む、項目３４〜３６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目３８）
前記１つ以上のシステインが、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸で置換されている、項目３６〜３７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目３９）
前記Ｆｃドメインが、配列番号２１のアミノ酸７６６〜９９０、配列番号２６の７６６〜１００３、配列番号２６の７８６〜１００３、配列番号２７の１〜２３８より選択されるアミノ酸配列を含む、項目３４または３５に記載のポリペプチド。
（項目４０）
前記補体Ｂ因子アナログのアミノ酸配列が補体Ｂ因子の断片に対応する、項目１〜３または３４〜３９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目４１）
前記補体Ｂ因子アナログがＢ因子のＮ末端の短縮化に対応する短縮化を含む、項目４０に記載のポリペプチド。
（項目４２）
前記補体Ｂ因子アナログがＢ因子のＣ末端の短縮化に対応する短縮化を含む、項目４０または４１に記載のポリペプチド。
（項目４３）
前記補体Ｂ因子アナログが、配列番号１、２、または４のアミノ酸４０７、４２７、４５７、４７７、４８０、４８４、４８７、５０７、または５２７に対応するアミノ酸に対してＣ末端側の短縮化に対応するＣ末端の短縮化を含む、項目４２に記載のポリペプチド。
（項目４４）
前記補体Ｂ因子アナログが、配列番号１、２、または４のアミノ酸４０７〜４８７、４７０〜４９５、または４７７〜４８７に対応するアミノ酸の間のアミノ酸でのＣ末端短縮化に対応する短縮化を含む、項目４２に記載のポリペプチド。
（項目４５）
前記補体Ｂ因子アナログが、配列番号１、２、または４のアミノ酸４０８〜７６４、４２８〜７６４、４５８〜７６４、４７８〜７６４、４８１〜７６４、４８５〜７６４、４８８〜７６４、５０８〜７６４、５２８〜７６４に対応するアミノ酸を含まない、項目４０〜４２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目４６）
前記補体Ｂ因子アナログが、崩壊促進因子と相互作用する補体Ｂ因子中のアミノ酸に対応するアミノ酸の変異を含む、上記項目のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目４７）
前記補体Ｂ因子アナログが、配列番号１のアミノ酸２９０、２９１、３２３、３６３、３６４、または４０７に対応するアミノ酸の１つ以上の変異を含む、上記項目のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目４８）
前記１つ以上の変異が置換または欠失である、項目４７に記載のポリペプチド。
（項目４９）
前記１つ以上の変異が、配列番号１のＫ２９０Ａ、Ｋ２９１Ａ、Ｋ３２３Ｅ、Ｙ３６３Ａ、Ｓ３６４Ａ、またはＤ４０７Ｎのうちの１つ以上に対応する、項目４８に記載のポリペプチド。
（項目５０）
前記補体Ｂ因子アナログが、配列番号１のＫ２９０Ａ／Ｋ２９１Ａ、Ｙ３６３Ａ／Ｓ３６４Ａ、またはＫ２９０Ａ／Ｋ２９１Ａ／Ｙ３６３Ａ／Ｓ３６４Ａに対応する変異の組み合わせのうちの１つを含む、項目４９に記載のポリペプチド。
（項目５１）
前記補体Ｂ因子タンパク質アナログが、タンパク質全体において少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９．５％、または少なくとも９９．９％純粋である、上記項目のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目５２）
前記ポリペプチドが補体活性を阻害するかまたは低下させる、上記項目のいずれか１項
に記載のポリペプチド。
（項目５３）
前記ポリペプチドが代替補体経路を阻害する、項目５２に記載のポリペプチド。
（項目５４）
上記項目のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有している核酸。
（項目５５）
項目５４に記載の核酸を含有しているウイルスベクター。
（項目５６）
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、肝炎ウイルスベクター、ＳＶ４０ウイルスベクター、ＡＡＶベクター、ＥＢＶベクター、およびＮＤＶベクターからなる群より選択される、項目５５に記載のウイルスベクター。
（項目５７）
前記レンチウイルスベクターが、ＢＩＶ、ＨＩＶ、ＥＩＡＶ、ＳＩＶ、またはＦＩＶベクターである、項目５６に記載のウイルスベクター。
（項目５８）
前記ウイルスベクターが崩解促進因子を含む、項目５７に記載のウイルスベクター。
（項目５９）
項目１〜５３のいずれか１項に記載のポリペプチド、項目５４に記載の核酸、項目５５〜５８のいずれか１項に記載のウイルスベクター、またはこれらの任意の組み合わせを含有している、薬学的製剤。
（項目６０）
ヒスチジン、ＭｇＣｌ ２ 、トレハロース、ポリソルベート、ポリソルベート２０、スクロース、アルギニン、およびプロリンからなる群より選択される少なくとも１つの成分を含有している、項目５９に記載の薬学的製剤。
（項目６１）
補体活性を阻害する方法であって、該方法は、該補体活性を阻害するために十分な量の項目１〜５３のいずれか１項に記載のポリペプチド、項目５４に記載の核酸、項目５５〜５８のいずれか１項に記載のウイルスベクター、項目５９〜６０のいずれか１項に記載の薬学的組成物、またはこれらの任意の組み合わせを、補体活性の部位に導入または投与する工程を含み、ここでは、該ポリペプチドが該補体活性を阻害する、方法。
（項目６２）
患者に対して、前記ポリペプチド、前記核酸、前記ウイルスベクター、前記薬学的組成物、またはこれらの任意の組み合わせを投与する工程を含む、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
前記ポリペプチドが、ネイティブの補体Ｂ因子の結合と競合する、項目６１または６２に記載の方法。
（項目６４）
項目６２または６３に記載の方法を含む、患者の補体媒介疾患を処置する方法。
（項目６５）
前記補体媒介疾患が眼の疾患である、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
前記薬学的組成物を眼に投与する、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記薬学的組成物を、硝子体内注射、網膜下注射、前眼房内への注射、角膜への注射または局所適用、結膜下注射、テノン下注射、または点眼により投与する、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
前記補体媒介疾患が、黄斑変性症、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、地図状委縮、湿性ＡＭＤ
、心筋梗塞、乾性ＡＭＤ、ドルーゼン形成、関節炎、脳卒中、虚血再灌流傷害、糖尿病性網膜症、硝子体網膜症、外傷性臓器損傷、角膜の炎症、角膜血管新生、ブドウ膜炎、高眼圧症、または緑内障である、項目６４〜６７のいずれか１項に記載の方法。
（項目６９）
前記補体媒介疾患が、アテローム性動脈硬化症、気道応答性亢進、免疫関連疾患、自己免疫関連疾患、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節炎、リウマチ性疾患、抗リン脂質抗体症候群、腸および腎臓のＩ／Ｒ傷害、喘息、非定型溶血性尿毒症症候群、ＩＩ型膜増殖性糸球体腎炎、非増殖性糸球体腎炎、胎児喪失、脳傷害、外傷後臓器損傷、梗塞後臓器損傷、血管炎、遺伝性血管浮腫、発作性夜間ヘモグロビン尿症、脳血管偶発症、アルツハイマー病、移植片拒絶、感染症、敗血症、敗血症性ショック、シェーグレン症候群、重症筋無力症、抗体に媒介される皮膚疾患、Ｉ型およびＩＩ型真性糖尿病、インスリン抵抗性症候群、妊娠性糖尿病、甲状腺炎、特発性血小板減少性紫斑病および溶血性貧血、神経障害、多発性硬化症、心肺バイパス傷害、結節性多発性動脈炎、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、血清病、グッドパスチャー病、全身性壊死性血管炎、連鎖球菌感染後の糸球体腎炎、特発性肺線維症、膜性糸球体腎炎、急性ショック性肺症候群、成人呼吸窮迫症候群、および再灌流からなる群より選択される、項目６４〜６７のいずれか１項に記載の方法。
（項目７０）
前記薬学的組成物の投与前、投与と同時、または投与後に、補体阻害因子または抗血管形成因子を前記患者に投与する工程をさらに含む、項目６４〜６９のいずれか１項に記載の方法。
（項目７１）
前記補体阻害因子が、Ｈ因子、Ｈ因子様１、ＭＣＰ、ＤＡＦ、または可溶性形態のＭＣＰからなる群より選択される、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
前記抗血管形成因子が、エンドスタチン、ＶＥＧＦ結合分子、ＰＥＤＦ、Ｔ２−ＴｒｐＲＳ、ｓＦＬＴ、アフリバーセプト、およびキニノスタチンからなる群より選択される、項目７０または７１に記載の方法。
（項目７３）
抗炎症剤を、前記薬学的組成物の投与前、投与と同時、または投与後に投与する、項目６４〜７２のいずれか１項に記載の方法。
（項目７４）
前記抗炎症剤を
（ｉ）前記薬学的組成物と同時に投与する、または
（ｉｉ）前記薬学的組成物が前記抗炎症剤を含む、
項目７３に記載の方法。
（項目７５）
前記抗炎症剤を眼に投与する、項目７３または７４に記載の方法。
（項目７６）
前記抗炎症剤が、デキサメタゾン、デキサメタゾンナトリウムメタスルホベンゾエート、デキサメタゾンナトリウムホスフェート、フルオロメトロン、ブロムフェナク、プラノプロフェン、シクロスポリン眼科用乳液、ナプロキセン、糖質コルチコイド、ケトロラク、イブプロフェン、トルメチン、非ステロイド性抗炎症薬、ステロイド性抗炎症薬、ジクロフェナク、フルルビプロフェン、インドメタシン、およびスプロフェンからなる群より選択される、項目７３、７４、または７５に記載の方法。
（項目７７）
前記ウイルスベクターを含有している薬学的製剤を、約１週間、１か月、２か月、３か月、６か月、９か月、１年、１８か月、２年、３０か月、３年、５年、または１０年に１回投与する、項目６２〜６４のいずれか１項に記載の方法。
（項目７８）
補体活性、Ｔ細胞の活性化、Ｂ細胞、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、エストロゲン、インターロイキン−１、またはインターフェロン−γを阻害する化合物を、前記薬学的組成物の投与前、投与と同時、または投与後に投与する、項目６４〜７７のいずれか１項に記載の方法。
（項目７９）
前記化合物が、インフリキシマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ、エタネルセプト、アバタセプト、およびリツキシマブからなる群より選択される、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
前記ウイルスベクターを含有している薬学的製剤を前記患者に１度だけ投与する、項目６２〜６４のいずれか１項に記載の方法。
（項目８１）
項目５４に記載の核酸を含有している細胞であって、ポリペプチドを発現する、細胞。
（項目８２）
前記細胞が哺乳動物細胞である、項目８１のいずれか１項に記載の細胞。
（項目８３）
前記細胞が、２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＰｅｒＣ６細胞、またはＶｅｒｏ細胞からなる群より選択される、項目８１に記載の細胞。
（項目８４）
前記細胞が原核生物細胞である、項目８１に記載の細胞。
（項目８５）
前記細胞が大腸菌細胞である、項目８１に記載の細胞。
（項目８６）
補体Ｂ因子タンパク質アナログを含有しているポリペプチドを生産する方法であって：
ａ．項目１〜５３のいずれか１項に記載のポリペプチドを細胞中で発現させる工程；および
ｂ．該ポリペプチドを精製する工程
を含む、方法。
本発明を説明する目的のために、本発明の特定の実施形態を図面において説明する。しかしながら、本発明は図面に示す実施形態の厳密な配置および手段に限定されない。
図１Ａは、古典的補体経路およびレクチン補体経路を示す。古典的経路はＣ１を介して開始されるが、レクチン経路はマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）を介して開始される。Ｃ４ｂＣ２ａはＣ３を切断してＣ３ａおよびＣ３ｂとするプロテアーゼであり、Ｃ３コンバターゼと呼ばれる。同様に、Ｃ４ｂＣ２ａＣ３ｂはＣ５を切断してＣ５ａおよびＣ５ｂとし、そしてＣ５コンバターゼと呼ばれる。Ｃ３ａ、Ｃ４ａ、およびＣ５ａは炎症特性を有しており、貪食性細胞を引き付ける。Ｃ５ｂ６〜９は膜攻撃複合体（ＭＡＣ）を形成し、これは、感染性物質を死滅させるが宿主細胞にも損傷を与える可能性がある膜細孔を作製する。ＭＡＳＰはマンナン結合レクチン関連セリンプロテアーゼである。。図１Ｂは代替補体経路を示す。この経路はＣ３の自発的切断を介して低レベルで構成的に活性である。適切な表面の存在下においては、Ｃ３ｂは補体Ｂ因子（ｆＢ）に結合する。次に、この複合体が補体Ｄ因子（ｆＤ）により切断されてＣ３ｂＢｂが生じる。数分以内のこの複合体の自発的解離（「崩壊」）がその不活性化をもたらし、一方、プロペジンによる安定化によりＣ３を切断する複合体、即ちＣ３コンバターゼが生成される。補体経路を減衰させる因子のいくつかはＣ３コンバターゼおよびＣ５コンバターゼの崩壊を加速させることによりそれを行う。Ｃ３ｂはＣ３コンバターゼに参加して追加のＣ３ｂを生成し、これにより大きな矢印で示すような正のフィードバックループを生じさせる。Ｃ３ｂＢｂはＣ３コンバターゼである。Ｃ３ｂＢｂＣ３ｂはＣ５コンバターゼである。 図２は、ｈｆＢ３−２９２Ｓ発現構築物である。ＣＭＶ−サイトメガロウイルス即時初期プロモーター；ＩＲＥＳ−配列内リボソーム進入部位；Ｎｅｏ−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子；ＳｙｎポリＡ−合成ポリＡ；Ａｍｐ−アンピシリン耐性遺伝子。配列番号８は、図２に示すｈｆＢ３−２９２Ｓ発現構築物のヌクレオチド配列である。 図３は、細胞培養物の７２時間のインキュベーション（２×１０６細胞／ｍＬ）後のｈｆＢ３タンパク質またはｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質のいずれかを含有している未精製の細胞培養物上清のウェスタンブロット分析を示す。レーン１、陰性対照とした未処理の非トランスフェクト２９３ ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ細胞由来の１μｌの細胞培養培地；レーン２、陽性対照とした血漿から精製した１００ｎｇのヒト野生型Ｂ因子（Ｑｕｉｄｅｌ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）；レーン３、ｈｆＢ３生産細胞由来の１μｌの細胞培養培地；レーン４、ｈｆＢ３−２９２Ｓ生産細胞由来の１μｌの細胞培養培地。ＫＤａの分子量マーカーを右側に示す。 図４は溶血試験の結果を示す。これらの結果は、未精製のｈｆＢ３タンパク質またはｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質生産細胞の培養培地によるヒト代替補体経路の溶血活性の阻害を示す。相対的な溶血活性を、ヒト代替補体経路の活性によるｒＲＢＣの溶血後に放出されたヘモグロビンによりスコアする。Ｘ軸（左から右に）：０μｇの精製したヒトＢ因子タンパク質を補充したＢ因子枯渇ヒト血清（対照、ｒＲＢＣの溶解なし）；０．５μｇの精製したヒトＢ因子タンパク質と、ｈｆＢ３タンパク質またはｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質生産細胞の培養培地由来の、示すとおりの、１．０、０．５、０．２５、もしくは０．１２５μｇのｈｆＢ３タンパク質またはｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質との混合物をそれぞれの反応において補充したＢ因子枯渇ヒト血清。注：１００％の阻害はｒＲＢＣの溶解がないことを示す。Ｙ軸は、平均ＯＤ４０５と標準偏差（ＳＤ）を示す。 図５Ａは、３工程のクロマトグラフィー処理により精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色分析を行ったｈｆＢ３タンパク質（２００ｎｇ）を示す。図５Ｂは、精製したｈｆＢ３タンパク質によるヒト代替補体経路の溶血活性の阻害を示す。Ｘ軸（左から右に）：０μｇの精製した野生型ヒトＢ因子タンパク質（ｗｔ ｈｆＢ）を補充したＢ因子タンパク質枯渇ヒト血清（対照、ｒＲＢＣの溶解なし）；０．５μｇの精製した野生型ヒトＢ因子タンパク質と、示すとおりの、１．０、０．５、０．３、０．２、０．１、または０．０５μｇのｈｆＢ３との混合物をそれぞれの反応において補充したＢ因子タンパク質枯渇ヒト血清。１００％の阻害はｒＲＢＣの溶解がないことを示す。Ｙ軸は、平均ＯＤ４０５とＳＤを示す。 図６は、ｈｆＢ３タンパク質の２つの集団の生物学的活性を示す。ヒト代替補体経路の溶血活性の阻害について、ピークＩおよびピークＩＩに由来する、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により精製したｈｆＢ３タンパク質の結果を示す。Ｘ軸（左から右に）：０μｇの精製したヒトＢ因子タンパク質を補充したＢ因子タンパク質枯渇ヒト血清（対照、ｒＲＢＣの溶解なし）；０．５μｇの精製した野生型ヒトＢ因子タンパク質と１．０〜０．０５μｇの範囲の様々な量のｈｆＢ３タンパク質との混合物をそれぞれの反応において補充したＢ因子タンパク質枯渇ヒト血清。１００％の阻害はｒＲＢＣの溶解がないことを示す。Ｙ軸は、平均ＯＤ４０５とＳＤを示す。 図７は、組織培養物の７２時間のインキュベーション（２×１０６細胞／ｍＬ）後の、ｈｆＢ３タンパク質またはｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質のいずれかを含有している未精製の細胞培養物上清の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を示す。Ａ）ｈｆＢ３生産細胞（．．．．．）、ｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質生産細胞（＿＿＿＿＿）、および未処理の２９３細胞（＿ ＿ ＿ ＿ ＿）由来の上清を、狭口径Ｊｕｐｉｔｅｒ（商標）Ｃ４カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を使用するＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰ１１００ ＨＰＬＣシステムにアプライし、０．１％のＴＦＡを含有する水／アセトニトリル（２５〜７０％のアセトニトリル）勾配で５０分間で溶離させた。溶離をＰＤＡ検出器で２１５ｎｍでモニターした。３つの試料全ての中に存在する熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）の位置もまた示す。Ｂ）ｈｆＢ３タンパク質のピークＩおよびピークＩＩ、ならびにｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質を含有しているピークを含む領域（２５〜２９分）に焦点を当てた、図７Ａに示すクロマトグラムの拡大図。 図７は、組織培養物の７２時間のインキュベーション（２×１０６細胞／ｍＬ）後の、ｈｆＢ３タンパク質またはｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質のいずれかを含有している未精製の細胞培養物上清の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を示す。Ａ）ｈｆＢ３生産細胞（．．．．．）、ｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質生産細胞（＿＿＿＿＿）、および未処理の２９３細胞（＿ ＿ ＿ ＿ ＿）由来の上清を、狭口径Ｊｕｐｉｔｅｒ（商標）Ｃ４カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を使用するＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰ１１００ ＨＰＬＣシステムにアプライし、０．１％のＴＦＡを含有する水／アセトニトリル（２５〜７０％のアセトニトリル）勾配で５０分間で溶離させた。溶離をＰＤＡ検出器で２１５ｎｍでモニターした。３つの試料全ての中に存在する熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）の位置もまた示す。Ｂ）ｈｆＢ３タンパク質のピークＩおよびピークＩＩ、ならびにｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質を含有しているピークを含む領域（２５〜２９分）に焦点を当てた、図７Ａに示すクロマトグラムの拡大図。 図８は、ｈｆＢ３−Ｆｃタンパク質を含有している２μｌの細胞培養物上清について非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析を行ったことによる、ｈｆＢ３−Ｆｃタンパク質の発現の分析を示す（実施例１２を参照のこと）。ｈｆＢ３−Ｆｃタンパク質の２つのバンドを、左に示したＫＤａの分子量マーカーとともに検出した。 図９は、実施例１６に記載する関節リウマチについてのコラーゲン抗体誘導関節炎（ＣＡＩＡ）のマウスモデルにおける、ｈｆＢ３−２９２Ｓを試験する研究によるマウスの右前肢関節のパラフィン切片の代表的なＨ＆Ｅ染色を示す。グループ１はコラーゲン抗体カクテルを投与しなかった溶媒対照グループである。グループ２はコラーゲン抗体カクテルを投与した未処置のグループである。グループ３は、コラーゲン抗体カクテルを投与し、ｈｆＢ３−２９２Ｓで処置した処置グループである。 図１０は、実施例１６に記載する関節リウマチについてのコラーゲン抗体誘導関節炎（ＣＡＩＡ）のマウスモデルにおける、ｈｆＢ３−２９２Ｓを試験する研究による関節腫脹の測定値を示す。グループは段落に記載したように図８のグループと同じである。ｈｆＢ３−２９２Ｓは、未処置のグループ（グループ２）と比較して、関節腫脹の統計的に有意な軽減（ｐ＜０．０００３）を生じた。 図１１は、ｈｆＢ３−２９２ＳＮ４８０発現構築物をトランスフェクトした細胞由来の細胞培養培地のウェスタンブロット分析を示す。このウェスタンブロット分析は、ｈｆＢ３−２９２Ｓに特異的なモノクローナル抗体を使用して行った。左のレーンはｈｆＢ３−２９２Ｓを含み、右のレーンはｈｆＢ３−２９２ＳＮ４８０発現構築物をトランスフェクトした細胞由来の細胞培養培地である。この分析により、ｈｆＢ３−２９２ＳＮ４８０細胞株の細胞培養培地からおよそ５５ＫＤａのバンドを検出した（右のレーン）。 図１２は、以下の実施例１９に記載するｈｆＢ３−２９２Ｓ／Ｆｃ−ｍｏｎｏ発現構築物をトランスフェクトした細胞由来の細胞培養培地のウェスタンブロット分析を示す。およそ１１５ＫＤａのバンドを、この非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって精製したヤギ抗ヒトＢ因子抗体により検出した。 図１３は、ｈｆＢ３−２９２ＳＮ４８０を発現する細胞由来の細胞培養物上清がヒト代替補体経路の溶血活性を用量依存性様式で阻害したことを示す。 図１４は、ｈｆＢ３−２９２Ｓ／Ｆｃ−ｍｏｎｏを発現する細胞由来の細胞培養物上清がヒト代替補体経路の溶血活性を用量依存性様式で阻害したことを示す。
配列の簡単な説明
配列番号１ − 野生型ヒト補体Ｂ因子のアミノ酸配列。
配列番号２ − 以下の変異を含むヒト補体Ｂ因子タンパク質アナログｈｆＢ３−２９２Ｓのアミノ酸配列：Ｋ２５８Ａ、Ｒ２５９Ａ、Ｋ２６０Ａ、Ｄ２７９Ｇ、Ｎ２８５Ｄ、およびＣ２９２Ｓ。
配列番号３ − 配列番号１と比較して以下の変異を含むヒト補体Ｂ因子アナログｈｆＢ３−２９２Ｓ−７４０Ｎのアミノ酸配列：Ｋ２５８Ａ、Ｒ２５９Ａ、Ｋ２６０Ａ、Ｄ２７９Ｇ、Ｎ２８５Ｄ、Ｄ７４０Ｎ、およびＣ２９２Ｓ。
配列番号４ − 配列番号１と比較して以下の変異を含むヒト補体Ｂ因子アナログ、ｈｆＢ３のアミノ酸配列：Ｋ２５８Ａ、Ｒ２５９Ａ、Ｋ２６０Ａ、Ｄ２７９Ｇ、およびＮ２８５Ｄ。
配列番号５ − ｈｆＢ３発現構築物のヌクレオチド配列。この構築は実施例１に記載する。
配列番号６〜７ − 部位特異的変異誘発のためのプライマー。
配列番号８ − ｈｆＢ３−２９２Ｓ発現構築物のヌクレオチド配列。この構築は実施例２に記載する。
配列番号９〜１４ − それぞれ、ヒト、マウス、ラット、ブタ、サル、およびヒツジ由来の補体Ｂ因子タンパク質の部分的アミノ酸配列。
配列番号１５〜１６ − 部位特異的変異誘発のためのプライマー。
配列番号１７ − ヒト補体Ｂ因子タンパク質アナログｈｆＢ４のアミノ酸配列。
配列番号１８ − ｈｆＢ３−Ｆｃ発現構築物のヌクレオチド配列。この構築は実施例１２に記載する。
配列番号１９〜２０ − 部位特異的変異誘発のためのプライマー。
配列番号２１ − ヒト補体Ｂ因子タンパク質アナログｈｆＢ３−Ｆｃのアミノ酸配列。
配列番号２２ − ヒト補体Ｂ因子タンパク質アナログｈｆＢ３−２９２Ｓ−Ｆｃのアミノ酸配列。
配列番号２３ − ヒト補体Ｂ因子タンパク質アナログｈｆＢ３−２９２Ｓ−７４０Ｎ−Ｆｃのアミノ酸配列。
配列番号２４ − ｈｆＢ３−２９２ＳＮ４８０を発現させるための発現構築物のヌクレオチド配列。
配列番号２５ − ｈｆＢ３−２９２Ｓ／Ｆｃ−ｍｏｎｏについてのヌクレオチド配列遺伝子発現構築物。
配列番号２６ − ｈｆＢ３−２９２Ｓ／Ｆｃ−ｍｏｎｏのアミノ酸配列。
配列番号２７ − Ｆｃドメインのアミノ酸配列。
（詳細な説明）
本発明の実施では、特段の記載が無い限り、当業者の技術の範囲内である細胞生物学、分子生物学、細胞培養、ウイルス学などの従来技術を利用する。これらの技術は本明細書中および／または最新文献、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ編、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｃｅｌｉｓ Ｊ．Ｅ．「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）、およびＢａｈｎｓｏｎら、Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，５４：１３１−１４３（１９９５）の中に十分に開示されている。
本明細書に記載するいずれかの方法、調製物、または組成物を、本明細書に記載するいずれかの他の方法、調製物、または組成物に関して実施することができる。請求項および／または明細書における「含む」という用語と組み合わせて使用する場合の「ある〜」という単語の使用は「１つの〜」という意味を有してよいが、「１つ以上の〜」、「少なくとも１つの〜」および「１つまたは１つより多い〜」の意味とも合致するものである。「および／または」という用語／句の使用は、列挙により使用する場合、列挙された項目の１つ以上を利用してよいこと、例えば、要素の１つまたは全てに限定されないことを意味する。
ｈｆＢ３と命名した補体Ｂ因子タンパク質アナログ（配列番号４）の生産および精製の間に、補体Ｂ因子タンパク質アナログの２つの集団が検出された。一方の集団は補体Ｂ因子タンパク質アナログについて所望される活性を有していたが（ピークＩ）、他方の集団は所望される活性を実質的には有していなかった（ピークＩＩ）（例えば、図６および７を参照のこと）。２つの集団の特性決定による結果は、２つの集団がそれらのジスルフィド結合パターンにおいて異なることを示唆していた。遊離のシステイン（配列番号４の２９２位）がセリンに変異していた場合には、ピークＩＩは検出できなかった。図６は、ピークＩＩ画分が補体／溶血活性を阻害する能力をいくらか示すものの、ピークＩ画分と比較するとタンパク質１μｇあたりの能力がはるかに低いことを示している。ピークＩＩを用いた場合に見られた補体／溶血阻害活性は、主に、またはもっぱら、おそらくは、ピークＩおよびピークＩＩの結果が互いに完全には分解されていないために、２９２位に遊離のシステインを持ついくつかのｈｆＢ３を含有しているピークＩＩの結果である可能性がある。
配列番号１の２９２位に対応するシステインは、様々な哺乳動物種の補体Ｂ因子タンパク質の間で高度に保存されている（例えば、表１を参照のこと）。高度に保存されている配列は、通常、タンパク質の機能に重要である。「分子進化状態の中立説は、変異が遺伝子産物の機能に影響を及ぼさない限りは、アミノ酸の変異は確率的に一定の様式で起こると述べている［Ｋｉｍｕｒａ Ｍ：Ｔｈｅ ｎｅｕｔｒａｌ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｓｃｉ Ａｍ １９７９，２４１（５）：９８−１００，１０２，１０８ ｐａｓｓｉｍ］。一方、タンパク質の機能および構造に重要なアミノ酸は、タンパク質活性に有害な影響を及ぼさずに変異することはできない。したがって、これらのアミノ酸は、進化の間に所定のタンパク質ファミリーにおいて極めてゆっくりと変化するであろう」（Ｌｉｕら、ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００６，７：３７）。
例えば配列番号２（ｈｆＢ３−２９２）に示すような、補体Ｂ因子タンパク質アナログのアミノ酸２９２位のシステインのセリンへの変異は、取り除かれなければ、ピークＩＩ（実質的に低活性）集団の量を大きく減少させ、ｈｆＢ３−２９２Ｓ補体Ｂ因子タンパク質アナログはその活性（この場合は、補体活性を阻害するまたは低下させる能力）を保持する（例えば、以下の実施例１０を参照のこと）。
理論に縛られることは望ましくないが、ｈｆＢ３タンパク質の低活性の集団（ピークＩＩ画分）はｈｆＢ３タンパク質の誤った折り畳みの結果であり得る。ｈｆＢ３タンパク質について使用した様式と同様の様式で野生型ヒト補体Ｂ因子タンパク質（配列番号１）を発現するように細胞が操作された場合には、野生型ヒトＢ因子タンパク質の１つの集団だけが検出された（未公開データ）という理由から、ピークＩＩ集団の大部分の生成は、遊離のシステインとｈｆＢ３タンパク質に導入された変異の組み合わせが原因である可能性がある。
遊離のシステインのこの変異は、生産される補体Ｂ因子タンパク質アナログの全てではないがほとんどが活性な形態であるため、活性な補体Ｂ因子アナログの高い収率を可能にする。さらに、残りの変異していないシステインが全てジスルフィド結合の一部であり、起こり得る望ましくない有害な反応に関与し得る遊離のシステインが残っていないために、遊離のシステインの変異はより安定なタンパク質を生じる。さらに、遊離のシステインの変異は予想外に、補体Ｂ因子タンパク質アナログの凝集を減少させたまたは排除したとみられる。例えば、実施例６および図３を参照のこと。
ＰＣＴ公開番号ＷＯ０８／１０６６４４または米国特許公開番号ＵＳ２０１００１２０６６５（両方とも言及されたことによりそれらの全体が組み入れられたこととなる）に記載されている補体Ｂ因子タンパク質アナログは、変異したそれらの遊離のシステインを有し得、そして変異の上記利点による恩恵を受けつつ、なおもそれらの所望される機能を保持し得る。したがって、本発明は、遊離のシステインの変異を持つ、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０８／１０６６４４または米国特許公開番号ＵＳ２０１００１２０６６５に記載されている任意の補体Ｂ因子タンパク質アナログを含む。
用語「遊離のシステイン」は、同じタンパク質またはペプチド中の別のシステインとジスルフィド結合を形成しない、タンパク質またはペプチドの一部であるシステインを意味する。いくつかの場合は、タンパク質アナログの「遊離のシステイン」は、タンパク質アナログが所望される活性を有している場合には（同じタンパク質またはペプチド中の）別のシステインとジスルフィド結合を形成しないが、タンパク質アナログの低活性または不活性の形態においては（同じタンパク質またはペプチド中の）別のシステインとジスルフィド結合を形成することができる。
用語「補体媒介」は補体が関与する過程または疾患を意味する。典型的には、「補体媒介」疾患または状態は、補体活性が疾患または状態の根本となる原因の１つであり、そして、補体活性の阻害またはブロッキングが疾患または状態の程度を低下させるものである。多数の補体媒介疾患または状態の例を本明細書に記載する。
用語「野生型」（ｗｉｌｄｔｙｐｅまたはｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）は、「ネイティブ」と互換的に使用され、哺乳動物ゲノム、自然界に存在する核酸などによりコードされる自然界に存在するタンパク質に関する。いくつかの場合は、例えば、対立遺伝子の相違；様々なイソ型；および／または１つの種の様々な個体間での遺伝的バリエーションが原因で、野生型バージョンに対応する２つ以上のタンパク質が実際に存在し得る。
用語「アナログ」はタンパク質（親タンパク質）の構造的誘導体を意味する。アナログは、必ずしも親タンパク質の全ての特性を保持している必要はなく、いくつかの場合は、対応するネイティブの親タンパク質と比較して少なくとも１つの変化した特性を有する。いくつかの実施形態においては、親タンパク質はネイティブの（自然界に存在する）タンパク質である。アナログまたはバリアントタンパク質は、そのタンパク質の対応するネイティブのアミノ酸配列に関して、アミノ酸を置き換える、置換する、欠失させる、および／または付加することにより生成される。置換または挿入は典型的には、自然界に存在するアミノ酸が関与するが、合成または非従来のアミノ酸も同様に含まれ得る。いくつかの実施形態においては、アナログまたはバリアントはタンパク質を変異させること、例えば、それをコードする核酸を変異させることにより生成される。アナログは典型的には、対応するネイティブの親タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％を保持することになる（例えば、親タンパク質全体の長さに渡り、または、特定の実施形態においては、親タンパク質の特定のドメインまたは一部分にわたり決定した場合に、自然界に存在する親タンパク質に関してそのようなパーセントアミノ酸配列同一性を有する）。アナログはまた、アミノ酸配列の一部分を含む全長アナログの断片を含み、そして親タンパク質または全長アナログの生物学的活性の１つ以上を保持しているか、あるいはこれらの生物学的活性の１つ以上を阻害するかのいずれかである。
用語「対応する」または「対応している」は、特定のタンパク質中のアミノ酸に言及する場合は、その特定のタンパク質中の特定のアミノ酸を、そしてまた、関連するまたは類似するタンパク質中のアミノ酸も意味し、タンパク質に同様の機能を提供し得る。例えば、ヒト補体Ｂ因子中のアミノ酸は、通常は２つのアミノ酸配列をアラインすることにより決定される、マウス補体Ｂ因子中の、またはＢ因子のヒト対立遺伝子バリアント中のアミノ酸と対応させて見ることができる。例えば当業者であれば、例えば、ＢＬＡＳＴプログラムを使用して、２つ以上の関連する配列、例えば、配列番号９〜１４をアラインさせて対応するアミノ酸を決定することができる（例えば、上記表１を参照のこと）。さらにまた、対応するアミノ酸は、例えば、関連または関連のないタンパク質内のモチーフ（例えば、プロテアーゼ切断モチーフ）をアラインさせることにより決定することができる。そのようなアライメントはまた、標的タンパク質のコンセンサス配列またはそのドメインを導くために使用され得る。
本明細書中で使用する場合は、用語「遺伝子」は典型的にはタンパク質のコード領域を意味する。しかし本明細書中の一部の文脈においては、用語「遺伝子」はまた、プロモーター、エンハンサー、スプライシング部位（アクセプターおよび／またはドナー）、ポリアデニル化シグナル、イントロン、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域などのような、コード領域に作動可能であるように連結されたエレメント（例えば、調節エレメント）を意味していることが明らかであろう。
用語「薬学的に許容され得る」は、連邦または州政府の規制機関により認可されているか、あるいは米国薬局方または人における使用に関する他の一般的に認知された薬局方に列挙されていることを意味する。
「治療上の利益」は必ずしも特定の疾患または状態（本明細書に記載する任意の疾患または状態を含む）の治癒ではなく、むしろ疾患または状態の軽減、疾患または状態の排除、疾患または状態に関連する１つ以上の症状の低減、原発性の疾患または状態の発生により生じる二次的な疾患または状態の予防または軽減、状態または疾患を発症する可能性の低減、疾患または状態の重症度の低下、疾患または状態の性質の変化、疾患または状態の経過の短縮、疾患または状態の進行または悪化の緩徐化または予防、および／あるいは疾患または状態の予防を最も典型的には含む結果を含む。
補体Ｂ因子アナログ
本発明は、補体Ｂ因子タンパク質アナログおよび補体因子アナログを含有しているポリペプチドおよびそれらの使用を含む。本発明のいくつかの実施形態は、遊離のシステインが変異した補体Ｂ因子タンパク質アナログを含む。いくつかの実施形態においては、遊離のシステインのこの変異には、遊離のシステインの欠失、または別のアミノ酸（単数または複数）での遊離のシステインの置換が含まれ得る。遊離のシステインは、補体Ｂ因子タンパク質アナログが所望される特性（単数または複数）のうちの少なくともいくつか、例えば、補体活性をダウンレギュレートする、低下させる、または取り除く能力を保持することをなおも可能にする、原則的に任意のアミノ酸で置換することができる。置換は１つ以上のアミノ酸を用いて行われ得る。いくつかの実施形態においては、遊離のシステインがセリンで置換される。いくつかの実施形態においては、遊離のシステインが、アラニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、チロシン、およびバリンからなる群より選択される１つ以上のアミノ酸で置換される。いくつかの実施形態においては、遊離のシステインは配列番号１のアミノ酸２９２に対応する。
いくつかの実施形態においては、本発明は遊離のシステインを含まない補体Ｂ因子タンパク質アナログを提供する。本発明はまた、遊離のシステインを変異させる工程を含む補体Ｂ因子タンパク質アナログを作製または生産する方法も提供する。
遊離のシステインの変異は、補体Ｂ因子タンパク質の他の変異、例えば、本明細書中に記載する他の変異と組み合わせることができる。
本発明はまた、配列番号１のアミノ酸２９２に対応するシステインが変異している補体Ｂ因子タンパク質アナログも提供する。この変異は、欠失、挿入、または置換（例えば、セリン置換）、または本明細書中に記載する他の変異であり得る。
アナログは、自然界に存在するアミノ酸配列以外の配列の様々な変異タンパク質を含み得る。例えば、単一または多数のアミノ酸置換（例えば、保存的または非保存的アミノ酸置換）を自然界に存在する配列の中に作製することができる。保存的アミノ酸置換は一般的には、親配列の構造的特徴を実質的に変化させてはならない（例えば、置き換えのアミノ酸は親配列中に存在するへリックスを断裂する傾向を有してはならず、また親配列を特徴づける他の型の二次構造を崩壊させてはならない）。当該分野で知られているポリペプチドの二次および三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ ａｎｄ Ｊ．Ｔｏｏｚｅ，編，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１））；およびＴｈｏｒｎｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５４：１０５（１９９１）に記載されている。保存的置換としては、以下の群による置換が挙げられるがこれらに限定されるわけではない：酸性残基Ａｓｐ（Ｄ）およびＧｌｕ（Ｅ）；塩基性残基Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、およびＨｉｓ（Ｈ）；親水性無電化残基Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ａｓｎ（Ｎ）、およびＧｌｎ（Ｑ）；脂肪族無電化残基Ｇｌｙ（Ｇ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、およびＩｌｅ（Ｉ）；非極性無電化残基Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、およびＰｒｏ（Ｐ）；芳香族残基Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、およびＴｒｐ（Ｗ）；アルコール基を含有している残基ＳおよびＴ；脂肪族残基Ｉ、Ｌ、Ｖ、およびＭ；シクロアルケニルを伴う残基Ｆ、Ｈ、Ｗ、およびＹ；疎水性残基Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹ；負電荷を持つ残基ＤおよびＥ；極性残基Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、およびＴ；正電荷を持つ残基Ｈ、Ｋ、およびＲ；小さい残基Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、およびＶ；非常に小さい残基Ａ、Ｇ、およびＳ；ターンの形成に関与する残基Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｐ、およびＴ；ならびに可撓性残基Ｑ、Ｔ、Ｋ、Ｓ、Ｇ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、およびＲ。
いくつかの実施形態においては、非保存的置換が使用される。
いくつかの実施形態においては、変異には、１つ以上のアミノ酸の置換、１つ以上のアミノ酸の欠失、または１つ以上のアミノ酸の挿入が含まれるがこれらに限定されるわけではない。変異には（１）タンパク質分解に対する補体Ｂ因子アナログの感受性を低下させるもの、（２）酸化に対する補体Ｂ因子アナログの感受性を低下させるもの、（３）タンパク質複合体を形成する補体Ｂ因子アナログの結合親和性を変化させるもの、（４）補体Ｂ因子アナログの結合親和性を変化（例えば、増大または低下）させるもの、（５）補体Ｂ因子アナログの免疫原性を低下させるもの、（６）補体Ｂ因子アナログの安定性（例えば、熱安定性）を高めるもの；（７）補体Ｂ因子タンパク質アナログの凝集を減少させるもの；あるいは、１〜７の任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
いくつかの実施形態においては、本発明のヒト補体Ｂ因子アナログはネイティブの補体Ｂ因子の結合と競合する。例えば、ネイティブの補体Ｂ因子は補体因子Ｃ３ｂと結合してＣ３ｂＢを形成することができる（例えば、図１Ｂを参照のこと）。Ｂ因子はＣ３ｂＢ複合体の一部であり、Ｄ因子に結合することができる。したがっていくつかの実施形態においては、本発明の補体Ｂ因子アナログは、（ｉ）Ｃ３ｂに対する結合、（ｉｉ）Ｄ因子に対する結合、または（ｉｉｉ）両方についてネイティブのＢ因子の結合と競合し得る。
いくつかの実施形態においては、本発明の補体Ｂ因子タンパク質アナログは、ジスルフィド結合を形成するシステインアミノ酸と、別のアミノ酸により置換された遊離のシステインアミノ酸を有しており、２つ以上のアミノ酸が置換されずに欠失している、配列番号４のアナログである。
本発明のいくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子タンパク質アナログは対応するネイティブの補体Ｂ因子タンパク質と比較して増大したＣ３ｂ結合親和性を有し、補体Ｂ因子タンパク質アナログは、（ｉ）対応するネイティブの補体Ｂ因子タンパク質と比較して低下したプロテアーゼ活性；（ｉｉ）対応するネイティブの補体Ｂ因子タンパク質と比較して低下した、Ｄ因子タンパク質により切断される能力；または（ｉｉｉ）対応するネイティブの補体Ｂ因子タンパク質と比較して低下したプロテアーゼ活性と対応するネイティブの補体Ｂ因子タンパク質と比較して低下した、Ｄ因子タンパク質により切断される能力を含む。
いくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子アナログはＣ３ｂ結合ドメイン中に変異を含み、補体Ｂ因子タンパク質アナログは、対応するネイティブの補体Ｂ因子タンパク質のＣ３ｂに対する結合親和性と比較して高い、Ｃ３ｂに対する結合親和性を示す。いくつかの実施形態においては、Ｃ３ｂ結合ドメイン中の変異は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸２７９に対応するアスパラギン酸の置換もしくは欠失、配列番号１のアミノ酸２８５に対応するアスパラギンの置換もしくは欠失、またはこれらの両方；あるいは、（ｉｉ）上記アスパラギン酸または上記アスパラギンの隣への少なくとも１つのアミノ酸の挿入を含む。いくつかの実施形態においては、このアスパラギン酸、アスパラギン、または両方が、１つ以上のアミノ酸で置換される。いくつかの実施形態においては、配列番号１のアミノ酸２７９に対応するアスパラギン酸がグリシン、アラニン、またはアスパラギンで置換される。いくつかの実施形態においては、配列番号１のアミノ酸２８５に対応するアスパラギンがグリシン、アラニン、またはアスパラギン酸で置換される。いくつかの実施形態においては、配列番号１のアミノ酸２７９に対応するアスパラギン酸がグリシンで置換され、配列番号１のアミノ酸２８５に対応するアスパラギンがアスパラギン酸で置換される。
いくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子タンパク質アナログはヒト補体因子タンパク質をベースとするヒト補体Ｂ因子タンパク質アナログである。
本発明は、例えば、補体活性化の代替経路を減衰させるためにタンパク質として、および／または遺伝子導入を介して送達することができる補体Ｂ因子タンパク質アナログを含む。これらのアナログは、例えば以下を含むいくつかの補体阻害剤の開発を妨害する複数のハードルを克服すると考えられる：１）長期の全身免疫抑制を回避すること；２）血中の補体因子のそうしなければ悲観的なほどに高いレベルにもかかわらず薬効を達成すること；３）薬効のために網膜およびブルーフ膜の近傍において治療用補体Ｂ因子タンパク質アナログの十分なレベルおよび分布を達成すること；４）ドルーゼン内部で治療用補体Ｂ因子タンパク質アナログの活性を達成すること；５）慢性疾患を処置するための治療薬送達の十分な継続期間を達成すること；６）眼の後ろ側における古典的補体経路の活性を弊害をもたらすほどに妨害することなく薬効を達成すること；および／または７）治療薬に対する免疫応答（例えば、局所免疫反応）を回避するもしくは小さくすること。
代替経路における正のフィードバックループの減衰は、代替経路全体のダウンレギュレーションの手段である。代替経路のフィードバックループを減衰させるための１つの適切な手段は、補体Ｂ因子（ｆＢ）タンパク質の機能またはレベルを妨害することである。本発明のいくつかの実施形態では、補体活性を減衰させるために補体Ｂ因子アナログを使用する。
本発明の補体Ｂ因子タンパク質アナログは、Ｋ２５８Ａ、Ｒ２５９Ａ、Ｋ２６０Ａ、Ｄ２７９Ｇ、Ｎ２８５Ｄ、およびＤ７４０Ｎからなる群より選択される配列番号１の変異に対応する少なくとも１つの変異を含み得る。いくつかの実施形態においては、これは、配列番号１のＫ２５８Ａ、Ｒ２５９Ａ、Ｋ２６０Ａ、Ｄ２７９Ｇ、およびＮ２８５Ｄに対応する変異を含む。いくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子タンパク質アナログは配列番号１のＤ７４０Ｎに対応する変異を含む。
例示的な目的については、補体Ｂ因子タンパク質の特異的アナログを本明細書中に記載する。例えば、代替経路の活性化を阻害するまたは低下させるためのＢ因子タンパク質は、多数の方法で操作することができる。いくつかの実施形態においては、Ｂ因子中の特定の部位を、その分子がもはや完全には適切に機能しないように、例えば、部位特異的変異誘発によって変化させることができる。いくつかの実施形態においては、その分子がもはや酵素活性を有さないかまたは低下した（例えば、少なくとも２倍、５倍、１０倍、５０倍、または１００倍低下した）酵素活性を有するように、分子の酵素部分またはドメイン（例えば、プロテアーゼドメイン、これはセリンプロテアーゼである）を変化させることができる。いくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子タンパク質アナログはセリンプロテアーゼドメインの活性部位の中に変異を含み、ここでは変異は対応するネイティブの補体Ｂ因子タンパク質と比較して補体因子Ｃ３を切断する補体Ｂ因子タンパク質アナログの能力を低下させるか、または取り除く。
いくつかの実施形態においては、これは配列番号１のアミノ酸７４０に対応する残基を変化させることにより達成することができる。いくつかの実施形態においては、この変異は、配列番号１のアミノ酸７４０に対応するアスパラギン酸の欠失または置換を含む。いくつかの実施形態においては、配列番号１のアミノ酸７４０に対応するアスパラギン酸（Ｄ）が、別のアミノ酸、例えば、アスパラギン（Ｎ）、アラニン（Ａ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、チロシン（Ｙ）、またはグリシン（Ｇ）で置換される。本明細書に記載する特定のＢ因子アミノ酸のナンバリングはシグナルペプチドを含むポリペプチド全体に関連しており、そして配列番号１に反映される。Ｈｏｕｒｃａｄｅら（ＪＢＣ（１９９８）２７３（４０）：２５９９６−６０００）は、配列番号１のアミノ酸７３９〜７４６（Ｈｏｕｒｃａｄｅらのナンバリングには２５個のアミノ酸のシグナル配列／ペプチドが含まれないために、Ｈｏｕｒｃａｄｅらにおいてはアミノ酸７１４〜７２１と呼ばれる）がＢ因子タンパク質のセリンプロテアーゼ機能において役割を担うことを記載している。さらに、Ｎ６９３、Ｔ６９４、およびＤ７４０は、基質結合部位の一部を構成するかまたは一部であり得、そしてＨ５２６、Ｄ５７６、およびＳ６９９は触媒中心の一部を構成するかまたは一部であり得る。例えば、Ｘｕら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０００ ２７５（１）：３７８−８５を参照のこと。いくつかの実施形態においては、Ｂ因子タンパク質アナログは、配列番号１のアミノ酸７３９〜７４６より選択されるアミノ酸の少なくとも１つの変異を含む。いくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子タンパク質アナログは、配列番号１のアミノ酸７３９に対応するアミノ酸のアラニンでの置換を含む。いくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子タンパク質アナログは、アスパラギン、グルタミン酸、アラニン、セリン、およびチロシンからなる群より選択されるアミノ酸での配列番号１のアミノ酸７４０に対応するアミノ酸の置換を含む。いくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子タンパク質アナログは、トリプトファンおよびアラニンからなる群より選択されるアミノ酸での配列番号１のアミノ酸７４１に対応するアミノ酸の置換を含む。いくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子タンパク質アナログは、配列番号１のアミノ酸７４２に対応するアミノ酸のグルタミンでの置換を含む。いくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子タンパク質アナログは配列番号１のアミノ酸７４３に対応するアミノ酸のフェニルアラニンでの置換を含む。いくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子タンパク質アナログは配列番号１のアミノ酸７４５に対応するアミノ酸のフェニルアラニンでの置換を含む。いくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子タンパク質アナログは配列番号１のアミノ酸７４６に対応するアミノ酸のトリプトファンまたはアラニンでの置換を含む。いくつかの実施形態においては、Ｂ因子タンパク質アナログは配列番号１のアミノ酸６９３および６９４のうちの１つまたは２つの変異、例えば、置換または欠失を含む。いくつかの実施形態においては、Ｂ因子タンパク質アナログは配列番号１のアミノ酸５２６、５７６、および６９９のうちの１つまたは２つの変異、例えば、置換または欠失を含む。
変化させることができるＢ因子中の他の部位としては以下が挙げられる：１）結合がより低い親和性（例えば、野生型Ｂ因子タンパク質と比較して２倍、５倍、１０倍、５０倍または１００倍低い親和性）で、またはより高い親和性（例えば、野生型Ｂ因子タンパク質と比較して少なくとも２倍、５倍、１０倍、５０倍または１００倍高い親和性）で起こるようなプロペルジンに対する結合部位（プロペルジン結合ドメイン）；２）結合がより低い親和性（例えば、野生型Ｂ因子タンパク質と比較して少なくとも２倍、５倍、１０倍、５０倍または１００倍低い親和性）で、またはより高い親和性（例えば、野生型Ｂ因子タンパク質と比較して少なくとも２倍、５倍、１０倍、５０倍または１００倍高い親和性、例えばこれは、配列番号１の２７９位および／または２８５位に対応するアミノ酸を他のアミノ酸で置換することにより達成され得、例えばこの場合は、２７９位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン（Ｎ）、アラニン（Ａ）、もしくはグリシン（Ｇ）で置換される、および／または２８５位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸（Ｄ）またはアラニン（Ａ）で置換される）で起こるようなＣ３ｂタンパク質に対する結合部位（Ｃ３ｂ結合ドメイン）；３）Ｄ因子がＢ因子を切断してＢｂを形成する能力が低下しているか、もはや切断しないように、Ｄ因子が作用する部位（例えば、Ｄ因子切断部位で、例えば、配列番号１の２５８、２５９、または２６０位に対応する位置のアミノ酸の少なくとも１つを、例えばアラニン（Ａ）に変化させることができる、あるいは、上記１、２、および／または３の任意の組み合わせ。
いくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子タンパク質アナログは補体Ｄ因子切断部位の中に変化を含み、この場合は、この変化によりＤ因子タンパク質による補体Ｂ因子タンパク質アナログの切断が減少するまたは取り除かれる。いくつかの実施形態においては、Ｄ因子切断部位中の変化には、（ｉ）配列番号１のアミノ酸２５９に対応するアルギニンの置換または欠失、配列番号１アミノ酸２５８もしくは２６０に対応するリジンの一方もしくは両方の置換または欠失、またはアルギニンと両方のリジンの置換または欠失；あるいは（ｉｉ）アルギニンの隣、１つもしくは両方のリジンの隣、またはアルギニンと１つもしくは両方のリジンの隣への挿入が含まれる。いくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子タンパク質アナログは、それぞれがアラニンで置き換えられた配列番号１のアミノ酸２５８〜２６０に対応するアミノ酸を有する。
本発明は、（ｉ）Ｃ３ｂ因子およびＤ因子の両方に結合する補体Ｂ因子タンパク質アナログ；（ｉｉ）Ｃ３ｂ因子およびＤ因子の両方に対して（それらのネイティブの形態と比較して）増大した結合を有する補体Ｂ因子タンパク質アナログ；（ｉｉｉ）Ｄ因子タンパク質に対して（それらのネイティブの形態と比較して）増大した結合を有する補体Ｂ因子タンパク質アナログ；および（ｉｖ）Ｃ３ｂＢ複合体に対して（それらのネイティブの形態と比較して）増大した結合を有する補体Ｂ因子タンパク質アナログを含む。本発明はまた、上記ｉ〜ｉｖのような本発明の補体Ｂ因子タンパク質アナログを使用して補体経路を阻害する方法を含む。
いくつかの実施形態においては、増大した結合は、約１．５〜約１０，０００、約１０〜約１０，０００、約１００〜約１０，０００、約１，０００〜約１０，０００、約１．５〜約１，０００、約１．５〜約１００、約１．５〜約１０、約２〜約５、約２〜約１０、約５〜約１０、約５〜約２０、約１０〜約２０、約１０〜約３０、約２０〜約３０、約３０〜約５０、約５０〜約１００、約１００〜約５００、約５００〜約１，０００、約１，０００〜約５，０００、または約５，０００〜約１０，０００倍まで増大する。いくつかの実施形態においては、増大した結合は１．５、２、３、４、５、１０、５０、１００、５００、１０００、５０００または１０，０００倍を上回って増大する。いくつかの実施形態においては、増大した結合は、例えば、野生型タンパク質と比較して免疫沈降により、またはＢｉａｃｏｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して測定することができる。上記（ｉ）の一例として、結合はＣ３ｂタンパク質についての結合分子を用いるタンパク質の免疫沈降、次に、例えばＥＬＩＳＡまたはウェスタンのような免疫測定法を使用して、免疫沈降物中のＤ因子タンパク質を検出することにより測定することができる。例えばこの場合、増大した結合はウェスタンにおいて強度が増大したバンドとして明らかとなる。
本発明のいくつかのＢ因子タンパク質アナログは、野生型のＢ因子のＣ３ｂ因子および／またはＤ因子に対する結合と比較して、２倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍の、Ｃ３ｂタンパク質および／またはＤ因子タンパク質に対する増大した結合を有し得る。いくつかの実施形態においては、増大した結合は、免疫沈降により、またはＢｉａｃｏｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して測定することができる。
本発明のいくつかの修飾されたＢ因子タンパク質アナログは本明細書中で考察するアミノ酸変化のうちの１つ以上を含み、そしてさらに、１つ以上の追加的なアミノ酸の置換、挿入または変化（例えば、少なくとも１、２、５、８、１０、１５、２０、５０、１００、もしくは２００の変化、または１、２、５、８、１０、１５、２０、５０、１００、もしくは２００を超えない変化）を有し、そのアナログはＣ３ｂおよび／またはＤ因子に対する増大した結合、または補体経路の阻害を媒介する本明細書中で考察するＢ因子タンパク質アナログの他の生物学的活性を保持している。そのようなアナログは野生型Ｂ因子タンパク質、例えば、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９９．９％、９９％、９８％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％または７０％のアミノ酸配列同一性を有し得、そしてＣ３ｂおよび／またはＤ因子に対する増大した結合を保持し得る。
遺伝子治療および補体Ｂ因子タンパク質アナログの発現の状況下では、変化／変異がコードしている核酸のレベルで反映される。したがって、修飾はまた、発現を増強するために核酸について行うこともできる。例えば、特定のコドンが特定の宿主細胞により好まれる場合がある。したがって、例えば特定の哺乳動物発現系または細胞において特定のコドンが好まれる場合には、再コーディングを行うことができる。
本発明のいくつかの実施形態は、補体Ｂ因子タンパク質アナログの生産に有用なポリヌクレオチドおよび宿主細胞（または宿主多細胞生物）に関し、また、アナログ、例えば、ｈｆＢ３−２９２Ｓ（配列番号２）、ｈｆＢ３−２９２Ｓ−７４０Ｎ（配列番号３）、ｈｆＢ３−２９２Ｓ−Ｆｃ（配列番号２２）、ｈｆＢ３−２９２Ｓ−７４０Ｎ−Ｆｃ（配列番号２３）、またはｈｆＢ３−２９２Ｓ／Ｆｃ−ｍｏｎｏ（配列番号２６）に関する。これらの補体Ｂ因子タンパク質アナログを単離する、およびその補体媒介活性を試験する方法も提供される。本発明のいくつかの態様は、補体Ｂ因子タンパク質アナログが治療および／または予防の状況下で有効成分となる医薬組成物／薬学的製剤に関する。本発明のいくつかの実施形態はまた、治療有効量の補体Ｂ因子タンパク質アナログを使用して補体媒介障害を処置する方法にも関する。
本発明のいくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子アナログは、自然界に存在する補体Ｂ因子上でのグリコシル化パターンとは異なるグリコシル化パターンを含む場合があり、あるいは、グリコシル化を全て欠く場合もある。炭水化物は、例えばイヌ膵臓ミクロソーム系（例えば、Ｍｕｅｃｋｌｅｒ ａｎｄ Ｌｏｄｉｓｈ（１９８６）Ｃｅｌｌ ４４：６２９ ａｎｄ Ｗａｌｔｅｒ，Ｐ．（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９６：８４を参照のこと）などのように、インビトロでＮ−および／またはＯ−連結グリコシル化のためのグリコシル化部位配列を含むＢ因子アナログに付加される場合、および／またはそれから除去される場合がある。グリコシル化部位に対応するアミノ酸配列の付加または欠失／変異を含む本発明の補体Ｂ因子アナログを生成させることができ、例えば、タンパク質のグリコシル化パターン／状態を変化させることにより、タンパク質の機能的特性を変化させることができる。例えば、ｈｆＢ２、ｈｆＢ３（配列番号４）、ｈｆＢ３−２９２Ｓ（配列番号２）、ｈｆＢ３−２９２Ｓ−７４０Ｎ（配列番号３）、ｈｆＢ３−２９２Ｓ−Ｆｃ（配列番号２２）、ｈｆＢ３−２９２Ｓ−７４０Ｎ−Ｆｃ（配列番号２３）、およびｈｆＢ３−２９２Ｓ／Ｆｃ−ｍｏｎｏ（配列番号２６）は、野生型Ｂ因子（配列番号１）と比較して、Ｎグリコシル化部位の除去を生じるＮ２８５Ｄ置換を含む。（ｈｆＢ２およびｈｆＢ３補体Ｂ因子タンパク質アナログはいずれも、米国特許公開番号ＵＳ２０１００１２０６６５の中で詳細に記載されている）。Ｎグリコシル化部位の消失はタンパク質の特性を変化させる。同じ作用は、グリコシル化パターンが変化したか、またはこのＮ２８５をグリコシル化しない細胞中でこのタンパク質を生産させることにより達成され得る。例えば、Ｂ因子タンパク質またはアナログはＮ２８５をグリコシル化しない大腸菌細胞中で生産され得る。いくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子タンパク質アナログは、例えば、配列番号１のアミノ酸Ｎ２８５に対応する、通常はグリコシル化される野生型Ｂ因子タンパク質に対応するアミノ酸をグリコシル化しない細胞（例えば、大腸菌）の中で生産される。
ＰＣＴ公開番号ＷＯ０８／１０６６４４および米国特許公開番号ＵＳ２０１００１２０６６５において明らかにされているように、いくつかの場合は、１つの種に由来するネイティブのＢ因子タンパク質が別の種に由来する補体反応／経路において活性を有し得る。したがって、本発明はまた、別の種において補体活性を阻害するための１つの種に由来する補体Ｂ因子タンパク質アナログを含む。
いくつかの実施形態においては、本発明の補体Ｂ因子タンパク質アナログがＰＥＧ化される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５４（４）：４５９−４７６（２００２）；Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２２（５）：４０５−４１７（２００１）；Ｆｅｅ ａｎｄ Ａｌｓｔｉｎｅ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６１（３）：９２４−９３９（２００６）；Ｋｏｄｅｒａら、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３（７）：１２３３−１２７１（１９９８）；Ｍｏｒａｒ，Ｂｉｏｐｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ １９（４）：３４（２００６）；およびＶｅｒｏｎｅｓｅ ａｎｄ Ｐａｓｕｔ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ １０（２１）：１４５１−１４５８（２００５）を参照のこと。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を本発明の補体Ｂ因子タンパク質アナログに付着させることができる。いくつかの実施形態においては、ＰＥＧは、（例えば、補体Ｂ因子アナログのＮ末端に対して、またはＣ末端に対して）ＰＥＧの部位特異的コンジュゲーションを通じて、またはリジン残基上に存在するεアミノ基を介してのいずれかにより、多機能性リンカーを伴ってまたは伴わずに付着させられる。いくつかの実施形態においては、いくつかの実施形態においては、生物学的活性の損失を最小限にしか生じない直鎖状または分枝鎖の重合体誘導体化を使用することができる。コンジュゲーションの程度は補体Ｂ因子アナログに対するＰＥＧ分子の適正なコンジュゲーションを確実にするためにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量スペクトル分析により厳密にモニタリングすることができる。いくつかの実施形態においては、未反応のＰＥＧを、サイズ排除クロマトグラフィーにより、および／またはイオン交換クロマトグラフィーにより、ＰＥＧ結合体から分離することができる。
特定の実施形態においては、補体Ｂ因子アナログのカルボキシ末端またはアミノ末端、または両方が化学修飾される。アシル化（例えば、アセチル化）またはアルキル化（例えば、メチル化）のようなアミノ末端修飾、およびアミド化のようなカルボキシ末端修飾、ならびに他の末端修飾（環化を含む）を本発明の様々な実施形態に組み込むことができる。コア配列に対する特定のアミノ末端および／もしくはカルボキシ末端の修飾、ならびに／あるいはペプチドの伸長（例えば、非相同ポリペプチド、例えば、アルブミン、免疫グロブリン、またはその一部分、例えば、免疫グロブリンＦｃドメインへの融合）は、好都合な物理的、化学的、生化学的、および薬理学的特性；例えば、増強された安定性、増大した効能および／または薬効、血清プロテアーゼに対する耐性、望ましい薬物動態特性などを提供することができる。
いくつかの実施形態においては、本発明の補体Ｂ因子タンパク質アナログは免疫グロブリンＦｃドメイン（例えば、ヒト免疫グロブリンＦｃドメイン）を含む。いくつかの実施形態においては、Ｆｃドメインは、対応する補体Ｂ因子アナログのアミノ酸配列に対してＣ末端側に存在する。いくつかの実施形態においては、Ｆｃドメインは、配列番号２１のアミノ酸７６６〜９９０、または配列番号２６のアミノ酸７６６〜１００３もしくは７８６〜１００３を含むか、あるいはそれからなる。いくつかの実施形態においては、Ｆｃドメインは配列番号２７のアミノ酸１〜２３９または２〜２３９である。いくつかの実施形態においては、ＦｃドメインはヒトＦｃドメインである。いくつかの実施形態においては、Ｆｃドメインは、免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ４のようなＩｇＧ由来である。いくつかの実施形態においては、Ｆｃドメインは、別のＦｃドメインと二量体を形成することができる。いくつかの実施形態においては、本発明の補体Ｂ因子アナログは、例えば、限定ではないがＦｃドメインの相互作用を通じて二量体（例えば、相同二量体）を形成することができる。いくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子アナログは二量体を形成することができないか、または補体Ｂ因子アナログ集団／調製物の大部分が単量体の形態である。いくつかの実施形態においては、Ｆｃドメインを含有している補体Ｂ因子アナログは二量体を形成しないか、またはこの補体Ｂ因子アナログの集団／調製物の大部分が単量体の形態である。いくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子アナログは、Ｆｃドメイン配列中のシステイン（単数または複数）（例えば、Ｆｃドメインの二量体化に関与するシステイン）のうちの１つまたは複数の変異を有するＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態においては、Ｆｃドメインは、配列番号２７のアミノ酸１７および／または２０に対応する１つ以上のシステインの変異を含む。いくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子アナログは、Ｆｃドメイン配列中に遊離のシステイン（単数または複数）の１つまたは複数の変異を有するＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態においては、システイン（単数または複数）が、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸で置換される。いくつかの実施形態においては、システインが欠失させられる。いくつかの実施形態においては、アミノ酸配列リンカーが、補体Ｂ因子アナログとＦｃ領域のアミノ酸配列の間で使用される。いくつかの実施形態においては、このリンカーは１アミノ酸、例えば、アルギニンである。
いくつかの実施形態においては、ポリペプチドは、短縮型補体Ｂ因子アナログとＦｃ領域の両方を含み、例えば、配列番号２のアミノ酸２６〜４８０とＦｃ領域に対応するアミノ酸を含有している。
本発明はさらに、補体Ｂ因子タンパク質もしくはアナログの少なくとも２０、３０、５０、７０、１００、１５０、２００、３００、４００、４８０、５００、６００、または７００個のアミノ酸部分を含有する、および／または、タンパク質の１、２、または３個のドメインを含み、そして野生型補体Ｂ因子タンパク質もしくはアナログの１つ以上の生物学的活性を有するかまたは保持する、ならびに／あるいは補体系（古典的経路、代替経路のいずれか、または両方）の１つの態様の阻害剤として作用する、補体Ｂ因子タンパク質またはアナログの断片であるアナログを提供する。これらの断片は、アナログの安定性を増大させるおよび／または半減期を延長するために、Ｆｃのような別のタンパク質もしくは断片と連結または融合させることによりさらに修飾することができる。いくつかの実施形態においては、アナログは、補体Ｂ因子タンパク質またはアナログの断片であり、この断片は、野生型補体Ｂ因子の対応するアミノ酸配列と少なくとも９９．５％、９９％、９８％、９５％、９０％、８５％、または６２％の同一性を有する。
本発明は、補体Ｂ因子タンパク質またはアナログの断片を含有しているタンパク質を提供する。この場合、断片は、Ｎ末端および／またはＣ末端の短縮を有する。いくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子アナログはＣ末端短縮を含み、この場合、アナログは、配列番号１、２、もしくは４のアミノ酸４０７、４２７、４５７、４７７、４８０、４８４、４８７、５０７、または５２７に対応するアミノ酸で、あるいはその後ろ（Ｃ末端）で短縮される。いくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子アナログは、アナログが配列番号１、２、もしくは４のアミノ酸４０７〜４８７、４７０〜４９５、または４７７〜４８７に対応するアミノ酸の間にあるアミノ酸で短縮されたＣ末端短縮を含む。いくつかの実施形態においては、本発明の補体Ｂ因子アナログは、配列番号１、２、もしくは４のアミノ酸４０８〜７６４、４２８〜７６４、４５８〜７６４、４７８〜７６４、４８１〜７６４、４８５〜７６４、４８８〜７６４、５０７〜７６４、５２７〜７６４に対応するアミノ酸を含まない。いくつかの実施形態においては、Ｂ因子タンパク質もしくはアナログの短縮化または断片化により遊離のシステインを生じさせることができる。例えば、短縮化は、ネイティブの補体Ｂ因子タンパク質においてジスルフィド結合を形成するシステイン対の一方のシステインの欠失を生じさせることができ、これによりシステインを含むが、そのネイティブのシステイン「パートナー」を含まないポリペプチドを生じさせることができる。これらの実施形態のいくつかにおいては、対の残っているシステインが変異させられる場合があり、例えば、アラニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、チロシン、およびバリンのような別のアミノ酸で置換される場合があり、また、例えば、望ましくないジスルフィド結合形成の可能性を排除するためにシステインが欠失させられる場合もある。
本発明のアナログは、化学合成を含むがこれに限定されない様々な技術により、または組み換えアナログの発現により調製することができる。
ヒトＢ因子をコードする遺伝子およびコード領域のヌクレオチド配列、ならびにアミノ酸配列は当該分野で公知である。例えば、ヒトＢ因子をコードする遺伝子はＮＣＢＩデータベースアクセッション番号ＮＧ＿００００１３の中に見られる。ヒトＢ因子のコード配列はＮＣＢＩデータベースアクセッション番号ＮＭ＿００１７１０の中に見られ、ヒト補体Ｂ因子プレプロタンパク質のアミノ酸配列はＮＣＢＩデータベースアクセッション番号ＮＰ＿００１７０１またはＰ００７５１の中に見られる。他の動物種由来の配列も当該分野で知られている。比較として、マウスＢ因子タンパク質配列（例えば、ＮＣＢＩデータベースアクセッション番号Ｐ０４１８６参照）においては、第３のＳＣＲドメインはこの７６１アミノ酸のプレタンパク質の１６０〜２１７位に位置し、そして成熟マウスＢ因子タンパク質は２３〜７６１位に及ぶ。マウスＢ因子タンパク質の最初の２２個のアミノ酸はシグナル配列を含む。
典型的には、ヒトＢ因子プレタンパク質はアミノ酸位置１〜２５に及ぶシグナルペプチドを持つ７６４個のアミノ酸のタンパク質（例えば、配列番号１を参照のこと）である。Ｂ因子の成熟鎖は位置２６〜７６４に対応する（例えば、配列番号１を参照のこと）。ヒトＢ因子の３つのＳＣＲ領域は、ＳＣＲ１（Ｓｕｓｈｉ １とも呼ばれ、約３５位から約１００位に及ぶ）、ＳＣＲ２（Ｓｕｓｈｉ ２とも呼ばれ、約１０１位から約１６０位に及ぶ）、およびＳＣＲ３（Ｓｕｓｈｉ ３とも呼ばれ、約１６３位から約２２０位に及ぶ）である。
ＰＣＴ公開番号ＷＯ０８／１０６６４４および米国特許公開番号ＵＳ２０１００１２０６６５にはとりわけ、ｈｆＢ１、ｈｆＢ２、およびｈｆＢ３と命名された３つの特異的優性阻害ヒトＢ因子タンパク質アナログが記載されている。これらの３つのアナログの第１のものはｆＢ１と呼ばれ、Ｂ因子（ｆＢ）プロテアーゼ部位中に１つの変異したアミノ酸を含む。このｆＢ部分は通常の親和性および反応速度論でＣ３ｂに結合するが、Ｄ因子（ｆＤ）による作用を受け、プロペルジンにより安定化されれば、プロテアーゼとしては機能せず、Ｃ３コンバターゼを形成しない。ｆＢ１は、配列番号１のアミノ酸７４０に対応するアミノ酸においてＮによる置換（例えば、Ｄ７４０Ｎ）を含む。これらの補体Ｂ因子アナログの第２のものはｆＢ２と呼ばれ、ｆＢ１と同じアミノ酸が変化しているが、加えて、Ｃ３ｂ結合ドメイン中の２つのさらなるアミノ酸も変化しており（配列番号１のアミノ酸２７９および２８５に対応するアミノ酸の置換）、これがＣ３ｂに対するｆＢ２の結合親和性を増大させ、例えば、Ｄ２７９Ｇ、Ｎ２８５Ｄ、およびＤ７４０Ｎの変化である。Ｎ２８５Ｄの置換は推定されるＮグリコシル化部位を除去する。これらの補体Ｂ因子タンパク質アナログの第３のものはｈｆＢ３と呼ばれ、ｆＢ２からのＣ３ｂ結合を増大させる変異を、Ｄ因子による切断のための部位をノックアウトする変異と、特に、配列番号１の残基２５８、２５９、および２６０に対応するアミノ酸の置換、ならびに残基２７９および２８５に対応するアミノ酸の置換、例えば、Ｋ２５８Ａ、Ｒ２５９Ａ、Ｋ２６０Ａ、Ｄ２７９Ｇ、およびＮ２８５Ｄの変化と組み合わせている。野生型ｆＢのＤ因子による切断はｆＢプロテアーゼを活性化する。したがって、その５つのアミノ酸変化を持つｈｆＢ３はＣ３ｂに効率的に結合するが、プロテアーゼ活性を最小限にしか有さない。
ｈｆＢ１、ｈｆＢ２、およびｈｆＢ３は、配列番号１のアミノ酸２９２に対応する遊離のシステインを変異させることにより、例えば、このシステインをセリンで置換することにより本発明の補体Ｂ因子アナログにさらに修飾されることができるヒトＢ因子アナログの例であるが、本発明はこれらの特定のアナログに限定されない。本発明のいくつかの実施形態は補体経路を調節する、遊離のシステインを含まない任意の補体Ｂ因子アナログを含む。いくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子アナログは、変異した遊離のシステインに加えて、配列番号１の以下のアミノ酸：アミノ酸２５８、２５９、２６０、２７９、２８５、７３９、７４０、７４１、７４２、７４３、７４４、７４５、および７４６の１つ以上に対応するアミノ酸の１つ以上の変異を含む。これらの１つ以上の変異はアミノ酸の置換もしくは欠失、あるいは対応するアミノ酸の１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のアミノ酸に隣接するか、またはその内部への少なくとも１つのアミノ酸の付加であり得る。いくつかの実施形態においては、この付加は列挙したアミノ酸の機能を混乱させる、変化させる、増強する、または阻害し、例えば（ｉ）別のタンパク質の切断におけるその役割（例えば、７４０）、（ｉｉ）別のタンパク質による切断の部位としてのその役割（例えば、配列番号１の残基２５８、２５９、および／または２６０に対応するアミノ酸）、あるいは（ｉｉｉ）別のタンパク質への結合におけるその役割（例えば、配列番号１の残基２７９または２８５に対応するアミノ酸）を混乱させる。
本発明のいくつかの実施形態は、例えば、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンからなる群より選択されるアミノ酸で、配列番号１の２５８、２５９、および／または２６０に対応するアミノ酸の１つ以上に対応するアミノ酸の置換を含む。本発明のいくつかの実施形態は、配列番号１のアミノ酸２５８、２５９、および／または２６０に対応するアミノ酸のうちの１、２、または３つに対応するアミノ酸の欠失を含む。本発明のいくつかの実施形態は、配列番号１のアミノ酸２５８、２５９、および／または２６０に対応するアミノのすぐ隣への１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多いアミノ酸の少なくとも１つの付加を含む。
本発明のいくつかの実施形態は、配列番号１のアミノ酸７３９に対応するアミノ酸の置換を含む。本発明のいくつかの実施形態は、例えば、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンからなる群から選択されるアミノ酸での配列番号１のアミノ酸７３９に対応するアミノ酸の置換を含む。本発明のいくつかの実施形態は、配列番号１の７３９位のアミノ酸に対応するアミノ酸の欠失を含む。
本発明のいくつかの実施形態は、例えば、グルタミン酸、アスパラギン、アラニン、セリン、グリシン、およびチロシンからなる群より選択されるアミノ酸での配列番号１のアミノ酸７４０に対応するアミノ酸の置換を含む。本発明のいくつかの実施形態は、バリン、ロイシン、イソロイシン、スレオニン、システイン、メチオニン、グルタミン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、グルタミン酸、アスパラギン、アラニン、セリン、グリシン、およびチロシンからなる群より選択されるアミノ酸での配列番号１のアミノ酸７４０に対応するアミノ酸の置換を含む。本発明のいくつかの実施形態は、配列番号１の７４０位のアミノ酸に対応するアミノ酸の欠失を含む。
本発明のいくつかの実施形態は、例えば、トリプトファンおよびアラニンからなる群より選択されるアミノ酸での配列番号１のアミノ酸７４１に対応するアミノ酸の置換を含む。本発明のいくつかの実施形態は、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンからなる群より選択されるアミノ酸での配列番号１のアミノ酸７４１に対応するアミノ酸の置換を含む。本発明のいくつかの実施形態は、トリプトファン、チロシン、およびフェニルアラニンからなる群より選択されるアミノ酸での配列番号１のアミノ酸７４１に対応するアミノ酸の置換を含む。本発明のいくつかの実施形態は、配列番号１の７４１位のアミノ酸に対応するアミノ酸の欠失を含む。
本発明のいくつかの実施形態は、例えば、グルタミンでの配列番号１のアミノ酸７４２に対応するアミノ酸の置換を含む。本発明のいくつかの実施形態は、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、およびアスパラギン酸からなる群より選択されるアミノ酸での配列番号１のアミノ酸７４２に対応するアミノ酸の置換を含む。本発明のいくつかの実施形態は、配列番号１のアミノ酸７４２に対応するアミノ酸の欠失を含む。
本発明のいくつかの実施形態は、例えば、フェニルアラニンでの配列番号１のアミノ酸７４３および／または７４５に対応するアミノ酸の置換を含む。本発明のいくつかの実施形態は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸での配列番号１のアミノ酸７４３および／または７４５に対応するアミノ酸の置換を含む。本発明のいくつかの実施形態は、配列番号１のアミノ酸７４３、７４４、および／または７４５に対応するアミノ酸の１つ以上の欠失を含む。
本発明のいくつかの実施形態は、例えば、トリプトファンおよびアラニンからなる群より選択されるアミノ酸での配列番号１のアミノ酸７４６に対応するアミノ酸の置換を含む。本発明のいくつかの実施形態は、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンからなる群より選択されるアミノ酸での配列番号１のアミノ酸７４６に対応するアミノ酸の置換を含む。本発明のいくつかの実施形態は、トリプトファン、チロシン、およびフェニルアラニンからなる群より選択されるアミノ酸での配列番号１のアミノ酸７４６に対応するアミノ酸の置換を含む。本発明のいくつかの実施形態は、配列番号１のアミノ酸７４６に対応するアミノ酸の欠失を含む。
本発明のいくつかの実施形態は、配列番号１のアミノ酸７３９、７４０、７４１、７４２、７４３、７４４、７４５、および／または７４６に対応するアミノ酸の任意の１つ以上のすぐ隣の、あるいはその代わりに１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多いアミノ酸の挿入あるいは置換を含む。
本発明のいくつかの実施形態は、例えば、グリシン、アラニン、およびアスパラギンからなる群より選択されるアミノ酸での配列番号１のアミノ酸２７９に対応するアミノ酸の置換を含む。本発明のいくつかの実施形態は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンからなる群より選択されるアミノ酸での配列番号１のアミノ酸２７９に対応するアミノ酸の置換を含む。本発明のいくつかの実施形態は、アスパラギン、グルタミン酸、およびグルタミンからなる群より選択されるアミノ酸での配列番号１のアミノ酸２７９に対応するアミノ酸の置換を含む。本発明のいくつかの実施形態は、配列番号１のアミノ酸２７９に対応するアミノ酸の欠失を含む。本発明のいくつかの実施形態は、配列番号１のアミノ酸２７９に対応するアミノ酸すぐ隣の、またはその代わりに１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多いアミノ酸の挿入あるいは置換を含む。
本発明のいくつかの実施形態は、例えば、アラニンおよびアスパラギン酸からなる群より選択されるアミノ酸での配列番号１のアミノ酸２８５に対応するアミノ酸の置換を含む。本発明のいくつかの実施形態は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンからなる群より選択されるアミノ酸での配列番号１のアミノ酸２８５に対応するアミノ酸の置換を含む。本発明のいくつかの実施形態は、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびグルタミンからなる群より選択されるアミノ酸での配列番号１のアミノ酸２８５に対応するアミノ酸の置換を含む。本発明のいくつかの実施形態は、配列番号１のアミノ酸２８５に対応するアミノ酸の欠失を含む。本発明のいくつかの実施形態は、配列番号１のアミノ酸２８５に対応するアミノ酸のすぐ隣の、またはその代わりに１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多いアミノ酸の挿入あるいは置換を含む。
本発明のいくつかの実施形態は、配列番号１のアミノ酸２７９、２８２、２８３、２８４、および２８５に対応するアミノ酸の１つ以上の置換を含む。いくつかの実施形態においては、これらのアミノ酸は、グリシン、イソロイシン、プロリン、ヒスチジン、およびアスパラギン酸でそれぞれ置き換えられる。
本発明のいくつかの実施形態は、本明細書に記載するように、配列番号１の２５８、２５９、２６０、２７９、および２８５位に対応するアミノ酸の変異を含む。
いくつかの特別な実施形態において、本発明は、配列番号２、３、２１、２２、または２３のアミノ酸配列（随意に、任意のシグナル配列、例えば、その中に含まれるアミノ酸１〜２５を伴わない）を含むＢ因子タンパク質アナログを提供する。これらのＢ因子タンパク質アナログを本発明の方法において使用することができる。
本発明は、本明細書中で考察した変異（置換、欠失、および付加）の組み合わせを含有する補体Ｂ因子タンパク質アナログを含む。いくつかの実施形態においては、これらの補体Ｂ因子アナログは、ｈｆＢ１、ｈｆＢ２、ｈｆＢ３、ｈｆＢ３−２９２Ｓ、もしくはｈｆＢ３−２９２Ｓ−７４０Ｎアナログ、または本明細書で考察した任意の他の補体Ｂ因子アナログの特性の１つ以上を保持している。本発明はさらに、上記で考察したアナログの特性の１つ以上を有しているこれらのアナログの断片（例えば、本明細書に示した１つ以上のアミノ酸変異を有している補体Ｂ因子タンパク質の１つ以上のドメインを含有している）であるアナログを提供する（例えば、ｈｆＢ３−２９２ＳＮ４８０）。加えてアナログは、そのアナログが対応する野生型補体Ｂ因子と少なくとも９９．５％、９９％、９８％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、または７５％の同一性を有するように、追加的なアミノ酸置換、欠失または挿入（例えば、保存的アミノ酸の置換、Ｎ末端またはＣ末端の短縮化など）を含んでよく、また、補体Ｂ因子の断片を含有するアナログの場合は、このアナログは、そのアナログと野生型補体Ｂ因子の対応する部分との間に少なくとも９９．５％、９９％、９８％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、または７０％の同一性を有する。
ｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質およびｈｆＢ３−２９２ＳＮ４８０タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって以下の重要な特徴を含む：１）ヒト２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞のような哺乳動物の発現細胞での効率的な分泌のためのＢ因子タンパク質のネイティブのシグナル配列；２）変異したＣ３ｂ依存性Ｄ因子タンパク質切断部位（Ｋ２５８Ｒ２５９Ｋ２６０からＡ２５８Ａ２５９Ａ２６０にアミノ酸を変化させる）；３）Ｃ３ｂタンパク質とのその強力な結合およびＣ３ｂタンパク質の捕捉を可能にするための、変異したＣ３ｂタンパク質結合部位（Ｄ２７９からＧ２７９にアミノ酸を変化させる；およびＮ２８５からＤ２８５にアミノ酸を変化させる）；ならびに４）「活性な」または正確に折り畳まれたタンパク質の量を増加させるための変異した遊離のシステイン（Ｃ２９２からＳ２９２にアミノ酸を変化させる）。
本発明のいくつかの実施形態においては、ヒト補体Ｂ因子タンパク質アナログは、（ｉ）配列番号１、２、３、２２、または２３；（ｉｉ）配列番号１、２、または３のアミノ酸２６〜７６４；（ｉｉｉ）配列番号２２または２３のいずれかのアミノ酸１〜９９０もしくは２６〜９９０；配列番号２のアミノ酸２６〜４８０；および（ｉｖ）配列番号２６のアミノ酸１〜１００３もしくは２６〜１００３に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、あるいは少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態においては、本発明のヒト補体Ｂ因子タンパク質アナログは、（ｉ）配列番号２、３、２２、２３、または２６；（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸１〜４８０；（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸２６〜４８０；（ｉｖ）配列番号２または３のアミノ酸２６〜７６４；（ｖ）配列番号２２または２３のアミノ酸２６〜９９０；あるいは（ｖｉ）配列番号２６のアミノ酸２６〜１００３を含む。いくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子タンパク質アナログは、（ｉ）配列番号２または３のアミノ酸２６〜７６４；（ｉｉ）配列番号２または３のアミノ酸２６〜４８０；（ｉｉｉ）配列番号２２または２３のアミノ酸２６〜９９０；あるいは（ｉｖ）配列番号２６のアミノ酸２６〜１００３から本質的になる。
図１は、古典的補体経路およびレクチン補体経路（図１ａ）、ならびに代替補体経路（図１ｂ）を示す。両方の経路がＣ３ｂを利用する。Ｃ３ｂＢｂ複合体はＣ３をＣ３ｂに転換するＣ３コンバターゼである。数分以内のＣ３ｂＢｂの自発的解離（「崩壊」）はその不活化をもたらすが、一方、プロペルジンはＣ３ｂＢｂ複合体を安定化させる。Ｃ３ｂは追加のＣ３ｂを生じさせるようにＣ３コンバターゼに関与し、それにより大きな矢印により示すようなポジティブフィードバックループを生じる。崩壊促進因子（ＤＡＦ）のような補体経路を減衰させる因子のいくつかは、Ｃ３コンバターゼであるＣ３ｂＢｂの崩壊を促進することによりそのように作用する。理論に縛られることは望ましくないが、本明細書中に記載する補体Ｂ因子アナログのいくつかはネイティブの補体Ｂ因子の代わりにＣ３ｂに結合し、それによりＣ３ｂに対する結合についてネイティブの補体Ｂ因子と競合する。本発明のいくつかの補体Ｂ因子アナログはＣ３ｂに結合して、不活性な複合体またはネイティブのＣ３ｂＢｂ複合体と比較してＣ３コンバターゼ活性が有意に低下した複合体を生じる。
本発明はまた、Ｃ３ｂＢｂ複合体の崩壊を促進する因子／分子と相互作用する補体Ｂ因子中のアミノ酸に対応するアミノ酸の変異を含有している補体Ｂ因子アナログを提供する。いくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子アナログは、ＤＡＦと相互作用するアミノ酸の変異を含む。これらの変異には、配列番号１のアミノ酸２９０、２９１、３２３、３６３、３６４、または４０７に対応するアミノ酸の１つ以上の変異が含まれるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの実施形態においては、これらの変異は、配列番号１のアミノ酸２９０、２９１、３２３、３６３、３６４、または４０７に対応するアミノ酸の１つ以上の置換あるいは欠失である。いくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子アナログは、配列番号１のＫ３２３Ｅ、Ｋ２９０Ａ、Ｋ２９１Ａ、Ｙ３６３Ａ、Ｓ３６４Ａ、またはＤ４０７Ｎに対応する変異のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子アナログは、配列番号１のＫ２９０Ａ／Ｋ２９１Ａ、Ｙ３６３Ａ／Ｓ３６４Ａ、またはＫ２９０Ａ／Ｋ２９１Ａ／Ｙ３６３Ａ／Ｓ３６４Ａに対応する変異の組み合わせのうちの１つを含む。理論に縛られることは望ましくないが、Ｃ３ｂＢｂ複合体の崩壊を促進する因子／分子と相互作用する補体Ｂ因子アナログ中のアミノ酸の変異は、Ｃ３ｂと本発明の補体Ｂ因子アナログとの複合体の崩壊を阻害し得、それにより補体Ｂ因子アナログが補体活性をより良好に阻害することを可能にする。
ｃＤＮＡ（例えば、ヒト野生型ｆＢおよび３つの補体Ｂ因子アナログ、ならびに４つの類似するマウス配列）を作製するための例示的な手順、およびベクターへのそれらの取り込みは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０８／１０６６４４の実施例８および米国特許公開番号ＵＳ２０１００１２０６６５に詳細に記載されている。
核酸
本発明は、本発明の補体Ｂ因子タンパク質アナログをコードするヌクレオチド配列を含有している核酸を含み、そしてこれらの核酸を含有しているベクターを含む。
目的の核酸の局所的および長期の発現を確実にするために、本発明のいくつかの実施形態は、本発明の補体Ｂ因子アナログをコードする核酸またはベクターでの細胞の形質導入を意図する。本発明はいずれかの１つの特定の核酸送達方法に限定されると解釈されるべきではなく、インビボまたはインビトロのいずれかの核酸送達ストラテジーとともに用いる任意の利用可能な核酸送達媒体、または操作された細胞（例えば、Ｎｅｕｒｏｔｅｃｈ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＲＩ，例えば、米国特許第６，２３１，８７９号；同第６，２６２，０３４号；同第６，２６４，９４１号；同第６，３０３，１３６号；同第６，３２２，８０４号；同第６，４３６，４２７号；同第６，８７８，５４４号の技術を参照のこと）、ならびに補体Ｂ因子アナログ自体をコードする本発明の核酸（例えば「裸のＤＮＡ」）の使用も本発明の実施において使用することができる。様々な送達媒体、例えばベクターを本発明とともに使用することができる。例えば、ウイルスベクター、アンフィトリピック脂質（ａｍｐｈｉｔｒｏｐｈｉｃ ｌｉｐｉｄ）、陽イオン性重合体（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）およびポリリジン）、デンドリマー（例えば、コンバースト（ｃｏｍｂｂｕｒｓｔ）分子およびスターバースト（ｓｔａｒｂｕｒｓｔ）分子、非イオン性脂質、陰イオン性脂質、小胞、リポソームおよび遺伝子送達の他の合成核酸手段（例えば、米国特許６，９５８，３２５号および同第７，０９８，０３０号；およびＬａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔら、「Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ」、「Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ」；およびＬｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ＆ Ｆｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐｐ．３１７−３２７および３５３−３６５（１９８９）参照）；「裸の」核酸などを、本発明の実施において使用することができる。
ベクターは、目的の核酸（例えば、治療用タンパク質をコードし得る治療用核酸）を目的の標的細胞に導入する手段である。ベクターは典型的には、出発材料（例えば、外来遺伝子またはトランスジーンを担持することができ、そして標的細胞内に侵入してそこで発現されることができる核酸）から構築または獲得される。ベクターを獲得できる適切な出発材料としては、当該分野で公知であるように、トランスポゾン、プラスミド、ウイルス、ＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡなどが挙げられる。目的のベクターを獲得または構築するための方法としては、当該分野で公知であるように、標準的な遺伝子操作技術、配列決定反応、制限酵素消化、ポリメラーゼ反応、ＰＣＲ、ＰＣＲ ＳＯＥイング、ライゲーション、リコンビナーゼ反応（例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）技術）、核酸に作用する他の酵素、細菌およびウイルスの増殖物質および方法、化学薬品および試薬、部位特異的変異誘発プロトコルなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓらの文献である「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」を参照のこと。
本発明の核酸は典型的には、補体Ｂ因子タンパク質アナログをコードする配列に対して作動可能であるように連結されたプロモーターを含む。プロモーターは例えば、組織特異的プロモーター、細胞特異的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制可能プロモーター、構成性プロモーター、合成プロモーター、またはハイブリッドプロモーターであり得る。本発明の構築物において有用なプロモーターの例としては、例えば、ファージλ（ＰＬ）プロモーター；ＳＶ４０初期プロモーター；単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）プロモーター；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（例えば、ヒトＣＭＶ即時初期プロモーター；テトラサイクリン制御トランス活性化物質応答性プロモーター（ｔｅｔ）系）；長末端リピート（ＬＴＲ）プロモーター（例えば、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ＢＩＶ ＬＴＲ、またはＨＩＶ ＬＴＲ）；モロニーマウス肉腫ウイルスのＵ３領域プロモーター；グランザイムＡプロモーター；メタロチオネイン遺伝子の調節配列（単数または複数）；ＣＤ３４プロモーター；ＣＤ８プロモーター；チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター；Ｂ１９パルボウイルスプロモーター；ＰＧＫプロモーター；グルココルチコイドプロモーター；熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）プロモーター（例えば、ＨＳＰ６５およびＨＳＰ７０プロモーター）；免疫グロブリンプロモーター；ＭＭＴＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；ｌａｃプロモーター；ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター；およびノパリン合成酵素プロモーターが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの実施形態においては、プロモーターはＭＮＤプロモーター（Ｒｏｂｂｉｎｓら，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：９４６６−９４７４）またはＭＮＣプロモーター（これは、ＬＴＲエンハンサーが最小ＣＭＶプロモーターと組み合わせられている、ＭＮＤプロモーターの誘導体である（Ｈａｂｅｒｍａｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４（１８）：８７３２−８７３９，２０００））である。
いくつかの実施形態においては、本発明のベクターは、例えば、補体Ｂ因子タンパク質アナログをコードする遺伝子の一部としてイントロンを含む。異種イントロンは公知であり、非限定的な例として、ヒトβ−グロビン遺伝子イントロンが挙げられる。イントロンは補体Ｂ因子遺伝子に由来し得るか、または異種イントロンであり得る。
シグナル配列またはリーダー配列は公知であり、例えば、補体Ｂ因子発現構築物中で使用することができる。シグナル配列は、選択されたポリペプチドのアミノ末端に結合させられたペプチドとしてインフレームで翻訳され、分泌シグナル配列は宿主細胞の機構と相互作用することによりポリペプチドの分泌を引き起こす。分泌過程の部分として、この分泌シグナル配列は切断除去される。ヒト胎盤アルカリンホスファターゼ分泌シグナル配列が有用なシグナル配列の一例である。本発明は特定の分泌シグナル配列に限定されず、そして他のものは当業者に公知である。用語「シグナル配列」はまた分泌ペプチドをコードする核酸配列も意味する。シグナル配列が含まれる場合、それは野生型補体Ｂ因子配列、相同配列、または非相同配列のいずれかであり得る。
ウイルスベクター
本発明は、本発明の補体Ｂ因子アナログ（単数または複数）をコードするウイルスベクターを含む。本発明において有用なウイルスベクターの例は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０８／１０６６４４および米国特許公開番号ＵＳ２０１００１２０６６５に記載されている。本発明は特定のウイルスベクターに限定されない。ウイルスベクターとして、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター（例えば、米国特許第７，０４５，３４４号を参照のこと）、ＡＡＶベクター（例えば、米国特許第７，１０５，３４５号を参照のこと）、ヘルペスウイルスベクター（例えば、米国特許第５，８３０，７２７号および同第６，０４０，１７２号を参照のこと）、肝炎（例えば、Ｄ型肝炎）ウイルスベクター（例えば、米国特許第５，２２５，３４７号を参照のこと）、ＳＶ４０ベクター、ＥＢＶベクター（例えば、米国特許第６，５２１，４４９を参照のこと）、およびニューカッスル病ウイルスベクター（例えば、米国特許第６，１４６，６４２号、同第７，４４２，３７９号、同第７，３３２，１６９号、および同第６，７１９，９７９号を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの実施形態においては、レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ、ＥＩＡＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、またはＢＩＶベクターである。本発明はまた、本発明のウイルスベクターを生産する細胞を提供する。
ＢＩＶ系の例は、例えば、Ｍａｔｕｋｏｎｉｓら，２００２ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３，１２９３−１３０３；Ｍｏｌｉｎａら，２００２ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．３０４，１０−２３；Ｍｏｌｉｎａら、２００４ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１５，６５−８７７；米国特許第６，８６４，０８５号、同第７，１２５，７１２号、同第７，１５３，５１２号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ０８／１０６６４４および米国特許公開番号ＵＳ２０１００１２０６６５に記載されている。
本発明のベクタービリオンは、インビボまたはインビトロで細胞（例えば、哺乳動物細胞）に投与することができる。ベクター（ウイルス性および非ウイルス性）を使用して細胞（未分化細胞、分化細胞、体細胞、原始細胞および／または幹細胞を含むがこれらに限定されるわけではない）を形質導入または形質転換することができる。いくつかの実施形態においては、幹細胞はヒトへの投与のために意図され、小児への分化および発生のための適切な擬似妊娠女性への移植は意図されない。
いくつかの実施形態においては、本発明のウイルスベクターは崩壊促進因子（ＤＡＦ）を含む。例えば、エンベロープを有するウイルスベクターはウイルス膜上にＤＡＦを含む。いくつかの実施形態においては、ＤＡＦは野生型ＤＡＦである。いくつかの実施形態においては、ＤＡＦはエンベロープタンパク質との融合タンパク質の一部である。例えば、Ｇｕｉｂｉｎｇａら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００５、１１（４）：６４５−５１を参照のこと。いくつかの実施形態においては、ＢＩＶプロデューサー細胞はＤＡＦを発現する。
本発明の補体Ｂ因子アナログの生産
本発明の補体Ｂ因子タンパク質アナログは細胞により生産させることができる。いくつかの実施形態においては、その後、補体Ｂ因子タンパク質アナログが細胞から、および／または細胞培養培地から精製される。
本発明は、（ｉ）本発明の補体Ｂ因子アナログをコードするヌクレオチド配列を含有している核酸を含む細胞、および／または（ｉｉ）本発明の補体Ｂ因子タンパク質アナログを発現する細胞を含む。いくつかの実施形態においては、哺乳動物細胞が利用される。いくつかの実施形態においては、原核生物細胞が利用される。
宿主細胞は典型的には、タンパク質生産のための発現またはクローニングベクターでトランスフェクトあるいは形質導入され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、所望される配列をコードする遺伝子の増幅のため、または下流での精製および／もしくは濃縮の手順のために必要に応じて改変された従来の栄養培地中で培養される。
ベクター中のコード領域のクローニングまたは発現に適している宿主細胞は、原核生物、酵母、またはより高等真核生物の細胞である。この目的に適している原核生物として、真正細菌目（例えば、グラム陰性またはグラム陽性の生物、例えば、腸内細菌科（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、大腸菌））、エンテロバクター属、エルウイニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア属（例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、およびシゲラ属、ならびにバシラス属（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（例えば、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ４１Ｐ））、シュードモナス属（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、およびストレプトマイセス属が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。いくつかの実施形態においては、大腸菌クローニング宿主はＥ．ｃｏｌｉ ２９４（例えばＡＴＣＣ ３１，４４６）であるが、他の株、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６（例えば、ＡＴＣＣ ３１，５３７）およびＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（例えば、ＡＴＣＣ ２７，３２５）も適している場合がある。
原核生物に加えて、真核生物の微生物、例えば、糸状菌または酵母も適切なクローニングまたは発現の宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、即ち一般的なパン酵母が、より下等の真核生物宿主微生物の中では一般的に使用されている。しかし、以下のような多数の他の属、種、および株が一般的に入手可能であり、本明細書中で有用である：Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ；クルイベロマイセス属宿主（例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（例えば、ＡＴＣＣ １２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（例えば、ＡＴＣＣ １６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（例えば、ＡＴＣＣ ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（例えば、ＡＴＣＣ ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（例えば、ＡＴＣＣ ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、およびＫ．ｍａｒｘｉａｍｉｓ）；ヤロウイア属（例えば、ＥＰ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（例えば、ＥＰ１８３，０７０）；カンジダ属；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ（例えば、ＥＰ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）；および糸状菌（例えば、ニューロスポラ属、ペニシリウム属、トリポクラジウム属、およびアスペルギルス属の宿主（例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓおよびＡ．ｎｉｇｅｒ））。
例えば、グリコシル化されたタンパク質の発現に適している宿主細胞は多細胞生物から誘導することができる。無脊椎動物細胞の例として、植物細胞および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株およびバリアントおよび以下のような宿主に由来する対応する許容される昆虫宿主細胞が同定されており、タンパク質を発現するために使用することができる：Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（イモムシ）、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ（カ）、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（カ）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ミバエ）、およびＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ。トランスフェクションのための様々なウイルス株（例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ＮＰＶのＬ−１バリアントおよびＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ＮＰＶのＢｍ−５株）をタンパク質の発現のために使用することができ、これらは公的に入手することができ、そしてそのようなウイルスは、例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために本発明にしたがって使用され得る。綿花、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、およびタバコの植物細胞培養物もまた宿主として利用することができる。
本発明のいくつかの実施形態は、脊椎動物または哺乳動物の細胞を利用し、そして培養物（組織培養物）中での脊椎動物細胞の増殖が日常的に行われいる手法であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０で形質転換されたサル腎ＣＶＩ細胞株（例えば、ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚性腎細胞株（例えば、２９３または２９３Ｔ細胞（２９３ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））または２９３ＦＴのような懸濁培養物中での増殖のためにサブクローニングされたいずれかの細胞株（Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））を含む））；ベビーハムスター腎細胞（例えば、ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（例えば、ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（例えば、ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎細胞（例えば、ＣＶＩ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（例えば、ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（例えば、ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎細胞（例えば、ＭＯＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；ＣＦ２ＴＨ細胞；バッファローラット肝細胞（例えば、ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（例えば、Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳癌細胞（例えば、ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８３））；ＭＲＣ５細胞；およびＦＳ４細胞である。
いくつかの場合には、宿主細胞は内因性タンパク質の発現を低下または排除するように改変され得る。例えば、補体Ｂ因子タンパク質アナログを特定の宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）中で生産させようとする場合は、宿主細胞のネイティブのＢ因子タンパク質（例えば、ハムスターＢ因子）の発現が低下するかまたは排除されるように宿主細胞が改変され得る。これは、下流での補体Ｂ因子タンパク質アナログの精製に有利であり得る。したがって本発明は、宿主細胞中での対応するネイティブの補体タンパク質の発現を低下させるまたは排除することを含む本発明の補体タンパク質アナログを生産する方法を提供する。宿主細胞タンパク質の発現を低下させる、排除する、またはノックアウトする方法は当該分野で公知である。例えば、タンパク質の発現レベルは、タンパク質をコードするＲＮＡに特異的な阻害性ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡｉ）を発現するように宿主細胞を操作することにより低下させられ得るかまたは排除され得る。例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）が様々なベクターおよびキット、例えば、宿主細胞中でのタンパク質の発現をノックダウンするためのＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）ＲＮＡｉシステムの一部と呼ばれるものを販売している。他の方法には、任意のクローニングされた遺伝子内への特異的変異の導入を可能にする相同組み換えによる遺伝子ターゲティングが含まれる。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９４−１９９８、セクション９．１６および９．１７を参照のこと。これは宿主細胞タンパク質を発現している遺伝子をノックアウトするために使用することができる。
内因性タンパク質の発現を低下させるために利用することができる別の方法には、内因性タンパク質の発現を抑制するターゲティングされた転写因子を使用することが含まれる。例えば、転写因子に由来するリプレッサードメインが亜鉛フィンガーポリペプチドのようなＤＮＡ結合ドメインに結合または融合させられ得る。当業者であれば特定のＤＮＡ配列に結合する亜鉛フィンガーポリペプチドを設計することができる。例えば、米国特許６，１４０，０８１号；および同第７，０６７，６１７号；および米国特許出願公開番号２００６００７８８８０；同２００４０２２４３８５；および同２００７０２１３２６９を参照のこと。当業者であれば設計された亜鉛フィンガーポリペプチドを転写リプレッサードメイン（例えば、ＫＲＡＢ（Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス）ドメイン）と結合させることができる。そのような分子および技術の例は、Ｂｅｅｒｌｉら（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０００、９７（４）：１４９５−１５００）および米国特許出願公開番号２００７００２０６２７に記載されている。本発明のいくつかの実施形態においては、宿主細胞に転写リプレッサーを発現するベクターが形質導入される。このアプローチは、ほとんどの場合において、宿主細胞が二倍体となり、そして両方の遺伝子コピーをノックアウトすることが望ましいために、相同組み換えを使用して目的の遺伝子をノックアウトすることよりも有利である。その一方で、転写リプレッサーの発現は両方の遺伝子コピーの発現を抑制するはずである。
特定の内因性タンパク質の発現はまた、その特定の内因性タンパク質の発現を直接または間接的に低下させる化合物を使用して低下させられる場合がある。ｆＢを例とすると、様々な化合物を内因性ｆＢ発現の発現を低下させるために使用することができる。例えばｆＢタンパク質の発現はヒスタミン（Ｆａｌｕｓ ＆ Ｍｅｒｅｔｅｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９８７ ６０：５４７−５５１およびＦａｌｕｓ ＆ Ｍｅｒｅｔｅｙ，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９８８、２５（１１）：１０９３−９７）、酪酸ナトリウム（Ａｎｄｏｈら、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏ １９９９，１１８：２３−２９）、糖質コルチコイド、例えばデキサメタゾン（Ｄａｕｃｈｅｌら，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９０、２０（８）：１６６９−７５）、血小板由来成長因子（Ｃｉｒｃｏｌｏら、１９９０、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６５（９）：５０６６−５０７１）、表皮成長因子（Ｃｉｒｃｏｌｏら、１９９０）、および線維芽細胞成長因子（Ｃｉｒｃｏｌｏら、１９９０）により阻害されることが示されている。本発明の宿主細胞は、補体Ｂ因子タンパク質の内因性発現を低下させるためにこれらの分子の任意の１つまたは組み合わせの存在下で培養され得る。したがって、本発明のいくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子タンパク質アナログを発現する宿主細胞が、ヒスタミン、酪酸ナトリウム、糖質コルチコイド（例えば、デキサメタゾン）、血小板由来成長因子、表皮成長因子、または線維芽細胞成長因子からなる群より選択される任意の１つ以上の化合物の存在下で培養される。
様々な化合物およびタンパク質が補体Ｂ因子タンパク質の発現をアップレギュレートまたは維持することが示されている。例えば、補体Ｂ因子タンパク質の発現は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）（Ａｎｄｏｈら、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏ １９９９ １１８：２３−２９）、エストロゲン（Ｓｈｅｎｇ−Ｈｓｉａｎｇら、Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ２００２ ６６：３２２−３３２）、インターロイキン−１（Ｄａｕｃｈｅｌら、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９０、２０（８）：１６６９−７５）、デキサメタゾン（Ｌａｐｐｉｎ ＆ Ｗｈａｌｅｙ，ＢｉｏｃｈｅｍＪ、１９９１、２８０：１１７−１２３）、プレドニソロン（Ｌａｐｐｉｎ ＆ Ｗｈａｌｅｙ １９９１）、コルチカール（Ｌａｐｐｉｎ ＆ Ｗｈａｌｅｙ １９９１）、およびインターフェロン−γ（Ｈｕａｎｇら、２００１ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３１：３６７６−３６８６）によりアップレギュレートまたは維持されることが示されている。本発明の宿主細胞をこれらの分子の任意の１つまたは組み合わせの非存在下で培養して、補体Ｂ因子タンパク質の内因性発現を低下させることができる。さらに、宿主細胞はこれらの化合物の任意の１つ以上の阻害剤の存在下で培養される場合がある。したがって、本発明のいくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子タンパク質アナログを発現する宿主細胞が、ＴＮＦ、エストロゲン、インターロイキン−１、デキサメタゾン、プレドニソロン、コルチカール、およびインターフェロン−γからなる群より選択される化合物を阻害する任意の１つ以上の化合物の存在下で培養される。いくつかの実施形態においては、１つ以上のこれらの化合物の宿主細胞による発現が、例えば本明細書に記載する方法を使用して低下させられる。エストロゲンの阻害剤の例としてタモキシフェンが挙げられるが、これに限定されるわけではない。阻害剤にはまた、化合物に結合し、その活性を低下させる抗体も含まれる。例えば、ＴＮＦに結合してＴＮＦを不活性化させる様々な抗体が当該分野で公知である。
細胞から調製された組成物を含有している補体Ｂ因子タンパク質アナログは、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、免疫アフィニティークロマトグラフィー、接線流精製、透析濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、逆相クロマトグラフィー、ヘパリンセファロースアフィニティークロマトグラフィー、ならびに他の公知の分離および濃縮の形態を使用して精製することができる。任意の事前の精製工程（単数または複数）に続いて、補体Ｂ因子タンパク質アナログと、もし存在するならば混入物質とを含有している混合物について、いくつかの場合には、低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）で行われる低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーが、例えば約２．５〜４．５の間のｐＨの溶離緩衝液を使用して、あるいは、さらなる精製のための他の手順が行われ得る。
いくつかの実施形態においては、本発明の補体Ｂ因子タンパク質アナログは、全タンパク質に関して少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９．５％、または少なくとも９９．９％純粋である。
本発明はまた、本発明の補体Ｂ因子タンパク質アナログを細胞中で発現させる工程および補体Ｂ因子タンパク質アナログを精製する工程を含む、補体Ｂ因子タンパク質アナログの生産方法を提供する。
補体媒介状態／疾患
補体活性化には３つの経路：古典的経路、代替経路、およびレクチン経路がある（図１）。本発明の補体Ｂ因子タンパク質アナログの例を本明細書中に記載する。いくつかの実施形態においては、これらの補体Ｂ因子タンパク質アナログは、補体活性化の代替経路を減衰させることができる。しかし、３つの補体経路の全てが交差する状況に基づくと、これらのアナログは３つの補体経路のいずれかにより引き起こされる炎症を小さくすることができ、これによりその病因に少なくとも部分的に補体活性化が関与している任意の疾病の治療法を提供することができる。これらには、早期ＡＭＤ、湿性ＡＭＤ、および地図状委縮が含まれるがこれらに限定されるわけではない。図１Ａおよび１Ｂは補体経路を要約する。これらがＣ３ｂで交差することに留意されたい。
本発明は、本発明の薬学的製剤、本発明の補体Ｂ因子アナログ、または本発明の補体Ｂ因子アナログをコードする核酸もしくはベクターを患者に投与する工程を含む、補体媒介疾患の処置方法を提供する。本発明はまた補体活性を阻害する方法も含み、ここでは、この方法には、被検体においてネイティブの補体Ｂ因子の結合と競合することにより補体経路を阻害するために十分な量の変異したヒト補体Ｂ因子アナログをヒト被検体に投与する工程が含まれる。この場合、変異したヒト補体Ｂ因子アナログは、ジスルフィド結合を形成するシステインアミノ酸と、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸で置換された遊離のシステインアミノ酸を有している配列番号４の活性な補体Ｂ因子アナログである。いくつかの実施形態においては、変異した補体Ｂ因子アナログは配列番号２、３、２２、または２３を含む。
本発明はまた補体活性を阻害する方法を提供し、ここでは、この方法には、補体活性を阻害するために十分な量の本発明の補体Ｂ因子アナログ、本発明の核酸、本発明のウイルスベクター、本発明の薬学的組成物／薬学的製剤、またはこれらの任意の組み合わせを補体活性の部位に導入する工程が含まれる。いくつかの実施形態においては、本発明の方法は、ジスルフィド結合を形成するシステインアミノ酸と別のアミノ酸で置換された遊離のシステインアミノ酸を有している配列番号４のアナログである補体Ｂ因子を利用する。
本発明は補体活性を阻害する方法を提供し、ここでは、この方法には、ネイティブの補体Ｂ因子の結合と競合する変異したヒト補体Ｂ因子アナログにより補体活性を阻害するために十分な量の変異したヒト補体Ｂ因子アナログを補体活性の部位に導入する工程が含まれる。この場合、変異したヒト補体Ｂ因子アナログは、ジスルフィド結合を形成するシステインアミノ酸と、アミノ酸で置換された遊離のシステインアミノ酸を有している配列番号４の活性な補体Ｂ因子アナログである。いくつかの実施形態においては、この方法は、配列番号２のアミノ酸２６〜７６４、配列番号３のアミノ酸２６〜７６４、配列番号２２のアミノ酸２６〜９９０、または配列番号２３のアミノ酸２６〜９９０を含む補体Ｂ因子アナログを利用する。
補体経路は、免疫系の体液性および細胞に媒介される分岐の活性化の前に感染からの即時保護をもたらす先天免疫系として知られている免疫系の一部である。これらは高次の反応速度論を示すが相当に十分調節されているカスケード反応を介して活性化され、そして不活性化される。代替補体経路は特に、正のフィードバックループを介して迅速にサイクルアップするように展開する。
本発明の補体Ｂ因子タンパク質アナログおよび／またはそれらを発現するベクターは、哺乳動物への局所および／または全身投与のため、ならびに／あるいは、慢性疾患を処置するために好都合に使用され得る。本発明のいくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子アナログがネイティブの補体Ｂ因子の、例えば、Ｃ３ｂタンパク質および／またはＤ因子タンパク質に対する結合と競合することにより補体経路を阻害する。これは経路の完全な遮断とは逆に、補体活性の減衰を可能にし得る。したがって、補体活性を完全に遮断することなく治療性がある（例えば、一部の症状またはその重症度を軽減する）レベルにまで補体活性をダウンレギュレートすることが可能である場合がある。これにより、高い感染リスクのような補体活性の遮断に伴うリスクが回避されるかまたは低下する。したがって本発明は、本発明の補体Ｂ因子タンパク質アナログの局所もしくは全身投与（例えば、ｉ．ｖ．、腹腔内、または経口）により補体媒介疾患（例えば、慢性疾患）を処置するための方法を提供する。
いくつかの実施形態においては、本発明は補体活性をモジュレートする、調節する、阻害する、および／または増強するための組成物ならびに方法を提供する。補体関係経路には、古典的補体経路、レクチン補体経路、および代替補体経路が含まれるがこれらに限定されるわけではない。いくつかの場合には、補体関係経路は特定の状態または疾患（単数または複数）において役割を果たす場合がある。したがって、本発明のいくつかの実施形態は、本発明の補体Ｂ因子アナログまたは本発明の補体Ｂ因子アナログをコードする核酸もしくはベクターを投与することにより、１つ以上の補体関係経路により媒介される疾患の状況を調節する、改質する、治癒させる、阻害する、予防する、改善する、進行を遅らせる、および／または処置する方法を提供する。そのような疾患の状況または状態として以下が挙げられるが、これらに限定されるわけではない：ドルーゼン形成、黄斑変性、ＡＭＤ、ドライアイ、角膜潰瘍、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、硝子体網膜症（Ｇｒｉｓａｎｔｉら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３２：２７１１−２７１７）、角膜炎症、気道応答性亢進、免疫関連疾患、自己免疫関連疾患、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節炎（例えば、関節リウマチ）、リウマチ性疾患、抗リン脂質抗体症候群、腸および腎臓のＩ／Ｒ傷害、喘息、非定型溶血性尿毒症症候群、ＩＩ型膜増殖性糸球体腎炎、非増殖性糸球体腎炎、胎児喪失（例えば、自然胎児喪失）、緑内障、ブドウ膜炎、高眼圧症、脳傷害（例えば、外傷性脳傷害）、脳卒中（例えば、Ａｒｕｍｕｇａｍら、ＰＮＡＳ ９３（１２）：５８７２−６（１９９６）を参照のこと）、外傷後臓器損傷、熱傷（例えば、火傷）、梗塞後臓器損傷（例えば、心臓、神経系）、血管炎、川崎病、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ、マルキアファーバ−ミケリ症候群と呼ばれる場合もある）、大腸炎、炎症性腸疾患、腫瘍転移、虚血再灌流傷害、脳血管偶発症、アルツハイマー病、移植片拒絶（例えば、異種移植片および自家移植片）、感染症、敗血症、敗血症性ショック、シェーグレン症候群、重症筋無力症、抗体に媒介される皮膚疾患、全ての抗体に媒介される臓器特異的疾患（Ｉ型およびＩＩ型真性糖尿病、甲状腺炎、特発性血小板減少性紫斑病および溶血性貧血、および神経障害を含む）、インスリン抵抗性症候群（例えば、Ｗｅｙｅｒら（２０００）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ，２３（６）：７７９−７８５を参照のこと）、妊娠性糖尿病、多発性硬化症、乾癬、心肺バイパス傷害、結節性多発性動脈炎、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、血清病、グッドパスチャー病、全身性壊死性血管炎、連鎖球菌感染後の糸球体腎炎、特発性肺線維症（通常の間質性肺炎）、膜性糸球体腎炎、心筋炎（例えば、自己免疫性心筋炎）（Ｋａｙａら、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；２（８）：７３９−４５）、心筋梗塞、筋ジストロフィー（例えば、ジストロフィン欠損に関連）、急性ショック性肺症候群、成人呼吸窮迫症候群、再灌流、および／または補体媒介疾患。
いくつかの実施形態においては、補体媒介疾患は眼の疾患である。いくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子アナログまたは薬学的組成物は、例えば、硝子体内注射、網膜下注射、前眼房内への注射、角膜への注射または局所適用、結膜下注射、テノン下注射、または点眼によって眼に投与される。いくつかの実施形態においては、例えば、ｈｆＢ３−２９２Ｓ（配列番号２）、ｈｆＢ３−２９２Ｓ−７４０Ｎ（配列番号３）、ｈｆＢ３−２９２Ｓ−Ｆｃ（配列番号２２）、およびｈｆＢ３−２９２Ｓ−７４０Ｎ−Ｆｃ（配列番号２３）の群より選択される少なくとも１つの補体Ｂ因子アナログを含有している薬学的組成物が眼に投与される。
加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）は、先進国において６５歳超の人の視力低下の最も一般的な原因である。乾式ＡＭＤは中央の視野の喪失を引き起こす黄斑の進行性の変性を特徴とする。より急性の消耗性のＡＭＤは湿性ＡＭＤとして知られている網膜の病性盛んな血管新生および管外遊出を含む。現在ＡＭＤについて有効な治療法はない。
ＡＭＤの特徴は網膜色素上皮（ＲＰＥ）の基底層とブルーフ膜の内層のと間に位置するドルーゼンの蓄積である（Ｐａｕｌｅｉｋｈｏｆｆら、１９９０ Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１０９，３８−４３；Ｂｒｅｓｓｌｅｒら、１９９０ Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１０８，１４４２−１４４７）。ドルーゼン、ならびにブルーフ膜の近位で生じる他の加齢による変化は、虚血を誘導すること、ならびに網膜と脈絡膜との間の栄養および老廃物の交換の制限により、ＲＰＥおよび網膜の機能不全および変性に寄与すると考えられている（Ｂｉｒｄ，１９９２ Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＡＭＤ．Ａｇｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｍａｃｕｌａｒ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｈａｍｐｔｏｎ，Ｇ．，ａｎｄ Ｎｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｔ．，編）第３章，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋによる報告）。いくつかの研究はＡＭＤの発症における免疫媒介過程を示している。重要なことは、免疫および炎症媒介過程がドルーゼンの発生および／または除去に関与しているという仮説により予測されたように、自己抗体がＡＭＤ患者の血清中で検出されたことである（Ｐｅｎｆｏｌｄら、１９９０ Ｇｒａｅｆｅｓ Ａｒｃｈ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２２８，２７０−２７４）。
眼におけるドルーゼンの形成は黄斑変性のような様々な疾患に関連し得る。いくつかの場合には、ドルーゼンの形成および／またはその疾患との関連性が補体活性と関係していることが示唆されている。本発明のいくつかの実施形態は、ヒトのような動物におけるドルーゼンの形成または成長をモジュレートする、調節する、阻害する、減少させる、遅らせる、および／または逆戻りさせるための組成物ならびに方法を提供する。例えば、本発明の組成物または分子は（例えば、ドルーゼン内への直接の注射（ドルーゼン内注射）、ドルーゼンの近傍への注射、または硝子体内注射により）ドルーゼンに送達され得る。本発明のいくつかの実施形態は、おそらくドルーゼン形成を阻害することにより黄斑変性の進行を遅らせるために利用することができる。ドルーゼンの大量成分であるビトロネクチンはまた、アテローム性動脈硬化症（Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕら、１９８９ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，７８，１９７−２０３）、アミロイドーシス（Ｄａｈｌｂａｃｋら、１９９３ Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１００，１６６−１７０）、弾力線維症（Ｄａｈｌｂａｃｋら、１９８８ Ａｃｔａ Ｄｅｒｍ．Ｖｅｎｅｒｅｏｌ．６８，１０７−１１５）、およびＭＰＧＮ ＩＩ型（Ｊａｎｓｅｎら、１９９３ Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４３，１３５６−１３６５）に関連する細胞外付着物の成分でもある。ビトロネクチンは、細胞接着、止血の維持、および補体に誘導される細胞溶解の阻害において機能する多機能性タンパク質である（Ｐｒｅｉｓｓｎｅｒ，１９９１ Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７，２７５−３１０）。さらに、アテローム性動脈硬化症のプラークはドルーゼンと共通して、補体成分およびアポリポタンパク質Ｅのような多くの他の構成成分を有している。進行型ＡＭＤと頸動脈のアテローム性動脈硬化症と間の関連性が疫学的研究（Ｖｉｎｇｅｒｌｉｎｇら，１９９５ Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．１４２，４０４−４０９）において報告されており、そして別の研究ではＡＭＤ患者における日光に曝露されたものではない皮膚炎の弾性症変性と脈絡膜血管新生との間での有意な相関関係が明らかにされている（Ｂｌｕｍｅｎｋｒａｎｚら，１９８６ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，９３，５５２−５５８）。最後に、アルツハイマー病におけるニューライトプラークの主要な構成成分であるアミロイドβペプチドもまたドルーゼンの中に見られる（Ｊｏｈｎｓｏｎら、２００２ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９，１１８３０−１１８３５）。アミロイドβペプチドは補体の主要な活性化物質として関与しているとされている（Ｂｒａｄｔら、１９９８ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８，４３１−４３８）。
ヒトドルーゼンの分子組成ならびにドルーゼンに隣接するまたはドルーゼンに重なるＲＰＥ細胞の包括的な分析により、免疫グロブリンに対する免疫反応性、および、免疫複合体の付着に関連する補体系の成分が明らかにされた（Ｊｏｈｎｓｏｎら、２０００ Ｅｘｐ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．７０，４４１−４４９）。ドルーゼンはまた、免疫系のモジュレーションにおいて役割を果たしているビトロネクチン（Ｈａｇｅｍａｎら、１９９９ ＦＡＳＥＢ Ｊ．１３，４７７−４８４）およびアポリポタンパク質Ｅ（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２００１ Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１３１，７６７−７８１）のような多機能性タンパク質も含む。加えて、アミロイドＰ成分およびα１−抗トリプシンのような炎症に対する急性期応答に関与する分子もドルーゼンの中に認められており（Ｍｕｌｌｉｎｓら、２０００ Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ，１４，８３５−８４６）、さらには、凝固およびフィブリン溶解に関与するタンパク質（Ｘ因子、トロンビン、およびフィブリノーゲン）も認められている（Ｍｕｌｌｉｎｓら、２０００ Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ，１４，８３５−８４６）。ドルーゼンの形成および関連するＲＰＥの病理は補体カスケードを活性化する慢性の炎症応答に寄与していると示唆されている（Ｈａｇｅｍａｎら、２００１ Ｐｒｏｇ．Ｒｅｔｉｎ，Ｅｙｅ Ｒｅｓ．２０，７０５−７３２；Ｊｏｈｎｓｏｎら、２００１ Ｅｘｐ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．７３，８８７−８９６）。
ＡＭＤにより生じ、網膜の混乱をもたらす視覚障害の１つの他の形態は地図状委縮であり、これは桿状細胞および錐体細胞ならびにＲＰＥ細胞の斑の死滅につながる。
アテローム性動脈硬化症は補体が関係する経路に典型的に関与していることが示されている。例えば、Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３０（１）：７３−８０（８）（２００４）およびＮｉｃｕｌｅｓｃｕ ａｎｄ Ｈｏｒｅａ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０（１）：７３−８０（２００４）を参照のこと。補体活性化およびＣ５ｂ−９の付着は、典型的にはヒトおよび実験用のアテローム性動脈硬化症の両方において起こる。Ｃ５ｂ−９は細胞溶解を担っている場合があり、Ｃ５ｂ−９の溶解下でのアセンブリは平滑筋細胞（ＳＭＣ）および内皮細胞（ＥＣ）の活性化および増殖を誘導する。補体Ｃ６の機能不全は食事によるアテローム性動脈硬化症に対して保護的作用を有しており、これは、Ｃ５ｂ−９のアセンブリがアテローム性動脈硬化症の病変の進行に必要であるか、またはそれにおいて少なくとも有意な役割を担っていることを示唆している。例えば、Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ ａｎｄ Ｈｏｒｅａ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０（１）：７３−８０（２００４）を参照のこと。本発明のいくつかの実施形態は、Ｃ５ｂ−９の形成を阻害するため、および／またはアテローム性動脈硬化症を阻害するために使用され得る。いくつかの実施形態においては、本発明の補体Ｂ因子タンパク質アナログがアテローム性動脈硬化症の部位またはその可能性がある部位に投与される。このＢ因子タンパク質アナログは１つの経路（例えば、古典的経路および／または代替補体経路）を阻害し、次にこれが、Ｃ５ｂ−９またはアテローム性動脈硬化症に関与している別の補体経路関連化合物の形成あるいは活性化を阻害する。その形成および／または活性化が同様の様式で阻害または遮断され得る、アテローム性動脈硬化症に関与している他の補体関連タンパク質が存在すると考えられる。
気道応答亢進症（ＡＨＲ）は、喘息（例えば、アレルギー性喘息）を含むがこれに限定されない様々な疾患の特徴である。ＡＨＲは補体が関係する経路に典型的に関与していることが示されている。例えば、Ｔａｕｂｅら、２００６ ＰＮＡＳ １０３（２１）：８０８４−８０８９；Ｐａｒｋら、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １６９：７２６−７３２，（２００４）；Ｔｈｕｒｍａｎ ａｎｄ Ｈｏｌｅｒｓ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７６：１３０５−１３１０（２００６）、および米国特許公開番号２００５０２６０１９８を参照のこと。Ｐａｒｋらは腹腔内注射により投与されたＣｒｒｙ−ＩｇがＡＨＲに対する作用を有していることを示した。本発明のいくつかの実施形態は、ヒトのような動物においてＡＨＲをモジュレートする、調節する、阻害する、および／または低下させる組成物ならびに方法を提供する。処置、軽減、阻害、および／または改善することができる特定のＡＨＲに関係する疾患として、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、過敏性肺炎、好酸球性肺炎、肺気腫、気管支炎、アレルギー性気管支炎、気管支拡張症、嚢胞性線維症、結核、過敏性肺臓炎、職業性喘息、類肉腫、反応性気道疾患症候群、間質性肺疾患、過好酸性症候群、鼻炎、副鼻腔炎、運動誘発喘息、公害誘発喘息、咳喘息、肺寄生虫症、呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）感染症、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）感染症、ライノウイルス（ＲＶ）感染症、ハンターンウイルス（例えば、フォーコーナーズ株）感染症およびアデノウイルス感染症が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
自己免疫関連疾患、ＨＬＡ−Ｂ２７関連炎症性疾患、ループス腎炎および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のような免疫関連疾患は補体が関係する経路に典型的に関与していることが示されている。例えば、Ｔｈｕｒｍａｎ ａｎｄ Ｈｏｌｅｒｓ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７６：１３０５−１３１０（２００６）を参照のこと。ループス腎炎はＳＬＥの１つの合併症である。これは狼瘡の自己免疫過程に関係しており、この場合、免疫系が体成分に対する抗体（抗核抗体など）を生産する。これらの抗体と補体成分との複合体は典型的には腎臓に蓄積し、そして炎症反応を生じる。本発明のいくつかの実施形態は、例えば、ＳＬＥのような、補体経路に関与しているかまたは関係する免疫関連疾患を調節する、改変する、治癒させる、阻害する、予防する、改善する、および／または処置するための方法ならびに組成物を提供する。
関節炎は補体に関係する経路が典型的に関与していることが示されている。例えば、Ｔｈｕｒｍａｎ ａｎｄ Ｈｏｌｅｒｓ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７６：１３０５−１３１０（２００６）およびＢａｎｄａら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７（３）：１９０４−１２（２００６）を参照のこと。代替補体経路は関節炎の誘導において重要な役割を担っており、そして代替補体経路がなおも必要とされる場合がある。本発明のいくつかの実施形態は、関節炎（例えば、関節リウマチまたは炎症性関節炎）を調節する、改変する、治癒させる、阻害する、予防する、改善する、および／または処置するための方法ならびに組成物を提供する。
発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）は、補体系の制御できていない増幅を生じる補体による赤血球（ＲＢＣ）の血管内での分解が原因で起こる補体に誘導される血管内溶血性貧血および血栓症を特徴とする、血液の生死にかかわる可能性がある疾患であり、これはＲＢＣ膜の分解を生じる。この疾患に罹患した人は、典型的には、ＰＩＧ−Ａと呼ばれる遺伝子を欠損している血球を有している。この遺伝子は、グリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）と呼ばれる物質が、細胞に特定のタンパク質を突き刺すことを手助けすることを可能にする。ＰＩＧ−Ａを伴わなければ、補体調節タンパク質は細胞表面につながることができず、補体から細胞を保護することができない。本発明のいくつかの実施形態は、発作性夜間ヘモグロビン尿症を調節する、改変する、治癒させる、阻害する、予防する、改善する、および／または処置するための方法ならびに組成物を提供する。
遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）は、典型的には補体系のタンパク質であるＣ１阻害剤の不足により起こる、生死にかかわる可能性がある遺伝性の状態である。この症状としては、手、足、顔、および気道を含む様々な体の部分における浮腫（腫脹）のエピソードが挙げられる。遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）には３つの形態があり、これらの全てが、常染色体優性の形態で遺伝する遺伝性変異により起こる。Ｉ型およびＩＩ型はＳＥＲＰＩＮＧ１遺伝子の変異により起こる。ＳＥＲＰＩＮＧ１遺伝子の変異は、Ｃ１阻害剤タンパク質の低下したレベルまたは機能が失われた形態のいずれかを生じる（Ｉ型ＨＡＥ）。ＩＩＩ型ＨＡＥは、ＸＩＩ凝固因子タンパク質をコードするＦ１２遺伝子の変異と連鎖している。全てのＨＡＥ形態が補体系の異常な活性化につながる。いくつかの現在行われている処置としては、カリクレインのペプチド阻害剤であるエカランチド（例えば、米国特許公開番号ＵＳ２００７０２１３２７５を参照のこと）、イカチバント（Ｆｉｒａｚｙｒ、Ｊｅｒｉｎｉ）（これは、選択的ブラジキニン受容体アンタゴニストである）、およびＣ１エステラーゼ阻害剤であるシンライズ（Ｃｉｎｒｙｚｅ）（Ｖｉｒｏｐｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。本発明のいくつかの実施形態は、発作性夜間ヘモグロビン尿症を調節する、改変する、治癒させる、阻害する、予防する、改善する、および／または処置するための方法ならびに組成物を提供する。
緑内障は視神経障害の特徴的パターンにおける網膜神経節細胞の喪失を伴う視神経の疾患の１つの群である。網膜神経節細胞を喪失した緑内障患者のおよそ２５％が正常な眼圧を有している。高眼圧症（ＯＨＴ）は緑内障の発症についての重要なリスクファクターであり、医薬品または外科手術によりそれを低下させることが緑内障の処置の現在の主流である。高眼圧症および緑内障は、典型的には補体が関係する経路が関与していることが示されている。例えば、Ｋｈａｌｙｆａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｓｉｏｎ，１３：２９３−３０８（２００７）；Ｓｔａｓｉら、ＩＯＶＳ ４７（３）：１０２４−１０２９（２００７）；およびＫｕｅｈｎら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８３：６２０−６２８（２００６）を参照のこと。Ｃ１ｑおよびＣ３の発現および／または存在はＯＨＴに罹患した網膜においてより高くなることが示されている。本発明のいくつかの実施形態は、緑内障を調節する、改変する、治癒させる、阻害する、予防する、改善する、および／または処置するための方法ならびに組成物を提供する。
ブドウ膜炎は、典型的には補体経路に関連することが示されている。例えば、Ｍｏｎｄｉｎｏ ａｎｄ Ｒａｏ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４：３８０−３８４（１９８３）およびＪｈａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４４：３９０１−３９０８（２００７）を参照のこと。ＭｏｎｄｉｎｏおよびＲａｏは、房水から血清の計測までの全ての試験した補体成分の平均値が過去に眼の手術の病歴がある患者において上昇しており、そして前部ブドウ膜炎の患者において最も高かったことを明らかにした。本発明のいくつかの実施形態は、ブドウ膜炎を調節する、改変する、治癒させる、阻害する、予防する、改善する、および／または処置するための方法ならびに組成物を提供する。
糖尿病性網膜症は中年個体における視力喪失の主要原因の１つである。補体系の活性化は糖尿病性網膜症の発症において重要な役割を果たしていると考えられている（例えば、Ｊｈａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４４：３９０１−３９０８（２００７）を参照のこと）。本発明のいくつかの実施形態は、糖尿病性網膜症を調節する、改変する、治癒させる、阻害する、予防する、改善する、および／または処置するための方法ならびに組成物を提供する。
増殖性硝子体網膜症（ＰＶ）は網膜剥離の最も一般的な合併症の１つである。ＰＶは補体活性と関連している。例えば、Ｇｒｉｓａｎｔｅら、Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．１９９１；３２（１０）：２７１１−７、およびＧｒｉｓａｎｔｅら、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｅ．１９９２；８９（１）：５０−４を参照のこと。本発明のいくつかの実施形態は、ＰＶを調節する、改変する、治癒させる、阻害する、予防する、改善する、および／または処置するための方法ならびに組成物を提供する。
抗リン脂質抗体症候群、腸および腎虚血再灌流Ｉ／Ｒ傷害、非定型溶血性尿毒症候群、ＩＩ型膜増殖性糸球体腎炎、および胎児損失（例えば、自発的胎児損失）には典型的には補体に関係する経路が関与していることが示されている。例えば、Ｔｈｕｒｍａｎ ａｎｄ Ｈｏｌｅｒｓ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７６：１３０５−１３１０（２００６）を参照のこと。
脳傷害（例えば、外傷性脳傷害）には典型的には補体に関係する経路が関与していることが示されている。例えば、Ｌｅｉｎｈａｓｅら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ４：１３（２００７）、およびＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：５５（２００６）を参照のこと。Ｌｅｉｎｈａｓｅ ２００６は、野生型（ｆＢ＋／＋）マウスにおける実験用の外傷性脳傷害の後に、時間依存性の全身性の補体活性化が存在することを示した。これとは対照的に、全身性補体活性化の程度はｆＢ−／−マウスにおいては有意に減衰されていた。本発明のいくつかの実施形態は、神経細胞死、外傷性神経傷害（例えば、脳）、補体媒介神経炎症および／または神経障害を調節する、改変する、治癒させる、阻害する、予防する、改善する、および／または処置するための方法ならびに組成物を提供する。
虚血再灌流傷害は細胞および組織により生産される様々な有害となる可能性がある化合物の生産量または酸化の増大を引き起こすことができ、これは細胞および組織の酸化性の損傷または死滅をもたらす可能性がある。例えば、腎虚血再灌流傷害は急性尿細管壊死に特徴的な腎尿細管の損傷および変化を含む腎臓の組織学的損傷を生じ得る。結果として生じる腎機能不全は腎臓から通常排出される窒素性の老廃物（例えば、血清中尿素態窒素（ＳＵＮ））の蓄積を可能にする。虚血再灌流はまた、肺のような離れた臓器にも傷害を起こす場合がある。本発明のいくつかの実施形態は、例えば、虚血再灌流を経験または発症しているか、あるいはそのリスクがある動物に投与されると、補体経路のモジュレーター、例えば、阻害剤（例えば、Ｂ因子活性の阻害剤）を利用する。いくつかの実施形態においては、これらのモジュレーターは虚血再灌流が原因である傷害の少なくとも１つの症状を予防する、低減させる、または阻害する。本発明の方法および組成物を使用して予防するかまたは低減させることができる虚血再灌流傷害の他の型として、心臓虚血再灌流傷害、例えば、心筋梗塞または冠動脈バイパス手術、中枢神経系虚血再灌流傷害、四肢または指の虚血再灌流傷害、肺、肝臓または腸のような臓器の虚血再灌流、あるいは任意の移植された臓器または組織の虚血再灌流傷害が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。例えば、心筋梗塞および補体経路について考察しているＰＣＴ公開番号ＷＯ０３／０６１７６５を参照のこと。
炎症は心筋梗塞の主要な病因の決定因子である（Ｒｉｄｋｅｒ，２００７ Ｎｕｔｒ．Ｒｅｖ．６５（１２ Ｐｔ ２）：Ｓ２５３−９）。骨髄（幹）細胞の送達（例えば、冠動脈内）が急性心筋梗塞後の収縮期機能の改善をもたらすこともまた示されている（Ｗｏｌｌｅｒｔ，２００８，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｊａｎ ３１［Ｅｐｕｂ］）。また、骨髄幹細胞は梗塞した心筋を再生させることができる（Ｏｒｌｉｃら、２００３ Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．７ 補遺３：８６−８８）。間葉性幹細胞は虚血性心疾患において心臓保護作用を提供することが示されている（Ｇｕｏら、２００７ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ３０（３−４）：９７−１０４）。本発明においては幹細胞の送達は、冠動脈内注射、心筋への（例えば、罹患した心筋および／または健常な心筋内への（例えば、受傷領域の隣接部））直接の注射のような任意の手段により行うことができる。いくつかの実施形態においては、哺乳動物をサイトカインで処置して、循環の中にその骨髄幹細胞を移動させて、幹細胞を心筋梗塞まで運搬することができる。
様々な幹細胞が様々な用途のためにインビボで使用されている。インビボでの幹細胞の使用に伴う１つの問題は、例えば、目的の領域における幹細胞の生存および／または播種が所望に満たないことである。幹細胞の低い播種性および生存性の１つの重大な理由はその部位での炎症である可能性がある。従って本発明は、処置方法ならびに／あるいは幹細胞の生存性および／または播種性を改善する方法を提供する。いくつかの実施形態においては、これらの方法は幹細胞の投与または移動の前、その間、および／またはその後に本発明の組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態においては、本発明の補体阻害剤は所望される播種領域（例えば、損傷した心臓または骨髄）へと帰巣し、そして生存するように、そしてしたがって損傷した組織を修復するかまたはそれに置き換わるために幹細胞にとって好ましい環境を作り出す抗炎症剤として機能する。幹細胞は、本発明の補体Ｂ因子タンパク質アナログもまた含有する溶液中で投与される場合がある。幹細胞は、造血幹細胞、胚性幹細胞、間葉性幹細胞、神経幹細胞、乳腺幹細胞、嗅幹細胞、膵島幹細胞、全能性幹細胞、多能性幹細胞または多分化性幹細胞であってよいが、これらに限定されるわけではない。幹細胞は、自系であっても、同種異系であっても、または同系であってもよい。
補体活性は筋ジストロフィーに関与していると考えられる（例えば、ジストロフィン欠損に関連）。例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００７１３００３１，Ｓｐｕｌｅｒ ＆ Ｅｎｇｅｌ １９９８ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ５０：４１−４６、およびＳｅｌｃｅｎら、２００１ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ５６：１４７２−１４８１を参照のこと。したがって本発明のいくつかの実施形態は、筋ジストロフィーを調節する、改変する、治癒させる、阻害する、予防する、改善する、および／または処置するための方法ならびに組成物を提供する。
補体活性は、角膜の炎症にも寄与する場合がある。したがって本発明のいくつかの実施形態は、例えば、外科手術後に角膜の炎症を調節する、改変する、治癒させる、阻害する、予防する、改善する、および／または処置するための方法ならびに組成物を提供する。いくつかの実施形態においては、本発明の補体Ｂ因子アナログは点眼薬により、あるいは本明細書に記載する別の方法で投与される。
いくつかの実施形態においては、本発明の補体Ｂ因子アナログが、角膜血管新生を調節する、改変する、治癒させる、阻害する、予防する、改善する、および／または処置するために使用される。
本発明のいくつかの実施形態は、冠動脈もしくは末梢動脈のバイパス移植または血管形成術の後の薬効を高めるための方法を提供する。いくつかの実施形態においては、本発明の補体Ｂ因子タンパク質アナログ（例えば、ｈｆＢ３−２９２ＳまたはｈｆＢ３−２９２Ｓ−７４０Ｎ）をコードする本発明のベクターを使用して血管の細胞（例えば、内皮細胞）を形質導入する。いくつかの実施形態においては、血管の細胞が動物への移植の前に形質導入される。いくつかの実施形態においては、血管の細胞はインビボで形質導入される。
術後の患者の疼痛および苦痛および炎症を軽減することは、臨床医学において特に着目されている分野であり、特に、実施される外来患者の手術の件数が毎年増加している。本発明の補体Ｂ因子アナログは、例えば、補体活性を阻害することにより炎症を阻害するために利用することができる。したがって、補体Ｂ因子アナログは、例えば術後患者において炎症を軽減するために使用できる。いくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子アナログは、炎症を阻害しようとする手術部位に局所的に投与され（例えば、周術期送達）、これは一部の場合においては、疼痛および苦痛を軽減することになる。いくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子アナログは、溶液中で、例えば、生理学的電解質分散媒体中で投与される。いくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子アナログは、組成物を含有している灌注用溶液の手術部位への周術期送達により直接送達される。いくつかの実施形態においては、本発明の局所的周術期送達法が原因で、所望される治療効果は、他の送達方法（例えば、静脈内、筋肉内、皮下、および経口）を利用する場合に必要であるよりも低用量の薬剤を用いて達成される場合がある。いくつかの実施形態においては、周術期に使用される場合は、この溶液は手術部位の疼痛および／または炎症の臨床的に意味のある低下をもたらすことになり、これにより患者の術後の鎮痛剤（例えば、鎮静剤）の必要性の低下をもたらし、そして適切である場合には、患者が手術部位を早期に動かすことを可能にする。いくつかの実施形態においては、従来の灌注用液に対して本発明の溶液を使用するためには、外科医および手術室の担当者の役割に過剰な負担がかからないことが求められる。いくつかの実施形態においては、本発明の組成物は、関節鏡検査、心臓血管および一般的な血管の治療および診断の手順、泌尿器科の手順、一般的な外科的創傷および一般的な創傷に使用される（例えば、灌注用液中で）。本発明の組成物は、注射により（例えば、注射器による）、灌注用液により、創傷を被覆する包帯の一部として、または局所適用において、例えば、溶液剤、クリーム剤、ゲル剤などとして送達され得るが、これらに限定されるわけではない。
本発明のいくつかの実施形態においては、本発明の補体Ｂ因子アナログおよび／またはベクターは、補体Ｂ因子アナログおよび／またはベクターの投与前、それと同時、またはその後に補体阻害因子と組み合わせて投与される。補体阻害因子としては、Ｈ因子、Ｈ因子様１、ＭＣＰ、ＤＡＦ、またはＭＣＰの可溶性形態が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
本発明のいくつかの実施形態においては、本発明の補体Ｂ因子アナログおよび／またはベクターは抗血管新生因子と組み合わせて投与される。抗血管新生因子としては、エンドスタチン、ＶＥＧＦ結合分子、ＰＥＤＦ、Ｔ２−ＴｒｐＲＳ（例えば、米国特許第７，２７３，８４４号を参照のこと）、ｓＦＬＴ（例えば、Ｋｏｎｇら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ（１９９８）９：８２３−８３３を参照のこと）、アフリバーセプト（ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ）、ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ−ｅｙｅ、キニノスタチン、ラニビズマブ、およびベバシズマブが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
いくつかの実施形態においては、本発明の補体Ｂ因子アナロおよび／またはベクターは、ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）（ラニビズマブ）、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ）、ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ−ｅｙｅ、アフリバーセプト、あるいは、ＶＥＧＦに結合するおよび／または血管形成を阻害する分子（単数または複数）と組み合わせて投与される。ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）は湿性ＡＭＤを処置するために使用される。本発明のいくつかの実施形態はまた、湿性ＡＭＤを処置するためにも使用することができる。したがって本発明は、ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）（ラニビズマブ）、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ）、ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ−ｅｙｅ、アフリバーセプト、ならびに／あるいは、ＶＥＧＦに結合するおよび／または血管形成を阻害する分子（単数または複数）と組み合わせて本発明の組成物を別々に、あるいはそれらと一緒に投与することを含む、湿性ＡＭＤを処置するための方法ならびに組成物を提供する。さらに、眼内炎症は、ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）の投与後に報告されている最も一般的な有害反応の１つである。例えば、ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）についての「Ｆｕｌｌ Ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ」を参照のこと。本発明は、ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）、ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ−ｅｙｅ、またはアフリバーセプトの投与の前、それと同時、および／またはその後に本発明の分子または組成物を投与することを含む、眼内炎症（例えば、ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）の投与によって生じる）を阻害または低減するための方法を提供する。
本発明のいくつかの実施形態においては、本発明の補体Ｂ因子アナログまたはベクターは、Ｔ細胞の活性化、Ｂ細胞、ＴＮＦ、インターロイキン−１（例えば、インターロイキン−１ｂ）、インターロイキン−６、および／またはインターフェロン−γを阻害する化合物のような別の化合物（単数または複数）と組み合わせて投与される。本発明の補体Ｂ因子アナログまたはベクターはまた、補体活性、例えば、代替補体活性を阻害する化合物（単数または複数）と組み合わせて投与することもできる。使用することができるＴＮＦを阻害する化合物としては、抗体（例えば、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））、ゴリムマブ（ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標））、およびアダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標）））のような、ＴＮＦに結合する化合物、あるいは、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））のような、ＴＮＦに結合する可溶性受容体が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。使用することができ、Ｔ細胞の活性化を阻害する他の化合物としては、アバタセプト（ＯＲＥＮＣＩＡ（登録商標））のようなＢ７に結合する化合物が挙げられるがこれに限定されるわけではない。リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）およびＭＡＢＴＨＥＲＡ（登録商標））のようなＣＤ２０に結合する化合物を含むがこれらに限定されないＢ細胞をダウンレギュレートする化合物もまた使用することができる。
疾患に寄与している、および／または疾患を誘発する補体経路は、本発明の一部である様々な方法および／または補体Ｂ因子タンパク質アナログを使用してモジュレート、調節、阻害、および／または活性化することができる。
組成物、製剤、および調製物
本発明のいくつかの実施形態は、例えば、治療薬として使用されるような、本発明の補体Ｂ因子アナログを含有している組成物、例えば、薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態においては、薬学的組成物は、配列番号２のアミノ酸２６〜７６４、配列番号３のアミノ酸２６〜７６４、配列番号２２のアミノ酸２６〜９９０、または配列番号２３のアミノ酸２６〜９９０、例えば、ｈｆＢ３−２９２Ｓ（配列番号２）、ｈｆＢ３−２９２Ｓ−７４０Ｎ（配列番号３）、ｈｆＢ３−２９２Ｓ−Ｆｃ（配列番号２２）、またはｈｆＢ３−２９２Ｓ−７４０Ｎ−Ｆｃ（配列番号２３）を含有している補体Ｂ因子アナログを含む。いくつかの実施形態においては、薬学的組成物は、配列番号２のアミノ酸２６〜７６４、配列番号３のアミノ酸２６〜７６４、配列番号２２のアミノ酸２６〜９９０、または配列番号２３のアミノ酸２６〜９９０からなる補体Ｂ因子アナログを含有する。本発明の補体Ｂ因子アナログとともに使用することができる薬学的組成物および製剤の例は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０８／１０６６４４および米国特許公開番号ＵＳ２０１００１２０６６５に記載されている。
本発明のいくつかの実施形態は、本発明の補体Ｂ因子タンパク質アナログ、本発明の核酸、本発明のウイルスベクターまたはこれらの任意の組み合わせを含有している薬学的製剤を含む。
製剤（例えば、注射用）は一般的に、例えば、Ｈａｎｋ溶液またはＲｉｎｇｅｒ溶液を含有している有効成分の生体適合性溶液であるが、必ずしもそうではない。経皮または経粘膜投与のための製剤は一般的には、浸透剤（例えば、フシジン酸または胆汁酸塩）を界面活性剤または表面活性剤と組み合わせて含むが、これらに限定されるわけではない。いくつかの実施形態においては、製剤はエアロゾル、坐剤、またはパッチとして製造することができる。いくつかの実施形態においては、経口投与はタンパク質またはペプチドである有効成分について好ましくない場合がある。しかしこの型の組成物は、経口投与もまた利用できるように、消化酵素から保護されるべく、例えば、腸溶性コーティング形態において、デポー製剤において、カプセル剤においてなどで、適切に製剤され得る。本発明のいくつかの製剤はバランス塩溶液（Ａｌｃｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ，Ｔｅｘａｓ）またはバランス塩溶液プラス（Ａｌｃｏｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を含む。いくつかの実施形態においては、製剤は以下の１つ以上を含む：クエン酸塩、ＮａＣｌ（例えば０．６４％）、塩化カリウム（ＫＣｌ）（例えば、０．０７５％）、塩化カルシウム２水和物（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）（例えば、０．０４８％）、塩化マグネシウム６水和物（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）（例えば、０．０３％）、酢酸ナトリウム３水和物（ＣＨ３ＣＯ２Ｎａ・３Ｈ２Ｏ）（例えば、０．３９％）、クエン酸ナトリウム２水和物（Ｃ６Ｈ５Ｏ７Ｎａ３・２Ｈ２Ｏ）（例えば、０．１７％）、スクロース、ならびに水酸化ナトリウムおよび／または塩酸（ｐＨ調節用）、ならびに水。上記列挙には特定の水和物、例えば、２水和物、３水和物、６水和物などとして列挙されるいくつかの分子が含まれる。これらの化合物の様々な水和物を本発明において使用することができ、そして本発明は列挙した分子のこれらの特定の水和物形態に限定されないことが理解される。いくつかの実施形態においては、製剤は以下の１つ以上を含む：ＮａＣｌ、１塩基性リン酸塩１水和物、２塩基性リン酸ナトリウム７水和物、ならびにｐＨ調節用の塩酸および／または水酸化ナトリウム、ならびに水。いくつかの実施形態においては、薬学的組成物は、ヒスチジン、ＭｇＣｌ２、トレハロース、ポリソルベート、ポリソルベート２０、ＮａＣｌ、スクロース、アルギニン、およびプロリンからなる群より選択される少なくとも１つの成分を含む。いくつかの実施形態においては、製剤は、ヒスチジン（例えば、約１０ｍＭ）；α，α−トレハロース脱水物（例えば、約１０％または約５０ｍＭ）；ＭｇＣｌ２（例えば、約１０ｍＭ）；ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０（例えば、約０．０１％）；およびＮａＣｌ（例えば、約０．１％）のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態においては、製剤は、スクロース、アルギニン、またはプロリンのうちの１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態においては、製剤は、本発明の分子（単数または複数）、１０ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのトレハロースおよび０．０１％のポリソルベート２０を含むかまたはこれらからなる。いくつかの実施形態においては、製剤は、本発明の分子（単数または複数）、０．１％のＮａＣｌおよび１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含むかまたはこれらからなる。いくつかの実施形態においては、製剤は、本発明の分子（単数または複数）と、重炭酸塩、デキストロース、およびグルタチオンを多く含む平衡化された塩溶液（例えば、ＢＳＳ ＰＬＵＳ（登録商標））を含むか、あるいはこれらからなる。いくつかの実施形態においては、製剤はトレハロースを含まない。いくつかの実施形態においては、製剤または組成物は、約５．５のｐＨである。いくつかの実施形態においては、製剤または組成物は、有効成分（単数または複数）の生物学的活性および安定性を保持するために適切である限りは、約５．０〜９．０、約５．０〜５．５、約５．３〜５．７、約５．５〜６．０、約５．８〜６．２、約６．０〜６．５、約６．３〜６．７、約６．５〜７．０、約６．８〜７．２、約７．０〜７．５、約７．３〜７．７、約７．５〜８．０、約７．８〜８．２、約８．０〜８．５、約８．３〜８．７、および約８．５〜９．０のｐＨである。
本発明のいくつかの製剤は、エアロゾル、座薬、点眼薬、またはパッチとして製造できる。
所望される投与様式に適している製剤およびのための製剤方法の例は、最新版のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡおよび米国特許７，２０８，５７７号に見ることができる。
いくつかの実施形態においては、インビボで使用される組成物は「担体」または「薬学的に許容され得る担体」を含有する。用語「担体」は希釈剤、アジュバント、賦形剤、または媒体を意味し、これとともに目的のベクターが投与される。用語「担体」には、固体または液体のいずれかの物質が含まれるがこれらに限定されるわけではなく、これは無機であっても有機であってもよく、また、合成のものであっても天然起源のものであってもよく、被検体への投与を容易にするために、これとともに組成物の有効成分（単数または複数）が混合されるかまたは製剤される。
一般的には、適切な油脂（単数または複数）、生理食塩水、水性デキストロース（グルコース）、ならびに関連する糖溶液およびグリコール類（例えば、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）が、非経口溶液に典型的に適している担体である。いくつかの実施形態においては、非経口投与のための溶液は有効成分の水溶性の塩、適切な安定化剤、および所望されるかまたは必要である場合は、緩衝物質を含有する。抗酸化剤（例えば、重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、またはアスコルビン酸）が、単独で、または組み合わせにおいて、安定化剤として使用され得る。クエン酸およびその塩、ならびにＥＤＴＡナトリウムも同様に使用される。加えて、非経口溶液には、保存料（例えば、塩化ベンザルコニウム、メチル−またはプロピル−パラベン、およびクロロブタノール）が含まれ得る。
担体としては、炭水化物（例えばトレハロース、マンニトール、グルタチオン、キシリトール、スクロース、ラクトース、およびソルビトール）を挙げることができる。製剤中で使用される他の成分としては、例えば、ＤＰＰＣ（１，２−ジデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、およびＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）を挙げることができる。天然または合成の界面活性剤が使用される場合がある。ポリエチレングリコールが使用される場合がある（タンパク質を送達する場合のその使用とは別個に）。デキストラン（例えば、シクロデキストラン）が使用される場合がある。いくつかの実施形態においては、シクロデキストリン、第３級アミンおよび／またはβ−シクロデキストリンが使用される場合がある。胆汁酸塩および他の関連するエンハンサーが使用される場合がある。セルロースおよびセルロース誘導体が使用される場合がある。緩衝物質製剤における使用のようにアミノ酸が使用される場合がある。また、リポソーム、マイクロカプセルまたはマイクロスフェア、封入複合体、または他の型の担体の使用も意図される。
適切な薬学的賦形剤として、澱粉、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、抗生物質、保存料、麦芽、コメ、コムギ、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。所望される場合は、組成物にはまた、水和剤および／または乳化剤および／またはｐＨ緩衝剤も含めることができる。必要に応じて、組成物にはまた、可溶化剤および／または局所麻酔剤（例えば、リグノカイン）が、注射部位の疼痛を緩和するために含まれる場合がある。
本発明の薬剤またはタンパク質（またはその誘導体）の肺送達もまた本明細書中で意図される。いくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子アナログ（単数または複数）は、哺乳動物の肺に吸入しながら送達されて、大部分が肺の中に留まることができ、いくつかの実施形態においては、肺の上皮内層を横断して血流に到るように送達される（例えば、Ａｄｊｅｉら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７：５６５−５６９（１９９０）；Ａｄｊｅｉら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ６３：１３５−１４４（１９９０）；Ｂｒａｑｕｅｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １３（補遺５）：ｓ．１４３−１４６（１９８９）；Ｈｕｂｂａｒｄら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３：２０６−２１２（１９８９）；Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：１１４５−１１４６（１９８９）；Ｏｓｗｅｉｎら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ＩＩ，Ｋｅｙｓｔｏｎｅ，Ｃｏｌｏ．，Ｍａｒｃｈ，１９９０；Ｄｅｂｓら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４０：３４８２−３４８８（１９８８）およびＰｌａｔｚら、米国特許５，２８４，６５６号を参照のこと）。治療用製品の肺送達のために設計された広範な種類の機械装置（ネブライザー、計量吸入器、および粉末吸入器を含むがこれらに限定されるわけではない）は、本発明の実施における使用が意図される。本発明のいくつかの実施形態の実施に適している市販されている装置のいくつかの具体例は、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．により製造されたＵＬＴＲＡＶＥＮＴ（商標）ネブライザー；Ｍａｒｑｕｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ，Ｃｏｌｏ．により製造されたＡＣＯＲＮ ＩＩ（登録商標）ネブライザー；Ｇｌａｘｏ Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，Ｎ．Ｃ．により製造されたＶＥＮＴＯＬＩＮ計量吸入器；およびＦｉｓｏｎｓ Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓにより製造されたＳＰＩＮＨＡＬＥＲ粉末吸入器である。
いくつかの実施形態においては、タンパク質が粒状形態に調製される。いくつかの実施形態においては、この粒状形態は遠位の肺への送達のために１０μｍ（またはミクロン）未満、最も好ましくは０．５〜５μｍの平均粒径を有する。
ネブライザー（例えば、ジェットまたは超音波）とともに使用するために適している製剤は典型的には、水中に溶解させられた補体Ｂ因子アナログを、いくつかの実施形態においては、溶液１ｍＬ当たり約０．１〜約２５ｍｇの生物学的に活性なタンパク質の濃度で含む。製剤にはまた、緩衝液および／または単糖（例えば、タンパク質の安定化および浸透圧の調節のため）が含まれる場合がある。ネブライザー製剤にはまた、エアロゾルを形成する際の溶液の霧状化により起こるタンパク質（単数または複数）の表面で誘導される凝集を減らすまたは防ぐために、界面活性剤が含まれる場合がある。
計量吸入装置とともに使用される製剤は一般的に、例えば、界面活性剤の助けを借りて高圧ガス中に懸濁した本発明の補体Ｂ因子アナログを含有している微粉末を含む。高圧ガスはこの目的のために利用される任意の従来物質、例えば、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、または炭化水素（トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、および１，１，１，２−テトラフルオロエタン）、またはこれらの組み合わせであり得る。適切な界面活性剤としてソルビタントリオレエートおよび大豆レシチンが挙げられる。オレイン酸はまた、界面活性剤としても有用である場合がある。いくつかの実施形態においては、粉末吸入装置から分散させるための製剤に、本発明の補体Ｂ因子アナログを含有している乾燥微粉末が含まれ、増量剤（例えば、ラクトース、ソルビトール、スクロース、マンニトール、トレハロース、またはキシリトール）もまた、装置からの粉末の分散を容易にする量、例えば、製剤の５０〜９０重量％で含まれる場合がある。
投与および送達
補体Ｂ因子タンパク質アナログをコードする核酸の導入または投与について議論される場合は、本発明が補体Ｂ因子タンパク質アナログ自体の導入または投与も意図することが理解される。補体Ｂ因子アナログの導入について議論される場合は、本発明が補体Ｂ因子タンパク質アナログをコードする核酸の導入もまた意図することが理解される。
いくつかの実施形態においては、本発明の補体Ｂ因子アナログまたは組成物は局所的または全身に投与することができる。有用な投与経路を本明細書に記載し、そしてこれらは当該分野で公知である。導入または投与の方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、気管内、局所、吸入、経皮、直腸、非経口経路、硬膜外、頭蓋内、脳内、脳室内、硬膜下、動脈内、髄腔内、心臓内、冠動脈内、硝子体内、網膜下、前眼房内、特に、角膜上に局所的に、結膜下、テノン下注射、点眼薬の適用による、経口経路、バルーンカテーテルによる、ステントによる、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。いくつかの実施形態においては、本発明の組成物または補体Ｂ因子アナログは、例えば、ドルーゼンへの直接の注射により、ドルーゼンに投与される。全身投与は、静脈内または動脈内注射によるか、あるいは経粘膜、皮下、および／または経皮送達によって行われ得るが、これらに限定されるわけではない。いくつかの実施形態においては、本発明の組成物は、最初は罹患部位以外の部位に向けられ得る。例えば、動物の肺において起こるＡＨＲに関しては、本発明のタンパク質、ベクター、または核酸の腹腔内注射が肺のＡＨＲの変化を生じる場合がある。例えば、Ｐａｒｋら、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １６９：７２６−７３２，（２００４）を参照のこと。いくつかの実施形態においては、組成物の用量レベルおよび／または投与様式は組成物の性質、治療すべき状態（単数または複数）の性質、および／または個々の患者の病歴に応じたものとなり得る。いくつかの実施形態においては、本発明の補体Ｂ因子アナログを発現する細胞が投与される。これらの細胞は、異種、同種異系、または自系の細胞株であり得る。
例えば眼への投与を含むいくつかの実施形態においては、本発明の補体Ｂ因子タンパク質アナログまたはベクターは、約１週間、１か月、２か月、３か月、６か月、９か月、１年、１８か月、２年、３０か月、３年、５年、１０年に１回、または必要に応じて投与される。例えば眼への投与を含むいくつかの実施形態においては、本発明の分子またはベクターは、約１〜４週毎、約４〜８週毎、約１〜４か月毎、約３〜６か月毎、約４〜８か月毎、約６〜１２か月毎、約９〜１５か月毎、約１２〜１８か月毎、約１５〜２１か月毎、約１８〜２４か月毎、約１〜２年毎、約１．５〜３年毎、約２〜４年毎、約３〜５年毎、約５〜７年毎、約７〜１０年毎、または約１０〜２０年毎に投与される。補体Ｂ因子タンパク質アナログをコードするベクターの投与は、補体Ｂ因子タンパク質アナログの投与よりも少ない頻度であると予想される。本発明のいくつかの実施形態においては、薬学的製剤に本発明の補体Ｂ因子アナログをコードするベクターが含まれ、この薬学的製剤がわずかに１度、患者に投与される。
例えば眼への投与を含むいくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子アナログをコードするベクターが患者に対して、その生涯において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回、またはそれより多い回数投与される。例えば眼への投与を含むいくつかの実施形態においては、本発明のレンチウイルスベクターが患者に対して、その生涯において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回、またはそれより多い回数投与される。
いくつかの実施形態においては、本発明の補体Ｂ因子タンパク質アナログは、硝子体内注射によってヒトの眼に投与される。いくつかの実施形態においては、約１５μｇ〜約５ｍｇ；約１５μｇ〜約５００μｇ；約１００μｇ〜約９００μｇ；約３００μｇ〜約７００μｇ；約５００μｇ〜約１ｍｇ；約１ｍｇ〜約５ｍｇ；約１ｍｇ；または約５００μｇの補体Ｂ因子タンパク質アナログが、硝子体内注射によってヒトの眼に投与される。
いくつかの実施形態においては、本発明の補体Ｂ因子タンパク質アナログは、レンチウイルスもしくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの網膜下注射または硝子体内注射によって投与される。いくつかの実施形態においては、約５×１０６〜約５×１０８；約５×１０６〜約５×１０７；約５×１０７〜約５×１０８；約１×１０７〜約１×１０８；約３×１０７〜約５×１０７；約２．５×１０７；約５×１０７；約７．５×１０７；または約１×１０８形質導入単位のレンチウイルスベクターが網膜下注射によって投与される。いくつかの実施形態においては、約５×１０８〜約１×１０９；約５×１０８〜約７．５×１０８；約７．５×１０８〜約１×１０９；約６×１０８〜約９×１０８；約７×１０８〜約８×１０８；約５×１０８；約６×１０８；約７×１０８；約８×１０８；約９×１０８；または約１×１０９形質導入単位のＡＡＶベクターが網膜下注射によって投与される。
いくつかの実施形態においては、約５×１０８〜約１×１０１０；約５×１０８〜約５×１０９；約５×１０８〜約２×１０９；約２×１０９〜約５×１０９；約５×１０９〜約１×１０１０；約５×１０８〜約１×１０９；約１×１０９〜約３×１０９；約３×１０９〜約６×１０９；約６×１０９〜約１×１０１０；または約１×１０９〜約１×１０１０形質導入単位のＡＡＶベクターが硝子体内注射によって投与される。
いくつかの実施形態においては、約５０μｌ〜約１００μｌ、約５０μｌ〜約７５μｌ、約７５μｌ〜約１００μｌ、約６０μｌ〜約９０μｌ、約７０μｌ〜約８０μｌ、約５０μｌ；約６０μｌ；約７０μｌ；約８０μｌ；約９０μｌ；または約１００μｌの補体Ｂ因子タンパク質アナログあるいは補体Ｂ因子タンパク質アナログをコードするベクターが網膜下に注射される。いくつかの実施形態においては、約５０μｌ〜約１ｍｌ、約５０μｌ〜約５００μｌ、約５００μｌ〜約１ｍｌ、約２５０μｌ〜約７５０μｌ、約２５０μｌ〜約５００μｌ、約５００μｌ〜約７５０μｌ、約４００μｌ〜約６００μｌ、または約７５０μｌ〜約１ｍｌの補体Ｂ因子タンパク質アナログあるいは補体Ｂ因子タンパク質アナログをコードするベクターが硝子体に注射される。
いくつかの実施形態においては、抗炎症剤は、本発明の補体Ｂ因子タンパク質アナログ（例えば、ｈｆＢ３−２９２ＳまたはｈｆＢ３−２９２Ｓ−７４０Ｎ）、ベクター、または核酸と組み合わせて送達される場合がある。抗炎症剤は、本発明の分子またはベクターの投与の前、それと同時、および／またはその後に送達され得る。いくつかの実施形態においては、抗炎症剤は本発明の補体Ｂ因子タンパク質アナログ、核酸、またはベクターと同じ溶液および／または同じ注射器中で投与される。いくつかの実施形態においては、本発明の補体Ｂ因子タンパク質アナログまたはベクターと抗炎症剤が、例えば本明細書に記載するように眼に同時投与される。
多くの抗炎症剤が当該分野で公知であり、デキサメタゾン、デキサメタゾンナトリウムメタスルホベンゾエート、デキサメタゾンナトリウムホスフェート、フルオロメトロン、ブロムフェナク、プラノプロフェン、ＲＥＳＴＡＳＩＳ（商標）、シクロスポリン眼科用乳液、ナプロキセン、糖質コルチコイド、ケトロラック、イブプロフェン、トルメチン、非ステロイド系抗炎症剤、ステロイド系抗炎症剤、ジクロフェナク、フルルビプロフェン、インドメタシン、およびスプロフェンが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
本発明のいくつかの実施形態は、補体Ｂ因子タンパク質アナログおよびそれをコードするベクターの両方の投与を含む。本発明の補体Ｂ因子タンパク質アナログは、本発明のベクターの投与前、それと同時、および／またはその後に送達され得る。いくつかの実施形態においては、本発明の補体Ｂ因子タンパク質アナログは、本発明のベクターと同じ溶液および／または同じ注射器中で投与される。いくつかの実施形態においては、本発明の補体Ｂ因子タンパク質アナログと本発明のベクターが、例えば本明細書に記載するように眼に同時投与される。
さらに、補体Ｂ因子アナログまたはそれをコードする核酸は、例えば細胞療法として、細胞を介して動物に送達または投与することができる。例えば、これは補体Ｂ因子アナログ（単数または複数）を発現する細胞（単数または複数）を投与または送達することにより達成することができる。いくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子アナログ（単数または複数）は、調節可能な、誘導可能な、および／または抑制可能なプロモーターにより細胞から発現させられる。いくつかの実施形態においては、補体Ｂ因子アナログ（単数または複数）を発現するカプセル化された細胞が動物に送達される。例えば、カプセル化された細胞に関するＰＣＴ公開番号ＷＯ０７０７８９２２を参照のこと。いくつかの実施形態においては、細胞は局所に（例えば、関節内、硝子体内、網膜内、頭蓋内など）、または全身に（例えば、ｉ．ｖ．）投与される。
動物に投与される細胞は、自系、同種異系、または異種であり得る。いくつかの実施形態においては、自系細胞が、それらが本発明の補体Ｂ因子タンパク質アナログの生産を生じるようにエキソビボで操作され、いくつかの実施形態においては、細胞が動物に導入されて戻される。コード領域を含む核酸のエキソビボでの細胞への転移は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、染色体媒介遺伝子転移、マイクロ細胞媒介遺伝子転移、スフェロプラスト融合、リポフェクション、マイクロパーティクルボンバードメント、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ウイルス感染などのような任意の方法により行うことができる。任意に、選択マーカーもまた細胞内に導入することができる。選択マーカーが利用される場合は、細胞をその後、例えば発現を増強するため、および／または転移されたコード領域を発現するそのような細胞を単離するための選択下に置くことができる（例えば、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ ＆ Ｂｅｈｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８（１９９３）；Ｃｏｈｅｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４（１９９３）；およびＣｌｉｎｅ，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２（１９８５）を参照のこと）。
組み換え細胞（例えば、インビトロで形質導入された自系または同種異系の細胞）を当該分野で公知の様々な方法により患者に送達することができる。例えば、当該分野で公知であるように、細胞を投与の前にカプセル化することができる。いくつかの実施形態においては、カプセル化する場合は細胞は自系ではない。いくつかの実施形態においては、組み換え体である血球（例えば、造血幹細胞および／または前駆細胞）が静脈内投与される。いくつかの実施形態においては、眼細胞および／または多分化能細胞を目に直接注射することができる。必要な細胞の量は所望される作用、動物の状態などに依存する。
本発明のいくつかの実施形態においては、遺伝子送達系は、標的細胞への補体Ｂ因子アナログの遺伝子またはコード領域の形質導入および／あるいは安定な組み込みを生じることができる。いくつかの実施形態においては、標的細胞は哺乳動物細胞、例えば、霊長類細胞およびヒト細胞である。いくつかの実施形態においては、標的細胞は眼の細胞、例えば、網膜色素上皮細胞、網膜細胞、または多分化能細胞である。標的細胞はインビトロ、エキソビボ、またはインビボであり得る。いくつかの実施形態においては、標的細胞は幹細胞である。幹細胞として、多分化能幹細胞、全能性幹細胞、造血幹細胞、癌幹細胞、および胚性幹細胞が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの実施形態においては、本明細書中で意図される多分化能細胞は接合体または分割球からの生存実体の増殖のためのものではない。本発明はまた、例えば眼の細胞を再生させるための処置を必要とする患者の眼への移植のための部分的に未分化である細胞の使用も意図する。
トランスジェニック動物
本発明のいくつかの実施形態は、本発明の補体Ｂ因子アナログを発現するトランスジェニック動物（例えば、非ヒト）を提供する。トランスジェニック動物を作製するための方法は当該分野で公知である。いくつかの実施形態においては、トランスジェニック動物（例えば、マウス）はまた、Ｆａｓ遺伝子中に変異、欠失または断裂を含む。例えば、Ｍａｃｍｉｃｋｉｎｇら、Ｃｅｌｌ．８１：６４１−６５０（１９９５）を参照のこと。
本発明を以下の実施例を参照しながらここに記載する。これらの実施例は説明の目的のためだけに提供され、本発明はこれらの実施例に限定されるものとは決して解釈されるべきではなく、むしろ本明細書中に提供する教示の結果として明らかになる任意の全てのバリエーションを含むと解釈されるべきである。
説明する目的のために本発明の特定の実施形態を本明細書中に記載しているが、詳細についての多数のバリエーションが添付の特許請求の範囲に記載するような本発明から逸脱することなく行われ得ることが当業者に理解されるものとする。
実施例１．ｈｆＢ３発現構築物の作製
ヒトｈｆＢ３のコード配列をＩＲＥＳ−Ｎｅｏ選択マーカーとともに含むプラスミドを設計した（ｈｆＢ３−ＩＲＥＳ−Ｎｅｏ）。このプラスミドはＧＥＮＥＡＲＴ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｐｌａｓｍｉｄ）により合成され、業務受託機関に個別に支払った。Ｎｈｅ Ｉ制限酵素部位をコード配列の５’末端および３’末端の両方に組み込んだ。ｈｆＢ３核酸コード配列を、哺乳動物細胞中での最適な発現のためにコドン最適化した。
遺伝子発現プラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を修飾した。最初に、ＢＧＨ（ウシ生長ホルモン）ポリＡをｐＣＩから除去し、合成のポリＡで置き換えた。次に、選択マーカーを持つｈｆＢ３コード配列（ｈｆＢ３−ＩＲＥＳ−Ｎｅｏ）をプラスミドからＮｈｅ Ｉによって切り出し、修飾したｐＣＩのＳａｌ Ｉ部位に平滑末端ライゲーションとしてクローニングしてｈｆＢ３発現構築物を作製した。このプラスミドをその全体において配列決定して、この構築物の配列完全性を確認した（配列番号５）。
実施例２．ｈｆＢ３−２９２Ｓ発現構築物の作製
さらなる修飾をｈｆＢ３タンパク質に導入した。ヒト野生型Ｂ因子タンパク質およびｈｆＢ３タンパク質は２３個のシステインアミノ酸（Ｃ）を有しており、このことはタンパク質中に少なくとも１つの対合しない遊離のシステインが存在することを示唆している。ジスルフィド結合マッピングは、生物学的に活性なｈｆＢ３中の遊離のＣがアミノ酸２９２に位置していることを示唆した。２９２位のＣは様々な種のＢ因子タンパク質の間で高度に保存されている（表１、上記）。本実施例では、この２９２位のＣをセリン（Ｓ）に変化させてｈｆＢ３−２９２Ｓを作製する。
ｈｆＢ３−２９２Ｓ発現構築物を作製するために、部位特異的変異をｈｆＢ３発現構築物に導入した（配列番号５）。
ｈｆＢ３発現構築物を鋳型として使用して、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅの部位特異的変異誘発キットを製造業者の説明書にしたがって利用して２９２位のＣをＳに変化させる部位変異を作製し、ｈｆＢ３−２９２Ｓ発現構築物を作製した。２つのプライマーを使用した：
下線を付けたヌクレオチドはＣからＳに変異させたアミノ酸を示す。ｈｆＢ３−２９２Ｓ発現カセットは、５’から３’の方向に、ＣＭＶプロモーター、キメライントロン、コドン最適化したｈｆＢ３−２９２Ｓのコード配列、ＩＲＥＳ−Ｎｅｏ選択マーカー、および合成ポリＡを含む（図２）。構築物全体を配列決定して、変異と構築物の完全性を確認した（配列番号８）。ｈｆＢ３−２９２Ｓについて予想したアミノ酸配列を配列番号２に示す。
実施例３．安定なｈｆＢ３発現細胞株およびｈｆＢ３−２９２Ｓ発現細胞株の作製
ｈｆＢ３タンパク質またはｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質を発現する安定な細胞株を、２９３ ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号Ｒ７９００７）にｈｆＢ３発現構築物またはｈｆＢ３−２９２Ｓ発現構築物をトランスフェクトすることにより作製した。プラスミドＤＮＡの２９３ ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ細胞へのトランスフェクションは、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号２３９６６）に基づくトランスフェクションにより媒介された。１ｍｇ／ｍＬの最終濃度のＰＥＩ溶液を滅菌水中に調製した。ｐＨを５ＮのＨＣｌで７．０に調整した。この溶液を０．２２μｍの濾紙を使用して滅菌した。ＰＥＩのアリコートを使用するまで−８０℃で凍結保存した。
トランスフェクションプロトコールは以下の通りとした：
トランスフェクションの１日前に、細胞を無血清２９３Ｆ発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号１２３３８−０１８）中に１×１０６細胞／ｍＬで播種した。
翌日、細胞を、ＨＴ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（カタログ番号１１０６７−０３０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）だけを補充した基本ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号２２４００−０８９）で洗浄し、同じ培地中に２×１０６細胞／ｍＬで再懸濁し、新しい６ウェルプレートに、各ウェル中に１ｍＬで分注した。
ＤＮＡおよびＰＥＩのストック溶液を以下のように滅菌の１５０ｍＭのＮａＣｌ中に調製した：２．５μｇのｈｆＢ３またはｈｆＢ３−２９２Ｓ発現構築物ＤＮＡ（２．５μＬ中）を４７．５μＬの１５０ｍＭ ＮａＣｌ中に希釈し、ピペッティングにより混合した（ＤＮＡ溶液）。１０マイクロリットル（１０μＬ）のＰＥＩ溶液を４０μＬの１５０ｍＭ ＮａＣｌ中に希釈し、続いて静かにボルテックスした（ＰＥＩ溶液）。このＤＮＡ溶液とＰＥＩ溶液を室温で５分間インキュベートした。次に、ＰＥＩ溶液をＤＮＡ溶液に添加し、この混合液を室温でさらに１０分間インキュベートし、その後、ＤＮＡ／ＰＥＩ混合液を６−ウェルプレート中の細胞に添加し、細胞を８％のＣＯ２および８５％の湿度のインキュベーターの中で３７℃で５時間、撹拌（２００ＲＰＭ）しながらインキュベートした。５時間後、１．１ｍＬの完全２９３Ｆ発現培地（添加物なし）を各ウェルに添加し、インキュベーションを７２時間継続した。
その後、細胞を回収し、２９３Ｆ発現培地で１回洗浄し、３００μｇ／ｍＬのＧ４１８（Ｔｅｋｎｏｖａ）を含有している新鮮な２９３Ｆ発現培地に入れた。陰性対照として、同数のトランスフェクトしていない２９３Ｆネイティブ細胞を同じＧ４１８含有培地中で培養した。細胞をＧ４１８選択下におよそ３週間置いておいた。この時点で、Ｇ４１８含有培地中のトランスフェクトされていない細胞は死滅した。トランスフェクトされた細胞は、Ｇ４１８耐性である生存している集団から死滅したまたは死滅しつつある細胞を取り除くためのＦＩＣＯＬ勾配（Ｓｉｇｍａ）を通り抜けた。Ｇ４１８耐性である生存している集団を約２週間さらに増殖させ、その間、２〜３日毎に細胞をスピンダウンさせ、３００μｇ／ｍＬのＧ４１８を含有している新鮮な２９３発現培地中に再懸濁した。
実施例４．ｈｆＢ３およびｈｆＢ３−２９２Ｓの生産
Ｇ４１８耐性であるｈｆＢ３またはｈｆＢ３−２９２Ｓ生産細胞を、各ウェルに２ｍＬの培地を含む６−ウェルプレート中、各フラスコの中に１００ｍＬの培地を含む５００ｍＬのスピナーフラスコ中、または各フラスコの中に１，０００ｍＬの培地を含む３，０００ｍＬのスピナーフラスコ中のいずれかにおいて、２９３Ｆ発現培地中に２×１０６細胞／ｍＬの密度で播種した。細胞を、８％のＣＯ２および８０％の湿度の３７℃のインキュベーター中で、オービタルシェーカー上で１００ｒｐｍで振盪させながら７２時間インキュベートした。
次に、ｈｆＢ３タンパク質またはｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質を含有している細胞培養培地上清を回収し、２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞の破片を取り除き、その後、培養培地を０．２２μｍの濾紙を通過させて濾過した。
実施例５．ｈｆＢ３タンパク質およびｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質の定量
標準としてヒト野生型Ｂ因子を用いる電気化学発光試験（ＥＣＬ）を、ｈｆＢ３およびｈｆＢ３−２９２Ｓの定量のために開発した。この試験はＢｉｏＶｅｒｉｓのＥＣＬ技術に基づくサンドイッチ免疫測定法であった。簡単に説明すると、ＥＣＬ試験は、９６ウェルプレートサンドイッチである、１工程の、そして洗浄を行わない試験として様式化される。品質管理試料（ヒト血漿から精製されたＢ因子、Ｑｕｉｄｅｌ，カタログ番号Ａ４０８）と試験試料を、ビオチニル化抗ｈｆＢモノクローナル抗体（抗ヒトＢ因子モノクローナル抗体、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号ＭＡＢ２７３９）、ＢＶ−ＴＡＧ＋標識化抗ｈｆＢポリクローナル抗体（抗ヒトＢ因子ポリクローナル抗体、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号ＡＦ２７３９）を含有しているマスターミックス試薬とストレプトアビジンがコーティングされた常磁性ビーズとともにインキュベートした。この混合物を１５０分間インキュベートした。インキュベーション後、停止溶液（５００ｍＭの塩化ナトリウムおよび１．６ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有しているホウ酸塩緩衝液、２５０ｍＭ、ｐＨ９．２）を添加し、次にプレートをＭ１ＭＲ分析器で読み取った。この試験について推定したダイナミックレンジは９．０〜９５０ｎｇ／ｍＬであった。
実施例６．ｈｆＢ３およびｈｆＢ３−２９２Ｓについてのウェスタンブロット分析
変性（ｄｅｎｔｕｒｉｎｇ）であるが非還元性の条件下でのｈｆＢ３タンパク質およびｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質のポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を、ｈｆＢ３タンパク質またはｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質の試料を非還元性のタンパク質試料緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）と混合することにより行った。血漿から精製されたヒトＢ因子タンパク質（試料あたり１００ｎｇ、Ｑｕｉｄｅｌ）を陽性対照として使用した。各ゲルにはまた、予め染色されたタンパク質分子量マーカー（１５μＬ／レーン）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むウェルも含めた。試料とマーカーを、非還元性タンパク質試料緩衝液中で９５℃で５分間加熱した。試料を７．５％のＴｒｉｓ−ＨＣＬ Ｐｒｅｃａｓｔミニゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上にロードした。このゲルを７５Ｖで１５分間、または色素が濃縮用ゲルの前面を通過して分離ゲルに入るまで泳動させた（１０×ＳＤＳ／Ｔｒｉｓ／グリシンランニングバッファー、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）。色素の前面が分離ゲルに入ったら、電圧を１００Ｖまで高め、色素の前面がゲルから出てしまうまで電気泳動を継続した。
ウェスタンブロット分析を、静かに揺らしながら２０分間、トランスファーバッファー（１０×Ｔｒｉｓ／グリシントランスファーバッファー、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中でゲルを洗浄し、平衡化させることにより行った。ニトロセルロースメンブレン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）および吸い取り紙もまた、トランスファーバッファー中で平衡化させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離したタンパク質を、Ｔｒａｎｓ Ｂｌｏｔ Ｓｅｍｉ−Ｄｒｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｃｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してニトロセルロース上に電気泳動により移動させた（２０Ｖで４５分間）。移動が完了したら、メンブレンを、振盪機上で静かに撹拌しながら室温で少なくとも１時間、１×カゼイン溶液（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でブロックした。メンブレンを、１×カゼイン溶液中に１：１０，０００に希釈した一次抗体（ヒトＢ因子に対するモノクローナル抗体、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号ＭＡＢ２７３９）で、静かに撹拌しながら室温で１時間プローブし、１０ｍＬの１×カゼイン溶液中で５分間を３回、それぞれ振盪機上で静かに撹拌しながら室温で洗浄した。メンブレンを、１×カゼイン溶液中に１：２０，０００に希釈したビオチニル化ヤギ抗マウスＩｇＧ（二次抗体、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号ＢＡＦ００７）とともに、振盪機上で静かに撹拌しながら室温で１時間インキュベートし、１０ｍＬの１×カゼイン溶液中で５分間を３回、それぞれ室温で静かに撹拌しながら洗浄した。このメンブレンを、４０μＬの試薬Ａおよび４０μＬの試薬Ｂを含有している２０ｍＬの１×カゼイン溶液中で４５分間、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ−ＡｍＰ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中でインキュベートした。このメンブレンを１０ｍＬの１×カゼイン溶液中で５分間を３回、それぞれ室温で静かに撹拌しながら洗浄した。
ウェスタンブロットから化学発光シグナルを獲得するために、メンブレンを２０ｍＬの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．５）中で５分間、撹拌せずに平衡化させた。過剰量の緩衝液を、メンブレンを垂直に保ち、メンブレンの縁をＫｉｍｗｉｐｅに触れさせることによりメンブレンから除去した。メンブレンの標的側を表面を上に向けて新しい容器の中においた。Ｄｕｏｌｏｘ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（７ｍＬ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、暗所で５分間インキュベートしたメンブレンの標的側の上に直接おいた。過剰量のＤｕｏｌｏｘを、メンブレンを垂直に保ち、メンブレンの縁をＫｉｍｗｉｐｅに触れさせることによりメンブレンから除去した。メンブレンを、暗所で撹拌しながらこれを２０ｍＬの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．５）中に５分間沈めることにより洗浄した。過剰量の緩衝液を、メンブレンを垂直に保ち、メンブレンの縁をＫｉｍｗｉｐｅに触れさせることによりメンブレンから除去した。このメンブレンを折り畳んだプラスチックラップシートの中に置き、フィルムカセットの中でＫｏｄａｋ ＢｉｏＭａｘ ＭＳ Ｘ線フィルムに１〜５分間感光させた。フィルムをＫｏｄａｋ現像液（９２ｍＬのｄｄＨ２Ｏ中に２６ｍＬのこの現像液を希釈する）の中に１分間置いた。フィルムを現像液から取り出し、Ｋｏｄａｋ定着液（９２ｍＬのｄｄＨ２Ｏ中に２６ｍＬのこの定着液を希釈する）の中に１分間置いた。最後に、フィルムを水道水で濯ぎ、室温で乾燥させた。
図３に示すように、Ｇ４１８耐性ｈｆＢ３生産細胞およびＧ４１８耐性ｈｆＢ３−２９２Ｓ生産細胞は、細胞培養培地中で、適切な大きさ（およそ１００ＫＤａ）のｈｆＢ３タンパク質（レーン３）およびｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質（レーン４）を生産した。これらのタンパク質は、ヒト血漿から精製された野生型ヒトＢ因子とほぼ同じ速度で移動した（レーン２）。可視バンドはトランスフェクトされていない細胞培養培地（陰性対照）中では検出されず、これはモノクローナル抗ヒトＢ因子抗体の特異性を示している（レーン１）。興味深いことに、推定したおよそ２００〜２６０ＫＤａの凝集物はｈｆＢ３試料中では容易に検出されたが（レーン３）、同じ実験条件下で生産させたｈｆＢ３−２９２Ｓ試料中では凝集物は検出されなかった（レーン４）。凝集は、細胞培養培地中の誤って折り畳まれたｈｆＢ３の集団によって引き起こされた可能性がある。タンパク質が誤って折り畳まれると、これらは疎水性−疎水性相互作用により凝集物を形成する傾向がある疎水性領域を露出することになる。これらのデータは、ｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質の調製において、ｈｆＢ３タンパク質と比較して誤った折り畳みが排除されたかまたは有意に減少したかのいずれかであったことを示唆している。
実施例７．代替補体経路の溶血活性試験
ヒト代替補体経路の活性は、この実施例に記載するように溶血試験を使用して測定することができる。
１ミリリットル（１ｍＬ）のウサギ赤血球（ｒＲＢＣ）（Ｌａｍｐｉｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，カタログ番号７２４６４０８）懸濁液を新しく作製した冷却したＭｇ２＋−ＥＧＴＡ緩衝液で洗浄した。赤血球を５０ｍＬの円錐形の遠心分離管に移し、３０ｍＬのＭｇ２＋−ＥＧＴＡ緩衝液を添加し、細胞を静かに混合した。ｒＲＢＣを４℃、１，２００ｒｐｍでブレーキをかけずに５分間、Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｌｌｅｇｒａ ６ＫＲ遠心分離機においてペレット化させ、Ｍｇ２＋−ＥＧＴＡ緩衝液中に再懸濁した。この洗浄工程を２回繰り返した。ｒＲＢＣを２ｍＬの氷冷したＭｇ２＋−ＥＧＴＡ緩衝液中に再懸濁し、細胞数を血球計を使用して求めた。
溶血活性反応混合物を、氷上に置いたＶ底９６ウェルプレートの中にセットした。ｈｆＢ３タンパク質またはｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質が野生型ヒトＢ因子タンパク質と競合し、その溶血活性を阻害することができるかどうかを決定するために、競合試験を、５００ｎｇの野生型ヒトＢ因子、漸増量のｈｆＢ３タンパク質またはｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質、およびＧＶＢ＋＋緩衝液（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ６４１５）を含む４０μＬの全容量の中にセットした。Ｍｇ２＋−ＥＧＴＡ緩衝液で２５倍に希釈した５０マイクロリットル（５０μＬ）のＢ因子枯渇ヒト血清を各ウェルに添加し、続いて１０μＬの、Ｍｇ２＋−ＥＧＴＡで洗浄した５×１０７のｒＲＢＣを添加した。ｒＲＢＣの添加後、各試料を、マルチチャンネルピペットを使用して９６ウェルプレートの中で静かに混合した。
９６ウェルプレートを、３７℃の水の層を含むガラストレイの中に置き、プレートの底に沈めた。次に、このトレイを３７℃の水浴の中に置き、１１０ｒｐｍで４０分間オービタルシェーキングした。インキュベーション後、プレートを氷上に置き、１５０μＬの氷冷した０．９％の生理食塩水を各ウェルに添加し、各反応をピペッティングによって静かに混合して反応を停止させた。９６ウェルプレートを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５８１０Ｒ遠心分離機においてブレーキをかけずに２，０００ｒｐｍで４℃で５分間（ｍｉｎ）、遠心分離して、ｒＲＢＣをプレートの底にペレット化させた。上清（１８０μＬ）を、ペレットを乱さずに各ウェルから除去し、新しい９６ウェルプレートの対応するウェルに移動させた。各試料の吸光度をマイクロプレートリーダーにおいて４０５ｎｍで測定した。
実施例８．ｈｆＢ３およびｈｆＢ３−２９２Ｓの生物学的活性
ｈｆＢ３タンパク質およびｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質の生物学的活性を、代替補体経路に媒介されるｒＲＢＣの溶血を測定することにより試験した。実施例７に記載した試験を使用して、ヒト代替補体経路の阻害におけるｈｆＢ３タンパク質またはｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質の効力を試験した。各反応を３連で行った。図４に示すように、ｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質生産細胞およびｈｆＢ３タンパク質生産細胞由来の未精製の細胞培養培地は、用量依存性の様式で代替補体経路の活性を効率よく阻害した／低下させた。理論に縛られることは望ましくないが、ｈｆＢ３タンパク質およびｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質は、野生型Ｂ因子タンパク質と競合する、ならびに／あるいはＣ３ｂおよび／または補体Ｄ因子を捕捉することにより、代替補体経路の活性を阻害することができる。
実施例９．ｈｆＢ３タンパク質およびｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質の精製
トランスフェクトされた、ｈｆＢ３タンパク質またはｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質を安定的に発現し、分泌するヒト２９３ ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ細胞株由来の細胞培養培地をｈｆＢ３タンパク質またはｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質の精製のための出発材料として使用した。可溶性の分泌されたｈｆＢ３またはｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質を、ＧＥ ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒを使用して、捕捉工程、中間精製工程、および研磨工程についてそれぞれ、陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー、疎水性相互作用（ＨＩＣ）クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の組み合わせにより細胞培養物上清から精製した。２つの精製のスキームを以下に記載する。これらの２つのスキームは、一方が１つのＨＩＣクロマトグラフィー工程を使用し、他方がＨＩＣクロマトグラフィーを２工程を使用する点で異なる。
ｈｆＢ３タンパク質を含有している細胞培養物上清を、伝導性をセンチメートルあたり約８ミリシーメンス（ｍＳ／ｃｍ）に下げるために培養上清／水の４：１の容量比で蒸留水で希釈し、５０ｍＭのリン酸塩緩衝液でｐＨ７．５に調整した。この物質を、１分あたり３０ｍＬの流速でＰ−９６０ポンプを使用して、ＡＫＴＡ清浄機上の予め充填したイオン交換カラム（ＰＯＲＯＳ ＨＱ ５０，ＡＢＩ）上に直接ロードした。このカラムを緩衝液Ａ（５０ｍＭのリン酸塩緩衝液（ＰＢ）、ｐＨ７．５、伝導性約８ｍＳ／ｃｍ）で、６００ｍＬ／ｈｒ（約１カラム容量／分、ＣＶ／分）の線流速で予め平衡化した。溶出液を２８０ｎｍでのＵＶ検出によりモニターした。結合しなかった物質を洗い流した後、保持されている物質を、８ｍＳ／ｃｍ（２ＣＶについては０％の緩衝液Ｂ）から３３ｍＳ／ｃｍ（８ＣＶについては２５％の緩衝液Ｂ）まで、そして最終的には１０５ｍＳ／ｃｍ（５ＣＶについては１００％の緩衝液Ｂ）に移動相の伝導性を段階的に順次上昇させるための緩衝液Ａおよび緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＰＢおよび１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）の非線形勾配で溶離させた。
宿主タンパク質混入物、中間体の混入物の除去をさらに容易にするために、疎水性相互作用（ＨＩＣ）クロマトグラフィー工程を導入した。これにより、それらの表面疎水性の差に基づいてタンパク質を精製し、分離する。ｈｆＢ３タンパク質を含有している主要な画分（ＡＥＸクロマトグラフィー工程による）をプールし、およそ１．４Ｍの硫酸アンモニウムおよび４７ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）（伝導性２１６ｍＳ／ｃｍ）（ｈｆＢ３−２９２Ｓについては、１．０Ｍの硫酸アンモニウムおよび３３．７ｍＭのリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．５、伝導性１６９ｍＳ／ｃｍ）を含むように、緩衝液Ｃ（１．５Ｍの硫酸アンモニウムおよび５０ｍＭのリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．５）を硫酸アンモニウム／リン酸塩緩衝液対試料のおよそ３０：１の容量比で試料に添加することにより調整した。プールした試料を０．２μｍの濾紙を通過させて濾過し、１．５Ｍの硫酸アンモニウムおよび５０ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）（緩衝液Ｃ）（ｈｆＢ３−２９２Ｓについては１．０Ｍの硫酸アンモニウムおよび３３．７ｍＭのリン酸塩緩衝液）で予め平衡化した疎水性相互作用カラム（ＨｉＴｒａｐ Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に、３００ｍＬ／ｈｒ（１ＣＶ／ｍｉｎ）の流速でアプライした。保持された物質を非線形様式で硫酸アンモニウム濃度を低下させることにより溶離させた。
あるいは、中間のＨＩＣクロマトグラフィー工程を、例えば、スケールアップすることがより容易な精製過程を作り上げるために、２工程のＨＩＣクロマトグラフィーで置き換えることができる。この２工程のＨＩＣ精製過程においては、宿主細胞タンパク質の大部分を、最初の工程のＨＩＣクロマトグラフィー、ＨＩＣ陰性選択により、低塩条件（ｆＢ３については０．７５Ｍの硫酸アンモニウムおよび２５ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）、そしてｈｆＢ３−２９２Ｓについては０．６Ｍの硫酸アンモニウムおよび２０ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）伝導性１００ｍＳ／ｃｍ）でＨＩＣカラム（ＨｉＴｒａｐ Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結合させることによって、ｆＢ３またはｆＢ３−２９２Ｓから分離した。次に、ｈｆＢ３またはｆＢ３−２９２Ｓタンパク質を含有しているＨＩＣ陰性選択工程によるフロースルー画分を、ｆＢ３についてはおよそ１．５Ｍの硫酸アンモニウムおよび５０ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）（伝導性２１６ｍＳ／ｃｍ）、またはｈｆＢ３−２９２Ｓについては１．０Ｍの硫酸アンモニウムおよび３３．７ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）（伝導性１６９ｍＳ／ｃｍ）を含むように再度調整した。第２の工程のＨＩＣクロマトグラフィーについては、試料を０．２μｍの濾紙を通して濾過し、ｆＢ３については１．５Ｍの硫酸アンモニウムおよび５０ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）、ならびにｈｆＢ３−２９２Ｓについては１．０Ｍの硫酸アンモニウムおよび３３．７ｍＭのリン酸塩緩衝液で予め平衡化した疎水性相互作用カラム（ＨｉＴｒａｐ Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に、３００ｍＬ／ｈｒ（１ＣＶ／ｍｉｎ）の流速でアプライした。保持されている物質を硫酸アンモニウム濃度を非線形様式で低下させることにより溶離させて、残っている宿主細胞タンパク質からｆＢ３またはｆＢ３−２９２Ｓタンパク質をさらに分離した。
ＨＩＣクロマトグラフィー工程による生物学的に活性なｈｆＢ３タンパク質を含有している画分をプールし、遠心濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ，カタログ番号９０１０２４、１０，０００ＭＷのカットオフ）で濃縮した。濃縮した試料について、ＰＢＳ緩衝液（４ｍＭのリン酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）（ＧＩＢＣＯ））中で平衡化させたＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ３００ ２６／６０ ＨＲカラム（最大充填容量：ＣＶの３％、約１０ｍＬ）上でサイズ排除クロマトグラフィーを行った。ｈｆＢ３タンパク質の溶離は、ＰＢＳを使用して６０ｃｍ／ｈｒの一定の線流速で行い、２８０ｎｍでのＵＶ検出により溶出液をモニタリングした。精製したｈｆＢ３タンパク質をアリコートで−８０℃で保存した。
この手順により、他の混入物質からｈｆＢ３タンパク質をほぼ完全に分離することができた。３工程のクロマトグラフィー過程後のｈｆＢ３タンパク質の純度は、０．２μｇの精製したｈｆＢ３タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色分析だけが１つの鋭いバンドを生じたという事実により示されるように、極めて高かった（図５、左のパネル）。上記３工程のクロマトグラフィー過程により精製したｈｆＢ３タンパク質について溶血試験においてヒト野生型Ｂ因子に対する競合試験を行った場合には、これがヒト代替補体経路の溶血活性を抑制し、このことは、精製したｈｆＢ３タンパク質が生物学的に活性であることを明らかに示している（図５、右のパネル）。驚くべきことに、ｈｆＢ３の２つの集団がＨＩＣによって検出され、一方は生物学的に活性であり（ピークＩまたは活性集団と命名した）、他方は、はるかに低い生物学的活性を有していた（ピークＩＩまたは低活性集団と命名した）（図６）。これらの２つの形態は、安定なｈｆＢ３タンパク質生産細胞の未処理の細胞培養培地中で逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって容易に検出された（図７）。
実施例１０．ｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質生産細胞株はピークＩＩ集団を生産しない
２９２位にセリンで置換された遊離のシステインを持つ補体Ｂ因子アナログを含有している未精製のｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質細胞培養培地について、陰性対照としての未精製の未処理の２９３ ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ細胞培養培地、および陽性対照としての未精製のｈｆＢ３タンパク質細胞培養培地とともにＲＰ−ＨＰＬＣ分析を行った（図７）。ｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質細胞培養培地は検出可能なピークＩＩ集団を全く生じることはなく、一方、ｈｆＢ３タンパク質細胞培養培地の分析は、ｈｆＢ３の３５％が低活性のピークＩＩ集団であったことを示した（図７ＡおよびＢ）。
実施例１１．ｈｆＢ４発現構築物およびｈｆＢ４タンパク質の作製と特性決定
ｈｆＢ３中のアミノ酸７４０のアスパラギン酸をアスパラギンに変化させるようにｈｆＢ４タンパク質を設計した。この変化は、この補体Ｂ因子タンパク質アナログのセリンプロテアーゼ機能の機能を減衰させるかまたは阻害すると考えられる。
ｈｆＢ４発現構築物を作製するために、部位特異的変異をｈｆＢ３発現構築物中に導入した。
実施例１に記載したｈｆＢ３発現構築物（配列番号５）を鋳型として使用して、配列番号４中の７４０位のアスパラギン酸（Ｄ）をアスパラギン（Ｎ）に変化させる変異を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅの部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を製造業者の説明書にしたがって利用して作製し、ｈｆＢ４発現構築物を作製した。２つのプライマーを使用した：
下線を付けたヌクレオチドは、ＤからＮへのアミノ酸変化を生じるヌクレオチド変化を示す。このｈｆＢ４発現構築物は、５’から３’の方向に、ＣＭＶプロモーター、キメライントロン、コドン最適化されたｈｆＢ４のコード配列、ＩＲＥＳ−Ｎｅｏ選択マーカー、および合成ポリＡを含む。構築物全体を配列決定して、変異と構築物の完全性を確認した。ｈｆＢ４について予想したアミノ酸配列を配列番号１７に示す。ｈｆＢ３のアミノ酸配列とｈｆＢ４のアミノ酸配列の間の唯一の相違がＤ７４０Ｎの変化である。
ｈｆＢ４タンパク質を発現する安定な細胞株を、実施例３に記載したように２９３細胞のＰＥＩ媒介トランスフェクションおよび薬剤選択により作製した。選択した細胞集団の細胞培養培地中のｈｆＢ４タンパク質の濃度を、実施例５に記載したようにＥＣＬによって測定した。
１回のＨＩＣクロマトグラフィー工程の方法を使用して実施例９に記載したように精製したｈｆＢ４タンパク質の生物学的活性を、実施例７に記載したような溶血活性試験によって試験した。表２は、ｈｆＢ４タンパク質を含有している細胞培養培地によるヒト代替補体経路の溶血活性の阻害を示す。相対的な溶血活性を、ヒト代替補体経路の活性によるｒＲＢＡの溶血後に放出されたヘモグロビンによりスコアした。表２に示すように、ｈｆＢ４タンパク質は代替補体経路の活性を効率よく阻害した。
実施例１２．ｈｆＢ３−Ｆｃ発現構築物およびｈｆＢ３−Ｆｃタンパク質の作製と特性決定
ｈｆＢ３−Ｆｃは、ｈｆＢ３とＩｇＧ Ｆｃの間での融合タンパク質である。具体的には、全長のｈｆＢ３タンパク質をヒトＩｇＧ４ Ｆｃと融合させた。
ｈｆＢ３−Ｆｃ発現構築物を作製するために、ＰＣＲ産物を２つのプライマーを使用して実施例１に記載したｈｆＢ３発現構築物（配列番号５）から増幅させた：正方向プライマー：５’−ＧＣＧＣＡＣＣＧＧＴＧＣＴＡＧＣＧＡＡＴＴＣＧＧＣＧＡＣＡＡＧＡＡＧＧＧＣＡＧＣＴＧＣＧＡ−３’（配列番号１９）；および逆方向プライマー：５’−ＧＣＧＣＡＧＡＴＣＴＣＡＧＧＡＡＧＣＣＣＡＧＧＴＣＣＴＣＡＴ−３’（配列番号２０）。次に、ｈｆＢ３−ＦｃのＣ末端のコード領域を含有している３７７ｂｐのＰＣＲ産物をＡｇｅ ＩとＢｇｌ ＩＩで消化し、Ａｇｅ ＩとＢｇｌ ＩＩで予め消化したｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ４Ｆｃ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，カタログコード：ｐｆｕｓｅ−ｈｇ４ｆｃｌ）にライゲーションして、プラスミドｐｈｆＢ３Ｃｔｅｒｍ−Ｆｃを作製した。ｈｆＢ３発現構築物（実施例１に記載した配列番号５）をＥｃｏＲ ＩとＥｃｏＲ Ｖで消化した。ｈｆＢ３のＮ末端を含有しているＥｃｏＲ Ｉ／ＥｃｏＲ Ｖ断片を、ＥｃｏＲ ＩとＥｃｏＲ Ｖで予め消化したｐｈｆＢ３Ｃｔｅｒｍ−Ｆｃにライゲーションして、ｐｈｆＢ３−Ｆｃを作製した。ｐｈｆＢ３−ＦｃプラスミドをＮｈｅ Ｉで消化し、ｈｆＢ３とＦｃコード配列を含有している断片を、実施例１に記載したＩＲＥＳ−Ｎｅｏを持つ修飾したｐＣＩ構築物にライゲーションして、ｈｆＢ３−Ｆｃ発現構築物を作製した（配列番号１８）。このｈｆＢ３−Ｆｃ発現構築物は５’から３’の方向に、ＣＭＶプロモーター、キメライントロン、ｈｆＢ３−Ｆｃのコード配列、ＩＲＥＳ−Ｎｅｏ選択マーカー、および合成ポリＡを含む。構築物全体を配列決定して構築物の完全性を確認した（配列番号１８）。配列番号２１はｈｆＢ３−Ｆｃタンパク質のアミノ酸配列である。
ｈｆＢ３−Ｆｃタンパク質を発現する安定な細胞株を、実施例３に記載したように２９３細胞のＰＥＩ媒介トランスフェクション、および薬剤選択により作製した。薬剤選択した細胞を２×１０６細胞／ｍＬで７２時間培養した。その後、ｈｆＢ３−Ｆｃタンパク質の発現を、２μｌの細胞培養物上清について非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロット分析を行うことにより試験した。図８に示すように、ｈｆＢ３−Ｆｃタンパク質の２つのバンドがヤギ抗Ｂ因子特異的抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号ＡＦ２７３９）により検出された。ＫＤａの分子量マーカーを左に示す。理論に縛られることは望ましくないが、ｈｆＢ３−Ｆｃタンパク質のこれらの２つのバンドは、このタンパク質の単量体と二量体を示している可能性がある。ｈｆＢ３−Ｆｃタンパク質（細胞培養物上清中）の生物学的活性を、実施例７に記載した溶血活性試験によって試験した。表３に示すように、ｈｆＢ３−Ｆｃタンパク質は代替補体経路の活性を阻害した。
実施例１３．ｈｆＢ３−２９２Ｓの補体阻害に対する凍結／解凍の繰り返しの影響
ｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質を、１回のＨＩＣクロマトグラフィー工程の方法を使用して実施例９に記載したように精製した。−８０℃の冷凍庫から取り出し、室温で解凍したＰＢＳ中の精製したｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質を、最初の凍結解凍サイクルとしてカウントした。この解凍後、ｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質濃度をＰＢＳで２ｍｇ／ｍＬに調整し、ｈｆＢ３−２９２Ｓの１つのアリコートをサンプリングし、最初の凍結解凍試料として氷上に置いておいた。その後、ｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質のチューブを、メタノール／ドライアイス浴の中に２０分間チューブを置くことにより凍結し、その後、室温で完全に融解するまで解凍した（２回目の凍結解凍サイクル）。試料の１つのアリコートをサンプリングし、次の凍結解凍サイクルを繰り返す前にとっておいた。各凍結解凍サイクル（全部で７回）による試料の生物学的活性を、実施例７に記載したように代替補体経路が媒介する溶血試験において野生型ヒトＢ因子と競合するそれらの能力を測定することによって分析した。各反応に、漸増量のｈｆＢ３−２９２Ｓとともに定量の野生型ヒトＢ因子（０．５μｇ）を含めた。表４の結果は、溶血試験における阻害の百分率を示す。
これらの結果は、ｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質が７回の凍結解凍サイクルの後もなお、代替経路が媒介する溶血を依然効率よく阻害できることを示している（表４）。同様のレベルの溶血阻害が全ての試料にわたり観察され、これは、凍結解凍の繰り返し（７回まで）が補体媒介溶血を阻害するｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質の能力に影響を及ぼさなかったことを示している。
実施例１４．ｈｆＢ３タンパク質よりも高いｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質の熱安定性
ｈｆＢ３およびｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質を、１回のＨＩＣクロマトグラフィー工程の方法を使用して実施例９に記載したように精製した。精製したｈｆＢ３タンパク質およびｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質（いずれもＰＢＳ中）を−８０℃から取り出した。タンパク質濃度をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に２ｍｇ／ｍＬになるように再度調整した。ｈｆＢ３タンパク質およびｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質を３個の０．６ｍＬのエッペンドルフチューブに等しくアリコートし（チューブあたり４０μＬ）、その後、４℃、−８０℃、および３７℃の条件で７日間保存した。保存した試料のそれぞれの生物学的活性（補体媒介溶血を阻害する能力）を、実施例７に記載したように代替補体経路に媒介される溶血を阻害するそれらの能力を測定することによって分析した。この溶血試験の結果は、４℃または−８０℃で７日間の保存が代替補体経路に媒介される溶血を阻害するｈｆＢ３またはｈｆＢ３−２９２Ｓのいずれの能力にも影響を及ぼさなかったことを示した。しかし、３７℃で７日間保存したｈｆＢ３タンパク質は、試験した４つの試料の全てにおいてその生物学的活性を本質的には全て失った。際立つのは、３７℃で７日間保存したｈｆＢ３−２９２Ｓがその生物学的活性を良好に保存し、なおも野生型ヒトＢ因子と効率的に競合できたことである（表５）。表５の結果は、ｈｆＢ３またはｈｆＢ３−２９２Ｓのいずれかによるヒト代替補体活性の阻害の百分率を（標準偏差とともに）示す。これらの結果は、ｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質が３７℃でｈｆＢ３タンパク質よりも高い熱安定性を有していることを示した。
実施例１５．ヒトＢ因子、ｆＢ３、およびｆＢ３−２９２Ｓタンパク質のタンパク質融解温度の決定
タンパク質融解温度（Ｔｍ）はタンパク質の熱安定性の尺度であり、タンパク質のアミノ酸配列の変化は、特に、タンパク質の熱安定性に影響を及ぼし得る。ヒトＢ因子タンパク質（ｈｆＢ）は２３個のシステイン残基を含み、そのうちの２２個はジスルフィド結合対（シスチン）として存在し、Ｃ２９２である１つは対合していない遊離のスルフヒドリル形態で存在する。
ｈｆＢ３タンパク質（Ｋ２５８Ａ、Ｒ２５９Ａ、Ｋ２６０Ａ、Ｄ２７９Ｇ、Ｎ２８５Ｄ）およびｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質（ｈｆＢ３タンパク質の１つの対合していないシステイン残基がセリンになるように修飾された）の融解温度プロフィールを、１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸（ＡＮＳ）の存在下で各タンパク質をインキュベートし、４６０ｎｍでのＡＮＳの蛍光の増大を測定することにより、ｈｆＢタンパク質のものと比較した。ＡＮＳはタンパク質の疎水性領域に結合し（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９６５）１３：４８２−４９５）、そしてｈｆＢタンパク質の表面疎水性に対する温度の影響を調べるために使用されている（Ｔａｋａｄａら、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（１９８５）２：１９３−２０３）。ｈｆＢタンパク質（３５μｇ）、ｈｆＢ３タンパク質（５０μｇ）、およびｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質（３９μｇ）を含有している試料を、１０ｍＭのＡＮＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号Ａ−４７）を含有している１００μＬのＰＢＳ（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．４）緩衝液中に調整した。各タンパク質試料（３連）を閉じたポリプロピレンチューブの中で、２１℃、３０℃、３７℃、４４℃、４７℃、５０℃、５５℃、６０℃、および６５℃で３０分間インキュベートした。試料を透明な９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３６３５）に移し、蛍光をＰｅｒｃｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ ４０００マイクロプレート分光光度計（励起＝６０／４０ｎｍ、発光＝４６０／４０ｎｍ）において測定した。結果を非線形４ＰＬ曲線フィットを使用して分析した。野生型ｈｆＢタンパク質、ｈｆＢ３タンパク質、およびｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質のＴｍ値（２回の実験による結果の平均）を、それぞれ４６．４℃、４５．１℃、および４７．０℃と決定した。野生型ｈｆＢタンパク質に関してｈｆＢ３タンパク質中に作製した５個のアミノ酸変化（Ｋ２５８Ａ、Ｒ２５９Ａ、Ｋ２６０Ａ、Ｄ２７９Ｇ、Ｎ２８５Ｄ）は、ΔＴｍ＝−１．３℃を生じ、これは、ｈｆＢ３タンパク質が対応する野生型ｈｆＢタンパク質と比較して熱安定性が低かったことを示している。しかし、ｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質のＴｍ（４７．０℃）はｈｆＢ３タンパク質に対してΔＴｍ＝＋１．９℃を生じ、ｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質が野生型ｈｆＢタンパク質（４６．４℃）と少なくとも同程度に熱安定性であったことを示していた。
したがって、ヒト線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−１）タンパク質中のシステイン残基のセリンでの置換（Ｃ８３ＳまたはＣ１１７Ｓ）は、Ｔｍをそれぞれ１３℃および２℃低下させたことを示したＣｕｌａｊａｙら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０００）３９：７１５３−７１５８）の結果とは対照的に、アミノ酸Ｃ２９２でのｈｆＢ３のセリン置換はｈｆＢ３よりも熱安定性が高いｈｆＢ３−２９２Ｓを生じた。
実施例１６．ｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質はマウス関節リウマチモデルにおいて関節の炎症と損傷を予防する
コラーゲン抗体誘導関節炎（ＣＡＩＡ）は、関節リウマチについての侵襲性のマウスモデルである（Ｔｅｒａｔｏ Ｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１４８（７）：２１０３−８；Ｔｅｒａｔｏ Ｋら、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９５）２２（３）：１３７−４７）。このモデルにおいては、コラーゲンに対する４種類のモノクローナル抗体を含有しているコラーゲン抗体カクテル（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ，Ｉｎｃ．，カタログ番号：１００１０）をＬＰＳ追加抗原とともに使用して、６週齢の雄のＤＢＡ／１Ｊ野生型マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）において関節炎を誘導した。
４０匹のマウスを３つのグループに分けた。グループ１には溶媒対照グループとして１０匹のマウスを含めた。ここでは、１００μＬのＰＢＳ（リン酸塩緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．４）を０日目に尾静脈に注射し、マウス１匹あたり２５μｇのＬＰＳの追加抗原注射（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，カタログ番号：４２１）を３日目に腹腔内に投与し（ＬＰＳはＰＢＳ中に５００μｇ／ｍＬの濃度とした）、そして３、５、７、および９日目に尾静脈から再び１００μＬのＰＢＳを投与した。グループ２には０日目に尾静脈からコラーゲン抗体カクテル（マウス１匹あたり１００μＬのＰＢＳ中の０．２５ｍｇ）を注射し、３日目に２５μｇのＬＰＳの追加抗原注射を投与し、そして３、５、７、および９日目に尾静脈から１００μＬのＰＢＳを投与した１５匹のマウスを含めた。グループ３には、０日目に尾静脈から０．２５ｍｇのコラーゲン抗体カクテルと１ｍｇのｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質をマウス１匹あたり１００μＬのＰＢＳ中で両方一緒に注射し、３日目に２５μｇのＬＰＳの追加抗原注射を投与し、そして３、５、７、および９日目に尾静脈から１００μＬのＰＢＳ中の１ｍｇのｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質を投与した１５匹のマウスを含めた。
マウスを毎日試験した。各マウスの体重を関節の測定を行う時に記録した。前肢と後肢の関節を、−１、４、６、９、および１１日目に幅と厚みの両方についてノギスを使用して測定した。測定順序は、左前肢、左後肢、右後肢、および右前肢とした。１１日目に、全ての動物を屠殺し、全ての肢（左前肢、右前肢、左後肢、および右後肢）を回収し、個別にラベルを付けたプラスチックカセットの中に保存した。各カセットを１０％の中性緩衝ホルマリン溶液を含有している組織学用容器箱に入れた。
これらのマウスの肢を、関節中の発病を試験するためにパラフィン切片化し、Ｈ＆Ｅ染色した。具体的には、固定後、各マウス由来の各肢をプラスチックカセットに別々に移した。これらの肢を、固定液を除去するために室温（ＲＴ）で３０分間（ｍｉｎ）、ビーカー中で流水で濯いだ。その後、各カセットを脱灰した溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号８３４０）を含むビーカーに、この溶液中にカセットを浸すことによって移動させた。前肢を８時間脱灰し、後肢を９時間脱灰した。８時間または９時間後、肢を再び流水で、ＲＴで３０分間濯いで脱灰した溶液を除去した。脱灰後、次の脱水工程のために肢を７０％のエタノール中で一晩（Ｏ／Ｎ）保存した。肢を、７５％のエタノール（１００％のエタノールから作製した）に２回；８５％のエタノールに２回、９５％のエタノールに２回、そして１００％のエタノールに２回、それぞれＲＴで１５分間、振盪させながら順次浸すことにより脱水した。次に、肢を、１００％のエタノールおよびセダーウッド油（Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号０４０−１）の１：１混合物中にＲＴで１５分間、振盪させながら浸し、さらに２回、合計３回繰り返した。その後、肢を１００％のセダーウッド油に浸し、４０℃で５時間インキュベートした。５時間のインキュベーション後、肢をセダーウッド油とサリチル酸メチル（ＡＣＲＯＳ、カタログ番号１１９−３６−８）の１：１混合物中にＲＴで６０分間浸した。次に肢を、別の、セダーウッド油とサリチル酸メチルの１：１混合物中でＲＴでＯ／Ｎ浸した。Ｏ／Ｎのインキュベーション後、肢を１００％のサリチル酸メチル中にＲＴで４０分間浸し、さらに１回繰り返した（合計２回）。最後に、肢を、６０℃で７時間のインキュベーションにより調製したパラフィン中に包埋した。
マウスの肢のパラフィン切片をミクロトームを使用して調製し、７μｍの厚さにカットした。これらの切片を４０℃の水浴上でインキュベートし、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓ顕微鏡スライドに移動させた。スライドをＲＴでＯ／Ｎ乾燥させ、スライドウォーマー上でのＯ／Ｎのインキュベーションによりさらに乾燥させた。このスライドを染色するまでＲＴで保った。
取り付けたマウスの肢のパラフィン切片についてＨ＆Ｅ染色を行った。切片を脱パラフィン化し、キシレンに３分間浸し、２回繰り返し、合計３回行うことにより再水和した。次に、過剰量のキシレンをブロットし、切片を１００％のエタノール中に３分間、合計３回、次に、９５％のエタノール中に３分間を１回、８０％のエタノール中に３分間を１回、そして脱イオン水中に５分間を１回浸した。全てのインキュベーションをＲＴで行った。ヘマトキシリン染色のために、スライドをヘマトキシリン中に４分間を１回浸し、脱イオン水で濯いだ。これらのスライドを水道水に１回、５分間浸して、染色を明らかにさせた。スライドを酸エタノール（２００ｍｌの７０％のエタノール＋１５０μＬの濃ＨＣＬ）中に８〜１２回、素早く浸して切片を脱染色した。その後、スライドを水道水中で１分間、２回濯ぎ、次に脱イオン水中で１回、２分間濯いだ。過剰量の水をエオシン染色の前にスライドからブロットした。
エオシン染色のために、スライドを１回、２０秒間エオシンに浸した。次に、スライドを９５％のエタノール中に５分間を３回浸すことによって脱水した。スライドを１００％のエタノール中で５分間を３回、インキュベートした。過剰量のエタノールをブロットし、スライドをキシレン中で１５分を３回、インキュベートした。カバースライドを、キシレンベースのＰｅｒｍｏｕｎｔ（ＥＭＳ、カタログ番号１７９８６−０１）を使用して、泡が形成しないように注意しながらガラス棒を使用してスライド上にＰｅｒｍｏｕｎｔを１滴載せることにより、スライドに付着させた。次に、カバースリップをスライド上に角度をつけておき、スライド上に静かに落とした。Ｐｅｒｍｏｕｎｔが、カバースリップの真下に広がって切片全体を覆うことができた。スライドをドラフトの中でＲＴでＯ／Ｎ乾燥させた。
図１０に示すように、ｈｆＢ３−２９２Ｓの非存在下でコラーゲン抗体カクテルを注射したグループ（グループ２）は、重症の前肢の腫脹を誘導した。抗体カクテルを注射したが、ｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質で処置したマウス（グループ３）は、肢の大きさの６５％の低減を示した（ｐ＜０．０００３）（図１０）。これらの結果は、ｈｆＢ３−２９２Ｓによるこのモデルの関節炎の有意な阻害効果を示している。ＣＡＩＡの誘導のためのマウス１匹あたり２５０μｇのコラーゲン抗体カクテルの投与量では、マウスの後肢は明らかな腫脹を示さなかった。マウスの体重に対してｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質での処置についての有意な悪影響は観察されなかった。全てのマウスの平均体重は一定に維持された。３つのグループの全ての全マウスの平均体重は、実験の終わりまで２０．４±１．１グラムであった。
図９に示すように、グループ１のマウスは正常な関節を有しているように見え、関節および軟骨および骨への炎症細胞の浸潤は検出されず、正常に見えた（図９、上のパネル）。グループ２のマウスは、関節の重篤な炎症、炎症細胞の浸潤、パンヌスの形成、軟骨の損傷、および骨浸食を有していた（図９、中央のパネル）。ｈｆＢ３−２９２Ｓで処置したグループ３のマウスは正常な関節構造を有しており、炎症細胞の浸潤はなく、軟骨もしくは骨の浸食または損傷もなかった（図９、下のパネル）。
これらのデータは、ｈｆＢ３−２９２ＳがこのＣＡＩＡマウスモデルにおいて関節の炎症および損傷を予防することについて有意に有効であることを示しており、これは関節リウマチについてのｈｆＢ３−２９２Ｓタンパク質の治療上の有用性を実証している。
実施例１７．ｈｆＢ３−２９２Ｓ−Ｆｃ発現構築物およびｈｆＢ３−２９２Ｓ−Ｆｃタンパク質の作製および特性決定
ｈｆＢ３−２９２Ｓ−Ｆｃタンパク質（配列番号２２）を発現する安定な細胞株を、実施例３に記載したように２９３細胞のＰＥＩ媒介トランスフェクションおよび薬剤選択により作製した。薬剤選択した細胞を２×１０６細胞／ｍＬで７２時間培養した。その後、ｈｆＢ３−２９２Ｓ−Ｆｃタンパク質の発現を、２μＬの細胞培養物上清について非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析を行うことにより試験した。ｈｆＢ３−２９２Ｓ−Ｆｃタンパク質の２つのバンドをヤギ抗Ｂ因子特異的抗体により検出した（未公開データ）。理論に縛られることは望ましくないが、ｈｆＢ３−２９２Ｓ−Ｆｃタンパク質のこれらの２つのバンドは、このタンパク質の単量体および二量体を示している可能性がある。
ｈｆＢ３−２９２Ｓ−ＦｃをプロテインＡカラムで精製した。精製したｈｆＢ３−２９２Ｓ−Ｆｃタンパク質の生物学的活性を、実施例７に記載した溶血活性試験により試験した。表６に示すように、ｈｆＢ３−２９２Ｓ−Ｆｃタンパク質は代替補体経路の活性を用量依存性様式で阻害した。
実施例１８．Ｃ末端短縮型ｈｆＢ３−２９２Ｓ
Ｃ末端の２８４個のアミノ酸（セリンプロテアーゼドメイン）が欠失しているｈｆＢ３−２９２Ｓの短縮型を発現する遺伝子発現構築物を作製した。この分子をｈｆＢ３−２９２ＳＮ４８０と命名した。これは、ｈｆＢ３−２９２ＳのＮ末端の４８０個のアミノ酸（配列番号２のアミノ酸１〜４８０、または分泌ペプチドの切断後は配列番号２のアミノ酸２６〜４８０）からなる。ｈｆＢ３−２９２ＳＮ４８０の発現構築物のＤＮＡ配列を、ｈｆＢ３−２９２ＳＮ４８０のコード配列であるヌクレオチド１０６４〜２５０９とともに配列番号２４に示す。この発現構築物を、実施例３に先に記載したように２９３ ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ細胞にトランスフェクトし、Ｇ４１８で選択した。Ｇ４１８耐性非クローン性細胞培養培地について、対照として全長ｈｆＢ３−２９２Ｓ（左のレーン）を使用して、ｈｆＢ３−２９２ＳＮ４８０の発現についてのウェスタンブロット分析を行った。図１１に示すように、ｈｆＢ３−２９２Ｓに特異的なモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット分析により、ｈｆＢ３−２９２ＳＮ４８０細胞株の細胞培養培地からおよそ５５ＫＤａの１つのバンドを検出し（右のレーン）、これは、ｈｆＢ３−２９２ＳのＣ末端から２８０個のアミノ酸が欠失していてもなお、Ｎ末端の４８０個のアミノ酸が適切な大きさで発現され得ることを示唆している。
代替補体活性の試験を先に記載したように行って、ｈｆＢ３−２９２ＳＮ４８０が代替補体活性を阻害できるかどうかを決定した。図１３に示すように、ｈｆＢ３−２９２ＳＮ４８０を発現する細胞由来の細胞培養上清は、容量依存性様式で代替補体活性を阻害した。これは、ｈｆＢ３−２９２Ｓの断片がなおも補体活性を阻害する能力を保持し得、したがって、ｈｆＢ３−２９２Ｓ（配列番号２）について本明細書中に記載したものと同様に利用できることを示している。
実施例１９．単量体ｈｆＢ３−２９２Ｓ／Ｆｃ融合タンパク質ｈｆＢ３−２９２Ｓ／Ｆｃ−ｍｏｎｏ
ヒトＩｇＧ４ Ｆｃに「融合させた」全長ｈｆＢ３−２９２Ｓをコードする遺伝子発現構築物を操作した。ｈｆＢ３−２９２Ｓは、先に記載したように、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞中で生産される場合は単量体である。例えば、ｈｆＢ３−２９２Ｓが非還元条件下でおよそＭＷ １００ＫＤａの１つのバンドとして検出されたことを示し、ｈｆＢ３−２９２Ｓが単量体であることを示唆している実施例６に記載した図３を参照のこと。ヒトＩｇＧ４ Ｆｃのヒンジ領域中の２つのシステインを変異させて、融合タンパク質が単量体であり、補体活性を阻害するｈｆＢ３−２９２Ｓの生物学的特性を保持することを確実にした。これらの２つのシステインを、これらをそれぞれセリンで置換することにより変異させた。ｈｆＢ３−２９２Ｓと変異させたＩｇＧ４ Ｆｃとのこの融合タンパク質をｈｆＢ３−２９２Ｓ／Ｆｃ−ｍｏｎｏと命名した。この融合タンパク質発現構築物のＤＮＡ配列を配列番号２６に示す。ｈｆＢ３ ２９２Ｓ／Ｆｃ ｍｏｎｏの対応するアミノ酸配列を、ｈｆＢ３−２９２Ｓ領域であるアミノ酸１〜７６４、およびネイティブのヒトＩｇＧ４ Ｆｃにおいて見られるシステイン残基に置き換わったセリンアミノ酸であるアミノ酸７８２と７８５を持つヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域であるアミノ酸７６５〜１００３とともに、配列番号２５に示す。
ｈｆＢ３−２９２Ｓ／Ｆｃ−ｍｏｎｏ遺伝子発現構築物（配列番号２６）をヒト２９３ ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ細胞にトランスフェクトした。次に、これらの細胞についてＧ４１８選択を行った。薬剤耐性細胞由来の培養培地を、融合タンパク質についてウェスタンブロット分析した。図１２に示すように、およそ１１５ＫＤａの１つのバンドがこの非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析において、精製されたヤギ抗ヒトＢ因子抗体によって検出された。２つのより大きなバンドは単量体融合タンパク質の凝集物である可能性が最も高い。データは、ｈｆＢ３−２９２ＳとヒトＩｇＧ４ Ｆｃとの単量体融合タンパク質（ｈｆＢ３−２９２Ｓ／Ｆｃ−ｍｏｎｏ）が哺乳動物細胞中でうまく発現されたこと、そしてこの融合タンパク質の大部分が単量体であると見られることを示唆していた。
ｈｆＢ３−２９２Ｓ／Ｆｃ−ｍｏｎｏが代替補体活性を遮断するｈｆＢ３−２９２Ｓの特性を保存しているかどうかを試験するために、代替補体活性の試験を先に記載したように行った。図１４に示すように、ｈｆＢ３−２９２Ｓ／Ｆｃ−ｍｏｎｏ生産細胞由来の細胞培養物上清は代替補体活性を容量依存性様式で阻害し、これはｈｆＢ３−２９２Ｓの補体阻害活性がこの単量体ｈｆＢ３−２９２Ｓ／Ｆｃ−ｍｏｎｏ融合タンパク質において失われていないことを示唆している。
本明細書中で言及した全ての刊行物、特許、および特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的かつ個々に引用されたことにより本明細書中に組み込まれることが示されているかのように、同じ程度まで本明細書中にそれらの全体が引用により本明細書中に組み込まれる。

Claims (13)

  1. ｈｆＢ３−２９２Ｓ（配列番号２のアミノ酸１〜７６４または２６〜７６４）、ｈｆＢ３−２９２ＳＮ４８０（配列番号２のアミノ酸１〜４８０または２６〜４８０）、および、ｈｆＢ３−２９２Ｓ−Ｆｃ（配列番号２２のアミノ酸１〜９９０または２６〜９９０）からなる群から選択されるポリペプチド。
  2. 請求項１に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有している核酸。
  3. 請求項２に記載の核酸を含有しているウイルスベクター。
  4. 前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、肝炎ウイルスベクター、ＳＶ４０ウイルスベクター、ＡＡＶベクター、ＥＢＶベクター、およびＮＤＶベクターからなる群より選択される、請求項３に記載のウイルスベクター。
  5. 前記レンチウイルスベクターが、ＢＩＶ、ＨＩＶ、ＥＩＡＶ、ＳＩＶ、またはＦＩＶベクターである、請求項４に記載のウイルスベクター。
  6. 請求項１に記載のポリペプチド、請求項２に記載の核酸、請求項３〜５のいずれか１項に記載のウイルスベクター、またはこれらの任意の組み合わせを含有している、薬学的製剤。
  7. 補体活性を阻害するための組成物であって、該組成物は、該補体活性を阻害するために十分な量の請求項１に記載のポリペプチド、請求項２に記載の核酸、請求項３〜５のいずれか１項に記載のウイルスベクター、請求項６に記載の薬学的製剤、またはこれらの任意の組み合わせを含み、該組成物は、該補体活性の部位に導入または投与されることを特徴とする、組成物。
  8. 患者の補体媒介疾患を処置するための、請求項７に記載の組成物。
  9. 前記補体媒介疾患が眼の疾患である、請求項８に記載の組成物。
  10. 前記組成物が眼に投与されることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
  11. 前記組成物が、硝子体内注射、網膜下注射、前眼房内への注射、角膜への注射または局所適用、結膜下注射、テノン下注射、または点眼により投与されることを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
  12. 前記補体媒介疾患が、黄斑変性症、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、地図状委縮、湿性ＡＭＤ、心筋梗塞、乾性ＡＭＤ、ドルーゼン形成、関節炎、脳卒中、虚血再灌流傷害、糖尿病性網膜症、硝子体網膜症、外傷性臓器損傷、角膜の炎症、角膜血管新生、ブドウ膜炎、高眼圧症、または緑内障である、請求項８に記載の組成物。
  13. 前記補体媒介疾患が、アテローム性動脈硬化症、気道応答性亢進、免疫関連疾患、自己免疫関連疾患、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節炎、リウマチ性疾患、抗リン脂質抗体症候群、腸および腎臓のＩ／Ｒ傷害、喘息、非定型溶血性尿毒症症候群、ＩＩ型膜増殖性糸球体腎炎、非増殖性糸球体腎炎、胎児喪失、脳傷害、外傷後臓器損傷、梗塞後臓器損傷、血管炎、遺伝性血管浮腫、発作性夜間ヘモグロビン尿症、脳血管偶発症、アルツハイマー病、移植片拒絶、感染症、敗血症、敗血症性ショック、シェーグレン症候群、重症筋無力症、抗体に媒介される皮膚疾患、Ｉ型およびＩＩ型真性糖尿病、インスリン抵抗性症候群、妊娠性糖尿病、甲状腺炎、特発性血小板減少性紫斑病および溶血性貧血、神経障害、多発性硬化症、心肺バイパス傷害、結節性多発性動脈炎、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、血清病、グッドパスチャー病、全身性壊死性血管炎、連鎖球菌感染後の糸球体腎炎、特発性肺線維症、膜性糸球体腎炎、急性ショック性肺症候群、成人呼吸窮迫症候群、および再灌流からなる群より選択される、請求項８に記載の組成物。
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