JP7022165B2 - ＸＴＥＮおよびｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子タンパク質を有する第ＶＩＩＩ因子の複合体、および、その使用 - Google Patents

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Description

血友病Ａは、凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）をコードする遺伝子の異常により発生
する出血性疾患であり、１０，０００人の出生男児のうち１～２人が発症する。Grawet a
l., Nat. Rev.Genet. 6(6): 488-501 (2005)。血友病Ａに罹患した患者は、精製ＦＶＩ
ＩＩまたは組換え生産されたＦＶＩＩＩの投与により治療することができる。しかしなが
ら、市販されているすべてのＦＶＩＩＩ製品は、約８～１２時間の半減期であることが知
られており、頻繁に患者に静脈内投与しなければならない。WeinerM.A. and Cairo, M.S.
, PediatricHematology Secrets, Lee,M.T., 12. Disorders ofCoagulation, Elsevier
HealthSciences, 2001; Lillicrap,D. Thromb. Res. 122Suppl 4:S2-8 (2008)を参照の
こと。さらに、ＦＶＩＩＩの半減期を延長させるため、多くの方法が試されている。凝固
因子の半減期を延長させるために開発中の方法としては、たとえば、ペグ化、糖ペグ化お
よびアルブミンとの結合が挙げられる。Dumontet al., Blood. 119(13): 3024-3030(Publ
ished onlineJan. 13,2012)を参照のこと。しかしながら、どのタンパク質組換え法を用
いているかに関わらず、現在、開発中の長期作用型ＦＶＩＩＩ製品は、わずかな半減期（
前臨床動物モデルにおいて、約１．５～２時間）しかないことが報告されている。上記文
献を参照のこと。ヒトでも結果は同じであり、たとえば、ｒＦＶＩＩＩＦｃは、ＡＤＶＡ
ＴＥ（登録商標）と比較して、血友病Ａ患者において約１．７倍の半減期延長の改善が報
告されている。上記文献を参照のこと。それゆえ、細かな改良にかかわらず、半減期の延
長には、他のＴ１／２制限因子が存在することが示唆される。Liu,T. et al., 2007 ISTH
meeting,abstract #P-M-035; Henrik,A. et al., 2011 ISTHmeeting, abstract #P=MO-
181; Liu, T. etal.,2011 ISTH meeting abstract#P-WE-131を参照のこと。
血漿ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｒｂｒａｎｄ因子（ＶＷＦ）の半減期はおよそ１２時間である
（９～１５時間の範囲）。http://www.nhlbi.nih.gov/guidelines/vwd/2_scientificover
view.htm（最終確認は２０１１年１０月２２日）。ＶＷＦの半減期は、多くの因子（グリ
コシル化のパターン、ＡＤＡＭＴＳ－１３（ａ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｎｄ ｍｅ
ｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ ｗｉｔｈ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ｍｏｔｉｆ－
１３）およびＶＷＦ中の様々な変異）により影響を受け得る。
血漿中では、９５～９８％のＦＶＩＩＩが、全長ＶＷＦとの強固な非共有結合性の複合
体の状態で循環している。この複合体の組成は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける適切な血漿ＦＶ
ＩＩＩの維持に重要である。Lentinget al., Blood. 92(11): 3983-96 (1998); Lentinge
tal., J.Thromb. Haemost. 5(7):1353-60 (2007)。全長の野生型ＦＶＩＩＩは、そのほ
とんどが、重鎖（ＭＷ ２００ｋＤ）および軽鎖（ＭＷ ７３ｋＤ）を有するヘテロ二量
体として存在している。ＦＶＩＩＩが、重鎖の３７２位および７４０位、ならびに軽鎖の
１６８９位でのタンパク質分解により活性化された場合、ＦＶＩＩＩに結合するＶＷＦは
、活性化ＦＶＩＩＩから除去される。活性化第ＩＸ因子、カルシウムおよびリン脂質とと
もに活性化されたＦＶＩＩＩ（テナーゼ（ｔｅｎａｓｅ）複合体）は、第Ｘ因子の活性化
を誘導し、多量のトロンビンを産生させる。次いで、トロンビンがフィブリノーゲンを開
裂し、可溶性のフィブリン単量体を形成し、次いで、それらが自発的に多量体化し、可溶
性のフィブリンポリマーを形成する。トロンビンはまた第ＸＩＩＩ因子を活性化し、それ
らは、カルシウムと共に、可溶性フィブリンポリマーを架橋および安定化させ、架橋フィ
ブリン（不溶性）を形成する。活性化ＦＶＩＩＩは、タンパク質分解により循環系から速
やかに除去される。
頻繁な投与および投与スケジュールから生じる不便さのために、より少ない頻度の投与
で済むＦＶＩＩＩ製品、すなわち、半減期限界の１．５～２倍長い半減期を有するＦＶＩ
ＩＩ製品の開発が求められている。
Lenting et al., Blood.(1998)92(11):3983-96 Lenting et al., J. Thromb. Haemost.(2007)5(7):1353-60
本発明は、（ｉ）ＶＷＦのＤ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有するｖｏｎ Ｗｉｌ
ｌｅｒｂｒａｎｄ因子（ＶＷＦ）断片、（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列、および、（ｉｉｉ）ＦＶ
ＩＩＩタンパク質を含有するキメラタンパク質を目的としており、ここで、当該ＶＷＦ断
片およびＸＴＥＮ配列は、任意のリンカーにより連結されており、および、ここで、ＶＷ
Ｆ断片またはＸＴＥＮ配列は、ＦＶＩＩＩタンパク質に連結、または関連付けられている
。キメラタンパク質は、ＶＷＦ断片、ＸＴＥＮ配列およびＦＶＩＩＩタンパク質を含有す
る単一なポリペプチド鎖を含有していてもよく、または、２つのポリペプチド鎖（１つ目
の鎖はＶＷＦ断片を含有し、２つ目の鎖はＦＶＩＩＩタンパク質を含有する）を含有して
いてもよく、ここで、ＸＴＥＮポリペプチドは、ＶＷＦ断片またはＦＶＩＩＩタンパク質
のいずれかに連結されている。
１つの実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、
（ａ）Ｖ－Ｘ－ＦＶＩＩＩ、
（ｂ）ＦＶＩＩＩ－Ｘ－Ｖ、
（ｃ）Ｖ－Ｘ：ＦＶＩＩＩ、
（ｄ）Ｘ－Ｖ：ＦＶＩＩＩ、
（ｅ）ＦＶＩＩＩ：Ｖ－Ｘ、または、
（ｆ）ＦＶＩＩＩ：Ｘ－Ｖ
を含有する式を含有し、ここで、
ＶはＶＷＦ断片を含有し、
Ｘは１以上のＸＴＥＮ配列を含有し、および、
ＦＶＩＩＩはＦＶＩＩＩタンパク質を含有する。ハイフン（－）は、ペプチド結合または
リンカー（たとえば、開裂可能なリンカー）であっても良く、コロン（：）は、ポリペプ
チドの間の化学的関連または物理的関連（たとえば、共有結合または非共有結合）を表す
。
他の実施態様において、キメラタンパク質はさらに、（ｉｖ）ＶＷＦ断片、ＸＴＥＮ配
列、ＦＶＩＩＩタンパク質またはそれらの任意の組み合わせに連結されたイムノグロブリ
ン（Ｉｇ）定常領域またはその一部（Ｆ１もしくは第一のＩｇ定常領域またはその一部と
しても示される）を含有する。他の実施態様において、キメラタンパク質はさらに、追加
のＩｇ定常領域またはその一部（Ｆ２もしくは第二のＩｇ定常領域またはその一部として
も示される）を含有する。第一のＩｇ定常領域またはその一部は、ＶＷＦ断片またはＸＴ
ＥＮ配列に連結されていてもよく、および、第二のＩｇ定常領域は、ＦＶＩＩＩタンパク
質に連結されていてもよい。第一のＩｇ定常領域、第二のＩｇ定常領域、またはその一部
、または両方は、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長してもよい。
一部の実施態様において、第二のＩｇ定常領域またはその一部（Ｆ２）は、リンカー（
たとえば、プロセッシング可能なリンカー）によりＶＷＦ断片に連結されている。他の実
施態様において、第二のＩｇ定常領域またはその一部（Ｆ２）は、（第一の）Ｉｇ定常領
域またはその一部（Ｆ１）に関連している。第二のＩｇ定常領域またはその一部（Ｆ２）
および、第一のＩｇ定常領域またはその一部（Ｆ１）は同一であっても、異なっていても
良い。第二のＩｇ定常領域またはその一部は、共有結合（たとえば、ジスルフィド結合）
によりＩｇ定常領域またはその一部に関連していてもよい。第一のＩｇ定常領域またはそ
の一部に連結されたＶＷＦ断片はまた、非共有結合により第二のＦｃ領域に連結されたＦ
ＶＩＩＩタンパク質と関連していてもよい。ある実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク
質はさらに、ＦＶＩＩＩタンパク質のＣ末端またはＮ末端に連結されている１以上の追加
のＸＴＥＮ配列、またはＦＶＩＩＩタンパク質中の１以上のアミノ酸のすぐ下流に挿入さ
れている（たとえば、１以上のＸＴＥＮ挿入部位）１以上の追加のＸＴＥＮ配列を含有し
ても良い。一部の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、野生型ＦＶＩＩ
ＩまたはＶＷＦ断片を有していないＦＶＩＩＩタンパク質を比較して、延長されている。
一部の実施態様において、キメラタンパク質は、
（ｇ）Ｖ－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－Ｆ１：ＦＶＩＩＩ－Ｌ３－Ｆ２、
（ｈ）Ｖ－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－Ｆ１：Ｆ２－Ｌ３－ＦＶＩＩＩ、
（ｉ）Ｆ１－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｖ：ＦＶＩＩＩ－Ｌ３－Ｆ２、
（ｊ）Ｆ１－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｖ：Ｆ２－Ｌ３－ＦＶＩＩＩ、
（ｋ）Ｖ－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－Ｆ１－Ｌ４－ＦＶＩＩＩ－Ｌ３－Ｆ２、
（ｌ）Ｆ２－Ｌ３－ＦＶＩＩＩ－Ｌ４－Ｆ１－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｖ、
（ｍ）ＦＶＩＩＩ－Ｌ３－Ｆ２－Ｌ４－Ｖ－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－Ｆ１、および、
（ｎ）Ｆ１－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｖ－Ｌ４－Ｆ２－Ｌ３－ＦＶＩＩＩ、
を含有する式を含有し、ここで、
ＶはＶＷＦ断片を含有し、
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３のぞれぞれは任意のリンカー（たとえば、開裂可能なリンカー）を
含有し、
Ｌ４は任意のリンカー（たとえば、プロセッシング可能なリンカー）であり、
ＦＶＩＩＩはＦＶＩＩＩタンパク質を含有し、
Ｘは１以上のＸＴＥＮ配列を含有し、
Ｆ１は任意の第一のＩｇ定常領域またはその一部を含有し、
Ｆ２は任意の第二のＩｇ定常領域またはその一部を含有し、および、
（：）は共有結合または非共有結合である。
また、本発明は、（ｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質、（ｉｉ）、ＸＴＥＮ配列、および（ｉ
ｉｉ）Ｉｇ定常領域またはその一部を含有するキメラタンパク質を目的とし、ここで、Ｘ
ＴＥＮ配列は、任意のリンカーによりＦＶＩＩＩタンパク質のＮ末端またはＣ末端でＦＶ
ＩＩＩタンパク質に連結され、または、ＦＶＩＩＩＩタンパク質の１以上のアミノ酸のす
ぐ下流（１以上の挿入部位）に挿入されており、および、ここで、Ｉｇ定常領域またはそ
の一部は、ＦＶＩＩＩタンパク質またはＸＴＥＮ配列に連結、または関連している。１つ
の実施態様において、本キメラタンパク質に有用なＩｇ定常領域またはその一部は、第一
のＦｃ領域を含有する。他の実施態様において、本キメラタンパク質はさらに、追加のＩ
ｇ定常領域またはその一部を含有する。本発明に有用な追加のＩｇ定常領域またはその一
部は、第二のＦｃ領域（第一のＦｃ領域に、たとえば共有結合により、連結されている、
または関連している）を含有している。他の実施態様において、第一のＦｃ領域は、たと
えばプロセッシング可能なリンカー等のリンカーにより、第二のＦｃ領域に連結されてい
る。
他の態様において、キメラタンパク質は、（ｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質、（ｉｉ）ＸＴ
ＥＮ配列、（ｉｉｉ）ＶＷＦ断片、および、（ｉｖ）Ｉｇ定常領域またはその一部（ＶＷ
ＦのＤ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有する）、を含有し、ここで、ＸＴＥＮ配列は
、ＦＶＩＩＩタンパク質のＮ末端またはＣ末端で任意のリンカーによりＦＶＩＩＩタンパ
ク質に連結され、または、ＦＶＩＩＩタンパク質中の１以上のアミノ酸のすぐ下流（たと
えば、１以上の挿入部位）に挿入されており、ＶＷＦ断片は、ＦＶＩＩＩタンパク質また
はＸＴＥＮ配列に連結、または関連しており、および、Ｉｇ定常領域またはその一部は、
ＦＶＩＩＩタンパク質、ＸＴＥＮ配列、ＶＷＦ断片またはそれらの任意の組み合わせに連
結されている。キメラタンパク質の非限定的な例として、以下：
（１）ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）－Ｌ１－Ｆ１：Ｖ－Ｌ２－Ｘ２－Ｌ３－Ｆ２、
（２）ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）－Ｌ１－Ｆ１：Ｆ２－Ｌ３－Ｘ２－Ｌ２－Ｖ、
（３）Ｆ１－Ｌ１－ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）：Ｖ－Ｌ２－Ｘ２－Ｌ３－Ｆ２、
（４）Ｆ１－Ｌ１－ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）；Ｆ２－Ｌ３－Ｘ２－Ｌ２－Ｖ、
（５）ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）－Ｌ１－Ｆ１－Ｌ４－Ｖ－Ｌ２－Ｘ２－Ｌ３－Ｆ２、
（６）ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）－Ｌ１－Ｆ１－Ｌ４－Ｆ２－Ｌ３－Ｘ２－Ｌ２－Ｖ、
（７）Ｆ１－Ｌ１－ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）－Ｌ４－ Ｖ－Ｌ２－Ｘ２－Ｌ３－Ｆ２、または
、
（８）Ｆ１－Ｌ１－ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）－Ｌ４－ Ｆ２－Ｌ３－Ｘ２－Ｌ２－Ｖ、
を含有する式を含有しても良く、ここで、
ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）は、ＦＶＩＩＩタンパク質および１以上のＸＴＥＮ配列を含有し、こ
こで、１以上のＸＴＥＮ配列は、ＦＶＩＩＩタンパク質のＮ末端またはＣ末端に連結され
、またはＦＶＩＩＩタンパク質中の１以上のアミノ酸のすぐ下流（たとえば、１以上のＸ
ＴＥＮ挿入部位）に挿入されており、
Ｌ１、Ｌ２またはＬ３のそれぞれは、たとえば開裂可能なリンカー等の任意のリンカーを
含有しており、
Ｌ４は、リンカー（プロセッシング可能なリンカー）であり、
Ｘ２は、１以上のＸＴＥＮ配列を含有し、
Ｆ１はＩｇ定常領域またはその一部を含有し、
Ｆ２は任意の追加のＩｇ定常領域またはその一部を含有し、および、
ＶはＶＷＦ断片を含有し、
（－）はペプチド結合または１以上のアミノ酸であり、および、
（：）は共有結合または非共有結合を含有する。
本発明の１つの態様において、本キメラタンパク質に有用なＶＷＦ断片は、ＦＶＩＩＩ
タンパク質と内因性ＶＷＦの相互作用を妨害または抑制するＶＷＦクリアランス受容体に
結合しない。ゆえに、当該ＶＷＦ断片を含有するキメラタンパク質は、ＶＷＦクリアラン
ス経路を介しては除去されない。本発明の他の態様において、ＶＷＦ断片は、１以上のプ
ロテアーゼ開裂からＦＶＩＩＩタンパク質を防御することができ、活性化からＦＶＩＩＩ
タンパク質を防御することができ、ＦＶＩＩＩタンパク質の重鎖および／または軽鎖を安
定化させることができ、または、１以上のスカベンジャー受容体によるＦＶＩＩＩタンパ
ク質のクリアランスを妨害することができる。
ＶＷＦ断片は、ＦＶＩＩＩタンパク質と内因性ＶＷＦの間の相互作用を妨害または抑制
することができるため、当該ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、ＶＷＦ断片を有していな
いＦＶＩＩＩタンパク質と比較し、延長される。１つの実施態様において、ＦＶＩＩＩタ
ンパク質の半減期は、野生型ＦＶＩＩＩよりも、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２
倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、
少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくと
も約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、延長される。他の実施態様にお
いて、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、少なくとも約１０時間、少なくとも約１１時間
、少なくとも約１２時間、少なくとも約１３時間、少なくとも約１４時間、少なくとも約
１５時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少な
くとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時
間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３６時間、少なくとも
約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少
なくとも約９６時間、または少なくとも約１０８時間である。
本キメラタンパク質に有用な、Ｉｇ定常領域またはその一部は、任意のリンカー（たと
えば、開裂可能なリンカー）により、ＶＷＦ断片に連結されている第一のＦｃ領域を含有
する。キメラタンパク質はさらに、任意のリンカーにより、ＦＶＩＩＩタンパク質または
ＸＴＥＮ配列、Ｉｇ定常領域もしくはその一部、ＶＷＦ断片、またはそれらの任意の組み
合わせに連結されている、追加のＩｇ定常領域またはその一部を含有しても良い。１つの
実施態様において、追加のＩｇ定常領域またはその一部は、任意のリンカーによりＦＶＩ
ＩＩタンパク質に連結されている。追加のＩｇ定常領域またはその一部は、第二のＦｃ領
域を含有してもよい。
本発明に有用なＩｇ定常領域またはその一部、および、本発明に有用な追加のＩｇ定常
領域またはその一部は、同一、または異なっている。
一部の態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩタンパク質のＣ末端または
Ｎ末端でＸＴＥＮ配列に連結され、または、成熟型天然ヒトＦＶＩＩＩ中の１以上のアミ
ノ酸のすぐ下流（たとえば、１以上の挿入部位）に挿入され、または、それらの任意の組
み合わせである。ＦＶＩＩＩタンパク質中の１以上の挿入部位は、Ａ１ドメイン、ａ１酸
性領域、Ａ２ドメイン、ａ２酸性領域、Ａ３ドメイン、Ｂドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２
ドメイン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＦＶＩＩＩタンパ
ク質の１以上のドメインの内に位置しても良く、または、Ａ１ドメインとａ１酸性領域、
ａ１酸性領域とＡ２ドメイン、Ａ２ドメインとａ２酸性領域、ａ２酸性領域とＢドメイン
、ＢドメインとＡ３ドメイン、Ａ３ドメインとＣ１ドメイン、Ｃ１ドメインとＣ２ドメイ
ン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＦＶＩＩＩタンパク質の
１以上のドメインの間に位置しても良く、または、Ａ１ドメインとａ１酸性領域、ａ１酸
性領域とＡ２ドメイン、Ａ２ドメインとａ２酸性領域、ａ２酸性領域とＢドメイン、Ｂド
メインとＡ３ドメイン、Ａ３ドメインとＣ１ドメイン、Ｃ１ドメインとＣ２ドメイン、お
よびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＦＶＩＩＩタンパク質の２つの
ドメインの間に位置しても良い。
１つの実施態様において、１以上の挿入部位は、表７、８、９、１０、１１またはそれ
らの任意の組み合わせ中のアミノ酸残基からなる群から選択される成熟型天然ヒトＦＶＩ
ＩＩ（たとえば、配列番号４[成熟型ＦＶＩＩＩ配列全長]）中の１以上のアミノ酸のすぐ
下流に位置する。
他の実施態様において、１以上の挿入部位は、成熟型天然ヒトＦＶＩＩＩの許容ループ
内に位置する。他の実施態様において、１以上の挿入部位は、成熟型天然ヒトＦＶＩＩＩ
のａ３領域内に位置する。たとえば、ＸＴＥＮ配列は、配列番号４（全長成熟型ＦＶＩＩ
Ｉ）のアミノ酸１６５６位のすぐ下流に挿入されてもよい。他の実施態様において、ＦＶ
ＩＩＩタンパク質は、少なくとも２つのＸＴＥＮ配列（ａ３領域内に挿入された第一のＸ
ＴＥＮ配列およびＦＶＩＩＩタンパク質の許容ループ内に挿入された第二のＸＴＥＮ配列
）に連結されている（たとえば、Ａ１－１、Ａ１－２、Ａ２－１、Ａ２－２、Ａ３－１、
または、Ａ３－２）。さらに他の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質は、少なくと
も３つのＸＴＥＮ配列（ａ３領域内に挿入されたＸＴＥＮ配列、ならびに、ＦＶＩＩＩタ
ンパク質内の１または２の許容ループ内に挿入された第二のＸＴＥＮ配列および第三のＸ
ＴＥＮ配列）に連結されている（たとえば、Ａ１－１、Ａ１－２、Ａ２－１、Ａ２－２、
Ａ３－１、または、Ａ３－２）。
ある実施態様において、１以上のＸＴＥＮ挿入のための１以上の挿入部位は、以下：
（１） アミノ酸３、（２）アミノ酸１８、
（３） アミノ酸２２、（４） アミノ酸２６、
（５） アミノ酸３２、（６） アミノ酸４０、
（７） アミノ酸６０、（８） アミノ酸６５、
（９） アミノ酸８１、（１０） アミノ酸１１６、
（１１） アミノ酸１１９、（１２） アミノ酸１３０、
（１３） アミノ酸１８８、（１４） アミノ酸２１１、
（１５） アミノ酸２１６、（１６） アミノ酸２２０、
（１７） アミノ酸２２４、（１８） アミノ酸２３０、
（１９） アミノ酸３３３、（２０） アミノ酸３３６、
（２１） アミノ酸３３９、（２２） アミノ酸３７５、
（２３） アミノ酸３９９、（２４） アミノ酸４０３、
（２５） アミノ酸４０９、（２６） アミノ酸４１６、
（２６） アミノ酸４４２、（２８） アミノ酸４８７、
（２９） アミノ酸４９０、（３０） アミノ酸４９４、
（３１） アミノ酸５００、（３２） アミノ酸５１８、
（３３） アミノ酸５９９、（３４） アミノ酸６０３、
（３５） アミノ酸７１３、（３６） アミノ酸７４５、
（３７） アミノ酸１６５６、（３８） アミノ酸１７１１、
（３９） アミノ酸１７２０、（４０） アミノ酸１７２５、
（４１） アミノ酸１７４９、（４２） アミノ酸１７９６、
（４３） アミノ酸１８０２、（４４） アミノ酸１８２７、
（４５） アミノ酸１８６１、（４６） アミノ酸１８９６、
（４７） アミノ酸１９００、（４８） アミノ酸１９０４、
（４９） アミノ酸１９０５、（５０） アミノ酸１９１０、
（５１） アミノ酸１９３７、（５２） アミノ酸２０１９、
（５３） アミノ酸２０６８、（５４） アミノ酸２１１１、
（５５） アミノ酸２１２０、（５６） アミノ酸２１７１、
（５７） アミノ酸２１８８、（５８） アミノ酸２２２７、
（５９） アミノ酸２２７７、および、（６０）それらの２以上の組み合わせ
からなる群から選択される１以上のアミノ酸のすぐ下流である。
一部の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質中に１つのＸＴＥＮが挿入されている
。一部の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質中に２つのＸＴＥＮが挿入されている
。一部の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質中に３つのＸＴＥＮが挿入されている
。
特定の例において、第一のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸２６のすぐ下流に挿入さ
れており、第二のＸＴＥＮは、配列番号４（全長成熟型ＦＶＩＩＩ）に対応するアミノ酸
１７２０のすぐ下流に挿入されている。他の例において、第一のＸＴＥＮは、配列番号４
のアミノ酸４０３のすぐ下流に挿入されており、第二のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ
酸１７２０のすぐ下流に挿入されている。一部の例において、第一のＸＴＥＮは、配列番
号４のアミノ酸１６５６のすぐ下流に挿入されており、第二のＸＴＥＮは、配列番号４の
アミノ酸１７２０のすぐ下流に挿入されている。他の例において、第一のＸＴＥＮは、配
列番号４のアミノ酸２６のすぐ下流に挿入されており、第二のＸＴＥＮは、配列番号４の
アミノ酸１６５６のすぐ下流に挿入されており、および、第三のＸＴＥＮは配列番号４の
アミノ酸１７２０のすぐ下流に挿入されている。さらに他の実施態様において、第一のＸ
ＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸４０３のすぐ下流に挿入されており、第二のＸＴＥＮは
、配列番号４のアミノ酸１６５６のすぐ下流に挿入され、および第三のＸＴＥＮは配列番
号４のアミノ酸１７２０のすぐ下流に挿入されている。さらに他の実施態様において、第
一のＸＴＥＮは配列番号４のアミノ酸４０３と４０４の間に挿入され、第二のＸＴＥＮは
配列番号４のアミノ酸１６５６のすぐ下流に挿入され、および、第三のＸＴＥＮは配列番
号４のアミノ酸１７２０のすぐ下流に挿入されている。ある実施態様において、第一のＸ
ＴＥＮは、配列番号４（全長成熟型ＦＶＩＩＩ）に対応するアミノ酸２６のすぐ下流に挿
入されており、第二のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸１７２０のすぐ下流に挿入され
ており、および、第三のＸＴＥＮは配列番号４のアミノ酸１９００のすぐ下流に挿入され
ている。一部の実施態様において、第一のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸２６のすぐ
下流に挿入されており、第二のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸１６５６のすぐ下流に
挿入されており、第三のＸＴＥＮは配列番号４のアミノ酸１７２０のすぐ下流に挿入され
ており、および、第四のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸１９００のすぐ下流に挿
入されている。他の例において、ＸＴＥＮは配列番号４のアミノ酸７４５のすぐ下流に挿
入されている。さらなる例において、第一のＸＴＥＮは配列番号４のアミノ酸１６５６の
すぐ下流に挿入されており、および第二のＸＴＥＮは配列番号４のアミノ酸１９００のす
ぐ下流に挿入されている。一部の実施態様において、第一のＸＴＥＮは配列番号４のアミ
ノ酸２６のすぐ下流に挿入されており、第二のＸＴＥＮは配列番号４のアミノ酸１６５６
のすぐ下流に挿入されており、および第三のＸＴＥＮは配列番号４のアミノ酸１９００の
すぐ下流に挿入されている。他の例において、第一のＸＴＥＮは配列番号４のアミノ酸４
０３のすぐ下流に挿入されており、および、第二のＸＴＥＮは配列番号４のアミノ酸７４
５のすぐ下流に挿入されている。一部の実施態様において、第一のＸＴＥＮは配列番号４
のアミノ酸７４５のすぐ下流に挿入されており、および、第二のＸＴＥＮは配列番号４の
アミノ酸１９００のすぐ下流に挿入されている。一部の実施態様において、第一のＸＴＥ
Ｎは配列番号４のアミノ酸１８のすぐ下流に挿入されており、および、第二のＸＴＥＮは
配列番号４のアミノ酸７４５のすぐ下流に挿入されている。
一部の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質は、二本鎖のＦＶＩＩＩアイソフォー
ムである。一部の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質は一本鎖ＦＶＩＩＩアイソフ
ォームである。
一部の実施態様において、挿入されるＸＴＥＮは、配列番号３９（ＡＥ２８８）である
。一部の例において、挿入されるＸＴＥＮは、配列番号３８および３７（ＡＧ１４４およ
びＡＥ１４４）である。一部の例において、挿入されるＸＴＥＮは、配列番号３７、３８
および３７（ＡＥ１４４、ＡＧ１４４およびＡＥ１４４）である。一部の実施態様におい
て、挿入されるＸＴＥＮは、配列番号３７および４０（ＡＥ１４４およびＡＥ２８８）で
ある。一部の実施態様において、挿入されるＸＴＥＮは、ＡＥ４２（配列番号３６）、Ａ
Ｅ７２（配列番号１２７）、ＡＥ１４４＿２Ａ（配列番号１２８）、ＡＥ１４４＿３Ｂ（
配列番号１２９）、ＡＥ１４４＿４Ａ（配列番号１３０）、ＡＥ１４４＿５Ａ（配列番号
１３１）、ＡＥ１４４＿６Ｂ（配列番号１３２）、ＡＥ１４４＿Ａ（配列番号１３３）、
ＡＥ１４４＿Ｂ（配列番号１３４）、ＡＥ１４４＿Ｃ（配列番号１３５）、ＡＥ１４４＿
Ｆ（配列番号１３６）、ＡＥ８６４（配列番号４３）、ＡＥ５７６（配列番号４１）、Ａ
Ｅ２８８（配列番号３９）、ＡＥ２８８＿２（配列番号１３７）、ＡＥ１４４（配列番号
３７）、ＡＧ８６４（配列番号４４）、ＡＧ５７６（配列番号４２）、ＡＧ２８８（配列
番号４０）、ＡＧ１４４（配列番号３８）、およびそれらの任意の組み合わせである。
本発明において有用なＦＶＩＩＩタンパク質は、Ｂドメインまたはその一部（たとえば
、ＳＱ Ｂドメイン欠損ＦＶＩＩＩ）を含有してもよい。１つの実施態様において、ＦＶ
ＩＩＩタンパク質は、一本鎖ＦＶＩＩＩを含有する。他の実施態様において、一本鎖ＦＶ
ＩＩＩは、全長成熟型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド（配列番号４）の１６４８残基、１６
４５残基またはその両方に相当する残基の位置で、または、ＳＱ ＢＤＤ第ＶＩＩＩ因子
（配列番号６）の７５４残基、７５１残基またはその両方の位置で、少なくとも１つのア
ミノ酸置換を含有する。他の実施態様において、アミノ酸置換は、アルギニン以外のアミ
ノ酸である。一部の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質はＦＶＩＩＩの重鎖および
ＦＶＩＩＩの軽鎖を含有し、ここで、当該重鎖および当該軽鎖は、金属結合により互いに
関連している。
ＦＶＩＩＩタンパク質は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）に対
し、低いアフィニティを有するか、または結合しなくともよい（たとえば、ＬＲＰに対す
るアフィニティを下げる、少なくとも１つのアミノ酸置換を含有することにより、または
、ＬＲＰに対する結合を除去する、少なくとも１つのアミノ酸置換を含有することにより
）。そのような少なくとも１つのアミノ酸置換は、全長成熟型ＦＶＩＩＩの、４７１残基
、４８４残基、４８７残基、４９０残基、４９７残基、２０９２残基、２０９３残基また
はそれらの２以上の組み合わせの残基の位置であってもよい。特定の実施態様において、
４７１、４８４または４９７残基でのアミノ酸置換は、アルギニン以外のアミノ酸であり
、４８７残基でのアミノ酸置換は、チロシン以外のアミノ酸であり、２０９２残基でのア
ミノ酸置換はリシン以外アミノ酸であり、または、２０９３残基でのアミノ酸置換は、フ
ェニルアラニン以外のアミノ酸である。
一部の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質は、少なくとも１つのアミノ酸置換を
含有し、それにより、置換を有しないＦＶＩＩＩタンパク質よりも、当該ＦＶＩＩＩタン
パク質はより安定となる。そのような置換は、ＦＶＩＩＩタンパク質のＡ２ドメインとＡ
３ドメインに位置しても良い（たとえば、全長成熟型ＦＶＩＩＩの、６６４残基、１８２
６残基、６６２残基、１８２８残基、またはそれらの２以上の組み合わせに対応する残基
の位置）。
本発明に有用なＶＷＦ断片は、Ｄ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有し、それらは共
に、ＦＶＩＩＩに結合することができる。ＶＷＦ断片は、配列番号２のアミノ酸７６４～
８６６に対し、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、
１００％同一であるＤ´ドメインのアミノ酸配列、および／または、配列番号２のアミノ
酸８６７～１２４０に対し、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９
％、または、１００％同一であるＤ３ドメインのアミノ酸配列を含有しても良い。１つの
実施態様において、ＶＷＦ断片は単量体である。他の実施態様において、ＶＷＦ断片は、
少なくとも２つのＶＷＦ断片、少なくとも３つのＶＷＦ断片、少なくとも４つのＶＷＦ断
片、少なくとも５つのＶＷＦ断片、または、少なくとも６つのＶＷＦ断片を含有する。Ｖ
ＷＦ断片は、配列番号２のアミノ酸７６４～１２４０に対し、少なくとも９０％、９５％
、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％同一であるアミノ酸を含有しても
よい。ＶＷＦ断片は、本質的に配列番号２のアミノ酸７６４～１２４０からなる、または
、配列番号２のアミノ酸７６４～１２４０からなることができる。ある実施態様において
、ＶＷＦ断片は、配列番号２の１０９９残基、１１４２残基または、１０９９と１１４２
残基の両方に相当する残基の位置で、少なくとも１つのアミノ酸置換を含有しても良い。
他の実施態様において、ＶＷＦ断片はさらに、ＶＷＦのＤ１ドメイン、Ｄ２ドメイン、ま
たはＤ１とＤ２ドメインを含有する。
ＶＷＦ断片はさらに、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ａ３ドメイン、Ｄ４ドメイン、Ｂ
１ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、ＣＫドメイン
、それらの１以上の断片、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＶ
ＷＦドメインを含有しても良い。たとえば、ＶＷＦ断片は、（１）ＶＷＦのＤ´ドメイン
およびＤ３ドメインもしくはそれらの断片、（２）ＶＷＦのＤ１、Ｄ´およびＤ３ドメイ
ンもしくはそれらの断片、（３）ＶＷＦのＤ２、Ｄ´およびＤ３ドメインもしくはそれら
の断片、（４）ＶＷＦのＤ１、Ｄ２、Ｄ´およびＤ３ドメインもしくはそれらの断片、ま
たは、（５）ＶＷＦのＤ１、Ｄ２、Ｄ´、Ｄ３およびＡ１ドメイン、もしくはそれらの断
片、本質的にからなる、または、からなることができる。一部の実施態様において、ＶＷ
Ｆ断片はさらに、ＶＷＦ断片に作動可能に連結されているＶＷＦまたはＦＶＩＩＩのシグ
ナルペプチドを含有する。
本発明に有用なリンカーのうち１つ以上は、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５
０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６
０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、３０
０、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８０
０、８５０、９００、９５０、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、ま
たは２０００アミノ酸の長さを有する。一部の実施態様において、リンカーのうちの１つ
以上は、約１～約２００アミノ酸の長さを有する。１つの実施態様において、リンカーの
うちの１つ以上は、少なくとも約２０、３５、４２、４８、７３、７５、９５、９８、１
４４、２８８、３２４、３３３、５７６、または、８６４アミノ酸の長さを有している。
他の実施態様において、リンカーのうちの１つ以上は、ｇｌｙ／ｓｅｒペプチド、ＸＴＥ
Ｎ配列またはそれら両方を含有する。ｇｌｙ／ｓｅｒペプチドの例としては、限定されな
いが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１３９）、または、Ｓ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配
列番号１４０）の式が挙げられ、ここで、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９お
よび１０からなる群から選択される正の整数である。たとえば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリ
ンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号６３）または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番
号１３８）であってもよい。１つの実施態様において、リンカーは、当該リンカーのＮ末
端に少なくとも１つの第一の開裂部位を含有し、当該リンカーのＣ末端に少なくとも１つ
の第二の開裂部位を含有し、またはそれら両方を含有する。他の実施態様において、リン
カーは２０アミノ酸、３５アミノ酸、４８アミノ酸、７３アミノ酸、または９５アミノ酸
のトロンビン開裂可能なリンカーを含有する。開裂可能なリンカーは、第ＸＩａ因子、第
ＸＩＩａ因子、カリクレイン、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＩＩａ因
子（トロンビン）、エラスターゼ２、グランザイム（ｇｒａｎｚｙｍｅ）Ｂ、ＴＥＶ、エ
ンテロキナーゼ、プロテアーゼ３Ｃ、ソルターゼ（ｓｏｒｔａｓｅ）Ａ、ＭＭＰ－１２、
ＭＭＰ－１３、ＭＭＰ－１７、およびＭＭＰ－２０（たとえば、ＴＬＤＰＲＳＦＬＬＲＮ
ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥＫ（配列番号８））からなる群から選択されるプロテアーゼ
による１つ以上の開裂部位を含有しても良い。当該１以上の開裂部位の非限定的な例とし
ては、ＲＲＲＲ（配列番号９）、ＲＫＲＲＫＲ（配列番号１０）、ＲＲＲＲＳ（配列番号
１１）、ＴＱＳＦＮＤＦＴＲ（配列番号１２）、ＳＶＳＱＴＳＫＬＴＲ（配列番号１３）
、ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ（配列番号１４）、ＴＴＫＩＫＰＲ（配列番号１５）、ＬＶＰＲ
Ｇ（配列番号１６）、ＡＬＲＰＲ（配列番号１７）、ＫＬＴＲＡＥＴ（配列番号１８）、
ＤＦＴＲＶＶＧ（配列番号１９）、ＴＭＴＲＩＶＧＧ（配列番号２０）、ＳＰＦＲＳＴＧ
Ｇ（配列番号２１）、ＬＱＶＲＩＶＧＧ（配列番号２２）、ＰＬＧＲＩＶＧＧ（配列番号
２３）、ＩＥＧＲＴＶＧＧ（配列番号２４）、ＬＴＰＲＳＬＬＶ（配列番号２５）、ＬＧ
ＰＶＳＧＶＰ （配列番号２６）、ＶＡＧＤＳＬＥＥ（配列番号２７）、ＧＰＡＧＬＧＧ
Ａ（配列番号２８）、ＧＰＡＧＬＲＧＡ（配列番号２９）、ＡＰＬＧＬＲＬＲ（配列番号
３０）、ＰＡＬＰＬＶＡＱ（配列番号３１）、ＥＮＬＹＦＱＧ （配列番号３２）、ＤＤ
ＤＫＩＶＧＧ（配列番号３３）、ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号３４）、および、ＬＰＫＴ
ＧＳＥＳ（配列番号３５）からなる群から選択されるアミノ酸配列が挙げられる。一部の
実施態様において、第一の開裂部位および第二の開裂部位は同一または異なっている。
本発明に有用なＸＴＥＮ配列は、ＡＥ４２（配列番号３６）、ＡＥ１４４（配列番号３
７）、ＡＧ１４４（配列番号３８）、ＡＥ２８８（配列番号３９）、ＡＧ２８８（配列番
号４０）、ＡＥ５７６（配列番号４１）、ＡＧ５７６（配列番号４２）、ＡＥ８６４（配
列番号４３）、ＡＥ７２（配列番号１２７）、ＡＥ１４４＿２Ａ（配列番号１２８）、Ａ
Ｅ１４４＿３Ｂ（配列番号１２９）、ＡＥ１４４＿４Ａ（配列番号１３０）、ＡＥ１４４
＿５Ａ（配列番号１３１）、ＡＥ１４４＿６Ｂ（配列番号１３２）、ＡＧ１４４＿Ａ（配
列番号１３３）、ＡＧ１４４＿Ｂ（配列番号１３４）、ＡＧ１４４＿Ｃ（配列番号１３５
）、ＡＧ１４４＿Ｆ（配列番号１３６）、ＡＥ２８８＿２（配列番号１３７）、または、
ＡＧ８６４（配列番号４４）からなる群から選択されても良い。特定の実施態様において
、ＸＴＥＮ配列は、ＡＧ２８８およびＡＧ２８８を含有する。
本発明のキメラタンパク質は、ポリシアル化、ペグ化、またはヘシル化（ｈｅｓｙｌａ
ｔｅｄ）されていても良い。
本発明はまた、当該キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはポリヌク
レオチドのセットを目的とする。当該ポリヌクレオチドはさらに、ＰＣ５またはＰＣ７を
コードするポリヌクレオチド鎖を含有しても良い。本発明はまた、ポリヌクレオチドまた
はポリヌクレオチドのセット、および、当該ポリヌクレオチドのセットに作動可能に連結
された１以上のプロモーターを含有するベクターを目的とする。当該ベクターはさらに、
追加のベクター（ＰＣ５またはＰＣ７をコードするポリヌクレオチド鎖を含有する）を含
有しても良い。本発明はまた、当該ポリヌクレオチドまたは当該ベクターを含有する宿主
細胞を見出したものである。当該宿主細胞は、哺乳類細胞（たとえば、ＨＥＫ２９３細胞
、ＣＨＯ細胞、またはＢＨＫ細胞）であっても良い。一部の実施態様において、宿主細胞
のＰＣ５またはＰＣ７は、ＶＷＦのＤ１Ｄ２ドメインを開裂する。
本発明はまた、キメラタンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞、お
よび、薬学的に受容可能な担体を含有する医薬組成物を目的とする。本発明の組成物は、
ゆえに、野生型ＦＶＩＩＩタンパク質と比較して、半減期が延長されている。ＦＶＩＩＩ
タンパク質の半減期は、野生型ＦＶＩＩＩよりも、少なくとも約１．５倍、少なくとも約
２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍
、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なく
とも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、延長される。第ＦＶＩＩＩ因
子の半減期は、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、
少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２
３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約２６時間、少なく
とも約２７時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約２９時間、少なくとも約３０時間
、少なくとも約３１時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３３時間、少なくとも約
３４時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少な
くとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９６時
間、または少なくとも約１０８時間である。
本発明の組成物は、局所投与、眼球内投与、非経口投与、くも膜下投与、硬膜下投与、
または経口投与からなる群から選択される経路により投与されても良い。１つの実施態様
において、組成物は、非経口投与（たとえば、静脈内または皮下投与）を介して投与され
る。本発明の組成物は、その必要のある患者における出血性疾患または状態を処置するの
に有用である。出血性疾患または状態は、出血凝固障害、関節出血、筋肉出血、口腔出血
、大量出血、筋肉内への大量出血、口腔内での大量出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、
頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後腔の出血、腹膜後
腔の出血、腸腰筋鞘の出血、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される
。１つの実施態様において、本キメラタンパク質で処置される対象は、外科手術を受ける
予定である。他の実施態様において、処置は、予防的に、または要求に応じて行われる。
本発明はまた、内因性ＶＷＦとＦＶＩＩＩタンパク質の結合を妨害または抑制する方法
を目的としており、本キメラタンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞または
組成物の有効量を、その必要のある対象に投与することを含み、ここで、ＶＷＦ断片がＦ
ＶＩＩＩタンパク質に結合し、それゆえに、内因性ＶＷＦの結合が妨害または抑制される
こととなる。本発明はさらに、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長または増加させる方
法を目的とし、ここで、当該方法には、キメラタンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター
、宿主細胞、または組成物の有効量を、その必要のある対象に投与することが含まれ、こ
こで、ＶＷＦ断片はＦＶＩＩＩタンパク質に結合し、それゆえに、ＦＶＩＩＩタンパク質
の半減期が延長または増加される。本方法はまた、細胞からＦＶＩＩＩタンパク質が除去
されることを妨害または抑制する方法を提示し、ここで、当該方法には、キメラタンパク
質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または組成物の有効量を、ＦＶＩＩＩタン
パク質またはＦＶＩＩＩタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する細胞に添加
することが含まれ、ここで、ＶＷＦ活性を有するタンパク質が、ＦＶＩＩＩタンパク質に
結合する。本発明の方法が有用な対象は、動物（たとえば、ヒト（たとえば、血友病Ａに
罹患している患者））である。
本発明はまた、その必要のある対象における出血性疾患または状態を処置する方法を提
示し、当該方法には、キメラタンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞または
組成物の有効量を投与することが含まれ、ここで、当該出血性疾患または状態は、出血凝
固障害、関節出血、筋肉出血、口腔出血、大量出血、筋肉内への大量出血、口腔内での大
量出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中
枢神経系出血、咽頭後腔の出血、腹膜後腔の出血、腸腰筋鞘の出血、からなる群から選択
される。治療は、予防的または要求に応じて行うものであっても良い。１つの実施態様に
おいて、有効量は、０．１μｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇである。
本発明にはまた、ポリヌクレオチドまたはベクターと１つ以上の宿主細胞をトランスフ
ェクトすること、および、当該宿主細胞中で当該キメラタンパク質を発現させること、を
含む、当該キメラタンパク質の製造方法が含まれる。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
（ｉ）ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ＶＷＦ）のＤ´ドメインおよびＤ３ドメイ
ンを含有するＶＷＦタンパク質、（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列、および、（ｉｉｉ）ＦＶＩＩＩ
タンパク質を含有するキメラタンパク質であって、ここで、上記ＶＷＦ断片および上記Ｘ
ＴＥＮ配列は、任意選択的なリンカーで連結されており、ここで、上記ＶＷＦ断片または
上記ＸＴＥＮ配列は、上記ＦＶＩＩＩタンパク質に連結または関連付けられている、キメ
ラタンパク質。
（項目２）
（ａ）Ｖ－Ｘ－ＦＶＩＩＩ、
（ｂ）ＦＶＩＩＩ－Ｘ－Ｖ、
（ｃ）Ｖ－Ｘ：ＦＶＩＩＩ、
（ｄ）Ｘ－Ｖ ：ＦＶＩＩＩ、
（ｅ）ＦＶＩＩＩ：Ｖ－Ｘ、または、
（ｆ）ＦＶＩＩＩ：Ｘ－Ｖ、
を含有する式を含有するキメラタンパク質であって、ここで、
Ｖは、ＶＷＦ断片を含有し、
Ｘは、１以上のＸＴＥＮ配列を含有し、
ＦＶＩＩＩは、ＦＶＩＩＩタンパク質を含有し；
（－）は、ペプチド結合または１以上のアミノ酸であり；
（：）は、共有結合または非共有結合である、キメラタンパク質。
（項目３）
上記ＸＴＥＮ配列が、リンカーによりＦＶＩＩＩタンパク質に連結されている、項目１
または２のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目４）
上記リンカーが、開裂可能なリンカーである、項目３に記載のキメラタンパク質。
（項目５）
上記ＶＷＦ断片、上記ＸＴＥＮ配列、および上記ＦＶＩＩＩタンパク質を含有する、一
本鎖ポリペプチドを含有する、項目１～４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目６）
第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖を含有し、ここで、上記第一のポリ
ペプチド鎖がＦＶＩＩＩを含有し、上記第二のポリペプチド鎖が上記ＶＷＦ断片および上
記ＸＴＥＮ配列を含有する、項目１～４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目７）
（ｉｖ）上記ＶＷＦ断片、上記ＸＴＥＮ配列、もしくは上記ＦＶＩＩＩタンパク質、ま
たはそれらの任意の組み合わせのいずれかに連結されたＩｇ定常領域またはその一部をさ
らに含有する、項目１～６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目８）
（ｇ）Ｖ－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－Ｆ１：ＦＶＩＩＩ－Ｌ３－Ｆ２；
（ｈ）Ｖ－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－Ｆ１：Ｆ２－Ｌ３－ＦＶＩＩＩ；
（ｉ）Ｆ１－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｖ：ＦＶＩＩＩ－Ｌ３－Ｆ２；
（ｊ）Ｆ１－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｖ：Ｆ２－Ｌ３－ＦＶＩＩＩ；
（ｋ）Ｖ－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－Ｆ１－Ｌ４－ＦＶＩＩＩ－Ｌ３－Ｆ２；
（ｌ）Ｆ２－Ｌ３－ＦＶＩＩＩ－Ｌ４－Ｆ１－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｖ；
（ｍ）ＦＶＩＩＩ－Ｌ３－Ｆ２－Ｌ４－Ｖ－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－Ｆ１；および、
（ｎ）Ｆ１－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｖ－Ｌ４－Ｆ２－Ｌ３－ＦＶＩＩＩ、
を含有する式を含有するキメラタンパク質であって、ここで、
Ｖは、ＶＷＦ断片を含有し、
Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３のそれぞれは、任意選択的なリンカーを含有し、
Ｌ４は、任意選択的なリンカーであり、
ＦＶＩＩＩは、ＦＶＩＩＩタンパク質を含有し、
Ｘは、１以上のＸＴＥＮ配列を含有し、
Ｆ１は、任意選択的なＩｇ定常領域またはその一部を含有し、
Ｆ２は、任意選択的な追加のＩｇ定常領域またはその一部を含有し、
（－）は、ペプチド結合または１以上のアミノ酸であり；
（：）は、共有結合または非共有結合である、キメラタンパク質。
（項目９）
上記Ｉｇ定常領域またはその一部は、上記ＶＷＦ断片の半減期を延長させる、項目７ま
たは８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１０）
上記Ｉｇ定常領域またはその一部は、上記ＸＴＥＮ配列または上記ＶＷＦ断片に連結さ
れている第一のＦｃ領域を含有する、項目７～９のいずれか１項に記載のキメラタンパク
質。
（項目１１）
上記Ｉｇ定常領域またはその一部は、リンカーにより上記ＸＴＥＮ配列に連結されてい
る、項目１０に記載のキメラタンパク質。
（項目１２）
上記リンカーは、開裂可能なリンカーを含有する、項目１２に記載のキメラタンパク質
。
（項目１３）
追加のＩｇ定常領域またはその一部をさらに含有する、項目７～１２のいずれか１項に
記載のキメラタンパク質。
（項目１４）
上記追加のＩｇ定常領域またはその一部は、追加のＦｃ領域を含有する、項目１３に記
載のキメラタンパク質。
（項目１５）
上記追加のＩｇ定常領域またはその一部は、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長させ
る、項目１４に記載のキメラタンパク質。
（項目１６）
上記追加のＩｇ定常領域またはその一部は、上記ＦＶＩＩＩタンパク質に連結されてい
る、項目１３～１５のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１７）
上記第二のＦｃ領域はさらに、リンカーにより上記ＶＷＦ断片に連結されている、項目
１６に記載のキメラタンパク質。
（項目１８）
上記リンカーは、プロセッシング可能なリンカーである、項目１７に記載のキメラタン
パク質。
（項目１９）
Ｌ４は、プロセッシング可能なリンカーである、項目８～１８のいずれか１項に記載の
キメラタンパク質。
（項目２０）
上記追加のＩｇ定常領域またはその一部は、、上記Ｉｇ定常領域またはその一部と関連
付けられている、項目７～１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目２１）
上記追加のＩｇ定常領域またはその一部は、共有結合により、上記Ｉｇ定常領域または
その一部と関連付けられている、項目２０に記載のキメラタンパク質。
（項目２２）
上記共有結合は、ジスルフィド結合である、項目２１に記載のキメラタンパク質。
（項目２３）
上記ＶＷＦ断片は、非共有結合により上記ＦＶＩＩＩタンパク質と関連付けられている
、項目１～２２のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目２４）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、上記ＶＷＦ断片を有していないＦＶＩＩＩタン
パク質、または野生型ＦＶＩＩＩタンパク質と比較して、延長されている、項目１～２３
のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目２５）
上記ＦＶＩＩＩの半減期が、上記ＶＷＦ断片を有していないＦＶＩＩＩタンパク質より
も、または野生型ＦＶＩＩＩと比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少
なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なく
とも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１
０倍、少なくとも約１１倍、または少なくとも約１２倍長く延長されている、項目２４に
記載のキメラタンパク質。
（項目２６）
上記第ＶＩＩＩ因子の半減期が、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少な
くとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時
間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２５時間、少なくとも
約２６時間、少なくとも約２７時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約２９時間、少
なくとも約３０時間、少なくとも約３１時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３３
時間、少なくとも約３４時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約３６時間、少なくと
も約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、
少なくとも約９６時間、または少なくとも約１０８時間である、項目２４に記載のキメラ
タンパク質。
（項目２７）
（ｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質、（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列、および、（ｉｉｉ）Ｉｇ定常領
域またはその一部を含有するキメラタンパク質であって、ここで、上記ＸＴＥＮ配列は、
任意選択的なリンカーにより上記ＦＶＩＩＩタンパク質のＮ末端またはＣ末端で上記ＦＶ
ＩＩＩタンパク質に連結されており、または、上記ＦＶＩＩＩタンパク質中の少なくとも
１以上の挿入部位の２アミノ酸の間に挿入されており、および、ここで、上記Ｉｇ定常領
域またはその一部は、上記ＦＶＩＩＩタンパク質または上記ＸＴＥＮ配列に連結され、ま
たは関連付けられている、キメラタンパク質。
（項目２８）
上記ＸＴＥＮ配列および上記Ｉｇ定常領域またはその一部は、上記ＦＶＩＩＩタンパク
質の半減期を延長する、項目２７に記載のキメラタンパク質。
（項目２９）
上記ＶＷＦ結合部位は、上記ＦＶＩＩＩタンパク質のＡ３ドメイン、またはＣ２ドメイ
ン、または上記Ａ３ドメインおよび上記Ｃ２ドメインの両方に位置づけられている、項目
２７および２８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目３０）
上記ＶＷＦ結合部位は、配列番号４のアミノ酸１６６９～１６８９およびアミノ酸２３
０３～２３３２に相当するアミノ酸配列を含有する、項目２９に記載のキメラタンパク質
。
（項目３１）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、上記Ｉｇ定常領域またはその一部を有していな
いＦＶＩＩＩタンパク質、または、上記ＸＴＥＮ配列を有していないＦＶＩＩＩタンパク
質と比較して、延長されている、項目２７～３０のいずれか１項に記載のキメラタンパク
質。
（項目３２）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期が、上記Ｉｇ定常領域またはその一部を有していな
いＦＶＩＩＩタンパク質、または、上記ＸＴＥＮ配列を有していないＦＶＩＩＩタンパク
質、または、野生型ＦＶＩＩＩよりも、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少な
くとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくと
も約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０
倍、少なくとも約１１倍、または少なくとも約１２倍長く延長されている、項目３１に記
載のキメラタンパク質。
（項目３３）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期が、少なくとも約１０時間、少なくとも約１１時間
、少なくとも約１２時間、少なくとも約１３時間、少なくとも約１４時間、少なくとも約
１５時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少な
くとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時
間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３６時間、少なくとも
約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少
なくとも約９６時間、または少なくとも約１０８時間である。項目３１に記載のキメラタ
ンパク質。
（項目３４）
上記Ｉｇ定常領域またはその一部が、第一のＦｃ領域を含有している、項目２７～３３
のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目３５）
追加のＩｇ定常領域またはその一部をさらに含有する、項目２７～３４のいずれか１項
に記載のキメラタンパク質。
（項目３６）
上記追加のＩｇ定常領域またはその一部が、上記第一のＦｃ領域に連結または関連付け
られている、第二のＦｃ領域を含有する、項目３５に記載のキメラタンパク質。
（項目３７）
上記第二のＦｃ領域が、共有結合により上記第一のＦｃ領域に関連付けられている、項
目３６に記載のキメラタンパク質。
（項目３８）
上記第一のＦｃ領域が、リンカーにより上記第二のＦｃ領域に連結されている、項目３
６に記載のキメラタンパク質。
（項目３９）
上記リンカーが、プロセッシング可能なリンカーである、項目３８に記載のキメラタン
パク質。
（項目４０）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質、上記ＸＴＥＮ配列、および上記Ｉｇ定常領域またはその一
部を含有する一本鎖ポリペプチドを含有する、項目２７～３４のいずれか１項に記載のキ
メラタンパク質。
（項目４１）
第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖を含有し、ここで、上記第一のポリ
ペプチド鎖が、上記ＦＶＩＩＩの重鎖を含有し、上記第二のポリペプチド鎖が、上記ＦＶ
ＩＩＩタンパク質の軽鎖およびＸＴＥＮ配列ならびに、上記Ｉｇ定常領域またはその一部
を含有する、項目２７～３４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目４２）
第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖を含有し、ここで、上記第一のポリ
ペプチド鎖が上記ＦＶＩＩＩタンパク質、上記ＸＴＥＮ配列、および上記Ｉｇ定常領域を
含有し、および、上記第二のポリペプチド鎖が上記追加のＩｇ定常領域またはその一部を
含有する、項目３５～３９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目４３）
第一のポリペプチド鎖、第二のポリペプチド鎖、および第三のポリペプチド鎖を含有し
、ここで、上記第一のポリペプチド鎖が上記ＦＶＩＩＩタンパク質の重鎖および上記ＸＴ
ＥＮ配列を含有し、上記第二のポリペプチド鎖が上記ＦＶＩＩＩタンパク質の軽鎖および
上記Ｉｇ定常領域またはその一部を含有し、および、上記第三のポリペプチド鎖が上記追
加のＩｇ定常領域またはその一部を含有する、項目３５～３９のいずれか１項に記載のキ
メラタンパク質。
（項目４４）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質、上記ＸＴＥＮ配列、上記Ｉｇ定常領域またはその一部、お
よび、上記追加のＩｇ定常領域またはその一部を含有する一本鎖ポリペプチドを含有する
、項目３５～３９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目４５）
ＶＷＦのＤ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有する、（ｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質、
（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列、（ｉｉｉ）ＶＷＦ断片、および（ｉｖ）Ｉｇ定常領域またはその
一部を含有するキメラタンパク質であって、ここで、上記ＸＴＥＮ配列は、任意選択的な
リンカーにより、上記ＦＶＩＩＩタンパク質のＮ末端またはＣ末端で上記ＦＶＩＩＩタン
パク質に連結され、または、上記ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上の挿入部位のすぐ下流で
挿入されており、上記ＶＷＦ断片は、上記ＦＶＩＩＩタンパク質または上記ＸＴＥＮ配列
に連結または関連付けられており、および、上記Ｉｇ定常領域またはその一部は、上記Ｆ
ＶＩＩＩタンパク質、上記ＸＴＥＮ配列、上記ＶＷＦ断片、またはそれらの任意の組み合
わせに連結されている、キメラタンパク質。
（項目４６）
（１）ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）－Ｌ１－Ｆ１：Ｖ－Ｌ２－Ｘ２－Ｌ３－Ｆ２；
（２）ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）－Ｌ１－Ｆ１：Ｆ２－Ｌ３－Ｘ２－Ｌ２－Ｖ；
（３）Ｆ１－Ｌ１－ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）：Ｖ－Ｌ２－Ｘ２－Ｌ３－Ｆ２；
（４）Ｆ１－Ｌ１－ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）；Ｆ２－Ｌ３－Ｘ２－Ｌ２－Ｖ；
（５）ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）－Ｌ１－Ｆ１－Ｌ４－Ｖ－Ｌ２－Ｘ２－Ｌ３－Ｆ２；
（６）ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）－Ｌ１－Ｆ１－Ｌ４－Ｆ２－Ｌ３－Ｘ２－Ｌ２－Ｖ；
（７）Ｆ１－Ｌ１－ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）－Ｌ４－Ｖ－Ｌ２－Ｘ２－Ｌ３－Ｆ２；または、
（８）Ｆ１－Ｌ１－ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）－Ｌ４－Ｆ２－Ｌ３－Ｘ２－Ｌ２－Ｖ、
を含有する式を含有するキメラタンパク質であって、ここで、ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）は、Ｆ
ＶＩＩＩタンパク質およびＸＴＥＮ配列を含有し、ここで、上記ＸＴＥＮ配列は、上記Ｆ
ＶＩＩＩタンパク質のＮ末端またはＣ末端に連結され、または、上記ＦＶＩＩＩタンパク
質の１以上のアミノ酸（「１以上の挿入部位」）のすぐ下流に挿入されており；
Ｌ１、Ｌ２、またはＬ３のそれぞれは、任意選択的なリンカーを含有し；
Ｌ４は、リンカーであり、
Ｘ２は、１以上のＸＴＥＮ配列を含有し、
Ｆ１は、Ｉｇ定常領域またはその一部を含有し、
Ｆ２は、任意選択的な追加のＩｇ定常領域またはその一部を含有し、および、
Ｖは、ＶＷＦ断片を含有し、
（－）は、ペプチド結合または１以上のアミノ酸であり；ならびに、
（：）は、共有結合または非共有結合である、キメラタンパク質。
（項目４７）
上記ＶＷＦ断片は、ＶＷＦクリアランス受容体に結合しない、項目４５または４６のい
ずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目４８）
上記ＶＷＦ断片は、１以上のプロテアーゼによる開裂から上記ＦＶＩＩＩタンパク質を
保護することができる、活性化から上記ＦＶＩＩＩタンパク質を保護することができる、
上記ＦＶＩＩＩタンパク質の重鎖および／または軽鎖を安定化することができる、または
、１以上のスカベンジャー受容体による上記ＦＶＩＩＩタンパク質の除去を妨害すること
ができる、項目４５～４７のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目４９）
上記Ｉｇ定常領域またはその一部は、上記ＦＶＩＩＩタンパク質のＶＷＦ結合部位を遮
蔽または妨害することにより、上記ＦＶＩＩＩタンパク質に内因性ＶＷＦが結合すること
を抑制または妨害する、項目４５～４８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目５０）
上記ＶＷＦ結合部位は、上記ＦＶＩＩＩタンパク質のＡ３ドメイン、またはＣ２ドメイ
ン、または、上記Ａ３ドメインおよび上記Ｃ２ドメインの両方に位置づけられている、項
目４９に記載のキメラタンパク質。
（項目５１）
上記ＶＷＦ結合部位は、配列番号４のアミノ酸１６６９～１６８９およびアミノ酸２３
０３～２３３２に相当するアミノ酸配列を含有する、項目４９または５０のいずれか１項
に記載のキメラタンパク質。
（項目５２）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、上記ＶＷＦ断片を有していないＦＶＩＩＩタン
パク質と比較して、延長されている、項目４５～５１のいずれか１項に記載のキメラタン
パク質。
（項目５３）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期が、野生型ＦＶＩＩＩよりも、少なくとも約１．５
倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、
少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくと
も約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、または少なくとも約１２倍長く延
長されている、項目５２に記載のキメラタンパク質。
（項目５４）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期が、少なくとも約１０時間、少なくとも約１１時間
、少なくとも約１２時間、少なくとも約１３時間、少なくとも約１４時間、少なくとも約
１５時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少な
くとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時
間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３６時間、少なくとも
約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少
なくとも約９６時間、または少なくとも約１０８時間である、項目５２に記載のキメラタ
ンパク質。
（項目５５）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質、上記ＸＴＥＮ配列、上記ＶＷＦ断片、および上記Ｉｇ定常
領域またはその一部を含有する一本鎖ポリペプチドを含有する、項目４５～５４のいずれ
か１項に記載のキメラタンパク質。
（項目５６）
上記Ｉｇ定常領域またはその一部は、第一のＦｃ領域を含有する、項目４５～５４のい
ずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目５７）
上記Ｉｇ定常領域またはその一部は、任意選択的なリンカーにより上記ＶＷＦ断片に連
結されている、項目４５～５４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目５８）
上記リンカーは、開裂可能なリンカーを含有する、項目５７に記載のキメラタンパク質
。
（項目５９）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質、上記Ｉｇ定常領域またはその一部、上記ＶＷＦ断片、また
はそれらの任意の組み合わせに、任意選択的なリンカーにより連結されている、追加のＩ
ｇ定常領域またはその一部をさらに含有する、項目４５～５０のいずれか１項に記載のキ
メラタンパク質。
（項目６０）
上記追加のＩｇ定常領域またはその一部は、任意選択的なリンカーにより上記ＦＶＩＩ
Ｉタンパク質に連結されている、項目５９に記載のキメラタンパク質。
（項目６１）
上記Ｉｇ定常領域またはその一部は、第二のＦｃ領域である。項目５９または６０に記
載のキメラタンパク質。
（項目６２）
上記Ｉｇ定常領域またはその一部、および、上記追加のＩｇ定常領域またはその一部は
、同一であるか、または異なっている、項目８～２６、４２～４４、および４６～６１の
いずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目６３）
第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖を含有し、ここで、上記第一のポリ
ペプチド鎖が上記ＦＶＩＩＩタンパク質、上記ＸＴＥＮ配列、および上記Ｉｇ定常領域ま
たはその一部を含有し、および、上記第二のポリペプチド鎖が、上記ＶＷＦ断片および上
記追加のＩｇ定常領域またはその一部を含有する、項目４６～６２のいずれか１項に記載
のキメラタンパク質。
（項目６４）
第一のポリペプチド鎖、第二のポリペプチド鎖、および第三のポリペプチド鎖を含有し
、ここで、上記第一のポリペプチド鎖が上記ＦＶＩＩＩタンパク質の重鎖および上記ＸＴ
ＥＮ配列を含有し、上記第二のポリペプチド鎖が上記ＦＶＩＩＩタンパク質の軽鎖および
上記Ｉｇ定常領域またはその一部を含有し、および、上記第三のポリペプチド鎖が上記Ｖ
ＷＦ断片および上記追加のＩｇ定常領域またはその一部を含有する、項目４６～６２のい
ずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目６５）
第一のポリペプチド鎖、第二のポリペプチド鎖、および第三のポリペプチド鎖を含有し
、ここで、上記第一のポリペプチド鎖が上記ＦＶＩＩＩタンパク質の重鎖を含有し、上記
第二のポリペプチド鎖が上記ＦＶＩＩＩタンパク質の軽鎖、上記ＸＴＥＮ配列および上記
Ｉｇ定常領域またはその一部を含有し、および、上記第三のポリペプチド鎖が上記ＶＷＦ
断片および上記追加のＩｇ定常領域またはその一部を含有する、項目４６～６２のいずれ
か１項に記載のキメラタンパク質。
（項目６６）
第一のポリペプチド鎖、および第二のポリペプチド鎖を含有し、ここで、上記第一のポ
リペプチド鎖が上記ＦＶＩＩＩタンパク質の重鎖および上記ＸＴＥＮ配列を含有し、およ
び、上記第二のポリペプチド鎖が上記ＦＶＩＩＩタンパク質の軽鎖、上記Ｉｇ定常領域ま
たはその一部、上記ＶＷＦ断片、および上記追加のＩｇ定常領域またはその一部を含有す
る、項目４６～６２のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目６７）
上記ＶＷＦ断片または上記追加のＩｇ定常領域もしくはその一部に連結された追加のＸ
ＴＥＮ配列をさらに含有する、項目６３～６６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質
。
（項目６８）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質が、上記ＦＶＩＩＩタンパク質のＣ末端またはＮ末端でＸＴ
ＥＮ配列に連結されている、または、上記ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上のアミノ酸のす
ぐ下流で挿入されている、またはそれらの任意の組み合わせである、項目１～２６のいず
れか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目６９）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質が、少なくとも２つのＸＴＥＮ配列、少なくとも３つのＸＴ
ＥＮ配列、少なくとも４つのＸＴＥＮ配列、少なくとも５つのＸＴＥＮ配列、または、少
なくとも６つのＸＴＥＮ配列に連結されている、項目２７～６８のいずれか１項に記載の
キメラタンパク質。
（項目７０）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質が、Ａ１ドメイン、ａ１酸性領域、Ａ２ドメイン、ａ２酸性
領域、Ｂドメイン、Ａ３ドメイン、ａ３酸性領域、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、それら
の１以上の断片、および、それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＦＶＩＩ
Ｉの１以上のドメインを含有する、項目１～６９のいずれか１項に記載のキメラタンパク
質。
（項目７１）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質の上記１以上の挿入部位が、Ａ１ドメイン、ａ１酸性領域、
Ａ２ドメイン、ａ２酸性領域、Ａ３ドメイン、Ｂドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン
、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される上記ＦＶＩＩＩタンパク質
の１以上のドメインの内に位置付けられる、または、Ａ１ドメインとａ１酸性領域、ａ１
酸性領域とＡ２ドメイン、Ａ２ドメインとａ２酸性領域、ａ２酸性領域とＢドメイン、Ｂ
ドメインとＡ３ドメイン、Ａ３ドメインとＣ１ドメイン、Ｃ１ドメインとＣ２ドメイン、
およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される上記ＦＶＩＩＩタンパク質の
１以上のドメインの間に位置付けられる、または、Ａ１ドメインとａ１酸性領域、ａ１酸
性領域とＡ２ドメイン、Ａ２ドメインとａ２酸性領域、ａ２酸性領域とＢドメイン、Ｂド
メインとＡ３ドメイン、Ａ３ドメインとＣ１ドメイン、Ｃ１ドメインとＣ２ドメイン、お
よびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される上記ＦＶＩＩＩタンパク質の２
つのドメインの間に位置づけられる、項目２７～７０のいずれか１項に記載のキメラタン
パク質。
（項目７２）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上の挿入部位が、表７、表８、表９、および表１０の
アミノ酸残基からなる群から選択される１以上のアミノ酸である、項目２７～７１のいず
れか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目７３）
配列番号４のアミノ酸３Ｒに相当する挿入部位で挿入された上記ＸＴＥＮ配列が、ＡＴ
Ｒのアミノ酸配列をさらに含有する、項目７２に記載のキメラタンパク質。
（項目７４）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上の挿入部位が、
（１） アミノ酸３、（２）アミノ酸１８、
（３） アミノ酸２２、（４） アミノ酸２６、
（５） アミノ酸３２、（６） アミノ酸４０、
（７） アミノ酸６０、（８） アミノ酸６５、
（９） アミノ酸８１、（１０） アミノ酸１１６、
（１１） アミノ酸１１９、（１２） アミノ酸１３０、
（１３） アミノ酸１８８、（１４） アミノ酸２１１、
（１５） アミノ酸２１６、（１６） アミノ酸２２０、
（１７） アミノ酸２２４、（１８） アミノ酸２３０、
（１９） アミノ酸３３３、（２０） アミノ酸３３６、
（２１） アミノ酸３３９、（２２） アミノ酸３７５、
（２３） アミノ酸３９９、（２４） アミノ酸４０３、
（２５） アミノ酸４０９、（２６） アミノ酸４１６、
（２６） アミノ酸４４２、（２８） アミノ酸４８７、
（２９） アミノ酸４９０、（３０） アミノ酸４９４、
（３１） アミノ酸５００、（３２） アミノ酸５１８、
（３３） アミノ酸５９９、（３４） アミノ酸６０３、
（３５） アミノ酸７１３、（３６） アミノ酸７４５、
（３７） アミノ酸１６５６、（３８） アミノ酸１７１１、
（３９） アミノ酸１７２０、（４０） アミノ酸１７２５、
（４１） アミノ酸１７４９、（４２） アミノ酸１７９６、
（４３） アミノ酸１８０２、（４４） アミノ酸１８２７、
（４５） アミノ酸１８６１、（４６） アミノ酸１８９６、
（４７） アミノ酸１９００、（４８） アミノ酸１９０４、
（４９） アミノ酸１９０５、（５０） アミノ酸１９１０、
（５１） アミノ酸１９３７、（５２） アミノ酸２０１９、
（５３） アミノ酸２０６８、（５４） アミノ酸２１１１、
（５５） アミノ酸２１２０、（５６） アミノ酸２１７１、
（５７） アミノ酸２１８８、（５８） アミノ酸２２２７、
（５９） アミノ酸２２７７、および、（６０）それらの２以上の組み合わせ、
からなる群から選択される１以上のアミノ酸のすぐ下流に位置づけられる、項目２７～７
１のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目７５）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質が、Ｂドメインまたはその一部を含有する、項目１～７４の
いずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目７６）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質が、ＳＱ Ｂドメイン欠損ＦＶＩＩＩである、項目７５に記
載のキメラタンパク質。
（項目７７）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質が、一本鎖ＦＶＩＩＩを含有する、項目１～７６のいずれか
１項に記載のキメラタンパク質。
（項目７８）
上記一本鎖ＦＶＩＩＩが、全長成熟型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド（配列番号４）の、
１６４８残基、１６４５残基、もしくはその両方に相当する残基で、または、ＳＱ ＢＤ
Ｄ第ＶＩＩＩ因子（配列番号６）の７５４残基、７５１残基、もしくはその両方に相当す
る残基で、少なくとも１以上のアミノ酸置換を含有する、項目７７に記載のキメラタンパ
ク質。
（項目７９）
上記アミノ酸置換が、アルギニン以外のアミノ酸である、項目７８に記載のキメラタン
パク質。
（項目８０）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質が、ＦＶＩＩＩの重鎖および第ＶＩＩＩ因子の軽鎖を含有し
、ここで、上記重鎖および軽鎖は、金属結合により互いに関連付けられている、項目１～
７６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目８１）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質が、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）
に対し、低いアフィニティを有するか、または結合しない、項目１～８０のいずれか１項
に記載のキメラタンパク質。
（項目８２）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質が、上記ＬＲＰに対するアフィニティを減少させる、または
、上記ＬＲＰに対する結合を消失させる、アミノ酸置換を少なくとも１つ含有する、項目
８１に記載のキメラタンパク質。
（項目８３）
上記少なくとも１つのアミノ酸置換が、全長成熟型ＦＶＩＩＩの、４７１残基、４８４
残基、４８７残基、４９０残基、４９７残基、２０９２残基、２０９３残基またはそれら
の２以上の組み合わせに相当する残基の位置である、項目８２に記載のキメラタンパク質
。
（項目８４）
４７１、４８４または４９７残基でのアミノ酸置換は、アルギニン以外のアミノ酸であ
り、４８７残基でのアミノ酸置換は、チロシン以外のアミノ酸であり、２０９２残基での
アミノ酸置換はリシン以外のアミノ酸であり、または、２０９３残基でのアミノ酸置換は
、フェニルアラニン以外のアミノ酸である、項目８３に記載のキメラタンパク質。
（項目８５）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質が、上記置換を有していないＦＶＩＩＩタンパク質よりも、
上記ＦＶＩＩＩタンパク質をより安定化させるアミノ酸置換を少なくとも１つ含有する、
項目１～８４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目８６）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質の上記Ａ２ドメインおよびＡ３ドメインが、共有結合により
互いに関連付けられている、項目８５に記載のキメラタンパク質。
（項目８７）
上記少なくとも１つのアミノ酸置換が、全長成熟型ＦＶＩＩＩの６６４残基、１８２６
残基、６６２残基、１８２８残基、またはそれらの２以上の組み合わせに相当する残基の
位置である、項目８５または８６に記載のキメラタンパク質。
（項目８８）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質が、（ａ）全長成熟型ＦＶＩＩＩの６６４残基に相当する残
基でシステイン、および全長成熟型ＦＶＩＩＩの１８２６残基に相当する残基でシステイ
ン、または、（ｂ）全長成熟型ＦＶＩＩＩの６６２残基に相当する残基でシステイン、お
よび全長成熟型ＦＶＩＩＩの１８２８残基に相当する残基でシステイン、を含有する、項
目８７に記載のキメラタンパク質。
（項目８９）
上記ＶＷＦ断片が、配列番号２のアミノ酸７６４～１２７４ではない、項目１～２６お
よび４５～８８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目９０）
上記Ｄ´ドメインのアミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸７６４～８６６に対して、
少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％同一で
ある、項目１～２６および４５～８９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目９１）
上記Ｄ３ドメインのアミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸８６７～１２４０に対して
、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％同一
である、項目１～２６および４５～９０のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目９２）
上記ＶＷＦ断片が、単量体である、項目１～２６および４５～９１のいずれか１項に記
載のキメラタンパク質。
（項目９３）
上記ＶＷＦ断片が、少なくとも２つのＶＷＦ断片、少なくとも３つのＶＷＦ断片、少な
くとも４つのＶＷＦ断片、少なくとも５つのＶＷＦ断片、または、少なくとも６つのＶＷ
Ｆ断片を含有する、項目１～２６および４５～９１のいずれか１項に記載のキメラタンパ
ク質。
（項目９４）
上記ＶＷＦ断片が、配列番号２のアミノ酸７６４～１２４０に対して、少なくとも９０
％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％同一であるアミノ酸を
含有する、項目１～２６および４５～９３のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目９５）
上記ＶＷＦ断片が、配列番号２のアミノ酸７６４～１２４０から本質的になる、または
、からなる、項目９４に記載のキメラタンパク質。
（項目９６）
上記ＶＷＦ断片が、配列番号２の１０９９残基、１１４２残基または、１０９９残基お
よび１１４２残基の両方に相当する残基で、少なくとも１つのアミノ酸置換を含有する、
項目１～２６および４５～９５のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目９７）
上記ＶＷＦ断片が、配列番号２の１０９９残基、１１４２残基または、１０９９残基お
よび１１４２残基の両方に相当する残基に対して置換された、システイン以外のアミノ酸
を含有する、項目９６に記載のキメラタンパク質。
（項目９８）
上記ＶＷＦ断片がさらに、ＶＷＦのＤ１ドメイン、Ｄ２ドメインまたは、Ｄ１およびＤ
２ドメインを含有する、項目１～２６および４５～９７のいずれか１項に記載のキメラタ
ンパク質。
（項目９９）
上記ＶＷＦ断片がさらに、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ａ３ドメイン、Ｄ４ドメイン、
Ｂ１ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、ＣＫドメイ
ン、それらの１以上の断片、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される
ＶＷＦドメインを含有する、項目１～２７および４５～９８のいずれか１項に記載のキメ
ラタンパク質。
（項目１００）
上記ＶＷＦ断片が：（１）ＶＷＦのＤ´およびＤ３ドメイン、またはその断片；（２）
ＶＷＦのＤ１、Ｄ´およびＤ３ドメインまたはその断片；（３）ＶＷＦのＤ２、Ｄ´およ
びＤ３ドメインまたはその断片；（４）ＶＷＦのＤ１、Ｄ２、Ｄ´およびＤ３ドメインま
たはその断片；または、（５）ＶＷＦのＤ１、Ｄ２、Ｄ´、Ｄ３およびＡ１ドメインまた
はその断片から本質的になる、または、からなる、項目１～２７および４５～９９のいず
れか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１０１）
上記ＶＷＦ断片が、上記ＶＷＦ断片に作動可能に連結されているＶＷＦまたはＦＶＩＩ
Ｉのシグナルペプチドをさらに含有する、項目１～２７および４５～１００いずれか１項
に記載のキメラタンパク質。
（項目１０２）
上記リンカーのうちの１以上が、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、
７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０
、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、３００、３５０
、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０
、９００、９５０、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、または２００
０アミノ酸の長さを有する、項目１～１０１のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１０３）
上記リンカーのうちの１以上が、約１～約２０００アミノ酸の長さを有する、項目１～
１０１のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１０４）
上記リンカーのうちの１以上が、少なくとも約２０、３５、４２、４８、７３、７５、
９５、９８、１４４、２８８、３２４、３３３、５７６、または８６４アミノ酸の長さを
有する、項目１０３に記載のキメラタンパク質。
（項目１０５）
上記リンカーのうちの１以上が、Ｇｌｙ／Ｓｅｒペプチドを含有する、項目１～１０４
のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１０６）
上記Ｇｌｙ／Ｓｅｒペプチドが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１３９）、または、
Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１４０）の式を有し、ここで、ｎは、１、２、３
、４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される正の整数である、項目１
０５に記載のキメラタンパク質。
（項目１０７）
上記（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカーが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号６３）または
、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号１３８）である、項目１０６に記載のキメラタンパク
質。
（項目１０８）
上記ＸＴＥＮ配列が、ＡＥ４２、ＡＥ７２、ＡＥ８６４、ＡＥ５７６、ＡＥ２８８、Ａ
Ｅ１４４、ＡＧ８６４、ＡＧ５７６、ＡＧ２８８、およびＡＧ１４４からなる群から選択
される、項目１～１０７のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１０９）
上記ＸＴＥＮ配列が、配列番号３６；配列番号３７；配列番号３８；配列番号３９；配
列番号４０；配列番号４１；配列番号４２；配列番号４３、配列番号４４および、配列番
号１２７からなる群から選択される、項目１０８に記載のキメラタンパク質。
（項目１１０）
上記ＸＴＥＮ配列が、ＡＥ２８８またはＡＧ２８８である、項目１０９に記載のキメラ
タンパク質。
（項目１１１）
上記リンカーが、上記リンカーのＮ末端で少なくとも１つの第一の開裂部位を含有し、
上記リンカーのＣ末端で少なくとも１つの第二の開裂部位を含有し、または、その両方で
ある、項目１～１１０のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１１２）
上記リンカーが、２０アミノ酸、３５アミノ酸、４８アミノ酸、７３アミノ酸、または
９５アミノ酸を含有する、項目１～１１１のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１１３）
上記リンカーが、４８アミノ酸のトロンビン開裂リンカーである、項目１１２に記載の
キメラタンパク質。
（項目１１４）
上記リンカーが、３５アミノ酸のトロンビン開裂リンカーである、項目１１２に記載の
キメラタンパク質。
（項目１１５）
上記開裂部位の１以上が、ＴＬＤＰＲＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥＫ（配
列番号８）である、項目１１１に記載のキメラタンパク質。
（項目１１６）
上記開裂部位の１以上が、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、カリクレイン、第ＶＩＩａ
因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＩＩａ因子（トロンビン）、エラスターゼ２、グラ
ンザイム－Ｂ、ＴＥＶ、エンテロキナーゼ、プロテアーゼ３Ｃ、ソルターゼＡ、ＭＭＰ－
１２、ＭＭＰ－１３、ＭＭＰ－１７およびＭＭＰ－２０からなる群から選択されるプロテ
アーゼにより開裂される、項目１１１に記載のキメラタンパク質。
（項目１１７）
上記開裂部位の１以上が、ＲＲＲＲ（配列番号９）、ＲＫＲＲＫＲ（配列番号１０）、
ＲＲＲＲＳ（配列番号１１）、ＴＱＳＦＮＤＦＴＲ（配列番号１２）、ＳＶＳＱＴＳＫＬ
ＴＲ（配列番号１３）、ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ（配列番号１４）、ＴＴＫＩＫＰＲ（配列
番号１５）、ＬＶＰＲＧ（配列番号１６）、ＡＬＲＰＲ（配列番号１７）、ＫＬＴＲＡＥ
Ｔ（配列番号１８）、ＤＦＴＲＶＶＧ（配列番号１９）、ＴＭＴＲＩＶＧＧ（配列番号２
０）、ＳＰＦＲＳＴＧＧ（配列番号２１）、ＬＱＶＲＩＶＧＧ（配列番号２２）、ＰＬＧ
ＲＩＶＧＧ（配列番号２３）、ＩＥＧＲＴＶＧＧ（配列番号２４）、ＬＴＰＲＳＬＬＶ（
配列番号２５）、ＬＧＰＶＳＧＶＰ（配列番号２６）、ＶＡＧＤＳＬＥＥ（配列番号２７
）、ＧＰＡＧＬＧＧＡ（配列番号２８）、ＧＰＡＧＬＲＧＡ（配列番号２９）、ＡＰＬＧ
ＬＲＬＲ（配列番号３０）、ＰＡＬＰＬＶＡＱ（配列番号３１）、ＥＮＬＹＦＱＧ（配列
番号３２）、ＤＤＤＫＩＶＧＧ（配列番号３３）、ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号３４）、
およびＬＰＫＴＧＳＥＳ（配列番号３５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有
する、項目１１１または１１６のいずれかに記載のキメラタンパク質。
（項目１１８）
上記第一の開裂部位および上記第二の開裂部位が、同一、または異なっている、項目１
１１～１１７のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１１９）
ポリシアル化、ペグ化、またはヘシル化されている、項目１～１１８のいずれか１項に
記載のキメラタンパク質。
（項目１２０）
項目１～１２０のいずれか１項に記載のキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチ
ドまたは、ポリヌクレオチドのセット。
（項目１２１）
ＰＣ５または、ＰＣ７をコードする、ポリヌクレオチド鎖をさらに含有する、項目１２
０に記載のポリヌクレオチド。
（項目１２２）
項目１２０または１２１に記載のポリヌクレオチド、および上記ポリヌクレオチドまた
はポリヌクレオチドのセットに作動可能に連結されている１以上のプロモーターを含有す
る、ベクター。
（項目１２３）
ＰＣ５またはＰＣ７をコードするポリヌクレオチド鎖を含有する、追加のベクターをさ
らに含有する、項目１２２に記載のベクター。
（項目１２４）
項目１２０または１２１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または項目１２２
または１２３のいずれか１項に記載のベクターを含有する、宿主細胞。
（項目１２５）
哺乳類細胞である、項目１２４に記載の宿主細胞。
（項目１２６）
上記哺乳類細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、およびＢＨＫ細胞からなる群から
選択される、項目１２５に記載の宿主細胞。
（項目１２７）
項目１～１１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質、項目１２０または１２１の
いずれか１項に記載のポリヌクレオチド、項目１２２または１２３のいずれか１項に記載
のベクター、または、項目１２４～１２５のいずれか１項に記載の宿主細胞、および、薬
学的に受容可能な担体を含有する、医薬組成物。
（項目１２８）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質が、野生型ＦＶＩＩＩタンパク質と比較して、半減期が延長
されている、項目１２７に記載の組成物。
（項目１２９）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期が、野生型ＦＶＩＩＩよりも、少なくとも約少なく
とも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なく
とも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８
倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、または少なくとも約
１２倍長く延長されている、項目１２７または１２８のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１３０）
上記第ＶＩＩＩ因子の半減期が、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少な
くとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時
間、少なくとも約２３時間、少なくとも約 ２４時間、少なくとも約２５時間、少なくと
も約２６時間、少なくとも約２７時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約２９時間、
少なくとも約３０時間、少なくとも約３１時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３
３時間、少なくとも約３４時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約３６時間、少なく
とも約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間
、少なくとも約９６時間、または少なくとも約１０８時間である、項目１２８または１２
９のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１３１）
局所投与、眼球内投与、非経口投与、くも膜下投与、硬膜下投与、および経口投与から
なる群から選択される経路により投与される、項目１２７～１３０のいずれか１項に記載
の組成物。
（項目１３２）
上記非経口投与が、静脈内投与または皮下投与である、項目１３１に記載の組成物。
（項目１３３）
その必要のある対象における、出血性疾患または状態を処置するために用いられる、項
目１２７～１３２のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１３４）
上記出血性疾患または状態が、出血凝固障害、関節出血、筋肉出血、口腔出血、大量出
血、筋肉内への大量出血、口腔内での大量出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出
血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後腔の出血、腹膜後腔の出血
、腸腰筋鞘の出血、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、項目１
３３に記載の組成物。
（項目１３５）
上記対象が、外科手術を受ける予定である、項目１３３または１３４のいずれか１項に
記載の組成物。
（項目１３６）
上記処置が、予防的に、または、要求に応じて行われるものである、項目１３３～１３
５のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１３７）
項目１～２６および４５～１１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質、項目１２
０または１２１のいずれかに記載のポリヌクレオチド、項目１２２または１２３のいずれ
か１項に記載のベクター、項目１２４～１２６のいずれか１項に記載の宿主細胞、または
、項目１２７～１３６のいずれか１項に記載の組成物の有効量を、それを必要とする対象
に添加することを含む、内因性ＶＷＦとＦＶＩＩＩタンパク質の結合を妨害または抑制す
る方法であって、ここで、上記ＶＷＦ断片は、上記ＦＶＩＩＩタンパク質に結合し、それ
によって、内因性ＶＷＦの結合を妨害または抑制する、方法。
（項目１３８）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長または増加させる方法であって、ここで、上
記方法は、項目１～２６および４５～１１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質、
項目１２０または１２１のいずれかに記載のポリヌクレオチド、項目１２２または１２３
のいずれか１項に記載のベクター、項目１２４～１２６のいずれか１項に記載の宿主細胞
、または、項目１２７～１３６のいずれか１項に記載の組成物の有効量を、それを必要と
する対象に添加することを含み、ここで、上記ＶＷＦ断片は、上記ＦＶＩＩＩタンパク質
に結合し、それによって、上記ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長または増加させる、
方法。
（項目１３９）
細胞からのＦＶＩＩＩタンパク質の除去を妨害または抑制する方法であって、ここで、
上記方法は、項目１～２６および４５～１１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質
、項目１２０または１２１のいずれかに記載のポリヌクレオチド、項目１２２または１２
３のいずれか１項に記載のベクター、項目１２４～１２６のいずれか１項に記載の宿主細
胞、または、項目１２７～１３６のいずれか１項に記載の組成物の有効量を、ＦＶＩＩＩ
タンパク質または上記ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する細
胞に添加することを含み、ここで、上記ＶＷＦ活性を有するタンパク質は、上記ＦＶＩＩ
Ｉタンパク質に結合する、方法。
（項目１４０）
上記対象が、動物である、項目１３７～１３９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４１）
上記動物が、ヒトである、項目１４０に記載の方法。
（項目１４２）
上記対象が、血友病Ａに罹患している、項目１４０に記載の方法。
（項目１４３）
項目１～２６および４５～１１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質、項目１２
０または１２１のいずれかに記載のポリヌクレオチド、項目１２２または１２３のいずれ
か１項に記載のベクター、項目１２４～１２６のいずれか１項に記載の宿主細胞、または
、項目１２７～１３６のいずれか１項に記載の組成物の有効量を投与することを含む、そ
れを必要とする対象に、出血性疾患または障害を処置する方法であって、ここで、上記出
血性疾患または障害は、出血凝固障害、関節出血、筋肉出血、口腔出血、大量出血、筋肉
内への大量出血、口腔内での大量出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔
内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後腔の出血、腹膜後腔の出血、腸腰筋
鞘の出血からなる群から選択される、方法。
（項目１４４）
上記処置が、予防的または要求に応じて行われる、項目１４３に記載の方法。
（項目１４５）
上記有効量が、０．１μｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇである、項目１４３または１４４
のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４６）
項目１～１１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質、項目１２０または１２１の
いずれかに記載のポリヌクレオチド、項目１２２または１２３のいずれか１項に記載のベ
クター、項目１２４～１２６のいずれか１項に記載の宿主細胞、または、項目１２７～１
３６のいずれか１項に記載の組成物が、局所投与、眼球内投与、非経口投与、くも膜下投
与、硬膜下投与、および経口投与からなる群から選択される経路により投与される、項目
１４３～１４５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４７）
上記非経口投与が、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、および皮内投与からなる群か
ら選択される、項目１４６に記載の方法。
（項目１４８）
項目１２０または１２１のいずれかに記載のポリヌクレオチド、または、項目１２２ま
たは１２３のいずれか１項に記載のベクターで、宿主細胞の１以上をトランスフェクトす
ること、および、上記キメラタンパク質を上記宿主細胞内で発現させること、を含有する
、キメラタンパク質を作製する方法。
（項目１４９）
上記ＸＴＥＮ挿入部位が、成熟型ＦＶＩＩＩタンパク質（配列番号４）の７４５残基の
すぐ下流である、項目２７～１１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１５０）
上記ＸＴＥＮ挿入部位が、上記ＦＶＩＩＩタンパク質の１６５６残基および１９００残
基のすぐ下流である、項目２７～１１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１５１）
上記ＸＴＥＮ挿入部位が、上記ＦＶＩＩＩタンパク質の２６残基、１６５６残基および
１９００残基のすぐ下流である、項目２７～１１９のいずれか１項に記載のキメラタンパ
ク質。
（項目１５２）
上記ＸＴＥＮ挿入部位が、上記ＦＶＩＩＩタンパク質の４０３残基および７４５残基の
すぐ下流である、項目２７～１１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１５３）
上記ＸＴＥＮ挿入部位が、上記ＦＶＩＩＩタンパク質の７４５残基および１９００残基
のすぐ下流である、項目２７～１１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１５４）
上記ＸＴＥＮ挿入部位が、上記ＦＶＩＩＩタンパク質の１８残基および７４５残基のす
ぐ下流である、項目２７～１１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１５５）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質が、二本鎖ＦＶＩＩＩアイソフォームである、項目１４９～
１５４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１５６）
上記ＦＶＩＩＩタンパク質が、一本鎖ＦＶＩＩＩアイソフォームである、項目１４９～
１５４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１５７）
１つのＸＴＥＮを含有する、項目１４９～１５６のいずれか１項に記載のキメラタンパ
ク質。
（項目１５８）
２つのＸＴＥＮを含有する、項目１４９～１５６のいずれか１項に記載のキメラタンパ
ク質。
（項目１５９）
挿入されている３つのＸＴＥＮを含有する、項目１４９～１５６のいずれか１項に記載
のキメラタンパク質。
（項目１６０）
上記ＸＴＥＮが、配列番号３９（ＡＥ２８８）である、項目１４９～１５７のいずれか
１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１６１）
上記ＸＴＥＮが、配列番号３８および３７（ＡＧ１４４およびＡＥ１４４）である、項
目１４９～１５６および１５８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１６２）
上記ＸＴＥＮが、配列番号３７、３８および３７（ＡＥ１４４、ＡＧ１４４、およびＡ
Ｅ１４４）である、項目１４９～１５６および１５９のいずれか１項に記載のキメラタン
パク質。
（項目１６３）
上記ＸＴＥＮが、配列番号３８および３９（ＡＥ１４４およびＡＥ２８８）である、項
目１４９～１５６および１５７のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
（項目１６４）
上記ＰＣ５またはＰＣ７が、ＶＷＦの上記Ｄ１Ｄ２ドメインを開裂する、項目１２４に
記載の宿主細胞。
（項目１６５）
少なくとも２つのＸＴＥＮ、少なくとも３つのＸＴＥＮ、少なくとも４つのＸＴＥＮ、
少なくとも５つのＸＴＥＮ、または少なくとも６つのＸＴＥＮを含有する、項目１～２７
のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
ＶＷＦ断片の概略図である。図１Ａは、本発明に有用な、３つの例示的なＶＷＦ断片（ＶＷＦ－００２、ＶＷＦ－０１０、および、ＶＷＦ－０１３）を示す。ＶＷＦ－００２は、配列番号１２４（配列番号２のアミノ酸７６４～１２４０）のアミノ酸１～４７７を含有し、プレ／プロペプチド配列無しで合成される。ＶＷＦ－０１０は、Ｄ´Ｄ３ドメインに加え、Ｄ１Ｄ２ドメインを含有する。ＶＷＦ－０１３は、配列番号１２３の３３６残基および３７９残基で、システインを置換するアラニン残基に加え、Ｄ１Ｄ２Ｄ´Ｄ３ドメインを含有する。図１Ｂは、開裂可能なリンカー（たとえば、４８アミノ酸トロンビン開裂可能なリンカー）によってＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、Ｆｃ領域）に、融合されたＤ１Ｄ２Ｄ´Ｄ３ドメインを含有するＶＷＦ－０３１を示す。図１Ｃは、ｐＬＩＶＥベクター中に含まれるＤ１Ｄ２Ｄ´Ｄ３ドメインをコードするヌクレオチド配列であるＶＷＦ－０２５、および、ｐＬＩＶＥベクター中の、Ｃ３３６ＡとＣ３７９Ａの２つのアミノ酸置換を有するＤ１Ｄ２Ｄ´Ｄ３ドメインをコードするヌクレオチド配列であるＶＷＦ－０２９を示す。 図１Ｄは、プロペプチド（Ｄ１およびＤ２ドメイン）および、成熟型サブユニット（Ｄ´、Ｄ３、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｄ４、Ｂ１－３、Ｃ１－２ドメイン）を含有する全長ＶＷＦ断片を示す。ＶＷＦ断片は約２５０ｋＤａタンパク質であり、ジスルフィド結合により多量体（＞２０ＭＤａ）を形成する。ＶＷＦ断片は、非共有結合性の複合体中のＦＶＩＩＩ（９５～９８％）と関連し、次いで、プロテアーゼ開裂／活性化からＦＶＩＩＩを保護すること、重鎖および軽鎖を安定化させること、ならびに、スカベンジャー受容体によるＦＶＩＩＩの除去を妨害すること、によりＦＶＩＩＩの半減期を延長させる。また、ＶＷＦ断片は、ＶＷＦ受容体を介してＦＶＩＩＩ－ＶＷＦ複合体を除去すること、ならびに、ｒＦＶＩＩＩＦｃのピノサイトーシスおよびリサイクルを妨害すること、によりＦＶＩＩＩの半減期を制限することもできる。 ＶＷＦ Ｄ´Ｄ３発現マウス、または、ＦＶＩＩＩとＶＷＦのダブルノックアウト（ＤＫＯ）マウスにおける、ｒＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ（ｒＦＶＩＩＩ－ＡＥ２８８、または、ｒＦＶＩＩＩ－２８８ＡＥ）の薬物動態プロファイルである。図２Ａは、プラスミドＤＮＡ（ＶＷＦ－０２５）をコードするＤ´Ｄ３ドメインの水圧注入（５日前）、ｒＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ ＡＥ２８８の静脈内投与（０日）、およびＰＫ試料採取（５日目）のタイムラインを示す。図２Ｂは、Ｄ１Ｄ２Ｄ´Ｄ３マウスにおけるｒＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ２８８のＩＶ投与（逆三角）およびＤＫＯマウスにおけるｒＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ２８８（ひし形）のＩＶ投与後のＦＶＩＩＩ発色アッセイにより測定されたＦＶＩＩＩ活性を示す。図２Ｃは、ＶＷＦ－０２５の投与後のＤ´Ｄ３の血漿レベル（ｎｇ／ｍＬ）を示す。Ｘ軸は、時間単位での、時間を表す。 例示的なＶＷＦ：ＦＶＩＩＩヘテロ二量体構築物の概略図。構築物は、式ＦＶＩＩＩ－Ｆ１－Ｌ１－Ｖ－Ｘ－Ｌ２－Ｆ２で表される共通構造を有しているが、異なる可変リンカーの例を含有している。示されている構築物（ＦＶＩＩＩ－１６１）は、ＶＷＦ断片（ＸＴＥＮ配列に連結されたＶＷＦのＤ´およびＤ３ドメイン（すなわち、Ｃ３３６ＡとＣ３７９Ａのアミノ酸置換を有する、配列番号２のアミノ酸１～４７７）である）および第一のＦｃ領域に連結されたヘテロ二量体ＦＶＩＩＩ（重鎖と軽鎖は金属結合により関連）を含有し、それらはさらに、開裂可能なリンカーおよび第二のＦｃ領域に連結されている。ＦＶＩＩＩ－１６１に含まれるＸＴＥＮ配列は、ＸＴＥＮ ＡＥ２８８配列であり、リンカーはトロンビン開裂可能なリンカー（３５アミノ酸を有する）である。ＦＶＩＩＩ－１６１において、第一のＦｃ領域に連結されたＦＶＩＩＩタンパク質は、プロセッシング可能なリンカーによりＶＷＦ断片に連結されている。発現すると、プロセッシング可能なリンカーは、細胞内プロセッシング酵素により開裂されることができ、それにより、３つのポリペプチド鎖が互いに関連する構築物が作製される。 ＦＶＩＩＩ－ＶＷＦヘテロ二量体または単量体の例の概略図である。ＦＶＩＩＩ－１６８、ＦＶＩＩＩ－１７５、ＦＶＩＩＩ－１７２、ＦＶＩＩＩ－１７４、および、ＦＶＩＩＩ１７０。構築物ＦＶＩＩＩ－１６８は、トロンビン開裂可能なリンカー（４８アミノ酸を有する）により第二のＦｃ領域に連結されているＶＷＦ断片に融合されている、第一のＦｃ領域に連結された一本鎖ＦＶＩＩＩ配列（１６４５残基と１６４８残基で、アルギニン残基がアラニン残基に置換されている）を含有する。ＡＥ２８８ ＸＴＥＮは、一本鎖ＦＶＩＩＩ配列のＢドメインに挿入されている。第一のＦｃ領域とＶＷＦ断片の間の連結には、細胞内プロセッシング酵素により開裂することができるリンカー（すなわち、プロセッシング可能なリンカー）が含有されている。構築物ＦＶＩＩＩ－１７５は、ＡＥ２８８ ＸＴＥＮおよび第一のＦｃ領域に連結された一本鎖ＦＶＩＩＩ（１６４５残基と１６４８残基で、アルギニン残基がアラニン残基に置換されている）を含有しており、それは、リンカー（たとえば、プロセッシング可能なリンカー）により第二のＦｃ領域に連結されている。ＡＥ２８８ ＸＴＥＮは、一本鎖ＦＶＩＩＩ配列のＢドメインに挿入されている。ＦＶＩＩＩ－１７２構築物は、２つのポリペプチド鎖を含有しており、第一の鎖は、ＡＥ２８８ ＸＴＥＮに融合された重鎖ＦＶＩＩＩ配列を含有し、第二の鎖は、軽鎖ＦＶＩＩＩ配列、第一のＦｃ領域、リンカー（たとえば、プロセッシング可能なリンカー）、ＶＷＦ断片、トロンビン開裂可能なリンカー（たとえば、４８アミノ酸）および第二のＦｃ領域を含有している。ＦＶＩＩＩ－１７４構築物は、２つのポリペプチド鎖を含有し、第一の鎖は、ＡＥ２８８ ＸＴＥＮに融合された重鎖ＦＶＩＩＩ配列を含有し、第二の鎖は、軽鎖ＦＶＩＩＩ、第一のＦｃ領域、リンカー（たとえば、プロセッシング可能なリンカー）、および第二のＦｃ領域を含有している。ＦＶＩＩＩ－１７０構築物は、ＶＷＦ断片、ＡＥ２８８ ＸＴＥＮ、リンカー（たとえば、３５アミノ酸の長さのトロンビン開裂可能なリンカー）および一本鎖ＦＶＩＩＩ配列を含有する。 Ｆｃ領域と結合されたＸＴＥＮ配列を含有するＦＶＩＩＩ／ＶＷＦヘテロ二量体の薬物動態プロファイルである。ＦＶＩＩＩ－１６１、ＦＶＩＩＩ－１６８およびＦＶＩＩＩ－１７２構築物を、水圧注入（ＨＤＩ）により、１００ｕｇ／マウスの用量で、ＦＶＩＩＩ：ＶＷＦのダブルノックアウト（ＤＫＯ）に投与した。ＦＶＩＩＩ－１７０構築物は、ＨＤＩにより、５０μｇ／マウスの用量で、ＦＶＩＩＩ：ＶＷＦのＤＫＯマウスに投与された。ＨＤＩ後の血漿ＦＶＩＩＩ活性を、ＦＶＩＩＩ発色アッセイにより、ＨＤＩ後の２４時間、分析した。ＸＴＥＮ配列およびＦｃドメインを含有するＦＶＩＩＩ：ＶＷＦヘテロ二量体のＦＶＩＩＩ活性を、ＶＷＦ断片、ＸＴＥＮ配列およびＦｃドメインの無いＢＤＤ－ＦＶＩＩＩのＦＶＩＩＩ活性と比較した。 ＦＶＩＩＩ－ＶＷＦヘテロ二量体例の共トランスフェクションシステムの概略図である。図６Ａ。ＦＶＩＩＩ－１６９構築物は、Ｆｃ領域に連結されている全長ＦＶＩＩＩ配列（１６４５残基および１６４８残基の位置でアルギニンがアラニン残基で置換されており、一本鎖ＦＶＩＩＩ配列中にＸＴＥＮ配列が挿入されている）を含有する。ＶＷＦ－０３１は、４８トロンビン開裂可能なリンカーで、他のＦｃ領域に連結されているＤ１Ｄ２Ｄ´Ｄ３断片（３３６位および３７９位で、システイン残基がアラニン残基で置換されている）を含有する。細胞内プロセッシングの後、ＦＶＩＩＩ－１６９構築物は、１つのＦｃ断片とＸＴＥＮ配列に融合されている全長一本鎖ＦＶＩＩＩ（ＳＣＦＶＩＩＩ）を産生し、ＶＷＦ－０３１構築物は、他のＦｃ断片に連結されている４７７アミノ酸のＤ´Ｄ３断片を産生する。ＳＣ ＦＶＩＩＩまたはＤ´Ｄ３断片に連結されているＦｃ断片の間に２つの共有結合が形成され、それにより、ＦＶＩＩＩとＤ´Ｄ３の非共有結合性の関連が可能となってもよい。図６Ｂ。ＦＶＩＩＩ－１７３構築物は、ヘテロ二量体ＦＶＩＩＩ配列、ＸＴＥＮ配列に連結された重鎖ＦＶＩＩＩ配列、およびＦｃ領域に連結された軽鎖ＦＶＩＩＩ配列を含有する。ＶＷＦ－０３１は上述されている。細胞内プロセッシングの後、ＦＶＩＩＩ－１７３構築物は、ヘテロ二量体タンパク質、ＸＴＥＮ配列に融合された重鎖ＦＶＩＩＩ、１つのＦｃ断片に融合された軽鎖ＦＶＩＩＩを産生し、およびＶＷＦ－０３１構築物は、他のＦｃ断片に連結された４７７アミノ酸のＤ´Ｄ３断片を産生する。軽鎖ＦＶＩＩＩまたはＤ´Ｄ３断片に連結されたＦｃ断片の間に２つの共有結合が形成され、これにより、ＦＶＩＩＩとＤ´Ｄ３の非共有結合性の関連が可能となっても良い。 Ｏｃｔｅｔ分析における、固定ｈＶＷＦに対する、ＸＴＥＮ配列およびＦｃドメインを含有する例示的なＦＶＩＩＩ：ＶＷＦの結合アフィニティ。固定されたｈＶＷＦに対する、ＦＶＩＩＩ－１６９／ＶＷＦ－０３１およびＦＶＩＩＩ－０５７（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）の結合アフィニティを、バイオ層（ｂｉｏｌａｙｅｒ）干渉分光法を基にした測定（Ｏｃｔｅｔ分析）を用いて検証した。図７Ａにおいて、固定されたｈＶＷＦに対する、ＦＶＩＩＩ１６９およびＦＶＩＩＩＦｃ医薬成分（陽性対照）のナノモル単位での結合応答を示す。図７Ｂにおいて、固定されたヒトＶＷＦに対する、ヒトＩｇＧ１（陰性対照）の結合応答を示す。 ＨｅｍＡマウスおよびＦＶＩＩＩ：ＶＷＦのダブルノックアウト（ＤＫＯ）マウスにおける、ＦＶＩＩＩ－１６９の薬物動態（ＰＫ）プロファイルである。図８Ａにおいて、ＨｅｍＡマウスにおけるＦＶＩＩＩ－１６９／ＶＷＦ－０３１およびＦＶＩＩＩＦｃのＰＫプロファイルを示す。ＨｅｍＡマウスを、ＦＶＩＩＩ－１６９／ＶＷＦ－０３１を２００ＩＵ／ｋｇにて単回静脈内投与で処置した。マウスから採取した血漿試料を、ＦＶＩＩＩ発色アッセイにより検証した。ＦＶＩＩＩ－１６９／ＶＷＦ－０３１の半減期を、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎプログラムを用いて算出した。 図８Ｂにおいて、ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ ＤＫＯマウスにおける、ＦＶＩＩＩ－１６９／ＶＷＦ－０３１、ＦＶＩＩＩ－１６９／ＦｃおよびＦＶＩＩＩＦｃのＰＫプロファイルを示す。 Ｄ´Ｄ３発現ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ ＤＫＯマウスにおけるＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ変異体のＰＫプロファイルである。図９Ａにおいて、ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ変異体（１つのＸＴＥＮを有するＦＶＩＩＩ、２つのＸＴＥＮを有するＦＶＩＩＩ、および３つのＸＴＥＮを有するＦＶＩＩＩ）のＰＫプロファイルの比較を示す。１、２または３つのＸＴＥＮを、Ｃ末端およびＢドメインを含むＦＶＩＩＩの様々な位置に挿入した。ＣＴは、ＸＴＥＮがＦＶＩＩＩのＣ末端に連結されていることを示す。挿入部位Ｂ／ＣＴは、１つのＸＴＥＮが、ＦＶＩＩＩタンパク質のアミノ酸残基７４５とアミノ酸残基７４６の間に挿入され、他のＸＴＥＮは、ＦＶＩＩＩタンパク質のＣ末端に連結されていることを示している。アミノ酸残基のナンバリングは、ＳＱ ＢＤＤ ＦＶＩＩＩタンパク質配列に対応している。挿入部位１９００／Ｂ／ＣＴは、第一のＸＴＥＮが、ＦＶＩＩＩのアミノ酸残基１９００とアミノ酸残基１９０１の間に挿入され、第二のＸＴＥＮがＦＶＩＩＩのアミノ酸残基７４５とアミノ酸残基７４６の間に挿入され、そして第三のＸＴＥＮがＦＶＩＩＩのＣ末端に連結されていることを示す。ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ変異体の投与に用いられたマウスの系統は、Ｄ´Ｄ３ドメインを発現するＤＫＯマウス系統である。 図９Ｂに、３つのＸＴＥＮ挿入を有するＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮのＰＫプロファイルを示す。ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ（１９００／Ｂ／ＣＴ）変異体は、ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ ＤＫＯマウスまたはＨｅｍＡマウスのいずれかに投与された。ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ（１９００／Ｂ／ＣＴ）の半減期が比較されている。 発色アッセイにより計測された、ＤＫＯマウス血漿中のＦＶＩＩＩＦｃ（白三角）、ＦＶＩＩＩ１６９：Ｆｃ（黒丸）、およびＦＶＩＩＩ１６９：ＶＷＦ３１（白三角）のＦＶＩＩＩ活性である。ＦＶＩＩＩ：Ｆｃは、Ｆｃ二量体に融合された二本鎖ＦＶＩＩＩ（重鎖および軽鎖）を含有する（すなわち、単量体－二量体のハイブリッド）。ＦＶＩＩＩ１６９は、上述である（成熟型ＦＶＩＩＩ配列のアミノ酸７４５のすぐ下流、ＢドメインにＡＥ２８８を含有する）。ＦＶＩＩＩ１６９：Ｆｃは、Ｆｃ二量体に融合されたＦＶＩＩＩ１６９を含有する。ＦＶＩＩＩ１６９：ＶＷＦ３１は、Ｆｃ二量体に加えてＶＷＦ３１を含有し、ＦＶＩＩＩ１６９は第一のＦｃ領域に融合され、そしてＶＷＦ３１は第二のＦｃ領域に融合され、ここで、第一のＦｃ領域および第二のＦｃ領域は共有結合を形成する（たとえば、１以上のジスルフィド結合）。 ＦＶＩＩＩ半減期延長に対する、Ｆｃ、ＸＴＥＮ、およびＶＷＦ－Ｄ´Ｄ３の効果。ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ（ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標））（四角）、ＦＶＩＩＦｃ（丸）、ＦＶＩＩＩ１６９／Ｆｃ（三角）、およびＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３１（逆三角）を、ＦＶＩＩＩとＶＷＦのダブルノックアウト（ＤＫＯ）マウスへと投与した。ＦＶＩＩＩ活性は、発色アッセイにより測定され、半減期を、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ－Ｐｈｏｅｎｉｘプログラムを用いて算出した。Ｘ軸は時間を示し、Ｙ軸はｍＵ／ｍＬ単位での血漿ＦＶＩＩＩ活性を示す。 ＨｅｍＡマウスにおける、ｒＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ／ＶＷＦヘテロ二量体中の異なるＸＴＥＮの効果。図１２Ａは、成熟型ＦＶＩＩＩ配列の７４５残基のすぐ下流にＸＴＥＮを含有するＦＶＩＩＩ－１６９と比較した、成熟型ＦＶＩＩＩ配列の１９００残基と１６５６残基のすぐ下流に挿入された２つのＸＴＥＮの、５分値に対して標準化された、ＦＶＩＩＩの血漿活性を示す（％）（すなわち、ＦＶＩＩＩ－１９５（二本鎖ＦＶＩＩＩアイソフォーム）およびＦＶＩＩＩ－１９９（一本鎖ＦＶＩＩＩアイソフォーム））。ＦＶＩＩＩ－１６９／ＶＷＦ－０３１（黒丸）、ＦＶＩＩＩ－１９９／ＶＷＦ－０３１（黒四角）、およびＦＶＩＩＩ－１９５／ＶＷＦ０３１（白四角）を、ＨｅｍＡマウスに投与し、ＦＶＩＩＩの血漿活性を測定した。 図１２Ｂは、ＦＶＩＩＩ－１６９（ＢドメインにのみＸＴＥＮの挿入を有する）と比較した、成熟型ＦＶＩＩＩ配列の残基４０３（Ａ２ドメイン）および残基７４５（Ｂドメイン）（すなわち、ＦＶＩＩＩ－２０３）、ならびに、残基７４５（Ｂドメイン）および残基１９００（Ａ３ドメイン）（ＦＶＩＩＩ－２０４）のすぐ下流に第二のＸＴＥＮを挿入することによる、半減期延長の効果を示す。ＦＶＩＩＩ－２０４／ＶＷＦ０３１（黒三角）、ＦＶＩＩＩ－１６９／ＶＷＦ－０３１(黒丸)、ＦＶＩＩＩ－２０３／ＶＷＦ－０３１（黒四角）、およびｓｃＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ（白ひし形）を、ＨｅｍＡマウスに投与した。Ｘ軸は、５分値に対して標準化したＦＶＩＩＩの血漿活性（％）を示し、Ｙ軸は、時間単位での時間を示す。 図１２Ｃは、ＦＶＩＩＩ－１６９（Ｂドメインに１つのＸＴＥＮ挿入を有する）、および、一本鎖ＦＶＩＩＩ（いずれのＦｃ領域またはＸＴＥＮも無い（すなわち、ＦＶＩＩＩ－２０７））と比較した、残基１８（Ａ１ドメイン）と残基７４５（Ｂドメイン）のすぐ下流に２つのＸＴＥＮを挿入した（すなわち、ＦＶＩＩＩ－２０５）ことによる半減期延長の効果を示す。図１２Ｃにおいてさらに、ＦＶＩＩＩ－１６９（残基７４５のすぐ下流に１つのＸＴＥＮ挿入を有する）と比較した、残基２６（Ａ１ドメイン）、１６５６（Ａ３ドメイン）および１９００（Ａ３ドメイン）のすぐ下流に組み込まれた３つのＸＴＥＮ挿入（すなわち、ＦＶＩＩＩ－２０１）の半減期延長の効果を示す。ＦＶＩＩＩ－２０５／ＶＷＦ－０３１（黒四角）、ＦＶＩＩＩ－２０１／ＶＷＦ－０３１（逆三角）、ＦＶＩＩＩ－１６９／ＶＷＦ－０３１（黒丸）、および、ＦＶＩＩＩ－２０７（白ひし形）を、ＨｅｍＡマウスに投与した。５分値に対して標準化したＦＶＩＩＩの血漿活性（％）（Ｘ軸）を、経時的に時間単位で測定した（Ｙ軸）。 ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ ＤＫＯマウスにおける、ｒＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ／ＶＷＦ－ＸＴＥＮヘテロ二量体のＦＶＩＩＩ活性。血漿試料中のＦＶＩＩＩ活性を、ＦＶＩＩＩ発色アッセイにより分析し、時間関数（Ｙ軸）としてのＦＶＩＩＩ血漿活性（Ｘ軸）の回帰曲線をプロットした。ＦＶＩＩＩ－１５５（いずれのＸＴＥＮも有さないｓｃＦＶＩＩＩＦｃ）を、ＶＷＦ－０３４（ＡＥ２８８ ＸＴＥＮを有するＶＷＦ－Ｆｃに、３５残基のトロンビン開裂可能なリンカーを足したもの）と共発現させた。ＦＶＩＩＩ－１５５／ＶＷＦ－０３４の半減期を、ＦＶＩＩＩ－１６９／ＶＷＦ－０３１（ＦＶＩＩＩのＢドメイン接合部分（成熟型ＦＶＩＩＩポリペプチドの７４５残基のすぐ下流）内に挿入されたＡＥ２８８ＸＴＥＮを有する）と比較した。 様々なｒＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ／ＶＷＦ構築物の概略図。これらの構築物は、本明細書の他の項においても記述されている。図１４Ａは、一本鎖Ｂドメイン欠損ＦＶＩＩＩタンパク質を示す（本明細書において、場合により、ｓｃＢＤＤ－ＦＶＩＩＩと示される）。ｓｃＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ構築物は、１６４５残基と１６４８残基で、２つの置換（ＡｒｇからＡｌａへ）を含有する。図１４Ｂは、２つのポリペプチド鎖構築物（ＦＶＩＩＩ１５５／ＶＷＦ０３１）を示し、第一のポリペプチド鎖は、いずれのＸＴＥＮも有さないＦｃ領域に連結された一本鎖ＦＶＩＩＩを含有し、第二の鎖は、Ｆｃ領域に連結されたＶＷＦ Ｄ´Ｄ３断片を含有する。この構築物を対照として用いた。図１４Ｃにおいて、２つのポリペプチド鎖構築物（ＦＶＩＩＩ１９９／ＶＷＦ０３１）を示す（第一の鎖は、成熟型ＦＶＩＩＩ配列の１９００残基のすぐ下流に第一のＸＴＥＮが挿入され、成熟型ＦＶＩＩＩ配列の１６５６残基のすぐ下流に第二のＸＴＥＮが挿入されている、Ｆｃ領域に連結されている一本鎖ＦＶＩＩＩを含有し、第二の鎖は、Ｆｃ領域に連結されているＶＷＦ Ｄ´Ｄ３断片を含有している）。図１４Ｄにおいて、２つのポリペプチド鎖構築物（ＦＶＩＩＩ２０１／ＶＷＦ０３１）を示す（第一の鎖は、成熟型ＦＶＩＩＩ配列の２６残基のすぐ下流に第一のＸＴＥＮが挿入され、成熟型ＦＶＩＩＩ配列の１６５６残基のすぐ下流に第二のＸＴＥＮが挿入され、成熟型ＦＶＩＩＩ配列の１９００残基のすぐ下流に第三のＸＴＥＮが挿入されている、Ｆｃ領域に連結された一本鎖ＦＶＩＩＩタンパク質を含有し、第二の鎖は、Ｆｃ領域に連結されたＶＷＦ Ｄ´Ｄ３断片を含有する）。図１４Ｅは、２つのポリペプチド鎖構築物（ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３１）を示す（第一の鎖は、成熟型ＦＶＩＩＩ配列の７４５残基のすぐ下流（Ｂと示される）にＸＴＥＮが挿入されている、Ｆｃ領域に連結された一本鎖ＦＶＩＩＩタンパク質を含有し、第二の鎖は、Ｆｃ領域に連結されたＶＷＦ Ｄ´Ｄ３断片を含有する）。図１４Ｆは、２つのポリペプチド鎖構築物（ＦＶＩＩＩ２０３／ＶＷＦ０３１）を示す（第一の鎖は、成熟型ＦＶＩＩＩ配列の７４５残基（Ｂ）で第一のＸＴＥＮが挿入され、成熟型ＦＶＩＩＩ配列の１９００残基で第二のＸＴＥＮが挿入されている、一本鎖ＦＶＩＩＩタンパク質を含有し、第二の鎖は、Ｆｃ領域に連結されたＶＷＦ Ｄ´Ｄ３断片を含有する）。図１４Ｇは、２つのポリペプチド鎖構築物（ＦＶＩＩＩ２０４／ＶＷＦ０３１）を示す（第一の鎖は、成熟型ＦＶＩＩＩ配列の４０３残基のすぐ下流で第一のＸＴＥＮが挿入され、成熟型ＦＶＩＩＩ配列の７４５残基のすぐ下流（Ｂ）で第二のＸＴＥＮが挿入されている、Ｆｃ領域に連結された一本鎖ＦＶＩＩＩタンパク質を含有し、第二の鎖は、Ｆｃ領域に連結されたＶＷＦ Ｄ´Ｄ３を含有する）。図１４Ｈは、２つのポリペプチド鎖構築物（ＦＶＩＩＩ２０５／ＶＷＦ０３１）を示す（第一の鎖は、成熟型ＦＶＩＩＩ配列の１８残基のすぐ下流で第一のＸＴＥが挿入され、成熟型ＦＶＩＩＩ配列の７４５残基のすぐ下流（Ｂ）で第二のＸＴＥＮが挿入されている、一本鎖ＦＶＩＩＩを含有し、第二の鎖は、Ｆｃ領域に連結されたＶＷＦ Ｄ´Ｄ３を含有する）。 ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ ＤＫＯマウスにおける、ｒＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ／ＶＷＦおよびＢＤＤ－ＦＶＩＩＩのＦＶＩＩＩ活性。血漿試料中のＦＶＩＩＩ活性を、ＦＶＩＩＩ発色アッセイにより分析し、時間関数（Ｙ軸）としてのＦＶＩＩＩ血漿活性（Ｘ軸）の回帰曲線をプロットした。ｒＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ／ＶＷＦ（ＦＶＩＩＩ－２０５／ＶＷＦ－０３１）の半減期を、ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩおよびｒＦＶＩＩＩＦｃと比較した。 尾切断出血モデルを用いた、ＨｅｍＡマウスにおけるＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｆｃ：ＶＷＦ－Ｆｃヘテロ二量体の有効性。ＨｅｍＡマウスの尾切断出血モデルを用いて、ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４、ＦＶＩＩＩ２０５／ＶＷＦ０３１、および、ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩの有効性を比較した。２００ＩＵ／ｋｇのＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４、および、ＦＶＩＩＩ２０５／ＶＷＦ０３１に対する、ｍｌ単位での失血量のメジアンを、２００ＩＵ／ｋｇのＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ、６５ＩＵ／ｋｇのＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ、２０ＩＵ／ｋｇのＢＤＤ－ＦＶＩＩＩおよびビヒクルと比較した。
定義
「一つの」（「ａ」または「ａｎ」）という用語の実体は、その実体の１以上を指すこ
とに注意されたい。たとえば、「一つのヌクレオチド配列」とは、１以上のヌクレオチド
配列を表すと理解される。同様に、「一つの」、「一つ以上の」および「少なくとも一つ
の」という用語は、本明細書において、相互交換可能に用いることができる。
「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語は、単数の核酸ならびに複数
の核酸を包含することが意味され、単離された核酸分子または構築物（たとえば、メッセ
ンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ））を指す。ある実施態
様において、ポリヌクレオチドは、従来的なホスホジエステル結合または非従来的な結合
（たとえば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）において存在する、アミド結合）を含有する。「核
酸」という用語は、ポリヌクレオチドに存在する任意の１以上の核酸セグメント（たとえ
ば、ＤＮＡまたはＲＮＡ断片）を指す。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドは、
その天然の環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡ、またはＲＮＡが意図される。たとえ
ば、ベクター中に含有される第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドをコードする組換えポリヌ
クレオチドは、本発明の目的に対し、単離されたとみなされる。単離されたポリヌクレオ
チドのさらなる例としては、異種宿主細胞中で維持される組換えポリヌクレオチド、また
は、溶液中の他のポリヌクレオチドから（部分的に、または実質的に）精製された組換え
ポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたＲＮＡ分子としては、本発明のポリヌクレオ
チドのｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏＲＮＡ転写産物が挙げられる。本発明に従
う、単離されたポリヌクレオチドまたは核酸としては、合成して製造された分子も含まれ
る。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸に、たとえばプロモーター、エンハンサー、リ
ボソーム結合部位、または転写終止シグナル等の制御因子が含まれても良い。
本明細書において、「コード領域」または「コード配列」は、アミノ酸へと翻訳される
コドンからなるポリヌクレオチドの部分である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡまたは
ＴＡＡ）は通常、アミノ酸へと翻訳されないが、コドン領域の一部であるとみなされても
良く、しかし、たとえばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イン
トロン等の隣接する配列はいずれも、コード領域の一部ではない。コード領域の境界は通
常、５´末端の開始コドン（得られるポリペプチドのアミノ末端をコードする）、および
３´末端にある翻訳終止コドン（得られるポリペプチドのカルボキシル末端をコードする
）により決定される。本発明の２以上のコード領域が、１つのポリペプチド構築物中（た
とえば、１つのベクター）に、または別々のポリヌクレオチド構築物（たとえば別々の（
異なる）ベクター）に、存在してもよい。そして、１つのベクターは、ただ１つのコード
領域を含有してもよく、または、２以上のコード領域を含有しても良い（たとえば、１つ
のベクターは、以下に記述されるように、結合ドメインＡと結合ドメインＢを別々にコー
ドしてもよい）。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、本発明
の結合ドメインをコードする核酸に融合された、または融合されていない、異種のコード
領域をコードしてもよい。異種のコード領域としては、限定されないが、たとえば分泌シ
グナルペプチド、または異種の機能性ドメイン等の、特殊化した因子またはモチーフが挙
げられる。
哺乳類細胞から分泌される、あるタンパク質は、分泌シグナルぺプチド（発達途上のタ
ンパク質鎖が粗面小胞体を超えて輸送されると成熟型タンパク質から開裂される）と結合
している。当業者であれば、シグナルペプチドは多くの場合、ポリペプチドのＮ末端に融
合されており、そして、完全ポリペプチド、または「全長」ポリペプチドから切り離され
、当該ポリペプチドの分泌型または「成熟」型が産生されることを認識している。ある実
施態様において、天然型のシグナルペプチドまたは、作動可能に結合されているポリペプ
チドの分泌を誘導することができる能力を保持している、その配列の機能性誘導体。ある
いは、異種哺乳類シグナルペプチド（たとえば、ヒト組織プラスミノーゲン活性化物質（
ＴＰＡ）またはマウスβグルクロニダーゼシグナルペプチド）、またはその機能性誘導体
が用いられても良い。
「下流」という用語は、基準となるヌクレオチド配列に対して３´に位置づけられるヌ
クレオチド配列を指す。ある実施態様において、下流のヌクレオチド配列とは、転写の開
始地点の後に続く配列のことである。たとえば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写の開始
部分の下流に位置づけられている。
「上流」という用語は、基準となるヌクレオチド配列に対して５´に位置づけられるヌ
クレオチド配列を指す。ある実施態様において、上流のヌクレオチド配列とは、コード領
域の５´側、または、転写の開始部分に位置づけられている。たとえば、ほとんどのプロ
モーターは、転写の開始部分の上流に位置づけられている。
本明細書において、「制御領域」という用語は、コード領域の上流（５´非コード配列
）、コード領域内、またはコード領域の下流（３´非コード配列）に位置づけられている
ヌクレオチド配列を指し、関連コード領域の転写、ＲＮＡプロセッシング、安定性、また
は翻訳に影響を与える。制御領域には、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、
ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位、およびス
テムループ構造が含まれても良い。もしコード領域が、真核細胞中の発現を目的とするも
のである場合、通常、当該コード配列の３´にポリアデニル化シグナルおよび転写終止配
列が位置づけられている。
遺伝子産物（たとえば、ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドは、１以上のコ
ード領域に作動可能に関連づけられているプロモーターおよび／または他の転写制御因子
または翻訳制御因子を含有してもよい。操作可能な関連付けにおいて、遺伝子産物（たと
えば、ポリペプチド）に対するコード領域は、制御領域（複数含む）の影響の下、または
制御の下で、遺伝子産物の発現を設定するような方法で、１以上の制御領域に関連付けら
れている。たとえば、プロモーター機能を誘導することにより、コード領域によりコード
されている遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写が発生する場合、および、プロモータ
ーとコード領域の間の連携の本来のありようでは、遺伝子産物の発現を誘導するプロモー
ターの能力に干渉することがない、または転写されるＤＮＡ鋳型の能力に干渉することが
ない場合、コード領域およびプロモーターは、「作動可能に関連づけられている」。他の
プロモーターのそばにある転写制御因子（たとえば、エンハンサー、オペレーター、リプ
レッサーおよび転写終止シグナル）もまた、遺伝子産物の発現を誘導するために、コード
領域に作動可能に関連づけられていてもよい。
様々な転写制御領域が、当業者に公知である。これらには、限定されないが、脊椎動物
細胞で機能する転写制御領域（たとえば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来の
プロモーターおよびエンハンサーセグメント（イントロンＡと連結した前初期プロモータ
ー）、シミアン・ウイルス４０（ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０）のプロモーターおよ
びエンハンサーセグメント（初期プロモーター）、および、レトロウイルス（たとえば、
ラウス肉腫ウイルス）のプロモーターおよびエンハンサーセグメント）が含まれる。他の
転写制御領域としては、たとえば、アクチン、ヒートショックタンパク質、ウシ成長ホル
モンおよびウサギβグロビン等の脊椎動物遺伝子由来のもの、ならびに、真核細胞におい
て遺伝子発現を制御することが出来る他の配列が挙げられる。さらなる適切な転写制御領
域としては、組織特異的プロモーターおよびエンハンサー、ならびに、リンホカイン誘導
プロモーター（たとえば、インターフェロンまたはインターロイキンにより誘導可能なプ
ロモーター）が挙げられる。
同様に、様々な翻訳制御因子が当業者に公知である。これらとしては、限定されないが
、リボソーム結合部位、翻訳開始コドンおよび終止コドン、ならびに、ピコルナウイルス
由来の因子（特に、配列内リボソーム侵入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ
ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）またはＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列ともまた呼称される）が挙げられ
る。
本明細書において、「発現」という用語は、ポリヌクレオチドが遺伝子産物（たとえば
、ＲＮＡまたはポリヌクレオチド）を産生するプロセスを指す。限定されないが、メッセ
ンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子ヘアピン型Ｒ
ＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または任意の他のＲＮＡ産物へ
の、ポリヌクレオチドの転写、および、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳が含まれる。発
現により、「遺伝子産物」が産生される。本明細書において、遺伝子産物とは、核酸（た
とえば、遺伝子の転写により産生されたメッセンジャーＲＮＡ）または転写物から翻訳さ
れたポリペプチドのいずれかであっても良い。本明細書において遺伝子産物とは、さらに
、転写後修飾（たとえば、ポリアデニル化またはスプライシング）された核酸、または翻
訳後修飾（たとえば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニッ
トとの関連、またはタンパク分解性の開裂等）されたポリペプチドが含まれる。
「ベクター」とは、宿主細胞への核酸のクローニングおよび／または移送のための任意
のビヒクルを指す。ベクターは、他の核酸セグメントが付随し、当該付随セグメントの複
製も発生しうる、レプリコンであっても良い。「レプリコン」とは、ｉｎ ｖｉｖｏで複
製の自律的単位として機能する（すなわち、自身の制御の下で複製することができる）任
意の遺伝子因子（たとえば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）を指
す。「ベクター」という用語には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉ
ｖｏで細胞へ核酸を導入するための、ウイルス性のビヒクルおよび非ウイルス性のビヒク
ルの両方が含まれる。たとえば、プラスミド、改変真核細胞ウイルス、または改変細菌性
ウイルス等を含む、多くのベクターが当分野に公知であり、使用されている。適切なベク
ターへのポリヌクレオチドの挿入は、適切なポリヌクレオチド断片を、相補的な付着末端
を有する選択ベクターへとライゲーションすることにより行うことができる。
ベクターを操作して、ベクターが組み込まれている細胞の選択または同定を行う選択マ
ーカーまたはレポーターをコードさせてもよい。選択マーカーまたはレポーターの発現に
より、ベクターに含まれている他のコード領域を組み込み、発現する宿主細胞の同定およ
び／または選択が可能となる。当分野に公知であり、使用されている選択マーカー遺伝子
の例としては、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハ
イグロマイシン、ビアラホス除草剤（ｂｉａｌａｐｈｏｓ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ）、スル
ホンアミド等に対する抵抗性をもたらす遺伝子、および、表現型マーカーとしても用いら
れる遺伝子（すなわち、アントシアニン制御遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ
遺伝子等）が挙げられる。当分野に公知であり、使用されているレポーターの例としては
、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、グルクロニダー
ゼ（Ｇｕｓ）等が挙げられる。
「プラスミド」という用語は、細胞の中央代謝の一部ではないが、通常、環状二本鎖Ｄ
ＮＡ分子の形態にある遺伝子を多くの場合に保有する染色体外因子を指す。そのような因
子は、任意の源由来の、自律的に複製する配列、ゲノム組込み配列、ファージもしくはヌ
クレオチド配列、直線状、環状、もしくは超らせん状の一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたは
ＲＮＡであってもよく、その中で、多くのヌクレオチド配列が、適切な３´非翻訳配列と
共に、選択遺伝子産物のためのプロモーター断片およびＤＮＡ配列を、細胞へと導入する
ことができる独特の構造体へと連結または組換えられる。
用いることができる真核細胞性ウイルスベクターとしては、限定されないが、アデノウ
イルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、およびポック
スウイルス（たとえば、ワクシニアウイルスベクター）、バキュロウイルスベクター、ま
たはヘルペスウイルスベクターが挙げられる。非ウイルス性ベクターとしては、プラスミ
ド、リポソーム、帯電脂質（サイトフェクチン（ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎｓ））、ＤＮＡ－
タンパク質複合体およびバイオポリマーが挙げられる。
「クローニングベクター」とは、連続して複製する核酸の単位長さであり、たとえばプ
ラスミド、ファージまたはコスミド等の複製起源を含有する、「レプリコン」を指し、他
の核酸セグメントが付随され、当該付随セグメントの複製が開始されてもよい。あるクロ
ーニングベクターは、１つの細胞型（たとえば、細菌）で複製され、そしてそれ以外（た
とえば、真核細胞）で発現されることができる。クローニングベクターは通常、ベクター
を含有する細胞の選別に用いることができる１以上の配列を含有し、および／または、対
象の核酸配列の挿入のための複数のクローニング部位を含有する。
「発現ベクター」という用語は、宿主細胞への挿入後、挿入された核酸配列を発現する
ことができるように設計されたビヒクルを指す。挿入核酸配列は、上述の制御領域と作動
可能に関連づけられた状態で挿入される。
ベクターは、当分野公知の方法（たとえば、トランスフェクション、エレクトロポレー
ション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン
酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用、またはＤＮ
Ａベクタートランスポーター）により宿主細胞へと導入される。
本明細書において、「培養」、「培養すること」および「培養する」とは、細胞増殖も
しくは分裂が可能となるｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下で細胞をインキュベートすること、また
は、細胞を生きている状態に維持すること、を意味する。本明細書において、「培養され
た細胞」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖された細胞を意味する。
本明細書において、「ポリペプチド」という用語は、単数の「ポリペプチド」ならびに
複数の「ポリペプチド」を包含することが意図され、および、アミド結合（ペプチド結合
としても知られる）により直線的に連結された単量体（アミノ酸）から構成される分子を
指す。「ポリペプチド」という用語は、２以上のアミノ酸の任意の鎖（複数含む）を指す
が、特定の長さの産物は意図されない。ゆえに、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、
オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２以上のアミノ酸の鎖（複数
含む）を呼称するために用いられる任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義の中に含
まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のうちの任意のものの代わりに、ま
たは相互交換可能に用いることができる。「ポリペプチド」という用語はまた、発現後に
ポリペプチドを改変した産物を指すことも意図され、限定されないが、グリコシル化、ア
セチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基による誘導体化、タンパク質分解性の開裂
、または非天然型アミノ酸での置換等が挙げられる。ポリペプチドは、天然の生物源から
誘導されてもよく、または、組み換え技術により製造されてもよいが、指定された核酸配
列から翻訳される必要がある。化学合成によるものを含む、任意の方法で作製されてもよ
い。
「単離された」ペプチドまたはその断片、変異体もしくは誘導体は、自然環境中には無
いポリペプチドを指す。特定レベルの精製は必要ない。たとえば、単離されたポリペプチ
ドは、その自然の状態であってもよく、または自然環境から単に取り出されたものであっ
てもよい。組み換え技術により製造されたポリペプチドおよび宿主細胞で発現されたタン
パク質は、任意の適切な技術により分離され、分画され、または部分的にもしくは実質的
に精製された天然型ポリペプチドまたは組換えポリペプチドと同様、本発明の目的に対し
、単離されたとみなされる。
本発明にはまた、ポリペプチドの断片または変異体、およびそれらの任意の組み合わせ
が含まれる。本発明のポリペプチド結合ドメインまたはポリペプチド結合分子を呼称する
際の「断片」または「変異体」という用語には、基準となるポリペプチドの少なくとも一
部の特性（たとえば、ＦｃＲｎ結合ドメインまたはＦｃ変異体については、ＦｃＲｎ結合
アフィニティ、ＦＶＩＩＩ変異体については、凝固活性、または、ＶＷＦ断片については
ＦＶＩＩＩ結合活性等）を保持している任意のポリペプチドが含まれる。ポリペプチドの
断片には、タンパク質分解断片、ならびに、欠損断片、さらに本明細書の別項に解説され
る特定の抗体断片が含まれるが、天然型の全長ポリペプチド（または成熟型ポリペプチド
）は含まれない。本発明のポリペプチド結合ドメインまたは結合分子の変異体には、上述
の断片が含まれ、および、アミノ酸置換、欠失または挿入による改変アミノ酸配列を有す
るポリペプチドも含まれる。変異体は、天然型であっても、非天然型であっても良い。非
天然型の変異型は、公知の突然変異誘導技術を用いて製造されてもよい。変異型ポリペプ
チドは、保存的アミノ酸置換もしくは非保存的アミノ酸の置換、欠失または付加を含んで
も良い。
本明細書において用いられる「ＶＷＦ断片」（複数含む）という用語は、ＦＶＩＩＩと
相互作用する任意のＶＷＦ断片を意味し、正常であれば全長ＶＷＦによってＦＶＩＩＩに
もたらされる少なくとも１以上の特性（たとえば、ＦＶＩＩＩａに対する時期尚早の活性
化を防ぐ、時期尚早のタンパク質分解を防ぐ、時期尚早のクリアランスをもたらすリン脂
質メンバーとの結合を防ぐ、裸のＦＶＩＩＩとは結合できるが、ＶＷＦ結合ＦＶＩＩＩと
は結合できないＦＶＩＩＩクリアランス受容体への結合を防ぐ、および／または、ＦＶＩ
ＩＩ重鎖と軽鎖の相互作用を安定化させる、等）を保持する任意のＶＷＦ断片を意味する
。
「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換
されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野で定義されて
おり、塩基性側鎖（たとえば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（たとえば
、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（たとえば、グリシン、アスパラギ
ン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（たとえば
、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニ
ン、トリプトファン）、β分枝側鎖（たとえば、スレオニン、バリン、イソロイシン）お
よび芳香族側鎖（たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン
）が含まれる。ゆえに、ポリペプチド中のアミノ酸が、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ
酸と置換される場合、その置換は保存的であるとみなされる。他の実施態様において、ア
ミノ酸の列は、側鎖ファミリーメンバの系列および／または組成が異なる構造的に類似の
ストリングで保存的に置換されてもよい。
当分野において、２つのポリペプチド間の「配列同一性」とは、１つのポリペプチドの
アミノ酸配列と、第二のポリペプチドの配列とを比較することにより決定されると認識さ
れている。本明細書において検討される場合、任意の特定のポリペプチドが、他のポリペ
プチドに対して少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％
、９５％、９９％、または、１００％の同一であるかどうかは、当分野公知の方法および
コンピュータープログラム／ソフトウェア（限定されないが、たとえば、ＢＥＳＴＦＩＴ
ｐｒｏｇｒａｍ （Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａ
ｃｋａｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標）， Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａ
ｒｋ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ ５３７１１
））を用いて決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴでは、Smithand Waterman, Advance
s in AppliedMathematics 2:482-489 (1981)の部分的相同性アルゴリズムを用いて、２
つの配列間の最も良い相同性セグメントが見出される。特定の配列が、本発明に従う基準
配列と、たとえば、９５％の同一であるかどうかを決定するために、ＢＥＳＴＦＩＴまた
は任意の他の配列アライメントプログラムを用いる場合、パラメーターは、同一性のパー
セントが基準ポリペプチド配列の全長にわたって算出され、基準配列中のアミノ酸の総数
のうちの５％までの相同性ギャップが許可されるよう、セットされる。
本明細書において、ＶＷＦ配列またはＦＶＩＩＩタンパク質配列における、「～に対応
するアミノ酸」または「同等のアミノ酸」は、第一のＶＷＦまたはＦＶＩＩＩ配列と、第
二のＶＷＦまたはＦＶＩＩＩ配列の間の同一性または類似性を最大化するアライメントに
より特定される。第二のＶＷＦまたはＦＶＩＩＩ配列中の同等のアミノ酸を特定するため
に用いられる数は、第一のＶＷＦまたはＦＶＩＩＩ配列中の対応するアミノ酸を特定する
ために用いられた数に基づいている。
本明細書において、「挿入部位」という用語は、異種部分が挿入されうる位置のすぐ上
流の、ＦＶＩＩＩポリペプチド、またはその断片、変異体もしくは誘導体中の位置を指す
。「挿入部位」は、番号として特定され、その番号は、挿入位置に対してすぐＮ末端側に
ある、挿入部位に相当する、成熟型天然ＦＶＩＩＩ（配列番号４）中のアミノ酸の番号で
ある。たとえば、「ａ３は、配列番号４のアミノ酸１６５６に対応する挿入部位にＸＴＥ
Ｎを有する」という表現は、当該異種部分が、配列番号４のアミノ酸１６５６とアミノ酸
１６５７に対応する２つのアミノ酸の間に位置することを指す。
本明細書において、「アミノ酸のすぐ下流」という表現は、アミノ酸の末端カルボキシ
基側の方のすぐ隣の位置を指す。同様に、「アミノ酸のすぐ上流」という表現は、アミノ
酸の末端アミノ基側の方のすぐ隣の位置を指す。それゆえ、本明細書において、「挿入部
位の２つのアミノ酸の間」という表現は、ＸＴＥＮまたは他の任意のポリペプチドが、２
つの隣接するアミノ酸の間に挿入される位置を指す。ゆえに、「アミノ酸のすぐ下流に挿
入される」および「挿入部位の２つのアミノ酸の間に挿入される」という表現は、「挿入
部位で挿入される」と同義で用いられる。
本明細書において、「挿入された」、「挿入される」、「～へ挿入される」またはそれ
らと文法的に関連した用語は、成熟型天然ヒトＦＶＩＩＩ中の類似の位置と比較した、キ
メラポリペプチド中のＸＴＥＮの位置を指す。本明細書において、その用語は、成熟型天
然ヒトＦＶＩＩＩと比較した、組換えＦＶＩＩＩポリペプチドの特徴を指すが、キメラポ
リペプチドが作製された任意の方法またはプロセスを示唆、暗示または推察させるもので
はない。たとえば、本明細書に提示されるキメラポリペプチドに関連して、「ＸＴＥＮが
、ＦＶＩＩＩポリペプチドの７４５残基のすぐ下流へと挿入される」という表現は、キメ
ラポリペプチドが、成熟型天然ヒトＦＶＩＩＩの７４５アミノ酸に対応するアミノ酸のす
ぐ下流にＸＴＥＮを含有する（たとえば、成熟型天然ヒトＦＶＩＩＩの７４５と７４６ア
ミノ酸に対応するアミノ酸で囲まれている）ということを意味する。
「融合」または「キメラ」タンパク質は、自然界では、本来、連結されていない第二の
アミノ酸配列に連結されている第一のアミノ酸配列を含有する。通常は別々のタンパク質
中に存在するアミノ酸配列を、融合ポリペプチド中に集めても良く、または、通常は同じ
タンパク質中に存在するアミノ酸配列を、融合ポリペプチド中に新たな配置で設置しても
良い（たとえば、Ｉｇ Ｆｃドメインと本発明の第ＶＩＩＩ因子ドメインの融合）。融合
タンパク質は、たとえば、化学合成により、または所望される関係性でペプチド領域がコ
ードされているポリペプチドを作製および翻訳することにより、作製される。キメラタン
パク質はさらに、共有結合、非ペプチド結合、または非共有結合により第一のアミノ酸配
列と関連する第二のアミノ酸配列を含有してもよい。
本明細書において、「半減期」という用語は、特定のポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏの
生物学的半減期を指す。半減期は、対象に投与された量の半分が、動物内の循環系および
／または他の組織から除去されるために必要とされる時間と表されても良い。所与のポリ
ペプチドのクリアランス曲線が時間関数として描かれる場合、その曲線は通常、急峻なα
相と、より長いβ相の二相性となる。α相は多くの場合、投与されたキメラポリペプチド
の、血管内腔と血管外腔の間の平衡を表し、ポリペプチドのサイズによりある程度は決定
される。β相は多くの場合、血管内腔におけるポリペプチドの異化を表す。一部の実施態
様において、ＦＶＩＩＩとＦＶＩＩＩを含有するキメラタンパク質は単相性であり、α相
を有せず、β相のみを有する。それゆえ、ある実施態様において、本明細書に用いられる
半減期という用語は、β相におけるポリペプチドの半減期を指す。ヒトにおける、ヒト抗
体の典型的なβ相半減期は２１日である。
本明細書において、「連結された」という用語は、第二のアミノ酸配列またはヌクレオ
チド配列に共有結合、または非共有結合された、それぞれ、第一のアミノ酸配列またはヌ
クレオチド配列を指す。第一のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列は、第二のアミノ酸
配列またはヌクレオチド配列に直接結合または並置されてもよく、あるいは、介在配列が
、第一の配列を第二の配列に共有結合させてもよい。「連結された」という用語は、Ｃ末
端またはＮ末端での、第一のアミノ酸配列の第二のアミノ酸配列への融合のみならず、第
二のアミノ酸配列中の任意の２つのアミノ酸へ、第一のアミノ酸配列のすべてを挿入する
こと（または、第一のアミノ酸配列中の任意の二つのアミノ酸へ、第二のアミノ酸配列の
すべてを挿入すること）を含むことが意図される。１つの実施態様において、第一のアミ
ノ酸配列は、ペプチド結合またはリンカーにより、第二のアミノ酸配列に連結されてもよ
い。第一のヌクレオチド配列は、ホスホジエステル結合またはリンカーにより、第二のヌ
クレオチド配列に連結されてもよい。リンカーは、（ポリペプチド鎖に対しては）ペプチ
ドもしくはポリペプチド、または、（ヌクレオチド鎖に対しては）ヌクレオチドもしくは
ヌクレオチド鎖、または、（ポリペプチド鎖およびポリヌクレオチド鎖の両方に対しては
）任意の化学結合であってもよい。「連結された」という用語はまた、ハイフン（－）に
より示される。
本明細書において、「関連した」という用語は、第一のアミノ酸鎖と第二のアミノ酸鎖
の間に形成された共有結合または非共有結合を指す。１つの実施態様において、「関連し
た」という用語は、共有結合的な非ペプチド結合、または非共有結合を意味する。この関
連は、コロン（すなわち、（：））により示されても良い。他の実施態様において、それ
は、ペプチド結合を除く共有結合を意味する。たとえば、アミノ酸システインは、ジスル
フィド結合を形成することが出来るチオール基、または第二のシステイン残基上のチオー
ル基と架橋することができるチオール基を含有する。ほとんどの天然型ＩｇＧ分子におい
て、ＣＨ１およびＣＬ領域は、ジスルフィド結合により関連づけられ、２つの重鎖は２３
９および２４２に相当する位置（Ｋａｂａｔナンバリングシステムを使用（ＥＵナンバリ
ングシステムにおける２２６または２２９位））の２つのジスルフィド結合により関連づ
けられる。共有結合の例としては、限定されないが、ペプチド結合、金属結合、水素結合
、ジスルフィド結合、シグマ結合、π背面結合（ｂａｃｋｂｏｎｄ）、二重結合、三重結
合、四重結合、五重結合、六重結合、共役（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）、超共役、芳香族
性、ハプト数または反結合が挙げられる。非共有結合の非限定的な例としては、イオン結
合（たとえば、カチオン－π結合または塩結合）、金属結合、水素結合（たとえば、二水
素結合、二水素複合体、低障壁水素結合、または対称性水素結合）、ファンデルワールス
力、ロンドン分散力、機械的結合、ハロゲン結合、金親和性、インターカレーション、ス
タッキング（ｓｔａｃｋｉｎｇ）、エントロピー力、または化学的極性が挙げられる。
本明細書において、「単量体－二量体ハイブリッド」という用語は、ジスルフィド結合
により互いに関連している、第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖を含有するキ
メラタンパク質を指し、ここで、第一の鎖は凝固因子（たとえば、第ＶＩＩＩ因子）およ
び第一のＦｃ領域を含有し、第二の鎖は、凝固因子の無い第二のＦｃ領域を含有し、凝固
因子の無い第二のＦｃ領域から本質的になり、または、からなる。ゆえに、単量体－二量
体ハイブリッド構築物は、ただ１つの凝固因子のみを有する単量体の特徴と、２つのＦｃ
領域を有する二量体の特徴を含有するハイブリッドである。
本明細書において、「開裂部位」または「酵素開裂部位」という用語は、酵素により認
識される部位を指す。ある酵素開裂部位は、細胞内プロセッシング部位を含有する。１つ
の実施態様において、ポリペプチドは、凝固カスケードの間に活性化される酵素により開
裂される酵素開裂部位を有し、そのような部位の開裂は凝固形成部位で生じる。そのよう
な部位の例としては、たとえば、トロンビン、第ＸＩａ因子または第Ｘａ因子により認識
されるものが挙げられる。例示的なＦＸＩａ開裂部位としては、たとえば、ＴＱＳＦＮＤ
ＦＴＲ（配列番号４５）および、ＳＶＳＱＴＳＫＬＴＲ（配列番号４６）が挙げられる。
例示的なトロンビン開裂部位としては、たとえば、ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ（配列番号４７
）、ＴＴＫＩＫＰＲ（配列番号４８）、ＬＶＰＲＧ（配列番号４９）および、ＡＬＲＰＲ
（配列番号５０のアミノ酸１～５）が挙げられる。他の酵素開裂部位も当分野に公知であ
る。
本明細書において、「プロセッシング部位」または「細胞内プロセッシング部位」とい
う用語は、ポリペプチドの翻訳後に機能する酵素の標的である、ポリペプチド中の酵素開
裂部位のタイプを指す。１つの実施態様において、そのような酵素は、ゴルジ内腔からト
ランス－ゴルジ部分への輸送の間に機能する。細胞内プロセッシング酵素は、細胞からタ
ンパク質が分泌される前に、ポリペプチドを開裂する。そのようなプロセッシング部位の
例としては、たとえば、エンドぺプチダーゼファミリーのＰＡＣＥ／ｆｕｒｉｎ（ＰＡＣ
Ｅは、Ｐａｉｒｅｄ ｂａｓｉｃ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ Ｃｌｅａｖｉｎｇ Ｅｎｚｙ
ｍｅ（塩基性アミノ酸開裂酵素対）の頭字語である）により標的とされるものが挙げられ
る。これらの酵素はゴルジ膜に位置し、Ａｒｇ－［任意の残基］－（ＬｙｓまたはＡｒｇ
）－Ａｒｇ配列モチーフのカルボキシ末端側上でタンパク質を開裂する。本明細書におい
て、酵素の「ｆｕｒｉｎ」ファミリーとしては、たとえば、ＰＣＳＫ１（ＰＣ１／Ｐｃ３
としてもまた知られる）、ＰＣＳＫ２（ＰＣ２としてもまた知られる）、ＰＣＳＫ３（ｆ
ｕｒｉｎまたはＰＡＣＥとしてもまた知られる）、ＰＣＳＫ４（ＰＣ４としてもまた知ら
れる）、ＰＣＳＫ５（ＰＣ５またはＰＣ６としてもまた知られる）、ＰＣＳＫ６（ＰＡＣ
Ｅ４としてもまた知られる）、または、ＰＣＳＫ７（ＰＣ７／ＬＰＣ、ＰＣ８、またはＳ
ＰＣ７としてもまた知られる）が挙げられる。他のプロセッシング部位も当分野に公知で
ある。
２以上のプロセッシング部位または開裂部位を含む構築物において、そのような部位は
同じであっても、異なっていても良いことが理解される。
「Ｆｕｒｉｎ」という用語は、ＥＣ第３．４．２１．７５に対応する酵素を指す。Ｆｕ
ｒｉｎは、サブチリシン様前駆タンパク質転換酵素であり、ＰＡＣＥ（Ｐａｉｒｅｄ ｂ
ａｓｉｃ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ Ｃｌｅａｖｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ）としてもまた知ら
れている。Ｆｕｒｉｎは、生物学的に活性なタンパク質へと転換させるために、前駆タン
パク質の不活性な部分を削除する。細胞内輸送の間に、Ｆｕｒｉｎ酵素によりＶＷＦのプ
ロペプチドが成熟型ＶＷＦ分子から開裂されてもよい。一部の実施態様において、Ｆｕｒ
ｉｎは、ＶＷＦのＤ´Ｄ３からＤ１Ｄ２を開裂する。他の実施態様において、Ｆｕｒｉｎ
によりＤ１Ｄ２ドメインが細胞内で切り離されるように、Ｆｕｒｉｎをコードするヌクレ
オチド配列がＶＷＦ断片をコードするヌクレオチドとともに発現されてもよい。
２以上のプロセッシング部位または開裂部位を含有する構築物において、そのような部
位は同じであっても異なっていても良いことを理解されたい。
本明細書において、「プロセッシング可能なリンカー」とは、本明細書の他項に記述さ
れる、細胞内プロセッシング部位を少なくとも１つ含有するリンカーを指す。
本明細書において、止血障害とは、フィブリン塊形成の能力が無い、または能力が損な
われたことによる、自然発生的な、または外傷の結果としての、大量出血の傾向により特
徴付けられる遺伝性または後天的な状態を意味する。そのような障害の例としては、血友
病が挙げられる。血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子欠損）、血友病Ｂ（第ＩＸ欠損または「クリ
スマス病」）および血友病Ｃ（第ＸＩ欠損、軽度な出血傾向）が３つの主な形態である。
他の止血障害としては、たとえば、Ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ症、第ＸＩ因子欠損（
ＰＴＡ欠損）、第ＸＩＩ因子欠損、フィブリノーゲン、プロトロンビン、第Ｖ因子、第Ｖ
ＩＩ因子、第Ｘ因子または第ＸＩＩＩ因子の欠損または構造異常、Ｂｅｒｎａｒｄ－Ｓｏ
ｕｌｉｅｒ症候群（ＧＰＩｂの異常または欠損である）が挙げられる。ＶＷＦの受容体で
あるＧＰＩｂが不完全である可能性もあり、一次血栓形成（一次止血）の欠落をもたらし
、出血傾向を増加させ、Ｇｌａｎｚｍａｎ ａｎｄ Ｎａｅｇｅｌｉの血小板無力症（Ｇ
ｌａｎｚｍａｎｎ血小板無力症）をもたらす。肝不全（急性および慢性状態）においては
、肝臓による凝固因子の産生が不十分であり、これによって出血リスクが高まりうる。
本発明のキメラ分子は、予防的に用いられても良い。本明細書において、「予防的処置
」という用語は、出血症状の前に分子を投与することを指す。１つの実施態様において、
全般的な止血剤の必要性がある対象は、外科手術を受けている、または外科手術を受けよ
うとしているものである。本発明のキメラタンパク質は、予防剤として、外科手術の前、
または後に投与されても良い。本発明のキメラタンパク質は、深刻な出血症状を制御する
ために、外科手術の間、または外科手術の後に投与されても良い。外科手術には、限定さ
れないが、肝臓移植、肝切除、歯科処置または幹細胞移植が挙げられる。
本発明のキメラタンパク質はまた、要求に応じた処置に用いられても良い。「要求に応
じた処置」という用語は、出血症状の兆候に応じてキメラ分子を投与すること、または、
出血をもたらしうる活動の前にキメラタンパク分子を投与することを指す。１つの態様に
おいて、要求に応じた処置は、出血が始まるとき（たとえば外傷の後）、または出血が予
期されるとき（たとえば外科手術の前）に、対象に施されても良い。他の態様において、
要求に応じた処置は、たとえば接触のあるスポーツ等の出血リスクが増大する活動の前に
施されても良い。
本明細書において、「深刻な出血」という用語は、背景事情に関わらず、出血症状を指
す。たとえば、対象は、外傷、尿毒症、遺伝性出血性疾患（たとえば、第ＶＩＩ因子欠損
）、血小板疾患、または凝固因子に対する抗体の発現による抵抗性を有していても良い。
本明細書において、処置する、処置、処置することとは、疾患または状態の重篤度を下
げること；疾患経過の持続期間を短くすること；疾患または状態に関連した１以上の症状
を改善すること；疾患または状態を有する対象に対して、有益な効果を提供すること、ま
たは、当該疾患または状態を処置する必要がない対象に対して、疾患または状態に関連し
た１以上の症状の予防法を提供すること、を指す。１つの実施態様において、「処置する
こと」または「処置」という用語は、本発明のキメラタンパク質またはＶＷＦ断片を投与
することにより、対象におけるＦＶＩＩＩのトラフレベルを、少なくとも約１ＩＵ／ｄＬ
、２ＩＵ／ｄＬ、３ＩＵ／ｄＬ、４ＩＵ／ｄＬ、５ＩＵ／ｄＬ、６ＩＵ／ｄＬ、７ＩＵ／
ｄＬ、８ＩＵ／ｄＬ、９ＩＵ／ｄＬ、１０ＩＵ／ｄＬ、１１ＩＵ／ｄＬ、１２ＩＵ／ｄＬ
、１３ＩＵ／ｄＬ、１４ＩＵ／ｄＬ、１５ＩＵ／ｄＬ、１６ＩＵ／ｄＬ、１７ＩＵ／ｄＬ
、１８ＩＵ／ｄＬ、１９ＩＵ／ｄＬ、または、２０ＩＵ／ｄＬに維持することを意味する
。他の実施態様において、処置すること、または処置とは、ＦＶＩＩＩのトラフレベルを
、約１～約２０ＩＵ／ｄＬ、約２～約２０ＩＵ／ｄＬ、約３～約２０ＩＵ／ｄＬ、約４～
約２０ＩＵ／ｄＬ、約５～約２０ＩＵ／ｄＬ、約６～約２０ＩＵ／ｄＬ、約７～約２０Ｉ
Ｕ／ｄＬ、約８～約２０ＩＵ／ｄＬ、約９～約２０ＩＵ／ｄＬ、または、約１０～約２０
ＩＵ／ｄＬに維持することを意味する。疾患もしくは状態の処置または処置することには
、非血友病の対象におけるＦＶＩＩＩ活性の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％
、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％
、１７％、１８％、１９％、または、２０％に相当するレベルに、対象におけるＦＶＩＩ
Ｉ活性を維持することも含まれる。処置に必要とされる最小のトラフレベルは、１以上の
公知の方法により測定することができ、各人物に対して調整する（増加させる、または減
少させる）ことができる。
キメラタンパク質
本発明は、ＶＷＦ断片とＸＴＥＮ配列を用いて、ＦＶＩＩＩ半減期制限因子（すなわち
、内因性ＶＷＦ）が、ＦＶＩＩＩタンパク質と関連することを妨害または抑制することに
より、第ＶＩＩＩ因子タンパク質の半減期を延長させることを目的とする。内因性ＶＷＦ
は、非共有結合性複合体のＦＶＩＩＩの約９５～９８％と関連する。内因性ＶＷＦはＦＶ
ＩＩＩの半減期制限因子であり、また、内因性ＶＷＦのＦＶＩＩＩタンパク質への結合は
、様々な方法でＦＶＩＩＩを保護することが知られている。たとえば、全長ＶＷＦ（約２
５０ｋＤａを有する多量体）は、プロテアーゼ開裂およびＦＶＩＩＩ活性化からＦＶＩＩ
Ｉを保護することができ、ＦＶＩＩＩの重鎖および／または軽鎖を安定化させ、ならびに
、スカベンジャー受容体によるＦＶＩＩＩのクリアランスを妨害することができる。しか
し、同時に、内因性ＶＷＦは、ピノサイトーシスを妨害し、そして、ＶＷＦクリアランス
経路を介し、身体からＦＶＩＩＩ－ＶＷＦ複合体を除去することにより、ＦＶＩＩＩの半
減期を制限する。学説に縛られることは望まないが、内因性ＶＷＦは半減期制限因子であ
り、これによって、半減期延長物質に融合したＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、野生型
ＦＶＩＩＩの約２倍より長くはならないと考えられている。それゆえ、本発明は、ＶＷＦ
断片を用いて内因性ＶＷＦとＦＶＩＩＩタンパク質の間の相互作用を妨害または抑制し、
それにより、ＸＴＥＮ配列のみを用いて、または、Ｉｇ定常領域もしくはその一部との組
み合わせでＸＴＥＮ配列を用いることにより、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長させ
ることを目的とする。ＸＴＥＮ配列は、ＦＶＩＩＩタンパク質またはＶＷＦ断片に連結さ
れてもよい。それにより、ＶＷＦ断片と関連したＦＶＩＩＩタンパク質は、１以上のＶＷ
Ｆクリアランス受容体により、さらにゆっくりと循環系から除去され、ＶＷＦ断片を有し
ていないＦＶＩＩＩタンパク質または野生型ＦＶＩＩＩと比較して、ＸＴＥＮ配列または
Ｉｇ定常領域と組み合わせたＸＴＥＮ配列による完全な半減期延長が得られる。
１つの実施態様において、ＶＷＦ断片は、共有結合または非共有結合により、ＦＶＩＩ
Ｉタンパク質と関連（または連結）する。しかしながら、一部の例において、ＶＷＦ断片
とＦＶＩＩＩタンパク質の間の物理的封鎖または化学的関連（たとえば、非共有結合性の
結合）は、内因性ＶＷＦの存在下では、ＦＶＩＩＩおよびＶＷＦ断片を含有する複合体を
安定化させるほどには強くない可能性がある。たとえば、ＦＶＩＩＩタンパク質と非共有
結合を形成している（他の結合は何もない）ＶＷＦ断片は、内因性ＶＷＦの存在下では、
ｉｎ ｖｉｖｏで容易にＦＶＩＩＩタンパク質から解離し、内因性ＶＷＦとＶＷＦ断片（
たとえば、組換えＶＷＦ、すなわち、ｒＶＷＦ）が置き換わってしまう可能性がある。そ
れゆえ、内因性ＶＷＦと非共有結合しているＦＶＩＩＩタンパク質は、ＶＷＦクリアラン
ス経路を経て、身体から容易に除去されてしまう。ＦＶＩＩＩタンパク質とＶＷＦ断片の
解離を防ぐために、一部の実施態様においては、ＦＶＩＩＩタンパク質とＶＷＦ断片の間
の関連または連結は、共有結合（たとえば、ペプチド結合、１以上のアミノ酸、またはジ
スルフィド結合）である。ある実施態様において、付属部分とＦＶＩＩＩタンパク質の間
の関連（すなわち、連結）は、ペプチド結合、またはＦＶＩＩＩタンパク質とＶＷＦ断片
の間のリンカー（ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦリンカー）である。リンカーの非限定的な例は、本
明細書の他項に記述する。一部の実施態様において、ＶＷＦ断片は、少なくとも約１０、
１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００
、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００
、１９００、２０００、２５００、３０００、または、４０００アミノ酸を含有する、本
質的にからなる、または、からなるポリペプチドである。ＶＷＦ断片の非限定的な例は、
本明細書の別項に記述する。
ある実施態様において、ＶＷＦ断片は、ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上のＶＷＦ結合部
位に化学的（たとえば、非共有結合的）に結合、または、ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上
のＶＷＦ結合部位を物理的に封鎖する。ＦＶＩＩＩタンパク質のＶＷＦ結合部位は、ＦＶ
ＩＩＩタンパク質のＡ３ドメインまたはＣ２ドメイン内に位置する。さらに他の実施態様
において、ＦＶＩＩＩタンパク質のＶＷＦ結合部位は、Ａ３ドメインおよびＣ２ドメイン
内に位置する。たとえば、ＦＶＩＩＩタンパク質のＶＷＦ結合部位は、配列番号４（全長
成熟型ＦＶＩＩＩ）のアミノ酸１６６９～１６８９および／または２３０３～２３３２に
対応する。
本発明はまた、１以上のＸＴＥＮ配列をさらに含有するキメラタンパク質（ＦＶＩＩＩ
タンパク質とＶＷＦ断片を含有する）を提示し、それにより、さらなる半減期延長の特性
がもたらされる。１以上のＸＴＥＮ配列は、ＦＶＩＩＩタンパク質またはＶＷＦ断片の内
に挿入されてもよく、または、ＦＶＩＩＩタンパク質もしくはＶＷＦ断片のＮ末端または
Ｃ末端に連結されてもよい。本発明にはまた、ＸＴＥＮ配列（第一の半減期延長部分）に
連結されたＦＶＩＩＩタンパク質および、Ｉｇ定常領域またはその一部（第二の半減期延
長部分）を含み、それにより、その２つの半減期延長部分が、２つの異なるメカニズムを
介して、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長する。
一部の実施態様において、キメラタンパク質は、第一のＩｇ定常領域またはその一部（
たとえば、第一のＦｃＲｎ結合パートナー）に連結されたＦＶＩＩＩタンパク質、第二の
Ｉｇ定常領域またはその一部（たとえば、第二のＦｃＲｎ結合パートナー）に連結された
ＶＷＦ断片、および、ＦＶＩＩＩタンパク質もしくはＶＷＦ断片に挿入された、または連
結された１以上のＸＴＥＮ配列を含有し、ここで、ＶＷＦ断片は、ＦＶＩＩＩ半減期制限
因子（たとえば、内因性ＶＷＦ）がＦＶＩＩＩタンパク質に結合することを妨害し、ここ
で、第一および第二のＩｇ定常領域またはその一部は、共有結合（たとえば、ジスルフィ
ド結合）を形成し、および、１以上のＸＴＥＮ配列が、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を
延長する。
ある実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、任意選択的なリンカー（すなわ
ち、ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦリンカー）によりＶＷＦ断片に連結されたＦＶＩＩＩタンパク質
、および、ＦＶＩＩＩタンパク質もしくはＶＷＦ断片に挿入された、または連結された１
以上のＸＴＥＮ配列を含有し、ここで、ＶＷＦ断片は、ＦＶＩＩＩ半減期制限因子（たと
えば、内因性ＶＷＦ）がＦＶＩＩＩタンパク質に結合することを妨害し、および、１以上
のＸＴＥＮ配列が、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長する。１つの態様において、任
意選択的なリンカー（ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦリンカー）は、ソルターゼ認識モチーフを含有
する。他の態様において、任意選択的なリンカー（ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦリンカー）は、開
裂可能な部位を含有する。開裂リンカー（すなわち、１以上の開裂部位を含有するリンカ
ー）の例は、本明細書の別項に記述する。
本発明のキメラタンパク質は、限定されないが、以下を含有する：
（１）Ｄ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有するＶＷＦ断片、ＸＴＥＮ配列、およびＦ
ＶＩＩＩであり、ここで、ＸＴＥＮ配列は、ＶＷＦ断片に連結されている、
（２）ＦＶＩＩＩタンパク質、ＸＴＥＮ配列、およびＩｇ定常領域またはその一部であり
、ここで、ＦＶＩＩＩタンパク質はＸＴＥＮ配列およびＩｇ定常領域またはその一部に連
結されており、または、
（３）ＦＶＩＩＩタンパク質、ＸＴＥＮ配列、およびＶＷＦ断片であり、ここで、ＸＴＥ
Ｎ配列は、Ｃ末端またはＮ末端でＦＶＩＩＩタンパク質に連結されているか、または、Ｆ
ＶＩＩＩの１以上のアミノ酸のすぐ下流（たとえば、１以上のＸＴＥＮ挿入部位）に挿入
されており、および、ＶＷＦ断片およびＦＶＩＩＩタンパク質は互いに関連している。
（１）ＸＴＥＮに連結されたＶｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ＶＷＦ）断片およびＦ
ＶＩＩＩ
本発明は、（ｉ）ＶＷＦのＤ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有するＶＷＦ断片、（
ｉｉ）ＸＴＥＮ配列、および、（ｉｉｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質を含有するキメラタンパ
ク質を目的とするものであり、ここで、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）は、互いに連
結または関連している。本発明のキメラタンパク質の一部として、ＸＴＥＮ配列に連結さ
れたＶＷＦは、ＦＶＩＩＩタンパク質を関連し、それによって、内因性ＶＷＦとそのＦＶ
ＩＩＩタンパク質の間の相互作用を妨害または抑制する。ある実施態様において、内因性
ＶＷＦとＦＶＩＩＩタンパク質の結合を妨害または抑制することができるＶＷＦ断片は、
同時に、少なくとも１つのＶＷＦ様ＦＶＩＩＩ保護特性を有することができる。ＶＷＦ様
ＦＶＩＩＩ保護特性の例としては、限定されないが、プロテアーゼ開裂およびＦＶＩＩＩ
活性化からＦＶＩＩＩを保護すること、ならびに、ＦＶＩＩＩ重鎖および／または軽鎖を
安定化させること、ならびに、スカベンジャー受容体によるＦＶＩＩＩの除去を妨害する
ことが挙げられる。その結果として、ＶＷＦ断片は、ＶＷＦクリアランス経路を介したＦ
ＶＩＩＩタンパク質の除去を阻害し、それによって、身体からのＦＶＩＩＩの除去を減少
させる。一部の実施態様において、本発明のＶＷＦ断片は、ＦＶＩＩＩタンパク質と結合
または関連し、および／または、ＦＶＩＩＩタンパク質のＶＷＦ結合部位を物理的にもし
くは化学的に封鎖する。ＶＷＦ断片に関連したＦＶＩＩＩタンパク質は、そのようにして
、野生型ＦＶＩＩＩまたはＶＷＦ断片と関連していないＦＶＩＩＩと比較して、循環系か
らさらにゆっくりと除去される。
１つの実施態様において、本発明は、（ｉ）ＶＷＦのＤ´ドメインおよびＤ３ドメイン
を含有するＶＷＦ断片、（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列、および、（ｉｉｉ）ＦＶＩＩＩタンパク
質を含有するキメラタンパク質を目的とするものであり、ここで、ＸＴＥＮ配列は、ＶＷ
Ｆ断片に連結されており（たとえば、（ａ１）Ｖ－Ｘまたは（ａ２）Ｘ－Ｖであり、ここ
で、ＶはＶＷＦ断片を含有し、ＸはＸＴＥＮ配列を含有する）、および、ＶＷＦ断片はＦ
ＶＩＩＩタンパク質に連結または関連している。他の実施態様において、ＶＷＦ断片およ
びＸＴＥＮ配列は、リンカーまたはペプチド結合により連結されている（たとえば、（ａ
３）Ｖ－Ｌ－Ｘまたは（ａ４）Ｘ－Ｌ－Ｖ）。リンカーは、凝固部位で開裂されることが
できる開裂可能なリンカー（たとえばトロンビン開裂可能なリンカー）であっても良い。
他の実施態様において、ＶＷＦ断片、ＸＴＥＮ配列、およびＦＶＩＩＩタンパク質は、単
一のポリペプチド鎖に配置される。さらに他の実施態様において、キメラタンパク質は２
つのポリペプチド鎖を含有し、ここで第一の鎖はＶＷＦ断片およびＸＴＥＮ配列を含有し
、第二の鎖はＦＶＩＩＩタンパク質を含有する。さらに他の実施態様において、キメラタ
ンパク質は３つのポリペプチド鎖を含有し、ここで第一の鎖はＶＷＦ断片およびＸＴＥＮ
配列を含有し、第二の鎖はＦＶＩＩＩの軽鎖を含有し、ならびに、第三の鎖はＦＶＩＩＩ
の重鎖を含有し、ここで、第一の鎖および第二の鎖は互いに関連づけられ（たとえば、共
有結合（たとえば、ジスルフィド結合））、第二の鎖と第三の鎖は互いに関連付けられて
いる（たとえば、金属結合）。さらに他の実施態様において、ＸＴＥＮ配列は、ＶＷＦ断
片のＮ末端またはＣ末端に連結されていても良く、または、ＶＷＦ断片の１以上のアミノ
酸のすぐ下流に挿入されていても良い。
ある実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、以下を含有する式を含有する：
（ａ）Ｖ－Ｘ－ＦＶＩＩＩ、
（ｂ）ＦＶＩＩＩ－Ｘ－Ｖ、
（ｃ）Ｖ－Ｘ：ＦＶＩＩＩ、
（ｄ）Ｘ－Ｖ：ＦＶＩＩＩ、
（ｅ）ＦＶＩＩＩ：Ｖ－Ｘ、
（ｆ）ＦＶＩＩＩ：Ｘ－Ｖ、または、
（ａ５）Ｘ－Ｖ－ＦＶＩＩＩ、
であり、ここで、ＶはＶＷＦ断片を含有し、
Ｘは１以上のＸＴＥＮ配列を含有し、
ＦＶＩＩＩはＦＶＩＩＩタンパク質を含有し；
（－）はペプチド結合または１以上のアミノ酸を表し；および、
（：）は化学的関連または物理的関連である。１つの実施態様において、（：）は、化学
的関連（たとえば、少なくとも１つの非ペプチド結合）を表す。他の実施態様において、
化学的関連、すなわち、（：）は共有結合である。他の実施態様において、化学的関連、
すなわち、（：）は非共有結合的相互作用（たとえば、イオン性相互作用、疎水性相互作
用、親水性相互作用、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ相互作用、または水素結合）である。
他の実施態様において、（：）は、非ペプチド共有結合である。さらに他の実施態様にお
いて、（：）はペプチド結合である。さらに他の実施態様において、（：）は２つの配列
の間の物理的関連を表し、ここで、第一の配列の一部は、第二の配列に非常に近接してお
り、それによって、その第二の配列の一部は、第一の配列によって他の部分と相互作用す
ることから保護され、または妨害され、および、さらに、その第二の配列と他の部分が相
互作用せずに、この物理的関連は維持される。本明細書のポリペプチドの式の方向は、Ｎ
末端（左側）からＣ末端（右側）へと列記されている。たとえば、式Ｖ－Ｘ－ＦＶＩＩＩ
は、式ＮＨ２－Ｖ－Ｘ－ＦＶＩＩＩ－ＣＯＯＨを意味する。１つの実施態様において、本
明細書に記述される式は、２つの部分の間に任意の追加の配列を含有しても良い。たとえ
ば、式Ｖ－Ｘ－ＦＶＩＩＩはさらに、他で特定されない限り、ＶとＸの間のＶのＮ末端で
、ＸとＦＶＩＩＩの間で、または、ＦＶＩＩＩのＣ末端で、任意の配列を含有しても良い
。他の実施態様において、ハイフン（－）はペプチド結合を示す。
他の実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、以下を含有する式を含有する：
（ａ）Ｖ（Ｘ１）－Ｘ２－ＦＶＩＩＩ、
（ｂ）ＦＶＩＩＩ－Ｘ２－Ｖ（Ｘ１）、
（ｃ）Ｖ（Ｘ１）：ＦＶＩＩＩ、
（ｄ）ＦＶＩＩＩ：Ｖ（Ｘ１）、または、
（ａ５）Ｘ２－Ｖ（Ｘ１）－ＦＶＩＩＩ、
であり、ここで、Ｖ（Ｘ１）はＶＷＦ断片および第一のＸＴＥＮ配列（Ｘ１）を含有し、
ここで、ＸＴＥＮ配列は、ＶＷＦ断片の１以上のアミノ酸のすぐ下流に挿入され、Ｘ２は
１以上の任意選択的なＸＴＥＮ配列を含有し、
ＦＶＩＩＩはＦＶＩＩＩタンパク質を含有し、
（－）はペプチド結合または１以上のアミノ酸を表し；および、
（：）は化学的関連または物理的関連である。
一部の実施態様において、キメラタンパク質は、（ｉ）ＶＷＦのＤ´ドメインおよびＤ
３ドメインを含有するＶＷＦ断片、（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列、（ｉｉｉ）ＦＶＩＩＩタンパ
ク質、（ｉｖ）第一の任意選択的なリンカー、および（ｖ）第二の任意選択的なリンカー
、を含有するキメラタンパク質を目的とするものであり、ここで、ＸＴＥＮ配列は、リン
カーにより、ＶＷＦ断片および／またはＦＶＩＩＩタンパク質に連結されている。ある実
施態様において、キメラタンパク質は、以下の式を含有する：
（ｂ１）Ｖ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－ＦＶＩＩＩ、
（ｂ２）ＦＶＩＩＩ－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－Ｖ、
（ｂ３）Ｖ－Ｌ１－Ｘ：ＦＶＩＩＩ、
（ｂ４）Ｘ－Ｌ１－Ｖ：ＦＶＩＩＩ、
（ｂ５）ＦＶＩＩＩ：Ｖ－Ｌ１－Ｘ、
（ｂ６）ＦＶＩＩＩ：Ｘ－Ｌ１－Ｖ、
（ｂ７）Ｘ－Ｌ１－Ｖ－Ｌ２－ＦＶＩＩＩ、または、
（ｂ８）ＦＶＩＩＩ－Ｌ２－Ｖ－Ｌ１－Ｘ、
であり、ここで、ＶはＶＷＦ断片を含有し、
Ｘは１以上のＸＴＥＮ配列を含有し、
ＦＶＩＩＩはＦＶＩＩＩタンパク質を含有し；
Ｌ１は第一の任意選択的なリンカー（たとえば、第一の開裂可能なリンカー）を含有し、
Ｌ２は第二の任意選択的なリンカー（たとえば、第二の開裂可能なリンカー、または任意
選択的なプロセッシング可能なリンカー）を含有し、
（－）はペプチド結合または１以上のアミノ酸であり；および、
（：）は化学的関連または物理的関連である。１つの実施態様において、（：）は、化学
的関連（たとえば、少なくとも１つの非ペプチド結合）を表す。他の実施態様において、
化学的関連、すなわち、（：）は共有結合である。他の実施態様において、化学的関連、
すなわち、（：）は非共有結合的相互作用（たとえば、イオン性相互作用、疎水性相互作
用、親水性相互作用、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ相互作用、または水素結合）である。
他の実施態様において、（：）は、非ペプチド共有結合である。さらに他の実施態様にお
いて、（：）はペプチド結合である。さらに他の実施態様において、（：）は２つの配列
の間の物理的関連を表し、ここで、第一の配列の一部は、第二の配列に非常に近接してお
り、それによって、その第二の配列の一部は、第一の配列によって他の部分と相互作用す
ることから保護され、または妨害され、および、さらに、その第二の配列と他の部分が相
互作用せずに、この物理的関連は維持される。本明細書のポリペプチドの式の方向は、Ｎ
末端（左側）からＣ末端（右側）へと列記されている。たとえば、式（ｂ１）Ｖ－Ｌ１－
Ｘ－Ｌ２－ＦＶＩＩＩは、式ＮＨ２－Ｖ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－ＦＶＩＩＩ－ＣＯＯＨを意味
する。１つの実施態様において、本明細書に記述される式は、２つの部分の間に任意の追
加の配列を含有しても良い。他の実施態様において、ハイフン（－）はペプチド結合を示
す。
本発明の他の態様において、ＦＶＩＩＩ半減期制限因子（たとえば、内因性ＶＷＦ）と
相互作用しないＦＶＩＩＩキメラタンパク質が提示され、同時に、第二の半減期延長物質
または、ＦＶＩＩＩタンパク質とＶＷＦ断片の間の共有結合をもたらす部分（たとえば、
Ｉｇ定常領域またはその一部）と組み合わせたＸＴＥＮ配列を用いた、ＦＶＩＩＩタンパ
ク質の半減期の最大化が提示される。１つの実施態様において、本発明のキメラタンパク
質は、（ｉ）ＶＷＦのＤ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有するＶＷＦ断片、（ｉｉ）
ＸＴＥＮ配列、（ｉｉｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質、および、（ｉｖ）Ｉｇ定常領域または
その一部（本明細書において、Ｆとも呼称される）、を含有し、ここで、（１）ＶＷＦ断
片は、任意選択的なリンカー（たとえば開裂可能なリンカー）によりＸＴＥＮ配列に連結
され、（２）ＶＷＦ断片は、追加の任意選択的なリンカー（たとえば、開裂可能なリンカ
ー）によりＦＶＩＩＩタンパク質と関連、または連結されており、および、（３）Ｉｇ定
常領域またはその一部は、ＶＷＦ断片、ＸＴＥＮ配列、またはＦＶＩＩＩタンパク質に連
結されている。他の実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、（ｉ）ＶＷＦのＤ
´ドメインおよびＤ３ドメインを含有するＶＷＦ断片、（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列、（ｉｉｉ
）ＦＶＩＩＩタンパク質、（ｉｖ）Ｉｇ定常領域またはその一部（Ｆ１または第一のＩｇ
定常領域）、および、（ｖ）追加のＩｇ定常領域またはその一部（Ｆ２または第二のＩｇ
定常領域）を含有し、ここで、（１）ＶＷＦ断片は、任意選択的なリンカー（たとえば開
裂可能なリンカー）によりＸＴＥＮ配列に連結され、（２）ＸＴＥＮ配列またはＶＷＦ断
片は、Ｉｇ定常領域またはその一部に連結されており、（３）ＦＶＩＩＩは追加のＩｇ定
常領域またはその一部に連結されており、および、（４）Ｉｇ定常領域またはその一部は
、追加のＩｇ定常領域またはその一部と関連、または連結している。１つの実施態様にお
いて、２つのＩｇ定常領域またはその一部の間の関連または連結は、共有結合（たとえば
、ジスルフィド結合）である。他の実施態様において、２つのＩｇ定常領域またはその一
部の間の関連または連結は、プロセッシング可能なリンカーであり、ここで、当該プロセ
ッシング可能なリンカーは、細胞内でプロテアーゼによってプロセッシングされる。たと
えば、キメラタンパク質は、以下の式を含有する：
（ｇ）Ｖ－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－Ｆ１：ＦＶＩＩＩ－Ｌ３－Ｆ２；
（ｈ）Ｖ－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－Ｆ１：Ｆ２－Ｌ３－ＦＶＩＩＩ；
（ｉ）Ｆ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｖ：ＦＶＩＩＩ－Ｌ３－Ｆ２；
（ｊ）Ｆ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｖ：Ｆ２－Ｌ３－ＦＶＩＩＩ；
（ｋ）Ｖ－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－Ｆ１－Ｌ４－ＦＶＩＩＩ－Ｌ３－Ｆ２；
（ｌ）Ｆ２－Ｌ３－ＦＶＩＩＩ－Ｌ４－Ｆ１－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｖ；
（ｍ）ＦＶＩＩＩ－Ｌ２－Ｆ２－Ｌ４－Ｖ－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－Ｆ１；または、
（ｎ）Ｆ１－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｖ－Ｌ４－Ｆ２－Ｌ２－ＦＶＩＩＩ、
であり、ここで、ＶはＶＷＦ断片を含有し、
Ｌ１およびＬ３のそれぞれは、任意選択的なリンカーを含有し、
Ｌ２は、任意選択的なリンカー（たとえば、開裂可能なリンカー）を含有し、
Ｌ４は、任意選択的なリンカー（たとえば、プロセッシング可能なリンカー）であり、
ＦＶＩＩＩはＦＶＩＩＩタンパク質を含有し、
Ｘは１以上のＸＴＥＮ配列を含有し、
Ｆ１は任意選択的なＩｇ定常領域またはその一部を含有し、
Ｆ２は任意選択的な追加のＩｇ定常領域またはその一部を含有し、
（－）はペプチド結合または１以上のアミノ酸であり；および、
（：）は化学的関連または物理的関連である。
一部の実施態様において、本明細書に開示される任意の構築物または式中のＦＶＩＩＩ
タンパク質はさらに、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４
つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つのＸＴＥＮ配列を含有し、ＸＴＥＮ配列のそ
れぞれは、ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上のアミノ酸のすぐ下流に挿入され、または、Ｆ
ＶＩＩＩタンパク質のＮ末端またはＣ末端に連結される。ＸＴＥＮ挿入部位の非限定的な
例は、本明細書の別項に記述される。
１つの実施態様において、（：）は、化学的関連（たとえば、少なくとも１つの非ペプ
チド結合）を表す。他の実施態様において、化学的関連、すなわち、（：）は共有結合で
ある。他の実施態様において、化学的関連、すなわち、（：）は非共有結合的相互作用（
たとえば、イオン性相互作用、疎水性相互作用、親水性相互作用、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａ
ａｌｓ相互作用、または水素結合）である。他の実施態様において、（：）は、非ペプチ
ド共有結合である。さらに他の実施態様において、（：）はペプチド結合である。さらに
他の実施態様において、（：）は２つの配列の間の物理的関連を表し、ここで、第一の配
列の一部は、第二の配列に非常に近接しており、それによって、その第二の配列の一部は
、第一の配列によって他の部分と相互作用することから保護され、または妨害され、およ
び、さらに、その第二の配列と他の部分が相互作用せずに、この物理的関連は維持される
。本明細書のポリペプチドの式の方向は、Ｎ末端（左側）からＣ末端（右側）へと列記さ
れている。たとえば、式（ｎ）Ｆ１－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｖ－Ｌ４－Ｆ２－Ｌ２－ＦＶＩＩ
Ｉは、式ＮＨ２－Ｆ１－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｖ－Ｌ４－Ｆ２－Ｌ２－ＦＶＩＩＩ－ＣＯＯＨ
を意味する。１つの実施態様において、本明細書に記述される式は、２つの部分の間に任
意の追加の配列を含有しても良い。他の実施態様において、ハイフン（－）はペプチド結
合を示す。
１つの実施態様において、ＶＷＦ断片またはＦＶＩＩＩタンパク質に連結される、Ｉｇ
定常領域またはその一部（場合によって、本明細書において、「Ｆ」または「Ｆ１」と示
される）および追加のＩｇ定常領域またはその一部（場合によって、本明細書において、
「Ｆ２」と示される）のいずれかまたは両方は、ＶＷＦ断片、ＦＶＩＩＩタンパク質また
はその両方の半減期を延長させてもよい。他の実施態様において、Ｉｇ定常領域またはそ
の一部（場合によって、本明細書において、「Ｆ」または「Ｆ１」と示される）および追
加のＩｇ定常領域またはその一部（場合によって、本明細書において、「Ｆ２」と示され
る）のペアは、各々、ＶＷＦ断片およびＦＶＩＩＩタンパク質に連結され、ＦＶＩＩＩタ
ンパク質とＶＷＦ断片の間の非共有結合よりも強い結合をもたらし（すなわち、共有結合
（たとえばジスルフィド結合）をもたらし）、それによって、ｉｎ ｖｉｖｏで、内因性
ＶＷＦとＶＷＦ断片が置き換わることを防ぐ。Ｆ１またはＦ２は、Ｆｃ領域またはＦｃＲ
ｎ結合パートナーを含有してもよい。他の実施態様において、ＶＷＦ断片および／または
ＦＶＩＩＩタンパク質に連結されたＦ１およびＦ２のいずれか、または両方は、Ｆ１とＦ
２の愛さに共有結合（たとえば、ジスルフィド結合）を形成し、それによって、ＶＷＦ断
片とＦＶＩＩＩタンパク質を非常に近接させ、ＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質の相互
作用を抑制する。一部の実施態様において、Ｆ１とＦ２は同一であるか、または異なって
いる。Ｆ１およびＦ２の非限定的な例は、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメ
イン、ＣＨ４ドメイン、ヒンジドメイン、それらの任意の機能性断片、誘導体、またはア
ナログ、およびそれらの２以上の組み合わせからなる群から選択されてもよい。１つの実
施態様において、Ｆ１、Ｆ２またはその両方は、少なくとも１つのＣＨ１ドメイン、少な
くとも１つのＣＨ２ドメイン、少なくとも１つのＣＨ３ドメイン、少なくとも１つのＣＨ
４ドメイン、またはその機能性断片、誘導体もしくはアナログを含有する。他の実施態様
において、Ｆ１、Ｆ２またはその両方は、少なくとも１つのヒンジドメインまたはその一
部、および、少なくとも１つのＣＨ２ドメインまたはその一部（たとえば、ヒンジ－ＣＨ
２の方向で）を含む。他の実施態様において、Ｆ１、Ｆ２またはその両方は、少なくとも
１つのＣＨ２ドメインまたはその一部、および、少なくとも１つのＣＨ３ドメインまたは
その一部（たとえば、ＣＨ２－ＣＨ３の方向で）を含む。その組み合わせの例としては、
限定されないが、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびヒンジドメイン（それらは、Ｆ
ｃ領域（またはＦｃドメイン）としても知られる）（たとえば、Ｆ１に対する第一のＦｃ
領域またはＦｃＲｎ結合パートナー、および、Ｆ２に対する第二のＦｃ領域または第二の
ＦｃＲｎ結合パートナー）が挙げられる。他の実施態様において、Ｆ１は、リンカーによ
りＶＷＦ断片に連結されており、および／または、Ｆ２はリンカーによりＦＶＩＩＩに連
結されている。一部の実施態様において、Ｆ１および／またはＦ２は、ヒンジ領域を含有
する、本質的にからなる、または、からなる。Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーの
非限定的な追加例は、本明細書の別項に記述する。
ある実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、第一のポリペプチド鎖（Ｄ´ド
メインおよびＤ３ドメインを含有するＶＷＦ断片、ＸＴＥＮ配列、第一のＩｇ定常領域ま
たはその一部（たとえば、第一のＦｃ領域）およびＶＷＦ断片とＸＴＥＮ配列の間の任意
選択的なリンカーを含有するＶＷＦ断片、またはＸＴＥＮ配列または第一のＩｇ定常領域
もしくはその一部を含有する、本質的にからなる、または、からなる）および、第二のポ
リペプチド鎖（ＦＶＩＩＩタンパク質および第二のＩｇ定常領域またはその一部（たとえ
ば、第二のＦｃ領域）を含有する、本質的にからなる、または、からなる）の、２つのポ
リペプチド鎖を含有する。ＶＷＦ断片と第一のＩｇ定常領域もしくはその一部の間のリン
カーは、凝固部位で開裂されることができる、開裂可能なリンカー（たとえば、開裂可能
なリンカー）であっても良い。一部の実施態様において、第一のポリペプチド鎖および第
二のポリペプチド鎖は、互いに関連している。第一の鎖と第二の鎖の間の関連により、ｉ
ｎ ｖｉｖｏでの、内因性ＶＷＦと、ＶＷＦ断片を含有する第一の鎖の置換が妨げられる
。１つの実施態様において、第一の鎖と第二の鎖の間の関連は、共有結合であってもよい
。特定の実施態様において、共有結合はジスルフィド結合である。一部の実施態様におい
て、第二の鎖のＦＶＩＩＩタンパク質はさらに、ＦＶＩＩＩタンパク質のＣ末端またはＮ
末端に連結された１以上のＸＴＥＮ配列を含有し、または、ＦＶＩＩＩタンパク質の１以
上のアミノ酸のすぐ下流（たとえば、本明細書に開示される少なくとも１つの挿入部位）
に挿入される。本発明の非限定的な例は、本明細書の別項に記述される。
他の実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、３つのポリペプチド鎖を含有し
、ここで、第一のポリペプチド鎖は、ＦＶＩＩＩタンパク質の重鎖を含有し、本質的にか
らなり、または、からなり、第二のポリペプチド鎖は第一のＩｇ定常領域またはその一部
（たとえば、第一のＦｃ領域）に融合されたＦＶＩＩＩタンパク質の軽鎖を含有し、本質
的にからなり、または、からなり、および、第三のポリペプチド鎖は、Ｄ´ドメインおよ
びＤ３ドメインを含有するＶＷＦ断片、ＸＴＥＮ配列、第二のＩｇ定常領域またはその一
部（たとえば、第二のＦｃ領域）およびＸＴＥＮ配列と第二のＩｇ定常領域もしくはその
一部の間の任意選択的なリンカーまたはＶＷＦ断片とＸＴＥＮ配列の間の任意選択的なリ
ンカーを含有し、本質的にからなり、または、からなる。第三の鎖のリンカーは、凝固部
位（たとえば、トロンビン開裂部位）で開裂される開裂可能なリンカーであっても良い。
一部の実施態様において、ＦＶＩＩＩの重鎖またはＦＶＩＩＩの軽鎖は、Ｎ末端またはＣ
末端に連結されることができる、または、ＦＶＩＩＩ配列内の１以上の挿入部位内に挿入
されることができる、１以上のＸＴＥＮ配列に連結されている。挿入部位の非限定的な例
は、本明細書の別項に記述される。
さらに他の実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、第一の鎖（ＦＶＩＩＩタ
ンパク質の重鎖を含有する、本質的にからなる、または、からなる）および第二の鎖（Ｆ
ＶＩＩＩタンパク質の軽鎖、第一のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第一のＦｃ
領域）、第一のリンカー（たとえば、１以上の細胞内プロセッシング部位を含有する１以
上のプロテアーゼ開裂部位を含有する、プロセッシング可能なリンカー）、ＶＷＦ断片、
第二のリンカー（たとえば、トロンビン開裂可能なリンカー）、ＸＴＥＮ配列、および第
二のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第二のＦｃ領域）を含有する、本質的にか
らなる、または、からなる）を含有し、ここで、ＦＶＩＩＩタンパク質の軽鎖は、第一の
Ｉｇ定常領域またはその一部に連結され、それはさらに第一のリンカーによりＶＷＦ断片
に連結され、および、ここで、ＶＷＦ断片はＸＴＥＮ配列に連結され、それはさらに、第
二のリンカーにより第二の定常領域またはその一部に連結されている。ある実施態様にお
いて、第一のリンカーはプロセッシング可能なリンカーであり、第二のリンカーは開裂可
能なリンカーである。発現することで、キメラタンパク質は、プロセッシング可能なリン
カーを開裂する細胞内プロセッシング酵素により開裂されることができ、それによって、
キメラタンパク質は、３つのポリペプチド鎖を含有する、本質的にからなる、またはから
なることができる。さらに、ＶＷＦ断片は、開裂可能なリンカーによって、凝固部位で開
裂されることができる。
ある実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、一本鎖ＦＶＩＩＩタンパク質、
第一のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第一のＦｃ領域）、第一のリンカー（た
とえば、プロセッシング可能なリンカー）、ＶＷＦ断片、ＸＴＥＮ配列、第二のリンカー
（たとえば、トロンビン開裂可能なリンカー）、および第二のＩｇ定常領域またはその一
部（たとえば、第二のＦｃ領域）を含有する、１つのポリペプチド鎖を含有し、ここで、
一本鎖ＦＶＩＩＩタンパク質は、第一のＩｇ定常領域またはその一部に連結され、それは
さらに、第一のリンカーによりＶＷＦ断片に連結され、そして、ＶＷＦ断片はＸＴＥＮ配
列に連結され、それはさらに、第二のＩｇ定常領域またはその一部に連結されている。１
つの実施態様において、ＶＷＦ断片およびＸＴＥＮ配列は、第二のリンカーにより連結さ
れている。他の実施態様において、ＸＴＥＮ配列および第二のＩｇ定常領域またはその一
部は、第二のリンカーにより連結されている。他の実施態様において、第二の鎖はさらに
第三のリンカーを含有する。それにより、一本鎖ポリペプチドは、第二のリンカーにより
ＸＴＥＮ配列に連結されたＶＷＦ断片、および第三のリンカーにより第二のＩｇ定常領域
またはその一部に連結されたＸＴＥＮを含有する。第二のリンカーおよび第三のリンカー
は同じであっても異なっていても良い。１つの実施態様において、第一のリンカーはプロ
セッシング可能なリンカーである。他の実施態様において、第二のリンカーまたは第三の
リンカーは、１または２の開裂可能な部位を含有する開裂可能なリンカーである。特定の
実施態様において、第二のリンカーは、トロンビン開裂可能なリンカーである。本発明に
有用なリンカーは、本明細書の別項に記述する。
（２）ＦＶＩＩＩ、ＸＴＥＮおよびＦｃ
本発明のキメラタンパク質はまた、（ｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質、（ｉｉ）ＸＴＥＮ配
列（第一の半減期伸長物質）、および、（ｉｉｉ）Ｉｇ定常領域またはその一部（第二の
半減期伸長物質）を含有し、その中で、ＸＴＥＮ配列は任意選択的なリンカーによりＦＶ
ＩＩＩタンパク質に連結され、追加の任意選択的なリンカーによりＩｇ定常領域またはそ
の一部に連結されている。ＸＴＥＮ配列およびＩｇ定常領域またはその一部を共に用いて
、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長することができる。１つの実施態様において、キ
メラタンパク質は単量体である。他の実施態様において、キメラタンパク質は二量体（ホ
モ二量体またはヘテロ二量体）である。
本発明はまた、（ｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質、（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列、（ｉｉｉ）Ｉｇ
定常領域またはその一部（すなわち、第一のＩｇ定常領域またはその一部（ＦまたはＦ１
））および、（ｉｖ）追加のＩｇ定常領域またはその一部（すなわち、第二のＩｇ定常領
域またはその一部、Ｆ２）を含有するキメラタンパク質を目的とする。１つの実施態様に
おいて、ＸＴＥＮ配列は、Ｎ末端またはＣ末端でＦＶＩＩＩタンパク質に連結されている
か、または、ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上のアミノ酸のすぐ下流（たとえば、１以上の
ＸＴＥＮ挿入部位）に挿入されており、ＦＶＩＩＩタンパク質は、第一のＩｇ定常領域ま
たはその一部に連結されており、ならびに、第一のＩｇ定常領域またはその一部、および
第二の定常領域またはその一部は、任意選択的なリンカーにより互いに関連、または連結
されている。ある態様において、キメラタンパク質は、第一のポリペプチド鎖と第二のポ
リペプチド鎖を含有する単量体－二量体ハイブリッドであり、ここで、第一のポリペプチ
ド鎖は、ＦＶＩＩＩタンパク質、ＸＴＥＮ配列、および第一のＩｇ定常領域またはその一
部を含有し、ならびに、第二のポリペプチド鎖は、ＦＶＩＩＩタンパク質の無い第二のＩ
ｇ定常領域またはその一部を含有し、本質的にからなり、またはからなり、ならびに、こ
こで、第一の鎖と第二の鎖は、互いに関連している。Ｉｇ定常領域またはその一部（たと
えば第一のＦｃ領域）と、追加のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第二のＦｃ領
域）の間の関連は、化学的関連または物理的関連である。ある実施態様において、化学的
関連は共有結合である。他の実施態様において、化学的関連は、非共有結合的相互作用（
たとえば、イオン性相互作用、疎水性相互作用、親水性相互作用、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａ
ａｌｓ相互作用、または水素結合）である。他の実施態様において、関連は、非ペプチド
共有結合である。さらに他の実施態様において、関連はペプチド結合である。
他の態様において、キメラタンパク質は、ＦＶＩＩＩタンパク質、ＸＴＥＮ配列、第一
の定常領域またはその一部、リンカー（たとえば、プロセッシング可能なリンカー）およ
び第二の定常領域またはその一部を含有する一本鎖ポリペプチドであり、ここで、一本鎖
ポリペプチドは、細胞内酵素により、発現の後でプロセッシングされ、２つのポリペプチ
ド鎖となる。
１つの実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質に連結されたＩｇ定常領域またはその
一部（場合によって、「Ｆ」または「Ｆ１」と示される）は、ＸＴＥＮ配列と共に、ＦＶ
ＩＩＩタンパク質の半減期を延長することができる。他の実施態様において、Ｉｇ定常領
域またはその一部（ＦまたはＦ１）は、本明細書の別項に記述されるＦｃ領域またはＦｃ
Ｒｎ結合パートナーである。
他の実施態様において、第一のＩｇ定常領域もしくはその一部と関連または連結される
、追加のＩｇ定常領域もしくはその一部（場合によって、Ｆ２または第二のＩｇ定常領域
またはその一部と本明細書において示される）もまた、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を
延長することができる。他の実施態様において、第二のＩｇ定常領域またはその一部は（
Ｆ２）は、第一のＩｇ定常領域またはその一部およびＸＴＥＮ配列と共に、ＦＶＩＩＩタ
ンパク質の半減期を延長することができる。追加のＩｇ定常領域またはその一部は、本明
細書の別項に記述されるＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーであってもよい。
ある実施態様において、第一のＩｇ定常領域またはその一部と連結された、第二のＩｇ
定常領域またはその一部はさらに、本明細書の別項に記述されるＶＷＦ断片および任意選
択的なＸＴＥＮ配列に連結される。
一部の実施態様において、Ｉｇ定常領域またはその一部（ＦもしくはＦ１または第一の
Ｉｇ定常領域もしくはその一部）および、追加のＩｇ定常領域またはその一部（すなわち
、第二のＩｇ定常領域もしくはその一部またはＦ２）のいずれか、または両方（本段落に
おいては、Ｉｇ定常領域またはその一部として示される）としては、限定されないが、Ｃ
Ｈ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、ヒンジドメイン、そ
れらの任意の機能性断片、誘導体、もしくはアナログ、またはそれらの２以上の組み合わ
せ、が挙げられる。１つの実施態様において、Ｉｇ定常領域またはその一部は、少なくと
も１つのＣＨ１ドメイン、少なくとも１つのＣＨ２ドメイン、少なくとも１つのＣＨ３ド
メイン、少なくとも１つのＣＨ４ドメイン、またはその機能性断片、誘導体もしくはアナ
ログを含有する。他の実施態様において、Ｉｇ定常領域またはその一部は、少なくとも１
つのヒンジドメインまたはその一部、および、少なくとも１つのＣＨ２ドメインまたはそ
の一部（たとえば、ヒンジ－ＣＨ２の方向で）を含む。他の実施態様において、Ｉｇ定常
ドメインまたはその一部は、少なくとも１つのＣＨ２ドメインまたはその一部、および、
少なくとも１つのＣＨ３ドメインまたはその一部（たとえば、ＣＨ２－ＣＨ３の方向で）
を含む。

その組み合わせの例としては、限定されないが、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよび
ヒンジドメイン（それらは、Ｆｃ領域（またはＦｃドメイン）としても知られる）が挙げ
られる（たとえば、第一のＦｃ領域）。Ｉｇ定常領域またはその一部の追加例は、本明細
書の別項に記述する。
本発明のキメラタンパク質は、野生型ＦＶＩＩＩと比較し延長された半減期のＦＶＩＩ
Ｉタンパク質を有してもよい。１つの実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期
は、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３
倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少な
くとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくと
も約１２倍、野生型ＦＶＩＩＩよりも長く、延長されている。他の実施態様において、Ｆ
ＶＩＩＩタンパク質の半減期は、少なくとも約１０時間、少なくとも約１１時間、少なく
とも約１２時間、少なくとも約１３時間、少なくとも約１４時間、少なくとも約１５時間
、少なくとも約１６時間、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約
１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少な
くとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時
間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少なくとも
約９６時間、または少なくとも約１０８時間である。
（３）ＦＶＩＩＩ、ＸＴＥＮおよびＶＷＦ
１つの態様において、本発明のキメラタンパク質は、（ｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質、（
ｉｉ）ＸＴＥＮ配列、および、（ｉｉｉ）ＶＷＦのＤ´ドメインおよびＤ３ドメインを含
有するＶＷＦ断片、を含有し、ここで、ＦＶＩＩＩタンパク質は、ＸＴＥＮ配列に連結さ
れ、ここで、ＦＶＩＩＩタンパク質は、ＶＷＦ断片と関連し、または連結されている。１
つの実施態様において、本明細書に記述されるキメラタンパク質のＶＷＦ断片は、ＶＷＦ
クリアランス受容体に結合することができない。他の実施態様において、ＶＷＦ断片は、
ＦＶＩＩＩタンパク質を１以上のプロテアーゼ開裂から保護すること、ＦＶＩＩＩタンパ
ク質を活性化から保護すること、ＦＶＩＩＩタンパク質の重鎖および／または軽鎖を安定
化させること、または、１以上のスカベンジャー受容体によるＦＶＩＩＩタンパク質の除
去を妨げること、ができる。他の実施態様において、ＶＷＦ断片は、内因性ＶＷＦが、Ｆ
ＶＩＩＩタンパク質のＶＷＦ結合部位へと結合することを、妨害または抑制する。ＶＷＦ
結合部位は、ＦＶＩＩＩタンパク質のＡ３ドメインまたはＣ２ドメインに位置していても
よく、または、Ａ３ドメインおよびＣ２ドメインの両方に位置していても良い。特定の実
施態様において、ＶＷＦ結合部位は、配列番号２の、アミノ酸１６６９～１６８９および
／または２３０３～２３３２に対応するアミノ酸配列を含有する。
他の態様において、キメラタンパク質は、（ｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質、（ｉｉ）ＸＴ
ＥＮ配列、（ｉｉｉ）ＶＷＦのＤ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有するＶＷＦ断片、
および、（ｉｖ）Ｉｇ定常領域またはその一部、を含有し、ここで、ＸＴＥＮ配列はＣ末
端またはＮ末端でＦＶＩＩＩタンパク質に連結され、または、ＦＶＩＩＩタンパク質の１
以上のアミノ酸のすぐ下流（たとえば、本明細書に開示される１以上のＸＴＥＮ挿入部位
）に挿入され、ＶＷＦ断片は、ＦＶＩＩＩタンパク質またはＸＴＥＮ配列に連結または関
連し、および、Ｉｇ定常領域またはその一部は、ＦＶＩＩＩタンパク質、ＸＴＥＮ配列、
ＶＷＦ断片、またはそれらの任意の組み合わせに連結される。本発明のキメラタンパク質
に有用なＩｇ定常領域またはその一部は、本明細書の別項に記述される。１つの実施態様
において、Ｉｇ定常領域またはその一部は、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長させる
ことができる。他の実施態様において、Ｉｇ定常領域またはその一部は、第一のＦｃ領域
または第一のＦｃＲｎ結合パートナーを含有する。さらに他の実施態様において、Ｉｇ定
常領域またはその一部は、任意選択的なリンカーによりＦＶＩＩＩタンパク質に連結され
る。さらに他の実施態様において、リンカーは、開裂可能なリンカーを含有する。キメラ
タンパク質は、一本鎖ポリペプチド、すなわち、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（
ｉｖ）を含有する単量体（すなわち、一本鎖）であってもよく、または、（ｉ）および（
ｉｉ）を含有する第一の鎖と、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を含有する第二の鎖を含有する
、二本鎖ポリペプチドであっても良い。他の態様において、キメラタンパク質は、二量体
（たとえば、ホモ二量体またはヘテロ二量体）であある。１つの実施態様において、キメ
ラタンパク質は、それぞれが（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を含有する２
つの鎖を含有する。
ある実施態様において、キメラタンパク質は、（ｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質、（ｉｉ）
ＸＴＥＮ配列、（ｉｉｉ）ＶＷＦのＤ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有するＶＷＦ断
片、（ｉｖ）Ｉｇ定常領域またはその一部（場合によって、「Ｆ」、「第一のＩｇ定常領
域またはその一部」または「Ｆ２」とも示される）、および、（ｖ）追加のＩｇ定常領域
またはその一部（場合によって、「Ｆ２」または「第二のＩｇ定常領域またはその一部」
とも示される）を含有し、ここで、（１）ＦＶＩＩＩタンパク質はＦＶＩＩＩタンパク質
のＣ末端またはＮ末端でＸＴＥＮ配列に連結、または、ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上の
アミノ酸のすぐ下流（たとえば、本明細書に開示される１以上のＸＴＥＮ挿入部位）で挿
入され、（２）ＸＴＥＮ配列またはＦＶＩＩＩタンパク質のいずれかは、Ｉｇ定常領域ま
たはその一部に連結され、（３）ＶＷＦ断片は、第二のＩｇ定常領域またはその一部に連
結され、および、（４）Ｉｇ定常領域またはその一部は、第二のＩｇ定常領域またはその
一部と関連する。１つの実施態様において、ＦＶＩＩタンパク質またはＸＴＥＮ配列に連
結されたＩｇ定常領域またはその一部はさらに、リンカー（プロセッシング可能なリンカ
ー）によりＶＷＦ断片に連結される。他の実施態様において、本発明のキメラタンパク質
に有用な追加のＩｇ定常領域またはその一部はさらに、任意選択的なリンカー（たとえば
、プロセッシング可能なリンカー）によりＦＶＩＩＩタンパク質またはＩｇ定常領域また
はその一部に連結されてもよい。一部の実施態様において、Ｉｇ定常領域またはその一部
、および追加のＩｇ定常領域またはその一部のペアは、それぞれがＶＷＦ断片およびＦＶ
ＩＩＩタンパク質に連結され、ＦＶＩＩＩタンパク質とＶＷＦ断片の間の非共有結合より
も強い結合（すなわち、共有結合（たとえば、ジスルフィド結合））をもたらし、それに
よって、内因性ＶＷＦが、ｉｎ ｖｉｖｏでＶＷＦ断片と置き換わることを妨げる。他の
実施態様において、Ｉｇ定常領域またはその一部、および、追加のＩｇ定常領域またはそ
の一部のいずれか、または両方は、ＦＶＩＩＩタンパク質またはＶＷＦ断片の半減期を延
長することができる。他の実施態様において、追加のＩｇ定常領域またはその一部は、第
二のＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーを含有する。キメラタンパク質中のＩｇ定常
領域またはその一部、および、追加のＩｇ定常領域またはその一部は、同一または異なっ
ている。
ある実施態様において、Ｉｇ定常領域またはその一部、および、追加のＩｇ定常領域ま
たはその一部は、化学的関連または物理的関連により関連している。１つの実施態様にお
いて、化学的関連、すなわち、（：）は、少なくとも１つの非ペプチド結合である。ある
実施態様において、化学的関連、すなわち、（：）は、共有結合である。他の実施態様に
おいて、化学的関連、すなわち、（：）は非共有結合的相互作用（たとえば、イオン性相
互作用、疎水性相互作用、親水性相互作用、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ相互作用、また
は水素結合）である。他の実施態様において、（：）は、非ペプチド共有結合である。さ
らに他の実施態様において、（：）はペプチド結合である。さらに他の実施態様において
、（：）は２つの配列の間の物理的関連を表し、ここで、第一の配列の一部は、第二の配
列に非常に近接しており、それによって、その第二の配列の一部は、第一の配列によって
他の部分と相互作用することから保護され、または妨害される。一部の実施態様において
、Ｉｇ定常領域またはその一部、および、追加のＩｇ定常領域またはその一部の間の関連
は、共有結合（たとえば、ジスルフィド結合）であっても良く、それにより、ＶＷＦ断片
または、ＶＷＦ断片を含有するポリペプチドが、内因性ＶＷＦと置き換わることが妨げら
れる。すなわち、ＦＶＩＩＩタンパク質と内因性ＶＷＦの間の相互作用を妨げることによ
り、ＦＶＩＩＩタンパク質に対する半減期制限因子が取り除かれ、それによって、ＦＶＩ
ＩＩタンパク質の半減期が、ＶＷＦタンパク質を有しないＦＶＩＩＩタンパク質、または
野生型ＦＶＩＩＩと比較して、延長される。
他の態様において、キメラタンパク質は、下記を含有する式を含有する：
（１）ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）－Ｌ１－Ｆ１：Ｖ－Ｌ２－Ｘ２－Ｌ３－Ｆ２、
（２）ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）－Ｌ１－Ｆ１：Ｆ２－Ｌ３－Ｘ２－Ｌ２－Ｖ、
（３）Ｆ１－Ｌ１－ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）：Ｖ－Ｌ２－Ｘ２－Ｌ３－Ｆ２、
（４）Ｆ１－Ｌ１－ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）；Ｆ２－Ｌ３－Ｘ２－Ｌ２－Ｖ、
（５）ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）－Ｌ１－Ｆ１－Ｌ４－Ｖ－Ｌ２－Ｘ２－Ｌ３－Ｆ２、
（６）ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）－Ｌ１－Ｆ１－Ｌ４－Ｆ２－Ｌ３－Ｘ２－Ｌ２－Ｖ、
（７）Ｆ１－Ｌ１－ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）－Ｌ４－Ｖ－Ｌ２－Ｘ２－Ｌ３－Ｆ２、または、
（８）Ｆ１－Ｌ１－ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）－Ｌ４－Ｆ２－Ｌ３－Ｘ２－Ｌ２－Ｖ、
であり、ここで、ＦＶＩＩＩ（Ｘ１）は、ＦＶＩＩＩタンパク質および１以上のＸＴＥＮ
配列を含有し、ここで、１以上のＸＴＥＮは、ＦＶＩＩＩタンパク質のＮ末端またはＣ末
端に連結され、または、ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上のアミノ酸のすぐ下流（たとえば
、本明細書に開示される１以上のＸＴＥＮ挿入部位）に挿入され、
Ｌ１、Ｌ２またはＬ３のそれぞれは、任意のリンカー（たとえば開裂可能なリンカー）を
含有し、
Ｌ４は、リンカー（たとえば、プロセッシング可能なリンカー）であり、
Ｘ２は、１以上の任意選択的なＸＴＥＮ配列を含有し、
Ｆ１はＩｇ定常領域またはその一部を含有し、
Ｆ２は任意選択的な追加のＩｇ定常領域またはその一部を含有し、および、
ＶはＶＷＦ断片を含有し、
（－）はペプチド結合または１以上のアミノ酸であり、および、
（：）は共有結合または非共有結合を含有する。１つの実施態様において、（：）は、化
学的関連（たとえば、少なくとも１つの非ペプチド結合）を表す。他の実施態様において
、化学的関連、すなわち、（：）は、共有結合である。他の実施態様において、化学的関
連、すなわち、（：）は非共有結合的相互作用（たとえば、イオン性相互作用、疎水性相
互作用、親水性相互作用、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ相互作用、または水素結合）であ
る。他の実施態様において、（：）は、非ペプチド共有結合である。さらに他の実施態様
において、（：）はペプチド結合である。さらに他の実施態様において、（：）は２つの
配列の間の物理的関連を表し、ここで、第一の配列の一部は、第二の配列に非常に近接し
ており、それによって、その第二の配列の一部は、第一の配列によって他の部分と相互作
用することから保護され、または妨害され、および、さらに、その第二の配列と他の部分
が相互作用せずに、この物理的関連は維持される。本明細書のポリペプチドの式の方向は
、Ｎ末端（左側）からＣ末端（右側）へと列記されている。たとえば、式Ｖ－Ｘ－ＦＶＩ
ＩＩは、式ＮＨ２－Ｖ－Ｘ－ＦＶＩＩＩ－ＣＯＯＨを意味する。１つの実施態様において
、本明細書に記述される式は、２つの部分の間に任意の追加の配列を含有しても良い。た
とえば、式Ｖ－Ｘ－ＦＶＩＩＩはさらに、他で特定されない限り、ＶとＸの間のＶのＮ末
端で、ＸとＦＶＩＩＩの間で、または、ＦＶＩＩＩのＣ末端で、任意の配列を含有しても
良い。他の実施態様において、ハイフン（－）はペプチド結合を示す。
１つの態様において、キメラタンパク質は、２つのポリペプチド鎖、つまり、（Ａ）（
ｉ）一本鎖ＦＶＩＩＩタンパク質、（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列、および、（ｉｉｉ）第一のＩ
ｇ定常領域またはその一部（たとえば、第一のＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナー）
を含有する第一の鎖であり、ここで、ＸＴＥＮ配列はＮ末端またはＣ末端でＦＶＩＩＩタ
ンパク質に連結され、または、ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上のアミノ酸のすぐ下流（た
とえば、本明細書に開示される１以上のＸＴＥＮ挿入部位）に挿入され、および、ＸＴＥ
Ｎ配列がＣ末端またはＣ末端でＦＶＩＩＩタンパク質に連結される場合には、第一のＩｇ
定常領域またはその一部はＸＴＥＮ配列に連結され、および、ＸＴＥＮ配列がＦＶＩＩＩ
タンパク質内に挿入される場合には、第一のＩｇ定常領域またはその一部はＦＶＩＩＩタ
ンパク質に連結され、ならびに、（Ｂ）（ｉｖ）Ｄ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有
するＶＷＦ断片、（ｖ）リンカー、および、（ｖｉ）第二のＩｇ定常領域またはその一部
（たとえば、第二のＦｃ領域または第二のＦｃＲｎ結合パートナー）を含有する第二の鎖
であり、ここで、ＶＷＦ断片はリンカー（たとえば、開裂可能なリンカー）に連結され、
それはさらに第二のＩｇ定常領域またはその一部に連結され、ならびに、ここで、第一の
ポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖は、互いに関連（たとえば、ジスルフィド結合等
の共有結合）する、を含有する。１つの実施態様において、リンカーは、本明細書の別項
に記述される開裂可能なリンカーである（たとえば、トロンビン開裂可能なリンカー）。
一部の実施態様において、第二の鎖は、（ｉｖ）および（ｖ）、または、（ｖ）および（
ｖｉ）の間に１以上のＸＴＥＮ配列を含有する。
キメラタンパク質は、（ｉ）一本鎖ＦＶＩＩＩタンパク質、（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列、（
ｉｉｉ）第一のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第一のＦｃ領域または第一のＦ
ｃＲｎ結合パートナー）、（ｉｖ）第一のリンカー、（ｖ）Ｄ´ドメインおよびＤ３ドメ
インを含有するＶＷＦ断片、（ｖｉ）第二のリンカー、（ｖｉｉ）第二のＩｇ定常領域ま
たはその一部（たとえば、第二のＦｃ領域または第二のＦｃＲｎ結合パートナー）、を含
有する１つのポリペプチド鎖を含有し、ここで、（ｉ）～（ｖｉｉ）は、その順で、また
は任意の順で、連結されている。１つの実施態様において、第一のリンカーは、発現後に
細胞内でプロセッシングされ、または、開裂され、そして一本鎖ポリペプチドを２つのポ
リペプチド鎖にすることができる、プロセッシング可能なリンカーである。他の実施態様
において、第二のリンカーは、本明細書に記述される開裂可能なリンカー（たとえば、ト
ロンビン開裂可能なリンカー）である。本明細書において用いられるＸＴＥＮ配列は、任
意選択的なリンカーにより、ＦＶＩＩＩタンパク質のＮ末端またはＣ末端でＦＶＩＩＩタ
ンパク質に連結されてもよく、または、ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上のアミノ酸のすぐ
下流（たとえば、１以上のＸＴＥＮ挿入部位）で挿入されても良い。
ある態様において、キメラタンパク質は、（Ａ）互いに連結されている、（ｉ）ＦＶＩ
ＩＩの重鎖および（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列、を含有する第一のポリペプチド鎖、ならびに、
（Ｂ）互いに連結されている、（ｉｉｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質の軽鎖および（ｉｖ）第
一のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第一のＦｃ領域または第一のＦｃＲｎ結合
パートナー）、を含有する第二のポリペプチド鎖、ならびに、（Ｃ）（ｖ）Ｄ´ドメイン
とＤ３ドメインを含有するＶＷＦ断片、（ｖｉ）リンカー、および、（ｖｉｉ）第二のＩ
ｇ定常領域またはその一部（たとえば、第二のＦｃ領域または第二のＦｃＲｎ結合パート
ナー）、を含有する第三のポリペプチド鎖、の３つのポリペプチド鎖を含有し、ここで、
第二の鎖は、第一の鎖と第三の鎖に関連している。１つの実施態様において、第一の鎖と
第二の鎖の間の関連は、化学的関連または物理的関連である。たとえば、第一の鎖と第二
の鎖の間の関連は、金属結合であっても良い。他の実施態様において、第二の鎖と第三の
鎖の間の関連もまた、化学的関連または物理的関連（たとえば、共有結合または非共有結
合等）である。ある実施態様において、第二の鎖と第三の間の関連は、２つのＩｇ定常領
域またはその一部を介しており、および、ジスルフィド結合である。第二の鎖と第三の鎖
の間の結合により、ＦＶＩＩＩタンパク質が内因性ＶＷＦと結合することが妨害または抑
制され、それによって、ＶＷＦクリアランス経路によりＦＶＩＩＩタンパク質が除去され
ることを防ぐ。一部の実施態様において、リンカーは、宿主細胞における発現の後で、細
胞内で開裂される、プロセッシング可能なリンカーである。本明細書で用いられるＸＴＥ
Ｎ配列は、任意選択的なリンカーにより、ＦＶＩＩＩタンパク質のＮ末端またはＣ末端で
ＦＶＩＩＩタンパク質に連結され、または、ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上のアミノ酸の
すぐ下流（たとえば、１以上のＸＴＥＮ挿入部位）に挿入される。
ある実施態様において、ＶＷＦ断片は、ペプチド結合またはリンカーにより、１以上の
ＸＴＥＮを含有するＦＶＩＩＩタンパク質に直接、連結される。ＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩ
タンパク質（１以上のＸＴＥＮが挿入され、または、直接連結（たとえば、ペプチド結合
）またはリンカーを介して連結されている）の連結方法の１つとして、酵素的ライゲーシ
ョン（たとえば、ソルターゼ）を用いても良い。たとえば、ソルターゼとは、カルボキシ
末端選別シグナルを認識および開裂することにより、表面タンパク質を改変する、原核細
胞の酵素の群を指す。ソルターゼ酵素の基質のほとんどに対し、認識シグナルは、ＬＰＸ
ＴＧ（Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－ａｎｙ－Ｔｈｒ－Ｇｌｙ（配列番号５１）モチーフ、次いで、高
度に疎水性の膜貫通型配列、次いで、塩基性残基（たとえば、アルギニン）のクラスター
からなる。Ｔｈｒ残基を介した、ライゲーションパートナーのＣｙｓ残基活性部位への一
過性の付着で、ＴｈｒとＧｌｙの間に開裂が発生し、次いで、細胞壁へタンパク質を共有
結合的に付着させるペプチド転移が発生する。一部の実施態様において、ライゲーション
パートナーは、Ｇｌｙ（ｎ）を含有する。他の実施態様において、キメラタンパク質はさ
らに、ソルターゼ認識モチーフを含有する。一部の実施態様において、ＶＷＦ断片は、ソ
ルターゼ介在ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質ライゲーションを用いて、挿入された、または
連結された１以上のＸＴＥＮを含有するＦＶＩＩＩに付着する。
１つの実施態様において、任意選択的なリンカーにより、ソルターゼ認識モチーフに連
結されたＶＷＦ断片は、ソルターゼによりＧｌｙ（ｎ）に連結されたＦＶＩＩＩに融合さ
れていてもよく、ここで、ｎは、任意の整数であってもよく、および、ここで、１以上の
ＸＴＥＮが、ＦＶＩＩＩタンパク質内に挿入または連結されていてもよい。ライゲーショ
ン構築物は、ＶＷＦ断片（構築物のＮ末端部分）および、１以上のＸＴＥＮが挿入または
連結されているＦＶＩＩＩタンパク質（構築物のＣ末端部分）を含有し、ここで、ソルタ
ーゼ認識モチーフは、その間に挿入されている。他のライゲーション構築物は、ＶＷＦ断
片（構築物のＮ末端部分）、リンカー、ソルターゼ認識モチーフ、および、１以上のＸＴ
ＥＮが挿入または連結されているＦＶＩＩＩタンパク質（構築物のＣ末端部分）を含有す
る。他の実施態様において、任意選択的なリンカーによりソルターゼ認識モチーフに連結
されたＦＶＩＩＩタンパク質は、ソルターゼによりＧｌｙ（ｎ）に連結されたＶＷＦ断片
に融合されていてもよく、ここで、ｎは、任意の整数である。得られたライゲーション構
築物は、１以上のＸＴＥＮが挿入または連結されているＦＶＩＩＩタンパク質（構築物の
Ｎ末端部分）、および、ＶＷＦ断片（構築物のＣ末端部分）を含有し、ここで、ソルター
ゼ認識モチーフは、その間に挿入されている。他の得られたライゲーション構築物は、１
以上のＸＴＥＮが挿入または連結されているＦＶＩＩＩタンパク質（構築物のＮ末端部分
）、リンカー、ソルターゼ認識モチーフ、およびＶＷＦ断片（構築物のＣ末端部分）を含
有する。他の実施態様において、第一の任意選択的なリンカーによりソルターゼ認識モチ
ーフに連結されたＶＷＦ断片は、第二の任意選択的なリンカーによりトロンビン開裂部位
に連結された異種部分（たとえば、イムノグロブリン定常領域またはその一部（たとえば
、Ｆｃ領域））に融合されていてもよい。得られた構築物は、ＶＷＦ断片（Ｎ末端部分）
、第一のリンカー、ソルターゼ認識モチーフ、プロテアーゼ開裂部位、第二の任意選択的
なリンカー、および異種部分を含有してもよい。
一部の実施態様において、ＶＷＦ断片は、ＦＶＩＩＩタンパク質に関連している。ＶＷ
Ｆ断片とＦＶＩＩＩタンパク質の間の関連は、化学的関連または物理的関連であってもよ
い。化学的関連は、非共有結合的相互作用（たとえば、イオン性相互作用、疎水性相互作
用、親水性相互作用、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ相互作用、または水素結合）であって
もよい。さらに他の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質とＶＷＦ断片の間の関連は
、２つの配列の間の物理的関連（たとえば、ＦＶＩＩＩタンパク質を有する配列と、ＶＷ
Ｆ断片を有する配列の間のさらなる関連によるもの）であり、ここで、第一の配列の一部
は、第二の配列に非常に近接しており、それによって、その第二の配列の一部は、第一の
配列によって他の部分と相互作用することから保護され、または妨害される。
内因性ＶＷＦとＦＶＩＩＩタンパク質との相互作用をＶＷＦ断片が妨害または抑制する
ことにより、本明細書に記述されるキメラタンパク質は、野生型ＦＶＩＩＩまたはＶＷＦ
断片の無い対照キメラタンパク質と比較して、半減期が延長される。１つの実施態様にお
いて、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、ＶＷＦ断片の無いＦＶＩＩＩタンパク質よりも
、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍
、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なく
とも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも
約１２倍、延長される。他の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、少な
くとも約１０時間、少なくとも約１１時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１３時
間、少なくとも約１４時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約１６時間、少なくとも
約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少
なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４
時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくと
も約７２時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９６時間、または少なくとも約１０
８時間である。特定の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、ＨｅｍＡマ
ウスにおいて、少なくとも１０時間、少なくとも約１１時間、少なくとも約１２時間、少
なくとも約１３時間、少なくとも約１４時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約１６
時間、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくと
も約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、
少なくとも約２４時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約２６時間、少なくとも約２
７時間、延長される。
Ａ）Ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ＶＷＦ）断片
ＶＷＦ（Ｆ８ＶＷＦとしてもまた知られる）は、血漿中に存在する大きな多量体糖タン
パク質であり、内皮（バイベル・パラーデ（Ｗｅｉｂｅｌ－Ｐａｌａｄｅ）小体）、巨核
球（血小板のα顆粒）および内皮下結合組織において、構造的に産生される。基礎となる
ＶＷＦ単量体は、２８１３アミノ酸のタンパク質である。すべての単量体には、Ｄ´／Ｄ
３ドメイン（第ＶＩＩＩ因子に結合する）、Ａ１ドメイン（血小板ＧＰＩｂ受容体、ヘパ
リン、および／または、おそらくコラーゲンに結合する）、Ａ３ドメイン（コラーゲンに
結合する）、Ｃ１ドメイン（活性化された際に、その中のＲＧＤドメインが血小板インテ
グリンαＩＩｂβ３に結合する）、およびタンパク質のＣ末端の「システインノット」ド
メイン（ＶＷＦが、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）
、およびβヒト絨毛性ゴナドトロピン（βＨＣＧ）と共有する）等の特定の機能を有する
多くの特定ドメインが含有される。
本明細書において「ＶＷＦ断片」という用語には、限定されないが、内因性ＶＷＦのＦ
ＶＩＩＩへの結合を抑制することができる、Ｄ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有する
機能性ＶＷＦ断片が含まれる。１つの実施態様において、ＶＷＦ断片は、ＦＶＩＩＩタン
パク質に結合する。他の実施態様において、ＶＷＦ断片は、ＦＶＩＩＩタンパク質状のＶ
ＷＦ結合部位を妨害し、それにより、ＦＶＩＩＩタンパク質と内因性ＶＷＦとの相互作用
を抑制する。ＶＷＦ断片には、ＶＷＦのこれらの活性を保持する、誘導体、変異体、突然
変異体、またはアナログが含まれる。
ヒトＶＷＦの２８１３単量体アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号Ｎ
Ｐ＿０００５４３．２として報告されている。ヒトＶＷＦをコードするヌクレオチド配列
は、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿０００５５２．３として報告されている
。ヒトＶＷＦのヌクレオチド配列は、配列番号１として指定されている。配列番号２は、
配列番号１にコードされるアミノ酸配列である。ＶＷＦの各ドメインは、表１にリストア
ップされる。
Figure 0007022165000001
Figure 0007022165000002
Figure 0007022165000003
Figure 0007022165000004
Figure 0007022165000005
Figure 0007022165000006
Figure 0007022165000007
Figure 0007022165000008
Figure 0007022165000009
Figure 0007022165000010
Figure 0007022165000011
Figure 0007022165000012
Figure 0007022165000013
Figure 0007022165000014
本明細書において、ＶＷＦ断片は、ＶＷＦのＤ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有す
るＶＷＦ断片であってもよく、ここで、ＶＷＦ断片は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に
結合し、内因性ＶＷＦ（全長ＶＷＦ）のＦＶＩＩＩへの結合を抑制する。Ｄ´ドメインお
よびＤ３ドメインを含有するＶＷＦ断片はさらに、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ａ３ド
メイン、Ｄ１ドメイン、Ｄ２ドメイン、Ｄ４ドメイン、Ｂ１ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ
３ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、ＣＫドメイン、それらの１以上の断片、およ
びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＶＷＦドメインを含有しても良い
。１つの実施態様において、ＶＷＦ断片は、（１）ＶＷＦのＤ´ドメインおよびＤ３ドメ
インもしくはそれらの断片、（２）ＶＷＦのＤ１、Ｄ´およびＤ３ドメインもしくはそれ
らの断片、（３）ＶＷＦのＤ２、Ｄ´およびＤ３ドメインもしくはそれらの断片、（４）
ＶＷＦのＤ１、Ｄ２、Ｄ´およびＤ３ドメインもしくはそれらの断片、または、（５）Ｖ
ＷＦのＤ１、Ｄ２、Ｄ´、Ｄ３およびＡ１ドメイン、もしくはそれらの断片、を含有する
、本質的にからなる、または、からなる。本明細書に記述されるＶＷＦ断片は、ＶＷＦク
リアランス受容体に結合する部位を含有しない。他の実施態様において、本明細書に記述
されるＶＷＦ断片は、配列番号２のアミノ酸７６４～１２７４ではない。本発明のＶＷＦ
断片は、ＶＷＦ断片に連結された、または融合された、任意の他の配列を含有しても良い
。たとえば、本明細書に記述されるＶＷＦ断片は、シグナルペプチドをさらに含有しても
よい。
１つの実施態様において、ＶＷＦ断片は、ＦＶＩＩＩタンパク質に結合、または関連す
る。ＦＶＩＩＩタンパク質に結合、または関連することにより、本発明のＶＷＦ断片は、
プロテアーゼ開裂およびＦＶＩＩＩ活性化からＦＶＩＩＩを保護し、ＦＶＩＩＩの重鎖お
よび軽鎖を安定化させ、スカベンジャー受容体によるＦＶＩＩＩの除去を妨害する。他の
実施態様において、ＶＷＦ断片はＦＶＩＩＩに結合または関連し、ＦＶＩＩＩがリン脂質
および活性化されたプロテインＣに結合することを妨害または防ぐ。ＦＶＩＩＩタンパク
質と内因性の全長ＶＷＦとの結合を妨害または抑制することによって、本発明のＶＷＦ断
片は、ＶＷＦクリアランス受容体によるＦＶＩＩＩの除去を減少させ、それによって、Ｆ
ＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長させる。ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期の延長は、Ｖ
ＦＶＩＩＩタンパク質に対するＷＦクリアランス受容体結合部位が欠落しているＶＷＦ断
片の結合または関連によるものであり、および、ＶＷＦ断片によって、ＦＶＩＩＩタンパ
ク質が、ＶＷＦクリアランス受容体結合部位を含有する内因性ＶＷＦから隠蔽される、ま
たは保護されることによるものである。全長ＶＷＦ分子に含有されるＶＷＦクリアランス
経路受容体結合部位を除去することにより、本発明の、ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦヘテロ二量体
は、ＶＷＦクリアランス経路から隠蔽され、さらにＦＶＩＩＩの半減期が延長される。
１つの実施態様において、本発明のＶＷＦ断片は、ＶＷＦのＤ´ドメインおよびＤ３ド
メインを含有し、ここで、Ｄ´ドメインは、配列番号２のアミノ酸７６４～８６６と少な
くとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９
９％、または、１００％同一であり、ここで、ＶＷＦ断片は、内因性ＶＷＦがＦＶＩＩＩ
に結合することを妨害する。他の実施態様において、ＶＷＦ断片は、ＶＷＦのＤ´ドメイ
ンおよびＤ３ドメインを含有し、ここで、Ｄ３ドメインは、配列番号２のアミノ酸８６７
～１２４０と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９
７％、９８％、９９％、または、１００％同一であり、ここで、ＶＷＦ断片は、内因性Ｖ
ＷＦがＦＶＩＩＩに結合することを妨害する。一部の実施態様において、本明細書に記述
されるＶＷＦ断片は、ＶＷＦ断片は、配列番号２のアミノ酸７６４～１２４０と少なくと
も６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％
、または、１００％同一である、ＶＷＦのＤ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有する、
本質的にからなる、または、からなり、ここで、ＶＷＦ断片は、内因性ＶＷＦがＦＶＩＩ
Ｉに結合することを妨害する。他の実施態様において、ＶＷＦ断片は、配列番号２のアミ
ノ酸２３～１２４０と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９
６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％同一である、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ´および
Ｄ３ドメインを含有する、本質的にからなる、または、からなり、ここで、ＷＦ断片は、
内因性ＶＷＦがＦＶＩＩＩに結合することを妨害する。さらに他の実施態様において、Ｖ
ＷＦ断片は、ＶＷＦ断片に作動可能に連結されたシグナルペプチドをさらに含有する。
一部の実施態様において、本発明のＶＷＦ断片は、（１）Ｄ´Ｄ３ドメイン、Ｄ１Ｄ´
Ｄ３ドメイン、Ｄ２Ｄ´Ｄ３ドメイン、または、Ｄ１Ｄ２Ｄ´Ｄ３ドメイン、および、（
２）約１０アミノ酸までの追加のＶＷＦ断片（たとえば、配列番号２のアミノ酸７６４～
１２４０から、配列番号２のアミノ酸７６４～１２５０由来の任意の配列）、約１５アミ
ノ酸までの追加のＶＷＦ断片（たとえば、配列番号２のアミノ酸７６４～１２４０から、
配列番号２のアミノ酸７６４～１２５５由来の任意の配列）、約２０アミノ酸までの追加
のＶＷＦ断片（たとえば、配列番号２のアミノ酸７６４～１２４０から、配列番号２のア
ミノ酸７６４～１２６０由来の任意の配列）、約２５アミノ酸までの追加のＶＷＦ断片（
たとえば、配列番号２のアミノ酸７６４～１２４０から、配列番号２のアミノ酸７６４～
１２６５由来の任意の配列）、約３０アミノ酸までの追加のＶＷＦ断片（たとえば、配列
番号２のアミノ酸７６４～１２４０から、配列番号２のアミノ酸７６４～１２６０由来の
任意の配列）から本質的になる、または、からなる。特定の実施態様において、Ｄ´ドメ
インおよびＤ３ドメインを含有する、または本質的にからなる、ＶＷＦ断片は、配列番号
２のアミノ酸７６４～１２７４ではなく、また、全長成熟型ＶＷＦでもない。一部の実施
態様において、Ｄ１Ｄ２ドメインは、Ｄ´Ｄ３ドメインと、ｔｒａｎｓの状態で発現され
る。一部の実施態様において、Ｄ１Ｄ２ドメインは、Ｄ´Ｄ３ドメインとｃｉｓの状態で
発現される。
他の実施態様において、Ｄ１Ｄ２ドメインに連結されているＤ´Ｄ３ドメインを含有す
るＶＷＦ断片は、細胞内開裂部位（たとえば、ＰＡＣＥ（ｆｕｒｉｎ）またはＰＣ５によ
る開裂部位）をさらに含有し、それにより、発現の際に、Ｄ´Ｄ３ドメインからＤ１Ｄ２
ドメインが開裂される。細胞内開裂部位の非限定的な例は、本明細書の別項に記述される
。
さらに他の実施態様において、ＶＷＦ断片は、Ｄ´ドメインおよびＤ３ドメインを含有
するが、（１）配列番号２のアミノ酸１２４１～２８１３、（２）配列番号２のアミノ酸
１２７０～２８１３、（３）配列番号２のアミノ酸１２７１～２８１３、（４）配列番号
２のアミノ酸１２７２～２８１３、（５）配列番号２のアミノ酸１２７３～２８１３、（
６）配列番号２のアミノ酸１２７４～２８１３、および、それらの任意の組み合わせから
なる群から選択されるアミノ酸配列を含有しない。
さらに他の実施態様において、本発明のＶＷＦ断片は、Ｄ´ドメイン、Ｄ３ドメイン、
およびＡ１ドメインに対応するアミノ酸配列を含有する、本質的にからなる、または、か
らなり、ここで、アミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸７６４～１４７９と少なくとも
６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、
９９％、または、１００％同一であり、ここで、ＶＷＦ断片は、内因性ＶＷＦがＦＶＩＩ
Ｉに結合することを妨害する。特定の実施態様において、ＶＷＦ断片は、配列番号２のア
ミノ酸７６４～１２７４ではない。
一部の実施態様において、本発明のＶＷＦ断片は、、Ｄ´ドメインおよびＤ３ドメイン
を含有するが、（１）Ａ１ドメイン、（２）Ａ２ドメイン、（３）Ａ３ドメイン、（４）
Ｄ４ドメイン、（５）Ｂ１ドメイン、（６）Ｂ２ドメイン、（７）Ｂ３ドメイン、（８）
Ｃ１ドメイン、（９）Ｃ２ドメイン、（１０）ＣＫドメイン、（１１）ＣＫ ドメイン、
および、Ｃ２ドメイン、（１２）ＣＫドメイン、Ｃ２ドメイン、および、Ｃ１ドメイン、
（１３）ＣＫドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｂ３ドメイン、（１４）ＣＫドメ
イン、Ｃ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｂ２ドメイン、（１５）ＣＫドメイ
ン、Ｃ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｂ２ドメイン、および、Ｂ１ドメイン
、（１６）ＣＫドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｂ２ドメイン、
Ｂ１ドメイン、および、Ｄ４ドメイン、（１７）ＣＫドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ１ドメ
イン、Ｂ３ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ１ドメイン、Ｄ４ドメイン、および、Ａ３ドメイ
ン、（１８）ＣＫドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｂ２ドメイン
、Ｂ１ドメイン、Ｄ４ドメイン、Ａ３ドメイン、および、Ａ２ドメイン、（１９）ＣＫド
メイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ１ドメイン、Ｄ
４ドメイン、Ａ３ドメイン、Ａ２ドメイン、および、Ａ１ドメイン、および、（２０）そ
れらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのＶＷＦドメインを含
有しない。
さらに他の実施態様において、ＶＷＦ断片は、Ｄ´Ｄ３ドメインおよび１以上のドメイ
ンまたは分子を含有する。そのようなドメインまたは分子の例としては、限定されないが
、Zhouretal., Blood published online April 6, 2012: DOI10.1182/blood-2012-01-40
5134に開示されているドメインおよび分子が挙げられる。たとえば、ＶＷＦ断片は、Ｄ
´Ｄ３ドメインおよび、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ａ３ドメイン、Ｄ４Ｎモジュール
、ＶＷＤ４モジュール、Ｃ８－４モジュール、ＴＩＬ－４モジュール、Ｃ１モジュール、
Ｃ２モジュール、Ｃ３モジュール、Ｃ４モジュール、Ｃ５モジュール、Ｃ５モジュール、
Ｃ６モジュールおよびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１以上のドメ
インまたはモジュールを含有しても良い。
さらに他の実施態様において、ＶＷＦ断片は、異種部分に連結され、ここで、異種部分
は、ＶＷＦ断片のＮ末端またはＣ末端に連結され、または、ＶＷＦ断片のＦＶＩＩＩタン
パク質の１以上のアミノ酸のすぐ下流（たとえば、１以上のＸＴＥＮ挿入部位）に挿入さ
れる。たとえば、ＶＷＦ断片の異種部分の挿入部位は、Ｄ´ドメイン、Ｄ３ドメインまた
はその両方の中であってもよい。異種部分は、半減期延長物質であっても良い。
ある実施態様において、本発明のＶＷＦ断片は多量体（たとえば、二量体、三量体、四
量体、五量体、六量体、七量体またはそれより高次の多量体）を形成する。他の実施態様
において、ＶＷＦ断片は、１つのＶＷＦ断片のみを有する単量体である。一部の実施態様
において、本発明のＶＷＦ断片は、１以上のアミノ酸置換、欠失、付加または改変を有し
ても良い。１つの実施態様においてＶＷＦ断片は、そのＶＷＦ断片がジスルフィド結合を
形成することができない、または二量体または多量体を形成することができないよう、ア
ミノ酸置換、欠失、付加または改変を含有しても良い。他の実施態様において、アミノ酸
置換は、Ｄ´ドメインおよびＤ３ドメイン内にある。特定の実施態様において、本発明の
ＶＷＦ断片は、配列番号２の残基１０９９、残基１１４２、または残基１０９９と残基１
１４２の両方に対応する残基で、少なくとも１つのアミノ酸置換を含有する。少なくとも
１つのアミノ酸置換は、野生型ＶＷＦにおいて天然には発生しない任意のアミノ酸であっ
てもよい。たとえば、アミノ酸置換は、システイン以外の任意のアミノ酸（たとえば、イ
ソロイシン、アラニン、ロイシン、アスパラギン、リシン、アスパラギン酸、メチオニン
、フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニン、グルタミン、トリプトファン、グリシ
ン、バリン、プロリン、セリン、チロシン、アルギニン、またはヒスチジン）であっても
良い。他の例において、アミノ酸置換は、ＶＷＦ断片が多量体を形成することを妨害また
は抑制する１以上のアミノ酸を有する。
ある実施態様において、本発明に有用なＶＷＦ断片は、ＦＶＩＩＩとの相互作用を改善
するために（たとえば、ＦＶＩＩＩに対する結合アフィニティを改善するために）さらに
改変されていても良い。非限定的な例として、ＶＷＦ断片は、配列番号２のアミノ酸７６
４に対応する残基でセリン残基を含有し、配列番号２のアミノ酸７７３に対応する残基で
リシン残基を含有する。残基７６４および／または残基７７３は、ＦＶＩＩＩに対するＶ
ＷＦ断片の結合アフィニティに寄与することができる。他の実施態様において、本発明に
有用なＶＷＦ断片は、他の改変（たとえば、タンパク質は、ペグ化、グリコシル化、ヘシ
ル化、またはポリシアル化）を有しても良い。
Ｂ）ＸＴＥＮ配列
本明細書において、「ＸＴＥＮ配列」とは、主に小さな親水性アミノ酸から構成される
、天然には存在せず、実質的に非反復性の配列を有し、生理学的条件下で低次構造を有す
る、または二次構造もしくは三次構造を有さない配列を有する、伸長された長さのポリペ
プチドを指す。キメラタンパク質のパートナーとして、ＸＴＥＮは、キメラタンパク質の
作製のために本発明のＶＷＦ断片またはＦＶＩＩＩ配列に連結された際、ある所望の薬物
動態特性、物理化学特性、および薬剤特性をもたらす、担体としての役割を果たすことが
できる。そのような所望の特性としては、限定されないが、薬物動態パラメーターおよび
可溶性の特徴の増強が挙げられる。本明細書において、「ＸＴＥＮ」は、たとえば、抗体
、または、一本鎖抗体または軽鎖もしくは重鎖のＦｃ断片等の抗体断片を具体的に除外す
る。
一部の実施態様において、本発明のＸＴＥＮ配列は、約２０、３０、４０、５０、６０
、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５
０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５
０、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、または２０００アミノ酸残基
よりも大きいアミノ酸を有するペプチドまたはポリペプチドである。ある実施態様におい
て、ＸＴＥＮは、約２０～約３０００アミノ酸残基、約３０～約２５００アミノ酸残基、
約４０～約２０００アミノ酸残基、約５０～約１５００アミノ酸残基、約６０～約１００
０アミノ酸残基、約７０～約９００アミノ酸残基、約８０～約８００アミノ酸残基、約９
０～約７００アミノ酸残基、約１００～約６００アミノ酸残基、約１１０～約５００アミ
ノ酸残基、または約１２０～約４００アミノ酸残基、よりも大きいアミノ酸を有するペプ
チドまたはポリペプチドである。
本発明のＸＴＥＮ配列は、９～１４アミノ酸残基のモチーフ配列、または、配列モチー
フに対して少なくとも８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６
％、９７％、９８％、または、９９％同一であるアミノ酸配列を１つ以上、含有してもよ
く、ここで、モチーフは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン
（Ｔ）、グルタミン酸塩（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）からなる群から選択されるアミノ酸
のうち４～６のタイプを含有する、本質的にからなる、またはからなる（ＵＳ２０１０－
０２３９５５４ Ａ１を参照のこと）。
一部の実施態様において、ＸＴＥＮは、配列の約８０％、または少なくとも約８５％、
または少なくとも約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または
約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または
約９９％、または約１００％が、ファミリー配列となる、表２Ａから選択される単一モチ
ーフファミリーから選択される、非反復配列の複数の単位からなる、非反復配列モチーフ
を含有する。本明細書において、「ファミリー」という用語は、ＸＴＥＮが、表２Ａから
の単一モチーフカテゴリーからのみ選択されるモチーフ（すなわち、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、
ＡＧ、ＡＭ、ＡＱ、ＢＣ、または、ＢＤ ＸＴＥＮ）を有すること、および、ファミリー
モチーフ由来ではない、ＸＴＥＮ中の他の任意のアミノ酸は、必要とされる特性（たとえ
ば、コードヌクレオチドによる制限酵素部位の組み込み、開裂配列の組み込みを可能とす
るため、または、ＦＶＩＩＩまたはＶＷＦへの連結をより良いものとするため）を得るた
めに選択されること、を意味する。ＸＴＥＮファミリーの一部の実施態様において、ＸＴ
ＥＮ配列は、ＡＤモチーフファミリー、またはＡＥモチーフファミリー、またはＡＦモチ
ーフファミリー、またはＡＧモチーフファミリー、またはＡＭモチーフファミリー、また
はＡＱモチーフファミリー、またはＢＣファミリー、またはＢＤファミリーの非反復配列
モチーフの複数の単位を含有し、得られたＸＴＥＮ配列は、上述の相同性の範囲を示す。
他の実施態様において、ＸＴＥＮは、表２Ａのモチーフファミリーのうちの２以上由来の
モチーフ配列の複数の単位を含有する。これらの配列は、所望される物理的／化学的特性
（正味荷電、親水性、二次構造の欠落、または、モチーフのアミノ酸組成による反復性の
欠落等の特性を含む）を得るために選択されても良い（下記により詳細に記述される）。
本段落の上述の実施態様において、ＸＴＥＮに組み込まれるモチーフは、約３６～約３０
００アミノ酸残基のＸＴＥＮを得るために本明細書に記述される方法を用いて選択および
アセンブリされてもよい。
Figure 0007022165000015
Figure 0007022165000016
ＸＴＥＮは、ＦＶＩＩＩまたはＶＷＦへの挿入または連結のために、様々な長さを有し
ても良い。１つの実施態様において、ＸＴＥＮ配列（複数含む）の長さは、融合タンパク
質中で得られる特性または機能に基づいて選択される。意図される特性または機能に基づ
いて、ＸＴＥＮは、短い、もしくは中間の長さの配列、または、担体として役に立ち得る
より長い配列であってもよい。ある実施態様において、ＸＴＥＮは、約６～約９９アミノ
酸残基の短いセグメント、約１００～約３９９アミノ酸残基の中間の長さのセグメント、
および約４００～１０００および約３０００アミノ酸残基までの、より長いセグメントを
含有してもよい。ゆえに、ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩに連結された、または挿入された
ＸＴＥＮは、約６、約１２、約３６、約４０、約４２、約７２、約９６、約１４４、約２
８８、約４００、約５００、約５７６、約６００、約７００、約８００、約８６４、約９
００、約１０００、約１５００、約２０００、約２５００の長さ、または、約３０００ま
での長さのアミノ酸残基を有しても良い。他の実施態様において、ＸＴＥＮは、約６～約
５０、約５０～約１００、約１００～１５０、約１５０～２５０、約２５０～４００、約
４００～約５００、約５００～約９００、約９００～１５００、約１５００～２０００、
または、約２０００～約３０００のアミノ酸残基の長さである。ＦＶＩＩＩまたはＶＷＦ
に連結された、または挿入されたＸＴＥＮの正確な長さは、ＦＶＩＩＩまたはＶＷＦの活
性に悪い影響を与えることなく、変化することができる。１つの実施態様において、本明
細書に用いられる１つ以上のＸＴＥＮは、３６アミノ酸、４２アミノ酸、７２アミノ酸、
１４４アミノ酸、２８８アミノ酸、５７６アミノ酸、または８６４アミノ酸の長さを有し
、ＸＴＥＮファミリー配列、すなわち、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、ＡＱ、ＢＣ、ま
たは、ＢＤのうちの１つ以上から選択されてもよい。
一部の実施態様において、本発明に用いられるＸＴＥＮ配列は、ＡＥ４２、ＡＧ４２、
ＡＥ４８、ＡＭ４８、ＡＥ７２、ＡＧ７２、ＡＥ１０８、ＡＧ１０８、ＡＥ１４４、ＡＦ
１４４、ＡＧ１４４、ＡＥ１８０、ＡＧ１８０、ＡＥ２１６、ＡＧ２１６、ＡＥ２５２、
ＡＧ２５２、ＡＥ２８８、ＡＧ２８８、ＡＥ３２４、 ＡＧ３２４、ＡＥ３６０、ＡＧ３
６０、ＡＥ３９６、ＡＧ３９６、ＡＥ４３２、ＡＧ４３２、ＡＥ４６８、ＡＧ４６８、Ａ
Ｅ５０４、ＡＧ５０４、ＡＦ５０４、ＡＥ５４０、ＡＧ５４０、ＡＦ５４０、ＡＤ５７６
、ＡＥ５７６、ＡＦ５７６、ＡＧ５７６、ＡＥ６１２、ＡＧ６１２、ＡＥ６２４、ＡＥ６
４８、ＡＧ６４８、ＡＧ６８４、ＡＥ７２０、ＡＧ７２０、ＡＥ７５６、ＡＧ７５６、Ａ
Ｅ７９２、ＡＧ７９２、ＡＥ８２８、ＡＧ８２８、ＡＤ８３６、ＡＥ８６４、ＡＦ８６４
、ＡＧ８６４、ＡＭ８７５、ＡＥ９１２、ＡＭ９２３、ＡＭ１３１８、ＢＣ８６４、ＢＤ
８６４、ＡＥ９４８、ＡＥ１０４４、ＡＥ１１４０、ＡＥ１２３６、ＡＥ１３３２、ＡＥ
１４２８、ＡＥ１５２４、ＡＥ１６２０、ＡＥ１７１６、ＡＥ１８１２、ＡＥ１９０８、
ＡＥ２００４Ａ、ＡＧ９４８、ＡＧ１０４４、ＡＧ１１４０、ＡＧ１２３６、ＡＧ１３３
２、ＡＧ１４２８、ＡＧ１５２４、ＡＧ１６２０、ＡＧ１７１６、ＡＧ１８１２、ＡＧ１
９０８、およびＡＧ２００４からなる群から選択される配列に対し、少なくとも６０％、
７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、
９７％、９８％、９９％、または１００％である（ＵＳ ２０１０－０２３９５５４ Ａ
１を参照のこと）。
１つの実施態様において、ＸＴＥＮ配列は、ＡＥ４２（配列番号３６）、ＡＥ７２（配
列番号１２７）、ＡＥ１４４＿２Ａ（配列番号１２８）、ＡＥ１４４＿３Ｂ（配列番号１
２９）、ＡＥ１４４＿４Ａ（配列番号１３０）、ＡＥ１４４＿５Ａ（配列番号１３１）、
ＡＥ１４４＿６Ｂ（配列番号１３２）、ＡＧ１４４＿Ａ（配列番号１３３）、ＡＧ１４４
＿Ｂ（配列番号１３４）、ＡＧ１４４＿Ｃ（配列番号１３５）、ＡＧ１４４＿Ｆ（配列番
号１３６）、ＡＥ８６４（配列番号４３）、ＡＥ５７６（配列番号４１）、ＡＥ２８８（
配列番号３９）、ＡＥ２８８＿２（配列番号１３７）、ＡＥ１４４（配列番号３７）、Ａ
Ｇ８６４（配列番号４４）、ＡＧ５７６（配列番号４２）、ＡＧ２８８（配列番号４０）
、ＡＧ１４４（配列番号３８）、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択さ
れるアミノ酸配列に対し、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％
、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。他の実施態様において、ＸＴＥ
Ｎ配列は、ＡＥ４２（配列番号３６）、ＡＥ７２（配列番号１２７）、ＡＥ１４４＿２Ａ
（配列番号１２８）、ＡＥ１４４＿３Ｂ（配列番号１２９）、ＡＥ１４４＿４Ａ（配列番
号１３０）、ＡＥ１４４＿５Ａ（配列番号１３１）、ＡＥ１４４＿６Ｂ（配列番号１３２
）、ＡＧ１４４＿Ａ（配列番号１３３）、ＡＧ１４４＿Ｂ（配列番号１３４）、ＡＧ１４
４＿Ｃ（配列番号１３５）、ＡＧ１４４＿Ｆ（配列番号１３６）、ＡＥ８６４（配列番号
４３）、ＡＥ５７６（配列番号４１）、ＡＥ２８８（配列番号３９）、ＡＥ２８８＿２（
配列番号１３７）、ＡＥ１４４（配列番号３７）、ＡＧ８６４（配列番号４４）、ＡＧ５
７６（配列番号４２）、ＡＧ２８８（配列番号４０）、ＡＧ１４４（配列番号３８）、お
よびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。特定の実施態様において、Ｘ
ＴＥＮ配列は、ＡＥ２８８である。本発明の任意のＸＴＥＮ配列に対するアミノ酸配列を
、表２Ｂに示す。
Figure 0007022165000017
Figure 0007022165000018
Figure 0007022165000019
Figure 0007022165000020
Figure 0007022165000021
さらなる実施態様において、本発明に用いられるＸＴＥＮ配列は、本発明のキメラタン
パク質の物理的特性または化学的特性（たとえば、薬物動態的な）に影響を与える。本発
明に用いられるＸＴＥＮ配列は、以下の有益な特性のうちの１以上を示しうる：配座柔軟
性、水溶解度の増強、高度なプロテアーゼ抵抗性、低い免疫原性、哺乳類受容体に対する
低結合性、または、流体力学的（またはストークス（Ｓｔｏｋｅｓ））半径の増加。特定
の実施態様において、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質に連結されたＸＴＥＮ配列は、たと
えば半減期の延長または曲線下面積（ＡＵＣ）の増加等の薬物動態的特性を増加させ、そ
れにより、本明細書に記述されるキメラタンパク質は、野生型ＦＶＩＩＩと比較して、長
い期間、ｉｎ ｖｉｖｏに留まることとなる。さらなる実施態様において、本発明に用い
られるＸＴＥＮ配列は、たとえば半減期の延長または曲線下面積（ＡＵＣ）の増加等の薬
物動態的特性を増加させ、それにより、ＦＶＩＩＩタンパク質は、野生型ＦＶＩＩＩと比
較して、長い期間、ｉｎ ｖｉｖｏに留まることとなる。
様々な方法およびアッセイを用いて、ＸＴＥＮ配列を含有するタンパク質の物理的／化
学的特性を測定することができる。そのような方法としては、限定されないが、分析的遠
心、ＥＰＲ、ＨＰＬＣイオン交換、ＨＰＬＣサイズ排除、ＨＰＬＣ逆相、光散乱、キャピ
ラリー電気泳動、円偏光二色性、示差走査熱量測定、屈折率測定、およびＵＶ／可視光分
光法が挙げられる。さらなる方法は、Amauet al., Prot Expr and Purif 48, 1-13 (2006
)に開示されている。
本発明に従い用いることができるＸＴＥＮ配列のさらなる例は、米国特許出願公開第２
０１０／０２３９５５４ Ａ１号、第２０１０／０３２３９５６ Ａ１号、第２０１１／
００４６０６０ Ａ１号、第２０１１／００４６０６１ Ａ１号、第２０１１／００７７
１９９ Ａ１号、もしくは、第２０１１／０１７２１４６ Ａ１号、または、国際特許出
願公開ＷＯ２０１００９１１２２ Ａ１、ＷＯ２０１０１４４５０２ Ａ２、ＷＯ２０１
０１４４５０８ Ａ１、ＷＯ２０１１０２８２２８ Ａ１、ＷＯ２０１１０２８２２９
Ａ１、または、ＷＯ２０１１０２８３４４ Ａ２に開示されている。
Ｃ）第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質
本明細書に用いられる「ＦＶＩＩＩタンパク質」とは、他で特定されない限り、凝固系
におけるその通常の役割において、機能的であるＦＶＩＩＩポリペプチドを意味する。Ｆ
ＶＩＩＩタンパク質という用語には、凝固系における全長の野生型第ＶＩＩＩ因子の機能
を保持する、その機能性断片、変異体、アナログまたは誘導体が含まれる。「ＦＶＩＩＩ
タンパク質」は、ＦＶＩＩＩポリペプチド（またはタンパク質）またはＦＶＩＩＩと相互
交換可能に用いられる。ＦＶＩＩＩ機能の例としては、限定されないが、凝固系を活性化
する能力、第ＩＸ因子の補因子として作用する能力、または、Ｃａ２＋およびリン脂質の
存在下で第ＩＸ因子とテナーゼ（ｔｅｎａｓｅ）複合体を形成し、それによって第Ｘ因子
を活性化形態第Ｘａ因子へと転換させる能力、が挙げられる。ＦＶＩＩＩタンパク質は、
ヒト、ブタ、イヌ、ラット、またはマウスＦＶＩＩＩタンパク質であっても良い。さらに
、ヒトのＦＶＩＩＩと他種のＦＶＩＩＩを比較することにより、その機能のために必要と
される可能性がある、保存残基が特定されている（Cameronet al., Thromb. Haemost. 79
:317-22 (1998);US6,251,632）。
凝固システムの機能を評価するための多くの検証が利用可能である：活性化部分トロン
ボプラスチン時間（ａＰＴＴ）テスト、発色アッセイ、ＲＯＴＥＭアッセイ、プロトロン
ビン時間（ＰＴ）テスト（ＩＮＲを測定するためにも用いられる）、フィブリノーゲン検
証（多くの場合、Ｃｌａｕｓｓ法による）、血小板計数、血小板機能検証（多くの場合、
ＰＦＡ－１００）、ＴＣＴ、出血時間、混合テスト（元となる血漿が正常な血漿と混合さ
れた場合には、異常性が補正されるかどうか）、凝固因子アッセイ、抗リン脂質抗体、Ｄ
－二量体、遺伝的テスト（たとえば、第Ｘ因子Ｌｅｉｄｅｎ、プロトロンビン変異Ｇ２０
２１０Ａ）、希釈ラッセルヘビ毒時間（ｄｉｌｕｔｅ Ｒｕｓｓｅｌｌ‘ｓ ｖｉｐｅｒ
ｖｅｎｏｍ ｔｉｍｅ、ｄＲＶＶＴ）、混合血小板機能テスト、トロンボエラストグラ
フィ（ＴＥＧまたはＳｏｎｏｃｌｏｔ）、トロンボエラストメトリー（ＴＥＭ（登録商標
）、たとえば、ＲＯＴＥＭ（登録商標））、または真性グロブリン溶解時間（ＥＬＴ）。
ａＰＴＴテストは、「内因性」凝固経路（接触活性化経路とも呼称される）および共通
凝固経路の両方の有効性を測定する、性能の指標である。このテストは、市販の遺伝子組
み換え凝固因子（たとえば、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸ）の凝固活性を測定するために普遍
的に用いられている。これを、外因経路を測定する、プロトロンビン時間（ＰＴ）と組み
合わせて用いる。
ＲＯＴＥＭ分析により、全体的な止血動態に関する情報が得られる：凝固時間、凝固形
成、凝固安定性および溶解。トロンボエラストメトリーにおける異なるパラメーターは、
血漿凝固システム、血小板機能、線維素溶解、またはこれらの相互作用に影響を与える多
くの因子の活性に依存している。このアッセイにより、二次止血の全体的な概観が得られ
る。
ＦＶＩＩＩポリペプチドおよびポリヌクレオチドの配列は公知であり、多くの機能性断
片、変異体および改変体が存在する。ヒトＦＶＩＩＩ配列（全長）の例を以下に示す。
Figure 0007022165000022
Figure 0007022165000023
Figure 0007022165000024
Figure 0007022165000025
Figure 0007022165000026
Figure 0007022165000027
Figure 0007022165000028
ＦＶＩＩＩポリペプチドには、全長ＦＶＩＩＩ、全長ＦＶＩＩＩからＮ末端のＭｅｔを
引いたもの、成熟型ＦＶＩＩＩ（シグナルペプチドを引いたもの）、Ｎ末端にＭｅｔを付
加した成熟型ＦＶＩＩＩ、および／または、Ｂドメインのすべて、または部分的に欠損し
たＢドメインを有するＦＶＩＩＩが含まれる。ある実施態様において、ＦＶＩＩＩ変異体
には、Ｂドメイン欠損（部分的または全ての欠損のいずれか）が含まれる。
天然型成熟ヒトＦＶＩＩＩの配列は、配列番号４として示されている。天然型ＦＶＩＩ
Ｉタンパク質は、以下の式を有する：Ａ１－ａ１－Ａ２－ａ２－Ｂ－ａ３－Ａ３－Ｃ１－
Ｃ２、ここで、Ａ１、Ａ２およびＡ３は構造的に関連した「Ａドメイン」であり、Ｂは、
「Ｂドメイン」であり、Ｃ１およびＣ２は、構造的に関連した「Ｃドメイン」であり、な
らびに、ａ１、ａ２およびａ３は、酸性スペーサー領域である。配列番号４の一次アミノ
酸配列の位置に関して、ヒトＦＶＩＩＩのＡ１ドメインは、Ａｌａ１から、およそＡｒｇ
３３６にわたり、ａ１スペーサー領域は、およそＭｅｔ３３７から、およそＶａｌ３７４
にわたり、Ａ２ドメインは、およそＡｌａ３７５から、およそＴｙｒ７１９にわたり、ａ
２スペーサー領域は、およそＧｌｕ７２０から、およそＡｒｇ７４０にわたり、Ｂドメイ
ンは、およそＳｅｒ７４１から、およそＡｒｇ１６４８にわたり、ａ３スペーサー領域は
、およそＧｌｕ１６４９から、およそＡｒｇ１６８９にわたり、Ａ３ドメインは、およそ
Ｓｅｒ１６９０から、およそＬｅｕ２０２５にわたり、Ｃ１ドメインは、およそＧｌｙ２
０２６から、およそＡｓｎ２０７２にわたり、そして、Ｃ２ドメインは、およそＳｅｒ２
０７３から、およそＴｙｒ２３３２にわたる。特定のタンパク質溶解性の開裂部位以外の
、ＦＶＩＩＩのドメインおよび領域の間の境界の位置の指定は、参照文献ごとに変化しう
る。本明細書に記述される境界は、それゆえ、「およそ」という用語を用いることにより
、近似値として指定されている。
ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子は単離され、哺乳類細胞中で発現されている（Toole, J. J., et
al., Nature312:342-347 (1984); Gitschier,J., et al., Nature 312:326-330(1984);
Wood, W. I., etal., Nature312:330-337 (1984); Vehar, G. A., et al.,Nature 312:3
37-342 (1984)；ＷＯ８７／０４１８７；ＷＯ８８／０８０３５；ＷＯ８８／０３５５８
；および、米国特許第４，７５７，００６号）。ＦＶＩＩＩアミノ酸配列は、米国特許第
４，９６５，１９９号において示されるように、ｃＤＮＡから推定されている。さらに、
部分的Ｂドメイン欠損、または完全Ｂドメイン欠損したＦＶＩＩＩは、米国特許第４，９
９４，３７１号および第４，８６８，１１２号において示されている。一部の実施態様に
おいて、ヒトＦＶＩＩＩ Ｂドメインは、ヒト第Ｖ因子のＢドメインと置換されている（
米国特許第５，００４，８０３号）。ヒト第ＶＩＩＩ因子をコードするｃＤＮＡ配列およ
びアミノ酸配列は、それぞれ、米国特許出願公開第２００５／０１００９９０号の配列番
号４および５に示されている。
ブタＦＶＩＩＩの配列は、Toole, J. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA83:593
9-5942(1986)、に公開されている。さらに、ブタ脾臓ｃＤＮＡライブラリ由来のＦＶＩ
ＩＩ配列のＰＣＲ増幅から得られた、完全ブタｃＤＮＡ配列は、Healey, J. F., et al.,
Blood88:4209-4214 (1996)、に報告されている。すべてのドメイン、すべてのサブユニ
ット、および特定のアミノ酸配列の置換を有するハイブリッドのヒト／ブタＦＶＩＩＩは
、LollarおよびRungeによる米国特許第５，３６４，７７１号およびＷＯ９３／２００９
３に開示されている。さらに最近になって、ブタＦＶＩＩＩのＡ１ドメインおよびＡ２ド
メインのアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列、および、ブタＡ１および／またはＡ
２ドメインが、対応するヒトのドメインで置換されたキメラＦＶＩＩＩが、ＷＯ９４／１
１５０３に報告されている。米国特許第５，８５９，２０４号（Ｌｏｌｌａr,J. S.）も
また、ブタｃＤＮＡおよび推定アミノ酸配列を開示している。米国特許第６，４５８，５
６３号は、Ｂドメイン欠損ブタＦＶＩＩＩを開示している。
米国特許第５，８５９，２０４号（Lollar, J. S.）は、抗原性および免疫反応性が減
少したＦＶＩＩＩの機能的変異体を報告している。米国特許第６，３７６，４６３号（Lo
llar, J. S.）もまた、免疫反応性が減少したＦＶＩＩＩの変異体を報告している。米国
特許出願公開第２００５／０１００９９０号（Saenko et al.）は、ＦＶＩＩＩのＡ２ド
メインにおける機能性変異を報告している。
１つの実施態様において、ＦＶＩＩＩ（または、キメラタンパク質のＦＶＩＩＩ部分）
は、配列番号６のアミノ酸１～１４３８、または、配列番号４のアミノ酸１～２３３２の
ＦＶＩＩＩアミノ酸配列（シグナル配列は伴わない）に対して、または、配列番号３のア
ミノ酸１～１９および配列番号６のアミノ酸１～１４３８のＦＶＩＩＩアミノ酸配列に対
して、または、配列番号３のアミノ酸１～１９および配列番号４のアミノ酸１～２３３２
のＦＶＩＩＩアミノ酸配列（シグナル配列を伴う）に対して、少なくとも５０％、６０％
、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００
％同一であってもよく、ここで、ＦＶＩＩＩは、凝固活性（たとえば、補因子として第Ｉ
Ｘ因子を活性化し、第Ｘ因子を活性化第Ｘ因子へと転換させる）を有している。ＦＶＩＩ
Ｉ（または、キメラタンパク質のＦＶＩＩＩ部分）は、配列番号６のアミノ酸１～１４３
８、または、配列番号４のアミノ酸１～２３３２のＦＶＩＩＩアミノ酸配列（シグナル配
列を伴わない）と同一であってもよい。ＦＶＩＩＩはさらに、シグナル配列を含有しても
よい。
本明細書において、ＦＶＩＩＩの「Ｂドメイン」は、内部アミノ酸配列の同一性および
タンパク質溶解性開裂の部位（たとえば、全長ヒトＦＶＩＩＩのＳｅｒ７４１－Ａｒｇ１
６４８残基）により定義づけられる、当分野公知のＢドメインと同一である。他のヒトＦ
ＶＩＩＩドメインは、以下のアミノ酸残基により定義づけられる：Ａ１、残基Ａｌａ１－
Ａｒｇ３７２；Ａ２、残基Ｓｅｒ３７３－Ａｒｇ７４０；Ａ３、残基Ｓｅｒ１６９０－Ａ
ｓｎ２０１９；Ｃ１、残基Ｌｙｓ２０２０－Ａｓｎ２１７２；Ｃ２、残基Ｓｅｒ２１７３
－Ｔｙｒ２３３２。Ａ３－Ｃ１－Ｃ２配列には、残基Ｓｅｒ１６９０－Ｔｙｒ２３３２が
含有される。残りの配列、つまり、残基Ｇｌｕ１６４９－Ａｒｇ１６８９は、通常、ａ３
酸性領域と呼ばれる。ブタ、マウスおよびイヌＦＶＩＩＩに対する、Ｂドメインを含む、
全てのドメインに対する境界の位置は、当分野に公知である。１つの実施態様において、
ＦＶＩＩＩのＢドメインは欠損している（Ｂドメイン欠損第ＶＩＩＩ因子、または、ＢＤ
Ｄ ＦＶＩＩＩ）。ＢＤＤ ＦＶＩＩＩの例は、ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）（組換えＢ
ＤＤ ＦＶＩＩＩ）であり、表５の配列の第ＶＩＩＩ部分と同じ配列を有している（ＢＤ
Ｄ ＦＶＩＩＩの重鎖は、二重下線。Ｂドメインはイタリック体。ＢＤＤ ＦＶＩＩＩ軽
鎖は標準文字で表されている）。表５（配列番号７）をコードするヌクレオチド配列は、
表６に示す。
Figure 0007022165000029
Figure 0007022165000030
Figure 0007022165000031
Figure 0007022165000032
Figure 0007022165000033
「Ｂドメイン欠損ＦＶＩＩＩ」は、米国特許第６，３１６，２２６号、第６，３４６，
５１３号、第７，０４１，６３５号、第５，７８９，２０３号、第６，０６０，４４７号
、第５，５９５，８８６号、第６，２２８，６２０号、第５，９７２，８８５号、第６，
０４８，７２０号、第５，５４３，５０２号、第５，６１０，２７８号、第５，１７１，
８４４号、第５，１１２，９５０号、第４，８６８，１１２号、および、第６，４５８，
５６３号に開示されている、全欠損または部分欠損を有していても良い。一部の実施態様
において、本発明のＢドメイン欠損ＦＶＩＩＩ配列は、米国特許第６，３１６，２２６号
（または米国特許第６，３４６，５１３号）の４段落目、４行目～５段落目、２８行目お
よび実施例１～５に開示されている欠損のうちの任意の１つを含有する。他の実施態様に
おいて、Ｂドメイン欠損第ＶＩＩＩ因子は、Ｓ７４３／Ｑ１６３８ Ｂドメイン欠損第Ｖ
ＩＩＩ因子（ＳＱ ＢＤＤ ＦＶＩＩＩ）（たとえば、配列番号４の、アミノ酸７４４～
１６３７の欠損を有する第ＶＩＩＩ因子、たとえば、アミノ酸１～７４３およびアミノ酸
１６３８～２３３２を有する第ＶＩＩＩ因子、すなわち、配列番号６）である。一部の実
施態様において、本発明のＢドメイン欠損ＦＶＩＩＩは、米国特許第５，７８９，２０３
号、（または、米国特許第６，０６０，４４７号、第５，５９５，８８６号、および、第
６，２２８，６２０号）の２段落目、２６～５１行目および実施例５～８に開示されてい
る欠損を有する。一部の実施態様において、Ｂドメイン欠損第ＶＩＩＩ因子は、米国特許
第５，９７２，８８５号の１段落目、２５行目～２段落目、４０行目に開示される欠損；
米国特許第６，０４８，７２０号の６段落目、１－２２行目および実施例１に開示される
欠損；米国特許第５，５４３，５０２号の２段落目、１７－４６行目に開示される欠損；
米国特許第５，１７１，８４４号の４段落目、２２行目～５段落目、３６行目に開示され
る欠損；米国特許第５，１１２，９５０号の２段落目、５５－６８行目、図２および実施
例１に開示される欠損；米国特許第４，８６８，１１２号の２段落目、２行目～１９段落
目、２１行目および表２に開示される欠損；米国特許第７，０４１，６３５号の２段落目
、１行目～３段落目、１９行目、３段落目、４０行目～４段落目、６７行目、７段落目、
４３行目～８段落目、２６行目、および、１１段落目、５行目～１３段落目、３９行目に
開示される欠損；または、米国特許第６，４５８，５６３号の４段落目、２５－５３行目
に開示される欠損を有する。一部の実施態様において、Ｂドメイン欠損ＦＶＩＩＩは、Ｂ
ドメインのほとんどを欠損するが、ＷＯ９１／０９１２２に開示されるように、一次翻訳
産物の２つのポリペプチド鎖への、ｉｎ ｖｉｖｏタンパク質溶解性プロセッシングにと
って必須である、Ｂドメインのアミノ末端配列を含有する。一部の実施態様において、Ｂ
ドメイン欠損ＦＶＩＩＩは、アミノ酸７４７～１６３８の欠損（すなわち、実質的にＢド
メインの完全な欠損）を伴って、構成される。HoebenR.C., et al. J. Biol. Chem. 265
(13): 7318-7323(1990)。Ｂドメイン欠損第ＶＩＩＩ因子はまた、ＦＶＩＩＩのアミノ
酸７７１－１６６６または、アミノ酸８６８－１５６２の欠損を含有しても良い。Meulie
n P., et al. Protein Eng. 2(4):301-6 (1988)。本発明の一部である、さらなるＢド
メインの欠損としては、以下が挙げられる：アミノ酸９８２～１５６２、または、７６０
～１６３９の欠損(Toole et al., Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A. (1986) 83,5939-5942
))、７９７～１５６２の欠損(Eaton,et al.Biochemistry(1986) 25:8343-8347))、７
４１～１６４６の欠損(Kaufman (ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ８７／０４１８７））、７
４７～１５６０の欠損(Sarver, et al., DNA(1987) 6:553-564))、７４１～１６４８の
欠損（Pasek（ＰＣＴ国際特許出願８８／００８３１))、または、８１６～１５９８、も
しくは、７４１～１６４８の欠損 (Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988)、欧州特許第２
９５５９７号))。他の実施態様において、ＢＤＤ ＦＶＩＩＩとしては、１以上のＮ結合
型グリコシル化部位（たとえば、残基７５７、７８４、８２８、９００、９６３、または
、任意選択的に、９４３（全長ＦＶＩＩＩ配列のアミノ酸配列に対応している））の１つ
以上を保持するＢドメインの断片を含有するＦＶＩＩＩポリペプチドが挙げられる。Ｂド
メイン断片の例としては、Miao,H.Z., et al., Blood 103(a): 3412-3419 (2004), Kasud
a,A, et al., J.Thromb.Haemost. 6: 1352-1359 (2008)、および、Pipe, S.W., et al.,
J.Thromb. Haemost. 9:2235-2242 (2011)に開示されている、Ｂドメインの２２６アミ
ノ酸または１６３アミノ酸が挙げられる（すなわち、Ｂドメインの最初の２２６アミノ酸
、または１６３アミノ酸が保持されている）。さらに他の実施態様において、ＢＤＤ Ｆ
ＶＩＩＩはさらに、ＢＤＤ ＦＶＩＩＩタンパク質の発現を改善するために、残基３０９
の位置で点変異（ＰｈｅからＳｅｒへの）を含有する。Miao,H.Z., et al., Blood 103(a
): 3412-3419(2004)を参照のこと。さらに他の実施態様において、ＢＤＤ ＦＶＩＩＩ
には、Ｂドメインの一部を含有するが、１以上のｆｕｒｉｎ開裂部位（たとえば、Ａｒｇ
１３１３およびＡｒｇ１６４８）を含有しないＦＶＩＩＩポリペプチドが含まれる。Pipe
,S.W., et al.,J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011)を参照のこと。前述の各
欠損は、任意のＦＶＩＩＩ配列において作製されうる。
一部の実施態様において、ＦＶＩＩＩは、部分的なＢドメインを有する。一部の実施態
様において、部分的なＢドメインを有するＦＶＩＩＩは、ＦＶＩＩＩ１９８（配列番号８
９）である。ＦＶＩＩＩ１９８は、一本鎖ＦＶＩＩＩＦｃ分子－２２６Ｎ６を含有する部
分的Ｂドメインである。２２６は、ＦＶＩＩＩ ＢドメインのＮ末端２２６アミノ酸を表
し、Ｎ６は、Ｂドメインの６つのＮグリコシル化部位を表す。
１つの実施態様において、ＦＶＩＩＩは、（全長第ＶＩＩＩ因子、または配列番号４の
）アミノ酸１６４８のアルギニンのすぐ後で、（Ｓ７４３／Ｑ１６３８ Ｂドメイン欠損
第ＶＩＩＩ因子または配列番号６の）アミノ酸７５４のアルギニンのすぐ後で、または、
（他の変異体の）対応するアルギニン残基のすぐ後で、開裂され、それによって、重鎖お
よび軽鎖が得られる。他の実施態様において、ＦＶＩＩＩは、金属イオン介在非共有結合
により連結、または関連している、重鎖および軽鎖を含有する。
他の実施態様において、ＦＶＩＩＩは、（全長第ＦＶＩＩＩ因子、または配列番号４の
）アミノ酸１６４８のアルギニンのすぐ後で、（Ｓ７４３／Ｑ１６３８ Ｂドメイン欠損
第ＦＶＩＩＩ因子または配列番号６の）アミノ酸７５４のアルギニンのすぐ後で、または
、（他の変異体の）対応するアルギニン残基のすぐ後で、開裂されていない、一本鎖ＦＶ
ＩＩＩである。一本鎖ＦＶＩＩＩは、１以上のアミノ酸置換を含有してもよい。１つの実
施態様において、アミノ酸置換は、全長成熟型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド（配列番号４
）の残基１６４８、残基１６４５、もしくはその両方に対応する残基、または、ＳＱ Ｂ
ＤＤ 第ＶＩＩＩ因子（配列番号６）の残基７５４、残基７５１、またはその両方に対応
する残基にある。アミノ酸置換は、アルギニン以外の任意のアミノ酸（たとえば、イソロ
イシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファ
ン、バリン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グ
ルタミン、グリシン、プロリン、セレノシステイン、セリン、チロシン、ヒスチジン、オ
ルニチン、ピロリシン、またはタウリン）であっても良い。
ＦＶＩＩＩはさらに、トロンビンにより開裂され、その後、ＦＶＩＩＩａとして活性化
され、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）の補因子としての役割を果たしてもよい。活性化Ｆ
ＶＩＩＩと活性化ＦＩＸは共に、Ｘａｓｅ複合体を形成し、第Ｘ因子を活性化第Ｘ因子（
ＦＸａ）へと転換する。活性化に対し、ＦＶＩＩＩは、３つのアルギニン残基（アミノ酸
３７２、７４０および１６８９（Ｂドメイン欠損ＦＶＩＩＩ配列のアミノ酸３７２、７４
０、および７９５に相当））の後でトロンビンにより開裂され、その開裂により、５０ｋ
ＤａのＡ１、４３ｋＤａのＡ２、および７３ｋＤａのＡ３－Ｃ１－Ｃ２鎖を有するＦＶＩ
ＩＩａが産生される。１つの実施態様において、本発明に有用なＦＶＩＩＩタンパク質は
、非活性のＦＶＩＩＩである。他の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質は、活性化
ＦＶＩＩＩである。
ＶＷＦ断片に連結された、または関連するＦＶＩＩＩポリペプチドを有するタンパク質
は、配列番号４または６に対し、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、
９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％同一である配列を含有して
も良く、ここで、その配列は、ＦＶＩＩＩ凝固活性（たとえば、補因子として第ＩＸ因子
を活性化し、第Ｘ因子を活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）へと転換させる）を有する。
「ハイブリッド」または「キメラ」ポリペプチドおよびタンパク質は、本明細書におい
て、第一のポリペプチド鎖（たとえば、第一のＩｇ定常領域またはその一部に任意選択的
に融合されたＶＷＦ断片）と、第二のポリペプチド鎖（たとえば、第二のＩｇ定常領域ま
たはその一部に任意選択的に融合されたＸＴＥＮ配列に連結されたＦＶＩＩＩであり、そ
れによって、ヘテロ二量体を形成する）の組み合わせを含む。１つの実施態様において、
ハイブリッド中の第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドは、タンパク質－タンパ
ク質の相互作用（たとえば、電荷－電荷、または疎水性相互作用等）を介して互いに関連
している。他の実施態様において、ハイブリッド中の第一のポリペプチドおよび第二のポ
リペプチドは、ジスルフィド結合または他の共有結合（複数含む）を介して互いに関連し
ている。ハイブリッドは、たとえば、米国特許出願第２００４／１０１７４０号および米
国特許出願第２００６／０７４１９９号に記述されている。第二のポリペプチドは、第一
のポリペプチドの同一の複製物または非同一なポリペプチドであっても良い。１つの実施
態様において、第一のポリペプチドは、ＦＶＩＩＩタンパク質（Ｘ）－Ｆｃ融合タンパク
質であり、第二のポリペプチドは、Ｆｃ領域を含有する、本質的にからなる、またはから
なる、ポリペプチドであり、ここで、第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドは互
いに関連している。他の実施態様において、第一のポリペプチドは、ＶＷＦ断片－ＸＴＥ
Ｎ－Ｆｃ融合タンパク質を含有し、第二のポリペプチドは、ＦＶＩＩＩ－Ｆｃ融合タンパ
ク質を含有し、それによって、ハイブリッドはヘテロ二量体となる。他の実施態様におい
て、第一のポリペプチドは、ＶＷＦ断片－Ｆｃ融合タンパク質を含有し、第二のポリペプ
チドは、ＦＶＩＩＩ（Ｘ）－Ｆｃ融合タンパク質を含有し、それによって、ハイブリッド
はヘテロ二量体となる。さらに他の実施態様において、第一のポリペプチドは、ＶＷＦ断
片－ＸＴＥＮ－Ｆｃ融合タンパク質を含有し、第二のポリペプチドは、ＦＶＩＩＩ（Ｘ）
－Ｆｃ融合タンパク質を含有する。第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドは、第
一のＦｃ領域と第二のＦｃ領域の間の共有結合（たとえば、ジスルフィド結合）を介して
互いに関連してもよい。第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドはさらに、ＶＷＦ
断片とＦＶＩＩＩタンパク質の間の結合により互いに関連してもよい。
本発明に有用なＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩの凝固活性に影響を与えない１以
上の追加のＸＴＥＮ配列を有するＦＶＩＩＩを含有してもよい。そのようなＸＴＥＮ配列
を、ＦＶＩＩＩタンパク質のＣ末端またはＮ末端に融合してもよく、または、挿入によっ
てＦＶＩＩＩの凝固活性もしくはＦＶＩＩＩの機能に影響を与えることなく、ＦＶＩＩＩ
タンパク質の２つのアミノ酸残基のうちの１以上の間に挿入されてもよい。１つの実施態
様において、挿入により、ＦＶＩＩＩタンパク質の薬物動態特性（たとえば、半減期）が
改善される。他の実施態様において、挿入は、複数の挿入（たとえば、２、３、４、５、
６、７、８、９、または１０以上の挿入）であってもよい。挿入部位の例としては、限定
されないが、表７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５にリストアップされる
部位、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
１以上のＸＴＥＮ配列に連結されたＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩ（Ｘ）、ＦＶ
ＩＩＩ（Ｘ１）、ＦＶＩＩＩ（ａ→ｂ）－Ｘ－ＦＶＩＩＩ（ｃ→ｄ）と表されても良く、
ここで、ＦＶＩＩＩ（ａ→ｂ）は、アミノ酸残基「ａ」からアミノ酸残基「ｂ」のＦＶＩ
ＩＩタンパク質の第一の部分を含有し、本質的にからなり、または、からなり；Ｘまたは
Ｘ１は、１以上のＸＴＥＮ配列を含有し、本質的にからなり、または、からなり、ＦＶＩ
ＩＩ（ｃ→ｄ）は、アミノ酸残基「ｃ」からアミノ酸残基「ｄ」のＦＶＩＩＩタンパク質
の第二の部分を含有し、本質的にからなり、または、からなり；
ａは、ＦＶＩＩＩタンパク質の第一の部分のＮ末端アミノ酸残基であり、
ｂは、ＦＶＩＩＩタンパク質の第一の部分のＣ末端アミノ酸残基であり、ＸＴＥＮ配列が
挿入されている挿入部位の２アミノ酸のＮ末端アミノ酸残基でもあり、
ｃは、ＦＶＩＩＩタンパク質の第二の部分のＮ末端アミノ酸残基であり、ＸＴＥＮ配列が
挿入されている挿入部位の２アミノ酸のＣ末端アミノ酸残基でもあり、
ｄは、ＦＶＩＩＩタンパク質のＣ末端アミノ酸残基であり、
ここで、ＦＶＩＩＩタンパク質の第一の部分およびＦＶＩＩＩタンパク質の第二の部分は
、互いに同一ではなく、および、併せて、ＦＶＩＩＩタンパク質が、ＦＶＩＩＩ凝固活性
を有するのに十分な長さのものである。
１つの実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質の第一の部分およびＦＶＩＩＩタンパ
ク質の第二の部分は、配列番号４（全長成熟型ＦＶＩＩＩ配列）の断片、または配列番号
６（Ｂドメイン欠損ＦＶＩＩＩ）の断片である（たとえば、それぞれ、Ｎ末端部分および
Ｃ末端部分）。ある実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質の第一の部分は、ＦＶＩＩ
Ｉタンパク質のＡ１ドメインおよびＡ２ドメインを含有する。ＦＶＩＩＩタンパク質の第
二の部分は、Ａ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、および、任意選択的にＣ２ドメインを含有す
る。さらに他の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質の第一の部分は、Ａ１ドメイン
およびＡ２ドメインを含有し、ならびに、ＦＶＩＩＩタンパク質の第二の部分は、Ｂドメ
イン、Ａ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、および任意選択的にＣ２ドメインを含有する。さら
に他の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質の第一の部分は、ＦＶＩＩＩタンパク質
のＡ１ドメイン、Ａ２ドメインおよびＢドメインの一部を含有し、ならびに、ＦＶＩＩＩ
タンパク質の第二の部分は、Ａ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、および任意選択的にＣ２ドメ
インを含有する。さらに他の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質の第一の部分は、
ＦＶＩＩＩタンパク質のＡ１ドメイン、Ａ２ドメインおよびＢドメインの第一の部分を含
有する。ＦＶＩＩＩタンパク質の第二の部分は、Ｂドメインの第二の部分、Ａ３ドメイン
、Ｃ１ドメイン、および任意選択的にＣ２ドメインを含有する。一部の実施態様において
、２つのアミノ酸（「ｂ」および「ｃ」）は、任意の１つ以上の、表７、８、９、１０、
１１、１２、１３、１４、および１５に示されるアミノ酸残基挿入部位であってもよい。
たとえば、「ｂ」は、１以上のＸＴＥＮ配列が挿入または連結される部位のすぐ上流のア
ミノ酸残基であってもよく、および、「ｃ」は、１以上のＸＴＥＮ配列が挿入または連結
される部位のすぐ下流のアミノ酸残基であってもよい。一部の実施態様において、「ａ」
は、ＦＶＩＩＩタンパク質の第一の成熟型アミノ酸配列であり、および、「ｄ」は、ＦＶ
ＩＩＩタンパク質の最後のアミノ酸配列である。たとえば、ＦＶＩＩＩ（ａ→ｂ）は、配
列番号６（Ｂドメイン欠損ＦＶＩＩＩアミノ酸配列）または、配列番号４（全長ＦＶＩＩ
Ｉ）のアミノ酸１～７４５に対して、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６
％、９７％、９８％、９９％、または、１００％同一であるアミノ酸配列であってもよく
、および、ＦＶＩＩＩ（ｃ→ｄ）は、それぞれ、配列番号６のアミノ酸７４６～１４３８
、または、配列番号４のアミノ酸１６４１～２３３２であっても良い。
一部の態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質の挿入部位は、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイ
ン、Ａ３ドメイン、Ｂドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ末端、またはそれらの
任意の組み合わせである、ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上のドメイン内に位置づけられて
も良く、または、Ａ１ドメインとａ１酸性領域、ａ１酸性領域とＡ２ドメイン、Ａ２ドメ
インとａ２酸性領域、ａ２酸性領域とＢドメイン、ＢドメインとＡ３ドメイン、Ａ３ドメ
インとＣ１ドメイン、Ｃ１ドメインとＣ２ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせで
ある、ＦＶＩＩＩタンパク質の２つのドメインの間に位置づけられても良い。たとえば、
ＸＴＥＮ配列が挿入されうる挿入部位は、Ｎ末端とＡ１ドメイン、Ｎ末端とＡ２ドメイン
、Ｎ末端とＡ３ドメイン、Ｎ末端とＢドメイン、Ｎ末端とＣ１ドメイン、Ｎ末端とＣ２ド
メイン、Ｎ末端とＣ末端、Ａ１およびＡ２ドメイン、Ａ１およびＡ３ドメイン、Ａ１およ
びＢドメイン、Ａ１およびＣ１ドメイン、Ａ１およびＣ２ドメイン、Ａ１ドメインおよび
Ｃ末端、Ａ２およびＡ３ドメイン、Ａ２およびＢドメイン、Ａ２およびＣ１ドメイン、Ａ
２およびＣ２ドメイン、Ａ２ドメインおよびＣ末端、Ａ３およびＢドメイン、Ａ３および
Ｃ１ドメイン、Ａ３およびＣ２ドメイン、Ａ３ドメインおよびＣ末端、ＢおよびＣ１ドメ
イン、ＢおよびＣ２ドメイン、ＢドメインおよびＣ末端、Ｃ１およびＣ２ドメイン、Ｃ１
ドメインおよびＣ末端、Ｃ２ドメインおよびＣ末端、ならびにそれらの２以上の組み合わ
せからなる群から選択される。挿入部位の非限定的な例は、表７、８、９、１０、１１、
１２、１３、１４、および１５に示される。
ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上のアミノ酸のすぐ下流（たとえば、１以上のＸＴＥＮ挿
入部位）にＸＴＥＮ配列が挿入されるＦＶＩＩＩタンパク質、または、ＸＴＥＮ配列がＣ
末端もしくはＮ末端で連結されるＦＶＩＩＩタンパク質は、ＸＴＥＮ配列への連結後、ま
たはＸＴＥＮ配列の挿入後、ＦＶＩＩＩ活性を保持している。ＸＴＥＮ配列は、挿入によ
ってＦＶＩＩＩ活性が影響を受けないように（すなわち、ＦＶＩＩＩタンパク質は凝固特
性をまた維持している）、１度、または２度以上、３度以上、４度以上、５度以上、６度
以上、または７度以上、ＦＶＩＩＩタンパク質に挿入されてもよい。
本発明に有用なＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩタンパク質のＮ末端またはＣ末端
に任意選択的なリンカーにより１以上のＸＴＥＮポリペプチドを連結されてもよく、また
は、ＦＶＩＩＩタンパク質の１以上のアミノ酸のすぐ下流（たとえば、１以上のＸＴＥＮ
挿入部位）に、１以上の任意選択的なリンカーにより、挿入されてもよい。１つの実施態
様において、ＸＴＥＮが挿入される２つのアミノ酸残基、またはＸＴＥＮ配列が連結され
るアミノ酸残基は、表７、表８、表９、および表１０ならびにそれらの任意の組み合わせ
の中にある残基からなる群から選択される、配列番号４（全長成熟型ＦＶＩＩＩ）の２以
上のアミノ酸残基に相当する
他の実施態様において、少なくとも１つのＸＴＥＮ配列が、本明細書に開示される任意
の１以上のＸＴＥＮ挿入部位、またはそれらの任意の組み合わせの中に挿入される。１つ
の態様において、少なくとも１つのＸＴＥＮ配列は、表７に開示される１以上のアミノ酸
に開示される１以上のＸＴＥＮ挿入部位に挿入される。
Figure 0007022165000034
Figure 0007022165000035
Figure 0007022165000036
Figure 0007022165000037
Figure 0007022165000038
Figure 0007022165000039
一部の実施態様において、１以上のＸＴＥＮ配列が、アミノ酸３２、２２０、２２４、
３３６、３３９、３９９、４１６、６０３、１６５６、１７１１、１７２５、１９０５、
もしくは１９１０（配列番号４に対応）、またはそれらの任意の組み合わせから、およそ
６アミノ酸、上流または下流の内に挿入される。
Figure 0007022165000040
他の実施態様において、１以上のＸＴＥＮ配列が、表９の１以上の挿入部位からなる群
から選択される、全長成熟型ヒトＦＶＩＩＩに対応する１以上のアミノ酸のすぐ下流に挿
入される。
Figure 0007022165000041
さらに他の実施態様において、１以上のＸＴＥＮがＦＶＩＩＩのＢドメインに挿入され
る。１つの例において、ＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸７４０と１６４０の間に挿入
されており、ここで、アミノ酸７４０と１６４０の間のＦＶＩＩＩ配列は、任意選択的に
、存在しない。他の例において、ＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸７４１と１６9０の
間に挿入されており、ここで、アミノ酸７４０と１６9０の間のＦＶＩＩＩ配列は、任意
選択的に、存在しない。他の例において、ＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸７４１と１
６４８の間に挿入されており、ここで、アミノ酸７４１と１６４８の間のＦＶＩＩＩ配列
は、任意選択的に、存在しない。さらに他の例において、ＸＴＥＮは、配列番号４のアミ
ノ酸７４３と１６３８の間に挿入されており、ここで、アミノ酸７４３と１６３８の間の
ＦＶＩＩＩ配列は、任意選択的に、存在しない。さらに他の例において、ＸＴＥＮは、配
列番号４のアミノ酸７４５と１６５６の間に挿入されており、ここで、アミノ酸７４５と
１６５６の間のＦＶＩＩＩ配列は、任意選択的に、存在しない。さらに他の例において、
ＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸７４５と１６５７の間に挿入されており、ここで、ア
ミノ酸７４５と１６５７の間のＦＶＩＩＩ配列は、任意選択的に、存在しない。さらに他
の例において、ＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸７４５と１６６７の間に挿入されてお
り、ここで、アミノ酸７４５と１６６７の間のＦＶＩＩＩ配列は、任意選択的に、存在し
ない。さらに他の例において、ＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸７４５と１６８６の間
に挿入されており、ここで、アミノ酸７４５と１６８６の間のＦＶＩＩＩ配列は、任意選
択的に、存在しない。一部の他の例において、ＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸７４７
と１６４２の間に挿入されており、ここで、アミノ酸７４７と１６４２の間のＦＶＩＩＩ
配列は、任意選択的に、存在しない。さらに他の例において、ＸＴＥＮは、配列番号４の
アミノ酸７５１と１６６７の間に挿入されており、ここで、アミノ酸７５１と１６６７の
間のＦＶＩＩＩ配列は、任意選択的に、存在しない。
一部の実施態様において、１以上のＸＴＥＮが、表１０のアミノ酸残基からなる群から
選択される挿入部位のアミノ酸のすぐ下流の１以上のアミノ酸に挿入されている。
Figure 0007022165000042
Figure 0007022165000043
Figure 0007022165000044
Figure 0007022165000045
１つの実施態様において、１以上のＸＴＥＮ挿入部位が、ＦＶＩＩＩタンパク質の１以
上の、表面に露出した、可塑性のあるループ構造（たとえば、許容ループ（ｐｅｒｍｉｓ
ｓｉｖｅ ｌｏｏｐ））の内に位置づけられている。たとえば、少なくとも１つのＸＴＥ
Ｎ配列が、少なくとも２つの「許容ループ」を含有する各ＦＶＩＩＩの「Ａ」ドメイン内
に挿入されており、組換えタンパク質の凝固促進活性、または、宿主細胞でｉｎ ｖｉｖ
ｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで発現される組換えタンパク質の活性をを損なうことなく、少
なくとも１つのＸＴＥＮポリペプチドが、そのループに挿入されることができる。許容ル
ープは、少なくとも１つのＸＴＥＮ配列が挿入でき、そして他の性質の中でもとりわけ、
高い表面の露出または溶媒への曝露、および高い配座柔軟性を可能とする領域である。Ａ
１ドメインは、許容ループ１（Ａ１－１）領域および許容ループ２（Ａ１－２）領域を含
有し、Ａ２ドメインは、許容ループ１（Ａ２－１）領域および許容ループ２（Ａ２－２）
領域を含有し、Ａ３ドメインは、許容ループ１（Ａ３－１）領域および許容ループ２（Ａ
３－２）領域を含有する。
１つの態様において、ＦＶＩＩＩ Ａ１ドメインの第一の許容ループ（Ａ１－１）は、
βストランド１とβストランド２の間に位置づけられ、および、ＦＶＩＩＩ Ａ２ドメイ
ンの第二の許容ループ（Ａ１－２）は、βストランド１１とβストランド１２の間に位置
づけられる。ＦＶＩＩＩ Ａ２ドメインの第一の許容ループ（Ａ２－１）は、βストラン
ド２２とβストランド２３の間に位置づけられ、および、ＦＶＩＩＩ Ａ２ドメインの第
二の許容ループ（Ａ２－２）は、βストランド３２とβストランド３３の間に位置づけら
れる。ＦＶＩＩＩ Ａ３ドメインの第一の許容ループ（Ａ３－１）は、βストランド３８
とβストランド３９の間に位置づけられ、および、ＦＶＩＩＩ Ａ３ドメインの第二の許
容ループ（Ａ３－２）は、βストランド４５とβストランド４６の間に位置づけられる。
ある態様において、Ａ１－１を含有する、表面が露出された、可塑性ループ構造は、配列
番号４のおよそアミノ酸１５～およそアミノ酸４５の天然型成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける
領域（たとえば、配列番号４のおよそアミノ酸１８～およそアミノ酸４１）に相当する。
他の態様において、Ａ１－２を含有する、表面が露出された、可塑性のループ構造は、配
列番号４のおよそアミノ酸２０１～およそアミノ酸２３２の天然型成熟ヒトＦＶＩＩＩに
おける領域（たとえば、配列番号４のおよそアミノ酸２１８～およそアミノ酸２２９）に
相当する。さらに他の態様において、Ａ２－１を含有する、表面が露出された、可塑性の
ループ構造は、配列番号４のおよそアミノ酸３９５～およそアミノ酸４２１の天然型成熟
ヒトＦＶＩＩＩにおける領域（たとえば、配列番号４のおよそアミノ酸３９７～およそア
ミノ酸４１８）に相当する。さらに他の実施態様において、Ａ２－２を含有する、表面が
露出された、可塑性のループ構造は、配列番号４のおよそアミノ酸５７７～およそアミノ
酸６３５の天然型成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域（たとえば、配列番号４のおよそアミ
ノ酸５９５～およそアミノ酸６０７）に相当する。ある態様において、Ａ３－１を含有す
る、表面が露出された、可塑性のループ構造は、配列番号４のおよそアミノ酸１７０５～
およそアミノ酸１７３２の天然型成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域（たとえば、配列番号
４のおよそアミノ酸１７１１～およそアミノ酸１７２５）に相当する。さらに他の態様に
おいて、Ａ３－２を含有する、表面が露出された、可塑性のループ構造は、配列番号４の
およそアミノ酸１８８４～およそアミノ酸１９１７の天然型成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける
領域（たとえば、配列番号４のおよそアミノ酸１８９９～およそアミノ酸１９１１）に相
当する。
他の実施態様において、少なくとも１つのＸＴＥＮ配列が挿入される、１以上のアミノ
酸は、ａ３ドメイン（たとえば、全長成熟型ＦＶＩＩＩポリペプチドに対応するアミノ酸
１６４９～１６８９）内に位置づけられる。特定の実施態様において、ＸＴＥＮ配列は、
配列番号４（全長成熟型ＦＶＩＩＩ）のアミノ酸１６５６～１６５７の間に挿入される。
特定の実施態様において、配列番号４のアミノ酸１６５６のすぐ下流に挿入されたＸＴＥ
Ｎ配列を含有するＦＶＩＩＩはさらに、配列番号４のアミノ酸７４５～アミノ酸１６５６
の欠損を含有する。
一部の実施態様において、１以上のＸＴＥＮ挿入に対する１以上の挿入部位は、
（１）アミノ酸３、（２）アミノ酸１８、（３）アミノ酸２２、
（４） アミノ酸２６、（５）アミノ酸３２、（６）アミノ酸４０、
（７）アミノ酸６０、（８）アミノ酸６５、（９）アミノ酸８１、
（１０）アミノ酸１１６、（１１）アミノ酸１１９、（１２）アミノ酸１３０、
（１３）アミノ酸１８８、（１４）アミノ酸２１１、（１５）アミノ酸２１６、
（１６）アミノ酸２２０、（１７）アミノ酸２２４、（１８）アミノ酸２３０、
（１９）アミノ酸３３３、（２０）アミノ酸３３６、（２１）アミノ酸３３９、
（２２）アミノ酸３７５、（２３）アミノ酸３９９、（２４）アミノ酸４０３、
（２５）アミノ酸４０９、（２６）アミノ酸４１６、（２６）アミノ酸４４２、
（２８）アミノ酸４８７、（２９）アミノ酸４９０、（３０）アミノ酸４９４、
（３１）アミノ酸５００、（３２）アミノ酸５１８、（３３）アミノ酸５９９、
（３４）アミノ酸６０３、（３５） アミノ酸７１３、（３６）アミノ酸７４５、
（３７）アミノ酸１６５６、（３８）アミノ酸１７１１、（３９）アミノ酸１７２０、
（４０）アミノ酸１７２５、（４１）アミノ酸１７４９、（４２）アミノ酸１７９６、
（４３）アミノ酸１８０２、（４４）アミノ酸１８２７、（４５）アミノ酸１８６１、
（４６）アミノ酸１８９６、（４７）アミノ酸１９００、（４８）アミノ酸１９０４、
（４９）アミノ酸１９０５、（５０）アミノ酸１９１０、（５１）アミノ酸１９３７、
（５２）アミノ酸２０１９、（５３）アミノ酸２０６８、（５４）アミノ酸２１１１、
（５５）アミノ酸２１２０、（５６）アミノ酸２１７１、（５７）アミノ酸２１８８、
（５８）アミノ酸２２２７、（５９）アミノ酸２２７７、および、
（６０）それらの２以上の組み合わせ、
からなる群から選択される１以上のアミノ酸のすぐ下流である。
１つの実施態様において、本発明に有用なＦＶＩＩＩタンパク質は、２つのＸＴＥＮ配
列（第一のＸＴＥＮ挿入部位に挿入された第一のＸＴＥＮ配列、第二のＸＴＥＮ挿入部位
に挿入された第二のＸＴＥＮ）を含有する。第一のＸＴＥＮ挿入部位および第二のＸＴＥ
Ｎ挿入部位の非限定的な例を表１１にリストアップする。
Figure 0007022165000046
Figure 0007022165000047
Figure 0007022165000048
ＦＶＩＩＩタンパク質に挿入された、または連結された２つのＸＴＥＮは、同一であっ
ても、異なっていても良い。一部の実施態様において、本発明に有用なＦＶＩＩＩタンパ
ク質は、ＦＶＩＩＩタンパク質に挿入された２つのＸＴＥＮ配列（配列番号４のアミノ酸
７４５のすぐ下流に挿入された第一のＸＴＥＮ配列、および、配列番号４のアミノ酸２３
３２（Ｃ末端）のすぐ下流に挿入された第二のＸＴＥＮ配列）を含有する。他の実施態様
において、第一のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸１８、２６、４０、１６５６、
または１７２０のすぐ下流に挿入され、および、第二のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のア
ミノ酸４０３のすぐ下流に挿入される。さらに他の実施態様において、第一のＸＴＥＮ配
列は、配列番号４のアミノ酸１８、２６、または４０のすぐ下流に挿入され、および、第
二のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸５９９のすぐ下流に挿入される。さらに他の
実施態様において、第一のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸１６５６のすぐ下流に
挿入され、および、第二のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸１８、２６、４０、３
９９、４０３、１７２５、１７２０、１９００、１９０５、または２３３２のすぐ下流に
挿入される。ある実施態様において、第一のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸１９
００のすぐ下流に挿入され、および、第二のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸１８
、２６または４０のすぐ下流に挿入される。一部の実施態様において、第一のＸＴＥＮ配
列は、配列番号４のアミノ酸１８、２６または４０のすぐ下流に挿入され、および、第二
のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸３９９のすぐ下流に挿入される。他の実施態様
において、第一のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸１７２０のすぐ下流に挿入され
、および、第二のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸１８、２６、または４０のすぐ
下流に挿入される。さらに他の実施態様において、第一のＸＴＥＮ配列は、配列番号４の
アミノ酸１７２０のすぐ下流に挿入され、および、第二のＸＴＥＮ配列は、配列番号４の
アミノ酸１８のすぐ下流に挿入される。特定の実施態様において、２つのＸＴＥＮ配列（
配列番号４のアミノ酸７４５のすぐ下流に挿入された第一のＸＴＥＮ、および、配列番号
４のアミノ酸２３３２のすぐ下流に挿入された第二のＸＴＥＮ）を含有するＦＶＩＩＩタ
ンパク質であって、ここで、ＦＶＩＩＩタンパク質はさらに、配列番号４のアミノ酸７４
５から配列番号４のアミノ酸１６８５の欠損を有し、配列番号４のアミノ酸１６８０で変
異または置換（たとえば、Ｙ１６８０Ｆ）を有し、配列番号４のアミノ酸１６４８で変異
または置換（Ｒ１６４８Ａ）を有し、または、配列番号４のアミノ酸１６４８、および、
配列番号４のアミノ酸１６８０で、少なくとも２つの変異または置換（たとえば、Ｒ１６
４８Ａ、Ｙ１６８０Ｆ）を有する。特定の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質は、
２つのＸＴＥＮ配列（配列番号４のアミノ酸１６５６のすぐ下流に挿入された第一のＸＴ
ＥＮ、および、配列番号４のアミノ酸２３３２のすぐ下流に挿入された第二のＸＴＥＮ）
を含有し、ここで、ＦＶＩＩＩタンパク質はさらに、配列番号４のアミノ酸７４５～アミ
ノ酸１６５６の欠損を有する。
ある実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質は、３つのＸＴＥＮ配列（第一のＸＴＥ
Ｎ挿入部位に挿入された第一のＸＴＥＮ配列、第二のＸＴＥＮ挿入部位に挿入された第二
のＸＴＥＮ配列、および、第三のＸＴＥＮ挿入部位に挿入された第三のＸＴＥＮ配列）を
含有する。第一、第二、または、第三のＸＴＥＮ配列は、同一であっても、または、異な
っていても良い。第一、第二、および、第三の挿入部位は、本明細書に開示される挿入部
位のうちの任意の１つの群から選択されてもよい。一部の実施態様において、３つのＸＴ
ＥＮ配列を含有するＦＶＩＩＩタンパク質はさらに、変異または置換（たとえば、配列番
号４のアミノ酸１６４８で、たとえば、Ｒ１６４８Ａ）を含有しても良い。たとえば、第
一、第二、および第三のＸＴＥＮ挿入部位の非限定的な例を、表１２にリストアップする
。
Figure 0007022165000049
Figure 0007022165000050
一部の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質は、３つのＸＴＥＮ配列（第一のＸＴ
ＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸２６のすぐ下流に挿入され、第二のＸＴＥＮ配列は、
配列番号４のアミノ酸４０３のすぐ下流に挿入され、および、第三のＸＴＥＮ配列は、配
列番号４のアミノ酸１６５６、１７２０または１９００のすぐ下流に挿入される）を含有
する。他の実施態様において、第一のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸２６のすぐ
下流に挿入され、第二のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸１６５６のすぐ下流に挿
入され、および、第三のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸１７２０または１９００
のすぐ下流に挿入される。さらに他の実施態様において、第一のＸＴＥＮ配列は、配列番
号４のアミノ酸２６のすぐ下流に挿入され、第二のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ
酸１７２０のすぐ下流に挿入され、および、第三のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ
酸１９００のすぐ下流に挿入される。さらに他の実施態様において、第一のＸＴＥＮ配列
は、配列番号４のアミノ酸４０３のすぐ下流に挿入され、第二のＸＴＥＮ配列は、配列番
号４のアミノ酸１６５６のすぐ下流に挿入され、および、第三のＸＴＥＮ配列は、配列番
号４のアミノ酸１７２０または１９００のすぐ下流に挿入される。他の実施態様において
、第一のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸４０３または１６５６のすぐ下流に挿入
され、第二のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸１７２０のすぐ下流に挿入され、お
よび、第三のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸１９００のすぐ下流に挿入される。
他の実施態様において、第一のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸１８、２６、４０
、３９９、４０３、１７１１、１７２０、１７２５、１９００、１９０５、または、１９
１０のすぐ下流に挿入され、第二のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸７４５のすぐ
下流に挿入され、および、第三のＸＴＥＮ配列は、配列番号４のアミノ酸１７２０または
２３３２のすぐ下流に挿入される。
他の実施態様において、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質は４つのＸＴＥＮ配列（第一の
ＸＴＥＮ配列は第一の挿入部位に挿入され、第二のＸＴＥＮ配列は第二の挿入部位に挿入
され、第三のＸＴＥＮ配列は第三の挿入部位に挿入され、および、第四のＸＴＥＮ配列は
第四の挿入部位に挿入される）を含有する。第一、第二、第三、および第四のＸＴＥＮ配
列は、同一であっても、異なっていても、またはそれらの組み合わせであってもよい。一
部の実施態様において、４つのＸＴＥＮ配列を含有するＦＶＩＩＩタンパク質はさらに、
変異または置換（たとえば、配列番号４のアミノ酸１６４８（たとえば、Ｒ１６４８Ａ）
）を含有してもよい。第一、第二、第三、および第四のＸＴＥＮ挿入部位の非限定的な例
を表１３にリストアップする。
Figure 0007022165000051
Figure 0007022165000052
Figure 0007022165000053
Figure 0007022165000054
一部の実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質は、５つのＸＴＥＮ配列（第一のＸＴ
ＥＮ配列は第一の挿入部位に挿入され、第二のＸＴＥＮ配列は第二の挿入部位に挿入され
、第三のＸＴＥＮ配列は第三の挿入部位に挿入され、第四のＸＴＥＮ配列は第四の挿入部
位に挿入され、および、第五のＸＴＥＮ配列は第五の挿入部位に挿入される）を含有する
。第一、第二、第三、第四および第五のＸＴＥＮ配列は、同一であっても、異なっていて
も、またはそれらの組み合わせであってもよい。一部の実施態様において、第一、第二、
第三、第四および第五のＸＴＥＮ挿入部位の非限定的な例を表１４にリストアップする。
Figure 0007022165000055
ある実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質は、６つのＸＴＥＮ配列（第一のＸＴＥ
Ｎ配列は第一の挿入部位に挿入され、第二のＸＴＥＮ配列は第二の挿入部位に挿入され、
第三のＸＴＥＮ配列は第三の挿入部位に挿入され、第四のＸＴＥＮ配列は第四の挿入部位
に挿入され、第五のＸＴＥＮ配列は第五の挿入部位に挿入され、および、第六のＸＴＥＮ
配列は第六の挿入部位に挿入される）を含有する。第一、第二、第三、第四、第五および
第六のＸＴＥＮ配列は、同一であっても、異なっていても、またはそれらの組み合わせで
あってもよい。一部の実施態様において、６つのＸＴＥＮ挿入部位の例は、限定されない
が、表１５にリストアップされる挿入部位が挙げられる。
Figure 0007022165000056
特定の例において、第一のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸２６と２７の間に挿入さ
れ、および、第二のＸＴＥＮは、配列番号４（全長成熟型ＦＶＩＩＩ）のアミノ酸１７２
０と１７２１の間に挿入される。他の例において、第一のＸＴＥＮは、配列番号４のアミ
ノ酸４０３と４０４の間に挿入され、および、第二のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸
１７２０と１７２１の間に挿入される。一部の例において、第一のＸＴＥＮは、配列番号
４のアミノ酸１６５６と１６５７の間に挿入され、および、第二のＸＴＥＮは、配列番号
４のアミノ酸１７２０と１７２１の間に挿入される。他の例において、第一のＸＴＥＮは
、配列番号４のアミノ酸２６と２７の間に挿入され、第二のＸＴＥＮは、配列番号４のア
ミノ酸１６５６と１６５７の間に挿入され、および、第三のＸＴＥＮは、配列番号４のア
ミノ酸１７２０と１７２１の間に挿入される。さらに他の実施態様において、第一のＸＴ
ＥＮは、配列番号４のアミノ酸４０３と４０４の間に挿入され、第二のＸＴＥＮは、配列
番号４のアミノ酸１６５６と１６５７の間に挿入され、および、第三のＸＴＥＮは、配列
番号４のアミノ酸１７２０と１７２１の間に挿入される。さらに他の実施態様において、
第一のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸４０３と４０４の間に挿入され、第二のＸＴＥ
Ｎは、配列番号４のアミノ酸１６５６と１６５７の間に挿入され、および、第三のＸＴＥ
Ｎは、配列番号４のアミノ酸１７２０と１７２１の間に挿入される。ある実施態様におい
て、第一のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸２６と２７の間に挿入され、第二のＸＴＥ
Ｎは、配列番号４のアミノ酸１７２０と１７２１の間に挿入され、および、第三のＸＴＥ
Ｎは、配列番号４のアミノ酸１９００と１９０１の間に挿入される。一部の実施態様にお
いて、第一のＸＴＥＮは、配列番号４のアミノ酸２６と２７の間に挿入され、第二のＸＴ
ＥＮは、配列番号４のアミノ酸１６５６と１６５７の間に挿入され、第三のＸＴＥＮは、
配列番号４のアミノ酸１７２０と１７２１の間に挿入され、および、第四のＸＴＥＮは、
配列番号４のアミノ酸１９００と１９０１の間に挿入される。
特定の実施態様において、ＸＴＥＮ配列は、全長第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸７４５と７
４６の間に挿入され、または、Ｂドメイン欠損第ＶＩＩＩ因子の対応する挿入部位に挿入
される。
一部の実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、２つのポリペプチド配列を含
有し、第一のポリペプチド配列は、ＦＶＩＩＩ－１６１（配列番号１０１）、ＦＶＩＩＩ
－１６９（配列番号１０３）、ＦＶＩＩＩ－１７０（配列番号１０２）、ＦＶＩＩＩ－１
７３（配列番号１０４）；ＦＶＩＩＩ－１９５ （配列番号１０５）；ＦＶＩＩＩ－１９
６（配列番号１０６）、ＦＶＩＩＩ１９９ （配列番号１０７）、ＦＶＩＩＩ－２０１（
配列番号１０８）；ＦＶＩＩＩ－２０３（配列番号１０９）、ＦＶＩＩＩ－２０４（配列
番号１１０）、ＦＶＩＩＩ－２０５（配列番号１１１）、ＦＶＩＩＩ－２６６（配列番号
１１２）、ＦＶＩＩＩ－２６７（配列番号１１３）、ＦＶＩＩＩ－２６８（配列番号１１
４）、ＦＶＩＩＩ－２６９（配列番号１１５）、ＦＶＩＩＩ－２７１（配列番号１１６）
、または、ＦＶＩＩＩ－２７２（配列番号１１７）から選択される配列に対し、少なくと
も約８０％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含有し、および
、第二のポリペプチド配列は、ＶＷＦ０３１（配列番号１１８）、ＶＷＦ０３４（配列番
号１１９）、または、ＶＷＦ－０３６（配列番号１２０）から選択される配列に対し、少
なくとも約８０％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含有する
。
Ｄ） Ｉｇ定常領域またはその一部
本発明のＸＴＥＮ配列に連結されたＶＷＦ断片またはＦＶＩＩＩタンパク質はさらに、
Ｉｇ定常領域またはその一部を含有してもよい。Ｉｇ定常領域またはその一部は、ＸＴＥ
Ｎ配列を組み合わされたＶＷＦ断片またはＦＶＩＩＩタンパク質の薬物動態特性または薬
力学特性を改善してもよい。ある実施態様において、Ｉｇ定常領域またはその一部は、Ｉ
ｇ定常領域またはその一部と融合された分子の半減期を延長する。
Ｉｇ定常領域は、ＣＨ（定常重鎖）ドメインと示されるドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２等）
から構成される。アイソタイプ（すなわち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたは、Ｉ
ｇＥ）によって、定常領域は、３つ、または４つのＣＨドメインから構成されてもよい。
一部のアイソタイプ（たとえば、ＩｇＧ）の定常領域はまた、ヒンジ領域を含有する。Ja
newayet al.2001, Immunobiology, GarlandPublishing, N.Y., N.Yを参照のこと。
本発明のキメラタンパク質の製造のための、Ｉｇ定常領域またはその一部は、多くの異
なる源から入手されてもよい。一部の実施態様において、Ｉｇ定常領域またはその一部は
、ヒトＩｇから誘導される。しかしながら、Ｉｇ定常領域またはその一部は、他の哺乳類
種（たとえば、げっ歯類（たとえば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット等）、または
非ヒト霊長類種（たとえば、チンパンジー、マカク）を含む）のＩｇから誘導されても良
いことを理解されたい。さらに、Ｉｇ定常領域またはその一部は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、Ｉｇ
Ａ、ＩｇＤおよびＩｇＥを含む任意のＩｇクラス、および、任意のＩｇアイソタイプ（Ｉ
ｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む）から誘導されても良い。１つの実
施態様において、ヒトのアイソタイプのＩｇＧ１が用いられる。
様々なＩｇ定常領域の遺伝子配列（たとえば、ヒト定常領域遺伝子配列）が、第三者利用
なデポジットの形態で入手可能である。特定のエフェクター機能を有する（または、特定
のエフェクター機能を欠損している）定常領域ドメインの配列、または、免疫原性を減少
させるために特定の改変が為されている定常領域ドメインの配列を、選択することができ
る。多くの抗体の配列、および抗体をコードする遺伝子の配列が公開されており、当分野
公知の技術を用いて、これらの配列から、適切なＩｇ定常領域の配列（たとえば、ヒンジ
、ＣＨ２および／もしくはＣＨ３配列、またはその一部）を得ることができる。次いで、
前述の任意の方法を用いて得られた遺伝的材料を改変、または合成して、本発明のポリペ
プチドを得ても良い。さらに、本発明の範囲には、定常領域のＤＮＡ配列の対立遺伝子、
変異体、および突然変異を包含することを認識されたい。
Ｉｇ定常領域またはその一部の配列は、たとえば、ポリメラーゼ鎖反応および対象のド
メインを増幅するために選択されたプライマーを用いて、クローニングされてもよい。抗
体からＩｇ定常領域またはその一部の配列をクローニングするために、ｍＲＮＡをハイブ
リドーマ、脾臓、またはリンパ細胞から単離し、ＤＮＡへ逆転写し、および、抗体遺伝子
をＰＣＲにより増幅してもよい。ＰＣＲ増幅法は、米国特許第４，６８３，１９５号；第
４，６８３，２０２号；第４，８００，１５９号；第４，９６５，１８８号、および、た
とえば、"PCRProtocols:A Guide to Methods and Applications"Innis et al. eds., Ac
ademicPress,San Diego, CA (1990); Ho et al. 1989.Gene 77:51; Horton et al.
1993. MethodsEnzymol. 217:270)に詳述されている。コンセンサス定常領域プライマー
により、または、公開されている重鎖および軽鎖ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列に基づい
た、より特異的なプライマーにより、ＰＣＲが開始されてもよい。上述のように、ＰＣＲ
を用いて抗体の重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡクローンを単離してもよい。この場合
において、ライブラリは、コンセンサスプライマーまたはより大きな相同プローブ（たと
えばマウス定常領域プローブ）によりスクリーニングされてもよい。抗体遺伝子の増幅に
適切な多くのプライマーセットが当分野に公知である（たとえば、精製抗体のＮ末端配列
に基づいた５´プライマー（Benharand Pastan. 1994. Protein Engineering 7:1509）；
ｃＤＮＡ末端の急速増幅（Ruberti, F. et al.1994. J.Immunol. Methods 173:33)）；抗
体リーダー配列（Larricket al. 1989 Biochem.Biophys. Res. Commun. 160:1250）等）
。抗体配列のクローニングは、Ｎｅｗｍａｎらの米国特許第５，６５８，５７０
号（１９９５年１月２５日出願、参照により本明細書に援用される）にさらに詳述されて
いる。
本明細書に用いられているＩｇ定常領域は、すべてのドメインおよびヒンジ領域、また
はそれらの一部を含むことができる。１つの実施態様において、Ｉｇ定常領域またはその
一部は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびヒンジ領域（すなわち、Ｆｃドメインま
たはＦｃＲｎ結合パートナー）を含有する。
本明細書において、「Ｆｃ領域」という用語は、天然型イムノグロブリンのＦｃ領域に
相当するポリペプチド部分、すなわち、その２つの重鎖の各Ｆｃドメインの二量体性の関
連付けにより形成される部分と定義づけられる。天然型Ｆｃ領域は他のＦｃ領域とホモ二
量体を形成する。対照的に、「遺伝的に融合されたＦｃ領域」または「一本鎖Ｆｃ領域」
（ｓｃＦｃ領域）という用語は、本明細書において、一本鎖ポリペプチド（すなわち、単
一の連続的な遺伝子配列にコードされたもの）内で遺伝的に連結されたＦｃドメインから
構成される合成二量体Ｆｃ領域を指す。
１つの実施態様において、「Ｆｃ領域」とは、パパイン開裂部位のちょうど上流にある
ヒンジ領域（すなわち、１１４である重鎖定常領域の最初の残基を取り、ＩｇＧ中の残基
２１６）から始まり、抗体のＣ末端で終わる、単一Ｉｇ重鎖部分を指す。従って、完全な
Ｆｃドメインは、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含
有する。
Ｉｇ定常領域のＦｃ領域は、Ｉｇアイソタイプに依存して、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ
４ドメイン、ならびにヒンジ領域を含有しても良い。キメラタンパク質がＩｇのＦｃ領域
を含有することによって、安定性の増加、血清半減期の増加（seeCapon et al., 1989, N
ature 337:525を参照のこと）、ならびに、たとえば胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）等の
Ｆｃ受容体への結合の増加を含む、いくつかの所望の特性がキメラタンパク質にもたらさ
れる（米国特許第６，０８６，８７５号、第６，４８５，７２６号、第６，０３０，６１
３号；ＷＯ０３／０７７８３４；ＵＳ２００３－０２３５５３６Ａ１、それらは、参照に
よりその全体で本明細書に援用される）。
Ｉｇ定常領域またはその一部は、ＦｃＲｎ結合パートナーであってもよい。ＦｃＲｎは
、成人の上皮組織で活性であり、腸管腔、気道、鼻腔面、膣表面、結腸表面および直腸表
面で発現される（米国特許第６，４８５，７２６号）。ＦｃＲｎ結合パートナーは、Ｆｃ
Ｒｎに結合するＩｇの部分である。
ＦｃＲｎ受容体は、ヒトを含む、いくつかの哺乳類種から単離されている。ヒトＦｃＲ
ｎ、サルＦｃＲｎ、ラットＦｃＲｎ、およびマウスのＦｃＲｎの配列が公知である（Stor
yet al. 1994,J. Exp. Med. 180:2377）。ＦｃＲｎ受容体は、比較的低いｐＨでＩｇＧ
に結合し（たとえば、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥ等の他のＩｇクラスには結合
しない）、内腔内でＩｇＧを漿膜方向に経細胞的に能動輸送し、次いで、腸管液中の比較
的高いｐＨでＩｇＧを放出する。肺および腸管上皮（Israelet al. 1997, Immunology 92
:69）、近位尿細管上皮細胞（Kobayashiet al. 2002, Am. J. Physiol.Renal Physiol.
282:F358）、ならびに鼻腔上皮、膣表面および胆管表面を含む、成人の上皮組織（米国特
許第６，０８６，８７５号、第６，４８５，７２６号、第６，０３０，６１３号；ＷＯ０
３／０７７８３４；ＵＳ２００３－０２３５５３６Ａ１）で発現されている。
本発明に有用なＦｃＲｎ結合パートナーには、ＩｇＧ全体、ＩｇＧのＦｃ断片、および
、ＦｃＲｎ受容体の完全な結合領域を含む他の断片を含む、ＦｃＲｎ受容体により特異的
に結合されることができる分子が包含される。ＦｃＲｎ受容体に結合するＩｇＧのＦｃ部
分の領域は、Ｘ線結晶構造解析に基づき、記述されている（Burmeisteret al. 1994, Nat
ure 372:379）。ＦｃＲｎとのＦｃの主な接触領域は、ＣＨ２とＣＨ３ドメインの接合点
の近くである。Ｆｃ－ＦｃＲｎの接触はすべて、単一のＩｇ重鎖内である。ＦｃＲｎ結合
パートナーには、ＩｇＧ全体、ＩｇＧのＦｃ断片、および、ＦｃＲｎの完全な結合領域を
含むＩｇＧの他の断片が含まれる。主な接触部位としては、ＣＨ２ドメインのアミノ酸残
基２４８、２５０－２５７、２７２、２８５、２８８、２９０－２９１、３０８－３１１
および３１４、ならびに、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３８５－３８７、４２８および
４３３－４３６が含まれる。ＩｇまたはＩｇ断片のアミノ酸のナンバリングに作成された
基準はすべて、Kabatetal. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest,
U.S. DepartmentofPublic Health, Bethesda, Mdに基づいている。
ＦｃＲｎに結合されたＦｃ領域、またはＦｃＲｎ結合パートナーは、ＦｃＲｎによって
、効率的に上皮バリアを超えて行き来することができるため、それにより、所望の治療分
子を全身投与するための非侵襲的な手段が得られる。さらに、Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結
合パートナーを含有する融合タンパク質は、ＦｃＲｎを発現している細胞により、エンド
サイト―シスされる。しかし、分解されるかわりに、これらの融合タンパク質は、循環系
へと再びリサイクルされ、それによって、これらのタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ半減期は
延長される。ある実施態様において、Ｉｇ定常領域の一部は、多くの場合、ジスルフィド
結合および他の非特定の相互作用を介して他のＦｃ領域または他のＦｃＲｎ結合パートナ
ーと関連し、二量体および高次の多量体を形成する、Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合パート
ナーである。
２つのＦｃＲｎ受容体は、１つのＦｃ分子と結合することができる。結晶構造解析のデ
ータから、各ＦｃＲｎ分子は、Ｆｃホモ二量体の１つのポリペプチドに結合することが示
唆されている。１つの実施態様において、ＦｃＲｎ結合パートナー（たとえば、ＩｇＧの
Ｆｃ断片）の、生物学的に活性な分子への連結は、経口、口腔、舌下、経直腸、経腟、経
鼻もしくは肺経路を介するエアロゾル投与、または、眼内経路を介する、生物学的に活性
な分子を送達する手段となる。他の実施態様において、キメラタンパク質は侵襲的に投与
（たとえば、皮下投与、静脈内投与）されてもよい。
ＦｃＲｎ結合パートナー領域は、ＦｃＲｎ受容体により特異的に結合され、その結果、
Ｆｃ領域のＦｃ受容体により能動輸送されることができる、分子またはその一部である。
特異的な結合とは、生理学的条件下で比較的安定な複合体を形成する２つの分子を指す。
特定の結合は、高いアフィニティおよび低～中程度の容量（キャパシティ）により特徴付
けられ、非特異的結合（通常、低いアフィニティおよび中～高度の容量を有する）から明
確に区別される。典型的には、アフィニティ定数ＫＡが、１０６Ｍ－１、または１０８Ｍ
－１よりも高い場合に、その結合は特異的であるとみなされる。もし必要であれば、結合
条件を変えることにより、特異的結合に実質的な影響を与えることなく、非特異的結合を
減少させることができる。適切な結合条件（たとえば、分子の濃度、溶液のイオン強度、
温度、結合させる時間、ブロッキング剤（たとえば、血清アルブミン、ミルクカゼイン等
）の濃度等）は、通常の技術を用いて当業者により最適化されてもよい。
ある実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）のＦｃ領
域に対する結合特性をもたらすには十分な、断片化Ｆｃ領域を１以上含有する。たとえば
、ＦｃＲｎに結合するＦｃ領域の部分（すなわち、ＦｃＲｎ結合部分）は、ＥＵナンバリ
ングでＩｇＧ１のおよそアミノ酸２８２～４３８を含有する（ＣＨ２ドメインのアミノ酸
２４８、２５０－２５７、２７２、２８５、２８８、２９０－２９１、３０８－３１１、
および３１４、ならびに、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３８５－３８７、４２８および
、４３３－４３６である主要接触部位を有する）。ゆえに本発明のＦｃ領域は、ＦｃＲｎ
結合部分を含有してもよい、または、からなるものであってもよい。ＦｃＲｎ結合部分は
、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプの重鎖から誘
導されてもよい。１つの実施態様において、ヒトのアイソタイプＩｇＧ１の抗体由来のＦ
ｃＲｎ結合部分が用いられる。他の実施態様において、ヒトのアイソタイプＩｇＧ４の抗
体由来のＦｃＲｎ結合部分が用いられる。
他の実施態様において、「Ｆｃ領域」には、Ｆｃドメインのアミノ酸配列、またはＦｃ
ドメイン由来のアミノ酸配列が含まれる。ある実施態様において、Ｆｃ領域は、ヒンジ（
たとえば、上部ヒンジ領域、中部ヒンジ領域、および／または下部ヒンジ領域）ドメイン
（ＥＵナンバリングで、抗体Ｆｃ領域のおよそアミノ酸２１６～２３０）、ＣＨ２ドメイ
ン（ＥＵナンバリングで、抗体Ｆｃ領域のおよそアミノ酸２３１～３４０）、ＣＨ３ドメ
イン（ＥＵナンバリングで、抗体Ｆｃ領域のおよそアミノ酸３４１～４３８）、ＣＨ４ド
メイン、またはそれらの変異体、部分もしくは断片の内の少なくとも１つを含有する。他
の実施態様において、Ｆｃ領域は、完全なＦｃドメイン（すなわち、ヒンジドメイン、Ｃ
Ｈ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン）を含有する。一部の実施態様において、Ｆｃ領域は
、ＣＨ３ドメイン（またはその一部）に融合されたヒンジドメイン（またはその一部）、
ＣＨ２ドメイン（またはその一部）に融合されたヒンジドメイン（またはその一部）、Ｃ
Ｈ３ドメイン（またはその一部）に融合されたＣＨ２ドメイン（またはその一部）、ヒン
ジドメイン（またはその一部）およびＣＨ３ドメイン（またはその一部）の両方に融合さ
れたＣＨ２ドメイン（またはその一部）を含有する、本質的にからなる、または、からな
る。さらに他の実施態様において、Ｆｃ領域は、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部を欠損
する（たとえば、ＣＨ２ドメインの一部またはすべて）。特定の実施態様において、Ｆｃ
領域は、ＥＵナンバリングで２２１～４４７に相当するアミノ酸を含有する、または、か
らなる。
Ｆ、Ｆ１、またはＦ２と本明細書に表記されるＦｃ領域は、多くの異なる源から得られ
ても良い。１つの実施態様において、ポリペプチドのＦｃ領域は、ヒトＩｇから誘導され
る。しかしながら、Ｆｃ領域は、他の哺乳類種（たとえば、げっ歯類（たとえば、マウス
、ラット、ウサギ、またはモルモット）または非ヒト霊長類種（たとえば、チンパンジー
、マカク）を含む）のＩｇから誘導されても良いことを理解されたい。さらに、Ｆｃドメ
インまたはその一部のポリペプチドは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを
含む任意のＩｇクラス、および、任意のＩｇアイソタイプ（ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ
３、およびＩｇＧ４を含む）から誘導されても良い。他の実施態様において、ヒトのアイ
ソタイプのＩｇＧ１が用いられる。
ある実施態様において、前記野生型Ｆｃドメインを含有するＦｃ領域によりもたらされ
るエフェクター機能の少なくとも１つに対し、Ｆｃ変異体は、変化をもたらす（たとえば
、Ｆｃ受容体（たとえば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、または、ＦｃγＲＩＩＩ）または
補体タンパク質（たとえば、Ｃ１ｑ）に結合するＦｃ領域の活性における改善または減少
、または、抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）、ファゴサイトーシスもしくは補体依存
性細胞傷害活性（ＣＤＣＣ）を引き起こすＦｃ領域の活性における改善または減少等）。
他の実施態様において、Ｆｃ変異体は、遺伝子操作されたシステイン残基をもたらす。
本発明のＦｃ領域に、エフェクター機能および／またはＦｃＲもしくはＦｃＲｎ結合に
変化をもたらすことが知られている、当分野公知のＦｃ変異体を用いても良い。具体的に
は、本発明の結合分子は、たとえば、国際特許出願ＷＯ８８／０７０８９Ａ１、ＷＯ９６
／１４３３９Ａ１、ＷＯ９８／０５７８７Ａ１、ＷＯ９８／２３２８９Ａ１、ＷＯ９９／
５１６４２Ａ１、ＷＯ９９／５８５７２Ａ１、ＷＯ００／０９５６０Ａ２、ＷＯ００／３
２７６７Ａ１、ＷＯ００／４２０７２Ａ２、ＷＯ０２／４４２１５Ａ２、ＷＯ０２／０６
０９１９Ａ２、ＷＯ０３／０７４５６９Ａ２、ＷＯ０４／０１６７５０Ａ２、ＷＯ０４／
０２９２０７Ａ２、ＷＯ０４／０３５７５２Ａ２、ＷＯ０４／０６３３５１Ａ２、ＷＯ０
４／０７４４５５Ａ２、ＷＯ０４／０９９２４９Ａ２、ＷＯ０５／０４０２１７Ａ２、Ｗ
Ｏ０４／０４４８５９、ＷＯ０５／０７０９６３Ａ１、ＷＯ０５／０７７９８１Ａ２、Ｗ
Ｏ０５／０９２９２５Ａ２、ＷＯ０５／１２３７８０Ａ２、ＷＯ０６／０１９４４７Ａ１
、ＷＯ０６／０４７３５０Ａ２、およびＷＯ０６／０８５９６７Ａ２；米国特許公開ＵＳ
２００７／０２３１３２９、ＵＳ２００７／０２３１３２９、ＵＳ２００７／０２３７７
６５、ＵＳ２００７／０２３７７６６、ＵＳ２００７／０２３７７６７、ＵＳ２００７／
０２４３１８８、ＵＳ２００７０２４８６０３、ＵＳ２００７０２８６８５９、ＵＳ２０
０８００５７０５６；または、米国特許第５，６４８，２６０号；第５，７３９，２７７
号；第５，８３４，２５０号；第５，８６９，０４６号；第６，０９６，８７１号；第６
，１２１，０２２号；第６，１９４，５５１号；第６，２４２，１９５号；第６，２７７
，３７５号；第６，５２８，６２４号；第６，５３８，１２４号；第６，７３７，０５６
号；第６，８２１，５０５号；第６，９９８，２５３号；第７，０８３，７８４号；第７
，４０４，９５６、および、７，３１７，０９１号（それら各々は、参照により本明細書
に援用される）に開示されるアミノ酸の位置のうちの１つ以上で、たとえば変化（たとえ
ば、置換）を含有してもよい。１つの実施態様において、開示されたアミノ酸の位置の１
つ以上で、特定の変化（たとえば、当分野公知の１以上のアミノ酸の特定の置換）があっ
ても良い。他の実施態様において、開示されたアミノ酸の位置の１つ以上で、異なる変化
（たとえば、当分野公知の１以上のアミノ酸の位置の異なる置換）があっても良い。
ＩｇＧのＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーを、たとえば、良く知られた方法（た
とえば、特定部位の突然変異誘導等）により改変し、ＦｃＲｎにより結合される、改変Ｉ
ｇＧまたはＦｃ断片もしくはその一部を得ても良い。そのような改変として、ＦｃＲｎ接
触部位から離れた部位にある改変、ならびに、ＦｃＲｎに対する結合を失わない、または
、あまつさえ増強する、接触部位内の改変が挙げられる。たとえば、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ
（Ｆｃ γ１）の以下の１アミノ酸残基は、ＦｃＲｎに対するＦｃ結合アフィニティを著
しく損ねることなく、置換することができる：Ｐ２３８Ａ、Ｓ２３９Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｋ
２４８Ａ、Ｄ２４９Ａ、Ｍ２５２Ａ、Ｔ２５６Ａ、Ｅ２５８Ａ、Ｔ２６０Ａ、Ｄ２６５Ａ
、Ｓ２６７Ａ、Ｈ２６８Ａ、Ｅ２６９Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｅ２７２Ａ、Ｌ２７４Ａ、Ｎ２７
６Ａ、Ｙ２７８Ａ、Ｄ２８０Ａ、Ｖ２８２Ａ、Ｅ２８３Ａ、Ｈ２８５Ａ、Ｎ２８６Ａ、Ｔ
２８９Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｒ２９２Ａ、Ｅ２９３Ａ、Ｅ２９４Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｙ２９６Ｆ
、Ｎ２９７Ａ、Ｓ２９８Ａ、Ｙ３００Ｆ、Ｒ３０１Ａ、Ｖ３０３Ａ、Ｖ３０５Ａ、Ｔ３０
７Ａ、Ｌ３０９Ａ、Ｑ３１１Ａ、Ｄ３１２Ａ、Ｎ３１５Ａ、Ｋ３１７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ
３２０Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｓ３２４Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ａ３３０Ｑ
、Ｐ３３１Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｔ３３５Ａ、Ｓ３３７Ａ、Ｋ３３８Ａ、Ｋ３４
０Ａ、Ｑ３４２Ａ、Ｒ３４４Ａ、Ｅ３４５Ａ、Ｑ３４７Ａ、Ｒ３５５Ａ、Ｅ３５６Ａ、Ｍ
３５８Ａ、Ｔ３５９Ａ、Ｋ３６０Ａ、Ｎ３６１Ａ、Ｑ３６２Ａ、Ｙ３７３Ａ、Ｓ３７５Ａ
、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｑ、Ｅ３８０Ａ、Ｅ３８２Ａ、Ｓ３８３Ａ、Ｎ３８４Ａ、Ｑ３８
６Ａ、Ｅ３８８Ａ、Ｎ３８９Ａ、Ｎ３９０Ａ、Ｙ３９１Ｆ、Ｋ３９２Ａ、Ｌ３９８Ａ、Ｓ
４００Ａ、Ｄ４０１Ａ、Ｄ４１３Ａ、Ｋ４１４Ａ、Ｒ４１６Ａ、Ｑ４１８Ａ、Ｑ４１９Ａ
、Ｎ４２１Ａ、Ｖ４２２Ａ、Ｓ４２４Ａ、Ｅ４３０Ａ、Ｎ４３４Ａ、Ｔ４３７Ａ、Ｑ４３
８Ａ、Ｋ４３９Ａ、Ｓ４４０Ａ、Ｓ４４４Ａ、およびＫ４４７Ａ（ここで、たとえば、Ｐ
２３８Ａとは、野生型プロリンが、２３８番の位置でアラニンに置換されることを表す）
。例として、特定の実施態様において、Ｎ２９７Ａ変異を組込み、高度に保存されたＮグ
リコシル化部位を除去している。アラニンに加え、他のアミノ酸で、上記特定の部位で野
生型アミノ酸を置換してもよい。変異を個々にＦｃに導入し、天然型Ｆｃとは異なる２０
０以上のＦｃ領域を生じさせてもよい。さらに、２、３またはそれ以上のこれら個々の変
異の組み合わせを共に導入して、数百以上のＦｃ領域を生じさせてもよい。さらに、本発
明の構築物のＦｃ領域のうちの１つが変異され、当該構築物の他のＦｃ領域はまったく変
異を受けなくても良く、または、それら両方ともが異なる変異で、変異されていてもよい
。
上述の変異のうちのいくつかは、Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーに新たな機能
性をもたらしうる。たとえば、１つの実施態様において、Ｎ２９７Ａを導入し、高度に保
存されたＮグリコシル化部位を除去する。この変異の効果は、免疫原性を減少させること
であり、これにより、Ｆｃ領域の循環半減期が延長され、および、ＦｃＲｎに対するアフ
ィニティを損ねることなく、Ｆｃ領域はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢお
よびＦｃγＲＩＩＩＡに結合することができなくなる（Routledgeet al. 1995, Transpla
ntation 60:847;Friend et al. 1999,Transplantation68:1632; Shields et al. 1995,
J. Biol. Chem.276:6591）。上述の変異から生じる新たな機能性のさらなる例として
、一部の例においては、ＦｃＲｎに対するアフィニティが、野生型のそれを超えて増加し
うることが挙げられる。このアフィニティの増加は、「オン」の比率の増加、「オフ」の
比率の減少、または、「オン」の比率増加と「オフ」の比率減少の両方を反映している可
能性がある。ＦｃＲｎに対するアフィニティ増加をもたらすと考えられている変異の例と
して、限定されないが、Ｔ２５６Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、および、Ｎ４３４Ａが挙
げられる（Shieldsetal. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591）。
さらに、少なくとも３つのヒトＦｃγ受容体が、下部ヒンジ領域（通常は、アミノ酸２
３４～２３７）の内で、ＩｇＧ上の結合部位を認識すると考えられている。それゆえ、他
の新たな機能性の例、および、免疫原性の減少の可能性は、たとえばヒトＩｇＧ１のアミ
ノ酸２３３～２３６（ＥＬＬＧ）を、ＩｇＧ２の対応する配列（ＰＶＡ）（１アミノ酸の
欠失を伴う）へと置換する等、この領域の変異によりもたらされる可能性がある。様々な
エフェクター機能を調節する、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩは、その
ような変異が導入された場合、ＩｇＧ１に結合しなくなることが示されている。Wardand
Ghetie 1995,Therapeutic Immunology 2:77、および、Armour et al. 1999, Eur. J.Imm
unol. 29:2613。
１つの実施態様において、Ｉｇ定常領域またはその一部（たとえば、Ｆｃ領域）は、配
列ＰＫＮＳＳＭＩＳＮＴＰ（配列番号５２）を含むポリペプチドおよび、任意選択的に、
ＨＱＳＬＧＴＱ（配列番号５３）、ＨＱＮＬＳＤＧＫ（配列番号５４）、ＨＱＮＩＳＤＧ
Ｋ（配列番号５５）、または、ＶＩＳＳＨＬＧＱ（配列番号５６）（米国特許第５，７３
９，２７７号）から選択される配列をさらに含むポリペプチドである。
他の実施態様において、イムノグロブリン定常領域またはその一部は、１以上のジスル
フィド結合を他のイムノグロブリン定常領域またはその一部と形成する、ヒンジ領域また
はその一部のアミノ酸配列を含有する。イムノグロブリン定常領域またはその一部による
ジスルフィド結合は、ＦＶＩＩＩを含有する第一のポリペプチドおよび、ＶＷＦ断片を含
有する第二のポリペプチド共に位置し、それにより、内因性ＶＷＦは、ＶＷＦ断片を置換
せず、および、ＦＶＩＩＩに結合しない。それゆえ、第一のイムノグロブリン定常領域ま
たはその一部と、第二のイムノグロブリン定常領域またはその一部の間のジスルフィド結
合は、内因性ＶＷＦとＦＶＩＩＩタンパク質の間の相互作用を阻害する。この、ＶＷＦと
ＦＶＩＩＩタンパク質の間の相互作用の阻害により、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期が、
２倍という限界を超える。ヒンジ領域またはその一部はさらに、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３
、その断片およびそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上のドメインに連結されてい
てもよい。特定の実施態様において、イムノグロブリン定常領域またはその一部ヒンジ領
域およびＣＨ２である。
ある実施態様において、Ｉｇ定常領域またはその一部は、半グリコシル化されている。
たとえば、２つのＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーを含有するキメラタンパク質は
、第一の、グリコシル化されたＦｃ領域（たとえば、グリコシル化ＣＨ２領域）またはＦ
ｃＲｎ結合パートナー、および、第二の、グリコシル化されていないＦｃ領域（たとえば
、グリコシル化されていないＣＨ２領域）またはＦｃＲｎ結合パートナー、を含有しても
よい。１つの実施態様において、リンカーは、グリコシル化されたＦｃ領域と、グリコシ
ル化されていないＦｃ領域の間に置かれても良い。他の実施態様において、Ｆｃ領域また
はＦｃＲｎ結合パートナーは、完全にグリコシル化されている（すなわち、Ｆｃ領域のす
べては、グリコシル化されている）。他の実施態様において、Ｆｃ領域は、グリコシル化
されていなくても良い（すなわち、Ｆｃ部分は１つもグリコシル化されていない）。
ある実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、Ｉｇ定常領域またはその一部に
対するアミノ酸置換を含有し（たとえば、Ｆｃ変異体）、それにより、Ｉｇ定常領域の抗
原非依存性エフェクター機能が変化する（特に、タンパク質の循環半減期）。
そのようなタンパク質は、置換の無いタンパク質と比較し、ＦｃＲｎに対する結合の増
加、または減少のいずれかを示し、それにより、それぞれ、血清中の半減期が増加、また
は減少する。ＦｃＲｎに対するアフィニティが改善されたＦｃ変異体は、血清半減期が延
長することが予期され、そのような分子は、長い半減期の投与ポリペプチドが所望される
場合（たとえば、慢性疾患または障害）の哺乳類の治療方法における応用に有用である（
たとえば、米国特許第７，３４８，００４号、第７，４０４，９５６号、および、第７，
８６２，８２０号を参照のこと）。対照的に、ＦｃＲｎ結合アフィニティが減少したＦｃ
変異体は、短い半減期を有することが予期され、そのような分子はまた、たとえば、短時
間の循環が有利である場合（たとえば、ｉｎ ｖｉｖｏ診断イメージング、または、開始
ポリペプチドが長い期間、循環系に存在すると、毒性のある副作用がある場合）の哺乳類
への投与に有用である。ＦｃＲｎ結合アフィニティが減少したＦｃ変異体はまた、胎盤を
通過する可能性が少なく、ゆえに、妊娠した女性における疾患または障害の処置に有用で
ある。さらに、ＦｃＲｎ結合アフィニティの減少が望ましい他の応用として、脳、腎臓、
および／または肝臓への局在が望まれるアプリケーションが挙げられる。１つの例示的な
実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、脈管系から腎臓糸球体上皮を超える輸
送の減少を示す。他の実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、脳から血管腔内
への、血液脳関門（ＢＢＢ）を超える輸送の減少を示す。１つの実施態様において、Ｆｃ
Ｒｎ結合が変換したタンパク質は、Ｉｇ定常領域の「ＦｃＲｎ結合ループ」内に、１以上
のアミノ酸置換を有する、少なくとも１つのＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナー（た
とえば、１または２のＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナー）を含有する。ＦｃＲｎ結
合ループは、野生型、全長Ｆｃ領域のアミノ酸残基２８０～２９９（ＥＵナンバリングに
従う）から構成されている。他の実施態様において、改変されたＦｃＲｎ結合アフィニテ
ィを有する本発明のキメラタンパク質のＩｇ定常領域またはその一部は、１５ÅのＦｃＲ
ｎ「接触域」内に、１以上のアミノ酸置換を有する、少なくとも１つのＦｃ領域またはＦ
ｃＲｎ結合パートナーを含有する。本明細書において、１５ÅのＦｃＲｎ「接触域」とい
う用語には、野生型、全長Ｆｃ部分の以下の位置の残基を含む：２４３－２６１、２７５
－２８０、２８２－２９３、３０２－３１９、３３６－３４８、３６７、３６９、３７２
－３８９、３９１、３９３、４０８、４２４、４２５－４４０（ＥＵナンバリングに従う
）。他の実施態様において、改変されたＦｃＲｎ結合アフィニティを有する本発明のＩｇ
定常領域またはその一部は、以下のＥＵ位のうちの任意の１つに相当するアミノ酸の位置
で、１以上のアミノ酸置換を有するＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーを少なくとも
１つ含有する：２５６、２７７－２８１、２８３－２８８、３０３－３０９、３１３、３
３８、３４２、３７６、３８１、３８４、３８５、３８７、４３４（たとえば、Ｎ４３４
ＡまたはＮ４３４Ｋ）、および４３８。ＦｃＲｎ結合活性を変化させる例示的なアミノ酸
置換は、国際特許出願公開ＷＯ０５／０４７３２７（参照により、本明細書に援用される
）に開示されている。
本発明に用いられるＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーはまた、キメラタンパク質
のグリコシル化を変える、当分野公知のアミノ酸置換を含有してもよい。たとえば、ＶＷ
Ｆ断片またはＦＶＩＩＩタンパク質に連結されたキメラタンパク質のＦｃ領域またはＦｃ
Ｒｎ結合パートナーは、グリコシル化（たとえば、Ｎ結合型グリコシル化またはＯ結合型
グリコシル化）の減少をもたらす変異を含有してもよく、または、野生型Ｆｃ部分の改変
糖型を含有しても良い（たとえば、低フコース、またはフコースのないグリカン）。
１つの実施態様において、本発明のプロセッシングを受けていないキメラタンパク質は
、本明細書に記述されるＩｇ定常領域またはその一部から独立して選択される、その構成
Ｉｇ定常領域またはその一部を２つ以上有する、遺伝子融合されたＦｃ領域（すなわち、
ｓｃＦｃ領域）を含有してもよい。１つの実施態様において、二量体Ｆｃ領域のＦｃ領域
は、同一である。他の実施態様において、Ｆｃ領域のうちの少なくとも２つは、異なって
いる。たとえば、本発明のタンパク質のＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーは、同数
のアミノ酸残基を含有し、または、それらは、１以上のアミノ酸残基により長さが異なっ
ていても良い（たとえば、約５アミノ酸残基（たとえば、１、２、３、４または５アミノ
酸残基）、約１０残基、約１５残基、約２０残基、約３０残基、約４０残基、または約５
０残基により）。さらに他の実施態様において、本発明のタンパク質のＦｃ領域またはＦ
ｃＲｎ結合パートナーは、１以上のアミノ酸の位置で、配列が異なっていても良い。たと
えば、Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーのうちの少なくとも２つは、約５アミノ酸
の位置（たとえば、１、２、３、４または５アミノ酸の位置）、約１０の位置、約１５の
位置、約２０の位置、約３０の位置、約４０の位置、または約５０の位置で、異なってい
ても良い。
Ｅ） リンカー
本発明のキメラタンパク質はさらに、１以上のリンカーを含有する。リンカーのうちの
１つのタイプは、対象にｉｎ ｖｉｖｏで投与された際に、様々なプロテアーゼにより、
（たとえば、凝固部位で）、開裂されることができる、開裂可能なリンカーである。１つ
の実施態様において、開裂可能なリンカーにより、凝固カスケードが発生している部位で
の、キメラタンパク質からの部分（たとえば、ＶＷＦ断片）の開裂が可能となり、それに
よって、活性化されたＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩａ）が、そのＦＶＩＩＩａ活性を有するよ
うになる。他のタイプのリンカーは、細胞内開裂部位を含有するプロセッシング可能なリ
ンカーであり、それにより、宿主細胞内の細胞内プロセッシング酵素により開裂されるこ
とができ、ポリペプチドの簡便な発現およびキメラタンパク質の形成が可能となる。
１以上のリンカーが、キメラタンパク質中の任意の２つのタンパク質の間に存在しても
よい。１つの実施態様において、キメラタンパク質は、（ｉ）ＶＷＦ断片、（ｉｉ）ＸＴ
ＥＮ配列、（ｉｉｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質を含有し、ここで、ＶＷＦ断片は、リンカー
（たとえば、開裂可能なリンカー）によりＸＴＥＮ配列に連結されており、および、ＸＴ
ＥＮ配列はさらに、ＦＶＩＩＩタンパク質に連結されている（すなわち、Ｖ－Ｌ－Ｘ－Ｆ
ＶＩＩＩ）。他の実施態様において、キメラタンパク質は、（ｉ）ＶＷＦ断片、（ｉｉ）
ＸＴＥＮ配列、および、（ｉｉｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質を含有し、ここで、ＶＷＦ断片
はＸＴＥＮ配列に連結されており、および、ＸＴＥＮ配列は、リンカー（たとえば、開裂
可能なリンカー）によりＦＶＩＩＩに連結されている（すなわち、Ｖ－Ｘ－Ｌ－ＦＶＩＩ
Ｉ）。
ある実施態様において、キメラタンパク質は、（ｉ）ＶＷＦ断片、（ｉｉ）ＸＴＥＮ配
列、および、（ｉｉｉ）第一のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第一のＦｃ領域
）、（ｉｖ）ＦＶＩＩＩタンパク質、および、（ｖ）第二のＩｇ定常領域またはその一部
（たとえば、第二のＦｃ領域）を含有し、ここで、ＶＷＦ断片は任意選択的なリンカー（
たとえば、開裂可能なリンカー）によりＸＴＥＮ配列に連結されている。ＸＴＥＮ配列は
さらに、リンカー（たとえば、開裂可能なリンカー）により第一のＩｇ定常領域またはそ
の一部に連結されていてもよい。ＦＶＩＩＩタンパク質（ＸＴＥＮ配列を含む、または含
まない）もまた、任意選択的なリンカー（たとえば、開裂可能なリンカー）により、第二
のＩｇ定常領域またはその一部に連結されていてもよい。ある実施態様において、キメラ
タンパク質はさらに、１以上のリンカー（たとえば、プロセッシング可能なリンカー）を
、第一のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば第一のＦｃ領域）と、第二のＩｇ定常領
域またはその一部（たとえば第二のＦｃ領域）の間、ＶＷＦ断片と第二のＩｇ定常領域ま
たはその一部の間、または、ＦＶＩＩＩタンパク質と第一のＩｇ定常領域またはその一部
（たとえば、第一のＦｃ領域）の間に、含有する。
一部の実施態様において、本発明は、（ｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質、（ｉｉ）ＸＴＥＮ
配列、（ｉｉｉ）第一のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第一のＦｃ領域）、お
よび、（ｉｖ）第二のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第二のＦｃ領域）を含有
し、ここで、第一のＩｇ定常領域またはその一部、および第二のＩｇ定常領域またはその
一部は、プロセッシング可能なリンカーにより連結されている。
本発明に有用なリンカーは、任意の有機分子を含有してもよい。１つの実施態様におい
て、リンカーは、ポリマー（たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））または、ヒ
ドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）を含有する。他の実施態様において、リンカーは、ア
ミノ酸配列を含有する。リンカーは、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０
、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７０
０、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、
１６００、１７００、１８００、１９００、または、２０００アミノ酸を含有してもよい
。リンカーは、１～５アミノ酸、１～１０アミノ酸、１～２０アミノ酸、１０～５０アミ
ノ酸、５０～１００アミノ酸、１００～２００アミノ酸、２００～３００アミノ酸、３０
０～４００アミノ酸、４００～５００アミノ酸、５００～６００アミノ酸、６００～７０
０アミノ酸、７００～８００アミノ酸、８００～９００アミノ酸、または、９００～１０
００アミノ酸を含有してもよい。１つの実施態様において、リンカーは、ＸＴＥＮ配列を
含有する。追加例のＸＴＥＮを本発明に従い用いても良く、米国特許出願公開２０１０／
０２３９５５４ Ａ１、２０１０／０３２３９５６ Ａ１、２０１１／００４６０６０
Ａ１、２０１１／００４６０６１ Ａ１、２０１１／００７７１９９ Ａ１、もしくは、
２０１１／０１７２１４６ Ａ１、または、国際特許出願公開ＷＯ２０１００９１１２２
Ａ１、ＷＯ２０１０１４４５０２ Ａ２、ＷＯ２０１０１４４５０８ Ａ１、ＷＯ２０
１１０２８２２８ Ａ１、ＷＯ２０１１０２８２２９ Ａ１、もしくは、ＷＯ２０１１０
２８３４４ Ａ２に開示されている。他の実施態様において、リンカーは、ＰＡＳ配列で
ある。
本発明に有用なリンカーは、任意の有機分子を含有してもよい。１つの実施態様におい
て、リンカーは、ポリマー（たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））または、ヒ
ドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）である。他の実施態様において、リンカーは、アミノ
酸配列である。リンカーは、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、
８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８０
０、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００
、１７００、１８００、１９００、または、２０００アミノ酸を含有してもよい。リンカ
ーは、１～５アミノ酸、１～１０アミノ酸、１～２０アミノ酸、１０～５０アミノ酸、５
０～１００アミノ酸、１００～２００アミノ酸、２００～３００アミノ酸、３００～４０
０アミノ酸、４００～５００アミノ酸、５００～６００アミノ酸、６００～７００アミノ
酸、７００～８００アミノ酸、８００～９００アミノ酸、または、９００～１０００アミ
ノ酸を含有してもよい。
リンカーの例は、当分野に公知である。１つの実施態様において、リンカーは、配列Ｇ
ｎを含有する。リンカーは、配列（ＧＡ）ｎを含有してもよい。リンカーは、配列（ＧＧ
Ｓ）ｎを含有してもよい。他の実施態様において、リンカーは、配列（ＧＧＧＳ）ｎ（配
列番号５７）を含有する。さらに他の実施態様において、リンカーは、配列（ＧＧＳ）ｎ
（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５８）を含有する。これらの例において、ｎは、１～１００
の整数であってもよい。他の例において、ｎは、１～２０の整数、すなわち、１、２、３
、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、
１９、または２０であっても良い。リンカーの例としては、限定されないが、ＧＧＧ、Ｓ
ＧＧＳＧＧＳ（配列番号５９）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号６０）、Ｇ
ＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６１）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧ
ＧＳ（配列番号６２）、またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６３）が挙げ
られる。リンカーは、ＶＷＦ断片の活性または第ＶＩＩＩ因子の凝固活性を消去または減
少させない。任意選択的に、リンカーは、たとえば、立体障害の影響をさらに減少させ、
ＶＷＦ断片または第ＶＩＩＩ因子タンパク質を、その標的結合部位へより接近しやすくさ
せることにより、ＶＷＦ断片の活性または第ＶＩＩＩ因子タンパク質の凝固活性を増強す
る。
１つの実施態様において、キメラタンパク質に有用なリンカーは、１５～２５アミノ酸
の長さである。他の実施態様において、キメラタンパク質に有用なリンカーは、１５～２
０アミノ酸の長さである。一部の実施態様において、キメラタンパク質のリンカーは、１
０～２５アミノ酸の長さである。他の実施態様において、キメラタンパク質のリンカーは
、１５アミノ酸の長さである。さらに他の実施態様において、キメラタンパク質のリンカ
ーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号６４）であり、ここでＧは、グリシンを表し、Ｓはセ
リンを表し、そしてｎは、１～２０の整数である。
Ｆ）開裂部位
リンカーはまた、他分子から１分子を放出させるために、化学的に（たとえば、エステ
ル結合の加水分解等）、酵素的に（すなわち、プロテアーゼ開裂配列の組み込み）、また
は光分解（たとえば、３－アミノ－３－（２－ニトロフェニル）プロピオン酸（ＡＮＰ）
）のいずれかで開裂することができる部分を組み込んでもよい。
１つの実施態様において、リンカーは、開裂可能なリンカーである。開裂可能なリンカ
ーは、Ｎ末端もしくはＣ末端またはその両方で、１以上開裂部位を含有してもよい。他の
実施態様において、開裂可能なリンカーは、１以上の開裂可能な部位から本質的になる、
または、からなる。他の実施態様において、開裂可能なリンカーは、本明細書に記述され
る異種アミノ酸リンカー配列、または、ポリマー、および１以上の開裂可能な部位を含有
する。
ある実施態様において、開裂可能なリンカーは、宿主細胞中で開裂することができる１
以上の開裂部位（すなわち、細胞内プロセッシング部位）を芽乳する。開裂部位の非限定
的な例として、ＲＲＲＲ（配列番号９）、ＲＫＲＲＫＲ（配列番号１０）、およびＲＲＲ
ＲＳ（配列番号１１）が挙げられる。
他の実施態様において、開裂可能なリンカーは、当該開裂可能なリンカーを含有するキ
メラタンパク質が対象に投与された後にプロテアーゼにより開裂される、１以上の開裂部
位を含有する。１つの実施態様において、開裂部位は、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、
カリクレイン、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＩＩａ因子（トロンビン
）、エラスターゼ２、ＭＭＰ－１２、ＭＭＰ－１３、ＭＭＰ－１７およびＭＭＰ－２０か
らなる群から選択されるプロテアーゼにより開裂される。他の実施態様において、開裂部
位は、ＸＩａ開裂部位（たとえば、ＫＬＴＲ↓ＡＥＴ（配列番号６５））、ＦＸＩａ開裂
部位（たとえば、ＤＦＴＲ↓ＶＶＧ（配列番号６６））、ＦＸＩＩａ開裂部位（たとえば
、ＴＭＴＲ↓ＩＶＧＧ（配列番号６７））、カリクレイン開裂部位（たとえば、ＳＰＦＲ
↓ＳＴＧＧ（配列番号６８））、ＦＶＩＩａ開裂部位（たとえば、ＬＱＶＲ↓ＩＶＧＧ（
配列番号６９））、ＦＩＸａ開裂部位（たとえば、ＰＬＧＲ↓ＩＶＧＧ（配列番号７０）
）、ＦＸａ開裂部位（たとえば、ＩＥＧＲ↓ＴＶＧＧ（配列番号７１））、ＦＩＩａ（ト
ロンビン）開裂部位（たとえば、ＬＴＰＲ↓ＳＬＬＶ（配列番号７２））、エラスターゼ
－２開裂部位（たとえば、ＬＧＰＶ↓ＳＧＶＰ（配列番号７３））、グランザイム－Ｂ開
裂（たとえば、ＶＡＧＤ↓ＳＬＥＥ（配列番号７４））、ＭＭＰ－１２開裂部位（たとえ
ば、ＧＰＡＧ↓ＬＧＧＡ（配列番号７５））、ＭＭＰ－１３開裂部位（たとえば、ＧＰＡ
Ｇ↓ＬＲＧＡ（配列番号７６））、ＭＭＰ－１７開裂部位（たとえば、ＡＰＬＧ↓ＬＲＬ
Ｒ（配列番号７７））、ＭＭＰ－２０開裂部位（たとえば、ＰＡＬＰ↓ＬＶＡＱ（配列番
号７８））、ＴＥＶ開裂部位（たとえば、ＥＮＬＹＦＱ↓Ｇ（配列番号７９））、エンテ
ロキナーゼ開裂部位（たとえば、ＤＤＤＫ↓ＩＶＧＧ（配列番号８０））、プロテアーゼ
３Ｃ（ＰＲＥＳＣＩＳＳＩＯＮ（登録商標））開裂部位（たとえば、ＬＥＶＬＦＱ↓ＧＰ
（配列番号８１））、およびソルターゼＡ開裂部位（たとえば、ＬＰＫＴ↓ＧＳＥＳ）（
配列番号８２）からなる群から選択される。ある実施態様において、ＦＸＩａ開裂部位と
しては、限定されないが、たとえば、ＴＱＳＦＮＤＦＴＲ（配列番号８３）およびＳＶＳ
ＱＴＳＫＬＴＲ（配列番号８４）が挙げられる。トロンビン開裂部位の非限定的な例とし
ては、たとえば、ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ（配列番号８５）、ＴＴＫＩＫＰＲ（配列番号８
６）、またはＬＶＰＲＧ（配列番号８７）、および、ＡＬＲＰＲ（配列番号１７）、（た
とえば、ＡＬＲＰＲＶＶＧＧＡ（配列番号８８））を含有する、本質的にからなる、また
は、からなる配列が挙げられる。
特定の実施態様において、開裂部位は、ＴＬＤＰＲＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥ
ＤＥＥＫ（配列番号８）である。
ポリヌクレオチド、ベクター、および宿主細胞
本発明において、本明細書に記述される、（ａ）ＸＴＥＮ配列およびＦＶＩＩＩタンパ
ク質に連結されたＶＷＦ断片、（ｂ）ＸＴＥＮ配列およびＦｃに連結されたＦＶＩＩＩタ
ンパク質、または、（ｃ）ＸＴＥＮ配列およびＶＷＦ断片に連結されるＦＶＩＩＩタンパ
ク質、もまた開示される。キメラタンパク質が一本鎖ポリペプチドである場合（たとえば
、Ｆ２－Ｌ２－Ｘ－Ｖ－Ｌ１－Ｆ１－ＦＶＩＩＩであり、ここで、ＦＶＩＩＩタンパク質
はＦＶＩＩＩタンパク質を含有し、Ｆ１は第一のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば
、第一のＦｃ領域）を含有し、Ｌ１は第一のリンカーを含有し、ＶはＶＷＦ断片を含有し
、ＸはＸＴＥＮ配列を含有し、Ｌ２は第二のリンカーを含有し、および、Ｆ２は第二のＩ
ｇ定常領域またはその一部（たとえば、第二のＦｃ領域）を含有する）、本発明は、一本
鎖ポリペプチドをコードする一本鎖ポリヌクレオチドを含有する。キメラタンパク質が第
一および第二のポリペプチド鎖を含有する場合（Ｆ２－Ｌ２－Ｘ－Ｖ：ＦＶＩＩＩ－Ｆ１
）、第一のポリペプチド鎖はＸＴＥＮ配列に連結されたＶＷＦ断片を含有し、それはさら
に、開裂可能なリンカーにより第一のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第一のＦ
ｃ領域）に連結され（たとえば、Ｆ２－Ｌ２－Ｘ－Ｖ）、および、第二のポリペプチド鎖
はＦＶＩＩＩタンパク質および第二のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第二のＦ
ｃ領域）を含有し（たとえば、ＦＶＩＩＩ－Ｆ１）、ここで、第一のポリペプチド鎖およ
び第二のポリペプチド鎖は互いに関連し、ポリヌクレオチドは第一のヌクレオチド配列お
よび第二のヌクレオチド配列を含有してもよい。１つの実施態様において、第一のポリペ
プチド鎖および第二のポリペプチド鎖は、一本鎖ポリヌクレオチドによりコードされても
よい。他の実施態様において、第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖は、２
つの異なるポリヌクレオチド（すなわち、第一のヌクレオチド配列および第二のヌクレオ
チド配列）によりコードされる。他の実施態様において、第一のヌクレオチド配列および
第二のヌクレオチド配列は、２つの異なるポリヌクレオチド上にある（たとえば、異なる
ベクター）。ある実施態様において、本発明は、第一のヌクレオチド鎖および第二のヌク
レオチド鎖を含有するポリヌクレオチドのセットを目的とするものであり、ここで、第一
のヌクレオチド鎖は、キメラタンパク質のＶＷＦ断片をコードし、および、第二のヌクレ
オチド鎖は、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする。一部の実施態様において、２つのポリ
ペプチド鎖または３つのポリペプチド鎖を含有するキメラタンパク質は、一本鎖ポリヌク
レオチドによりコードされ、次いで、２または３（またはそれ以上）のポリペプチド鎖に
プロセッシングされてもよい。さらに他の実施態様において、これらのポリペプチド鎖を
含有するキメラタンパク質は、２または３のポリヌクレオチド鎖によりコードされてもよ
い。
他の実施態様において、ポリヌクレオチドのセットはさらに、タンパク質転換酵素をコ
ードする、追加のヌクレオチド鎖（たとえば、キメラポリペプチドが一本鎖ポリヌクレオ
チドによりコードされる場合の第二のヌクレオチド鎖、または、キメラタンパク質が２つ
のポリヌクレオチド鎖によりコードされる場合の、第三のヌクレオチド鎖）を含有する。
タンパク質転換酵素は、前駆タンパク質転換酵素サブチリシン（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）
／５型ケキシン（ＰＣＳＫ５またはＰＣ５）、前駆タンパク質転換酵素サブチリシン／７
型ケキシン（ＰＣＳＫ７またはＰＣ５）、酵母Ｋｅｘ２、前駆タンパク質転換酵素サブチ
リシン／３型ケキシン（ＰＡＣＥまたはＰＣＳＫ３）、およびそれらの２以上の組み合わ
せからなる群から選択されてもよい。一部の実施態様において、タンパク質転換酵素は、
ＰＡＣＥ、ＰＣ５、またはＰＣ７である。特定の実施態様において、タンパク質転換酵素
は、ＰＣ５またはＰＣ７である。国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４３５６８を参
照のこと。
本明細書において、発現ベクターとは、適切な宿主細胞へと導入された際に、挿入され
たコード配列の転写および翻訳に必要な要素を含有する任意の核酸構築物を指し、ＲＮＡ
ウイルスベクターの場合には、適切な宿主細胞へと導入された際に、複製および翻訳にと
って必要な要素を含有する任意の核酸構築物を指す。発現ベクターは、プラスミド、ファ
ージミド、ウイルスおよびその誘導体が含まれる。
本発明の発現ベクターは、本明細書に記述されるキメラタンパク質をコードするポリヌ
クレオチドを含有する。１つの実施態様において、ＶＷＦ断片およびＸＴＥＮ、ＦＶＩＩ
Ｉタンパク質およびＸＴＥＮ、またはその両方に対するコード配列のうちの１つ以上が、
発現制御配列に作動可能に連結されている。本明細書において、各構成核酸配列がその機
能性を保持するように共有結合的に連結されている場合、２つの核酸配列が作動可能に連
結されている。遺伝子発現制御配列の影響の下、または制御の下で、コード配列の発現ま
たは転写および／もしくは翻訳が発生するように共有結合的に連結されている場合、コー
ド配列および遺伝子発現制御配列は作動可能に連結されているとみなされる。もし、５´
遺伝子発現配列のプロモーターの誘導によってコード配列の転写が生じ、および、２つの
ＤＮＡ配列の間の連結の性質によって、（１）フレームシフト変異の導入がもたらされな
い、（２）コード配列の転写を誘導するプロモーター領域の活性が妨げられない、または
、（３）タンパク質へと翻訳される、対応するＲＮＡ転写物の活性が妨げられない、場合
に、２つのＤＮＡ配列は、作動可能に連結されているとみなされる。ゆえに、もし、遺伝
子発現配列が、コード核酸配列の転写を生じさせることができ、それによって、得られた
転写物が所望されるタンパク質またはポリペプチドへと翻訳される場合には、その遺伝子
発現配列は、コード核酸配列に作動可能に連結されている。
本明細書において、遺伝子発現制御配列は、たとえば、プロモーター配列または、プロ
モーター－エンハンサーの組み合わせ等の、任意の制御性ヌクレオチド配列であり、それ
らが作動可能に連結されているコード核酸の効率的な転写および翻訳を促進する。遺伝子
発現制御配列は、たとえば、哺乳類またはウイルスプロモーター（たとえば、構造性プロ
モーターまたは誘導性プロモーター）であってもよい。構造性哺乳類プロモーターとして
は、限定ｓあれないが、以下の遺伝子に対するプロモーターが挙げられる：ヒポキサンチ
ンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン
酸キナーゼ、βアクチンプロモーター、および他の構造性プロモーター。真核細胞におい
て構造的に機能するウイルスプロモーターの例としては、たとえば、サイトメガロウイル
ス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス（たとえば、ＳＶ４０）、パピローマウイルス、アデノ
ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイル
ス、モロニー白血病ウイルスの末端反復配列（ＬＴＲ）、および他のレトロウイルス由来
のプロモーター、および単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが挙げら
れる。他の構造性プロモーターも、当業者に公知である。本発明の遺伝子発現配列として
有用なプロモーターとしてはまた、誘導性プロモーターが挙げられる。誘導性プロモータ
ーは、誘導剤の存在下で発現される。たとえば、メタロチオネインプロモーターは、ある
金属イオンの存在下で、転写および翻訳を促進するように誘導される。他の誘導性プロモ
ーターも、当業者に公知である。
一般的に、遺伝子発現制御配列として、必要に応じて、転写および翻訳の開始に関与す
る、それぞれ、５´非転写配列および５´非翻訳配列（たとえば、ＴＡＴＡボックス、キ
ャップ配列、ＣＡＡＴ配列等）が含まれる。特に、そのような５´非転写配列は、作動可
能に接続されたコード核酸の転写制御に対するプロモーター配列を含む、プロモーター領
域を含有する。遺伝子発現配列は、任意選択的に、エンハンサー配列、または、所望され
る上流の活性化配列を含有する。
ウイルスベクターとしては、限定されないが、以下のウイルス由来の核酸配列が挙げら
れる：たとえば、モロニーマウス白血病ウイルス、Ｈａｒｖｅｙマウス肉腫ウイルス、マ
ウス乳腺腫瘍ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス；アデノウイルス、アデノ随伴ウイル
ス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス；パ
ピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；および、
たとえばレトロウイルス等のＲＮＡウイルス。当分野公知の他のベクターも容易に使用す
ることができる。あるウイルスベクターは、非必須遺伝子が、対象の遺伝子と置換されて
いる、非細胞変性の真核生物ウイルスに基づいている。非細胞変性ウイルスとしては、レ
トロウイルスが挙げられ、そのライフサイクルには、ゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの
逆転写、次いで、宿主細胞ＤＮＡへのプロウイルス融合が含まれている。レトロウイルス
は、ヒト遺伝子治療の治験が承認されている。最も有用なレトロウイルスは、複製欠損し
ているレトロウイルス（すなわち、所望されるタンパク質の合成を誘導することはできる
が、感染性粒子の製造を行うことはできない）である。そのような遺伝子改変されたレト
ロウイルス発現ベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて高効率で遺伝子を形質導入するとい
う様々な実用性を有する。複製欠損レトロウイルス製造の標準的なプロトコール（外来性
遺伝子物質のプラスミドへの組み込み、プラスミドを有するパッケージング細胞株のトラ
ンスフェクション、パッケージング細胞株による組換えレトロウイルスの産生、組織培養
培地からのウイルス粒子の回収、および標的細胞へのウイルス粒子の感染、の工程を含む
）は、Kriegler,M.,Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual,W.H. Freema
n Co., NewYork(1990)、および、Murry, E. J.,Methods in Molecular Biology, Vol.
7, HumanaPress, Inc., Cliffton, N.J. (1991)に提示されている。
１つの実施態様において、ウイルスは、アデノ随伴ウイルス、二本鎖ＤＮＡウイルスで
ある。アデノ随伴ウイルスは遺伝子操作して、複製欠損とすることができ、そして、広範
囲の細胞型および種に感染することができる。さらに、たとえば熱安定性および油性溶媒
安定性；多様な系統の細胞（造血系細胞を含む）における、高い形質導入頻度；重複感染
阻害の欠落により、複数種の形質導入が可能、等の利点を有する。報告によると、アデノ
随伴ウイルスは、部位特異的な様式でヒト細胞ＤＮＡへ組み込むことができ、それにより
、挿入による突然変異の可能性および、レトロウイルス感染による、挿入遺伝子発現の特
性の変動の可能性を最小限とすることができる。さらに野生型のアデノ随伴ウイルスの感
染は、選択圧力無しで、１００回超の組織培養継代において観察されていることから、ア
デノ随伴ウイルスのゲノム組み込みは、比較的安定な事象であることが暗示される。アデ
ノ随伴ウイルスはまた、染色体外の環境でも機能することができる。
他のベクターとしては、プラスミドベクターが挙げられる。プラスミドベクターは、当
分野で広範囲に評価され、当業者に公知である。たとえば、Sambrook etal., Molecular
Cloning: ALaboratory Manual,Second Edition, Cold Spring Harbor LaboratoryPress,
1989を参照のこと。ここ数年において、プラスミドベクターは宿主ゲノム内を置換す
ることができず、および宿主ゲノム内に組み込まれることができないことから、ｉｎ ｖ
ｉｖｏで細胞へと遺伝子を送達する場合において特に有利であることが判明している。し
かしながら、宿主細胞と同等のプロモーターを有するこれらのプラスミドは、プラスミド
内に作動可能にコードされた遺伝子からペプチドを発現することができる。市販されてい
る、普遍的に用いられているプラスミドのいくつかを挙げると、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１
８、ｐＵＣ１９、様々なｐｃＤＮＡプラスミド、ｐＲＣ／ＣＭＶ、様々なｐＣＭＶプラス
ミド、ｐＳＶ４０、および、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔがある。具体的なプラスミドの追加
例としては、ｐｃＤＮＡ３．１、カタログ番号Ｖ７９０２０；ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇ
ｒｏ、カタログ番号Ｖ８７０２０；ｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ－Ｈｉｓ、カタログ番号Ｖ８６
３２０；および、ｐＢｕｄＣＥ４．１、カタログ番号Ｖ５３２２０（すべて、Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ （Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ．）より入手）が挙げられる。他のプラスミド
も、当業者に公知である。さらに、標準的な分子生物学的技法を用いてプラスミドのカス
タム設計を行い、特定のＤＮＡ断片を除去および／または付加してもよい。
本発明のタンパク質を産生するために用いられうる、１つの昆虫発現システムにおいて
、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を
ベクターとして用いて、外来性遺伝子を発現する。ウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ
ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞中で成長する。コード配列は、ウイルスの非必須領域（たとえ
ば、多角体（ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｎ）遺伝子）へとクローニングされ、ＡＣＮＰＶプロモ
ーター（たとえば、多角体（ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｎ）プロモーター）の制御下に置かれて
も良い。コード配列が成功裏に挿入されると、多角体遺伝子の不活化および非閉塞ウイル
スの産生（すなわち、多角体遺伝子によりコードされるタンパク質性のコートを欠損する
ウイルス）がもたらされる。次いで、これらの組換えウイルスを用いて、挿入遺伝子が発
現されるＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞を感染させる。（たとえば、
Smithet al.(1983) J Virol 46:584；米国特許第４，２１５，０５１号を参照のこと）
。この発現システムのさらなる例は、Ausubel etal., eds. (1989) Current Protocols i
nMolecularBiology, Vol. 2, Greene Publish.Assoc. & Wiley Interscienceに見出すこ
とができる。
本発明のタンパク質を発現するために用いることができる他のシステムは、グルタミン
合成酵素遺伝子発現システム（「ＧＳ発現システム」とも呼称される（Ｌｏｎｚａ Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃｓ ＰＬＣ， Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ ＵＫ））である。この発現システムは
、米国特許第５，９８１，２１６号に詳述されている。
哺乳類宿主細胞においては、多くのウイルスベースの発現システムを用いることができ
る。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、コード配列は、アデノウイルス転
写／翻訳制御複合体（たとえば、後期プロモーターおよび三連リーダー配列）へとライゲ
ートされてもよい。次いで、このキメラ遺伝子を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖ
ｏの遺伝子組み換えにより、アデノウイルスゲノムに挿入してもよい。ウイルスゲノムの
非必須領域（たとえば、Ｅ１またはＥ３領域）への挿入により、感染宿主内で生存するこ
とができ、およびペプチドを発現することができる、組換えウイルスが得られる。たとえ
ば、Logan&Shenk (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:3655)を参照のこと。あるいは、
ワクシニア７．５Ｋプロモーターを用いてもよい。たとえば、Mackettet al. (1982) Pro
c Natl Acad SciUSA 79:7415;Mackett et al. (1984) J Virol49:857; Panicali et al.
(1982) ProcNatl Acad Sci USA 79:4927を参照のこと。
産生効率を上げるために、酵素開裂部位により分離された、本発明のタンパク質の複数
のユニットをコードするようにポリヌクレオチドを設計してもよい。得られたポリペプチ
ドを開裂して（たとえば、適切な酵素で処理することにより）、ポリペプチド単位で回収
することができる。これにより、１つのプロモーターにより為されるポリペプチドの産生
量を増加させることができる。適切なウイルス発現システムを用いた場合、ｍＲＮＡによ
りコードされる各ポリペプチドの翻訳は、転写物の内部で指示される（たとえば、内部リ
ボソーム侵入部位、ＩＲＥＳ）。従って、ポリシストロニックな構築物は、単一の、大き
なポリシストロニックのｍＲＮＡの転写を指示し、同様に、複数の、個々のポリペプチド
の翻訳を指示する。この方法により、ポリプロテインの産生および酵素処理が省略され、
１つのプロモーターによりなされるポリペプチドの産生量が著しく増加しうる。
形質転換に用いられるベクターは通常、形質転換体を特定するために用いられる選択マ
ーカーを含有する。昆虫システムにおいては、たとえばアンピシリンまたはカナマイシン
等の抗生物質抵抗性遺伝子が挙げられる。培養哺乳類細胞に用いるための選択マーカーと
しては、薬物（たとえば、ネオマイシン、ハイグロマイシン、およびメトトレキサート等
）に対する抵抗性を寄与する遺伝子が挙げられる。選択マーカーは、増幅可能な選択マー
カーであっても良い。１つの増幅可能な選択マーカーは、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦ
Ｒ）遺伝子である。SimonsenCC et al. (1983) Proc Natl Acad SciUSA 80:2495-9。選
択マーカーは、Thilly(1986)Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers,Sto
neham, Mass.により、概説されており、選択マーカーの選択は、当業者レベルの範囲内
である。
選択マーカーは、対象の遺伝子と同時に、別々のプラスミド上で、細胞内へと導入され
てもよく、または、同じプラスミド上で導入されてもよい。もし同じプラスミド上にある
場合、選択マーカーおよび対象遺伝子は、異なるプロモーターの制御下にあっても、同一
のプロモーターの制御下にあってもよく、後者の配置の場合には、ジシストロニックなメ
ッセンジャーが産生される。このタイプの構築物は当業者公知である（たとえば、米国特
許第４，７１３，３３９号）。
発現ベクターは、遺伝子組み換え的に産生されたタンパク質の精製を容易にするための
タグをコードしてもよい。例としては、限定されないが、発現されるタンパク質のコード
配列が、ｌａｃＺコード領域と共にインフレームでベクターへとライゲートされ、それに
よりタグ化された融合タンパク質が産生される、ｐＵＲ２７８が挙げられ（Rutheret al.
(1983)EMBO J 2:1791）；ｐＧＥＸベクターを用いて、本発明のタンパク質を、グルタ
チオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグと共に発現してもよい。これらのタンパク質
は通常可溶性であり、グルタチオン－アガロースビーズへ吸着させ、次いで、遊離グルタ
チオンの存在下で溶出することにより、細胞から容易に精製することができる。当該ベク
ターは、精製後にタグを容易に除去するために、開裂部位（トロンビン、または第Ｘａ因
子プロテアーゼ、またはＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ（登録商標）（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ， Ｐｅａｐａｃｋ， Ｎ．Ｊ．））を含有する。
次いで、発現ベクター（複数含む）を、ポリペプチドを発現する適切な標的細胞へとト
ランスフェクト、または共トランスフェクトする。当分野公知のトランスフェクション法
としては、限定されないが、リン酸カルシウム沈殿（Wigleret al. (1978) Cell 14:725
）、エレクトロポレーション（Neumann et al. (1982) EMBO J 1:841）、および、リポソ
ームベースの試薬が挙げられる。原核細胞および真核細胞の両方を含む、様々な宿主－発
現ベクターシステムを用いて、本明細書に記述されるタンパク質を発現させてもよい。こ
れらとしては、限定されないが、たとえば、適切なコード配列を含有する、組換えバクテ
リオファージＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（たとえ
ば、大腸菌）等の微生物；適切なコード配列を含有する、組換え酵母発現ベクターまたは
組換え真菌発現ベクターで形質転換された酵母または糸状菌；適切なコード配列を含有す
る、組換えウイルス発現ベクター（たとえば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞
システム；適切なコード配列を含有する、組換えウイルス発現ベクター（たとえば、カリ
フラワーモザイクウイルスまたはタバコモザイクウイルス）で感染させた、または、組換
えプラスミド発現ベクター（たとえば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された、植物細胞シ
ステム；または、哺乳類細胞（たとえば、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、Ｃｏｓ、ＨｅＬａ、Ｈ
ＫＢ１１、およびＢＨＫ細胞）を含む、動物細胞システムが挙げられる。
１つの実施態様において、宿主細胞は、真核細胞である。本明細書において、真核細胞
とは、限定的な核を有する任意の動物細胞または植物細胞を指す。動物の真核細胞として
は、脊椎動物（たとえば、哺乳類）の細胞、および無脊椎動物（たとえば、昆虫）の細胞
が挙げられる。植物の真核細胞では特に、限定されないが、酵母細胞を含むことができる
。真核細胞は原核細胞（たとえば、細菌）とは明確に異なる。
ある実施態様において、真核細胞は、哺乳類細胞である。哺乳類細胞は、哺乳類由来の
任意の細胞である。哺乳類細胞として特に、限定されないが、哺乳類細胞株が挙げられる
。１つの実施態様において、哺乳類細胞は、ヒトの細胞である。他の実施態様において、
哺乳類細胞は、ヒトの胎児腎細胞株である、ＨＥＫ２９３細胞である。ＨＥＫ２９３細胞
は、ＣＲＬ－１５３３として、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌ
ｅｃｔｉｏｎ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡから入手可能であり、または、２９３－Ｈ細
胞として、カタログ番号１１６３１－０１７で、または、２９３－Ｆ細胞として、カタロ
グ番号１１６２５－０１９として、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ， Ｃａｌ
ｉｆ．）から入手可能である。一部の実施態様において、哺乳類細胞は、網膜由来のヒト
細胞株である、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）である。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞は、Ｃ
ｒｕｃｅｌｌ（Ｌｅｉｄｅｎ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手可能である
。他の実施態様において、哺乳類細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で
ある。ＣＨＯ細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ．（たとえば、ＣＨＯ－Ｋ１；ＣＣＬ－６１）から入
手可能である。さらに他の実施態様において、哺乳類細胞は、ベビーハムスター腎臓（Ｂ
ＨＫ）細胞である。ＢＨＫ細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ．（たとえば、ＣＲＬ－１６３２）から
入手可能である。一部の実施態様において、哺乳類細胞は、ＨＥＫ２９３細胞とヒトＢ細
胞株のハイブリッド細胞株である、ＨＫＢ１１細胞である。Meiet al., Mol. Biotechnol
. 34(2): 165-78(2006)。
１つの実施態様において、ＦＶＩＩＩ（Ｘ）融合コード配列、ＶＷＦ断片－Ｌ－Ｆｃ融
合コード配列、またはそれら両方、および、選択マーカー（たとえば、ゼオシン（ｚｅｏ
ｃｉｎ）抵抗性）を含有するプラスミドが、キメラタンパク質産生のために、ＨＥＫ２９
３細胞へとトランスフェクトされる。
他の実施態様において、ＦＶＩＩＩ－Ｆｃ融合コード配列、ＶＷＦ断片－ＸＴＥＮ－Ｌ
－Ｆｃ融合コード配列、またはその両方、および選択マーカー（たとえば、ゼオシン抵抗
性）を含有するプラスミドを、キメラタンパク質の産生のために、ＨＥＫ２９３細胞へと
トランスフェクトする。
他の実施態様において、ＦＶＩＩＩ（Ｘ）－Ｆｃ融合コード配列、Ｆｃコード配列、ま
たはその両方、および選択マーカー（たとえば、ゼオシン抵抗性）を含有するプラスミド
を、キメラタンパク質の産生のために、ＨＥＫ２９３細胞へとトランスフェクトする。
一部の実施態様において、ＦＶＩＩＩ（Ｘ）－融合コード配列および第一の選択マーカ
ー（たとえば、ゼオシン抵抗性遺伝子）を含有する第一のプラスミド、ならびに、Ｆｃコ
ード配列またはＶＷＦ断片－Ｌ－Ｆｃコード配列および第二の選択マーカー（たとえば、
ネオマイシン抵抗性遺伝子）を含有する第二のプラスミド、ならびに、タンパク質転換酵
素コード配列および第三の選択マーカー（たとえば、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子）を
含有する第三のプラスミド、を、キメラタンパク質の産生のために、ＨＥＫ２９３細胞へ
とトランスフェクトする。第一および第二のプラスミドは、等量（すなわち、１：１のモ
ル比）で導入されてもよく、または、非等量で導入されてもよい。
さらに他の実施態様において、ＦＶＩＩＩ－Ｆｃ融合コード配列および第一の選択マー
カー（たとえば、ゼオシン抵抗性遺伝子）を含有する第一のプラスミド、ならびに、ＶＷ
Ｆ断片－ＸＴＥＮ－Ｌ－Ｆｃコード配列および第二の選択マーカー（たとえば、ネオマイ
シン抵抗性遺伝子）を含有する第二のプラスミド、ならびに、タンパク質転換酵素コード
配列および第三の選択マーカー（たとえば、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子）を含有する
第三のプラスミド、を、キメラタンパク質の産生のために、ＨＥＫ２９３細胞へとトラン
スフェクトする。第一および第二のプラスミドは、等量（すなわち、１：１のモル比）で
導入されてもよく、または、非等量で導入されてもよい。
さらに他の実施態様において、ＦＶＩＩＩ（Ｘ）－Ｆｃ融合コード配列および第一の選
択マーカー（たとえば、ゼオシン抵抗性遺伝子）を含有する第一のプラスミド、ならびに
、ＶＷＦ断片－ＸＴＥＮ－Ｌ－Ｆｃコード配列および第二の選択マーカー（たとえば、ネ
オマイシン抵抗性遺伝子）を含有する第二のプラスミド、ならびに、タンパク質転換酵素
コード配列および第三の選択マーカー（たとえば、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子）を含
有する第三のプラスミド、を、キメラタンパク質の産生のために、ＨＥＫ２９３細胞へと
トランスフェクトする。第一および第二のプラスミドは、等量（すなわち、１：１のモル
比）で導入されてもよく、または、非等量で導入されてもよい。
ある実施態様において、ＦＶＩＩＩ（ＸＴＥＮを伴う、または伴わない）－Ｆ１－Ｌ１
－Ｖ－ＸＴＥＮ－Ｌ２－Ｆ２コード配列および第一の選択マーカー（たとえば、ゼオシン
抵抗性遺伝子）を含有する第一のプラスミド、ならびに、タンパク質転換酵素コード配列
および第二の選択マーカー（たとえば、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子）を含有する第二
のプラスミド、を、キメラタンパク質の産生のために、ＨＥＫ２９３細胞へとトランスフ
ェクトする。ＦＶＩＩＩ（Ｘ）－Ｆｃコード配列およびＶＷＦ－ＸＴＥＮ－Ｆｃコード配
列に対するプロモーターは、異なっていてもよく、または、同一であっても良い。
さらに他の実施態様において、トランスフェクト細胞は、安定的にトランスフェクトさ
れている。当業者公知の標準的な技術を用いてこれらの細胞を選択し、安定細胞株として
維持してもよい。
タンパク質のＤＮＡ構築物を含有する宿主細胞を、適切な増殖培地中で増殖させる。本
明細書において、「適切な増殖培地」という用語は、細胞の増殖に必要とされる栄養素を
含有する培地を意味する。細胞増殖に必要とされる栄養素は、炭素源、窒素源、必須アミ
ノ酸、ビタミン、ミネラル、および増殖因子を含有してもよい。任意選択的に、培地は、
１以上の選択因子を含有してもよい。任意選択的に、培地は、仔牛血清またはウシ胎児血
清（ＦＣＳ）を含有しても良い。１つの実施態様において、培地は、実質的にＩｇＧを含
有しない。増殖培地は一般的に、たとえば、薬剤選択または必須栄養素の欠損（ＤＮＡ構
築物上の選択マーカーにより補完される、またはＤＮＡ構築物とともに共トランスフェク
トされる）等により、ＤＮＡ構築物を含有する細胞に対して選択される。培養哺乳類細胞
は通常、市販の血清含有培地、または無血清培地（たとえば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＤＭＥ
Ｍ／Ｆ１２等）で増殖する。１つの実施態様において、培地は、ＣＤ２９３（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ．）である。他の実施態様において、培地は、
ＣＤ１７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ．）である。使用する特
定の細胞株に対して適切な培地の選択は、当業者レベルの範囲内にある。
キメラタンパク質の２つのポリペプチド鎖を共発現させるために、宿主細胞を、両鎖の
発現が可能となるような条件下で培養する。本明細書において、培養する、とは、少なく
とも所定の時間、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生きている細胞を維持することを指す。維持とは、
生細胞群を必ずしも増殖させなくともよい。たとえば、培養で維持されている細胞は、数
に変化がなくてもよいが、生きており、所望の産物（たとえば、組換えタンパク質または
組換え融合タンパク質）を産生することができる。真核細胞培養のための適切な条件は当
分野で公知であり、培養培地の適切な選択、培地の補完、温度、ｐＨ、酸素飽和度等が含
まれる。商業目的に関しては、攪拌フラスコ、ローラーボトル、中空糸バイオリアクター
、攪拌タンクバイオリアクターエアリフトバイオリアクター、ウェーブバイオリアクター
等を含む、様々なタイプの任意のスケールアップシステムの使用を培養に含んでも良い。
また、細胞培養条件は、ＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質の関連が可能となるように
選択される。ＶＷＦ断片および／またはＦＶＩＩＩタンパク質の発現が可能となる条件に
は、ビタミンＫ源の存在が含まれうる。たとえば、１つの実施態様において、安定的トラ
ンスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞は、４ｍＭのグルタミンを補完されたＣＤ２９３培
地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ．）またはＯｐｔｉＣＨＯ培地
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ．）中で培養される。
１つの態様において、本発明は、ａ）キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含有する宿主細胞をトランスフェクトすること、および、ｂ）キメラタンパク質を発現
するために適した条件の下で培養培地中の宿主細胞を培養することであって、ここで、当
該キメラタンパク質は発現されている、ことを含む、本発明のキメラタンパク質を発現、
作製または製造する方法を目的とする。
さらなる実施態様において、ＸＴＥＮ配列に連結されたＶＷＦ断片、または、ＸＴＥＮ
配列に連結されたＦＶＩＩＩタンパク質を含有するタンパク質産物は、培地中に分泌され
る。培地を、細胞から分離し、濃縮し、ろ過し、次いで、２、または３のアフィニティカ
ラム（たとえば、プロテインＡ）および１または２の陰イオン交換カラムに通す。
ある態様において、本発明は、本明細書に記述される方法により製造されたキメラタン
パク質に関する。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ生産により、本発明の所望される改変ポリペプチドを大量に得るため
のスケールアップが可能となる。組織培養条件下での、哺乳類細胞培養の技法は当分野公
知であり、同種浮遊培養（たとえば、エアリフトバイオリアクター、または連続攪拌リア
クター等にて）、または、固定細胞培養またはエントラップ細胞培養（たとえば、中空糸
にて、マイクロカプセルにて、アガロースマイクロビーズ上で、またはセラミックカート
リッジ上で）が挙げられる。もし必要であれば、および／または、所望の場合には、ポリ
ペプチドの溶液を、通常のクロマトグラフィ法（たとえば、ゲルろ過、イオン交換クロマ
トグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）、ＤＥＡＥ－セルロースを通す
クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ等）により精製してもよい。
医薬組成物
本発明のキメラタンパク質を含有する組成物は、適切な薬学的に受容可能な担体を含有
してもよい。たとえば、活性化合物が、作用部位への送達のために設計された調製物へプ
ロセッシングされることを促進する、賦形剤および／または補助剤を含有してもよい。
医薬組成物は、ボーラス注入による非経口投与（すなわち、静脈内、皮下、または筋肉
内）のために処方されてもよい。注入のための剤型は、単位投与量の形態（たとえば、ア
ンプル、または防腐剤が添加された複数投与用容器）であってもよい。組成物は、油性も
しくは水性ビヒクル中の懸濁液、溶液または、乳濁液等の形態であってもよく、たとえば
、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤等の処方剤を含有してもよい。あるいは、活性
成分は、適切なビヒクル（たとえば、発熱物質の無い水）との構成のための、粉末形態で
あってもよい。
また、非経口投与のための適切な剤型としては、水溶性の形態（たとえば、水溶性の塩
）の活性化合物の水性溶液が挙げられる。さらに、適切な油性注射懸濁液として、活性化
合物の懸濁液が投与されてもよい。適切な脂溶性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油（
たとえば、ゴマ油）、または合成脂肪酸エステル（たとえば、オレイン酸エチルまたはト
リグリセリド）が挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を上げる物質（たとえば
、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよびデキストラン等）を含有
してもよい。任意選択的に、懸濁液はまた、安定化剤を含有しても良い。また、リポソー
ムを使用して、細胞または間質空間への送達のために、本発明の分子をカプセル化しても
よい。薬学的に受容可能な担体の例は、生理学的適合性を有する溶媒、分散媒、コーティ
ング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、水、生理食塩水、リン酸緩衝
生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等である。一部の実施態様にお
いて、組成物は、等張剤（たとえば、糖類、ポリアルコール類（たとえば、マンニトール
、ソルビトール）、または塩化ナトリウム）を含有する。他の実施態様において、組成物
は、たとえば湿潤剤等の薬学的に受容可能な物質、または少量の補助物質（たとえば、湿
潤剤または乳化剤）、保存剤または緩衝剤を含有し、それにより、活性成分の有効期間ま
たは有効性が増強される。
本発明の組成物は、たとえば、液体（たとえば、注射用溶液および不溶解性溶液等）、
分散液、懸濁液、半固体および固体の剤型等を含む、様々な形態であってもよい。好まし
い形態は投与方法および治療アプリケーションに依存する。
組成物は、溶液、微乳濁液、分散液、リポソーム、または他の高薬剤濃度に適した規則
構造として製剤化されてもよい。滅菌注射可能溶液は、適切な溶媒に溶解した必要量の活
性成分と、必要に応じて、上述の成分の１つ、または組み合わせと組み合わせ、ろ過滅菌
を行うことにより、調製されてもよい。一般的に、分散剤は、活性成分を、基礎分散培地
および上述の必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクルへと組み込むことにより調製
される。滅菌注射溶液の調製のための、滅菌粉末の場合には、好ましい調製方法は、真空
乾燥および凍結乾燥であり、これにより、前もって滅菌ろ過された溶液から、所望される
任意の追加成分と活性成分の粉末を得る。溶液の適切な流動性は、たとえば、レシチン等
のコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持により、および
、界面活性剤の使用により、維持されてもよい。たとえば、モノステアリン酸塩およびゼ
ラチン等の吸収を遅延させる剤を組成物中に含有させることにより、注射組成物の吸収を
遅延させてもよい。
活性成分は、制御放出された剤型またはデバイスで、製剤化されてもよい。そのような
剤型またはデバイスの例としては、インプラント、経皮貼布、およびマイクロカプセル化
デリバリーシステムが挙げられる。生分解性で、生物適合性のあるポリマー（たとえば、
エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル
およびポリ乳酸等）を用いても良い。そのような製剤およびデバイスの調製方法は当分野
公知である。たとえば、Sustainedand Controlled Release Drug Delivery Systems, J.
R.Robinson,ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照のこと。
注射用デポ製剤は、たとえば、ポリラクチド‐ポリグリコリド等の生分解性ポリマーに
、マイクロカプセル化した薬物基質を形成することにより作製されてもよい。ポリマーに
対する薬物の比率、および用いられるポリマーの性質に依存して、薬物の放出率を制御す
ることができる。他の例示的な生分解性ポリマーは、ポリオルトエステルおよびポリ無水
物である。また、注射用デポ製剤は、薬物をリポソームまたは微乳濁液中に封入すること
により調製してもよい。
補充用活性化合物を、組成物へと組み込んでも良い。１つの実施態様において、本発明
のキメラタンパク質は、他の凝固因子、またはその変異体、断片、アナログ、もしくは誘
導体と製剤化される。たとえば、凝固因子としては、限定されないが、第Ｖ因子、第ＶＩ
Ｉ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩ
Ｉ因子、プロトロンビン、フィブリノーゲン、ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子もしく
は組換え可溶性組織因子（ｒｓＴＦ）または、前述の任意のものの活性化形態が挙げられ
る。また、止血剤の凝固因子に、抗線維素溶解剤（たとえば、イプシロン－アミノ－カプ
ロン酸、トラネキサム酸等）を含有してもよい。
投与レジメンは、最適な所望の応答が得られるように調節されてもよい。たとえば、１
回の急速投与を行っても良く、時間をかけて数回に分割された投与を行っても良く、また
は、処置状況の緊急性により示されるように、投与量を比例的に減少または増加させても
よい。投薬量単位の形態で非経口組成物を製剤化すると、投与の簡便さ、そして投与量の
均一性の点で有利である。たとえば、Remington'sPharmaceutical Sciences (Mack Pub.
Co., Easton,Pa.1980)を参照のこと。
液体の投薬形態は、活性化合物に加え、不活性成分（たとえば、水、エチルアルコール
、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコ
ール、１，３－ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油、グリセロール、テトラ
ヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステ
ル等）を含有してもよい。
適切な薬学的担体の非限定的な例はまた、Remington's Pharmaceutical Sciences by E
. W. Martin.に記述されている。賦形剤のいくつかの例としては、デンプン、グルコース
、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、コメ、小麦粉、胡粉、シリカゲル、ステ
アリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、滑石、塩化ナトリウム、乾燥スキ
ムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。組
成物はまた、ｐＨ緩衝試薬および湿潤剤もしくは乳化剤を含有してもよい。
経口投与に対しては、医薬組成物は、標準的な手段で調製された錠剤またはカプセルの
形態であってもよい。組成物はまた、たとえばシロップまたは懸濁液等の液体として調製
されてもよい。液体には、懸濁化剤（たとえば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導
体または水素化食用脂等）、乳化剤（レシチンまたはアカシア）、非水性ビヒクル（たと
えば、アーモンドオイル、油性エステル、エチルアルコール、または分画化植物油）、お
よび保存剤（たとえば、メチルもしくはプロピル－ｐ－ヒドロキシベンゾエートまたはソ
ルビン酸）が含まれても良い。調製物はまた、香味剤、着色剤および甘味剤を含有しても
よい。あるいは、組成物は、水または他の適切なビヒクルとの構成のための乾燥製品であ
ってもよい。
口腔投与に対しては、組成物は、標準的なプロトコールに従った、錠剤またはトローチ
剤の形態であってもよい。
吸入による投与に対しては、本発明に従う使用のための化合物は、賦形剤を伴う、また
は伴わないネブライザー用エアロゾルの形態で、または、任意選択的に、高圧ガス（たと
えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロ
メタン、二酸化炭素、または他の適切なガス）とともに、加圧パックもしくはネブライザ
ーからのエアロゾルスプレーの形態で、簡便に送達される。加圧されたエアロゾルの場合
には、投薬量の単位は、測定された量を送達するようにバルブを規定することで、決定さ
れてもよい。吸入具または吸入器における使用のために、たとえば、ゲラチン等のカプセ
ルおよびカートリッジは、化合物と、適切な粉末ベース（たとえば、ラクトースまたはデ
ンプン等）の粉末混合物を含有して処方されてもよい。
医薬組成物はまた、座薬または停留浣腸として（たとえば、ココアバターまたは他のグ
リセリド等の、標準的な座薬ベースを含有して）、直腸投与用に製剤化されてもよい。
１つの実施態様において、医薬組成物は、キメラタンパク質、当該キメラタンパク質を
コードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含有するベクター、または当該ベ
クターを含有する宿主細胞と、薬学的に受容可能な担体を含有する。キメラタンパク質中
のＦＶＩＩＩタンパク質は、野生型ＦＶＩＩＩタンパク質または、ＶＷＦ断片の無い対照
ＦＶＩＩＩタンパク質と比較して、半減期が延長されている。１つの実施態様において、
ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくと
も約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約
６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、
少なくとも約１１倍、または少なくとも約１２倍、野生型ＦＶＩＩＩよりも長い。他の実
施態様において、第ＶＩＩＩ因子の半減期は、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８
時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくと
も約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２５時間、
少なくとも約２６時間、少なくとも約２７時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約２
９時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３１時間、少なくとも約３２時間、少なく
とも約３３時間、少なくとも約３４時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約３６時間
、少なくとも約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約
８４時間、少なくとも約９６時間、または少なくとも約１０８時間である。
一部の実施態様において、組成物は、局所投与、眼内投与、非経口投与、髄腔内投与、
硬膜下投与および経口投与からなる群から選択される経路により投与される。非経口投与
は、静脈内投与または皮下投与であってもよい。
他の実施態様において、組成物は、その必要のある対象における出血性疾患または状態
を処置するために用いられる。出血性疾患または状態は、出血凝固障害、関節出血、筋肉
出血、口腔出血、大量出血、筋肉内への大量出血、口腔内での大量出血、外傷、頭部外傷
、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後腔
の出血、腹膜後腔の出血、腸腰筋鞘の出血、およびこれらの任意の組み合わせからなる群
から選択される。さらに他の実施態様において、対象は、外科手術を受ける予定である。
さらに他の実施態様において、処置は、予防的に、または要求に応じて行われる。
遺伝子治療
本発明のキメラタンパク質は、治療的に有益であろう、出血凝固障害、関節出血、筋肉
出血、口腔出血、大量出血、筋肉内への大量出血、口腔内での大量出血、外傷、頭部外傷
、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後腔
の出血、腹膜後腔の出血、および腸腰筋鞘の出血からなる群から選択される出血性疾患ま
たは障害の治療に対する遺伝子治療法を用いて、哺乳類（たとえば、ヒト患者）において
、ｉｎ ｖｉｖｏで産生されてもよい。１つの実施態様において、出血性疾患または障害
は、血友病である。他の実施態様において、出血性疾患または障害は、血友病Ａである。
これには、適切な発現制御配列に作動可能に連結された、適切なキメラタンパク質をコー
ドする核酸の投与が含まれる。ある実施態様において、これらの配列は、ウイルスベクタ
ーへと組み込まれている。そのような遺伝子治療に適切なウイルスベクターとしては、ア
デノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、Ｅｐｓｔ
ｅｉｎ Ｂａｒｒウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ワクシニアウイルスベク
ター、単純ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが
挙げられる。他の実施態様において、アデノウイルスベクターは、そのＥ１遺伝子および
Ｅ３遺伝子を欠損している。アデノウイルスベクターを用いる場合、哺乳動物は、選択マ
ーカー遺伝子をコードする核酸に曝露されなくともよい。他の実施態様において、配列は
、当業者公知の非ウイルス性ベクターへと組み込まれる。
キメラタンパク質を使用する方法
本発明は、内因性ＶＷＦのＦＶＩＩＩタンパク質への結合を妨害または抑制するために
、本明細書に記述されるキメラタンパク質を使用する方法を目的とする。本発明はまた、
ＸＴＥＮおよびＩｇ定常領域またはその一部に連結されたＦＶＩＩＩを有するキメラタン
パク質を使用する方法を目的とする。
本発明の１つの態様は、ＦＶＩＩＩ上のＶＷＦ結合部位を妨害または隠蔽することによ
り、内因性ＶＷＦとＦＶＩＩＩの相互作用を妨害または抑制し、同時に、Ｉｇ定常領域ま
たはその一部（それらはまた、半減期伸長物質であってもよい）と組み合わせて、ＸＴＥ
Ｎ配列を用いてＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長することを目的とする。１つの実施
態様において、本発明は、野生型ＦＶＩＩＩよりも長い半減期を有するＦＶＩＩＩタンパ
ク質を構築する方法を目的とする。１つの実施態様において、ＸＴＥＮ配列は、キメラタ
ンパク質中のＦＶＩＩＩタンパク質と内因性ＶＷＦの相互作用を抑制または妨害する。他
の実施態様において、Ｉｇ定常領域またはその一部は、ＦＶＩＩＩタンパク質と内因性Ｖ
ＷＦの相互作用を抑制または妨害する。本方法に有用なキメラタンパク質は、本明細書に
記述される任意の１以上のキメラタンパク質が挙げられる。
本発明の他の態様において、野生型ＦＶＩＩＩよりも長い半減期を有するＦＶＩＩＩタ
ンパク質を含有するキメラタンパク質を、その必要のある対象に投与する方法が含まれ、
ここで、当該方法は、本明細書に記述されるキメラタンパク質を当該対象に投与すること
を含む。
１つの実施態様において、本発明は、ＦＶＩＩＩタンパク質と内因性ＶＷＦの相互作用
を妨害または抑制するためのＶＷＦ断片、ならびに、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延
長するためのＸＴＥＮ配列およびＩｇ定常領域またはその一部、を用いる方法を目的とす
る。ＸＴＥＮ配列に連結され、次いで、ＶＷＦ断片に結合または関連したＦＶＩＩＩタン
パク質（たとえば、ＦＶＩＩＩ（Ｘ））は、ＶＷＦのクリアランス経路から遮蔽または保
護され、それによって、ＶＷＦ断片に結合されていないＦＶＩＩＩタンパク質と比較して
、除去されることが減少する。ゆえに、遮蔽されたＦＶＩＩＩタンパク質は、ＸＴＥＮ配
列およびＶＷＦ断片に結合または関連していないＦＶＩＩＩタンパク質と比較し、半減期
が最大限延長されている。ある実施態様において、ＶＷＦ断片と関連またはＶＷＦ断片に
より保護され、および、ＸＴＥＮ配列に連結されたＦＶＩＩＩタンパク質は、ＶＷＦクリ
アランス受容体により除去されない。他の実施態様において、ＶＷＦ断片と関連またはＶ
ＷＦ断片により保護され、ＸＴＥＮ配列に連結されたＦＶＩＩＩタンパク質は、ＶＷＦ断
片と関連または保護されていないが、ＸＴＥＮ配列に連結されている、ＦＶＩＩＩタンパ
ク質よりもゆっくりと身体から除去される。
１つの態様において、ＸＴＥＮ配列に連結されたＦＶＩＩＩタンパク質、または、ＸＴ
ＥＮに連結されたＶＷＦ断片に結合もしくは関連したＦＶＩＩＩタンパク質を含有するキ
メラタンパク質は、当該ＶＷＦ断片がＶＷＦクリアランス受容体結合部位を含有していな
いため、循環系からの除去が減少する。ＶＷＦ断片は、当該ＶＷＦ断片に結合または関連
したＦＶＩＩＩの、ＶＷＦクリアランス経路を介した身体からの除去を妨害または抑制す
る。本発明に有用なＶＷＦ断片はまた、内因性ＶＷＦによりもたらされる、ＶＷＦ様のＦ
ＶＩＩＩ保護特性の少なくとも１つ以上をもたらし得る。ある実施態様において、ＶＷＦ
断片またはＸＴＥＮ配列はまた、１以上のＦＶＩＩＩクリアランス受容体結合部位を隠す
ことができ、それによって、それ自身のクリアランス経路による、ＦＶＩＩＩの除去を妨
害することができる。
一部の実施態様において、ＶＷＦ断片またはＸＴＥＮ配列による、内因性ＶＷＦへのＦ
ＶＩＩＩタンパク質の結合の妨害または抑制は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ
であってもよい。
また、本明細書に記述されるキメラタンパク質を、それを必要とする対象に投与するこ
とを含む、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を増加させる方法が提示される。全長ＶＷＦに
結合または関連した、非活性化ＦＶＩＩＩの半減期は、血漿中で約１２～１４時間である
。３型ＶＷＤにおいて（ここで、循環系にはほとんどＶＷＦは存在しない）、ＦＶＩＩＩ
の半減期は、およそ６時間のみであり、これにより、ＦＶＩＩＩの濃度減少に起因する、
そのような患者における軽度～中度の血友病Ａの症状がもたらされる。本発明のＶＷＦ断
片またはＸＴＥＮ配列に連結または関連したＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、全長ＶＷ
Ｆに結合または関連した非活性化ＦＶＩＩＩの半減期よりも、少なくとも約１．５倍、１
．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２
．４倍、２．６倍、２．７．倍、２．８倍、２．９倍、３．０倍、３．１倍、３．２倍、
３．３倍、３．４倍、３．５倍、３．６倍、３．７倍、３．８倍、３．９倍、または４．
０倍、長く延長されてもよい。
１つの実施態様において、ＸＴＥＮ配列を含有するキメラタンパク質中で、ＶＷＦ断片
に連結または関連したＦＶＩＩＩタンパク質の半減期、または、Ｉｇ定常領域またはその
一部に連結したＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、全長ＶＷＦに結合または関連した非活
性化ＦＶＩＩＩの半減期よりも、少なくとも約２倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４
．０倍、４．５倍、５．０倍、５．５倍、６．０倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍、
長く延長される。他の実施態様において、ＸＴＥＮ配列を含有するキメラタンパク質中で
、ＶＷＦ断片またはＩｇ定常領域もしくはその一部に連結または関連したＦＶＩＩＩタン
パク質の半減期は、全長ＶＷＦまたは野生型ＦＶＩＩＩに結合または関連した非活性化Ｆ
ＶＩＩＩの半減期よりも、約２～約５倍、約３～約１０倍、約５～約１５倍、約１０～約
２０倍、約１５～約２５倍、約２０～約３０倍、約２５～約３５倍、約３０～約４０倍、
約３５～約４５倍、長く延長される。特定の実施態様において、ＸＴＥＮ配列を含有する
キメラタンパク質中で、ＶＷＦ断片に連結または関連したＦＶＩＩＩタンパク質の半減期
、またはＩｇ定常領域に連結したＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、ＦＶＩＩＩとＶＷＦ
のダブルノックアウトマウス中の野生型ＦＶＩＩＩの半減期よりも、少なくとも約３０、
３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０倍長く延長される
。
一部の実施態様において、第一のＩｇ定常領域またはその一部（たとえば、第一のＦｃ
領域）およびＸＴＥＮ配列に融合されたＶＷＦ断片、ＸＴＥＮ配列および第二のＩｇ定常
領域またはその一部（たとえば、第二のＦｃ領域）に連結されたＦＶＩＩＩタンパク質、
を含有するキメラタンパク質の半減期は、内因性ＶＷＦに関連したＦＶＩＩＩの半減期よ
りも長い。他の実施態様において、キメラタンパク質の半減期は、内因性ＶＷＦと関連し
たＦＶＩＩＩタンパク質、または野生型ＦＶＩＩＩの半減期の少なくとも約１．５倍、２
倍、２．５倍、３．５倍、３．６倍、３．７倍、３．８倍、３．９倍、４．０倍、４．５
倍、または５．０倍である。
一部の実施態様において、本発明の結果として、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、Ｖ
ＷＦ断片を有していないＦＶＩＩＩタンパク質または野生型ＦＶＩＩＩと比較して、延長
されている。本発明のキメラタンパク質の半減期は、ＶＷＦ断片を有していないＦＶＩＩ
Ｉタンパク質または野生型ＦＶＩＩＩの半減期よりも、少なくとも約１．５倍、少なくと
も約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約
５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少
なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、または少なくとも約１２倍、長い。１つの実施
態様において、ＦＶＩＩＩの半減期は、野生型ＦＶＩＩＩの半減期よりも、約１．５倍～
約２０倍、約１．５倍～約１５倍、または、約１．５倍～約１０倍、長い。他の実施態様
において、ＦＶＩＩＩの半減期は、ＶＷＦ断片を有していないＦＶＩＩＩタンパク質また
は野生型ＦＶＩＩＩと比較して、約２倍～約１０倍、約２倍～約９倍、約２倍～約８倍、
約２倍～約７倍、約２倍～約６倍、約２倍～約５倍、約２倍～約４倍、約２倍～約３倍、
約２．５倍～約１０倍、約２．５倍～約９倍、約２．５倍～約８倍、約２．５倍～約７倍
、約２．５倍～約６倍、約２．５倍～約５倍、約２．５倍～約４倍、約２．５倍～約３倍
、約３倍～約１０倍、約３倍～約９倍、約３倍～約８倍、約３倍～約７倍、約３倍～約６
倍、約３倍～約５倍、約３倍～約４倍、約４倍～約６ ｆｏｌｄ， 約５倍～約７倍、ま
たは、約６倍～約８倍、延長されている。他の実施態様において、本発明のキメラタンパ
ク質の半減期は、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間
、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約
２３時間、少なくとも約 ２４時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約２６時間、少
なくとも約２７時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約２９時間、少なくとも約３０
時間、少なくとも約３１時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３３時間、少なくと
も約３４時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、
少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９
６時間、または少なくとも約１０８時間である。さらに他の実施態様において、本発明の
キメラタンパク質の半減期は、約１５ 時間～約２週間、約１６時間～約１週間、約１７
時間～約１週間、約１８時間～約１週間、約１９時間～約１週間、約２０時間～約１週間
、約２１時間～約１週間、約２２時間～約１週間、約２３時間～約１週間、約２４時間～
約１週間、約３６時間～約１週間、約４８時間～約１週間、約６０時間～約１週間、約２
４時間～約６日、約２４時間～約５日、約２４時間～約４日、約２４時間～約３日、また
は、約２４時間～約２日である。
一部の実施態様において、本発明のキメラタンパク質の対象ごとの平均半減期は、約１
５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、
約２２時間、約２３時間、約２４時間（１日）、約２５時間、約２６時間、約２７時間、
約２８時間、約２９時間、約３０時間、約３１時間、約３２時間、約３３時間、約３４時
間、約３５時間、約３６時間、約４０時間、約４４時間、約４８時間（２日）、約５４時
間、約６０時間、約７２時間（３日）、約８４時間、約９６時間（４日）、約１０８時間
、約１２０時間（５日）、約６日、約７日（１週）、約８日、約９日、約１０日、約１１
日、約１２日、約１３日、または約１４日である。
さらに、本発明は、キメラタンパク質の有効量を投与することを含む、出血性疾患また
は障害を処置または予防する方法を提示する。１つの実施態様において、出血性疾患また
は障害は、出血凝固障害、関節出血、筋肉出血、口腔出血、大量出血、筋肉内への大量出
血、口腔内での大量出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔
内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後腔の出血、腹膜後腔の出血、腸腰筋鞘の出血から
なる群から選択される。特定の実施態様において、出血性疾患または障害は、血友病Ａで
ある。
本明細書に記述される、ＶＷＦ断片（本発明により調製された、内因性ＶＷＦとＦＶＩ
ＩＩタンパク質の相互作用を妨害または抑制する）と組み合わせた、ＸＴＥＮ配列および
Ｉｇ定常領域またはその一部を含有するキメラタンパク質には多くの用途があることが当
業者に認識され、限定されないが、止血障害を有する対象を処置する方法および全般的な
止血剤を必要としている対象を処置する方法が含まれる。１つの実施態様において、本発
明は、キメラタンパク質の治療有効量を投与することを含む、止血障害を有する対象を処
置する方法に関する。
キメラタンパク質のＦＶＩＩＩタンパク質部分は、陰性荷電されたリン脂質表面上で第
ＩＸ因子に対する補因子として供され、それによって、Ｘａｓｅ複合体を形成することに
より、止血障害を処置または予防する。リン脂質表面への活性化凝固因子の結合により、
血管損傷部位にこのプロセスは限局する。リン脂質表面上で、第ＶＩＩＩａ因子は、第Ｉ
Ｘａ因子による第Ｘ因子活性化の最大速度を、およそ２００，０００倍まで増加させ、そ
れにより、トロンビン生成の大きな第二バーストがもたらされる。
本発明のキメラタンパク質を用いて、任意の止血障害を処置してもよい。本発明のキメ
ラタンパク質の投与により処置されうる止血障害としては、限定されないが、血友病Ａ、
ならびに、第ＶＩＩＩ因子に関連する欠損症または構造異常が挙げられる。１つの実施態
様において、止血障害は、血友病Ａである。
本発明のキメラタンパク質を予防的に用いて、止血障害を有する対象を処置してもよい
。本発明のキメラタンパク質を用いて、止血障害を有する対象における、深刻な出血症状
を処置してもよい。他の実施態様において、止血障害は、不完全な凝固因子（たとえば、
ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子）の結果によるものであってもよい。１つの実施態様
において、止血障害は、遺伝性障害である。他の実施態様において、止血障害は、後天性
な障害である。後天性な障害は、潜在的な二次疾患または障害に起因するものであっても
よい。関係のない状態は、たとえば、限定されないが、癌、自己免疫疾患、または妊娠で
あっても良い。後天性障害は、老齢に起因してもよく、または、潜在的な二次障害を処置
するための医薬（たとえば、癌化学療法）に起因してもよい。
本発明はまた、先天的な止血障害を有していない、止血障害の獲得をもたらす二次疾患
または状態を有する（たとえば、抗ＦＶＩＩＩ抗体の発現または外科手術に起因する）、
対象を処置する方法に関する。本発明は、本方法により調製されたキメラタンパク質の治
療有効量を投与することを含む、全般的な止血剤の必要性がある対象を処置する方法に関
する。
本発明はまた、本明細書に記述されるキメラタンパク質の有効量、または、本明細書に
記述されるキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドの有効量を投与することを含
む、ＦＶＩＩＩの免疫原性を減少させる方法、または、ＦＶＩＩＩに対し、より少ない免
疫原性を誘導する方法に関する。
１つの実施態様において、全般的な止血剤の必要性のある対象は、外科手術を受けてい
る、または外科手術を受けようとしているものである。本発明のキメラタンパク質は、予
防的レジメンとして、外科手術の前、外科手術の間、または後に投与されても良い。本発
明のキメラタンパク質は、深刻な出血症状を制御するために、外科手術の前、外科手術の
間、または外科手術の後に投与されても良い。
本発明のキメラタンパク質を用いて、止血障害を有していない、深刻な出血症状を有す
る対象を処置してもよい。深刻な出血症状は、重篤な外傷（たとえば、外科手術、交通事
故、創傷、銃による裂傷、または、制御できない出血をもたらす他の任意の外傷性の事象
）に起因するものであってもよい。出血症状の非限定的な例としては、出血凝固障害、関
節出血、筋肉出血、口腔出血、大量出血、筋肉内への大量出血、口腔内での大量出血、外
傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出
血、咽頭後腔の出血、腹膜後腔の出血、腸腰筋鞘の出血、およびこれらの任意の組み合わ
せが挙げられる。
予防的応用においては、本発明のキメラタンパク質、またはそれらのカクテルを含有す
る１以上の組成物を、疾患または障害に関連する症状を減少するために、または患者の抵
抗性を増加させるために、疾患状態にはまだない患者に投与する。その量は、「予防的有
効量」であると定義される。治療的応用においては、疾患の進行が遅くなる、または止ま
るまで、および、患者が疾患症状の部分的改善または完全な改善を示すまで、比較的短い
間隔で、比較的高い投与量（たとえば、投与１回につき、約１～４００ｍｇ／ｋｇのポリ
ペプチド。放射免疫測定用の接合体に対し、普遍的に用いられるのは５～２５ｍｇの投与
量、および、細胞毒性薬剤改変ポリペプチドに対してはより高い投与量）が求められるこ
ともある。患者は、予防的レジメンを投与されてもよい。
一部の実施態様において、本発明のキメラタンパク質または組成物は、要求に応じた処
置（出血症状、関節出血、筋肉出血、口腔出血、大量出血、筋肉内への大量出血、口腔内
での大量出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨
折、中枢神経系出血、咽頭後腔の出血、腹膜後腔の出血、腸腰筋鞘の出血に対する処置を
含む）のために用いられる。対象は、外科的予防、周術期管理、または外科手術に対する
処置の必要があっても良い。そのような外科手術としては、たとえば、小手術、大手術、
抜歯、扁桃切除、鼡径ヘルニア術、滑膜切除術、全膝置換、開頭、骨接合、外傷手術、脳
内手術、腹膜内手術、胸腔内手術、または関節置換手術が挙げられる。
１つの実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、静脈内、皮下、筋肉内、また
は任意の粘膜表面（たとえば、経口、舌下、口腔内、舌下、経鼻、直腸内、経腟またはは
肺経路）を介して、投与される。本発明のＶＷＦ断片およびＦＶＩＩＩタンパク質を含有
するキメラタンパク質は、キメラタンパク質を出血部位へゆっくりと放出させるバイオポ
リマー固形支持体内に移植または連結されてもよく、または、包帯／包帯剤へと移植され
てもよい。キメラタンパク質の投与は、対象、および用いられる特定の投与経路によって
変化する。投与量は、０．１～１００，０００μｇ／ｋｇ体重の範囲であってもよい。１
つの実施態様において、投与量の範囲は、０．１～１，０００μｇ／ｋｇである。他の実
施態様において、投与量の範囲は０．１～５００μｇ／ｋｇである。タンパク質は、継続
的に投与されてもよく、または、特定の時間間隔で投与されてもよい。ｉｎ ｖｉｔｒｏ
アッセイを用いて、最適な投与範囲および／または投与スケジュールを決定してもよい。
凝固因子の活性を測定するｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは当分野に公知である（たとえば、
ＳＴＡ－ＣＬＯＴ ＶＩＩａ－ｒＴＦ凝固アッセイまたはＲＯＴＥＭ凝固アッセイ）。さ
らに、有効投与量は、動物モデル（たとえば、血友病のイヌ）から得られた用量応答曲線
から外挿されてもよい（Mountet al. 2002, Blood 99(8):2670）。
本発明について詳細に記述したが、同内容は、以下の実施例を参照することにより、さ
らに明確に理解されうるであろう。以下の実施例は、解説の目的のみ、本明細書に添付さ
れ、本発明の限定を表すものではない。本明細書に言及される全ての特許、公表文献およ
び論文は、参照により、明示的に、および具体的に本明細書に援用される。
実施例全体を通して、他で特定されない限り、以下の材料および方法が用いられた。
材料と方法
概して、本発明の実施には、他に示されない限り、標準的な化学的技術、生物物理学的
技術、分子生物学的技術、組み換えＤＮＡ技術、免疫学的技術（特に、たとえば、抗体の
技術）および、電気泳動の標準的な技術（たとえば、Sambrook,Fritsch and Maniatis, M
olecular Cloning:Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989); Antibody Engineering
Protocols(Methods inMolecular Biology), 510,Paul, S., Humana Pr (1996); Antibo
dy Engineering:APractical Approach(Practical Approach Series, 169), McCafferty,
Ed., IrlPr(1996); Antibodies: ALaboratory Manual, Harlow et al., CS.H.L. Press
,Pub. (1999);および、CurrentProtocolsin Molecular Biology,eds. Ausubel et
al., John Wiley& Sons (1992)を参照のこと）を採用している。
実施例１：異なるＶＷＦドメインのクローニング（図１）
（ａ）ｐＳＹＮ－ＶＷＦ－００２のクローニング
ｐＳＹＮ－ＶＷＦ－００２は、配列番号１００のアミノ酸１～４７７である。［ＶＷＦ
－Ｄ´Ｄ３タンパク質配列］アミノ酸番号は、プロぺプチドを有していない成熟型ＶＷＦ
配列に相当し、および、配列番号２のアミノ酸７６４～１２４０に相当する。ｐＳＹＮ－
ＶＷＦ－００２構築物は、Ｎ末端に、合成されたタンパク質を適切に分泌させるＦＶＩＩ
Ｉシグナルペプチドを有しており、続いて、タンパク質の精製のために用いられる、Ｃ末
端の６ｘＨｉｓタグを有している。以下のプライマーの組み合わせを用いて、合成された
。

ＶＩＩＩシグナルおよびＢｓｉＷ１部位を有する、ＥＳＣ４８－Ｆｗｄ－ＶＷＦ－Ｄ´Ｄ
３
TCGCGACGTACGGCCGCCACCATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTGCTTTAGCCT
ATCCTGTCGGCCCCCCATG （配列番号９０）

６ＨｉｓおよびＮｏｔ１部位を有する、ＥＳＣ５１－Ｒｅｖ－ＶＷＦ Ｄ´Ｄ３（１－４
７７アミノ酸）
TGACCTCGAGCGGCCGCTCAGTGGTGATGGTGATGATGCGGCTCCTGGCAGGCTTCACAGGTGAGGTTGACAAC （配
列番号９１）
５０μｌのＰＣＲ反応を、ＥＳＣ ４８／ＥＳＣ ５１のプライマーの組み合わせ、お
よび、鋳型として全長ＶＷＦプラスミドを用いて、２ステップのＰＣＲ増幅サイクル（９
４℃、２分；２１サイクルの（９６℃ ３０秒、６８℃ ２分））で、実施した。１４６
０ｂｐのバンドを、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃ
ｉａ，Ｃａｌｉｆ．）を用いてゲル精製し、ｐｃＤＮＡ４のＢｓｉＷＩおよびＮｏｔ１部
位へクローニングし、ｐＳＹＮ－ＶＷＦ ００２を作製した。
（ｂ）ｐＳＹＮ－ＶＷＦ ０１０および０１３のクローニング
ｐＳＹＮ－ＶＷＦ ０１０は、ｐＳＹＮ－ＶＷＦ－００８およびｐＳＹＮ－ＶＷＦ－０
０２を用いて構築した。ｐＳＹＮ－ＶＷＦ－００８は、ｐｃＤＮＡ ３．１中に全長ＶＷ
Ｆ配列を含有し（配列番号２のアミノ酸１－２８１３）、その中には、７６３アミノ酸の
プロペプチド（すなわち、Ｄ１Ｄ２ドメイン）が含まれ、その後に成熟型ＶＷＦの残りの
２０５０アミノ酸配列が続く。ｐＳＹＮ－ＶＷＦ－００２のＦＶＩＩＩシグナルペプチド
は、ｐＳＹＮ－ＶＷＦ－００８由来のＤ１Ｄ２ドメインと置換され、得られた構築物が、
ｐＳＹＮ－ＶＷＦ－０１０である。ｐＳＹＮ－ＶＷＦ－００８は、Ａｒｇ９０７で、Ｂａ
ｍＨ１部位を有し、コード領域の末端（ストップコドンの後）でＮｏｔ１部位を有する。
ｐＳＹＮ－ＶＷＦ－００８および００２を、ＢａｍＨ１およびＮｏｔ１制限酵素で消化し
た。ｐＳＹＮ－ＶＷＦ－００２由来の挿入物（１０２６ｂｐ）を、ｂａｍＨ１／Ｎｏｔ１
で消化したｐＳＹＮ－ＶＷＦ－００８（８２４２ｂｐ）へとライゲートし、ｐＳＹＮ－Ｖ
ＷＦ－０１０（Ｄ１Ｄ２Ｄ´Ｄ３：配列番号２のアミノ酸１－１２４０）を得て、６ｘＨ
ｉｓタグもまた、Ｃ末端に付加された。形質転換された細胞において、ｐＳＹＮ－ＶＷＦ
－０１０はプロペプチドとともに合成されるが、細胞内プロセッシングにより、分泌され
た産物にプロペプチド（Ｄ１Ｄ２）は含有されない。ＶＷＦ－０１０由来のタンパク質は
、二量体として存在する。
ｐＳＹＮ－ＶＷＦ－０１０を用いて、配列番号１００のＣ３３６ＡおよびＣ３７９Ａ（
アミノ酸番号は、Ｄ１Ｄ２ドメイン－ＶＷＦ配列２を有していない成熟型ＶＷＦ配列に相
当する）で２つの点変異を有するｐＳＹＮ－ＶＷＦ－０１３を作製した。これらの変異は
、ＶＷＦ Ｄ´Ｄ３ドメインの二量体化を阻害すると予測されている。
（ｃ）ｐＳＹＮ－ＶＷＦ－０２５およびｐＳＹＮ－ＶＷＦ－０２９のクローニング
ｐＳＹＮ－ＶＷＦ－０２５は、ｐＬＩＶＥベクターにおいて、全長ＶＷＦの野生型Ｄ１
Ｄ２Ｄ´Ｄ３配列を含有し、ｐＳＹＮ－ＶＷＦ－０２９は、Ｃ３３６ＡおよびＣ３７９Ａ
の変異を伴うＤ１Ｄ２Ｄ´Ｄ３配列を含有する。ｐＳＹＮ－ＶＷＦ－０２５のクローニン
グに対し、以下のプライマーの組み合わせを用いた：

Ｎｈｅ１部位を有する、ＥＳＣ８９－ｆｗｄ＝
CTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCCG （配列番号９２）

Ｓａｌ１を有する、ＥＳＣ９１－ｒｅｖ＝
CTGGATCCCGGGAGTCGACTCGTCAGTGGTGATGGTGATGATG （配列番号９３）
５０μｌのＰＣＲ反応を、ＥＳＣ ８９／ＥＳＣ９１のプライマーの組み合わせおよび
、ｐＳＹＮ－ＶＷＦ ０１０（ｐＳＹＮ－ＶＷＦ－０２５に対して）または、ｐＳＹＮ－
ＶＷＦ ０１３（ｐＳＹＮ－ＶＷＦ－０２９に対して）のいずれかのプラスミドを鋳型と
して用いて、３ステップのＰＣＲ増幅サイクル（９４℃、２分；２１サイクルの（９６℃
３０秒、５５℃ ３０秒、６８℃ ４分））で、実施した。予測されたサイズのバンド
（約３８００ｂｐ）を、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｖａｌ
ｅｎｃｉａ， Ｃａｌｉｆ．）を用いてゲル精製し、ｐＬＩＶＥ－Ｍｉｒｕｓベクター（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， Ｃａｌｉｆ．）のＮｈｅ１およびＳａｌ
１制限酵素部位へとクローニングして、ｐＳＹＮ－ＶＷＦ ０２５および０２９を作製し
た。
（ｄ）ｐＳＹＮ－ＶＷＦ－０３１のクローニング
ｐＳＹＮ－ＶＷＦ－０３１は、４８アミノ酸の長さのトロンビン開裂可能なリンカー（
８ｘＧＧＧＧＳ（配列番号９４）＋トロンビン部位）をＶＷＦ Ｄ１Ｄ２Ｄ´Ｄ３（Ｃ３
３６Ａ／Ｃ３７９Ａ）とＦｃ配列の間に有する、Ｄ１Ｄ２Ｄ´Ｄ３（Ｃ３３６Ａ／Ｃ３７
９Ａ）－Ｆｃ構築物である。この構築物を作製するために、ＶＷＦ－Ｆｃ領域を、ｐＳＹ
Ｎ－ＦＶＩＩＩ－０６４構築物（以下、ＦＶＩＩＩ－ＶＷＦ構築物と呼称）から増幅した
。ｐＳＹＮ－ＦＶＩＩＩ－ＶＷＦをＸｂａ１およびＮｈｅ１で消化した。得られた４１６
５ｂｐの挿入領域（ＶＷＦ断片およびＦｃ領域を含有）を、ＶＷＦおよびＦｃ領域のＬＷ
２２／ＬＷ２３のプライマーの組み合わせによる増幅のための鋳型として用いた。

ＦＶＩＩＩシグナル配列およびＢｓｉＷ１部位を有するＬＷ２２－ＦＷＤ－ＶＷＦ－Ｄ´
Ｄ３
GCGCCGGCCGTACGATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTGCTTTAGCCTATCCTGT
CGGCCCCCCATG（配列番号９５）

ストップコドンおよびＮｏｔ１部位を有するＬＷ２３－Ｒｅｖ－Ｆｃ
TCATCAATGTATCTTATCATGTCTGAATTCGCGGCCGCTCATTTACC（配列番号９６）
ＬＷ２２／ＬＷ２３増幅から得られたＰＣＲ産物（約２３００ｂｐ）を、ＢｓｉＷ１／
Ｎｏｔ１で消化したｐＳＹＮ－ＶＷＦ－００２へとクローニングして、ｐＳＹＮ－ＶＷＦ
－０１４中間体を得た。ｐＳＹＮ－ＶＷＦ－０１４はＦＶＩＩＩシグナルペプチド－Ｄ´
Ｄ３－２０アミノ酸トロンビン開裂可能なリンカー（Ｆｃ領域が後に続く）を含有する。
Ｄ１Ｄ２Ｄ´Ｄ３－Ｆｃ構築物を作製するために、ＬＷ２４／ＬＷ２７のプライマーの
組み合わせを用いて、標準的なＰＣＲ法により、ｐＳＹＮ－ＶＷＦ－０１３からＤ１Ｄ２
Ｄ´Ｄ３領域を増幅した。

ＢｓｉＷ１部位を有するＬＷ２４－Ｆｗｄ－ＶＷＦ Ｄ１Ｄ２Ｄ´Ｄ３クローニングオリ
ゴ
GCGCCGGCCGTACGATGATTCCTGCCAGATTTGCCGGGGTG（配列番号９７）

ＥｃｏＲＶを有する、ＬＷ２７－Ｒｅｖ－ＶＷＦ Ｄ´Ｄ３オリゴ
CCACCGCCAGATATCGGCTCCTGGCAGGCTTCACAGGTGAG（配列番号９８）
ＬＷ２２／ＬＷ２３増幅から得られたＰＣＲ産物（約３７５０ｂｐ）を、ＢｓｉＷ１／
ＥｃｏＲＶで消化したｐＳＹＮ－ＶＷＦ－０１４にクローニングして、ｐＳＹＮ－ＶＷＦ
－０１５中間体を得た。ＶＷＦ断片とＦｃ領域の間のリンカーの長さを変化させて、ｐＳ
ＹＮ－ＶＷＦ－０３１を得た。

ＶＷＦ－Ｄ１Ｄ２Ｄ´Ｄ３タンパク質配列１（配列番号９９）
Figure 0007022165000057
Figure 0007022165000058

ＶＷＦ－Ｄ´Ｄ３タンパク質配列２（配列番号１００）

Figure 0007022165000059
実施例２：ＦＶＩＩＩ半減期の延長に対する、Ｄ´Ｄ３およびＸＴＥＮ融合の効果
ｒＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ融合タンパク質の、Ｄ´Ｄ３ ＦＶＩＩＩ半減期延長の可能性
を評価するために、ＶＷＦ Ｄ´Ｄ３二量体を、その対応するＤＮＡ構築物ＶＷＦ－０２
５（実施例１）の水圧注入により、ＦＶＩＩＩ－ＶＷＦ ＤＫＯマウスへと導入した。Ｄ
´Ｄ３が安定して発現される状態になった後（注入後５日目）、ｒＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ
の単回投与を、２００ＩＵ／ｋｇの投与量で、ＩＶ注射により投与した。ｒＦＶＩＩＩ－
ＸＴＥＮ投与後の１２０時間まで、血液試料を採取した。血漿ＦＶＩＩＩ活性を、ＦＶＩ
ＩＩ発色アッセイにより分析した。Ｄ´Ｄ３発現レベルを、ＶＷＦ ＥＬＩＳＡにより測
定し、ｒＦＶＩＩＩＦｃ ＰＫプロファイルを、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎプログラムを用いて
解析した。
実験結果を図２に示し、Ｄ´Ｄ３を伴う／伴わない、ｒＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮの循環系
中のＰＫパラメーターを、表１６に示す。Ｄ´Ｄ３二量体はさらに、ｒＦＩＩＩ－ＸＴＥ
Ｎのｔ１／２を、３．４時間から１７．８時間へと、５倍増で延長させた。半減期に加え
、ＭＲＴに対して５倍の増加、ＡＵＣに対して３．６倍の増加、クリアランスに対して３
．８倍の増加が観察された。
Ｄ´Ｄ３断片とＸＴＥＮの技術の相乗的な効果が観察されたことから、血友病のモデル
において、一連のＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ／ＸＴＥＮ構築物のＦＶＩＩＩ半減期延長の可能性
に対して評価する。
Figure 0007022165000060
ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮのタンパク質精製
ＡＥ２８８ ＸＴＥＮを、本実験のために、ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩのＣ末端に挿入した。
このタンパク質を精製するために、接線流ろ過（ＴＦＦ）工程を最初に用いて、馴化培地
をバッファー交換した。次いで、ろ過物中の産物を、強陰イオン交換クロマトグラフィを
用いて捕捉し、次いで、アフィニティクロマトグラフィを用いてさらに精製した。分子の
純度は、ＨＰＬＣ－ＳＥＣによる許容範囲にあり、ウェスタンブロッティングによりさら
に確認された。分子の比活性は、ａＰＴＴアッセイおよびＥＬＩＳＡによる測定で、Ｂド
メイン欠損ＦＶＩＩＩと同等であった。
ＦＶＩＩＩ発色アッセイ
ＦＶＩＩＩ活性は、ＤｉａＰｈａｒｍａ（ｌｏｔ＃ Ｎ０８９０１９）から入手したＣ
ＯＡＴＥＳＴ ＳＰ ＦＶＩＩＩキットを用いて測定し、すべてのインキュベーションは
、３７℃のプレートヒーター上で振とうさせながら行った。
ｒＦＶＩＩＩ標準の範囲は、１００ｍＩＵ／ｍＬ～０．７８ｍＩＵ／ｍＬである。プー
ルされた正常ヒト血漿アッセイ対照および血漿試料（１ＸのＣｏａｔｅｓｔ緩衝液で希釈
した）を、Ｉｍｍｕｌｏｎ ２ＨＢ ９６ウェルプレートに、二重で添加した（２５μＬ
／ウェル）。調製したばかりのＩＸａ／ＦＸ／リン脂質混合物（５０μＬ）、２５μＬの
２５ｍＭ ＣａＣｌ２、および５０μＬのＦＸａ基質を、連続して各ウェルに添加した（
各添加の間に、５分間インキュベーションを行った）。基質とインキュベーションした後
、２５μＬの２０％酢酸を添加し、発色反応を停止させ、ＯＤ４０５の吸光度をＳｐｅｃ
ｔｒａＭＡＸ ｐｌｕｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）装置で測定した。デー
タは、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン５．２）で分析した。最
低定量値（ＬＬＯＱ）は、７．８ｍＩＵ／ｍＬである。
ＶＷＦ ＥＬＩＳＡ：
ヤギ抗ヒトＶＷＦ抗体（アフィニティ精製、ａｆｆｉｎｉｔｙ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
、ＧＡＶＷＦ－ＡＰ）を捕捉抗体として、０．５ｕｇ／ウェルで用いて、ＶＷＦ－ＥＩＡ
－Ｄ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＶＷＦ－ＥＩＡ－Ｄ、１：１００希
釈）をＶＷＦ ＥＬＩＳＡに対する検出抗体として用いた。ＥＬＩＳＡアッセイを、以下
の標準的なＥＬＩＳＡの手順に従い実施し、ＴＭＢをＨＲＰ基質として用いて、ＰＢＳＴ
／１．５％ ＢＳＡ／０．５Ｍ ＮａＣｌ緩衝液をブロッキングおよび結合緩衝液として
用いた。アッセイの標準範囲は、１００ｎｇ～０．７８ｎｇであり、アッセイの定量下限
（ＬＬＱＱ）は、７．８ｎｇ／ｍＬである。
実施例３：ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ構築物を含有する、ＸＴＥＮのプラスミド構築
（ａ）ｐＳＹＮ－ＦＶＩＩＩ－１６１のクローニング（図３）
ＦＶＩＩＩ－１６１プラスミドは、細胞での合成の間にプロセッシングされる酵素開裂
部位を有する、一本鎖Ｆｃ（ｓｃＦｃ）スキャホールドを含有する。構築物は、全長ＶＷ
Ｆ（Ｄ´Ｄ３）のＦＶＩＩＩ結合ドメインを有する。
プラスミド（ｐＳＹＮ－ＦＶＩＩＩ－１６１）は、ＦＶＩＩＩ－ＦｃおよびＶＷＦ－Ｆ
ｃヘテロ二量体の発現のために設計され、Ｄ´Ｄ３ドメインはＦＶＩＩＩに結合し、リン
脂質と活性化プロテインＣのＦＶＩＩＩ相互作用を妨害する。ｐＳＹＮ－ＦＶＩＩＩ－１
６１からのタンパク質は、ＦＶＩＩＩ－ＦｃサブユニットのＣ末端が６ｘ（ＧＧＧＧＳ）
ポリペプチドリンカー（配列番号６４）によりＶＷＦ Ｄ´Ｄ３－ＦｃサブユニットのＮ
末端に連結されている単一ポリペプチドとして細胞内で発現される。さらに、各配列の最
後のＡｒｇの後に、前駆タンパク質転換酵素による細胞内開裂のために、ＲＲＲＲＳ（配
列番号１１）およびＲＫＲＲＫＲ（配列番号１０）の配列が、それぞれ、当該ポリペプチ
ドリンカーの５´末端と３´末端に挿入された。ゆえに、細胞は、ＦＶＩＩＩ－Ｆｃ鎖が
Ｃ末端でＲＲＲＲＳ配列（配列番号１１）を有しているが、リンカー配列の残りは除去さ
れている、二重鎖ＦＶＩＩＩ－Ｆｃ／Ｄ´Ｄ３－Ｆｃヘテロ二量体を発現してもよい。Ｆ
ＶＩＩＩ－ＶＷＦヘテロ二量体タンパク質がトロンビンにより活性化され、ＦＶＩＩＩと
他の凝固因子の相互作用が可能になった時に、ＦＶＩＩＩからのＶＷＦ断片の放出が促進
されるよう、トロンビン開裂部位を含有するＩＳ｛５Ｘ（ＧＧＧＧＳ）｝ＬＶＰＲＧＳＧ
Ｇ（配列番号１２２）ポリペプチドがすぐ後に続く、ＡＥ２８８ ＸＴＥＮ断片が、ＶＷ
ＦドメインとＦｃ領域の間に挿入されている。
ｐＳＹＮ－ＦＶＩＩＩ－１６１（配列番号１０１）タンパク質配列（ＦＶＩＩＩ配列の
アミノ酸の位置 １～１４５７）；下線領域はＦｃ領域を表し、波下線は第一のＦｃとＶ
ＷＦ断片の間にある開裂可能なリンカーを表し、二重下線領域はＶＷＦ断片を表し、太字
の領域はＶＷＦ断片とＦｃの間にある開裂可能なリンカーを表す。
Figure 0007022165000061
Figure 0007022165000062
Figure 0007022165000063
（ｂ）ｐＳＹＮ－ＦＶＩＩＩ－１６８、１７５、１７２および１７４のクローニング（図
４Ａ－４Ｄ）
ｐＳＹＮ－ＦＶＩＩＩ－１６８、１７２、１７４および１７５は、ｐＳＹＮ－ＦＶＩＩ
Ｉ－１６１の誘導体である。Ｒ１６４５Ａ／Ｒ１６４８Ａ変異をｐＳＹＮ－ＦＶＩＩＩ－
１６１に導入して、ＳＣ－ＦＶＩＩＩアイソフォームを産生するｐＳＹＮ－ＦＶＩＩＩ－
１６８を形成し、さらなる半減期延長のために、ＡＥ２８８ ＸＴＥＮをＦＶＩＩＩ－Ｈ
ＣのＣ末端に直接融合した。ＦＶＩＩＩ半減期延長に対するＦｃおよびＸＴＥＮ技術の効
果を評価するために、ｐＳＹＮ－ＦＶＩＩＩ－１７５を構築するために、Ｄ´Ｄ３コドン
配列をｐＳＹＮ－ＦＶＩＩＩ－１６８から除去した。
ｐＳＹＮ－ＦＶＩＩＩ－１７２を構築するために、ＡＥ２８８ ＸＴＥＮ断片を、さら
なる半減期延長のためにＦＶＩＩＩ－ＨＣのＣ末端へと直接融合した。そして、Ｄ´Ｄ３
コドン配列を、ＦＶＩＩＩ半減期延長に対するＦｃおよびＸＴＥＮ技術の効果を評価する
ための、ｐＳＹＮ－ＦＶＩＩＩ－１７４を形成するために、Ｄ´Ｄ３コドン配列をｐＳＹ
Ｎ－ＦＶＩＩＩ－１７２から除去した。
（ｃ）ｐＳＹＮ－ＦＶＩＩＩ－１７０のクローニング（図４Ｅ）
ＦＶＩＩＩ半減期延長に対するＸＴＥＮおよびＤ´Ｄ３断片の効果を評価するために、
ｐＳＹＮ－ＦＶＩＩＩ－１７０を構築した。コドン配列ＶＷＦ－Ｄ１Ｄ２Ｄ´Ｄ３断片お
よびＢＤＤ－ＦＶＩＩＩを、発現キャスケットの５´および３´末端へと導入し、３５ａ
ａトロンビン開裂可能なリンカーがすぐ後に続くＡＥ２８８ ＸＴＥＮコドン配列を用い
て、ＶＷＦおよびＦＶＩＩＩ分子を接続した。細胞内プロセッシングの後、分泌されたタ
ンパク質は、ＡＥ２８８ ＸＴＥＮ／３５ａａトロンビン開裂可能なリンカーにより成熟
型ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩのＮ末端に連結されている成熟型ＶＷＦ分子のＤ´Ｄ３断片を含有
する、ポリペプチドを含有する。
ｐＳＹＮ－ＦＶＩＩＩ－１７０タンパク質配列（配列番号１０２）
Figure 0007022165000064
Figure 0007022165000065
実施例４：ＦＶＩＩＩおよびＶＷＦ欠損マウスにおける、ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ構築物を含
有する、ＸＴＥＮの水圧注入
図３および４のＤＮＡ構築物を含有するＸＴＥＮはともに、２～３の半減期延長因子と
組み合わされている。それらのＦＶＩＩＩ半減期延長の可能性を評価するために、図３お
よび図４のＤＮＡ構築物の選択群を、水圧注入（ＨＤＩ）により、１００ｕｇ／マウスの
投与量で、ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦダブルノックアウト（ＤＫＯ）マウスへと導入した。次い
で、眼窩腔血液採取により、血液試料を、ＨＤＩ後２４時間で採取した。ＨＤＩ後の血漿
ＦＶＩＩＩの活性は、ＦＶＩＩＩ発色アッセイにより分析され、結果は、表１７および図
５に示す。野生型ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩと比較して、ＤＮＡ構築物を含有するすべてのＸＴ
ＥＮは、ＨＤＩ後２４時間で、有意に高いＦＶＩＩＩ血漿活性を有していたことから、対
応する分子は、ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩよりも有意に長い循環タンパク質半減期を有していた
ことが示唆される。それら半減期延長因子の組み合わせ応用を、血友病動物においてさら
に評価した。
Figure 0007022165000066
水圧注入
水圧注入は、小動物（たとえばマウスおよびラット）の肝臓へ、効果的および安全に非
ウイルス遺伝子を送達する方法である。元々は、約５～７秒で、動物の体重の１０分の１
量の裸のプラスミドＤＮＡ／生理食塩水溶液（エンドトキシンフリー）を急速に注入する
ものとして特徴付けられていた。裸のプラスミドＤＮＡに対象の遺伝子が含有され、肝臓
において、動物の体重の１０分の１量で産生された。標的タンパク質は、注入されたＤＮ
Ａから肝臓において産生され、注入後２４時間以内で検出することができる。次いで、血
漿試料を採取し、発現されたタンパク質の治療性を検討する。
本明細書において実施されたすべての水圧注入について、０．９％の滅菌生理食塩水溶
液に溶解したプラスミドＤＮＡを２ｍｌ、尾静脈注射を介して、約４～７秒で２０～３５
グラムのマウスに送達させた。マウスは、正常な動作が戻るまで、最初の２～３時間、厳
密にモニターされた。眼窩腔血液採取を介して血液試料を採取した後、次いで、血漿試料
を得て、さらなる分析を行うまで－８０℃で保存した。
実施例５：ＸＴＥＮ挿入を含有するＦＶＩＩＩＦｃ－ＶＷＦヘテロ二量体に対する共トラ
ンスフェクションシステムのプラスミド構築（図６）
タンパク質産生量を増加させるために、タンパク質産生のための２つの共トランスフェ
クションシステム（３つのＤＮＡ構築物を含有する）を作成した。第一のＤＮＡ構築物は
、ＡＥ２８８ ＸＴＥＮ断片がＦＶＩＩＩ重鎖のＣ末端に直接融合され、その後に野生型
ＦＶＩＩＩ軽鎖断片（ｐＳＹＮ－ＦＶＩＩＩ－１７３、図６Ｂ）または、Ｒ１６４５Ａ／
Ｒ１６４８Ａ変異を有するＦＶＩＩＩ軽鎖断片（ｐＳＹＮ－ＦＶＩＩＩ－１６９、図６Ａ
）のいずれかが続き、次いで、ＦＶＩＩＩ軽鎖は単一Ｆｃ断片に直接融合されている、Ｆ
ＶＩＩＩ－Ｆｃ融合タンパク質をコードした。第二のＤＮＡ構築物は、Ｄ´Ｄ３－Ｆｃ融
合タンパク質をコードしているｐＳＹＮ－ＶＷＦ－０３１（実施例１）である。ＨＥＫ２
９３Ｆ細胞に、第三のプラスミド（ＰＣ５）と共に２つのプラスミドが８０：１５：５の
比率でトランスフェクトされた。合成されたタンパク質は、ＦＶＩＩＩ（ＸＴＥＮ）Ｆｃ
／Ｄ´Ｄ３Ｆｃヘテロ二量体およびＤ´Ｄ３Ｆｃ二量体として分泌され、そして、ＦＶＩ
ＩＩ（ＸＴＥＮ）Ｆｃ／Ｄ´Ｄ３Ｆｃヘテロ二量体は、タンパク質精製によりＤ´Ｄ３Ｆ
ｃ二量体から分離された。

ｐＳＹＮ－ＦＶＩＩＩ－１６９成熟型タンパク質配列（配列番号１０３）
Figure 0007022165000067
Figure 0007022165000068

ｐＳＹＮ－ＦＶＩＩＩ－１７３成熟型タンパク質配列（配列番号１０４）
Figure 0007022165000069
Figure 0007022165000070
実施例６．ＦＶＩＩＩ－１６９／ＶＷＦ－０３１およびＦＶＩＩＩ－１７３／ＶＷＦ－０
３１のタンパク質精製
接線流ろ過（ＴＦＦ）工程を用いて、澄まされた馴化培地を緩衝液交換した。次いで、
２工程クロマトグラフィプロセスを用いて、ＦＶＩＩＩ－１６９／ＶＷＦ－０３１または
ＦＶＩＩＩ－１７３／ＶＷＦ－０３１を精製した。弱い陰イオン交換樹脂を用いて、アフ
ィニティクロマトグラフィを行った。最終精製産物は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣの許容範囲の純
度であった。比活性は、Ｂドメイン欠損ＦＶＩＩＩと同等であった（ＦＶＩＩＩ発色アッ
セイおよびＡ２８０濃度で測定）。純度および本分子の各部分の存在は、ＳＤＳ－ＰＡＧ
Ｅおよびウェスタンブロッティングにより確認された。
実施例７．Ｏｃｔｅｔアッセイによる、ＦＶＩＩＩ－１６９／ＶＷＦ－０３１の、ＶＷＦ
結合能の評価
ＦＶＩＩＩ－１６９／ＶＷＦ－０３１の、ＶＷＦ結合能は、Ｂｉｏ－Ｌａｙｅｒ Ｉｎ
ｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ）を基にした測定（Ｏｃｔｅｔ ａｓｓａｙ）により
、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ３８４で、Ｔｒｉｓ結合緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２）を用いて、２５℃で得られ
た。ＦＶＩＩＩ結合を測定するためのＯｃｔｅｔアッセイは、ＡＰＳ Ｂｉｏｓｅｎｓｏ
ｒ上へのヒトｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ カタログ番号ＨＣＶＷＦ－０１９１）の疎水性固定化後の１．０％ウ
シ血清アルブミン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ カタログ番号００
１－０００－１６１）の結合に基づいた。簡潔に述べると、ｈｖＷＦ（２０ μｇ／ｍＬ
）をＴｒｉｓ緩衝液中で希釈し、６００秒間、ＡＰＳ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ全体にわた
ってロードし、反応プローブ上でおよそ３．０～３．５ｎｍの結合を得た。対照ＡＰＳプ
ローブは、基準差し引きのために、ｈｖＷＦの非存在下で、１．０％ＢＳＡと共にロード
した。ロードの後、すべてのプローブを、３００秒間、Ｔｒｉｓ緩衝液中でインキュベー
トし、新たな基準線を確立した。続いて、バイオセンサープローブを、ＦＶＩＩＩ－ＸＴ
ＥＮ １６９または、ＦＶＩＩＩＦｃ Ｄｒｕｇ基質（０、０．６、２、６、２０、６０
、２００、６００ＩＵ／ｍＬ）の溶液中で、５分間、室温でインキュベートし、次いで、
５分間の解離工程を行った。Ｏｃｔｅｔデータ分析ソフトウェアを用いて、結合応答（ｎ
ｍ）を、差し引きデータ（反応プローブから基準プローブを差し引いた）から導いた。Ｆ
ＶＩＩＩ－１６９／ＶＷＦ－０３１（図７）に対しては、固定化ＶＷＦへの結合が検出さ
れなかったことから、Ｄ´Ｄ３断片による、全長ＶＷＦ分子からのＦＶＩＩＩの遮蔽が完
全であったことが示された。
実施例８．ＨｅｍＡマウスおよびＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ ＤＫＯマウスにおける、ＦＶＩＩ
Ｉ－１６９／ＶＷＦ－０３１のＰＫ
ＦＶＩＩＩ－１６９／ＶＷＦ－０３１のＰＫプロファイルを、ＨｅｍＡマウスおよびＦ
ＶＩＩＩ／ＶＷＦ ＤＫＯマウスにおいて検証し、内因性ＶＷＦからＦＶＩＩＩ部分を遮
蔽するＤ´Ｄ３断片の能力を評価した。ＨｅｍＡマウスまたはＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ ＤＫ
Ｏマウスを、ＦＶＩＩＩ－１６９／ＶＷＦ－０３１の単回静脈内投与（２００ＩＵ／ｋｇ
）で処置して、次いで、血漿試料を、投与後、５分、８時間、２４時間、４８時間および
７２時間で採取した。血漿試料のＦＶＩＩＩ活性は、ＦＶＩＩＩ発色アッセイにより検証
し、ＦＶＩＩＩ－１６９／ＶＷＦ－０３１の半減期は、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎプログラムを
用いて算出した。
ＦＶＩＩＩ－１６９／ＶＷＦ－０３１に対し、固定化ＶＷＦへの構築物結合の完全な阻
害が、バイオレイヤー干渉法により示された（図７）。このことから、分子中のＤ´Ｄ３
断片は、天然型ＶＷＦ分子へのＦＶＩＩＩの結合を成功裏に妨害し、それにより、２つの
異なるマウス系統において、ＦＶＩＩＩ－１６９／ＶＷＦ－０３１は類似の半減期を有す
ることが予測された。図８Ａおよび表１８に示されるように、予測通り、ＦＶＩＩＩ－１
６９／ＶＷＦ－０３１は、ＨｅｍＡマウスおよびＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ ＤＫＯマウスの両
方において、類似のＰＫプロファイルを有していた（ＦＶＩＩＩＦｃ／ＶＷＦヘテロ二量
体の半減期は、内因性ＶＷＦの半減期とは無関係であることが示されている）。ＦＶＩＩ
ＩＦｃ／ＶＷＦヘテロ二量体の半減期と内因性ＶＷＦの半減期が異なることにより、ＦＶ
ＩＩＩが上限を超えて延長され、内因性ＶＷＦによって課せられていた半減期の限界の２
倍を超えて、ＦＶＩＩＩの半減期をさらに延長することが出来る可能性が生じる。
Figure 0007022165000071
ＸＴＥＮ挿入とＤ´Ｄ３断片の、ＦＶＩＩＩ防御活性を、ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ ＤＫＯ
マウスにおいてＦＶＩＩＩ－１６９／ＶＷＦ－０３１の半減期と、ＦＶＩＩＩ－１６９／
ＦｃおよびＦＶＩＩＩＦｃの半減期を比較することにより評価した。単回ＩＶ投与の後、
血液試料を、ＦＶＩＩＩ－１６９／ＶＷＦ－０３１に対しては、５分、８時間、２４時間
、４８時間および７２時間で採取し、ＦＶＩＩＩ－１６９／Ｆｃに対しては５分、８時間
、２４時間、３２時間、４８時間で採取し、ＦＶＩＩＩＦｃに対しては、５分、１、２、
４、６および８時間で採取した。血漿試料のＦＶＩＩＩ活性はＦＶＩＩＩ発色アッセイに
より検証し、ＦＶＩＩＩ－１５５／ＶＷＦ－０３１の半減期はＷｉｎＮｏｎｌｉｎプログ
ラムを用いて算出した。
実験結果を、図８Ｂおよび表１９に要約した。ｒＦＶＩＩＩＦｃは、ＶＷＦ保護の消失
により、ＤＫＯマウス中で、半減期は１．６時間であった。ＸＴＥＮ挿入がＦＶＩＩＩＦ
ｃ分子内へ導入された場合には、得られたＦＶＩＩＩ‐１６９／Ｆｃ分子は、ＸＴＥＮ挿
入により、半減期が４倍延長された（７時間の半減期）。最後に、Ｄ´Ｄ３断片が、分子
内に組み込まれ、ＦＶＩＩＩ－１６９／ＶＷＦ－０３１が形成された場合には、１７時間
の半減期が観察され、Ｄ´Ｄ３断片によって、さらに２．５倍、半減期が延長された。半
減期の改善に加え、平均滞留時間（ＭＲＴ）、クリアランス（Ｃｌ）およびＡＵＣの改善
もまた観察された（表１９に示す）。
ＦＶＩＩＩ－１６９／ＶＷＦ－０３１は、ＨｅｍＡマウスおよびＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ
ＤＫＯマウスの両方において、１７～１８時間のｔ１／２が得られた（ＶＷＦクリアラン
スにより課せられていた、ｔ１／２の延長限界の上限値）。さらなるｔ１／２延長因子を
この分子内に組み込んでもよい（たとえば、第二のＸＴＥＮをＦＶＩＩＩ内に挿入）。Ｄ
´Ｄ３断片とＸＴＥＮ挿入の相乗効果により、クリアランス経路からＦＶＩＩＩを完全に
防御することができる可能性があり、そして、ＦＶＩＩＩＦｃ／ＸＴＥＮ／ＶＷＦ変異体
により、最終的には、２倍のＦＶＩＩＩｔ１／２延長限界を超えることができるであろう
。
Figure 0007022165000072
実施例９：ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ変異体細胞培地は、Ｄ´Ｄ３発現ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ
ＤＫＯマウスにおけるＰＫを増強する
Ｄ´Ｄ３断片の、ＦＶＩＩ－ＸＴＥＮのｔ１／２を延長する能力を、Ｄ´Ｄ３発現ＦＶ
ＩＩＩ／ＶＷＦ ＤＫＯマウスモデル（実施例２に記述）において評価した。この実験に
おいては、循環中にＤ´Ｄ３二量体を導入するためにＶＷＦ－０２５を用いる代わりに、
ＶＷＦ－０２９構築物を用いて、循環中にＤ´Ｄ３単量体を導入した。ＦＶＩＩＩ－ＸＴ
ＥＮ変異体タンパク質を調製するために、小スケール（５０～１００ｍＬ）の一過性トラ
ンスフェクション培養培地を、トランスフェクション後４日目で調製し、細胞培養物を回
収し、ＰＫ実験に適したＦＶＩＩＩ活性の範囲（１０～２０ＩＵ／ｍＬ）になるまで濃縮
した。次いで、濃縮された細胞培地を、循環中にＤ´Ｄ３を有する、または有しないＦＶ
ＩＩＩ／ＶＷＦ ＤＫＯマウスにおける標準的なＰＫ実験に用いた。
１～３のＸＴＥＮ挿入を含有する、総数で６つのＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ変異体を、シス
テムにおいて検証し、それらのｔ１／２を表２０にまとめた、代表的な変異体のデータを
図９Ａにプロットした。
Ｄ´Ｄ３断片が循環中に存在するすべてのＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ変異体に対して半減期
の延長が観察され（表２０）、ＦＶＩＩＩ‐ＸＴＥＮがそのクリアランス経路からＤ´Ｄ
３により保護されたことが示された。さらに、ＨｅｍＡマウスにおける１４時間の半減期
と比較して、Ｄ´Ｄ３発現ＤＫＯマウスにおいて、ＬＳＤ００５５．０２１は２０．４時
間のｔ１／２を有していたことから（図９Ｂ、表２０）、ＦＶＩＩＩ分子が、２倍の半減
期延長という限界を最終的に突破したことが示される。ＦＶＩＩＩ（ＸＴＥＮ）／ＶＷＦ
分子のさらなる改変によって、さらに長いｔ１／２のＦＶＩＩＩが得られる可能性があり
、１週間に１度、またはそれよりも低い頻度での投与レジメンで済む、ＦＶＩＩＩタンパ
ク質をＨｅｍＡ患者にもたらすことが出来る可能性がある。
Figure 0007022165000073
Figure 0007022165000074
実施例１０：ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦダブルノックアウトマウス（ＤＫＯ）の血漿中の、ＶＷ
ＦおよびＸＴＥＮ含有ＦＶＩＩＩ変異体の安定性
ｒＦＶＩＩＩＦｃタンパク質変異体の血漿安定性を、ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦダブルノック
アウトマウス（ＤＫＯ）の血漿において検証した。安定性アッセイのために、ＨＥＫ２９
３細胞を、ｒＦＶＩＩＩＦｃまたはＦＶＩＩＩ－１６９（Ｂドメイン接合部分で挿入され
た、２８８ＡＥ ＸＴＥＮを有するｒＦＶＩＩＩＦｃ）を発現するプラスミド、およびＩ
ｇＧ－ＦｃまたはＶＷＦ－０３１（ＩｇＧ－Ｆｃに融合されたＶＷＦ Ｄ´Ｄ３領域）の
いずれかを発現するプラスミドと共トランスフェクションした。トランスフェクション後
４日目で、細胞培養培地を回収し、ＦＶＩＩＩ発色活性に基づき、３０ＩＵ／ｍＬまで濃
縮した。濃縮された細胞培養培地を、次いで、５ＩＵ／ｍＬのＦＶＩＩＩ活性をもたらす
ためにＤＫＯマウス血漿に添加し、３７℃でインキュベートした。発色アッセイによる活
性測定のために、異なる時点でアリコートを回収した。各時点での活性を二重で測定し、
平均活性を時間関数としてプロットした。ＦＶＩＩＩＦｃ（重鎖と軽鎖が非共有結合的相
互作用により共に保持されている二本鎖（ｄｃ）ＦＶＩＩＩ分子）の活性は、ＤＫＯマウ
ス血漿中で、時間と共に減少した（図１０）。ＦＶＩＩＩ－１６９：Ｆｃ（Ｂドメイン接
合部分で２８８ＡＥ ＸＴＥＮの挿入を含有する）の活性は、ｒＦＶＩＩＩＦｃと比較し
て、ゆっくりと低下したことから、ＸＴＥＮの挿入により安定性の増強がもたらされたこ
とが示された。ｉｎ ｖｉｖｏでＦＶＩＩＩの安定性を増強するためにＶＷＦを導入した
として、ＦＶＩＩＩ－１６９：ＶＷＦ－０３１の血漿安定性を評価した。このヘテロ二量
体（ＦＶＩＩＩ因子とＶＷＦ Ｄ´Ｄ３因子がＦｃの各ドメインの一部に融合されている
）は、ＦＶＩＩＩ－１６９：Ｆｃと比較して、さらなる血漿安定性を示したことから、Ｖ
ＷＦ Ｄ´Ｄ３ドメインおよびＸＴＥＮは、ｒＦＶＩＩＩＦｃの血漿安定性に対し相乗効
果を有することが示された。
実施例１１：Ｆｃ融合物、ＸＴＥＮ挿入およびＶＷＦのＤ´Ｄ３断片のＦＶＩＩＩ半減期
に対する効果
Ｆｃ融合物、ＸＴＥＮ挿入およびＶＷＦのＤ´Ｄ３断片のＦＶＩＩＩ半減期に対する効
果を評価するために、Ｂドメイン欠損組換えＦＶＩＩＩ（ｒＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ）、ｒＦ
ＶＩＩＩＦｃ、ＦＶＩＩＩ－１６９：ＦｃおよびＦＶＩＩＩ－１６９：ＶＷＦ－０３１の
薬物動態特性を、ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦダブルノックアウトマウス（ＤＫＯ）において評価
した。
ＤＫＯマウスを、ＦＶＩＩＩタンパク質の単回静脈内投与（２００ＩＵ／ｋｇ）で処置
し、血漿試料を、図１１に示される指定時点で採取した。血漿試料のＦＶＩＩＩ活性を、
ＦＶＩＩＩ発色アッセイにより分析し、半減期をＷｉｎＮｏｎｌｉｎ－Ｐｈｏｅｎｉｘプ
ログラムを用いて算出した。検証分子の薬物動態パラメーターを、表２１に示す。各ＦＶ
ＩＩＩ変異体に対する血漿ＦＶＩＩＩ活性の時間回帰曲線を図１１にプロットした。
改変していないＢＤＤ－ＦＶＩＩＩの半減期は、ＤＫＯマウスにおいて、０．２３時間
であり、ＦＶＩＩＩＦｃ融合タンパク質は、Ｆｃ：ＦｃＲｎ相互作用を介したＦＶＩＩＩ
Ｆｃタンパク質のリサイクルによって、ＤＫＯマウスにおける半減期は１．６６時間に延
長された。ＡＥＸＴＥＮポリペプチドの２８８残基が、ＦＶＩＩＩＦｃ分子内のＦＶＩＩ
ＩのＢドメイン領域へと組み込まれ、得られたＦＶＩＩＩ１６９／Ｆｃタンパク質の半減
期は、ＤＫＯマウスにおいて、さらに７．４１時間に延長されていた。最終的に、ＶＷＦ
のＤ´Ｄ３ドメインの付加により、ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３１ヘテロ二量体の半減
期は、ＤＫＯマウスにおいて、１７．９時間にまで延長された（図１１、表２１）。半減
期に加え、すべての他のＰＫパラメーターも、各因子の付加に比例して改善されていた（
表２１）。ＦＶＩＩＩは複数の半減期延長因子に対して耐容性であり、３つの因子のＦＶ
ＩＩＩ半減期延長に対する相乗効果により、ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ ＶＷＦヘテロ二量体
の半減期をさらに改善することができる。
Figure 0007022165000075
Figure 0007022165000076
実施例１２：異なるＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ＿ＶＷＦヘテロ二量体の薬物動態特性
ＦＶＩＩＩ半減期に対する、ＶＷＦ－Ｄ´Ｄ３断片とＸＴＥＮ挿入の組み合わせの効果
を評価するために、ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｆｃ：ＶＷＦ－Ｆｃヘテロ二量体の薬物動態
特性を、ＨｅｍＡマウスにおいて検証し、ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩの一本鎖アイソフォーム（
ｓｃＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ）およびＦＶＩＩＩ－１６９：ＶＷＦ－０３１（実施例１０）と
比較した。７つの新たなＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｆｃ構築物を作製した（タンパク質配列
は表２４に示す）。これら構築物の概略図は、図１４Ａ～Ｈに示す。ＦＶＩＩＩ－１９５
およびＦＶＩＩＩ－１９９はそれぞれ、ＦＶＩＩＩ二本鎖および一本鎖アイソフォームで
あり、各々、１９００位と１６５６位に２つのＸＴＥＮ挿入を含有する。ＦＶＩＩＩ－１
９６およびＦＶＩＩＩ－２０１は、それぞれ、ＦＶＩＩＩ二本鎖および一本鎖アイソフォ
ームであり、各々、２６位、１９００位と１６５６位に３つのＸＴＥＮ挿入を含有する。
ＦＶＩＩＩ－２０３、２０４および２０５は、Ｂドメインの接合部分および、１９００位
、４０３位、または１８位にそれぞれ、２つのＸＴＥＮ挿入を有するｓｃ－ＦＶＩＩＩＦ
ｃ分子である。各ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｆｃ構築物を、ＨＥＫ２９３細胞においてＶＷ
Ｆ－０３１と共に共発現させ、ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｆｃ／ＶＷＦヘテロ二量体タンパ
ク質を産生させた。トランスフェクション後４日目、細胞培養培地を回収し、ＦＶＩＩＩ
発色活性に基づき、２０ＩＵ／ｍＬまで濃縮（ＦＶＩＩＩ－１９５：ＶＷＦ－０３１、Ｆ
ＶＩＩＩ－１９６：ＶＷＦ－０３１、ＦＶＩＩＩ－１９９：ＶＷＦ－０３１、ＦＶＩＩＩ
－２０３：ＶＷＦ－０３１およびＦＶＩＩＩ－２０４：ＶＷＦ－０３１）、または、精製
（ｓｃＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩＩ－１６９：ＶＷＦ－０３１、ＦＶＩＩＩ－２０１
：ＶＷＦ－０３１ ａｎｄ ＦＶＩＩＩ－２０５：ＶＷＦ－０３１）のいずれかを行った
。ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｆｃ：ＶＷＦ－Ｆｃヘテロ二量体（ＦＶＩＩＩ－１６９：ＶＷ
Ｆ－０３１、実施例５）において、Ｄ´Ｄ３断片によって内因性ＶＷＦからＦＶＩＩＩ分
子は完全に分子間遮蔽されたことが示されているため、ＨｅｍＡマウスをＰＫ評価に選択
した。精製タンパク質または濃縮細胞培養培地を、８～１２週齢のＨｅｍＡマウスに、静
脈内投与によって、２００ＩＵ／１０ｍＬ／ｋｇの投与量で投与した。血漿試料は、投与
後、５分、８時間、１６時間、２４時間、３２時間、４８時間、７２時間、または９６時
間で採取した。血漿試料のＦＶＩＩＩ活性は、ＦＶＩＩＩ発色アッセイにより分析し、半
減期は、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ－Ｐｈｏｅｎｉｘプログラムを用いて算出した。検証分子の
薬物動態パラメーターは、表２２に示す。選択時点での、ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｆｃ／
ＶＷＦ－Ｆｃ変異体に対する血漿ＦＶＩＩＩ活性を、図１２Ａ～Ｃにプロットした。
ＸＴＥＮが１９００位および１６５６位に挿入された場合（ＦＶＩＩＩ－１９５および
ＦＶＩＩＩ－１９９）、ＦＶＩＩＩ－１６９：ＶＷＦ－０３１と比較して、中程度の半減
期改善がｓｃＦＶＩＩＩアイソフォーム（ＦＶＩＩＩ－１９９：ＶＷＦ－０３１）に対し
て観察された。しかしながら、ｄｃＦＶＩＩＩアイソフォームは、ＦＶＩＩＩ－１６９：
ＶＷＦ－０３１よりも短い半減期を示したことから、一本鎖アイソフォームは、対応する
二本鎖アイソフォームよりも有意に安定性が高いことが示唆された（表２２および図１２
Ａ）。第三のＸＴＥＮが２６位でＦＶＩＩＩ－１９９に組み込まれた場合、得られた分子
（ＦＶＩＩＩ－２０１：ＶＷＦ－０３１）の半減期は２４．６時間であり、ｓｃＢＤＤ－
ＦＶＩＩＩと比較して３倍超長い半減期の改善を示した（表２２および図１２Ｃ）。４０
３位（Ａ２ドメイン）、１９００位（Ａ３ドメイン）、および１８位（Ａ１ドメイン）で
の、第二のＸＴＥＮ挿入の半減期延長効果も検証した（それぞれ、ＢドメインＸＴＥＮ挿
入と組み合わせている）。Ａ２またはＡ３のＸＴＥＮ挿入の追加によって、さらなる半減
期延長は得られなかったが（表２２、図１２ｂ）、Ａ１挿入の追加により、ＦＶＩＩＩ－
ＸＴＥＮ－Ｆｃ：ＶＷＦ－Ｆｃヘテロ二量体の半減期はさらに２９．４時間まで延長され
た（表２２、図１２Ｃ）（ｓｃＢＤＤ－ＦＶＩＩＩよりも３倍超長い）。
ＸＴＥＮがＦＶＩＩＩＦｃ／ＶＷＦヘテロ二量体構築物に組み込まれた場合、得られた
分子の半減期改善の程度は様々であり、半減期と、ＸＴＥＮ挿入の部位またはＸＴＥＮ挿
入数のいずれの間にも、明らかな相関は認められなかったことから、ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥ
Ｎ－Ｆｃ／ＶＷＦヘテロ二量体の半減期は、ＸＴＥＮ挿入の数、またはＸＴＥＮ挿入の位
置よりもむしろ、分子全体の完全性により決定されることが示唆される。
ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｆｃ：ＶＷＦ－Ｆｃヘテロ二量体に対して観察された２４．６
時間および２９．４時間の半減期は、ＦＶＩＩＩ半減期延長の限界を１．６～２倍明らか
に超えていた。もしこの発見がＨｅｍＡ患者にも適用できるのであれば、ＦＶＩＩＩ予防
のための投与を、１週間に１度、またはより少ない頻度とすることができる。
Figure 0007022165000077
Figure 0007022165000078
ＦＶＩＩＩ分子へのＸＴＥＮの組み込みに加え、Ｄ´Ｄ３とＦｃ断片の間にリンカーと
してＸＴＥＮを組み込むことにより半減期延長の利点の可能性についても評価した。ＦＶ
ＩＩＩ－１５５（ｓｃＦＶＩＩＩＦｃ）を、ＨＥＫ２９３細胞において、ＶＷＦ－０３４
（ＡＥ２８８ ＸＴＥＮと３５残基のトロンビン開裂可能なリンカーを有するＶＷＦ－Ｆ
ｃ）と共発現させた。トランスフェクション後４日目に、細胞培養培地を回収し、ＦＶＩ
ＩＩ活性のアッセイに基づき、２０ＩＵ／ｍＬまで濃縮した。ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ ＤＫ
Ｏマウスに、濃縮した細胞培養培地を２００ＩＵ／１０ｍＬ／ｋｇで、単回静脈内投与で
投与した。血漿試料を、投与後５分、８時間、２４時間、４８時間、７２時間および９６
時間で採取した。血漿試料のＦＶＩＩＩ活性は、ＦＶＩＩＩ発色アッセイにより分析し、
血漿ＦＶＩＩＩ活性の回帰曲線を時間関数としてプロットした（図１３）。ＦＶＩＩＩ－
１５５／ＶＷＦ－０３４（ＦＶＩＩＩのＢドメイン接合部分にＡＥ２８８ ＸＴＥＮが挿
入されている）は、２つの分子に対する、重複する回帰曲線により図示されるように、Ｆ
ＶＩＩＩ－１６９／ＶＷＦ－０３１と同程度の半減期改善を示した（図１３）。ＶＷＦ－
ＦｃポリぺプチドへのＸＴＥＮ挿入により、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＢドメイン接合部
分でのＸＴＥＮ挿入によりもたらされるものと同程度の半減期改善が得られたことから、
ＦＶＩＩＩポリペプチドの分子内ＸＴＥＮ挿入と、ＶＷＦ－ＦｃポリペプチドのＶＷＦと
Ｆｃ因子の間の、ドメイン間ＸＴＥＮ挿入とが組み合わされた、ヘテロ二量体分子におい
て、さらに半減期を改善することが可能となる可能性が示唆される。
実施例１３Ａ：表２２に示されるＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ ＶＷＦヘテロ二量体に加え、異
なるＸＴＥＮ挿入、一本鎖ＦＶＩＩＩ、および二本鎖ＦＶＩＩＩの組成を含有するＦＶＩ
ＩＩ－ＸＴＥＮ ＶＷＦヘテロ二量体（表２３Ａ）を、薬物動態特性に関し、ＨｅｍＡに
おいて検証する。様々なＦＶＩＩＩ構築物（表２３Ｂ）およびＶＷＦ構築物（表２３Ｃ）
も、以下に開示する。ＨｅｍＡマウスを、ヘテロ二量体を２００ＩＵ／１０ｍＬ／ｋｇで
、単回静脈内投与で処置する。次いで、血漿試料は、投与後、５分、２４時間、４８時間
、７２時間、９６時間および１２０時間で採取する。血漿試料のＦＶＩＩＩ活性は、ＦＶ
ＩＩＩ発色アッセイにより分析し、半減期は、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ－Ｐｈｏｅｎｉｘプロ
グラムを用いて算出する。リストにあるヘテロ二量体のタンパク質配列は、表２５に示す
。
Figure 0007022165000079
Figure 0007022165000080
Figure 0007022165000081
Figure 0007022165000082
Figure 0007022165000083
実施例１３Ｂ：追加のＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ＿ＶＷＦヘテロ二量体の薬物動態特性
ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ＿ＶＷＦヘテロ二量体を、薬物動態特性に関し、ＨｅｍＡマウス
において検証した。検証したヘテロ二量体は、ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４、ＦＶＩ
ＩＩ２０５／ＶＷＦ０３４、ＦＶＩＩＩ２０５／ＶＷＦ０３６およびＦＶＩＩＩ２６６／
ＶＷＦ０３１である。ＨｅｍＡマウスに、２００ＩＵ／１０ｍＬ／ｋｇで、様々なヘテロ
二量体タンパク質を単回静脈内投与した。血漿試料を、投与後５分、２４、４８、７２、
９６および１２０時間で採取した。血漿試料のＦＶＩＩＩ活性は、ＦＶＩＩＩ発色アッセ
イにより分析し、半減期は、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ－Ｐｈｏｅｎｉｘプログラムを用いて算
出した。ＰＫの結果を、以下の表２４に示す。
Figure 0007022165000084
ｐＳＹＮＦＶＩＩＩ ０１０ヌクレオチド配列－（二本鎖ＦＶＩＩＩＦｃ）（配列番号１
２５）
Figure 0007022165000085
Figure 0007022165000086
Figure 0007022165000087
Figure 0007022165000088
ｐＳＹＮＦＶＩＩＩ ０１０タンパク質配列－（二本鎖ＦＶＩＩＩＦｃ）（配列番号１２
６）
Figure 0007022165000089
Figure 0007022165000090
実施例１４：血友病Ａマウスにおいて、３倍超の半減期延長を伴う、第ＶＩＩＩ凝固因子
の新規分子
ＦＶＩＩＩの新規分子は、２つのポリペプチド（１つは、ＦＶＩＩＩ配列内の１以上の
位置で挿入ＸＴＥＮを有する一本鎖Ｂドメイン欠損（ＢＤＤ）ＦＶＩＩＩからなり、もう
１つは、ＶＷＦのＤ´Ｄ３領域から構成される）を含有するように設計された。各ポリペ
プチドはまた、ＩｇＧ１のＦｃ領域に遺伝子組み換えにより融合され、Ｄ´Ｄ３領域がＦ
ＶＩＩＩ部分に結合するように正確に位置づけられた。得られたＦＶＩＩＩ変異体を、一
過性トランスフェクションによりＨＥＫ２９３細胞において発現させ、馴化培地から精製
した。ＦＶＩＩＩ活性はＦＶＩＩＩ発色アッセイにより評価し、薬物動態特性は、ＦＶＩ
ＩＩノックアウト（ＨｅｍＡマウス）マウスおよびＦＶＩＩＩ／ＶＷＦダブルノックアウ
ト（ＤＫＯ）マウスの両方において評価した。
ＸＴＥＮおよびＶＷＦのＤ´Ｄ３領域をｒＦＶＩＩＩへと組み込むことによって、融合
タンパク質は内因性ＶＷＦにより除去されず、循環半減期が延長された。この融合構造中
のＦＶＩＩＩは、ＶＷＦとの相互作用から完全に遮蔽されている（バイオレイヤー干渉法
（Ｏｃｔｅｔ）分析により測定）。これと一致して、ＨｅｍＡマウスおよびＤＫＯマウス
における薬物動態特性は同一であることが判明し、このことから、マウスにおける除去率
は、効果的にＶＷＦから離れたことによることが示唆される。ＸＴＥＮの長さ、およびＸ
ＴＥＮ挿入の位置の最適化により、ＶＷＦの限界（１６時間）を超えるタンパク質のサブ
セットを特定し、ＨｅｍＡマウスにおける循環半減期を３０時間まで増加させ、ＢＤＤ－
ＦＶＩＩＩを超える４倍の改善となった。重要なことは、これらのタンパク質は、その機
能性を維持していたことである（ＦＶＩＩＩ発色アッセイにより判定）。
ＶＷＦの従属が、治療用ＦＶＩＩＩの半減期の根本的な限界を設定している。ＶＷＦの
Ｄ´Ｄ３領域とＸＴＥＮの融合により半減期を延長させながら、ＦＶＩＩＩをＶＷＦクリ
アランス経路から離すことにより、４倍の半減期延長を伴う、ＦＶＩＩＩ新規分子が作製
された。これは、持続的効果のあるＦＶＩＩＩの開発における産業界全体の試みの中で、
半減期限界を超えた遺伝子組み換えＦＶＩＩＩの初の報告であり、血友病Ａの予防的処置
における、重大な進展となる可能性がある。
表２５：ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－ＦｃおよびＶＷＦ－Ｆｃ構築物のタンパク質配列

ＦＶＩＩＩ１９５タンパク質配列（アミノ酸１６５６および１９００で、２つの１４４
ＡＥ ＸＴＥＮを有する、二本鎖ＦＶＩＩＩＦｃ）（配列番号１０５）
Figure 0007022165000091
Figure 0007022165000092
ＦＶＩＩＩ１９６タンパク質配列（アミノ酸２６、１６５６および１９００で、３つの１
４４ ＡＥ ＸＴＥＮを有する、二本鎖ＦＶＩＩＩＦｃ）（配列番号１０６）
Figure 0007022165000093
Figure 0007022165000094
ＦＶＩＩＩ１９９タンパク質配列（アミノ酸１６５６および１９００で、３つの１４４
ＡＥ ＸＴＥＮを有する、一本鎖ＦＶＩＩＩＦｃ）（配列番号１０７）
Figure 0007022165000095
Figure 0007022165000096
ＦＶＩＩＩ２０１タンパク質配列（アミノ酸２６、１６５６および１９００で、３つの１
４４ ＡＥ ＸＴＥＮを有する、一本鎖ＦＶＩＩＩＦｃ）（配列番号１０８）
Figure 0007022165000097
Figure 0007022165000098
ＦＶＩＩＩ２０３タンパク質配列（２つのＡＥ ＸＴＥＮを有する一本鎖ＦＶＩＩＩＦｃ
；Ｂドメインで１つの２８８ＡＥ ＸＴＥＮを有し、アミノ酸１９００で、１つの１４４
ＡＥ ＸＴＥＮを有する）（配列番号１０９）
Figure 0007022165000099
Figure 0007022165000100
ＦＶＩＩＩ２０４タンパク質配列（２つのＡＥ ＸＴＥＮを有する一本鎖ＦＶＩＩＩＦｃ
；Ｂドメインで１つの２８８ＡＥ ＸＴＥＮを有し、アミノ酸４０３で、１つの１４４
ＡＥ ＸＴＥＮを有する）（配列番号１１０）
Figure 0007022165000101
Figure 0007022165000102
Figure 0007022165000103
ＦＶＩＩＩ２０５タンパク質配列（２つのＡＥ ＸＴＥＮを有する一本鎖ＦＶＩＩＩＦｃ
；Ｂドメインで１つの２８８ＡＥ ＸＴＥＮを有し、アミノ酸１８で、１つの１４４ Ａ
Ｅ ＸＴＥＮを有する）（配列番号１１１）
Figure 0007022165000104
Figure 0007022165000105
ｐＳＹＮ ＦＶＩＩＩ２６６タンパク質配列（Ｂドメインで２８８ＡＥ ＸＴＥＮ、およ
び、アミノ酸１８で４２ＡＥ ＸＴＥＮを有するＦＶＩＩＩ Ｆｃ）（配列番号１１２）
Figure 0007022165000106
Figure 0007022165000107
ｐＳＹＮ ＦＶＩＩＩ２６７タンパク質配列（Ｂドメインで２８８ＡＥ ＸＴＥＮ、およ
び、アミノ酸１８で７２ＡＥ ＸＴＥＮを有するＦＶＩＩＩ Ｆｃ）（配列番号１１３）
Figure 0007022165000108
Figure 0007022165000109
ｐＳＹＮ ＦＶＩＩＩ２６８タンパク質配列（アミノ酸１８で１４４ＡＥ-ＸＴＥＮを有
するＦＶＩＩＩ Ｆｃ）（配列番号１１４）
Figure 0007022165000110
Figure 0007022165000111
ｐＳＹＮ ＦＶＩＩＩ２６９タンパク質配列（アミノ酸１８で７２ＡＥ ＸＴＥＮを有す
るＦＶＩＩＩ Ｆｃ）（配列番号１１５）
Figure 0007022165000112
Figure 0007022165000113
ｐＳＹＮ ＦＶＩＩＩ２７１タンパク質配列（アミノ酸１８で４２ＡＥ ＸＴＥＮを有す
るＦＶＩＩＩ Ｆｃ）（配列番号１１６）
Figure 0007022165000114
Figure 0007022165000115
ｐＳＹＮ ＦＶＩＩＩ２７２タンパク質配列（アミノ酸１８で１４４ＡＥ ＸＴＥＮを有
し、Ｂドメインで２４４ＡＥ ＸＴＥＮを有するＦＶＩＩＩ（Ｆｃは無し））（配列番号
１１７）
Figure 0007022165000116
Figure 0007022165000117
ｐＳＹＮ ＶＷＦ０３１タンパク質配列（ＶＷＦ Ｄ１Ｄ２Ｄ´Ｄ３－４８ａａの長さの
トロンビン開裂可能ＧＳリンカー－Ｆｃ）（配列番号１１８）
Figure 0007022165000118
Figure 0007022165000119
ｐＳＹＮ ＶＷＦ０３４タンパク質配列（ＶＷＦ Ｄ１Ｄ２Ｄ´Ｄ３－２８８ＡＥ ＸＴ
ＥＮ－３５ａａの長さのトロンビン開裂可能ＧＳリンカー－Ｆｃ）（配列番号１１９）
Figure 0007022165000120
Figure 0007022165000121
ｐＳＹＮ ＶＷＦ０３６タンパク質配列（ＶＷＦ Ｄ１Ｄ２Ｄ´Ｄ－９８ａａの長さのト
ロンビン開裂可能ＧＳリンカー－Ｆｃ）（配列番号１２０）
Figure 0007022165000122
Figure 0007022165000123
ｐＳＹＮ Ｆｃ-０１５タンパク質配列（ＩｇＧ－Ｆｃドメイン）（配列番号１２１）
Figure 0007022165000124
実施例１５：ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｆｃ：ＶＷＦ－Ｆｃヘテロ二量体は、野生型ＢＤＤ
－ＦＶＩＩＩと比較して、正常なＦＶＩＩＩ特異的活性を維持している
ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｆｃ：ＶＷＦ－Ｆｃヘテロ二量体のＦＶＩＩＩ特異的活性を測
定した。ヘテロ二量体は、２ステップのクロマトグラフィプロセスを用いて精製した。弱
陰イオン交換樹脂を用いて、アフィニティクロマトグラフィを行った。最終精製産物は、
ＳＥＣ－ＨＰＬＣに受容可能な純度であった。特異的活性を、Ｂドメイン欠損ＦＶＩＩＩ
い（ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ）と比較した（ＦＶＩＩＩ発色アッセイおよびＡ２８０濃度によ
り測定）。データを表２６に示す。すべての検証分子は、ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩと同等のＦ
ＶＩＩＩ特異的活性を示した。分子の純度および各部分の存在は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよ
びウェスタンブロッティングにより確認した。
Figure 0007022165000125
ｒＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ／Ｄ´Ｄ３およびＢＤＤ－ＦＶＩＩＩの半減期を、ＨｅｍＡマ
ウスにおいて比較した（図１５、表２７）。図１５に示されるように、ｒＦＶＩＩＩ－Ｘ
ＴＥＮ／Ｄ´Ｄ３は、ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩにより得られた半減期よりも、４倍長い半減期
を示した。
Figure 0007022165000126
実施例１６：止血における、ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｆｃ：ＶＷＦ－Ｆｃヘテロ二量体の
有効性（ＦＶＩＩＩ活性）（ワンステージａＰＴＴアッセイにより測定）
止血におけるＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｆｃ：ＶＷＦ－Ｆｃヘテロ二量体の有効性を、Ｆ
ＶＩＩＩ特異的ａＰＴＴ活性により評価した（表２８にまとめる）。表２８に示されるよ
うに、ＶＷＦ Ｄ´Ｄ３断片の付加およびＦＶＩＩＩのドメイン内へのＸＴＥＮ挿入によ
り、ヘテロ二量体のＦＶＩＩＩ特異的ａＰＴＴ活性が減少する一方（ＦＶＩＩＩ１５５／
ＶＷＦ０３１データおよびＦＶＩＩＩ２０５／ＶＷＦ０３１データにより示される）で、
ＦＶＩＩＩ Ｂドメイン領域のＸＴＥＮ挿入またはＶＷＦ Ｄ´Ｄ３断片のＣ末端のＸＴ
ＥＮ挿入は、ＦＶＩＩＩ特異的ａＰＴＴ活性に悪影響を与えなかった（ＦＶＩＩＩ１６９
／ＶＷＦ０３１データおよびＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４データにより示される）。
二本鎖ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ（ｄｃＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ）と比較して、ＦＶＩＩＩ１５５／
ＶＷＦ０３１、ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３１、ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４およ
びＶＷＦ２０５／ＶＷＦ０３１は、それぞれ、２．５倍、２．８倍、２．６倍および、
５．５倍の特異的ａＰＴＴ活性の減少を示した。
Figure 0007022165000127
ＦＶＩＩＩ特異的ａＰＴＴアッセイ
ＦＶＩＩＩ変異体を、ａＰＴＴ緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ
－ＨＣｌ、１％ ＢＳＡ、ｐＨ７．４）を用いて線形アッセイ範囲（２００～１．６ｍＵ
／ｍＬ）で希釈した。その後に、５０μＬの希釈試料または標準物を、５０μＬの３７℃
、天然型ヒトＨｅｍＡのプールされた血漿、５０μＬの３７℃、ａＰＴＴ試薬（ＡＣＴＩ
Ｎ（登録商標）ＦＳＬ活性化セファロプラスチン試薬、Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ、参照
番号Ｂ４２１９－２）と混合し、３７℃、４分間、インキュベートした。次いで、５０μ
ｌの２０ｍＭ ＣａＣｌ２（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ［参照番号ＯＲＦＯ３７］）を試
薬混合物に添加して、凝固反応を開始させた。各試料の凝固時間（ＣａＣｌ２の添加から
、血塊形成開始までの時間の長さ）を用いて、ａＰＴＴ活性を、標準物（第８版 国際標
準ＦＶＩＩＩ濃縮物で作製された）に対して、算出した。特異的ａＰＴＴ活性は、ＯＤ２
８０により測定された各分子のタンパク質濃度に対して算出された。
実施例１７：ＨｅｍＡマウスおよび尾切断出血モデルにおける、ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ－
Ｆｃ：ＶＷＦ－Ｆｃヘテロ二量体のｉｎ ｖｉｖｏ有効性
ヘテロ二量体の止血有効性をさらに評価するために、ＨｅｍＡマウスおよび尾切断出血
モデルにおける、ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４および、ＦＶＩＩＩ２０５／ＶＷＦ０
３１の急性有効性を、ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩとの比較で評価した。ＨｅｍＡマウスを、２０
０、６５、および２０ＩＵ／ｋｇのＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ単回ＩＶ注射で処置し、尾切断損
傷後の失血対照レベルを作成した。２００ＩＵ／ｋｇのＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４
またはＦＶＩＩＩ２０５／ＶＷＦ０３１で処置されたマウスからの失血を、ＢＤＤ－ＦＶ
ＩＩＩで処置された対照群と比較して、止血における有効性を推定した。ビヒクル処置動
物を用いて、当該モデルの失血ベースラインを作成した。図１６に示されるように、ビヒ
クル処置動物と比較して、失血の有意な減少が、すべてのＦＶＩＩＩ処置群で観察された
（ｐ＜０．０５）。ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４および、ＦＶＩＩＩ２０５／ＶＷＦ
０３１の両方が、ＨｅｍＡマウス尾切断モデルにおいて有効であった。ＢＤＤ－ＦＶＩＩ
Ｉと比較して、ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４については約３倍低い有効性が観察され
た（６５ＩＵ／ｋｇ ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩおよび２００ＩＵ／ｋｇ ＦＶＩＩＩ１６９／
ＶＷＦ０３４は、同様の失血減少であった）。ＦＶＩＩＩ２０５／ＶＷＦ０３４に対して
は、１０倍の有効性減少が観察された（２０ＩＵ／ｋｇ ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩおよび２０
０ＩＵ／ｋｇ ＦＶＩＩＩ205／ＶＷＦ０３1は、同様の失血減少であった）。
ＦＶＩＩＩ１６９／ＶＷＦ０３４および、ＦＶＩＩＩ２０５／ＶＷＦ０３１は、ｒＢＤ
Ｄ－ＦＶＩＩＩと比較して同様の特異的ＦＶＩＩＩ発色活性を有しているが、ＦＶＩＩＩ
のａＰＴＴ活性およびｉｎ ｖｉｖｏ有効性の両方は、分子改変により減少していた。こ
れらのデータから、ＦＶＩＩＩ発色活性よりも、止血に対するｉｎ ｖｉｖｏ有効性を予
測するには、ＦＶＩＩＩ分子のａＰＴＴ活性のほうが、より正確な測定法であることが示
唆される。
ＨｅｍＡマウス尾切断出血マウス
８～１０週齢のオスのＨｅｍＡマウスを実験に用いた。尾切断の前に、マウスを、５０
ｍｇ／ｋｇのケタミン、０．５ｍｇ／ｋｇのデクスメデトミジンのカクテルで麻酔し、３
７℃のヒートパッド上に乗せ、体温を維持させた。次いで、マウスの尾を３７℃の水の中
に１０分間浸し、側血管脈を拡張させた。血管を拡張させた後、ｒＦＶＩＩＩまたはビヒ
クル溶液を、尾静脈から注射し、５分後、尾の末梢１ｃｍを、＃１１のストレージエッジ
の外科用メスを用いて切断した。流出した値を、１３ｍｌの３７℃に温めた生理食塩水へ
３０分間採取し、次いで、マウスを、麻酔下で両側開胸により安楽死させた。血液採取前
後の血液採取管の重量変化による重量測定で、失血量をグラム単位で定量し、それを失血
量ミリリットル（ｍＬ）へと変換した（１ｇの重量変化＝１ｍＬの失血）。
特定の実施態様に関する上記の記述は、当業者レベルの知識を用いることにより、本発
明の概念から逸脱することなく、および、他者が容易に実験を行うことなく、そのような
特定の実施態様の様々な応用を適用および／または改変することができるように、本発明
の一般的性質を全体的に明らかにするものである。それゆえ、本明細書に提示される教示
および指示に基づく、そのような応用および改変も、本開示の実施態様の均等の範囲およ
び意図の範囲内にある。本明細書の表現または専門用語は、限定ではなく、記述の目的の
ためであり、本明細書の表現または専門用語は、当業者により本教示および本指定を踏ま
えて解釈されるものである。
本発明の他の実施態様は、本明細書に開示される本発明の実施および明細書の事項から
、当業者には明らかである。明細書および実施例は、例示の目的のみえあり、本発明の真
の範囲および主旨は、以下の請求項により示されている。
本明細書に引用されている全ての特許および公表文献は、参照により、その全体で本明
細書に援用される。

Claims (17)

  1. ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットであって、（ｉ）第一のポリヌクレオチドおよび（ｉｉ）第二のポリヌクレオチドを含み、ここで、
    （ｉ）前記第一のポリヌクレオチドが、
    （ａ）ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ＶＷＦ）断片であって、ＶＷＦのＤ１ドメイン、Ｄ２ドメイン、Ｄ’ドメイン、およびＤ３ドメインを含む、ＶＷＦ断片
    （ｂ）第一のＸＴＥＮ配列、および
    （ｃ）第一のＦｃ領域
    を含む第一のポリペプチド鎖をコードし、
    （ｉｉ）前記第二のポリヌクレオチドが、
    （ａ）第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質であって、前記ＦＶＩＩＩタンパク質中に挿入された第二のＸＴＥＮ配列を有する、ＦＶＩＩＩタンパク質、および
    （ｂ）第二のＦｃ領域
    を含む第二のポリペプチド鎖をコードし、ここで、
    前記第二のポリヌクレオチドによりコードされる前記ＦＶＩＩＩタンパク質が、全長成熟ヒト第ＶＩＩＩ因子（配列番号４）のアミノ酸１～７４５を含み、前記第二のＸＴＥＮ配列が、配列番号４の残基７４５のすぐ下流に位置する挿入部位において前記ＦＶＩＩＩタンパク質内に挿入され、
    前記第一のポリペプチド鎖がＦＶＩＩＩ結合活性を有し、
    前記第二のポリペプチド鎖が凝固活性を有し、
    前記第一のＸＴＥＮ配列が、リンカーにより前記第一のＦｃ領域と連結されており、
    前記第一のＸＴＥＮ配列が、配列番号３６～４４および１２７～１３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、
    前記第二のＸＴＥＮ配列が、配列番号３６～４４および１２７～１３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、
    前記第一のポリペプチドが、前記ＶＷＦ断片、前記第一のＸＴＥＮ配列および前記第一のＦｃ領域を、Ｎ末端からＣ末端に、この特定の順序で含み、
    前記第二のポリペプチドが、前記ＸＴＥＮ挿入を有する前記ＦＶＩＩＩタンパク質および前記第二のＦｃ領域を、Ｎ末端からＣ末端に、この特定の順序で含み、
    前記第一のＦｃ領域が、ジスルフィド結合により前記第二のＦｃ領域と連結され、
    前記第一のポリペプチドと前記第二のポリペプチドがキメラタンパク質を形成し、かつ
    前記第一のＸＴＥＮ配列と前記第二のＸＴＥＮ配列が、前記キメラタンパク質の半減期を増加させる、
    ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセット。
  2. 前記第二のポリヌクレオチドにコードされる前記ＦＶＩＩＩタンパク質が、Ｂドメインまたはその一部を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセット。
  3. 前記第一のＸＴＥＮ配列が、前記ＶＷＦ断片のＣ末端と連結されており、前記第一のＦｃ領域が開裂可能なリンカーにより前記第一のＸＴＥＮ配列のＣ末端と連結される、請求項１または請求項２に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセット。
  4. 前記開裂可能なリンカーがトロンビンで開裂可能なリンカーである、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセット。
  5. 前記第二のポリヌクレオチドにコードされる前記ＦＶＩＩＩタンパク質が、一本鎖ＦＶＩＩＩアイソフォームである、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセット。
  6. 前記第一のポリヌクレオチドにコードされるＶＷＦの前記Ｄ’ドメインが、配列番号２のアミノ酸７６４～８６６と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセット。
  7. 前記第一のポリヌクレオチドにコードされるＶＷＦの前記Ｄ’ドメインが、配列番号２のアミノ酸７６４～８６６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセット。
  8. 前記第一のポリヌクレオチドにコードされるＶＷＦの前記Ｄ３ドメインが、配列番号２のアミノ酸８６７～１２４０と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセット。
  9. 前記第一のポリヌクレオチドにコードされる前記ＶＷＦ断片が、配列番号２のアミノ酸２３～１２４０と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセット。
  10. Ｐａｉｒｅｄ ｂａｓｉｃ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ Ｃｌｅａｖｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ（ＰＡＣＥ）をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセット。
  11. 請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットを含む、宿主細胞。
  12. 前記宿主細胞が、哺乳類細胞である、請求項１１に記載の宿主細胞。
  13. 前記哺乳類細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、またはＢＨＫ細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
  14. 前記哺乳類細胞が、ＨＥＫ２９３細胞である、請求項１３に記載の宿主細胞。
  15. 前記哺乳類細胞が、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
  16. 前記宿主細胞が、前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットで安定的にトランスフェクトされている、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  17. 請求項１６に記載の宿主細胞を含む、安定細胞株。
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