TWI667258B - 因子ｖｉｉｉ與ｘｔｅｎ及范威爾邦德（ｖｏｎ ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子蛋白質之複合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種嵌合蛋白，其包含含有VWF之D'域及D3域之VWF蛋白質、一或多個XTEN序列、及FVIII蛋白質，其中該VWF片段、該XTEN序列或該FVIII蛋白質係彼此連接或締合。該嵌合蛋白可進一步包含一或多個Ig恆定區或其部分(例如Fc區)。包含本發明之VWF片段之多肽鏈與包含連接於XTEN序列之FVIII蛋白質之多肽鏈結合或締合，且包含該VWF片段之該多肽鏈可阻止或抑制內源性VWF結合連接於該XTEN序列之該FVIII蛋白質。藉由阻止或抑制內源性VWF結合FVIII蛋白質，VWF片段可誘導包含FVIII蛋白質之嵌合蛋白之半衰期延長，其中該結合為FVIII之半衰期限制因素。本發明亦包括核苷酸、載體、宿主細胞、使用VWF片段或嵌合蛋白之方法。

Description

因子VIII與XTEN及范威爾邦德(VON WILLEBRAND)因子蛋白質之複合物及其用途
本發明係關於一種嵌合蛋白及其用途，特定言之，係關於一種因子VIII與XTEM及范威爾邦德(VON WILLEBRAND)因子蛋白質之複合物及其用於止血病症之治療劑之用途。
A型血友病(Haemophilia A)為一種由編碼凝血因子VIII(FVIII)之基因中之缺陷引起的流血病症且影響萬分之一至二之出生男嬰。Graw等人，Nat.Rev.Genet.6(6)：488-501(2005)。受A型血友病影響之患者可藉由輸注純化或重組產生之FVIII加以治療。然而，已知所有市售FVIII產品之半衰期皆為約8-12小時，從而需要頻繁地向患者進行靜脈內投藥。參見Weiner M.A.及Cairo,M.S.,Pediatric Hematology Secrets,Lee,M.T.,12.Disorders of Coagulation,Elsevier Health Sciences,2001；Lillicrap,D. Thromb.Res.122增刊4：S2-8(2008)。此外，已嘗試許多方法來延長FVIII半衰期。舉例而言，正在開發中的用以延長凝結因子之半衰期之方法包括聚乙二醇化、醣聚乙二醇化及與白蛋白結合。參見Dumont等人，Blood.119(13)：3024-3030(2012年1月13日線上發表)。然而，無論所用蛋白質工程改造如何，當前正在開發中之長效FVIII產品據報導具有有限半衰期-在臨床前動物模型中僅為約1.5至2小時。參見同上。已在人類中證明一致結果，例如相較於ADVATE®，據報導rFVIIIFc在A型血友病患者中之半衰期提高至多約1.7倍。參見同上。因此，儘管提高較少，但半衰期增加可指示存在其他T1/2限制因素。參見Liu,T.等人，2007 ISTH會議，摘要#P-M-035；Henrik,A.等人，2011 ISTH會議，摘要#P=MO-181；Liu,T.等人，2011 ISTH會議，摘要#P-WE-131。
血漿范威爾邦德因子(VWF)之半衰期為約12小時(在9至15小時之範圍內)。http：//www.nhlbi.nih.gov/guidelines/vwd/2_scientificoverview.htm(2011年10月22日最後訪問)。VWF半衰期可受以下許多因素影響：糖基化型態、ADAMTS-13(具有血栓反應素(thrombospondin)基元-13之去整合素(disintegrin)及金屬蛋白酶)及VWF中之各種突變。
在血漿中，95-98%之FVIII以與全長VWF形成之緊密非共價複合物形式循環。此複合物之形成對於維持活體內FVIII之適當血漿含量而言為重要的。Lenting 等人，Blood.92(11)：3983-96(1998)；Lenting等人，J.Thromb.Haemost.5(7)：1353-60(2007)。全長野生型FVIII主要以具有重鏈(MW 200kD)及輕鏈(MW 73kD)之雜二聚體形式存在。當FVIII由於在重鏈中之位置372及740處及輕鏈中之位置1689處發生蛋白水解而活化時，結合於FVIII之VWF自活化型FVIII移除。活化型FVIII連同活化型因子IX、鈣及磷脂一起(「因子X酶複合物(tenase complex)」)誘導因子X活化，從而產生大量凝血酶。凝血酶又接著裂解纖維蛋白原形成可溶性纖維蛋白單體，該等單體接著自發聚合形成可溶性纖維蛋白聚合物。凝血酶亦活化因子XIII，因子XIII連同鈣一起用於交聯及穩定化可溶性纖維蛋白聚合物，從而形成交聯(不溶性)纖維蛋白。活化型FVIII藉由蛋白水解自循環快速清除。
歸因於頻繁給藥及由給藥時程所致之不便，仍然需要開發不需要頻繁投藥之FVIII產品，亦即半衰期長於1.5至2倍半衰期限制之FVIII產品。
本發明係有關一種嵌合蛋白，其包含(i)包含范威爾邦德因子(VWF)之D'域及D3域之VWF片段，(ii)XTEN序列，及(iii)FVIII蛋白質，其中該VWF片段及該XTEN序列係由視情況選用之連接子連接且其中該VWF片段或該XTEN序列與該FVIII蛋白質連接或締合。嵌合蛋白可包含含有VWF片段、XTEN序列及FVIII蛋白 質之單一多肽鏈；或兩條多肽鏈，第一鏈包含VWF片段且第二鏈包含FVIII蛋白質，其中XTEN多肽連接於VWF片段或FVIII蛋白質。
在一個實施例中，本發明之嵌合蛋白包含含有以下之式：(a)V-X-FVIII，(b)FVIII-X-V，(c)V-X：FVIII，(d)X-V：FVIII，(e)FVIII：V-X，或(f)FVIII：X-V，其中V包含VWF片段，X包含一或多個XTEN序列，且FVIII包含FVIII蛋白質。連字符(-)可為連接子，例如可裂解連接子。
在另一實施例中，嵌合蛋白進一步包含(iv)連接於VWF片段、XTEN序列、FVIII蛋白質或其任何組合之免疫球蛋白(Ig)恆定區或其部分(亦指示為F1或第一Ig恆定區或其部分)。在其他實施例中，嵌合蛋白進一步包含另一Ig恆定區或其部分(亦指示為F2或第二Ig恆定區或其部分)。第一Ig恆定區或其部分可連接於VWF片段或XTEN序列，且第二Ig恆定區可連接於FVIII蛋白質。第一Ig恆定區、第二Ig恆定區或其部分或兩者可延長FVIII蛋白質之半衰期。
在一些實施例中，第二Ig恆定區或其部分(F2)藉由連接子(例如可加工連接子)連接於VWF片段。在其他實施例中，第二Ig恆定區或其部分(F2)與(第一)Ig恆定區或其部分(F1)締合。第二Ig恆定區或其部分(F2)與第一Ig恆定區或其部分(F1)可相同或不同。第二Ig恆定區或其部分可藉由共價鍵(例如二硫鍵)與Ig恆定區或其部分締合。連接於第一Ig恆定區或其部分之VWF片段亦可藉由非共價鍵與連接於第二Fc區之FVIII蛋白質締合。在某些實施例中，FVIII蛋白質可進一步包含一或多個連接於FVIII蛋白質之C末端或N末端或緊靠FVIII蛋白質中之一或多個胺基酸(例如一或多個XTEN插入位點)之下游插入的其他XTEN序列。在一些實施例中，相較於野生型FVIII或無VWF片段之FVIII蛋白質，FVIII蛋白質之半衰期延長。
在一些實施例中，嵌合蛋白包含含有以下之式：(g)V-L2-X-L1-F1：FVIII-L3-F2；(h)V-L2-X-L1-F1：F2-L3-FVIII；(i)F1-L1-X-L2-V：FVIII-L3-F2；(j)F1-L1-X-L2-V：F2-L3-FVIII；(k)V-L2-X-L1-F1-L4-FVIII-L3-F2；(l)F2-L3-FVIII-L4-F1-L1-X-L2-V；(m)FVIII-L3-F2-L4-V-L2-X-L1-F1；及(n)F1-L1-X-L2-V-L4-F2-L3-FVIII， 其中V包含VWF片段，L1、L2及L3各自包含視情況選用之連接子，例如可裂解連接子，L4為視情況選用之連接子，例如可加工連接子，FVIII包含FVIII蛋白質，X包含一或多個XTEN序列，F1包含視情況選用之第一Ig恆定區或其部分，F2包含視情況選用之第二Ig恆定區或其部分，且(：)為共價鍵或非共價鍵。
本發明亦係有關一種嵌合蛋白，其包含(i)FVIII蛋白質，(ii)XTEN序列，及(iii)Ig恆定區或其部分，其中該XTEN序列由視情況選用之連接子在該FVIII蛋白質之N末端或C末端連接於該FVIII蛋白質或緊靠該FVIII蛋白質中之一或多個胺基酸(例如一或多個插入位點)之下游插入且其中該Ig恆定區或其部分與該FVIII蛋白質或該XTEN序列連接或締合。在一個實施例中，適用於嵌合蛋白之Ig恆定區或其部分包含第一Fc區。在另一實施例中，嵌合蛋白進一步包含另一Ig恆定區或其部分。適用於本發明之另一Ig恆定區或其部分可包含例如藉由共價鍵與第一Fc區連接或締合之第二Fc區。在其他實施例中，第一Fc區藉由連接子(例如可加工連接子)連接於第二Fc區。
在其他態樣中，嵌合蛋白包含(i)FVIII蛋白質，(ii)XTEN序列，(iii)VWF片段，及(iv)Ig恆定區或其 部分，其包含VWF之D'域及D3域，其中該XTEN序列由視情況選用之連接子在該FVIII蛋白質之N末端或C末端連接於該FVIII蛋白質或緊靠該FVIII蛋白質中之一或多個胺基酸(例如一或多個插入位點)之下游插入，該VWF片段與該FVIII蛋白質或該XTEN序列連接或締合，且該Ig恆定區或其部分連接於該FVIII蛋白質、該XTEN序列、該VWF片段或其任何組合。嵌合蛋白之非限制性實例可包含含有以下之式：(1)FVIII(X1)-L1-F1：V-L2-X2-L3-F2；(2)FVIII(X1)-L1-F1：F2-L3-X2-L2-V；(3)F1-L1-FVIII(X1)：V-L2-X2-L3-F2；(4)F1-L1-FVIII(X1)；F2-L3-X2-L2-V；(5)FVIII(X1)-L1-F1-L4-V-L2-X2-L3-F2；(6)FVIII(X1)-L1-F1-L4-F2-L3-X2-L2-V；(7)F1-L1-FVIII(X1)-L4-V-L2-X2-L3-F2，或(8)F1-L1-FVIII(X1)-L4-F2-L3-X2-L2-V，其中FVIII(X1)包含FVIII蛋白質及一或多個XTEN序列，其中XTEN序列中之一或多者連接於FVIII蛋白質之N末端或C末端或緊靠FVIII蛋白質中之一或多個胺基酸(例如一或多個XTEN插入位點)之下游插入；L1、L2或L3各自包含視情況選用之連接子，例如可裂解連接子；L4為連接子，可加工連接子；X2包含一或多個XTEN序列； F1包含Ig恆定區或其部分；F2包含視情況選用之另一Ig恆定區或其部分，且V包含VWF片段；(-)為肽鍵或一或多個胺基酸；且(：)包含共價鍵或非共價鍵。
本發明之一個態樣為適用於嵌合蛋白之VWF片段不結合VWF清除受體，該VWF清除受體阻止或抑制FVIII蛋白質與內源性VWF之相互作用。因此，包含VWF片段之嵌合蛋白不經由VWF清除路徑清除。本發明之另一態樣為VWF片段能夠保護FVIII蛋白質免遭一或多種蛋白酶裂解、保護FVIII蛋白質免遭活化、穩定FVIII蛋白質之重鏈及/或輕鏈、或防止FVIII蛋白質由一或多種清除受體(scavenger receptor)清除。
由於VWF片段能夠阻止或抑制FVIII蛋白質與內源性VWF之間的相互作用，所以相較於無VWF片段之FVIII蛋白質，FVIII蛋白質之半衰期得以延長。在一個實施例中，FVIII蛋白質之半衰期延長至野生型FVIII之半衰期之至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍或至少約12倍長。在另一實施例中，FVIII蛋白質之半衰期為至少約10小時、至少約11小時、至少約12小時、至少約13小時、至少約14小時、至少約15小時、至少約16小時、至少約17小時、至少約18小時、 至少約19小時、至少約20小時、至少約21小時、至少約22小時、至少約23小時、至少約24小時、至少約36小時、至少約48小時、至少約60小時、至少約72小時、至少約84小時、至少約96小時或至少約108小時。
適用於嵌合蛋白之Ig恆定區或其部分包含由視情況選用之連接子(例如可裂解連接子)連接於VWF片段之第一Fc區。嵌合蛋白可進一步包含由視情況選用之連接子連接於FVIII蛋白質或XTEN序列、Ig恆定區或其部分、VWF片段或其任何組合之另一Ig恆定區或其部分。在一個實施例中，另一Ig恆定區或其部分由視情況選用之連接子連接於FVIII蛋白質。另一Ig恆定區或其部分可包含第二Fc區。
適用於本發明中之Ig恆定區或其部分與適用於本發明中之另一Ig恆定區或其部分相同或不同。
在一些態樣中，FVIII蛋白質在FVIII蛋白質之C末端或N末端連接於XTEN序列或緊靠成熟天然人類FVIII中之一或多個胺基酸(例如一或多個插入位點)之下游插入或其任何組合。FVIII蛋白質中之一或多個插入位點可位於FVIII蛋白質中一或多個選自由以下組成之群之域內：A1域、a1酸性區、A2域、a2酸性區、A3域、B域、C1域、C2域及其任何組合；或位於FVIII蛋白質中一或多個選自由以下組成之群之域之間：A1域與a1酸性區、a1酸性區與A2域、A2域與a2酸性區、a2酸性區與B域、B域與A3域、A3域與C1域、C1域與C2域及 其任何組合；或位於FVIII蛋白質中選自由以下組成之群之兩個域之間：A1域與a1酸性區、a1酸性區與A2域、A2域與a2酸性區、a2酸性區與B域、B域與A3域、A3域與C1域、C1域與C2域及其任何組合。
在一個實施例中，一或多個插入位點位於緊靠成熟天然人類FVIII(例如SEQ ID NO：4[成熟FVIII序列-全長])中之一或多個選自由表7、8、9、10、11中之胺基酸殘基或其任何組合組成之群之胺基酸的下游。
在另一實施例中，一或多個插入位點位於成熟天然人類FVIII之一或多個容許環中。在其他實施例中，一或多個插入位點位於成熟天然人類FVIII之a3區中。舉例而言，XTEN序列可緊靠對應於SEQ ID NO：4(全長成熟FVIII)之胺基酸1656之下游插入。在其他實施例中，FVIII蛋白質連接於至少兩個XTEN序列，第一XTEN序列插入在a3區內，且第二XTEN序列插入在FVIII蛋白質中之容許環(例如A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2)內。在其他實施例中，FVIII蛋白質連接於至少三個XTEN序列，第一XTEN序列插入在a3區內且第二XTEN序列及第三XTEN序列插入在FVIII蛋白質中之一或兩個容許環(例如A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2)內。
在某些實施例中，用於一或多個XTEN插入之一或多個插入位點緊靠一或多個選自由以下組成之群之胺基酸的下游： (1)胺基酸3，(2)胺基酸18，(3)胺基酸22，(4)胺基酸26，(5)胺基酸32，(6)胺基酸40，(7)胺基酸60，(8)胺基酸65，(9)胺基酸81，(10)胺基酸116，(11)胺基酸119，(12)胺基酸130，(13)胺基酸188，(14)胺基酸211，(15)胺基酸216，(16)胺基酸220，(17)胺基酸224，(18)胺基酸230，(19)胺基酸333，(20)胺基酸336，(21)胺基酸339，(22)胺基酸375，(23)胺基酸399，(24)胺基酸403，(25)胺基酸409，(26)胺基酸416，(26)胺基酸442，(28)胺基酸487，(29)胺基酸490，(30)胺基酸494，(31)胺基酸500，(32)胺基酸518，(33)胺基酸599，(34)胺基酸603，(35)胺基酸713，(36)胺基酸745，(37)胺基酸1656，(38)胺基酸1711，(39)胺基酸1720，(40)胺基酸1725，(41)胺基酸1749，(42)胺基酸1796，(43)胺基酸1802，(44)胺基酸1827，(45)胺基酸1861，(46)胺基酸1896，(47)胺基酸1900，(48)胺基酸1904，(49)胺基酸1905，(50)胺基酸1910，(51)胺基酸1937，(52)胺基酸2019，(53)胺基酸2068，(54)胺基酸2111，(55)胺基酸2120，(56)胺基酸2171，(57)胺基酸2188，(58)胺基酸2227，(59)胺基酸2277，及(60)其兩種或兩種以上組合。
在一些實施例中，插入一個XTEN。在一些實施例中，插入兩個XTEN。在一些實施例中，插入3個 XTEN。
在一特定實例中，第一XTEN緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸26之下游插入，且第二XTEN緊靠對應於SEQ ID NO：4(全長成熟FVIII)之胺基酸1720之下游插入。在另一實例中，第一XTEN緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸403之下游插入，且第二XTEN緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1720之下游插入。在一些實例中，第一XTEN緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656之下游插入，且第二XTEN緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1720之下游插入。在其他實例中，第一XTEN緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸26之下游插入，第二XTEN緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656之下游插入，且第三XTEN緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1720之下游插入。在其他實施例中，第一XTEN緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸403之下游插入，第二XTEN緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656之下游插入，且第三XTEN緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1720之下游插入。在其他實施例中，第一XTEN插入在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸403與404之間，第二XTEN緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656之下游插入，且第三XTEN緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1720之下游插入。在某些實施例中，第一XTEN緊靠對應於SEQ ID NO：4(全長成熟FVIII)之胺基酸26之下游插入，第二XTEN緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1720 之下游插入，且第三XTEN緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1900之下游插入。在一些實施例中，第一XTEN緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸26之下游插入，第二XTEN緊靠對應於SEQ ID NO：2之胺基酸1656之下游插入，第三XTEN緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1720之下游插入，且第四XTEN緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1900之下游插入。在另一實例中，XTEN緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸745之下游插入。在另一實例中，第一XTEN緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656之下游插入且第二XTEN緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1900之下游插入。在一些實施例中，第一XTEN緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸26之下游插入，第二XTEN緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656之下游插入，且第三XTEN緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1900之下游插入。在另一實例中，第一XTEN緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸403之下游插入且第二XTEN緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸745之下游插入。在一些實施例中，第一XTEN緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸745之下游插入，且第二XTEN緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1900之下游插入。在一些實施例中，第一XTEN緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸18之下游插入，且第二XTEN緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸745之下游插入。
在一些實施例中，FVIII蛋白質為雙鏈FVIII 同功異型物。在一些實施例中，FVIII蛋白質為單鏈FVIII同功異型物。
在一些實施例中，插入之XTEN為SEQ ID NO：39(AE288)。在一些實例中，插入之XTEN為SEQ ID NO：38及37(AG144及AE144)。在一些實例中，插入之XTEN為SEQ ID NO：37、38及37(AE144、AG144及AE144)。在一些實例中，插入之XTEN為SEQ ID NO：37及40(AE144及AE288)。
適用於本發明中之FVIII蛋白質可包含B域或其部分，例如SQ B域缺失之FVIII。在一個實施例中，FVIII蛋白質包含單鏈FVIII。在另一實施例中，單鏈FVIII在對應於全長成熟因子VIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基1648、殘基1645或兩者或SQ BDD因子VIII(SEQ ID NO：6)之殘基754、殘基751或兩者的殘基處含有至少一個胺基酸取代。在其他實施例中，胺基酸取代為除精胺酸以外之胺基酸。在一些實施例中，FVIII蛋白質包含FVIII之重鏈及FVIII之輕鏈，其中該重鏈與該輕鏈藉由金屬鍵彼此締合。
FVIII蛋白質可例如藉由含有至少一個使對低密度脂蛋白受體相關蛋白質(LRP)之親和力降低或消除與LRP之結合之胺基酸取代而對LRP具有低親和力或不結合LRP。此至少一個胺基酸取代可位於對應於全長成熟FVIII之殘基471、殘基484、殘基487、殘基490、殘基497、殘基2092、殘基2093或其兩種或兩種以上組合之 殘基處。在一特定實施例中，在殘基471、484或497處之胺基酸取代為除精胺酸以外之胺基酸，在殘基487處之胺基酸取代為除酪胺酸以外之胺基酸，在殘基2092處之胺基酸取代為除離胺酸以外之胺基酸，或在殘基2093處之胺基酸取代為除苯丙胺酸以外之胺基酸。
在一些實施例中，FVIII蛋白質含有至少一個胺基酸取代，其誘導FVIII蛋白質比無該取代之FVIII蛋白質更穩定。此等取代可位於FVIII蛋白質之A2域及A3域中，例如在對應於全長成熟FVIII之殘基664、殘基1826、殘基662、殘基1828或其兩種或兩種以上組合之殘基處。
適用於本發明之VWF片段包含共同能夠結合FVIII之D'域及D3域。VWF片段可包含與SEQ ID NO：2之胺基酸764至866至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之D'域胺基酸序列及/或與SEQ ID NO：2之胺基酸867至1240至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之D3域胺基酸序列。在一個實施例中，VWF片段為單體。在另一實施例中，VWF片段包含至少兩個VWF片段、至少三個VWF片段、至少四個VWF片段、至少五個VWF片段或至少六個VWF片段。VWF片段可包含與SEQ ID NO：2之胺基酸764至1240至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸。VWF片段可基本上由以下組成或由以下組成：SEQ ID NO：2之胺基酸764至1240。在某些實施例中， VWF片段可在對應於SEQ ID NO：2之殘基1099、殘基1142或殘基1099與1142兩者之殘基處含有至少一個胺基酸取代。在其他實施例中，VWF片段進一步包含VWF之D1域、D2域、或D1及D2域。
VWF片段可進一步包含選自由以下組成之群之VWF域：A1域、A2域、A3域、D4域、B1域、B2域、B3域、C1域、C2域、CK域、其一或多個片段及其任何組合。舉例而言，VWF片段可基本上由以下組成或由以下組成：(1)VWF之D'及D3域或其片段；(2)VWF之D1、D'及D3域或其片段；(3)VWF之D2、D'及D3域或其片段；(4)VWF之D1、D2、D'及D3域或其片段；或(5)VWF之D1、D2、D'、D3及A1域或其片段。在一些實施例中，VWF片段進一步包含VWF或FVIII之可操作地連接於VWF片段之信號肽。
適用於本發明中之一或多個連接子之長度為至少約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1200、1400、1600、1800或2000個胺基酸。在一些實施例中，一或多個連接子之長度為約1至約2000個胺基酸。在一個實施例中，一或多個連接子之長度為至少約20、35、42、48、73、75、95、98、144、288、324、333、576或864個胺基酸。在另一實施例中，一或多個 連接子包含gly/ser肽、XTEN序列或兩者。gly/ser肽之實例包括(但不限於)式(Gly4Ser)n(SEQ ID NO：139)或S(Gly4Ser)n(SEQ ID NO：140)，其中n為選自由以下組成之群之正整數：1、2、3、4、5、6、7、8、9及10。舉例而言，(Gly4Ser)n連接子可為(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：63)或(Gly4Ser)4(SEQ ID NO：138)。在一個實施例中，連接子包含在連接子之N末端之至少一個第一裂解位點、在連接子之C末端之至少一個第二裂解位點或兩者。在另一實施例中，連接子包含20個胺基酸、35個胺基酸、48個胺基酸、73個胺基酸或95個胺基酸的凝血酶(thrombin)可裂解連接子。可裂解連接子可包含一或多個由選自由以下組成之群之蛋白酶裂解的裂解位點：因子XIa、因子XIIa、胰舒血管素(kallikrein)、因子VIIa、因子IXa、因子Xa、因子IIa(凝血酶)、彈性蛋白酶(Elastase)-2、粒酶(Granzyme)-B、TEV、腸激酶、蛋白酶3C、分選酶(Sortase)A、MMP-12、MMP-13、MMP-17及MMP-20，例如TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK(SEQ ID NO：8)。一或多個裂解位點之非限制性實例包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：RRRR(SEQ ID NO：9)、RKRRKR(SEQ ID NO：10)、RRRRS(SEQ ID NO：11)、TQSFNDFTR(SEQ ID NO：12)、SVSQTSKLTR(SEQ ID NO：13)、DFLAEGGGVR(SEQ ID NO：14)、TTKIKPR(SEQ ID NO：15)、LVPRG(SEQ ID NO：16)、ALRPR(SEQ ID NO：17)、KLTRAET(SEQ ID NO：18)、DFTRVVG(SEQ ID NO：19)、 TMTRIVGG(SEQ ID NO：20)、SPFRSTGG(SEQ ID NO：21)、LQVRIVGG(SEQ ID NO：22)、PLGRIVGG(SEQ ID NO：23)、IEGRTVGG(SEQ ID NO：24)、LTPRSLLV(SEQ ID NO：25)、LGPVSGVP(SEQ ID NO：26)、VAGDSLEE(SEQ ID NO：27)、GPAGLGGA(SEQ ID NO：28)、GPAGLRGA(SEQ ID NO：29)、APLGLRLR(SEQ ID NO：30)、PALPLVAQ(SEQ ID NO：31)、ENLYFQG(SEQ ID NO：32)、DDDKIVGG(SEQ ID NO：33)、LEVLFQGP(SEQ ID NO：34)及LPKTGSES(SEQ ID NO：35)。在一些實施例中，第一裂解位點與第二裂解位點相同或不同。
適用於本發明之XTEN序列可選自由以下組成之群：AE42(SEQ ID NO：36)、AE144(SEQ ID NO：37)、AG144(SEQ ID NO：38)、AE288(SEQ ID NO：39)、AG288(SEQ ID NO：40)、AE576(SEQ ID NO：41).AG576(SEQ ID NO：42)、AE864(SEQ ID NO：43)、AE72(SEQ ID NO：127)、AE144_2A(SEQ IDN O：128)、AE144_3B(SEQ ID NO：129)、AE144_4A(SEQ ID NO：130)、AE144_5A(SEQ ID NO：131)、AE144_6B(SEQ ID NO：132)、AG144_A(SEQ ID NO：133)、AG144_B(SEQ ID NO：134)、AG144_C(SEQ ID NO：135)、AG144_F(SEQ ID NO：136)、AE288_2(SEQ ID NO：137)或AG864(SEQ ID NO：44)。在一特定實施例中，XTEN序列包含AE288或AG288。
本發明之嵌合蛋白可經聚唾液酸化、聚乙二醇化或羥乙基澱粉化。
本發明亦係有關一種編碼嵌合蛋白之聚核苷酸或一組編碼嵌合蛋白之聚核苷酸。聚核苷酸可進一步包含編碼PC5或PC7之聚核苷酸鏈。本發明亦係有關一種包含該聚核苷酸或該組聚核苷酸及一或多個可操作地連接於該聚核苷酸或該組聚核苷酸之啟動子的載體。載體可進一步包含含有編碼PC5或PC7之聚核苷酸鏈之另一載體。本發明亦係有關一種包含該聚核苷酸或該載體之宿主細胞。宿主細胞可為哺乳動物細胞，例如HEK293細胞、CHO細胞或BHK細胞。在一些實施例中，宿主細胞之PC5或PC7裂解VWF之D1D2域。
本發明亦係有關一種包含該嵌合蛋白、該聚核苷酸、該載體或該宿主細胞及醫藥學上可接受之載劑之醫藥組合物。因此，相較於野生型FVIII蛋白質，本發明之組合物具有延長之半衰期。FVIII蛋白質之半衰期延長至野生型FVIII之半衰期之至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍或至少約12倍長。因子VIII之半衰期為至少約17小時、至少約18小時、至少約19小時、至少約20小時、至少約21小時、至少約22小時、至少約23小時、至少約24小時、至少約25小時、至少約26小時、至少約27小時、至少約28小時、至少約29 小時、至少約30小時、至少約31小時、至少約32小時、至少約33小時、至少約34小時、至少約35小時、至少約36小時、至少約48小時、至少約60小時、至少約72小時、至少約84小時、至少約96小時或至少約108小時。
本發明之組合物可藉由選自由以下組成之群之途徑投與：局部投與、眼內投與、非經腸投與、鞘內投與、硬膜下投與及經口投與。在一個實施例中，組合物係經由非經腸投藥，例如靜脈內或皮下投藥加以投與。本發明之組合物適用於治療有需要之個體之流血疾病或病狀。流血疾病或病狀係選自由以下組成之群：流血凝血病症、關節積血、肌肉流血、口腔流血、出血、向肌肉中出血、口腔出血、創傷、頭部創傷、胃腸流血、顱內出血、腹內出血、胸內出血、骨折、中樞神經系統流血、咽後間隙中流血、腹膜後間隙中流血、髂腰肌鞘中流血及其任何組合。在一個實施例中，用嵌合蛋白治療之個體預定經歷手術。在另一實施例中，治療為預防性或按需治療。
本發明亦係有關一種阻止或抑制FVIII蛋白質與內源性VWF結合的方法，其包含向有需要之個體添加有效量之嵌合蛋白、聚核苷酸、載體、宿主細胞或組合物，其中VWF片段結合FVIII蛋白質且因此阻止或抑制內源性VWF之結合。本發明更係有關一種延長或增加FVIII蛋白質之半衰期之方法，其中該方法包含向有需要之個體添加有效量之嵌合蛋白、聚核苷酸、載體、宿主細 胞或組合物，其中VWF片段結合FVIII蛋白質且因此延長或增加FVIII蛋白質之半衰期。亦提供一種阻止或抑制FVIII蛋白質自細胞清除之方法，其中該方法包含向包含FVIII蛋白質或編碼該FVIII蛋白質之聚核苷酸之細胞添加有效量之嵌合蛋白、聚核苷酸、載體、宿主細胞或組合物，其中具有VWF活性之蛋白質結合FVIII蛋白質。適用於本發明方法之個體為動物，例如人類，例如罹患A型血友病之患者。
本發明亦提供一種治療有需要之個體之流血疾病或病症的方法，其包含投與有效量之嵌合蛋白、聚核苷酸、載體、宿主細胞或組合物，其中該流血疾病或病症係選自由以下組成之群：流血凝血病症、關節積血、肌肉流血、口腔流血、出血、向肌肉中出血、口腔出血、創傷、頭部創傷、胃腸流血、顱內出血、腹內出血、胸內出血、骨折、中樞神經系統流血、咽後間隙中流血、腹膜後間隙中流血及髂腰肌鞘中流血。治療可為預防性或按需治療。在一個實施例中，有效量為0.1μg/kg至500mg/kg。
本發明亦包括一種製備嵌合蛋白之方法，其包含用聚核苷酸或載體轉染一或多種宿主細胞及在宿主細胞中表現該嵌合蛋白。
圖1A-D. VWF片段之示意圖。圖1A展示適用於本發明之三個示範性VWF片段，例如VWF-002、 VWF-010及VWF-013。VWF-002含有SEQ ID NO：124之胺基酸1至477(SEQ ID NO：2之胺基酸764至1240)且合成為無前肽/肽原序列。除D'D3域之外，VWF-010亦含有D1D2域。除在SEQ ID NO：123之殘基336及379處取代半胱胺酸之丙胺酸殘基之外，VWF-013亦含有D1D2D'D3域。圖1B展示VWF-031，其含有藉由可裂解連接子(例如48個胺基酸之凝血酶可裂解連接子)融合於Ig恆定區或其部分(例如Fc區)的D1D2D'D3域。圖1C展示VWF-025，其為含於pLIVE載體中之編碼D1D2D'D3域之核苷酸序列；及VWF-029，其為pLIVE載體中之編碼具有兩個胺基酸取代C336A及C379A之D1D2D'D3域的核苷酸序列。圖1D展示包含肽原(D1及D2域)及成熟次單元(D'、D3、A1、A2、A3、D4、B1-3、C1-2域)之全長VWF片段。VWF片段為約250kDa蛋白質且藉由二硫化物鍵結形成多聚體(>20MDa)。VWF片段與FVIII(95-98%)締合成非共價複合物且接著藉由保護FVIII免遭蛋白酶裂解/活化、穩定化重鏈及輕鏈、及阻止FVIII由清除受體清除來延長FVIII之半衰期。VWF片段亦可藉由經由VWF受體清除FVIII-VWF複合物及阻止胞飲作用及使rFVIIIFc再循環來限制FVIII之半衰期。
圖2. rFVIII-XTEN(rFVIII-AE288或rFVIII-288AE)在VWF D'D3表現小鼠中或在FVIII及VWF雙重基因剔除(DKO)小鼠中之藥物動力學概況。圖2A展示流體動力學注射(HDI)D'D3域編碼質體DNA(VWF-025)(第-5 天)、靜脈內給與rFVIII-XTEN AE288(第0天)及PK樣品收集(第5天)之時間線。圖2B展示在D1D2D'D3小鼠中靜脈內給與rFVIII-XTEN288(倒三角)及在DKO小鼠中靜脈內給與rFVIII-XTEN288(菱形)之後藉由FVIII顯色分析量測的FVIII活性。圖2C展示在投與VWF-025之後的D'D3血漿含量(ng/mL)。X軸表示以小時計之時間。
圖3. 示範性VWF：FVIII雜二聚體構築體之示意圖。構築體具有表示為式FVIII-F1-L1-V-X-L2-F2之共同結構，但含有不同可變連接子之實例。所示構築體(FVIII-161)含有連接於第一Fc區及VWF片段之雜二聚FVIII(重鏈與輕鏈係藉由金屬鍵締合)，該VWF片段為連接於XTEN序列之VWF之D'及D3域(亦即SEQ ID NO：2之具有胺基酸取代C336A及C379A之胺基酸1至477)，該XTEN序列進一步連接於可裂解連接子及第二Fc區。FVIII-161中所含之XTEN序列為XTEN AE288序列，且連接子為具有35個胺基酸之凝血酶可裂解連接子。在FVIII-161中，連接於第一Fc區之FVIII蛋白質藉由可加工連接子連接於VWF片段。表現時，可加工連接子可由細胞內加工酶裂解，由此使得構築體成為彼此締合之三條多肽鏈。
圖4 為FVIII-VWF雜二聚體或單體實例之示意圖。FVIII-168、FVIII-175、FVIII-172、FVIII-174及FVIII170。構築體FVIII-168包含連接於第一Fc區之單鏈FVIII序列(在殘基1645及1648處具有丙胺酸殘基取代精 胺酸殘基)，該第一Fc區接著融合於藉由具有48個胺基酸之凝血酶可裂解連接子連接於第二Fc區之VWF片段。AE288 XTEN插入單鏈FVIII序列之B域中。第一Fc區與VWF片段之間的鍵聯包含能夠由細胞內加工酶裂解之連接子，亦即可加工連接子。構築體FVIII-175包含連接於AE288 XTEN及第一Fc區之單鏈FVIII(在殘基1645及1648處具有丙胺酸殘基取代精胺酸殘基)，該第一Fc區藉由連接子(例如可加工連接子)連接於第二Fc區。AE288 XTEN插入單鏈FVIII序列之B域中。構築體FVIII-172包含兩條多肽鏈，第一鏈包含融合於AE 288 XTEN之重鏈FVIII序列，第二鏈包含輕鏈FVIII序列、第一Fc區、連接子(例如可加工連接子)、VWF片段、凝血酶可裂解連接子(例如48個胺基酸)及第二Fc區。構築體FVIII-174包含兩條多肽鏈，第一鏈包含融合於AE288 XTEN之重鏈FVIII序列且第二鏈包含輕鏈FVIII、第一Fc區、連接子(例如可加工連接子)及第二Fc區。構築體FVIII-170包含VWF片段、AE288 XTEN、連接子(例如長度為35個胺基酸之凝血酶可裂解連接子)及單鏈FVIII序列。
圖5. 含有XTEN序列與Fc區之組合之FVIII/VWF雜二聚體的藥物動力學概況。在每只小鼠100μg之劑量下藉由流體動力學注射(HDI)向FVIII：VWF雙重基因剔除(DKO)小鼠投與構築體FVIII-161、FVIII-168及FVIII-172。在每只小鼠50μg之劑量下藉由HDI向FVIII：VWF DKO小鼠投與構築體FVIII-170。藉由FVIII 顯色分析，持續HDI後24小時分析HDI後血漿FVIII活性。將含有XTEN序列及Fc域之FVIII：VWF雜二聚體的FVIII活性與無VWF片段、XTEN序列及Fc域之BDD-FVIII的FVIII活性進行比較。
圖6. FVIII-VWF雜二聚體實例共轉染系統之示意圖。圖6A。構築體FVIII-169含有連接於Fc區之全長FVIII序列(在1645及1648處具有取代精胺酸殘基之丙胺酸殘基且在單鏈FVIII序列中插入XTEN序列)。VWF-031含有以48凝血酶可裂解連接子連接於另一Fc區之D1D2D'D3片段(在336及379處具有取代半胱胺酸殘基之丙胺酸殘基)。在細胞內加工之後，構築體FVIII-169產生融合於一個Fc片段及XTEN序列之全長單鏈FVIII(SCFVIII)，且構築體VWF-031產生連接於另一Fc片段之含477個胺基酸之D'D3片段。在連接於SC FVIII或D'D3片段之Fc片段之間可形成兩個共價鍵，此又允許FVIII與D'D3非共價締合。圖6B。構築體FVIII-173含有雜二聚FVIII序列，亦即連接於XTEN序列之重鏈FVIII序列及連接於Fc區之輕鏈FVIII序列。VWF-031係如上文所述。在細胞內加工之後，構築體FVIII-173產生雜二聚蛋白質，重鏈FVIII融合於XTEN序列，輕鏈FVIII融合於一個Fc片段，且構築體VWF-031產生連接於另一Fc片段之含477個胺基酸之D'D3片段。在連接於輕鏈FVIII或D'D3片段之Fc片段之間可形成兩個共價鍵，此又允許FVIII與D'D3非共價締合。
圖7. 含有XTEN序列及Fc域之示範性FVIII：VWF與固定hVWF在Octet分析中之結合親和力。使用基於生物層干涉量測術之量測法(Octet分析)測試FVIII-169/VWF-031及FVIII-057(rFVIIIFc)融合於固定hVWF之結合親和力。圖7A展示FVIII169及FVIIIFc藥物(陽性對照)對固定hVWF之以奈莫耳計之結合反應。圖7B展示人類IgG1(陰性對照)對固定人類VWF之結合反應。
圖8. FVIII-169在HemA小鼠及FVIII：VWF雙重基因剔除(DKO)小鼠中之藥物動力學(PK)概況。圖8A展示FVIII-169/VWF-031及FVIIIFc在HemA小鼠中之PK概況。HemA小鼠用單次靜脈內劑量之FVIII-169/VWF-031以200IU/kg治療。藉由FVIII顯色分析測試自小鼠收集之血漿樣品。使用WinNonlin程式計算FVIII-169/VWF-031之半衰期。圖8B展示FVIII-169/VWF-031、FVIII-169/Fc及FVIIIFc在FVIII/VWF DKO小鼠中之PK概況。
圖9. FVIII-XTEN變異體在D'D3表現FVIII/VWF DKO小鼠中之PK概況。圖9A展示FVIII-XTEN變異體、具有一個XTEN之FVIII、具有兩個XTEN之FVIII及具有三個XTEN之FVIII的PK概況比較。一個、兩個或三個XTEN插入FVIII之各種部分，包括C末端及B域中。CT指示XTEN連接於FVIII之C末端。插入位點B/CT指示一個XTEN插入在FVIII蛋白質之胺基 酸殘基745與胺基酸殘基746之間且另一XTEN連接於FVIII蛋白質之C末端。胺基酸殘基編號對應於SQ BDD FVIII蛋白質序列。插入位點1900/B/CT指示第一XTEN插入在FVIII之胺基酸殘基1900與胺基酸殘基1901之間，第二XTEN插入在FVIII之胺基酸殘基745與胺基酸殘基746之間，且第三XTEN連接於FVIII之C末端。用於投與FVIII-XTEN變異體之小鼠品系為表現D'D3域之DKO小鼠品系。圖9B展示具有三個XTEN插入之FVIII-XTEN之PK概況。向FVIII/VWF DKO小鼠或HemA小鼠投與FVIII-XTEN(1900/B/CT)變異體。比較FVIII-XTEN(1900/B/CT)之半衰期。
圖10. 藉由顯色分析量測之FVIIIFc(中空三角)、FVIII169：Fc(實心圓圈)及FVIII169：VWF31(中空三角)在小鼠DKO血漿中之FVIII活性。FVIII：Fc含有融合於Fc二聚體之雙鏈FVIII(重鏈及輕鏈)(亦即單體-二聚體雜交物)。在上文描述FVIII169(緊靠對應於成熟FVIII序列之胺基酸745之下游在B域中含有AE288)。FVIII169：Fc含有融合於Fc二聚體之FVIII169。除Fc二聚體之外，FVIII169：VWF31亦含有VWF31，FVIII169融合於第一Fc區且VWF31融合於第二Fc區，其中第一Fc區與第二Fc區形成共價鍵，例如一或多個二硫鍵。
圖11. Fc、XTEN及VWF-D'D3片段對FVIII半衰期延長之影響。向FVIII及VWF雙重基因剔除(DKO)小鼠投與BDD-FVIII(REFACTO®)(方塊)、FVIIFc(圓圈)、 FVIII169/Fc(三角)及FVIII169/VWF031(倒三角)。藉由顯色分析量測FVIII活性，且使用WinNonlin-Phoenix程式計算半衰期。X軸展示時間，且Y軸展示以mU/mL計之FVIII血漿活性。
圖12A-C. 在HemA小鼠中rFVIII-XTEN/VWF雜二聚體中之不同XTEN之作用。圖12A展示相較於緊靠對應於成熟FVIII序列之殘基745之下游含有XTEN的FVIII-169，緊靠對應於成熟FVIII序列(亦即FVIII-195(雙鏈FVIII同功異型物)及FVIII-199(單鏈FVIII同功異型物))之殘基1900及1656之下游插入之兩個XTEN之相對於5分鐘值校正的FVIII血漿活性(%)。在HemA小鼠中投與FVIII-169/VWF-031(實心圓圈)、FVIII-199/VWF-031(實心方塊)及FVIII-195/VWF031(中空方塊)以量測FVIII血漿活性。圖12B展示相較於FVIII-169(僅在B域中具有XTEN插入)，緊靠對應於成熟FVIII序列之殘基403(A2域)及745(B域)(亦即FVIII-203)以及殘基745(B域)及1900(A3域)(FVIII-204)之下游之第二XTEN插入的半衰期延長作用。向HemA小鼠投與FVIII-204/VWF031(實心三角)、FVIII-169/VWF-031(實心圓圈)、FVIII-203/VWF-031(實心方塊)及scBDD-FVIII(中空菱形)。X軸展示相對於5分鐘值校正之FVIII血漿活性(%)，且y軸展示以小時計之時間。圖12C展示相較於FVIII-169(在B域中具有單一XTEN插入)及無任何Fc區或任何XTEN之單鏈FVIII(亦即FVIII-207)，緊靠殘基 18(A1域)及745(B域)(亦即FVIII-205)之下游之兩個XTEN插入的半衰期延長作用。圖12C另外展示相較於FVIII-169(緊靠殘基745之下游具有單一XTEN插入)，緊靠殘基26(A1域)、1656(A3域)及1900(A3域)(亦即FVIII-201)之下游併入之三個XTEN插入的半衰期延長作用。向HemA小鼠投與FVIII-205/VWF-031(實心方塊)、FVIII-201/VWF-031(倒三角)、FVIII-169/VWF-031(實心圓圈)及FVIII-207(中空菱形)。隨以小時計之時間(Y軸)量測相對於5分鐘值校正之FVIII血漿活性(%)(X軸)。
圖13. rFVIII-XTEN/VWF-XTEN雜二聚體在FVIII/VWF DKO小鼠中之FVIII活性。藉由FVIII顯色分析來分析血漿樣品之FVIII活性，且繪製血漿FVIII活性(X軸)隨時間(Y軸)變化之回歸曲線。使FVIII-155(無任何XTEN之scFVIIIFc)與VWF-034(具有AE 288 XTEN加含35個殘基之凝血酶可裂解連接子之VWF-Fc)共表現。將FVIII-155/VWF-034之半衰期與具有插入FVIII之B域接合點(緊靠對應於成熟FVIII多肽之殘基745之下游)中之AE 288 XTEN的FVIII-169/VWF-031之半衰期進行比較。
圖14A-H. 各種rFVIII-XTEN/VWF構築體之示意圖。此等構築體亦描述於本文其他章節中。圖14A展示單鏈B域缺失之FVIII蛋白質(在本文中有時表示為scBDD-FVIII)。scBDD-FVIII構築體在殘基1645及1648處含有Arg取代為Ala之兩個取代。圖14B展示含兩條多肽鏈之構築體(FVIII155/VWF031)，第一鏈包含連接於Fc 區之無任何XTEN之單鏈FVIII且第二鏈包含連接於Fc區之VWF D'D3片段。此構築體用作對照。圖14C展示含兩條多肽鏈之構築體(FVIII199/VWF031)，第一鏈包含連接於Fc區之單鏈FVIII，其中第一XTEN緊靠對應於成熟FVIII序列之殘基1900之下游插入且第二XTEN緊靠對應於成熟FVIII序列之殘基1656之下游插入，且第二鏈包含連接於Fc區之VWF D'D3片段。圖14D展示含兩條多肽鏈之構築體(FVIII201/VWF031)，第一鏈包含連接於Fc區之單鏈FVIII蛋白質，其中第一XTEN緊靠對應於成熟FVIII序列之殘基26之下游插入，第二XTEN緊靠對應於成熟FVIII序列之殘基1656之下游插入，且第三XTEN緊靠對應於成熟FVIII序列之殘基1900之下游插入，且第二鏈包含連接於Fc區之VWF D'D3片段。圖14E展示含兩條多肽鏈之構築體(FVIII169/VWF031)，第一鏈包含連接於Fc區之單鏈FVIII蛋白質，其中XTEN緊靠對應於成熟FVIII序列之殘基745(表示為「B」)之下游插入，且第二鏈包含連接於Fc區之VWF D'D3片段。圖14F展示含兩條多肽鏈之構築體(FVIII203/VWF031)，第一鏈包含單鏈FVIII蛋白質，其中第一XTEN在對應於成熟FVIII序列之殘基745(「B」)處插入且第二XTEN在對應於成熟FVIII序列之殘基1900處插入，且第二鏈包含連接於Fc區之VWF D'D3片段。圖14G展示含兩條多肽鏈之構築體(FVIII204/VWF031)，第一鏈包含連接於Fc區之單鏈FVIII蛋白質，其中第一XTEN緊靠對應於成熟 FVIII序列之殘基403之下游插入且第二XTEN緊靠對應於成熟FVIII序列之殘基745(「B」)之下游插入，且第二鏈包含連接於Fc區之VWF D'D3片段。圖14H展示含兩條多肽鏈之構築體(FVIII205/VWF031)，第一鏈包含單鏈FVIII，其中第一XTEN緊靠對應於成熟FVIII序列之殘基18之下游插入且第二XTEN緊靠對應於成熟FVIII序列之殘基745(「B」)之下游插入，且第二鏈包含連接於Fc區之VWF D'D3片段。
圖15. rFVIII-XTEN/VWF及BDD-FVIII在FVIII/VWF DKO小鼠中之FVIII活性。藉由FVIII顯色分析來分析血漿樣品之FVIII活性，且繪製血漿FVIII活性(X軸)隨時間(Y軸)變化之回歸曲線。將rFVIII-XTEN/VWF(FVIII-205/VWF-031)之半衰期與BDD-FVIII及rFVIIIFc之半衰期進行比較。
圖16. 使用尾夾放血模型測定之FVIII-XTEN-Fc：VWF-Fc雜二聚體在HemA小鼠中之功效。HemA小鼠尾夾放血模型用於比較FVIII169/VWF034、FVIII205/VWF031及BDD-FVIII之功效。將200IU/kg之FVIII169/VWF034及FVIII205/VWF031之以ml計之中值失血量與200IU/kg BDD-FVIII、65IU/kg BDD-FVIII、20IU/kg BDD-FVIII、及媒劑進行比較。
定義
應注意術語「一(a/an)」實體係指一或多個彼實體；例如「一核苷酸序列」應理解成表示一或多個核苷酸序列。因此，術語「一」、「一或多個」及「至少一個」在本文中可互換使用。
術語「聚核苷酸」或「核苷酸」意欲涵蓋單個核酸以及複數個核酸，且係指經分離核酸分子或構築體，例如信使RNA(mRNA)或質體DNA(pDNA)。在某些實施例中，聚核苷酸包含習知磷酸二酯鍵或非習知鍵(例如醯胺鍵，諸如見於肽核酸(PNA)中)。術語「核酸」係指存在於聚核苷酸中之任何一或多個核酸區段，例如DNA或RNA片段。就「經分離」核酸或聚核苷酸而言，其意欲為已自天然環境移除之核酸分子.DNA或RNA。舉例而言，出於本發明之目的，載體中所含之編碼因子VIII多肽之重組聚核苷酸被視為經分離。經分離聚核苷酸之其他實例包括維持在異源宿主細胞中或自其他聚核苷酸純化(部分或實質上純化)之呈溶液形式之重組聚核苷酸。經分離RNA分子包括本發明聚核苷酸之活體內或活體外RNA轉錄物。本發明之經分離聚核苷酸或核酸進一步包括合成產生之此等分子。此外，聚核苷酸或核酸可包括調控元件，諸如啟動子、增強子、核糖體結合位點或轉錄終止信號。
如本文所用，「編碼區」或「編碼序列」為由可轉譯成胺基酸之密碼子組成之一部分聚核苷酸。儘管「終止密碼子」(TAG、TGA或TAA)通常不轉譯成胺基 酸，但其可被視為編碼區之一部分，然而任何側接序列(例如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止子、內含子及其類似序列)皆不為編碼區之部分。編碼區之邊界通常由在5'末端之起始密碼子(編碼所得多肽之胺基末端)及在3'末端之轉譯終止密碼子(編碼所得多肽之羧基末端)來確定。本發明之兩個或兩個以上編碼區可存在於單一聚核苷酸構築體中，例如在單一載體上，或存在於各別聚核苷酸構築體中，例如在各別(不同)載體上。則由此可見單一載體可僅含有單一編碼區，或包含兩個或兩個以上編碼區，例如單一載體可分別編碼如下所述之結合域A及結合域B。此外，本發明之載體、聚核苷酸或核酸可編碼融合或未融合於編碼本發明之結合域之核酸的異源編碼區。異源編碼區包括(但不限於)專門化元件或基元，諸如分泌信號肽或異源功能域。
由哺乳動物細胞分泌之某些蛋白質與分泌信號肽締合，一旦逐漸增長之蛋白質鏈跨越粗糙內質網之輸出已啟動，該信號肽即自成熟蛋白質裂解。一般技藝人士應瞭解信號肽通常融合於多肽之N末端，且自完全或「全長」多肽裂解以產生多肽之分泌或「成熟」形式。在某些實施例中，使用天然信號肽、或彼序列之保留引導與其可操作地締合之多肽分泌之能力的功能性衍生物。或者，可使用異源哺乳動物信號肽，例如人類組織血纖維蛋白溶酶原活化因子(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸酶(β-glucuronidase)信號肽或其功能性衍生物。
術語「下游」係指位於參照核苷酸序列之3'方向之核苷酸序列。在某些實施例中，下游核苷酸序列涉及在轉錄起始點之後之序列。舉例而言，基因之轉譯起始密碼子位於轉錄起始位點之下游。
術語「上游」係指位於參照核苷酸序列之5'方向之核苷酸序列。在某些實施例中，上游核苷酸序列涉及位於編碼區或轉錄起始點之5'側之序列。舉例而言，大多數啟動子位於轉錄起始位點之上游。
如本文所用，術語「調控區」係指位於編碼區之上游(5'非編碼序列)、內部或下游(3'非編碼序列)，且影響相關編碼區之轉錄、RNA加工、穩定性或轉譯之核苷酸序列。調控區可包括啟動子、轉譯前導序列、內含子、聚腺苷酸化識別序列、RNA加工位點、效應物結合位點及莖-環結構。若編碼區意欲在真核細胞中表現，則聚腺苷酸化信號及轉錄終止序列將通常位於編碼序列之3'方向。
編碼基因產物(例如多肽)之聚核苷酸可包括與一或多個編碼區可操作地締合之啟動子及/或其他轉錄或轉譯控制元件。在可操作締合中，基因產物(例如多肽)之編碼區以將該基因產物之表現置於調控區之影響或控制下的方式與一或多個調控區締合。舉例而言，若誘導啟動子功能會導致編碼由編碼區編碼之基因產物之mRNA轉錄，且若啟動子與編碼區之間的鍵聯之性質不干擾啟動子引導基因產物表現之能力或不干擾DNA模板被轉錄之能力， 則編碼區及啟動子係「可操作地締合」。除啟動子之外，其他轉錄控制元件(例如增強子、操縱子、阻遏子及轉錄終止信號)亦可與編碼區可操作地締合以引導基因產物表現。
多種轉錄控制區為熟習此項技術者所知。此等轉錄控制區包括(但不限於)在脊椎動物細胞中起作用之轉錄控制區，諸如(但不限於)來自巨細胞病毒(即刻早期啟動子，連同內含子-A一起)、猿猴病毒40(早期啟動子)及逆轉錄病毒(諸如勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus))之啟動子及增強子區段。其他轉錄控制區包括源於脊椎動物基因(諸如肌動蛋白(actin)、熱休克蛋白、牛生長激素及兔β-球蛋白)之彼等控制區、以及能夠控制真核細胞中之基因表現之其他序列。其他適合轉錄控制區包括組織特異性啟動子及增強子以及淋巴因子(lymphokine)誘導性啟動子(例如可由干擾素或介白素誘導之啟動子)。
類似地，多種轉譯控制元件為一般技藝人士所知。此等轉譯控制元件包括(但不限於)核糖體結合位點、轉譯起始及終止密碼子、及源於微小核糖核酸病毒之元件(特定言之內部核糖體進入位點或IRES，亦稱為CITE序列)。
如本文所用之術語「表現」係指聚核苷酸藉以產生基因產物(例如RNA或多肽)之過程。其包括(但不限於)聚核苷酸轉錄成信使RNA(mRNA)、轉移RNA(tRNA)、小髮夾RNA(shRNA)、小干擾RNA(siRNA) 或任何其他RNA產物，及mRNA轉譯成多肽。表現產生「基因產物」。如本文所用，基因產物可為核酸(例如藉由基因轉錄產生之信使RNA)或自轉錄物轉譯之多肽。本文所述之基因產物進一步包括具有轉錄後修飾(例如聚腺苷酸化或剪接)之核酸、或具有轉譯後修飾(例如甲基化、糖基化、添加脂質、與其他蛋白質次單元締合、或蛋白水解裂解)之多肽。
「載體」係指用於將核酸選殖及/或轉移至宿主細胞中之任何媒介物。載體可為可與另一核酸區段連接以達成所連接區段複製之複製子。「複製子」係指在活體內充當自主複製單元，亦即能夠在自身控制下複製之任何遺傳元件(例如質體、噬菌體、黏質體、染色體、病毒)。術語「載體」包括用於在活體外、離體或在活體內將核酸引入細胞中之病毒媒介物與非病毒媒介物兩者。此項技術中已知且使用許多載體，包括例如質體、經修飾真核病毒或經修飾細菌病毒。將聚核苷酸插入適合載體中可藉由將適當聚核苷酸片段連接至具有互補黏性末端之所選載體中來達成。
載體可經工程改造以編碼提供對已併有載體之細胞之選擇或鑒別的可選擇標記或報導體。可選擇標記或報導體之表現允許鑒別及/或選擇併有且表現載體上所含之其他編碼區之宿主細胞。此項技術中已知且使用之可選擇標記基因之實例包括：提供對胺苄青黴素(ampicillin)、鏈黴素(streptomycin)、健他黴素 (gentamycin)、康黴素(kanamycin)、潮黴素(hygromycin)、雙丙胺膦(bialaphos)除草劑、磺醯胺及其類似物之抗性之基因；及用作表型標記之基因，亦即花青素(anthocyanin)調控基因、異戊基轉移酶基因及其類似物。此項技術中已知且使用之報導體之實例包括：螢光素酶(luciferase，Luc)、綠色螢光蛋白(GFP)、氯黴素乙醯轉移酶(CAT)、-半乳糖苷酶(galactosidase，LacZ)、-葡糖醛酸酶(glucuronidase，Gus)及其類似物。可選擇標記亦可視為報導體。
術語「質體」係指染色體外元件，其常攜帶不為細胞之中心代謝之部分的基因，且通常呈環狀雙股DNA分子形式。此等元件可為源於任何來源之單股或雙股DNA或RNA之線性、環狀或超螺旋自主複製序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列，其中許多核苷酸序列已接合或重組成能夠將啟動子片段及所選基因產物之DNA序列連同適當3'未轉譯序列一起引入細胞中之獨特構造。
可使用之真核病毒載體包括(但不限於)腺病毒載體、逆轉錄病毒載體、腺相關病毒載體及痘病毒(例如牛痘病毒)載體、桿狀病毒載體或皰疹病毒載體。非病毒載體包括質體、脂質體、帶電荷脂質(細胞轉染劑)、DNA-蛋白質複合物及生物聚合物。
「選殖載體」係指一種「複製子」，其為依序複製且包含複製起點的單位長度之核酸(諸如質體、噬 菌體或黏質體)，另一核酸區段可與其連接以達成所連接區段之複製。某些選殖載體能夠在一個細胞類型(例如細菌)中複製且在另一細胞類型(例如真核細胞)中表現。選殖載體通常包含一或多種可用於選擇包含載體之細胞之序列及/或一或多個用於插入相關核酸序列之多選殖位點。
術語「表現載體」係指設計成使插入之核酸序列能夠在插入宿主細胞中之後表現之載體。插入之核酸序列安置成與如上所述之調控區可操作締合。
藉由此項技術中熟知之方法將載體引入宿主細胞中，該等方法例如轉染、電穿孔、顯微注射、轉導、細胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沈澱、脂質體轉染(溶酶體融合)、使用基因槍、或DNA載體轉運體(transporter)。
如本文所用之「培養(Culture/to culture)」意謂在允許細胞生長或分裂之活體外條件下培育細胞或意謂使細胞維持存活狀態。如本文所用之「培養細胞」意謂在活體外繁殖之細胞。
如本文所用，術語「多肽」意欲涵蓋單個「多肽」以及複數個「多肽」，且係指由藉由醯胺鍵(亦稱為肽鍵)線性連接之單體(胺基酸)構成之分子。術語「多肽」係指具有兩個或兩個以上胺基酸之任何一或多個鏈，且不指特定長度之產物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、「蛋白質」、「胺基酸鏈」或用於表示具有兩個或兩個以上胺基酸之一或多個鏈之任何其他術語均包括在「多肽」 之定義內且術語「多肽」可替代任何此等術語使用或可與任何此等術語互換使用。術語「多肽」亦意欲表示多肽之表現後修飾產物，該等修飾包括(但不限於)糖基化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、由已知保護/阻斷基團達成之衍生化、蛋白水解裂解、或由非天然存在之胺基酸達成之修飾。多肽可源於天然生物來源或藉由重組技術產生，但未必自指定核酸序列轉譯。其可以任何方式產生，包括藉由化學合成。
「經分離」多肽或其片段、變異體或衍生物係指不在天然環境中之多肽。不要求特定純化程度。舉例而言，經分離多肽可自其原生或天然環境簡單地移除。出於本發明之目的，在宿主細胞中表現之重組產生之多肽及蛋白質被視為經分離，已藉由任何適合技術分離、分級分離、或部分或實質上純化之天然或重組多肽亦視為經分離。
本發明中亦包括多肽之片段或變異體及其任何組合。術語「片段」或「變異體」在提及本發明之多肽結合域或結合分子時包括保留參照多肽之至少一些性質(例如FcRn結合域或Fc變異體之FcRn結合親和力、FVIII變異體之凝血活性、或VWF片段之FVIII結合活性)之任何多肽。除在本文中其他地方論述之特定抗體片段之外，多肽之片段亦包括蛋白水解片段以及缺失片段，但不包括天然存在之全長多肽(或成熟多肽)。本發明之多肽結合域或結合分子之變異體包括如上所述之片段以及胺 基酸序列歸因於胺基酸取代、缺失或插入而改變之多肽。變異體可為天然存在的或非天然存在的。非天然存在之變異體可使用此項技術已知之突變誘發技術來產生。變異型多肽可包含保守或非保守胺基酸取代、缺失或添加。
本文中使用之術語「VWF片段(VWF fragment/VWF fragments)」意謂與FVIII相互作用且保留至少一或多種通常由全長VWF提供給FVIII之性質之任何VWF片段，該等性質例如阻止過早活化成FVIIIa、阻止過早蛋白水解、阻止與磷脂膜進行可導致過早清除之締合、阻止結合可結合裸FVIII而非結合有VWF之FVIII之FVIII清除受體，及/或穩定化FVIII重鏈及輕鏈相互作用。
「保守胺基酸取代」為胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基置換之胺基酸取代。具有類似側鏈之胺基酸殘基之家族已在此項技術中定義，包括鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電荷極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、酥胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β-分支側鏈(例如酥胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因此，若多肽中之胺基酸經來自同一側鏈家族之另一胺基酸置換，則取代視為保守性取代。在另一實施例中，一串胺基酸可經側鏈家族成員 之順序及/或組成不同之在結構上類似之串保守置換。
如此項技術中所知，藉由比較一個多肽之胺基酸序列與第二多肽之序列來確定兩個多肽之間的「序列一致性」。當在本文中論述時，任何特定多肽是否與另一多肽至少約50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致可使用此項技術中已知之方法及電腦程式/軟體來確定，諸如(但不限於)BESTFIT程式(用於Unix之Wisconsin序列分析包，第8版，Genetics Computer Group,University Research Park,575 Science Drive,Madison,WI 53711)。BESTFIT使用Smith及Waterman,Advances in Applied Mathematics 2：482-489(1981)之局部同源性算法以得到兩個序列之間的最佳同源性區段。當使用BESTFIT或任何其他序列比對程式來確定特定序列與本發明之參照序列是否例如95%一致時，當然設置參數以便計算參照多肽序列全長上之一致性百分比且允許同源性間隙佔參照序列中之胺基酸總數之至多5%。
如本文所用，藉由比對以使第一VWF或FVIII序列與第二VWF或FVIII序列之間的一致性或相似性達到最大來鑒別VWF序列或FVIII蛋白質序列中之「對應於...之胺基酸」或「等效胺基酸」。用於鑒別第二VWF或FVIII序列中之等效胺基酸之編號係基於用於鑒別第一VWF或FVIII序列中之相應胺基酸之編號。
如本文所用，術語「插入位點」係指FVIII多 肽或其片段、變異體或衍生物中緊靠可插入異源部分之位置之上游的位置。以編號指定「插入位點」，該編號為成熟天然FVIII(SEQ ID NO：4)中由插入位點所對應之胺基酸的編號，該胺基酸緊靠插入位置之N端方向。舉例而言，片語「a3在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656之插入位點處包含XTEN」指示異源部分位於對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656及胺基酸1657之兩個胺基酸之間。
如本文所用之片語「緊靠胺基酸之下游」係指緊接於胺基酸之末端羧基之位置。類似地，片語「緊靠胺基酸之上游」係指緊接於胺基酸之末端胺基之位置。因此，如本文所用之片語「在插入位點之兩個胺基酸之間」係指XTEN或任何其他多肽插入在兩個相鄰胺基酸之間所處之位置。因此，片語「緊靠胺基酸之下游插入」及「插入在插入位點之兩個胺基酸之間」與「在插入位點處插入」同義使用。
如本文所用之術語「插入」、「經插入」、「插入...中」或語法相關術語係指相對於天然成熟人類FVIII中之類似位置，XTEN在嵌合多肽中之位置。如本文所用，該等術語係指重組FVIII多肽相對於天然成熟人類FVIII之特徵，且不指示、暗示或意指製備嵌合多肽之任何方法或過程。舉例而言，對於本文提供之嵌合多肽，片語「將XTEN緊靠FVIII多肽之殘基745之下游插入」意謂該嵌合多肽在緊靠對應於天然成熟人類FVIII中之胺基酸745之胺基酸的下游包含XTEN，其例如由對應於天 然成熟人類FVIII之胺基酸745及746之胺基酸所界定。
「融合」或「嵌合」蛋白包含第一胺基酸序列連接於在自然界中其未天然連接之第二胺基酸序列。通常存在於各別蛋白質中之胺基酸序列可集合在一起形成融合多肽，或通常存在於同一蛋白質中之胺基酸序列可以新排列安置在融合多肽中，該融合多肽例如為本發明之因子VIII域與Ig Fc域之融合體。例如藉由化學合成，或藉由產生並轉譯肽區以所要關係編碼之聚核苷酸來產生融合蛋白。嵌合蛋白可進一步包含藉由共價非肽鍵或非共價鍵與第一胺基酸序列締合之第二胺基酸序列。
如本文所用，術語「半衰期」係指特定多肽在活體內之生物半衰期。半衰期可由向個體投與之量的一半自動物中之循環及/或其他組織清除所需要的時間表示。當構建指定多肽作為時間之函數之清除曲線時，曲線通常為雙相的，具有快速α相及較長β相。α相通常表示所投與Fc多肽在血管間隙內與血管間隙外之間達到平衡且部分地由多肽之大小決定。β相通常表示多肽在血管內間隙中之分解代謝。在一些實施例中，FVIII及包含FVIII之嵌合蛋白為單相的，且因此不具有α相，而僅具有單一β相。因此，在某些實施例中，如本文所用之術語半衰期係指多肽在β相中之半衰期。人類抗體在人類中之典型β相半衰期為21天。
如本文所用之術語「連接」係指第一胺基酸序列或核苷酸序列分別共價或非共價接合於第二胺基酸序 列或核苷酸序列。第一胺基酸或核苷酸序列可直接接合或毗連於第二胺基酸或核苷酸序列，或者介入序列可將第一序列共價接合於第二序列。術語「連接」不僅意謂第一胺基酸序列在C末端或N末端融合於第二胺基酸序列，而且亦包括將整個第一胺基酸序列(或第二胺基酸序列)插入第二胺基酸序列(或相應地第一胺基酸序列)中之任何兩個胺基酸中。在一個實施例中，第一胺基酸序列可藉由肽鍵或連接子連接於第二胺基酸序列。第一核苷酸序列可藉由磷酸二酯鍵或連接子連接於第二核苷酸序列。連接子可為肽或多肽(用於多肽鏈)或核苷酸或核苷酸鏈(用於核苷酸鏈)或任何化學部分(用於多肽與聚核苷酸鏈兩者)。術語「連接」亦藉由連字符(-)加以指示。
如本文所用，術語「與...締合」係指在第一胺基酸鏈與第二胺基酸鏈之間形成共價或非共價鍵。在一個實施例中，術語「與...締合」意謂共價非肽鍵或非共價鍵。此締合可由冒號，亦即(：)指示。在另一實施例中，其意謂除肽鍵之外之共價鍵。舉例而言，胺基酸半胱胺酸包含可與第二半胱胺酸殘基上之硫醇基形成二硫鍵或二硫橋之硫醇基。在大多數天然存在之IgG分子中，CH1區與CL區藉由二硫鍵締合且兩個重鏈藉由在對應於239及242之位置處的兩個二硫鍵締合，該等位置係使用Kabat編號系統(位置226或229，EU編號系統)。共價鍵之實例包括(但不限於)肽鍵、金屬鍵、氫鍵、二硫鍵、σ鍵、π鍵、δ鍵、糖苷鍵、抓氫鍵、彎曲鍵、偶極鍵、π反向 鍵、雙鍵、參鍵、四鍵、五鍵、六鍵、結合、超結合、芳香性、哈普托數(hapticity)或反鍵結。非共價鍵之非限制性實例包括離子鍵(例如陽離子-π鍵或鹽鍵)、金屬鍵、氫鍵(例如二氫鍵、二氫複合物、低障壁氫鍵、或對稱氫鍵)、凡得瓦(Van der Walls)力、倫敦分散力(London dispersion force)、機械鍵、鹵素鍵、親金性、插入、堆疊、熵力或化學極性。
本文使用之術語「單體-二聚體雜交物」係指包含藉由二硫鍵彼此締合之第一多肽鏈及第二多肽鏈之嵌合蛋白，其中該第一鏈包含凝結因子(例如因子VIII)及第一Fc區，且該第二鏈包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：無凝結因子之第二Fc區。因此，單體-二聚體雜交物構築體為一種雜交物，其包含僅具有一個凝結因子之單體態樣及具有兩個Fc區之二聚體態樣。
如本文所用，術語「裂解位點」或「酶促裂解位點」係指由酶識別之位點。某些酶促裂解位點包含細胞內加工位點。在一個實施例中，多肽具有由在凝結級聯期間活化之酶裂解之酶促裂解位點，使得此等位點之裂解發生在凝塊形成之部位。示範性此類位點包括例如由凝血酶、因子XIa或因子Xa識別者。示範性FXIa裂解位點包括例如TQSFNDFTR(SEQ ID NO：45)及SVSQTSKLTR(SEQ ID NO：46)。示範性凝血酶裂解位點包括例如DFLAEGGGVR(SEQ ID NO：47)、TTKIKPR(SEQ ID NO：48)、LVPRG(SEQ ID NO：49)及ALRPR(SEQ ID NO：50之胺基酸1至5)。其他酶促裂解位點在此項技術中為已知的。
如本文所用，術語「加工位點」或「細胞內加工位點」係指多肽中一種類型之酶促裂解位點，其為在該多肽轉譯之後起作用之酶的目標。在一個實施例中，此等酶在自高爾基體內腔(Golgi lumen)轉運至反面高爾基體(trans-Golgi)區室期間起作用。細胞內加工酶在蛋白質自細胞分泌之前裂解多肽。此等加工位點之實例包括例如由內肽酶之PACE/弗林蛋白酶(furin)(其中PACE為成對鹼性胺基酸裂解酶(Paired basic Amino acid Cleaving Enzyme)之頭字語)家族所靶向者。此等酶定位於高爾基體膜且在序列基元Arg-[任何殘基]-(Lys或Arg)-Arg之羧基端側上裂解蛋白質。如本文所用，「弗林蛋白酶」酶家族包括例如PCSK1(亦稱為PC1/Pc3)、PCSK2(亦稱為PC2)、PCSK3(亦稱為弗林蛋白酶或PACE)、PCSK4(亦稱為PC4)、PCSK5(亦稱為PC5或PC6)、PCSK6(亦稱為PACE4)、或PCSK7(亦稱為PC7/LPC、PC8或SPC7)。其他加工位點在此項技術中為已知的。
在包括一個以上加工或裂解位點之構築體中，應瞭解此等位點可相同或不同。
術語「弗林蛋白酶」係指對應於EC編號3.4.21.75之酶。弗林蛋白酶為枯草桿菌蛋白酶樣前蛋白轉化酶，其亦稱為PACE(成對鹼性胺基酸裂解酶(Paired basic Amino acid Cleaving Enzyme))。弗林蛋白酶使無活 性前驅體蛋白質之部分缺失以將其轉化成生物活性蛋白質。在其細胞內轉運期間，VWF之肽原可由弗林蛋白酶自成熟VWF分子裂解。在一些實施例中，弗林蛋白酶自VWF之D'D3裂解D1D2。在其他實施例中，編碼弗林蛋白酶之核苷酸序列可連同編碼VWF片段之核苷酸序列一起表現以使D1D2域可由弗林蛋白酶在細胞內裂解去除。
在包括一個以上加工或裂解位點之構築體中，應瞭解此等位點可相同或不同。
如本文所用之「可加工連接子」係指包含至少一個在本文中其他地方描述之細胞內加工位點的連接子。
如本文所用之止血病症意謂特徵在於由於形成纖維蛋白凝塊之能力降低或不能形成纖維蛋白凝塊而有自發出血或由於創傷而出血之傾向的遺傳繼承性或獲得性病狀。此等病症之實例包括血友病。三種主要形式為A型血友病(因子VIII缺乏症)、B型血友病(因子IX缺乏症或「克雷司馬斯病(Christmas disease)」)及C型血友病(因子XI缺乏症，輕度流血傾向)。其他止血病症包括例如范威爾邦德病；因子XI缺乏症(PTA缺乏症)；因子XII缺乏症；纖維蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子X或因子XIII缺乏症或結構異常；伯納德-蘇里爾症候群(Bernard-Soulier syndrome)，其為一種GPIb缺陷症或缺乏症。VWF之受體GPIb可為有缺陷的且導致缺乏初級凝塊形成(初級止血)及流血傾向增加)、以及格蘭茨曼 (Glanzman)及內格利(Naegeli)血小板無力症(thrombasthenia)(格蘭茨曼血小板無力症)。在肝衰竭(急性及慢性形式)中，由肝之凝血因子產生不足；此可增加流血風險。
本發明之嵌合分子可預防性使用。如本文所用，術語「預防性治療」係指在流血事件之前投與分子。在一個實施例中，需要一般性止血劑之個體正經歷或即將經歷手術。本發明之嵌合蛋白可在手術之前或之後作為預防劑投與。本發明之嵌合蛋白可在手術期間或之後投與以控制急性流血事件。手術可包括(但不限於)肝移植、肝切除、牙齒程序或幹細胞移植。
本發明之嵌合蛋白亦用於按需治療。術語「按需治療」係指回應於流血事件之症狀或在可能導致流血之活動之前投與嵌合分子。在一個態樣中，按需治療可在流血開始時(諸如在損傷之後)或在預期會流血時(諸如在手術之前)給與個體。在另一態樣中，按需治療可在會增加流血風險之活動(諸如接觸性運動)之前給與。
如本文所用，術語「急性流血」係指無論潛在原因如何之流血事件。舉例而言，個體可具有創傷、尿毒症、遺傳性流血病症(例如因子VII缺乏症)、血小板病症，或歸因於產生針對凝結因子之抗體的抗性。
如本文所用之治療(Treat/treatment/treating)係指例如減輕疾病或病狀之嚴重性；減少疾病病程之持續時間；改善與疾病或病狀相關之一或多種症狀；向患有疾病 或病狀之個體提供有益作用，而未必治癒該疾病或病狀；或預防與疾病或病狀相關之一或多種症狀。在一個實施例中，術語「治療(treating/treatment)」意謂藉由投與本發明之嵌合蛋白或VWF片段來使個體之FVIII谷底含量維持在至少約1IU/dL、2IU/dL、3IU/dL、4IU/dL、5IU/dL、6IU/dL、7IU/dL、8IU/dL、9IU/dL、10IU/dL、11IU/dL、12IU/dL、13IU/dL、14IU/dL、15IU/dL、16IU/dL、17IU/dL、18IU/dL、19IU/dL或20IU/dL。在另一實施例中，治療意謂維持FVIII谷底含量在以下之間：約1與約20IU/dL、約2與約20IU/dL、約3與約20IU/dL、約4與約20IU/dL、約5與約20IU/dL、約6與約20IU/dL、約7與約20IU/dL、約8與約20IU/dL、約9與約20IU/dL、或約10與約20IU/dL。治療疾病或病狀亦可包括使個體體內之FVIII活性維持在類似於非血友病個體體內FVIII活性之至少約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%的程度。治療所需之最小谷底含量可藉由一或多種已知方法進行量測且可針對每個人進行調整(增加或減少)。
嵌合蛋白
本發明係有關使用VWF片段及XTEN序列，藉由阻止或抑制FVIII半衰期限制因素(亦即內源性VWF)與FVIII蛋白質締合來延長因子VIII蛋白質之半衰期。內 源性VWF與約95%至約98%之FVIII締合成非共價複合物。儘管內源性VWF為FVIII半衰期限制因素，但亦已知內源性VWF結合於FVIII蛋白質會以各種方式保護FVIII。舉例而言，全長VWF(呈具有約250kDa之多聚體形式)可保護FVIII免遭蛋白酶裂解及FVIII活化，穩定化FVIII重鏈及/或輕鏈，且阻止FVIII由清除受體清除。但同時，內源性VWF藉由阻止胞飲作用及藉由經由VWF清除路徑自系統清除FVIII-VWF複合物而限制FVIII半衰期。儘管不受理論束縛，但咸信內源性VWF為阻止融合於半衰期延長劑之FVIII蛋白質之半衰期長於野生型FVIII之約兩倍的半衰期限制因素。因此，本發明係有關使用VWF片段來阻止或抑制內源性VWF與FVIII蛋白質之間的相互作用，藉此藉由使用單獨XTEN序列或XTEN序列與Ig恆定區或其部分之組合來增加FVIII蛋白質之半衰期。XTEN序列可連接於FVIII蛋白質或VWF片段。因此，與VWF片段締合之FVIII蛋白質更緩慢地由一或多種VWF清除受體自循環清除且接著相較於野生型FVIII或無VWF片段之FVIII蛋白質，可使XTEN序列或XTEN序列與Ig恆定區之組合之半衰期充分延長。
在一個實施例中，VWF片段藉由共價或非共價鍵與FVIII蛋白質締合(或連接)。然而，在一些情況下，VWF片段與FVIII蛋白質之間的物理阻斷或化學締合(例如非共價鍵結)之強度可能不足以在內源性VWF存在下提供包含FVIII蛋白質及VWF片段之穩定複合物。舉 例而言，在無任何其他連接下與FVIII蛋白質形成非共價鍵之VWF片段在活體內在內源性VWF存在下可能易於解離，從而該VWF片段(例如重組VWF，亦即rVWF)經內源性VWF置換。因此，非共價結合於內源性VWF之FVIII蛋白質將經歷VWF清除路徑且易於自系統清除。為阻止VWF片段與FVIII蛋白質解離，在一些實施例中，FVIII蛋白質與VWF片段之間的締合或鍵聯為共價鍵，例如肽鍵、一或多個胺基酸、或二硫鍵。在某些實施例中，輔助部分與FVIII蛋白質之間的締合(亦即鍵聯)為FVIII蛋白質與VWF片段之間的肽鍵或連接子(「FVIII/VWF連接子」)。連接子之非限制性實例在本文中其他地方描述。在一些實施例中，VWF片段為包含以下、基本上由以下組成、或由以下組成之多肽：至少約10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000或4000個胺基酸。VWF片段之非限制性實例在本文中其他地方描述。
在某些實施例中，VWF片段以化學方式(例如非共價地)結合或以物理方式阻斷FVIII蛋白質上之一或多個VWF結合位點。FVIII蛋白質上之VWF結合位點位於FVIII蛋白質之A3域或C2域內。在其他實施例中，FVIII蛋白質上之VWF結合位點位於A3域及C2域內。舉例而言，FVIII蛋白質上之VWF結合位點可對應於SEQ ID NO：4[全長成熟FVIII]之胺基酸1669至1689及/或 2303至2332。
本發明亦提供一種進一步包含一或多個提供額外半衰期延長性質之XTEN序列的嵌合蛋白(包含FVIII蛋白質及VWF片段)。一或多個XTEN序列可插入在FVIII蛋白質或VWF片段內或連接於FVIII蛋白質或VWF片段之N末端或C末端。本發明亦包括一種連接於XTEN序列(第一半衰期延長部分)及Ig恆定區或其部分(第二半衰期延長部分)的FVIII蛋白質，以便兩個半衰期延長部分經由兩種不同機制延長FVIII蛋白質之半衰期。
在一些實施例中，嵌合蛋白包含連接於第一Ig恆定區或其部分(例如第一FcRn結合搭配物)之FVIII蛋白質、連接於第二Ig恆定區或其部分(例如第二FcRn結合搭配物)之VWF片段、及一或多個插入或連接於該FVIII蛋白質或該VWF片段之XTEN序列，其中該VWF片段阻止FVIII半衰期限制因素(例如內源性VWF)結合該FVIII蛋白質，其中第一及第二Ig恆定區或其部分形成共價鍵(例如二硫鍵)，且一或多個XTEN序列延長該FVIII蛋白質之半衰期。
在某些實施例中，本發明之嵌合蛋白包含由視情況選用之連接子(亦即FVIII/VWF連接子)連接於VWF片段之FVIII蛋白質及一或多個插入或連接於該FVIII蛋白質或該VWF片段之XTEN序列，其中該VWF片段阻止FVIII半衰期限制因素(例如內源性VWF)結合該FVIII蛋白質且該一或多個XTEN序列延長該FVIII蛋白 質之半衰期。在一個態樣中，視情況選用之連接子(FVIII/VWF連接子)包含分選酶識別基元。在另一態樣中，視情況選用之連接子(FVIII/VWF連接子)包含可裂解位點。裂解連接子(亦即含有一或多個裂解位點之連接子)之實例在本文中其他地方描述。
本發明之嵌合蛋白包括(但不限於)：(1)包含D'域及D3域之VWF片段、XTEN序列及FVIII，其中該XTEN序列連接於該VWF片段；(2)FVIII蛋白質、XTEN序列及Ig恆定區或其部分，其中該FVIII蛋白質連接於XTEN序列及該Ig恆定區或其部分，或(3)FVIII蛋白質、XTEN序列及VWF片段，其中該XTEN序列在C末端或N末端連接於該FVIII蛋白質或緊靠FVIII之一或多個胺基酸(例如一或多個XTEN插入位點)之下游插入，且該VWF片段與該FVIII蛋白質彼此締合。
(1)連接於XTEN及FVIII之范威爾邦德因子(VWF)片段
本發明係有關一種嵌合蛋白，其包含(i)包含VWF之D'域及D3域之VWF片段，(ii)XTEN序列、及(iii)FVIII蛋白質，其中(i)、(ii)及(iii)彼此連接或締合。作為本發明嵌合蛋白之一部分連接於XTEN序列的VWF片段與FVIII蛋白質締合，由此阻止或抑制內源性VWF與FVIII蛋白質之間的相互作用。在某些實施例中，能夠 阻止或抑制FVIII蛋白質與內源性VWF結合之VWF片段可同時具有至少一種VWF樣FVIII保護性質。VWF樣FVIII保護性質之實例包括(但不限於)保護FVIII免遭蛋白酶裂解及FVIII活化，穩定化FVIII重鏈及/或輕鏈，及阻止FVIII由清除受體清除。因此，VWF片段可阻止經由VWF清除路徑清除FVIII蛋白質，由此減少FVIII自系統之清除。在一些實施例中，本發明之VWF片段結合FVIII蛋白質或與FVIII蛋白質締合及/或物理或化學阻斷FVIII蛋白質上之VWF結合位點。因此，相較於野生型FVIII或未與VWF片段締合之FVIII，與VWF片段締合之FVIII蛋白質更緩慢地自循環清除。
在一個實施例中，本發明係有關一種嵌合蛋白，其包含(i)包含VWF之D'域及D3域之VWF片段，(ii)XTEN序列，及(iii)FVIII蛋白質，其中該XTEN序列連接於該VWF片段(例如(a1)V-X或(a2)X-V，其中V包含VWF片段且X包含XTEN序列)，且該VWF片段與該FVIII蛋白質連接或締合。在另一實施例中，VWF片段與XTEN序列可藉由連接子(例如(a3)V-L-X或(a4)X-L-V)或肽鍵連接。連接子可為可在凝血部位處裂解之可裂解連接子，例如凝血酶可裂解連接子。在其他實施例中，將VWF片段、XTEN序列及FVIII蛋白質安置在單一多肽鏈中。在其他實施例中，嵌合蛋白包含兩條多肽鏈，第一鏈包含VWF片段及XTEN序列且第二鏈包含FVIII蛋白質。在其他實施例中，嵌合蛋白包含三條多肽鏈，第一鏈 包含VWF片段及XTEN序列，第二鏈包含FVIII之輕鏈且第三鏈包含FVIII之重鏈，其中該第一鏈及該第二鏈彼此締合(例如共價鍵，例如二硫鍵)，且該第二鏈與該第三鏈彼此締合(例如金屬鍵)。在其他實施例中，XTEN序列可連接於VWF片段之N末端或C末端或緊靠VWF片段中之一或多個胺基酸之下游插入。
在某些實施例中，本發明之嵌合蛋白包含含有以下之式：(a)V-X-FVIII，(b)FVIII-X-V，(c)V-X：FVIII，(d)X-V：FVIII，(e)FVIII：V-X，(f)FVIII：X-V，或(a5)X-V-FVIII，其中V包含VWF片段，X包含一或多個XTEN序列，FVIII包含FVIII蛋白質；(-)表示肽鍵或一或多個胺基酸；且(：)為化學締合或物理締合。在一個實施例中，(：)表示化學締合，例如至少一個非肽鍵。在另一實施例中，化學締合(亦即(：))為共價鍵。在其他實施例中，化學締合(亦即(：))為非共價相互作用，例如離子相互作用、疏水性相互作用、親水性相互作用、凡得瓦相互作用或氫鍵。在其他實 施例中，(：)為非肽共價鍵。在其他實施例中，(：)為肽鍵。在其他實施例中，(：)表示兩個序列之間的物理締合，其中第一序列之一部分緊密接近於第二序列以使該第一序列遮蔽或阻斷該第二序列之一部分與另一部分相互作用，且進一步使此物理締合得以維持而不允許該第二序列與其他部分相互作用。本文多肽式之定向係自N末端(左)至C末端(右)列出。舉例而言，式V-X-FVIII意謂式NH2-V-X-FVIII-COOH。在一個實施例中，本文所述之式可在兩個部分之間包含任何其他序列。舉例而言，除非另外規定，否則式V-X-FVIII可進一步在V之N末端、V與X之間、X與FVIII之間、或在FVIII之C末端包含任何序列。在另一實施例中，連字符(-)指示肽鍵。
在其他實施例中，本發明之嵌合蛋白包含含有以下之式：(a)V(X1)-X2-FVIII，(b)FVIII-X2-V(X1)，(c)V(X1)：FVIII，(d)FVIII：V(X1)，或(a5)X2-V(X1)-FVIII，其中V(X1)包含VWF片段及第一XTEN序列(X1)，其中該XTEN序列緊靠該VWF片段中之一或多個胺基酸之下游插入，X2包含一或多個視情況選用之XTEN序列，FVIII包含FVIII蛋白質； (-)為肽鍵或一或多個胺基酸；且(：)為化學締合或物理締合。
在一些實施例中，嵌合蛋白包含(i)包含VWF之D'域及D3域之VWF片段，(ii)XTEN序列，(iii)FVIII蛋白質，(iv)第一視情況選用之連接子，及(v)第二視情況選用之連接子，其中該XTEN序列藉由該連接子連接於該VWF片段及/或該FVIII蛋白質。在某些實施例中，嵌合蛋白包含含有以下之式： (b1)V-L1-X-L2-FVIII，(b2)FVIII-L2-X-L1-V，(b3)V-L1-X：FVIII，(b4)X-L1-V：FVIII，(b5)FVIII：V-L1-X，(b6)FVIII：X-L1-V，(b7)X-L1-V-L2-FVIII，或(b8)FVIII-L2-V-L1-X，其中V包含VWF片段，X包含一或多個XTEN序列，FVIII包含FVIII蛋白質，L1包含第一視情況選用之連接子，例如第一可裂解連接子，L2包含第二視情況選用之連接子，例如第二可裂解連接子或視情況選用之可加工連接子；(-)為肽鍵或一或多個胺基酸；且 (：)為化學締合或物理締合。在一個實施例中，(：)表示化學締合，例如至少一個非肽鍵。在另一實施例中，化學締合(亦即(：))為共價鍵。在其他實施例中，化學締合(亦即(：))為非共價相互作用，例如離子相互作用、疏水性相互作用、親水性相互作用、凡得瓦相互作用或氫鍵。在其他實施例中，(：)為非肽共價鍵。在其他實施例中，(：)為肽鍵。在其他實施例中，(：)表示兩個序列之間的物理締合，其中第一序列之一部分緊密接近於第二序列以使該第一序列遮蔽或阻斷該第二序列之一部分與另一部分相互作用，且進一步使此物理締合得以維持而不允許該第二序列與其他部分相互作用。本文多肽式之定向係自N末端(左)至C末端(右)列出。舉例而言，式(b1)V-L1-X-L2-FVIII意謂式NH2-V-L1-X-L2-FVIII-COOH。在一個實施例中，本文所述之式可在兩個部分之間包含任何其他序列。在另一實施例中，連字符(-)指示肽鍵。
本發明之另一態樣在於提供一種不與FVIII半衰期限制因素(例如內源性VWF)相互作用，且同時使用XTEN序列(第一半衰期延長劑)與第二半衰期延長劑或在FVIII蛋白質與VWF片段之間提供共價鍵之部分(例如Ig恆定區或其部分)的組合使FVIII蛋白質之半衰期達到最大的FVIII嵌合蛋白。在一個實施例中，本發明之嵌合蛋白包含(i)包含VWF之D'域及D3域之VWF片段，(ii)XTEN序列，(iii)FVIII蛋白質，及(iv)Ig恆定區或其部分(在本文中亦稱為F)，其中(1)該VWF片段藉由視情況選用之連 接子(例如可裂解連接子)連接於該XTEN序列，(2)該VWF片段藉由另一視情況選用之連接子(例如可裂解連接子)與該FVIII蛋白質締合或連接，且(3)該Ig恆定區或其部分連接於該VWF片段、該XTEN序列或該FVIII蛋白質。在另一實施例中，本發明之嵌合蛋白包含(i)包含VWF之D'域及D3域之VWF片段，(ii)XTEN序列，(iii)FVIII蛋白質，(iv)Ig恆定區或其部分(F1或第一Ig恆定區或其部分)，及(v)另一Ig恆定區或其部分(F2或第二Ig恆定區或其部分)，其中(1)該VWF片段藉由視情況選用之連接子(例如可裂解連接子)連接於該XTEN序列，(2)該XTEN序列或該VWF片段連接於該Ig恆定區或其部分，(3)該FVIII連接於該另一Ig恆定區或其部分，且(4)該Ig恆定區或其部分與該另一Ig恆定區或其部分締合或連接。在一個實施例中，兩個Ig恆定區或其部分之間的締合或鍵聯為共價鍵，例如二硫鍵。在另一實施例中，兩個Ig恆定區或其部分之間的締合或鍵聯為可加工連接子，其中該可加工連接子由蛋白酶在細胞內加工。舉例而言，嵌合蛋白包含含有以下之式：(g)V-L2-X-L1-F1：FVIII-L3-F2；(h)V-L2-X-L1-F1：F2-L3-FVIII；(i)F-L1-X-L2-V：FVIII-L3-F2；(j)F-L1-X-L2-V：F2-L3-FVIII；(k)V-L2-X-L1-F1-L4-FVIII-L3-F2；(l)F2-L3-FVIII-L4-F1-L1-X-L2-V； (m)FVIII-L2-F2-L4-V-L2-X-L1-F1；或(n)F1-L1-X-L2-V-L4-F2-L2-FVIII，其中V包含VWF片段，L1及L3各自包含視情況選用之連接子，L2包含視情況選用之連接子，例如可裂解連接子，L4為視情況選用之連接子，例如可加工連接子，FVIII包含FVIII蛋白質，X包含一或多個XTEN序列，F1包含視情況選用之Ig恆定區或其部分，F2包含視情況選用之另一Ig恆定區或其部分；(-)為肽鍵或一或多個胺基酸；且(：)為化學締合或物理締合。
在一些實施例中，本文揭露之任何構築體或式中之FVIII蛋白質可進一步包含至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或至少六個XTEN序列，該等XTEN序列各自緊靠FVIII蛋白質中之一或多個胺基酸之下游插入或連接於FVIII蛋白質之N末端或C末端。XTEN插入位點之非限制性實例在本文中其他地方加以揭露。
在一個實施例中，(：)表示化學締合，例如至少一個非肽鍵。在另一實施例中，化學締合(亦即(：))為共價鍵。在其他實施例中，化學締合(亦即(：))為非共價相互作用，例如離子相互作用、疏水性相互作用、親水性相互作用、凡得瓦相互作用或氫鍵。在其他實施例中，(：)為非 肽共價鍵。在其他實施例中，(：)為肽鍵。在其他實施例中，(：)表示兩個序列之間的物理締合，其中第一序列之一部分緊密接近於第二序列以使該第一序列遮蔽或阻斷該第二序列之一部分與另一部分相互作用，且進一步使此物理締合得以維持而不允許該第二序列與其他部分相互作用。本文多肽式之定向係自N末端(左)至C末端(右)列出。舉例而言，式(n)F1-L1-X-L2-V-L4-F2-L2-FVIII意謂式NH2-F1-L1-X-L2-V-L4-F2-L2-FVIII-COOH。在一個實施例中，本文所述之式可在兩個部分之間包含任何其他序列。在另一實施例中，連字符(-)指示肽鍵。
在一個實施例中，連接於VWF片段或FVIII蛋白質之Ig恆定區或其部分(在本文中有時由「F」或「F1」指示)及另一Ig恆定區或其部分(在本文中有時由「F2」指示)中之任一者或兩者可延長VWF片段、FVIII蛋白質或兩者之半衰期。在另一實施例中，一對各自連接於VWF片段及FVIII蛋白質之Ig恆定區或其部分(在本文中有時由「F」或「F1」指示)及另一Ig恆定區或其部分(在本文中有時由「F2」指示)在FVIII蛋白質與VWF片段之間提供強於非共價鍵之鍵，亦即共價鍵(例如二硫鍵)，藉此阻止內源性VWF活體內置換VWF片段。F1或F2可包含Fc區或FcRn結合搭配物。在其他實施例中，連接於VWF片段及/或FVIII蛋白質之F1及F2中之任一者或兩者在F1與F2之間形成共價鍵(例如二硫鍵)，藉此緊密接近安置VWF片段及FVIII蛋白質以阻止FVIII蛋白質與 VWF片段相互作用。在一些實施例中，F1與F2相同或不同。F1及F2之非限制性實例可選自由以下組成之群：CH1域、CH2域、CH3域、CH4域、鉸鏈域、其任何功能性片段、衍生物或類似物及其兩種或兩種以上組合。在一個實施例中，F1、F2或兩者包含至少一個CH1域、至少一個CH2域、至少一個CH3域、至少一個CH4域或其功能性片段、衍生物或類似物。在另一實施例中，F1、F2或兩者包含至少一個鉸鏈域或其部分及至少一個CH2域或其部分(例如以鉸鏈-CH2定向)。在其他實施例中，F1、F2或兩者包含至少一個CH2域或其部分及至少一個CH3域或其部分(例如以CH2-CH3定向)。組合之實例包括(但不限於)CH2域、CH3域及鉸鏈域，其亦稱為Fc區(或Fc域)，例如就F1而言之第一Fc區或第一FcRn結合搭配物及就F2而言之第二Fc區或第二FcRn結合搭配物。在其他實施例中，F1藉由連接子連接於VWF片段，及/或F2藉由連接子連接於FVIII蛋白質。在一些實施例中，F1及/或F2包含鉸鏈區、基本上由鉸鏈區組成或由鉸鏈區組成。Fc區或FcRn結合搭配物之其他非限制性實例在本文中其他地方加以描述。
在某些實施例中，本發明之嵌合蛋白包含兩條多肽鏈，第一多肽鏈包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：包含D'域及D3域之VWF片段、XTEN序列、第一Ig恆定區或其部分(例如第一Fc區)、及在該VWF片段與該XTEN序列或該XTEN序列或該第一Ig恆定區或 其部分之間的視情況選用之連接子，且第二多肽鏈包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：FVIII蛋白質及第二Ig恆定區或其部分(例如第二Fc區)。VWF片段與第一Ig恆定區或其部分之間的連接子可為可在凝血部位處裂解之可裂解連接子，例如凝血酶可裂解連接子。在一些實施例中，第一多肽鏈與第二多肽鏈彼此締合。第一鏈與第二鏈之間的締合阻止包含VWF片段之第一鏈在活體內經內源性VWF置換。在一個實施例中，第一鏈與第二鏈之間的締合可為共價鍵。在一特定實施例中，共價鍵為二硫鍵。在一些實施例中，第二鏈中之FVIII蛋白質進一步包含一或多個連接於FVIII蛋白質之C末端或N末端或緊靠FVIII蛋白質中之一或多個胺基酸(例如至少一個本文揭露之插入位點)之下游插入的XTEN序列。插入位點之非限制性實例在本文中其他地方加以描述。
在其他實施例中，本發明之嵌合蛋白包含三條多肽鏈，其中第一多肽鏈包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：FVIII蛋白質之重鏈，第二多肽鏈包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：融合於第一Ig恆定區或其部分(例如第一Fc區)之FVIII蛋白質輕鏈，且第三多肽鏈包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：包含D'域及D3域之VWF片段、XTEN序列、第二Ig恆定區或其部分(例如第二Fc區)、及在該XTEN序列與該第二Ig恆定區或其部分之間或在該VWF片段與該XTEN序列之間的視情況選用之連接子。第三鏈中之連接子可為在 凝血部位處裂解之可裂解連接子，例如凝血酶裂解位點。在一些實施例中，重鏈FVIII或輕鏈FVIII連接於一或多個可連接於N末端、C末端或插入在FVIII序列內之一或多個插入位點內之XTEN序列。插入位點之非限制性實例在本文中其他地方加以揭露。
在其他實施例中，本發明之嵌合蛋白包含兩條多肽鏈，第一多肽鏈包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：FVIII蛋白質之重鏈，且第二多肽鏈包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：FVIII蛋白質之輕鏈、第一Ig恆定區或其部分(例如第一Fc區)、第一連接子(例如含有一或多個包含一或多個細胞內加工位點之蛋白酶裂解位點之可加工連接子)、VWF片段、第二連接子(例如凝血酶可裂解連接子)、XTEN序列及第二Ig恆定區或其部分(例如第二Fc區)，其中該FVIII蛋白質之該輕鏈連接於藉由該第一連接子進一步連接於該VWF片段之該第一Ig恆定區或其部分(例如該第一Fc區)，且其中該VWF片段連接於藉由該第二連接子進一步連接於該第二Ig恆定區或其部分之該XTEN序列。在某些實施例中，第一連接子為可加工連接子，且第二連接子為可裂解連接子。在表現時，嵌合蛋白可由裂解可加工連接子之細胞內加工酶加工，且因此嵌合蛋白可包含三條多肽鏈、基本上由三條多肽鏈組成或由三條多肽鏈組成。此外，VWF片段可由於可裂解連接子而在凝血部位處裂解去除。
在某些實施例中，本發明之嵌合蛋白包含一 條多肽鏈，其包含單鏈FVIII蛋白質、第一Ig恆定區或其部分(例如第一Fc區)、第一連接子(例如可加工連接子)、VWF片段、XTEN序列、第二連接子(例如凝血酶可裂解連接子)及第二Ig恆定區或其部分(例如第二Fc區)，其中該單鏈FVIII蛋白質連接於亦藉由該第一連接子連接於VWF片段之該第一Ig恆定區或其部分，且該VWF片段連接於進一步連接於該第二Ig恆定區或其部分之該XTEN序列。在一個實施例中，VWF片段與XTEN序列係藉由第二連接子連接。在另一實施例中，XTEN序列與第二Ig恆定區或其部分藉由第二連接子連接。在其他實施例中，第二鏈進一步包含第三連接子。因此，單一多肽鏈可包含藉由第二連接子連接於XTEN序列之VWF片段及藉由第三連接子連接於第二Ig恆定區或其部分之XTEN。第二連接子與第三連接子可相同或不同。在一個實施例中，第一連接子為可加工連接子。在另一實施例中，第二連接子或第三連接子為包含一或兩個可裂解位點之可裂解連接子。在一特定實施例中，第二連接子為凝血酶可裂解連接子。適用於本發明中之連接子在本文中其他地方加以描述。
(2)FVIII、XTEN及Fc
本發明之嵌合蛋白亦包含(i)FVIII蛋白質，(ii)XTEN序列(第一半衰期延長劑)，及(iii)Ig恆定區或其部分(第二半衰期延長劑)，其中該XTEN序列藉由視情況選用之連接子連接於該FVIII蛋白質且藉由另一視情況選 用之連接子連接於該Ig恆定區或其部分。XTEN序列及Ig恆定區或其部分可共同用於延長FVIII蛋白質之半衰期。在一個實施例中，嵌合蛋白為單體。在另一實施例中，嵌合蛋白為二聚體(均二聚體或雜二聚體)。
本發明亦係有關一種嵌合蛋白，其包含(i)FVIII蛋白質，(ii)XTEN序列，(iii)Ig恆定區或其部分(亦即第一Ig恆定區或其部分、「F」或「F1」)，及(iv)另一Ig恆定區或其部分(亦即第二Ig恆定區或其部分或「F2」)。在一個實施例中，XTEN序列在C末端或N末端連接於FVIII蛋白質或緊靠FVIII蛋白質中之一或多個胺基酸(例如一或多個XTEN插入位點)之下游插入，FVIII蛋白質連接於第一Ig恆定區或其部分，且第一Ig恆定區或其部分與第二Ig恆定區或其部分藉由視情況選用之連接子彼此締合或連接。在某些態樣中，嵌合蛋白為包含第一多肽鏈及第二多肽鏈之單體-二聚體雜交物，其中該第一多肽鏈包含FVIII蛋白質、XTEN序列及第一Ig恆定區或其部分，且該第二多肽鏈包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：無FVIII蛋白質之第二Ig恆定區或其部分，且其中該第一鏈與該第二鏈彼此締合。Ig恆定區或其部分(例如第一Fc區)與另一Ig恆定區或其部分(例如第二Fc區)之間的締合為化學締合或物理締合。在某些實施例中，化學締合為共價鍵。在其他實施例中，化學締合為非共價相互作用，例如離子相互作用、疏水性相互作用、親水性相互作用、凡得瓦相互作用或氫鍵。在其他實施例 中，締合為非肽共價鍵。在其他實施例中，締合為肽鍵。
在其他態樣中，嵌合蛋白為包含FVIII蛋白質、XTEN序列、第一Ig恆定區或其部分、連接子(例如可加工連接子)及第二Ig恆定區或其部分之單一多肽鏈，其中該單一多肽鏈在表現之後由細胞內酶加工且變成兩條多肽鏈。
在一個實施例中，連接於FVIII蛋白質之Ig恆定區或其部分(在本文中有時由「F」或「F1」指示)可連同XTEN序列一起延長FVIII蛋白質之半衰期。在另一實施例中，Ig恆定區或其部分(「F」或「F1」)為在本文中其他地方描述之Fc區或FcRn結合搭配物。
在其他實施例中，與第一Ig恆定區或其部分締合或連接之另一Ig恆定區或其部分(在本文中有時由「F2」或第二Ig恆定區或其部分指示)亦可延長FVIII蛋白質之半衰期。在其他實施例中，第二Ig恆定區或其部分(「F2」)連同第一Ig恆定區或其部分及XTEN序列一起可延長FVIII蛋白質之半衰期。另一Ig恆定區或其部分可為在本文中其他地方描述之Fc區或FcRn結合搭配物。
在某些實施例中，與第一Ig恆定區或其部分締合之第二Ig恆定區或其部分進一步連接於在本文中其他地方描述之VWF片段及視情況選用之XTEN序列。
在一些實施例中，Ig恆定區或其部分(「F」或「F1」或第一Ig恆定區或其部分)及另一Ig恆定區或其部分(亦即第二Ig恆定區或其部分或「F2」)中之任一者或 兩者(在此段落中指示為「Ig恆定區或其部分」)可包括(但不限於)CH1域、CH2域、CH3域、CH4域、鉸鏈域、其任何功能性片段、衍生物或類似物或其兩種或兩種以上組合。在一個實施例中，Ig恆定區或其部分包含至少一個CH1域、至少一個CH2域、至少一個CH3域、至少一個CH4域或其功能性片段、衍生物或類似物。在另一實施例中，Ig恆定區或其部分包含至少一個鉸鏈域或其部分及至少一個CH2域或其部分(例如以鉸鏈-CH2定向)。在其他實施例中，Ig恆定域或其部分包含至少一個CH2域或其部分及至少一個CH3域或其部分(例如以CF2-CH3定向)。組合之實例包括(但不限於)CH2域、CH3域及鉸鏈域，其亦稱為Fc區(或Fc域)，例如第一Fc區。Ig恆定區或其部分之其他實例在本文中其他地方加以描述。
相較於野生型FVIII，本發明之嵌合蛋白可具有延長之FVIII蛋白質半衰期。在一個實施例中，FVIII蛋白質之半衰期延長至野生型FVIII之半衰期之至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍或至少約12倍長。在另一實施例中，FVIII蛋白質之半衰期為至少約10小時、至少約11小時、至少約12小時、至少約13小時、至少約14小時、至少約15小時、至少約16小時、至少約17小時、至少約18小時、至少約19小時、至少約20小時、至少約21小時、至少約22小時、至少 約23小時、至少約24小時、至少約36小時、至少約48小時、至少約60小時、至少約72小時、至少約84小時、至少約96小時或至少約108小時。
(3)FVIII、XTEN及VWF
在一個態樣中，本發明之嵌合蛋白包含(i)FVIII蛋白質，(ii)XTEN序列，及(iii)包含VWF之D'域及D3域之VWF片段，其中該FVIII蛋白質連接於該XTEN序列且其中該FVIII蛋白質與該VWF片段締合或連接。在一個實施例中，本文所述之嵌合蛋白之VWF片段不能夠結合VWF清除受體。在另一實施例中，VWF片段能夠保護FVIII蛋白質免遭一或多種蛋白酶裂解、保護FVIII蛋白質免遭活化、穩定化FVIII蛋白質之重鏈及/或輕鏈、或阻止FVIII蛋白質由一或多種清除受體清除。在其他實施例中，VWF片段阻止或抑制內源性VWF結合FVIII蛋白質中之VWF結合位點。VWF結合位點可位於FVIII蛋白質之A3域或C2域中或位於A3域與C2域兩者中。在一特定實施例中，VWF結合位點包含對應於SEQ ID NO：2之胺基酸1669至1689及/或胺基酸2303至2332之胺基酸序列。
在另一態樣中，嵌合蛋白包含(i)FVIII蛋白質，(ii)XTEN序列，(iii)VWF片段，其包含VWF之D'域及D3域，及(iv)Ig恆定區或其部分，其中該XTEN序列在C末端或N末端連接於該FVIII蛋白質或緊靠FVIII蛋 白質中之一或多個胺基酸(例如一或多個本文揭露之XTEN插入位點)之下游插入，該VWF片段與該FVIII蛋白質或該XTEN序列連接或締合，且該Ig恆定區或其部分連接於該FVIII蛋白質、該XTEN序列、該VWF片段或其任何組合。適用於本發明之嵌合蛋白之Ig恆定區或其部分在本文中其他地方加以描述。在一個實施例中，Ig恆定區或其部分能夠延長FVIII蛋白質之半衰期。在另一實施例中，Ig恆定區或其部分包含第一Fc區或第一FcRn結合搭配物。在其他實施例中，Ig恆定區或其部分藉由視情況選用之連接子連接於FVIII蛋白質。在其他實施例中，連接子包含可裂解連接子。嵌合蛋白可為含有(i)、(ii)、(iii)及(iv)之單一多肽鏈，亦即單體(亦即單鏈)；或可為含有包含(i)及(ii)之第一鏈及包含(iii)及(iv)之第二鏈的兩條鏈。在其他態樣中，嵌合蛋白為二聚體(例如均二聚體或雜二聚體)。在一個實施例中，嵌合蛋白包含各自包含(i)、(ii)、(iii)及(iv)之兩條鏈。
在某些實施例中，嵌合蛋白包含(i)FVIII蛋白質，(ii)XTEN序列，(iii)VWF片段，其包含VWF之D'域及D3域，(iv)Ig恆定區或其部分(有時亦指示為「F」、「第一Ig恆定區或其部分」或「F2」)，及(v)另一Ig恆定區或其部分(有時亦指示為「F2」或「第二Ig恆定區或其部分」)，其中(1)該FVIII蛋白質在該FVIII蛋白質之C末端或N末端連接於該XTEN序列或緊靠該FVIII蛋白質中之一或多個胺基酸(例如一或多個本文揭露之XTEN插 入位點)之下游插入，(2)該XTEN序列或該FVIII蛋白質連接於該Ig恆定區或其部分，(3)該VWF片段連接於該第二Ig恆定區或其部分，且(4)該Ig恆定區或其部分與該第二Ig恆定區或其部分締合。在一個實施例中，連接於FVII蛋白質或XTEN序列之Ig恆定區或其部分藉由連接子(例如可加工連接子)進一步連接於VWF片段。在另一實施例中，適用於本發明之嵌合蛋白之另一Ig恆定區或其部分可藉由視情況選用之連接子(例如可加工連接子)進一步連接於FVIII蛋白質或Ig恆定區或其部分。在一些實施例中，一對各自連接於VWF片段及FVIII蛋白質之Ig恆定區或其部分及另一Ig恆定區或其部分在FVIII蛋白質與VWF片段之間提供強於非共價鍵之鍵，亦即共價鍵(例如二硫鍵)，藉此阻止內源性VWF活體內置換VWF片段。在其他實施例中，Ig恆定區或其部分及另一Ig恆定區或其部分中之任一者或兩者能夠延長FVIII蛋白質或VWF片段之半衰期。在其他實施例中，另一Ig恆定區或其部分包含第二Fc區或FcRn結合搭配物。在嵌合蛋白中，Ig恆定區或其部分與另一Ig恆定區或其部分相同或不同。
在某些實施例中，Ig恆定區或其部分與另一Ig恆定區或其部分藉由化學締合或物理締合進行締合。在一個實施例中，化學締合(亦即(：))為至少一個非肽鍵。在某些實施例中，化學締合(亦即(：))為共價鍵。在其他實施例中，化學締合(亦即(：))為非共價相互作用，例如離子相 互作用、疏水性相互作用、親水性相互作用、凡得瓦相互作用或氫鍵。在其他實施例中，(：)為非肽共價鍵。在其他實施例中，(：)為肽鍵。在其他實施例中，(：)表示兩個序列之間的物理締合，其中第一序列之一部分緊密接近於第二序列以使該第一序列遮蔽或阻斷該第二序列之一部分與另一部分相互作用。在一些實施例中，Ig恆定區或其部分與另一Ig恆定區或其部分之間的締合可為阻止VWF片段或含有VWF片段之多肽經內源性VWF置換之共價鍵，例如二硫鍵。因此，阻止FVIII蛋白質與內源性VWF之間的相互作用會消除FVIII蛋白質之半衰期限制因素，且因此相較於無VWF蛋白質之FVIII蛋白質或野生型FVIII，FVIII蛋白質之半衰期得以延長。
在其他態樣中，嵌合蛋白包含含有以下之式：(1)FVIII(X1)-L1-F1：V-L2-X2-L3-F2；(2)FVIII(X1)-L1-F1：F2-L3-X2-L2-V；(3)F1-L1-FVIII(X1)：V-L2-X2-L3-F2；(4)F1-L1-FVIII(X1)；F2-L3-X2-L2-V；(5)FVIII(X1)-L1-F1-L4-V-L2-X2-L3-F2；(6)FVIII(X1)-L1-F1-L4-F2-L3-X2-L2-V；(7)F1-L1-FVIII(X1)-L4-V-L2-X2-L3-F2，或(8)F1-L1-FVIII(X1)-L4-F2-L3-X2-L2-V，其中FVIII(X1)包含FVIII蛋白質及一或多個XTEN序列，其中該一或多個XTEN序列連接於該FVIII蛋白質之 N末端或C末端或緊靠該FVIII蛋白質中之一或多個胺基酸(例如一或多個本文揭露之XTEN插入位點)之下游插入；L1、L2或L3各自包含視情況選用之連接子，例如可裂解連接子；L4為連接子，例如可加工連接子；X2包含一或多個視情況選用之XTEN序列；F1包含Ig恆定區或其部分；F2包含視情況選用之另一Ig恆定區或其部分，且V包含VWF片段；(-)為肽鍵或一或多個胺基酸；且(：)包含化學締合或物理締合。在一個實施例中，(：)表示化學締合，例如至少一個非肽鍵。在另一實施例中，化學締合(亦即(：))為共價鍵。在其他實施例中，化學締合(亦即(：))為非共價相互作用，例如離子相互作用、疏水性相互作用、親水性相互作用、凡得瓦相互作用或氫鍵。在其他實施例中，(：)為非肽共價鍵。在其他實施例中，(：)為肽鍵。在其他實施例中，(：)表示兩個序列之間的物理締合，其中第一序列之一部分緊密接近於第二序列以使該第一序列遮蔽或阻斷該第二序列之一部分與另一部分相互作用，且進一步使此物理締合得以維持而不允許該第二序列與其他部分相互作用。本文多肽式之定向係自N末端(左)至C末端(右)列出。舉例而言，式V-X-FVIII意謂式NH2-V-X-FVIII-COOH。在一個實施例中，本文所述之式 可在兩個部分之間包含任何其他序列。舉例而言，除非另外規定，否則式V-X-FVIII可進一步在V之N末端、V與X之間、X與FVIII之間、或在FVIII之C末端包含任何序列。在另一實施例中，連字符(-)指示肽鍵。
在一個態樣中，嵌合蛋白包含兩條多肽鏈，(A)第一鏈包含(i)單鏈FVIII蛋白質，(ii)XTEN序列，及(iii)第一Ig恆定區或其部分，例如第一Fc區或FcRn結合搭配物，其中該XTEN序列在N末端或C末端連接於該FVIII蛋白質或緊靠該FVIII蛋白質之一或多個胺基酸(例如一或多個本文揭露之XTEN插入位點)之下游插入且該第一Ig恆定區或其部分連接於該XTEN序列(當該XTEN序列在N末端或C末端連接於該FVIII蛋白質時)或FVIII蛋白質(當該XTEN序列插入在該FVIII蛋白質內時)，且(B)第二鏈包含(iv)包含D'域及D3域之VWF片段，(v)連接子，及(vi)第二Ig恆定區或其部分(例如第二Fc區或第二FcRn結合搭配物)，其中該VWF片段連接於進一步連接於該第二Ig恆定區或其部分之該連接子(例如可裂解連接子)，且其中該第一多肽鏈與該第二多肽鏈例如藉由共價鍵(例如二硫鍵)彼此締合。在一個實施例中，連接子為在本文中其他地方描述之可裂解連接子，例如凝血酶可裂解連接子。在一些實施例中，第二鏈在(iv)與(v)之間或在(v)與(vi)之間包含一或多個XTEN序列。
在其他態樣中，嵌合蛋白包含一條多肽鏈，其包含(i)單鏈FVIII蛋白質，(ii)XTEN序列，(iii)第一Ig 恆定區或其部分，例如第一Fc區或第一FcRn結合搭配物，(iv)第一連接子，(v)包含D'域及D3域之VWF片段，(vi)第二連接子，及(vii)第二Ig恆定區或其部分，例如第二Fc區或第二FcRn結合搭配物，其中(i)至(vii)按該順序或以任何順序連接。在一個實施例中，第一連接子為可在表現之後在細胞內經加工或裂解且使得單一多肽鏈成為兩條多肽鏈之可加工連接子。在另一實施例中，第二連接子為本文所述之可裂解連接子，例如凝血酶可裂解連接子。本文使用之XTEN序列可藉由視情況選用之連接子在FVIII蛋白質之N末端或C末端連接於FVIII蛋白質或緊靠FVIII蛋白質中之一或多個胺基酸(例如一或多個XTEN插入位點)之下游插入。
在某些態樣中，嵌合蛋白包含三條多肽鏈，(A)第一多肽鏈包含彼此連接之(i)FVIII蛋白質之重鏈及(ii)XTEN序列且(B)第二多肽鏈包含彼此連接之(iii)該FVIII蛋白質之輕鏈及(iv)第一Ig恆定區或其部分，例如第一Fc區或第一FcRn結合搭配物，且(C)第三多肽鏈包含(v)包含D'域及D3域之VWF片段，(vi)連接子，及(vii)第二Ig恆定區或其部分，例如第二Fc區或第二FcRn結合搭配物，其中該第二鏈與該第一鏈及該第三鏈締合。在一個實施例中，第一鏈與第二鏈之間的締合為化學締合或物理締合。舉例而言，第一鏈與第二鏈之間的締合可為金屬鍵。在另一實施例中，第二鏈與第三鏈之間的締合亦為化學締合或物理締合，例如共價鍵或非共價鍵。在某些實 施例中，第二鏈與第三鏈之間的締合係經由兩個Ig恆定區或其部分達成且為二硫鍵。第二鏈與第三鏈之間的鍵結阻止或抑制FVIII蛋白質與內源性VWF結合，由此阻止FVIII蛋白質藉由VWF清除路徑清除。在一些實施例中，連接子為在宿主細胞中表現之後在細胞內裂解之可加工連接子。本文使用之XTEN序列藉由視情況選用之連接子在FVIII蛋白質之N末端或C末端連接於FVIII蛋白質或緊靠FVIII蛋白質中之一或多個胺基酸(例如一或多個XTEN插入位點)之下游插入。
在某些實施例中，VWF片段藉由肽鍵或連接子直接連接於包含一或多個XTEN之FVIII蛋白質。作為一種經由直接連接(例如肽鍵)或連接子來連接VWF片段與其中插入或連接有一或多個XTEN之FVIII蛋白質的方法，可採用酶連接法(例如分選酶)。舉例而言，分選酶係指一組原核酶，其藉由識別及裂解羧基末端分選信號來修飾表面蛋白質。對於分選酶之大多數受質，識別信號由基元LPXTG(Leu-Pro-任何胺基酸-Thr-Gly)(SEQ ID NO：51)、接著高度疏水性跨膜序列、接著一串鹼性殘基(諸如精胺酸)組成。裂解發生在Thr與Gly之間，伴有經由Thr殘基短暫連接於連接搭配物之活性位點Cys殘基，隨後進行使蛋白質共價連接於細胞壁之轉肽過程。在一些實施例中，連接搭配物含有Gly(n)。在其他實施例中，嵌合蛋白進一步包含分選酶識別基元。在一些實施例中，使用分選酶介導之活體外蛋白質連接法使VWF片段連接於包含在 內部具有一或多個XTEN插入或連接有一或多個XTEN的FVIII。
在一個實施例中，藉由視情況選用之連接子連接於分選酶識別基元之VWF片段可藉由分選酶融合於連接於Gly(n)之FVIII蛋白質，其中n可為任何整數且其中一或多個XTEN插入在該FVIII蛋白質內部或連接於該FVIII蛋白質。連接構築體包含VWF片段(構築體之N末端部分)及其中插入或連接有一或多個XTEN之FVIII蛋白質(構築體之C末端部分)，其中分選酶識別基元插入在兩者之間。另一連接構築體包含VWF片段(構築體之N末端部分)、連接子、分選酶識別基元及其中插入或連接有一或多個XTEN之FVIII蛋白質(構築體之C末端部分)。在另一實施例中，藉由視情況選用之連接子連接於分選酶識別基元之FVIII蛋白質可藉由分選酶融合於連接於Gly(n)之VWF片段，其中n為任何整數。所得連接構築體包含其中插入或連接有一或多個XTEN之FVIII蛋白質(構築體之N末端部分)、及VWF片段(構築體之C末端部分)，其中分選酶識別基元插入在兩者之間。另一所得連接構築體包含其中插入或連接有一或多個XTEN之FVIII蛋白質(構築體之N末端部分)、連接子、分選酶識別基元及VWF片段(構築體之C末端部分)。在其他實施例中，藉由第一視情況選用之連接子連接於分選酶識別基元之VWF片段可融合於藉由第二視情況選用之連接子連接於凝血酶裂解位點之異源部分，例如免疫球蛋白恆定區或其 部分，例如Fc區。所得構築體可包含VWF片段(N末端部分)、第一連接子、分選酶識別基元、蛋白酶裂解位點、第二視情況選用之連接子及異源部分。
在一些實施例中，VWF片段與FVIII蛋白質締合。VWF片段與FVIII蛋白質之間的締合可為化學締合或物理締合。化學締合可為非共價相互作用，例如離子相互作用、疏水性相互作用、親水性相互作用、凡得瓦相互作用或氫鍵。在其他實施例中，FVIII蛋白質與VWF片段之間的締合為兩個序列之間的物理締合，例如歸因於具有FVIII蛋白質之序列與具有VWF片段之序列之間的另一締合，其中第一序列之一部分緊密接近於第二序列以使該第一序列遮蔽或阻斷該第二序列之一部分與另一部分相互作用。
由於藉由VWF片段阻止或抑制內源性VWF與FVIII蛋白質相互作用，本文所述之嵌合蛋白相較於野生型FVIII或無VWF片段之相應嵌合蛋白具有延長之半衰期。在一個實施例中，FVIII蛋白質之半衰期延長至無VWF片段之FVIII蛋白質之半衰期之至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍或至少約12倍長。在另一實施例中，FVIII蛋白質之半衰期為至少約10小時、至少約11小時、至少約12小時、至少約13小時、至少約14小時、至少約15小時、至少約16小時、至少約17 小時、至少約18小時、至少約19小時、至少約20小時、至少約21小時、至少約22小時、至少約23小時、至少約24小時、至少約36小時、至少約48小時、至少約60小時、至少約72小時、至少約84小時、至少約96小時或至少約108小時。在一特定實施例中，FVIII蛋白質在HemA小鼠中之半衰期延長至少10小時、至少約11小時、至少約12小時、至少約13小時、至少約14小時、至少約15小時、至少約16小時、至少約17小時、至少約18小時、至少約19小時、至少約20小時、至少約21小時、至少約22小時、至少約23小時、至少約24小時、至少約25小時、至少約26小時或至少約27小時。
A)范威爾邦德因子(VWF)片段
VWF(亦稱為F8VWF)為一種存在於血漿中且在內皮(在懷布爾-帕拉德體(Weibel-Palade body)中)、巨核細胞(血小板之α-顆粒)及內皮下結締組織中組成性產生之大型多聚醣蛋白。基本VWF單體為具有2813個胺基酸之蛋白質。每個單體含有多個具有特定功能之特定域，亦即D'/D3域(其結合因子VIII)、A1域(其結合血小板GPIb受體、肝素及/或可能膠原蛋白)、A3域(其結合膠原蛋白)、C1域(其中RGD域在此域活化時結合血小板整合素(integrin)αIIbβ3)、及在蛋白質之C末端之「半胱胺酸結(cysteine knot)」域(該VWF與血小板源性生長因子 (PDGF)、轉型生長因子-β(TGFβ)及β-人類絨毛膜促性腺素(β-human chorionic gonadotropin，βHCG)共有該域)。
如本文所用之術語「VWF片段」包括(但不限於)能夠抑制內源性VWF結合FVIII之包含D'域及D3域之功能性VWF片段。在一個實施例中，VWF片段結合FVIII蛋白質。在另一實施例中，VWF片段阻斷FVIII蛋白質上之VWF結合位點，藉此抑制FVIII蛋白質與內源性之相互作用。VWF片段包括保留VWF之此等活性之衍生物、變異體、突變體或類似物。
人類VWF之2813單體胺基酸序列在Genbank中報導為寄存編號_NP_000543.2_。編碼人類VWF之核苷酸序列在Genbank中報導為寄存編號_NM_000552.3_。人類VWF之核苷酸序列指定為SEQ ID NO：1。SEQ ID NO：2為由SEQ ID NO：1編碼之胺基酸序列。VWF之各域列於表1中。
如本文所用之VWF片段可為包含VWF之D'域及D3域之VWF片段，其中該VWF片段結合因子 VIII(FVIII)且抑制內源性VWF(全長VWF)結合FVIII。包含D'域及D3域之VWF片段可進一步包含選自由以下組成之群之VWF域：A1域、A2域、A3域、D1域、D2域、D4域、B1域、B2域、B3域、C1域、C2域、CK域、其一或多個片段及其任何組合。在一個實施例中，VWF片段包含以下、基本上由以下組成、或由以下組成：(1)VWF之D'及D3域或其片段；(2)VWF之D1、D'及D3域或其片段；(3)VWF之D2、D'及D3域或其片段；(4)VWF之D1、D2、D'及D3域或其片段；或(5)VWF之D1、D2、D'、D3及A1域或其片段。本文所述之VWF片段不含結合VWF清除受體之位點。在另一實施例中，本文所述之VWF片段不為SEQ ID NO：2之胺基酸764至1274。本發明之VWF片段可包含連接於或融合於VWF片段之任何其他序列。舉例而言，本文所述之VWF片段可進一步包含信號肽。
在一個實施例中，VWF片段與FVIII蛋白質結合或締合。藉由與FVIII蛋白質結合或締合，本發明之VWF片段保護FVIII免遭蛋白酶裂解及FVIII活化，穩定化FVIII之重鏈及輕鏈，且阻止FVIII由清除受體清除。在另一實施例中，VWF片段與FVIII蛋白質結合或締合且阻斷或阻止FVIII蛋白質結合磷脂及活化型蛋白質C。藉由阻止或抑制FVIII蛋白質與內源性全長VWF結合，本發明之VWF片段減少FVIII由VWF清除受體之清除且因此延長FVIII蛋白質之半衰期。因此，FVIII蛋白質之半 衰期延長係歸因於缺乏VWF清除受體結合位點之VWF片段與FVIII蛋白質之結合或締合及由VWF片段遮蔽或保護FVIII蛋白質以免與含有VWF清除受體結合位點之內源性VWF結合。結合於VWF片段或由VWF片段保護之FVIII蛋白質亦可允許FVIII蛋白質再循環。藉由消除全長VWF分子中所含之VWF清除路徑受體結合位點，本發明之FVIII/VWF雜二聚體被遮蔽免遭VWF清除路徑，從而進一步延長FVIII半衰期。
在一個實施例中，本發明之VWF片段包含VWF之D'域及D3域，其中該D'域與SEQ ID NO：2之胺基酸764至866至少60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致，其中該VWF片段阻止內源性VWF結合FVIII。在另一實施例中，VWF片段包含VWF之D'域及D3域，其中該D3域與SEQ ID NO：2之胺基酸867至1240至少60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致，其中該VWF片段阻止內源性VWF結合FVIII。在一些實施例中，本文所述之VWF片段包含以下、基本上由以下組成、或由以下組成：VWF之D'域及D3域，該等域與SEQ ID NO：2之胺基酸764至1240至少60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致，其中該VWF片段阻止內源性VWF結合FVIII。在其他實施例中，VWF片段包含以下、基本上由以下組成、或由以下組成：D1、D2、D'及D3域，該等域 與SEQ ID NO：2之胺基酸23至1240至少60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致，其中該VWF片段阻止內源性VWF結合FVIII。在其他實施例中，VWF片段進一步包含與其可操作地連接之信號肽。
在一些實施例中，本發明之VWF片段基本上由以下組成或由以下組成：(1)D'D3域、D1D'D3域、D2D'D3域或D1D2D'D3域及(2)至多約10個胺基酸(例如SEQ ID NO：2之胺基酸764至1240至SEQ ID NO：2之胺基酸764至1250的任何序列)、至多約15個胺基酸(例如SEQ ID NO：2之胺基酸764至1240至SEQ ID NO：2之胺基酸764至1255的任何序列)、至多約20個胺基酸(例如SEQ ID NO：2之胺基酸764至1240至SEQ ID NO：2之胺基酸764至1260的任何序列)、至多約25個胺基酸(例如SEQ ID NO：2之胺基酸764至1240至SEQ ID NO：2之胺基酸764至1265的任何序列)、或至多約30個胺基酸(例如SEQ ID NO：2之胺基酸764至1240至SEQ ID NO：2之胺基酸764至1260的任何序列)之另一VWF序列。在一特定實施例中，包含D'域及D3域或基本上由D'域及D3域組成之VWF片段既不為SEQ ID NO：2之胺基酸764至1274亦不為全長成熟VWF。在一些實施例中，D1D2域以反式與D'D3域一起表現。在一些實施例中，D1D2域以順式與D'D3域一起表現。
在其他實施例中，包含連接於D1D2域之 D'D3域之VWF片段進一步包含細胞內裂解位點(例如PACE(弗林蛋白酶)或PC5之裂解位點)，從而允許在表現時，D1D2域自D'D3域裂解。細胞內裂解位點之非限制性實例在本文中其他地方加以揭露。
在其他實施例中，VWF片段包含D'域及D3域，但不包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：(1)SEQ ID NO：2之胺基酸1241至2813，(2)SEQ ID NO：2之胺基酸1270至胺基酸2813，(3)SEQ ID NO：2之胺基酸1271至胺基酸2813，(4)SEQ ID NO：2之胺基酸1272至胺基酸2813，(5)SEQ ID NO：2之胺基酸1273至胺基酸2813，(6)SEQ ID NO：2之胺基酸1274至胺基酸2813，及其任何組合。
在其他實施例中，本發明之VWF片段包含以下、基本上由以下組成、或由以下組成：對應於D'域、D3域及A1域之胺基酸序列，其中該胺基酸序列與SEQ ID NO：2之胺基酸764至1479至少60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致，其中該VWF片段阻止內源性VWF結合FVIII。在一特定實施例中，VWF片段不為SEQ ID NO：2之胺基酸764至1274。
在一些實施例中，本發明之VWF片段包含D'域及D3域，但不包含至少一個選自由以下組成之群之VWF域：(1)A1域，(2)A2域，(3)A3域，(4)D4域，(5)B1域，(6)B2域，(7)B3域，(8)C1域，(9)C2域， (10)CK域，(11)CK域及C2域，(12)CK域、C2域及C1域，(13)CK域、C2域、C1域、B3域，(14)CK域、C2域、C1域、B3域、B2域，(15)CK域、C2域、C1域、B3域、B2域及B1域，(16)CK域、C2域、C1域、B3域、B2域、B1域及D4域，(17)CK域、C2域、C1域、B3域、B2域、B1域、D4域及A3域，(18)CK域、C2域、C1域、B3域、B2域、B1域、D4域、A3域及A2域，(19)CK域、C2域、C1域、B3域、B2域、B1域、D4域、A3域、A2域及A1域，及(20)其任何組合。
在其他實施例中，VWF片段包含D'D3域及一或多個域或模組。此等域或模組之實例包括(但不限於)Zhour等人，Blood 2012年4月6日線上發表：DOI 10.1182/blood-2012-01-405134中揭露之域及模組。舉例而言，VWF片段可包含D'D3域及一或多個選自由以下組成之群之域或模組：A1域、A2域、A3域、D4N模組、VWD4模組、C8-4模組、TIL-4模組、C1模組、C2模組、C3模組、C4模組、C5模組、C5模組、C6模組及其任何組合。
在其他實施例中，VWF片段連接於異源部分，其中該異源部分連接於該VWF片段之N末端或C末端或緊靠FVIII蛋白質中之一或多個胺基酸(例如一或多個XTEN插入位點)之下游插入在VWF片段中。舉例而言，異源部分在VWF片段中之插入位點可在D'域、D3域或兩者中。異源部分可為半衰期延長劑。
在某些實施例中，本發明之VWF片段形成多聚體，例如二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、六聚體、七聚體或更高級多聚體。在其他實施例中，VWF片段為僅具有一個VWF片段之單體。在一些實施例中，本發明之VWF片段可具有一或多個胺基酸取代、缺失、添加或修飾。在一個實施例中，VWF片段可包括胺基酸取代、缺失、添加或修飾以使VWF片段不能形成二硫鍵或不能形成二聚體或多聚體。在另一實施例中，胺基酸取代在D'域及D3域內。在一特定實施例中，本發明之VWF片段在對應於SEQ ID NO：2之殘基1099、殘基1142、或殘基1099與1142兩者之殘基處含有至少一個胺基酸取代。至少一個胺基酸取代可為不天然存在於野生型VWF中之任何胺基酸。舉例而言，胺基酸取代可為除半胱胺酸以外之任何胺基酸，例如異白胺酸、丙胺酸、白胺酸、天冬醯胺、離胺酸、天冬胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、麩胺酸、酥胺酸、麩醯胺酸、色胺酸、甘胺酸、纈胺酸、脯胺酸、絲胺酸、酪胺酸、精胺酸或組胺酸。在另一實例中，胺基酸取代具有一或多個阻止或抑制VWF片段形成多聚體之胺基酸。
在某些實施例中，適用於本文之VWF片段可經進一步修飾以改良其與FVIII之相互作用，例如改良對FVIII之結合親和力。作為一非限制性實例，VWF片段在對應於SEQ ID NO：2之胺基酸764之殘基處包含絲胺酸殘基及在對應於SEQ ID NO：2之胺基酸773之殘基處包 含離胺酸殘基。殘基764及/或773可有助於VWF片段對FVIII之結合親和力。在其他實施例中，適用於本發明之VWF片段可具有其他修飾，例如蛋白質可經聚乙二醇化、糖基化、羥乙基澱粉化或聚唾液酸化。
B)XTEN序列
如此處所用，「XTEN序列」係指具有主要由小型親水性胺基酸構成之非天然存在之實質上非重複序列的延長長度多肽，其中該序列在生理條件下具有低度或不具有二級或三級結構。作為嵌合蛋白搭配物，XTEN可充當載體，從而例如當連接於本發明之VWF片段或FVIII序列以產生嵌合蛋白時，賦予某些合乎需要之藥物動力學、物理化學及醫藥性質。此等合乎需要之性質包括(但不限於)增強之藥物動力學參數及溶解性特徵。如本文所用，「XTEN」明確排除抗體或抗體片段，諸如單鏈抗體或輕鏈或重鏈之Fc片段。
在一些實施例中，本發明之XTEN序列為具有多於約20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1200、1400、1600、1800或2000個胺基酸殘基之肽或多肽。在某些實施例中，XTEN為具有多於約20至約3000個胺基酸殘基、多於30至約2500個殘基、多於40至約2000個殘基、多於50至約1500個殘基、多於60至約1000個殘 基、多於70至約900個殘基、多於80至約800個殘基、多於90至約700個殘基、多於100至約600個殘基、多於110至約500個殘基、或多於120至約400個殘基之肽或多肽。
本發明之XTEN序列可包含一或多個具有9至14個胺基酸殘基之序列基元或與該序列基元至少80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列，其中該基元包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：4至6種類型之選自由以下組成之群之胺基酸：甘胺酸(G)、丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、酥胺酸(T)、麩胺酸(E)及脯胺酸(P)。參見US 2010-0239554 A1。
在一些實施例中，XTEN包含不重疊序列基元，其中序列之約80%、或至少約85%、或至少約90%、或約91%、或約92%、或約93%、或約94%、或約95%、或約96%、或約97%、或約98%、或約99%或約100%由多個選自自表2A選擇之單一基元家族之不重疊序列之單元組成，從而產生家族序列。如本文所用，「家族」意謂XTEN具有僅選自來自表2A之單一基元類別的基元；亦即AD、AE、AF、AG、AM、AQ、BC或BD XTEN，且選擇XTEN中之不來自家族基元之任何其他胺基酸以達成所需性質，諸如允許藉由編碼核苷酸來併入限制位點，併入裂解序列，或達成與FVIII或VWF之更佳連接。在XTEN家族之一些實施例中，XTEN序列包含AD基元家族或AE 基元家族或AF基元家族或AG基元家族或AM基元家族或AQ基元家族或BC家族或BD家族之多個不重疊序列基元單元，從而所得XTEN展現上述同源性範圍。在其他實施例中，XTEN包含來自表2A之兩個或兩個以上基元家族之多個基元序列單元。可選擇此等序列以達成由以下更充分描述之胺基酸組成所賦予之所要物理/化學特徵，包括諸如淨電荷、親水性、缺乏二級結構或缺乏重複性之性質。在此段落中之上文所述實施例中，可使用本文所述之方法選擇及裝配併入XTEN中之基元以獲得具有約36至約3000個胺基酸殘基之XTEN。
* 表示當以各種排列一起使用時產生「家族序列」之個別基元序列
XTEN可具有不同長度以供插入FVIII或VWF中或與FVIII或VWF連接。在一個實施例中，基於欲在融合蛋白中達成之性質或功能選擇XTEN序列之長度。視預定性質或功能而定，XTEN可為短或中等長度序列或可充當載體之較長序列。在某些實施例中，XTEN包括具有 約6至約99個胺基酸殘基之短區段、具有約100至約399個胺基酸殘基之中等長度、及具有約400至約1000且至多約3000個胺基酸殘基之較長長度。因此，插入FVIII或VWF中或連接於FVIII或VWF之XTEN之長度可為約6、約12、約36、約40、約42、約72、約96、約144、約288、約400、約500、約576、約600、約700、約800、約864、約900、約1000、約1500、約2000、約2500或至多約3000個胺基酸殘基長。在其他實施例中，XTEN序列之長度為約6至約50、約50至約100、約100至150、約150至250、約250至400、約400至約500、約500至約900、約900至1500、約1500至2000、或約2000至約3000個胺基酸殘基。插入FVIII或VWF中或連接於FVIII或VWF之XTEN之精確長度可在不會不利地影響FVIII或VWF之活性下變化。在一個實施例中，本文使用之一或多個XTEN在長度方面具有36個胺基酸、42個胺基酸、72個胺基酸、144個胺基酸、288個胺基酸、576個胺基酸或864個胺基酸且可選自一或多個XTEN家族序列；亦即AD、AE、AF、AG、AM、AQ、BC或BD。
在一些實施例中，本發明中使用之XTEN序列與選自由以下組成之群之序列至少60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致：AE42、AG42、AE48、AM48、AE72、AG72、AE108、AG108、AE144、AF144、 AG144、AE180、AG180、AE216、AG216、AE252、AG252、AE288、AG288、AE324、AG324、AE360、AG360、AE396、AG396、AE432、AG432、AE468、AG468、AE504、AG504、AF504、AE540、AG540、AF540、AD576、AE576、AF576、AG576、AE612、AG612、AE624、AE648、AG648、AG684、AE720、AG720、AE756、AG756、AE792、AG792、AE828、AG828、AD836、AE864、AF864、AG864、AM875、AE912、AM923、AM1318、BC864、BD864、AE948、AE1044、AE1140、AE1236、AE1332、AE1428、AE1524、AE1620、AE1716、AE1812、AE1908、AE2004A、AG948、AG1044、AG1140、AG1236、AG1332、AG1428、AG1524、AG1620、AG1716、AG1812、AG1908及AG2004。參見US 2010-0239554 A1。
在一個實施例中，XTEN序列與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致：AE42(SEQ ID NO：36)、AE72(SEQ ID NO：127)、AE144_2A(SEQ IDNO：128)、AE144_3B(SEQ ID NO：129)、AE144_4A(SEQ ID NO：130)、AE144_5A(SEQ IDNO：131)、AE144_6B(SEQ IDNO：132)、AG144_A(SEQ ID NO：133)、AG144_B(SEQ IDNO：134)、AG144_C(SEQ ID NO：135)、AG144_F(SEQ IDNO：136)、AE864(SEQ ID NO：43)、AE576(SEQ ID NO： 41)、AE288(SEQ IDNO：39)、AE288_2(SEQ ID NO：137)、AE144(SEQ ID NO：37)、AG864(SEQ ID NO：44)、AG576(SEQ ID NO：42)、AG288(SEQ ID NO：40)、AG144(SEQ ID NO：38)及其任何組合。在另一實施例中，XTEN序列係選自由以下組成之群：AE42(SEQ ID NO：36)、AE72(SEQ ID NO：127)、AE144_2A(SEQ IDNO：128)、AE144_3B(SEQ ID NO：129)、AE144_4A(SEQ ID NO：130)、AE144_5A(SEQ IDNO：131)、AE144_6B(SEQ IDNO：132)、AG144_A(SEQ ID NO：133)、AG144_B(SEQ IDNO：134)、AG144_C(SEQ ID NO：135)、AG144_F(SEQ IDNO：136)、AE864(SEQ ID NO：43)、AE576(SEQ ID NO：41)、AE288(SEQ IDNO：39)、AE288_2(SEQ ID NO：137)、AE144(SEQ ID NO：37)、AG864(SEQ ID NO：44)、AG576(SEQ ID NO：42)、AG288(SEQ ID NO：40)、AG144(SEQ ID NO：38)及其任何組合。在一特定實施例中，XTEN序列為AE288。本發明之某些XTEN序列之胺基酸序列展示於表2B中。
在其他實施例中，本發明中使用之XTEN序列影響本發明之嵌合蛋白之物理或化學性質，例如藥物動力學。本發明中使用之XTEN序列可展現一或多種以下有利性質：構形可撓性、增強之水溶性、高度蛋白酶抗性、低免疫原性、與哺乳動物受體之低結合性或增加之流體動力學(或斯托克斯(Stokes))半徑。在一特定實施例中，連接於本發明中之FVIII蛋白質之XTEN序列增加藥物動力學性質，諸如較長終末半衰期或增加之曲線下面積(AUC)，以使本文所述之嵌合蛋白相較於野生型FVIII在活體內停留之時期增加。在其他實施例中，本發明中使用之XTEN序列增加藥物動力學性質，諸如較長終末半衰期或增加之曲線下面積(AUC)，以使FVIII蛋白質相較於野生型FVIII在活體內停留之時期增加。
多種方法及分析可用於測定包含XTEN序列之蛋白質之物理/化學性質。此等方法包括(但不限於)分析性離心、EPR、HPLC-離子交換、HPLC-尺寸排阻、逆相HPLC、光散射、毛細管電泳、圓二色性、示差掃描熱析法、螢光、HPLC-離子交換、HPLC-尺寸排阻、IR、NMR、拉曼(Raman)光譜術、折射法及UV/可見光譜術。其他方法揭露於Amau等人，Prot Expr and Purif 48,1-13(2006)中。
可根據本發明使用之XTEN序列之其他實例揭露於美國專利公開案第2010/0239554 A1號、第2010/0323956 A1號、第2011/0046060 A1號、第2011/0046061 A1號、第2011/0077199 A1號或第2011/0172146 A1號、或國際專利公開案第WO 2010091122 A1號、第WO 2010144502 A2號、第WO 2010144508 A1號、第WO 2011028228 A1號、第WO 2011028229 A1號或第WO 2011028344 A2號中。
C)因子VIII(FVIII)蛋白質
除非另外規定，否則如本文所用之「FVIII蛋白質」意謂在凝血中發揮正常作用之功能性FVIII多肽。術語FVIII蛋白質包括其保留全長野生型因子VIII在凝血路徑中之功能之功能性片段、變異體、類似物或衍生物。「FVIII蛋白質」可與FVIII多肽(或蛋白質)或FVIII互換使用。FVIII功能之實例包括(但不限於)能夠活化凝血、 能夠充當因子IX之輔因子、或能夠在Ca2+及磷脂存在下與因子IX形成因子X酶複合物，該因子X酶複合物接著將因子X轉化成活化形式Xa。FVIII蛋白質可為人類、豬、犬、大鼠或鼠類FVIII蛋白質。此外，來自人類與其他物種之FVIII之間的比較已鑒別出可能為功能所需之保守殘基(Cameron等人，Thromb.Haemost.79：317-22(1998)；US 6,251,632)。
許多測試可用於評估凝血系統之功能：活化部分凝血酶原激酶時間(aPTT)測試、顯色分析、ROTEM分析、凝血酶原時間(PT)測試(亦用於測定INR)、纖維蛋白原測試(常藉由克勞斯(Clauss)方法)、血小板計數、血小板功能測試(常藉由PFA-100)、TCT、流血時間、混合測試(若患者之血漿與正常血漿混合，則是否進行異常性校正)、凝血因子分析、抗磷脂抗體、D-二聚體、遺傳測試(例如因子V Leiden、凝血酶原突變G20210A)、稀釋魯塞爾蝰蛇毒時間(Russell's viper venom time，dRVVT)、混雜血小板功能測試、凝血彈性描記術(TEG或Sonoclot)、凝血彈性量測術(TEM®，例如ROTEM®)或優球蛋白(euglobulin)溶解時間(ELT)。
aPTT測試為量度「內在」凝血路徑(亦稱為接觸活化路徑)與共同凝血路徑兩者之功效之效能指標。此測試通常用於量測市售重組凝結因子(例如FVIII或FIX)之凝結活性。其係與量度外在路徑之凝血酶原時間(PT)結合使用。
ROTEM分析提供關於以下完整止血動力學之資訊：凝結時間、凝塊形成、凝塊穩定性及溶解。凝血彈性量測術中之不同參數取決於血漿凝血系統之活性、血小板功能、纖維蛋白溶解或影響此等相互作用之許多因素。此分析可提供對次級止血之完全綜覽。
已知FVIII多肽及聚核苷酸序列，亦已知許多功能性片段、突變體及修飾形式。以下展示人類FVIII序列(全長)之實例。
FVIII多肽包括全長FVIII、全長FVIII減去N末端Met、成熟FVIII(減去信號序列)、在N末端具有另一Met之成熟FVIII及/或B域全部或部分缺失之FVIII。在某些實施例中，FVIII變異體包括B域缺失，無論部分或全部缺失。
天然成熟人類FVIII之序列呈現為SEQ ID NO：4。天然FVIII蛋白質具有下式：A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2，其中A1、A2及A3為結構上相關之「A域」，B為「B域」，C1及C2為結構上相關之「C域」，且a1、a2及a3為酸性間隔子區。關於SEQ ID NO：4中之一級胺基酸序列位置，人類FVIII之A1域自Ala1延伸至約Arg336，a1間隔子區自約Met337延伸至約Val374，A2域自約Ala375延伸至約Tyr719，a2間隔子區自約Glu720延伸至約Arg740，B域自約Ser741延伸至約Arg1648，a3間隔子區自約Glu1649延伸至約Arg1689，A3域自約Ser1690延伸至約Leu2025，C1域自約Gly2026延伸至約Asn2072，且C2域自約Ser2073延伸至Tyr2332。除特定蛋白水解裂解位點以外，對FVIII之域及區之間的邊界之位置的指定在不同參考文獻中可有 所不同。因此，本文中指示之邊界藉由使用術語「約」來指定為大致邊界。
分離人類FVIII基因且在哺乳動物細胞中表現(Toole,J.J.，等人，Nature 312：342-347(1984)；Gitschier,J.，等人，Nature 312：326-330(1984)；Wood,W.I.，等人，Nature 312：330-337(1984)；Vehar,G.A.，等人，Nature 312：337-342(1984)；WO 87/04187；WO 88/08035；WO 88/03558；及美國專利第4,757,006號)。自如美國專利第4,965,199號中所示之cDNA推斷出FVIII胺基酸序列。此外，B域部分或全部缺失之FVIII展示於美國專利第4,994,371號及第4,868,112號中。在一些實施例中，人類FVIII B域經如美國專利第5,004,803號中所示之人類因子VB域置換。編碼人類因子VIII之cDNA序列及胺基酸序列分別展示於美國申請公開案第2005/0100990號中之SEQ ID NO：4及5中。
豬FVIII序列公開於Toole,J.J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5939-5942(1986)中。此外，由自豬脾cDNA文庫對FVIII序列進行PCR擴增獲得之完全豬cDNA序列已報導於Healey,J.F.等人，Blood 88：4209-4214(1996)中。具有所有域、所有次單元及特定胺基酸序列之取代之雜交人類/豬FVIII揭露於Lollar及Runge之美國專利第5,364,771號中及WO 93/20093中。新近，豬FVIII之A1及A2域及用豬A1及/或A2域取代相應人類域之嵌合FVIII的核苷酸及相應胺基酸序列報導於WO 94/11503中。Lollar,J.S.之美國專利第5,859,204號亦揭露豬cDNA及推斷出之胺基酸序列。美國專利第6,458,563號揭露一種B域缺失之豬FVIII。
Lollar,J.S.之美國專利第5,859,204號報導了具有降低的抗原性及降低的免疫反應性之FVIII功能性突變體。Lollar,J.S.之美國專利第6,376,463號亦報導具有降低的免疫反應性之FVIII突變體。Saenko等人之美國申請公開案第2005/0100990號報導了FVIII之A2域中之功能性突變。
在一個實施例中，FVIII(或嵌合蛋白之FVIII部分)可與具有SEQ ID NO：6之胺基酸1至1438或SEQ ID NO：4之胺基酸1至2332的FVIII胺基酸序列(無信號序列)或具有SEQ ID NO：3之胺基酸1至19及SEQ ID NO：6之胺基酸1至1438或SEQ ID NO：3之胺基酸1至19及SEQ ID NO：4之胺基酸1至2332的FVIII胺基酸序列(具有信號序列)至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致，其中該FVIII具有凝結活性，例如作為輔因子活化因子IX以將因子X轉化成活化型因子X。FVIII(或嵌合蛋白之FVIII部分)可與具有SEQ ID NO：6之胺基酸1至1438或SEQ ID NO：4之胺基酸1至2332的FVIII胺基酸序列(無信號序列)一致。FVIII可進一步包含信號序列。
如本文所用之FVIII之「B域」與此項技術中已知之藉由內部胺基酸序列一致性及蛋白水解裂解位點界 定之B域相同，例如為全長人類FVIII之殘基Ser741-Arg1648。其他人類FVIII域由以下胺基酸殘基界定：A1，殘基Ala1-Arg372；A2，殘基Ser373-Arg740；A3，殘基Ser1690-Asn2019；C1，殘基Lys2020-Asn2172；C2，殘基Ser2173-Tyr2332。A3-C1-C2序列包括殘基Ser1690-Tyr2332。剩餘序列殘基Glu1649-Arg1689通常稱為a3酸性區。豬、小鼠及犬FVIII之包括B域在內之所有域的邊界位置在此項技術中亦為已知的。在一個實施例中，缺失FVIII之B域(「B域缺失之因子VIII」或「BDD FVIII」)。BDD FVIII之一實例為REFACTO®(重組BDD FVIII)，其具有與表5中之序列之因子VIII部分相同的序列。(BDD FVIII重鏈加雙下劃線；B域用斜體表示；且BDD FVIII輕鏈呈純文本形式)。編碼表5之核苷酸序列(SEQ ID NO：7)展示於表6中。
「B域缺失之FVIII」可具有美國專利第6,316,226號、第6,346,513號、第7,041,635號、第 5,789,203號、第6,060,447號、第5,595,886號、第6,228,620號、第5,972,885號、第6,048,720號、第5,543,502號、第5,610,278號、第5,171,844號、第5,112,950號、第4,868,112號及第6,458,563號中揭露之全部或部分缺失。在一些實施例中，本發明之B域缺失之FVIII序列包含在美國專利第6,316,226號(亦在US 6,346,513中)之第4欄第4行至第5欄第28行及實例1-5中揭露之任一缺失。在另一實施例中，B域缺失之因子VIII為S743/Q1638 B域缺失之因子VIII(SQ BDD FVIII)(例如因子VIII具有自胺基酸744至胺基酸1637之缺失，例如因子VIII具有SEQ ID NO：4之胺基酸1-743及胺基酸1638-2332，亦即SEQ ID NO：6)。在一些實施例中，本發明之B域缺失之FVIII具有在美國專利第5,789,203號(以及US 6,060,447、US 5,595,886及US 6,228,620)之第2欄第26-51行及實例5-8中揭露之缺失。在一些實施例中，B域缺失之因子VIII具有以下文獻中描述之缺失：美國專利第5,972,885號之第1欄第25行至第2欄第40行；美國專利第6,048,720號之第6欄第1-22行及實例1；美國專利第5,543,502號之第2欄第17-46行；美國專利第5,171,844號之第4欄第22行至第5欄第36行；美國專利第5,112,950號之第2欄第55-68行，圖2及實例1；美國專利第4,868,112號之第2欄第2行至第19欄第21行及表2；美國專利第7,041,635號之第2欄第1行至第3欄第19行、第3欄第40行至第4欄 第67行、第7欄第43行至第8欄第26行、及第11欄第5行至第13欄第39行；或美國專利第6,458,563號之第4欄第25-53行。在一些實施例中，B域缺失之FVIII缺失大部分B域，但仍然含有在活體內將初級轉譯產物蛋白水解加工成兩個多肽鏈所必需的B域胺基端序列，如WO 91/09122中所揭露。在一些實施例中，B域缺失之FVIII構築成缺失胺基酸747-1638，亦即實際上完全缺失B域。Hoeben R.C.等人J.Biol.Chem.265(13)：7318-7323(1990)。B域缺失之因子VIII亦可含有FVIII之胺基酸771-1666或胺基酸868-1562之缺失。Meulien P.等人Protein Eng.2(4)：301-6(1988)。作為本發明之一部分之其他B域缺失包括：缺失胺基酸982至1562或760至1639(Toole等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1986)83,5939-5942))、797至1562(Eaton等人Biochemistry(1986)25：8343-8347))、741至1646(Kaufman(PCT公開申請案第WO 87/04187號))、747-1560(Sarver等人，DNA(1987)6：553-564))、741至1648(Pasek(PCT申請案第88/00831號))、或816至1598或741至1648(Lagner(Behring Inst.Mitt.(1988)No 82：16-25,EP 295597))。在其他實施例中，BDD FVIII包括含有B域之保留一或多個N-連接型糖基化位點之片段的FVIII多肽，該等位點例如對應於全長FVIII序列之胺基酸序列之殘基757、784、828、900、963或視情況943。B域片段之實例包括如Miao,H.Z.等人，Blood 103(a)：3412-3419(2004)、Kasuda,A等人，J. Thromb.Haemost.6：1352-1359(2008)及Pipe,S.W.等人，J.Thromb.Haemost.9：2235-2242(2011)中揭露的B域之226個胺基酸或163個胺基酸(亦即保留B域之前226個胺基酸或163個胺基酸)。在其他實施例中，BDD FVIII進一步包含在殘基309處之點突變(自Phe至Ser)以改良BDD FVIII蛋白質之表現。參見Miao,H.Z.等人，Blood 103(a)：3412-3419(2004)。在其他實施例中，BDD FVIII包括含有一部分B域，但不含一或多個弗林蛋白酶裂解位點(例如Arg1313及Arg1648)之FVIII多肽。參見Pipe,S.W.等人，J.Thromb.Haemost.9：2235-2242(2011)。可在任何FVIII序列中進行各前述缺失。
在一些實施例中，FVIII具有部分B域。在一些實施例中，具有部分B域之FVIII蛋白質為FVIII198(SEQ ID NO：89)。FVIII198為含有部分B域之單鏈FVIIIFc分子-226N6。226表示FVIIIB域之N端226個胺基酸，且N6表示B域中之六個N-糖基化位點。
在一個實施例中，就在胺基酸1648(在全長因子VIII或SEQ ID NO：4中)、胺基酸754(在S743/Q1638B域缺失之因子VIII或SEQ ID NO：6中)處之精胺酸或相應精胺酸殘基(在其他變異體中)之後裂解FVIII，藉此產生重鏈及輕鏈。在另一實施例中，FVIII包含重鏈及輕鏈，該等鏈藉由金屬離子介導之非共價鍵連接或締合。
在其他實施例中，FVIII為單鏈FVIII，其尚未就在胺基酸1648(在全長FVIII或SEQ ID NO：4中)、 胺基酸754(在S743/Q1638 B域缺失之FVIII或SEQ ID NO：6中)處之精胺酸或相應精胺酸殘基(在其他變異體中)之後被裂解。單鏈FVIII可包含一或多個胺基酸取代。在一個實施例中，胺基酸取代位於對應於全長成熟因子VIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基1648、殘基1645或兩者或SQ BDD因子VIII(SEQ ID NO：6)之殘基754、殘基751或兩者的殘基處。胺基酸取代可為除精胺酸以外之任何胺基酸，例如異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、酥胺酸、色胺酸、纈胺酸、丙胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、脯胺酸、硒半胱胺酸、絲胺酸、酪胺酸、組胺酸、鳥胺酸、吡咯離胺酸或牛磺酸。
FVIII可進一步由凝血酶裂解且接著活化成FVIIIa，充當活化型因子IX(FIXa)之輔因子。並且活化型FIX接著連同活化型FVIII一起形成X酶複合物且將因子X轉化成活化型因子X(FXa)。對於活化，FVIII由凝血酶在胺基酸372、740及1689(對應於B域缺失之FVIII序列中之胺基酸372、740及795)處之三個精胺酸殘基之後裂解，該裂解產生具有50kDa A1、43kDa A2及73kDa A3-C1-C2鏈之FVIIIa。在一個實施例中，適用於本發明之FVIII蛋白質為非活性FVIII。在另一實施例中，FVIII蛋白質為活化型FVIII。
具有與VWF片段連接或締合之FVIII多肽之蛋白質可包含與SEQ ID NO：4或6至少50%、60%、 70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之序列，其中該序列具有FVIII凝結活性，例如作為輔因子活化因子IX以將因子X轉化成活化型因子X(FXa)。
如本文所用之「雜交」或「嵌合」多肽及蛋白質包括視情況融合於第一Ig恆定區或其部分之第一多肽鏈(例如VWF片段)與視情況融合於第二Ig恆定區或其部分之第二多肽鏈(例如連接於XTEN序列之FVIII蛋白質)之組合，藉此形成雜二聚體。在一個實施例中，雜交物中之第一多肽與第二多肽經由蛋白質-蛋白質相互作用(諸如電荷-電荷或疏水性相互作用)彼此締合。在另一實施例中，雜交物中之第一多肽與第二多肽經由二硫鍵或其他共價鍵彼此締合。雜交物例如描述於US 2004/101740及US 2006/074199中。第二多肽可為第一多肽之相同複本或不相同多肽。在一個實施例中，第一多肽為FVIII蛋白質(X)-Fc融合蛋白，且第二多肽為包含Fc區、基本上由Fc區組成或由Fc區組成之多肽，其中該第一多肽與該第二多肽彼此締合。在另一實施例中，第一多肽包含VWF片段-XTEN-Fc融合蛋白，且第二多肽包含FVIII-Fc融合蛋白，從而使得雜交物為雜二聚體。在其他實施例中，第一多肽包含VWF片段-Fc融合蛋白，且第二多肽包含FVIII(X)-Fc融合蛋白，從而使得雜交物為雜二聚體。在其他實施例中，第一多肽包含VWF片段-XTEN-Fc融合蛋白，且第二多肽包含FVIII(X)-Fc融合蛋白。第一多肽與 第二多肽可經由第一Fc區與第二Fc區之間的共價鍵(例如二硫鍵)締合。第一多肽與第二多肽可進一步藉由VWF片段與FVIII蛋白質之間的結合而彼此締合。
適用於本發明中之FVIII蛋白質可包括具有一或多個不影響FVIII凝血活性之其他XTEN序列之FVIII。此等XTEN序列可融合於FVIII蛋白質之C末端或N末端或插入在FVIII蛋白質中之兩個胺基酸殘基之一或多者之間，同時該等插入不影響FVIII凝血活性或FVIII功能。在一個實施例中，插入改良FVIII蛋白質之藥物動力學性質(例如半衰期)。在另一實施例中，插入可為多個插入，例如多於兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個插入。插入位點之實例包括(但不限於)表7、8、9、10、11、12、13、14、15中所列之位點或其任何組合。
連接於一或多個XTEN序列之FVIII蛋白質可表示為FVIII(X)、FVIII(X1)、FVIII (a→b) -X-FVIII (c→d) ，其中FVIII (a→b) 包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：FVIII蛋白質之自胺基酸殘基「a」至胺基酸殘基「b」之第一部分；X或X1包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：一或多個XTEN序列，FVIII (c→d) 包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：FVIII蛋白質之自胺基酸殘基「c」至胺基酸殘基「d」之第二部分；a為FVIII蛋白質之第一部分之N末端胺基酸殘基，b為FVIII蛋白質之第一部分之C末端胺基酸殘基但亦為 其中插入XTEN序列之插入位點之兩個胺基酸的N末端胺基酸殘基，c為FVIII蛋白質之第二部分之N末端胺基酸殘基但亦為其中插入XTEN序列之插入位點之兩個胺基酸的C末端胺基酸殘基，且d為FVIII蛋白質之C末端胺基酸殘基，且其中FVIII蛋白質之第一部分與FVIII蛋白質之第二部分彼此不一致且共同具有足以使FVIII蛋白質具有FVIII凝血活性之長度。
在一個實施例中，FVIII蛋白質之第一部分及FVIII蛋白質之第二部分為SEQ ID NO：4[全長成熟FVIII序列]或SEQ ID NO：6[B域缺失之FVIII]之片段，例如分別為N端部分及C端部分。在某些實施例中，FVIII蛋白質之第一部分包含FVIII蛋白質之A1域及A2域。FVIII蛋白質之第二部分包含A3域、C1域及視情況C2域。在其他實施例中，FVIII蛋白質之第一部分包含A1域及A2域，且FVIII蛋白質之第二部分包含一部分B域、A3域、C1域及視情況C2域。在其他實施例中，FVIII蛋白質之第一部分包含FVIII蛋白質之A1域、A2域及一部分B域，且FVIII蛋白質之第二部分包含A3域、C1域及視情況C2域。在其他實施例中，FVIII蛋白質之第一部分包含FVIII蛋白質之A1域、A2域、及第一部分B域。 FVIII蛋白質之第二部分包含第二部分B域、A3域、C1域及視情況C2域。在一些實施例中，兩個胺基酸(「b」 及「c」)可為表7、8、9、10、11、12、13、14及15中所示之胺基酸殘基插入位點中之任一或多者。舉例而言，「b」可為緊靠其中插入或連接一或多個XTEN序列之位點之上游的胺基酸殘基，且「c」可為緊靠其中插入或連接一或多個XTEN序列之位點之下游的胺基酸殘基。在一些實施例中，「a」為FVIII蛋白質之第一成熟胺基酸序列，且「d」為FVIII蛋白質之末位胺基酸序列。舉例而言，FVIII (a→b) 可為與SEQ ID NO：6[B域缺失之FVIII胺基酸序列]或SEQ ID NO：4[全長FVIII]之胺基酸1至745至少70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列且FVIII (c→d) 可分別為SEQ ID NO：6之胺基酸746至1438或SEQ ID NO：4之胺基酸1641至2332。
在一些態樣中，FVIII蛋白質中之插入位點位於FVIII蛋白質之一或多個域(其為N末端、A1域、A2域、A3域、B域、C1域、C2域、C末端或其兩種或兩種以上組合)中或位於FVIII蛋白質之兩個域(其為A1域及a1酸性區、及a1酸性區及A2域、A2域及a2酸性區、a2酸性區及B域、B域及A3域、及A3域及C1域、C1域及C2域或其任何組合)之間。舉例而言，其中可插入XTEN序列之插入位點係選自由以下組成之群：N末端及A1域、N末端及A2域、N末端及A3域、N末端及B域、N末端及C1域、N末端及C2域、N末端及C末端、A1域及A2域、A1域及A3域、A1域及B域、A1域及 C1域、A1域及C2域、A1域及C末端、A2域及A3域、A2域及B域、A2域及C1域、A2域及C2域、A2域及C末端、A3域及B域、A3域及C1域、A3域及C2域、A3域及C末端、B域及C1域、B域及C2域、B域及C末端、C1域及C2域、C1域及C末端、C2域及C末端及其兩種或兩種以上組合。插入位點之非限制性實例列於表7、8、9、10、11、12、13、14及15中。
其中緊靠FVIII蛋白質中之一或多個胺基酸(例如一或多個XTEN插入位點)之下游插入或在C末端或N末端連接XTEN序列的FVIII蛋白質在連接於XTEN序列或由XTEN序列插入之後保留FVIII活性。XTEN序列可在FVIII蛋白質中插入一次或多於一次、兩次、三次、四次、五次或六次，使得插入不影響FVIII活性(亦即FVIII蛋白質仍然保留凝血性質)。
適用於本發明中之FVIII蛋白質可藉由視情況選用之連接子在FVIII蛋白質之N末端或C末端連接於一或多個XTEN多肽或藉由一或多個視情況選用之連接子緊靠FVIII蛋白質中之一或多個胺基酸(例如一或多個XTEN插入位點)之下游插入。在一個實施例中，其中插入XTEN序列之兩個胺基酸殘基或XTEN序列所連接之胺基酸殘基對應於SEQ ID NO：4[全長成熟FVIII]之兩個或一個選自由表7、表8、表9及表10中之殘基及其任何組合組成之群的胺基酸殘基。
在其他實施例中，至少一個XTEN序列插入 本文揭露之任一或多個XTEN插入位點或其任何組合中。在一個態樣中，至少一個XTEN序列插入表7中揭露之一或多個胺基酸中揭露的一或多個XTEN插入位點中。
在一些實施例中，一或多個XTEN序列插入在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸32、220、224、336、339、399、416、603、1656、1711、1725、1905或1910或其任何組合之上游或下游的約六個胺基酸內。
舉例而言，「-1,+2」指示在表示為-1、0、+1或+2之胺基酸殘基之N末端或C末端進行插入。
在其他實施例中，一或多個XTEN序列緊靠對應於全長成熟人類FVIII之一或多個選自由表9中之一或多個插入位點組成之群之胺基酸的下游插入。
在其他實施例中，一或多個XTEN插入FVIII之B域中。在一個實例中，XTEN插入在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸740與1640之間，其中胺基酸740與1640之間的FVIII序列視情況不存在。在另一實例中，XTEN插入在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸741與1690之間，其中胺基酸740與1690之間的FVIII序列視情況不存在。在其他實例中，XTEN插入在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸741與1648之間，其中胺基酸741與1648之間的FVIII序列視情況不存在。在其他實例中，XTEN插入在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸743與1638之間，其中胺基酸743與1638之間的FVIII序列視情況不存在。在其他實例中，XTEN插入在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸745與1656之間，其中胺基酸745與1656之間的FVIII序列視情況不存在。在一些實例中，XTEN插入在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸745與1657之間，其中胺基酸745與1657之間的FVIII序列視情況不存在。在某 些實例中，XTEN插入在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸745與1667之間，其中胺基酸745與1667之間的FVIII序列視情況不存在。在其他實例中，XTEN插入在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸745與1686之間，其中胺基酸745與1686之間的FVIII序列視情況不存在。在一些其他實例中，XTEN插入在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸747與1642之間，其中胺基酸747與1642之間的FVIII序列視情況不存在。在其他實例中，XTEN插入在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸751與1667之間，其中胺基酸751與1667之間的FVIII序列視情況不存在。
在一些實施例中，一或多個XTEN插入緊靠選自由表10中之胺基酸殘基組成之群的插入位點之胺基酸之下游的一或多個胺基酸中。
在一個實施例中，一或多個XTEN插入位點位於FVIII蛋白質之一或多個表面暴露之可撓性環結構(例如容許環)內。舉例而言，至少一個XTEN序列可插入包含其中可插入至少一個XTEN多肽而不消除重組蛋白質之促凝血活性或重組蛋白質在活體內或在活體外於宿主細胞中表現之能力之至少兩個「容許環」的各FVIII「A」域中。容許環為允許插入至少一個XTEN序列且具有高表面或溶劑暴露及高構形可撓性以及其他屬性之區域。A1域包含容許環-1(A1-1)區及容許環-2(A1-2)區，A2域包含容許環-1(A2-1)區及容許環-2(A2-2)區，A3域包含容許環-1(A3-1)區及容許環-2(A3-2)區。
在一個態樣中，FVIII A1域中之第一容許環 (A1-1)位於β股1與β股2之間，且FVIII A2域中之第二容許環(A1-2)位於β股11與β股12之間。FVIII A2域中之第一容許環(A2-1)位於β股22與β股23之間，且FVIII A2域中之第二容許環(A2-2)位於β股32與β股33之間。FVIII A3域中之第一容許環(A3-1)位於β股38與β股39之間，且FVIII A3中之第二容許環(A3-2)位於β股45與β股46之間。在某些態樣中，包含A1-1之表面暴露可撓性環結構對應於天然成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸15至約胺基酸45，例如自SEQ ID NO：4之約胺基酸18至約胺基酸41的區域。在其他態樣中，包含A1-2之表面暴露可撓性環結構對應於天然成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸201至約胺基酸232，例如自SEQ ID NO：4之約胺基酸218至約胺基酸229的區域。在其他態樣中，包含A2-1之表面暴露可撓性環結構對應於天然成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸395至約胺基酸421，例如自SEQ ID NO：4之約胺基酸397至約胺基酸418的區域。在其他實施例中，包含A2-2之表面暴露可撓性環結構對應於天然成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸577至約胺基酸635，例如自SEQ ID NO：4之約胺基酸595至約胺基酸607的區域。在某些態樣中，包含A3-1之表面暴露可撓性環結構對應於天然成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸1705至約胺基酸1732，例如自SEQ ID NO：4之約胺基酸1711至約胺基酸1725的區域。在其他態樣 中，包含A3-2之表面暴露可撓性環結構對應於天然成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸1884至約胺基酸1917，例如自SEQ ID NO：4之約胺基酸1899至約胺基酸1911的區域。
在另一實施例中，其中插入至少一個XTEN序列之一或多個胺基酸位於a3域，例如對應於全長成熟FVIII多肽之胺基酸1649至1689內。在一特定實施例中，XTEN序列插入在SEQ ID NO：4(全長成熟FVIII)之胺基酸1656與1657之間。在一特定實施例中，包含緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656之下游插入之XTEN序列的FVIII蛋白質進一步包含自對應於SEQ ID NO：4之胺基酸745至胺基酸1656的缺失。
在一些實施例中，用於一或多個XTEN插入之一或多個插入位點緊靠一或多個選自由以下組成之群之胺基酸的下游：(1)胺基酸3，(2)胺基酸18，(3)胺基酸22，(4)胺基酸26，(5)胺基酸32，(6)胺基酸40，(7)胺基酸60，(8)胺基酸65，(9)胺基酸81，(10)胺基酸116，(11)胺基酸119，(12)胺基酸130，(13)胺基酸188，(14)胺基酸211，(15)胺基酸216，(16)胺基酸220，(17)胺基酸224，(18)胺基酸230，(19)胺基酸333，(20)胺基酸336，(21)胺基酸339，(22)胺基酸375，(23)胺基酸399，(24)胺基酸403，(25)胺基酸409，(26)胺基酸416，(26)胺基酸442， (28)胺基酸487，(29)胺基酸490，(30)胺基酸494，(31)胺基酸500，(32)胺基酸518，(33)胺基酸599，(34)胺基酸603，(35)胺基酸713，(36)胺基酸745，(37)胺基酸1656，(38)胺基酸1711，(39)胺基酸1720，(40)胺基酸1725，(41)胺基酸1749，(42)胺基酸1796，(43)胺基酸1802，(44)胺基酸1827，(45)胺基酸1861，(46)胺基酸1896，(47)胺基酸1900，(48)胺基酸1904，(49)胺基酸1905，(50)胺基酸1910，(51)胺基酸1937，(52)胺基酸2019，(53)胺基酸2068，(54)胺基酸2111，(55)胺基酸2120，(56)胺基酸2171，(57)胺基酸2188，(58)胺基酸2227，(59)胺基酸2277，及(60)其兩種或兩種以上組合。
在一個實施例中，適用於本發明之FVIII蛋白質包含兩個XTEN序列，第一XTEN序列插入第一XTEN插入位點中且第二XTEN插入第二XTEN插入位點中。第一XTEN插入位點及第二XTEN插入位點之非限制性實例列於表11中。
插入或連接於FVIII蛋白質之兩個XTEN可相同或不同。在一些實施例中，適用於本發明之FVIII蛋白質包含兩個插入FVIII蛋白質中之XTEN序列，第一XTEN序列緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸745之下游插入，且第二XTEN序列緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸2332(C末端)之下游插入。在其他實施例中，第一XTEN序列緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸18、26、 40、1656或1720之下游插入，且第二XTEN序列緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸403之下游插入。在其他實施例中，第一XTEN序列緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸18、26或40之下游插入，且第二XTEN序列緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸599之下游插入。在其他實施例中，第一XTEN序列緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656之下游插入，且第二XTEN序列緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸18、26、40、399、403、1725、1720、1900、1905或2332之下游插入。在某些實施例中，第一XTEN序列緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1900之下游插入，且第二XTEN序列緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸18、26或40之下游插入。在一些實施例中，第一XTEN序列緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸18、26或40之下游插入，且第二XTEN序列緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸399之下游插入。在其他實施例中，第一XTEN序列緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1720之下游插入，且第二XTEN序列緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸18、26或40之下游插入。在其他實施例中，第一XTEN序列緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1720之下游插入，且第二XTEN序列緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸18之下游插入。在一特定實施例中，FVIII蛋白質包含兩個XTEN序列，第一XTEN序列緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸745之下游插入且第二XTEN序列緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸2332之下 游插入，其中該FVIII蛋白質進一步具有自對應於SEQ ID NO：4之胺基酸745至對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1685的缺失、在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1680處具有突變或取代(例如Y1680F)、在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1648處具有突變或取代(例如R1648A)、或在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1648(例如R1648A)及對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1680(例如Y1680F)處具有至少兩個突變或取代。在一特定實施例中，FVIII蛋白質包含兩個XTEN序列，第一XTEN緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656之下游插入且第二XTEN序列緊靠SEQ ID NO：4之胺基酸2332之下游插入，其中該FVIII蛋白質進一步具有自對應於SEQ ID NO：4之胺基酸745至胺基酸1656的缺失。
在某些實施例中，FVIII蛋白質包含三個XTEN序列，第一XTEN序列插入第一XTEN插入位點中，第二XTEN序列插入第二XTEN序列中，且第三XTEN序列插入第三XTEN插入位點中。第一、第二或第三XTEN序列可相同或不同。第一、第二及第三插入位點可選自本文揭露之任一插入位點之群。在一些實施例中，包含三個XTEN序列之FVIII蛋白質可進一步包含突變或取代，例如對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1648，例如R1648A。舉例而言，第一、第二及第三XTEN插入位點之非限制性實例列於表12中。
在一些實施例中，FVIII蛋白質包含三個XTEN序列，第一XTEN序列緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸26之下游插入，第二XTEN序列插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸403之下游，且第三XTEN序列插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656、1720或1900之下游。在其他實施例中，第一XTEN序列緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸26之下游插入，第二XTEN序列插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656之下游，且第三XTEN序列插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1720或1900之下游。在其他實施例中，第一XTEN序列緊靠對 應於SEQ ID NO：4之胺基酸26之下游插入，第二XTEN序列插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1720之下游，且第三XTEN序列插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1900之下游。在其他實施例中，第一XTEN序列緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸403之下游插入，第二XTEN序列插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656之下游，且第三XTEN序列插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1720或1900之下游。在其他實施例中，第一XTEN序列緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸403或1656之下游插入，第二XTEN序列插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1720之下游，且第三XTEN序列插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1900之下游。在其他實施例中，第一XTEN序列緊靠對應於SEQ ID NO：4之胺基酸18、26、40、399、403、1711、1720、1725、1900、1905或1910之下游插入，第二XTEN序列插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸745之下游，且第三XTEN序列插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸2332之下游。
在其他實施例中，本發明中之FVIII蛋白質包含四個XTEN序列，第一XTEN序列插入第一插入位點中，第二XTEN序列插入第二插入位點中，第三XTEN序列插入第三插入位點中，且第四XTEN序列插入第四插入位點中。第一、第二、第三及第四XTEN序列可相同、不同或為其組合。在一些實施例中，包含四個XTEN序列之FVIII蛋白質可進一步包含突變或取代，例如對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1648，例如R1648A。第一、第二、第三及第四XTEN插入位點之非限制性實例列於表13中。
在一些實施例中，FVIII蛋白質包含五個XTEN序列，第一XTEN序列插入第一插入位點中，第二XTEN序列插入第二插入位點中，第三XTEN序列插入第三XTEN插入位點中，第四XTEN序列插入第四XTEN插入位點中，且第五XTEN序列插入第五XTEN插入位點中。第一、第二、第三、第四或第五XTEN序列可相同、不同或為其組合。第一、第二、第三、第四及第五插入位點之非限制性實例列於表14中。
在某些實施例中，FVIII蛋白質包含六個XTEN序列，第一XTEN序列插入第一XTEN插入位點中，第二XTEN序列插入第二XTEN插入位點中，第三XTEN序列插入第三XTEN插入位點中，第四XTEN序列插入第四XTEN插入位點中，第五XTEN序列插入第五XTEN插入位點中，且第六XTEN序列插入第六XTEN插入位點中。第一、第二、第三、第四、第五或第六XTEN序列可相同、不同或為其組合。六個XTEN插入位點之實例包括(但不限於)表15中所列之插入位點。
在一特定實例中，第一XTEN插入在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸26與27之間，且第二XTEN插入在對應於SEQ ID NO：4(全長成熟FVIII)之胺基酸1720與1721之間。在另一實例中，第一XTEN插入在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸403與404之間，且第二XTEN插入在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1720與1721之間。在一些實例中，第一XTEN插入在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656與1657之間，且第二XTEN插入在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1720與1721之間。在其他實例中，第一XTEN插入在對應於SEQ ID NO：4之胺 基酸26與27之間，第二XTEN插入在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656與1657之間，且第三XTEN插入在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1720與1721之間。在其他實施例中，第一XTEN插入在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸403與404之間，第二XTEN插入在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656與1657之間，且第三XTEN插入在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1720與1721之間。在其他實施例中，第一XTEN插入在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸403與404之間，第二XTEN插入在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656與1657之間，且第三XTEN插入在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1720與1721之間。在某些實施例中，第一XTEN插入在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸26與27之間，第二XTEN插入在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1720與1721之間，且第三XTEN插入在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1900與1901之間。在一些實施例中，第一XTEN插入在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸26與27之間，第二XTEN插入在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656與1657之間，第三XTEN插入在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1720與1721之間，且第四XTEN插入在對應於SEQ ID NO：4之1900與1901之間。
在一特定實施例中，XTEN序列插入在全長因子VIII之胺基酸745與746之間或插入B域缺失之因子VIII之相應插入位點。
在一些實施例中，本發明之嵌合蛋白包含兩個多肽序列，第一多肽序列包含與選自FVIII-161(SEQ ID NO：101)、FVIII-169(SEQ ID NO：103)、FVIII-170(SEQ ID NO：102)、FVIII-173(SEQ ID NO：104)、FVIII-195(SEQ ID NO：105)、FVIII-196(SEQ ID NO：106)、FVIII199(SEQ ID NO：107)、FVIII-201(SEQ ID NO：108)、FVIII-203(SEQ ID NO：109)、FVIII-204(SEQ ID NO：110)、FVIII-205(SEQ ID NO：111)、FVIII-266(SEQ ID NO：112)、FVIII-267(SEQ ID NO：113)、FVIII-268(SEQ ID NO：114)、FVIII-269(SEQ ID NO：115)、FVIII-271(SEQ ID NO：116)或FVIII-272(SEQ ID NO：117)之序列至少約80%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列，且第二多肽序列包含與選自VWF031(SEQ ID NO：118)、VWF034(SEQ ID NO：119)或VWF-036(SEQ ID NO：120)之序列至少約80%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列。
D)Ig恆定區或其部分
本發明中連接於XTEN序列之VWF片段或FVIII蛋白質可進一步包含Ig恆定區或其部分。Ig恆定區或其部分可改良與XTEN序列組合之VWF片段或FVIII蛋白質之藥物動力學或藥效學性質。在某些實施例中，Ig恆定區或其部分延長融合於Ig恆定區或其部分之分子的半衰期。
Ig恆定區包含表示為CH(恆定重)域(CH1、 CH2等)之域。視同型(亦即IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)而定，恆定區可包含三個或四個CH域。一些同型(例如IgG)恆定區亦含有鉸鏈區。參見Janeway等人2001,Immunobiology,Garland Publishing,N.Y.,N.Y。
用於產生本發明之嵌合蛋白之Ig恆定區或其部分可自許多不同來源獲得。在一些實施例中，Ig恆定區或其部分源於人類Ig。然而，應瞭解Ig恆定區或其部分可源於另一哺乳動物物種之Ig，物種包括例如齧齒動物(例如小鼠、大鼠、兔、天竺鼠(guinea pig))或非人類靈長類動物(例如黑猩猩、獼猴)物種。此外，Ig恆定區或其部分可源於任何Ig類別(包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE)及任何Ig同型(包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)。在一個實施例中，使用人類同型IgG1。
多種Ig恆定區基因序列(例如人類恆定區基因序列)可以公開可得之寄存物形式獲得。可選擇具有特定效應功能(或缺乏特定效應功能)或具有用以降低免疫原性之特定修飾之恆定區域序列。許多抗體及抗體編碼基因序列已經公開且可使用業內公認之技術自此等序列獲得適合Ig恆定區序列(例如鉸鏈、CH2及/或CH3序列或其部分)。使用任何上述方法獲得之遺傳物質可接著加以改變或合成以獲得本發明之多肽。應進一步瞭解本發明之範疇涵蓋恆定區DNA序列之對偶基因、變異體及突變。
Ig恆定區或其部分之序列可例如使用選用於擴增相關域之聚合酶鏈反應及引子來選殖。為自抗體選殖Ig 恆定區或其部分之序列，可自融合瘤、脾或淋巴細胞分離mRNA，逆轉錄成DNA，且藉由PCR擴增抗體基因。PCR擴增方法詳述於美國專利第4,683,195號；第4,683,202號；第4,800,159號；第4,965,188號中；及例如「PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications」Innis等人編，Academic Press,San Diego,CA(1990)；Ho等人1989.Gene 77：51；Horton等人1993.Methods Enzymol.217：270)中。PCR可藉由共同恆定區引子或藉由基於公開之重鏈及輕鏈DNA及胺基酸序列之更特異性引子來啟始。如上所論述，PCR亦可用於分離編碼抗體輕鏈及重鏈之DNA純系。在此情況下，可藉由共同引子或較大同源性探針(諸如小鼠恆定區探針)來篩檢文庫。適於擴增抗體基因之眾多引子組在此項技術中為已知的(例如基於經純化抗體之N端序列之5’引子(Benhar及Pastan.1994.Protein Engineering 7：1509)；cDNA末端之快速擴增(Ruberti,F.等人1994.J.Immunol.Methods 173：33)；抗體前導序列(Larrick等人1989 Biochem.Biophys.Res.Commun.160：1250)。抗體序列之選殖進一步描述於Newman等人，1995年1月25日申請之美國專利第5,658,570號中，該專利以引用的方式併入本文中。
本文中使用之Ig恆定區可包括所有域及鉸鏈區或其部分。在一個實施例中，Ig恆定區或其部分包含CH2域、CH3域及鉸鏈區，亦即Fc區或FcRn結合搭配物。
如本文所用，術語「Fc區」定義為多肽中對應於天然Ig之Fc區的部分，亦即如藉由其兩個重鏈之各別Fc域之二聚締合所形成。天然Fc區與另一Fc區形成均二聚體。相反，如本文所用之術語「遺傳融合Fc區」或「單鏈Fc區」(scFc區)係指合成二聚Fc區，其包含在單一多肽鏈內遺傳連接之Fc域(亦即在單一連續遺傳序列中編碼)。
在一個實施例中，「Fc區」係指單一Ig重鏈之一部分，其在恰好在木瓜蛋白酶(papain)裂解位點(亦即IgG中之殘基216，將重鏈恆定區之第一殘基看作114)上游之鉸鏈區中開始且在抗體之C末端結束。因此，完整Fc域至少包含鉸鏈域、CH2域及CH3域。
視Ig同型而定，Ig恆定區之Fc區可包括CH2、CH3及CH4域以及鉸鏈區。包含Ig之Fc區之嵌合蛋白對嵌合蛋白賦予若干合乎需要之性質，包括增強之穩定性、增加之血清半衰期(參見Capon等人，1989,Nature 337：525)以及結合Fc受體，諸如新生兒Fc受體(FcRn)(美國專利第6,086,875號、第6,485,726號、第6,030,613號；WO 03/077834；US2003-0235536A1)，該等文獻及專利以全文引用的方式併入本文中。
Ig恆定區或其部分可為FcRn結合搭配物。FcRn在成人上皮組織中具有活性且表現在腸腔、肺氣道、鼻表面、陰道表面、結腸及直腸表面中(美國專利第6,485,726號)。FcRn結合搭配物為Ig中結合FcRn之部 分。
已自包括人類在內之若干哺乳動物物種分離 出FcRn受體。已知人類FcRn、猴FcRn、大鼠FcRn及小鼠FcRn之序列(Story等人1994,J.Exp.Med.180：2377)。FcRn受體在相對較低之pH值下結合IgG(但不結合其他Ig類別，諸如IgA、IgM、IgD及IgE)，以內腔至漿膜方向跨細胞主動轉運IgG，且接著在間隙液中存在之相對較高pH值下釋放IgG。其表現在成人上皮組織(美國專利第6,485,726號、第6,030,613號、第6,086,875號；WO 03/077834；US2003-0235536A1)，包括肺及腸上皮(Israel等人1997,Immunology 92：69)、腎近端小管上皮(Kobayashi等人2002,Am.J.Physiol.Renal Physiol.282：F358)以及鼻上皮；陰道表面；及膽系表面中。
適用於本發明中之FcRn結合搭配物涵蓋可由FcRn受體特異性結合之分子，包括完整IgG、IgG之Fc片段、及包括FcRn受體之完整結合區之其他片段。已基於X射線結晶學描述了IgG之Fc部分中結合FcRn受體的區域(Burmeister等人1994,Nature 372：379)。Fc與FcRn之主要接觸區域接近CH2域與CH3域之接合點。Fc-FcRn接觸皆在單一Ig重鏈內。FcRn結合搭配物包括完整IgG、IgG之Fc片段及IgG中包括FcRn之完整結合區域的其他片段。主要接觸位點包括CH2域之胺基酸殘基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311及314以及CH3域之胺基酸殘基385-387、428及433-436。 對Ig或Ig片段之胺基酸編號的提及皆基於Kabat等人1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Public Health,Bethesda,Md。
結合於FcRn之Fc區或FcRn結合搭配物可藉由FcRn有效地跨越上皮障壁穿梭，由此提供一種全身性投與所要治療分子之非侵襲性手段。另外，包含Fc區或FcRn結合搭配物之融合蛋白由表現FcRn之細胞胞飲。但並未顯著降解，而使此等融合蛋白再次再循環至循環中，由此增加此等蛋白質之活體內半衰期。在某些實施例中，Ig恆定區之部分為Fc區或FcRn結合搭配物，其通常經由二硫鍵及其他非特異性相互作用與另一Fc區或另一FcRn結合搭配物締合以形成二聚體及更高級多聚體。
兩個FcRn受體可結合單一Fc分子。結晶學資料表明各FcRn分子結合Fc均二聚體之單一多肽。在一個實施例中，將FcRn結合搭配物(例如IgG之Fc片段)連接於生物活性分子會提供一種經口、經頰、舌下、經直腸、經陰道、以經鼻或經由肺途徑投與之氣霧劑形式、或經由眼途徑傳遞該生物活性分子之手段。在另一實施例中，可侵襲性地投與嵌合蛋白，例如皮下、靜脈內。
FcRn結合搭配物區為可由FcRn受體特異性結合，隨後由FcRn受體主動轉運Fc區之分子或其部分。特異性結合係指兩個分子在生理條件下形成相對穩定之複合物。特異性結合之特徵在於親和力高且能力較低至中等，如與通常親和力低且能力中等至較高之非特異性結合相區 分。通常，當親和力常數KA高於106M-1或高於108M-1時，結合被視為特異性結合。必要時，可藉由改變結合條件來減少非特異性結合而不實質上影響特異性結合。諸如分子濃度、溶液之離子強度、溫度、允許結合時間、阻斷劑(例如血清白蛋白、乳酪蛋白)濃度等之適當結合條件可由熟練技術人員使用常規技術進行最佳化。
在某些實施例中，本發明之嵌合蛋白包含一或多個截短型Fc區，儘管如此，該等Fc區仍然足以對Fc區賦予Fc受體(FcR)結合性質。舉例而言，Fc區中結合FcRn之部分(亦即FcRn結合部分)包含IgG1之約胺基酸282-438(EU編號)，(其中主要接觸位點為CH2域之胺基酸248、250-257、272、285、288、290-291、308-311及314以及CH3域之胺基酸殘基385-387、428及433-436。因此，本發明之Fc區可包含FcRn結合部分或由FcRn結合部分組成。FcRn結合部分可源於包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4在內之任何同型之重鏈。在一個實施例中，使用來自人類同型IgG1之抗體之FcRn結合部分。在另一實施例中，使用來自人類同型IgG4之抗體之FcRn結合部分。
在另一實施例中，「Fc區」包括Fc域或源於Fc域之胺基酸序列。在某些實施例中，Fc區包含以下至少一者：鉸鏈(例如上、中及/或下鉸鏈區)域(抗體Fc區之約胺基酸216-230，根據EU編號)、CH2域(抗體Fc區之約胺基酸231-340，根據EU編號)、CH3域(抗體Fc區之 約胺基酸341-438，根據EU編號)、CH4域、或其變異體、部分或片段。在其他實施例中，Fc區包含完整Fc域(亦即鉸鏈域、CH2域及CH3域)。在一些實施例中，Fc區包含以下、基本上由以下組成、或由以下組成：融合於CH3域(或其部分)之鉸鏈域(或其部分)、融合於CH2域(或其部分)之鉸鏈域(或其部分)、融合於CH3域(或其部分)之CH2域(或其部分)、融合於鉸鏈域(或其部分)與CH3域(或其部分)兩者之CH2域(或其部分)。在其他實施例中，Fc區缺乏CH2域之至少一部分(例如CH2域之全部或一部分)。在一特定實施例中，Fc區包含以下或由以下組成：對應於EU編號221至447之胺基酸。
在本文中表示為F、F1或F2之Fc區可自許多不同來源獲得。在一個實施例中，多肽之Fc區源於人類Ig。然而，應瞭解Fc區可源於另一哺乳動物物種之Ig，物種包括例如齧齒動物(例如小鼠、大鼠、兔或天竺鼠)或非人類靈長類動物(例如黑猩猩、獼猴)物種。此外，Fc域或其部分之多肽可源於任何Ig類別(包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE)及任何Ig同型(包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)。在另一實施例中，使用人類同型IgG1。
在某些實施例中，Fc變異體賦予由包含該野生型Fc域之Fc區所賦予之至少一種效應功能的變化(例如Fc區結合Fc受體(例如FcγRI、FcγRII或FcγRIII)或補體蛋白質(例如C1q)、或觸發抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、吞噬作用或補體依賴性細胞毒性(CDCC)之能力 提高或降低)。在其他實施例中，Fc變異體提供工程改造之半胱胺酸殘基。
本發明之Fc區可採用業內公認之已知會賦予效應功能及/或FcR或FcRn結合之變化(例如增強或降低)之Fc變異體。詳言之，本發明之結合分子可包括例如在以下中揭露之一或多個胺基酸位置處之變化(例如取代)：國際PCT公開案WO88/07089A1、WO96/14339A1、WO98/05787A1、WO98/23289A1、WO99/51642A1、WO99/58572A1、WO00/09560A2、WO00/32767A1、WO00/42072A2、WO02/44215A2、WO02/060919A2、WO03/074569A2、WO04/016750A2、WO04/029207A2、WO04/035752A2、WO04/063351A2、WO04/074455A2、WO04/099249A2、WO05/040217A2、WO04/044859、WO05/070963A1、WO05/077981A2、WO05/092925A2、WO05/123780A2、WO06/019447A1、WO06/047350A2及WO06/085967A2；美國專利公開案第US2007/0231329號、第US2007/0231329號、第US2007/0237765號、第US2007/0237766號、第US2007/0237767號、第US2007/0243188號、第US20070248603號、第US20070286859號、第US20080057056號；或美國專利5,648,260；5,739,277；5,834,250；5,869,046；6,096,871；6,121,022；6,194,551；6,242,195；6,277,375；6,528,624；6,538,124；6,737,056；6,821,505；6,998,253；7,083,784；7,404,956及 7,317,091，該等專利各自以引用的方式併入本文中。在一個實施例中，可在一或多個所揭露之胺基酸位置處進行特定變化(例如此項技術中所揭露之一或多個胺基酸的特定取代)。在另一實施例中，可在一或多個所揭露之胺基酸位置處進行不同變化(例如此項技術中所揭露之一或多個胺基酸位置的不同取代)。
IgG之Fc區或FcRn結合搭配物可根據充分認可之程序(諸如定點突變誘發及其類似程序)加以修飾以產生將由FcRn結合之經修飾IgG或其Fc片段或部分。此等修飾包括保持或甚至增強與FcRn之結合的遠離FcRn接觸位點之修飾以及在接觸位點內之修飾。舉例而言，可取代人類IgG1 Fc(Fc γ1)中之以下單一胺基酸殘基而不顯著降低Fc對FcRn之結合親和力：P238A、S239A、K246A、K248A、D249A、M252A、T256A、E258A、T260A、D265A、S267A、H268A、E269A、D270A、E272A、L274A、N276A、Y278A、D280A、V282A、E283A、H285A、N286A、T289A、K290A、R292A、E293A、E294A、Q295A、Y296F、N297A、S298A、Y300F、R301A、V303A、V305A、T307A、L309A、Q311A、D312A、N315A、K317A、E318A、K320A、K322A、S324A、K326A、A327Q、P329A、A330Q、P331A、E333A、K334A、T335A、S337A、K338A、K340A、Q342A、R344A、E345A、Q347A、R355A、E356A、M358A、T359A、K360A、N361A、Q362A、 Y373A、S375A、D376A、A378Q、E380A、E382A、S383A、N384A、Q386A、E388A、N389A、N390A、Y391F、K392A、L398A、S400A、D401A、D413A、K414A、R416A、Q418A、Q419A、N421A、V422A、S424A、E430A、N434A、T437A、Q438A、K439A、S440A、S444A及K447A，其中例如P238A表示在位置編號238處野生型脯胺酸經丙胺酸取代。舉例而言，一特定實施例併有N297A突變，從而移除高度保守之N-糖基化位點。除丙胺酸之外，其他胺基酸亦可取代以上指定位置處之野生型胺基酸。突變可逐一引入Fc中，從而產生一百個以上不同於天然Fc之Fc區。另外，兩個、三個或三個以上此等個別突變之組合可一起引入，從而產生數百個以上Fc區。此外，可使本發明構築體之一個Fc區突變且該構築體之另一Fc區完全不突變，或其兩者均可突變，但突變不同。
某些以上突變可對Fc區或FcRn結合搭配物賦予新功能性。舉例而言，一個實施例併有N297A，從而移除高度保守之N-糖基化位點。此突變之作用在於降低免疫原性，藉此增強Fc區之循環半衰期，及在不損害對FcRn之親和力下致使Fc區不能結合FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB及FcγRIIIA(Routledge等人1995,Transplantation 60：847；Friend等人1999,Transplantation 68：1632；Shields等人1995,J.Biol.Chem.276：6591)。作為由於上述突變而產生之新功能性之 另一實例，對FcRn之親和力在一些情況下可增加超過野生型對FcRn之親和力。此親和力增加可反映「締合」速率增加、「解離」速率降低、或「締合」速率增加與「解離」速率降低兩者。咸信會使對FcRn之親和力增加之突變的實例包括(但不限於)T256A、T307A、E380A及N434A(Shields等人2001,J.Biol.Chem.276：6591)。
另外，至少三種人類Fcγ受體似乎識別IgG上在下鉸鏈區內之結合位點，通常為胺基酸234-237。因此，新功能性及潛在的降低之免疫原性之另一實例可由於此區域之突變而產生，如例如藉由將人類IgG1之胺基酸233-236「ELLG」置換成來自IgG2之相應序列「PVA」(其中有一個胺基酸缺失)。已顯示當已引入此等突變時，介導各種效應功能之FcγRI、FcγRII及FcγRIII將不結合IgG1。Ward及Ghetie 1995,Therapeutic Immunology 2：77及Armour等人1999,Eur.J.Immunol.29：2613。
在一個實施例中，Ig恆定區或其部分(例如Fc區)為包括序列PKNSSMISNTP(SEQ ID NO：52)且視情況進一步包括選自HQSLGTQ(SEQ ID NO：53)、HQNLSDGK(SEQ ID NO：54)、HQNISDGK(SEQ ID NO：55)或VISSHLGQ(SEQ ID NO：56)之序列的多肽(美國專利第5,739,277號)。
在另一實施例中，免疫球蛋白恆定區或其部分包含鉸鏈區或其部分中與另一免疫球蛋白恆定區或其部分形成一或多個二硫鍵的胺基酸序列。由免疫球蛋白恆定 區或其部分形成之二硫鍵使包含FVIII之第一多肽及包含VWF片段之第二多肽處於一起以使內源性VWF不置換VWF片段且不結合FVIII。因此，第一免疫球蛋白恆定區或其部分與第二免疫球蛋白恆定區或其部分之間的二硫鍵會阻止內源性VWF與FVIII蛋白質之間的相互作用。對VWF與FVIII蛋白質之間的相互作用之此抑制允許FVIII蛋白質之半衰期超過兩倍限制。鉸鏈區或其部分可進一步連接於CH1、CH2、CH3中之一或多個域、其片段及其任何組合。在一特定實施例中，免疫球蛋白恆定區或其部分為鉸鏈區及CH2。
在某些實施例中，Ig恆定區或其部分經半糖基化。舉例而言，包含兩個Fc區或FcRn結合搭配物之嵌合蛋白可含有第一糖基化Fc區(例如糖基化CH2區)或FcRn結合搭配物及第二無糖基化Fc區(例如無糖基化CH2區)或FcRn結合搭配物。在一個實施例中，連接子可插入在糖基化Fc區與無糖基化Fc區之間。在另一實施例中，Fc區或FcRn結合搭配物經完全糖基化，亦即所有Fc區皆經糖基化。在其他實施例中，Fc區可為無糖基化的，亦即無Fc部分經糖基化。
在某些實施例中，本發明之嵌合蛋白包含對Ig恆定區或其部分之胺基酸取代(例如Fc變異體)，其改變Ig恆定區之抗原非依賴性效應功能，特定言之改變蛋白質之循環半衰期。
當與缺乏此等取代之蛋白質比較時，此等蛋 白質展現與FcRn之結合增加或降低，且因此在血清中之半衰期分別增加或降低。預期對FcRn之親和力提高之Fc變異體會具有較長血清半衰期，且此等分子適合應用於治療哺乳動物之方法(其中需要投與之多肽之半衰期較長例如以治療慢性疾病或病症)中(參見例如美國專利7,348,004、7,404,956及7,862,820)。相反，預期FcRn結合親和力降低之Fc變異體會具有較短半衰期，且在縮短循環時間可為有利的情況下，例如適用於活體內診斷成像或在起始多肽當持續延長時期存在於循環中時具有毒性副作用之情形下，此等分子亦例如適用於向哺乳動物投與。FcRn結合親和力降低之Fc變異體亦較不太可能穿過胎盤，且因此亦適用於治療懷孕婦女之疾病或病症。此外，可能需要FcRn結合親和力降低之其他應用包括需要定位於腦、腎及/或肝之彼等應用。在一個示範性實施例中，本發明之嵌合蛋白展現自血管結構穿過腎小球之上皮之轉運降低。在另一實施例中，本發明之嵌合蛋白展現自腦穿過血腦障壁(BBB)進入血管間隙中之轉運降低。在一個實施例中，FcRn結合改變之蛋白質包含至少一個在Ig恆定區之「FcRn結合環」內具有一或多個胺基酸取代之Fc區或FcRn結合搭配物(例如一或兩個Fc區或FcRn結合搭配物)。FcRn結合環包含野生型全長Fc區之胺基酸殘基280-299(根據EU編號)。在其他實施例中，本發明嵌合蛋白中FcRn結合親和力改變的Ig恆定區或其部分包含至少一個在15 FcRn「接觸區」內具有一或多個胺基酸取代 之Fc區或FcRn結合搭配物。如本文所用，術語15 FcRn「接觸區」包括野生型全長Fc部分之以下位置處之殘基：243-261、275-280、282-293、302-319、336-348、367、369、372-389、391、393、408、424、425-440(EU編號)。在其他實施例中，本發明之FcRn結合親和力改變之Ig恆定區或其部分包含至少一個在對應於任一以下EU位置之胺基酸位置處具有一或多個胺基酸取代之Fc區或FcRn結合搭配物：256、277-281、283-288、303-309、313、338、342、376、381、384、385、387、434(例如N434A或N434K)及438。改變FcRn結合活性之示範性胺基酸取代揭露於國際PCT公開案第WO05/047327號中，該公開案以引用的方式併入本文中。
本發明中使用之Fc區或FcRn結合搭配物亦可包含業內公認之改變嵌合蛋白之糖基化之胺基酸取代。舉例而言，嵌合蛋白中連接於VWF片段或FVIII蛋白質之Fc區或FcRn結合搭配物可包含具有導致糖基化(例如N-連接型或O-連接型糖基化)減少之突變之Fc區，或可包含野生型Fc部分之改變的糖型(例如低海藻糖(fucose)或無海藻糖聚醣)。
在一個實施例中，本發明之未加工嵌合蛋白可包含遺傳融合之Fc區(亦即scFc區)，該Fc區具有獨立地選自本文所述之Ig恆定區或其部分之兩個或兩個以上其組成性Ig恆定區或其部分。在一個實施例中，二聚Fc區之Fc區為相同的。在另一實施例中，至少兩個Fc區為 不同的。舉例而言，本發明蛋白質之Fc區或FcRn結合搭配物包含相同數目之胺基酸殘基，或其可在長度方面相差一或多個胺基酸殘基(例如約5個胺基酸殘基(例如1、2、3、4或5個胺基酸殘基)、約10個殘基、約15個殘基、約20個殘基、約30個殘基、約40個殘基或約50個殘基)。在其他實施例中，本發明蛋白質之Fc區或FcRn結合搭配物可在序列方面在一或多個胺基酸位置上不同。舉例而言，至少兩個Fc區或FcRn結合搭配物可在約5個胺基酸位置(例如1、2、3、4或5個胺基酸位置)、約10個位置、約15個位置、約20個位置、約30個位置、約40個位置、或約50個位置上不同)。
E)連接子
本發明之嵌合蛋白進一步包含一或多個連接子。一種類型之連接子為可裂解連接子，其在活體內向個體投與，例如在凝血部位處投與時可由各種蛋白酶裂解。在一個實施例中，可裂解連接子允許在凝血級聯部位處自嵌合蛋白裂解部分(例如VWF片段)，由此使活化型FVIII(FVIIIa)具有其FVIIIa活性。另一類型之連接子為可加工連接子，其含有細胞內裂解位點且因此可由宿主細胞中之細胞內加工酶裂解，從而允許便利地表現多肽及形成嵌合蛋白。
一或多個連接子可存在於嵌合蛋白中之任何兩個蛋白質之間。在一個實施例中，嵌合蛋白包含(i)VWF 片段，(ii)XTEN序列，及(iii)FVIII蛋白質，其中該VWF片段藉由連接子(例如可裂解連接子)連接於該XTEN序列，且該XTEN序列進一步連接於該FVIII蛋白質(亦即V-L-X-FVIII)。在另一實施例中，嵌合蛋白包含(i)VWF片段，(ii)XTEN序列，及(iii)FVIII蛋白質，其中該VWF片段連接於該XTEN序列，且該XTEN序列藉由連接子(例如可裂解連接子)連接於該FVIII蛋白質(亦即V-X-L-FVIII)。
在某些實施例中，嵌合蛋白包含(i)VWF片段，(ii)XTEN序列，(iii)第一Ig恆定區或其部分(例如第一Fc區)，(iv)FVIII蛋白質，及(v)第二Ig恆定區或其部分(例如第二Fc區)，其中該VWF片段藉由視情況選用之連接子(例如可裂解連接子)連接於該XTEN序列。XTEN序列可藉由連接子(例如可裂解連接子)進一步連接於第一Ig恆定區或其部分。FVIII蛋白質(有或無XTEN序列)亦可藉由視情況選用之連接子(例如可裂解連接子)連接於第二Ig恆定區或其部分。在某些實施例中，嵌合蛋白進一步在第一Ig恆定區或其部分(例如第一Fc區)與第二Ig恆定區或其部分(例如第二Fc區)之間、在VWF片段與第二Ig恆定區或其部分之間、或在FVIII蛋白質與第一Ig恆定區或其部分(例如第一Fc區)之間包含一或多個連接子，例如可加工連接子。
在一些實施例中，本發明包括一種嵌合蛋白，其包含(i)FVIII蛋白質，(ii)XTEN序列，(iii)第一Ig 恆定區或其部分，及(iv)第二Ig恆定區或其部分，其中該第一Ig恆定區或其部分與該第二Ig恆定區或其部分係藉由可加工連接子加以連接。
適用於本發明中之連接子可包含任何有機分子。在一個實施例中，連接子包含聚合物，例如聚乙二醇(PEG)或羥乙基澱粉(HES)。在另一實施例中，連接子包含胺基酸序列。連接子可包含至少約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000個胺基酸。連接子可包含1-5個胺基酸、1-10個胺基酸、1-20個胺基酸、10-50個胺基酸、50-100個胺基酸、100-200個胺基酸、200-300個胺基酸、300-400個胺基酸、400-500個胺基酸、500-600個胺基酸、600-700個胺基酸、700-800個胺基酸、800-900個胺基酸、或900-1000個胺基酸。在一個實施例中，連接子包含XTEN序列。可根據本發明使用之XTEN之其他實例揭露於美國專利公開案第2010/0239554 A1號、第2010/0323956 A1號、第2011/0046060 A1號、第2011/0046061 A1號、第2011/0077199 A1號或第2011/0172146 A1號、或國際專利公開案第WO 2010091122 A1號、第WO 2010144502 A2號、第WO 2010144508 A1號、第WO 2011028228 A1號、第WO 2011028229 A1號或第WO 2011028344 A2號中。在另一實施例中，連接子為PAS序列。
適用於本發明中之連接子可包含任何有機分子。在一個實施例中，連接子為聚合物，例如聚乙二醇(PEG)或羥乙基澱粉(HES)。在另一實施例中，連接子為胺基酸序列。連接子可包含至少約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000個胺基酸。連接子可包含1-5個胺基酸、1-10個胺基酸、1-20個胺基酸、10-50個胺基酸、50-100個胺基酸、100-200個胺基酸、200-300個胺基酸、300-400個胺基酸、400-500個胺基酸、500-600個胺基酸、600-700個胺基酸、700-800個胺基酸、800-900個胺基酸、或900-1000個胺基酸。
連接子之實例在此項技術中為熟知的。在一個實施例中，連接子包含序列Gn。連接子可包含序列(GA)n。連接子可包含序列(GGS)n。在其他實施例中，連接子包含(GGGS)n(SEQ ID NO：57)。在其他實施例中，連接子包含序列(GGS)n(GGGGS)n(SEQ ID NO：58)。在此等情況下，n可為整數1-100。在其他情況下，n可為整數1-20，亦即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。連接子之實例包括(但不限於)GGG(SEQ ID NO：？？)、SGGSGGS(SEQ ID NO：59)、GGSGGSGGSGGSGGG(SEQ ID NO：60),GGSGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：61)、GGSGGSGGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO：62)或 GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：63)。連接子不消除或削弱VWF片段活性或因子VIII之凝結活性。視情況，連接子會增強VWF片段活性或因子VIII蛋白質之凝結活性，例如藉由進一步削弱空間位阻作用且使VWF片段或因子VIII部分更易接近其目標結合位點。
在一個實施例中，適用於嵌合蛋白之連接子之長度為15-25個胺基酸。在另一實施例中，適用於嵌合蛋白之連接子之長度為15-20個胺基酸。在一些實施例中，用於嵌合蛋白之連接子之長度為10-25個胺基酸。在其他實施例中，用於嵌合蛋白之連接子之長度為15個胺基酸。在其他實施例中，用於嵌合蛋白之連接子為(GGGGS)n(SEQ ID NO：64)，其中G表示甘胺酸，S表示絲胺酸且n為整數1-20。
F)裂解位點
連接子亦可併有能夠以化學方式(例如水解酯鍵)、以酶促方式(亦即併有蛋白酶裂解序列)或以光解方式(例如發色團，諸如3-胺基-3-(2-硝基苯基)丙酸(ANP))裂解之部分以使一個分子自另一分子釋放。
在一個實施例中，連接子為可裂解連接子。可裂解連接子可在N末端或C末端或兩者處包含一或多個裂解位點。在另一實施例中，可裂解連接子基本上由以下組成或由以下組成：一或多個可裂解位點。在其他實施例中，可裂解連接子包含本文所述之異源胺基酸連接子序 列或聚合物及一或多個可裂解位點。
在某些實施例中，可裂解連接子包含一或多個可在宿主細胞中裂解之裂解位點(亦即細胞內加工位點)。裂解位點之非限制性實例包括RRRR(SEQ ID NO：9)、RKRRKR(SEQ ID NO：10)及RRRRS(SEQ ID NO：11)。
在其他實施例中，可裂解連接子包含一或多個裂解位點，該等位點在向個體投與包含該可裂解連接子之嵌合蛋白之後由蛋白酶裂解。在一個實施例中，裂解位點由選自由以下組成之群之蛋白酶裂解：因子XIa、因子XIIa、胰舒血管素、因子VIIa、因子IXa、因子Xa、因子IIa(凝血酶)、彈性蛋白酶-2、MMP-12、MMP-13、MMP-17及MMP-20。在另一實施例中，裂解位點係選自由以下組成之群：FXIa裂解位點(例如KLTR↓AET(SEQ ID NO：65))、FXIa裂解位點(例如DFTR↓VVG(SEQ ID NO：66))、FXIIa裂解位點(例如TMTR↓IVGG(SEQ ID NO：67))、胰舒血管素裂解位點(例如SPFR↓STGG(SEQ ID NO：68))、FVIIa裂解位點(例如LQVR↓IVGG(SEQ ID NO：69))、FIXa裂解位點(例如PLGR↓IVGG(SEQ ID NO：70))、FXa裂解位點(例如IEGR↓TVGG(SEQ ID NO：71))、FIIa(凝血酶)裂解位點(例如LTPR↓SLLV(SEQ ID NO：72))、彈性蛋白酶-2裂解位點(例如LGPV↓SGVP(SEQ ID NO：73))、粒酶-B裂解(例如VAGD↓SLEE(SEQ ID NO：74))、MMP-12裂解位點(例如GPAG↓LGGA(SEQ ID NO：75))、MMP-13 裂解位點(例如GPAG↓LRGA(SEQ ID NO：76))、MMP-17裂解位點(例如APLG↓LRLR(SEQ ID NO：77))、MMP-20裂解位點(例如PALP↓LVAQ(SEQ ID NO：78))、TEV裂解位點(例如ENLYFQ↓G(SEQ ID NO：79))、腸激酶裂解位點(例如DDDK↓IVGG(SEQ ID NO：80))、蛋白酶3C(PRESCISSIONTM)裂解位點(例如LEVLFQ↓GP(SEQ ID NO：81))及分選酶A裂解位點(例如LPKT↓GSES)(SEQ ID NO：82)。在某些實施例中，FXIa裂解位點包括(但不限於)例如TQSFNDFTR(SEQ ID NO：83)及SVSQTSKLTR(SEQ ID NO：84)。非限制性示範性凝血酶裂解位點包括例如DFLAEGGGVR(SEQ ID NO：85)、TTKIKPR(SEQ ID NO：86)或LVPRG(SEQ ID NO：87)，及包含以下、基本上由以下組成或由以下組成之序列：ALRPR(SEQ ID NO：17)(例如ALRPRVVGGA(SEQ ID NO：88))。
在一特定實施例中，裂解位點為TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK(SEQ ID NO：8)。
聚核苷酸、載體及宿主細胞
本發明中亦提供一種聚核苷酸，其編碼本文所述之(a)連接於XTEN序列及FVIII蛋白質之VWF片段，(b)連接於XTEN序列及Fc之FVIII蛋白質，或(c)連接於XTEN序列及VWF片段之FVIII蛋白質。當嵌合蛋白為單一多肽鏈(例如F2-L2-X-V-L1-F1-FVIII，其中FVIII包含 FVIII蛋白質，F1包含第一Ig恆定區或其部分(例如第一Fc區)，L1包含第一連接子，V包含VWF片段，X包含XTEN序列，L2包含第二連接子，且F2包含第二Ig恆定區或其部分(例如第二Fc區))時，本發明係有關一種編碼該單一多肽鏈之單一聚核苷酸鏈。當嵌合蛋白包含第一及第二多肽鏈(F2-L2-X-V：FVIII-F1)，該第一多肽鏈包含連接於藉由可裂解連接子進一步連接於第一Ig恆定區或其部分(例如第一Fc區)之XTEN序列之VWF片段(例如F2-L2-X-V)，且該第二多肽鏈包含FVIII蛋白質及第二Ig恆定區或其部分(例如第二Fc區)(例如FVIII-F1)，其中該第一多肽鏈與該第二多肽鏈彼此締合時，聚核苷酸可包含第一核苷酸序列及第二核苷酸序列。在一個實施例中，第一多肽鏈及第二多肽鏈可由單一聚核苷酸鏈編碼。在另一實施例中，第一多肽鏈及第二多肽鏈由兩個不同聚核苷酸，亦即第一核苷酸序列及第二核苷酸序列編碼。在另一實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列在兩個不同聚核苷酸(例如不同載體)上。在某些實施例中，本發明係有關一組包含第一核苷酸鏈及第二核苷酸鏈之聚核苷酸，其中該第一核苷酸鏈編碼嵌合蛋白之VWF片段且該第二核苷酸鏈編碼FVIII蛋白質。在一些實施例中，包含兩條多肽鏈或三條多肽鏈之嵌合蛋白可由單一聚核苷酸鏈編碼，且接著加工成兩條或三條(或三條以上)多肽鏈。在其他實施例中，包含此等多肽鏈之嵌合蛋白可由兩條或三條聚核苷酸鏈編碼。
在其他實施例中，該組聚核苷酸進一步包含編碼蛋白質轉化酶之另一核苷酸鏈(例如當嵌合多肽由單一聚核苷酸鏈編碼時之第二核苷酸鏈或當嵌合蛋白由兩個聚核苷酸鏈編碼時之第三核苷酸鏈)。蛋白質轉化酶可選自由以下組成之群：前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 5型(PCSK5或PC5)、前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 7型(PCSK7或PC5)、酵母Kex 2、前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 3型(PACE或PCSK3)及其兩種或兩種以上組合。在一些實施例中，蛋白質轉化酶為PACE、PC5或PC7。在一特定實施例中，蛋白質轉化酶為PC5或PC7。參見國際申請案第PCT/US2011/043568號。
如本文所用，表現載體係指含有在引入適當宿主細胞中時，為所插入編碼序列之轉錄及轉譯所必需之元件，或在RNA病毒載體之情況下，為複製及轉譯所必需之元件的任何核酸構築體。表現載體可包括質體、噬菌粒、病毒及其衍生物。
本發明之表現載體將包括編碼本文所述之嵌合蛋白之聚核苷酸。在一個實施例中，VWF片段及XTEN、FVIII蛋白質及XTEN、或兩者之編碼序列中之一或多者可操作地連接於表現控制序列。如本文所用，當兩個核酸序列以允許各組成核酸序列保留其功能性之方式共價連接時，其係可操作地連接。當編碼序列及基因表現控制序列以使得編碼序列之表現或轉錄及/或轉譯處於基因表現控制序列之影響或控制下之方式共價連接時，其稱為 可操作地連接。若誘導5'基因表現序列中之啟動子導致編碼序列轉錄且若兩個DNA序列之間的鍵聯之性質不(1)導致引入框移突變，(2)干擾啟動子區域引導編碼序列轉錄之能力，或(3)干擾相應RNA轉錄物被轉譯成蛋白質之能力，則兩個DNA序列稱為可操作地連接。因此，若基因表現序列能夠實現編碼核酸序列之轉錄以使所得轉錄物轉譯成所要蛋白質或多肽，則該基因表現序列將可操作地連接於彼編碼核酸序列。
如本文所用之基因表現控制序列為有助於可操作地連接之編碼核酸之高效轉錄及轉譯的任何調控核苷酸序列，諸如啟動子序列或啟動子-增強子組合。基因表現控制序列可例如為哺乳動物或病毒啟動子，諸如組成性或誘導性啟動子。組成性哺乳動物啟動子包括(但不限於)以下基因之啟動子：次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)、腺苷去胺酶、丙酮酸激酶、β-肌動蛋白啟動子及其他組成性啟動子。在真核細胞中組成性起作用之示範性病毒啟動子包括例如來自巨細胞病毒(CMV)、猿猴病毒(例如SV40)、乳頭狀瘤病毒(papilloma virus)、腺病毒、人類免疫缺陷病毒(HIV)、勞斯肉瘤病毒、巨細胞病毒、莫洛尼白血病病毒(Moloney leukemia virus)之長末端重複序列(LTR)及其他逆轉錄病毒之啟動子、及單純皰疹病毒之胸苷激酶啟動子。其他組成性啟動子為一般技藝人士所知。適用作本發明之基因表現序列之啟動子亦包括誘導性啟動子。誘導性啟動子在誘導劑存在下表現。舉例而言，誘導 金屬硫蛋白啟動子以促進在某些金屬離子存在下之轉錄及轉譯。其他誘導性啟動子為一般技藝人士所知。
一般而言，基因表現控制序列在必要時將包括分別涉及轉錄及轉譯啟始之5'非轉錄及5'非轉譯序列，諸如TATA盒、加帽序列、CAAT序列及其類似序列。特定而言，此等5'非轉錄序列將包括啟動子區，該啟動子區包括用於對可操作地接合之編碼核酸進行轉錄控制之啟動子序列。必要時，基因表現序列視情況包括增強子序列或上游活化序列。
病毒載體包括(但不限於)來自以下病毒之核酸序列：逆轉錄病毒，諸如莫洛尼鼠類白血病病毒、哈維(Harvey)鼠類肉瘤病毒、鼠類乳腺腫瘤病毒及勞斯肉瘤病毒；腺病毒、腺相關病毒；SV40型病毒；多型瘤病毒；艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)；乳頭狀瘤病毒；皰疹病毒；牛痘病毒；小兒麻痺病毒；及RNA病毒，諸如逆轉錄病毒。可容易地採用此項技術中熟知之其他載體。某些病毒載體係基於非必需基因已經相關基因置換之非細胞病變真核病毒。非細胞病變病毒包括逆轉錄病毒，其壽命週期涉及基因組病毒RNA逆轉錄成DNA，隨後前病毒整合至宿主細胞DNA中。逆轉錄病毒已核准用於人類基因療法試驗。最適用的是複製缺陷型(亦即能夠直接合成所要蛋白質，但不能製造感染性粒子)之彼等逆轉錄病毒。此等遺傳學改造之逆轉錄病毒表現載體具有用於在活體內高效轉導基因之一般性效用。用於產生複製缺乏型 逆轉錄病毒之標準方案(包括以下步驟：將外源性遺傳物質併入質體中，用質體對包裝細胞株進行轉染，由包裝細胞株產生重組逆轉錄病毒，自組織培養基收集病毒粒子，及用病毒粒子感染目標細胞)提供於Kriegler,M.,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,W.H.Freeman公司，New York(1990)及Murry,E.J.,Methods in Molecular Biology，第7卷，Humana Press公司，Cliffton,N.J.(1991)中。
在一個實施例中，病毒為腺相關病毒，其為一種雙股DNA病毒。腺相關病毒可經工程改造成複製缺陷型且能夠感染廣泛範圍之細胞類型及物種。其進一步具有以下優勢：諸如熱及脂質溶劑穩定性；在不同譜系之細胞(包括造血細胞)中具有高轉導頻率；及缺乏重複感染抑制，因此允許進行多級轉導。據報導，腺相關病毒可以位點特異性方式整合至人類細胞DNA中，藉此使逆轉錄病毒感染所特有之插入突變誘發可能性及插入基因表現之可變性達到最小。此外，野生型腺相關病毒感染已在不存在選擇壓力下在組織培養物中沿襲100次繼代以上，從而暗示腺相關病毒基因組整合為相對穩定之事件。腺相關病毒亦可以染色體外方式起作用。
其他載體包括質體載體。質體載體已在此項技術中廣泛描述且為熟習此項技術者所熟知。參見例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989。在過 去數年中，已發現質體載體由於不能在宿主基因組內複製及整合至宿主基因組中而特別有利於在活體內將基因傳遞至細胞。然而，具有與宿主細胞相容之啟動子之此等質體可自質體內可操作地編碼之基因表現肽。一些可自商業供應商獲得之常用質體包括pBR322、pUC18、pUC19、各種pcDNA質體、pRC/CMV、各種pCMV質體、pSV40及pBlueScript。特定質體之其他實例包括pcDNA3.1，目錄編號V79020；pcDNA3.1/hygro，目錄編號V87020；pcDNA4/myc-His，目錄編號V86320；及pBudCE4.1，目錄編號V53220，全部來自Invitrogen(Carlsbad,CA.)。其他質體為一般技藝人士所熟知。另外，可使用標準分子生物學技術對質體進行定製設計以移除及/或添加特定DNA片段。
在一種可用於產生本發明蛋白質之昆蟲表現系統中，使用苜蓿銀紋夜蛾核多角體病病毒(Autographa californica nuclear polyhidrosis virus，AcNPV)作為載體來表現外來基因。該病毒生長在草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞中。編碼序列可選殖至病毒之非必需區域(例如多角體基因)中且置於ACNPV啟動子(例如多角體啟動子)之控制下。成功插入編碼序列將導致多角體基因不活化且產生非封閉重組病毒(亦即缺乏由多角體基因編碼之蛋白質衣殼之病毒)。此等重組病毒接著用於感染草地貪夜蛾細胞，在該細胞中表現插入基因。(參見例如Smith等人(1983)J Virol 46：584；美國專利第4,215,051號)。 此表現系統之其他實例可見於Ausubel等人編(1989)Current Protocols in Molecular Biology，第2卷，Greene Publish.Assoc.& Wiley Interscience中。
可用於表現本發明蛋白質之另一系統為麩醯胺酸合成酶基因表現系統，亦稱為「GS表現系統」(Lonza Biologics PLC,Berkshire UK)。此表現系統詳述於美國專利第5,981,216號中。
在哺乳動物宿主細胞中，可利用許多病毒基表現系統。在腺病毒用作表現載體之情況下，編碼序列可連接於腺病毒轉錄/轉譯控制複合物，例如晚期啟動子及三重前導序列。此嵌合基因可接著藉由活體外或活體內重組插入腺病毒基因組中。插入在病毒基因組之非必需區域(例如區域E1或E3)中將產生在受感染宿主中具有活力且能夠表現肽之重組病毒。參見例如Logan及Shenk(1984)Proc Natl Acad Sci USA 81：3655)。或者，可使用牛痘7.5K啟動子。參見例如Mackett等人(1982)Proc Natl Acad Sci USA 79：7415；Mackett等人(1984)J Virol 49：857；Panicali等人(1982)Proc Natl Acad Sci USA 79：4927。
為增加製造效率，聚核苷酸可設計成編碼由酶促裂解位點分開之本發明蛋白質的多個單元。所得多肽可經裂解(例如藉由用適當酶處理)以回收多肽單元。此舉可增加由單一啟動子驅動之多肽之產量。當用於適當病毒表現系統中時，在轉錄物內部引導由mRNA編碼之各多肽之轉譯；例如由內部核糖體進入位點IRES引導。因此， 多順反子構築體引導單一大型多順反子mRNA之轉錄，該mRNA又引導多個個別多肽之轉譯。此方法消除多聚蛋白質之製造及酶促加工且可顯著增加由單一啟動子驅動之多肽之產量。
轉型中使用之載體將通常含有用於鑒別轉型體之可選擇標記。在細菌系統中，此可選擇標記可包括抗生素抗性基因，諸如胺苄青黴素或康黴素。用於培養哺乳動物細胞中之可選擇標記包括賦予對諸如新黴素(neomycin)、潮黴素及甲胺蝶呤(methotrexate)之藥物之抗性的基因。可選擇標記可為可擴增可選擇標記。一種可擴增可選擇標記為二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)基因。Simonsen C C等人(1983)Proc Natl Acad Sci USA 80：2495-9。可選擇標記由Thilly(1986)Mammalian Cell Technology,Butterworth Publishers,Stoneham,Mass.評述，且對可選擇標記之選擇完全在此項技術中之一般技能範圍內。
可選擇標記可與相關基因同時於各別質體上引入細胞中，或其可於同一質體上引入。若位於同一質體上，則可選擇標記及相關基因可處於不同啟動子或相同啟動子控制下，後述排列會產生雙順反子訊息。此類型之構築體在此項技術中為已知的(例如美國專利第4,713,339號)。
表現載體可編碼允許容易地純化重組產生之蛋白質之標籤。實例包括(但不限於)載體pUR278(Ruther 等人(1983)EMBO J 2：1791)，其中欲表現之蛋白質之編碼序列可與lac z編碼區同框連接至載體中以使得產生所標記融合蛋白；pGEX載體可用於表現具有麩胱甘肽(glutathione)S轉移酶(GST)標籤之本發明蛋白質。此等蛋白質通常為可溶性的且可易於藉由吸附於麩胱甘肽-瓊脂糖珠粒，隨後在游離麩胱甘肽存在下溶離來自細胞純化。載體包括裂解位點(凝血酶或因子Xa蛋白酶或PRESCISSION PROTEASETM(Pharmacia,Peapack,N.J.))以便在純化之後容易地移除標籤。
一或多個表現載體接著轉染或共轉染至將表現多肽之適合目標細胞中。此項技術中已知之轉染技術包括(但不限於)磷酸鈣沈澱(Wigler等人(1978)Cell 14：725)、電穿孔(Neumann等人(1982)EMBO J 1：841)及脂質體基試劑。多種宿主表現載體系統可用於表現本文所述之蛋白質，該等系統包括原核細胞與真核細胞兩者。此等系統包括(但不限於)微生物，諸如經含有適當編碼序列之重組噬菌體DNA或質體DNA表現載體轉型之細菌(例如大腸桿菌)；經含有適當編碼序列之重組酵母或真菌表現載體轉型之酵母或絲狀真菌；經含有適當編碼序列之重組病毒表現載體(例如桿狀病毒)感染之昆蟲細胞系統；經重組病毒表現載體(例如花椰菜花葉病毒(cauliflower mosaic virus)或煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus))感染或經含有適當編碼序列之重組質體表現載體(例如Ti質體)轉型之植物細胞系統；或動物細胞系統，包括哺乳動物細 胞(例如HEK 293、CHO、Cos、HeLa、HKB11及BHK細胞)。
在一個實施例中，宿主細胞為真核細胞。如本文所用，真核細胞係指具有明確細胞核之任何動物或植物細胞。動物之真核細胞包括脊椎動物(例如哺乳動物)之細胞及無脊椎動物(例如昆蟲)之細胞。植物之真核細胞特定言之可包括(但不限於)酵母細胞。真核細胞不同於原核細胞(例如細菌)。
在某些實施例中，真核細胞為哺乳動物細胞。哺乳動物細胞為源於哺乳動物之任何細胞。哺乳動物細胞特定言之包括(但不限於)哺乳動物細胞株。在一個實施例中，哺乳動物細胞為人類細胞。在另一實施例中，哺乳動物細胞為HEK 293細胞，其為人類胚腎細胞株。HEK 293細胞可以CRL-1533自美國菌種中心(American Type Culture Collection,Manassas,VA)及以293-H細胞(目錄編號11631-017)或293-F細胞(目錄編號11625-019)自Invitrogen(Carlsbad,Calif.)獲得。在一些實施例中，哺乳動物細胞為PER.C6®細胞，其為一種源於視網膜之人類細胞株。PER.C6®細胞可自Crucell(Leiden,The Netherlands)獲得。在其他實施例中，哺乳動物細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。CHO細胞可自美國菌種中心(Manassas,VA.)獲得(例如CHO-K1；CCL-61)。在其他實施例中，哺乳動物細胞為幼小倉鼠腎(BHK)細胞。BHK細胞可自美國菌種中心(Manassas,Va.)獲得(例如CRL-1632)。在一些實施例 中，哺乳動物細胞為HKB11細胞，其為HEK293細胞與人類B細胞株之雜交細胞株。Mei等人，Mol.Biotechnol.34(2)：165-78(2006)。
在一個實施例中，將包括FVIII(X)-Fc融合體編碼序列、VWF片段-L-Fc融合體編碼序列或兩者及可選擇標記(例如博萊黴素(zeocin)抗性)之質體轉染至HEK 293細胞中以供產生嵌合蛋白。
在另一實施例中，將包括FVIII-Fc融合體編碼序列、VWF片段-XTEN-L-Fc融合體編碼序列或兩者及可選擇標記(例如博萊黴素抗性)之質體轉染至HEK 293細胞中以供產生嵌合蛋白。
在其他實施例中，將包括FVIII(X)-Fc融合體編碼序列、Fc編碼序列或兩者及可選擇標記(例如博萊黴素抗性)之質體轉染至HEK 293細胞中以供產生嵌合蛋白。
在一些實施例中，將包括FVIII(X)-Fc融合體編碼序列及第一可選擇標記(例如博萊黴素抗性基因)之第一質體、及包括Fc編碼序列或VWF片段-L-Fc編碼序列及第二可選擇標記(例如新黴素(neomycin)抗性基因)之第二質體、及包括蛋白質轉化酶編碼序列及第三可選擇標記(例如潮黴素(hygromycin)抗性基因)之第三質體共轉染至HEK 293細胞中以供產生嵌合蛋白。第一及第二質體可以相等量(亦即1：1莫耳比)引入，或其可以不相等量引入。
在其他實施例中，將包括FVIII-Fc融合體編 碼序列及第一可選擇標記(例如博萊黴素抗性基因)之第一質體、及包括VWF片段-XTEN-L-Fc編碼序列及第二可選擇標記(例如新黴素抗性基因)之第二質體、及包括蛋白質轉化酶編碼序列及第三可選擇標記(例如潮黴素抗性基因)之第三質體共轉染至HEK 293細胞中以供產生嵌合蛋白。第一及第二質體可以相等量(亦即1：1莫耳比)引入，或其可以不相等量引入。
在其他實施例中，將包括FVIII(X)-Fc融合體編碼序列及第一可選擇標記(例如博萊黴素抗性基因)之第一質體、及包括VWF片段-XTEN-L-Fc編碼序列及第二可選擇標記(例如新黴素抗性基因)之第二質體、及包括蛋白質轉化酶編碼序列及第三可選擇標記(例如潮黴素抗性基因)之第三質體共轉染至HEK 293細胞中以供產生嵌合蛋白。第一及第二質體可以相等量(亦即1：1莫耳比)引入，或其可以不相等量引入。
在某些實施例中，將包括嵌合蛋白編碼FVIII(有或無XTEN)-F1-L1-V-XTEN-L2-F2編碼序列及第一可選擇標記(例如博萊黴素抗性基因)之第一質體及包括蛋白質轉化酶編碼序列及第二可選擇標記(例如潮黴素抗性基因)之第二質體共轉染至HEK 293細胞中以供產生嵌合蛋白。FVIII(X)-Fc編碼序列之啟動子與VWF-XTEN-Fc編碼序列之啟動子可不同或其可相同。
在其他實施例中，轉染細胞係經穩定轉染。此等細胞可使用熟習此項技術者已知之習知技術選擇及維 持為穩定細胞株。
使含有蛋白質之DNA構築體之宿主細胞生長在適當生長培養基中。如本文所用，術語「適當生長培養基」意謂含有細胞生長所需要之養分之培養基。細胞生長所需要之養分可包括碳源、氮源、必需胺基酸、維生素、礦物質及生長因子。視情況，培養基可含有一或多種選擇因子。視情況，培養基可含有小牛血清或胎牛血清(FCS)。在一個實施例中，培養基實質上不含IgG。生長培養基將通常藉由例如藥物選擇或缺乏必需養分來選擇含有DNA構築體之細胞，該必需養分由DNA構築體上或與DNA構築體共轉染之可選擇標記補充。培養之哺乳動物細胞通常生長在市售含血清或無血清培養基(例如MEM、DMEM、DMEM/F12)中。在一個實施例中，培養基為CD293(Invitrogen,Carlsbad,CA.)。在另一實施例中，培養基為CD17(Invitrogen,Carlsbad,CA.)。對適於所用特定細胞株之培養基之選擇在一般技藝人士之技能範圍內。
為共表現嵌合蛋白之兩條多肽鏈，在允許兩條鏈表現之條件下培養宿主細胞。如本文所用，培養係指在活體外維持活細胞至少一定時間。維持可(但無需)包括活細胞群體增加。舉例而言，維持於培養物中之細胞在群體方面可為靜態的，但仍然具有活力且能夠產生所要產物，例如重組蛋白質或重組融合蛋白。適用於培養真核細胞之條件在此項技術中為熟知的且包括適當選擇培養基、培養基補充劑、溫度、pH值、氧飽和度及其類似條件。 出於商業目的，培養可包括使用各種類型擴增系統中之任一者，包括振盪瓶、滾瓶、中空纖維生物反應器、攪拌槽生物反應器、氣升生物反應器、搖袋式生物反應器(Wave bioreactor)及其他系統。
亦選擇細胞培養條件以允許VWF片段與FVIII蛋白質締合。允許VWF片段及/或FVIII蛋白質表現之條件可包括存在維生素K來源。舉例而言，在一個實施例中，將穩定轉染之HEK 293細胞在補充有4mM麩醯胺酸之CD293培養基(Invitrogen,Carlsbad,CA)或OptiCHO培養基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中培養。
在一個態樣中，本發明係有關一種表現、製備或產生本發明之嵌合蛋白之方法，其包含a)轉染包含編碼該嵌合蛋白之聚核苷酸之宿主細胞及b)在適於表現該嵌合蛋白之條件下在培養基中培養該宿主細胞，其中該嵌合蛋白得以表現。
在其他實施例中，含有連接於XTEN序列之VWF片段或連接於XTEN序列之FVIII蛋白質的蛋白質產物分泌至培養基中。將培養基與細胞分離、濃縮、過濾且接著穿過兩個或三個親和管柱，例如蛋白質A管柱及一或兩個陰離子交換管柱。
在某些態樣中，本發明係關於藉由本文所述之方法產生之嵌合蛋白。
活體外生產允許擴增以得到大量本發明所要改造多肽。用於在組織培養條件下進行哺乳動物細胞培養 之技術在此項技術中為已知的且包括例如在氣升反應器中或在連續攪拌反應器中進行均質懸浮培養，或例如在中空纖維、微囊中、在瓊脂糖微珠粒或陶瓷管殼上進行固定或包埋式細胞培養。必要及/或需要時，多肽之溶液可藉由慣用層析方法進行純化，該等方法例如凝膠過濾、離子交換層析、疏水性相互作用層析(HIC)、經DEAE-纖維素層析或親和層析。
醫藥組合物
含有本發明之嵌合蛋白之組合物可含有醫藥學上可接受之適合載劑。舉例而言，該等組合物可含有有助於將活性化合物加工成設計用於傳遞至作用部位之製劑之賦形劑及/或助劑。
醫藥組合物可調配成用於藉由團式注射進行非經腸投藥(亦即靜脈內、皮下或肌肉內)。注射用調配物可以例如於添加有防腐劑之安瓿或多劑量容器中的單位劑型提供。組合物可採用諸如於油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液之形式，且可含有調配劑，諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。或者，活性成分可呈用於以適合媒劑(例如無熱原質水)復原之粉末形式。
適用於非經腸投藥之調配物亦包括呈水溶性形式(例如水溶性鹽)之活性化合物之水溶液。此外，可投與呈適當油性注射懸浮液形式之活性化合物懸浮液。適合親脂性溶劑或媒劑包括脂肪油(例如芝麻油)或合成脂肪酸 酯(例如油酸乙酯或三酸甘油酯)。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液黏度之物質，包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇及葡聚糖。視情況，懸浮液亦可含有穩定劑。脂質體亦可用於囊封本發明之分子以傳遞至細胞或間質間隙中。醫藥學上可接受之示範性載劑為生理上相容之溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑、水、生理食鹽水、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、右旋糖、甘油、乙醇及其類似物。在一些實施例中，組合物包含等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化鈉。在其他實施例中，組合物包含增強活性成分之保存期限或有效性的醫藥學上可接受之物質，諸如濕潤劑或少量輔助物質，諸如濕潤劑或乳化劑、防腐劑或緩衝劑。
本發明之組合物可呈多種形式，包括例如液體(例如可注射及可輸注溶液)、分散液、懸浮液、半固體及固體劑型。較佳形式取決於投藥模式及治療應用。
組合物可調配成溶液、微乳液、分散液、脂質體或適於高藥物濃度之其他有序結構。可藉由將活性成分以所需量在必要時與以上列舉之一種成分或成分之組合一起併入適當溶劑中，隨後進行過濾滅菌來製備無菌可注射溶液。一般而言，藉由將活性成分併入含有基本分散介質及來自以上列舉之成分之所需其他成分的無菌媒劑中來製備分散液。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末之情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥，其產生活性成分外加來自先前無菌過濾溶液之任何其他所要成分的粉 末。溶液之適當流動性可例如藉由使用包衣(諸如卵磷脂(lecithin))、在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持。可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中包括延遲吸收之試劑(例如單硬脂酸鹽及明膠)來達成。
活性成分可用控制釋放調配物或裝置調配。此等調配物及裝置之實例包括植入物、經皮貼片及微囊封傳遞系統。可使用生物可降解之生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白(collagen)、聚原酸酯及聚乳酸。製備此等調配物及裝置之方法在此項技術中為已知的。參見例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson編，Marcel Dekker公司，New York,1978。
可注射儲積式調配物可藉由在諸如聚丙交酯-聚乙交酯之生物可降解聚合物中形成微囊封藥物基質來製備。視藥物與聚合物之比率及所用聚合物之性質而定，可控制藥物釋放速率。其他示範性生物可降解聚合物為聚原酸酯及聚酸酐。儲積式可注射調配物亦可藉由將藥物包埋在脂質體或微乳液中來製備。
可在組合物中併入補充性活性化合物。在一個實施例中，本發明之嵌合蛋白與另一凝結因子或其變異體、片段、類似物或衍生物一起調配。舉例而言，凝結因子包括(但不限於)因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、凝血酶原、 纖維蛋白原、范威爾邦德因子或重組可溶性組織因子(rsTF)或任何前述因子之活化形式。止血劑之凝結因子亦可包括抗纖維蛋白溶解藥物，例如ε-胺基-己酸、胺甲環酸(tranexamic acid)。
可調整劑量方案以提供最佳所要反應。舉例而言，可投與單一大丸劑，可隨時間投與若干分次劑量，或可如藉由治療情形之緊急性所指示，按比例降低或增加劑量。宜以劑量單位形式調配非經腸組合物以便於投藥及達成劑量均一性。參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.公司，Easton,Pa.1980)。
除活性化合物之外，液體劑型亦可含有惰性成分，諸如水、乙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲醯胺、油、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇及脫水山梨糖醇脂肪酸酯。
適合醫藥載劑之非限制性實例亦描述於由E.W.Martin所著之Remington's Pharmaceutical Sciences中。賦形劑之一些實例包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉、甘油、丙二醇、水、乙醇及其類似物。組合物亦可含有pH值緩衝試劑及濕潤劑或乳化劑。
對於經口投藥，醫藥組合物可採用藉由習知手段製備之錠劑或膠囊形式。組合物亦可製備成液體，例如糖漿或懸浮液。液體可包括懸浮劑(例如山梨糖醇糖 漿、纖維素衍生物或氫化食用脂肪)、乳化劑(卵磷脂或阿拉伯膠(acacia))、非水性媒劑(例如杏仁油、油性酯、乙醇或分餾植物油)及防腐劑(例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸)。製劑亦可包括調味劑、著色劑及甜味劑。或者，組合物可以用於以水或另一適合媒劑復原之乾燥產品形式提供。
對於經頰投藥，組合物可採用習知方案之錠劑或口含錠形式。
對於藉由吸入投藥，供根據本發明使用之化合物宜以有或無賦形劑之霧化氣霧劑形式或以氣霧劑噴霧形式視情況在推進劑(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟甲烷、二氧化碳或其他適合氣體)存在下自加壓包裝或噴霧器傳遞。在加壓氣霧劑之情況下，劑量單位可藉由提供用以傳遞經計量之量的閥來確定。用於在吸入器或吹入器中使用之例如明膠之膠囊及藥筒可調配成含有化合物與諸如乳糖或澱粉之適合粉末基質之粉末混合物。
醫藥組合物亦可調配用於以例如含有習知栓劑基質(諸如可可脂或其他甘油酯)之栓劑或保留灌腸劑形式經直腸投藥。
在一個實施例中，醫藥組合物包含嵌合蛋白、編碼該嵌合蛋白之聚核苷酸、包含該聚核苷酸之載體或包含該載體之宿主細胞及醫藥學上可接受之載劑。相較於野生型FVIII蛋白質或無VWF片段之相應FVIII蛋白質，嵌合蛋白中之FVIII蛋白質具有延長之半衰期。在一 個實施例中，其中FVIII蛋白質之半衰期延長至野生型FVIII之半衰期的至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍或至少約12倍長。在另一實施例中，因子VIII之半衰期為至少約17小時、至少約18小時、至少約19小時、至少約20小時、至少約21小時、至少約22小時、至少約23小時、至少約24小時、至少約25小時、至少約26小時、至少約27小時、至少約28小時、至少約29小時、至少約30小時、至少約31小時、至少約32小時、至少約33小時、至少約34小時、至少約35小時、至少約36小時、至少約48小時、至少約60小時、至少約72小時、至少約84小時、至少約96小時或至少約108小時。
在一些實施例中，組合物係藉由選自由以下組成之群之途徑投與：局部投與、眼內投與、非經腸投與、鞘內投與、硬膜下投與及經口投與。非經腸投與可為靜脈內或皮下投與。
在其他實施例中，組合物用於治療有需要之個體之流血疾病或病狀。流血疾病或病狀係選自由以下組成之群：流血凝血病症、關節積血、肌肉流血、口腔流血、出血、向肌肉中出血、口腔出血、創傷、頭部創傷、胃腸流血、顱內出血、腹內出血、胸內出血、骨折、中樞神經系統流血、咽後間隙中流血、腹膜後間隙中流血、髂 腰肌鞘中流血及其任何組合。在其他實施例中，個體預定經歷手術。在其他實施例中，治療為預防性或按需治療。
基因療法
本發明之其嵌合蛋白可在哺乳動物(例如人類患者)體內活體內產生，使用基因療法方法來治療流血疾病或病症將具有治療上之益處，該流血疾病或病症選自由以下組成之群：流血凝血病症、關節積血、肌肉流血、口腔流血、出血、向肌肉中出血、口腔出血、創傷、頭部創傷、胃腸流血、顱內出血、腹內出血、胸內出血、骨折、中樞神經系統流血、咽後間隙中流血、腹膜後間隙中流血及髂腰肌鞘中流血。在一個實施例中，流血疾病或病症為血友病。在另一實施例中，流血疾病或病症為A型血友病。此方法涉及投與可操作地連接於適合表現控制序列之適合嵌合蛋白編碼核酸。在某些實施例中，此等序列係併入病毒載體中。適用於此基因療法之病毒載體包括腺病毒載體、慢病毒載體、桿狀病毒載體、艾伯斯坦巴爾病毒載體、乳多泡病毒載體(papovaviral vector)、牛痘病毒載體、單純性皰疹病毒載體、及腺相關病毒(AAV)載體。病毒載體可為複製缺陷型病毒載體。在其他實施例中，腺病毒載體在其E1基因或E3基因中具有缺失。當使用腺病毒載體時，哺乳動物可不暴露於編碼可選擇標記基因之核酸。在其他實施例中，序列係併入熟習此項技術者已知之非病毒載體中。
使用嵌合蛋白之方法
本發明係有關一種使用本文所述之嵌合蛋白來阻止或抑制內源性VWF結合FVIII蛋白質之方法。本發明亦係有關一種使用具有連接於XTEN及Ig恆定區或其部分之FVIII蛋白質之嵌合蛋白的方法。
本發明之一個態樣係有關藉由阻斷或遮蔽FVIII上之VWF結合位點以免與內源性VWF結合來阻止或抑制FVIII與內源性VWF相互作用及同時使用XTEN序列與亦可為半衰期延長劑之Ig恆定區或其部分之組合來延長FVIII蛋白質之半衰期。在一個實施例中，本發明係有關一種構築半衰期長於野生型FVIII之FVIII蛋白質之方法。在一個實施例中，XTEN序列抑制或阻止嵌合蛋白中之FVIII蛋白質與內源性VWF相互作用。在另一實施例中，Ig恆定區或其部分抑制或阻止FVIII蛋白質與內源性VWF相互作用。適用於該方法中之嵌合蛋白包括本文所述之任一或多種嵌合蛋白。
本發明之另一態樣包括一種向有需要之個體投與包含半衰期長於野生型FVIII之FVIII蛋白質之嵌合蛋白的方法，其中該方法包含向該個體投與本文所述之嵌合蛋白。
在一個實施例中，本發明係有關一種使用XTEN序列及Ig恆定區或其部分來延長FVIII蛋白質及VWF片段之半衰期以阻止或抑制內源性VWF與FVIII蛋 白質相互作用的方法。連接於XTEN序列(例如FVIII(X))且接著與VWF片段結合或締合之FVIII蛋白質受到遮蔽或保護以免遭VWF之清除路徑且因此相較於未結合於VWF片段之FVIII蛋白質，清除率降低。因此，相較於未與XTEN序列及VWF片段結合或締合之FVIII蛋白質，受遮蔽FVIII蛋白質之半衰期得到最大延長。在某些實施例中，與VWF片段締合或受VWF片段保護且連接於XTEN序列之FVIII蛋白質不由VWF清除受體清除。在其他實施例中，與VWF片段締合或受VWF片段保護且連接於XTEN序列之FVIII蛋白質自系統之清除慢於未與VWF片段締合或受VWF片段保護且連接於XTEN序列之FVIII蛋白質。
在一個態樣中，包含連接於XTEN序列之FVIII蛋白質或與連接於XTEN之VWF片段結合或締合之FVIII蛋白質的嵌合蛋白自循環之清除率降低，因為VWF片段不含VWF清除受體結合位點。VWF片段阻止或抑制與VWF片段結合或締合之FVIII經由VWF清除路徑自系統清除。適用於本發明之VWF片段亦可提供至少一或多種由內源性VWF提供之VWF樣FVIII保護性質。在某些實施例中，VWF片段或XTEN序列亦可掩蔽一或多個FVIII清除受體結合位點，藉此阻止FVIII藉由其自身清除路徑清除。
在一些實施例中，由VWF片段或XTEN序列阻止或抑制FVIII蛋白質結合內源性VWF可發生在活體 外或活體內。
亦提供一種增加FVIII蛋白質之半衰期之方法，其包含向有需要之個體投與本文所述之嵌合蛋白。與全長VWF結合或締合之非活化型FVIII在血漿中之半衰期為約12至14小時。在循環中幾乎不存在VWF之3型VWD中，FVIII之半衰期僅為約六小時，從而由於FVIII濃度降低而在此等患者中產生輕度至中度A型血友病之症狀。與本發明之VWF片段或XTEN序列連接或締合之FVIII蛋白質的半衰期可增加至與全長VWF結合或締合之非活化型FVIII之半衰期的至少約1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.6倍、2.7.倍、2.8倍、2.9倍、3.0倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍、3.5倍、3.6倍、3.7倍、3.8倍、3.9倍或4.0倍高。
在一個實施例中，在包含XTEN序列之嵌合蛋白中與VWF片段連接或締合或連接於Ig恆定區或其部分之FVIII蛋白質的半衰期增加至與全長VWF結合或締合之非活化型FVIII之半衰期的至少約2倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、5.5倍、6.0倍、7倍、8倍、9倍或10倍高。在另一實施例中，在包含XTEN序列之嵌合蛋白中與VWF片段或Ig恆定區或其部分連接或締合之FVIII蛋白質的半衰期增加至與全長VWF結合或締合之非活化型FVIII或野生型FVIII之半衰期的約2至約5倍、約3至約10倍、約5至約15倍、約10 至約20倍、約15至約25倍、約20至約30倍、約25至約35倍、約30至約40倍、約35至約45倍高。在一特定實施例中，在FVIII及VWF雙重基因剔除小鼠中，在包含XTEN序列之嵌合蛋白中與VWF片段連接或締合或連接於Ig恆定區之FVIII蛋白質的半衰期增加至野生型FVIII之半衰期的至少約30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40倍高。
在一些實施例中，包含融合於第一Ig恆定區或其部分(例如第一Fc區)及XTEN序列之VWF片段、及連接於XTEN序列及第二Ig恆定區或其部分(例如第二Fc區)之FVIII蛋白質之嵌合蛋白的半衰期長於與內源性VWF締合之FVIII之半衰期。在其他實施例中，嵌合蛋白之半衰期為野生型FVIII或與內源性VWF締合之FVIII蛋白質之半衰期的至少約1.5倍、2倍、2.5倍、3.5倍、3.6倍、3.7倍、3.8倍、3.9倍、4.0倍、4.5倍或5.0倍。
在一些實施例中，作為本發明之結果，相較於無VWF片段之FVIII蛋白質或野生型FVIII，FVIII蛋白質之半衰期得到延長。本發明嵌合蛋白之半衰期為無VWF片段之FVIII蛋白質或野生型FVIII之半衰期的至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍或至少約12倍長。在一個實施例中，FVIII之半衰期為野生型FVIII之半衰期的約1.5倍至約20倍、約1.5倍至約15 倍、或約1.5倍至約10倍長。在另一實施例中，相較於野生型FVIII或無VWF片段之FVIII蛋白質，FVIII之半衰期延長至約2倍至約10倍、約2倍至約9倍、約2倍至約8倍、約2倍至約7倍、約2倍至約6倍、約2倍至約5倍、約2倍至約4倍、約2倍至約3倍、約2.5倍至約10倍、約2.5倍至約9倍、約2.5倍至約8倍、約2.5倍至約7倍、約2.5倍至約6倍、約2.5倍至約5倍、約2.5倍至約4倍、約2.5倍至約3倍、約3倍至約10倍、約3倍至約9倍、約3倍至約8倍、約3倍至約7倍、約3倍至約6倍、約3倍至約5倍、約3倍至約4倍、約4倍至約6倍、約5倍至約7倍、或約6倍至約8倍。在其他實施例中，本發明之嵌合蛋白之半衰期為至少約17小時、至少約18小時、至少約19小時、至少約20小時、至少約21小時、至少約22小時、至少約23小時、至少約24小時、至少約25小時、至少約26小時、至少約27小時、至少約28小時、至少約29小時、至少約30小時、至少約31小時、至少約32小時、至少約33小時、至少約34小時、至少約35小時、至少約36小時、至少約48小時、至少約60小時、至少約72小時、至少約84小時、至少約96小時或至少約108小時。在其他實施例中，本發明之嵌合蛋白之半衰期為約15小時至約兩週、約16小時至約一週、約17小時至約一週、約18小時至約一週、約19小時至約一週、約20小時至約一週、約21小時至約一週、約22小時至約一週、約23小時至約 一週、約24小時至約一週、約36小時至約一週、約48小時至約一週、約60小時至約一週、約24小時至約六天、約24小時至約五天、約24小時至約四天、約24小時至約三天、或約24小時至約兩天。
在一些實施例中，每位個體中本發明嵌合蛋白之平均半衰期為約15小時、約16小時、約17小時、約18小時、約19小時、約20小時、約21小時、約22小時、約23小時、約24小時(1天)、約25小時、約26小時、約27小時、約28小時、約29小時、約30小時、約31小時、約32小時、約33小時、約34小時、約35小時、約36小時、約40小時、約44小時、約48小時(2天)、約54小時、約60小時、約72小時(3天)、約84小時、約96小時(4天)、約108小時、約120小時(5天)、約六天、約七天(一週)、約八天、約九天、約10天、約11天、約12天、約13天或約14天。
此外，本發明提供一種治療或預防流血疾病或病症之方法，其包含投與有效量之嵌合蛋白。在一個實施例中，流血疾病或病症係選自由以下組成之群：流血凝血病症、關節積血、肌肉流血、口腔流血、出血、向肌肉中出血、口腔出血、創傷、頭部創傷、胃腸流血、顱內出血、腹內出血、胸內出血、骨折、中樞神經系統流血、咽後間隙中流血、腹膜後間隙中流血及髂腰肌鞘中流血。在一特定實施例中，流血疾病或病症為A型血友病。
藉由本發明製備之包含XTEN序列及Ig恆定 區或其部分與本文所述之VWF片段(其阻止或抑制FVIII蛋白質與內源性VWF相互作用)之組合的嵌合蛋白具有許多用途，如將由熟習此項技術者所認識到，包括(但不限於)治療患有止血病症之個體之方法及治療需要一般性止血劑之個體之方法。在一個實施例中，本發明係關於一種治療患有止血病症之個體之方法，其包含投與治療有效量之嵌合蛋白。
嵌合蛋白中之FVIII蛋白質部分藉由在帶負電荷磷脂表面上充當因子IX之輔因子，藉此形成X酶複合物來治療或預防止血病症。活化型凝血因子結合磷脂表面使此過程定位於血管損壞部位。在磷脂表面上，因子VIIIa使由因子IXa達成之因子X活化之最大速度增加約200,000倍，從而導致凝血酶產生之大規模瞬間爆發。
本發明之嵌合蛋白可用於治療任何止血病症。可藉由投與本發明之嵌合蛋白治療之止血病症包括(但不限於)A型血友病以及與因子VIII相關之缺乏症或結構異常。在一個實施例中，止血病症為A型血友病。
本發明之嵌合蛋白可預防性用於治療患有止血病症之個體。本發明之嵌合蛋白可用於治療患有止血病症之個體之急性流血事件。在另一實施例中，止血病症可為缺陷性凝結因子，例如范威爾邦德氏因子之結果。在一個實施例中，止血病症為遺傳性病症。在另一實施例中，止血病症為獲得性病症。獲得性病症可由潛在繼發性疾病或病狀所致。無關病狀可為例如(但不作為限制)癌症、自 體免疫性疾病或妊娠。獲得性病症可由老齡或治療潛在繼發性病症之藥物治療(例如癌症化學療法)所致。
本發明亦係關於治療未患先天性止血病症，但患有例如由於產生抗FVIII抗體或手術而導致獲得止血病症之繼發性疾病或病狀之個體的方法。因此，本發明係關於一種治療需要一般性止血劑之個體之方法，其包含投與治療有效量之藉由本發明方法製備之嵌合蛋白。
本發明亦係關於降低FVIII之免疫原性或降低所誘導針對FVIII之免疫原性的方法，其包含投與有效量之本文所述之嵌合蛋白或編碼其之聚核苷酸。
在一個實施例中，需要一般性止血劑之個體正經歷或即將經歷手術。本發明之嵌合蛋白可在手術之前、期間或之後作為預防性方案加以投與。本發明之嵌合蛋白可在手術之前、期間或之後投與以控制急性流血事件。
本發明之嵌合蛋白可用於治療未患止血病症但具有急性流血事件之個體。急性流血事件可由嚴重創傷，例如手術、車禍、傷口、槍擊裂傷、或導致流血不受控制之任何其他創傷事件所致。流血事件之非限制性實例包括流血凝血病症、關節積血、肌肉流血、口腔流血、出血、向肌肉中出血、口腔出血、創傷、頭部創傷、胃腸流血、顱內出血、腹內出血、胸內出血、骨折、中樞神經系統流血、咽後間隙中流血、腹膜後間隙中流血、髂腰肌鞘中流血及其任何組合。
在預防性應用中，將一或多種含有本發明嵌合蛋白或其混合物之組合物投與尚未處於疾病病況中之患者以增強該患者之抗性或減輕與疾病或病症相關之症狀。該種量定義為「預防有效劑量」。在治療性應用中，有時需要以相對較短時間間隔投與相對較高劑量(例如每劑約1至400mg/kg之多肽，其中5至25mg之劑量更通常用於放射免疫結合物且更高劑量用於細胞毒素-藥物修飾之多肽)直至疾病進展減緩或終止，及直至患者顯示疾病症狀部分或完全改善。此後，可向患者投與預防性方案。
在一些實施例中，本發明之嵌合蛋白或組合物用於按需治療，其包括治療流血事件、關節積血、肌肉流血、口腔流血、出血、向肌肉中出血、口腔出血、創傷、頭部創傷(頭創傷)、胃腸流血、顱內出血、腹內出血、胸內出血、骨折、中樞神經系統流血、咽後間隙中流血、腹膜後間隙中流血或髂腰肌鞘中流血。個體可能需要手術預防、手術期間管理或手術治療。此等手術包括例如小手術、大手術、拔牙、扁桃體切除術、腹股溝疝切開術、滑膜切除術、全膝置換、開顱術、骨縫合術、創傷手術、顱內手術、腹內手術、胸內手術或關節置換手術。
在一個實施例中，本發明之嵌合蛋白係靜脈內、皮下、肌肉內投與或經由任何黏膜表面投與，例如經口、舌下、經頰、經鼻、經直腸、經陰道或經由肺途徑投與。本發明之包含VWF片段及FVIII蛋白質之嵌合蛋白可植入在允許嵌合蛋白緩慢釋放至流血部位之生物聚合物 固體支撐物內或連接於該生物聚合物固體支撐物，或植入繃帶/敷料中。嵌合蛋白之劑量將視個體及所用特定投藥途徑而變化。劑量可在每公斤體重0.1至100,000μg之範圍內。在一個實施例中，劑量範圍為0.1-1,000μg/kg。在另一實施例中，劑量範圍為0.1-500μg/kg。蛋白質可連續或以特定時間間隔投與。可採用活體外分析來確定投藥之最佳劑量範圍及/或時程。量測凝結因子活性之活體外分析在此項技術中為已知的，例如STA-CLOT VIIa-rTF凝結分析或ROTEM凝結分析。另外，可自由動物模型(例如血友病狗)獲得之劑量-反應曲線外推出有效劑量(Mount等人2002,Blood 99(8)：2670)。
現已詳細描述了本發明，藉由參照以下實例將更清楚地瞭解本發明，該等實例係僅出於說明之目的包括於本文中且不欲限制本發明。本文中提及之所有專利、公開案及文章皆以引用的方式明確且特定地併入本文中。
實例
除非另外陳述，否則在整篇實例中，使用以下材料及方法。
材料及方法
一般而言，除非另外指示，否則本發明之實施採用習知化學技術、生物物理學技術、分子生物學技術、重組DNA技術、免疫學技術(尤其例如抗體技術)及 標準電泳技術。參見例如Sambrook,Fritsch及Maniatis,Molecular Cloning：Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Antibody Engineering Protocols(Methods in Molecular Biology),510,Paul,S.,Humana Pr(1996)；Antibody Engineering：A Practical Approach(Practical Approach Series,169),McCafferty編，Irl Pr(1996)；Antibodies：A Laboratory Manual,Harlow等人，CS.H.L.Press,Pub.(1999)；及Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel等人編，John Wiley & Sons(1992)。
實例1：選殖不同VWF域(圖1)
(a)選殖pSYN-VWF-002
pSYN-VWF-002含有編碼VWF片段之核苷酸序列，該VWF片段為SEQ ID NO：100之胺基酸1-477。[VWF-D'D3蛋白質序列]胺基酸編號表示無肽原之成熟VWF序列且對應於SEQ ID NO：2之胺基酸764-1240。pSYN-VWF-002構築體在N末端具有允許所合成蛋白質適當分泌之FVIII信號肽，且隨後在C末端具有用於蛋白質純化之6×His標籤。其係藉由使用以下引子組合來合成：ESC48-Fwd-VWF-D'D3，具有VIII信號及BsiW1位點TCGCGACGTACGGCCGCCACCATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTGCTTTAGCCTATCCTGTCGGCCCCCCATG(SEQ ID NO：90)ESC51-Rev-VWF D'D3(1-477胺基酸)，具有6His及Not 1位點 TGACCTCGAGCGGCCGCTCAGTGGTGATGGTGATGATGCGGCTCCTGGCAGGCTTCACAGGTGAGGTTGACAAC(SEQ ID NO：91)
使用2步PCR擴增循環：94℃ 2分鐘；21個循環之(96℃ 30秒，68℃ 2分鐘)，用ESC48/ESC51引子組合及作為模板之全長VWF質體進行50μl PCR反應。1460bp亮帶用凝膠萃取套組(Qiagen，Valencia,Calif.)進行凝膠純化且選殖至pcDNA 4之BsiWI及Not1限制位點中以產生pSYN-VWF 002。
(b)選殖pSYN-VWF-010及013
使用pSYN-VWF-008及pSYN-VWF-002構築pSYN-VWF-010。pSYN-VWF-008在pcDNA 3.1中含有全長VWF序列(SEQ ID NO：2之胺基酸1-2813)，其包括含有763個胺基酸之肽原(亦即D1D2域)，隨後為成熟VWF之含有剩餘2050個胺基酸之序列。pSYN-VWF-002中之FVIII信號肽置換為來自pSYN-VWF-008之D1D2域，所得構築體為pSYN-VWF-010。pSYN-VWF-008具有位於Arg907之BamH1位點及位於編碼區末端(在終止密碼子之後)之Not1位點。pSYN-VWF-008及002用BamH1及Not1限制酶消化。將來自pSYN-VWF-002之插入物(1026bp)連接至經bamH1/Not1消化之pSYN-VWF-008(8242bp)中以獲得pSYN-VWF-010(D1D2D'D3：SEQ ID NO：2之胺基酸1-1240)，在C末端亦添加6×His標籤。在轉型細胞中，合成之pSYN-VWF-010具有肽原，但歸因於細胞內加工，分泌之產物不含任何肽原(D1D2)。由VWF-010獲得 之蛋白質以二聚體形式存在。
pSYN-VWF-010用於產生pSYN-VWF-013，pSYN-VWF-013在對應於SEQ ID NO：100之C336A及C379A(胺基酸編號表示無D1D2域之成熟VWF序列-VWF序列2)處具有兩個點突變。預測此等突變會阻止VWF D'D3域之二聚化。
(c)選殖pSYN-VWF-025及pSYN-VWF-029
pSYN-VWF-025在pLIVE載體中含有全長VWF之野生型D1D2D'D3序列，且pSYN-VWF-029含有具有C336A及C379A突變之D1D2D'D3序列。對於選殖pSYN-VWF-025，使用以下引子組合：具有Nhe1位點之ESC 89-fwd=CTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCCG(SEQ ID NO：92)
具有Sal1之ESC 91-rev=CTGGATCCCGGGAGTCGACTCGTCAGTGGTGATGGTGATGATG(SEQ ID NO：93)
使用3步PCR擴增循環：94℃ -2分鐘；21個循環之(96℃ -30秒，55℃ -30秒，68℃ -4分鐘)，用ESC89/ESC91引子組合及作為模板之pSYN-VWF-010(針對pSYN-VWF-025)或pSYN-VWF-013(針對pSYN-VWF-029)質體進行50μl PCR反應。將預期尺寸亮帶(約3800bp)用凝膠萃取套組(Qiagen，Valencia,Calif.)進行凝膠純化且選殖至pLIVE-Mirus載體(Invitrogen，Carlsbad,Calif.)之Nhe1及Sal1限制位點中以產生pSYN-VWF-025 及029。
(d)選殖pSYN-VWF-031
pSYN-VWF-031為一種D1D2D'D3(C336A/C379A)-Fc構築體，其在VWF D1D2D'D3(C336A/C379A)與Fc序列之間具有長度為48個胺基酸之凝血酶可裂解連接子(8×GGGGS(SEQ ID NO 94)+凝血酶位點)。為製備此構築體，自構築體pSYN-FVIII-064(以下稱為FVIII-VWF構築體)擴增VWF-Fc區。pSYN-FVIII-VWF用Xba1及Nhe1消化。含有VWF片段及Fc區之4165bp所得插入物區域用作藉由引子組合LW22/LW23擴增VWF及Fc區之模板。
LW 22-FWD-VWF-D'D3，具有FVIII信號序列及BsiW1位點GCGCCGGCCGTACGATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTGCTTTAGCCTATCCTGTCGGCCCCCCATG(SEQ ID NO：95)
LW 23-Rev-Fc，具有終止密碼子及Not1位點TCATCAATGTATCTTATCATGTCTGAATTCGCGGCCGCTCATTTACC(SEQ ID NO：96)
將由LW22/LW23擴增獲得之PCR產物(約2300bp)選殖於經BsiW1/Not1消化之pSYN-VWF-002中以獲得pSYN-VWF-014中間物。pSYN-VWF-014依次含有FVIII信號肽-D'D3-含20個胺基酸之凝血酶可裂解連接子及Fc區。
為產生D1D2D'D3-Fc構築體，使用引子組合 LW24/LW27藉由標準PCR方法自pSYN-VWF-013擴增D1D2D'D3區。
LW24-Fwd-VWF D1D2D'D3選殖寡聚物，具有BsiW1位點GCGCCGGCCGTACGATGATTCCTGCCAGATTTGCCGGGGTG(SEQ ID NO：97)
LW27-Rev-VWF D'D3寡聚物，具有EcoRV CCACCGCCAGATATCGGCTCCTGGCAGGCTTCACAGGTGAG(SEQ ID NO：98)
將由LW22/LW23擴增獲得之PCR產物(約3750bp)選殖於經BsiW1/EcoRV消化之pSYN-VWF-014中以獲得pSYN-VWF-015中間物。改變VWF片段與Fc區之間的連接子長度以獲得pSYN-VWF-031。
VWF-D1D2D'D3蛋白質序列1(SEQ ID NO：99)
VWF-D1D2D'D3蛋白質序列2(SEQ ID NO：100)
實例2：D'D3及XTEN融合體對FVIII半衰期延長之影響
為評估D'D3延長rFVIII-XTEN融合蛋白之FVIII半衰期之潛力，藉由流體動力學注射VWF D'D3二聚體之相應DNA構築體VWF-025(實例1)來將該VWF D'D3二聚體引入FVIII-VWF DKO小鼠體內。在D'D3已達到穩態表現(注射後第5天)之後，藉由靜脈內注射以200IU/kg劑量投與單次劑量之rFVIII-XTEN。收集血液樣品直至rFVIII-XTEN給藥後120小時。藉由FVIII顯色分析來分析血漿FVIII活性。藉由VWF ELISA量測D'D3表現量，且使用WinNonlin程式分析rFVIIIFc PK概況。
研究結果展示於圖2中，且有/無D'D3之rFVIII-XTEN在循環中之PK參數列於表16中。D'D3二聚體進一步使rFIII-XTEN t1/2自3.4小時延長至17.8小時，增加5倍。除半衰期之外，亦觀測到MRT增加5倍，AUC增加3.6倍，清除率降低3.8倍。
吾人已觀測到D'D3片段及XTEN技術之協同效應，將在血友病動物中評估一系列FVIII/VWF/XTEN構 築體延長FVIII半衰期之潛力。
FVIII-XTEN之蛋白質純化
將AE288 XTEN插入在BDD-FVIII之C末端以進行此研究。為純化此蛋白質，首先使用切向流過濾(TFF)步驟對條件培養基進行緩衝液交換。接著使用強陰離子交換層析捕捉濾液中之產物，並接著使用親和層析進一步純化。根據HPLC-SEC，分子之純度為可接受的且藉由西方墨點術進一步確認。如藉由aPTT分析及ELISA所量測，分子之比活性與B域缺失之FVIII類似。
FVIII顯色分析
使用來自DiaPharma之COATEST SP FVIII套組(批號N089019)量測FVIII活性且所有培育皆在振盪下於37℃板式加熱器上進行。
rFVIII標準範圍為100mIU/mL至0.78mIU/mL。將匯合之正常人類血漿分析對照及血漿樣品(用1×Coatest緩衝液稀釋)一式兩份添加至Immulon 2HB 96 孔盤中(25μL/孔)。新鮮製備之IXa/FX/磷脂混合物(50μL)、25μL 25mM CaCl2及50μL FXa受質依序添加至各孔中，在各次添加之間培育5分鐘。在與受質一起培育之後，添加25μL 20%乙酸以終止顯色反應，且用SpectraMAX plus(Molecular Devices)儀器量測OD405之吸光度。用SoftMax Pro軟體(第5.2版)分析資料。最低定量含量(LLOQ)為7.8mIU/mL。
VWF ELISA：
使用0.5μg/孔之山羊抗人類VWF抗體(經親和純化，affinity biological，GAVWF-AP)作為捕捉抗體且使用VWF-EIA-D(Affinity Biologicals，VWF-EIA-D，1：100稀釋)作為VWF ELISA之偵測抗體。遵循標準ELISA程序進行ELISA分析，使用TMB作為HRP受質，使用PBST/1.5% BSA/0.5M NaCl緩衝液作為阻斷及結合緩衝液。分析標準範圍為100ng至0.78ng，且分析之定量下限(LLOQ)為7.8ng/mL。
實例3：含有XTEN之FVIII/VWF構築體之質體構築
(a)選殖pSYN-FVIII-161(圖3)
FVIII-161質體包含具有在於細胞中合成期間加工之酶裂解位點之單鏈FC(scFc)骨架。該構築體具有全長VWF之FVIII結合域(D'D3)。
質體(pSYN-FVIII-161)設計成用於表現FVIII-Fc及VWF-Fc雜二聚體，其中D'D3域結合FVIII且阻止 FVIII與磷脂及活化型蛋白質C相互作用。由pSYN-FVIII-161獲得之蛋白質在細胞中表現為單一多肽，其中FVIII-Fc次單元之C末端藉由6×(GGGGS)多肽連接子(SEQ ID NO：64)連接於VWF D'D3-Fc次單元之N末端。此外，RRRRS(SEQ ID NO：11)及RKRRKR(SEQ ID NO：10)序列分別插入在多肽連接子之5'末端及3'末端以便由前蛋白轉化酶在各序列之末位Arg之後進行細胞內裂解。因此，細胞可表現雙鏈FVIII-Fc/D'D3-Fc雜二聚體，其中FVIII-Fc鏈在C末端具有RRRRS序列(SEQ ID NO：11)，但連接子序列之其餘部分已移除。將之後緊接有IS{5×(GGGGS)}LVPRGSGG(SEQ ID NO：122)多肽(含有凝血酶裂解位點)之AE288 XTEN片段引入在VWF域與Fc區之間以促進FVIII-VWF雜二聚蛋白質由凝血酶活化後自FVIII釋放VWF片段，從而允許FVIII與其他凝結因子相互作用。
pSYN-FVIII-161(SEQ ID NO：101)。蛋白質序列(FVIII序列胺基酸位置1-1457；加下劃線區域表示Fc區；曲線下劃線表示第一Fc與VWF片段之間的可裂解連接子；加雙下劃線區域表示VWF片段；粗體區域表示VWF片段與Fc之間的可裂解連接子。
(b)選殖pSYN-FVIII-168、175、172及174(圖4A- 4D)
pSYN-FVIII-168、172、174及175為pSYN-FVIII-161之衍生物。將R1645A/R1648A突變引入pSYN-FVIII-161中以形成產生SC-FVIII同功異型物之pSYN-FVIII-168，且使AE288 XTEN直接融合至FVIII-HC之C末端中以進一步延長半衰期。為構築pSYN-FVIII-175，自pSYN-FVIII-168移除D'D3密碼子序列以便評估Fc及XTEN技術對FVIII半衰期延長之影響。
為構築pSYN-FVIII-172，使AE288 XTEN片段直接融合至FVIII-HC之C末端中以進一步延長半衰期，且自pSYN-FVIII-172移除D'D3密碼子序列以形成pSYN-FVIII-174來用於評估Fc及XTEN技術對FVIII半衰期延長之影響。
(c)選殖pSYN-FVIII-170(圖4E)
構築pSYN-FVIII-170以評估XTEN及D'D3片段對FVIII半衰期延長之影響。將密碼子序列VWF-D1D2D'D3片段及BDD-FVIII引入表現卡匣之5'末端及3'末端，使用之後接有35 aa凝血酶可裂解連接子之AE288 XTEN密碼子序列來連接VWF與FVIII分子。在細胞內加工之後，分泌之蛋白質包含含有成熟VWF分子之D'D3片段之多肽，該D'D3片段藉由AE288 XTEN/35 aa凝血酶可裂解連接子連接於成熟BDD-FVIII之N末端。
pSYN-FVIII-170蛋白質序列(SEQ ID NO：102)
實例4：在FVIII及VWF缺乏小鼠中流體動力學注射含有XTEN之FVIIIF/VWF構築體
圖3及4中含有XTEN之DNA構築體已將2-3個半衰期延長元件組合在一起。為評估其FVIII半衰期延長潛力，藉由在每只小鼠100μg之劑量下進行流體動 力學注射(HDI)來將圖3及圖4中之一組所選DNA構築體引入FVIII/VWF雙重基因剔除(DKO)小鼠中。接著藉由眶後血液收集法在HDI後24小時收集血液樣品。藉由FVIII顯色分析來分析HDI後血漿FVIII活性，且結果列於表17及圖5中。相較於野生型BDD-FVIII，所有含有XTEN之DNA構築體皆在HDI後24小時產生顯著較高的FVIII血漿活性，從而指示相應分子之循環蛋白質半衰期顯著長於BDD-FVIII。在血友病動物中進一步評估彼等半衰期延長元件之組合之應用。
流體動力學注射：
流體動力學注射為一種在諸如小鼠及大鼠之小動物中高效且安全地向肝傳遞非病毒基因之方法。其最初被描述為在約5-7秒內在動物體重之十分之一體積下快速注射不含內毒素之裸質體DNA/生理食鹽水溶液。裸質體DNA含有相關基因且肝產生於動物體重之十分之一體積中。目標蛋白質在肝中由所注射DNA產生且可在注射後24小時內偵測到。接著收集血漿樣品以研究所表現蛋白質之治療性質。
對於本文進行之所有流體動力學注射，在約4-7秒內經由靜脈內尾靜脈注射將2ml含質體DNA之0.9%無菌生理食鹽水溶液傳遞至體重為20-35公克之小鼠體內。持續前2小時密切監測小鼠直至恢復正常活動。在經由眶後血液收集法收集血液樣品之後，接著獲得血漿樣品且儲存在-80℃下以供進一步分析。
實例5：含有XTEN插入之FVIIIFc-VWF雜二聚體之共轉染系統之質體構築(圖6)
為增加蛋白質生產產量，產生兩個用於蛋白質產生之共轉染系統，其含有三種DNA構築體。第一DNA構築體編碼FVIII-Fc融合蛋白，其中AE288 XTEN片段直接融合於FVIII重鏈之C末端且之後接有野生型FVIII輕鏈片段(pSYN-FVIII-173，圖6B)或具有R1645A/R1648A突變之FVIII輕鏈片段(pSYN-FVIII-169，圖6A)，接著使FVIII輕鏈直接融合於單一Fc片段。第二DNA構築體為編碼D'D3-Fc融合蛋白之pSYN-VWF-031(實例1)。HEK293F細胞用該兩種質體連同第三質體(PC5)一起以80：15：5比率轉染。合成之蛋白質分泌為FVIII(XTEN)Fc/D'D3Fc雜二聚體及D'D3Fc二聚體且藉由蛋白質純化使FVIII(XTEN)Fc/D'D3Fc雜二聚體與D'D3Fc二聚體分離。
pSYN-FVIII-169成熟蛋白質序列(SEQ ID NO：103)：
pSYN-FVIII-173成熟蛋白質序列(SEQ ID NO：104)：
實例6. FVIII-169/VWF-031及FVIII-173/VWF-031之蛋白質純化
使用切向流過濾(TFF)步驟對澄清之條件培養基進行緩衝液交換。接著使用兩步層析方法純化FVIII-169/VWF-031或FVIII-173/VWF-031雜二聚體。依次使用弱陰離子交換樹脂及親和層析。根據SEC-HPLC，最終純化產物具有可接受之純度。如藉由FVIII顯色分析及 A280濃度所量測，比活性與B域缺失之FVIII相容。藉由SDS-PAGE及西方墨點術確認此分子之純度及此分子各部分之存在。
實例7. 藉由Octet分析評估FVIII-169/VWF-031之VWF結合能力
在25℃下，使用Tris結合緩衝液(50mM Tris(pH 7.2)、150mM NaCl、5mM CaCl2)，用ForteBio Octet 384儀器藉由基於生物層干涉量測術(BLI)之量測法(Octet分析)來獲得FVIII-169/VWF-031之VWF結合能力。用於測定FVIII結合之Octet分析係基於將人類范威爾邦德因子(Haematologic Technologies目錄編號HCVWF-0191)疏水性固定於APS生物感測器上，之後接著結合1.0%牛血清白蛋白(Jackson ImmunoResearch目錄編號001-000-161)。簡言之，將hvWF(20μg/mL)於Tris緩衝液中稀釋且在整個APS生物感測器上裝載600秒，從而在反應探針上產生約3.0-3.5nm結合。對照APS探針在不存在hvWF下用1.0% BSA裝載用於參照扣除。在裝載之後，所有探針皆在Tris緩衝液中培育300秒以建立新基線。隨後，將生物感測器探針在室溫下在FVIII-XTEN 169或FVIIIFc藥物(0、0.6、2、6、20、60、200、600IU/mL)之溶液中培育5分鐘，隨後進行5分鐘解離步驟。使用Octet資料分析軟體，由經扣除資料(反應探針減去參照探針)獲得結合反應(nm)。未偵測到FVIII-169/VWF-031 與固定VWF之結合(圖7)，從而指示FVIII由D'D3片段完全遮蔽而免於與全長VWF分子結合。
實例8. FVIII-169/VWF-031在HemA及FVIII/VWF DKO小鼠中之PK
在HemA及FVIII/VWF DKO小鼠中測試FVIII-169/VWF-031之PK概況以評估D'D3片段遮蔽FVIII部分以免與內源性VWF結合之能力。HemA或FVIII/VWF DKO小鼠用200IU/kg單次靜脈內劑量之FVIII-169/VWF-031處理，接著在給藥後5分鐘、8小時、24小時、48小時及72小時收集血漿樣品。藉由FVIII顯色分析測試血漿樣品之FVIII活性，且使用WinNonlin程式計算FVIII-169/VWF-031之半衰期。
對於FVIII-169/VWF-031，藉由生物層干涉量測術(圖7)證明完全抑制構築體與固定VWF之結合。此指示分子中之D'D3片段已成功阻斷FVIII與天然VWF分子之結合，因此，預期FVIII-169/VWF-031在兩種不同小鼠品系中之半衰期類似。如圖8A及表18中所示，如所預期，FVIII-169/VWF-031在HemA小鼠與FVIII/VWF DKO小鼠兩者中具有類似PK概況，從而證明FVIIIFc/VWF雜二聚體之半衰期與內源性VWF之半衰期無關。 FVIIIFc/VWF雜二聚體半衰期與內源性VWF半衰期之分離消除了FVIII延長最高限度且開闢進一步延長FVIII半衰期超過由內源性VWF造成之2倍半衰期限制的可能 性。
藉由比較FVIII-169/VWF-031與FVIII-169/Fc及FVIIIFc在FVIII/VWF DKO小鼠中之半衰期來評估XTEN插入及D'D3片段之FVIII保護能力。在單次靜脈內投藥之後，對於FVIII-169/VWF-031，在5分鐘、8小時、24小時、48小時及72小時收集血液樣品，對於FVIII-169/Fc，在5分鐘、8小時、24小時、32小時、48小時收集血液樣品，且對於FVIIIFc，在5分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時及8小時收集血液樣品。藉由FVIII顯色分析測試血漿樣品之FVIII活性，且使用WinNonlin程式計算FVIII-155/VWF-031之半衰期。
研究結果概述於圖8B及表19中，由於VWF保護喪失，rFVIIIFc在DKO小鼠中具有1.6小時之半衰期。當將XTEN插入引入FVIIIFc分子中時，所得FVIII-169/Fc分子具有7小時半衰期，半衰期因XTEN插入而延長4倍。最後，當將D'D3片段併入分子中以形成FVIII-169/VWF-031時，觀測到17小時半衰期，由D'D3片段再進一步增加2.5倍。除半衰期改良之外，如表19中所 示，亦觀測到平均滯留時間(MRT)、清除率(Cl)及AUC改良。
FVIII-169/VWF-031已在HemA小鼠與FVIII/VWF DKO小鼠兩者中達成17-18小時t1/2，此為由VWF清除造成之t1/2延長最高限度之上限。此分子中可進一步併入更多t1/2延長元件，諸如FVIII內之第二XTEN插入。D'D3片段與XTEN插入之協同效應提供完全保護FVIII免遭其清除路徑之可能性，最終突破2倍FVIII t1/2延長限制可能藉由FVIIIFc/XTEN/VWF變異體達成。
實例9：FVIII-XTEN變異體細胞培養基濃縮物在D'D3表現FVIII/VWF DKO小鼠中之PK
在D'D3表現FVIII/VWF DKO小鼠模型(實例2中所述)中評估D'D3片段延長FVII-XTEN之t1/2的能力。在此研究中，替代使用VWF-025將D'D3二聚體引入循環中，改為使用VWF-029構築體將D'D3單體引入循環中。為製備FVIII-XTEN變異體蛋白質，在轉染後第4天製備小規模(50-100mL)短暫轉染培養基，收集細胞培養物且濃縮以達到適於PK研究之FVIII活性範圍10-20 IU/mL。接著使用濃縮細胞培養基用於在循環中有或無D'D3之FVIII/VWF DKO小鼠中進行標準PK研究。
在系統中測試總計6個含有1-3個XTEN插入之FVIII-XTEN變異體，其t1/2概述於表20中且來自代表性變異體之資料繪製於圖9A中。
觀測到在循環中存在D'D3片段時，所有FVIII-XTEN變異體之半衰期皆較長(表20)，此證明D'D3保護FVIII-XTEN免遭其清除路徑。此外，當與其在HemA小鼠中之14小時半衰期比較時，LSD0055.021在D'D3表現DKO小鼠中具有20.4小時t1/2(圖9B，表20)，指示最終突破FVIII分子之2倍半衰期延長最高限度。藉由進一步修飾FVIII(XTEN)/VWF分子，吾人可潛在達成甚至更長之FVIII t1/2，且提供HemA患者僅需要每週一次或更小頻率給藥方案之FVIII蛋白質。
實例10：含有VWF之FVIII變異體及含有XTEN之FVIII變異體在FVIII/VWF雙重基因剔除(DKO)血漿中之穩定性
測試rFVIIIFc蛋白質變異體在FVIII/VWF雙重基因剔除(DKO)小鼠血漿中之血漿穩定性。對於穩定性分析，將HEK293細胞用引導rFVIIIFc或FVIII-169(在B域接合點處插入288 AE XTEN之rFVIIIFc)表現之質體及引導IgG-Fc或VWF-031(融合於IgG-Fc之VWF D'D3區)表現之質體共轉染。在轉染後第四天，收集細胞培養基且基於FVIII顯色活性濃縮至30IU/ml。接著添加濃縮細胞培養基至DKO小鼠血漿中以產生5IU/mL之FVIII活性且在37℃下培育。在不同時間點收集等分試樣以藉由顯色分析量測活性。一式兩份量測在各時間點之活性且將平均活性作為時間之函數繪圖。FVIIIFc(雙鏈(dc)FVIII分子，其中重鏈及輕鏈係藉由非共價相互作用保持在一起)在DKO小鼠血漿中之活性均隨時間降低(圖10)。相對於rFVIIIFc，在B域接合點處含有288 AE XTEN插入之FVIII-169：Fc之活性以減小之速率衰減，從而指示由XTEN插入賦予增強之穩定性。鑒於已提出VWF會增強FVIII之活體內穩定性，吾人評估FVIII-169：VWF-031之血漿穩定性。FVIII元件及VWF D'D3元件融合於Fc之各別半域之此雜二聚分子相對於FVIII-169：Fc展現附加血漿穩定性，從而指示VWF D'D3域及XTEN對rFVIIIFc之血漿穩定性具有協同效應。
實例11：Fc融合、XTEN插入及VWF之D'D3片段對FVIII半衰期之影響
為評估Fc融合、XTEN插入及VWF之D'D3片段對FVIII之半衰期之影響，在FVIII/VWF雙重基因剔除(DKO)小鼠中評估B域缺失之重組FVIII(rBDD-FVIII)、rFVIIIFc、FVIII-169：Fc及FVIII-169：VWF-031之藥物動力學性質。
DKO小鼠以單次靜脈內投與200IU/kg之FVIII蛋白質進行處理，且在如圖11中所指示之指定時間點收集血漿樣品。藉由FVIII顯色分析來分析血漿樣品之FVIII活性且使用WinNonlin-Phoenix程式計算半衰期。所測試分子之藥物動力學參數列於表21中。各FVIII變異體之血漿FVIII活性之時間回歸曲線繪製於圖11中。
未修飾BDD-FVIII在DKO小鼠中具有0.23小時之半衰期，由於FVIIIFc蛋白質經由Fc：FcRn相互作用再循環，FVIIIFc融合蛋白在DKO小鼠中具有1.66小時之延長半衰期。當將288個殘基之AEXTEN多肽併入FVIIIFc分子內FVIII之B域區中時，所得FVIII169/Fc蛋白質在DKO小鼠中之半衰期進一步延長至7.41小時。最後，在添加VWF之D'D3域時，FVIII169/VWF031雜二聚體在DKO小鼠中之半衰期已達到17.9小時(圖11，表21)。除半衰期之外，所有其他PK參數亦隨各元件之添加而按比例改良(表21)。FVIII可耐受多種半衰期延長元件，且三種元件對FVIII半衰期延長之此協同效應使得能夠進一步改良FVIII-XTEN VWF雜二聚體之半衰期。
實例12：不同FVIII-XTEN_VWF雜二聚體之藥物動力學性質
為評估VWF-D'D3片段及XTEN插入對FVIII半衰期之組合作用，在HemA小鼠中測試FVIII-XTEN-Fc：VWF-Fc雜二聚體之藥物動力學性質且與BDD-FVIII之單鏈同功異型物(scBDD-FVIII)及FVIII-169：VWF-031(實例10)之藥物動力學性質進行比較。產生七個新FVIII-XTEN-Fc構築體(蛋白質序列列於表24中)。彼等構築體之示意圖展示於圖14A-H中。FVIII-195及FVIII-199分別為FVIII雙鏈及單鏈同功異型物，其各自在位置1900及1656處含有兩個XTEN插入。FVIII-196及FVIII-201分別為FVIII雙鏈及單鏈同功異型物，其各自在位置26、1656及1900處含有三個XTEN插入。FVIII-203、FVIII-204及FVIII-205為在B域接合點處及分別在位置1900、403或18處具有兩個XTEN插入之sc-FVIIIFc分子。各FVIII-XTEN-Fc構築體與VWF-031一起在HEK293細胞中共表現以產生FVIII-XTEN-Fc/VWF雜二聚蛋白質。在轉染後第四天，收集細胞培養基且基於FVIII顯色活性濃 縮至20IU/mL(FVIII-195：VWF-031、FVIII-196：VWF-031、FVIII-199：VWF-031、FVIII-203：VWF-031及FVIII-204：VWF-031)或純化(scBDD-FVIII、FVIII-169：VWF-031、FVIII-201：VWF-031及FVIII-205：VWF-031)。已證明由FVIII-XTEN-Fc：VWF-Fc雜二聚體(FVIII-169：VWF-031，實例5)中之D'D3片段完全分子內遮蔽FVIII分子以免與內源性VWF結合，選擇HemA小鼠進行PK評估。藉由以200IU/10mL/kg之劑量進行靜脈內投藥來向8-12週齡HemA小鼠投與純化蛋白質或濃縮細胞培養基。在給藥後5分鐘、8小時、16小時、24小時、32小時，48小時、72小時及96小時收集血漿樣品。藉由FVIII顯色分析來分析血漿樣品之FVIII活性且使用WinNonlin-Phoenix程式計算半衰期。所測試分子之藥物動力學參數列於表22中。FVIII-XTEN-Fc/VWF-Fc變異體在所選時間點之血漿FVIII活性繪製於圖12A-C中。
當將XTEN插入位置1900及1656(FVIII-195、FVIII-199)中時，觀測到scFVIII同功異型物(FVIII-199：VWF-031)相較於FVIII-169：VWF-031，半衰期有適度改良。然而，dcFVIII同功異型物展現之半衰期短於FVIII-169：VWF-031所展現之半衰期，從而指示單鏈同功異型物可能比相應雙鏈同功異型物顯著更穩定(表22及圖12A)。當將第三XTEN在位置26處之插入併入FVIII-199中時，所得分子FVIII-201：VWF-031之半衰期已達到24.6小時，此表示相對於scBDD-FVIII，半衰期改良大於三倍 (表22及圖12C)。吾人亦已測試各自與B域XTEN插入組合之在位置403(A2域)、1900(A3域)及18(A1域)上之第二XTEN插入的半衰期延長作用。儘管添加A2或A3XTEN插入不賦予額外半衰期益處(表22，圖12b)，但添加A1插入進一步延長FVIII-XTEN-Fc：VWF-Fc雜二聚體之半衰期至29.4小時(表22，圖12C)，此大於scBDD-FVIII之半衰期三倍長。
當將XTEN併入FVIIIFc/VWF雜二聚體構築體中時，所得分子之半衰期改良程度可變化，且在半衰期與XTEN插入位點或數目之間無明顯關聯，從而表明FVIII-XTEN-Fc/VWF雜二聚體之半衰期由整個分子之完整性而非由XTEN插入之數目或位置決定。
所觀測到FVIII-XTEN-Fc：VWF-Fc雜二聚體之24.6小時及29.4小時半衰期明確超過FVIII半衰期延長之1.6至2倍限制。若此研究結果轉至HemA患者，其將允許每週一次或以更小頻率給藥來進行FVIII預防。
除將XTEN併入FVIII分子中之外，吾人亦評估將XTEN作為連接子併入在D'D3與Fc片段之間的潛在半衰期延長益處。將FVIII-155(scFVIIIFc)與VWF-034(具有AE 288 XTEN加含35個殘基之凝血酶可裂解連接子之VWF-Fc)一起共表現於HEK293細胞中。在轉染後第4天，收集細胞培養基且基於FVIII活性分析濃縮至20IU/mL。以單次靜脈內注射對FVIII/VWF DKO小鼠給與200IU/10mL/kg之濃縮細胞培養基。在給藥後5分鐘、8小時、24小時、48小時、72小時及96小時收集血漿樣品。藉由FVIII顯色分析來分析血漿樣品之FVIII活性，且繪製血漿FVIII活性隨時間變化之回歸曲線(圖13)。FVIII-155/VWF-034與具有AE 288 XTEN插入FVIII之B域接合點中之FVIII-169/VWF-031展現相同半衰期改良，如藉由兩種分子之重疊回歸曲線所說明(圖13)。對XTEN插入VWF-Fc多肽中會以與藉由在FVIII多肽之B域接合點處插入XTEN所賦予之量級類似之量級賦予半衰期改良的證明表明有可能在使FVIII多肽中分子內XTEN插入與VWF-Fc多肽之VWF與Fc元件之間域內XTEN插入相組合的雜二聚分子中進一步改良半衰期。
實例13A：其他FVIII-XTEN_VWF雜二聚體之藥物動力學性質
除表22中所列之FVIII-XTEN VWF雜二聚體之外，在或將在HemA中測試含有XTEN插入、單鏈及雙 鏈形式FVIII(表23A)之不同組成之FVIII-XTEN VWF雜二聚體的藥物動力學性質。以下亦揭露各種FVIII構築體(表23B)及VWF構築體(表23C)。HemA小鼠將以單次靜脈內投與200IU/10mL/kg劑量之雜二聚體蛋白質進行治療。接著在給藥後5分鐘、24小時、48小時、72小時、96小時及120小時收集血漿樣品。藉由FVIII顯色分析來分析血漿樣品之FVIII活性且使用WinNonlin-Phoenix程式計算半衰期。所列雜二聚體之蛋白質序列列於表25中。
實例13B：其他FVIII-XTEN_VWF雜二聚體之藥物動力學性質。
在HemA小鼠中測試FVIII-XTEN_VWF雜二聚體之藥物動力學性質。所測試之雜二聚體為FVIII169/VWF034、FVIII205/VWF034、FVIII205/VWF036及FVIII266/VWF031。向HemA小鼠投與單次靜脈內200IU/10mL/kg劑量之各種雜二聚體蛋白質。在給藥後5分鐘、24小時、48小時、72小時、96小時及120小時收集血漿樣品。藉由FVIII顯色分析來分析血漿樣品之FVIII 活性，且使用WinNonlin-Phoenix程式計算半衰期。PK結果展示於以下表24中。
pSYNFVIII 010核苷酸序列-(雙鏈FVIIIFc)(SEQ ID NO：125)
pSYNFVIII 010蛋白質序列-(雙鏈FVIIIFc)(SEQ ID NO：126)
實例14：一類在A型血友病小鼠中半衰期延長大於三倍之新凝血因子VIII分子
設計一類新FVIII分子含有兩個多肽；一個多肽由在FVIII序列內之一或多個位置處插入有XTEN之單鏈B域缺失(BDD)FVIII組成，且一個多肽由VWF之D'D3區構成。各多肽亦重組融合於IgG1之Fc區以使得D'D3區能夠恰當對準以結合FVIII部分。所得FVIII變異體藉由短暫轉染在HEK 293細胞中表現，且自條件培養基純化。藉由FVIII顯色分析評估FVIII活性且在FVIII基因剔除(HemA)小鼠與FVIII/VWF雙重基因剔除(DKO)小鼠兩者中評估藥物動力學性質。
將XTEN及VWF之D'D3區併入rFVIII中導致融合蛋白之清除與內源性VWF解除關聯同時延長其循環半衰期。呈此融合組態之FVIII被完全遮蔽而不與VWF相互作用，如藉由生物層干涉量測術(Octet)分析所量測。與此一致，發現其在HemA及DKO小鼠中之藥物動力學概況相同，從而指示其在小鼠中之清除速率與VWF有效斷開關聯。對XTEN長度及用於插入XTEN之位置之最佳化鑒別出一子組超過VWF限制(16小時)之蛋白質，其在HemA小鼠中達到長達30小時之循環半衰期，表示相比於BDD-FVIII，得到4倍改良。重要的是，此等蛋白質維持其功能性，如藉由FVIII顯色分析所判斷。
VWF依賴性對治療性FVIII之半衰期造成了根本限制。藉由融合VWF之D'D3區及XTEN來使FVIII與 VWF清除路徑解除關聯同時延長半衰期已產生了半衰期延長4倍之新穎FVIII分子。此為首次報導在長效FVIII之開發中經由全行業努力觀測到工程改造FVIII已超過半衰期限制，此表示在預防性治療A型血友病方面之潛在顯著進步。
FVIII 196蛋白質序列(在胺基酸26、1656及1900處具有三個144 AE XTEN之雙鏈FVIIIFc)(SEQ ID NO：106)
FVIII 199蛋白質序列(在胺基酸1656及1900處具有三個144 AE XTEN之單鏈FVIIIFc)(SEQ ID NO：107)
FVIII 201蛋白質序列(在胺基酸26、1656及1900處具有三個144 AE XTEN之單鏈FVIIIFc)(SEQ ID NO：108)
FVIII 203蛋白質序列(具有兩個AE XTEN之單鏈FVIIIFc；一個288AE XTEN在B域中且一個144 AE XTEN在胺基酸1900處)(SEQ ID NO：109)
FVIII 204蛋白質序列(具有兩個AE XTEN之單鏈FVIIIFc；一個288AE XTEN在B域中且一個144 AE XTEN在胺基酸403處)(SEQ ID NO：110)
FVIII 205蛋白質序列(具有兩個AE XTEN之單鏈FVIIIFc；一個288AE XTEN在B域中且一個144AE XTEN在胺基酸18處)(SEQ ID NO：111)
pSYN FVIII 266蛋白質序列(在胺基酸18處具有42 AE-XTEN且在B域中具有288 AE XTEN之FVIII Fc)SEQ ID NO：112
pSYN FVIII 267蛋白質序列(在胺基酸18處具有72 AE-XTEN且在B域中具有288AE XTEN之FVIII Fc)SEQ ID NO：113
pSYN FVIII 268蛋白質序列(在胺基酸18處具有144 AE-XTEN之FVIII Fc)SEQ ID NO：114
pSYN FVIII 269蛋白質序列(在胺基酸18處具有72 AE-XTEN之FVIII Fc)SEQ ID NO：115
pSYNFVIII 271蛋白質序列(在胺基酸18處具有42 AE-XTEN之FVIII Fc)SEQ ID NO：116
pSYN FVIII蛋白質序列272(在胺基酸18處具有144 AE XTEN且在B域中具有244 AE XTEN之FVIII-無Fc)SEQ ID NO：117
pSYN VWF 031蛋白質序列(VWF D1D2D'D3-長48 aa之凝血酶可裂解GS連接子-Fc)SEQ ID NO：118
pSYN VWF 034蛋白質序列(VWF D1D2D'D3-288AE XTEN-長35 aa之凝血酶可裂解GS連接子-Fc)SEQ ID NO：119
pSYN VWF 036蛋白質序列(VWF D1D2D'D-長98 aa之凝血酶可裂解GS連接子-Fc)SEQ ID NO：120
pSYN Fc-015蛋白質序列(IgG-Fc域)SEQ ID NO：121
實例15：FVIII-XTEN-Fc：VWF-Fc雜二聚體相較於野生型BDD-FVIII維持正常FVIII比活性。
測定FVIII-XTEN-Fc：VWF-Fc雜二聚體之FVIII比活性。使用兩步層析方法純化雜二聚體。依次使用弱陰離子交換樹脂及親和層析。根據SEC-HPLC，最終 純化產物具有可接受之純度。如藉由FVIII顯色分析及A280濃度所量測，將比活性與B域缺失之FVIII(BDD-FVIII)進行比較。資料呈現於表26中。所有所測試分子皆表明具有與BDD-FVIII類似之FVIII比活性。藉由SDS-PAGE及西方墨點術確認分子之純度及分子各部分之存在。
比較rFVIII-XTEN/D'D3與BDD-FVIII在HemA小鼠中之半衰期(圖15；表27)。如圖15所示，rFVIII-XTEN/D'D3達成之半衰期為由BDD-FVIII所達成之半衰期之四倍長。
實例16：如藉由單級aPTT分析所量測之FVIII-XTEN-Fc：VWF-Fc雜二聚體之止血效能(FVIII活性)
如表28中所概述藉由FVIII-XTEN-Fc：VWF-Fc雜二聚體之FVIII比aPTT活性來評估其止血效能。如藉由表28所示，儘管向FVIII之內域中添加VWF D'D3片段及插入XTEN會降低雜二聚體之FVIII比aPTT活性(如藉由FVIII155/VWF031資料及FVIII205/VWF031資料所指示)，但在FVIIIB域區中或在VWF D'D3片段之C末端插入XTEN對FVIII比aPTT活性沒有負面影響(如藉由FVIII169/VWF031資料及FVIII169/VWF034資料所指示)。相較於雙鏈BDD-FVIII(dcBDD-FVIII)，FVIII155/VWF031、FVIII169/VWF031、FVIII169/VWF034及VWF205/VWF031顯示比aPTT活性分別降低2.5倍、2.8倍、2.6倍及5.5倍。
FVIII比aPTT分析
將FVIII變異體用aPTT緩衝液(0.15M NaCl、0.05M Tris-HCl、1% BSA，pH 7.4)稀釋至線性分析範圍(200-1.6mU/mL)。將50μL稀釋樣品或標準物依序與50μL 37℃天然人類HemA匯合血漿、50μL 37℃ aPTT試劑(ACTIN® FSL活化腦透明質(cephaloplastin)試 劑-Dade Behring，參考編號B4219-2)混合且在37℃下培育4分鐘。接著添加50μl 20mM CaCl2(Dade Behring[參考編號ORFO37])至反應混合物中以起始凝結反應。使用各樣品之凝結時間(自添加CaCl2直至開始形成凝塊之時長)，相對於用第8國際標準FVIII濃縮物產生之標準來計算aPTT活性。相對於各分子之藉由OD280量測之蛋白質濃度計算比aPTT活性。
實例17：FVIII-XTEN-Fc：VWF-Fc雜二聚體在HemA小鼠尾夾放血模型中之活體內功效
為進一步獲得雜二聚體之止血效能，以與BDD-FVIII進行比較之方式在HemA小鼠尾夾放血模型中評估FVIII169/VWF034及FVIII205/VWF031之急性功效。將HemA小鼠用單次靜脈內注射200、65及20IU/kg之BDD-FVIII進行處理以產生尾夾損傷後失血對照量。將用200IU/kg之FVIII169/VWF034或FVIII205/VWF031處理之小鼠之失血量與BDD-FVIII處理對照組之失血量進行比較以估計其止血效能。使用媒劑處理動物來產生模型之失血基線。如圖16中所示，相較於媒劑處理動物之失血量，觀測到所有FVIII處理組之失血量皆顯著降低(p<0.05)。FVIII169/VWF034與FVIII205/VWF031兩者在HemA小鼠尾夾模型中均有效。相較於BDD-FVIII，觀測到FVIII169/VWF034之效能低約3倍，如藉由由65IU/kg BDD-FVIII及200IU/kg FVIII169/VWF034達成之類似失 血量降低所證明。就FVIII205/VWF034而言，已觀測到10倍效能降低，如藉由由20IU/kg BDD-FVIII及200IU/kg FVIII205/VWF031達成之類似失血量降低所證明。
即使FVIII69/VWF034及FVIII205/VWF031相較於rBDD-FVIII具有類似比FVIII顯色活性，但其FVIII aPTT活性與活體內效能兩者均由於對分子之修飾而降低。彼等資料指示FVIII分子之aPTT活性對於預測其活體內止血效能而言為比FVIII顯色活性更準確的量測結果。
HemA小鼠尾夾放血模型
使用8-10週齡雄性HemA小鼠進行研究。在尾夾損傷之前，用50mg/kg克他明(Ketamine)/0.5mg/kg右旋美托咪啶(Dexmedetomidine)混合物麻醉小鼠且置放在37℃加熱板上以幫助維持體溫。接著將小鼠之尾巴浸漬在37℃水中10分鐘以擴張側靜脈。在靜脈擴張之後，經由尾靜脈注射rFVIII或媒劑溶液且5分鐘後，使用具有直緣之11號解剖刀切除遠端1cm尾巴。將流出血液收集至13ml 37℃溫熱生理食鹽水中持續30分鐘且接著藉由雙側開胸術在仍然處於麻醉下時對小鼠實施安樂死。在收集血液之前及之後藉由血液收集管之重量變化(以公克計)來以重量分析方式定量失血，該重量變化轉換成失血體積之毫升數(mL)(1g重量變化=1mL失血)。
上文對特定實施例之描述將充分揭示本發明 之一般特性以致他人可在不脫離本發明之一般概念下，不進行過度實驗即可藉由應用此項技術技能範圍內之知識而容易地修改及/或改適對此等特定實施例進行各種應用。因此，基於本文呈現之教示及指導，意欲此等改適及修改在所揭露實施例之等效物的含義及範圍內。應瞭解本文之措辭或術語係出於描述而非限制之目的，因此本說明書之術語或措辭應由熟練技術人員根據教示及指南來解釋。
本發明之其他實施例對於熟習此項技術者而言將藉由考慮本文揭露之本發明之說明書及實施而變得顯而易知。意欲說明書及實例被視為僅具有示範性，且本發明之真實範疇及精神由以下申請專利範圍指示。
本文引用之所有專利及公開案皆以全文引用的方式併入本文中。
<110> 拜健艾克麻州股份有限公司(Biogen Idec MA Inc.) 亞穆尼克斯營運公司(Amunix Operating Inc.)
<120> 因子VIII與XTEN及范威爾邦德(VON WILLEBRAND)因子蛋白質之複合物及其用途
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<221> misc_feature
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<223> VWF信號肽
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<222> (23)..(763)
<223> VWF D1D2區域
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<223> VWF D’域
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<223> VWF D3域
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<223> VWF A1域
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<221> misc_feature
<222> (2016)..(2016)
<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸
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<220>
<223> 裂解位點
<400> 49
<210> 50
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 裂解位點
<400> 50
<210> 51
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分選酶識別基元
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸
<400> 51
<210> 52
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽
<400> 52
<210> 53
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽
<400> 53
<210> 54
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽
<400> 54
<210> 55
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽
<400> 55
<210> 56
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽
<400> 56
<210> 57
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<220>
<221> REPEAT
<222> (1)..(4)
<223> 重複1至100次
<400> 57
<210> 58
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<220>
<221> REPEAT
<222> (1)..(3)
<223> 可重複1至100次
<220>
<221> REPEAT
<222> (4)..(8)
<223> 可重複1至100次
<400> 58
<210> 59
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 59
<210> 60
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 60
<210> 61
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 61
<210> 62
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 62
<210> 63
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 63
<210> 64
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<220>
<221> REPEAT
<222> (1)..(5)
<223> 可重複1-20次
<400> 64
<210> 65
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 裂解位點
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> 裂解位點
<400> 65
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 裂解位點
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> 裂解位點
<400> 66
<210> 67
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 裂解位點
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> 裂解位點
<400> 67
<210> 68
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 裂解位點
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> 裂解位點
<400> 68
<210> 69
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 裂解位點
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> 裂解位點
<400> 69
<210> 70
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 裂解位點
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> 裂解位點
<400> 70
<210> 71
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 裂解位點
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> 裂解位點
<400> 71
<210> 72
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 裂解位點
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> 裂解位點
<400> 72
<210> 73
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 裂解位點
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> 裂解位點
<400> 73
<210> 74
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 裂解位點
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> 裂解位點
<400> 74
<210> 75
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 裂解位點
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> 裂解位點
<400> 75
<210> 76
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 裂解位點
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> 裂解位點
<400> 76
<210> 77
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 裂解位點
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> 裂解位點
<400> 77
<210> 78
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 裂解位點
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> 裂解位點
<400> 78
<210> 79
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 裂解位點
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(7)
<223> 裂解位點
<400> 79
<210> 80
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 裂解位點
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> 裂解位點
<400> 80
<210> 81
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 裂解位點
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(7)
<223> 裂解位點
<400> 81
<210> 82
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 裂解位點
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> 裂解位點
<400> 82
<210> 83
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 裂解位點
<400> 83
<210> 84
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 裂解位點
<400> 84
<210> 85
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 裂解位點
<400> 85
<210> 86
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 裂解位點
<400> 86
<210> 87
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 裂解位點
<400> 87
<210> 88
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 裂解位點
<400> 88
<210> 89
<211> 1896
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FVIII 198
<400> 89
<210> 90
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ESC48-Fwd-VWF-D’D3，具有VIII信號及BsiW1位點
<400> 90
<210> 91
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ESC51-Rev-VWF D’D3(1-477胺基酸)，具有6His及Not 1位點
<400> 91
<210> 92
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ESC 89-fwd，具有Nhe1位點
<400> 92
<210> 93
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ESC 91-rev，具有Sal1
<400> 93
<210> 94
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 94
<210> 95
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LW 22-FWD-VWF-D’D3，具有FVIII信號序列及BsiW1位點
<400> 95
<210> 96
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LW 23-Rev-Fc，具有終止密碼子及Not1位點
<400> 96
<210> 97
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LW24-Fwd-VWF D1D2D’D3選殖寡聚物，具有BsiW1位點
<400> 97
<210> 98
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LW27-Rev-VWF D’D3寡聚物，具有EcoRV
<400> 98
<210> 99
<211> 1240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VWF-D1D2D’D3蛋白質序列1
<400> 99
<210> 100
<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VWF-D’D3蛋白質序列2
<400> 100
<210> 101
<211> 2754
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pSYN-FVIII-161
<400> 101
<210> 102
<211> 2242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pSYN-FVIII-170蛋白質序列
<400> 102
<210> 103
<211> 1959
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pSYN-FVIII-169成熟蛋白質序列
<400> 103
<210> 104
<211> 1959
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pSYN-FVIII-173成熟蛋白質
<400> 104
<210> 105
<211> 1984
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FVIII 195蛋白質序列
<400> 105
<210> 106
<211> 2134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FVIII 196蛋白質序列
<400> 106
<210> 107
<211> 1984
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FVIII 199蛋白質序列
<400> 107
<210> 108
<211> 2134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FVIII 201蛋白質序列
<400> 108
<210> 109
<211> 2128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FVIII 203蛋白質序列
<400> 109
<210> 110
<211> 2128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FVIII 204蛋白質序列
<400> 110
<210> 111
<211> 2128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FVIII 205蛋白質序列
<400> 111
<210> 112
<211> 2020
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pSYN FVIII 266蛋白質序列
<400> 112
<210> 113
<211> 2056
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pSYN FVIII 267蛋白質序列
<400> 113
<210> 114
<211> 1834
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pSYN FVIII 268蛋白質序列
<400> 114
<210> 115
<211> 1762
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pSYN FVIII 269蛋白質序列
<400> 115
<210> 116
<211> 1726
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pSYNFVIII 271蛋白質序列
<400> 116
<210> 117
<211> 1901
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pSYN FVIII蛋白質序列272
<400> 117
<210> 118
<211> 1515
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pSYN VWF 031蛋白質序列
<400> 118
<210> 119
<211> 1778
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pSYN VWF 034蛋白質序列
<400> 119
<210> 120
<211> 1565
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pSYN VWF 036蛋白質序列
<400> 120
<210> 121
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pSYN Fc-015蛋白質序列
<400> 121
<210> 122
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽
<400> 122
<210> 123
<211> 1240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VWF-D1D2D’D3
<400> 123
<210> 124
<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VWF-D’D3
<400> 124
<210> 125
<211> 5055
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pSYNFVIII 010
<400> 125
<210> 126
<211> 1684
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pSYNFVIII 010
<400> 126
<210> 127
<211> 78
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AE72 XTEN
<400> 127
<210> 128
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AE144_2A
<400> 128
<210> 129
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AE144_3B
<400> 129
<210> 130
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AE144_4A
<400> 130
<210> 131
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AE144_5A
<400> 131
<210> 132
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AE144_6B
<400> 132
<210> 133
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AG144_A
<400> 133
<210> 134
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AG144_B
<400> 134
<210> 135
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AG144_C
<400> 135
<210> 136
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AG144_F
<400> 136
<210> 137
<211> 288
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AE288_2
<400> 137
<210> 138
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 138
<210> 139
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<220>
<221> REPEAT
<222> (1)..(5)
<223> 可重複1至10次
<400> 139
<210> 140
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<220>
<221> REPEAT
<222> (2)..(6)
<223> 可重複1至10次
<400> 140

Claims (49)

  1. 一種嵌合蛋白，其包含(i)包含VWF之D'域及D3域之范威爾邦德因子(von Willebrand Factor，VWF)片段，(ii)延長長度多肽(XTEN)，(iii)因子VIII(FVIII)蛋白質，(iv)第一Ig恆定區或其部分，及(v)第二Ig恆定區或其部分，其中該VWF片段及該XTEN藉由視情況選用之連接子來連接，其中該XTEN或該VWF片段係與該第一Ig恆定區或其部分連接，其中該FVIII蛋白質係與該第二Ig恆定區或其部分連接，且其中該第一Ig恆定區或其部分係藉由共價鍵與該第二Ig恆定區或其部分連接或締合。
  2. 如申請專利範圍第1項之嵌合蛋白，其包含(a)含有該VWF片段、該XTEN、該第一Ig恆定區或其部分、該第二Ig恆定區或其部分及該FVIII蛋白質之單一多肽鏈；或(b)第一多肽鏈及第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含VWF片段、該XTEN、及該第一Ig恆定區或其部分，且該第二多肽鏈包含該FVIII蛋白質及該第二Ig恆定區或其部分。
  3. 如申請專利範圍第1項之嵌合蛋白，其包含含選自由下列所組成之群組之式：(a)V-L2-X-L1-F1：FVIII-L3-F2；(b)V-L2-X-L1-F1：F2-L3-FVIII；(c)F1-L1-X-L2-V：FVIII-L3-F2；(d)F1-L1-X-L2-V：F2-L3-FVIII；(e)V-L2-X-L1-F1-L4-FVIII-L3-F2；(f)F2-L3-FVIII-L4-F1-L1-X-L2-V；(g)FVIII-L3-F2-L4-V-L2-X-L1-F1；及(h)F1-L1-X-L2-V-L4-F2-L3-FVIII，其中V包含該VWF片段；L1、L2及L3各自包含視情況選用之連接子；L4為視情況選用之連接子；FVIII包含該FVIII蛋白質；X包含該XTEN；F1包含該第一Ig恆定區或其部分；F2包含該第二Ig恆定區或其部分；(-)為肽鍵或一或多個胺基酸；且(：)為共價鍵。
  4. 如申請專利範圍第1項之嵌合蛋白，其中該第一Ig恆定區或其部分包含第一Fc區。
  5. 如申請專利範圍第1項之嵌合蛋白，其中該第一Ig恆定區或其部分藉由連接子連接於該XTEN。
  6. 如申請專利範圍第5項之嵌合蛋白，其中該第一Ig恆定區或其部分與該XTEN之間的該連接子包含可裂解連接子。
  7. 如申請專利範圍第1項之嵌合蛋白，其中該第二Ig恆定區或其部分包含第二Fc區。
  8. 如申請專利範圍第7項之嵌合蛋白，其中該第二Fc區藉由連接子進一步連接於該第一Fc區。
  9. 如申請專利範圍第1項之嵌合蛋白，其中該共價鍵為二硫鍵。
  10. 如申請專利範圍第1項之嵌合蛋白，其中相較於無該VWF片段之FVIII蛋白質或野生型FVIII，該FVIII蛋白質之半衰期得到延長。
  11. 如申請專利範圍第1項之嵌合蛋白，其進一步包含第二XTEN，該第二XTEN緊靠該FVIII蛋白質中一或多個插入位點之下游插入。
  12. 如申請專利範圍第1項之嵌合蛋白，其包含含選自由下列所組成之群組之式：(1)FVIII(X1)-L1-F1：V-L2-X2-L3-F2；(2)FVIII(X1)-L1-F1：F2-L3-X2-L2-V；(3)F1-L1-FVIII(X1)：V-L2-X2-L3-F2；(4)F1-L1-FVIII(X1)F2-L3-X2-L2-V；(5)FVIII(X1)-L1-F1-L4-V-L2-X2-L3-F2；(6)FVIII(X1)-L1-F1-L4-F2-L3-X2-L2-V；(7)F1-L1-FVIII(X1)-L4-V-L2-X2-L3-F2，或(8)F1-L1-FVIII(X1)-L4-F2-L3-X2-L2-V，其中FVIII(X1)包含該FVIII蛋白質及第二XTEN，其中該第二XTEN連接於該FVIII蛋白質之N末端或C末端或緊靠該FVIII蛋白質中之一或多個胺基酸(「一或多個插入位點」)之下游插入；L1、L2或L3各自包含視情況選用之連接子；L4為連接子；X2包含該XTEN；F1包含該第一Ig恆定區或其部分；F2包含該第二Ig恆定區或其部分，且V包含該VWF片段；(-)為肽鍵或一或多個胺基酸；且(：)包含共價鍵。
  13. 如申請專利範圍第12項之嵌合蛋白，其中該第二XTEN係插入於該FVIII蛋白質中之一或多個插入位點內，該一或多個插入位點選自由表7、表8、表9及表10中之胺基酸殘基組成之群。
  14. 如申請專利範圍第1項之嵌合蛋白，其中該VWF片段不結合VWF清除受體或能夠保護該FVIII蛋白質免遭一或多種蛋白酶裂解、保護該FVIII蛋白質免遭活化、穩定化該FVIII蛋白質之重鏈及/或輕鏈、或阻止該FVIII蛋白質由一或多種清除受體清除。
  15. 如申請專利範圍第1項之嵌合蛋白，其中該第一Ig恆定區或其部分及該第二Ig恆定區或其部分相同或不同。
  16. 一種嵌合蛋白，其包含第一多肽鏈及第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含包括VWF之D’域及D3域之VWF片段、XTEN及第一Ig恆定區或其部分且該第二多肽鏈包含FVIII蛋白質及第二Ig恆定區或其部分，且其中該第一Ig恆定區或其部分經由共價鍵與該第二Ig恆定區或其部分連接或締合。
  17. 一種嵌合蛋白，其包含第一多肽鏈及第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含包括VWF之D’域及D3域之VWF片段、第一XTEN及第一Ig恆定區或其部分，且該第二多肽鏈包含FVIII蛋白質、第二XTEN及第二Ig恆定區或其部分，其中該第一Ig恆定區或其部分經由共價鍵與該第二Ig恆定區或其部分連接或締合，且其中該第二XTEN連接於該FVIII蛋白質之C末端或N末端或緊靠該FVIII蛋白質中之一或多個插入位點之下游插入。
  18. 一種嵌合蛋白，其包含第一多肽鏈、第二多肽鏈及第三多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含包括VWF之D’域及D3域之VWF片段、XTEN及第一Ig恆定區或其部分，該第二多肽鏈包含該FVIII蛋白質之輕鏈及第二Ig恆定區或其部分，且該第三多肽鏈包含FVIII蛋白質之重鏈，其中該第一Ig恆定區或其部分經由共價鍵與該第二Ig恆定區或其部分連接或締合，且其中該FVIII蛋白質之輕鏈與該FVIII蛋白質之重鏈連接或締合。
  19. 一種嵌合蛋白，其包含第一多肽鏈、第二多肽鏈及第三多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含包括VWF之D’域及D3域之VWF片段、第一XTEN及第一Ig恆定區或其部分，該第二多肽鏈包含該FVIII蛋白質之輕鏈及第二Ig恆定區或其部分，且該第三多肽鏈包含FVIII蛋白質之重鏈及第二XTEN，其中該第一Ig恆定區或其部分經由共價鍵與該第二Ig恆定區或其部分連接或締合，其中該第二XTEN序列連接於該FVIII蛋白質之該重鏈之C末端或N末端或緊靠該FVIII蛋白質中之一或多個插入位點之下游插入，且其中該FVIII蛋白質之輕鏈與該FVIII蛋白質之重鏈連接或締合。
  20. 如申請專利範圍第16項之嵌合蛋白，其中該FVIII蛋白質連接於至少兩個XTEN、至少三個XTEN、至少四個XTEN、至少五個XTEN或至少六個XTEN。
  21. 如申請專利範圍第16項之嵌合蛋白，其中該第二XTEN插入於該FVIII蛋白質中之一或多個插入位點內，該一或多個插入位點選自由表7、表8、表9及表10中之胺基酸殘基組成之群。
  22. 如申請專利範圍第17項之嵌合蛋白，其中該第二XTEN插入於該FVIII蛋白質中之一或多個插入位點內，該一或多個插入位點選自由表7、表8、表9及表10中之胺基酸殘基組成之群。
  23. 如申請專利範圍第18項之嵌合蛋白，其中該第二XTEN插入於該FVIII蛋白質中之一或多個插入位點內，該一或多個插入位點選自由表7、表8、表9及表10中之胺基酸殘基組成之群。
  24. 如申請專利範圍第19項之嵌合蛋白，其中該第二XTEN插入於該FVIII蛋白質中之一或多個插入位點內，該一或多個插入位點選自由表7、表8、表9及表10中之胺基酸殘基組成之群。
  25. 如申請專利範圍第1項之嵌合蛋白，其中該FVIII蛋白質包含B域或其部分或不包含B域。
  26. 如申請專利範圍第1項之嵌合蛋白，其中該FVIII蛋白質為SQ B域缺失之FVIII。
  27. 如申請專利範圍第11項之嵌合蛋白，其中該FVIII多肽鏈包含B域或其部分，且其中該第二XTEN係插入該B域或其部分內。
  28. 如申請專利範圍第17項之嵌合蛋白，其中該FVIII多肽鏈包含B域或其部分，且其中該第二XTEN係插入該B域或其部分內。
  29. 如申請專利範圍第1項之嵌合蛋白，其中該FVIII蛋白質包含單鏈FVIII或雙鏈FVIII。
  30. 如申請專利範圍第29項之嵌合蛋白，其中該單鏈FVIII在對應於全長成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基1645、殘基1648或兩者或SQ BDDFVIII(SEQ ID NO：6)之殘基751、殘基754或兩者之殘基處含有至少一個胺基酸取代。
  31. 如申請專利範圍第1項之嵌合蛋白，其中該VWF片段為單體。
  32. 如申請專利範圍第1項之嵌合蛋白，其包含至少兩個VWF片段、至少三個VWF片段、至少四個VWF片段、至少五個VWF片段或至少六個VWF片段。
  33. 如申請專利範圍第1項之嵌合蛋白，其中該VWF片段包含與SEQ ID NO：2之胺基酸764至1240至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
  34. 如申請專利範圍第33項之嵌合蛋白，其中該VWF片段基本上由SEQ ID NO：2之胺基酸764至1240組成或由SEQ ID NO：2之胺基酸764至1240組成。
  35. 如申請專利範圍第1項之嵌合蛋白，其中該VWF片段含有取代對應於SEQ ID NO：2之殘基1099、殘基1142或殘基1099與1142兩者之殘基的除半胱胺酸以外之胺基酸。
  36. 如申請專利範圍第1項之嵌合蛋白，其中該VWF片段基本上由以下組成或由以下組成：(1)VWF之D'及D3域；(2)VWF之D1、D'及D3域；(3)VWF之D2、D'及D3域；(4)VWF之D1、D2、D'及D3域；或(5)VWF之D1、D2、D'、D3及A1域。
  37. 如申請專利範圍第1項之嵌合蛋白，其中該等XTEN中之一或多者包含選自表2A的至少一個基元。
  38. 如申請專利範圍第1項之嵌合蛋白，其中該等XTEN中之一或多者係選自由AE42、AE72、AE144、AG144、AE288、AG288、AE576、AG576、AE864、AG864及其任何組合組成之群。
  39. 如申請專利範圍第38項之嵌合蛋白，其中該XTEN包含選自由下列組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：36；SEQ ID NO：37；SEQ ID NO：38；SEQ ID NO：39；SEQ ID NO：40；SEQ ID NO：41；SEQ ID NO：42；SEQ ID NO：43；SEQ ID NO：44；SEQ ID NO：127；SEQ ID NO：128；SEQ ID NO：129；SEQ ID NO：130；SEQ ID NO：131；SEQ ID NO：132；SEQ ID NO：133；SEQ ID NO：134；SEQ ID NO：135；SEQ ID NO：136；SEQ ID NO：137及其任何組合。
  40. 如申請專利範圍第39項之嵌合蛋白，其中該XTEN序列為AE144或AE288。
  41. 一種聚核苷酸或一組聚核苷酸，其編碼如申請專利範圍第1項至第40項中任一項之嵌合蛋白。
  42. 一種載體，其包含如申請專利範圍第41項之聚核苷酸或該組聚核苷酸及一或多個可操作地連接於該聚核苷酸或該組聚核苷酸之啟動子。
  43. 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第41項之聚核苷酸或該組聚核苷酸或如申請專利範圍第42項之載體。
  44. 一種醫藥組合物，其包含如申請專利範圍第1項至第40項中任一項之嵌合蛋白及醫藥學上可接受之載劑。
  45. 一種醫藥組合物，其包含如申請專利範圍第41項之聚核苷酸或該組聚核苷酸、如申請專利範圍第42項之載體、或如申請專利範圍第43項之宿主細胞及醫藥學上可接受之載劑。
  46. 一種如申請專利範圍第1項至第40項中任一項之嵌合蛋白、如申請專利範圍第41項之聚核苷酸或該組聚核苷酸、如申請專利範圍第42項之載體、如申請專利範圍第43項之宿主細胞、或如申請專利範圍第44項或第45項之組合物用於製造供防止或抑制FVIII蛋白質與內源性VWF之結合、延長或增加FVIII蛋白質之半衰期或防止或抑制FVIII蛋白質自有需要之個體中之細胞清除的藥劑之用途。
  47. 一種如申請專利範圍第1項至第40項中任一項之嵌合蛋白、如申請專利範圍第41項之聚核苷酸或該組聚核苷酸、如申請專利範圍第42項之載體、如申請專利範圍第43項之宿主細胞、或如申請專利範圍第44項或第45項之組合物用於製造供治療有需要之個體中的血友病的藥劑之用途。
  48. 一種製備嵌合蛋白之方法，其包含在適合培養基下培養如申請專利範圍第43項之宿主細胞及在該宿主細胞中表現該嵌合蛋白。
  49. 如申請專利範圍第48項之方法，其進一步包含分離該嵌合蛋白。
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