KR20190085021A - 혈우병을 치료하기 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자 폴리펩타이드 - Google Patents

혈우병을 치료하기 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자 폴리펩타이드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 혈액 응고 장애의 치료에 사용하기 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자 (VWF) 및 반감기 연장 모이어티를 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것으로서, 상기 치료가 상기 폴리펩타이드를 혈액 응고 장애를 갖고 내인성 인자 VIII (FVIII)를 갖는 대상체에 투여함을 포함하고, 여기서, 상기 폴리펩타이드를 사용한 치료 전 상기 대상체에서 내인성 FVIII의 활성 수준이 정상 사람 혈장 (NHP)에서 FVIII의 활성 수준에 상대적으로 감소되어 있고, 단, 상기 대상체 내 내인성 FVIII의 활성 수준이 정상 사람 혈장 (NHP)에서 내인성 FVIII의 활성 수준의 적어도 0.5%이고, 상기 폴리펩타이드가 내인성 FVIII에 결합할 수 있고 상기 내인성 FVIII 수준이 상기 폴리펩타이드의 투여 후 증가된다.

Description

혈우병을 치료하기 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자 폴리펩타이드
본 발명은 혈액 응고 장애의 치료를 개선하기 위한 제품 및 방법에 관한 것이다.
혈액 응고 인자의 결핍으로 유발되는 다양한 출혈성 장애들이 존재한다. 가장 흔한 장애는 혈우병 A 및 혈우병 B이고, 이는 각각 혈액 응고 인자 VIII(FVIII) 및 IX의 결핍으로부터 초래된다. 기타 공지의 출혈 장애는 폰 빌레브란트 질환(VWD: von Willebrand's disease)이다.
혈장에 있어서, FVIII는 대부분 폰 빌레브란트 인자(VWF)와의 비-공유결합적 복합체로서 존재하고, 이의 응혈 기능은 인자 X의 인자 Xa로의 인자 IXa 의존적 전환을 가속화시키는 것이다.
전형적인 혈우병 또는 혈우병 A는 유전성 출혈 장애이다. 이는 혈액 응고 FVIII의 염색체 X-관련된 결핍증으로부터 초래되고, 이는 10,000명당 1 내지 2명의 개체의 발병률로 거의 대부분 남성에게 영향을 미친다. X-염색체 결함은 이들 자신은 혈우병이 아닌 여성 보유자에 의해 전달된다. 혈우병 A의 임상학적 징후는 증가된 출혈 경향이다.
예방학적 치료를 받고 있는 중증의 혈우병 A 환자에 있어서, FVIII는 약 12 내지 14시간의 FVIII의 짧은 혈장 반감기로 인하여 주당 약 3회 정맥내(i.v.) 투여되어야만 한다. 각각의 i.v. 투여는 번거롭고, 통증과 연관되어 있으며, 특히 이는 대부분 환자 자신에 의해 또는 혈우병 A로 진단된 아동의 부모에 의해 가정에서 이루어지므로 감염의 위험을 수반한다.
따라서, 이러한 FVIII를 함유하는 약제학적 조성물이 덜 빈번하게 투여되어야만 하도록 FVIII의 반감기를 증가시키는 것이 매우 바람직할 수 있다.
세포 수용체와의 비-활성화된 FVIII의 상호작용을 감소시킴으로써(WO 03/093313 A2, WO 02/060951 A2), 중합체를 FVIII에 공유결합적으로 부착시킴으로써(WO 94/15625, WO 97/11957 및 US 4970300), FVIII의 캡슐화에 의해(WO 99/55306), 신규한 금속 결합 부위의 도입에 의해(WO 97/03193), 펩타이드성(WO 97/40145 및 WO 03/087355) 또는 디설파이드 연결(WO 02/103024A2) 중 어느 하나에 의해 A3 도메인에 A2 도메인을 공유결합적으로 부착시킴으로써 또는 A2 도메인에 A1 도메인을 공유결합적으로 부착시킴으로써(WO2006/108590) 비-활성화된 FVIII의 반감기를 연장시키기 위한 몇몇의 시도가 이루어져 왔다.
FVIII 또는 VWF의 기능적 반감기를 증진시키기 위한 다른 접근법은 FVIII의 페길화(PEGylation)(WO 2007/126808, WO 2006/053299, WO 2004/075923) 또는 VWF의 페길화(WO 2006/071801)에 의한 것이다. 페길화된 VWF의 증가된 반감기는 또한 간접적으로 혈장에 존재하는 FVIII의 반감기를 증진시킨다. 또한, FVIII의 융합 단백질들에 대해서도 기술된 바 있다(WO 2004/101740, WO2008/077616 및 WO 2009/156137).
손실되어 있거나, 기능적으로 결함이 있거나 또는 상이한 형태의 폰 빌레브란트 질환(VWD)에서만 감소된 양으로 입수가능한, VWF는 다중 생리학적 기능을 갖는 포유동물의 혈장에 존재하는 다량체성 부착성 당단백질이다. 1차 지혈동안, VWF는 혈소판 표면 상의 특정 수용체들과, 콜라겐과 같은 세포외 기질의 성분들 사이에서 매개체로서 작용한다. 또한, VWF는 응혈촉진성 FVIII을 위한 운반체 및 안정화 단백질로서 작용한다. VWF는 2813개의 아미노산 전구체 분자로서 내피세포 및 거핵세포 내에서 합성된다. 야생형 VWF의 아미노산 서열 및 cDNA 서열은 문헌[Collins et al. 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4393-4397]에 기재되어 있다. 전구체 폴리펩타이드, 프레-프로-VWF(pre-pro-VWF)는 N-말단의 22-잔기 신호 펩타이드, 이어서, 741-잔기 프로-펩타이드 및 성숙한 혈장 VWF에서 발견되는 2050-잔기 폴리펩타이드로 이루어진다(Fischer et al., FEBS Lett. 351: 345-348, 1994). 소포체 내 신호 펩타이드의 절단 후, VWF의 두 단량체들 사이에 C-말단 디설파이드 브릿지가 형성된다. 분비 경로를 통해 추가로 수송하는 동안, 12개의 N이 결합되고 10개의 O가 결합된 탄수화물 측쇄들이 부가된다. 보다 중요하게, VWF 이량체는 N-말단 디설파이드 브릿지를 통해 다량체화되고, 741개 아미노산 길이의 프로펩타이드는 후기 골지 기관(Golgi apparatus)의 효소 PACE/푸린(furin)에 의해 절단제거된다.
프로테아제 ADAMTS13은 일단 혈장 내로 분비되면, VWF의 A1 도메인 내에서 고-분자량 VWF 다량체를 절단할 수 있다. 따라서, 혈장 VWF는 500kDa의 단일 이량체부터 10,000kDa 초과의 분자량의 20개 초과의 이량체들로 이루어진 다량체까지 이르는 전체 범위의 다량체들로 이루어진다. VWF-HMWM은 이에 의해 리스토세틴 보조인자 활성(VWF:RCo)에서 측정될 수 있는 가장 강력한 지혈 활성을 갖는다. VWF:RCo/VWF 항원의 비율이 높을수록, 고분자량 다량체들의 상대적인 양도 커진다.
혈장에서 FVIII는 VWF에 높은 친화도로 결합하고, 이는 FVIII를 조기 제거(premature elimination)로부터 보호하고, 따라서 1차 지혈에서의 이의 역할에 추가하여 FVIII를 안정화시키는데 결정적인 역할을 하고, FVIII의 혈장 수준을 조절하고, 또한 결과적으로 2차 지혈을 제어하기 위한 중심 인자이다. VWF에 결합된 비-활성화 FVIII의 반감기는 혈장에서 약 12시간 내지 14시간이다. VWF가 존재하지 않거나 거의 존재하지 않는 폰 빌레브란트 질환 유형 3에서, FVIII의 반감기는 단지 약 2 내지 6시간이고, 이는 FVIII의 감소된 농도로 인하여 이러한 환자에서 경증 내지 중간 정도의 혈우병 A 증상을 유도한다. FVIII에 대한 VWF의 안정화 효과는 또한 CHO 세포에서 FVIII의 재조합 발현을 보조하는데 사용되어 왔다(Kaufman et al., 1989, Mol Cell Biol 9:1233-1242). 폰 빌레브란트 질환 유형 2N은 FVIII의 VWF로의 결합에 영향을 미치는 VWF 내 돌연변이로 인한 낮은 FVIII 수준을 특징으로 한다. VWD 유형 2N 환자에서 FVIII 수준은 VWF 내 특정 돌연변이에 의존하여 약 3 IU/dL 내지 30 IU/dL의 범위, 전형적으로 20 IU/dL 미만의 범위이다. 폰 빌레브란트 질환 유형 1은 정상의 사람 혈장에서 내인성 FVIII 활성 수준과 비교하여 감소된 내인성 FVIII 활성 수준을 특징으로 한다(문헌참조: Sadler J.E. and Blinder M., Von Willebrand Disease: Diagnosis, Classification, and Treatment; in: Hemostasis and Thrombosis, eds. Colman, Marder, Clowes, George, Aird, and Goldhaber, Lippincott Williams & Wilkins 2006, pp 905-921).
VWF-유래된 폴리펩타이드, 특히, VWF 단편은 시험관내에서 그리고 생체내에서 FVIII를 안정화시키는 것으로 기술되어 왔다. WO 2013/106787 A1은 소정 VWF 단편 및 FVIII 단백질을 포함하는 키메라 단백질에 관한 것이다. FVIII 및 VWF-단편의 이들 키메라 이종-이량체는 1:1의 VWF 대 FVIII의 고정된 몰 비를 갖는다. WO 2014/198699 A2 및 WO 2013/083858 A2는 VWF 단편 및 혈우병의 치료시의 이들의 용도를 기술한다. FVIII의 생물유용성(bioavailability)은 유사한 몰량의 VWF 단편을 사용한 혈관외 동시-투여(co-administration)시 유의하게 개선될 수 있음이 밝혀졌다. FVIII에 비해 높은 몰 과량의 VWF는 바람직하지 않다고 하였고, FVIII와 함께 s.c. 동시-투여된 VWF 단편을 이용한 실험에서, VWF 용량은 FVIII 생체 이용률에 결정적이지 않았음이 밝혀졌다. 따라서, FVIII에 비한 VWF 단편의 몰 비는 최대 50:1로 제한되었고, 바람직한 범위는 최대 1.5:1로 제한되었다. WO 2011/060242 A2는 소정 VWF 단편 및 10:1 이하의 FVIII에 대한 VWF 단편의 특정 몰 비를 제시하는 항체 Fc 영역을 포함하는 융합 폴리 펩타이드를 개시한다. WO 2013/093760 A2는 FVIII 또는 절단된 형태의 VWF를 포함하는 VWF 폴리펩타이드를 재조합체 α-2,3-시알릴트랜스퍼라제와 함께 동시-발현시킴을 포함하는, 단백질을 제조하는 방법을 기술한다. 문헌[Yee et al. (2014) Blood 124(3):445-452]은 D'D3-Fc 융합 단백질을 함유하는 VWF 단편이 VWF-결핍 마우스에서 인자 VIII를 안정화시키는데 충분함을 밝힌다. 그러나, VWF D'D3-Fc 융합 단백질은 FVIII-결핍 마우스에 수혈되는 경우에 현저하게 연장된 생존을 나타냈지만, VWF D'D3-Fc 융합 단백질은 동시-수혈된 FVIII의 생존을 연장시키지 않았다.
투여 빈도가 감소된 FVIII 및 FVIII 생성물의 반감기를 증가시키는 방법이 지속적으로 요구되고 있다.
발명의 요약
내인성 인자 VIII의 생체내 반감기는 절단되고(truncated) 반감기 연장된 VWF 폴리펩타이드(본 발명의 폴리펩타이드)의 투여에 의해 연장될 수 있음이 본 발명자들에 의해 밝혀졌다. 내인성 인자 VIII의 생체내 반감기가 심지어 외인성 FVIII의 동시-투여 없이도 본 발명의 상기 폴리펩타이드의 투여에 의해 연장될 수 있음이 또한 밝혀졌다. 환자들은 상기 폴리펩타이드를 사용한 치료 전에 정상 사람 혈장 (NHP)에서의 FVIII의 수준에 상대적으로 내인성 FVIII의 감소된 수준을 갖는다. 상기 환자에서 내인성 FVIII의 수준은 정상 사람 혈장 (NHP)에서 내인성 FVIII의 수준의 적어도 0.5%이다. 본 발명의 폴리펩타이드는 내인성 FVIII 수준을 상승시킬 수 있다. 이것은 외인성 FVIII의 동시 투여 없이 환자의 예방학적 치료를 가능하게 한다. 외인성 FVIII가 동시-투여되는 경우, 출혈 사건의 후속 치료는 본 발명의 폴리펩타이드만으로, 즉, 외인성 FVIII의 계속적인 동시 투여 없이 수행될 수 있다. 환자들은 외인성 FVIII의 투여에 의해 상기 대상체 내 내인성 FVIII를 제공하여 상기 내인성 인자 FVIII의 생체내 반감기를 연장시킴으로써 본 발명의 폴리펩타이드를 사용한 치료로부터 이득을 얻을 수 있음이 또한 본 발명자들에 의해 밝혀졌다.
따라서, 본 발명은 특히 하기의 구현예 [1] 내지 [91]에 관한 것이다:
[1] 혈액 응고 장애의 치료에 사용하기 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자 (VWF) 및 반감기 연장 모이어티를 포함하는 폴리펩타이드로서, 상기 치료가 상기 폴리펩타이드를 혈액 응고 장애를 갖고 내인성 인자 VIII (FVIII)를 갖는 대상체에 투여함을 포함하고, 여기서, 상기 폴리펩타이드를 사용한 치료 전 상기 대상체에서 내인성 FVIII의 활성 수준이 정상 사람 혈장 (NHP)에서 FVIII의 활성 수준에 상대적으로 감소되어 있고, 단, 상기 대상체 내 내인성 FVIII의 활성 수준이 정상 사람 혈장 (NHP)에서 내인성 FVIII의 활성 수준의 적어도 0.5%이고, 상기 폴리펩타이드가 내인성 FVIII에 결합할 수 있고 상기 내인성 FVIII 수준이 상기 폴리펩타이드의 투여 후 증가되고, 여기서,
- (i) 상기 폴리펩타이드는 출혈 사건의 예방학적 예방을 위해 투여되거나(여기서,
a) 상기 치료가 외인성 FVIII의 동시-투여를 포함하지 않거나,
b) 상기 치료가 외인성 FVIII가 투여됨으로써 상기 대상체 내 내인성 FVIII를 제공함을 포함한다),
- (ii) 상기 폴리펩타이드는 출혈 사건의 치료를 위해 또는 예방학적 치료 용법의 개시를 위해 외인성 FVIII와 함께 동시 투여되고, 여기서, 후속 치료를 위해 상기 폴리펩타이드는 외인성의 동시 투여 없이 투여되는 폴리펩타이드.
본 발명은 특히 환자가 본 발명의 폴리펩타이드에 의해 안정화될 수 있는 나머지 낮은 수준의 내인성 FVIII로부터 이득을 얻을 수 있다는 이점을 제공한다. 내인성 FVIII의 안정화는 FVIII의 보다 높은 보호 혈장 수준을 가능하게 할 수 있다. 본 발명의 특정 양상에 따라, 상기 폴리펩타이드는 임의로, 절단된 VWf 및 반감기 연장 모이어티를 포함하는 상기 폴리펩타이드의 혈관외 투여를 가능하게 한다. 추가로, 투여 빈도는 본 발명의 폴리펩타이드를 적용함에 의해 감소될 수 있다. 상기 폴리펩타이드의 투여는 생리학적 범위로 상승될 수 있거나 생리학적 범위에서 연장될 수 있는 내인성 FVIII 활성 수준의 증가를 가능하게 한다. 상기 폴리펩타이드의 투여에 의해, 병리학적 aPTT 값은 생리학적 값으로 감소될 수 있다. 외인성 FVIII는 반드시 본 발명의 치료요법에 따라 투여될 필요는 없기 때문에, FVIII에 대한 저해제의 형성 가능성은 감소될 수 있다. 따라서, 환자들은 필요한 FVIII의 동시 투여 없이도 본 발명의 폴리펩타이드를 사용한 치료로부터 이득을 얻을 수 있다.
[2] 구현예 [1]에 있어서, 상기 절단된 폰 빌레브란트 인자 (VWF)가 내인성 FVIII로의 폴리펩타이드의 결합 능력을 제공하는, 폴리펩타이드.
[3] 구현예 [1] 또는 구현예 [2]에 있어서, 상기 내인성 FVIII 수준이 정상 사람 혈장 (NHP)에서 내인성 FVIII의 활성 수준의 적어도 1%, 또는 바람직하게 적어도 2%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 100%의 수준으로 상기 폴리펩타이드의 투여 후 증가되는, 폴리펩타이드.
[4] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 절단된 폰 빌레브란트 인자 (VWF)가 사람 절단된 폰 빌레브란트 인자 (VWF)인, 폴리펩타이드.
[5] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드를 사용한 치료 전 상기 대상체에서 내인성 FVIII의 활성 수준이 NHP에서 내인성 FVIII의 활성 수준의 80% 미만, 60% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만 또는 10% 미만인, 폴리펩타이드.
[6] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체에서 내인성 FVIII의 활성 수준이 NHP에서 내인성 FVIII의 활성 수준의 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4% 또는 적어도 5%인, 폴리펩타이드.
[7] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 혈액 응고 장애가 혈우병 A 또는 폰-빌레브란트 질환, 바람직하게, 폰-빌레브란트 질환 유형 2N, 폰-빌레브란트 질환 유형 3 또는 폰-빌레브란트 질환 유형 1인, 폴리펩타이드.
[8] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 혈액 응고 장애가 치료 전 또는 치료 부재하의 내인성 FVIII 활성 수준이 전형적으로 NHP 내 내인성 FVIII 활성 수준의 1% 내지 5%의 범위에 있음을 특징으로 하는 중간 정도의 혈우병 A인, 폴리펩타이드.
[9] 구현예 [8]에 있어서, 치료 옵션 (i) 또는 치료 옵션 (ii)이 적용되는, 폴리펩타이드.
[10] 구현예 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 있어서, 상기 혈액 응고 장애가 치료 전 또는 치료 부재하의 내인성 FVIII 활성 수준이 전형적으로 NHP 내 내인성 FVIII 활성 수준의 5% 초과 및 40% 이하임을 특징으로 하는 약한 혈우병 A인, 폴리펩타이드.
[11] 구현예 [10]에 있어서, 치료 옵션 (i) 또는 치료 옵션 (ii)이 적용되는, 폴리펩타이드.
[12] 구현예 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 있어서, 상기 혈액 응고 장애가 전형적으로 치료 전 또는 치료 부재하의 내인성 FVIII 활성 수준이 일반적으로 NHP 내 내인성 FVIII 활성 수준의 약 1% 내지 약 20%에 상응하는 약 1 IU/dL 내지 20 IU/dL FVIII 활성 수준의 범위에 있음을 특징으로 하는 폰-빌레브란트 유형 3인, 폴리펩타이드. 대부분의 환자들은 10 IU/dL 미만의 내인성 FVIII 활성 수준을 갖고, 따라서 NHP에서 내인성 FVIII 활성 수준의 10% 미만의 수준을 갖는다.
[13] 구현예 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 있어서, 상기 혈액 응고 장애가 전형적으로 치료 전 또는 치료 부재하의 내인성 FVIII 활성 수준이 NHP 내 내인성 FVIII 활성 수준의 약 3% 내지 약 30%에 상응하는 약 3 IU/dL 내지 30 IU/dL FVIII 활성 수준의 범위에 있음을 특징으로 하는 폰-빌레브란트 유형 2N인, 폴리펩타이드. 대부분의 환자들은 20 IU/dL 미만의 내인성 FVIII 활성 수준을 갖고, 따라서 NHP에서 내인성 FVIII 활성 수준의 20% 미만의 수준을 갖는다. 따라서, 폰-빌레브란트 질환 유형 2N을 갖는 대상체는 혈장 내 0.03 IU/mL 내지 0.3 IU/mL, 전형적으로 0.2 IU/mL 미만의 내인성 FVIII 활성 수준을 갖는다.
[14] 구현예 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 있어서, 상기 혈액 응고 장애가 치료 전 또는 치료 부재하의 내인성 FVIII 활성 수준이 전형적으로 NHP 내 내인성 FVIII 활성 수준과 비교하여 감소되어 있음을 특징으로 하는 폰-빌레브란트 질환 유형 1인, 폴리펩타이드.
[15] 구현예 [12] 내지 [14]에 있어서, 치료 옵션 (i) 또는 치료 옵션 (ii)이 적용되는, 폴리펩타이드.
[16] 구현예 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 있어서, 치료 옵션 (i) b)가 적용되는, 폴리펩타이드.
[17] 구현예 [16]에 있어서, 상기 혈액 응고 장애가 혈우병 A인, 폴리펩타이드.
[18] 구현예 [17]에 있어서, 상기 응고 장애가 치료 전 또는 치료 부재하의 내인성 FVIII 활성 수준이 전형적으로 NHP 내 내인성 FVIII 활성 수준의 1% 미만임을 특징으로 하는 중증 혈우병 A인, 폴리펩타이드.
[19] 구현예 [17] 또는 [18]에 있어서, 상기 외인성 FVIII가 상기 폴리펩타이드의 투여 전 또는 후에 투여되거나; 상기 외인성 FVIII가 상기 폴리펩타이드와 동시에 투여되는, 폴리펩타이드.
[20] 구현예 [19]에 있어서, 상기 외인성 FVIII가 상기 폴리펩타이드 전 투여되는, 폴리펩타이드.
[21] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체가 내인성 FVIII 활성의 제공을 위해 FVIII 유전자 치료요법 또는 FVIII 유전자 전달 접근법에 의해 현재 치료 중이거나 치료받은 적이 있고 반면, 상기 내인성 FVIII 활성 수준이 바람직하게 구현예 [5]에서 정의된 바와 같은 FVIII 활성 수준 중 하나 미만인, 폴리펩타이드.
[22] 구현예 [21]에 있어서, 치료 옵션 (i) b)가 적용되고, 반면, “외인성” FVIII가 FVIII 유전자 치료요법 또는 FVIII 유전자 전달 접근법에 의해 제공되어 내인성 FVIII를 제공하는, 폴리펩타이드.
[23] 구현예 [16] 내지 [20] 중 어느 하나에 있어서, 외인성 FVIII가 투여되어 비롯된 대상체의 혈장 내 FVIII의 활성 수준 및 임의의 FVIII가 대상체에 의해 형성되는 경우 내인성으로 대상체에 의해 형성되는 대상체 혈장 내 FVIII의 활성 수준이 정상 사람 혈장 (NHP) 내 내인성 FVIII의 활성 수준의 적어도 0.5% 이도록 함께 고려되는, 폴리펩타이드. 다른 말로, 상기 구현예에 따라, 정상 사람 혈장 (NHP) 내 내인성 FVIII의 활성 수준의 적어도 0.5%인 내인성 FVIII는 외인성 FVIII, 바람직하게 이전에 투여된 FVIII 및 대상체에 의해 형성되는 내인성 FVIII로부터 기원하는 FVIII의 혼합물일 수 있거나 어떠한 FVIII가 대상체에 의해 형성되지 않는 경우에 단지 이전에 투여된 잔류하는 FVIII일 수 있다.
[24] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 정맥내 및/또는 혈관외로 투여되는, 폴리펩타이드. 혈관외 투여의 경우에, 피하 투여가 바람직하다.
[25] 구현예 [16] 내지 [23] 중 어느 하나에 있어서, 상기 외인성 FVIII가 정맥내로 투여되어, 즉 따라서 내인성 FVIII를 제공하는, 폴리펩타이드.
[26] 구현예 [25]에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 FVIII와 다른 상이한 투여 경로를 통해 투여되고, 바람직하게 상기 폴리펩타이드가 피하 투여되는, 폴리펩타이드.
[27] 구현예 [16] 내지 [25] 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 정맥내 투여되는, 폴리펩타이드.
[28] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체가 사람인, 폴리펩타이드.
[29] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 이량체인, 폴리펩타이드.
[30] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 절단된 VWF가 (a) 서열번호 4의 아미노산 776 내지 805 또는 (b) 서열번호 4의 아미노산 776 내지 805와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
[31] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 절단된 VWF가 (a) 서열번호 4의 아미노산 766 내지 864 또는 (b) 서열번호 4의 아미노산 766 내지 864와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
[32] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 절단된 VWF가 서열번호 4의 아미노산 764 내지 1242를 포함하는, 폴리펩타이드.
[33] 이전의 구현예 중 어느 한 하나에 있어서, 상기 절단된 VWF가 (a) 서열번호 4의 아미노산 764 내지 1242, (b) 서열번호 4의 아미노산 764 내지 1242와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 (c) (a) 또는 (b)의 단편으로 이루어진, 폴리펩타이드.
[34] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 절단된 VWF에 서열번호 4의 아미노산 1243 내지 2813이 결여되어 있는, 폴리펩타이드.
[35] 이전의 구현예 중 어느 한 하나에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티가 상기 절단된 VWF에 융합된 이종성 아미노산 서열인, 폴리펩타이드.
[36] 구현예 [35]에 있어서, 상기 이종성 아미노산 서열이 트랜스페린 및 이들의 단편, 사람 융모성 고나도트로핀의 C-말단 펩타이드, XTEN 서열, 동종-아미노산 반복체(HAP), 프롤린-알라닌-세린 반복체(PAS), 알부민, 아파민, 알파-태아단백질, 비타민 D 결합 단백질, 생리학적 조건 하에 알부민 또는 면역글로불린 불변 영역에 결합할 수 있는 폴리펩타이드, 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 결합할 수 있는 폴리펩타이드, 특히 면역글로불린 불변 영역 및 이의 일부, 바람직하게 면역글로불린의 Fc 부분 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 폴리펩타이드를 포함하거나 이러한 폴리펩타이드로 이루어진, 폴리펩타이드. 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분은 바람직하게 면역글로불린 G1의 Fc 단편, 면역글로불린 G2의 Fc 단편 또는 면역글로불린 A의 Fc 단편이다.
[37] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티가 상기 폴리펩타이드에 접합되어 있는, 폴리펩타이드.
[38] 구현예 [37]에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티가 하이드록시에틸 전분(HES), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리시알산(PSA), 엘라스틴-유사 폴리펩타이드, 헤파로산 중합체, 히알루론산 및 알부민 결합 리간드, 예를 들면, 지방산 쇄 또는 알부민 결합 펩타이드, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
[39] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 내인성 FVIII의 약동학적 파라미터가 폴리펩타이드의 투여에 의해 개선되고, 특히, 상기 내인성 FVIII의 평균 체류 시간 (MRT)가 증가되고/되거나 상기 내인성 FVIII의 반감기가 연장되고/되거나 상기 내인성 FVIII의 소거율이 감소된, 폴리펩타이드.
[40] 내인성 FVIII의 혈장 반감기를 안정화시키고/시키거나 증가시키기 위한 구현예 [1] 내지 [39] 중 어느 한 구현예에서 정의된 바와 같은 폴리펩타이드의 용도.
[41] 구현예 [1] 내지 [40] 중 어느 하나에 있어서, 제공된 치료 옵션 (ii)이 적용되고 상기 폴리펩타이드가 출혈 사건의 치료를 위해 또는 예방학적 치료 용법의 개시를 위해 외인성 FVIII와 함께 동시 투여되고, 후속 치료를 위해, 상기 폴리펩타이드가 외인성 FVIII의 동시-투여 없이 투여되고, 외인성 FVIII에 대한 동시 투여될 폴리펩타이드의 몰비가 50 초과인, 폴리펩타이드. 상기 동시 투여되는 외인성 FVIII는 혈장 유래되거나 임의의 재조합 FVIII일 수 있다. 재조합 외인성 FVIII는 예를 들어, 바람직하게 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단일쇄 인자 VIII일 수 있다.
[42] 구현예 [1] 내지 [41] 중 어느 하나에 있어서, 치료 옵션 (i)b) 또는 치료 옵션 (ii)이 적용된 경우에, 상기 외인성 FVIII에 대한 폴리펩타이드의 몰비가 적어도 50인, 폴리펩타이드.
[43] 구현예 [42]에 있어서, 외인성 FVIII에 대한 폴리펩타이드의 몰 비가 적어도 75인, 폴리펩타이드.
[44] 구현예 [42]에 있어서, 외인성 FVIII에 대한 폴리펩타이드의 몰 비가 적어도 100인, 폴리펩타이드.
[45] 구현예 [42]에 있어서, 외인성 FVIII에 대한 폴리펩타이드의 몰 비가 적어도 200인, 폴리펩타이드.
[46] 구현예 [42]에 있어서, 외인성 FVIII에 대한 폴리펩타이드의 몰 비가 적어도 300인, 폴리펩타이드.
[47] 구현예 [42]에 있어서, 외인성 FVIII에 대한 폴리펩타이드의 몰 비가 적어도 400 또는 적어도 500인, 폴리펩타이드.
[48] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 N-글리칸을 포함하는 당단백질이고, 여기서, 상기 N-글리칸의 적어도 75%가 평균적으로 적어도 1개의 시알산 모이어티를 포함하는, 폴리펩타이드.
[49] 구현예 [48]에 있어서, 상기 N-글리칸의 적어도 85%가 평균적으로 적어도 1개의 시알산 모이어티를 포함하는, 폴리펩타이드.
[50] 구현예 [49]에 있어서, 상기 N-글리칸의 적어도 95%가 평균적으로 적어도 1개의 시알산 모이어티를 포함하는, 폴리펩타이드.
[51] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 이량체, 바람직하게 본원에 기재된 구현예 중 하나에 정의된 바와 같은 2개의 폴리펩타이드 (단량체)를 포함하는 동종이량체이고, 상기 이량체를 형성하는 2개의 단량체가 절단된 VWF 내 시스테인 잔기에 의해 형성된 하나 이상의 디설파이드 브릿지를 통해 서로 공유적으로 연결되어 있는, 폴리펩타이드.
[52] 구현예 [51]에 있어서, 1개 이상의 디설파이드 브릿지를 형성하는 상기 시스테인 잔기가 Cys-1099, Cys-1142, Cys-1222, Cys-1225, Cys-1227 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게 Cys-1099 및 Cys-1142이고, 여기서, 상기 아미노산 넘버링은 서열번호 4를 나타내는, 폴리펩타이드.
[53] 구현예 [51] 또는 [52] 중 어느 하나에 있어서, 상기 FVIII(외인성 또는 내인성 FVIII)에 대한 상기 이량체 폴리펩타이드의 친화도가 상기 FVIII에 대한 단량체성 폴리펩타이드의 친화도보다 더 크고, 상기 단량체성 폴리펩타이드는 이량체성 폴리펩타이드의 단량체성 서브유닛과 동일한 아미노산 서열을 갖는, 폴리펩타이드.
[54] 구현예 [51] 내지 [53] 중 어느 하나에 있어서, 본 발명의 폴리펩타이드의 이량체:단량체 비율이 적어도 1.5, 바람직하게는 적어도 2, 보다 바람직하게는 적어도 2.5 또는 적어도 3인, 폴리펩타이드. 가장 바람직하게는, 본 발명의 모든 폴리펩타이드는 이량체로 존재한다.
[55] 구현예 [51] 내지 [54] 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 1 nM 미만, 바람직하게 500 pM 미만, 200 pM 미만, 100 pM 미만, 90 pM 미만 또는 80 pM 미만의 해리 상수 KD를 특징으로 하는 FVIII 결합 친화도를 갖는, 폴리펩타이드.
[56] 구현예 [55]에 있어서, 상기 해리 상수 KD가 0.1 pM 내지 500 pM, 0.5 pM 내지 200 pM, 0.75 pM 내지 100 pM의 범위, 가장 바람직하게 1 내지 80pM의 범위인, 폴리펩타이드.
[57] 구현예 [51] 내지 [56] 중 어느 하나에 있어서, 상기 이량체성 폴리펩타이드가 해리 상수 KD를 특징으로 하는 FVIII 결합 친화도를 갖고 상기 이량체성 폴리펩타이드의 해리 상수가 단량체성 폴리펩타이드의 해리 상수 KD와 비교하여 감소된, 바람직하게 적어도 10의 인자, 적어도 100의 인자, 적어도 500의 인자 또는 적어도 1000의 인자 만큼 감소된, 폴리펩타이드.
[58] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 특히 정상 사람 혈장 (NHP)에서 상응하는 FVIII 약동학적 파라미터와 비교하는 경우 또는 폴리펩타이드를 투여받지 않은 대상체에서 상응하는 FVIII 약동학적 파라미터와 비교하는 경우, 상기 내인성 FVIII의 약동학적 파라미터가 폴리펩타이드의 투여에 의해 개선되고, 바람직하게, 상기 내인성 FVIII의 평균 체류 시간 (MRT)가 증가되고/되거나 상기 내인성 FVIII의 반감기가 연장되고/되거나 상기 내인성 FVIII의 소거율이 감소되고, 폴리펩타이드.
[59] 구현예 [58]에 있어서, 상기 내인성 FVIII의 MRT 및/또는 말단 반감기의 증가가 적어도 50%인, 폴리펩타이드.
[60] 구현예 [59]에 있어서, 상기 내인성 FVIII의 MRT 및/또는 말단 반감기의 증가가 적어도 100%인, 폴리펩타이드.
[61] 구현예 [58]에 있어서, 상기 내인성 FVIII의 소거율이 상기 폴리펩타이드의 투여에 의해 감소되고 상기 감소가 적어도 25%인, 폴리펩타이드.
[62] 구현예 [61]에 있어서, 상기 감소가 적어도 50%인, 폴리펩타이드.
[63] 구현예 [62]에 있어서, 상기 감소가 적어도 100%인, 폴리펩타이드.
[64] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 혈장 반감기가 내인성 VWF의 혈장 반감기와 비교하는 경우 및/또는 정상 사람 혈장 (NHP)의 VWF의 혈장 반감기와 비교하는 경우 증가된, 폴리펩타이드.
[65] 구현예 [64]에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 혈장 반감기가 내인성 VWF의 반감기 및/또는 정상 사람 혈장 (NHP)의 VWF의 반감기 보다 적어도 25% 높거나, 특히, 적어도 50% 높거나, 적어도 75 % 높거나 적어도 100% 높은, 폴리펩타이드.
[66] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 MRT가 내인성 VWF의 MRT와 비교하는 경우 및/또는 정상 사람 혈장 (NHP)의 VWF의 MRT와 비교하는 경우 증가되고, 특히, 적어도 25 % 높거나, 적어도 50 % 높거나, 적어도 75 % 높거나 적어도 100% 높은, 폴리펩타이드.
[67] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 MRT 및/또는 혈장 반감기가, 표준 폴리펩타이드가 반감기 연장 모이어티가 결여되어 있는 것을 제외하고는 상기 폴리펩타이드와 동일한 상기 표준 폴리펩타이드와 비교하는 경우 증가된, 폴리펩타이드.
[68] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 비치료된 대상체와 비교되는 바와 같이 내인성 인자 VIII의 최대 농도(Cmax)를 증가시키는, 폴리펩타이드.
[69] 구현예 [68]에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 투여 후, FVIII에 대한 Cmax가 적어도 10 mIU/mL, 적어도 25 mIU/mL, 적어도 50 mIU/mL, 적어도 100 mIU/mL, 적어도 200 mIU/mL, 적어도 300 mIU/mL 또는 적어도 400 mIU/mL의 양에 이르는, 폴리펩타이드.
[70] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 비치료된 대상체와 비교되는 바와 같이 혈장 농도-시간 곡선 이하의 피크 면적을 제로에서 내인성 인자 VIII의 마지막 측정된 시점 (AUC)까지 증가시키는, 폴리펩타이드.
[71] 구현예 [70]에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 투여 후, 내인성 FVIII에 대한 AUC가 적어도 1000 mIU*h/mL, 적어도 2000 mIU*h/mL, 적어도 3000 mIU*h/mL, 적어도 5000 mIU*h/mL, 적어도 10000 mIU*h/mL 또는 적어도 20000 mIU*h/mL의 발색성 FVIII 활성의 수준으로 증가되는, 폴리펩타이드.
[72] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 적어도 하나의 아미노산이 야생형 VWF의 아미노산 서열과 비교되는 바와 같이 치환되고, 여기서, 상기 변형된 폴리펩타이드의 FVIII로의 결합 친화도가 상기 적어도 하나의 치환의 도입에 의해 상기 변형을 제외하고는 동일한 아미노산 서열을 갖는 표준 폴리펩타이드의 친화도와 비교하여 추가로 증가되는, 폴리펩타이드.
[73] 구현예 [72]에 있어서, 상기 절단된 VWF 내 상기 적어도 하나의 치환이 폴리펩타이드의 투여 후 내인성 FVIII의 반감기를 추가로 증가시키는 능력을 갖고/갖거나 재조합 폴리펩타이드의 투여될 용량을 감소시킬 수 있는, 폴리펩타이드.
[74] 구현예 [72] 또는 [73]에 있어서, 아미노산 넘버링과 관련하여 서열번호 4의 서열을 참조하여 상기 치환이 S764G/S766Y, S764P/S766I, S764P/S766M, S764V/S766Y, S764E/S766Y, S764Y/S766Y, S764L/S766Y, S764P/S766W, S766W/S806A, S766Y/P769K, S766Y/P769N, S766Y/P769R, S764P/S766L, 및 S764E/S766Y/V1083A로 이루어진 조합 그룹으로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
[75] 구현예 [74]에 있어서, 상기 치환이 조합 S764E/S766Y 또는 S764E/S766Y/V1083A인, 폴리펩타이드.
[76] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 혈관외로, 특히 피하로 투여되고 투여 후 상기 폴리펩타이드가 적어도 20%, 바람직하게 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70% 또는 적어도 80%의 생물유용성을 나타내는, 폴리펩타이드.
[77] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 투여 후 대상체의 내인성 FVIII 활성 수준의 증가가 성취되고, 바람직하게 내인성 FVIII 활성 수준이 생리학적 FVIII 수준 (100% = 1 IU/mL)까지 증가되거나 폴리펩타이드의 투여 후 생리학적 FVIII 수준 초과로 실질적으로 증가되지 않고, 바람직하게 각각 정상 사람 혈장의 혈장에서 평균 FVIII 활성 수준의 300% = 3 IU/mL을 초과하지 않거나, 보다 바람직하게 250% = 2.5 IU/mL을 초과하지 않거나, 200% = 2 IU/mL을 초과하지 않거나, 150% = 1.5 IU/mL을 초과하지 않거나 120% = 1.2 IU/mL을 초과하지 않는 내인성 FVIII 활성 수준의 증가를 유도하는, 폴리펩타이드.
[78] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 혈액 응고 장애를 앓는 대상체로의 상기 폴리펩타이드의 투여 후, 증가된 응혈 위험이 예방되는, 폴리펩타이드.
[79] 구현예 [78]에 있어서, 응혈 위험의 예방이 상기 폴리펩타이드의 투여 후 대상체의 내인성 FVIII 활성 수준의 단지 제한된 증가에 의해 결정되거나 성취되고, 바람직하게 내인성 FVIII 활성 수준이 생리학적 FVIII 수준 (100% = 1 IU/mL)까지 증가되거나 폴리펩타이드의 투여 후 생리학적 FVIII 수준 초과로 실질적으로 증가되지 않고, 바람직하게 각각 정상 사람 혈장의 혈장에서 평균 FVIII 활성 수준의 300% = 3 IU/mL을 초과하지 않거나, 보다 바람직하게 250% = 2.5 IU/mL을 초과하지 않거나, 200% = 2 IU/mL을 초과하지 않거나, 150% = 1.5 IU/mL을 초과하지 않거나 120% = 1.2 IU/mL을 초과하지 않는 내인성 FVIII 활성 수준의 증가를 유도하는, 폴리펩타이드.
[80] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 투여 후, 상기 폴리펩타이드에 대한 최대 농도(Cmax)가 적어도 20　nmol/kg, 적어도 40　nmol/kg, 적어도 60 nmol/kg, 적어도 80 nmol/kg 또는 적어도 160 nmol/kg인, 폴리펩타이드.
[81] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 투여 후, 상기 투여된 폴리펩타이드에 대한 t=0에서 t=∞ (AUC0-inf)까지의 농도 이하 면적이 적어도 2 nmol * h/kg, 적어도 3 nmol * h/mL, 적어도 4 nmol * h/mL, 적어도 20 nmol * h/mL, 적어도 40nmol * h/mL 또는 적어도 80 nmol * h/mL인, 폴리펩타이드.
[82] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 투여 후, 상기 폴리펩타이드에 대한 소거율 (CL) 값이 표준 치료와 비교하여 적어도 2, 적어도 5 또는 적어도 10 인자 만큼 감소되고, 상기 표준 치료가, 투여될 상기 폴리펩타이드가 반감기 연장 모이어티를 포함하지 않는 것을 제외하고는 상기 치료와 동일한, 폴리펩타이드.
[83] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 적어도 0.01 mg/kg, 적어도 0.1 mg/kg, 적어도 0.2 mg/kg, 적어도 0.5 mg/kg, 적어도 1 mg/kg 또는 적어도 3 mg/kg 폴리펩타이드의 양으로 투여되는, 폴리펩타이드.
[84] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드가 상기 폴리펩타이드의 20 mg/kg을 초과하지 않거나, 15 mg/kg을 초과하지 않거나, 10 mg/kg을 초과하지 않거나, 5　mg/kg을 초과하지 않는 양으로 투여되는, 폴리펩타이드.
[85] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 투여 후, 생리학적 활성화된 부분 트롬빈 시간 (aPTT) 값이 성취되고, 특히, 병리학적 aPTT 값이 생리학적 값으로 감소된, 폴리펩타이드.
[86] 구현예 [85]에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 투여 후, 활성화된 부분 트롬빈 시간 (aPTT)이 적어도1.5, 적어도 2, 적어도 2.5, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5 또는 적어도10의 인자 만큼 감소된, 폴리펩타이드.
[87] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 반복적으로 투여되고, 바라직하게 1개월 마다 1회, 3주 마다 1회, 2주 마다 1회, 7일 마다 1회, 주 마다 2회 또는 2일 마다 1회 투여되는, 폴리펩타이드.
[88] 구현예 [87]에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 반복적인, 즉, 다중 투여 후, 대상체에서 내인성 FVIII 활성 수준의 안정된 상태의 수준이 성취되고, 상기 안정된 상태의 FVIII 활성 수준이 바람직하게 1% 초과의 트로프 수준, 바람직하게 5% 초과의 트로프 수준, 바람직하게 10% 초과의 트로프 수준, 보다 바람직하게 20% 초과의 트로프 수준, 보다 바람직하게 50% 초과의 트로프 수준을 제공하고 심지어 가장 바람직하게, 안정된 상태의 FVIII 활성 수준이 필수적으로 생리학적 FVIII 활성 수준의 범위내에 있는, 폴리펩타이드.
[89] 구현예 [87] 또는 [88]에 있어서, 상기 반복적인, 즉 다중 투여 후, 활성화된 부분 트롬빈 시간 (aPTT)의 지속적 감소가 상기 대상체에서 성취되고, 상기 aPTT가 바람직하게 필수적으로 aPTT에 대한 생리학적 범위내에 있는, 폴리펩타이드.
[90] 구현예 [1] 내지 [89] 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 유효량의 폴리펩타이드를 FVIII를 동시-투여하는 것 없이 환자에게 투여함을 포함하는 혈액 응고 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 환자가 내인성 인자 VIII (FVIII)를 갖고, 상기 폴리펩타이드로 치료하기 전 상기 환자에서 상기 내인성 FVIII의 활성 수준이 정상 사람 혈장 (NHP)에서 FVIII의 활성 수준에 상대적으로 감소되고, 단, 상기 환자에서 내인성 FVIII의 활성 수준이 정상 사람 혈장 (NHP)에서 내인성 FVIII의 활성 수준의 적어도 0.5%이고 내인성 FVIII 수준이 상기 폴리펩타이드의 투여 후 증가되는, 방법. 상기 폴리펩타이드는 바람직하게 또한 출혈 사건의 예방학적 예방을 위해 투여되고, 여기서, 상기 치료가 외인성 FVIII의 동시-투여를 포함하지 않거나 상기 폴리펩타이드가 출혈 사건의 치료를 위해 또는 예방학적 치료 요법의 개시를 위해 외인성 FVIII와 함께 동시-투여되고, 상기 후속 치료를 위해 상기 폴리펩타이드가 외인성 FVIII의 동시-투여 없이 투여된다.
[91] 구현예 [1] 내지 [89] 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 유효량의 폴리펩타이드를 환자에게 투여함을 포함하는, 혈액 응고 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 환자가 내인성 인자 VIII (FVIII)를 갖고, 상기 폴리펩타이드를 사용한 치료 전 상기 환자에서 내인성 FVIII의 활성 수준이 정상 사람 혈장 (NHP)에서 FVIII의 활성 수준과 비교하여 감소되고, 단 상기 환자에서 내인성 FVIII의 활성 수준이 정상 사람 혈장 (NHP)에서 내인성 FVIII의 활성 수준의 적어도 0.5%이고 상기 내인성 FVIII 수준이 상기 폴리펩타이드의 투여 후 증가되는, 방법. 상기 치료는 외인성 FVIII가 투여됨을 포함하고 이에 의해 상기 대상체에서 내인성 FVIII를 제공한다. 상기 폴리펩타이드는 바람직하게 출혈 사건의 예방학적 예방을 위해 투여된다. 바람직한 구현예에 따라, 상기 폴리펩타이드는 피하 투여되고 FVIII는 정맥내 투여된다.
도 1은 실시예 1.1에 기재된 바와 같이 rD'D3-FP의 i.v. 투여 후 CD 래트에서 rD'D3-FP 노출, FVIII 활성 및 aPTT를 보여준다.
도 1a는 이의 알부민 성분을 통해 정량된 rD'D3-FP를 보여주고, 데이터는 시점 당 n=2-3 래트에 대한 평균 ± SD로서 나타내고;
도 1b는 IU/mL로 발색성 FVIII 활성으로서 정량된 FVIII를 보여주고, 데이터는 시점 당 n=1-3 래트 (예비용량 데이터를 제외한: n=7)에 대해 평균 ± SD로 나타낸다. 점선은 예비용량 데이터의 최소 및 최대를 나타낸다. ULN으로서 표시된 점선은 정상 값의 상한치를 나타내고;
도 1c는 표준값의 %로 응고 FVIII 활성으로서 정량된 FVIII를 보여주고, 데이터는 시점 당 n=1-3 래트 (예비용량 데이터를 제외한: n=7)에 대해 평균 ± SD로 나타낸다. 점선은 예비용량 데이터의 최소 및 최대를 나타낸다. ULN으로서 표시된 점선은 정상 값의 상한치를 나타내고;
도 1d는 상기와 같이 발색성 또는 응고 FVIII 활성으로서 정량된 FVIII를 보여준다. AUC는 시간 제로로부터 14일까지의 혈장 농도-시간 곡선 이하의 피크 면적으로서 계산되었고;
도 1e는 Pathromtin® SL을 사용한 활성화된 부분 트롬빈 시간을 보여주고 데이터는 시점 당 n=1-3 래트 (예비용량 데이터를 제외한: n=7)에 대한 평균 ± SD로 나타낸다. 점선은 예비용량 데이터의 최소 및 최대를 나타낸다.
도 2는 실시예 1.2에 기재된 바와 같이 rD'D3-FP의 i.v. 투여 후 토끼에서 rD'D3-FP 노출, FVIII 활성 및 aPTT를 보여준다.
도 2a는 이의 알부민 성분을 통해 정량된 rD'D3-FP를 보여주고, 데이터는 시점 당 n=1-3 토끼에 대한 평균 ± SD로서 나타내고;
도 2b는 IU/mL로 발색성 FVIII 활성으로서 정량된 FVIII를 보여주고, 데이터는 시점 당 n=1-3 토끼에 대한 평균 ± SD로 나타낸다. 점선은 예비용량 데이터의 최소 및 최대를 나타내고;
도 2c는 표준값의 %로 응고 FVIII 활성으로서 정량된 FVIII를 보여주고, 데이터는 시점 당 n=1-3 래트에 대한 평균 ± SD로 나타낸다. 점선은 예비용량 데이터의 최소 및 최대를 나타내고;
도 2d는 상기와 같이 발색성 또는 응고 FVIII 활성으로서 정량된 FVIII를 보여준다. AUC는 시간 제로로부터 10일까지의 혈장 농도-시간 곡선 이하의 피크 면적으로서 계산되었고;
도 2e는 Actin® FSL을 사용한 활성화된 부분 트롬빈 시간을 보여주고 데이터는 시점 당 n=1-3 토끼에 대한 평균 ± SD로 나타낸다. 점선은 예비용량 데이터의 최소 및 최대를 나타낸다.
도 3은 실시예 1.3에 기재된 바와 같이 rD'D3-FP의 i.v. 투여 후 몽키에서 rD'D3-FP 노출 및 FVIII 활성을 보여준다.
도 3a는 이의 알부민 성분을 통해 정량된 표준물에 대해 정량된 rD'D3-FP를 보여주고, 데이터는 시점 당 n=3 몽키에 대한 평균 ± SD로서 나타내고;
도 3b는 표준값의 %로 발색성 FVIII 활성으로서 정량된 FVIII를 보여주고, 데이터는 시점 당 n=3 몽키에 대한 평균 ± SD로 나타낸다. 점선은 예비용량 데이터의 최소 및 최대를 나타내고, 점선은 예비용량 데이터 (예비용량 데이터: n=22)의 평균을 나타낸다.
도 4는 실시예 1.4에 기재된 바와 같이 rD'D3-FP의 i.v. 투여 후 VWF 녹아웃 래트에서 rD'D3-FP 노출, FVIII 활성 및 aPTT를 보여준다.
도 4a는 이의 알부민 성분을 통해 정량된 rD'D3-FP를 보여주고, 데이터는 시점 당 n=1-4 래트에 대한 평균 ± SD로서 나타내고;
도 4b는 IU/mL로 발색성 FVIII 활성으로서 정량된 FVIII를 보여주고, 데이터는 시점 당 n=1-4 래트 (예비용량 데이터를 제외한: n≤8)에 대해 평균 ± SD로 나타낸다. VWF ko 래트에서 예비용량 데이터는 정량 한계치 미만이다. 음영 영역은 건강한 CD 래트로부터의 예비 용량 데이터의 최소 및 최대를 나타내고; ULN으로서 표시된 점선은 정상값의 상한치를 나타내고;
도 4c는 표준 값의 %로 응고 FVIII 활성으로서 정량된 FVIII를 보여주고, 데이터는 시점 당 n=1-4 래트 (예비용량 데이터를 제외한: n≤8)에 대해 평균 ± SD로 나타낸다. 음영 영역은 건강한 CD 래트로부터의 예비 용량 데이터의 최소 및 최대를 나타내고; ULN으로서 표시된 점선은 정상값의 상한치를 나타내고;
도 4d는 상기와 같이 발색성 또는 응고 FVIII 활성으로서 정량된 FVIII를 보여준다. AUC는 시간 제로로부터 10일까지의 혈장 농도-시간 곡선 이하의 피크 면적으로서 계산되었고;
도 4e는 Pathromtin® SL을 사용한 활성화된 부분 트롬빈 시간을 보여주고 데이터는 시점 당 n=1-3 래트 (예비용량 데이터를 제외한: n≤7)에 대한 평균 ± SD로 나타낸다. 점선은 VWF ko 래트의 예비용량 데이터의 최소 및 최대를 나타낸다. 음영 영역은 건강한 CD 래트로부터 예비용량 데이터의 최소 및 최대를 나타내고;
도 5는 실시예 1.5에 기재된 바와 같이 rD'D3-FP의 투여 후 VWF 녹아웃 마우스에서 rD'D3-FP 노출 및 FVIII 활성을 보여준다.
도 5a는 이의 알부민 성분을 통해 정량된 rD'D3-FP를 보여주고, 데이터는 시점 당 n=3 마우스에 대한 평균 ± SD로서 나타내고;
도 5b는 IU/mL로 발색성 FVIII 활성으로서 정량된 FVIII를 보여주고, 데이터는 시점 당 n=3 마우스에 대한 평균 ± SD로 나타낸다. VWF Ko 마우스에서 비히클 데이터는 정량 한계치 미만 (LLOQ)이다. 음영 영역은 건강한 NMRI 마우스로부터 예비용량 데이터의 최소 및 최대를 나타내고;
도 5c는 표준값의 %로 응고 FVIII 활성으로서 정량된 FVIII를 보여주고, 데이터는 시점 당 n=3-4 마우스에 대한 평균 ± SD로 나타낸다. VWF Ko 마우스에서 비히클 데이터는 검출 한계치 미만이다.
도 5d는 상기와 같이 발색성 또는 응고 FVIII 활성으로서 정량된 FVIII를 보여준다. AUC는 시간 제로로부터 7일까지의 혈장 농도-시간 곡선 이하의 피크 면적으로서 계산되었고;
도 6은 실시예 1.6에 기재된 바와 같이 rD'D3 변이체의 i.v. 투여 후 VWF 녹아웃 래트에서 rD'D3 변이체 노출 및 FVIII 활성을 보여준다.
도 6a는 이의 알부민 성분(rD'D3-FP)을 통해 또는 D'D3 성분(rD'D3-CTP)을 통해 VWF ko 래트에서 정량된 rD'D3-FP WT, rD'D3-FP EY, rD'D3-FP EYA 또는 rD'D3-CTP를 보여주고, 데이터는 시점 당 n=3-4 래트에 대한 평균 ± SD로서 나타낸다. 점선은 각각 알부민 및 rD'D3-CTP에 대한 검출 한계치를 나타내고;
도 6b는 VWF ko 래트에서 IU/mL로 발색성 FVIII 활성으로서 정량된 FVIII를 보여주고, 데이터는 시점 당 n=1-4 래트에 대한 평균 ± SD로 나타낸다.
도 6c는 VWF ko 래트에서 표준값의 %로 응고 FVIII 활성으로서 정량된 FVIII를 보여주고, 데이터는 시점 당 n=1-4 래트에 대한 평균 ± SD로 나타낸다.
도 6d는 상기와 같이 발색성 또는 응고 FVIII 활성으로서 정량된 FVIII를 보여준다. AUC는 시간 제로로부터 10일까지의 혈장 농도-시간 곡선 이하의 피크 면적으로서 계산되었고;
도 7은 실시예 1.7에 기재된 바와 같이 rD'D3-FP의 i.v. 또는 s.c. 투여 후 FVIII 녹아웃, VWF ko 및 NMRI 마우스 및 VWF ko 또는 CD 래트 또는 돼지에서 rD'D3-FP 노출을 보여준다.
도 7a-1은 이의 알부민 성분을 통해 FVIII ko, VWF ko 및 NMRI 마우스에서 정량된 rD'D3-FP를 보여주고, 데이터는 시점 당 n=1-3 마우스에 대한 평균 ± SD로서 나타내고;
도 7a-2는 이의 알부민 성분을 통해 VWF ko 및 CD 래트에서 정량된 rD'D3-FP를 보여주고 데이터는 시점 당 n=2-4 래트에 대한 평균 ± SD로서 나타낸다. 점선은 rD'D3-FP에 대한 검출 한계치를 나타내고;
도 7a-3은 이의 알부민 성분을 통해 돼지에서 정량된 rD'D3-FP를 보여주고, 데이터는 시점 당 n=1-3 돼지에 대한 평균 ± SD로서 나타낸다. 점선은 rD'D3-FP에 대한 검출 한계치를 나타내고;
도 7b-1은 VWF ko 래트에서 발색성 FVIII 활성으로서 정량된 FVIII를 보여주고, 데이터는 시점 당 n=2-4 래트에 대한 평균 ± SD로 나타낸다. 점선은 비치료된 건강한 CD 래트로부터의 데이터의 최소 및 최대를 나타내고;
도 7b-2는 돼지에서 발색성 FVIII 활성으로서 정량된 FVIII를 보여주고, 데이터는 시점 당 n=2-3 돼지에 대한 평균 ± SD로 나타낸다. 점선은 돼지로부터의 예비용량 값으로부터 얻은 범위를 나타내고;
도 8은 실시예 1.8에 기재된 바와 같이 rD'D3-FP의 i.v. 또는 s.c. 투여 후 FVIII 녹아웃, VWF ko 및 NMRI 마우스 및 VWF ko 또는 CD 래트 또는 돼지에서 rD'D3-FP 노출 및 FVIII 발색성 활성을 보여준다.
도 8a는 이의 알부민 성분을 통해 VWF ko 래트에서 정량된 rD'D3-FP를 보여주고 데이터는 시점 당 n=3 래트에 대한 평균 ± SD로서 나타낸다. 점선은 rD'D3-FP에 대한 검출 한계치를 나타내고;
도 8b는 VWF ko 래트에서 발색성 FVIII 활성으로서 정량된 FVIII를 보여주고, 데이터는 시점 당 n=2-3 래트에 대한 평균 ± SD로 나타낸다. 점선과 함께 회색 음영은 비치료된 건강한 CD 래트로부터 얻은 데이터의 최소 및 최대를 나타내고;
도 8c는 VWF ko 래트에서 응고 FVIII 활성으로서 정량된 FVIII를 보여주고, 데이터는 시점 당 n=2 래트에 대한 평균 ± SD로 나타낸다. 회색 음영은 비치료된 건강한 CD 래트로부터의 데이터의 최소 내지 최대 범위를 나타내고;
도 8d는 VWF ko 래트에서 Pathromtin® SL을 사용한 활성화된 부분 트롬빈 시간을 보여주고 데이터는 시점 당 n=2 래트에 대한 평균 ± SD로 나타낸다. 회색 음영은 VWF ko 래트의 예비용량 데이터의 최소 및 최대를 나타낸다. 음영 영역은 건강한 CD 래트로부터 예비용량 데이터의 최소 및 최대를 나타내고;
도 9는 실시예 1.9에 기재된 바와 같이 rD'D3-FP의 i.v. 또는/및 또는 s.c.와 조합된 투여 후 FVIII ko 래트에서 rD'D3-FP 및 FVIII 노출을 보여준다.
도 9a는 FVIII ko 래트에서 발색성 FVIII 활성으로서 정량된 FVIII를 보여주고, 데이터는 시점 당 n=3 FVIII ko 마우스에 대한 평균 ± SD로 나타낸다. 검출 한계는 건강한 CD 래트로부터 예비용량 데이터의 최소 및 최대를 나타내고;
도 9b는 FVIII ko 래트에서 발색성 FVIII 활성으로서 정량된 FVIII를 보여주고, 데이터는 시점 당 n=2-3 FVIII ko 마우스에 대한 평균 ± SD로 나타낸다. 검출 한계는 건강한 CD 래트로부터 예비용량 데이터의 최소 및 최대를 나타내고;
도 9c는 FVIII ko 래트에서 발색성 FVIII 활성으로서 정량된 FVIII를 보여주고, 데이터는 시점 당 n=2-3 FVIII ko 마우스에 대한 평균 ± SD로 나타낸다. 검출 한계는 건강한 CD 래트로부터 예비용량 데이터의 최소 및 최대를 나타낸다.
제1 양상에서, 본 발명은 혈액 응고 장애의 치료에 사용하기 위한 (i) 절단된 폰 빌레브란트 인자 (VWF) 및 (ii) 반감기 연장 모이어티를 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이고, 상기 치료는 상기 폴리펩타이드를 혈액 응고 장애를 앓고 내인성 인자 VIII (FVIII)를 갖는 대상체에 투여함을 포함하고, 여기서, 상기 폴리펩타이드를 사용한 치료 전 상기 대상체에서 내인성 FVIII의 활성 수준은 정상 사람 혈장 (NHP)에서 FVIII의 활성 수준에 상대적으로 감소되어 있고, 단, 상기 대상체 내 내인성 FVIII의 활성 수준은 정상 사람 혈장 (NHP)에서 내인성 FVIII의 활성 수준의 적어도 0.5%이고, 상기 내인성 FVIII 수준은 상기 폴리펩타이드의 투여 후 증가되고 상기 폴리펩타이드는 출혈 사건의 예방학적 예방을 위해 투여되고, 상기 치료는 외인성 FVIII의 동시-투여를 포함하지 않는다.
제2 양상에서, 본 발명은 혈액 응고 장애의 치료에 사용하기 위한 (i) 절단된 폰 빌레브란트 인자 (VWF) 및 (ii) 반감기 연장 모이어티를 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이고, 상기 치료는 상기 폴리펩타이드를 혈액 응고 장애를 앓고 내인성 인자 VIII (FVIII)를 갖는 대상체에 투여함을 포함하고, 여기서, 상기 폴리펩타이드를 사용한 치료 전 상기 대상체에서 내인성 FVIII의 활성 수준은 정상 사람 혈장 (NHP)에서 FVIII의 활성 수준에 상대적으로 감소되어 있고, 단, 상기 대상체 내 내인성 FVIII의 활성 수준은 정상 사람 혈장 (NHP)에서 내인성 FVIII의 활성 수준의 적어도 0.5%이고, 상기 내인성 FVIII 수준은 상기 폴리펩타이드의 투여 후 증가되고 상기 폴리펩타이드는 출혈 사건의 치료를 위해 또는 예방학적 치료 용법의 개시를 위해 외인성 FVIII와 함께 동시 투여되고, 후속 치료를 위해, 상기 폴리펩타이드는 외인성 FVIII의 동시 투여 없이 투여된다.
제3 양상은 혈액 응고 장애의 치료에 사용하기 위한 (i) 절단된 폰 빌레브란트 인자 (VWF) 및 (ii) 반감기 연장 모이어티를 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이고, 상기 치료는 상기 폴리펩타이드를 혈액 응고 장애를 앓고 내인성 인자 VIII (FVIII)를 갖는 대상체에 투여함을 포함하고, 여기서, 상기 폴리펩타이드를 사용한 치료 전 상기 대상체에서 내인성 FVIII의 활성 수준은 정상 사람 혈장 (NHP)에서 FVIII의 활성 수준에 상대적으로 감소되어 있고, 단, 상기 대상체 내 내인성 FVIII의 활성 수준은 정상 사람 혈장 (NHP)에서 내인성 FVIII의 활성 수준의 적어도 0.5%이고, 상기 내인성 FVIII 수준은 상기 폴리펩타이드의 투여 후 증가되고 상기 폴리펩타이드는 출혈 사건의 예방학적 예방을 위해 투여되고, 상기 치료는 외인성 FVIII의 동시 투여를 포함하지 않는다.
제4 양상은 혈액 응고 장애의 치료에 사용하기 위한 (i) 절단된 폰 빌레브란트 인자 (VWF) 및 (ii) 반감기 연장 모이어티를 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이고, 상기 치료는 상기 폴리펩타이드를 혈액 응고 장애를 앓고 내인성 인자 VIII (FVIII)를 갖는 대상체에 투여함을 포함하고, 여기서, 상기 폴리펩타이드를 사용한 치료 전 상기 대상체에서 내인성 FVIII의 활성 수준은 정상 사람 혈장 (NHP)에서 FVIII의 활성 수준에 상대적으로 감소되어 있고, 단, 상기 대상체 내 내인성 FVIII의 활성 수준은 정상 사람 혈장 (NHP)에서 내인성 FVIII의 활성 수준의 적어도 0.5%이고, 상기 내인성 FVIII 수준은 상기 폴리펩타이드의 투여 후 증가되고 상기 폴리펩타이드는 출혈 사건의 치료를 위해 또는 예방학적 치료 용법의 개시를 위해 외인성 FVIII와 함께 동시 투여되고, 후속 치료를 위해, 상기 폴리펩타이드는 외인성 FVIII의 동시 투여 없이 투여된다.
제5 양상은 혈액 응고 장애의 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 (i) 절단된 폰 빌레브란트 인자 (VWF) 및 반감기 연장 모이어티를 포함하는 재조합 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이고, (ii) 상기 치료는 상기 폴리펩타이드를 혈액 응고 장애를 앓고 내인성 인자 VIII (FVIII)를 갖는 대상체에 투여함을 포함하고, 여기서, 상기 폴리펩타이드를 사용한 치료 전 상기 대상체에서 내인성 FVIII의 활성 수준은 정상 사람 혈장 (NHP)에서 FVIII의 활성 수준에 상대적으로 감소되어 있고, 단, 상기 대상체 내 내인성 FVIII의 활성 수준은 정상 사람 혈장 (NHP)에서 내인성 FVIII의 활성 수준의 적어도 0.5%이고, 상기 내인성 FVIII 수준은 상기 폴리펩타이드의 투여 후 증가되고, 여기서,
- 상기 폴리펩타이드는 또한 출혈 사건의 예방학적 예방을 위해 투여되고, 여기서, 상기 치료는 외인성 FVIII의 동시-투여를 포함하지 않거나,
- 상기 폴리펩타이드는 출혈 사건의 치료를 위해 또는 예방학적 치료 요법의 개시를 위해 외인성 FVIII와 함께 동시-투여되고, 상기 후속 치료를 위해 상기 폴리펩타이드는 외인성 FVIII의 동시-투여 없이 투여된다.
절단된 폰 빌레브란트 인자(VWF) 및 반감기 연장 모이어티를 포함하는 폴리펩타이드는 본원에서 "본 발명의 폴리펩타이드"로서 언급될 것이다.
절단된 VWF
본원에 사용된 용어 "폰 빌레브란트 인자"(VWF)는 자연 발생(천연) VWF뿐만 아니라, 적어도 자연 발생 VWF의 FVIII 결합 활성을 보유하는 이들의 변이체, 예를 들면, 1개 이상의 잔기가 삽입되거나, 결실되거나, 또는 치환된 서열 변이체도 포함한다. FVIII 결합 활성은 실시예 2에 기재된 바와 같이 FVIII-VWF 결합 검정에 의해 결정된다.
본 발명에 따른 VWF는 서열번호 4에 나타낸 아미노산 서열로 나타내어지는 사람 VWF이고, 바람직하게는 절단된 VWF이다. 서열번호 4를 암호화하는 cDNA는 서열번호 3에 나타낸다.
야생형 VWF를 암호화하는 유전자는 9kb의 mRNA로 전사되며, 이는 310,000Da의 추정 분자량을 갖는 2813개의 아미노산들의 프리-프로폴리펩티드(pre-propolypeptide)로 해독된다. 상기 프레-프로폴리펩타이드는 N-말단 22개 아미노산 신호 펩타이드, 이어서, 741개 아미노산 프로-폴리펩타이드(서열번호 4의 아미노산 23 내지 763) 및 성숙 서브유닛(서열번호 4의 아미노산 764 내지 2813)을 함유한다. N-말단에서 741개의 아미노산 프로폴리펩티드의 절단은 2050개의 아미노산들로 이루어진 성숙한 VWF를 생성시킨다. 사람 천연 VWF 프레-프로폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 4에 나타낸다. 달리 지적되지 않는 경우, 본 출원에서 VWF 잔기의 아미노산 넘버링은 VWF 분자가 서열번호 4의 모든 잔기를 포함하지 않는 경우라도 서열번호 4를 참조로 한다.
천연 VWF의 프로폴리펩타이드는 다중 도메인을 포함한다. 다양한 도메인 주석(annotation)이 문헌에서 찾을 수 있다(예를 들면, 문헌[Zhou et al. (2012) Blood 120(2): 449-458). VWF의 천연 프레-프로폴리펩타이드의 하기 도메인 주석이 본 출원에서 적용된다:
D1-D2-D'-D3-A1-A2-A3-D4-C1-C2-C3-C4-C5-C6-CK
서열번호 4를 참조로 하여, 상기 D' 도메인은 아미노산 764 내지 865로 이루어지고; 상기 D3 도메인은 아미노산 866 내지 1242로 이루어진다.
“절단된(truncated)”이라는 특성은 상기 폴리펩타이드가 성숙한 VWF의 전체 아미노산 서열(서열번호 4의 아미노산 764 내지 2813)을 포함하는 것이 아님을 의미한다. 통상적으로, 상기 절단된 VWF는 서열번호 4의 모든 아미노산 764 내지 2813을 포함하는 것이 아니라, 이들의 단편만을 포함한다. 또한, 절단된 VWF는 VWF 단편으로서 또는 복수의 VWF 단편들로 지칭될 수 있다.
통상적으로, 상기 절단된 VWF는 인자 VIII에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 상기 절단된 VWF는 성숙한 형태의 사람 천연 인자 VIII에 결합할 수 있다. 상기 절단된 VWF는 내인성 및/또는 외인성 인자 VIII에 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 절단된 VWF는 동시 투여된 재조합 FVIII에, 바람직하게, 본원에 기재된 바와 같은 FVIII에, 보다 바람직하게는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단일쇄 인자 VIII에 결합할 수 있다. 인자 VIII로의 절단된 VWF의 결합은 실시예 2에 기술된 바와 같은 FVIII-VWF 결합 검정에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 절단된 VWF는 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산 776 내지 805와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이러한 아미노산 서열로 이루어지고, FVIII에 결합할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 절단된 VWF는 서열번호 4의 아미노산 776 내지 805와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이러한 서열로 이루어지고, FVIII에 결합할 수 있다. 가장 바람직하게, 절단된 VWF는 서열번호 4의 아미노산 776 내지 805를 포함하거나 또는 서열번호 4의 아미노산 776 내지 805로 이루어진다. 본원에 달리 나타내지 않는 한, 서열 동일성은 표준 서열의 전장(예를 들면, 서열번호 4의 아미노산 776 내지 805)에 대해 결정된다.
본 발명의 절단된 VWF는 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산 766 내지 864와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이러한 아미노산 서열로 이루어지고, FVIII에 결합할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 절단된 VWF는 서열번호 4의 아미노산 766 내지 864와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이러한 서열로 이루어지고, FVIII에 결합할 수 있다. 가장 바람직하게, 절단된 VWF는 서열번호 4의 아미노산 766 내지 864를 포함하거나 또는 서열번호 4의 아미노산 776 내지 864로 이루어진다.
다른 바람직한 구현예에서, 절단된 VWF는 (a) 서열번호 4의 아미노산 764 내지 1242와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 (b) 이의 단편으로 이루어지고, 단, 상기 절단된 VWF는 여전히 FVIII에 결합할 수 있다. 보다 바람직하게, 절단된 VWF는 (a) 서열번호 4의 아미노산 764 내지 1242와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 (b) 이의 단편으로 이루어지고, 단, 상기 절단된 VWF는 여전히 FVIII에 결합할 수 있다. 가장 바람직하게, 절단된 VWF는 (a) 서열번호 4의 아미노산 764 내지 1242, 또는 (b) 이의 단편으로 이루어지고, 단, 상기 절단된 VWF는 여전히 FVIII에 결합할 수 있다.
하기에 보다 상세하게 기재된 바와 같이, 폴리펩타이드는 상기 절단된 VWF를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 사용하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 핵산은 그 자체가 공지된 기술에 의해 적합한 숙주 세포에 도입된다.
바람직한 구현예에서, 숙주 세포 내의 핵산은 (a) 서열번호 4의 아미노산 1 내지 1242와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 (b) 이의 단편을 암호화하고, 단, 절단된 성숙 VWF는 여전히 FVIII에 결합할 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 핵산은 (a) 서열번호 4의 아미노산 1 내지 1242와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 (b) 이의 단편을 암호화하고, 단, 상기 절단된 VWF는 여전히 FVIII에 결합할 수 있다. 가장 바람직하게, 상기 핵산은 (a) 서열번호 4의 아미노산 1 내지 1242, 또는 (b) 이의 단편을 암호화하고, 단, 상기 절단된 VWF는 여전히 FVIII에 결합할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 폴리펩타이드가 이량체인 경우, 상기 핵산은, 상기 폴리펩타이드 내의 절단된 VWF가 VWF의 아미노산 1 내지 763(예컨대, 서열번호 4)을 포함하지 않는다 하더라도 VWF의 아미노산 1 내지 763을 인암호화하는 서열(예컨대, 서열번호 4)을 포함할 것이다.
다른 구현예에서, 상기 절단된 VWF는 각각 서열번호 4를 지칭하는 하기 아미노산 서열들 중 하나를 포함하거나 또는 이로 이루어진다:
776-805; 766-805; 764-805; 776-810; 766-810; 764-810; 776-815; 766-815; 764-815;
776-820; 766-820; 764-820; 776-825; 766-825; 764-825; 776-830; 766-830; 764-830;
776-835; 766-835; 764-835; 776-840; 766-840; 764-840; 776-845; 766-845; 764-845;
776-850; 766-850; 764-850; 776-855; 766-855; 764-855; 776-860; 766-860; 764-860;
776-864; 766-864; 764-864; 776-865; 766-865; 764-865; 776-870; 766-870; 764-870;
776-875; 766-875; 764-875; 776-880; 766-880; 764-880; 776-885; 766-885; 764-885;
776-890; 766-890; 764-890; 776-895; 766-895; 764-895; 776-900; 766-900; 764-900;
776-905; 766-905; 764-905; 776-910; 766-910; 764-910; 776-915; 766-915; 764-915;
776-920; 766-920; 764-920; 776-925; 766-925; 764-925; 776-930; 766-930; 764-930;
776-935; 766-935; 764-935; 776-940; 766-940; 764-940; 776-945; 766-945; 764-945;
776-950; 766-950; 764-950; 776-955; 766-955; 764-955; 776-960; 766-960; 764-960;
776-965; 766-965; 764-965; 776-970; 766-970; 764-970; 776-975; 766-975; 764-975;
776-980; 766-980; 764-980; 776-985; 766-985; 764-985; 776-990; 766-990; 764-990;
776-995; 766-995; 764-995; 776-1000; 766-1000; 764-1000; 776-1005; 766-1005; 764-1005;
776-1010; 766-1010; 764-1010; 776-1015; 766-1015; 764-1015; 776-1020; 766-1020; 764-1020;
776-1025; 766-1025; 764-1025; 776-1030; 766-1030; 764-1030; 776-1035; 766-1035; 764-1035;
776-1040; 766-1040; 764-1040; 776-1045; 766-1045; 764-1045; 776-1050; 766-1050; 764-1050;
776-1055; 766-1055; 764-1055; 776-1060; 766-1060; 764-1060; 776-1065; 766-1065; 764-1065;
776-1070; 766-1070; 764-1070; 776-1075; 766-1075; 764-1075; 776-1080; 766-1080; 764-1080;
776-1085; 766-1085; 764-1085; 776-1090; 766-1090; 764-1090; 776-1095; 766-1095; 764-1095;
776-1100; 766-1100; 764-1100; 776-1105; 766-1105; 764-1105; 776-1110; 766-1110; 764-1110;
776-1115; 766-1115; 764-1115; 776-1120; 766-1120; 764-1120; 776-1125; 766-1125; 764-1125;
776-1130; 766-1130; 764-1130; 776-1135; 766-1135; 764-1135; 776-1140; 766-1140; 764-1140;
776-1145; 766-1145; 764-1145; 776-1150; 766-1150; 764-1150; 776-1155; 766-1155; 764-1155;
776-1160; 766-1160; 764-1160; 776-1165; 766-1165; 764-1165; 776-1170; 766-1170; 764-1170;
776-1175; 766-1175; 764-1175; 776-1180; 766-1180; 764-1180; 776-1185; 766-1185; 764-1185;
776-1190; 766-1190; 764-1190; 776-1195; 766-1195; 764-1195; 776-1200; 766-1200; 764-1200;
776-1205; 766-1205; 764-1205; 776-1210; 766-1210; 764-1210; 776-1215; 766-1215; 764-1215;
776-1220; 766-1220; 764-1220; 776-1225; 766-1225; 764-1225; 776-1230; 766-1230; 764-1230;
776-1235; 766-1235; 764-1235; 776-1240; 766-1240; 764-1240; 776-1242; 766-1242; 764-1242;
764-1464; 764-1250; 764-1041; 764-828; 764-865; 764-1045; 764-1035; 764-1128; 764-1198;
764-1268; 764-1261; 764-1264; 764-1459; 764-1463; 764-1464; 764-1683; 764-1873; 764-1482;
764-1479; 764-1672; 및 764-1874.
특정 구현예에서 상기 절단된 VWF는 성숙된 야생형 VWF와 비교하여 내부 결실을 가진다. 예를 들어, A1, A2, A3, D4, C1, C2, C3, C4, C5, C6, CK 도메인 또는 이들의 조합은 결실될 수 있으며, D' 도메인 및/또는 D3 도메인은 보유된다. 추가의 구현예에서, 상기 절단된 VWF는 혈소판 당단백질 Ibα(GPIbα), 콜라겐 및/또는 인테그린 αIIbβIII(C1 도메인 내의 RGDS 서열)에 대한 결합 부위를 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 상기 절단된 VWF는 VWF의 중심 A2 도메인에 위치하는 ADAMTS13에 대한 절단 부위(Tyr1605-Met1606)를 포함하지 않는다. 또 다른 구현예에서, 상기 절단된 VWF는 GPIbα에 대한 결합 부위를 포함하지 않고/않거나, 콜라겐에 대한 결합 부위를 포함하지 않고/않거나, 인테그린 αIIbβIII에 대한 결합 부위를 포함하지 않고/않거나, VWF의 중심 A2 도메인에 위치하는 ADAMTS13에 대한 절단 부위(Tyr1605-Met1606)를 포함하지 않는다.
다른 구현예에서, 상기 절단된 VWF는 선행 단락에 인용된 상기 아미노산 서열들 중 하나와 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이러한 서열로 이루어지고, 단 상기 절단된 VWF는 FVIII에 결합할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 상기 본 발명의 폴리펩타이드의 2개의 단량체들이 공유결합되어 있는 경우 본 발명에서 "이량체"라고 칭한다. 바람직하게는, 2개의 단량체성 서브유닛들은 적어도 1개의 이황화 가교를 통해, 예컨대, 1개, 2개, 3개 또는 4개의 이황화 가교에 의해 공유결합된다. 적어도 1개의 이황화 가교를 형성하는 시스테인 잔기는 바람직하게는 본 발명의 폴리펩타이드의 절단된 VWF 부분 내에 위치한다. 한 구현예에서, 이들 시스테인 잔기들은 Cys-1099, Cys-1142, Cys-1222, Cys-1225 또는 Cys-1227, 또는 이들의 조합이다.
이량체들은 바람직하게 동종-이량체이고, 여기서, 각각의 단량체는 바람직하게 본원에 기재된 바와 같은 반감기 연장 모이어티를 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드가 이량체인 경우, 상기 절단된 VWF는 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산 764 내지 1099, 아미노산 764 내지 1142, 아미노산 764 내지 1222, 아미노산 764 내지 1225, 또는 아미노산 764 내지 1227과 각각 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 각각 갖는 2개의 폴리펩타이드들을 포함하거나 또는 이들 폴리펩타이드들로 이루어지고, FVIII에 결합할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 절단된 VWF는 서열번호 4의 아미노산 764 내지 1099, 아미노산 764 내지 1142, 아미노산 764 내지 1222, 아미노산 764 내지 1225, 또는 아미노산 764 내지 1227과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산을 포함하거나 또는 이러한 아미노산으로 이루어지고, FVIII에 결합할 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 절단된 VWF는 서열번호 4의 아미노산 764 내지 1099, 아미노산 764 내지 1142, 아미노산 764 내지 1222, 아미노산 764 내지 1225, 아미노산 764 내지 1227또는 아미노산 764 내지 1242를 포함하거나 또는 이들로 이루어진다.
상기 절단된 VWF는 WO 2013/106787 A1, WO 2014/198699 A2, WO 2011/060242 A2 또는 WO 2013/093760 A2에 개시되어 있는 VWF 단편들 중 임의의 하나일 수 있고, 상기 문헌들의 개시내용은 본원에 참조로 인용된다.
추가의 바람직한 구현예에 따라, 상기된 바와 같은 절단된 VWF는 WO　2016/000039　A1에 기재된 바와 같은 아미노산 치환 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 상기 변형된 버젼의 절단된 VWF는 서열번호 4에 따른 야생형 VWF의 D’ 도메인의 아미노산 서열과 비교했을 때, D' 도메인 내에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 상기 변형된 버젼의 절단된 VWF의 아미노산 서열은 각각의 야생형 서열에 비해 하나 이상의 아미노산 치환들을 가질 수 있다. 상기 변형된 절단된 VWF의 D' 도메인의 아미노산 서열은 바람직하게 서열번호 4의 D’ 도메인에 비해 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 갖는다. 서열번호 2의 1번 위치에 상응하는 서열번호 4의 764번 위치에서의 S가 G, P, V, E, Y, A 및 L로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되는 것이 바람직하다. 서열번호 2의 3번 위치에 상응하는 서열번호 4의 766번 위치에서의 S는 Y, I, M, V, F, H, R 및 W로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산으로 치환되는 것이 또한 바람직하다. 치환의 바람직한 조합은 서열번호 4의 서열을 참조로 하여, S764G/S766Y, S764P/S766I, S764P/S766M, S764V/S766Y, S764E/S766Y, S764Y/S766Y, S764L/S766Y, S764P/S766W, S766W/S806A, S766Y/P769K, S766Y/P769N, S766Y/P769R 및 S764P/S766L을 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드의 FVIII로의 결합 친화성은 상기 변형을 제외하고는 동일한 아미노산 서열을 갖는 표준 폴리펩타이드의 결합 친화성과 비교하여 상기 치환에 의해 추가로 증가될 수 있다. 절단된 VWF 내 상기 치환은 내인성 FVIII의 반감기 또는 동시 투여된 FVIII의 반감기를 추가로 증가시키는데 기여할 수 있고/있거나 투여될 본 발명의 재조합 폴리펩타이드의 용량을 감소시킬 수 있다.
반감기 연장 모이어티
사람 혈장 내 내인성 VWF의 반감기는 약 16h이다(Lenting PJ, Christophe OD, Denis CV. von Willebrand factor biosynthesis, secretion, and clearance: connecting the far ends. Blood. 2015.125(13):2019-28).
상기 절단된 VWF 이외에, 본 발명의 폴리펩타이드는 반감기 연장 모이어티를 추가로 포함한다. 상기 반감기 연장 모이어티는 절단된 VWF에 융합된 이종성 아미노산 서열일 수 있다. 다르게는, 상기 반감기 연장 모이어티는 펩타이드 결합과 다른 공유 결합에 의해 상기 절단된 VWF를 포함하는 폴리펩타이드에 화학적으로 접합될 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 반감기는 화학적 변형, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(페길화), 글리코실화된 PEG, 하이드록실 에틸 전분(헤실화(HESylation)), 폴리시알산, 엘라스틴-유사 폴리펩타이드, 헤파로산 중합체 또는 히알루론산과 같은 반감기 연장 모이어티의 부착에 의해 연장된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 화학적 링커를 통해 알부민과 같은 HLEP에 접합된다. 이러한 접합 기술의 원리은 컨주켐 엘엘씨(Conjuchem LLC)에 의한 예시적 방식으로 기재된 바 있다(예를 들어, 미국 특허 7,256,253호를 참조한다).
다른 구현예에서, 반감기 연장 모이어티는 반감기 증진 단백질(HLEP)이다. 바람직하게, HLEP는 알부민 또는 이의 단편이다. 알부민의 N-말단은 상기 절단된 VWF의 C-말단에 융합될 수 있다. 대안적으로, 알부민의 C-말단은 상기 절단된 VWF의 N-말단에 융합될 수 있다. 1개 이상의 HLEP들은 VWF의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있고, 단, 이들은 FVIII에 대한 상기 절단된 VWF의 결합 능력을 방해하거나 상실시키지 않는다.
재조합 폴리펩타이드는 추가로 바라직하게 절단된 VWF와 HLEM 사이에 위치된 화학적 결합 또는 링커 서열을 포함한다.
상기 링커 서열은 하나 이상의 아미노산, 특히 1 내지 50, 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5 또는 1 내지 3(예컨대, 1, 2 또는 3)개의 아미노산들로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있고, 이들은 서로 동일하거나 서로 상이할 수 있다. 바람직하게, 상기 링커 서열은 야생형 VWF 내의 상응하는 위치에 존재하지 않는다. 상기 링커 서열에 존재하는 바람직한 아미노산은 Gly 및 Ser을 포함한다. 상기 링커 서열은 비-면역원성이어야 한다. 바람직한 링커는 번갈아 존재하는 글리신과 세린 잔기로 구성될 수 있다. 적합한 링커는 예를 들어, WO2007/090584에 기재되어 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 절단된 VWF 모이어티와 HLEM 사이의 펩타이드성 링커는 펩타이드 서열들로 이루어지고, 이는 사람 단백질 내의 천연 도메인간 링커로서 작용한다. 바람직하게는, 이들의 천연 환경에 있는 이러한 펩타이드 서열은 단백질 표면에 가깝에 위치해 면역계에 접근가능하기 때문에, 이러한 서열에 대한 천연 관용성을 추정할 수 있다. 이의 예는 WO 2007/090584에 제공된다. 절단가능한 링커 서열은 예를 들어, WO 2013/120939 A1호에 기재되어 있다.
재조합 폴리펩타이드의 바람직한 구현예에서, 절단된 VWF와 HLEM 사이의 링커는 서열번호 2의 아미노산 서열 480-510을 갖거나 이들로 이루어진 글리신/세린 펩타이드 링커이다.
하나의 구현예에서, 상기 폴리펩타이드는 하기 구조를 갖는다:
[화학식 1]
tVWF - L1 - H
상기 식 중에서, tVWF는 상기 절단된 VWF이고, L1은 화학 결합 또는 링커 서열이고, H는 HLEP이다.
L1은 하나 이상의 아미노산, 예를 들어, 1 내지 50, 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5 또는 1 내지 3개(예를 들어,1, 2 또는 3개)의 아미노산들로 이루어진 화학 결합 또는 링커 서열일 수 있고, 이들은 서로 동일하거나 서로 상이할 수 있다. 통상적으로, 상기 링커 서열은 야생형 VWF 내의 상응하는 위치에 존재하지 않는다. L1에 존재하는 적절한 아미노산의 예로는 Gly 및 Ser이 포함된다. 상기 링커는 비면역원성이어야 하고, 절단불가능한 링커 또는 절단가능한 링커일 수 있다. 절단불가능한 링커는 WO2007/090584호에 예시된 바와 같이 번갈아 존재하는 글리신과 세린 잔기로 구성될 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 절단된 VWF 모이어티와 알부민 모이어티 사이의 펩타이드성 링커는 펩타이드 서열들로 이루어지고, 이는 사람 단백질 내의 천연 도메인간 링커로서 작용한다. 바람직하게는, 이런 천연 환경에 있는 이러한 펩타이드 서열은 단백질 표면에 가깝에 위치해 면역계에 접근가능하기 때문에, 이러한 서열에 대해 자연적 내성을 가질 수 있다고 추정할 수 있다. 그 예들은 WO2007/090584호에 제공되어 있다. 절단가능한 링커 서열은 예를 들어, WO 2013/120939 A1호에 기술되어 있다.
바람직한 HLEP 서열들은 상기에 기술되어 있다. 마찬가지로, 각 HLEP의 정확한 "N-말단 아미노산"에 대한 융합 또는 정확한 “C-말단 아미노산"에 대한 융합, 또는 각 HLEP의 "N-말단 아미노산” 또는 “C-말단 아미노산"에 대한 융합이 본 발명에 포함되고, 이는 HLEP의 하나 이상의 아미노산에 대한 N-말단 결실을 포함한다. 상기 폴리펩타이드는 1개 초과의 HLEP 서열, 예를 들어, 2개 또는 3개의 HLEP 서열을 포함할 수 있다. 이러한 다중 HLEP 서열들은 VWF의 C-말단 부분에 탠덤(tandem)식으로, 예를 들면, 연속적인 반복으로서 융합될 수 있다.
반감기 증진 폴리펩타이드 (HLEP)
바람직하게, 반감기 연장 모이어티는 반감기 연장 폴리펩타이드(HLEP)이고, 보다 바람직하게, HLEP는 알부민 또는 이의 단편, 면역글로불린 불변 영역 및 이의 부분, 예를 들면, Fc 단편, 큰 유체역학적 용적을 갖는 용매화된 무작위 쇄(예를 들면, XTEN(Schellenberger et al. 2009; Nature Biotechnol. 27:1186-1190)), 동종-아미노산 반복체(HAP) 또는 프롤린-알라닌-세린 반복체(PAS), 아파민, 알파-태아단백질, 비타민 D 결합 단백질, 트랜스페린 또는 이의 변이체, 사람 융모성 고나도트로핀-β 서브유닛의 카르복실-말단 펩타이드(CTP), 생리학적 조건 하에 알부민 또는 면역글로불린 불변 영역에 결합할 수 있는 폴리펩타이드 또는 지질로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본원에 사용된 바와 같은 “반감기 증진 폴리펩타이드"는 바람직하게는 알부민, 알부민-패밀리의 구성원, 면역글로불린 G의 불변 영역 및 이의 단편, 생리학적 조건 하에 알부민, 알부민 패밀리의 구성원 뿐만 아니라 면역글로불린 불변 영역의 부분에 결합할 수 있는 영역 및 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이는 본원에 기재되어 있는 전장 반감기 증진 단백질(예컨대, 알부민, 알부민-패밀리의 구성원 또는 면역글로불린 G의 불변 영역), 또는 혈액응고 인자의 치료학적 활성 또는 생물학적 활성을 안정화시키거나 연장시킬 수 있는 이의 1개 이상의 단편일 수 있다. 이러한 단편은 10개 이상의 아미노산 길이로 이루어질 수 있거나, 또는 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 적어도 약 50개, 적어도 약 100개, 또는 그 이상의 연속된 HLEP 서열의 아미노산을 포함할 수 있거나, 또는 HLEP 단편이 해당 HLEP 부재 하에 각 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 25%의 기능적 반감기 연장을 제공하는 한, 각 HLEP의 특정 도메인의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드의 HLEP 부분은 야생형 HLEP의 변이체일 수 있다. 용어 "변이체"는 보존적 또는 비보존적인 삽입, 결실 및 치환을 포함하고, 이 경우, 그러한 변화는 실질적으로 상기 절단된 VWF의 FVIII-결합 활성을 변화시키지 않는다.
특히, 본 발명에서 제안된 VWF HLEP 융합 작제물은 HLEP의 자연 발생형 다형성 변이체 및 HLEP의 단편을 포함할 수 있다. 상기 HLEP는 임의의 척추동물, 특히 임의의 포유동물, 예를 들어, 사람, 원숭이, 소, 양 또는 돼지로부터 유래될 수 있다. 비포유동물 HLEP로는 수탉 및 연어가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본원의 개시내용의 특정 구현예에 따라, 본 발명의 폴리펩타이드의 일부인 반감기 연장 모이어티, 특히, HLEP는 또 다른 용어 “FP”로 특정될 수 있다. 바람직하게, 용어 "FP"는 달리 지적되지 않는 경우 사람 알부민을 나타낸다.
특정 바람직한 구현예에 따라, 상기 폴리펩타이드는 융합 단백질이다. 본 발명 측면에서 융합 단백질은 절단된 VWF 및 HLEP를 암호화하는 적어도 2개의 DNA 서열의 프레임 내 연결에 의해 생성되는 단백질이다. 당업자는 융합 단백질 DNA 서열의 해독이 단일 단백질 서열을 유도함을 이해한다. 추가의 바람직한 구현예에 따른 펩타이드 링커를 암호화하는 DNA 서열의 프레임 내 삽입의 결과로서, 절단된 VWF, 적합한 링커 및 HLEP를 포함하는 융합 단백질이 수득될 수 있다.
HLEP로서의 알부민
"사람 혈청 알부민"(HSA) 및 "사람 알부민"(HA) 및 "알부민"(ALB)이라는 용어는 본 출원에서 상호 교환하여 사용된다. "알부민" 및 "혈청 알부민"이라는 용어가 더 광의적으로, 사람 혈청 알부민(및 그의 단편들 및 변이체들) 뿐만 아니라 다른 종들의 알부민(및 그의 단편들 및 변이체들)을 망라한다.
본원에서, "알부민"은 알부민의 하나 이상의 기능적 활성(예를 들면, 생물학적 활성)을 갖는, 알부민 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열, 또는 알부민 단편 또는 변이체를 총괄하여 지칭한다. 특히, "알부민"은 사람 알부민 또는 이의 단편, 특히 본원의 서열번호 6에 나타낸 사람 알부민 또는 다른 척추동의 알부민의 성숙된 형태 또는 이의 단편들, 또는 이러한 분자들의 유사체 또는 변이체 또는 이의 단편을 지칭한다.
본원의 개시내용의 특정 구현예에 따라, 또 다른 용어 "FP"는 HLEP를 식별하고, 특히 HLEP로서 알부민을 한정하기 위해 사용된다.
특히, 본 발명의 제안된 폴리펩타이드는 사람 알부민의 자연 발생 다형성 변이체 및 사람 알부민의 단편를 포함할 수 있다. 일반적으로 말하면, 알부민 단편 또는 변이체는 적어도 10개, 바람직하게는 적어도 40개, 가장 바람직하게는 70개 이상의 아미노산 길이이다.
본 발명의 바람직한 구현예들은 FcRn 수용체에 대한 결합이 증강된, 본 발명의 폴리펩타이드의 HLEP로서 사용된 알부민 변이체를 포함한다. 이러한 알부민 변이체는 절단된 VWF의 야생형 알부민과의 융합과 비교했을 때 상기 절단된 VWF 알부민 변이체 융합 단백질의 보다 긴 혈장 반감기를 유도할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드의 알부민 부분은 HA의 적어도 하나의 서브도메인 또는 도메인, 또는 이들의 보존적 변형을 포함할 수 있다.
HLEP로서의 면역글로불린
면역글로불린 G(IgG) 불변 영역(Fc)은 당해 분야에 치료학적 단백질의 반감기를 증가시키는 것으로 공지되어 있다(문헌참조: Dumont J A et al. 2006. BioDrugs 20:151-160). 중쇄의 IgG 불변 영역은 3개의 도메인(CH1-CH3)과 힌지 영역으로 이루어진다. 면역글로불린 서열은 임의의 포유동물, 또는 그의 서브클래스 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 각각 유도될 수 있다. 항원-결합 도메인이 없는 IgG 및 IgG 단편들이 HLEP로서 사용될 수도 있다. 치료용 폴리펩타이드 부분은 바람직하게는 항체 또는 펩타이드 링커의 힌지 영역을 통해 IgG 또는 IgG 단편에 연결되며, 이는 심지어 절단할 수도 있다. 수개의 특허 및 특허출원들이 치료용 단백질의 생체내 반감기를 개선하기 위해 면역글로불린 불변 영역에 상기 치료용 단백질을 융합시키는 것에 대하여 기술하고 있다. US 2004/0087778호 및 WO 2005/001025호는 펩타이드의 반감기를 증가시키고 그렇지 않으면 생체내에서 신속하게 제거되는, 생물학적으로 활성인 펩타이드를 갖는 면역글로불린 불변영역의 적어도 일부 또는 Fc 도메인의 융합 단백질에 대하여 설명하고 있다. 증강된 생물학적 활성, 연장된 순환성 반감기 및 더 큰 용해도가 달성된 Fc-IFN-β 융합 단백질에 대해서도 기술되었다 (WO 2006/000448호). 연장된 혈청 반감기 및 증가된 생체내 효능을 갖는 Fc-EPO 단백질(WO 2005/063808)뿐만 아니라, 전부 반감기 증진 특성을 갖는 G-CSF를 갖는 Fc 융합(WO 2003/076567), 글루카곤-유사 펩타이드-1(WO 2005/000892), 응혈 인자(WO 2004/101740) 및 인터류킨-10(U.S. Pat. No. 6,403,077)이 개시되었다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 각종 HLEP는 WO 2013/120939 A1에 상세하게 기재되어 있다.
본 발명의 폴리펩타이드의 N-글리칸 및 시알릴화
본 발명의 폴리펩타이드는 바람직하게는 N-글리칸을 포함하며, 상기 N-글리칸 중 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%는, 평균적으로, 적어도 하나의 살리실산 부분을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 N-글리칸 중 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%는, 평균적으로, 적어도 하나의 살리실산 부분을 포함한다. 본 발명자들은 고도로 시알릴화된 VWF 단편을 포함하는 폴리펩타이드가 자체적으로 연장된 반감기를 가질 뿐만 아니라 동시 투여된 FVIII의 반감기를 연장시킬 수도 있다는 사실을 밝혔다. 다시 말해서, 본 발명의 폴리펩타이드의 투여는 연장된 반감기 및/또는 동시 투여된 FVIII의 감소된 소거율을 유도한다.
본 발명의 폴리펩타이드 바람직하게는 N-글리칸을 포함하며, 상기 폴리펩타이드의 N-글리칸의 시알릴기 중 적어도 50%는 α-2,6-결합된 시알릴기이다. 일반적으로, 말단 시알릴기는 α-2,3- 또는 α-2,6-결합을 통해 갈락토스 기에 부착될 수 있다. 통상적으로, 본 발명의 폴리펩타이드의 N-글리칸은 α-2,3-결합된 시알릴기보다 α-2,6-결합된 시알릴기를 더 많이 포함한다. 바람직하게는, N-글리칸의 시알릴기 중 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%는 α-2,6-결합된 시알릴기이다. 이러한 구현예들은 예를 들어, 포유동물 세포에서 사람 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제를 동시-발현시킴에 의해 수득될 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 N-글리칸 중 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%는 적어도 하나의 시알산기를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 N-글리칸 중 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%는 적어도 하나의 시알산기를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 N-글리칸 중 15% 미만, 12% 미만, 10% 미만, 또는 8% 미만, 또는 6% 미만, 또는 5% 미만, 또는 4% 미만, 또는 3% 미만, 또는 2% 미만 또는 심지어 1% 미만이 비시알산-N-글리칸, 즉, 시알산기가 결여된 N-글리칸이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 N-글리칸 중 15% 미만, 12% 미만, 10% 미만, 또는 8% 미만, 또는 6% 미만, 또는 5% 미만, 또는 4% 미만, 또는 3% 미만, 또는 2% 미만 또는 심지어 1% 미만이 비시알산-N-글리칸인데, 즉, 이들은 시알산기를 함유하고 있지 않다.
상기 당단백질을 생성하는 적합한 방법은 계류중인 PCT/EP2016/061440에 기재되어 있다. 따라서, 시알화가 증가된 N-글리칸을 포함하는 당단백질을 제조하는 방법은 본원에 기재되어 있고, 상기 방법은 절단된 폰 빌레브란트 인자 (VWF)를 포함하는폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 제공하는 단계 및 (ii) 상기 세포를 36.0°C 미만의 온도에서 배양하는 단계를 포함한다. 추가로, 절단된 폰 빌레브란트 인자 (VWF)를 포함하는 당단백질의 이량체를 제조하거나, 또는 상기 당단백질의 이량체화를 증가시키는 방법이 기재되고, 상기 방법은 (i) 당단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 제공하는 단계, 및 (ii) 상기 세포를 36.0℃ 미만의 온도에서 배양하는 단계를 포함한다. 추가로, 시알화가 증가된 N-글리칸을 포함하는 당단백질을 제조하는 방법이 본원에 기재되어 있고, 상기 방법은 (i) 절단된 폰 빌레브란트 인자 (VWF)를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 제공하는 단계 및 (ii) 상기 세포를 당단백질 및 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제의 발현을 가능하게 하는 조건하에서 배양하는 단계를 포함한다.
상기된 구현예들은 서로 조합될 수 있다. 상기 언급한 N-글리칸의 임의의 비율, 또는 시알릴화의 정도에 대한 임의의 표시는, 평균 비율 또는 정도로서 이해되며, 즉 이들은 단일 분자가 아니라 분자의 집단에 대하여 언급하고 있는 것이다. 당단백질의 군 내에서 개개의 당단백질 분자의 글리코실화 또는 시알릴화는 일부 이종성을 나타낼 것이라는 것은 명백하다.
이량체
본 발명의 폴리펩타이드는 바람직하게 높은 비율의 이량체를 갖는다. 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 바람직하게는 이량체로 존재한다. 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 바람직하게는 이량체로 존재한다. 한 구현예에서, 폴리펩타이드 중 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%는 이량체로 존재한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 이량체:단량체 비율은 적어도 1.5, 바람직하게는 적어도 2, 보다 바람직하게는 적어도 2.5 또는 적어도 3이다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 모든 폴리펩타이드는 이량체로 존재한다. 이량체가 단량체에 비해 인자 VIII에 대해 개선된 친화도를 가지기 때문에, 이량체의 사용이 선호된다. 본 발명의 폴리펩타이드의 이량체 함량 및 이량체 대 단량체의 비율은 실시예에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 인자 VIII로의 친화성은 동일한 인자 VIII 분자에 대한 사람 고유의 VWF의 친화성 보다 크다. 인자 VIII 친화도는 사람의 천연 인자 VIII, 또는 서열번호 5를 특징으로 하는 인자 VIII 분자를 가리킬 수 있다.
높은 이량체 비율을 갖는 본 발명의 폴리펩타이드의 제조는 인자 VIII에 대하여 친화도가 증가된다는 점도 밝혀졌다. 이러한 인자 VIII에 대해 증가된 친화도는 본 발명의 폴리펩타이드에 의한 인자 VIII의 증강된 안정화를 유도하게 된다. 증가된 이량체 비율과 다르게, 또는 이와 조합하여, 인자 VIII에 대한 친화도를 증가시키는 인자 VIII 결합 도메인 내에 돌연변이를 갖는 본 발명에 따른 폴리펩타이드도 본 발명의 바람직한 구현예가다. 적절한 돌연변이는 예컨대, WO 2013/120939 A1호에 개시되어 있다.
폴리펩타이드의 제조
발현되는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 당업계에 공지되어 있는 방법에 따라 제조될 수 있다. VWF의 cDNA 서열(서열번호 3)에 기초하여, 상기 언급된 절단된 VWF 작제물을 암호화하는 재조합 DNA를 설계하여 제조할 수 있다.
숙주 세포에 의해 분비되는 폴리펩타이드가 VWF의 아미노산 1 내지 763을 포함하지 않는 경우라도, 상기 폴리펩타이드의 세포내 전구체를 암호화하는 핵산(예를 들면, DNA)은 서열번호 4의 아미노산 23 내지 763 또는 바람직하게는 아미노산 1 내지 763과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는, 상기 폴리펩타이드의 세포내 전구체를 암호화하는 핵산(예를 들어, DNA)은 서열번호 4의 아미노산 23 내지 763 또는 서열번호 4의 아미노산 1 내지 763을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
DNA가 발현 플라스미드에 정확한 배향으로 삽입된 전체 오픈 리딩 프레임을 포함하는 작제물을 단백질 발현에 사용할 수 있다. 통상적인 발현 벡터는 플라스미드를 함유하는 세포 내에서 상기 삽입된 핵산에 상응하는 대량의 mRNA의 합성을 지시하는 프로모터를 포함한다. 또한, 이들은 숙주 유기체 내에서 이들의 자가 복제를 가능케 하는 복제 기원의 서열 및 합성된 mRNA가 번역되는 효능을 증가시키는 서열을 포함할 수도 있다. 안정한 장기 벡터는 예를 들어, 바이러스의 조절 요소(예컨대, 엡스타인 바(Epstein Barr) 바이러스 게놈 유래의 OriP 서열)를 사용함으로써 자유롭게 복제하는 독립체로서 유지될 수 있다. 게놈성 DNA에 벡터를 통합한 세포주도 제조될 수 있으며, 이러한 방식으로 유전자 생성물은 지속적으로 생산된다.
통상적으로, 제공되는 세포는 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포유동물 숙주 세포에 도입함으로써 수득된다.
세포 배양물 및 당단백질의 발현에 대해 민감한 임의의 숙주 세포를 본 발명에 따라 이용할 수 있다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 포유동물이다. 본 발명에 따라 사용할 수 있는 포유동물 세포의 비-제한적 예로는 BALB/c 마우스 골수종 세포주(NSO/1, ECACC No: 85110503); 사람 망막모세포(PER.C6(CruCell, Leiden, The Netherlands)); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 사람 배아 신장 세포주(293 또는 현탁 배양액 중의 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59, 1977); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL10); 차이니즈 햄스터 난소 세포 +/-DHFR(CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243 251, 1980); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1 587); 사람 자궁경부 암종 세포(HeLa, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 사람 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 사람 간 세포(HepG2, HB 8065); 마우스 유선 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., Annals NY. Acad. Sci., 383:44-68, 1982); MRC 5 세포; PS4 세포; 사람 양수 세포(CAP); 및 사람 간세포암 세포주(Hep G2)가 포함된다. 바람직하게는, 상기 세포주는 설치류 세포주이고, 특히 CHO 또는 BHK와 같은 햄스터 세포주이다.
원하는 당단백질의 발현을 달성하기에 충분한 핵산을 포유동물 숙주 세포 내에 도입하는데 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Gething et al., Nature, 293:620-625, 1981; Mantei et al., Nature, 281:40-46, 1979; Levinson et al. EP 117,060; 및 EP 117,058]을 참조한다. 포유동물 세포의 경우, 포유동물 세포에 유전자 물질을 도입하는 통상의 방법으로는 Graham 및 van der Erb(Virology, 52:456-457, 1978)의 칼슘 포스페이트 침전법 또는 Hawley-Nelson(Focus 15:73, 1993)의 리포펙타민™(Gibco BRL) 방법이 포함된다. 포유동물 세포 숙주 시스템 형질전환의 일반적 양상은 US. Pat. No. 4,399,216에 Axel에 의해 기술되어 있다. 포유동물 세포에 유전자 물질을 도입하기 위한 각종 기법에 대해서는, 문헌[Keown et al., Methods in Enzymology, 1989], [Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537, 1990] 및 [Mansour et al., Nature, 336:348-352, 1988]을 참조한다.
세포는 상기 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 하는 조건 하에 배양된다. 상기 폴리펩타이드는 당업계의 숙련자에게 공지된 방법을 사용하여 회수 및 정제될 수 있다.
내인성 FVIII의 최대 농도 및 이의 시간-농도 곡선 이하 면적
본 발명의 바람직한 양상에 따라 본원에서 상기 정의된 바와 같은 폴리펩타이드는 비치료된 대상체와 비교하여 단독, 즉, FVIII의 동시-투여 없이 본 발명의 폴리펩타이드의 투여에 의해 내인성 인자 FVIII의 Cmax 또는 AUC를 증가시키기 위해 사용된다.
최대 농도(Cmax)는 측정된 최고의 혈장 농도 값이다. 상기 재조합 폴리펩타이드의 투여 후, FVIII에 대한 Cmax는 적어도 10 mIU/mL, 적어도 25 mIU/mL, 적어도 50 mIU/mL, 적어도 100 mIU/mL, 적어도 200 mIU/mL, 적어도 300 mIU/mL 또는 적어도 400 mIU/mL일 수 있다.
AUC0-t 는 제로에서 마지막 측정된 시점까지의 혈장 농도-시간 곡선 이하의 피크 면적이다. 상기 재조합 폴리펩타이드의 투여 후, 내인성 FVIII에 대한 AUC는 적어도 1000 mIU*h/mL, 적어도 2000 mIU*h/mL, 적어도 3000 mIU*h/mL, 적어도 5000 mIU*h/mL, 적어도 10000 mIU*h/mL 또는 적어도 20000 mIU*h/mL의 발색성 FVIII 활성일 수 있다.
피하 투여 후 rD'D3-FP의 생물유용성
본 발명의 추가의 양상은 본원에서 상기 정의된 바와 같은 폴리펩타이드의 피하 생물유용성을 제공하거나 개선시키는 것에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 생물유용성은 i.v. 투여 후 본 발명의 폴리펩타이드의 AUC0-inf에 상대적으로 s.c. 투여 후 본 발명의 폴리펩타이드의 AUC0-inf의 퍼센트로서 정의된다. AUC0-inf 는 제로에서 무제한의 혈장 농도-시간 곡선 이하의 면적이다. AUC0-inf의 계산을 위한 약동학 데이터의 평가를 위해, 2개-격실 모델 (2단계 약동학 프로필)을 적용하였다.
특정 구현예에 따라, 동시-투여된 FVIII의 부재하에 재조합 폴리펩타이드의 생물유용성은 적어도 30%, 바람직하게 적어도 35%, 보다 바람직하게 적어도 40%, 적어도 45% 또는 적어도 50%이다.
특정 구현예에 따라, FVIII와의 동시-투여 후 재조합 폴리펩타이드의 생물유용성은 적어도 30%, 바람직하게 적어도 35%, 보다 바람직하게 적어도 40%, 적어도 45% 또는 적어도 50%이다.
응고 장애의 치료
본 발명의 추가의 양상은 혈액 응고 장애를 치료하는 방법이고, 상기 방법은 상기 본원에 정의된 바와 같은 유효량의 폴리펩타이드를, 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함한다.
본 발명의 폴리펩타이드는 혈우병 A 및 폰-빌레브란트 질환을 포함하는 혈액 응고 장애를 치료하기 위해 유용하다. 용어 "혈우병 A"는 일반적으로 유전되는 기능적 응고 FVIII에서의 결핍을 언급한다. 폰-빌레브란트 질환은 폰-빌레브란트 질환 유형 2N, 폰-빌레브란트 질환 유형 3, 및 폰-빌레브란트 질환 유형 1로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 상기 혈액 응고 장애는 치료 전 내인성 FVIII 활성 수준이 NHP 내 내인성 FVIII 활성 수준과 비교하여 감소되어 있음을 특징으로 하는 폰-빌레브란트 질환 유형 1이다.
치료될 환자는 NHP 내 내인성 FVIII와 비교하여 내인성 FVIII의 감소된 활성 및/또는 수준을 가질 수 있다. 환자에서 내인성 FVIII 활성은 NHP 내 내인성 FVIII 활성의 80% 미만, 또는 70% 미만, 또는 60% 미만, 또는 50% 미만, 또는 40% 미만, 또는 30% 미만, 또는 20% 미만, 또는 20% 미만, 또는 10% 미만, 또는 5% 미만일 수 있다. 치료될 환자에서 내인성 FVIII 활성은 전체 혈액의 0.8 IU/ml 미만, 또는 0.7 IU/ml 미만, 또는 0.6 IU/ml 미만, 또는 0.5 IU/ml 미만, 또는 0.4 IU/ml 미만, 또는 0.3 IU/ml 미만, 또는 0.2 IU/ml 미만, 또는 0.1 IU/ml 미만, 또는 0.05 IU/ml 미만일 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 적어도 0.005 IU/mL의 내인성 FVIII 활성을 갖는 환자에게 투여되어야만 한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 전체 혈액의 0.01 내지 0.4 IU/ml, 또는 0.02 내지 0.3 IU/ml, 또는 0.03 내지 0.2 IU/ml, 또는 0.04 내지 0.1 IU/ml의 내인성 FVIII 활성을 갖는 환자에게 투여되어야만 한다.
하나의 구현예에서, 혈액 응고 장애는 중간 정도의 혈우병 A이다. 중간 정도의 혈우병 A는 바람직하게 NHP에서 내인성 FVIII 활성의 약 1% 내지 약 5%인 내인성 FVIII 활성 수준을 특징으로 한다. 전형적으로, 중간 정도의 혈우병 A를 갖는 대상체는 혈장 중 0.01 내지 0.05 IU/mL의 내인성 FVIII 활성 수준을 갖는다.
또 다른 구현예에서, 혈액 응고 장애는 약한 혈우병 A이다. 약한 혈우병 A는 바람직하게 NHP에서 내인성 FVIII 활성 수준의 약 5% 내지 약 40%인 내인성 FVIII 활성 수준을 특징으로 한다. 전형적으로, 약한 혈우병 A를 갖는 대상체는 혈장 중 0.05 내지 0.4 IU/mL의 내인성 FVIII 활성 수준을 갖는다.
또 다른 구현예에서, 혈액 응고 장애는 중증 혈우병 A이다. 중증 혈우병 A는 NHP에서 내인성 FVIII 활성의 1% 미만인 내인성 FVIII 활성 수준을 특징으로 한다.
또 다른 구현예에서, 혈액 응고 장애는 폰-빌레브란트 질환 유형 2N이다. 폰-빌레브란트 질환 유형 2N은 바람직하게 치료 전 내인성 FVIII 활성 수준이 NHP 내 내인성 FVIII 활성 수준의 약 3% 내지 약 30%에 상응하는 약 3 IU/dL 내지 약 30 IU/dL FVIII 활성 수준의 범위에 있음을 특징으로 한다. 대부분의 환자들은 20 IU/dL 미만의 내인성 FVIII 활성 수준을 갖고, 따라서 NHP에서 내인성 FVIII 활성 수준의 20% 미만의 수준을 갖는다. 따라서, 폰-빌레브란트 질환 유형 2N을 갖는 대상체는 혈장 내 0.03 IU/mL 내지 0.3 IU/mL, 전형적으로 0.2 IU/mL 미만의 내인성 FVIII 활성 수준을 갖는다.
또 다른 구현예에서 혈액 응고 장애는 폰-빌레브란트 질환 유형 3이고, 이는 바람직하게 치료 전 내인성 FVIII 활성 수준이 NHP 내 내인성 FVIII 활성 수준의 약 1% 내지 약 20%에 상응하는 약 1 IU/dL 내지 약 20 IU/dL FVIII 활성 수준의 범위에 있음을 특징으로 한다. 대부분의 환자들은 10 IU/dL 미만의 내인성 FVIII 활성 수준을 갖고, 따라서 NHP에서 내인성 FVIII 활성 수준의 10% 미만의 수준을 갖는다.
본 발명의 폴리펩타이드는 바람직하게 출혈 사건의 예방학적 예방을 위해 대상체에게 투여된다. 상기 치료는 임의의 외인성 FVIII의 투여를 포함하지 않는다. 본 발명의 폴리펩타이드는 또한 출혈 사건의 치료를 위해 대상체에게 투여될 수 있다. 상기 경우에, 본 발명의 폴리펩타이드는 외인성 FVIII와 동시-투여될 수 있다. 출혈 사건의 상기 치료 후, 이어서 후속 치료는 외인성 FVIII의 동시-투여 없이 수행된다. 즉, 후속 치료는 단지 본 발명의 폴리펩타이드를 사용하여 수행된다.
전형적으로, 단독의, 즉 외인성 FVIII의 동시-투여 없이 본 발명의 폴리펩타이드를 사용한 치료는 출혈 사건이 일어날때까지 계속된다. 단독의, 즉 외인성 FVIII의 동시-투여 없이 본 발명의 폴리펩타이드를 사용한 치료의 지속기간은 특히 제한되지 않고, 이것은 일반적으로 적어도 1주, 또는 적어도 2주, 또는 적어도 3주, 또는 적어도 4주, 또는 적어도 2개월 동안 계속된다.
질환의 치료는 임의의 임상학적 단계 또는 징후의 임의 형태의 질환을 갖는 것으로 이미 진단된 환자의 치료; 상기 질환의 증상 또는 징후의 개시 또는 진전 또는 악화 또는 격화의 지연; 및/또는 상기 질환의 예방 및/또는 상기 질환의 중증도의 감소를 포함한다.
본 발명의 폴리펩타이드가 투여되는 "대상체" 또는 "환자"는 사람인 것이 바람직하다. 특정 양태에서, 상기 사람은 소아 환자이다. 다른 양태에서, 상기 사람은 성인 환자이다.
본 발명의 폴리펩타이드 및 임의로 FVIII를 포함하는 조성물이 본원에 기술된다. 상기 조성물은 통상적으로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 멸균 약제학적 조성물의 일부로서 제공된다. 이러한 조성물은 (환자에게 이를 투여하는 소정의 방법에 따라) 임의 적절한 형태로 존재할 수 있다.
"인자 VIII" 및 "FVIII” 라는 용어는 본원에서 상호교환하여 사용되며, 혈장 유래된 FVIII 및 재조합 FVIII 모두를 포함한다. 재조합 FVIII는 전장 FVIII 뿐만 아니라, 단일쇄 B-도메인 결실 또는 절단된 변이체 및 2쇄 B-도메인 결실 또는 절단된 변이체, 예를 들어, WO 2004/067566호에 기술된 것들과, B-도메인 외부에 돌연변이를 갖지만 FVIII의 생물학적 활성을 갖는 다른 FVIII 변이체도 제한없이 포함한다.
본 발명의 폴리펩타이드는 경구, 경피, 피하, 비강내, 정맥내, 복강내, 근육내, 국소 또는 국부와 같은 각종 경로에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 임의의 주어진 경우에서 가장 적합한 투여 경로는 특정 폴리펩타이드, 대상체 및 질환의 성질 및 중증도 및 대상체의 생리학적 조건에 의존할 것이다. 전형적으로, 본 발명의 폴리펩타이드는 정맥내 투여될 것이다.
본 발명에 따라, 본 발명의 폴리펩타이드로 치료받은 환자는 또한 혈액 응고 인자 VIII로 치료받을 수 있고 단, 후속 치료는 단독의, 즉 외인성 FVIII의 동시-투여 없이 수행된다. 본 발명의 폴리펩타이드 및 인자 VIII는 "병용 치료요법" 및 "동시 투여"라는 용어에 포함되는 양 투여 방식 모두로 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드 및 인자 VIII 혼합물로서, 즉, 동일한 조성물 내에서, 또는 개별적으로, 즉, 별도의 조성물로서 투여될 수 있다.
폴리펩타이드 및 임의로 FVIII는 바람직하게 정맥내 또는 피하 투여된다.
제1 구현예에서, 상기 폴리펩타이드 및 임의로 FVIII 둘다는 정맥내 투여된다. 제2 구현예에서, 상기 폴리펩타이드 및 임의로 FVIII 둘다는 피하 투여된다.
또 다른 구현예에서, 상기 FVIII는 정맥내 투여되고, 상기 폴리펩타이드는 다른 경로를 통해 투여된다. 추가의 구현예에서, 상기 폴리펩타이드는 피하 투여되고, 상기 FVIII는 다른 경로를 통해 투여된다. 예를 들어, 상기 폴리펩타이드는 피하 투여될 수 있고, 상기 FVIII는 정맥내 투여될 수 있다.
추가의 구현예에서, 상기 FVIII는 피하 투여되고, 상기 폴리펩타이드는 다른 경로를 통해 투여된다. 추가의 구현예에서, 상기 폴리펩타이드는 정맥내 투여되고, 상기 FVIII는 다른 경로를 통해 투여된다. 예를 들어, 상기 폴리펩타이드는 정맥내 투여될 수 있고, 상기 FVIII는 피하 투여될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드를 이용한 총 용량 수 및 치료 기간의 결정은 당업자의 능력 범위내에 있다. 투여될 본 발명의 폴리펩타이드의 용량은 치료될 환자에서 내인성 FVIII의 농도, 내인성 VWF의 농도, 또는 상기 둘다에 의존할 수 있다. 본원에 기재된 비율을 기초로 한 유효 용량은 본 발명의 폴리펩타이드의 분자량을 고려하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. FVIII에 대한 통상적인 용량은 약 20 U/kg 체중 내지 약 100 U/kg 체중 범위일 수 있다.
사용된 조성물 중의 인자 VIII의 농도는 전형적으로 10 내지 10,000 IU/mL의 범위 내이다. 서로 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물 중의 FVIII의 농도는 10 내지 8,000 IU/mL, 또는 10 내지 5,000 IU/mL, 또는 20 내지 3,000 IU/mL, 또는 50 내지 1,500 IU/mL의 범위 내이거나, 3,000 IU/mL, 또는 2,500 IU/mL, 또는 2,000 IU/mL, 또는 1,500 IU/mL, 또는 1,200 IU/mL, 또는 1,000 IU/mL, 또는 800 IU/mL, 또는 750 IU/mL, 또는 600 IU/mL, 또는 500 IU/mL, 또는 400 IU/mL, 또는 300 IU/mL, 또는 250 IU/mL, 또는 200 IU/mL, 또는 150 IU/mL, 또는 125 IU/mL, 또는 100 IU/mL, 또는 62.5 IU/mL, 또는 50 IU/mL이며, 단, 본원에 정의된 VWF 본 발명의 폴리펩타이드에 있어서 비율에 관한 요건을 충족한다.
"국제 단위", 즉 "IU"는 "IU"로 교정된 국제 표준품(international standard preparation)에 대해 교정된 표준을 사용하는 1단계 응혈 분석 또는 발색성 기질 FVIII 활성 분석과 같은 FVIII 활성 분석에 의해 측정된 FVIII의 혈액 응고 활성(효능)의 측정 단위이다. 1단계 응혈 분석은 문헌[N Lee, Martin L, et al., An Effect of Predilution on Potency Assays of FVIII Concentrates, Thrombosis Research (Pergamon Press Ltd.) 30, 511 519 (1983)]에 기술된 것들과 같이 당업계에 공지되어 있다. 1단계 분석의 원리: 본 시험은 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT)-분석의 변형된 버전으로서 실행된다: 인지질 및 표면 활성화제와 혈장의 항온배양은 고유의 혈액 응고 시스템의 인자들의 활성화를 유도한다. 칼슘 이온의 부가는 혈액 응고 캐스케이드(cascade)를 촉발시킨다. 측정가능한 피브린 응괴의 형성까지의 시간이 측정된다. 본 분석은 인자 VIII가 결핍된 혈장의 존재 하에 수행된다. 결핍된 혈장의 응혈 능력은 시험될 샘플 중에 포함된 혈액 응고 인자 VIII에 의해 회복된다. 혈액 응고 시간의 단축은 샘플 중에 존재하는 인자 VIII의 양에 비례한다. 혈액 응고 인자 VIII의 활성은 국제 단위에서 인자 VIII의 공지의 활성을 갖는 표준품과의 직접적 비교에 의해 정량화된다.
또 다른 표준 검정은 발색성 기질 검정이다. 발색성 기질 검정은 코어매틱(coamatic) FVIII 시험 키트(Chromogenix-Instrumentation Laboratory SpA V. le Monza 338 - 20128 Milano, Italy)와 같이 상업적으로 구매할 수 있다. 발색성 검정의 원리: 칼슘 및 인지질의 존재 하에, 인자 X는 인자 IXa에 의해 인자 Xa로 활성화된다. 이러한 반응은 보조 인자로서의 인자 VIIIa에 의해 자극된다. FVIIIa는 측정하고자 하는 샘플 중의 FVIII로부터의 반응 혼합물 중의 소량의 트롬빈에 의해 형성된다. Ca2+, 인지질과 인자 IXa 및 과량의 인자 X의 최적 농도를 사용하는 경우, 인자 X의 활성화는 인자 VIII의 효능에 비례한다. 활성화된 인자 X는 발색성 기질 S-2765로부터 발색단 pNA를 방출한다. 따라서, 405 nm에서 측정된 pNA의 방출은 형성된 FXa의 양에 비례하며, 그에 따라 샘플의 인자 VIII 활성에도 비례한다.
폴리펩타이드 용도의 일부 바람직한 구현예에 따라, 상기 내인성 FVIII 수준은 정상 사람 혈장 (NHP)에서 내인성 FVIII의 활성 수준의 적어도 1%, 또는 바람직하게 적어도 2%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 100%의 수준으로 상기 폴리펩타이드의 투여 후 증가된다.
추가의 바람직한 구현예에서, 내인성 FVIII수준은 상기 폴리펩타이드의 투여 후 정상 사람 혈장 (NHP)에서 내인성 FVIII의 활성 수준의 1% 내지 500%, 바람직하게 1% 내지 400%, 1% 내지 300%, 1% 내지 200%, 1% 내지 150%, 또는 1% 내지 100%의 범위에 있는 수준으로 증가된다.
추가의 바람직한 구현예에서, 내인성 FVIII수준은 상기 폴리펩타이드의 투여 후 정상 사람 혈장 (NHP)에서 내인성 FVIII의 활성 수준의 5% 내지 400%, 바람직하게 5% 내지 300%, 10% 내지 200%, 10% 내지 150%, 20% 내지 150%, 또는 40% 내지 150%의 범위에 있는 수준으로 증가된다.
추가의 바람직한 구현예에서, 내인성 FVIII 수준은 상기 폴리펩타이드의 투여 후 본원에 기재된 바와 같은 수준으로 증가되고, 여기서, 상기 투여된 폴리펩타이드의 용량 및/또는 상기 폴리펩타이드의 투여 빈도는 대상체에서 내인성 FVIII 수준의 상기 수준을 성취하기 위해 조정된다.
비율
특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 출혈 사건의 치료를 위해 또는 예방학적 치료 용법의 개시를 위해 외인성 FVIII와 함께 동시-투여되고, 여기서, 후속 치료를 위해, 상기 폴리펩타이드는 외인성 FVIII의 동시 투여 없이 투여된다. 외인성 FVIII와 함께 본 발명의 폴리펩타이드의 동시-투여를 포함하는 상기 구현예에 대해, 본 발명의 폴리펩타이드는 바람직하게 동시-투여될 폴리펩타이드와 외인성 FVIII의 몰비가 50 초과이도록 하는 용량으로 투여된다.
본 발명의 폴리펩타이드는 단량체, 이량체 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 본 발명에 따른 임의의 몰비는, 실제로 단량체 또는 이량체로 존재하던 간에 상관없이 본 발명의 폴리펩타이드의 단량체성 서브유닛의 몰 농도의 비율을 지칭한다. 비율은 내인성 FVIII의 몰 농도, 또는 특정 구현예에 대해 동시-투여된 FVIII의 몰 농도 또는 내인성 VWF 서브유닛의 몰 농도에 대해 형성된다. 본 출원에서 FVIII에 대한 본 발명의 폴리펩타이드의 임의의 비율은, 달리 지시하지 않는 한, 바람직하게 투여될 이량체로서 존재하는, 본 발명의 폴리펩타이드에 포함된 단량체의 양(몰로)을 투여될 FVIII의 양 (몰)으로 나눈 것을 지칭한다. 비제한적인 예로서, 100 μM의 본 발명의 단량체 폴리펩타이드와 1 μM의 FVIII의 동시-투여는 100의 비율을 의미한다. 100의 동일 비율은 50 μM의 본 발명의 이량체성 폴리펩타이드가 1 μM의 FVIII와 동시 투여되는 경우 수득된다.
내인성 VWF는 존재하는 경우 본 발명의 폴리펩타이드와 투여될, 동물 또는 사람의 혈장 내에 존재하는 VWF이다. 이는 보통 약 2 내지 40개의 VWF의 단량체성 서브유닛의 서로 다른 다양한 올리고머로 이루어진다. 달리 지시하지 않는 한, 본 출원에서 내인성 VWF에 대한 본 발명의 폴리펩타이드의 임의의 비율은, 본 발명의 폴리펩타이드의 투여 직후 치료된 대상체의 체중 1 kg당 본 발명의 폴리펩타이드의 몰 혈장 농도를 치료된 대상체의 체중 1 kg당 내인성 VWF의 몰 혈장 농도로 나눈 것을 가리킨다. 본 발명의 폴리펩타이드의 투여 직후 치료된 대상체의 체중 1 kg당 본 발명의 폴리펩타이드의 몰 혈장 농도는, 투여 직후에 상기 투여된 본 발명의 폴리펩타이드의 40 ml/kg의 혈장 용적 내에서의 희석을 가정하여 계산된다. 정맥 내로 투여되는 경우에 투여 직후 본 발명의 폴리펩타이드의 양은 본 발명의 목적상 투여된 양과 동일한 것으로 가정한다.
본 발명의 한 양상에 따르면, 상기 내인성 VWF에 대한 본 발명의 폴리펩타이드의 몰 비는 0.5를 초과한다. 치료될 대상체의 혈장 내에서의 내인성 VWF의 농도는, 예를 들어, 실시예에 기재된 것과 같은 ELISA 및/또는 활성 분석에 의해 측정될 수 있다. 통상적으로, 측정된 농도는 U/mL로 기재될 것이다. 이 값은 하기에 기재된 바와 같이 몰농도로 전환될 수 있다.
정상적인 사람 혈장 (NHP)은 1 U/mL의 농도 또는 정의상 100%의 VWF를 포함한다. 이는 대략 10㎍/mL의 단백질 농도에 상당한다(Haberichter S.L. and Montgomery R.R., Structure and function of von Willebrand factor; in: Hemostasis and Thrombosis, eds. Marder, Aird, Bennett, Schulman and White, Lippincott Williams & Wilkins 2013, pp 197-207). NHP에서의 이러한 VWF 농도 및 18-19%의 글리코실화를 포함하는 약 267,500 Da의 성숙한 VWF 단량체의 분자량을 토대로, NHP에 대하여 대략 37 x 10-9 Mol/L의 VWF 단량체 유닛의 몰 혈장 농도가 산출될 수 있다.
정상적인 랫트 또는 래빗 혈장에서 랫트 또는 래빗 VWF 서브유닛의 몰 농도를 각기 계산하기 위해, 랫트 또는 래빗 혈장에서 추정된 유사한 특이적 활성 (100 U/mg) 및 측정된 내인성 VWF 활성과 함께 사람 VWF와 비슷한 단량체성 서브유닛의 분자량 (267,500 Da)을 사용하였다 (실시예도 참조).
사람 개체군에서의 VWF의 농도는, NHP에서 약 60% 내지 약 200%의 VWF 농도로 다양하다. 본 발명의 특정 구현예에서, 내인성 VWF의 농도는 NHP에서의 농도로서 정의된다. 다른 구현예에서, 내인성 VWF의 농도는 치료될 대상체 내에서 측정하며, 폴리펩타이드의 용량은 이러한 개별 수치를 기초로 한다.
내인성 VWF에 대해 투여되는 본 발명의 폴리펩타이드의 몰비는 바람직하게는 적어도 2, 또는 적어도 3, 또는 적어도 4, 또는 적어도 5, 또는 적어도 6, 또는 적어도 7, 또는 적어도 8, 또는 적어도 9, 또는 적어도 10, 보다 바람직하게는 적어도 15, 또는 적어도 20, 또는 적어도 25, 또는 적어도 30, 가장 바람직하게는 적어도 40, 또는 적어도 50, 또는 적어도 75이다.
내인성 VWF에 대해 투여되는 본 발명의 폴리펩타이드의 몰비는 0.5 내지 1,000, 또는 1 내지 500, 또는 2 내지 400, 또는 3 내지 300, 또는 4 내지 250, 또는 5 내지 200, 또는 6 내지 150, 또는 7 내지 140, 또는 8 내지 130, 또는 9 내지 120, 또는 10 내지 110 범위일 수 있다. 바람직하게는, 내인성 VWF에 대해 투여되는 본 발명의 폴리펩타이드의 몰비는 3 내지 100, 또는 4 내지 90, 또는 5 내지 80, 또는 6 내지 75, 또는 10 내지 60 범위일 수 있다.
내인성 FVIII에 대한 투여되는 본 발명의 폴리펩타이드의 몰비는 바람직하게는 적어도 2, 또는 적어도 5, 또는 적어도 10, 또는 적어도 20, 또는 적어도 30, 또는 적어도 40, 또는 적어도 50이며, 보다 바람직하게는 상기 몰비는 50 초과, 적어도 75, 또는 적어도 100, 또는 100 초과, 또는 적어도 200, 가장 바람직하게는 적어도 300, 또는 적어도 400, 또는 적어도 500이다.
내인성 FVIII에 대한 투여되는 본 발명의 폴리펩타이드의 몰비는 2 내지 10,000, 또는 5 내지 5,000, 또는 10 내지 4,000, 또는 20 내지 3,000, 또는 30 내지 2,000, 또는 40 내지 1,000 범위일 수 있다. 바람직하게는, 내인성 FVIII에 대한 투여되는 본 발명의 폴리펩타이드의 몰비는 60 내지 2,500, 또는 110 내지 2,000, 또는 150 내지 1,500, 또는 200 내지 1,000 범위이다.
동시-투여될 외인성 FVIII에 대한, 투여되는 본 발명의 폴리펩타이드의 몰비는 바람직하게는 적어도 2, 또는 적어도 5, 또는 적어도 10, 또는 적어도 20, 또는 적어도 30, 또는 적어도 40, 또는 적어도 50이며, 보다 바람직하게는 상기 몰비는 50 초과, 적어도 75, 또는 적어도 100, 또는 100 초과, 또는 적어도 200, 가장 바람직하게는 적어도 300, 또는 적어도 400, 또는 적어도 500이다.
동시-투여될 FVIII에 대한, 투여되는 본 발명의 폴리펩타이드의 몰비는 2 내지 10,000, 또는 5 내지 5,000, 또는 10 내지 4,000, 또는 20 내지 3,000, 또는 30 내지 2,000, 또는 40 내지 1,000 범위일 수 있다. 동시-투여될 FVIII에 대한, 투여되는 본 발명의 폴리펩타이드의 몰비는 바람직하게 50 내지 10,000, 또는 50 내지 5,000, 또는 50 내지 4,000, 또는 50 내지 3,000, 또는 50 내지 2,000, 또는 50 내지 1,000 범위일 수 있다. 바람직하게, 동시-투여될 FVIII에 대한, 투여될 본 발명의 폴리펩타이드의 몰비는 60 내지 2,500, 또는 110 내지 2,000, 또는 150 내지 1,500, 또는 200 내지 1,000의 범위이다.
약제학적 조성물
본원에 기술된 방법에 적합한 본 발명의 폴리펩타이드의 치료학적 제형은 보관을 위해 임의의 약제학적으로 허용되는 담체, 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 부형제 또는 안정화제(이의 전부는 본원에서 "담체"로서 나타냄), 즉, 완충제, 안정화제, 보존제, 등장화제, 비-이온성 세제, 항산화제, 및 기타 다양한 첨가제와 원하는 정도의 순도를 갖는 폴리펩타이드를 혼합함으로써 동결건조된 제형 또는 수성 용액으로서 조제될 수 있다. 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed. 1980)]을 참조한다. 이러한 첨가제는 사용되는 용량 및 농도에서 수여자에 대해 비독성이어야만 한다.
완충제는 생리학적 조건을 비슷하게 하는 범위 내로 pH를 유지하는 것을 도와준다. 이들은 약 2 mM 내지 약 50 mM의 범위의 농도로 존재할 수 있다. 적절한 완충제로는 유기산 및 무기산 모두 및 이들의 염, 예컨대, 시트르산염 완충제(예를 들면, 시트르산일나트륨-시트르산이나트륨염 혼합물, 시트르산-시트르산삼나트륨 혼합물, 시트르산-시트르산일나트륨 혼합물 등), 석신산염 완충제(예를 들면, 석신산-석신산일나트륨 혼합물, 석신산-수산화나트륨 혼합물, 석신산-석신산이나트륨 혼합물 등), 타르타르산염 완충제(예를 들면, 타르타르산-타르타르산나트륨 혼합물, 타르타르산-타르타르산칼륨 혼합물, 타르타르산-수산화나트륨 혼합물 등), 푸마르산염 완충제(예를 들면, 푸마르산-푸마르산나트륨 혼합물, 푸마르산-푸마르산이나트륨 혼합물, 푸마르산나트륨-푸마르산이나트륨 혼합물 등), 글루콘산염 완충제(예를 들면, 글루콘산-글루콘산나트륨 혼합물, 글루콘산-수산화나트륨 혼합물, 글루콘산-글루콘산칼륨 혼합물 등), 옥살산염 완충제(예를 들면, 옥살산-옥살산나트륨 혼합물, 옥살산-수산화나트륨 혼합물, 옥살산-옥살산칼륨 혼합물 등), 락트산염 완충제(예를 들면, 락트산-락트산나트륨 혼합물, 락트산-수산화나트륨 혼합물, 락트산-락트산칼륨 혼합물 등) 및 아세트산염 완충제(예를 들면, 아세트산-아세트산나트륨 혼합물, 아세트산-수산화나트륨 혼합물 등)를 포함한다. 추가로, 포스페이트 완충제, 히스티딘 완충제 및 트리메틸아민 염, 예컨대, Tris가 사용될 수 있다.
보존제는 미생물 성장을 저지하기 위해 첨가될 수 있고, 0.2% 내지 1%(w/v) 범위의 양으로 첨가될 수 있다. 적절한 보존제로는 페놀, 벤질 알콜, 메타-크레졸, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 벤잘코늄 할라이드(예를 들면, 클로라이드, 브로마이드 및 아이오다이드), 헥사메토늄 클로라이드 및 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 사이클로헥사놀 및 3-펜타놀을 포함한다. 때로 "안정화제"로서 알려져 있는 등장화제는 액체 조성물의 등장성을 확보하기 위해 첨가될 수 있으며, 이의 예로는 다가 당알콜, 바람직하게는 3가 또는 그 이상의 당알콜, 예컨대, 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 크실리톨, 소르비톨 및 만니톨을 포함한다. 안정화제는 벌킹제(bulking agnet)에서부터 치료제를 가용화시키거나 변성 또는 용기 벽에 대한 부착을 예방하는 것을 돕는 첨가제까지 기능상 다양할 수 있는 광범위한 범주의 부형제를 지칭한다. 통상적인 안정화제는 다가 당알콜(상기 열거됨); 아미노산, 예를 들면, 아르기닌, 리신, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 알라닌, 오르니틴, L-류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌 등, 유기 당 또는 당알콜, 예를 들면, 락토스, 트레할로스, 스타키오스, 만니톨, 소르비톨, 크실리톨, 리비톨, 미오이니시톨, 갈락티톨, 글리세롤 등(이노시톨과 같은 사이클리톨을 포함함); 폴리에틸렌 글리콜; 아미노산 중합체; 황함유 환원제, 예를 들면, 우레아, 글루타티온, 티옥트산, 티오글리콜산나트륨, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤 및 티오황산나트륨; 저분자량 폴리펩타이드(예를 들면, 10개 이하의 잔기의 펩타이드); 단백질, 예를 들면, 사람 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리비닐피롤리돈 모노사카라이드, 예컨대, 크실로스, 만노스, 프럭토스, 글루코스; 디사카라이드, 예를 들면, 락토스, 말토스, 슈크로스 및 트리사카라이드, 예를 들면, 라피노스; 및 폴리사카라이드, 예를 들면, 엑스트란일 수 있다. 안정화제는 활성 단백질 1중량부당 0.1 내지 10,000 중량 범위 내로 존재할 수 있다.
비이온성 계면활성제 또는 세제("습윤제"로도 알려져 있음)는, 치료제를 가용화시키는 것을 돕기 위해서 뿐만 아니라 교반으로 유도된 응집에 대해 치료학적 단백질을 보호하기 위해서도 첨가될 수 있으며, 또한 제제가 단백질의 변성을 야기하지 않으면서 응력을 받는 전단 표면에 노출되도록 한다. 적절한 비이온성 계면활성제로는 폴리소르베이트(20, 80 등), 폴리옥사머(184, 188 등), 플루로닉 폴리올, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에테르(TWEEN®-20, TWEEN®-80 등)를 포함한다. 비이온성 계면활성제는 약 0.05 mg/ml 내지 약 1.0 mg/ml의 범위, 또는 약 0.07 mg/ml 내지 약 0.2 mg/ml의 범위로 존재할 수 있다.
기타 다양한 부형제로는 벌킹제(예를 들면, 전분), 킬레이트제(예를 들면, EDTA), 산화방지제(예를 들면, 아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E) 및 공용매를 포함한다.
본원의 제제는 본 발명의 폴리펩타이드 이외에 제2 치료제를 함유할 수 있다. 적합한 제2 치료제의 예는 하기에 제공된다.
투약 스케쥴은 질환의 유형, 질환의 중증도 및 본 발명의 폴리펩타이드에 대한 환자의 민감도를 비롯한 다수의 임상학적 요인들에 따라 매월 1회 내지 매일 1회로 다를 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 매주 2회, 5일마다, 매주 1회, 10일마다, 2주마다, 3주마다, 4주마다 또는 매월 1회, 또는 상기한 수치들 중 임의의 두 수치 사이의 임의의 범위로, 예를 들어, 4주마다 내지 매월, 10일마다 내지 2주마다, 또는 1주에 2회 내지 3회 등으로 투여된다.
투여되는 본 발명의 폴리펩타이드의 용량은 특정 폴리펩타이드, 대상체 및 질환의 특성 및 중증도, 대상체의 생리학적 조건, 치료학적 용법(예를 들면, 제2 치료학적 제제가 사용되는지의 여부), 및 선택된 투여 경로에 따라 다양할 것이고; 적절한 용량은 당해 분야 숙련가에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드의 최적의 양 및 개별 용량의 간격은 치료되는 병태의 특성 및 정도, 투여의 형태, 경로 및 부위, 및 치료되는 특정 대상체의 연령 및 상태에 의해 결정될 것이고, 의사는 궁극적으로 사용되는 적절한 용량을 결정할 것임이 당해 분야 숙련가에 의해 인지될 것이다. 이러한 용량은 적절하게 자주 반복될 수 있다. 부작용이 발생하는 경우에는, 정상적인 임상 실무에 따라서 용량의 양 및/또는 빈도가 변경되거나 감소될 수 있다.
서열목록에 나타낸 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 표 1에 요약된다.
[표 1]
Figure pct00001
하기 실시예는 본 발명을 설명하지만, 본 발명을 이하 본원에 기술된 특정 구현예들에 제한하는 것으로 해석되지 말아야 한다.
실시예
실시예 1 rD'D3-FP의 투여 후 혈장 중 FVIII 수준 분석
본원 발명자는 내인성 FVIII 수준에 대한 rD'D3-FP의 영향을 특징 분석하여 일반적으로 약한 것 내지 중간 정도 또는 중증의 혈우병 A 환자 또는 낮은 수준의 VWF 및 기능성 내인성 FVIII를 갖는 특정 유형의 폰-빌레브란트 질환의 치료를 지원함을 목적으로 하였다. 본원 발명자는 상이한 접근법에서 상기 효과를 조사하였다:
- 정상의 내인성 FVIII와 VWF 수준을 갖는 모델, 즉 래트 (실시예 1.1), 토끼 (실시예 1.2) 및 몽키 (실시예 1.3)로의 정맥내 투여는 건강한 대상체에서 정맥내 (i.v.) rD'D3-FP 투여 후 내인성 FVIII의 잠재적 추가의 증가를 조사하기 위한 것이다.
- VWF 결핍으로 인해 낮은 FVIII 수준을 갖는 모델, 즉 VWF ko 래트 (실시예 1.4) 및 VWF ko 마우스 (실시예 1.5)로의 정맥내 투여는 질환 대상체에서 정맥내 (i.v.) rD'D3-FP 투여 후 내인성 FVIII의 증가 크기를 조사하기 위한 것이다.
- VWF 결핍으로 인해 낮은 FVIII 수준을 갖는 모델, 즉 VWF ko 래트로의 정맥내 투여는 질환 대상체(실시예 1.6)에서 정맥내 (i.v.) rD'D3-FP 변이체 투여 후 내인성 FVIII의증가 크기를 조사하기 위한 것이다.
- 정상 또는 낮은 FVIII 수준을 갖는 모델, 즉, 돼지, FVIII ko 및 VWF ko 마우스 및 FVIII ko 및 VWF ko 래트 (실시예 1.7)로의 피하 투여는 내인성 FVIII에 대한 효과 뿐만 아니라 rD'D3-FP의 i.v. 및 s.c. 생물유용성을 비교하기 위해 조사하였다.
- 최종 실험은 VWF ko 래트 (실시예 1.8)에서 다중 rD'D3-FP 용량 (i.v.)의 효과를 조사하였다.
- 혈우병 A 모델, 즉 FVIII ko 래트 (실시예 1.9)에서 rD'D3-FP 피하 투여 및 rVIII-SingleChain 정맥내 투여의 조사.
재료 및 방법
실시예를 위해, 서열번호 2에 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 절단된 VWF를 포함하는 폴리펩타이드를 사용하였다. 상기 특정 융합 단백질은 VWF D´D3 영역을 나타내는 1 내지 479의 N-말단 아미노산 서열(사람 고유 VWF의 아미노산 764 - 1242)에 이어서 31 아미노산 글리신/세린 링커 펩타이드 및 511 - 1095의 C-말단 사람 알부민 아미노산 서열로 이루어진다. 서열번호 2에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 상기 융합 단백질은 하기에서 rD'D3-FP 또는 rD'D3-FP WT로서 언급된다.
반감기 연장 폴리펩타이드 (HLEP)로서 알부민에 대한 대안으로서, 일부 실시예에, 또 다른 반감기 연장된 rD'D3 변이체를 사용하고 이는 알부민 대신 글리신/세린 링커를 통해 D'D3에 융합된 CTP (사람 만성 고나도트로핀-ß 서브유닛의 C-말단 펩타이드)를 갖고 이는 이후부터 rD'D3-CTP로서 언급된다. 융합 단백질 rD'D3-CTP는 서열번호 7에 한정된 바와 같은 서열을 갖는다.
특정 실시예에서, rD'D3-FP의 고친화성 변이체를 사용하였다. 하나의 특정 변이체 융합 단백질은 VWF D´D3 영역을 나타내는 1-479의 N-말단 아미노산 서열(사람 고유 VWF의 아미노산 764 - 1242)에 이어서 31 아미노산 글리신/세린 링커 펩타이드 및 511 - 1095의 말단 사람 알부민 아미노산 서열로 이루어지고, 단 상기 폴리펩타이드의 D'D3 도메인 내에는 2개의 아미노산 치환, 즉, S764E 및 S766Y가 존재한다. 상기 융합 단백질은 D'D3 영역 내에 상기 2개의 치환, 즉 S764E 및 S766Y를 갖는 서열번호 2에 정의된 바와 같은 서열로 이루어진다. VWF 아미노산 S764은 서열번호 2의 서열 내 아미노산 번호 1에 상응한다(또한 표 1을 참조한다). rD'D3-FP EY 변이체는 WO　2016/000039　A1에 기재된 바와 같이 생성하였다. 상기 변이체는 이후 rD'D3-FP EY로서 언급된다.
특정 실시예에서, rD'D3-FP의 또 다른 고친화성 변이체를 사용하였다. 상기 특정 변이체 융합 단백질은 VWF D´D3 영역을 나타내는 1-479의 N-말단 아미노산 서열(사람 고유 VWF의 아미노산 764 - 1242)에 이어서 31 아미노산 글리신/세린 링커 펩타이드 및 511 - 1095의 말단 사람 알부민 아미노산 서열로 이루어지고, 단 상기 폴리펩타이드의 D'D3 도메인 내에는 3개의 아미노산 치환, 즉, S764E, S766Y 및 V1083A가 존재한다. 상기 융합 단백질은 D'D3 영역 내에 상기 3개의 치환, 즉 S764E, S766Y 및 V1083A를 갖는 서열번호 2에 정의된 바와 같은 서열로 이루어진다. 상기 변이체는 이후 rD'D3-FP EYA로서 언급된다.
분석
모든 실시예에서, rD'D3-FP는 사람 알부민 ELISA에 의해 정량된, 즉 단백질의 알부민 부분을 측정하는 용량 수준으로 적용하였다. 상기 rD'D3-FP ELISA는 제형화 및 혈장 샘플 (관련 사람 알부민 교차-반응성을 보여주는 몽키 혈장 샘플을 제외함)을 위해 사용하였다.
rD'D3-CTP가 rD'D3 변이체로서 사용되는 실시예에서, 폴리펩타이드는 OD280 측정에 의해 정량된 용량 수준으로 적용하였고, 상기 단백질 양은 rD'D3-FP와 동일한 높은 범위에서의 몰 농도로 조정하였다.
(“표준”) rD'D3-FP ELISA는 제조원 (Bethyl Laboratories, Inc. (Montgomery, USA))으로부터의 폴리클로날 염소 항-사람 알부민 포획 항체를 사용하였다. 검출 용액은 폴리클로날 퍼옥시다제 표지된 항-사람 알부민 검출 항체 제제(Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, USA)로 이루어진다. 발색성 판독, 즉, 제조원 (Siemens Healthcare (Eschborn, Germany))으로부터의 TMB는 중단 후 직접적으로 450/650 nm에서 마이크로플레이트 판독기 (ELx808, BioTek, USA)에서 정량을 위해 사용하였다. 표준물로서, rD'D3-FP를 함유하는 약물 제형을 사용하였다. rD'D3-FP 양은 mg 알부민으로 주어지고, 즉, 분자의 D'D3 부분에 대해 어떠한 조정도 수행하지 않았다.
몽키 혈장 샘플에 대한 rD'D3-FP ELISA는 혼합 ELISA로서 설정하였고, 여기서, 상기 D'D3 도메인을 포획하고 알부민 도메인을 검출하였다. 상기 검정은 항-D'D3 모노클로날 포획 항체(CSL Behring, in house research grade preparation)를 사용하였다. 검출 용액은 폴리클로날 퍼옥시다제 표지된 항-사람 알부민 검출 항체 제제(Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, USA)로 이루어진다. 발색성 판독, 즉, 제조원 (Siemens Healthcare (Eschborn, Germany))으로부터의 TMB는 중단 후 직접적으로 450/650 nm에서 마이크로플레이트 판독기 (ELx808, BioTek, Instruments Inc., Winooski, USA)에서 정량을 위해 사용하였다. 표준물로서, rD'D3-FP를 함유하는 약물 제형을 사용하였다. rD'D3-FP 양은 mg 알부민으로 주어지고, 즉, 분자의 D'D3 부분에 대해 어떠한 조정도 수행하지 않았다.
rD'D3-CTP를 함유하는 PK의 혈장 샘플은 항-D'D3 ELISA에서 측정하였다. 상기 항 D'D3 ELISA는 샌드위치 포맷으로 2개의 모노클로날 항-사람 D'D3 항체를 사용하여 수행하였다. 포획 및 검출을 위한 항체 둘다는 내부 연구 제제로부터 유래하였다. 항-사람 D'D3 검출 항체는 퍼옥시다제로 표지되어 있다. 발색성 판독, 즉, 제조원 (Siemens Healthcare (Eschborn, Germany))으로부터의 TMB는 중단 후 직접적으로 450/650 nm에서 마이크로플레이트 판독기 (ELx808, BioTek, Instruments Inc., Winooski, USA)에서 정량을 위해 사용하였다. 표준물로서, rD'D3-CTP를 함유하는 약물 제형을 사용하였다. rD'D3-CTP 양은 rD'D3-CTP 농도로서 주어진다.
사람 FVIII:Ag 혈장 수준은 시험 지침 매뉴얼에 따라 제조원 (Stago, S.A.S., France)으로부터 FVIII 아서라크롬(Asserachrom) ELISA 시험 키트를 사용하여 결정하였다. 아서라크롬 시험키트는 중단 용액을 제외하고는 모든 시약을 함유하였고, 상기 중단 용액은 제조원(Siemens Healthcare (Eschborn, Germany))으로부터 수득하였다. 표준물로서, rVIII-단일쇄를 함유하는 약물 제형을 사용하였다.
FVIII 발색성 활성 혈장 수준은 제조원 (Siemens Healthcare Diagnostics (Marburg, Germany))으로부터의 BCS XP 분석기 상에서 제조업자의 시험 지침 매뉴얼에 따라 COAMATIC® FVIII 검정 (FVIII:C 발색성 검정, Chromogenix, Instrumentation Laboratory SpA, Milan, Italy)에 의해 검출하였다. 보정(calibration)을 위해, 표준물 사람 혈장을 사용하였다. 대안적으로, 이들은 제조원 (Siemens Healthcare Diagnostics (Marburg, Germany))으로부터의 사람 FVIII 결핍 혈장에서 샘플의 사전 희석과 함께 동일한 COAMATIC® FVIII 검정에 의해 검출하고 이어서 제조원 (Tecan (Tecan Trading AG, Switzerland))으로부터의 무제한 M200 ELISA-판독기 상에서 판독하였다. 보정을 위해, 사람 혈장-유래된 폰 빌레브란트 인자 및 FVIII 함유 제품, Haemate® P (제조원: CSL Behring)을 사용하였다. 상기 샘플은 참조 없이 405nm에서 측정하였다. 일반적으로, FVIII 발색성 활성은 FVIII:C로서 약칭한다.
FVIII 응고 활성 혈장 수준은 1단계 응고 검정을 사용하여 검출하였고, 이는 Pathromtin® SL, 사람 FVIII 결핍 혈장 및 염화칼슘 용액을 포함하고, 이들 모두는 제조원(Siemens Healthcare Diagnostics (Marburg, Germany))으로부터 시판된다. 측정은 제조원 (Siemens Healthcare Diagnostics (Marburg, Germany))으로부터의 BCS XP 분석기 상에서 수행하였다. 보정(calibration)을 위해, 표준물 사람 혈장을 사용하였다.
활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT)은 BCS XP 분석기 (제조원: Siemens Healthcare Diagnostics (Marburg, Germany))로부터의 BCS XP 분석상에서 Pathromtin® SL 시약 (마우스 및 래트) 또는 Actin® FSL (토끼) 및 염화칼슘 용액을 사용하여 혈장 샘플 중에서 분석하였다. 모든 시약은 제조원(Siemens Healthcare Diagnostics (Marburg, Germany))으로부터 시판되고 있다.
실험 동물
FVIII ko 마우스
FVIII ko 마우스 (혈우병 A 표현형을 나타내는)를 선택하였는데 그 이유는 이들이 FVIII 유전자의 엑손 16 및 17이 결여되어 있음에 따라서 혈장 인자 VIII 활성을 갖지 않기 때문이다(Bi L. et al, Nature genetics, 1995, Vol 10(1), 119-121; Bi L. et al, Blood, 1996, Vol 88(9), 3446-3450). 이것은 이들 마우스의 혈장 중 FVIII 활성의 정량에 의해, FVIII를 사용한 치료 후 FVIII 활성 수준의 분석을 가능하게 한다.
FVIII ko 래트
혈우병 A 표현형을 나타내는 FVIII ko 래트는 CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 SAGE 연구실(A Horizon Discovery Group Company, Saint Louis, MO 63146, USA)에서 생성하였다. 엑손 18 내 위치 23471-23472에서 2bp (염기쌍) 결실 및 1bp 삽입을 유도하여 조기 중단 코돈을 생성시킨다. 생성된 FVIII ko 돌연변이는 파괴된 FVIII 기능을 갖는 FVIII ko 래트를 생성시켰다. 이것은 이들 래트의 혈장 중 FVIII 활성의 정량에 의해, FVIII를 사용한 치료 후 FVIII 활성 수준의 분석을 가능하게 한다.
VWF ko 마우스
VWF 녹-아웃 (ko) 마우스 (VWD 표현형을 나타내는)를 선택하였는데 그 이유는 이들이 VWF 유전자의 엑손 4 및 5가 결여되어 있어서 혈장 VWF 활성을 갖지 않기 때문이다(문헌참조: Denis C. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, Vol 95, 9524-9529). 이것은 이들 마우스의 혈장에서 내인성 FVIII 활성 수준에 대한 D'D3 폴리펩타이드의 분석을 가능하게 한다.
VWF ko 래트
VWD 표현형을 나타내는 VWF ko 래트는 CompoZr™ 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 기술 및 SAGEspeed™ 동물 녹아웃 생성 공정을 사용하여 연구실(Sigma Advanced Genetic Engineering (SAGE) Labs (Saint Louis, MO 63146, USA))에서 생성하였다. 게놈 서열 내 위치 33926bp-33941bp에서 16bp (염기쌍) 결실은 엑손 7 내에서 유도하여 조기 중단 코돈을 생성시킨다. 일반적으로 연구실 (Sigma Advanced Genetic Engineering (SAGE) Labs (Sigma-Aldrich Biotechnology))에 의한 ZFN 기술을 사용한 녹-아웃 래트의 생성은 문헌(참조: X. Cui et al. (Nature Biotechnology, 2010), in MH. Porteus & D. Carroll (Nature Biotechnology, 2005))에 기재되어 있다. 생성된 VWFI ko 돌연변이는 파괴된 VWF 기능을 갖는 VWF ko 래트를 생성시켰다. 이것은 이들 래트의 혈장에서 내인성 FVIII 활성 수준에 대한 D'D3 폴리펩타이드의 분석을 가능하게 한다.
D´D3 알부민 융합 단백질 (D´D3-FP)의 생성:
VWF 아미노산 1 내지 1242를 암호화하는 cDNA, 글리신/세린 링커 및 사람 알부민의 cDNA로 이루어진 D'D3-FP에 대한 발현 카세트는 커스텀(custom) 유전자 합성(Eurofins Genomics, Ebersberg, Germany)에 의해 제조하였다. 플랭킹(flanking) 제한 부위(EcoRI, NotI)를 통해 발현 카세트는 공급된 클로닝 벡터로부터 절제되었고, EcoRI 및 NotI를 이용하여 선형화된 pIRESneo3 벡터(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)에 삽입되었다. 수득한 발현 플라스미드는 CMV 프로모터 제어 하에 짧은 링커 암호화 서열을 통해 알부민 암호화 서열에 융합된 VWF 프로펩타이드, D' 및 D3(서열번호 4의 VWF 아미노산 1 내지 1242)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하였다. 암호화 서열의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1로서 표시되고, 성숙한 D'D3-FP의 아미노산 서열은 서열번호 2로서 나타낸다. 발현 동안에 D1D2 VWF 프로펩타이드 (741 아미노산)의 존재는 합성된 폴리펩타이드의 이량체화를 위해 중요하다.
유사한 접근법을 사용하여 글리신/세린 링커를 통해 연결되고 융합 단백질의 C-말단에서 8개의 히스티딘에 의해 태그된 사람 융모성 고나도트로핀-ß 서브유닛의 C-말단 펩타이드로의 D'D3 융합 단백질에 대한 발현 플라스미드를 생성하였다. 성숙한 rD'D3-CTP의 아미노산 서열은 서열번호 7에 나타낸다.
상기 기술된 발현 플라스미드는 XL10 Gold(Agilent Technologies)에서 성장시켰고 표준 프로토콜(Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하여 정제하였다.
CHO K1 세포는 Lipofectamine 2000 시약(Invitrogen)을 이용하여 형질감염시켰고, 500 내지 1000㎍/ml 제네티신(Geneticin)의 존재 하에 무혈청 배지(CD-CHO, Invitrogen)에서 성장시켰다. WO2007/144173에 기재된 바와 같은 PACE/푸린(pFu-797)을 암호화하는 발현 플라스미드를 공동-형질감염시켜 프로펩타이드 절단 효능을 최대화하였다. 단일 세포 유도된 클론을 성장시켰고, 알부민 특이적 효소 면역검정(하기 참조)에 의해 정량된 이들의 D'D3-FP 발현 수율에 따라 선별하였다. D'D3-FP 발효에 대해 최종 선별된 세포주를 T2050-CL3이라고 호칭하였다.
D'D3-FP의 생산은 관류 방식으로 발효 공정을 적용하는 생물반응기(bioreactor)에서 수행하였다. rD'D3-FP의 생산을 위한 발효 공정은 세포주 T2050-CL3의 해동으로 시작하였고, 진탕 플라스크에서의 세포 확장 및 마지막으로 Sartorius BioStat B-DCU 5L 생물반응기 및 BioStat STR 50L 단일-사용 생물반응기를 사용한 관류 방식으로의 발효 공정으로 이어졌다. BioSeps 10L 또는 200L(Applikon)은 각각 세포 보유 장치로 사용되었다. 세포 배양 배지는 8mM의 L-글루타민 및 1μM의 CuSO4를 갖는 PowerCHO3(Lonza BESP1204) 또는 10mM의 L-글루타민 및 1μM의 CuSO4를 갖는 ProCHO5(Lonza BESP1072)이었다.
진탕 플라스크에서의 씨드 트레인(seed train)은 160rpm의 진탕 속도로 37℃, 7.5% CO2에서 수행하였다.
5L 생물반응기에 2.5 x 105 세포/mL의 표적 VCD를 접종하였다. 상기 세포는 8mM의 L-글루타민 및 1μM의 CuSO4를 갖는 PowerCHO3에서 +37.0℃의 온도, 7.00의 pH에서 그리고 30% 산소 포화도에서 배양하였다. +37.0℃에서 실행된 생물반응기로부터의 최초 수거물을 취한 후 +34.0℃(평가된 범위 +31.0℃ 내지 +35.0℃)로의 온도 이동(shift)을 수행하였다. pH는 산으로서의 살포된(sparged) CO2 및 염기로서의 NaHCO3를 이용하여 제어하였다. 오버레이 기류 속도(overlay air flow rate)를 0.5L/min으로 설정하였다. 살포 유닛으로서 링 스파저(ring sparger)를 사용하였다. 교반 속도는 다운 풀 방식(down pull mode)의 2배 피치 블레이드 임펠러(2fold pitch blade impeller)를 이용하여 150rpm이었다.
50L 생물반응기에 3.0 x 105 세포/mL의 표적 VCD를 접종하였다. 상기 세포는 10mM의 L-글루타민 및 1μM의 CuSO4를 갖는 ProCHO5에서 +37.0℃의 온도, 6.90의 pH에서 그리고 30% 산소 포화도에서 배양하였다. 최초 1 또는 2회의 수거 후 +34.0℃로의 온도 이동을 수행하였다. pH는 상기와 같이 제어하였고, 오버레이 기류 속도를 2L/min으로 설정하였다. 살포 유닛으로서 마이크로 스파저(micro sparger)를 사용하였다. 교반 속도는 다운 풀 방식의 2배 피치 블레이드 임펠러를 이용하여 90rpm이었다.
생물반응기 내의 VCD가 1.0 x 106 세포/mL 이상이었을 때에 관류를 개시하였다. 관류 속도를 1.0용적/용적/일로 설정하였다. BioSep은 5(10)분 실행 시간 및 7(30)W의 전력 입력으로 10초의 역 플러시(back flush)를 이용한 역 플러시 방식으로 작동되었다(괄호 안의 숫자는 50L 생물반응기를 나타낸다). 관류액 및 혈액은 직렬(inline) 여과되었고 +2℃ 내지 +8℃에서 48시간에 걸쳐 백(bag)에 수집하였다. VCD는 2g/L 글루코스의 표적을 갖는 파라미터로서 글루코스 소비를 이용한 혼탁도 프로브를 사용하여 활성 출혈에 의해 제어되었다. 수거물 및 혈액은 직렬 여과되었고 일회용 필터와 일회용 백으로 구성된 수거 시스템은 2일마다 교체되었다.
하기 기재되는 PK 분석을 위한 재료를 제조하기 위해서 수거물을 친화도 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 간략하게, 생물반응기로부터의 세포-불포함 수거물은 30kD 막(예를 들면, Pall Centramate OS030T12)을 갖는 TFF 시스템(예를 들면, Pall Centramate 500 S)을 이용하여 30배 농축시켰다. 해당 농축물은 0.75M NaCl 및 5mM EDTA의 최종 농도로 NaCl 및 EDTA를 급등시켰고(spiked), 20mM Tris 완충액 pH 7.4를 이용하여 사전-평형화된(pre-equilirated) CaptureSelect 사람 알부민 컬럼(Life Technologies)에 밤새 부하하였다. 평형화 완충액으로 상기 컬럼을 세척한 후, 용출 완충액(20mM Tris, 2M MgCl2, pH 7.4)을 이용하여 rD'D3-FP를 용출시켰다. 이어서, 상기 용출물을 10배 농축시켰고, 30kD 컷오프(cut-off)를 갖는 초 원심분리 필터(예를 들면, Amicon. UFC903024)를 이용하여 50mM Tris, 150mM NaCl, pH 7.4에 대해 투석시켰다. 단량체 부분으로부터 rD'D3-FP 이량체를 분리하기 위해, 해당 재료를 50mM Tris, 150mM NaCl, pH 7.4로 사전-평형화된 Superdex 200pg 컬럼(GE Healthcare Code: 17-1069-01) 상에 로딩하고 D'D3-FP 이량체를 항유하는 피크 분획물을 모았다. 이량체 및 단량체 피크 분획에 대한 곡선 아래 면적은 이량체 대 단량체 비를 계산하는데 사용하였다. 상기 D'D3-알부민 융합 단백질의 이량체 제제는 실시예 1.1 내지 실시예 1.6의 약동학 실험에 사용하였다. 상기 이량체 제제는 하기에서 달리 지적되지 않는 경우 D'D3-FP 또는 rD'D3-FP로 언급된다.
rD'D3-FP EY 및 EYA 변이체는 균등한 방법 단계에 의해 생성되었다.
실시예 1.1: 래트에서 생리학적 내인성 FVIII 수준에 대한 rD'D3-FP를 사용한 정맥내 치료의 영향
동물
200 내지 294g 체중 범위 내의 암컷 Crl:CD(스프라그 돌리(Sparague Dawley)) 래트를 찰스 리버 래버러토리(Charles River Laboratories)(Sulzfeld, Germany)에서 사육하였다. 실험실 내에서, 상기 동물들을 표준 하우징(housing) 조건으로, 즉, 12h/12h 명암 사이클 하에서 20 내지 24℃로 유지하였다. 동물들은 표준 마우스 및 래트 식이(Ssniff-Versuchsdiaten, Soest, Germany)로 자유 급식하였다. 수돗물을 자유 공급하였다. 가축 사육 및 연구 절차는 독일 동물 복지법 및 유럽 연합 규정을 준수하였다.
1 mg/kg 그룹에 대해, 그룹 크기는 n=9이고, 3개 코호트로 나뉘고, 대조군(단지 n=3 마리)은 제외한다. 1mg/kg 그룹의 그룹 크기는 n=6이었고, 2개의 코호트(cohort)로 나뉘었다. 따라서, 시점당 n=3의 동물이 항상 사용되었다.
실험의 세부사항
시험 제품을 래트(그룹 당 n=3)의 측면 꼬리 정맥으로의 단일 주사에 의해 i.v. 투여하였다. rD'D3-FP는 사람 알부민 값을 기준으로 1 mg/kg 또는 3 mg/kg의 용량 수준으로 적용하였다. 1 mg/kg 그룹의 혈액 샘플은 정맥내 볼러스 주사 후, 투여 후 (p.a.) 6시간 및 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10 및 14일째에 사전 용량에서 안구뒤에서 채취(베나 카바 (Vena cava) 천공에 의해 10일 및 14일째 말단 샘플링)한다. 3 mg/kg 그룹의 혈액 샘플을 투여 후 0.083, 3, 8h 및 1, 2, 3 및 4일째에 인출한다. 이들은 나트륨 시트레이트 (1부 나트륨 시트레이트 3.13% + 9부 혈액)을 사용하여 응고를 억제하고 혈장으로 가공하여 rD'D3-FP 및/또는 FVIII 활성의 결정을 위해 대략 -70°C에서 저장하였다.
D'D3-FP 노출은 사람 알부민 ELISA를 이용한 작제물의 알부민 부분의 측정에 의해 결정되었다. FVIII 활성 혈장 수준은 발색성 검정 및 1-단계 응고 검정을 사용하여 검출하였다.
곡선 이하 총 피크 면적 (AUC)의 계산은 기준선으로서 전처리 값을 사용하고 최소에서 최대 값까지의 ≤30% 거리를 갖는 피크를 동정하여 14일의 기간 동안 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) (GraphPad Software, La Jolla, California, USA)으로 수행하였다.
결과
rD'D3-FP는 4 d (3 mg/kg) 또는 14 d (1 mg/kg) p.a.까지 정량하고 측정된 데이터는 전체 관찰 기간에 걸친 검출 한계를 훨씬 초과하였다(도 1a). 선형 용량-의존성은 2개 시험된 용량에 대해서 관찰되었다.
FVIII 활성은 1 mg/kg rD'D3-FP로 처리된 그룹에 대한 발색성 및 1-단계 응고 활성으로서 측정하였고, FVIII 활성 시험 둘다는 rD'D3-FP의 투여 후 식염수 대조군과 비교하여 내인성 FVIII 수준에서 일시적 증가를 보여주었고(도 1b 및 1c), 피크는 2일 (발색성 활성) 또는 1일 (응고 활성)과 5일 p.a. 사이에 있다. 다시 검정 둘다에 대해, 평균 FVIII 농도는 최대 예비용량 값, 즉, 발색성 FVIII 활성에 대해 3.1 IU/mL 및 응고 FVIII 활성에 대해 454 % (4.5 IU/mL)를 거의 초과하지 않았다. 샘플의 정량을 위해 사용되는 1:4 희석된 정규값의 상한치 (ULN)가 어느 동물에 대해서도 도달되지 않았음이 언급된다. 이와 일치하여, 도 1d에 나타낸 바와 같이 AUC (0일 내지 14일 p.a.에 걸쳐 평가된)는 1mg/kg rD'D3-FP의 용량에서 발색성 검정 및 응고 검정과 함께 증가하였다.
FVIII 활성에서의 증가와 일치되게, 비히클-처리된 동물과 비교하여 약 7일 p.a. 때까지 피크를 갖는 투여 직후 개시하여 생리학적 활성화된 부분 트롬빈 시간 (aPTT)는 감소하였다 (aPTT). 다시 말해, 평균 값은 사전 용량 범위 내에 있고 1일 p.a.에만 평균 값은 16.5 s의 최저 사전 용량 값 미만이었다.
적어도 14일 동안 rD'D3-FP로의 소정의 노출과 함께, FVIII 활성에서의 약간의 증가가 관찰되었다. 피크 값은 1 내지 5일 p.a. 사이에 주어졌고 이는 임의의 경우에 식염수-처리된 동물의 <2-배 초과였고 (FVIII 발색성 활성: ~1 IU/mL 또는 100% 내지 ~3.5 IU/mL = 350%까지 최대 증가; FVIII 응고 활성: ~300% 내지 ~700% 까지, 대부분 by ~100% 내지 ~500%까지 최대 증가 - 이는 인간과 비교하여 이들 동물에서 보다 높은 기준선 값과 일치한다) 대부분 생리학적 변화내에 있다. FVIII 활성의 약간의 증가는 aPTT의 감축을 유발하였고, 평균 값은 단지 최소 사전 용량 값의 근소하게 미만이다. 따라서, 건강한 래트에서, FVIII 수준에서의 약간의 증가는 1 mg/kg rD'D3-FP의 용량에서 관찰되었지만, 이들 값은 생리학적 범위를 벗어나는 변화가 거의 없다.
실시예 1.2: 토끼에서 생리학적 내인성 FVIII 수준에 대한 rD'D3-FP를 사용한 정맥내 치료의 영향
동물
2.0 내지 3.2kg 체중 범위 내의 암컷 CHB 토끼(Bauer, Neuental, Germany)를 표준 하우징 조건으로, 즉, 12h/12h 명암 사이클 하에서 20 내지 23℃ 및 50% 상대 습도로 와이어-스틸 케이지에 케이지당 1마리씩 하우징하였다. 상기 동물에게 수돗물은 자유롭게 공급되고 토끼 펠렛이 공급된다(Deukanin®, Deutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG, D
Figure pct00002
sseldorf, Germany). 가축 사육 및 연구 절차는 독일 동물 복지법 및 유럽 연합 규정을 준수하였다.
실험의 세부사항
시험 제품을 토끼(그룹 당 n=3)의 측면 귀 정맥으로의 단일 주사에 의해 i.v. 투여하였다. rD'D3-FP는 사람 알부민 값을 기준으로 1, 3 또는 10 mg/kg의 용량 수준으로 적용하였다. 혈액 샘플은 1, 3 및 6h에서 사전 용량으로 귀 동맥으로부터 취함에 이어서 매일 정맥내 볼러스 주사 후, 투여 후 (p.a.) 10일까지 매일 샘플링한다. 이들은 나트륨 시트레이트 (1부 나트륨 시트레이트 3.13% + 9부 혈액)을 사용하여 응고를 억제하고 혈장으로 가공하여 rD'D3-FP 및/또는 FVIII 활성의 결정을 위해 대략 -70°C에서 저장하였다.
D'D3-FP 노출은 사람 알부민 ELISA를 이용한 작제물의 알부민 부분의 측정에 의해 결정되었다. FVIII 활성 혈장 수준은 발색성 검정 및 1-단계 응고 검정을 사용하여 검출하였다. 추가로, aPTT는 Actin® FSL 시험을 사용하여 정량하였다. 임의의 응고된 샘플은 평가로부터 배제하였다.
곡선 이하 총 피크 면적 (AUC)의 계산은 기준선으로서 전처리 값을 사용하고 최소에서 최대 값까지의 ≤30% 거리를 갖는 피크를 동정하여 10일의 기간 동안 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) (GraphPad Software, La Jolla, California, USA)으로 수행하였다.
결과
rD'D3-FP 는 10일 p.a.까지 정량하였고 측정된 데이터는 전체 관찰 기간 동안 16 또는 31 ng/mL의 검출 한계치를 훨씬 초과하였지만 7일에 또는 이후에 일부 동물에서는 하강이 관찰되었다(도 2a). 노출에서 상기 급하강은 7 내지 10일째에 개시하여 그리고 특히 보다 높은 용량에서 단일 동물에서 관찰되었다. 하나의 잠재적 원인은 시험된 다른 종과 비교하여 토끼 및 인간에서 D'D3 영역의 보다 낮은 상동성과 일치되는, 항-약물-항체의 형성일 수 있다.
FVIII 활성은 발색성 및 1단계 응고 활성으로서 측정되었고 상기 활성 둘다는 식염수 대조군과 비교하여 내인성 수준에서 증가를 보여준다(도 2b 및 2c). 상기 데이터는 3 내지 7일 p.a.의 피크와 함께 rD'D3-FP의 투여 후 내인성 FVIII 수준의 약간의 증가를 시사한다. 그럼에도 불구하고, 평균 값은 단지 일시적으로 응고 FVIII 활성 시험에서, 발색성에 있어서의 2.8 IU/mL 의 사전 용량 값의 범위에서 증가하고 규정치 (6.1 IU/mL)의 611%로 증가하였다. 이와 일치하여, 도 2d에서 보여주는 바와 같이 AUC (0 내지 10일 p.a. 동안 상승된)는 증가하였다: 발색성 검정은 3 mg/kg의 용량에서 개시하고, 응고 검정을 사용한 효과는 단지 10 mg/kg에서 가시적이었다. 이것은 잠재적으로 처리된 그룹에서 이미 보다 약간 높았던, 응고 검정에서 기준선 값의 보다 높은 변화와 관련된다.
FVIII 활성이 약간의 증가를 보여주었지만, 어떠한 감소도 aPTT에서 관찰되지 않았다(도 2e).
적어도 6일 동안 rD'D3-FP에 대한 소정의 노출과 함께, FVIII 활성에서의 약간의 증가가 관찰되었고 이는 식염수 처리된 동물에서 관찰된 수준을 약간 초과하였다. 피크 값은 3 내지 7일 p.a. 사이에 주어졌고 이는 식염수-처리된 동물의 <2-배 초과였다(FVIII 발색성 활성: ~1 IU/mL 또는 100% 내지 ~3.5 IU/mL = 350%까지 최대 증가; FVIII 응고 활성: ~400% 내지 ~900% 까지 최대 증가 - 이는 인간과 비교하여 이들 동물에서 보다 높은 기준선 값과 일치한다). 이들 증가된 FVIII 활성 수준은 10 mg/kg의 용량에서 3 내지 6일째에 토끼에서 생리학적 수준을 단지 약간 초과하였고, aPTT를 감소시키지 않았다. 따라서, 건강한 토끼에서, FVIII 수준에서의 단지 약간의 변화가 관찰되었다.
실시예 1.3: 몽키에서 생리학적 내인성 FVIII 수준에 대한 rD'D3-FP를 사용한 정맥내 치료의 영향
동물
체중 범위가 4 내지 7kg이고 연령이 대략 5 내지 6세인 수컷 시노몰구스 몽키(베트남으로부터 수득된 - 서류는 건강 스크리닝 및 연구소(Huntingdon Life Sciences, Cambridgeshire, UK)에 도착 전 투여받은 임의의 치료를 포함한다)는 표준 하우징 조건에서, 즉 12h/12h 명암 사이클 하에 15-24°C 및 40-70% 상대 습도에서 비-사람 영장류를 하우징하도록 특별히 다지인된 케이지에서 쌍으로 하우징시킨다. 상기 동물에게 수돗물을 자유롭게 공급하고 올드 월드 몽키 식이물(Old World Monkey Diet) (동물 당 하루 200 g) + 보충 식이물 (2개의 비스킷 보충물, 각각 대략 25 g, 및 신선한 과일 제품)을 공급하였다.
실험의 세부사항
시험 제품은 몽키 (그룹 당 n=3)의 복재 정맥으로 단일 주사에 의해 정맥내 투여하였다. rD'D3-FP는 사람 알부민 값을 기준으로 2.5mg/kg의 용량 수준으로 적용하였다. 혈액 샘플은 정맥내 볼러스 주사 후, 사전-용량에서 및 5, 30 분, 2, 6, 16, 30, 48, 72, 96, 120, 144, 168 시간에 대퇴 정맥으로부터 취하였다. 이들은 나트륨 시트레이트 (1부 나트륨 시트레이트 3.2% + 9부 혈액)을 사용하여 응고를 억제하고 혈장으로 가공하여 FVIII 활성 및/또는 rD'D3-FP의 투여를 위해 대략 -70°C에서 저장하였다.
rD'D3-FP 노출은 분자의 D'D3 부분을 포획하는 항체를 사용하고 알부민에 대한 검출 항체를 사용하여 작제물의 알부민 부분을 측정하여 결정하였다. FVIII 발색성 활성 혈장 수준은 Chromogenix 검정에 의해 검출하였다.
결과
rD'D3-FP는 이의 성분, 알부민 및 D'D3 둘다에 결합하는 ELISA를 사용하여 정량하였고, 측정은 168 h (7 d) p.a.까지 수행하였다. 측정된 데이터는 전체 관찰 기간 동안 검출 한계를 훨씬 초과하였다(도 3a).
FVIII 활성은 도 3b에 나타낸 바와 같은 색소성 활성으로서 측정하였다. 기본 내인성 수준은 적절히 다양하였고, 규정치(0.8-3.1 IU/mL = 도 3b에서 점선)의 83.6-314.8 %의 범위이고 규정치 (1.8 IU/mL, 도 3b에서 파선)의 평균 176.4%이다. 래트 및 토끼에서와 같이, 규정치의 258.9%의 평균 최대치까지 내인성 FVIII 수준의 소량 증가만이 관찰되었고 가변성은 매우 높았다. 그럼에도 불구하고 개별 사전 용량 값과 비교하여 규정치( ~2.5 IU/mL 또는 ~2.5 IU/mL - 인간과 비교하여 이들 동물에서의 보다 높은 기준선 값과 일치하는)의 ~1 IU/mL 또는 ~100 %까지 내인성 FVIII 수준에서의 증가가 입증되었고, 이는 (평균으로서) 그럼에도 불구하고 몽키의 생리학적 FVIII 수준을 초과하지 않았다.
실시예 1.4: VWF ko 래트에서 내인성 FVIII 수준에 대한 rD'D3-FP를 사용한 정맥내 치료의 영향
동물
261 내지 598g 체중 범위 내의 수컷 및 암컷 VWF ko 래트를 찰스 리버 래버러토리(Charles River Laboratories)(Sulzfeld, Germany)에서 사육하였다. 실험실 내에서, 상기 동물들을 표준 하우징(housing) 조건으로, 즉, 12h/12h 명암 사이클 하에서 20 내지 24℃로 유지하였다. 동물들은 표준 마우스 및 래트 식이(Ssniff-Versuchsdiaten, Soest, Germany)로 자유 급식하였다. 수돗물을 자유 공급하였다. 가축 사육 및 연구 절차는 독일 동물 복지법 및 유럽 연합 규정을 준수하였다.
1 및 10mg/kg 그룹의 그룹 크기는 n=9이고, 3개 코호트로 나뉘고, 대조군(단지 n=3 마리)은 제외한다. 따라서, 시점 당 n=3 동물은 모든 비히클, 1 및 10 mg/kg rD'D3-FP 시점에 대해 사용되었다. 3mg/kg 그룹에 대해, 상기 그룹 크기는 시점 당 n=4였다.
실험의 세부사항
시험 제품을 측면 꼬리 정맥으로의 단일 주사에 의해 2 또는 3mL/kg의 총 용적으로 i.v. 투여하였다. rD'D3-FP는 사람 알부민 값을 기준으로 1, 3 또는 10 mg/kg의 용량 수준으로 적용하였다. 혈액 샘플은 교호 샘플링 계획을 사용하여 사전 용량, 6, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 240, 336 시간 (1 및 10 mg/kg) p.a에서 단기 마취하에 안구뒤에서 취하거나 각각의 개별 동물로부터 사전 용량, 1, 24, 48, 72, 120, 192, 240 및 336 시간 p.a. (3 mg/kg)에서 복재 정맥으로부터 취하였다 . PK 프로파일은 그룹 당 래트의 3개 코호트 (1 및 10mg/kg)로부터 또는 개별 동물 (3mg/kg)로부터 취하였다. 혈액 샘플을 나트륨 시트레이트(1부 나트륨 시트르레이트 3.13% + 9부 혈액)을 사용하여 응고를 억제하고, 혈장으로 프로세싱하였고, FVIII 활성 및/또는 알부민의 측정을 위해 -70℃에서 저장하였다.
D'D3-FP 노출은 사람 알부민 ELISA를 이용한 작제물의 알부민 부분의 측정에 의해 결정되었다. 추가로, FVIII 발색성 및 응고 활성 및 aPTT는 측정하였다(그룹에서 후자만이 1 및 10 mg/kg rD'D3-FP로 치료하였다).
곡선 이하 면적 (AUC)의 계산은 트라페조이드성 방법을 사용하여 제로에서 10일까지 MATLAB R2017a (Natick, Massachusetts, USA)를 사용하여 수행하였다.
결과
rD'D3-FP는 사람 알부민에 대해 ELISA를 사용하여 정량하고 측정은 14일 p.a.까지 수행하였다. 모든 측정된 데이터는 14일까지 전체 관찰 기간 동안 검출 한계를 훨씬 초과하였다(도 4a). 선형 용량-의존성은 1 내지 10 mg/kg rD'D3-FP로부터 나타났다.
도 4b에 나타낸 바와 같은 발색성 활성으로서 측정된 FVIII 활성은 적절한 기준선 FVIII 수준을 제공하지 못했다: 23개 샘플 중 22개는 검출 한계치(0.005 IU/mL 또는 0.5%) 미만이었고 하나의 동물은 0.007 IU/mL의 값을 가졌다. VWF ko 래트에서(CD 래트와는 대조적으로), 규정치의 상한치(ULN, 4 IU/mL)는 래트 종 둘다의 샘플의 정량을 위해 사용되는 1:4의 희석과 함께 도달하였다: rD'D3-FP의 투여 후, 수준은 2일내 증가하였고, 심지어 10 mg/kg 용량으로 4 IU/mL (또는 400%)의 검정의 정량의 상한치를 초과한다. VWF ko 래트에서, 1 또는 3mg/kg이 아니라 10mg/kg의 rD'D3-FP의 투여 후 FVIII 활성 수준은 건강한 CD 래트에서 측정된 값을 일시적으로 초과하였다. FVIII 발색성 활성 값은 10 mg/kg rD'D3-FP의 투여 후 또한 다른 건강한 종, 즉 토끼(10 mg/kg까지 rD'D3-FP가 투여된) 또는 몽키 (2.5 mg/kg rD'D3-FP)에서 보다 높았다. 10 mg/kg rD'D3-FP의 투여 후 래트에서의 효과는 10일까지 지속하였다. 심지어 1 mg/kg rD'D3-FP의 용량에서도, 2.36 IU/mL (또는 236%)의 최고 혈장 농도가 2일째에 도달하였고 상기 효과는 여전히 주마다 7일째에 나타났다. 3 mg/kg rD'D3-FP와 유사하게, 최고 FVIII 혈장 농도는 1일째(2.09 IU/mL 또는 209%)에 도달하였다. 이들 보다 낮은 2개 용량을 사용했을 때, 평균 FVIII 농도는 단지 CD 래트로부터 정상 수준 범위내에 있다.
FVIII 활성은 도 4c에 도시된 바와 같이 응고 검정을 사용하여 측정되는 경우, 기준선 FVIII 수준은 측정가능하였다(희석되지 않은 샘플: 평균 22.3%, 규정치, n=17의 최소 11.7% 및 최대 40.9%, n=17; 및 40%의 검출 한계치, 나머지 20개 샘플은 <40%). 따라서, CD 래트 및 토끼에서와 같이, 기준선 값은 매우 가변적이다. rD'D3-FP의 투여 후 모든 샘플이 1:8의 희석으로 규정치의 1186.4 %의 ULN을 생성시킬 필요가 있음을 언급할 필요가 있다. 다시, 10 mg/kg의 용량으로 rD'D3-FP의 투여 후, 내인성 FVIII 수준은 검정의 ULN을 심지어 초과하여, 즉, 토끼에서 보다 더 높게 2일 이내 증가하였다. 상기 효과는 10 mg/kg rD'D3-FP의 높은 용량에서 14일까지 지속하였다. 심지어 1 mg/kg의 용량에서도, 정규치의 388.8%의 최고 혈장 농도가 2일째에 도달하였고 상기 효과는 여전히 주마다 7일째에 나타났다. 유사하게 3 mg/kg의 용량에서, 2일째에 측정된 최고 혈장 농도는 규정치의 435.2%였다. 발색성 FVIII 활성과 유사하게, FVIII 활성의 생리학적 범위는 10 mg/kg의 투여 후 초과되었고 단지 1 또는 3 mg/kg rD'D3-FP의 투여 후 도달되었다.
따라서, 발색성 및 응고 활성 데이터는 추정컨대 사람 FVIII 표준물에 대한 기준선 래트 FVIII의 측정과 관련된, 약간 보다 강한 반응을 보여주는 응고 활성 데이터와 일치한다. FVIII 활성에서의 증가가 관찰되었고, 이는 건강한 CD 래트 (1 및 3 mg/kg)에서 관찰된 수준에 도달하거나 이들을 초과하였다(10 mg/kg). 10 mg/kg 용량에 대해, 피크 값은 상한 검출 한계치를 초과하였고, 정상 범위 초과의 x-배 증가는 결정될 수 없다.
이것은 AUC (0 내지 10일)에서의 계산된 증가와 일치하고 이는 도 4d에 도시된 바와 같이 1, 3 및 10 mg/kg rD'D3-FP의 투여 후 증가를 보여준다. 1 및 3 mg/kg rD'D3-FP를 사용한 투여 후 증가는 비히클 치료와 비교하여 발색성 활성에 대해 ~10-배이고 응고 FVIII 활성에 대해 ~80-배이고, 10 mg/kg rD'D3-FP를 사용한 것들은 발색성 활성에 대해 ~50-배 및 AUC0-10d에 대해 430 배 효과에 도달하였다.
FVIII 수준에서의 이들 증가와 일치하여, 활성화된 부분 트롬빈 시간 (aPTT)은 10mg/kg rD'D3-FP 용량 그룹에서 비히클 데이터로부터 12.5s의 최저 평균 값으로 적절하게 감소하였다(도 4e). 상기 감소는 측정된 용량 그룹 둘다 (1 및 10mg/kg)에서 14일까지 지속하였고, (1 mg/kg rD'D3-FP) 또는 (10 mg/kg rD'D3-FP)의 약간 미만에서 aPTT 값을 건강한 CD 레트에서 관찰된 범위(범위 16.5-36.6 s)에 있게 하였다.
실시예 1.5: VWF ko 마우스에서 내인성 FVIII 수준에 대한 rD'D3-FP를 사용한 정맥내 치료의 영향
동물
30 내지 45g의 체중 범위에서 수컷 및 암컷 ko 마우스는 연구소(harles River Laboratories (Sulzfeld, Germany))에서 사육하였다. 실험실 내에서, 상기 동물들을 표준 하우징(housing) 조건으로, 즉, 12h/12h 명암 사이클 하에서 20 내지 24℃로 유지하였다. 동물들은 표준 마우스 및 래트 식이(Ssniff-Versuchsdiaten, Soest, Germany)로 자유 급식하였다. 수돗물을 자유 공급하였다. 가축 사육 및 연구 절차는 독일 동물 복지법 및 유럽 연합 규정을 준수하였다.
그룹 크기는 n=12이고, 4개 코호트로 나뉘고, 대조군(n=4 마리 동물)은 제외한다. 따라서, 시점당 n=3-4 마리의 동물이 사용되었다.
실험의 세부사항
시험 제품(rD'D3-FP 또는 비히클(등장성 식염수))은 5 mL/kg의 총 용적으로 측면 꼬리 정맥으로 단일 주사에 의해 i.v. 투여하였다. rD'D3-FP는 사람 알부민 값을 기준으로 10 mg/kg의 용량 수준으로 적용하였다. 혈액 샘플은 rD'D3-FP-용량 동물로부터 교호 샘플링 계획을 사용하여 4, 7, 16, 24, 48, 72, 96 및 168 h p.a.에서 및 비히클-처리된 동물로부터 4 및 168 h p.a에서 단기 마취하에 안구뒤에서 취하였다. PK 프로파일은 그룹당 마우스의 4개의 코호트로부터 취하였다. 혈액 샘플을 나트륨 시트레이트(1부 나트륨 시트르레이트 3.13% + 9부 혈액)을 사용하여 응고를 억제하고, 혈장으로 프로세싱하였고, FVIII 활성 및/또는 알부민의 측정을 위해 -70℃에서 저장하였다.
D'D3-FP 노출은 사람 알부민 ELISA를 이용한 작제물의 알부민 부분의 측정에 의해 결정되었다. 추가로, FVIII 발색성 활성 및 응고 활성을 측정하였다.
곡선 이하 총 피크 면적 (AUC)의 계산은 초소 내지 최대 값까지의 ≤10% 거리를 갖는 피크를 동정하여 7일의 기간 동안 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) (GraphPad Software, La Jolla, California, USA)으로 수행하였다.
결과
rD'D3-FP는 사람 알부민에 대해 ELISA를 사용하여 정량하고 측정은 7일 p.a.까지 수행하였다. 모든 측정된 데이터는 전체 관찰 기간 동안 검출 한계를 훨씬 초과하였다(도 5a).
발색성 활성으로서 측정된 FVIII 활성은 적절한 기준선 FVIII 수준을 제공하지 못하였다: 비히클-처리된 동물로부터 모든 6개 측정된 샘플은 검출 한계치 미만(10 mIU/mL 또는 1%)이다. 비교를 위해, 건강한 NMRI 마우스의 발색성 활성은 약 96-300 mIU/mL, 메디안 230 mIU/mL, 평균 206 mIU/mL의 범위 (규정치의 범위 10-30%, 공개되지 않은 데이터), 즉 다른 동물 종 또는 인간에서 관찰된 것 미만의 범위였다. 도 5b에 따르면, rD'D3-FP의 투여 후, 수준은 4시간 이내 138 mU/mL (14%)의 평균 값으로 신속히 증가하였고, 추가로 증가하여 48 h p.a.에서 최대로 도달하였고, 평균적으로 421 mU/mL (42%) 내지 72 h p.a. (429 IU/mL 또는 43%)이다. 168 h (7d) p.a.에서 마지막 시점에서, 여전히 194 mU/mL (20%)이 측정되었다. 이와 함께, 10 mg/kg rD'D3-FP를 사용한 치료 후 FVIII 발색성 활성은 NMRI 마우스에서 측정된 바와 같이 생리학적 FVIII 혈장 수준을 약간 초과하였고 효과는 VWF ko 래트에 상응하였다.
FVIII 활성이 응고 검정을 사용하여 측정되는 경우, 기준선 FVIII 수준은 측정가능하였다(비히클-처리된 동물: 평균 31.1, 규정치의 최소 25.8 및 최대 41.8 %, n=8). 따라서, 다른 종에서와 같이, 기준선 값은 매우 가변적이다. 다시, rD'D3-FP의 투여 후, 수준은 도 5c에 도시된 바와 같이 신속히 증가하였고, 단지 1:60의 희석에서 측정될 수 있다(기준선 값의 정량을 위해 사용되는 비히클-처리된 동물은 1:10의 희석과 함께 측정하였다). 4 h p.a.의 처음 샘플링 지점에서, 평균 값은 이미 규정치의 137 %에 있고 16h p.a.까지 추가로 증가하였고, 평균은 규정치의 218%이다. 최대 노출은 72 h p.a.에서 도달하였고 평균은 규정치의 304 %이다. 168 h (7d) p.a.에서 마지막 시점에서, 여전히 규정치의 254%가 측정되었다.
따라서, 발색성 및 응고 활성 데이터는 일반적으로, 추정컨대 사람 FVIII 표준물에 대한 마우스 FVIII (VWF ko 동물에서)의 측정과 관련된, 약간 보다 강한 반응을 보여주는 응고 활성 데이터와 일치한다. FVIII 활성에서의 증가가 관찰되었고, 이는 건강한 NMRI 마우스 <2-배에서 관찰된 수준을 초과하였다 (FVIII 발색성 활성: 0.1 IU/mL까지 최대 증가 = ~10% 내지 ~0.4 IU/mL = 40% - 이는 인간과 비교하여 이들 동물에서 보다 낮은 기준선 값과 일치하고; FVIII 응고 활성: ~300% 까지 최대 증가(NMRI 마우스로부터 어떠한 범위도 결정되지 않음)). 이것은 AUC (0 내지 7일)에서의 계산된 증가와 일치하고 이는 도 5d에 도시된 바와 같이 비히클 처리된 동물과 비교하여 10 mg/kg rD'D3-FP의 투여 후 큰 증가를 보여준다.
실시예 1.6: VWF ko 래트에서 내인성 FVIII 수준에 대한 상이한 rD'D3 폴리펩타이드를 사용한 정맥내 치료의 영향
동물
261 내지 559g 체중 범위 내의 수컷 및 암컷 VWF ko 래트를 찰스 리버 래버러토리(Charles River Laboratories)(Sulzfeld, Germany)에서 사육하였다. 실험실 내에서, 상기 동물들을 표준 하우징(housing) 조건으로, 즉, 12h/12h 명암 사이클 하에서 20 내지 24℃로 유지하였다. 동물들은 표준 마우스 및 래트 식이(Ssniff-Versuchsdiaten, Soest, Germany)로 자유 급식하였다. 수돗물을 자유 공급하였다. 가축 사육 및 연구 절차는 독일 동물 복지법 및 유럽 연합 규정을 준수하였다.
그룹 크기는 각각의 그룹에 대해 n=4이었다.
실험의 세부사항
시험 제품은 3 mL/kg의 총 용적으로 측면 꼬리 정맥으로 단일 주사에 의해 i.v. 투여하였다. rD'D3-FP는 사람 알부민 값을 기준으로 3 mg/kg의 용량 수준으로 적용하였다. 혈액 샘플은 rD'D3-FP-용량 동물로부터 사전 용량, 1, 24, 48, 72, 120, 192, 240 및 336 h p.a에서 및 rD'D3-CTP 치료받은 동물로부터 사전 용량, 1, 24, 48, 72, 96, 168, 240 및 336h에서 복재 정맥으로부터 취하였다. 혈액 샘플을 나트륨 시트레이트(1부 나트륨 시트르레이트 3.13% + 9부 혈액)을 사용하여 응고를 억제하고, 혈장으로 프로세싱하였고, FVIII 활성 및/또는 알부민의 측정을 위해 -70℃에서 저장하였다.
D'D3-FP 노출은 사람 알부민 ELISA를 이용한 작제물의 알부민 부분의 측정에 의해 결정되었다. rD'D3-CTP는 항-사람 D'D3에 대한 항체를 사용한 ELISA 기술에 의해 측정하였다. 추가로, FVIII 발색성 활성 및 응고 활성을 측정하였다.
0 내지 10일까지의 곡선 이하 면적 (AUC) 계산은 트라페조이드성 방법을 사용하여 MATLAB R2017a (Mathworks, Natick, Massachusetts, USA)로 수행하였다.
결과
rD'D3-FP는 사람 알부민에 대해 ELISA를 사용하여 정량하고 측정은 14일 p.a.까지 수행하였다. rD'D3-FP 변이체의 모든 측정된 데이터는 전체 관찰 기간에 걸쳐 검출 한계치를 초과하였고, rD'D3-CTP는 14일째에 기준선 값에 도달하였다(도 6a). rD'D3-FP WT의 약간의 이점은 변이체 EY 및 EYA와 비교하여 회수시에 관찰되었지만 어떠한 관련된 차이가 소거율과 관련하여 나타나지 않았다. rD'D3-CTP는 사람 rD'D3에 대해 ELISA를 사용하여 정량하였고 측정은 10일 p.a.까지 및 이를 포함하여 검출 한계치를 훨씬 초과하였다(도 6a).
발색성 활성으로서 측정된 FVIII 활성은 적절한 기준선 FVIII 수준을 제공하지 못하였다: 모든 18개 측정된 사전 용량 샘플은 검출 한계치 미만(20 mIU/mL 또는 2%)이다. 도 6b에 따라, rD'D3-FP 변이체의 투여 후, 수준은 이미 1h p.a.에서 (WT 197 ± 20 mIU/mL 또는 5%, EY 171 ± 84 mIU/mL 또는 17%, EYA 203 ± 117 mIU/mL 또는 20% 및 CTP 110 ± 102 mIU/mL 또는 11%) 및 심지어 추가로 다음 측정된 시점에서 증가하였다. 최대치는 1일 내지 8일에서 도달하였고 WT에 대해 평균 2088 mU/mL (209%), EY에 대해 평균 2889 mU/mL (289%), EYA에 대해 평균 1044 mU/mL (104%) 및 CTP에 대해 평균 2214 mU/mL (221%)이었다. 마지막 측정가능한 FVIII 활성은 10일째에 WT(237 ± 225 mU/mL (24%)), 10일째에 EY(512 ± 603 mU/mL (51%)), 14일째에 EYA(마지막 측정된 시점, 179 ± 107 mU/mL (18%), 및 14일째에 CTP(22 ± 4 mU/mL (2%))에 대해 관찰되었다. 이것은 rD'D3-CTP 변이체의 i.v. 투여 후 최고 관찰된 AUC0-10d를 유도하였다(표 2, 도 6d).
FVIII 활성이 응고 검정으로 측정되는 경우, 기준선 FVIII 수준은 또한 측정가능하지 않았다(n=20 사전 용량 처리된 동물, 검출 한계치 40%). 도 6c에 도시된 바와 같이, rD'D3-HLP의 투여 후, 수준은 이미 1h p.a.에서 (WT 47 ± 4 %, EY 41 ± 1 %, EYA 45 ± 5 % 및 CTP 40 ± 1 %) 및 심지어 추가로 다음 측정된 시점에서 증가하였다. 최대치는 1일 내지 8일에서 도달하였고 WT에 대해 평균 435 %, EY에 대해 평균 453%, EYA에 대해 평균 779 % 및 CTP에 대해 358%이었다. 마지막 측정가능한 FVIII 활성은 10일째에 WT(85 ± 39 %), 10일째에 EY(130 ± 84 %), 14일째에 EYA(마지막 측정된 시점, 46 ± 7 %, 및 7일째에 CTP(57 ± 29 %)에 대해 관찰되었다. rD'D3-FP EYA의 i.v. 투여 후 최고 관찰된 AUC0-10d를 성취하였다(표 2, 도 6d).
따라서, 발색성 활성 및 응고 활성 데이터는 일반적으로 다시 보다 강한 반응을 보여주는 응고 활성 데이터와 일치하였다. FVIII 활성에서의 증가는 발색성 FVIII 활성에 대해 약 1.5-2 IU/mL (150-200%)로 및 응고 활성에 대해 ~300-700 %로 관찰되었고, 따라서, CD 래트에서 발색성 FVIII 활성에 대한 값의 약간 미만이고 CD 래트에서 응고 FVIII 활성에 대한 값의 약간 초과였고(참조: 실시에 1.4에서 도 4b 및 도 4c) - 이는 인간의 것들과는 상이한 동물에서의 기준선 값과 일치한다.
[표 2]
Figure pct00003
따라서, 발색성 및 응고 활성 데이터는 일반적으로 보다 높은 절대 AUC0-10d 값과 관련된 보다 높은 절대 FVIII 농도를 보여주는 응고 활성 데이터와 일치하였다. FVIII 활성에 대한 효과는 응고 검정과 비교하여 발색성 활성에서 rD'D3-CTP 투여 후 보다 강한 것으로 언급된다. 모든 4개의 rD'D3-FP 변이체는 약 상응하는 노출을 보여주었고, FVIII에 대해 최고 결합 친화성을 갖는 rD'D3-FP EYA 변이체는 내인성 FVIII에 대해 최장 및 최고 효과를 보여주었다.
실시예 1.7: FVIII ko, VWF ko 및 NMRI 마우스, VWF ko 및 CD 래트 및 돼지에서 rD'D3-FP의 피하 유용성, 및 VWF ko 래트 및 돼지에서 내인성 FVIII 수준에 대한 이의 영향
동물
FVIII ko 마우스
20 내지 30g의 체중 범위에서 수컷 및 암컷 ko 마우스는 연구소(harles River Laboratories (Sulzfeld, Germany))에서 사육하였다. 그룹 크기는 n=12이었고, 4개의 코호트(cohort)로 나뉘었다. 따라서, 시점당 n=3의 동물이 사용되었다.
VWF ko 마우스
25 내지 40g의 체중 범위에서 수컷 및 암컷 ko 마우스는 연구소(harles River Laboratories (Sulzfeld, Germany))에서 사육하였다. 그룹 크기는 n=12이었고, 4개의 코호트(cohort)로 나뉘었다. 따라서, 시점당 n=3의 동물이 사용되었다.
NMRI 마우스
27 내지 34g의 체중 범위에서 암컷 NMRI 마우스는 연구소(harles River Laboratories (Sulzfeld, Germany))에서 사육하였다. 그룹 크기는 n=12이었고, 4개의 코호트(cohort)로 나뉘었다. 따라서, 시점당 n=3의 동물이 사용되었다.
CD 래트
250 내지 302g 체중 범위 내의 암컷 래트 Crl:CD(스프라그 돌리(Sparague Dawley))를 찰스 리버 래버러토리(Charles River Laboratories)(Sulzfeld, Germany)에서 사육하였다. 그룹 크기는 n=6이었고, 2개의 코호트(cohort)로 나뉘었다. 따라서, 시점당 n=3의 동물이 사용되었다.
VWF ko 래트
222 내지 559g 체중 범위 내의 수컷 및 암컷 VWF ko 래트를 찰스 리버 래버러토리(Charles River Laboratories)(Sulzfeld, Germany)에서 사육하였다. 그룹 크기는 n=4이었다.
실험실 내에서, 상기 마우스 및 래트를 표준 하우징(housing) 조건으로, 즉, 12h/12h 명암 사이클 하에서 20 내지 24℃로 유지하였다. 동물들은 표준 마우스 및 래트 식이(Ssniff-Versuchsdiaten, Soest, Germany)로 자유 급식하였다. 수돗물을 자유 공급하였다. 가축 사육 및 연구 절차는 독일 동물 복지법 및 유럽 연합 규정을 준수하였다.
돼지
돼지는 이들이 인간에 대한 예측과 관련하여 피하 생물유용성에 대해 양호한 모델을 나타내기 때문에 선택되었다. 상기 그룹 크기는 2 (정맥내) 또는 3 (피하)이었다.
23-27 kg의 체중 범위에서 수컷 돼지는 연구소(Schlosser (Schwalmtal, Germany))에서 사육하였다. 실험실 내에서, 상기 동물은 18-21°C에서 스트로우 상에서 안정한 상태로 유지하였다. 동물에게 상처난 낟알을 공급하였다. 수돗물을 자유 공급하였다. 가축 사육 및 연구 절차는 독일 동물 복지법 및 유럽 연합 규정을 준수하였다.
실험의 세부사항
FVIII ko, VWF ko 및 NMRI 마우스
시험 제품을 측면 꼬리 정맥으로의 단일 주사에 의해 5mL/kg의 총 용적으로 i.v. 투여하거나, 목으로의 단일 주사에 의해 5mL/kg의 총 용적으로 s.c. 투여하였다. 혈액 샘플은 3, 8, 16, 24, 32, 48, 72 및 96 h p.a.에서 교호 샘플링 계획을 사용하는 단기 마취하에 안구뒤에서 취하고 5분 p.a.에서 i.v. 추가로 취하였다.
혈액 샘플을 나트륨 시트레이트(1부 나트륨 시트르레이트 3.13% + 9부 혈액)을 사용하여 응고를 억제하고, 혈장으로 프로세싱하였고, -70℃에서 저장하였다.
D'D3-FP 노출은 사람 알부민 ELISA를 이용한 작제물의 단백질의 알부민 부분의 측정에 의해 결정되었다.
VWF ko 래트
시험 제품을 측면 꼬리 정맥으로의 단일 주사에 의해 3mL/kg의 총 용적으로 i.v. 투여하거나, 옆구리 한쪽 측면에 단일 주사에 의해 2mL/kg의 총 용적으로 s.c. 투여하였다.
s.c. 그룹으로부터의 혈액 샘플은 각각의 동물로부터 사전 용량, 4, 24, 48, 72, 96 및 168 h p.a.에서 복재 정맥으로부터 및 사전 용량, 1, 24, 48, 72, 120, 192, 240 및 336 h p.a에서 i.v. 그룹으로부터 취하였다.
혈액 샘플을 나트륨 시트레이트(1부 나트륨 시트르레이트 3.13% + 9부 혈액)을 사용하여 응고를 억제하고, 혈장으로 프로세싱하였고, -70℃에서 저장하였다.
D'D3-FP 노출은 사람 알부민 ELISA를 이용한 작제물의 단백질의 알부민 부분의 측정에 의해 결정되었다. 추가로, FVIII 발색성 활성을 측정하였다.
CD 래트
시험 제품을 측면 꼬리 정맥으로의 단일 주사에 의해 3mL/kg의 총 용적으로 i.v. 투여하거나, 옆구리 한쪽 측면에 단일 주사에 의해 3mL/kg의 총 용적으로 s.c. 투여하였다.
혈액 샘플은 3, 8, 16, 24, 32, 48, 72 및 96 h p.a.에서 교호 샘플링 계획을 사용하는 단기 마취하에 안구뒤에서 취하고 5분 p.a.에서 i.v. 추가로 취하였다.
혈액 샘플을 나트륨 시트레이트(2부 나트륨 시트르레이트 3.13% + 8부 혈액)을 사용하여 응고를 억제하고, 혈장으로 프로세싱하였고, -70℃에서 저장하였다.
D'D3-FP 노출은 사람 알부민 ELISA를 이용한 작제물의 단백질의 알부민 부분의 측정에 의해 결정되었다.
돼지
시험 제품을 0.211 내지 0.751 mL/kg 범위의 총 용적으로 옆구리에서 s.c.로 또는 귀 정맥으로 i.v.로 투여하였다 .
혈액 샘플은 귀 또는 복재 정맥으로부터 취하였다. 10 mg/kg rD'D3-FP s.c. 그룹에서 시점은 사전 용량, 3, 12, 24, 32, 48, 72, 96, 120, 144 및 168 h p.a.이고, i.v. 그룹에서는 사전 용량, 3, 12, 24, 32, 48, 72, 96, 120, 144 및 168 h p.a이다. 3 mg/kg rD'D3-FP s.c. 그룹에서 시점은 사전 용량, 1, 3, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, 240 및 264 h p.a.이다.
PK 프로파일은 개별 동물로부터 취하였다. 혈액 샘플을 나트륨 시트레이트(1부 나트륨 시트르레이트 3.13% + 9부 혈액)을 사용하여 응고를 억제하고, 혈장으로 프로세싱하였고, FVIII 활성 및 알부민의 측정을 위해 -70℃에서 저장하였다.
D'D3-FP 노출은 사람 알부민 ELISA를 이용한 작제물의 단백질의 알부민 부분의 측정에 의해 결정되었다. 추가로, FVIII 발색성 활성을 측정하였다.
일반사항
rD'D3-FP는 사람 알부민 값을 기준으로 3, 3.5 또는 10 mg/kg의 용량 수준으로 적용하였다. 마우스에서, 일부 그룹에서, rVIII-단일쇄를 100 또는 200 IU/kg의 용량으로 동시 투여하였다. PK 프로파일은 각각 그룹 당 마우스의 4개 코호트 또는 래트의 2개 코호트로부터 또는 개별 돼지로부터 취하였다.
0 내지 무제한까지의 곡선 이하 면적 (AUC) 계산은 MATLAB R2017a (Mathworks, Natick, Massachusetts, USA)로 수행하였다.
결과
rD'D3-FP는 사람 알부민에 대해 ELISA를 사용하여 정량하고 측정은 마우스에서 4일 p.a.까지 및 래트 및 돼지에서 14일 p.a.까지 수행하였다. 모든 측정된 데이터는 전체 관찰 기간 동안 검출 한계를 훨씬 초과하였다(도 7a).
도 7a-1은 rFVIII 동시-투여의 어떠한 가시적 영향이 없는, 상이한 마우스 종 중에 rD'D3-FP의 PK 프로파일을 보여준다. 모든 3개이 종 중에서 곡선은 대략 상응하지만 그럼에도 불구하고 NMRI 마우스에서 노출은 FVIII ko 또는 VWF ko 동물에서 보다 신속하게 감소한다.
rD'D3-FP의 AUC0-inf 및 수득한 생물유용성은 표 3에 요약한다. FVIII ko 마우스에서, rVIII-단일쇄의 존재 또는 부재하의 rD'D3-FP의 i.v. 투여는 AUC0-inf에 대해 어떠한 영향을 갖지 않는(FVIII의 사용은 100%로 설정되고 -> FVIII의 부재는 89%로 계산됨)것으로 나타났다. 따라서, 상기 실험에서 rD'D3-FP PK 프로파일에 대한 rVIII-단일쇄의 관련 효과가 없었다. 상이한 종에서 AUC0-inf의 비교는 3개의 종 간에 어떠한 주요 차이를 시사하지 않고, VWF ko 동물 (1197 h*μg/mL)에 대한 FVIII ko(1590 h*μg/mL)로부터 아기나(agina)로의 랭킹은 NMRI 동물 (940 h*μg/mL)에서의 AUC0-inf를 약하게 저하시킨다.
래트에서 PK 프로파일은 도 7a-2에 나타내고, CD 및 VWF ko 래트에서 s.c. 및 i.v. 투여 후 rD'D3-FP의 상응하는 소거율을 시사한다. 그럼에도 불구하고, s.c. 가용성은 CD 래트와 비교하여 VWF ko 래트에서 최저였다. 도 7a-3은 돼지에서 PK 프로파일을 보여주고 이는 늦어도 2일 후 동일한 용량에서 상응하는 노출 및 rD'D3-FP에 대한 rVIII-단일쇄의 어떠한 영향도 없음을 시사한다.
표 4는 종에 대한 rD'D3-FP의 생물유용성을 요약한다. 래트에서, 생물유용성의 계산을 위한 AUC0-inf (CD 래트) 및 AUC0-inf (VWF ko 래트)의 평가는 각각 40 % 및 11 %의 값을 보여주었고, 즉, 보다 양호한 생물유용성은 VWF ko 동물과 비교하여 FVIII-적격 래트에서 나타났다. 이것은 마우스 AUC0-inf inf 평가에서의 관찰과는 대조적이고, 이는 VWF ko 및 NMRI 동물로부터의 대략 상응하는 데이터를 시사한다. 적어도, VWF ko 마우스는 NMRI 마우스와 비교하여 양호한 AUC0-inf를 갖는다. 돼지에서, rD'D3-FP의 AUC0-inf는 59 내지 187% 범위이다 이를 종합하면, 종들과 비교하여 상기 돼지는 최고 rD'D3-FP 생물유용성을 보여주었다.
[표 3]
Figure pct00004
[표 4]
Figure pct00005
내인성 FVIII 발색성 활성은 정맥내 (이전 실시예 1.1-1.5 참조) 투여 후 뿐만 아니라 피하 rD’D-FP 투여 후 (도 7b) 증가하였다.
도 7b-1은 래트에서, 값은 1일 (3 mg/kg i.v.) 또는 4일 (10 mg/kg s.c.)에 최대로 증가하였음을 보여준다. 이것은 i.v. rD'D3-FP 투여(rD'D3-FP 용량과는 무관하게)와 비교하여 s.c. 투여 후 FVIII AUC0-inf에 대한 효과에서의 17% (발색성) 및 14% (응고) 활성으로의 감소에 대해 계산한다. 내인성 FVIII 활성에서 상기 약간이지만 그럼에도 불구하고 적절한 증가는 s.c. 치료 뿐만 아니라 i.v. 치료에 대해 관찰되었고 (주로 ~0.5-1 IU/mL 또는 50-100% 범위) 따라서 상기 범위는 CD 래트에서 관찰된 수준의 약간 미만이다(도 4b를 비교한다).
돼지에서(도 7b-2), FVIII 발색성 활성에서의 증가는 rD'D3-FP의 s.c. 투여 후 약 1일째에 관찰되었다. 상기 효과는 전체 11일 기간 동안 지속되었다. 상기 증가는 사전 용량 값의 최대 2배 초과였다(~5 IU/mL 또는 500% 내지 ~10 IU/mL = 1000%까지의 최대 증가 - 인간과 비교하여 이들 동물에서 보다 높은 기준선 값과 일치함, 즉, FVIII 적격 동물로의 i.v. 화합물 투여 후 작은 효과와 일치함).
따라서, 이들 데이터는 rD'D3-FP를 사용한 치료가 i.v. 화합물 투여를 사용할 뿐만 아니라 s.c. 화합물 투여를 사용하여 수행될 수 있음을 시사한다.
실시예 1.8: VWF ko 래트에서 내인성 FVIII 수준에 대한 rD'D3-FP의 다중 정맥내 용량의 영향
동물
281 내지 504g 체중 범위 내의 수컷 및 암컷 VWF ko 래트를 찰스 리버 래버러토리(Charles River Laboratories)(Sulzfeld, Germany)에서 사육하였다. 그룹 크기는 n=11이었고, 4개의 코호트(cohort)로 나뉘었다. 따라서, 시점당 n=2-3 마리의 동물이 사용되었다.
실험실 내에서, 상기 동물들을 표준 하우징(housing) 조건으로, 즉, 12h/12h 명암 사이클 하에서 20 내지 24℃로 유지하였다. 동물들은 표준 마우스 및 래트 식이(Ssniff-Versuchsdiaten, Soest, Germany)로 자유 급식하였다. 수돗물을 자유 공급하였다. 가축 사육 및 연구 절차는 독일 동물 복지법 및 유럽 연합 규정을 준수하였다.
실험의 세부사항
시험 제품은 0일 (코호트 1), 0+7일 (코호트 2), 0+7+14+21 (코호트 3) 또는 0+7+14일 (코호트 4) 째 3mL/kg의 총 용적으로 측면 꼬리 정맥으로 다중 주사에 의해 i.v. 투여하였다. 동물 당 2개의 혈액 샘플은 코호트-특이적 시점 (코호트 1: 사전 용량 + 7 일 p.a., 코호트 2: 3 + 10 일 p.a., 코호트 3: 17 + 24 일 p.a., 코호트 4: 14 + 21 일 p.a.)에서 단기 마취하에 안구 뒤에서 취하였다.
rD'D3-FP는 사람 알부민 값을 기준으로 3 mg/kg의 용량 수준으로 적용하였다. PK 프로파일은 VWF ko 래트의 4개 코호트로부터 취하였다. 혈액 샘플을 나트륨 시트레이트(2부 나트륨 시트르레이트 3.13% + 8부 혈액)을 사용하여 응고를 억제하고, 혈장으로 프로세싱하였고, 알부민의 측정을 위해 -70℃에서 저장하였다.
D'D3-FP 노출은 사람 알부민 ELISA를 이용한 작제물의 알부민 부분의 측정에 의해 결정되었다. 추가로, Pathromtin® SL을 사용하여 FVIII 발색성 및 응고 활성 및 aPTT를 측정하였다.
결과
rD'D3-FP는 사람 알부민에 대해 ELISA를 사용하여 정량하고 측정은 24일까지 수행하였다. 모든 측정된 데이터는 전체 관찰 기간 동안 검출 한계치를 훨씬 초과하였다(도 8a). 4회 투여와 함께, 약간의 축적은 트로프 (128% 까지) 수준 뿐만 아니라 피크 (151% 까지)에서 관찰되었다.
FVIII 발색성 (도 8b) 활성 수준은 CD 래트 (~1.8 IU/mL = 180%까지 최대 증가)에서 관찰된 범위로 2차 투여 후 하기 값으로부터 검출 한계치까지 증가하였다. FVIII 응고 활성(도 8c)은 심지어 CD 래트 (~800%까지 최대 증가 - 이는 인간과 비교하여 이들 동물에서 보다 높은 기준선과 일치함)에서 측정된 데이터를 약간 초과하였다. 그럼에도 불구하고, 4주 기간 동안 2개의 FVIII 활성에 대해 어떠한 축적도 나타나지 않았다.
이와 일치하여, aPTT는 CD 래트로부터 상기 규정치로부터 CD 래트의 규정 범위의 하한 범위에서의 값으로 감소하였다(도 8d).
이를 종합해 보면, 이들 데이터는 rD'D3-FP를 사용한 다중 치료가 rD'D3-FP의 약간의 축적과 함께 그러나 FVIII 수준 없이 함께 및 aPTT의 정상화와 함께 수행될 수 있음을 시사한다.
실시예 1.9: 혈우병 A 모델, 즉 FVIII ko 래트에서 rD'D3-FP 피하 투여 및 rVIII-단일쇄 정맥내 투여의 조사.
동물
220 내지 487g 체중 범위 내의 수컷 및 암컷 FVIII ko 래트를 찰스 리버 래버러토리(Charles River Laboratories)(Sulzfeld, Germany)에서 사육하였다. 그룹 크기는 n=6이었고, 2개의 코호트(cohort)로 나뉘었다. 따라서, 시점당 n=3의 동물이 사용되었다.
실험실 내에서, 상기 동물들을 표준 하우징(housing) 조건으로, 즉, 12h/12h 명암 사이클 하에서 20 내지 24℃로 유지하였다. 동물들은 표준 마우스 및 래트 식이(Ssniff-Versuchsdiaten, Soest, Germany)로 자유 급식하였다. 수돗물을 자유 공급하였다. 가축 사육 및 연구 절차는 독일 동물 복지법 및 유럽 연합 규정을 준수하였다.
실험의 세부사항
시험 제품을 총 3mL/kg의 용적으로 목 (rD'D3-FP)에서 s.c. 또는 FVIII ko 래트의 측면 꼬리 정맥으로 (rVIII-단일쇄) i.v. 투여하였다. rD'D3-FP는 rVIII-단일쇄 10분 전에 사람 알부민 값을 기준으로 3mg/kg의 용량으로 적용하였다. 동물은 200 IU/kg 발색성 FVIII 활성의 용량으로 rVIII-단일쇄를 사용하여 정맥내 치료하였다. rVIII-단일쇄는 주사용수로 재구성하고 rD'D3-FP를 물 욕조에서 해동시켰다. 모든 경우에, 3 mL/kg의 용량 용적을 투여하고 FVIII (rVIII-단일쇄)에 대한 희석 완충액 또는 등장성 식염수(rD'D3-FP)을 필요한 만큼 화합물의 용해를 위해 사용한다.
혈액 샘플은 꼬리 정맥의 배관 삽입에 의해 취하였다. 그룹 내 시점은 0.083, 1, 4, 8, 16, 24, 32, 48 및 72 h p.a이다. PK 프로파일은 그룹 당 래트의 2개의 코호트로부터 취하였고 시점 당 n=3이다. 혈액 샘플을 나트륨 시트레이트(2부 나트륨 시트르레이트 3.13% + 8부 혈액)을 사용하여 응고를 억제하고, 혈장으로 프로세싱하였고, FVIII 활성 및 FVIII 활성의 측정을 위해 -70℃에서 저장하였다.
D'D3-FP 노출은 사람 알부민 ELISA를 이용한 작제물의 알부민 부분의 측정에 의해 결정되었다. 추가로, FVIII 발색성 활성 및 사람 FVIII 활성을 측정하였다.
최대 농도(Cmax), t=0 내지 t=∞ (AUC0-inf)의 시간 곡선에 대한 농도 이하 면적, 평균 체류 시간(MRT), 소거율 (CL) 및 말단 반감기 (t1/2)의 평가는 i.v. 계산에서 2-격실 모델링에 의해 그리고 s.c. 계산에서 2-격실-흡착 모델링에 의해 수행하였다. 파라미터 평가를 위해, 중량 최소-제곱 비용 함수를 적용하였다. 생물유용성은 i.v. 투여와 비교하여 s.c 투여 후 AUC0-inf의 퍼센트로서 계산하였다. 1, 5 및 10 % 트로프 수준까지의 시간은 0.01, 0.05 또는 0.1 IU/mL과 동일한 모델 방정식을 설정하고 시간에 대해 계산함에 의해 계산하였다.
결과
D'D3 데이터의 평가
rD'D3-FP는 s.c. 투여 후 흡수되었다. rD'D3-FP는 72시간의 전체 관찰 기간 동안 정량될 수 있고; 즉, 이것은 27 ng/mL의 검출 한계치 초과로 남아 있다(도 9a).
Cmax, AUC0-inf, 소거율, MRT 및 t1/2은 표 5에 나타내고 피하 투여 후 시간 경과에 따라 rD'D3-FP의 관련 노출을 확인한다.
[표 5]
Figure pct00006
FVIII 데이터의 평가
rD'D3-FP의 피하 사전투여 후 rVIII-단일쇄의 FVIII PK 프로파일은 FVIII 활성 (도 9c) 뿐만 아니라 FVIII 발색성 활성 (도 9b)에 대해 단독으로 주어지는 rVIII-단일쇄와 비교하여 연장된다.
FVIII 발색성 활성 (도 9b)은 rD'D3-FP가 사전 투여되는 경우 72h p.a.의 마지막 시점까지 검출 한계치를 훨씬 초과하고 FVIII가 단독으로 주어지는 경우 72 h에 기준선에 도달하였다. 가시적으로, 노출은 32 h p.a.에서 개시하여 rD'D3-FP의 피하 사전 투여와 함께 개선된다.
유사한 관찰을 FVIII:Ag에 대해 수행하였지만 (도 9c), 노출은 이미 24 h p.a.에서 개시하여 rD'D3-FP의 피하 사전 투여와 함께 개선되었고, 기준선은 아마도 측정된 농도의 보다 낮은 가변성과 관련되는, 단독으로 주어진 FVIII를 사용한 48 h p.a.에서 이미 도달하였다.
rD'D3-FP의 사전 투여는 FVIII 발색성 활성 및 FVIII Ag 둘다에 대해 소거율, MRT 및 t1/2를 개선시켰다.
AUC0-inf은 FVIII 발색성 활성에 대해 41%까지 개선되었고(표 6) FVIII:Ag에 대해서는 49 %까지 개선되었다(표 8). Cmax는 FVIII 발색성 활성에 대해 30 %까지 개선되었고 FVIII:Ag에 대해서는 23%까지 개선되었다(각각 표 6 및 8).
트로프까지의 시간은 rD'D3-FP의 존재 또는 부재하에 발색성 활성 (표 7) 및 FVIII;Ag (표 9)에 대한 2개의 투여 계획에 대해 계산되었다. AUC0-inf에 대하여, rD'D3-FP의 사전 투여는 또한 FVIII 활성 뿐만 아니라 발색성 활성에 대해 선호될 수 있는 트로프 수준을 보여주었다. 연장은 각각 발색성 FVIII 활성 및 FVIII:Ag에 대하여 1% 트로프에 대해 6% 및 18%이고, 5% 트로프에 대해 9% 및 19%이고 10% 트로프에 대해 8% 및 18%였다.
[표 6]
Figure pct00007
[표 7]
Figure pct00008
[표 8]
Figure pct00009
[표 9]
Figure pct00010
생체내 동물 실험으로부터의 결론
이들 연구는 rD'D3-FP의 i.v. 또는 s.c. 투여가 건강한 래트, 토끼, 돼지 및 몽키에서, 심지어 이들 동물이 이미 생리학적 FVIII 수준을 갖고 있음에도 FVIII의 내인성 수준을 약간 증가시킴을 입증한다. 사전 용량 값은 거의 초과되지 않고 단지 약하게 또는 감축 없는 aPTT가 관찰되었다.
혈우병 A 출혈 유형을 보여주는 동물 (적절히 감소된 FVIII 활성 수준을 보여주는 VWF ko 래트 또는 VWF ko 마우스)에서, 내인성 FVIII 활성의 증가는 건강한 마우스 및 래트의 것과 거의 동일하거나 이를 초과하는 수준으로의 절대 FVIII 수준의 증가와 함께 건강한 동물에서 보다 강하다. 이들 동물에서, 생리학적 수준이 회복 (VWF ko 래트에서 1 및 3mg/kg rD'D3-FP의 투여 후, 생리학적 가변성의 상한 말단 내 수준, 예를 들어, 규정 발색성 FVIII 활성의 200 내지 300%까지-인간과 비교하여 이들 동물에서 보다 높은 기준선 값과 일치함)되거나 생리학적 범위를 초과(예를 들어, VWF ko 래트에서 10 mg/kg rD'D3-FP의 투여 후 규정 발색성 FVIII 활성의 ≥400%). 인간과 비교하여 발색성 FVIII 활성에 관한 하한 기준선 값을 갖는 하나의 예로서 VWF ko 마우스에서, 규정치의 ~40%가 10 mg/kg rD'D3-FP의 용량에서 도달하였고, 즉, 상기 수준의 <2-배 증가가 건강한 NMRI 마우스에서 관찰되었다. 이것은 초기에 감소된 FVIII 수준, 즉 혈우병 A 표현형을 갖는 개체에서, FVIII 상승 효과가 잠재적으로 건강한 대상체에서 보다 강할 수 있음을 시사한다.
유사한 효과는 rD'D3-FP EYA 또는 EY 변이체의 동시 투여에 의해, 또는 rD'D3-CTP에 의해 성취되었다
VWF ko 래트에서 rD'D3-FP의 다중 용량은 시간 경과에 따라 rD'D3-FP의 약간의 축적을 유도하였고, FVIII 활성은 (발색성 활성)에 도달하거나 (응고 활성) 생리학적 수준을 약간 초과하였고, aPTT는 규정 값으로 회복하였다.
특정 이론에 국한되는 것 없이, 이것은 VWF ko 래트 및 마우스와 비교하여 생리학적 FVIII 수준을 갖는 건강한 동물에서 FVIII 합성의 생리학적 하향 조절에 의해 설명될 수 있다. 따라서, 사람 혈우병A 환자에서 FVIII에 대한 효과는 VWF ko 래트 및 마우스에서 관찰된 것에 상응해야만 하고 따라서 오랜 지속적인 생리학적 수준을 성취해야만 하는 것으로 고려될 수 있다. 이들 효과는 i.v. 및 s.c. 투여 후 나타났다. 11 내지 187% 범위의 rD'D3-FP의 추가의 생물유용성은 종 및 유전자형에 의존하고 최고 값은 s.c. 생물유용성에 대한 양호한 예측 모델인 것으로 공지된 돼지에서 성취된다. 이로써, 이들 데이터는 s.c. 치료가 또한 실행가능할 수 있음을 시사한다.
실시예 2: VWF 단편 이량체 및 단량체에 대한 FVIII의 친화도 측정
VWF 단편 (1-1242) 알부민 융합체 (D´D3-FP)를 생물반응기에서 발현시키고; 상기된 바와 같이 정제하고 단량체 및 이량체를 단리시킨 후, 이들 제제에 대한 FVIII의 친화성을 바이오코어 장비(Biacore instrument (T200, GE Healthcare))를 통해 표면 플라스몬 공명을 통해 평가하였다.
항-알부민 항체(MA1-20124, Thermo Scientific)는 이의 N-말단을 통해 제조원(GE Healthcare)으로부터의 아민 커플링 키트(BR1000-50)에 둘 다 함유된 NHS(N-하이드록시석신이미드) 및 EDC(에탄올아민 하이드로클로라이드)에 의해 활성화된 CM 3 칩에 공유결합으로 커플링시켰다. 고정화를 위해, 3 μg/mL의 항체를 나트륨 아세테이트 완충액(10 mM, pH 5.0)에서 희석시키고 항체 용액을 7분 동안 10 μL/min의 유속으로 칩상에 유동시켰다. 고정화 과정 후, 비-커플링된 덱스트란 필라멘트는 5분 동안 10 μL/min의 유속으로) 칩 상에 에탄올아민 용액 (1M, pH 8.3)을 유동시킴에 의해 포화시켰다. 유동 세포를 포화시키는 것의 목적은 상기 칩에 대한 분석물의 비특이적 결합을 최소화하기 위한 것이었다. 참조 유동 세포는 상기와 동일한 절차를 이용함으로써 에탄올아민으로 빈(empty) 플로우 세포를 포화시킴으로써 설정되었다.
이량체성 및 단량체성 D'D3-FP 단백질은 각각 3분 동안 칩 상에 D'D3-FP 단백질(5㎍/mL)을 유동(10㎕/분의 유속)시켜 공유결합으로 커플링된 항-알부민 항체에 고정화하였다.
FVIII에 대한 결합 곡선을 생성하기 위해, 각각의 D'D3-FP 단백질 제제를 전개 완충액(HBS-P+: 0.1M HEPES, 1.5M NaCl 및 0.5% v/v 계면활성제 P20, pH 7.4; 제품 코드 BR100671, GE Healthcare)에 0.25nM, 0.5nM, 1nM, 3nM 및 4nM의 농도로 희석시켰다. 단일 주기 동역학을 수행함으로써, 각각의 희석액의 상승하는 농도를 갖는 샘플을 2분 동안 칩 상애 유동시키고(유속 30μL/분), 전개 완충액 HBS-P+를 이용한 10분의 해리 시간이 이어졌다. 모든 측정은 2회 실행하였다. 측정 절차를 위한 온도는 +25℃로 조정되었다.
결합 파라미터는 BiaEvaluation 소프트웨어를 이용하여 계산하였다. 곡선 맞춤(curve fitting) 방법은 랭뮤어(Langmuir) 방정식에 기초하였다. 상기 계산을 위한 입력 데이터는 170kDa의 분석물 FVIII(rVIII-단일쇄)의 몰량이었고, 최대 RU와 같은 기타 파라미터들 및 기울기는 핏팅된(fitted) 회합 및 해리 곡선으로부터 자동으로 얻어졌다. BioEvaluation 소프트웨어의 출력값은 회합 속도 상수 및 해리 속도 상수이고, 이로부터 친화도 상수가 계산되었다. 상기 결과는 표 10에 나타낸다.
[표 10]
Figure pct00011
이량체 D'D3-FP는 rVIII-단일쇄의 보다 신속한 결합 및 보다 느린 해리 둘다로부터 비롯되는 D'D3-FP 단량체 (KD = 30 nM)와 비교하여 FVIII에 대해 상당히 증가된 친화성을 보여준다.
<110> CSL Behring Recombinant Facility AG <120> Truncated Von Willebrand Factor Polypeptides for Treating Hemophilia <130> 2016_L003_A249 <150> EP 16198501.5 <151> 2016-11-11 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5616 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding construct VWF fragment - G/S Linker - albumin <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> EcoRI restriction enzyme cleavage site <220> <221> misc_feature <222> (32)..(3757) <223> coding sequence for VWF amino acids 1 to 1242 <220> <221> misc_feature <222> (3758)..(3850) <223> coding sequence for glycine/serine linker <220> <221> misc_feature <222> (3851)..(5608) <223> coding sequence for human albumin <220> <221> misc_feature <222> (5609)..(5616) <223> NotI restriction enzyme cleavage site <400> 1 gaattcccgc agccctcatt tgcaggggaa gatgattcct gccagatttg ccggggtgct 60 gcttgctctg gccctcattt tgccagggac cctttgtgca gaaggaactc gcggcaggtc 120 atccacggcc cgatgcagcc ttttcggaag tgacttcgtc aacacctttg atgggagcat 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Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro 530 535 540 cgg gtg gag gac ttc ggg aac gcc tgg aag ctg cac ggg gac tgc cag 1680 Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln 545 550 555 560 gac ctg cag aag cag cac agc gat ccc tgc gcc ctc aac ccg cgc atg 1728 Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met 565 570 575 acc agg ttc tcc gag gag gcg tgc gcg gtc ctg acg tcc ccc aca ttc 1776 Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe 580 585 590 gag gcc tgc cat cgt gcc gtc agc ccg ctg ccc tac ctg cgg aac tgc 1824 Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys 595 600 605 cgc tac gac gtg tgc tcc tgc tcg gac ggc cgc gag tgc ctg tgc ggc 1872 Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly 610 615 620 gcc ctg gcc agc tat gcc gcg gcc tgc gcg ggg aga ggc gtg cgc gtc 1920 Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val 625 630 635 640 gcg tgg cgc gag cca ggc cgc tgt gag ctg aac tgc ccg aaa ggc cag 1968 Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln 645 650 655 gtg tac ctg cag tgc ggg acc ccc tgc aac ctg acc tgc cgc tct ctc 2016 Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu 660 665 670 tct tac ccg gat gag gaa tgc aat gag gcc tgc ctg gag ggc tgc ttc 2064 Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe 675 680 685 tgc ccc cca ggg ctc tac atg gat gag agg ggg gac tgc gtg ccc aag 2112 Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys 690 695 700 gcc cag tgc ccc tgt tac tat gac ggt gag atc ttc cag cca gaa gac 2160 Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp 705 710 715 720 atc ttc tca gac cat cac acc atg tgc tac tgt gag gat ggc ttc atg 2208 Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met 725 730 735 cac tgt acc atg agt gga gtc ccc gga agc ttg ctg cct gac gct gtc 2256 His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val 740 745 750 ctc agc agt ccc ctg tct cat cgc agc aaa agg agc cta tcc tgt cgg 2304 Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg 755 760 765 ccc ccc atg gtc aag ctg gtg tgt ccc gct gac aac ctg cgg gct gaa 2352 Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu 770 775 780 ggg ctc gag tgt acc aaa acg tgc cag aac tat gac ctg gag tgc atg 2400 Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met 785 790 795 800 agc atg ggc tgt gtc tct ggc tgc ctc tgc ccc ccg ggc atg gtc cgg 2448 Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg 805 810 815 cat gag aac aga tgt gtg gcc ctg gaa agg tgt ccc tgc ttc cat cag 2496 His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln 820 825 830 ggc aag gag tat gcc cct gga gaa aca gtg aag att ggc tgc aac act 2544 Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr 835 840 845 tgt gtc tgt cgg gac cgg aag tgg aac tgc aca gac cat gtg tgt gat 2592 Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp 850 855 860 gcc acg tgc tcc acg atc ggc atg gcc cac tac ctc acc ttc gac ggg 2640 Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly 865 870 875 880 ctc aaa tac ctg ttc ccc ggg gag tgc cag tac gtt ctg gtg cag gat 2688 Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp 885 890 895 tac tgc ggc agt aac cct ggg acc ttt cgg atc cta gtg ggg aat aag 2736 Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys 900 905 910 gga tgc agc cac ccc tca gtg aaa tgc aag aaa cgg gtc acc atc ctg 2784 Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu 915 920 925 gtg gag gga gga gag att gag ctg ttt gac ggg gag gtg aat gtg aag 2832 Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys 930 935 940 agg ccc atg aag gat gag act cac ttt gag gtg gtg gag tct ggc cgg 2880 Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg 945 950 955 960 tac atc att ctg ctg ctg ggc aaa gcc ctc tcc gtg gtc tgg gac cgc 2928 Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg 965 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tgc att tac gac acc tgc tcc tgt gag tcc att ggg gac tgc gcc 3294 Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala 1085 1090 1095 tgc ttc tgc gac acc att gct gcc tat gcc cac gtg tgt gcc cag 3339 Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln 1100 1105 1110 cat ggc aag gtg gtg acc tgg agg acg gcc aca ttg tgc ccc cag 3384 His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln 1115 1120 1125 agc tgc gag gag agg aat ctc cgg gag aac ggg tat gag tgt gag 3429 Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu 1130 1135 1140 tgg cgc tat aac agc tgt gca cct gcc tgt caa gtc acg tgt cag 3474 Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln 1145 1150 1155 cac cct gag cca ctg gcc tgc cct gtg cag tgt gtg gag ggc tgc 3519 His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys 1160 1165 1170 cat gcc cac tgc cct cca ggg aaa atc ctg gat gag ctt ttg cag 3564 His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln 1175 1180 1185 acc tgc gtt gac cct gaa gac tgt cca gtg tgt gag gtg gct ggc 3609 Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly 1190 1195 1200 cgg cgt ttt gcc tca gga aag aaa gtc acc ttg aat ccc agt gac 3654 Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp 1205 1210 1215 cct gag cac tgc cag att tgc cac tgt gat gtt gtc aac ctc acc 3699 Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr 1220 1225 1230 tgt gaa gcc tgc cag gag ccg gga ggc ctg gtg gtg cct ccc aca 3744 Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr 1235 1240 1245 gat gcc ccg gtg agc ccc acc act ctg tat gtg gag gac atc tcg 3789 Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser 1250 1255 1260 gaa ccg ccg ttg cac gat ttc tac tgc agc agg cta ctg gac ctg 3834 Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu 1265 1270 1275 gtc ttc ctg ctg gat ggc tcc tcc agg ctg tcc gag gct gag ttt 3879 Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe 1280 1285 1290 gaa gtg ctg aag gcc ttt gtg gtg gac atg 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cca ccc ttt gat gaa cac aag tgt ctg gct 8109 Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys Cys Leu Ala 2690 2695 2700 gag gga ggt aaa att atg aaa att cca ggc acc tgc tgt gac aca 8154 Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys Cys Asp Thr 2705 2710 2715 tgt gag gag cct gag tgc aac gac atc act gcc agg ctg cag tat 8199 Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg Leu Gln Tyr 2720 2725 2730 gtc aag gtg gga agc tgt aag tct gaa gta gag gtg gat atc cac 8244 Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp Ile His 2735 2740 2745 tac tgc cag ggc aaa tgt gcc agc aaa gcc atg tac tcc att gac 8289 Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr Ser Ile Asp 2750 2755 2760 atc aac gat gtg cag gac cag tgc tcc tgc tgc tct ccg aca cgg 8334 Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser Pro Thr Arg 2765 2770 2775 acg gag ccc atg cag gtg gcc ctg cac tgc acc aat ggc tct gtt 8379 Thr Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His Cys Thr Asn Gly Ser Val 2780 2785 2790 gtg tac cat gag gtt ctc aat gcc atg gag 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Claims (21)

  1. 혈액 응고 장애의 치료에 사용하기 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자 (VWF) 및 반감기 연장 모이어티를 포함하는 폴리펩타이드로서, 상기 치료가 상기 폴리펩타이드를 혈액 응고 장애를 갖고 내인성 인자 VIII (FVIII)를 갖는 대상체에 투여함을 포함하고, 여기서, 상기 폴리펩타이드를 사용한 치료 전 상기 대상체에서 내인성 FVIII의 활성 수준이 정상 사람 혈장 (NHP)에서 FVIII의 활성 수준에 비해 상대적으로 감소되어 있고, 단, 상기 대상체 내 내인성 FVIII의 활성 수준이 정상 사람 혈장 (NHP)에서 내인성 FVIII의 활성 수준의 적어도 0.5%이고, 상기 폴리펩타이드가 내인성 FVIII에 결합할 수 있고 상기 내인성 FVIII 수준이 상기 폴리펩타이드의 투여 후 증가되고, 여기서,
    - (i) 상기 폴리펩타이드는 출혈 사건의 예방학적 예방을 위해 투여되거나(여기서,
    a) 상기 치료가 외인성 FVIII의 동시-투여를 포함하지 않거나,
    b) 상기 치료가 외인성 FVIII가 투여됨으로써 상기 대상체 내 내인성 FVIII를 제공함을 포함한다),
    - (ii) 상기 폴리펩타이드는 출혈 사건의 치료를 위해 또는 예방학적 치료 용법의 개시를 위해 외인성 FVIII와 함께 동시-투여되고, 여기서, 후속 치료를 위해, 상기 폴리펩타이드는 외인성 FVIII의 동시 투여 없이 투여되는, 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 절단된 폰 빌레브란트 인자 (VWF)가 내인성 FVIII에 대한 폴리펩타이드의 결합 능력을 제공하는, 폴리펩타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 내인성 FVIII 수준이 상기 폴리펩타이드의 투여 후 적어도 1%의 수준으로 증가되는, 폴리펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 절단된 폰 빌레브란트 인자 (VWF)가 사람 절단된 폰 빌레브란트 인자 (VWF)인, 폴리펩타이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드를 사용한 치료 전 상기 대상체에서 내인성 FVIII의 활성 수준이 NHP에서 내인성 FVIII의 활성 수준의 80% 미만, 60% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만 또는 10% 미만인, 폴리펩타이드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 전 상기 대상체에서 내인성 FVIII의 활성 수준이 바람직하게 NHP에서 내인성 FVIII의 활성 수준의 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4% 또는 적어도 5%인, 폴리펩타이드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈액 응고 장애가 혈우병 A 및 폰 빌레브란트 질환으로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 사람 대상체인, 폴리펩타이드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 정맥내 또는 혈관외로 투여되는, 폴리펩타이드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 이량체인, 폴리펩타이드.
  11. 제10항에 있어서, FVIII에 대한 상기 이량체의 친화성이 상기 FVIII에 대한 단량체 폴리펩타이드의 친화성을 초과하고, 상기 단량체성 폴리펩타이드가 상기 이량체 폴리펩타이드의 단량체 서브유니트와 동일한 아미노산 서열을 갖고; 상기 폴리펩타이드가 바람직하게는 1 nM 미만, 바람직하게 500 pM 미만, 200 pM 미만, 100 pM 미만, 90 pM 미만 또는 80 pM 미만의 해리 상수 KD를 특징으로 하는 FVIII 결합 친화성을 갖는, 폴리펩타이드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 절단된 VWF가 서열번호 4의 아미노산 776 내지 805와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 서열번호 4의 아미노산 764 내지 1242와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 절단된 VWF가 (a) 서열번호 4의 아미노산 764 내지 1242, (b) 서열번호 4의 아미노산 764 내지 1242와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 (c) (a) 또는 (b)의 단편으로 이루어진, 폴리펩타이드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티가 상기 절단된 VWF에 융합된 이종성 아미노산 서열인, 폴리펩타이드.
  15. 제14항에 있어서, 상기 이종성 아미노산 서열이 알부민 또는 이의 단편, 트랜스페린 및 이들의 단편, 사람 융모성 고나도트로핀의 C-말단 펩타이드, XTEN 서열, 동종-아미노산 반복체(HAP), 프롤린-알라닌-세린 반복체(PAS), 아파민, 알파-태아단백질, 비타민 D 결합 단백질, 생리학적 조건 하에 알부민 또는 면역글로불린 불변 영역에 결합할 수 있는 폴리펩타이드, 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 결합할 수 있는 폴리펩타이드, 특히 면역글로불린 불변 영역 및 이의 일부, 바람직하게 면역글로불린의 Fc 부분 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 폴리펩타이드를 포함하거나 이러한 폴리펩타이드로 이루어진, 폴리펩타이드.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티가 상기 폴리펩타이드에 접합되어 있는, 폴리펩타이드.
  17. 제16항에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티가 하이드록시에틸 전분(HES), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리시알산(PSA), 엘라스틴-유사 폴리펩타이드, 헤파로산 중합체, 히알루론산 및 알부민 결합 리간드, 예를 들면, 지방산 쇄 또는 알부민 결합 펩타이드, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내인성 FVIII의 약동학적 파라미터가 폴리펩타이드의 투여에 의해 개선되고, 특히, 상기 내인성 FVIII의 평균 체류 시간 (MRT)가 증가되고/되거나 상기 내인성 FVIII의 반감기가 연장되고/되거나 상기 내인성 FVIII의 소거율이 감소된, 폴리펩타이드.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 혈장 반감기가 내인성 VWF의 혈장 반감기 보다 높고/높거나 정상 사람 혈장 (NHP)의 VWF의 혈장 반감기 보다 높은, 폴리펩타이드.
  20. 제19항에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 혈장 반감기가 내인성 VWF의 반감기 보다 적어도 25% 높고/높거나 정상 사람 혈장 (NHP)의 VWF의 반감기 보다 적어도 25% 높은, 폴리펩타이드.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 투여 후 상기 대상체의 내인성 FVIII 활성 수준의 증가가 성취되고, 바람직하게 상기 내인성 FVIII 활성 수준이 생리학적 FVIII 수준 (100% = 1 IU/mL)까지 증가되거나 폴리펩타이드의 투여 후 생리학적 FVIII 수준 초과로 실질적으로 증가되지 않고, 바람직하게 각각 정상 사람 혈장의 혈장에서 평균 FVIII 활성 수준의 300% = 3 IU/mL을 초과하지 않거나, 보다 바람직하게 250% = 2.5 IU/mL을 초과하지 않거나, 200% = 2 IU/mL을 초과하지 않거나, 150% = 1.5 IU/mL을 초과하지 않거나 120% = 1.2 IU/mL을 초과하지 않는 내인성 FVIII 활성 수준의 증가를 유도하는, 폴리펩타이드.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110950964B (zh) * 2018-09-26 2021-06-18 安源医药科技（上海）有限公司 突变型单链人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途
BR112021017062A2 (pt) * 2019-03-19 2021-11-16 CSL Behring Lengnau AG Variantes do fator ix e usos das mesmas em terapia
KR20220029733A (ko) * 2019-07-04 2022-03-08 체에스엘 베링 렝나우 아게 응고 인자 viii의 시험관내 안정성을 증가시키기 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자 (vwf)
CN113862301A (zh) * 2021-08-25 2021-12-31 上海交通大学医学院附属瑞金医院 一种vwf前肽表达载体及其制备方法和应用

Family Cites Families (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4713339A (en) 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
AU2353384A (en) 1983-01-19 1984-07-26 Genentech Inc. Amplification in eukaryotic host cells
US4970300A (en) 1985-02-01 1990-11-13 New York University Modified factor VIII
AU6029594A (en) 1993-01-15 1994-08-15 Enzon, Inc. Factor viii - polymeric conjugates
EP1621206A1 (en) 1994-12-12 2006-02-01 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Chimeric cytokines and uses thereof
WO1997003193A1 (en) 1995-07-11 1997-01-30 Chiron Corporation Novel factor viii:c polypeptide analogs with altered metal-binding properties
SE9503380D0 (sv) 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
CA2252896C (en) 1996-04-24 2009-03-10 The Regents Of The University Of Michigan Inactivation resistant factor viii
US20040092442A1 (en) 1996-04-24 2004-05-13 University Of Michigan Inactivation resistant factor VIII
WO1999055306A1 (en) 1998-04-27 1999-11-04 Opperbas Holding B.V. Pharmaceutical composition comprising factor viii and neutral liposomes
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6887470B1 (en) 1999-09-10 2005-05-03 Conjuchem, Inc. Protection of endogenous therapeutic peptides from peptidase activity through conjugation to blood components
EP1351986A2 (en) 2001-01-12 2003-10-15 The American National Red Cross Methods and compositions for reducing heparan sulfate proteoglycan-mediated clearance of factor viii
EP2110385A1 (en) 2001-06-14 2009-10-21 The Scripps Research Institute Stabilized factor VIII with engineered disulfide bonds
AU2003210806A1 (en) 2002-03-05 2003-09-22 Eli Lilly And Company Heterologous g-csf fusion proteins
ATE463514T1 (de) 2002-04-29 2010-04-15 Sanquin Bloedvoorziening ANTAGONISTEN DER INTERAKTION ZWISCHEN FAKTOR VIII UND LRP (ßLOW-DENSITY LIPOPROTEIN RECEPTOR RELATED PROTEINß)
US7041635B2 (en) 2003-01-28 2006-05-09 In2Gen Co., Ltd. Factor VIII polypeptide
EP1596887B1 (en) 2003-02-26 2022-03-23 Nektar Therapeutics Polymer-factor viii moiety conjugates
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
DE602004031390D1 (de) 2003-05-06 2011-03-24 Syntonix Pharmaceuticals Inc Gerinnungsfaktor VII-Fc chimäre Proteine zur Behandlung von hämostatischen Krankheiten
AU2004251145C1 (en) 2003-06-12 2011-04-14 Eli Lilly And Company GLP-1 analog fusion proteins
AU2004309063B2 (en) 2003-12-31 2010-10-28 Merck Patent Gmbh Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics
US7670595B2 (en) 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
EP2371856B1 (en) 2004-11-12 2022-05-18 Bayer HealthCare LLC Site-directed modification of FVIII
DK1835938T3 (da) 2004-12-27 2013-11-04 Baxter Int Polymer-von Willebrand-faktor-konjugater
KR20080007226A (ko) 2005-04-14 2008-01-17 체에스엘 베링 게엠베하 증가된 안정성을 가진 변형된 응고 인자 ⅷ 및 이의 유도체
EP1816201A1 (en) 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modified coagulation factor VIIa with extended half-life
US7683158B2 (en) 2006-03-31 2010-03-23 Baxter International Inc. Pegylated factor VIII
JP5800458B2 (ja) 2006-06-14 2015-10-28 ツェー・エス・エル・ベーリング・ゲー・エム・ベー・ハー 血液凝固因子を有するタンパク質分解によって切断可能な融合タンパク質
AU2007338298B2 (en) 2006-12-22 2013-02-07 Csl Behring Gmbh Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life
PL2291523T3 (pl) 2008-06-24 2015-05-29 Csl Behring Gmbh Czynnik VIII, czynnik von Willebranda lub ich kompleksy o wydłużonym okresie półtrwania in vivo
PL2499165T3 (pl) * 2009-11-13 2017-04-28 Grifols Therapeutics Inc. Preparaty zawierające czynnik von willenbranda (vwf) oraz sposoby, zestawy i zastosowania z nim powiązane
AU2012340501A1 (en) 2011-12-19 2013-07-11 Grifols, S.A. Compositions, methods, and kits for preparing sialylated recombinant proteins
LT2804623T (lt) 2012-01-12 2019-12-10 Bioverativ Therapeutics Inc Chimeriniai viii faktoriaus polipeptidai ir jų panaudojimas
EP2814502B1 (en) 2012-02-15 2017-09-13 CSL Behring GmbH Von willebrand factor variants having improved factor viii binding affinity
WO2013083858A1 (en) 2012-04-24 2013-06-13 Novo Nordisk A/S Compounds suitable for treatment of haemophilia
LT2882450T (lt) 2012-07-11 2020-03-25 Bioverativ Therapeutics Inc. Faktoriaus viii komplekso su xten ir von vilebrando faktoriumi baltymas ir jo panaudojimas
ES2657291T3 (es) 2013-04-22 2018-03-02 Csl Ltd. Un complejo covalente de factor de von Willebrand y factor VIII asociado por un puente disulfuro
US20160207977A1 (en) 2013-06-12 2016-07-21 Novo Nordisk A/S Compounds Suitable for Treatment of Haemophilia
EP3013358A4 (en) * 2013-06-28 2017-03-22 Biogen MA Inc. Thrombin cleavable linker with xten and its uses thereof
DK3164150T3 (da) 2014-07-02 2021-02-08 CSL Behring Lengnau AG Modificeret von willebrand-faktor
AU2016266627A1 (en) * 2015-05-22 2018-01-18 CSL Behring Lengnau AG Truncated von Willebrand Factor polypeptides for treating hemophilia
KR20180012303A (ko) * 2015-05-22 2018-02-05 체에스엘 베링 리컴비넌트 퍼실리티 아게 변형된 폰 빌레브란트 인자의 제조 방법
DK3400002T3 (da) * 2016-01-07 2022-04-11 CSL Behring Lengnau AG Muteret, trunkeret von willebrand faktor
EP3400238B1 (en) * 2016-01-07 2021-05-19 CSL Behring Lengnau AG Mutated von willebrand factor

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