CN109922824A - 用于治疗血友病的截短的冯维勒布兰德因子多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含截短的冯维勒布兰德因子(VWF)和半衰期延长部分的多肽，其用于治疗凝血障碍的用途，所述治疗包括将该多肽施用患有凝血障碍的受试者并具有内源性因子VIII(FVIII)，其中所述受试者在用所述多肽治疗前内源性FVIII的活性水平相对于在正常人血浆(NHP)中FVIII的活性水平降低，条件是在所述受试者中内源性FVIII的活性水平为在正常人血浆(NHP)中内源性FVIII的活性水平的至少0.5％，其中多肽能够结合内源性FVIII，并且其中在施用所述多肽后内源性FVIII水平增加。

Description

用于治疗血友病的截短的冯维勒布兰德因子多肽
【发明领域】
本发明涉及用于改善凝血障碍治疗的产品和方法。
【背景技术】
由凝血因子的缺乏引起各种出血性疾病。最常见的疾病是血友病A和B，分别由凝血因子VIII(FVIII)和IX的缺乏引起。另一种已知的出血性疾病是冯维勒布兰德氏病(VWD)。
在血浆中，FVIII主要作为与von Willebrand因子(VWF)的非共价复合物存在，并且其凝血功能是加速因子IXa依赖性因子X向Xa的转化。
典型的血友病或血友病A是遗传性出血性疾病。它是由染色体X连锁的血液凝固FVIII缺乏引起的，并且几乎完全影响男性，其发病率为每10,000人一到两个人。X染色体缺陷由本身不是血友病的女性携带者传播。血友病A的临床表现是出血倾向增加。
在接受预防性治疗的严重血友病A患者中，由于FVIII的短血浆半衰期为约12～14小时，FVIII必须每周静脉内(静脉内)给药约3次。每个静脉内施用是麻烦的，与疼痛相关并且带来感染的风险，特别是因为这主要是由患者自己或在被诊断为血友病A的儿童的父母在家完成的。
因此非常希望增加FVIII的半衰期，使得含有这种FVIII的药物组合物必须不那么频繁地给药。
已经通过将聚合物共价连接至FVIII(WO 94/15625，WO 97/11957和US 4970300)，通过包封FVIII(WO 99/55306)，通过引入新的金属结合位点(WO 97/03193)，通过肽(BE97)将A2结构域共价连接至A3结构域。/40145和WO 03/087355)或二硫键(WO 02/103024A2)或通过将A1结构域共价连接至A2结构域(WO2006/108590)。
增强FVIII或VWF的功能半衰期的另一种方法是通过FVIII的聚乙二醇化(WO2007/126808，WO 2006/053299，WO 2004/075923)或通过VWF的聚乙二醇化(WO 2006/071801)增加的半衰期。聚乙二醇化VWF的间接也会间接地增加血浆中存在的FVIII的半衰期。还描述了FVIII的融合蛋白(WO 2004/101740，WO2008/077616和WO2009/156137)。
VWF缺失，功能缺陷或仅在不同形式的冯维勒布兰德病(VWD)中可用量减少，是存在于哺乳动物血浆中的多聚体粘附糖蛋白，其具有多种生理功能。在初次止血期间，VWF充当血小板表面上的特定受体和细胞外基质的组分(例如胶原)之间的介质。此外，VWF用作促凝血FVIII的载体和稳定蛋白。VWF在内皮细胞和巨核细胞中合成为2813个氨基酸的前体分子。Collins et al.1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:4393–4397公开了野生型VWF的氨基酸序列和cDNA序列。前体多肽，pre-pro-VWF，由N末端22残基信号肽，然后是741残基前肽和在成熟血浆VWF中发现的2050残基多肽组成(Fischer et al.,FEBS Lett.351:345-348,1994)。在内质网中切割信号肽后，在两个VWF单体之间形成C-末端二硫键。在通过分泌途径的进一步转运过程中，加入12个N-连接的和10个O-连接的碳水化合物侧链。更重要的是，VWF二聚体通过N-末端二硫键多聚化，并且741个氨基酸长度的前肽被晚期高尔基体中的PACE/弗林蛋白酶切割掉。
一旦分泌到血浆中，蛋白酶ADAMTS13可以切割VWF的A1结构域内的高分子量VWF多聚体。因此，血浆VWF由全范围的多聚体组成，范围从500kDa的单二聚体到由多达20多个分子量超过10,000kDa的二聚体组成的多聚体。因此，VWF-HMWM具有最强的止血活性，其可以在瑞斯托菌素辅因子活性(VWF:RCo)中测量。VWF:RCo/VWF抗原的比例越高，高分子量多聚体的相对量越高。
在血浆中，FVIII以高亲和力结合VWF，保护其免于过早消除，因此，除了其在初级止血中的作用外，还起到稳定FVIII，调节血浆FVIII水平的关键作用，因此也是控制继发性止血。与VWF结合的未活化的FVIII的半衰期在血浆中为约12～14小时。在von Willebrand病3型中，其中不存在或几乎不存在VWF，FVIII的半衰期仅为约2～6小时，由于FVIII浓度降低，导致此类患者中轻度至中度血友病A的症状。VWF对FVIII的稳定作用也已用于帮助FVIII在CHO细胞中的重组表达(Kaufman等，1989，Mol Cell Biol 9：1233-1242)。VonWillebrand病2N型的特征在于由于VWF突变而导致的FVIII水平低，其影响FVIII与VWF的结合。VWD型2N患者中的FVIII水平在约3IU/dL和30IU/dL之间，通常低于20IU/dL，这取决于VWF中的特定突变。与正常人血浆中的内源性FVIII的活性水平相比，1型Von-Willebrand病的特征在于内源性FVIII的活性水平降低(Sadler JE和Blinder M.，Von WillebrandDisease：Diagnosis，Classification，andtreatment；in：Hemostasis and Thrombosis)，编辑，Colman，Marder，Clowes，George，Aird和Goldhaber，Lippincott Williams&Wilkins2006，pp 905-921)。
已经描述了VWF衍生的多肽，特别是VWF片段，以在体外和体内稳定FVIII。WO2013/106787A1涉及包含某些VWF片段和FVIII蛋白的嵌合蛋白。那些FVIII和VWF片段的嵌合异二聚体确实具有1:1的固定摩尔比VWF与FVIII。WO2014/198686A2和WO2013/083858A2描述了VWF片段及其在血友病治疗中的用途。发现在用相似摩尔量的VWF片段进行血管外共同给药时，FVIII的生物利用度可以显着提高。据说，相对于FVIII，高摩尔过量的VWF是不理想的，并且在用共同施用的VWF片段进行的实验中。对于FVIII，发现VWF剂量对于FVIII生物利用度并不重要。因此，VWF片段相对于FVIII的摩尔比限制为最大50:1，优选范围限制为最大1.5:1。WO2011/060242A2公开了包含某些VWF片段和抗体Fc区的融合多肽，其提出VVF片段相对于FVIII的特定摩尔比为至多10:1。WO2013/093760A2描述了一种用于制备蛋白质的方法，其包括与重组α-2,3-唾液酸转移酶共表达FVIII或VWF多肽，包括截短形式的VWF。Yee等人。(2014)Blood 124(3)：445-452发现含有D'D3结构域的VWF片段足以稳定VWF缺陷型小鼠中的因子VIII。然而，尽管VWF D'D3-Fc融合蛋白在输入FVIII缺陷型小鼠时表现出显着延长的存活，但VWF D'D3-Fc融合蛋白不延长共同输注的FVIII的存活。
一直需要以降低的给药频率增加FVIII和FVIII产物的半衰期的方法。
【发明概述】
本发明人已经发现，通过施用截短的和半衰期延长的VWF多肽(本发明的多肽)可以延长内源因子VIII的体内半衰期。还发现，通过施用本发明的所述多肽，甚至可以延长内源因子VIII的体内半衰期，而不需要共同施用外源FVIII。相对于正常人血浆(NHP)中的FVIII水平，患者在用所述多肽治疗之前具有降低的内源性FVIII水平。所述患者中内源性FVIII的水平是正常人血浆(NHP)中内源性FVIII水平的至少0.5％。本发明的多肽能够提高内源性FVIII水平。这允许对患者进行预防性治疗，而无需共同施用外源性FVIII。如果共同施用外源性FVIII，则可以仅用本发明的多肽进行出血事件的后续治疗，即不继续共同施用外源性FVIII。本发明人还发现，患者可以通过施用外源性FVIII从本发明多肽治疗中获益，从而在所述受试者中提供内源性FVIII，这种内源性因子VIII的体内半衰期。被延长
因此，本发明特别涉及以下实施方式【1】至【91】：
【1】包含截短的冯维勒布兰德因子(VWF)和半衰期延长部分的多肽，用于治疗凝血障碍，所述治疗包括将所述多肽施用给患有凝血障碍且具有内源性的受试者。因子VIII(FVIII)，其中在用所述多肽治疗之前在所述受试者中内源性FVIII的活性水平相对于在正常人血浆(NHP)中FVIII的活性水平降低，条件是在所述受试者中内源性FVIII的活性水平为在正常人血浆(NHP)中内源性FVIII的活性水平的至少0.5％，其中所述多肽能够结合内源性FVIII，并且其中在施用所述多肽后内源性FVIII水平增加，并且其中
(i)施用所述多肽用于预防性预防出血事件，其中
(a)所述治疗不包括共同施用外源性FVIII，或
(b)所述治疗包括施用外源性FVIII，从而在所述受试者中提供内源性FVIII；或者
(ii)所述多肽与外源性FVIII一起共同施用，用于治疗出血事件或用于开始预防性治疗方案，其中对于后续治疗，施用所述多肽而不共同施用外源性FVIII。
本发明特别提供了以下优点：患者可以受益于剩余的低水平的内源性FVIII，其可以通过本发明的多肽稳定。内源性FVIII的稳定化可能允许更高的FVIII保护性血浆水平。根据本发明的某个方面，所述多肽任选地允许血管外施用所述多肽，所述多肽包含截短的VWF和半衰期延长部分。另外，通过应用本发明的多肽可以降低给药频率。多肽的施用允许内源性FVIII的活性水平的增加，其可以升高到生理范围或在生理范围内延长。通过施用多肽病理学，aPTT值可以降低至生理值。由于外源性FVIII不一定需要根据本发明的治疗施用，因此可能降低形成针对FVIII的抑制剂的可能性。因此，即使没有必要的共同施用FVIII，患者也可以受益于用本发明的多肽治疗。
【2】根据实施方式【1】的多肽，其中截短的冯维勒布兰德因子(VWF)提供多肽与内源性FVIII结合的能力。
【3】根据实施方式【1】或实施方式【2】的多肽，其中在施用所述多肽至少1％，或优选至少2％，至少5的水平后，内源性FVIII水平增加。％，至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或至少100在正常人血浆(NHP)中内源性FVIII的活性水平的％。
【4】根据前述实施方式任一项的多肽，其中截短的冯维勒布兰德因子(VWF)是人截短的冯维勒布兰德因子(VWF)。
【5】根据前述实施方式之任一项的多肽，其中在用所述多肽治疗之前在所述受试者中内源性FVIII的活性水平小于80％，小于60％，小于40％，小于30％。在NHP中内源性FVIII的活性水平的％，小于20％或小于10％。
【6】根据前述实施方式之任一项的多肽，其中在所述受试者中内源性FVIII的活性水平为至少1％，至少2％，至少3％，至少4％或至少5在NHP中内源性FVIII的活性水平的％。
【7】根据前述实施方式之任一项的多肽，其中所述血液凝固病症是血友病A或冯维勒布兰德病，优选von-Willebrand病2N型，von-Willebrand病3型或von-Willebrand病型1。
【8】根据前述实施方式之任一项的多肽，其中所述凝血障碍是中度血友病A，其特征在于在治疗之前或不在治疗之前的内源性FVIII的活性水平，其在1％至5％的范围内。在NHP中内源性FVIII的活性水平的％。
【9】根据实施方式【8】的多肽，其中应用治疗选项(i)a)或治疗选项(ii)。
【10】根据实施方式【1】至【7】之任一项的多肽，其中所述凝血障碍是轻度血友病A，其特征在于治疗前或治疗前的内源性FVIII的活性水平大于5％。在NHP中高达40％的内源性FVIII的活性水平。
【11】根据实施方式【10】的多肽，其中应用治疗选项(i)a)或治疗选项(ii)。
【12】根据实施方式【1】至【7】之任一项的多肽，其中所述凝血障碍是von-Willebrand病3型，通常以治疗前后的内源性FVIII活性为特征，通常为约1IU/dL至约20IU/dL FVIII活性水平的范围对应于在NHP中内源性FVIII的活性水平的约1％至约20％。大多数患者的内源性FVIII的活性水平低于10IU/dL，因此水平低于在NHP中内源性FVIII的活性水平的10％。
【13】根据实施方式【1】至【7】之任一项的多肽，其中所述凝血障碍是2型von-Willebrand病，其特征在于在治疗之前或不治疗之前的内源性FVIII的活性水平。范围在约3IU/dL和约30IU/dL FVIII活性水平之间，相当于在NHP中内源性FVIII的活性水平的约3％至约30％。大多数患者的内源性FVIII的活性水平低于20IU/dL，因此水平低于在NHP中内源性FVIII的活性水平的20％。因此，具有2N型von-Willebrand病的受试者在血浆中具有0.03IU/mL至0.3IU/mL的内源性FVIII的活性水平，通常低于0.2IU/mL。
【14】根据实施方式【1】至【7】之任一项的多肽，其中所述血液凝固病症是von-Willebrand病1型，其特征在于在治疗之前或之后具有内源性FVIII的活性水平，与之相比降低。NHP中的内源性FVIII的活性水平。
【15】根据实施方式【12】至【14】之任一项的多肽，其中应用治疗选项(i)a)或治疗选项(ii)。
【16】根据实施方式【1】至【7】之任一项的多肽，其中应用治疗选项(i)b)。
【17】根据实施方式【16】的多肽，其中所述凝血障碍是血友病A.
【18】根据实施方式【17】的多肽，其中所述凝血障碍是严重的血友病A，其特征在于在治疗之前或不在治疗之前的内源性FVIII的活性水平低于NHP中内源性FVIII活性的1％。
【19】根据实施方式【17】或【18】的多肽，其中所述外源性FVIII在施用所述多肽之前或之后给药；或其中所述外源性FVIII与所述多肽同时施用。
【20】根据实施方式【19】的多肽，其中所述外源性FVIII在所述多肽之前施用。
【21】根据前述实施方式之任一项的多肽，其中所述受试者目前正在接受治疗或已经通过FVIII基因疗法或FVIII基因转移方法治疗以提供内源性FVIII活性，而内源性FVIII的活性水平优选低于实施方式【5】中定义的FVIII活性水平之一。
【22】根据实施方式【21】使用的多肽，其中应用治疗选项(i)b)，而通过FVIII基因治疗或FVIII基因转移方法提供“外源”FVIII，从而提供内源性FVIII。
【23】根据实施方式【16】至【20】之任一项的多肽，其中所述受试者血浆中FVIII的活性水平由施用的外源性FVIII和受试者血浆中FVIII的活性水平形成。如果受试者形成任何FVIII，则内源性受试者一起被认为是正常人血浆(NHP)中内源性FVIII的活性水平的至少0.5％。根据该实施方式的其他词语，内源性FVIII为正常人血浆(NHP)中内源性FVIII的活性水平的至少0.5％可以是源自外源性FVIII的FVIII的混合物，优选先前施用的FVIII，和形成的内源性FVIII。在受试者未形成FVIII的情况下，受试者可以仅仅是先前施用的剩余FVIII。
【24】根据前述实施方式任一项的多肽，其中所述多肽通过静脉内和/或血管外给药。在血管外给药的情况下，皮下给药是优选的。
【25】根据实施方式【16】至【23】之任一项的多肽，其中所述外源性FVIII通过静脉内给药，即由此提供内源性FVIII。
【26】根据实施方式至[25]的多肽，其中所述多肽通过与FVIII不同的给药途径给药，优选所述多肽皮下给药。
【27】根据实施方式【16】至【25】之任一项的多肽，其中所述多肽是静脉内施用的。
【28】根据前述实施方式之任一项的用途的多肽，其中所述受试者是人。
【29】根据前述实施方式之任一项的用途的多肽，其中所述多肽是二聚体。
【30】根据前述实施方式任一项的多肽，其中截短的VWF包含(a)SEQ ID NO：4的氨基酸776～805或(b)具有至少序列同一性的氨基酸序列。90％，至少95％；SEQ ID NO：4的氨基酸776～805的至少96％，至少97％，至少98％或至少99％。
【31】根据前述实施方式任一项的多肽，其中截短的VWF包含(a)SEQ ID NO：4的氨基酸766～864或(b)具有至少序列同一性的氨基酸序列。90％，至少95％；SEQ ID NO：4的氨基酸766～864的至少96％，至少97％，至少98％或至少99％。
【32】根据前述实施方式之任一项的用途的多肽，其中截短的VWF包含SEQ ID NO：4的氨基酸764～1242。
【33】根据前述实施方式之任一项的用途的多肽，其中截短的VWF由(a)SEQ ID NO：4的氨基酸764～1242，(b)具有序列同一性的氨基酸序列组成。SEQ ID NO：4的氨基酸764～1242的至少90％，或(c)(a)或(b)的片段。
【34】根据前述实施方式之任一项的用途的多肽，其中截短的VWF缺少SEQ ID NO：4的氨基酸1243～2813。
【35】根据前述实施方式任一项的多肽，其中半衰期延长部分是与截短的VWF融合的异源氨基酸序列。
【36】根据实施方式【35】的多肽，其中所述异源氨基酸序列包含选自转铁蛋白及其片段，人绒毛膜促性腺激素C末端肽，XTEN序列的多肽或由其组成。，同型氨基酸重复序列(HAP)，脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸重复序列(PAS)，白蛋白，afamin，甲胎蛋白，维生素D结合蛋白，能够在生理条件下与白蛋白或免疫球蛋白恒定区结合的多肽，能够结合新生儿Fc受体(FcRn)，特别是免疫球蛋白恒定区及其部分，优选免疫球蛋白的Fc部分，及其组合。免疫球蛋白恒定区或其部分优选为免疫球蛋白G1的Fc片段，免疫球蛋白G2的Fc片段或免疫球蛋白A的Fc片段。
【37】根据前述实施方式之任一项的用途的多肽，其中所述半衰期延长部分与所述多肽缀合。
【38】根据实施方式【37】的多肽，其中所述半衰期延长部分选自羟乙基淀粉(HES)，聚乙二醇(PEG)，聚唾液酸(PSA)，弹性蛋白样多肽，肝素原(heparosan)聚合物，透明质酸和白蛋白结合配体，例如，脂肪酸链或白蛋白结合肽，及其组合。
【39】根据前述实施方式之任一项的用途多肽，其中内源性FVIII的药代动力学参数通过施用多肽得到改善，特别是其中内源性FVIII的平均停留时间(MRT)增加并且/或延长内源性FVIII的半衰期和/或降低内源性FVIII的清除率。
【40】前述实施方式之任一项所定义的多肽【1】-【39】用于稳定和/或增加内源性FVIII的血浆半衰期。
【41】根据实施方式【1】至【40】之任一项使用的多肽，提供了治疗选项(ii)，并且所述多肽与外源性FVIII一起共同施用，用于治疗出血事件或开始治疗。预防性治疗方案，其中对于后续治疗，所述多肽在不共同施用外源性FVIII的情况下施用，其中与外源性FVIII共同施用的多肽的摩尔比大于50.共同施用的外源性FVIII。可以是血浆衍生的或任何重组FVIII。重组外源FVIII可以是例如单链因子VIII，优选由氨基酸序列SEQ ID NO：5组成。
【42】如果应用治疗选项(i)b)或治疗选项(ii)，根据实施方式【1】至【41】之任一项使用的多肽，其中多肽与外源的摩尔比FVIII至少为50。
【43】据实施方式[42]使用的多肽，其中多肽与外源FVIII的摩尔比为至少75。
【44】根据实施方式[42]使用的多肽，其中多肽与外源FVIII的摩尔比为至少100。
【45】根据实施方式【42】使用的多肽，其中多肽与外源FVIII的摩尔比至少为200。
【46】根据实施方式【42】使用的多肽，其中多肽与外源FVIII的摩尔比至少为300。
【47】根据实施方式【42】使用的多肽，其中多肽与外源FVIII的摩尔比为至少400或至少500。
【48】根据前述实施方式之任一项的多肽，其中所述多肽是包含N-聚糖的糖蛋白，并且其中至少75％的所述N-聚糖平均包含至少一个唾液酸部分。
【49】根据实施方式【48】的多肽，其中至少85％的所述N-聚糖平均包含至少一个唾液酸部分。
【50】根据实施方式【49】的多肽，其中至少95％的所述N-聚糖平均包含至少一个唾液酸部分。
【51】根据前述实施方式之任一项的多肽，其中所述多肽是二聚体，优选包含两个本文公开的实施方式中定义的多肽(单体)的同型二聚体，并且形成二聚体的两个单体是通过截短的VWF内的半胱氨酸残基形成的一个或多个二硫键彼此共价连接。
【52】根据实施方式【51】的多肽，其中形成一个或多个二硫键的半胱氨酸残基选自Cys-1099，Cys-1142，Cys-1222，Cys-1225，Cys-1227及其组合，优选Cys-1099和Cys-1142，其中氨基酸编号是指SEQ ID NO：4。
【53】根据实施方式【51】至【52】之任一项的多肽，其中所述二聚体多肽与FVIII(外源或内源性FVIII)的亲和力大于单体多肽对所述FVIII的亲和力，所述单体多肽具有与二聚体多肽的单体亚基相同的氨基酸序列。
【54】根据实施方式【51】至【53】之任一项的多肽，其中本发明多肽的二聚体：单体的比例为至少1.5，优选至少2，更优选至少2.5或at最优选地，本发明的所有多肽都以二聚体形式存在。
【55】根据实施方式【51】至【54】之任一项的多肽，该多肽具有FVIII结合亲和力，其特征在于解离常数KD小于1nM，优选小于500pM，小于200pM。，小于100pM，小于90pM或小于80pM。
【56】根据实施方式【55】的多肽，其中解离常数KD为0.1pM至500pM，0.5pM至200pM，0.75pM至100pM或最优选1pM至80pM。
【57】根据实施方式之任一项使用的多肽【51】至【56】，其中二聚体多肽具有以解离常数KD为特征的FVIII结合亲和力，并且与二聚体多肽相比，所述二聚体多肽的解离常数KD降低。单体多肽的解离常数KD，优选至少10倍，至少100倍，至少500倍或至少1000倍。
【58】根据前述实施方式任一项的多肽，其中内源性FVIII的药代动力学参数通过施用多肽得到改善，优选其中内源性FVIII的平均停留时间(MRT)增加和/或或者内源性FVIII的半衰期延长和/或内源性FVIII的清除率降低，特别是与正常人血浆(NHP)中相应的FVIII药代动力学参数相比时或与受试者中相应的FVIII药代动力学参数相比时不接受多肽。
【59】根据实施方式【58】的多肽，其中所述内源性FVIII的MRT和/或终末半衰期的增加为至少50％。
【60】根据实施方式【59】的多肽，其中所述内源性FVIII的MRT和/或终末半衰期的增加至少为100％。
【61】根据实施方式【58】的多肽，其中通过施用所述多肽降低内源性FVIII的清除率，并且所述降低至少为25％。
【62】根据实施方式【61】的多肽，其中所述降低至少为50％。
【63】根据实施方式【62】的多肽，其中所述降低至少为100％。
【64】根据前述实施方式之任一项的多肽，其中与内源性VWF的血浆半衰期相比和/或与血浆半衰期相比时，所述多肽的血浆半衰期增加。正常人血浆(NHP)的VWF。
【65】根据实施方式【64】的多肽，其中所述多肽的血浆半衰期至少高25％，特别是高至少50％，高至少75％或高至少100％。比内源性VWF的半衰期和/或正常人血浆(NHP)的VWF的半衰期更长。
【66】根据前述实施方式之任一项的多肽，其中所述多肽的MRT增加，特别是高至少25％，高至少50％，高至少75％或至少100％。当与内源性VWF的MRT相比和/或与正常人血浆(NHP)的VWF的MRT相比时，其更高。
【67】根据前述实施方式之任一项的多肽，其中与参照多肽的MRT和/或血浆半衰期相比，所述多肽的MRT和/或血浆半衰期与所述多肽相同，除了参考多肽外。缺乏半衰期延长部分。
【68】根据前述实施方式任一项的多肽，其中与未治疗的受试者相比，所述多肽增加内源因子VIII的最大浓度(Cmax)。
【69】根据实施方式【68】的多肽，其中，在施用所述多肽后，FVIII的Cmax至少为10mIU/mL，至少25mIU/mL，至少50mIU/mL，至少100mIU/mL，至少200mIU/mL，至少300mIU/mL或至少400mIU/mL。
【70】根据前述实施方式之任一项的多肽，其中与未治疗的受试者相比，所述多肽使血浆浓度-时间曲线下的峰面积从零到最终测量的内源因子VIII的时间点(AUC)增加。
【71】根据实施方式【70】的多肽，其中，在施用多肽后，内源性FVIII的AUC增加至至少1000mIU*h/mL，至少2000mIU*h/mL的水平。，至少3000mIU*h/mL，至少5000mIU*h/mL，至少10000mIU*h/mL或至少20000mIU*h/mL生色FVIII活性。
【72】根据前述实施方式之任一项的多肽，其中与野生型VWF的氨基酸序列相比，所述多肽的至少一个氨基酸被取代，其中所述经修饰的多肽的结合亲和力与具有除所述修饰之外的相同氨基酸序列的参考多肽的结合亲和力相比，通过引入所述至少一个取代进一步增加FVIII。
【73】根据实施方式【72】的多肽，其中所述截短的VWF内的所述至少一个取代具有在施用所述多肽后进一步增加内源性FVIII的半衰期的能力和/或可以允许还原施用剂量的重组多肽。
【74】根据实施方式之任一项所述的多肽【72】至【73】，其中所述取代选自由S764G/S766Y，S764P/S766I，S764P/S766M，S764V/S766Y，S764E组成的组合。/S766Y，S764Y/S766Y，S764L/S766Y，S764P/S766W，S766W/S806A，S766Y/P769K，S766Y/P769N，S766Y/P769R，S764P/S766L和S764E/S766Y/V1083A，参考SEQ ID NO的序列：4关于氨基酸编号。
【75】根据实施方式【74】的多肽，其中所述取代是S764E/S766Y或S764E/S766Y/V1083A的组合。
【76】根据前述实施方式之任一项的多肽，其中所述多肽在血管外，特别是皮下施用，并且在施用后，所述多肽表现出至少20％，优选至少30％的生物利用度。至少40％，至少50％，至少60％，至少70％或至少80％。
【77】根据前述实施方式之任一项的多肽，其中在施用所述多肽后，实现了受试者内源性FVIII的活性水平的增加，优选地，内源性FVIII的活性水平增加至生理学FVIII水平(100)。施用多肽后，％＝1IU/mL)或在生理学FVIII水平以上没有显着增加，优选导致内源性FVIII的活性水平增加不超过300％＝3IU/mL，更优选不超过250％＝2.5。IU/mL，不超过200％＝2IU/mL，不超过150％＝1.5IU/mL或不超过120％＝1.2IU/mL的正常人血浆的血浆中的平均FVIII活性水平。
【78】根据前述实施方式之任一项的多肽，其中在将所述多肽施用于患有凝血障碍的受试者后，防止了增加的血栓形成风险。
【79】根据实施方式【78】的多肽，其中通过仅在施用多肽后受试者中内源性FVIII的活性水平的有限增加来确定或实现预防血栓形成风险，优选内源性FVIII的活性水平。在施用多肽后，增加至生理学FVIII水平(100％＝1IU/mL)或在生理学FVIII水平以上没有显着增加，优选导致内源性FVIII的活性水平增加不超过300％＝3IU/mL，更优选不超过250％＝2.5IU/mL，不超过200％＝2IU/mL，不超过150％＝1.5IU/mL或不超过120％＝1.2IU/mL血浆中平均FVIII活性水平分别为正常人血浆。
【80】根据前述实施方式之任一项的多肽，其中在施用所述多肽后，所述多肽的最大浓度(Cmax)为至少20nmol/kg，至少40nmol/kg，至少60nmol。/kg，至少80nmol/kg或至少160nmol/kg。
【81】根据前述实施方式之任一项的多肽，其中在施用所述多肽后，施用的多肽的t＝0至t＝∞(AUC0-inf)浓度随时间变化曲线的面积至少为2nmol*h/mL，至少3nmol*h/mL，至少4nmol*h/mL，至少20nmol*h/mL，至少40nmol*h/mL，或至少80nmol*h/毫升。
【82】根据前述实施方式之任一项的多肽，其中在施用所述多肽后，所述多肽的清除率(CL)降低至少2倍，至少5倍，或至少10倍，与参照治疗相比，其中所述参照治疗与所述治疗相同，除了待施用的多肽不包含半衰期延长部分。
【83】根据前述实施方式之任一项的多肽，其中所述多肽以至少0.01mg/kg，至少0.1mg/kg，至少0.2mg/kg，至少0.5mg的量施用。/kg，至少1mg/kg或至少3mg/kg多肽。
【84】根据前述实施方式之任一项的多肽，其中所述重组多肽的施用量不超过20mg/kg，不超过15mg/kg，不超过10mg/kg，或不超过5mg/kg。mg/kg多肽。
【85】根据前述实施方式之任一项的多肽，其中在施用所述多肽后，实现生理活化的部分凝血酶时间(aPTT)值，特别是病理性aPTT值降低至生理值。
【86】根据实施方式【85】的多肽，其中在施用多肽后，活化的部分凝血酶时间(aPTT)降低至少1.5倍，至少2倍，至少2.5倍，至少3倍，至少4，至少5或至少10。
【87】根据前述实施方式之任一项的多肽，其中所述多肽重复施用，优选每月一次，每三周一次，每两周一次，每七天一次，每周两次或每周一次或多次给药。每隔一天一次。
【88】根据实施方式【87】的多肽，其中在所述多肽的重复给药，即多次给药后，实现受试者内源性FVIII的活性水平的稳态水平，其中稳态FVIII活性水平优选提供高于1％的谷值，优选高于5％的谷值，优选低于10％的谷值，更优选低于20％的谷值，更优选低于50％的谷值，甚至最优选稳态FVIII活性水平基本上在生理学FVIII活性水平的范围内。
【89】根据实施方式【87】至【88】之任一项的多肽，其中在所述重复，即多次给药后，在受试者中实现活化部分凝血酶时间(aPTT)的持续降低，其中aPTT优选基本上在aPTT的生理范围内。
【90】一种治疗凝血障碍的方法，包括给患者施用有效量的实施方式【1】至【89】之任一项所定义的多肽，而不共同施用FVIII，所述患者具有内源性因子VIII(FVIII)，其中在用所述多肽治疗之前所述患者中内源性FVIII的活性水平相对于在正常人血浆(NHP)中FVIII的活性水平降低，条件是所述患者中内源性FVIII的活性水平为至少0.5％。内源性FVIII在正常人血浆(NHP)中的活性水平，并且其中在施用所述多肽后内源性FVIII水平增加。所述多肽优选用于预防性预防出血事件，其中所述治疗不包括共同施用外源性FVIII或所述多肽与外源性FVIII一起共同给药用于治疗出血事件或用于预防预防治疗方案，其中对于后续治疗，所述多肽在不共同施用外源性FVIII的情况下施用。
【91】一种治疗凝血障碍的方法，包括给患者施用有效量的如实施方式【1】至【89】之任一项所定义的多肽，所述患者具有内源性因子VIII(FVIII)，其中所述患者在用所述多肽治疗前内源性FVIII的活性水平相对于在正常人血浆(NHP)中FVIII的活性水平降低，条件是所述患者中内源性FVIII的活性水平为活性水平的至少0.5％。在正常人血浆(NHP)中的内源性FVIII，并且其中在施用所述多肽后内源性FVIII水平增加。所述治疗包括施用外源性FVIII，从而在所述受试者中提供内源性FVIII。优选施用所述多肽用于预防性预防出血事件。根据优选的实施方式，皮下施用多肽并静脉内施用FVIII。
【附图简述】
图1显示静脉注射后CD大鼠的rD'D3-FP暴露，FVIII活性和aPTT。如实施例1.1中所述，施用rD'D3-FP。
图1A显示通过其白蛋白组分定量的rD'D3-FP，数据以每个时间点n＝2～3只大鼠的平均值±SD给出；
图1B显示FVIII定量为IU/mL的生色FVIII活性，数据以每个时间点n＝1～3只大鼠的平均值±SD给出(给药前数据除外：n＝7)。虚线表示预先数据的最小值和最大值。标记为ULN的虚线表示正常的上限；
图1C显示FVIII定量为以标准的％表示的凝固FVIII活性，并且数据以每个时间点n＝1～3只大鼠的平均值±SD给出(除了给药前数据：n＝7)。虚线表示预先数据的最小值和最大值。标记为ULN的虚线表示正常的上限；
图1D显示FVIII定量为如上所述的生色或凝固FVIII活性。AUC计算为从0时刻到第14天的血浆浓度-时间曲线下的峰面积；
图1E显示了使用SL的活化的部分凝血酶时间，并且数据以每个时间点n＝1～3只大鼠的平均值±SD给出(除了给药前数据：n＝7)。虚线表示预先数据的最小值和最大值；
图2显示静脉注射后兔的rD'D3-FP暴露，FVIII活性和aPTT。如实施例1.2中所述，施用rD'D3-FP。
图2A显示通过其白蛋白组分定量的rD'D3-FP，数据以每个时间点n＝1～3只兔的平均值±SD给出；
图2B显示FVIII定量为IU/mL的生色FVIII活性，数据以每个时间点n＝1～3只兔的平均值±SD给出。虚线表示预先数据的最小值和最大值；
图2C显示FVIII定量为以标准的％表示的凝固FVIII活性，并且数据以每个时间点n＝1～3只兔的平均值±SD给出。虚线表示预先数据的最小值和最大值；
图2D显示FVIII定量为如上所述的生色或凝固FVIII活性。AUC计算为从0时刻到第10天的血浆浓度-时间曲线下的峰面积；
图2E显示了使用FSL的活化部分凝血酶时间，并且数据以每个时间点n＝1～3只兔的平均值±SD给出。虚线表示预先数据的最小值和最大值；
图3显示静脉注射后猴的rD'D3-FP暴露和FVIII活性。如实施例1.3中所述，施用rD'D3-FP。
图3A显示相对于通过其白蛋白组分定量的标准定量的rD'D3-FP，数据以每个时间点n＝3只猴的平均值±SD给出；
图3B显示FVIII定量为生色的FVIII活性，以标准的％表示，数据以每个时间点n＝3只猴的平均值±SD给出。虚线表示给药前数据的最小值和最大值，虚线表示给药前数据的平均值(给药前数据：n＝22)。
图4显示静脉注射后VWF敲除大鼠中的rD'D3-FP暴露，FVIII活性和aPTT。如实施例1.4中所述，施用rD'D3-FP。
图4A显示通过其白蛋白组分定量的rD'D3-FP，数据以每个时间点n＝1～4只大鼠的平均值±SD给出；
图4B显示FVIII定量为IU/mL的生色FVIII活性，数据以每个时间点n＝1～4只大鼠的平均值±SD给出(除了给药前数据：n≤8)。VWFko大鼠的预测数据低于定量限。阴影区域代表来自健康CD大鼠的给药前数据的最小值和最大值；标记为ULN的虚线表示正常的上限；
图4C显示FVIII定量为以标准的％表示的凝固FVIII活性，并且数据以每个时间点n＝1～4只大鼠的平均值±SD给出(除了给药前数据：n≤8)。阴影区域代表来自健康CD大鼠的给药前数据的最小值和最大值；标记为ULN的虚线表示正常的上限；
图4D显示FVIII定量为如上所述的生色或凝固FVIII活性。AUC计算为从0时刻到第10天的血浆浓度-时间曲线下的峰面积；
图4E显示使用SL的活化的部分凝血酶时间，并且数据以每个时间点n＝1～3只大鼠的平均值±SD给出(除了给药前数据：n≤7)。虚线表示VWF ko大鼠的给药前数据的最小值和最大值。阴影区域代表来自健康CD大鼠的给药前数据的最小值和最大值；
图5显示施用rD'D3-FP后VWF敲除小鼠中的rD'D3-FP暴露和FVIII活性，如实施例1.5中所述。
图5A显示通过其白蛋白组分定量的rD'D3-FP，数据以每个时间点n＝3只小鼠的平均值±SD给出；
图5B显示FVIII以mIU/mL定量为生色FVIII活性，并且数据以每个时间点n＝3只小鼠的平均值±SD给出。VWF ko小鼠中的媒质数据低于定量限(LLOQ)。阴影区域代表来自健康NMRI小鼠的给药前数据的最小值和最大值；
图5C显示FVIII定量为以标准的％表示的凝固FVIII活性，并且数据以每个时间点n＝3～4只小鼠的平均值±SD给出。VWF ko小鼠中的媒质数据低于检测限；
图5D显示FVIII定量为如上所述的生色或凝固FVIII活性。AUC计算为从0时刻到第7天的血浆浓度-时间曲线下的峰面积；
图6显示静脉注射后VWF敲除大鼠中的rD'D3变体暴露和FVIII活性。如实施例1.6中所述，施用rD'D3变体。
图6A显示了通过其白蛋白组分(rD'D3-FP)或通过D'在VWF ko大鼠中定量的rD'D3-FP WT，rD'D3-FP EY，rD'D3-FP EYA或rD'D3-CTP。D3组分(rD'D3-CTP)和数据以每个时间点n＝3～4只大鼠的平均值±SD给出。虚线分别代表白蛋白和rD'D3-CTP的检测限；
图6B显示在VWF ko大鼠中以mIU/mL定量为FVIII活性的FVIII，数据以每个时间点n＝1～4只大鼠的平均值±SD给出；
图6C显示FVIII定量为VWF ko大鼠中以标准的％表示的凝固FVIII活性，数据以每个时间点n＝1～4只大鼠的平均值±SD给出；
图6D显示FVIII定量为如上所述的生色或凝固FVIII活性。AUC计算为从0时刻到第10天的血浆浓度-时间曲线下的峰面积；
图7显示静脉注射后FVIII敲除，VWF ko和NMRI小鼠和VWF ko或CD大鼠或猪中的rD'D3-FP暴露。或者是皮下如实施例1.7中所述，施用rD'D3-FP。
图7A-1显示了在FVIII ko，VWF ko和NMRI小鼠中通过其白蛋白组分定量的rD'D3-FP，数据以每个时间点n＝1～3只小鼠的平均值±SD给出；
图7A-2显示了通过其白蛋白组分在VWF ko和CD大鼠中定量的rD'D3-FP，并且数据以每个时间点n＝2～4只大鼠的平均值±SD给出。虚线表示rD'D3-FP的检测限；
图7A-3显示了通过其白蛋白组分在猪中定量的rD'D3-FP，数据以每个时间点n＝1～3只猪的平均值±SD给出。虚线表示rD'D3-FP的检测限；
图7B-1显示FVIII定量为VWF ko大鼠中的生色FVIII活性，数据以每个时间点n＝2～4只大鼠的平均值±SD给出。虚线表示来自未处理的健康CD大鼠的最小和最大数据；
图7B-2显示FVIII在猪中定量为生色FVIII活性，数据以每个时间点n＝2～3只猪的平均值±SD给出。虚线表示来自猪的食前值的范围；
图8显示静脉注射后FVIII敲除，VWF ko和NMRI小鼠和VWF ko或CD大鼠或猪中的rD'D3-FP暴露和FVIII生色活性。或者是皮下如实施例1.8中所述，施用rD'D3-FP。
图8A显示了通过其白蛋白组分在VWF ko大鼠中定量的rD'D3-FP，并且数据以每个时间点n＝3只大鼠的平均值±SD给出。虚线表示rD'D3-FP的检测限；
图8B显示在VWF ko大鼠中定量为FVIII活性的FVIII，并且数据以每个时间点n＝2～3只大鼠的平均值±SD给出。带有虚线的灰色阴影代表来自未治疗的健康CD大鼠的最小和最大数据；
图8C显示FVIII定量为VWF ko大鼠中的凝固FVIII活性，数据以每个时间点n＝2只大鼠的平均值±SD给出。灰色阴影代表来自未治疗的健康CD大鼠的最小至最大数据范围；
图8D显示了在VWF ko大鼠中使用SL的活化部分凝血酶时间，并且数据以每个时间点n＝2只大鼠的平均值±SD给出。灰色阴影代表VWF ko大鼠的给药前数据的最小值和最大值。阴影区域代表来自健康CD大鼠的给药前数据的最小值和最大值；
图9显示静脉注射后FVIII ko大鼠中的rD'D3-FP和FVIII暴露。或/和/或与皮下结合如实施例1.9中所述，施用rD'D3-FP。
图9A显示FVIII定量为FVIII ko大鼠中的生色FVIII活性，数据以每个时间点n＝3个FVIII ko小鼠的平均值±SD给出。检测限表示来自健康CD大鼠的给药前数据的最小值和最大值；
图9B显示FVIII定量为FVIII ko大鼠中的生色FVIII活性，数据以每个时间点n＝2～3个FVIII ko小鼠的平均值±SD给出。检测限表示来自健康CD大鼠的给药前数据的最小值和最大值；
图9C显示FVIII定量为FVIII ko大鼠中的生色FVIII活性，数据以每个时间点n＝2～3个FVIII ko小鼠的平均值±SD给出。检测限表示来自健康CD大鼠的给药前数据的最小值和最大值；
【发明详述】
在第一方面，本发明涉及包含(i)截短的冯维勒布兰德因子(VWF)和(ii)半衰期延长部分的多肽，其用于治疗凝血障碍，所述治疗包括施用所述多肽患有血液凝固障碍并具有内源性因子VIII(FVIII)，其中所述受试者在用所述多肽治疗前内源性FVIII的活性水平相对于正常人血浆(NHP)中的FVIII活性水平降低)条件是在所述受试者中内源性FVIII的活性水平为正常人血浆(NHP)中内源性FVIII的活性水平的至少0.5％，并且其中在施用所述多肽后施用所述多肽时内源性FVIII水平增加。用于预防性预防出血事件，其中所述治疗不包括共同施用外源性FVIII。
在第二方面，本发明涉及一种多肽，其包含(i)截短的冯维勒布兰德因子(VWF)和(ii)半衰期延长部分，用于治疗凝血障碍，所述治疗包括施用所述多肽患有血液凝固障碍并具有内源性因子VIII(FVIII)，其中所述受试者在用所述多肽治疗前内源性FVIII的活性水平相对于正常人血浆(NHP)中的FVIII活性水平降低)条件是在所述受试者中内源性FVIII的活性水平为正常人血浆(NHP)中内源性FVIII的活性水平的至少0.5％，并且其中在施用所述多肽后内源性FVIII水平增加，并且其中所述多肽是co-与外源性FVIII一起施用以治疗出血事件或开始预防性治疗方案，其中为所述多肽在不共同施用外源性FVIII的情况下给药。
第三方面涉及药物组合物，其包含多肽，所述多肽包含(i)截短的冯维勒布兰德因子(VWF)和(ii)半衰期延长部分，用于治疗凝血障碍，所述治疗包括施用多肽患有血液凝固障碍并具有内源性因子VIII(FVIII)的受试者，其中所述受试者在用所述多肽治疗之前内源性FVIII的活性水平相对于在正常人血浆(NHP)中FVIII的活性水平降低。只要在所述受试者中内源性FVIII的活性水平为正常人血浆(NHP)中内源性FVIII的活性水平的至少0.5％，并且其中在施用所述多肽后内源性FVIII水平增加并且所述多肽施用于预防性预防出血事件，其中所述治疗不包括共同施用外源性FVIII。
第四方面涉及药物组合物，其包含多肽，所述多肽包含(i)截短的冯维勒布兰德因子(VWF)和(ii)半衰期延长部分，用于治疗凝血障碍，所述治疗包括施用多肽患有血液凝固障碍并具有内源性因子VIII(FVIII)的受试者，其中所述受试者在用所述多肽治疗之前内源性FVIII的活性水平相对于在正常人血浆(NHP)中FVIII的活性水平降低。条件是，在所述受试者中内源性FVIII的活性水平为正常人血浆(NHP)中内源性FVIII的活性水平的至少0.5％，并且其中在施用所述多肽后内源性FVIII水平增加，并且其中所述多肽是共同的。与外源性FVIII一起施用以治疗出血事件或开始预防性治疗方案用于后续治疗的所述多肽在不共同施用外源性FVIII的情况下施用。
第五方面涉及重组多肽的用途，所述重组多肽包含(i)截短的冯维勒布兰德因子(VWF)和(ii)半衰期延长部分，用于制备用于治疗凝血障碍的药物，所述治疗包括：将多肽施用给患有凝血障碍并具有内源性因子VIII(FVIII)的受试者，其中所述受试者在用所述多肽治疗之前内源性FVIII的活性水平相对于正常人血浆(NHP)中FVIII的活性水平降低提供在所述受试者中内源性FVIII的活性水平为正常人血浆(NHP)中内源性FVIII的活性水平的至少0.5％，并且其中在施用所述多肽后内源性FVIII水平增加，并且其中
所述多肽用于预防性预防出血事件，其中所述治疗不包括共同施用外源性FVIII或
所述多肽与外源性FVIII一起共同施用，用于治疗出血事件或用于开始预防性治疗方案，其中对于后续治疗，施用所述多肽而不共同施用外源性FVIII。
包含截短的冯维勒布兰德因子(VWF)和半衰期延长部分的多肽在本文中称为“本发明的多肽”。
【截断的VWF】
本文所用的术语“von Willebrand因子”(VWF)包括天然存在的(天然)VWF，但也包括至少保留天然存在的VWF的FVIII结合活性的变体，例如VWF。序列变体，其中已插入，缺失或取代一个或多个残基。如实施例2中所述，通过FVIII-VWF结合测定法测定FVIII结合活性。
根据本发明的VWF是由SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列表示的人VWF，并且优选是截短的VWF。编码SEQ ID NO：4的cDNA显示在SEQ ID NO：3中。
编码人天然VWF的基因转录成9kb mRNA，其被翻译成2813个氨基酸的前多肽，估计分子量为310,000Da。前多肽包含N末端22个氨基酸的信号肽，接着是741个氨基酸的前多肽(SEQ ID NO：4的氨基酸23～763)和成熟亚基(SEQ ID NO：764～2813)。NO：4)。从N-末端切割741个氨基酸的前多肽导致由2050个氨基酸组成的成熟VWF。人天然VWF前多肽的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：4中。除非另有说明，否则本申请中VWF残基的氨基酸编号是指SEQID NO：4，即使VWF分子不包含SEQ ID NO：4的所有残基。
天然VWF的前多肽包含多个结构域。可以在文献中找到不同的域注释(参见例如Zhou等人(2012)Blood 120(2)：449-458)。本申请中应用了以下VWF天然前多肽的域注释：
D1-D2-D'-D3-A1-A2-A3-D4-C1-C2-C3-C4-C5-C6-CK
参考SEQ ID NO：4，D'结构域由氨基酸764～865组成；D3结构域由氨基酸866～1242组成。
特征“截短的”是指多肽不包含成熟VWF的完整氨基酸序列(SEQ ID NO：4的氨基酸764～2813)。通常，截短的VWF不包含SEQ ID NO：4的所有氨基酸764～2813，而仅包含其片段。截短的VWF也可称为VWF片段，或多个称为VWF片段。
通常，截短的VWF能够结合因子VIII。优选地，截短的VWF能够结合成熟形式的人天然因子VIII。截短的VWF能够结合内源性和/或外源性因子VIII。在某些实施方式中，截短的VWF能够结合共同施用的重组FVIII，优选结合如本文所述的FVIII，更优选结合由氨基酸序列SEQ ID NO：5组成的单链因子VIII。截短的VWF与因子VIII的结合可以通过如实施例2中所述的FVIII-VWF结合测定来确定。
本发明的截短的VWF优选包含SEQ ID NO：4的氨基酸776～805具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列或由其组成，并且能够结合FVIII。在优选的实施方式中，截短的VWF包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：4的氨基酸776～805的序列同一性具有至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性，并且能够结合FVIII。最优选地，截短的VWF包含SEQ ID NO：4的氨基酸776～805或由其组成。除非本文另有说明，否则在参考序列的整个长度上确定序列同一性(例如SEQ ID NO：4的氨基酸776～805)。
本发明的截短的VWF优选包含氨基酸序列或由其组成，所述氨基酸序列与SEQ IDNO：4的氨基酸766～864具有至少90％的序列同一性，并且能够结合FVIII。在优选的实施方式中，截短的VWF包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与氨基酸766～766的序列同一性具有至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。SEQID NO：4的864并且能够结合FVIII。最优选地，截短的VWF包含SEQ ID NO：4的氨基酸766～864或由其组成。
在另一个优选的实施方式中，截短的VWF由(a)与SEQ ID NO：4的氨基酸764～1242具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，或(b)其片段组成，条件是截短的VWF仍然能够结合FVIII。更优选地，截短的VWF由(a)氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与氨基酸764具有至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。SEQ ID NO：4的1242，或(b)其片段，条件是截短的VWF仍然能够结合FVIII。最优选地，截短的VWF由(a)SEQ IDNO：4的氨基酸764～1242，或(b)其片段组成，条件是截短的VWF仍能够结合FVIII。
如下文更详细描述的，多肽可以通过使用包含编码包含截短的VWF的多肽的核酸的细胞的方法制备。通过本身已知的技术将核酸引入合适的宿主细胞中。
在优选的实施方式中，宿主细胞中的核酸编码(a)与SEQ ID NO：4的氨基酸1～1242具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，或(b)其片段，条件是截短的成熟VWF仍然能够结合FVIII。更优选地，所述核酸编码(a)氨基酸序列，所述氨基酸序列与氨基酸1至序列同一性具有至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。SEQ IDNO：4的1242，或(b)其片段，条件是截短的VWF仍然能够结合FVIII。最优选地，核酸编码(a)SEQ ID NO：4的氨基酸1～1242，或(b)其片段，条件是截短的VWF仍然能够结合FVIII。特别地，如果根据本发明的多肽是二聚体，则核酸将包含编码VWF的氨基酸1～763的序列(例如SEQ ID NO：4)，即使多肽中的截短的VWF不包含氨基酸VWF的1～763(例如SEQ ID NO：4)。
在其他实施方式中，截短的VWF包含下列氨基酸序列之一或由其组成，每个氨基酸序列参见SEQ ID NO：4：776～805；766～805；764～805；776～810；766～810；764～810；776～815；766～815；764～815；776～820；766～820；764～820；776～825；766～825；764～825；776～830；766～830；764～830；776～835；766～835；764～835；776～840；766～840；764～840；776～845；766～845；764～845；776～850；766～850；764～850；776～855；766～855；764～855；776～860；766～860；764～860；776～864；766～864；764～864；776～865；766～865；764～865；776～870；766～870；764～870；776～875；766～875；764～875；776～880；766～880；764～880；776～885；766～885；764～885；776～890；766～890；764～890；776～895；766～895；764～895；776～900；766～900；764～900；776～905；766～905；764～905；776～910；766～910；764～910；776～915；766～915；764～915；776～920；766～920；764～920；776～925；766～925；764～925；776～930；766～930；764～930；776～935；766～935；764～935；776～940；766～940；764～940；776～945；766～945；764～945；776～950；766～950；764～950；776～955；766～955；764～955；776～960；766～960；764～960；776～965；766～965；764～965；776～970；766～970；764～970；776～975；766～975；764～975；776～980；766～980；764～980；776～985；766～985；764～985；776～990；766～990；764～990；776～995；766～995；764～995；776～1000；766～1000；764～1000；776～1005；766～1005；764～1005；776～1010；766～1010；764～1010；776～1015；766～1015；764～1015；776～1020；766～1020；764～1020；776～1025；766～1025；764～1025；776～1030；766～1030；764～1030；776～1035；766～1035；764～1035；776～1040；766～1040；764～1040；776～1045；766～1045；764～1045；776～1050；766～1050；764～1050；776～1055；766～1055；764～1055；776～1060；766～1060；764～1060；776～1065；766～1065；764～1065；776～1070；766～1070；764～1070；776～1075；766～1075；764～1075；776～1080；766～1080；764～1080；776～1085；766～1085；764～1085；776～1090；766～1090；764～1090；776～1095；766～1095；764～1095；776～1100；766～1100；764～1100；776～1105；766～1105；764～1105；776～1110；766～1110；764～1110；776～1115；766～1115；764～1115；776～1120；766～1120；764～1120；776～1125；766～1125；764～1125；776～1130；766～1130；764～1130；776～1135；766～1135；764～1135；776～1140；766～1140；764～1140；776～1145；766～1145；764～1145；776～1150；766～1150；764～1150；776～1155；766～1155；764～1155；776～1160；766～1160；764～1160；776～1165；766～1165；764～1165；776～1170；766～1170；764～1170；776～1175；766～1175；764～1175；776～1180；766～1180；764～1180；776～1185；766～1185；764～1185；776～1190；766～1190；764～1190；776～1195；766～1195；764～1195；776～1200；766～1200；764～1200；776～1205；766～1205；764～1205；776～1210；766～1210；764～1210；776～1215；766～1215；764～1215；776～1220；766～1220；764～1220；776～1225；766～1225；764～1225；776～1230；766～1230；764～1230；776～1235；766～1235；764～1235；776～1240；766～1240；764～1240；776～1242；766～1242；764～1242；764～1464；764～1250；764～1041；764～828；764～865；764～1045；764～1035；764～1128；764～1198；764～1268；764～1261；764～1264；764～1459；764～1463；764～1464；764～1683；764～1873；764～1482；764～1479；764～1672；和764～1874。
在某些实施方式中，截短的VWF相对于成熟野生型VWF具有内部缺失。例如，可以删除A1，A2，A3，D4，C1，C2，C3，C4，C5，C6，CK结构域或其组合，并保留D'结构域和/或D3结构域。在进一步的实施方式中，截短的VWF不包含血小板糖蛋白Ibα(GPIbα)，胶原和/或整联蛋白αIIbβIII(C1结构域内的RGDS序列)的结合位点。在其他实施方式中，截短的VWF不包含ADAMTS13的切割位点(Tyr1605-Met1606)，其位于VWF的中心A2结构域。在另一个实施方式中，截短的VWF不包含GPIbα的结合位点，和/或不包含胶原的结合位点，和/或不包含整联蛋白αIIbβIII的结合位点，和/或它不包含ADAMTS13的切割位点(Tyr1605-Met1606)位于VWF的中心A2结构域。
在其他实施方式中，截短的VWF包含具有至少90％，或至少91％，或至少92％，或至少93％，或至少94％的序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％，前一段中所述的氨基酸序列之一，条件是截短的VWF能够与FVIII结合。
如果本发明的多肽的两个单体共价连接，则本发明的多肽在本发明中称为“二聚体”。优选地，两个单体亚基通过至少一个二硫键共价连接，例如通过一个，两个，三个或形成至少一个二硫键的半胱氨酸残基优选位于本发明多肽的截短的VWF部分内。在一个实施方式中，这些半胱氨酸残基是Cys-1099，Cys-1142，Cys-1222，Cys-1225，或Cys-1227或其组合。
二聚体优选是同二聚体，其中每个单体优选包含本文公开的半衰期延长部分。如果本发明的多肽是二聚体，则截短的VWF优选包含两个多肽或由两个多肽组成，每个多肽具有与氨基酸764～1099，氨基酸764～1142，氨基酸764～1222，氨基酸764～1225，或SEQ IDNO：4的氨基酸764～1227具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，并且能够结合FVIII。在优选的实施方式中，截短的VWF包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与氨基酸764～1099，氨基酸764～1142，氨基酸764～1222，氨基酸764～1225，或SEQ ID NO：4的氨基酸764～1227的序列同一性具有至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性，并且能够结合FVIII。最优选地，截短的VWF包含SEQ ID NO4的氨基酸764～1099，氨基酸764～1142，氨基酸764～1222，氨基酸764～1225，氨基酸764～1227或氨基酸764～1242或由其组成。
截短的VWF可以是WO2013/106787A1，WO2014/198686A2，WO2011/060242A2或WO2013/093760A2中公开的VWF片段中的任一种，其公开内容通过引用并入本文。
根据进一步优选的实施方式，如上公开的截短的VWF可以包含WO 2016/000039A1中公开的至少一个氨基酸取代。与根据SEQ ID NO：4的野生型VWF的D'结构域的氨基酸序列相比，截短的VWF的那些修饰形式在其D'结构域内包含至少一个氨基酸取代。截短的VWF的修饰形式可以相对于相应的野生型序列具有一个或多个氨基酸取代。修饰的截短的VWF的D'结构域的氨基酸序列优选相对于SEQ ID NO：4的D'结构域具有一个或两个氨基酸取代。优选地，对应于SEQ ID NO：2的位置1的SEQ ID NO：4的764位的S被选自G，P，V，E，Y，A和A的氨基酸取代。L.还优选SEQ ID NO：4的766位的S，对应于SEQ ID NO：2的3位的氨基酸被选自Y，I，M，V，F的氨基酸取代，H，R和W.优选的替换组合包括S764G/S766Y，S764P/S766I，S764P/S766M，S764V/S766Y，S764E/S766Y，S764Y/S766Y，S764L/S766Y，S764P/S766W，S766W/S806A，S766Y/P769K，S766Y/P769N，S766Y/P769R和S764P/S766L，参考SEQ ID NO：4的序列。与具有除所述修饰之外的相同氨基酸序列的参照多肽的结合亲和力相比，通过引入所述取代可以进一步增加本发明多肽与FVIII的结合亲和力。截短的VWF内的所述取代可以有助于进一步增加内源性FVIII的半衰期或共同施用的FVIII的半衰期和/或可以允许减少待施用的本发明的重组多肽的剂量。
【半衰期延长部分】
内源性VWF在人血浆中的半衰期为约16小时(Lenting PJ，Christophe OD，DenisCV.von Willebrand factor biosynthesis，secretion，clearance：connections the farends.Blood。2015.125(13)：2019-28)。
除截短的VWF外，本发明的多肽还包含半衰期延长部分。半衰期延长部分可以是与截短的VWF融合的异源氨基酸序列。或者，半衰期延长部分可以通过不同于肽键的共价键与包含截短的VWF的多肽化学缀合。
在本发明的某些实施方式中，本发明多肽的半衰期通过化学修饰延长，例如，连接半衰期延长部分，例如聚乙二醇(聚乙二醇化)，糖基化PEG，羟乙基淀粉(HES化)，聚唾液酸，弹性蛋白样多肽，肝素原(heparosan)聚合物或透明质酸。在另一个实施方式中，本发明的多肽通过化学接头与HLEP如白蛋白缀合。Conjuchem LLC以示例性方式描述了该缀合技术的原理(参见，例如，美国专利号7,256,253)。
在其他实施方式中，半衰期延长部分是半衰期增强蛋白(HLEP)。优选地，HLEP是白蛋白或其片段。白蛋白的N-末端可以与截短的VWF的C-末端融合。或者，白蛋白的C末端可以与截短的VWF的N末端融合。一个或多个HLEP可以与VWF的N-或C-末端部分融合，条件是它们不干扰或消除截短的VWF与FVIII的结合能力。
重组多肽还优选包含位于截短的VWF和HLEM之间的化学键或接头序列。
所述接头序列可以是由一个或多个氨基酸组成的肽接头，特别是1～50、1～30、1～20、1～15、1～10、1～5或1～3(例如1，2或3)氨基酸，它们可以彼此相同或不同。优选地，接头序列不存在于野生型VWF中的相应位置。存在于所述接头序列中的优选氨基酸包括Gly和Ser。接头序列应该是非免疫原性的。优选的接头可以包含交替的甘氨酸和丝氨酸残基。合适的接头描述于例如WO2007/090584中。
在本发明的另一个实施方式中，截短的VWF部分和HLEM之间的肽接头由肽序列组成，其用作人蛋白质中的天然域间接头。优选地，这些肽序列在其天然环境中位于蛋白质表面附近并且可被免疫系统接近，从而可以假定对该序列具有天然耐受性。实例在WO 2007/090584中给出。可切割的接头序列描述于例如WO2013/120939A1中。
在重组多肽的优选实施方式中，截短的VWF和HLEM之间的接头是具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列480～510或由其组成的甘氨酸/丝氨酸肽接头。
在一个实施方式中，多肽具有以下结构：
tVWF-L1-H，[公式1]
其中tVWF是截短的VWF，L1是化学键或接头序列，H是HLEP。
L1可以是化学键或由一个或多个氨基酸组成的接头序列，例如，可以是1～50、1～30、1～20、1～15、1～10、1～5或1～3(例如1、2或3)个氨基酸，并且它们可以彼此相同或不同。通常，接头序列不存在于野生型VWF中的相应位置。存在于L1中的合适氨基酸的实例包括Gly和Ser。接头应该是非免疫原性的并且可以是不可切割或可切割的接头。不可切割的接头可以由交替的甘氨酸和丝氨酸残基组成，如WO2007/090584中所例示的。在本发明的另一个实施方式中，截短的VWF部分和白蛋白部分之间的肽接头由肽序列组成，其用作人蛋白质中的天然域间接头。优选地，这些肽序列在其天然环境中位于蛋白质表面附近并且可被免疫系统接近，从而可以假定对该序列具有天然耐受性。实例在WO2007/090584中给出。可切割的接头序列描述于例如WO2013/120939A1中。
优选的HLEP序列在下文描述。本发明同样包括与相应HLEP的确切“N-末端氨基酸”或精确“C-末端氨基酸”的融合，或与“N-末端部分”或“C-末端部分”的融合。相应的HLEP，其包括HLEP的一个或多个氨基酸的N-末端缺失。多肽可包含一个以上的HLEP序列，例如，两个或三个HLEP序列。这些多个HLEP序列可以串联融合到VWF的C末端部分，例如，随着连续重复。
【半衰期增强多肽(HLEPs)】
优选地，半衰期延长部分是延长半衰期的多肽(HLEP)，更优选HLEP选自白蛋白或其片段，免疫球蛋白恒定区及其部分，例如白蛋白。Fc片段，具有大流体动力学体积的溶剂化随机链(例如XTEN(Schellenberger等人2009；Nature Biotechnol.27：1186-1190)，同型氨基酸重复序列(HAP)或脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸重复序列(PAS)，afamin，甲胎蛋白，维生素D结合蛋白，转铁蛋白或其变体，人绒毛膜促性腺激素-β亚基的羧基末端肽(CTP)，能够在生理条件下与白蛋白或免疫球蛋白恒定区结合的多肽或脂质。
本文所用的“半衰期增强多肽”优选选自白蛋白，白蛋白家族成员，免疫球蛋白G恒定区及其片段，能够在生理条件下与白蛋白结合的区域和多肽。，对白蛋白家族的成员以及免疫球蛋白恒定区的部分。它可以是本文所述的全长半衰期增强蛋白(例如白蛋白，白蛋白家族的成员或免疫球蛋白G的恒定区)或其一个或多个能够稳定或延长治疗活性的片段。或凝血因子的生物活性。此类片段的长度可以是10个或更多个氨基酸，或者可以包括至少约15，至少约20，至少约25，至少约30，至少约50，至少约100或更多个连续氨基酸。来自HLEP序列或可包括相应HLEP的部分或全部特定结构域，只要HLEP片段与不含HLEP的相应多肽相比提供至少25％的功能性半衰期延长。
本发明多肽的HLEP部分可以是野生型HLEP的变体。术语“变体”包括保守或非保守的插入，缺失和取代，其中这种变化基本上不改变截短的VWF的FVIII结合活性。
特别地，本发明的所提出的VWF HLEP融合构建体可包括HLEP的天然存在的多态性变体和HLEP的片段。HLEP可以源自任何脊椎动物，尤其是任何哺乳动物，例如人，猴，牛，绵羊或猪。非哺乳动物HLEP包括但不限于母鸡和鲑鱼。
根据本公开的某些实施方式，本发明多肽的半衰期延长部分，特别是HLEP部分可以用替代术语“FP”指定。优选地，如果没有另外说明，术语“FP”代表人白蛋白。
根据某些优选的实施方式，多肽是融合蛋白。就本发明而言，融合蛋白是通过框内连接编码截短的VWF以及HLEP的至少两个DNA序列而产生的蛋白质。技术人员理解融合蛋白DNA序列的翻译将产生单一蛋白质序列。根据进一步优选的实施方式，作为编码肽接头的DNA序列的框内插入的结果，可以获得包含截短的VWF，合适的接头和HLEP的融合蛋白。
【白蛋白作为HLEP】
术语“人血清白蛋白”(HSA)和“人白蛋白”(HA)和“白蛋白”(ALB)在本申请中可互换使用。术语“白蛋白”和“血清白蛋白”更宽，并且包括人血清白蛋白(及其片段和变体)以及来自其他物种的白蛋白(及其片段和变体)。
如本文所用，“白蛋白”统指白蛋白多肽或氨基酸序列，或白蛋白片段或变体，具有白蛋白的一种或多种功能活性(例如生物活性)。特别地，“白蛋白”是指人白蛋白或其片段，尤其是本文SEQ ID NO：6中所示的成熟形式的人白蛋白或来自其他脊椎动物的白蛋白或其片段，或这些分子的类似物或变体或其片段。
根据本公开的某些实施方式，替代术语“FP”用于鉴定HLEP，特别是将白蛋白定义为HLEP。
特别地，所提出的本发明的多肽可包括人白蛋白的天然存在的多态性变体和人白蛋白的片段。一般而言，白蛋白片段或变体的长度为至少10，优选至少40，最优选70多个氨基酸。
本发明的优选实施方式包括用作本发明多肽的HLEP的白蛋白变体，其具有增强的与FcRn受体的结合。与用野生型白蛋白截短的VWF融合相比，这种白蛋白变体可导致截短的VWF白蛋白变体融合蛋白的更长的血浆半衰期。
本发明多肽的白蛋白部分可包含HA的至少一个亚结构域或结构域或其保守修饰。
【免疫球蛋白作为HLEP】
本领域已知免疫球蛋白G(IgG)恒定区(Fc)增加治疗性蛋白质的半衰期(Dumont JA等人2006.BioDrugs 20：151-160)。重链的IgG恒定区由3个结构域(CH1-CH3)和铰链区组成。免疫球蛋白序列可以分别来自任何哺乳动物，或来自亚类IgG1，IgG2，IgG3或IgG4。没有抗原结合结构域的IgG和IgG片段也可用作HLEP。治疗性多肽部分优选通过抗体的铰链区或肽接头与IgG或IgG片段连接，所述肽接头甚至可以是可切割的。一些专利和专利申请描述了治疗性蛋白质与免疫球蛋白恒定区的融合，以增强治疗性蛋白质的体内半衰期。US2004/0087778和WO 2005/001025描述了Fc结构域或至少部分免疫球蛋白恒定区的融合蛋白，其具有增加肽半衰期的生物活性肽，否则其将在体内快速消除。描述了Fc-IFN-β融合蛋白，其实现了增强的生物活性，延长的循环半衰期和更大的溶解度(WO 2006/000448)。公开了具有延长的血清半衰期和增加的体内效力的Fc-EPO蛋白(WO2005/063808)以及具有G-CSF的Fc融合体(WO 2003/076567)，胰高血糖素样肽-1(WO 2005/000892)，凝血因子(WO 2004/101740)和白细胞介素-10(美国专利号6,403,077)，均具有半衰期增强特性。
在WO2013/120939A1中详细描述了可以根据本发明使用的各种HLEP。
【N-聚糖和本发明多肽的唾液酸化】
本发明的多肽优选包含N-聚糖，并且至少75％，优选至少85％，更优选至少90％的所述N-聚糖平均包含至少一个唾液酸部分。在优选的实施方式中，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，所述N-聚糖的平均含有至少一个唾液酸部分。发明人发现，包含高度唾液酸化的VWF片段的多肽本身不仅具有延长的半衰期，而且还能够进一步延长共同施用的FVIII的半衰期。换句话说，施用本发明的多肽导致共同施用的FVIII的延长的半衰期和/或降低的清除率。
本发明的多肽优选包含N-聚糖，并且糖蛋白的N-聚糖的至少50％的唾液酸基是α-2,6-连接的唾液酸基。通常，末端唾液酸基团可以通过α-2,3-或通过α-2,6-键连接到半乳糖基团上。通常，本发明多肽的N-聚糖包含比α-2,3-连接的唾液酸基更多的α-2,6-连接的唾液酸基。优选地，N-聚糖的至少60％，或至少70％，或至少80％，或至少90％的唾液基是α-2,6-连接的唾液酸基。这些实施方式可以通过例如在哺乳动物细胞中共表达人α-2,6-唾液酸转移酶来获得。
在一个实施方式中，所述多肽的N-聚糖的至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％。本发明包括至少一个唾液酸基团。在另一个实施方式中，本发明多肽的N-聚糖的至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％包含至少一个唾液酸基团。
在另一个实施方式中，小于15％，小于12％，小于10％，或小于8％，或小于6％，或小于5％，或小于4％，或小于3％，或小于2％或甚至小于1％的本发明多肽的N-聚糖是去唾液酸-N-聚糖，即它们是缺少唾液酸基团的N-聚糖。在另一个实施方式中，小于15％，小于12％，小于10％，或小于8％，或小于6％，或小于5％，或小于4％，或小于3％，或小于2％或甚至小于1％的本发明多肽的N-聚糖是脱唾液酸-N-聚糖，即它们不具有唾液酸基团。
产生这种糖蛋白的合适方法描述于未决的PCT/EP2016/061440中。因此，其中描述了产生包含具有增加的唾液酸化的N-聚糖的糖蛋白的方法，该方法包括(i)提供包含编码包含截短的冯维勒布兰德因子(VWF)的多肽的核酸的细胞，和(ii)培养所述糖蛋白。温度低于36.0℃的电池。此外，描述了产生包含截短的冯维勒布兰德因子(VWF)的糖蛋白的二聚体的方法，或用于增加所述糖蛋白的二聚化的方法，该方法包括(i)提供包含编码氨基酸序列的核酸的细胞。糖蛋白，和(ii)在低于36.0℃的温度下培养所述细胞。此外，其中描述了产生包含具有增加的唾液酸化的N-聚糖的糖蛋白的方法，其包括(i)提供包含编码包含截短的冯维勒布兰德因子(VWF)的多肽的核酸和编码α-2,6-唾液酸转移酶的重组核酸的细胞，和(ii)在允许糖蛋白和α-2,6-唾液酸转移酶表达的条件下培养细胞。
上述实施例可以彼此组合。上述任何百分比的N-聚糖，或唾液酸化程度的任何指示，应理解为平均百分比或度数，即它们是指分子群，而不是指单个分子。很明显，糖蛋白群体中各糖蛋白分子的糖基化或唾液酸化将显示出一些异质性。
【二聚体】
本发明的多肽优选具有高比例的二聚体。因此，本发明的多肽优选以二聚体形式存在。因此，本发明的多肽优选以二聚体形式存在。在一个实施方式中，至少50％，或至少60％，或至少70％的多肽以二聚体形式存在。在另一个实施方式中，本发明多肽的二聚体：单体的比例为至少1.5，优选至少2，更优选至少2.5或至少3.最优选地，本发明的所有多肽均以二聚体形式存在。二聚体的使用是有利的，因为与单体相比，二聚体对因子VIII具有改善的亲和力。二聚体含量和本发明多肽的二聚体与单体的比例可如实施例中所述测定。
在一个实施方式中，本发明的多肽对因子VIII的亲和力大于人天然VWF对同一因子VIII分子的亲和力。因子VIII亲和力可以指人天然因子VIII，或指由SEQ ID NO：5表征的因子VIII分子。
已经发现，具有高比例二聚体的本发明多肽的制剂确实对因子VIII具有增加的亲和力。对因子VIII的这种增加的亲和力确实导致通过本发明的多肽增强的因子VIII的稳定性。作为增加的二聚体比例的替代或与增加的二聚体比例组合，根据本发明的具有因子VIII结合结构域内的突变的多肽确实增加了对因子VIII的亲和力，是本发明的优选实施方式。合适的突变公开于例如WO2013/120939A1中。
【多肽的制备】
编码本发明多肽的核酸可根据本领域已知的方法制备。基于VWF(SEQ ID NO：3)的cDNA序列，可以设计和产生编码本发明的上述截短的VWF构建体或多肽的重组DNA。
即使由宿主细胞分泌的多肽不包含VWF的氨基酸1～763，优选编码多肽的细胞内前体的核酸(例如DNA)包含编码氨基酸序列的核苷酸序列。具有与SEQ ID NO：4的氨基酸23～763或优选至氨基酸1～763的至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。最优选地，编码多肽的细胞内前体的核酸(例如DNA)包含编码SEQ ID NO：4的氨基酸23～763或SEQ ID NO：4的氨基酸1～763的核苷酸序列。
其中DNA含有以正确方向插入表达质粒的完整开放阅读框的构建体可用于蛋白质表达。典型的表达载体含有启动子，其指导与携带质粒的细胞中插入的核酸相对应的大量mRNA的合成。它们还可以包括允许其在宿主生物体内自主复制的复制起点序列，以及提高合成mRNA翻译效率的序列。通过使用例如病毒(例如来自Epstein Barr病毒基因组的OriP序列)的调节元件，可以将稳定的长期载体维持为自由复制的实体。还可以产生将载体整合到基因组DNA中的细胞系，并且以这种方式连续产生基因产物。
通常，通过将编码本发明多肽的核酸引入哺乳动物宿主细胞中来获得待提供的细胞。
根据本发明，可以使用对细胞培养敏感的任何宿主细胞和糖蛋白的表达。在某些实施方式中，宿主细胞是哺乳动物细胞。可根据本发明使用的哺乳动物细胞的非限制性实例包括BALB/c小鼠骨髓瘤系(NSO/1，ECACC No：85110503)；人视网膜细胞(PER.C6(CruCell，Leiden，The Netherlands))；由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(293或293细胞亚克隆用于在悬浮培养中生长，Graham等，J.Gen Virol。，36：59，1977)；小仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)；中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216，1980)；小鼠支持细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod。，23：243 251，1980)；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1 587)；人宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(HepG2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等，AnnalsNY.Acad.Sci。，383：44-68，1982)；MRC 5细胞；PS4细胞；人羊膜细胞(CAP)；和人肝癌细胞系(Hep G2)。优选地，细胞系是啮齿动物细胞系，尤其是仓鼠细胞系，例如CHO或BHK。
适合于引入足以实现感兴趣的糖蛋白表达到哺乳动物宿主细胞中的核酸的方法是本领域已知的。参见，例如，Gething等，Nature，293：620-625，1981；Mantei等，Nature，281：40-46，1979；莱文森等人。EP 117,060；和EP 117,058。对于哺乳动物细胞，将遗传物质引入哺乳动物细胞的常用方法包括Graham和van der Erb的磷酸钙沉淀法(Virology，52：456-457，1978)或者LipofectamineTM(Gibco BRL)Hawley-Nelson的方法(焦点)1993年15：73)。Axel在美国已经描述了哺乳动物细胞宿主系统转化的一般方面。拍。第4,399,216号。对于将遗传物质导入哺乳动物细胞的各种技术，参见Keown等，Methods in Enzymology，1989，Keown等，Methods in Enzymology，185：527-537，1990，和Mansour等，Nature，336：348-348，1988。
在允许多肽表达的条件下培养细胞。可以使用本领域技术人员已知的方法回收和纯化多肽。
【内源性FVIII的时间-浓度曲线下的最大浓度和面积】
根据本发明的优选方面，通过单独施用本发明的多肽，即不共同施用FVIII，与未治疗的受试者相比，如上文所定义的多肽用于增加内源因子VIII的Cmax或AUC。
最大浓度(Cmax)是测量的最高血浆浓度值。在施用所述重组多肽后，FVIII的Cmax可以是至少10mIU/mL，至少25mIU/mL，至少50mIU/mL，至少100mIU/mL，至少200mIU/mL，至少300mIU/mL或至少400mIU/mL。
AUC0-t是从零到最后测量的时间点的血浆浓度-时间曲线下的峰面积。施用重组多肽后，内源性FVIII增加的AUC可以是至少1000mIU*h/mL，至少2000mIU*h/mL，至少3000mIU*h/mL，至少5000mIU*h/mL，至少10000mIU*h/mL或至少20000mIU*h/mL生色FVIII活性。
【皮下给药后rD'D3-FP的生物利用度】
本发明的另一方面涉及提供或改善如上文所定义的多肽的皮下生物利用度。
如本文所用，术语生物利用度定义为皮下注射后本发明多肽的AUC0-inf的百分比。施用后，与静脉注射后本发明多肽的AUC0-inf有关。管理。AUC0-inf是血浆浓度-时间曲线下从零到无穷大的面积。为了评估用于计算AUC0-inf的药代动力学数据，应用两室模型(双相药代动力学曲线)。
根据某些实施方式，在不共同施用的FVIII的情况下，重组多肽的生物利用度为至少30％，优选至少35％，更优选至少40％，至少45％或至少50％。
根据某些实施方式，与FVIII共同施用后重组多肽的生物利用度为至少30％，优选至少35％，更优选至少40％，至少45％或至少50％。
【治疗凝血障碍】
本发明的另一方面是治疗凝血障碍的方法，包括对有此需要的患者施用有效量的如上文所定义的多肽。
本发明的多肽可用于治疗血液凝固障碍，包括血友病A和血管性血友病。术语“血友病A”是指功能性凝血FVIII的缺乏，其通常是遗传的。von-Willebrand病选自2型von-Willebrand病，3型von-Willebrand病和1型von-Willebrand病。
在另一个实施方式中，凝血障碍是1型von-Willebrand病，其特征在于治疗前的内源性FVIII的活性水平与NHP中的内源性FVIII的活性水平相比降低。
与NHP中的内源性FVIII相比，待治疗的患者可具有降低的活性和/或内源性FVIII水平。患者中的内源性FVIII活性可小于80％，或小于70％，或小于60％，或小于50％，或小于40％，或小于30％，或小于20％，NHP中内源性FVIII活性的低于或小于20％，或小于10％，或小于5％。待治疗患者的内源性FVIII活性可低于0.8IU/ml，或低于0.7IU/ml，或低于0.6IU/ml，或低于0.5IU/ml，或低于0.4IU/ml。，或小于0.3IU/ml，或小于0.2IU/ml，或小于0.1IU/ml，或小于0.05IU/ml的全血。
将本发明的多肽施用具有至少0.005IU/mL的内源性FVIII活性的患者。在某些实施方式中，将本发明的多肽施用于内源性FVIII活性为0.01～0.4IU/ml，或0.02～0.3IU/ml，或0.03～0.2IU/ml，或0.04～0.1IU的患者。/ml全血。
在一个实施方式中，凝血障碍是中度血友病A.中度血友病A优选地特征在于内源性FVIII的活性水平，其为在NHP中内源性FVIII的活性水平的约1％至约5％。通常，患有中度血友病A的受试者在血浆中具有0.01～0.05IU/mL的内源性FVIII的活性水平。
在另一个实施方式中，凝血障碍是轻度血友病A.轻度血友病A优选地特征在于内源性FVIII的活性水平，其为在NHP中内源性FVIII的活性水平的约5％至约40％。通常，患有轻度血友病A的受试者在血浆中具有0.05～0.4IU/mL的内源性FVIII的活性水平。
在另一个实施方式中，凝血障碍是严重的血友病A.严重血友病A的特征在于内源性FVIII的活性水平低于NHP中内源性FVIII活性的1％。
在另一个实施方式中，凝血障碍是2N型von-Willebrand病。2型Von-Willebrand病的优选特征在于治疗前的内源性FVIII的活性水平，其在约3IU/dL至约30IU/dL FVIII活性水平的范围内，相当于内源性的约3％至约30％。NHP中的FVIII活性水平。大多数患者的内源性FVIII的活性水平低于20IU/dL，因此水平低于在NHP中内源性FVIII的活性水平的20％。因此，具有2N型von-Willebrand病的受试者在血浆中具有0.03IU/mL至0.3IU/mL的内源性FVIII的活性水平，通常低于0.2IU/mL。
在另一个实施方式中，凝血障碍是von-Willebrand病3型，优选地特征在于治疗前的内源性FVIII的活性水平，其通常在约1IU/dL至约20IU/dL的范围内，对应于约1的FVIII活性水平。在NHP中内源性FVIII的活性水平的％至约20％。大多数患者的内源性FVIII的活性水平低于10IU/dL，因此水平低于在NHP中内源性FVIII的活性水平的10％。
优选将本发明的多肽施用受试者以预防出血事件。该治疗不包括施用任何外源性FVIII。本发明的多肽还可以施用于受试者以治疗出血事件。在那种情况下，本发明的多肽可以与外源FVIII共同施用。在出血事件的这种治疗之后，然后进行随访治疗而不共同施用外源性FVIII。也就是说，仅用本发明的多肽进行后续治疗。
通常，单独用本发明的多肽处理，即不共同施用外源FVIII，持续进行直至出现出血事件。单独使用本发明多肽治疗的持续时间，即不共同施用外源性FVIII，没有特别限制，通常持续至少一周，或至少两周，或至少三周，或至少四周，或至少两个月。
疾病的治疗包括在任何临床阶段或表现中治疗已经诊断为患有任何形式疾病的患者；延迟疾病的症状或体征的发作或进展或恶化或恶化；和/或预防和/或降低疾病的严重程度。
施用本发明多肽的“受试者”或“患者”优选是人。在某些方面，人是儿科患者。在其他方面，人是成年患者。
本文描述了包含本发明多肽和任选FVIII的组合物。该组合物通常作为包含药学上可接受的媒质的无菌药物组合物的一部分提供。该组合物可以是任何合适的形式(取决于将其施用患者的所需方法)。
术语“因子VIII”和“FVIII”在本文中可互换使用，包括血浆衍生的FVIII和重组FVIII。重组FVIII包括但不限于全长FVIII以及双链B结构域缺失或截短变体以及单链B结构域缺失或截短变体，例如WO2004/067566中描述的那些和具有突变的其他FVIII变体。在B结构域外，但具有FVIII的生物活性。
本发明的多肽可以通过多种途径施用患者，例如口服，透皮，皮下，鼻内，静脉内，腹膜内，肌肉内，局部或局部。在任何给定病例中，最合适的给药途径取决于特定多肽，受试者，疾病的性质和严重程度以及受试者的身体状况。通常，本发明的多肽将静脉内施用。
根据本发明，用本发明的多肽治疗的患者也可用凝血因子VIII治疗，条件是仅用本发明的多肽进行后续治疗，即不与外源性共同给药。FVIII。本发明的多肽和因子VIII可以同时或以顺序方式给药，两种给药方式均包括在术语“联合治疗”和“共同给药”中。本发明的多肽和因子VIII可以作为混合物给药，即在相同的组合物内，或分开给药，即作为单独的组合物给药。
多肽和任选的FVIII优选静脉内或皮下给药。
在第一个实施方式中，多肽和任选的FVIII都是静脉内给药的。在第二个实施方式中，皮下施用多肽和任选的FVIII。
在另一个实施方式中，静脉内施用FVIII，并且通过不同途径施用多肽。在进一步的实施方式中，皮下施用多肽，并且通过不同途径施用FVIII。例如，可以皮下施用多肽，并且可以静脉内施用FVIII。
在进一步的实施方式中，皮下施用FVIII，并且通过不同途径施用多肽。在进一步的实施方式中，静脉内施用多肽，并且通过不同途径施用FVIII。例如，可以静脉内施用多肽，并且可以皮下施用FVIII。
用本发明的多肽确定剂量总数和治疗时间长度完全在本领域技术人员的能力范围内。待施用的本发明多肽的剂量可取决于内源性FVIII的浓度，待治疗患者中内源性VWF的浓度，或两者。考虑到本发明多肽的分子量，本领域技术人员可以确定基于本文所述比例的有效剂量。FVIII的典型剂量可以为约20U/kg体重至约100U/kg体重。
所用组合物中因子VIII的浓度通常为10～10,000IU/mL。在不同的实施方式中，本发明组合物中FVIII的浓度范围为10～8,000IU/mL，或10～5,000IU/mL，或20～3,000IU/mL，或50～1,500IU/mL，或3,000IU/mL，或2,500IU/mL，或2,000IU/mL，或1,500IU/mL，或1,200IU/mL，或1,000IU/mL，或800IU/mL，或750IU/mL，或600IU/mL，或500IU/mL，或400IU/mL，或300IU/mL，或250IU/mL，或200IU/mL，或150IU/mL，或125IU/mL，或100IU/如果满足关于如本文定义的本发明的VWF多肽的比例的要求，则为mL，或62.5IU/mL，或50IU/mL。
“国际单位”或“IU”是FVIII的血液凝固活性(效力)的测量单位，通过FVIII活性测定法测量，例如一步凝固测定法或使用标准校准的生色底物FVIII活性测定法。反对以“IU”校准的国际标准准备。一个阶段凝血测定法是本领域已知的，如在N-李，马丁L，等人，预稀释的上FVIII浓缩物，血栓形成研究的效力测定中的影响(Pergamon出版社有限公司)30，描述511 519(1983)。所述一个阶段测定的原理：该试验的活化部分凝血酶时间(APTT)-assay的修改版本中执行：血浆孵育的磷脂和表面活性剂导致的固有凝血系统因子的活化。钙离子的添加触发凝血级联。确定形成可测量的纤维蛋白凝块的时间。在因子VIII缺乏的血浆存在下进行测定。通过待测样品中包含的凝血因子VIII恢复缺乏血浆的凝固能力。凝血时间的缩短与样品中存在的因子VIII的量成比例。凝血因子VIII的活性通过与国际单位中具有已知活性因子VIII的标准制剂直接比较来量化。
另一种标准测定是生色底物测定。可以商业购买生色底物测定，例如coamaticFVIII测试试剂盒(Chromogenix-Instrumentation Laboratory SpA V.le Monza 338-120128Milano，Italy)。生色测定的原理：在钙和磷脂的存在下，因子X被因子IXa活化为因子Xa。因子VIIIa作为辅因子刺激该反应。FVIIIa由待测样品中来自FVIII的反应混合物中的少量凝血酶形成。当使用最佳浓度的Ca2+，磷脂和因子IXa以及过量的因子X时，因子X的活化与因子VIII的效力成比例。活化因子X从生色底物S-2765释放生色团pNA。因此，在405nm处测量的pNA释放与形成的FXa的量成比例，因此也与样品的因子VIII活性成比例。
根据多肽用途的一些优选实施方式，在将所述多肽施用至至少1％，或优选至少2％，至少5％，至少10％的水平后，内源性FVIII水平增加。内源性FVIII的活性水平的至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或至少100％在正常人血浆(NHP)中。
在进一步优选的实施方式中，在将所述多肽施用至1％至500％，优选1％至400％，1％至300％，1％至200％的水平之后，内源性FVIII水平增加。正常人血浆(NHP)中内源性FVIII的活性水平的％，1％至150％，或1％至100％。
在进一步优选的实施方式中，在将所述多肽施用至5％至400％，优选5％至300％，10％至200％，10％至150％的水平后，内源性FVIII水平增加。正常人血浆(NHP)中内源性FVIII的活性水平的％，20％至150％，或40％至150％。
在进一步优选的实施方式中，在将所述多肽施用至本文所述的水平后，内源性FVIII水平增加，由此调节施用的多肽的剂量和/或多肽的施用频率以实现所述内源水平。受试者中的FVIII水平。
【比】
在某些实施方式中，本发明的多肽与外源性FVIII一起共同施用，用于治疗出血事件或用于开始预防性治疗方案，其中对于后续治疗，施用所述多肽而不共同施用外源性FVIII。对于包含本发明多肽与外源FVIII共同施用的那些实施方式，本发明的多肽优选以一定剂量施用，使得待施用的多肽与外源FVIII的摩尔比大于50。
本发明的多肽可以是单体，二聚体或其混合物。根据本发明的任何摩尔比是指本发明多肽的单体亚基的摩尔浓度与实际存在的单体或二聚体的比率。在内源性FVIII的摩尔浓度上形成比例，或者至少对于某些实施方式，在共同施用的FVIII的摩尔浓度上或在内源性VWF亚单位的摩尔浓度(如果存在的话)上形成比率。在本申请中，本发明的多肽与FVIII的任何比例是指本发明的多肽中包含的单体的量，其优选以二聚体形式存在，以(以摩尔计)除以待施用的FVIII的量。(除非另有说明)。作为非限制性实例，将100μM本发明的单体多肽与1μM的FVIII共同施用意指比率为100.如果50μM的本发明的二聚体多肽是100，则获得相同的比率100。与1μM的FVIII共同施用。
如果存在，内源性VWF是存在于动物或人的血浆中的VWF，其与本发明的多肽一起给药。它通常由大约2～40个VWF单体亚基的一系列不同的寡聚体组成。除非另有说明，本申请中本发明的多肽与内源性VWF的任何比例是指在施用本发明的多肽后立即每千克体重的受治疗者的摩尔血浆浓度除以摩尔数。每kg体重治疗受试者的内源性VWF的血浆浓度。本发明多肽的本发明多肽的摩尔血浆浓度是在施用本发明多肽后立即治疗的受试者每千克体重，假定在40ml血浆体积给药后直接施用本发明多肽的稀释度。公斤。出于本发明的目的，假定静脉内施用后立即施用的本发明多肽的量与施用的量相同。
根据本发明的一个方面，本发明的多肽与内源性VWF的摩尔比大于0.5。待治疗的受试者血浆中内源性VWF的浓度可通过ELISA或活性测定法测定，例如，如实施例中所述。通常，测量的浓度将以U/mL给出。该值可以转换成如下所述的摩尔浓度。
根据定义，正常人血浆(NHP)含有浓度为1U/mL或100％的VWF。这相当于蛋白质浓度约为10μg/mL(Haberichter SL和Montgomery RR，von Willebrand因子的结构和功能；在：Hemostasis and Thrombosis，eds.Marder，Aird，Bennett，Schulman和White，Lippincott Williams&Wilkins 2013，第197-207页)。基于NHP中的这种VWF浓度和成熟的VWF单体的分子量为约267,500Da，包括18～19％的糖基化，可以计算出约37×10-9Mol/L的VWF单体单元的摩尔血浆浓度。NHP。
为了分别计算正常大鼠或兔血浆中大鼠或兔VWF亚基的摩尔浓度，使用与人VWF相当的单体亚基的分子量(267,500Da)以及假设的可比比活性(100U/mg))和测量的大鼠或兔血浆中的内源性VWF活性(也参见实施例)。
人群中VWF的浓度在NHP中VWF浓度的约60％至约200％之间变化。在本发明的某些实施方式中，内源性VWF的浓度定义为NHP中的浓度。在其他实施方式中，在待治疗的受试者中测定内源性VWF的浓度，并且多肽的剂量基于该个体值。
施用于内源性VWF的本发明多肽的摩尔比优选为至少2，或至少3，或至少4，或至少5，或至少6，或至少7，或至少8，或至少9，或至少10，更优选至少15，或至少20，或至少25，或至少30，最优选至少40，或至少50，或至少75。
待施用于内源性VWF的本发明多肽的摩尔比可以为0.5～1,000，或1～500，或2～400，或3～300，或4～250，或5优选地，施用本发明多肽与内源性VWF的摩尔比范围为200，或6～150，或7～140，或8～130，或9～120，或10～110。优选地，本发明的多肽与内源性VWF的摩尔比范围为3～100，或4～90，或5～80，或6～75，或10～60。
待施用于内源性FVIII的本发明多肽的摩尔比优选为至少2，或至少5，或至少10，或至少20，或至少30，或至少40，或至少50。更优选该比例大于50，或至少75，至少100，或大于100，或至少200，最优选至少300，或至少400，或至少500。
待施用于内源性FVIII的本发明多肽的摩尔比可以为2～10,000，或5～5,000，或10～4,000，或20～3,000，或30～2,000，或40～40。1000。优选地，待施用的本发明多肽与内源性FVIII的摩尔比为60～2,500，或110～2,000，或150～1,500，或200～1,000。
待施用的本发明多肽与待施用的外源FVIII的摩尔比优选为至少2，或至少5，或至少10，或至少20，或至少30，或至少40。或者至少50，或更优选该比率大于50，或至少75，至少100，或大于100，或至少200，最优选至少300，或至少400，或至少500。
待施用的本发明多肽与共同施用的FVIII的摩尔比可以为2～10,000，或5～5,000，或10～4,000，或20～3,000，或30～2,000，或40～1,000。待施用的本发明多肽与共同施用的FVIII的摩尔比可优选为50～10,000，或50～5,000，或50～4,000，或50～3,000，或50～2,000。，或从50到1,000。优选地，待施用的本发明多肽与共同施用的FVIII的摩尔比为60～2,500，或110～2,000，或150～1,500，或200～1,000。
【药物组合物】
适合于本文所述方法的本发明多肽的治疗制剂可通过将具有所需纯度的多肽与本领域通常使用的任选的药学上可接受的媒质，赋形剂或稳定剂混合而制备成作为冻干制剂或水溶液储存。(所有这些在本文中称为“媒质”)，即缓冲剂，稳定剂，防腐剂，等渗剂，非离子型洗涤剂，抗氧化剂和其他各种添加剂。参见Remington's PharmaceuticalSciences，第16版(Osol，ed.1980)。在所用的剂量和浓度下，这些添加剂必须对接受者无毒。
缓冲剂有助于将pH维持在接近生理条件的范围内。它们可以以约2mM至约50mM的浓度存在。合适的缓冲剂包括有机酸和无机酸及其盐，例如柠檬酸盐缓冲剂(例如，柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物，柠檬酸-柠檬酸三钠混合物，柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)，琥珀酸盐缓冲剂(例如，琥珀酸盐)。酸-一钠琥珀酸盐混合物，琥珀酸-氢氧化钠混合物，琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)，酒石酸盐缓冲液(如酒石酸-酒石酸钠混合物，酒石酸-酒石酸钾混合物，酒石酸-氢氧化钠混合物，等)，富马酸盐缓冲液(如富马酸-富马酸单钠混合物，富马酸-富马酸二钠混合物，富马酸一钠-富马酸二钠混合物等)，葡萄糖酸盐缓冲液(如葡萄糖酸-葡萄糖酸钠混合物，葡萄糖酸钠氢氧化物混合物，葡萄糖酸-葡萄糖酸钾混合物等)，草酸盐缓冲液(如草酸-草酸钠混合物，草酸-氢氧化钠混合物，草酸-草酸钾)混合物等)，乳酸盐缓冲液(如乳酸-乳酸钠混合物，乳酸-氢氧化钠混合物，乳酸-乳酸钾混合物等)和醋酸盐缓冲液(如乙酸-乙酸钠混合物，乙酸-氢氧化钠混合物等)。另外，可以使用磷酸盐缓冲液，组氨酸缓冲液和三甲胺盐如Tris。
可以添加防腐剂以阻止微生物生长，并且可以以0.2％-1％(w/v)的量添加。合适的防腐剂包括苯酚，苯甲醇，间甲酚，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯，十八烷基二甲基苄基氯化铵，苯甲醛卤化物(例如氯化物，溴化物和碘化物)，氯化六甲基铵和对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯，儿茶酚，间苯二酚，环己醇和3-戊醇。可加入有时称为“稳定剂”的等渗剂以确保液体组合物的等渗性，并包括多元醇糖醇，优选三元或更高级的糖醇，例如甘油，赤藓糖醇，阿拉伯糖醇，木糖醇，山梨糖醇和甘露糖醇。稳定剂是指广泛类型的赋形剂，其功能范围可以从填充剂到添加剂，其可溶解治疗剂或有助于防止变性或粘附到容器壁上。典型的稳定剂可以是多元糖醇(以上列举)；氨基酸，如精氨酸，赖氨酸，甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，丙氨酸，鸟氨酸，L-亮氨酸，2-苯丙氨酸，谷氨酸，苏氨酸等，有机糖或糖醇，如乳糖，海藻糖，水苏糖，甘露醇，山梨糖醇，木糖醇，核糖醇，肌醇，半乳糖醇，甘油等，包括诸如肌醇的环醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，如尿素，谷胱甘肽，硫辛酸，硫代乙醇酸钠，硫代甘油，α-硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(例如，10个残基或更少的肽)；蛋白质如人血清白蛋白，牛血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮单糖，如木糖，甘露糖，果糖，葡萄糖；乳糖，麦芽糖，蔗糖等三糖类和棉子糖等三糖类；和多糖如葡聚糖。稳定剂可以以每重量份活性蛋白质0.1～10,000重量的范围存在。
可以添加非离子表面活性剂或洗涤剂(也称为“润湿剂”)以帮助溶解治疗剂以及保护治疗性蛋白质免受搅动诱导的聚集，这也允许制剂暴露于剪切表面应力不会导致蛋白质变性。合适的非离子表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、80等)，聚氧乙烯醚(184、188等)，Pluronic多元醇，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚(-20，-80等)。非离子表面活性剂可以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml的范围存在，或者以约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的范围存在。
另外的各种赋形剂包括填充剂(例如淀粉)，螯合剂(例如EDTA)，抗氧化剂(例如抗坏血酸，甲硫氨酸，维生素E)和助溶剂。
除了本发明的多肽之外，本文的制剂还可以含有第二种治疗剂。以下提供合适的第二治疗剂的实例。
给药方案可以从每月一次到每天一次，这取决于许多临床因素，包括疾病类型，疾病严重程度和患者对本发明多肽的敏感性。在具体的实施方式中，施用本发明的多肽，每周两次，每5天，每周一次，每10天，每两周，每三周，每四周或每月一次，或在任何两个之间的任何范围内。上述值，例如从每四周到每个月，从每10天到每两周，或每周两到三次等。
待施用的本发明多肽的剂量将根据特定多肽，受试者，疾病的性质和严重程度，受试者的身体状况，治疗方案(例如，第二治疗剂是否是用过的)和选定的给药途径；本领域技术人员可以容易地确定合适的剂量。
本领域技术人员将认识到，本发明多肽的各个剂量的最佳量和间隔将由所治疗病症的性质和程度，给药的形式，途径和部位以及所治疗的特定受试者的年龄和状况，以及医生将最终确定要使用的适当剂量。该剂量可以适当地重复进行。如果产生副作用，则可以根据正常的临床实践改变或减少剂量的量和/或频率。
序列表中显示的核苷酸和氨基酸序列总结在表1中。
【表1】
以下实施例说明了本发明，但不应解释为将本发明限制于下文所述的具体实施方式。
【实施例】
【实施例1：施用rD'D3-FP后血浆中的FVIII水平分析】
我们的目的是表征rD'D3-FP对内源性FVIII水平的影响，从而通常支持治疗具有低水平VWF和功能性内源性FVIII的轻度至中度或重度血友病A患者或某些类型的冯维勒布兰德病。我们用不同的方法研究了这种效应：
静脉内施用具有正常内源性FVIII和VWF水平的模型，即大鼠(实施例1.1)，兔(实施例1.2)和猴(实施例1.3)，以研究在健康受试者中静脉内(iv)施用rD'D3-FP后内源性FVIII的潜在进一步增加。
静脉内施用由于VWF缺乏而具有低FVIII水平的模型，即VWF ko大鼠(实施例1.4)和VWF ko小鼠(实施例1.5)，以研究在患病受试者中静脉内施用rD'D3-FP后内源性FVIII增加的大小。
向由于VWF缺乏而具有低FVIII水平的模型，即VWF ko大鼠静脉内施用，以研究在患病受试者中静脉内施用rD'D3-FP变体后内源性FVIII增加的大小(实施例1.6)。
对向具有正常或低FVIII水平的模型，即猪，FVIII ko和VWF ko小鼠以及FVIII ko和VWF ko大鼠皮下施用(实施例1.7)进行研究，以比较rD'D3-FP的静脉内和皮下生物利用度以及对内源性FVIII的影响。
最后的实验研究了多种rD'D3-FP剂量(静脉内)在VWF ko大鼠中的作用(实施例1.8)。
在血友病A模型，即在FVIII ko大鼠(实施例1.9)中的研究rD'D3-FP皮下施用和rVIII-单链静脉内施用。
【材料和方法】
对于实施例，使用包含具有SEQ ID NO：2中所定义的氨基酸序列的截短的VWF的多肽。该特定融合蛋白由1～479的N-末端氨基酸序列组成，代表VWF D'D3区域(人天然VWF的氨基酸764～1242)，接着是31个氨基酸的甘氨酸/丝氨酸接头肽和511～1095的C-末端人白蛋白氨基酸序列。此具有SEQ ID NO：2中定义的序列的融合蛋白在下文中称为rD'D3-FP或rD'D3-FP WT。
作为半衰期延长多肽(HLEP)的白蛋白的替代物，在一些实施例中，使用了另一半衰期延长的rD'D3变体，代替白蛋白而将CTP(人绒毛膜促性腺激素-β亚基的C-末端肽)通过甘氨酸/丝氨酸接头与D'D3融合，所述融合蛋白在下文称为rD'D3-CTP的。融合蛋白rD'D3-CTP具有SEQ ID NO：7中定义的序列。
在某些实施例中，使用rD'D3-FP的高亲和力变体。一种特定的变体融合蛋白由1～479的N-末端氨基酸序列组成，代表VWF D'D3区域(人天然VWF的氨基酸764～1242)，接着是31个氨基酸的甘氨酸/丝氨酸接头肽和511～1095的C-末端人白蛋白氨基酸序列，条件是在所述多肽的D'结构域内存在两个氨基酸取代，即S764E和S766Y。该融合蛋白由SEQ ID NO：2中定义的序列组成，在D'D3区内具有所述两个取代，即S764E和S766Y。VWF氨基酸S764对应于SEQ ID NO：2序列内的氨基酸编号1(也参见表1)。如WO 2016/000039A1中所述生成rD'D3-FP EY变体。所述变体在下文中称为rD'D3-FP EY。
在某些实施例中，使用rD'D3-FP的另一种高亲和力变体。该特定变体融合蛋白由1～479的N-末端氨基酸序列组成，代表VWF D'D3区域(人天然VWF的氨基酸764～1242)，接着是31个氨基酸的甘氨酸/丝氨酸接头肽和511～1095的C-末端人白蛋白氨基酸序列，条件是在所述多肽的D'D3结构域内存在三个氨基酸取代，即S764E，S766Y和V1083A。该融合蛋白由SEQ ID NO：2中定义的序列组成，在D'D3区内具有所述三个取代S764E，S766Y和V1083A。所述变体在下文中称为rD'D3-FP EYA。
【分析】
在所有实施例中，rD'D3-FP以通过人白蛋白ELISA(即测量蛋白质的白蛋白部分)定量的剂量水平施用。该rD'D3-FP ELISA用于制剂和血浆样品(显示相关的人白蛋白交叉反应性的猴血浆样品除外)。
在使用rD'D3-CTP作为rD'D3变体的实施例中，以通过OD280测量定量的剂量水平施用多肽，并将蛋白质量调节至与rD'D3-FP相同的高范围的摩尔浓度。
(“标准”)rD'D3-FP ELISA使用来自Bethyl Laboratories，Inc.(Montgomery，USA)的多克隆山羊抗人白蛋白捕获抗体。检测溶液由多克隆过氧化物酶标记的抗人白蛋白检测抗体制剂(Bethyl Laboratories Inc.，Montgomery，USA)组成。使用来自SiemensHealthcare(Eschborn，德国)的生色读数(即TMB)在停止后直接在酶标仪(ELx808，BioTek，USA)中在450/650nm处进行定量。作为标准物，使用含有rD'D3-FP的药物制剂。rD'D3-FP量以mg白蛋白给出，即没有对分子的D'D3部分进行调整。
将猴血浆样品的rD'D3-FP ELISA设置为混合ELISA，其中捕获D'D3结构域并检测白蛋白结构域。该测定使用抗D'D3单克隆捕获抗体(CSL Behring，在室内研究级制剂中)。检测溶液由多克隆过氧化物酶标记的抗人白蛋白检测抗体制剂(Bethyl LaboratoriesInc.，Montgomery，USA)组成。使用来自Siemens Healthcare(Eschborn，德国)的生色读数(即TMB)在停止后直接在酶标仪(ELx808，BioTek Instruments Inc.，Winooski，USA)中在450/650nm处进行定量。作为标准物，使用含有rD'D3-FP的药物制剂。rD'D3-FP量以mg白蛋白给出，即没有对分子的D'D3部分进行调整。
在抗-D'D3ELISA中测量含有rD'D3-CTP的PK的血浆样品。用两种单克隆抗人D'D3抗体以夹心形式进行该抗D'D3ELISA。用于捕获和检测的两种抗体均来自内部研究制备物。抗人D'D3检测抗体是过氧化物酶标记的。使用来自Siemens Healthcare(Eschborn，德国)的生色读数(即TMB)在停止后直接在酶标仪(ELx808，BioTek Instruments Inc.，Winooski，USA)中在450/650nm处进行定量。作为标准物，使用含有rD'D3-CTP的药物制剂。rD'D3-CTP量以rD'D3-CTP浓度给出。
根据测试说明书，用来自Stago，S.A.S.，France的FVIII Asserachrom ELISA测试试剂盒测定人FVIII:Ag血浆水平。Asserachrom测试包含有除停止溶液外的所有试剂，该溶液得自Siemens Healthcare(Eschborn，德国)。作为标准物，使用含有rVIII-单链的药物制剂。
在来自Siemens Healthcare Diagnostics的BCS XP分析仪(Marburg，德国)上，根据制造商的测试说明书，由FVIII测定法(FVIII:C chromogenic assay，Chromogenix，Instrumentation Laboratory SpA，Milan，意大利)检测FVIII生色活性血浆水平。为了校准，使用标准人血浆。或者，通过相同的FVIII测定法，用来自Siemens Healthcare Diagnostics(Marburg，德国)的人FVIII缺乏血浆中的样品预稀释检测它们，然后读取来自Tecan的Infinite M200ELISA读数器(Tecan Trading AG，瑞士)。为了校准，使用来自CSL Behring的含有人血浆衍生的冯维勒布兰德因子和FVIII的产品P。在没有参考的情况下在405nm下测量样品。通常，FVIII生色活性缩写为FVIII:C。
使用一步凝固测定法检测FVIII凝固活性血浆水平，所述一步凝固测定法包括SL，人FVIII缺乏血浆和氯化钙溶液，它们均可从Siemens HealthcareDiagnostics(Marburg，德国)商购获得。测量在来自Siemens Healthcare Diagnostics(Marburg，德国)的BCS XP分析仪上进行。为了校准，使用标准人血浆。
使用SL试剂(小鼠和大鼠)或FSL(兔)和氯化钙溶液在来自Siemens Healthcare Diagnostics(Marburg，德国)的BCS XP分析仪上分析血浆样品中活化的部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)。所有试剂均可从Siemens HealthcareDiagnostics(Marburg，德国)商购获得。
【实验动物】
【FVIII ko小鼠】
选择FVIII ko小鼠(代表血友病A表型)，因为它们缺乏FVIII基因的外显子16和17，因此没有血浆因子VIII活性(Bi L.等，Nature genetics，1995，Vol 10(1))，119-121；Bi L.等，Blood，1996，Vol88(9)，3446-3450)。这允许通过定量这些小鼠的血浆中的FVIII活性来分析用FVIII处理后的FVIII活性水平。
【FVIII ko大鼠】
代表血友病A表型的FVIII ko大鼠使用CRISPR/Cas9技术在SAGE Labs(A HorizonDiscovery Group Company，Saint Louis，MO63146，USA)产生。诱导外显子18内23471～23472位的2bp(碱基对)缺失和1bp插入，导致早期终止密码子。产生的FVIII ko突变导致FVIII ko大鼠具有破坏的FVIII功能。这允许通过定量这些大鼠血浆中的FVIII活性来分析用FVIII处理后的FVIII活性水平。
【VWF ko小鼠】
选择VWF敲除(ko)小鼠(代表VWD表型)，因为它们缺乏VWF基因的外显子4和5，因此没有血浆VWF活性(Denis C.等，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，1998，Vol 95，9524-9529)。这允许分析D'D3多肽对这些小鼠血浆中内源性FVIII的活性水平的影响。
【VWF ko大鼠】
代表VWD表型的VWF ko大鼠使用CompoZrTM锌指核酸酶(ZFN)技术和SAGEspeedTM动物敲除生产方法在Sigma Advanced Genetic Engineering(SAGE)Labs(Saint Louis，MO63146，USA)中产生。在外显子7中在位点33926bp-33941bp处诱导16bp(碱基对)缺失导致早期终止密码子。通常使用Sigma Advanced Genetic Engineering(SAGE)Labs(Sigma-Aldrich Biotechnology)的ZFN技术产生敲除大鼠在X.Cui等人(Nature Biotechnology，2010)，MH.Porteus&D.Carroll(Nature Biotechnology，2005)中描述。产生的VWF ko突变导致VWF ko大鼠具有破坏的VWF功能。这允许分析D'D3多肽对这些大鼠血浆中内源性FVIII的活性水平的影响。
【D'D3白蛋白融合蛋白(D'D3-FP)的产生】
通过定制基因合成(Eurofins Genomics，Ebersberg，德国)制备D'D3-FP的表达盒，其由编码VWF氨基酸1～1242的cDNA，甘氨酸/丝氨酸接头和人白蛋白的cDNA组成。通过侧翼限制性位点(EcoRI，NotI)，从提供的克隆载体中切下表达盒，并插入用EcoRI和NotI线性化的pIRESneo3载体(BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA)。得到的表达质粒含有编码VWF前肽的核苷酸序列，D'和D3(SEQ ID NO：4的VWF氨基酸1～1242)通过CMV启动子控制下的短接头编码序列与白蛋白编码序列融合。编码序列的核苷酸序列显示为SEQ ID NO：1，成熟D'D3-FP的氨基酸序列显示为SEQ ID NO：2。表达期间D1D2VWF前肽(741个氨基酸)的存在对合成多肽的二聚化至关重要。
使用类似的方法产生D'D3融合蛋白的表达质粒通过甘氨酸/丝氨酸接头连接至人绒毛膜促性腺激素-β亚基的C-末端肽，并在融合蛋白的C-末端用8个组氨酸标记。成熟rD'D3-CTP的氨基酸序列显示为SEQ ID NO：7。
如上所述的表达质粒在XL10Gold(Agilent Technologies)中生长，并使用标准方案(Qiagen，Hilden，德国)纯化。
使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)转染CHO K1细胞，并在500～1000μg/ml遗传霉素存在下在无血清培养基(CD-CHO，Invitrogen)中生长。将WO2007/144173中描述的编码PACE/弗林蛋白酶(pFu-797)的表达质粒共转染以最大化前肽切割功效。使单细胞衍生的克隆长大并根据其白蛋白特异性酶免疫测定法定量的D'D3-FP表达产量进行选择(见下文)。最终选择用于D'D3-FP发酵的细胞系称为T2050-CL3。
在灌注模式中应用发酵过程的生物反应器中进行rD'D3-FP的生产。生产rD'D3-FP的发酵过程始于细胞系T2050-CL3的解冻，然后在摇瓶中进行细胞扩增，最后使用Sartorius BioStat B-DCU 5L生物反应器和BioStat STR 50L一次性生物反应器进行灌注模式的发酵过程。BioSeps 10L或200L(Applikon)分别用作细胞保留装置。细胞培养基是具有8mM L-谷氨酰胺和1μM CuSO4的PowerCHO3(Lonza BESP1204)或具有10mM L-谷氨酰胺和1μM CuSO4的ProCHO5(Lonza BESP1072)。
摇瓶中的种子序列在37℃，7.5％CO2下以160rpm的摇床速度进行。
用2.5×105个细胞/mL的靶VCD接种5L生物反应器。在具有8mM L-谷氨酰胺和1μMCuSO4的PowerCHO3中，在+37.0℃的温度，7.00的pH和30％的氧饱和度下培养细胞。在从+37℃运行的生物反应器的初始收获后，进行温度变化至+34.0℃(评估范围+31℃至+35℃)。使用CO2喷射作为酸和NaHCO3作为碱来控制pH。覆盖空气流速设定为0.5L/min。环形分布器用作喷射单元。在下拉模式下，搅拌速率为150rpm，叶片叶轮为2倍。
用3.0×105个细胞/mL的靶VCD接种50L生物反应器。将细胞在含有10mM L-谷氨酰胺和1μM CuSO4的ProCHO5培养基中，在+37.0℃的温度，6.90的pH和30％的氧饱和度下培养。在最初的一次或两次收获后进行温度变化至+34.0℃。PH控制如上，覆盖空气流速设定为2L/min。使用微型分布器作为喷射单元。在下拉模式下，搅拌速率为90rpm，叶片叶轮为2倍。
当生物反应器中的VCD≥1.0×106个细胞/mL时开始灌注。灌注速率设定为1.0体积/体积/天。BioSep在反冲洗模式下运行，运行时间为5(10)分钟，在7(30)W的功率输入下反冲10秒(括号中的数字指50L生物反应器)。在线过滤灌注液和出血，并在+2至+8℃下在48小时内收集在袋中。使用浊度探针通过活性出血来控制VCD，使用葡萄糖消耗作为参数，目标为2g/L葡萄糖。收获和排出在线过滤，每隔一天更换由一次性过滤器和一次性袋组成的收获系统。
为了制备用于下述PK分析的材料，通过亲和和尺寸排阻色谱法纯化收获物。简而言之，使用具有30kD膜的TFF系统(例如Pall Centramate 500S)(例如Pall CentramateOS030T12)将来自生物反应器的无细胞收获物浓缩30倍。将该浓缩物掺入NaCl和EDTA至终浓度为0.75M NaCl和5mM EDTA，并在用pH7.4的20mM Tris缓冲液预平衡的CaptureSelect人白蛋白柱(Life Technologies)上加载过夜。用平衡缓冲液洗涤柱后，用洗脱缓冲液(20mM Tris，2M MgCl2，pH7.4)洗脱rD'D3-FP。然后将洗脱液浓缩10倍并使用具有30kD截留值的超离心过滤器(例如Amicon.UFC903024)对50mM Tris，150mM NaCl，pH 7.4透析。为了将rD'D3-FP二聚体与单体部分分离，将材料加载到用50mM Tris，150mM NaCl，pH7.4预平衡的Superdex 200pg柱(GE Healthcare Code：17-1069-01)上，合并含有D'D3-FP二聚体的峰级分。二聚体和单体峰级分的曲线下面积用于计算二聚物与单体的比率。所述D'D3白蛋白融合蛋白的二聚体制剂用于实施例1.1～1.6中的药代动力学实验。如果没有另外说明，这些二聚体制剂在下文中称为D'D3-FP或rD'D3-FP。
rD'D3-FP EY和EYA变体已通过等效方法步骤生成。
【实施例1.1：用rD'D3-FP静脉内治疗对大鼠的生理内源性FVIII水平的影响】
【动物】
重量范围为200～294g的雌性Crl:CD(Sprague Dawley)大鼠在Charles RiverLaboratories(Sulzfeld，德国)繁殖。在室内，将动物保持在标准的住笼条件下，即在12～24℃，12小时/12小时明暗循环下。用标准小鼠和大鼠饮食(SsniffSoest，德国)自由喂养动物。自由供应自来水。动物饲养和研究程序符合德国动物福利法和欧盟法规。
对于1mg/kg组，组大小为n＝9，除了对照(n＝仅3只动物)外，分为3个组。1mg/kg组的组大小为n＝6，分为2组。因此，总是使用每个时间点n＝3只动物。
【实验细节】
通过单次注射到大鼠的侧尾静脉(每组n＝3)来将试验物品静脉内给药。基于人白蛋白值，以1mg/kg或3mg/kg的剂量水平施用rD'D3-FP。1mg/kg组的血液样本在给药前，静脉推注后，在给药后(给药后)6小时和1、2、3、4、5、7、10和14天进行了眼窝后取样(第10天和第14天通过Vena cava穿刺进行末端取样)。在给药后0.083、3、8小时和1、2、3和4天抽取3mg/kg组的血液样品。使用柠檬酸钠(1份柠檬酸钠3.13％+9份血液)对它们进行抗凝，加工成血浆并在约-70℃下储存，用于测定rD'D3-FP和/或FVIII活性。
通过使用人白蛋白ELISA测量构建体的白蛋白部分来测定rD'D3-FP暴露。使用生色测定法以及一步凝固测定法检测FVIII活性血浆水平。
使用GraphPad Prism(GraphPad Software，La Jolla，California，USA)在14天的时间内使用预处理值作为基线计算曲线下的总峰面积(AUC)，并鉴定距离最小值到最大值≤30％的峰。
【结果】
rD'D3-FP定量至多给药后4天(3mg/kg)或14天(1mg/kg)，并且在整个观察期内测量数据远高于检测限(图1A)。对于2个测试剂量观察到线性剂量依赖性。
对于用1mg/kg rD'D3-FP处理的组，测量FVIII活性为生色和一阶段凝固活性，并且与施用rD'D3-FP后的盐水对照相比，两种FVIII活性测试显示内源性FVIII水平的瞬时增加(图1B和1C)，给药后第2天(生色活性)或给药后第1天(凝固活性)至第5天的峰值同样对于两种测定，平均FVIII浓度几乎不超过最大给药前值，即对于生色FVIII活性为3.1IU/mL，对于凝固FVIII活性为454％(4.5IU/mL)。应该提到的是，对于任何动物都没有达到用于定量样品的1:4稀释度的正常上限(ULN)。与此一致，如图1D所示的AUC(在给药后第0天至第14天评估)随着生色以及在1mg/kg rD'D3-FP的剂量下的凝固测定而增加。
与FVIII活性的增加一致，与媒质处理的动物相比，生理活化的部分凝血酶时间(aPTT)降低(图1E)，在施用峰值后立即开始直至约给药后第7天。同样，平均值在给药范围内，并且仅在给药后第1天进行。平均值低于16.5秒的最低预给药值。
在施用rD'D3-FP暴露至少14天的情况下，观察到FVIII活性的轻微增加。在给药后1～5天之间给出峰值，其在任何情况下比盐水处理的动物＜2倍(FVIII生色活性：最大增加～1IU/mL或100％至～3.5IU/mL＝350％；FVIII凝固活性：最大增加～300％至～700％，大多数增加～100％至～500％，与人相比，与这些动物中的高基线值一致，并且大多数在生理变异内。FVIII活性的这种轻微增加导致aPTT的缩短，平均值仅略微且略低于最小的给药前值。因此，在健康大鼠中，在1mg/kg rD'D3-FP的剂量下观察到FVIII水平的轻微增加，但是罕有将这些值改变到生理范围之外。
【实施例1.2：用rD'D3-FP静脉内治疗对兔的生理内源性FVIII水平的影响】
【动物】
重量范围为2.0～3.2kg的雌性CHB兔(Bauer，Neuental，德国)在标准住笼条件下，即在20～23℃和50％相对湿度下，在12小时/12小时明暗周期内每笼一个笼养在钢丝笼中。给动物随意提供自来水并喂食兔粮(Deutsche Tiernahrung Cremer GmbH&Co.KG，Düsseldorf，德国)。动物饲养和研究程序符合德国动物福利法和欧盟法规。
【实验细节】
试验物品通过单次注射到兔的侧耳静脉来静脉内给药(每组n＝3)。基于人白蛋白值，以1、3或10mg/kg的剂量水平施用rD'D3-FP。在给药前1、3和6小时从耳动脉取血样，然后在静脉推注后直到给药后(给药后)10天每天取样。使用柠檬酸钠(1份柠檬酸钠3.13％+9份血液)对它们进行抗凝，加工成血浆并在约-70℃下储存而用于测定rD'D3-FP和/或FVIII活性。
通过使用人白蛋白ELISA测量构建体的白蛋白部分来测定rD'D3-FP暴露。使用生色测定法以及一步凝固测定法检测FVIII活性血浆水平。此外，使用FSL测试定量aPTT。任何凝固的样品都被排除在评估之外。
使用GraphPad Prism(GraphPad Software，La Jolla，California，USA)在10天的时间内使用预处理值作为基线计算曲线下的总峰面积(AUC)，并鉴定距离最小值到最大值≤30％的峰。
【结果】
rD'D3-FP定量给药后至多10天，测量数据在整个观察期内远高于检测限16或31ng/mL，除了从第7天或之后的某些动物观察到的下降(图2A)。从第7～10天开始，在单个动物中观察到这种暴露的突然下降，特别是对于较高剂量。一个潜在的原因可能是抗药物抗体的形成-与其他测试物种相比，兔和人D'D3区域的同源性较低。
测量FVIII活性为生色和一阶段凝固活性，与盐水对照相比均显示内源水平增加(图2B和2C)。数据表明施用rD'D3-FP后内源性FVIII水平略有增加，在给药后第3～7天之间达到峰值。然而，在凝固FVIII活性测试中，平均值仅短暂地增加了生色的2.8IU/mL和标准的611％(6.1IU/mL)的给药前值的范围。与此一致，如图2D所示，AUC(在给药后第0天至第10天评估)增加：使用生色测定，从3mg/kg的剂量开始，而凝血测定的效果仅在10mg/kg时可见。这可能与凝血测定中基线值的较高变化有关，其在治疗组中已经略高。
尽管FVIII活性显示轻微增加，但在aPTT中未观察到减少(图2E)。
在施用rD'D3-FP暴露至少6天的情况下，观察到FVIII活性的轻微增加，其略微超过在盐水处理的动物中观察到的水平。在给药后第3～7天之间给出峰值，其比盐水处理的动物＜2倍(FVIII生色活性：最大增加～1IU/mL或100％至～3.5IU/mL＝350％；FVIII凝固)活动：最大增加～400％至～900％-与这些动物相比，与男性相比基线值更高)。在第3天至第6天，这些增加的FVIII活性水平仅略微超过兔的生理水平，剂量为10mg/kg，并且没有降低aPTT。因此，在健康的兔中，仅观察到FVIII水平的轻微变化。
【实施例1.3：用rD'D3-FP静脉内治疗对猴的生理内源性FVIII水平的影响】
【动物】
雄性食蟹猴体重约4～7千克，年龄约5～6岁(从越南获得-文献包括健康检查和在抵达英国剑桥郡的亨廷登生命科学公司之前进行的任何治疗)，成对饲养在专门设计用于在标准住房条件下容纳非人类灵长类动物的笼子中，即在12小时/12小时明暗周期下在15～24℃和40～70％相对湿度下。给动物随意提供自来水并喂食旧大陆猴饮食(每只动物每天200g)加上补充饮食(两种饼干补充剂，每种约25g，和新鲜水果产品)。
【实验细节】
试验物品通过单次注射到猴的隐静脉中来静脉内给药(每组n＝3)。基于人白蛋白值，以2.5mg/kg的剂量水平施用rD'D3-FP。在给药前和静脉推注后给药后5、30分钟，2、6、16、30、48、72、96、120、144、168小时从股静脉取血样。使用柠檬酸钠(1份柠檬酸钠3.2％+9份血液)对它们进行抗凝，加工成血浆并在约-70℃下储存以测定FVIII活性和/或rD'D3-FP。
通过使用捕获分子的D'D3部分的抗体并使用白蛋白的检测抗体测量构建体的白蛋白部分来确定rD'D3-FP暴露。通过Chromogenix测定法检测FVIII生色活性血浆水平。
【结果】
使用结合其两种组分，白蛋白和D'D3的ELISA定量rD'D3-FP，并且进行测量直至给药后168小时(7天)。在整个观察期内，测量数据远高于检测限(图3A)。
测量FVIII活性作为生色活性，如图3B所示。基础内源性水平相关变化，范围为标准的83.6～314.8％(0.8～3.1IU/mL＝图3B中的虚线)和平均值的176.4％(1.8IU/mL，图中的虚线).3B)。如在大鼠和兔中，仅观察到内源性FVIII水平的小幅增加，直至平均最大值为标准的258.9％，并且变异性非常高。然而，与人相比，内源性FVIII水平增加至约1IU/mL或约100％(约2.5IU/mL或～2.5IU/mL)，与这些动物的基线值相比更高与单独的给药前值相比，证明了(作为平均值)但不超过猴的生理学FVIII水平。
【实施例1.4：用rD'D3-FP静脉内治疗对VWF ko大鼠内源性FVIII水平的影响】
【动物】
重量范围为261～598g的雄性和雌性VWF ko大鼠在Charles River Laboratories(Sulzfeld，德国)繁殖。在室内，将动物保持在标准的住笼条件下，即在12～24℃，12小时/12小时明暗循环下。用标准小鼠和大鼠饮食(Ssniff-Soest，德国)自由喂养动物。自由供应自来水。动物饲养和研究程序符合德国动物福利法和欧盟法规。
除对照组(仅n＝3只动物)外，1和10mg/kg组的组大小为n＝9，分为3个组。因此，每个时间点n＝3只动物用于所有媒质，1和10mg/kg rD'D3-FP时间点。对于3mg/kg组，每组时间组的大小为n＝4。
【实验细节】
试验物品通过单次注射到侧尾静脉中来静脉内给药，总体积为2或3mL/kg。基于人白蛋白值，以1、3或10mg/kg的剂量水平施用rD'D3-FP。在给药前，给药(1和10mg/kg)后6、24、48、72、96、120、168、240、336小时，在短期麻醉下使用交替采样方案眼窝后采集血样，或从每只个体动物从隐静脉，在给药前，给药(3mg/kg)后1、24、48、72、120、192、240和336小时取血样。PK曲线取自每组三只大鼠(1和10mg/kg)或自个体动物(3mg/kg)。使用柠檬酸钠(1份柠檬酸钠3.13％+9份血液)对血液样品进行抗凝，加工成血浆并在-70℃下储存以测定FVIII活性和/或白蛋白。
通过使用人白蛋白ELISA测量构建体的白蛋白部分来测定rD'D3-FP暴露。此外，测量FVIII生色和凝固活性以及aPTT(后者仅在用1和10mg/kg rD'D3-FP处理的组中)。
使用MATLAB R2017a(Natick，Massachusetts，USA)使用梯形方法从第0天到第10天进行曲线下面积(AUC)的计算。
【结果】
使用针对人白蛋白的ELISA定量rD'D3-FP，并且进行测量直到给药后14天。在直至第14天的整个观察期内，所有测量数据都远高于检测限(图4A)。从1～10mg/kg rD'D3-FP显示线性剂量依赖性。
如图4B中所示，以生色活性测量的FVIII活性未给出相关的基线FVIII水平：23个样品中的22个低于检测限(0.005IU/mL或0.5％)并且一只动物具有0.007IU/mL的值。在VWFko大鼠中(与CD大鼠相反)，用1:4的稀释度达到正常上限(ULN，4IU/mL)，用于定量两种大鼠品系的样品：给药rD'D3-FP后，水平在2天内增加，10mg/kg剂量甚至超过4IU/mL(或400％)测定定量的上限。在VWF ko大鼠中，施用10mg/kg但不是1或3mg/kg-rD'D3-FP后的FVIII活性水平瞬时超过健康CD大鼠中测量的值。施用10mg/kg rD'D3-FP后FVIII生色活性值也高于其他健康物种，即兔(剂量高达10mg/kg rD'D3-FP)或猴(2.5mg/kg rD'D3-FP)。施用10mg/kg rD'D3-FP后对大鼠的作用持续长达10天。即使剂量为1mg/kg rD'D3-FP，在第2天达到最高血浆浓度2.36IU/mL(或236％)，并且在第7天仍然看不到效果。与3mg/kg rD'D3-FP相似，在第1天达到最高的FVIII血浆浓度(2.09IU/mL或209％)。使用这些较低的2剂量，平均FVIII浓度恰好在CD大鼠的正常水平范围内。
当如图4C所示用凝固测定法测量FVIII活性时，基线FVIII水平是可测量的(未稀释的样品：平均是标准的22.3％，最小是标准的11.7％和最大是标准的40.9％，n＝17；并且检测限为40％，20个样品保持＜40％)。因此，如在CD大鼠和兔中，基线值是高度可变的。需要提及的是，施用rD'D3-FP后的所有样品都需要1:8的稀释步骤，从而产生标准的1186.4％的ULN。再次，在以10mg/kg的剂量施用rD'D3-FP后，内源性FVIII水平甚至在2天内增加超过测定的ULN，即高于兔。在10mg/kg rD'D3-FP的高剂量下，该效果持续长达14天。即使在1mg/kg的剂量下，在第2天达到标准的388.8％的最高血浆浓度，并且在第7天仍然看到效果。类似地，在3mg/kg的剂量下，血浆浓度最高，在第2天测量的是标准的435.2％。与生色FVIII活性相似，施用10mg/kg后超过FVIII活性的生理范围，并且在施用1或3mg/kgrD'D3-FP后刚刚达到。
因此，生色和凝固活性数据是一致的，凝固活性数据显示略微更强的反应，假设与基线大鼠FVIII相对于人FVIII标准的测量相关。观察到FVIII活性的增加，其达到在健康CD大鼠(1和3mg/kg)中观察到的水平或超过它们(10mg/kg)。对于10mg/kg剂量，峰值高于检测上限，因此不能确定高于正常范围的x倍增加。
这与计算的AUC增加(第0～10天)一致，显示在剂量为1、3和10mg/kg rD'D3-FP后增加，如图4D所示。与媒质治疗相比，用1和3mg/kg rD'D3-FP给药后，生色增加约10倍，凝血FVIII活性约为80倍，而10mg/kg rD'D3-FP达到50倍的生色性和430倍对于AUC0～10d的效应。
与FVIII水平的这些增加一致，活化的部分凝血酶时间(aPTT)从病理性给药前或媒质数据相关地降低至10mg/kg rD'D3-FP剂量组中的最低平均值12.5s(图4E)。在两个测量剂量组(1和10mg/kg)中这种下降持续至14天，并使aPTT值(1mg/kg rD'D3-FP)或略低于(10mg/kg rD'D3-)FP)在健康CD大鼠中观察到的范围(范围16.5～36.6s)。
【实施例1.5：用rD'D3-FP静脉内治疗对VWF ko小鼠内源性FVIII水平的影响】
【动物】
重量范围为30～45g的雄性和雌性VWF ko小鼠在Charles RiverLaboratories(Sulzfeld，德国)繁殖。在室内，将动物保持在标准的住笼条件下，即在12～24℃，12小时/12小时明暗循环下。用标准小鼠和大鼠饮食(Ssniff-Soest，德国)自由喂养动物。自由供应自来水。动物饲养和研究程序符合德国动物福利法和欧盟法规。
除对照组(n＝4只动物)外，组大小为n＝12，分为4组。因此，每个时间点使用n＝3～4只动物。
【实验细节】
静脉内施用试验制品(rD'D3-FP或媒质(等渗盐水))。通过单次注射5mL/kg总体积到侧尾静脉。基于人白蛋白值，以10mg/kg的剂量水平施用rD'D3-FP。在给药后第4、7、16、24、48、72、96和168小时的短期麻醉下使用来自rD'D3-FP给药动物的交替采样方案对血液样本进行眼窝后采取，并在给药后第4和168小时使用。来自媒质处理的动物。PK曲线取自每组四组小鼠。使用柠檬酸钠(1份柠檬酸钠3.13％+9份血液)对血液样品进行抗凝，加工成血浆并在-70℃下储存以测定FVIII活性和/或白蛋白。
通过使用人白蛋白ELISA测量构建体的白蛋白部分来测定rD'D3-FP暴露。此外，测量FVIII生色和凝固活性。
用GraphPad Prism(GraphPad Software，La Jolla，California，USA)在7天的时间内计算曲线下的总峰面积(AUC)，鉴定从最小值到最大值的距离≤10％的峰。
【结果】
使用针对人白蛋白的ELISA定量rD'D3-FP，并且测量给药后至多7天进行测量。在整个观察期内，所有测量数据都远高于检测限(图5A)。
以生色活性测量的FVIII活性未给出相关的基线FVIII水平：来自媒质处理的动物的所有6个测量样品均低于检测限(10mIU/mL或1％)。为进行比较，健康NMRI小鼠的生色活性范围为约96～300mIU/mL，中位数为230mIU/mL，平均值为206mIU/mL(范围为标准的10～30％，未发表的数据)，即低于其他动物物种或人类。根据图5B，在施用rD'D3-FP后，水平在4小时内迅速增加至平均值138mU/mL(14％)，并且进一步增加，在给药后48小时时达到最大值，具有平均值为421mU/mL(42％)至给药后72小时(429IU/mL或43％)。在给药后168小时(7天)的最后时间点，测量仍然是194mU/mL(20％)。由此，用10mg/kg rD'D3-FP处理后的FVIII生色活性略微超过在NMRI小鼠中测量的生理学FVIII血浆水平，并且效果与VWF ko大鼠相当。
当用凝固测定法测量FVIII活性时，基线FVIII水平是可测量的(媒质处理的动物：平均值31.1，最小值25.8和最大值41.8％，n＝8)。因此，与其他物种一样，基线值变化很大。再次，施用rD'D3-FP后，水平迅速增加，如图5C所示，并且只能以1:60的稀释度进行测量(同时以1:10的稀释测量用于基线值定量的媒质处理的动物)。在给药后4小时的第一个采样点，平均值已经达到标准值的137％，并且进一步增加到给药后16小时，平均值为标准值的218％。在给药后72小时达到最大暴露量。平均值为标准的304％。在给药后168小时(7天)的最后一个时间点，仍然测量到标准的254％。
因此，生色和凝固活性数据通常是一致的，凝固活性数据显示更强的反应，假定与小鼠FVIII(在VWF ko动物中)相对于人FVIII标准的测量有关。观察到FVIII活性增加，超过健康NMRI小鼠中观察到的水平＜2倍(FVIII生色活性：最大增加0.1IU/mL＝～10％至～0.4IU/mL＝40％-与较低水平一致与人相比，这些动物的基线值；FVIII凝固活性：最大增加至～300％(未确定NMRI小鼠的范围))。这与AUC(第0～7天)的计算增加一致，与图5D中所示的媒质治疗的动物相比，在10mg/kg rD'D3-FP剂量后显示出大的增加。
【实施例1.6：用不同rD'D3多肽静脉内治疗对VWF ko大鼠内源性FVIII水平的影响】
【动物】
重量范围为261～559g的雄性和雌性VWF ko大鼠在Charles River Laboratories(Sulzfeld，德国)繁殖。在室内，将动物保持在标准的住笼条件下，即在12～24℃，12小时/12小时明暗循环下。用标准小鼠和大鼠饮食(Ssniff-Soest，德国)自由喂养动物。自由供应自来水。动物饲养和研究程序符合德国动物福利法和欧盟法规。
每组的组大小为n＝4。
【实验细节】
试验物品通过以3mL/kg的总体积单次注射到侧尾静脉中来静脉内给药。基于人白蛋白值，以3mg/kg的剂量水平施用rD'D3-FP。在给药前，给药后1、24、48、72、120、192、240和336小时，从rD'D3-FP给药的动物从隐静脉取血样，以及在给药前，给药后1、24、48、72、96、168、240和336h从rD'D3-CTP处理的动物取血样。使用柠檬酸钠(1份柠檬酸钠3.13％+9份血液)对血液样品进行抗凝，加工成血浆并在-70℃下储存以测定FVIII活性和/或白蛋白。
通过使用人白蛋白ELISA测量构建体的白蛋白部分来测定rD'D3-FP暴露。使用针对抗人D'D3的抗体，通过ELISA技术测量rD'D3-CTP。此外，测量FVIII生色和凝固活性。
使用梯形法用MATLAB R2017a(Mathworks，Natick，Massachusetts，USA)计算从第0天到第10天的曲线下面积(AUC)。
【结果】
使用针对人白蛋白的ELISA定量rD'D3-FP，并且进行测量直到给药后14天。rD'D3-FP变体的所有测量数据在整个观察期内远高于检测限，而rD'D3-CTP在第14天达到基线值(图6A)。与变体EY和EYA相比，在恢复中观察到rD'D3-FP WT的轻微优势，但在清除方面没有观察到相关差异。使用针对人rD'D3的ELISA定量rD'D3-CTP，并且测量值远高于检测限，直至并包括给药后第10天(图6A)。
以生色活性测量的FVIII活性未给出相关的基线FVIII水平：所有18个测量的给药前样品均低于检测限(20mIU/mL或2％)。根据图6B，在施用rD'D3-FP变体后，水平在给药(WT197±20mIU/mL或5％，EY 171±84mIU/mL或17％，EYA 203±117mIU/mL或20％和CTP110±102mIU/mL或11％)后第1小时已经增加，甚至在下一个测量的时间点进一步。在第1天至第8天达到最大值，WT为2088mU/mL(209％)，EY为2889mU/mL(289％)，EYA为1044mU/mL(104％)，CTP为2214mU/mL(221％)。在第10天观察到WT的最后可测量的FVIII活性(237±225mU/mL(24％))，第10天的EY(512±603mU/mL(51％))，第14天(最后一次测量时间点)的EYA是179±107mU/mL(18％)，第14天CTP(22±4mU/mL(2％))。这导致静脉注射rD'D3后观察到的AUC0～10d最高CTP变体(表2，图6D)。
当用凝固测定法测量FVIII活性时，基线FVIII水平也是不可测量的(n＝20个给药前处理的动物，检测限为40％)。如图6C所示，再次，在施用rD'D3-HLP后，水平在给药后第1小时已经增加(WT47±4％，EY 41±1％，EYA 45±5％和CTP 40±1％)，甚至在下一个测量的时间点进一步。在第1天至第8天达到最大值，WT为435％，EY为453％，EYA为779％，CTP为358％。在第10天(85±39％)观察到WT的最后可测量的FVIII活性，第10天的EY(130±84％)，第14天的EYA(最后测量的时间点，46±7％)和在第7天的CTP(57±29％)。观察到最高的AUC0～10d是在用rD'D3-FP EYA给药静脉注射后实现的(表2，图6D)。
因此，生色和凝固活性数据通常是一致的，再次凝固活性数据显示更强的反应。观察到FVIII活性增加至生色FVIII活性约1.5～2IU/mL(150～200％)和凝固活性约300～700％，因此显着低于CD大鼠的生色FVIII活性值和略微下降用于凝固FVIII活性的CD大鼠的上述值(参见实施例1.4中的图4B和图4C)，与这些动物的基线值一致，与人不同。
表2：静脉注射后rD'D3和FVIII活性的AUC0～10d。在VWF ko大鼠中施用rD'D3变体
因此，生色和凝固活性数据通常是一致的，凝固活性数据显示与更高的绝对AUC0～10d值相关的更高的绝对FVIII浓度。应该提到的是，与凝固测定相比，在生色中施用rD'D3-CTP后对FVIII活性的影响更强。虽然所有4种rD'D3-FP变体显示出相似的暴露，但对FVIII具有最高结合亲和力的rD'D3-FP EYA变体显示出对内源性FVIII的最长和最高效应。
【实施例1.7：在FVIII ko，VWF ko和NMRI小鼠，VWF ko和CD大鼠和猪中rD'D3-FP的皮下可用性及其对VWF ko大鼠和猪的内源性FVIII水平的影响】
【动物】
【FVIII ko小鼠】
重量范围为20～30g的雄性和雌性FVIII ko小鼠在Charles River Laboratories(Sulzfeld，德国)繁殖。组大小为n＝12，分为4组。因此，每个时间点使用n＝3只动物。
【VWF ko小鼠】
重量范围为25～40g的雄性和雌性VWF ko小鼠在Charles River Laboratories(Sulzfeld，德国)繁殖。组大小为n＝12，分为4组。因此，每个时间点使用n＝3只动物。
【NMRI小鼠】
体重范围为27～34g的雌性NMRI小鼠在Charles River Laboratories(Sulzfeld，德国)繁殖。组大小为n＝12，分为4组。因此，每个时间点使用n＝3只动物。
【CD大鼠】
雌性大鼠Crl：CD(Sprague Dawley)的重量范围为250～302g，在Charles RiverLaboratories(Sulzfeld，德国)繁殖。组大小为n＝6，分为2组。因此，每个时间点使用n＝3只动物。
【VWF ko大鼠】
在Charles River Laboratories(Sulzfeld，德国)繁殖重量范围为222～559g的雄性和雌性VWF ko大鼠。组大小为n＝4。
在室内，将小鼠和大鼠保持在标准的住笼条件下，即在12～24℃，12小时/12小时明暗循环下。用标准小鼠和大鼠饮食(Ssniff-Soest，德国)自由喂养动物。自由供应自来水。动物饲养和研究程序符合德国动物福利法和欧盟法规。
【猪】
选择猪，因为它们代表了皮下生物利用度的良好模型，因为它对人具有预测性。组大小为2(静脉内)或3(皮下)。
重量范围为23～27千克的雄性猪在Schlosser(Schwalmtal，德国)繁殖。在室内，将动物在18～21℃下保持在稻草中。给动物喂食碎谷物。自由供应自来水。动物饲养和研究程序符合德国动物福利法和欧盟法规。
【实验细节】
【FVIII ko，VWF ko和NMRI小鼠】
试验物品静脉内给药。通过单次注射到侧尾静脉中，总体积为5mL/kg或皮下通过单次注射到颈部，总体积为5mL/kg。在短期麻醉下使用交替采样方案在给药后第3、8、16、24、42、72和96小时眼窝后采集血样，并且另外在给药后5分钟静脉内采集血样。
使用柠檬酸钠(1份柠檬酸钠3.13％+9份血液)对血液样品进行抗凝，加工成血浆并在-70℃下储存。
通过使用人白蛋白ELISA测量蛋白质的白蛋白部分来测定rD'D3-FP暴露。
【VWF ko大鼠】
试验物品静脉内给药。通过单次注射到侧尾静脉中，总体积为3mL/kg或皮下通过单侧注射侧面的一侧，总体积为2mL/kg。
来自皮下组的血液样品在给药前，给药后4、24、48、72、96和168小时，从每只动物从隐静脉取出，和来自静脉内组的血液样品在给药前，给药后1、24、48、72、120、192、240和336小时采集。
使用柠檬酸钠(1份柠檬酸钠3.13％+9份血液)对血液样品进行抗凝，加工成血浆并在-70℃下储存。
通过使用人白蛋白ELISA测量蛋白质的白蛋白部分来测定rD'D3-FP暴露。此外，测量FVIII生色活性。
【CD大鼠】
试验物品以3mL/kg的总体积通过单次注射到侧尾静脉中来静脉内给药，或以3mL/kg的总体积通过单侧注射侧面的一侧来皮下给药。
在短期麻醉下使用交替采样方案，在给药后3小时，8小时，24小时，48小时，72小时和96小时眼窝后采集血样，以及另外在给药后5分钟静脉内采集血样。
使用柠檬酸钠(2份柠檬酸钠3.13％+8份血液)对血液样品进行抗凝，加工成血浆并在-70℃下储存。
通过使用人白蛋白ELISA测量蛋白质的白蛋白部分来测定rD'D3-FP暴露。
【猪】
测试物品以0.211～0.751mL/kg的总体积范围在侧翼或静脉内通过单次注射进入耳静脉来皮下给药。
从耳或隐静脉取血样。10mg/kg rD'D3-FP皮下组的时间点为给药前，给药后3、12、24、32、48、72、96、120、144和168小时，在静脉内组是给药前，给药后5分钟，3分钟，12分钟，24天，32天，48天，72天，96天，120天，144天和168小时。3mg/kg rD'D3-FP皮下组的时间点为给药前，给药后1、3、12、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240和264小时。
PK曲线取自个体动物。使用柠檬酸钠(1份柠檬酸钠3.13％+9份血液)对血液样品进行抗凝，加工成血浆并在-70℃下储存以测定FVIII抗原和白蛋白。
通过使用人白蛋白ELISA测量蛋白质的白蛋白部分来测定rD'D3-FP暴露。此外，测量FVIII生色活性。
【一般】
基于人白蛋白值，以3、3.5或10mg/kg的剂量水平施用rD'D3-FP。在小鼠中，在一些组中，rVIII-单链以100或200IU/kg的剂量共同施用。PK曲线分别取自每组四只小鼠或两组大鼠，或来自个体猪。
使用MATLAB R2017a(Natick，Massachusetts，USA)计算从0到无穷大的曲线下面积(AUC)。
【结果】
使用针对人白蛋白的ELISA定量rD'D3-FP，并且测量在小鼠中给药后至多4天进行测量，在大鼠和猪中给药后14天进行测量。在整个观察期内，所有测量数据都远高于检测限(图7A)。
图7A-1显示了rD'D3-FP在不同小鼠品系中的PK谱，没有rFVIII共同给药的视觉影响。所有三种菌株中的曲线大致相当，然而在NMRI小鼠中，暴露下降比在FVIII ko或VWF ko动物中更快。
AUC0-inf和rD'D3-FP的所得生物利用度总结在表3中。在FVIII ko小鼠中显示静脉内施用或不施用rVIII-单链的rD'D3-FP对rD'D3-FP的AUC0-inf没有影响(FVIII设定为100％-＞没有FVIII计算为89％)。因此，在该实验中，rVIII-单链对rD'D3-FP PK谱没有相关作用。不同菌株中AUC0-inf的比较表明三种菌株之间没有显着差异，在NMRI动物中从FVIIIko(1590h*μg/mL)到VWF ko动物(1197h*μg/mL)到agina略低AUC0-inf的排序(940h*μg/mL)。
大鼠中的PK曲线显示在图7A-2中，表明在CD和VWF ko大鼠皮下和静脉内给药后rD'D3-FP的清除率相当。然而，与CD大鼠相比，VWF ko大鼠中的皮下可用性最低。图7A-3显示了猪的PK曲线，表明在最近2天后相同剂量下的可比较暴露，并且rVIII-单链对rD'D3-FP的PK曲线没有影响。
表4总结了rD'D3-FP对物种的生物利用度。在大鼠中，用于计算生物利用度的AUC0-inf(CD大鼠)和AUC0-inf(VWF ko大鼠)的评价分别显示40％和11％的值，即，与VWF ko动物相比，FVIII感受态大鼠中观察到更好的生物利用度。这与小鼠AUC0-infinf评估中的观察结果形成对比，表明来自VWF ko和NMRI动物的可比数据。如果有的话，与NMRI小鼠相比，VWFko小鼠将具有更好的AUC0-inf。在猪中，rD'D3-FP的AUC0-inf介于59％至187％之间。总的来说，与物种相比，猪显示出最高的rD'D3-FP生物利用度。
表3：rD'D3-FP的AUC0-inf在不同小鼠品系中定量为白蛋白
n.d.：未检测
表4：在不同物种中定量为白蛋白的rD'D3-FP的生物利用度
小鼠 大鼠 猪
FVIII胜任的 n.d. 40％ 59～187％
FVIII ko 48％ n.d. n.d.
VWF ko n.d. 11％ n.d.
n.d.：未检测
内源性FVIII生色活性不仅在静脉内(参见之前，实施例1.1～1.5)之后，而且在皮下rD'D-FP给药后也增加(图7B)。
图7B-1显示在大鼠中，值在第1天(3mg/kg静脉内)或第4天(10mg/kg皮下)以最大值增加。这计算出与静脉内rD'D3-FP给药(独立于rD'D3-FP剂量)相比，在皮下注射后对FVIII AUC0-inf的影响减小至17％(生色)和14％(凝固)活性。静脉内以及皮下治疗(主要在约0.5～1IU/mL或50～100％范围内)观察到内源性FVIII活性的这种轻微但相关的相关增加，因此略低于CD大鼠达到的水平(比较图4B)。
在猪中(图7B-2)，在皮下施用rD'D3-FP后约1天观察到FVIII生色活性的增加。这种效果持续了整整11天。这种增加最多比给药前值高2倍(最大增加～5IU/mL或500％至～10IU/mL＝1000％，这和与人相比，这些动物中基线值更高一致，即符合静脉内化合物施用FVIII感受态动物后的小效果。
因此，这些数据表明用rD'D3-FP治疗不仅可以使用静脉内而且还使用皮下化合物给药。
【实施例1.8：多次静脉内剂量的rD'D3-FP对VWF ko大鼠内源性FVIII水平的影响】
【动物】
重量范围为281～504g的雄性和雌性VWF ko大鼠在Charles River Laboratories(Sulzfeld，德国)繁殖。组大小为n＝11，分为4组。因此，每个时间点使用n＝2～3只动物。
在室内，将动物保持在标准的住笼条件下，即在12～24℃，12小时/12小时明暗循环下。用标准小鼠和大鼠饮食(Ssniff-Soest，德国)自由喂养动物。自由供应自来水。动物饲养和研究程序符合德国动物福利法和欧盟法规。
【实验细节】
在第0天(队列1)，第0+7天(队列2)，第0+7+14+21天(队列3)或第0+7+14天(队列4)，通过以3mL/kg的总体积多次注射进入侧尾静脉静脉内给药试验物品。在队列特定时间点短期麻醉下每只动物眼窝后采集2个血样(队列1：给药前+给药后7天，队列2：3+给药后10天，队列3：17+给药后24天，队列4：14+给药后21天)。
基于人白蛋白值，以3mg/kg的剂量水平施用rD'D3-FP。PK曲线取自四组VWF ko大鼠。使用柠檬酸钠(2份柠檬酸钠3.13％+8份血液)对血液样品进行抗凝，加工成血浆并在-70℃下储存以测定白蛋白。
通过使用人白蛋白ELISA测量构建体的白蛋白部分来测定rD'D3-FP暴露。此外，测量了使用SL的FVIII生色和凝固活性和aPTT。
【结果】
使用针对人白蛋白的ELISA定量rD'D3-FP，并进行测量直至第24天。在整个观察期内，所有测量数据都远高于检测限(图8A)。对于4次给药，在峰值(至151％)和谷值(至128％)水平观察到轻微积累。
在第二次给药后，FVIII生色(图8B)活性水平从低于检测限值增加到CD大鼠中观察到的范围(最大增加至约1.8IU/mL＝180％)。FVIII凝固活性(图8C)甚至略高于CD大鼠中测量的数据(最大增加至约800％，这和与人相比，这些动物中的基线值更高一致)。然而，在4周的时间内未观察到两种FVIII活性测定的累积。
与此一致，aPTT从CD大鼠的正常值降低至CD大鼠正常范围的较低范围的值(图8D)。
总之，这些数据表明rD'D3-FP的多次治疗可以通过轻微积累rD'D3-FP进行，但没有FVIII水平的积累和aPTT的正常化。
【实施例1.9：在血友病A模型中，即在FVIII ko大鼠中静脉内施用皮下和rVIII-单链的rD'D3-FP的研究】
【动物】
重量范围为220～487g的雄性和雌性FVIII ko大鼠在CharlesRiverLaboratories(Sulzfeld，德国)繁殖。组大小为n＝6，分为2组。因此，每个时间点使用n＝3只动物。
在室内，将动物保持在标准的住笼条件下，即在12～24℃，12小时/12小时明暗循环下。用标准小鼠和大鼠饮食(Ssniff-Soest，德国)自由喂养动物。自由供应自来水。动物饲养和研究程序符合德国动物福利法和欧盟法规。
【实验细节】
测试物品以3mL/kg的总体积在颈部(rD'D3-FP)皮下给药或通过单次注射静脉内(rVIII-单链)给药进入FVIII ko大鼠的侧尾静脉。在rVIII-单链之前10分钟，基于人白蛋白值，以3mg/kg的剂量皮下应用rD'D3-FP。用剂量为200IU/kg生色FVIII活性的rVIII-单链静脉内处理动物。用注射用水重构rVIII-单链，并在水浴中解冻rD'D3-FP。在每种情况下，施用3mL/kg的剂量体积，用FVIII稀释缓冲液(rVIII-单链)或等渗盐水(rD'D3-FP)根据需要用于溶解化合物。
通过尾静脉插管取血样。组中的时间点分别为给药后0.083、1、4、8、16、24、32、48和72小时。PK曲线取自每组两组大鼠，每个时间点n＝3。使用柠檬酸钠(2份柠檬酸钠3.13％+8份血液)对血液样品进行抗凝，加工成血浆并在-70℃下储存以测定FVIII活性和FVIII抗原。
通过使用人白蛋白ELISA测量构建体的白蛋白部分来测定rD'D3-FP暴露。此外，测量FVIII生色活性和人FVIII抗原。
最大浓度(Cmax)，随时间变化的浓度曲线下面积从t＝0到t＝∞(AUC0-inf)，平均停留时间(MRT)，清除率(CL)和终末半衰期(t1/2)的估算通过静脉内计算中的两室模型，及由皮下计算中的双隔室吸收建模进行。对于参数估计，应用加权最小二乘成本函数。生物利用度计算为皮下给药相比静脉内给药后AUC0-inf的百分比。通过将模型方程设定为0.01、0.05或0.1IU/mL并求解时间来计算达到1％，5％和10％谷值水平的时间。
【结果】
【评估D'D3数据】
rD'D3-FP在皮下给药后被吸收。rD'D3-FP可以在72小时的整个观察期内量化；即它仍然高于检测限27ng/mL(图9A)。
Cmax，AUC0-inf，清除率，MRT和t1/2在表5中给出，并确认皮下给药后rD'D3-FP随时间的相关暴露。
表5：在FVIII ko大鼠中皮下施用rD'D3-FP、然后静脉施用rVIII-单链后rD'D3-FP的药代动力学参数
【评估FVIII数据】
与单独施用FVIII生色活性的rVIII-单链(图9B)以及FVIII抗原(图9C)相比，rD'D3-FP皮下预施用后rVIII-单链的FVIII PK特征延长。
FVIII生色活性(图9B)远高于检测限，直到给药后72小时的最后时间点。当rD'D3-FP预先给药时，当它单独施用FVIII时在72小时达到基线。在给药后32小时开始皮下预先施用rD'D3-FP，从视觉上看，暴露得到改善。
对FVIII:Ag进行了类似的观察(图9C)，但是在给药后24小时开始皮下预先施用rD'D3-FP已经改善了暴露，并且单独施用FVIII在给药后48小时时已经达到基线，可能与测量浓度的较低变异性有关。
预测rD'D3-FP改善了FVIII生色活性和FVIII.Ag的清除率，MRT和t1/2。
对于FVIII生色活性，AUC0-inf改善了41％(表6)，对于FVIII:Ag，AUC0-inf提高了49％(表8)。对于FVIII生色活性，Cmax提高30％，对于FVIII:Ag提高23％(分别为表6和8)。
对于具有和不具有rD'D3-FP的用于生色活性(表7)和对于FVIII:Ag(表9)的两种给药方案计算谷的时间。至于AUC0-inf，预先施用rD'D3-FP也显示出有利的生色活性以及FVIII抗原的谷值水平。对于生色FVIII活性和FVIII:Ag，对于1％谷值，延长率分别为6％和18％，对于5％谷值，延长率分别为9％和19％，对于10％谷值，延长率分别为8％和18％。
表6：在FVIII ko大鼠中皮下施用rD'D3-FP、之后静脉内施用rVIII-单链后FVIII生色活性的药代动力学参数
表7：在FVIII ko大鼠中皮下给药rVIII-单链(FVIII生色活性)后至谷水平的时间
表8：在FVIII ko大鼠中皮下施用rD'D3-FP、之后静脉内施用rVIII-单链后FVIII抗原的药代动力学参数
表9：在FVIII ko大鼠中皮下给药rVIII-单链(FVIII抗原)后至谷水平的时间
【结论来自体内动物实验】
这些研究证明了静脉内或者是皮下施用rD'D3-FP略微增加健康大鼠，兔，猪和猴中的内源性FVIII水平，即使这些动物中已经存在生理学FVIII水平。几乎没有超过给药前值，因此仅观察到aPTT的轻微缩短或没有缩短。
在显示出血型A型出血型(VWF ko大鼠或VWF ko小鼠，其相关性降低FVIII活性水平)的动物中，内源性FVIII活性的增加强于健康动物，绝对FVIII水平增加至约等于或高于健康小鼠和大鼠。在这些动物中，生理水平或恢复(生理变异的上限内的水平，例如在VWFko大鼠中施用1和3mg/kg rD'D3-FP后的标准生色FVIII活性的高达200～300％，这和与人相比，在这些动物中具有更高的基线值一致)或超过生理范围(例如，在VWF ko大鼠中施用10mg/kg rD'D3-FP后，正常的生色FVIII活性≥400％)。在VWF ko小鼠中，与人相比，关于生色FVIII活性的基线值较低，在10mg/kg rD'D3-FP剂量下达到标准的约40％，即增加＜2倍在健康的NMRI小鼠中观察到的水平以上。这表明在最初降低的FVIII水平，即A型血友病表型的个体中，FVIII升高作用可能比健康受试者更强。
通过共同施用rD'D3-FP EYA或EY变体或通过rD'D3-CTP实现类似的效果。
在VWF ko大鼠中多剂量的rD'D3-FP导致rD'D3-FP随时间轻微积累，而FVIII活性达到(生色活性)或略微超过(凝固活性)生理水平，并且aPTT恢复正常值。
不希望受理论束缚，这可以通过与VWF ko大鼠和小鼠相比具有生理学FVIII水平的健康动物中FVIII合成的生理学下调来解释。因此可以推测，对人类A型血友病患者中FVIII的影响应该与VWF ko大鼠和小鼠中观察到的相当，因此应该达到持久的生理水平。这些效果在静脉内和皮下给药后显示出来。rD'D3-FP的其他生物利用度范围在11～187％之间，取决于物种和基因型，在猪中达到最高值，已知是皮下生物利用度的良好预测模型。因此，这些数据表明皮下治疗也是可行的。
【实施例2：测定FVIII对VWF片段二聚体和单体的亲和力】
在生物反应器中表达VWF片段(1～1242)白蛋白融合物(D'D3-FP)；在如上所述纯化并分离单体和二聚体后，通过Biacore仪器(T200，GE Healthcare)通过表面等离振子共振评估FVIII对这些制剂的亲和力。
抗白蛋白抗体(MA1-20124，Thermo Scientific)通过其N-末端通过NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和EDC(盐酸乙醇胺)共价偶联至活化的CM 3芯片，两者均包含在胺偶联试剂盒(BR1000)中-50)来自GE Healthcare。为了固定，将3μg/mL抗体在乙酸钠缓冲液(10mM，pH5.0)中稀释，并将抗体溶液在芯片上流动7分钟。流速为10μL/min。在固定化程序之后，通过使乙醇胺溶液(1M，pH8.3)在芯片上流动5分钟(以10μL/min的流速)使未偶联的葡聚糖长丝饱和。使流动池饱和的目的是最小化分析物与芯片的非特异性结合。通过使用与上述相同的程序使空的流动池用乙醇胺饱和来建立参考流动池。
通过D'D3-FP蛋白(5μg/mL)在芯片上流动3分钟(流速为10μL/分钟)，将二聚体和单体D'D3-FP蛋白分别固定在共价偶联的抗白蛋白抗体上。
为了产生FVIII的结合曲线，将每种D'D3-FP蛋白质制剂在运行缓冲液中稀释(HBS-P+：0.1M HEPES，1.5M NaCl和0.5％v/v表面活性剂P20，pH7.4；产品代码BR100671，GEHealthcare)至浓度为0.25nM，0.5nM，1nM，3nM和4nM。通过进行单循环动力学，将具有每种稀释浓度递增浓度的样品在芯片上流动2分钟(流速30μL/min)，然后用运行缓冲区HBS-P+解离10分钟。所有测量均进行两次。将测量程序的温度调节至+25℃。
使用BiaEvaluation软件计算结合参数。曲线拟合方法基于Langmuir方程。用于计算的输入数据是分析物FVIII(rVIII-单链)的摩尔质量为170kDa，其他参数如max。从拟合的关联和解离曲线中自动提取RU和斜率。BiaEvaluation软件的输出是结合速率常数和解离速率常数，从中计算亲和常数。结果如表10所示。
表10：D'D3-FP二聚体和单体的FVIII亲和力数据
D'D3-FP制剂 ka[1/Ms] kd[1/s] K<sub>D</sub>[M]
D'D3-FP二聚体 4.5×10<sup>7</sup> 1.5×10<sup>-3</sup> 3.4x10<sup>-11</sup>
D'D3-FP单体 9.9×10<sup>5</sup> 3.0×10<sup>-2</sup> 3.0×10<sup>-8</sup>
与D'D3-FP单体(KD＝30nM)相比，二聚体D'D3-FP显示出对FVIII的显着(KD＝34pM)增加的亲和力，这导致rVIII-单链的更快结合和更慢的解离。
序列表
<110> CSL Behring Recombinant Facility AG
<120> 用于治疗血友病的截短的冯维勒布兰德因子多肽
<130> 2016_L003_A249
<150> EP 16198501.5
<151> 2016-11-11
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5616
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA 编码构建体 VWF 片段 - G/S 接头 - 白蛋白
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(6)
<223> EcoRI 限制酶切割位点
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(3757)
<223> VWF 氨基酸 1-1242的编码序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (3758)..(3850)
<223> 甘氨酸/丝氨酸接头的编码序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (3851)..(5608)
<223> 人白蛋白的编码序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (5609)..(5616)
<223> NotI 限制酶切割位点
<400> 1
gaattcccgc agccctcatt tgcaggggaa gatgattcct gccagatttg ccggggtgct 60
gcttgctctg gccctcattt tgccagggac cctttgtgca gaaggaactc gcggcaggtc 120
atccacggcc cgatgcagcc ttttcggaag tgacttcgtc aacacctttg atgggagcat 180
gtacagcttt gcgggatact gcagttacct cctggcaggg ggctgccaga aacgctcctt 240
ctcgattatt ggggacttcc agaatggcaa gagagtgagc ctctccgtgt atcttgggga 300
attttttgac atccatttgt ttgtcaatgg taccgtgaca cagggggacc aaagagtctc 360
catgccctat gcctccaaag ggctgtatct agaaactgag gctgggtact acaagctgtc 420
cggtgaggcc tatggctttg tggccaggat cgatggcagc ggcaactttc aagtcctgct 480
gtcagacaga tacttcaaca agacctgcgg gctgtgtggc aactttaaca tctttgctga 540
agatgacttt atgacccaag aagggacctt gacctcggac ccttatgact ttgccaactc 600
atgggctctg agcagtggag aacagtggtg tgaacgggca tctcctccca gcagctcatg 660
caacatctcc tctggggaaa tgcagaaggg cctgtgggag cagtgccagc ttctgaagag 720
cacctcggtg tttgcccgct gccaccctct ggtggacccc gagccttttg tggccctgtg 780
tgagaagact ttgtgtgagt gtgctggggg gctggagtgc gcctgccctg ccctcctgga 840
gtacgcccgg acctgtgccc aggagggaat ggtgctgtac ggctggaccg accacagcgc 900
gtgcagccca gtgtgccctg ctggtatgga gtataggcag tgtgtgtccc cttgcgccag 960
gacctgccag agcctgcaca tcaatgaaat gtgtcaggag cgatgcgtgg atggctgcag 1020
ctgccctgag ggacagctcc tggatgaagg cctctgcgtg gagagcaccg agtgtccctg 1080
cgtgcattcc ggaaagcgct accctcccgg cacctccctc tctcgagact gcaacacctg 1140
catttgccga aacagccagt ggatctgcag caatgaagaa tgtccagggg agtgccttgt 1200
cacaggtcaa tcacacttca agagctttga caacagatac ttcaccttca gtgggatctg 1260
ccagtacctg ctggcccggg attgccagga ccactccttc tccattgtca ttgagactgt 1320
ccagtgtgct gatgaccgcg acgctgtgtg cacccgctcc gtcaccgtcc ggctgcctgg 1380
cctgcacaac agccttgtga aactgaagca tggggcagga gttgccatgg atggccagga 1440
cgtccagctc cccctcctga aaggtgacct ccgcatccag catacagtga cggcctccgt 1500
gcgcctcagc tacggggagg acctgcagat ggactgggat ggccgcggga ggctgctggt 1560
gaagctgtcc cccgtctatg ccgggaagac ctgcggcctg tgtgggaatt acaatggcaa 1620
ccagggcgac gacttcctta ccccctctgg gctggcggag ccccgggtgg aggacttcgg 1680
gaacgcctgg aagctgcacg gggactgcca ggacctgcag aagcagcaca gcgatccctg 1740
cgccctcaac ccgcgcatga ccaggttctc cgaggaggcg tgcgcggtcc tgacgtcccc 1800
cacattcgag gcctgccatc gtgccgtcag cccgctgccc tacctgcgga actgccgcta 1860
cgacgtgtgc tcctgctcgg acggccgcga gtgcctgtgc ggcgccctgg ccagctatgc 1920
cgcggcctgc gcggggagag gcgtgcgcgt cgcgtggcgc gagccaggcc gctgtgagct 1980
gaactgcccg aaaggccagg tgtacctgca gtgcgggacc ccctgcaacc tgacctgccg 2040
ctctctctct tacccggatg aggaatgcaa tgaggcctgc ctggagggct gcttctgccc 2100
cccagggctc tacatggatg agagggggga ctgcgtgccc aaggcccagt gcccctgtta 2160
ctatgacggt gagatcttcc agccagaaga catcttctca gaccatcaca ccatgtgcta 2220
ctgtgaggat ggcttcatgc actgtaccat gagtggagtc cccggaagct tgctgcctga 2280
cgctgtcctc agcagtcccc tgtctcatcg cagcaaaagg agcctatcct gtcggccccc 2340
catggtcaag ctggtgtgtc ccgctgacaa cctgcgggct gaagggctcg agtgtaccaa 2400
aacgtgccag aactatgacc tggagtgcat gagcatgggc tgtgtctctg gctgcctctg 2460
ccccccgggc atggtccggc atgagaacag atgtgtggcc ctggaaaggt gtccctgctt 2520
ccatcagggc aaggagtatg cccctggaga aacagtgaag attggctgca acacttgtgt 2580
ctgtcgggac cggaagtgga actgcacaga ccatgtgtgt gatgccacgt gctccacgat 2640
cggcatggcc cactacctca ccttcgacgg gctcaaatac ctgttccccg gggagtgcca 2700
gtacgttctg gtgcaggatt actgcggcag taaccctggg acctttcgga tcctagtggg 2760
gaataaggga tgcagccacc cctcagtgaa atgcaagaaa cgggtcacca tcctggtgga 2820
gggaggagag attgagctgt ttgacgggga ggtgaatgtg aagaggccca tgaaggatga 2880
gactcacttt gaggtggtgg agtctggccg gtacatcatt ctgctgctgg gcaaagccct 2940
ctccgtggtc tgggaccgcc acctgagcat ctccgtggtc ctgaagcaga cataccagga 3000
gaaagtgtgt ggcctgtgtg ggaattttga tggcatccag aacaatgacc tcaccagcag 3060
caacctccaa gtggaggaag accctgtgga ctttgggaac tcctggaaag tgagctcgca 3120
gtgtgctgac accagaaaag tgcctctgga ctcatcccct gccacctgcc ataacaacat 3180
catgaagcag acgatggtgg attcctcctg tagaatcctt accagtgacg tcttccagga 3240
ctgcaacaag ctggtggacc ccgagccata tctggatgtc tgcatttacg acacctgctc 3300
ctgtgagtcc attggggact gcgcctgctt ctgcgacacc attgctgcct atgcccacgt 3360
gtgtgcccag catggcaagg tggtgacctg gaggacggcc acattgtgcc cccagagctg 3420
cgaggagagg aatctccggg agaacgggta tgagtgtgag tggcgctata acagctgtgc 3480
acctgcctgt caagtcacgt gtcagcaccc tgagccactg gcctgccctg tgcagtgtgt 3540
ggagggctgc catgcccact gccctccagg gaaaatcctg gatgagcttt tgcagacctg 3600
cgttgaccct gaagactgtc cagtgtgtga ggtggctggc cggcgttttg cctcaggaaa 3660
gaaagtcacc ttgaatccca gtgaccctga gcactgccag atttgccact gtgatgttgt 3720
caacctcacc tgtgaagcct gccaggagcc gggaggctcg agcgggggat ctggcgggtc 3780
tggaggctct ggagggtcgg gaggctctgg aggctctggg ggatctggcg ggtctggagg 3840
gtcgggatcc gatgcacaca agagtgaggt tgctcatcgg tttaaagatt tgggagaaga 3900
aaatttcaaa gccttggtgt tgattgcctt tgctcagtat cttcagcagt gtccatttga 3960
agatcatgta aaattagtga atgaagtaac tgaatttgca aaaacatgtg ttgctgatga 4020
gtcagctgaa aattgtgaca aatcacttca tacccttttt ggagacaaat tatgcacagt 4080
tgcaactctt cgtgaaacct atggtgaaat ggctgactgc tgtgcaaaac aagaacctga 4140
gagaaatgaa tgcttcttgc aacacaaaga tgacaaccca aacctccccc gattggtgag 4200
accagaggtt gatgtgatgt gcactgcttt tcatgacaat gaagagacat ttttgaaaaa 4260
atacttatat gaaattgcca gaagacatcc ttacttttat gccccggaac tccttttctt 4320
tgctaaaagg tataaagctg cttttacaga atgttgccaa gctgctgata aagctgcctg 4380
cctgttgcca aagctcgatg aacttcggga tgaagggaag gcttcgtctg ccaaacagag 4440
actcaagtgt gccagtctcc aaaaatttgg agaaagagct ttcaaagcat gggcagtagc 4500
tcgcctgagc cagagatttc ccaaagctga gtttgcagaa gtttccaagt tagtgacaga 4560
tcttaccaaa gtccacacgg aatgctgcca tggagatctg cttgaatgtg ctgatgacag 4620
ggcggacctt gccaagtata tctgtgaaaa tcaagattcg atctccagta aactgaagga 4680
atgctgtgaa aaacctctgt tggaaaaatc ccactgcatt gccgaagtgg aaaatgatga 4740
gatgcctgct gacttgcctt cattagctgc tgattttgtt gaaagtaagg atgtttgcaa 4800
aaactatgct gaggcaaagg atgtcttcct gggcatgttt ttgtatgaat atgcaagaag 4860
gcatcctgat tactctgtcg tgctgctgct gagacttgcc aagacatatg aaaccactct 4920
agagaagtgc tgtgccgctg cagatcctca tgaatgctat gccaaagtgt tcgatgaatt 4980
taaacctctt gtggaagagc ctcagaattt aatcaaacaa aattgtgagc tttttgagca 5040
gcttggagag tacaaattcc agaatgcgct attagttcgt tacaccaaga aagtacccca 5100
agtgtcaact ccaactcttg tagaggtctc aagaaaccta ggaaaagtgg gcagcaaatg 5160
ttgtaaacat cctgaagcaa aaagaatgcc ctgtgcagaa gactatctat ccgtggtcct 5220
gaaccagtta tgtgtgttgc atgagaaaac gccagtaagt gacagagtca ccaaatgctg 5280
cacagaatcc ttggtgaaca ggcgaccatg cttttcagct ctggaagtcg atgaaacata 5340
cgttcccaaa gagtttaatg ctgaaacatt caccttccat gcagatatat gcacactttc 5400
tgagaaggag agacaaatca agaaacaaac tgcacttgtt gagctcgtga aacacaagcc 5460
caaggcaaca aaagagcaac tgaaagctgt tatggatgat ttcgcagctt ttgtagagaa 5520
gtgctgcaag gctgacgata aggagacctg ctttgccgag gagggtaaaa aacttgttgc 5580
tgcaagtcaa gctgccttag gcttataggc ggccgc 5616
<210> 2
<211> 1095
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:1编码的多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(479)
<223> VWF D´D3 区 (VWF 氨基酸 764 - 1242)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (480)..(510)
<223> 甘氨酸/丝氨酸接头
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (511)..(1095)
<223> 人白蛋白
<400> 2
Ser Leu Ser Cys Arg Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp
1 5 10 15
Asn Leu Arg Ala Glu Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr
20 25 30
Asp Leu Glu Cys Met Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro
35 40 45
Pro Gly Met Val Arg His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys
50 55 60
Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys
65 70 75 80
Ile Gly Cys Asn Thr Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr
85 90 95
Asp His Val Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr
100 105 110
Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr
115 120 125
Val Leu Val Gln Asp Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile
130 135 140
Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys
145 150 155 160
Arg Val Thr Ile Leu Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly
165 170 175
Glu Val Asn Val Lys Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val
180 185 190
Val Glu Ser Gly Arg Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser
195 200 205
Val Val Trp Asp Arg His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr
210 215 220
Tyr Gln Glu Lys Val Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln
225 230 235 240
Asn Asn Asp Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val
245 250 255
Asp Phe Gly Asn Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg
260 265 270
Lys Val Pro Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met
275 280 285
Lys Gln Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val
290 295 300
Phe Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
305 310 315 320
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala Cys
325 330 335
Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln His Gly
340 345 350
Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln Ser Cys Glu
355 360 365
Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu Trp Arg Tyr Asn
370 375 380
Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln His Pro Glu Pro Leu
385 390 395 400
Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys His Ala His Cys Pro Pro
405 410 415
Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp
420 425 430
Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys
435 440 445
Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys
450 455 460
Asp Val Val Asn Leu Thr Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Ser
465 470 475 480
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
485 490 495
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Asp Ala
500 505 510
His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn
515 520 525
Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys
530 535 540
Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala
545 550 555 560
Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu
565 570 575
His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu
580 585 590
Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg
595 600 605
Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg
610 615 620
Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn
625 630 635 640
Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His
645 650 655
Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys
660 665 670
Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu
675 680 685
Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala
690 695 700
Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala
705 710 715 720
Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala
725 730 735
Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His
740 745 750
Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala
755 760 765
Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys
770 775 780
Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile
785 790 795 800
Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala
805 810 815
Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala
820 825 830
Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His
835 840 845
Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu
850 855 860
Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr
865 870 875 880
Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn
885 890 895
Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys
900 905 910
Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val
915 920 925
Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly
930 935 940
Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu
945 950 955 960
Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys
965 970 975
Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val
980 985 990
Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val
995 1000 1005
Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile
1010 1015 1020
Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
1025 1030 1035
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln
1040 1045 1050
Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys
1055 1060 1065
Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys
1070 1075 1080
Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
1085 1090 1095
<210> 3
<211> 8442
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(8442)
<400> 3
atg att cct gcc aga ttt gcc ggg gtg ctg ctt gct ctg gcc ctc att 48
Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
ttg cca ggg acc ctt tgt gca gaa gga act cgc ggc agg tca tcc acg 96
Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr
20 25 30
gcc cga tgc agc ctt ttc gga agt gac ttc gtc aac acc ttt gat ggg 144
Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly
35 40 45
agc atg tac agc ttt gcg gga tac tgc agt tac ctc ctg gca ggg ggc 192
Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly
50 55 60
tgc cag aaa cgc tcc ttc tcg att att ggg gac ttc cag aat ggc aag 240
Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys
65 70 75 80
aga gtg agc ctc tcc gtg tat ctt ggg gaa ttt ttt gac atc cat ttg 288
Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu
85 90 95
ttt gtc aat ggt acc gtg aca cag ggg gac caa aga gtc tcc atg ccc 336
Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro
100 105 110
tat gcc tcc aaa ggg ctg tat cta gaa act gag gct ggg tac tac aag 384
Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys
115 120 125
ctg tcc ggt gag gcc tat ggc ttt gtg gcc agg atc gat ggc agc ggc 432
Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly
130 135 140
aac ttt caa gtc ctg ctg tca gac aga tac ttc aac aag acc tgc ggg 480
Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly
145 150 155 160
ctg tgt ggc aac ttt aac atc ttt gct gaa gat gac ttt atg acc caa 528
Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln
165 170 175
gaa ggg acc ttg acc tcg gac cct tat gac ttt gcc aac tca tgg gct 576
Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala
180 185 190
ctg agc agt gga gaa cag tgg tgt gaa cgg gca tct cct ccc agc agc 624
Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser
195 200 205
tca tgc aac atc tcc tct ggg gaa atg cag aag ggc ctg tgg gag cag 672
Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln
210 215 220
tgc cag ctt ctg aag agc acc tcg gtg ttt gcc cgc tgc cac cct ctg 720
Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu
225 230 235 240
gtg gac ccc gag cct ttt gtg gcc ctg tgt gag aag act ttg tgt gag 768
Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu
245 250 255
tgt gct ggg ggg ctg gag tgc gcc tgc cct gcc ctc ctg gag tac gcc 816
Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala
260 265 270
cgg acc tgt gcc cag gag gga atg gtg ctg tac ggc tgg acc gac cac 864
Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His
275 280 285
agc gcg tgc agc cca gtg tgc cct gct ggt atg gag tat agg cag tgt 912
Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys
290 295 300
gtg tcc cct tgc gcc agg acc tgc cag agc ctg cac atc aat gaa atg 960
Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met
305 310 315 320
tgt cag gag cga tgc gtg gat ggc tgc agc tgc cct gag gga cag ctc 1008
Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu
325 330 335
ctg gat gaa ggc ctc tgc gtg gag agc acc gag tgt ccc tgc gtg cat 1056
Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His
340 345 350
tcc gga aag cgc tac cct ccc ggc acc tcc ctc tct cga gac tgc aac 1104
Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn
355 360 365
acc tgc att tgc cga aac agc cag tgg atc tgc agc aat gaa gaa tgt 1152
Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys
370 375 380
cca ggg gag tgc ctt gtc aca ggt caa tca cac ttc aag agc ttt gac 1200
Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp
385 390 395 400
aac aga tac ttc acc ttc agt ggg atc tgc cag tac ctg ctg gcc cgg 1248
Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg
405 410 415
gat tgc cag gac cac tcc ttc tcc att gtc att gag act gtc cag tgt 1296
Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys
420 425 430
gct gat gac cgc gac gct gtg tgc acc cgc tcc gtc acc gtc cgg ctg 1344
Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
435 440 445
cct ggc ctg cac aac agc ctt gtg aaa ctg aag cat ggg gca gga gtt 1392
Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val
450 455 460
gcc atg gat ggc cag gac gtc cag ctc ccc ctc ctg aaa ggt gac ctc 1440
Ala Met Asp Gly Gln Asp Val Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
465 470 475 480
cgc atc cag cat aca gtg acg gcc tcc gtg cgc ctc agc tac ggg gag 1488
Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu
485 490 495
gac ctg cag atg gac tgg gat ggc cgc ggg agg ctg ctg gtg aag ctg 1536
Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu
500 505 510
tcc ccc gtc tat gcc ggg aag acc tgc ggc ctg tgt ggg aat tac aat 1584
Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn
515 520 525
ggc aac cag ggc gac gac ttc ctt acc ccc tct ggg ctg gcg gag ccc 1632
Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro
530 535 540
cgg gtg gag gac ttc ggg aac gcc tgg aag ctg cac ggg gac tgc cag 1680
Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln
545 550 555 560
gac ctg cag aag cag cac agc gat ccc tgc gcc ctc aac ccg cgc atg 1728
Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met
565 570 575
acc agg ttc tcc gag gag gcg tgc gcg gtc ctg acg tcc ccc aca ttc 1776
Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
580 585 590
gag gcc tgc cat cgt gcc gtc agc ccg ctg ccc tac ctg cgg aac tgc 1824
Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys
595 600 605
cgc tac gac gtg tgc tcc tgc tcg gac ggc cgc gag tgc ctg tgc ggc 1872
Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly
610 615 620
gcc ctg gcc agc tat gcc gcg gcc tgc gcg ggg aga ggc gtg cgc gtc 1920
Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val
625 630 635 640
gcg tgg cgc gag cca ggc cgc tgt gag ctg aac tgc ccg aaa ggc cag 1968
Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln
645 650 655
gtg tac ctg cag tgc ggg acc ccc tgc aac ctg acc tgc cgc tct ctc 2016
Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu
660 665 670
tct tac ccg gat gag gaa tgc aat gag gcc tgc ctg gag ggc tgc ttc 2064
Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe
675 680 685
tgc ccc cca ggg ctc tac atg gat gag agg ggg gac tgc gtg ccc aag 2112
Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys
690 695 700
gcc cag tgc ccc tgt tac tat gac ggt gag atc ttc cag cca gaa gac 2160
Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp
705 710 715 720
atc ttc tca gac cat cac acc atg tgc tac tgt gag gat ggc ttc atg 2208
Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met
725 730 735
cac tgt acc atg agt gga gtc ccc gga agc ttg ctg cct gac gct gtc 2256
His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val
740 745 750
ctc agc agt ccc ctg tct cat cgc agc aaa agg agc cta tcc tgt cgg 2304
Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg
755 760 765
ccc ccc atg gtc aag ctg gtg tgt ccc gct gac aac ctg cgg gct gaa 2352
Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu
770 775 780
ggg ctc gag tgt acc aaa acg tgc cag aac tat gac ctg gag tgc atg 2400
Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met
785 790 795 800
agc atg ggc tgt gtc tct ggc tgc ctc tgc ccc ccg ggc atg gtc cgg 2448
Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg
805 810 815
cat gag aac aga tgt gtg gcc ctg gaa agg tgt ccc tgc ttc cat cag 2496
His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln
820 825 830
ggc aag gag tat gcc cct gga gaa aca gtg aag att ggc tgc aac act 2544
Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr
835 840 845
tgt gtc tgt cgg gac cgg aag tgg aac tgc aca gac cat gtg tgt gat 2592
Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp
850 855 860
gcc acg tgc tcc acg atc ggc atg gcc cac tac ctc acc ttc gac ggg 2640
Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly
865 870 875 880
ctc aaa tac ctg ttc ccc ggg gag tgc cag tac gtt ctg gtg cag gat 2688
Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp
885 890 895
tac tgc ggc agt aac cct ggg acc ttt cgg atc cta gtg ggg aat aag 2736
Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys
900 905 910
gga tgc agc cac ccc tca gtg aaa tgc aag aaa cgg gtc acc atc ctg 2784
Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu
915 920 925
gtg gag gga gga gag att gag ctg ttt gac ggg gag gtg aat gtg aag 2832
Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys
930 935 940
agg ccc atg aag gat gag act cac ttt gag gtg gtg gag tct ggc cgg 2880
Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg
945 950 955 960
tac atc att ctg ctg ctg ggc aaa gcc ctc tcc gtg gtc tgg gac cgc 2928
Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
965 970 975
cac ctg agc atc tcc gtg gtc ctg aag cag aca tac cag gag aaa gtg 2976
His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val
980 985 990
tgt ggc ctg tgt ggg aat ttt gat ggc atc cag aac aat gac ctc acc 3024
Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr
995 1000 1005
agc agc aac ctc caa gtg gag gaa gac cct gtg gac ttt ggg aac 3069
Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn
1010 1015 1020
tcc tgg aaa gtg agc tcg cag tgt gct gac acc aga aaa gtg cct 3114
Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro
1025 1030 1035
ctg gac tca tcc cct gcc acc tgc cat aac aac atc atg aag cag 3159
Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln
1040 1045 1050
acg atg gtg gat tcc tcc tgt aga atc ctt acc agt gac gtc ttc 3204
Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe
1055 1060 1065
cag gac tgc aac aag ctg gtg gac ccc gag cca tat ctg gat gtc 3249
Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
1070 1075 1080
tgc att tac gac acc tgc tcc tgt gag tcc att ggg gac tgc gcc 3294
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
1085 1090 1095
tgc ttc tgc gac acc att gct gcc tat gcc cac gtg tgt gcc cag 3339
Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln
1100 1105 1110
cat ggc aag gtg gtg acc tgg agg acg gcc aca ttg tgc ccc cag 3384
His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln
1115 1120 1125
agc tgc gag gag agg aat ctc cgg gag aac ggg tat gag tgt gag 3429
Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu
1130 1135 1140
tgg cgc tat aac agc tgt gca cct gcc tgt caa gtc acg tgt cag 3474
Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln
1145 1150 1155
cac cct gag cca ctg gcc tgc cct gtg cag tgt gtg gag ggc tgc 3519
His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys
1160 1165 1170
cat gcc cac tgc cct cca ggg aaa atc ctg gat gag ctt ttg cag 3564
His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
1175 1180 1185
acc tgc gtt gac cct gaa gac tgt cca gtg tgt gag gtg gct ggc 3609
Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly
1190 1195 1200
cgg cgt ttt gcc tca gga aag aaa gtc acc ttg aat ccc agt gac 3654
Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp
1205 1210 1215
cct gag cac tgc cag att tgc cac tgt gat gtt gtc aac ctc acc 3699
Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr
1220 1225 1230
tgt gaa gcc tgc cag gag ccg gga ggc ctg gtg gtg cct ccc aca 3744
Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr
1235 1240 1245
gat gcc ccg gtg agc ccc acc act ctg tat gtg gag gac atc tcg 3789
Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser
1250 1255 1260
gaa ccg ccg ttg cac gat ttc tac tgc agc agg cta ctg gac ctg 3834
Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu
1265 1270 1275
gtc ttc ctg ctg gat ggc tcc tcc agg ctg tcc gag gct gag ttt 3879
Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe
1280 1285 1290
gaa gtg ctg aag gcc ttt gtg gtg gac atg atg gag cgg ctg cgc 3924
Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg
1295 1300 1305
atc tcc cag aag tgg gtc cgc gtg gcc gtg gtg gag tac cac gac 3969
Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp
1310 1315 1320
ggc tcc cac gcc tac atc ggg ctc aag gac cgg aag cga ccg tca 4014
Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser
1325 1330 1335
gag ctg cgg cgc att gcc agc cag gtg aag tat gcg ggc agc cag 4059
Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln
1340 1345 1350
gtg gcc tcc acc agc gag gtc ttg aaa tac aca ctg ttc caa atc 4104
Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile
1355 1360 1365
ttc agc aag atc gac cgc cct gaa gcc tcc cgc atc gcc ctg ctc 4149
Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Ala Leu Leu
1370 1375 1380
ctg atg gcc agc cag gag ccc caa cgg atg tcc cgg aac ttt gtc 4194
Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val
1385 1390 1395
cgc tac gtc cag ggc ctg aag aag aag aag gtc att gtg atc ccg 4239
Arg Tyr Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro
1400 1405 1410
gtg ggc att ggg ccc cat gcc aac ctc aag cag atc cgc ctc atc 4284
Val Gly Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile
1415 1420 1425
gag aag cag gcc cct gag aac aag gcc ttc gtg ctg agc agt gtg 4329
Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val
1430 1435 1440
gat gag ctg gag cag caa agg gac gag atc gtt agc tac ctc tgt 4374
Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys
1445 1450 1455
gac ctt gcc cct gaa gcc cct cct cct act ctg ccc ccc cac atg 4419
Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro His Met
1460 1465 1470
gca caa gtc act gtg ggc ccg ggg ctc ttg ggg gtt tcg acc ctg 4464
Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu
1475 1480 1485
ggg ccc aag agg aac tcc atg gtt ctg gat gtg gcg ttc gtc ctg 4509
Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu
1490 1495 1500
gaa gga tcg gac aaa att ggt gaa gcc gac ttc aac agg agc aag 4554
Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys
1505 1510 1515
gag ttc atg gag gag gtg att cag cgg atg gat gtg ggc cag gac 4599
Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly Gln Asp
1520 1525 1530
agc atc cac gtc acg gtg ctg cag tac tcc tac atg gtg acc gtg 4644
Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr Val
1535 1540 1545
gag tac ccc ttc agc gag gca cag tcc aaa ggg gac atc ctg cag 4689
Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln
1550 1555 1560
cgg gtg cga gag atc cgc tac cag ggc ggc aac agg acc aac act 4734
Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr
1565 1570 1575
ggg ctg gcc ctg cgg tac ctc tct gac cac agc ttc ttg gtc agc 4779
Gly Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser
1580 1585 1590
cag ggt gac cgg gag cag gcg ccc aac ctg gtc tac atg gtc acc 4824
Gln Gly Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr
1595 1600 1605
gga aat cct gcc tct gat gag atc aag agg ctg cct gga gac atc 4869
Gly Asn Pro Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile
1610 1615 1620
cag gtg gtg ccc att gga gtg ggc cct aat gcc aac gtg cag gag 4914
Gln Val Val Pro Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu
1625 1630 1635
ctg gag agg att ggc tgg ccc aat gcc cct atc ctc atc cag gac 4959
Leu Glu Arg Ile Gly Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp
1640 1645 1650
ttt gag acg ctc ccc cga gag gct cct gac ctg gtg ctg cag agg 5004
Phe Glu Thr Leu Pro Arg Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg
1655 1660 1665
tgc tgc tcc gga gag ggg ctg cag atc ccc acc ctc tcc cct gca 5049
Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala
1670 1675 1680
cct gac tgc agc cag ccc ctg gac gtg atc ctt ctc ctg gat ggc 5094
Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly
1685 1690 1695
tcc tcc agt ttc cca gct tct tat ttt gat gaa atg aag agt ttc 5139
Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe
1700 1705 1710
gcc aag gct ttc att tca aaa gcc aat ata ggg cct cgt ctc act 5184
Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile Gly Pro Arg Leu Thr
1715 1720 1725
cag gtg tca gtg ctg cag tat gga agc atc acc acc att gac gtg 5229
Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Thr Thr Ile Asp Val
1730 1735 1740
cca tgg aac gtg gtc ccg gag aaa gcc cat ttg ctg agc ctt gtg 5274
Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu Ser Leu Val
1745 1750 1755
gac gtc atg cag cgg gag gga ggc ccc agc caa atc ggg gat gcc 5319
Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly Asp Ala
1760 1765 1770
ttg ggc ttt gct gtg cga tac ttg act tca gaa atg cat ggg gcg 5364
Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His Gly Ala
1775 1780 1785
cgc ccg gga gcc tca aag gcg gtg gtc atc ctg gtc acg gac gtc 5409
Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu Val Thr Asp Val
1790 1795 1800
tct gtg gat tca gtg gat gca gca gct gat gcc gcc agg tcc aac 5454
Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg Ser Asn
1805 1810 1815
aga gtg aca gtg ttc cct att gga att gga gat cgc tac gat gca 5499
Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr Asp Ala
1820 1825 1830
gcc cag cta cgg atc ttg gca ggc cca gca ggc gac tcc aac gtg 5544
Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser Asn Val
1835 1840 1845
gtg aag ctc cag cga atc gaa gac ctc cct acc atg gtc acc ttg 5589
Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Met Val Thr Leu
1850 1855 1860
ggc aat tcc ttc ctc cac aaa ctg tgc tct gga ttt gtt agg att 5634
Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val Arg Ile
1865 1870 1875
tgc atg gat gag gat ggg aat gag aag agg ccc ggg gac gtc tgg 5679
Cys Met Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys Arg Pro Gly Asp Val Trp
1880 1885 1890
acc ttg cca gac cag tgc cac acc gtg act tgc cag cca gat ggc 5724
Thr Leu Pro Asp Gln Cys His Thr Val Thr Cys Gln Pro Asp Gly
1895 1900 1905
cag acc ttg ctg aag agt cat cgg gtc aac tgt gac cgg ggg ctg 5769
Gln Thr Leu Leu Lys Ser His Arg Val Asn Cys Asp Arg Gly Leu
1910 1915 1920
agg cct tcg tgc cct aac agc cag tcc cct gtt aaa gtg gaa gag 5814
Arg Pro Ser Cys Pro Asn Ser Gln Ser Pro Val Lys Val Glu Glu
1925 1930 1935
acc tgt ggc tgc cgc tgg acc tgc ccc tgc gtg tgc aca ggc agc 5859
Thr Cys Gly Cys Arg Trp Thr Cys Pro Cys Val Cys Thr Gly Ser
1940 1945 1950
tcc act cgg cac atc gtg acc ttt gat ggg cag aat ttc aag ctg 5904
Ser Thr Arg His Ile Val Thr Phe Asp Gly Gln Asn Phe Lys Leu
1955 1960 1965
act ggc agc tgt tct tat gtc cta ttt caa aac aag gag cag gac 5949
Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val Leu Phe Gln Asn Lys Glu Gln Asp
1970 1975 1980
ctg gag gtg att ctc cat aat ggt gcc tgc agc cct gga gca agg 5994
Leu Glu Val Ile Leu His Asn Gly Ala Cys Ser Pro Gly Ala Arg
1985 1990 1995
cag ggc tgc atg aaa tcc atc gag gtg aag cac agt gcc ctc tcc 6039
Gln Gly Cys Met Lys Ser Ile Glu Val Lys His Ser Ala Leu Ser
2000 2005 2010
gtc gag ctg cac agt gac atg gag gtg acg gtg aat ggg aga ctg 6084
Val Glu Leu His Ser Asp Met Glu Val Thr Val Asn Gly Arg Leu
2015 2020 2025
gtc tct gtt cct tac gtg ggt ggg aac atg gaa gtc aac gtt tat 6129
Val Ser Val Pro Tyr Val Gly Gly Asn Met Glu Val Asn Val Tyr
2030 2035 2040
ggt gcc atc atg cat gag gtc aga ttc aat cac ctt ggt cac atc 6174
Gly Ala Ile Met His Glu Val Arg Phe Asn His Leu Gly His Ile
2045 2050 2055
ttc aca ttc act cca caa aac aat gag ttc caa ctg cag ctc agc 6219
Phe Thr Phe Thr Pro Gln Asn Asn Glu Phe Gln Leu Gln Leu Ser
2060 2065 2070
ccc aag act ttt gct tca aag acg tat ggt ctg tgt ggg atc tgt 6264
Pro Lys Thr Phe Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Leu Cys Gly Ile Cys
2075 2080 2085
gat gag aac gga gcc aat gac ttc atg ctg agg gat ggc aca gtc 6309
Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp Phe Met Leu Arg Asp Gly Thr Val
2090 2095 2100
acc aca gac tgg aaa aca ctt gtt cag gaa tgg act gtg cag cgg 6354
Thr Thr Asp Trp Lys Thr Leu Val Gln Glu Trp Thr Val Gln Arg
2105 2110 2115
cca ggg cag acg tgc cag ccc atc ctg gag gag cag tgt ctt gtc 6399
Pro Gly Gln Thr Cys Gln Pro Ile Leu Glu Glu Gln Cys Leu Val
2120 2125 2130
ccc gac agc tcc cac tgc cag gtc ctc ctc tta cca ctg ttt gct 6444
Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu Leu Leu Pro Leu Phe Ala
2135 2140 2145
gaa tgc cac aag gtc ctg gct cca gcc aca ttc tat gcc atc tgc 6489
Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala Thr Phe Tyr Ala Ile Cys
2150 2155 2160
cag cag gac agt tgc cac cag gag caa gtg tgt gag gtg atc gcc 6534
Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu Gln Val Cys Glu Val Ile Ala
2165 2170 2175
tct tat gcc cac ctc tgt cgg acc aac ggg gtc tgc gtt gac tgg 6579
Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn Gly Val Cys Val Asp Trp
2180 2185 2190
agg aca cct gat ttc tgt gct atg tca tgc cca cca tct ctg gtt 6624
Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser Cys Pro Pro Ser Leu Val
2195 2200 2205
tat aac cac tgt gag cat ggc tgt ccc cgg cac tgt gat ggc aac 6669
Tyr Asn His Cys Glu His Gly Cys Pro Arg His Cys Asp Gly Asn
2210 2215 2220
gtg agc tcc tgt ggg gac cat ccc tcc gaa ggc tgt ttc tgc cct 6714
Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser Glu Gly Cys Phe Cys Pro
2225 2230 2235
cca gat aaa gtc atg ttg gaa ggc agc tgt gtc cct gaa gag gcc 6759
Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser Cys Val Pro Glu Glu Ala
2240 2245 2250
tgc act cag tgc att ggt gag gat gga gtc cag cac cag ttc ctg 6804
Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly Val Gln His Gln Phe Leu
2255 2260 2265
gaa gcc tgg gtc ccg gac cac cag ccc tgt cag atc tgc aca tgc 6849
Glu Ala Trp Val Pro Asp His Gln Pro Cys Gln Ile Cys Thr Cys
2270 2275 2280
ctc agc ggg cgg aag gtc aac tgc aca acg cag ccc tgc ccc acg 6894
Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro Cys Pro Thr
2285 2290 2295
gcc aaa gct ccc acg tgt ggc ctg tgt gaa gta gcc cgc ctc cgc 6939
Ala Lys Ala Pro Thr Cys Gly Leu Cys Glu Val Ala Arg Leu Arg
2300 2305 2310
cag aat gca gac cag tgc tgc ccc gag tat gag tgt gtg tgt gac 6984
Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu Tyr Glu Cys Val Cys Asp
2315 2320 2325
cca gtg agc tgt gac ctg ccc cca gtg cct cac tgt gaa cgt ggc 7029
Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro Pro Val Pro His Cys Glu Arg Gly
2330 2335 2340
ctc cag ccc aca ctg acc aac cct ggc gag tgc aga ccc aac ttc 7074
Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly Glu Cys Arg Pro Asn Phe
2345 2350 2355
acc tgc gcc tgc agg aag gag gag tgc aaa aga gtg tcc cca ccc 7119
Thr Cys Ala Cys Arg Lys Glu Glu Cys Lys Arg Val Ser Pro Pro
2360 2365 2370
tcc tgc ccc ccg cac cgt ttg ccc acc ctt cgg aag acc cag tgc 7164
Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr Leu Arg Lys Thr Gln Cys
2375 2380 2385
tgt gat gag tat gag tgt gcc tgc aac tgt gtc aac tcc aca gtg 7209
Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn Cys Val Asn Ser Thr Val
2390 2395 2400
agc tgt ccc ctt ggg tac ttg gcc tca acc gcc acc aat gac tgt 7254
Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser Thr Ala Thr Asn Asp Cys
2405 2410 2415
ggc tgt acc aca acc acc tgc ctt ccc gac aag gtg tgt gtc cac 7299
Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro Asp Lys Val Cys Val His
2420 2425 2430
cga agc acc atc tac cct gtg ggc cag ttc tgg gag gag ggc tgc 7344
Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln Phe Trp Glu Glu Gly Cys
2435 2440 2445
gat gtg tgc acc tgc acc gac atg gag gat gcc gtg atg ggc ctc 7389
Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu Asp Ala Val Met Gly Leu
2450 2455 2460
cgc gtg gcc cag tgc tcc cag aag ccc tgt gag gac agc tgt cgg 7434
Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro Cys Glu Asp Ser Cys Arg
2465 2470 2475
tcg ggc ttc act tac gtt ctg cat gaa ggc gag tgc tgt gga agg 7479
Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys Gly Arg
2480 2485 2490
tgc ctg cca tct gcc tgt gag gtg gtg act ggc tca ccg cgg ggg 7524
Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro Arg Gly
2495 2500 2505
gac tcc cag tct tcc tgg aag agt gtc ggc tcc cag tgg gcc tcc 7569
Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp Ala Ser
2510 2515 2520
ccg gag aac ccc tgc ctc atc aat gag tgt gtc cga gtg aag gag 7614
Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu Cys Val Arg Val Lys Glu
2525 2530 2535
gag gtc ttt ata caa caa agg aac gtc tcc tgc ccc cag ctg gag 7659
Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val Ser Cys Pro Gln Leu Glu
2540 2545 2550
gtc cct gtc tgc ccc tcg ggc ttt cag ctg agc tgt aag acc tca 7704
Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys Thr Ser
2555 2560 2565
gcg tgc tgc cca agc tgt cgc tgt gag cgc atg gag gcc tgc atg 7749
Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu Ala Cys Met
2570 2575 2580
ctc aat ggc act gtc att ggg ccc ggg aag act gtg atg atc gat 7794
Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly Lys Thr Val Met Ile Asp
2585 2590 2595
gtg tgc acg acc tgc cgc tgc atg gtg cag gtg ggg gtc atc tct 7839
Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val Gln Val Gly Val Ile Ser
2600 2605 2610
gga ttc aag ctg gag tgc agg aag acc acc tgc aac ccc tgc ccc 7884
Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr Thr Cys Asn Pro Cys Pro
2615 2620 2625
ctg ggt tac aag gaa gaa aat aac aca ggt gaa tgt tgt ggg aga 7929
Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys Cys Gly Arg
2630 2635 2640
tgt ttg cct acg gct tgc acc att cag cta aga gga gga cag atc 7974
Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln Leu Arg Gly Gly Gln Ile
2645 2650 2655
atg aca ctg aag cgt gat gag acg ctc cag gat ggc tgt gat act 8019
Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gln Asp Gly Cys Asp Thr
2660 2665 2670
cac ttc tgc aag gtc aat gag aga gga gag tac ttc tgg gag aag 8064
His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe Trp Glu Lys
2675 2680 2685
agg gtc aca ggc tgc cca ccc ttt gat gaa cac aag tgt ctg gct 8109
Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys Cys Leu Ala
2690 2695 2700
gag gga ggt aaa att atg aaa att cca ggc acc tgc tgt gac aca 8154
Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys Cys Asp Thr
2705 2710 2715
tgt gag gag cct gag tgc aac gac atc act gcc agg ctg cag tat 8199
Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg Leu Gln Tyr
2720 2725 2730
gtc aag gtg gga agc tgt aag tct gaa gta gag gtg gat atc cac 8244
Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp Ile His
2735 2740 2745
tac tgc cag ggc aaa tgt gcc agc aaa gcc atg tac tcc att gac 8289
Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr Ser Ile Asp
2750 2755 2760
atc aac gat gtg cag gac cag tgc tcc tgc tgc tct ccg aca cgg 8334
Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser Pro Thr Arg
2765 2770 2775
acg gag ccc atg cag gtg gcc ctg cac tgc acc aat ggc tct gtt 8379
Thr Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His Cys Thr Asn Gly Ser Val
2780 2785 2790
gtg tac cat gag gtt ctc aat gcc atg gag tgc aaa tgc tcc ccc 8424
Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys Ser Pro
2795 2800 2805
agg aag tgc agc aag tga 8442
Arg Lys Cys Ser Lys
2810
<210> 4
<211> 2813
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 4
Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly
35 40 45
Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly
50 55 60
Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys
65 70 75 80
Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu
85 90 95
Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro
100 105 110
Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys
115 120 125
Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly
130 135 140
Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly
145 150 155 160
Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln
165 170 175
Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala
180 185 190
Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln
210 215 220
Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu
225 230 235 240
Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu
245 250 255
Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala
260 265 270
Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His
275 280 285
Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys
290 295 300
Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met
305 310 315 320
Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu
325 330 335
Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His
340 345 350
Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn
355 360 365
Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys
370 375 380
Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp
385 390 395 400
Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg
405 410 415
Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys
420 425 430
Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
435 440 445
Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val
450 455 460
Ala Met Asp Gly Gln Asp Val Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
465 470 475 480
Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu
485 490 495
Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu
500 505 510
Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn
515 520 525
Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro
530 535 540
Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln
545 550 555 560
Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met
565 570 575
Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
580 585 590
Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys
595 600 605
Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly
610 615 620
Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val
625 630 635 640
Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln
645 650 655
Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu
660 665 670
Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe
675 680 685
Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys
690 695 700
Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp
705 710 715 720
Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met
725 730 735
His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val
740 745 750
Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg
755 760 765
Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu
770 775 780
Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met
785 790 795 800
Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg
805 810 815
His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln
820 825 830
Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr
835 840 845
Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp
850 855 860
Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly
865 870 875 880
Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp
885 890 895
Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys
900 905 910
Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu
915 920 925
Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys
930 935 940
Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg
945 950 955 960
Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
965 970 975
His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val
980 985 990
Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr
995 1000 1005
Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn
1010 1015 1020
Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro
1025 1030 1035
Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln
1040 1045 1050
Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe
1055 1060 1065
Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
1070 1075 1080
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
1085 1090 1095
Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln
1100 1105 1110
His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln
1115 1120 1125
Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu
1130 1135 1140
Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln
1145 1150 1155
His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys
1160 1165 1170
His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
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Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly
1190 1195 1200
Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp
1205 1210 1215
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1220 1225 1230
Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr
1235 1240 1245
Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser
1250 1255 1260
Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu
1265 1270 1275
Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe
1280 1285 1290
Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg
1295 1300 1305
Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp
1310 1315 1320
Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser
1325 1330 1335
Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln
1340 1345 1350
Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile
1355 1360 1365
Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Ala Leu Leu
1370 1375 1380
Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val
1385 1390 1395
Arg Tyr Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro
1400 1405 1410
Val Gly Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile
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Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val
1430 1435 1440
Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys
1445 1450 1455
Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro His Met
1460 1465 1470
Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu
1475 1480 1485
Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu
1490 1495 1500
Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys
1505 1510 1515
Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly Gln Asp
1520 1525 1530
Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr Val
1535 1540 1545
Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln
1550 1555 1560
Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr
1565 1570 1575
Gly Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser
1580 1585 1590
Gln Gly Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr
1595 1600 1605
Gly Asn Pro Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile
1610 1615 1620
Gln Val Val Pro Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu
1625 1630 1635
Leu Glu Arg Ile Gly Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp
1640 1645 1650
Phe Glu Thr Leu Pro Arg Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg
1655 1660 1665
Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala
1670 1675 1680
Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly
1685 1690 1695
Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe
1700 1705 1710
Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile Gly Pro Arg Leu Thr
1715 1720 1725
Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Thr Thr Ile Asp Val
1730 1735 1740
Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu Ser Leu Val
1745 1750 1755
Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly Asp Ala
1760 1765 1770
Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His Gly Ala
1775 1780 1785
Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu Val Thr Asp Val
1790 1795 1800
Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg Ser Asn
1805 1810 1815
Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr Asp Ala
1820 1825 1830
Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser Asn Val
1835 1840 1845
Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Met Val Thr Leu
1850 1855 1860
Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val Arg Ile
1865 1870 1875
Cys Met Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys Arg Pro Gly Asp Val Trp
1880 1885 1890
Thr Leu Pro Asp Gln Cys His Thr Val Thr Cys Gln Pro Asp Gly
1895 1900 1905
Gln Thr Leu Leu Lys Ser His Arg Val Asn Cys Asp Arg Gly Leu
1910 1915 1920
Arg Pro Ser Cys Pro Asn Ser Gln Ser Pro Val Lys Val Glu Glu
1925 1930 1935
Thr Cys Gly Cys Arg Trp Thr Cys Pro Cys Val Cys Thr Gly Ser
1940 1945 1950
Ser Thr Arg His Ile Val Thr Phe Asp Gly Gln Asn Phe Lys Leu
1955 1960 1965
Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val Leu Phe Gln Asn Lys Glu Gln Asp
1970 1975 1980
Leu Glu Val Ile Leu His Asn Gly Ala Cys Ser Pro Gly Ala Arg
1985 1990 1995
Gln Gly Cys Met Lys Ser Ile Glu Val Lys His Ser Ala Leu Ser
2000 2005 2010
Val Glu Leu His Ser Asp Met Glu Val Thr Val Asn Gly Arg Leu
2015 2020 2025
Val Ser Val Pro Tyr Val Gly Gly Asn Met Glu Val Asn Val Tyr
2030 2035 2040
Gly Ala Ile Met His Glu Val Arg Phe Asn His Leu Gly His Ile
2045 2050 2055
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2060 2065 2070
Pro Lys Thr Phe Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Leu Cys Gly Ile Cys
2075 2080 2085
Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp Phe Met Leu Arg Asp Gly Thr Val
2090 2095 2100
Thr Thr Asp Trp Lys Thr Leu Val Gln Glu Trp Thr Val Gln Arg
2105 2110 2115
Pro Gly Gln Thr Cys Gln Pro Ile Leu Glu Glu Gln Cys Leu Val
2120 2125 2130
Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu Leu Leu Pro Leu Phe Ala
2135 2140 2145
Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala Thr Phe Tyr Ala Ile Cys
2150 2155 2160
Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu Gln Val Cys Glu Val Ile Ala
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Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn Gly Val Cys Val Asp Trp
2180 2185 2190
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2195 2200 2205
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2210 2215 2220
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2240 2245 2250
Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly Val Gln His Gln Phe Leu
2255 2260 2265
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2270 2275 2280
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2285 2290 2295
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2300 2305 2310
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2330 2335 2340
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2345 2350 2355
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2360 2365 2370
Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr Leu Arg Lys Thr Gln Cys
2375 2380 2385
Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn Cys Val Asn Ser Thr Val
2390 2395 2400
Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser Thr Ala Thr Asn Asp Cys
2405 2410 2415
Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro Asp Lys Val Cys Val His
2420 2425 2430
Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln Phe Trp Glu Glu Gly Cys
2435 2440 2445
Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu Asp Ala Val Met Gly Leu
2450 2455 2460
Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro Cys Glu Asp Ser Cys Arg
2465 2470 2475
Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys Gly Arg
2480 2485 2490
Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro Arg Gly
2495 2500 2505
Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp Ala Ser
2510 2515 2520
Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu Cys Val Arg Val Lys Glu
2525 2530 2535
Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val Ser Cys Pro Gln Leu Glu
2540 2545 2550
Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys Thr Ser
2555 2560 2565
Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu Ala Cys Met
2570 2575 2580
Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly Lys Thr Val Met Ile Asp
2585 2590 2595
Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val Gln Val Gly Val Ile Ser
2600 2605 2610
Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr Thr Cys Asn Pro Cys Pro
2615 2620 2625
Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys Cys Gly Arg
2630 2635 2640
Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln Leu Arg Gly Gly Gln Ile
2645 2650 2655
Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gln Asp Gly Cys Asp Thr
2660 2665 2670
His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe Trp Glu Lys
2675 2680 2685
Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys Cys Leu Ala
2690 2695 2700
Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys Cys Asp Thr
2705 2710 2715
Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg Leu Gln Tyr
2720 2725 2730
Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp Ile His
2735 2740 2745
Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr Ser Ile Asp
2750 2755 2760
Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser Pro Thr Arg
2765 2770 2775
Thr Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His Cys Thr Asn Gly Ser Val
2780 2785 2790
Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys Ser Pro
2795 2800 2805
Arg Lys Cys Ser Lys
2810
<210> 5
<211> 1444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链因子 viii 分子的氨基酸序列
<400> 5
Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr
1 5 10 15
Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro
20 25 30
Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys
35 40 45
Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro
50 55 60
Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val
65 70 75 80
Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val
85 90 95
Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala
100 105 110
Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val
115 120 125
Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn
130 135 140
Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser
145 150 155 160
His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu
165 170 175
Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu
180 185 190
His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp
195 200 205
His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser
210 215 220
Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg
225 230 235 240
Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His
245 250 255
Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu
260 265 270
Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile
275 280 285
Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly
290 295 300
Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg
325 330 335
Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp
340 345 350
Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe
355 360 365
Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His
370 375 380
Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu
385 390 395 400
Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro
405 410 415
Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr
420 425 430
Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile
435 440 445
Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile
450 455 460
Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile
465 470 475 480
Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys
485 490 495
His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys
500 505 510
Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys
515 520 525
Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala
530 535 540
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp
545 550 555 560
Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe
565 570 575
Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln
580 585 590
Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe
595 600 605
Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser
610 615 620
Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu
625 630 635 640
Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr
645 650 655
Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro
660 665 670
Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp
675 680 685
Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala
690 695 700
Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu
705 710 715 720
Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala
725 730 735
Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro Ser Thr Arg
740 745 750
Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Thr Thr Leu Gln
755 760 765
Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met
770 775 780
Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro
785 790 795 800
Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu
805 810 815
Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn
820 825 830
Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln
835 840 845
Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu
850 855 860
Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu
865 870 875 880
Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser
885 890 895
Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala
900 905 910
Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe
915 920 925
Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys
930 935 940
Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His
945 950 955 960
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn
965 970 975
Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe
980 985 990
Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu
995 1000 1005
Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr
1010 1015 1020
Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met
1025 1030 1035
Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg
1040 1045 1050
Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile
1055 1060 1065
His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr
1070 1075 1080
Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val
1085 1090 1095
Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu
1100 1105 1110
Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val
1115 1120 1125
Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His
1130 1135 1140
Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp
1145 1150 1155
Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala
1160 1165 1170
Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu
1175 1180 1185
Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln
1190 1195 1200
Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser
1205 1210 1215
Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly
1220 1225 1230
Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys
1235 1240 1245
His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu
1250 1255 1260
His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu
1265 1270 1275
Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu
1280 1285 1290
Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe
1295 1300 1305
Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His
1310 1315 1320
Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro
1325 1330 1335
Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr
1340 1345 1350
Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr
1355 1360 1365
Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp
1370 1375 1380
Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn
1385 1390 1395
Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu
1400 1405 1410
Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln
1415 1420 1425
Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu
1430 1435 1440
Tyr
<210> 6
<211> 585
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 6
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
100 105 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
340 345 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
355 360 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
580 585
<210> 7
<211> 584
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> His-标签的 CTP 融合蛋白
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(479)
<223> VWF D´D3 区 (VWF 氨基酸 764 - 1242)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (480)..(511)
<223> 甘氨酸 / 丝氨酸接头
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (512)..(576)
<223> 人绒毛膜促性腺激素β亚基的C-末端肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (577)..(584)
<223> 聚组氨酸标签
<400> 7
Ser Leu Ser Cys Arg Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp
1 5 10 15
Asn Leu Arg Ala Glu Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr
20 25 30
Asp Leu Glu Cys Met Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro
35 40 45
Pro Gly Met Val Arg His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys
50 55 60
Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys
65 70 75 80
Ile Gly Cys Asn Thr Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr
85 90 95
Asp His Val Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr
100 105 110
Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr
115 120 125
Val Leu Val Gln Asp Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile
130 135 140
Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys
145 150 155 160
Arg Val Thr Ile Leu Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly
165 170 175
Glu Val Asn Val Lys Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val
180 185 190
Val Glu Ser Gly Arg Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser
195 200 205
Val Val Trp Asp Arg His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr
210 215 220
Tyr Gln Glu Lys Val Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln
225 230 235 240
Asn Asn Asp Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val
245 250 255
Asp Phe Gly Asn Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg
260 265 270
Lys Val Pro Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met
275 280 285
Lys Gln Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val
290 295 300
Phe Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
305 310 315 320
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala Cys
325 330 335
Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln His Gly
340 345 350
Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln Ser Cys Glu
355 360 365
Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu Trp Arg Tyr Asn
370 375 380
Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln His Pro Glu Pro Leu
385 390 395 400
Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys His Ala His Cys Pro Pro
405 410 415
Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp
420 425 430
Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys
435 440 445
Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys
450 455 460
Asp Val Val Asn Leu Thr Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Ser
465 470 475 480
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
485 490 495
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ala
500 505 510
Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg
515 520 525
Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ala Ser Ser Ser
530 535 540
Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly
545 550 555 560
Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ala Gly Gly Ser Gly Gly Ser
565 570 575
His His His His His His His His
580

Claims (21)

1.包含截短的冯维勒布兰德因子(VWF)和半衰期延长部分的多肽，所述多肽用于治疗凝血障碍的用途，所述治疗包括将所述多肽施用给患有凝血障碍且具有内源性因子VIII(FVIII)的受试者，
其中在用所述多肽治疗之前在所述受试者中内源性FVIII的活性水平相对于在正常人血浆(NHP)中FVIII的活性水平降低，条件是在所述受试者中内源性FVIII的活性水平为在正常人血浆(NHP)中内源性FVIII的活性水平的至少0.5％，
其中所述多肽能够结合内源性FVIII，并且
其中在施用所述多肽后内源性FVIII水平增加，并且其中
(i)施用所述多肽用于预防性预防出血事件，其中
(a)要么所述治疗不包括共同施用外源性FVIII，
(b)要么所述治疗包括施用外源性FVIII，从而在所述受试者中提供内源性FVIII；或者
(ii)所述多肽与外源性FVIII一起共同施用，用于治疗出血事件或用于开始预防性治疗方案，其中对于后续治疗，施用所述多肽而不共同施用外源性FVIII。
2.权利要求1的用途的多肽，其中所述截短的冯维勒布兰德因子(VWF)提供所述多肽结合内源性FVIII的能力。
3.权利要求1或2的用途的多肽，其中在将所述多肽施用至至少1％的水平后，内源性FVIII水平增加。
4.前述权利要求之任一项的用途的多肽，其中所述截短的冯维勒布兰德因子(VWF)是人截短的冯维勒布兰德因子(VWF)。
5.前述权利要求之任一项的用途的多肽，其中在用所述多肽治疗之前在所述受试者中内源性FVIII的活性水平是在NHP中内源性FVIII的活性水平的小于80％，小于60％，小于40％，小于30％，小于20％或小于10％。
6.前述权利要求之任一项的用途的多肽，其中在治疗前在所述受试者中内源性FVIII的活性水平优选为在NHP中内源性FVIII的活性水平的至少1％，至少2％，至少3％，至少4％或至少5％。
7.前述权利要求之任一项的用途的多肽，其中所述凝血障碍选自血友病A和冯维勒布兰德病。
8.前述权利要求之任一项的用途的多肽，其中所述受试者是人受试者。
9.前述权利要求之任一项的用途的多肽，其中所述多肽通过静脉内或血管外给药。
10.前述权利要求之任一项的用途的多肽，其中所述多肽是二聚体。
11.权利要求10的用途的多肽，其中所述二聚体与FVIII的亲和力大于单体多肽对所述FVIII的亲和力，所述单体多肽具有与二聚体多肽的单体亚基相同的氨基酸序列，其中所述多肽优选具有FVIII结合亲和力，其特征在于，解离常数KD小于1nM，优选小于500pM，小于200pM，小于100pM，小于90pM或小于80pM。
12.前述权利要求之任一项的用途的多肽，其中所述截短的VWF包含与SEQ ID NO：4的氨基酸776～805具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，优选包含与SEQ ID NO：4的氨基酸764～1242具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。
13.前述权利要求之任一项的用途的多肽，其中所述截短的VWF由下列序列组成：
(a)SEQ ID NO：4的氨基酸764～1242，
(b)与SEQ ID NO：4的氨基酸764～1242具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，或
(c)所述(a)或(b)的片段。
14.前述权利要求之任一项的用途的多肽，其中所述半衰期延长部分是与截短的VWF融合的异源氨基酸序列。
15.权利要求14的用途的多肽，其中所述异源氨基酸序列包含选自下列的多肽，或由选自下列的多肽组成：白蛋白或其片段，转铁蛋白或其片段，人绒毛膜促性腺激素C末端肽，XTEN序列，同型氨基酸重复序列(HAP)，脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸重复序列(PAS)，afamin，甲胎蛋白，维生素D结合蛋白，能够在生理条件下与白蛋白或免疫球蛋白恒定区结合的多肽，能够结合新生儿Fc受体(FcRn)、特别是免疫球蛋白恒定区及其部分、优选免疫球蛋白的Fc部分的多肽，及其组合。
16.权利要求1～13之任一项的用途的多肽，其中所述半衰期延长部分与所述多肽缀合。
17.权利要求16的用途的多肽，其中所述半衰期延长部分选自羟乙基淀粉(HES)，聚乙二醇(PEG)，聚唾液酸(PSA)，弹性蛋白样多肽，肝素原(heparosan)聚合物，透明质酸和白蛋白结合配体，例如脂肪酸链或白蛋白结合肽，及其组合。
18.前述权利要求之任一项的用途的多肽，其中所述内源性FVIII的药代动力学参数通过施用所述多肽得到改善，特别是其中所述内源性FVIII的平均停留时间(MRT)增加和/或所述内源性FVIII的半衰期延长和/或所述内源性FVIII的清除率降低。
19.前述权利要求之任一项的用途的多肽，其中所述多肽的血浆半衰期高于内源性VWF的血浆半衰期和/或高于正常人血浆(NHP)的VWF的血浆半衰期。
20.权利要求19的用途的多肽，其中所述多肽的血浆半衰期比所述内源性VWF的半衰期高至少25％和/或比正常人血浆(NHP)的VWF的半衰期高至少25％。
21.前述权利要求之任一项的用途的多肽，其中在施用所述多肽后，实现了所述受试者的内源性FVIII的活性水平的增加，
优选地，在施用多肽后，所述内源性FVIII的活性水平增加至生理学FVIII水平(100％＝1IU/mL)，或未实质上增加至生理学FVIII水平以上，
优选导致内源性FVIII活性水平增加分别不超过正常人血浆的血浆中的平均FVIII活性水平的300％＝3IU/mL，更优选不超过250％＝2.5IU/mL，不超过200％＝2IU/mL，不超过150％＝1.5IU/mL或不超过120％＝1.2IU/mL。
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