CN108472503A - 用于治疗血栓性疾病的可溶性糖蛋白v - Google Patents

用于治疗血栓性疾病的可溶性糖蛋白v Download PDF

Info

Publication number
CN108472503A
CN108472503A CN201680075541.8A CN201680075541A CN108472503A CN 108472503 A CN108472503 A CN 108472503A CN 201680075541 A CN201680075541 A CN 201680075541A CN 108472503 A CN108472503 A CN 108472503A
Authority
CN
China
Prior art keywords
leu
ala
gly
ser
arg
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201680075541.8A
Other languages
English (en)
Inventor
B·奈斯瓦恩特
S·贝克
D·斯特格奈尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Julius Maximilians Universitaet Wuerzburg
Original Assignee
Julius Maximilians Universitaet Wuerzburg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Julius Maximilians Universitaet Wuerzburg filed Critical Julius Maximilians Universitaet Wuerzburg
Publication of CN108472503A publication Critical patent/CN108472503A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/38—Albumins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/40—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/79—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

包含缺乏功能性跨膜结构域的修饰的糖蛋白V(GPV)的可溶性多肽，其用于治疗或预防受试者的血栓性疾病，所述治疗或预防包括向受试者施用有效量的所述可溶性多肽。

Description

用于治疗血栓性疾病的可溶性糖蛋白V
发明背景
在血管损伤部位的血小板活化和随后的血栓形成对于正常止血是至关重要的，但它也可能导致心肌梗塞和中风(Coughlin SR.Nature.2000；407：258-64)。血小板粘附和活化是涉及多个血小板受体-配体相互作用的多步过程。在血管壁损伤后，循环血小板通过糖蛋白(GP)Ib-V-IX复合物与固定在暴露的内皮下细胞外基质上(例如胶原上)的vonWillebrand因子(vWF)的瞬时相互作用快速减少(Shapiro MJ等人，The Journal ofBiological Chemistry.2000；275：25216-21)。这种相互作用使血小板靠近血管壁并促进GPVI和胶原之间的接触(Nieswandt B等人，Blood.2003；102：449-61)。GPVI-胶原相互作用诱导细胞内信号传导级联，导致血小板活化和次级血小板激动剂如血栓素A2(TxA2)和二磷酸腺苷(ADP)的释放。这些可溶激动剂与局部产生的凝血酶一起通过G蛋白(Gi，Gq，G12/13)偶联受体进一步促进血小板活化(Offermanns S，Circulation research.2006；99：1293-304)。所有这些信号传导途径协同诱导复合细胞应答，如整联蛋白的活化，颗粒内容物的释放和提供用于活化凝血级联的促凝血表面(Nakanishi-Matsui M等人，Nature.2000；404：609-13；Cunningham MA等人，The Journal of experimental medicine.2000；191：455-62)。最终的血栓被嵌入纤维蛋白网络中以承受由流动血液产生的剪切力。新形成的血栓的稳定对于在血管损伤部位阻止出血是必不可少的。然而，如果这个过程以不受控制的方式发生，它也可能导致引起危及生命的疾病状态如心肌梗塞或缺血性中风的血栓形成事件。因此，单独或组合使用的抗血小板药物和抗凝血药物对于治疗心脑血管疾病是重要的(MayF等人，Blood.2009；114：3464-72；Schroder J等人，Mol Cell Biol.2009；29：1083-94；Braun A等人，Blood.2009；113：2056-63)。虽然目前的抗血小板治疗减少血管事件的复发，但由血小板抑制引起的出血风险增加是已经历中风的患者特别关注的问题，并且还有一部分患者仍然对抗血小板治疗难以耐受(Pleines I等人，Pflugers Archiv：Europeanjournal of physiology.2009；457：1173-85)，从而强调需要新颖的抗血小板策略。
它们在血小板粘附中的中心作用使两种受体复合物成为血小板研究的焦点：i)GPIb-V-IX复合物与固定在受损血管壁或活化血小板上的vWF相互作用，从而将血小板从血流中募集到在高剪切条件下的反应性表面。ii)GPIIb/IIIa(整联蛋白αIIbβ3)是纤维蛋白原和vWF的受体，其需要由激动剂受体介导的内向外活化，有助于牢固抗剪切血小板粘附并且对于聚集体形成是必需的。GPIb-V-IX复合物由4种相关的跨膜GP组成：GPIbα，GPIbβ，GPV和GPIX，它们以2：4：2：1的化学计量结合(Luo SZ等人，Blood.2007；109(2)：603-9)。在这个复合体中，GPIbα和GPIbβ通过二硫键连接，并与GPIX非共价结合。GPV与GPIb-IX非共价结合(Nieswandt B等人，Journal of Thrombosis and Haemostasis.2009；7：206-9)。在人血小板表面上发现大约30,000个拷贝的GPIb-IX复合物(Varga-Szabo D等人，Journal ofThrombosis and Haemostasis.2009；7：1057-66)。GPIb-V-IX功能的丧失引起Bernard-Soulier综合征(BSS)，一种严重的出血性疾病。BSS的特征在于异常巨大的循环血小板，其对vWF的粘附有缺陷并且凝血酶响应性降低(Canobbio I，等人Cellular signaling.2004；16：1329-44)。尽管GPIb或GPIX缺乏或功能障碍与BSS相关，但未报道过GP5中的功能缺失突变，并且小鼠中GPV的缺乏不导致BSS表型(Ramakrishnan V等人，PNAS.1999；96：13336-41；Kahn ML等人，Blood.1999；94：4112-21)。GPV是复合物正确表达所不需要的唯一亚基(DongJ等人，Journal of Biological Chemistry.1998；273：31449-54)。WO 95/02054A2，US 6,005,089和Lanza F等人Journal of Biological Chemistry.1993；268:20801-20807公开了人GPV基因的序列和结构以及人GPV的氨基酸序列。GPV是高度糖基化的并且含有凝血酶切割位点，导致在凝血酶存在下GPV从血小板表面的定量去除和可溶性GPV(sGPV)的产生(Ravanat C等人，Blood.1997；89：3253-62；Azorsa DO等人，Thrombosis andHaemostasis.1999；81：131-8；White GC等人，Thrombosis Research.38：641-648)。通过凝血酶切割产生的可溶性人GPV具有如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。值得注意的是，该凝血酶切割位点在小鼠、大鼠和人蛋白中是保守的(Ravanat C等人，Blood.1997；89：3253-62)。然而，与对凝血酶刺激不响应的蛋白酶活化受体(PAR)4-缺陷型小鼠(Kahn ML等人，Blood.1999；94：4112-21；Kahn ML等人，Nature.1998；394：690-4)相比，Gp5-/-小鼠显示出非常正常的血小板功能。除了凝血酶之外，GPV可像GPIbα或GPVI一样被去整合素和金属蛋白酶(ADAM)家族的脱落酶(最显著的是ADAM17(也称为肿瘤坏死因子转化酶TACE)和ADAM10(Garton KJ等人，Journal of Biological Chemistry.2001；276：37993-8001；GardinerEE等人，Blood.2004；104：3611-7；Bergmeier W等人，Thrombosis and Haemostasis.2004；91：951-8))切割，这导致了sGPV稍微更长的变体。然而，凝血酶被认为是GPV表面表达的主要调节剂。SGPV水平在血浆和血清之间差异很大(分别为17.3±6.3ng/ml和1.2±0.17μg/ml)(Azorsa DO等人，Thrombosis and Haemostasis.1999；81：131-8)，并且sGPV水平在某些病理学条件例如缺血性中风下略微升高(相比于对照中的28.1ng/ml，为39.4ng/ml)(Wolff V等人，Stroke.2005；36：e17-9)。迄今为止，没有描述过sGPV在血栓形成或止血中的作用。
发明概述
发明人令人惊讶地发现可溶性GPV具有抗血栓作用，而不影响出血时间。因此，本发明提供了包含可溶性GPV的抗血栓剂。本发明涉及以下实施方案(1)至(36)：
(1)包含修饰的糖蛋白V(GPV)的可溶性多肽，其用于治疗和/或预防受试者中的血栓性疾病，所述治疗和/或预防包括向受试者施用有效量的所述可溶性多肽。
(2)根据第(1)项使用的可溶性多肽，其中所述血栓性疾病选自：血栓炎症性病症，静脉血栓形成，动脉血栓形成，毛细血管血栓形成，门静脉血栓形成，肾静脉血栓形成，颈静脉血栓形成，脑静脉窦血栓形成，血液与人造表面接触期间或之后的血栓形成，特别是体外膜式氧合(ECMO)，动脉粥样硬化，关节炎，凝血障碍，深静脉血栓形成(DVT)，弥散性血管内凝血障碍(DIC)，慢性或急性血栓栓塞症，肺血栓栓塞症，布加综合征，Paget-Schroetter病，中风和心肌梗塞。
(3)根据前述项中任一项使用的可溶性多肽，其中所述修饰的GPV是截短的GPV。
(4)根据前述项中任一项使用的可溶性多肽，其中所述修饰的GPV或截短的GPV由天然GPV的胞外结构域的片段组成，所述片段具有至少6个氨基酸的长度。
(5)根据前述项中任一项使用的可溶性多肽，其中所述修饰的GPV或截短的GPV由天然GPV的胞外结构域的片段组成，所述片段具有至少8个氨基酸的长度。
(6)根据前述项中任一项使用的可溶性多肽，其中所述修饰的GPV或截短的GPV由天然GPV的胞外结构域的片段组成，所述片段具有至少30个氨基酸的长度。
(7)根据前述项中任一项使用的可溶性多肽，其中所述修饰的GPV或截短的GPV由天然GPV的胞外结构域的片段组成，所述片段具有至少100个氨基酸的长度。
(8)根据前述项中任一项使用的可溶性多肽，其中所述修饰的GPV或截短的GPV由天然GPV的胞外结构域的片段组成，所述片段具有至少250个氨基酸的长度。
(9)根据前述项中任一项使用的可溶性多肽，其中所述修饰的GPV或截短的GPV由天然GPV的胞外结构域的片段组成，所述片段具有至少400个氨基酸的长度。
(10)根据(4)至(9)中任一项使用的可溶性多肽，其中所述片段具有抗血栓活性。
(11)根据(4)至(10)中任一项使用的可溶性多肽，其中所述片段在施用后基本上不影响出血时间。
(12)根据(4)至(11)中任一项使用的可溶性多肽，其中所述天然GPV由SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列构成，所述胞外结构域基本上由SEQ ID NO：3的氨基酸1-503组成。
(13)根据(4)至(11)中任一项使用的可溶性多肽，其中所述天然GPV由SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列构成，所述胞外结构域基本上由SEQ ID NO：7的氨基酸1-502组成。
(14)根据前述项中任一项使用的可溶性多肽，其中所述可溶性多肽是非天然存在的多肽。
(15)根据第(14)项使用的可溶性多肽，其还包含延长半衰期的部分。
(16)根据第(15)项使用的可溶性多肽，其中所述延长半衰期的部分直接或经由接头与所述修饰的GPV缀合。
(17)根据第(16)项使用的可溶性多肽，其中所述延长半衰期的部分选自羟乙基淀粉(HES)，聚乙二醇(PEG)，聚唾液酸(PSA)和白蛋白结合配体，例如脂肪酸链。
(18)根据第(15)项使用的可溶性多肽，其中所述延长半衰期的部分是与所述修饰的GPV直接或通过接头融合的异源氨基酸序列。
(19)根据第(18)项使用的可溶性多肽，其中半衰期延长的异源氨基酸序列包含选自以下的多肽或由其组成：白蛋白及其长度为至少100个氨基酸的片段，免疫球蛋白恒定区及其片段，特别是Fc片段，转铁蛋白及其片段，人绒毛膜促性腺激素的C端肽，具有大流体动力学体积的溶剂化随机链(XTEN)，同型氨基酸重复序列(HAP)，脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸重复序列(PAS)，afamin，甲胎蛋白，维生素D结合蛋白，能够在生理条件下结合白蛋白或免疫球蛋白恒定区的多肽，以及它们的组合。
(20)根据前述项中任一项使用的可溶性多肽，其中所述可溶性多肽可通过在真核细胞中重组表达而获得。
(21)根据第(20)项使用的可溶性多肽，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。
(22)根据第(21)项使用的可溶性多肽，其中所述哺乳动物细胞是CHO细胞。
(23)根据第(20)项使用的可溶性多肽，其中所述真核细胞是昆虫细胞，例如Sf9细胞。
(24)根据(1)至(19)中任一项使用的可溶性多肽，其中所述可溶性多肽可通过在原核细胞中例如在细菌细胞中重组表达而得到。
(25)根据前述项中任一项使用的可溶性多肽，其中所述可溶性多肽具有抗血栓活性。
(26)根据前述项中任一项使用的可溶性多肽，其中所述可溶性多肽基本上不影响施用后的出血时间。
(27)根据前述项中任一项使用的可溶性多肽，其中所述治疗和/或预防进一步包括向所述受试者施用抗血小板或抗凝血药物。
(28)药物组合物，其包含如项(1)至(26)中任一项所定义的可溶性多肽和药学上可接受的赋形剂。
(29)第(28)项的药物组合物，其中可溶性多肽不由SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列组成。
(30)一种治疗受试者中的血栓性疾病的方法，其包括向该受试者施用有效量的如项(1)至(26)中任一项所定义的可溶性多肽或项(28)或(29)的药物组合物。
(31)一种制备根据(1)至(26)中任一项使用的可溶性多肽的方法，包括在哺乳动物中表达编码如项(1)至(26)中任一项所定义的可溶性多肽的核酸细胞，和从培养基中回收可溶性多肽。
(32)如(5)至(26)中任一项所定义的非天然存在的可溶性GPV。
(33)第(32)项的非天然存在的可溶性GPV，其不由SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列组成。
(34)不由SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列组成的可溶性GPV。
(35)一种药物试剂盒，其包含(i)根据(1)至(26)中任一项所述的可溶性多肽和(ii)除所述可溶性多肽以外的抗血小板或抗凝血药物。
(36)第(35)项的药物试剂盒，其中可溶性多肽不由SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列组成。
附图的简要说明
图1：可溶性GPV在主动脉损伤模型中具有抗血栓作用。使用镊子通过单次紧压将腹主动脉机械性损伤，并用多普勒流量计监测血流量。显示了至最终闭塞的时间。A、B)注射可溶性人GPV(A：shGPV；B：shGPV-白蛋白-融合蛋白(AFP))或可溶性鼠GPV(C：smGPV)后的闭塞时间。每个符号代表一只单独的小鼠。在小鼠不能形成闭塞性血栓的情况下，使用Fisher精确检验来计算P值。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001
图2：可溶性人GPV保护避免缺血性中风。小鼠经历60分钟的短暂性大脑中动脉闭塞(tMCAO)。在tMCAO后24小时通过面积测量法测量野生型(黑色条)和用shGPV-AFP预处理的野生型小鼠(灰色条)的脑梗塞体积。结果代表平均值±SD。
图3：可溶性GPV对尾出血时间没有影响。显示了接受媒介物或可溶性人GPV(A：shGPV；B：shGPV-AFP)的指示小鼠系的尾出血时间。每个符号代表一只动物。
图4：用可溶性GPV处理导致在体外流动下胶原蛋白上减少的表面覆盖率和血栓体积。A)将人血用shGPV-AFP处理，并在1000s-1的剪切速率下在胶原包被的表面上灌注。B)将来自野生型小鼠的血液与smGPV一起孵育，并在1700s-1的剪切速率下在胶原包被的表面上灌注。结果显示为平均值±SD。
发明详述
本发明涉及包含缺乏功能性跨膜结构域的修饰的糖蛋白V(GPV)的可溶性多肽，其用于治疗或预防受试者中的血栓性疾病，所述治疗或预防包括向受试者施用有效量的所述可溶性多肽。优选地，修饰的GPV是截短的GPV。
如本文所用的术语“可溶性”是指不结合细胞膜的多肽。特别地，可溶性多肽没有经由跨膜结构域整合到细胞膜中和/或其不能经由跨膜结构域整合到细胞膜中。通常，可溶性多肽缺乏功能性跨膜结构域。优选地，可溶性多肽可溶于水或缓冲剂，例如PBS。
糖蛋白V
如本文所用，术语“糖蛋白V”或“GPV”表示与SEQ ID NO：3中所示氨基酸序列具有至少50％序列同一性的蛋白质。优选地，GPV与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有至少60％，或至少70％，或至少80％，或至少90％，或至少95％的氨基酸同一性。根据本发明，在两个序列的比对后，被评估的序列(“比较序列”)与要求保护或描述的序列(“参考序列”)具有某一“百分比同一性”，或者是某一“百分比相同”的。“百分比同一性”是根据以下公式确定的：
同一性百分比＝100[1-(C/R)]
在该公式中，C是参考序列和比较序列之间在两个序列之间的比对长度上的差异数目，其中(i)参考序列中在比较序列中不具有对应的碱基的每个碱基，和(ii)参考序列中的每个间隙，以及(iii)参考序列中与比较序列中的比对碱基不同的每个比对碱基构成差异。R是参考序列在与比较序列的比对长度上的碱基数目，在参考序列中创建的任何缺口也被计算为碱基。
如果比较序列和参考序列之间存在比对，使得百分比同一性(如上计算)大约等于或大于指定的最小值，则比较序列具有指定的最小百分比同一性，即使比对可能在别处以显示比指定的百分比更低的百分比同一性存在于序列中。
在一个优选的实施方案中，用于比较目的的比对序列的长度为参考序列长度的至少30％，优选至少40％，更优选至少50％，甚至更优选至少60％，甚至更优选至少70％，80％或90％。
两个氨基酸序列之间的序列比较和百分比同一性(和百分比相似性)的确定可以使用任何合适的程序来完成，例如，程序“BLAST 2 SEQUENCES(blastp)”(Tatusova等人，FEMS Microbiol.Lett.1999，174：247-250)，其具有以下参数：Matrix BLOSUM62；打开缺口11和延伸缺口1的罚分；缺口x_dropoff50；预计10.0字大小3；过滤器：无。根据本发明，序列比较覆盖至少40个氨基酸，优选至少80个氨基酸，更优选至少100个氨基酸，最优选至少120个氨基酸。
通常，GPV是血小板GPV，并且修饰的GPV是修饰的血小板GPV。
天然(即未修饰的)GPV包含功能性跨膜结构域，即其包含能够在表达过程中赋予在细胞膜(例如质膜)中的整合的氨基酸序列。
天然GPV是天然存在的GPV。优选天然GPV来源于哺乳动物。在一个实施方案中，GPV是人GPV。根据该实施方案，天然GPV优选包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列或由其组成。在另一个实施方案中，天然GPV是鼠GPV。根据该实施方案，天然GPV优选地包含SEQ IDNO：7中所示的氨基酸序列或由其组成。本文所用的术语天然GPV包括但不限于由SEQ IDNO：2(具有信号肽)和SEQ ID NO：3(不含信号肽)表示的人GPV的同系物和直系同源物。除非另有说明，否则术语GPV是指缺乏信号肽的成熟多肽。
最优选地，天然GPV包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或由其组成。
修饰的GPV
根据本发明的修饰的GPV不同于其源自的天然GPV(也称为“亲本GPV”或“未修饰的GPV”)，至少在于由于突变或任何其他手段而跨膜结构域不再有功能。例如，代表修饰的GPV中的跨膜结构域的氨基酸序列相对于亲本GPV可具有一个或多个取代、缺失和/或插入。在一个实施方案中，修饰的GPV的氨基酸序列缺少亲本GPV的至少整个跨膜结构域。在另一个实施方案中，修饰的GPV是截短的GPV。人GPV的跨膜结构域从SEQ ID NO：3的氨基酸位置504延伸至527。鼠GPV的跨膜结构域从SEQ ID NO：7的氨基酸位置503延伸至526。
GPV的跨膜结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个氨基酸残基可以在修饰的GPV中被缺失或取代。在一个实施方案中，人GPV的跨膜结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个氨基酸(SEQ ID NO：3的氨基酸504至527)可被缺失或取代。在另一个实施方案中，鼠GPV的跨膜结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个氨基酸(SEQ ID NO：7的氨基酸503-526)可被缺失或取代。
修饰的GPV、优选截短的GPV具有抗血栓活性。可如实施例1所述的实验中所示测定抗血栓活性(参见实施例“材料和方法”部分中的“腹主动脉的机械损伤”)。如果受试化合物(例如20μg)能够延迟或防止小鼠动脉闭塞性血栓形成，则具有抗血栓活性。优选地，动脉闭塞性血栓形成被延迟至少1分钟，更优选至少5分钟，最优选至少10分钟。
截短的GPV
截短的GPV由GPV的片段组成。截短通常位于GPV的C-端。N-端可能被截短，或者它可能不被截短。
GPV的片段具有至少6个氨基酸的长度。优选地，GPV片段的长度为至少7，至少8，至少9，至少10，至少15，至少20，至少50，至少100，至少200，至少300或至少400个氨基酸。在某些实施方案中，截短的GPV由如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的片段组成，其中所述片段具有6个氨基酸的最小长度，优选至少7个，至少8个，至少9个，至少10，至少15，至少20，至少50，至少100，至少200，至少300或至少400个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，截短的GPV具有C-端截短并且缺乏其源自的GPV的完整跨膜结构域。在另一个实施方案中，截短的GPV具有C-端截短并且缺少跨膜结构域至截短的GPV不与膜结合的程度。
优选的截短的GPV由选自下列氨基酸序列的氨基酸序列组成，其中所有氨基酸位置分别指代SEQ ID NO：3(实施方案1-71)或SEQ ID NO：7(实施方案72-141)，如下面所示的：
表1
上述实施方案的氨基酸序列的上限和下限可以彼此组合。
特别地，截短的GPV的优选实施方案由SEQ ID NO：3的氨基酸1-516或SEQ ID NO：7的氨基酸1-502组成。
在其他实施方案中，截短的GPV包含以下序列或由以下序列组成。
表2
在本发明的具体实施方式中，如本文所述使用的可溶性多肽包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列或由其组成。
在另一个具体实施方案中，本发明的可溶性多肽是非天然存在的多肽。在又一个具体实施方案中，本发明的可溶性多肽不由SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列组成。在又一个具体的实施方案中，本发明的可溶性多肽是非天然存在的多肽并且不由SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列组成。
多肽的其他组分
本发明的可溶性多肽可以包含不同于衍生自GPV的氨基酸的其它氨基酸或其他延长半衰期的部分。
在本发明的一个实施方案中，本发明的可溶性多肽的半衰期通过化学修饰延长，例如，通过直接或经由接头附接延长半衰期的部分，所述延长半衰期的部分是例如聚乙二醇(聚乙二醇化)，糖基化PEG，羟乙基淀粉(HES化)，聚唾液酸，弹性蛋白样多肽，肝素聚合物或透明质酸。在另一个实施方案中，可溶性多肽(优选修饰的GPV)通过化学接头与延长半衰期的蛋白(HLEP)如白蛋白缀合。Conjuchem LLC以示例的方式描述了该缀合技术的原理(参见例如美国专利号7,256,253)。
在本发明的另一个实施方案中，可溶性多肽包含异源氨基酸序列(即对于所使用的各自GPV是异源的)，其直接或通过接头与所述GPV融合。
异源序列可以是被抗体或对标签具有高亲和力的其他分子识别的标签序列。实例包括但不限于多聚组氨酸标签，FLAG标签，myc-标签，GST标签等。标签序列通常有利于在宿主细胞中表达时纯化多肽。
在一个优选的实施方案中，可溶性多肽还包含半衰期延长蛋白(HLEP)。优选地，HLEP是白蛋白或其片段。白蛋白的N端可以与修饰的GPV的C端融合。一个或多个HLEP可以与修饰的GPV的N-或C-端部分融合，只要它们不干扰或消除修饰的GPV的抗血栓活性。
在一个实施方案中，该多肽具有以下结构：
mGPV-L1-H，[式1]
其中mGPV是修饰的GPV，L1是化学键或接头序列，并且H是HLEP。
L1可以是化学键或由一个或多个氨基酸组成的接头序列，例如，为1至50、1至30、1至20、1至15、1至10、1至5或1至3(例如1、2或3)个氨基酸，并且它们可以彼此相同或不同。通常，接头序列不存在于野生型GPV中的相应位置。存在于L1中的合适氨基酸的例子包括Gly和Ser。接头应该是非免疫原性的并且可以是不可切割或可切割的接头。不可切割的接头可以由交替的甘氨酸和丝氨酸残基组成，如WO2007/090584中所例举的。在本发明的另一个实施方案中，修饰的GPV部分和白蛋白部分之间的肽接头由肽序列组成，其作为人蛋白质中的天然域间接头。优选地，这些肽序列在其天然环境中位于靠近蛋白质表面的位置并且可被免疫系统接近，从而可以假定对该序列呈现天然的耐受性。实例在WO2007/090584中给出。可切割的接头序列描述于例如WO 2013/120939 A1中。
下面描述了优选的HLEP序列。同样地，本发明包括与相应HLEP的确切“N端氨基酸”的融合物，或与相应HLEP的“N端部分”的融合物，其包括HLEP的一个或多个氨基酸的N端缺失。该多肽可以包含多于一个HLEP序列，例如，两个或三个HLEP序列。这些多个HLEP序列可以串联地(例如，作为连续的重复序列)与修饰的GPV的C端部分融合。
延长半衰期的多肽(HLEP)
优选地，延长半衰期的部分是延长半衰期的多肽(HLEP)，更优选地，HLEP选自白蛋白或其片段、免疫球蛋白恒定区及其片段，例如Fc片段，具有大流体动力学体积的溶剂化随机链(例如XTEN(Schellenberger等人，Nature Biotechnol.2009.27：1186-1190)，同型氨基酸重复(HAP)或脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸重复序列(PAS)，afamin，甲胎蛋白，维生素D结合蛋白，转铁蛋白或其变体，人绒毛膜促性腺激素-β亚基的羧基端肽(CTP)，能够在生理条件下结合白蛋白或免疫球蛋白恒定区的多肽或脂质。
如本文所用，“延长半衰期的多肽”优选选自白蛋白，白蛋白家族的成员，免疫球蛋白G的恒定区及其片段，能够在生理条件下与白蛋白、白蛋白家族的成员以及免疫球蛋白恒定区的片段结合的区域和多肽。它可以是本文所述的延长半衰期的全长蛋白(例如白蛋白，白蛋白家族的成员或免疫球蛋白G的恒定区)或其能够稳定或延长修饰的GPV的治疗活性或生物学活性的一个或多个片段。这种片段的长度可以是10个或更多个氨基酸，或者可以包括来自HLEP序列的至少约15个，至少约20个，至少约25个，至少约30个，至少约50个，至少约100个或更多个连续氨基酸或可包含相应HLEP的部分或全部特定结构域，只要HLEP片段提供与不含HLEP的相应多肽相比至少25％的功能性半衰期延长。
本发明提出的凝血因子插入构建体的HLEP片段可以是正常HLEP的变体。术语“变体”包括保守或非保守的插入、缺失和取代，其中这些变化基本上不改变赋予修饰的GPV的生物学活性的活性位点或活性结构域。
具体而言，本发明提出的修饰的GPV-HLEP融合构建体可以包括HLEP的天然存在的多态性变体和HLEP的片段。HLEP可以来自任何脊椎动物，尤其是任何哺乳动物，例如人，猴，牛，绵羊或猪。非哺乳动物HLEP包括但不限于母鸡和鲑鱼。
作为HELP的白蛋白
术语“人血清白蛋白”(HSA)和“人白蛋白”(HA)和“白蛋白”(ALB)在本申请中可互换使用。术语“白蛋白”和“血清白蛋白”较宽，并且包括人血清白蛋白(及其片段和变体)以及来自其他物种的白蛋白(及其片段和变体)。
如本文所用，“白蛋白”总体上指具有白蛋白的一种或多种功能活性(例如生物活性)的白蛋白多肽或氨基酸序列、或白蛋白片段或变体。特别地，“白蛋白”是指人白蛋白或其片段，尤其是人白蛋白或来自其他脊椎动物的白蛋白的成熟形式或其片段，或者这些分子的类似物或变体或其片段。
具体而言，本发明提出的修饰的GPV融合构建体可以包括人白蛋白的天然存在的多态性变体和人白蛋白的片段。一般而言，白蛋白片段或变体的长度至少为10个，优选至少40个，最优选多于70个氨基酸。
所提出的本发明的修饰的GPV融合构建体的白蛋白片段可以包含至少一个子结构域或HA的结构域或其保守修饰。
在优选的实施方案中，本发明的可溶性多肽包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列或由其组成。
作为HELP的免疫球蛋白
本领域已知免疫球蛋白G(IgG)恒定区(Fc)增加治疗性蛋白质的半衰期(DumontJA等人，BioDrugs.2006；20：151-160)。重链的IgG恒定区由3个结构域(CH1-CH3)和铰链区组成。免疫球蛋白序列可以来自任何哺乳动物，或分别来自亚类IgG1，IgG2，IgG3或IgG4。没有抗原结合结构域的IgG和IgG片段也可以用作HLEP。治疗性多肽片段优选通过抗体的铰链区或肽接头(其甚至可以是可切割的)连接至IgG或IgG片段。若干专利和专利申请描述了治疗性蛋白质与免疫球蛋白恒定区的融合以增强治疗性蛋白质的体内半衰期。US 2004/0087778和WO 2005/001025描述了Fc结构域或至少免疫球蛋白恒定区的片段与生物活性肽的融合蛋白，其增加肽的半衰期，否则肽将在体内被快速消除。描述了获得增强的生物学活性、延长的循环半衰期和更大的溶解度的Fc-IFN-β融合蛋白(WO 2006/000448)。公开了具有延长的血清半衰期和增加的体内效力的Fc-EPO蛋白(WO 2005/063808)以及与G-CSF(WO2003/076567)、胰高血糖素样肽-1(WO 2005/000892)、凝血因子(WO 2004/101740)和白细胞介素-10(US 6、403、077)的Fc融合蛋白，均具有延长半衰期的性质。
在某些实施方案中，Fc融合蛋白是单体的。在其他实施方案中，Fc融合蛋白是二聚体。
在WO2013/120939中详细描述了根据本发明可以使用的各种HLEP。
核酸与表达
编码待表达多肽的核酸可根据本领域已知的方法制备。基于人GPV(SEQ ID NO：1)或鼠GPV(SEQ ID NO：5)的cDNA序列，可以设计并产生编码上述修饰的GPV构建体的重组DNA。表3总结了人和小鼠序列的进一步细节。
表3：小鼠和人野生型GPV序列的细节
其中cDNA含有以正确方向插入表达质粒中的完整开放阅读框的构建体可用于蛋白质表达。典型的表达载体含有启动子，其指导对应于携带质粒的细胞中插入的核酸的大量mRNA的合成。它们还可以包括允许它们在宿主生物体内自主复制的复制起始序列，以及增加翻译合成的mRNA的效率的序列。通过使用例如病毒的调控元件(例如来自EpsteinBarr病毒基因组的OriP序列)，稳定的长期载体可以作为自由复制的实体来维持。也可以生产将载体整合到基因组DNA中的细胞系，并且以这种方式连续生产基因产物。
通常，通过将编码包含修饰的GPV的多肽的核酸导入哺乳动物宿主细胞来获得待提供的细胞。
宿主细胞
根据本发明，可以利用任何易于细胞培养和表达多肽、优选糖基化多肽的宿主细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。可根据本发明使用的哺乳动物细胞的非限制性实例包括BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系(NSO/1，ECACC No：85110503)；人成视网膜细胞(PER.C6(CruCell，Leiden，The Netherlands))；SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚肾系(在悬浮培养物中亚克隆生长的HEK293或HEK293细胞，Graham等人，J.GenVirol.，36：59,1977)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)；中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO，Urlaub and Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216,1980)；小鼠支持细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod。，23：243 251,1980)；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1 587)；人宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(HepG2，HB 8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人，AnnalsNY.Acad.Sci.，383：44-68,1982)；MRC 5细胞；PS4细胞；人羊膜细胞(CAP)；和人肝癌细胞系(Hep G2)。优选地，细胞系是人或啮齿动物细胞系，特别是仓鼠细胞系如CHO。
本领域已知适于将足以实现目的糖蛋白表达的核酸导入哺乳动物宿主细胞中的方法。参见，例如，Gething等人，Nature.1981；293：620-625；Mantei等人，Nature.1979；281：40-46；Levinson等人EP117,060；和EP 117,058。对于哺乳动物细胞，将遗传物质导入哺乳动物细胞的常用方法包括Graham和van der Erb的磷酸钙沉淀方法(Virology.1978；52：456-457)或Hawley-Nelson的lipofectamineTM(Gibco BRL)方法(Focus.1993；15：73)。Axel在US 4,399,216中描述了哺乳动物宿主细胞系统转染的一般方面。关于将遗传物质引入哺乳动物细胞的各种技术，参见Keown等人(Methods in Enzymology，1989)，Keown等人(Methods in Enzymology.1990；185：527-537)和Mansour等人(Nature，1988；336：348-352)。
选择用于培养宿主细胞系的基础培养基对于本发明不是关键的，并且可以是适合于培养哺乳动物细胞的本领域已知的任何培养基或其组合。诸如Dulbecco's ModifiedEagle Medium，Ham's F-12 Medium，Eagle's Minimal Essential Medium和RPMI-1640Medium等的培养基可商购获得。生长因子例如重组胰岛素的添加是可选的。在一个实施方案中，生产培养基不含动物来源的组分。在一个优选的实施方案中，培养基是“无蛋白质”的，即它完全不含任何蛋白质或至少不含任何不是重组产生的蛋白质。人血清白蛋白可以用作产生糖蛋白的无血清培养补充物。任选地，培养基含有蛋白酶抑制剂，例如丝氨酸蛋白酶抑制剂，其适合于组织培养并且是合成或植物来源的。
一般而言，本发明可以用适合糖蛋白表达的任何细胞培养方法来进行。例如，细胞可以在分批或补料分批培养物中生长，其中在充分表达糖蛋白后终止培养，然后收获表达的糖蛋白。优选地，细胞可以在连续培养物(例如灌注培养物)中生长，其中将新鲜培养基周期性地或连续地添加到培养物中，并且周期性地或连续地收获表达的糖蛋白。培养可以是任何常规类型的培养，例如分批、补料分批或连续培养，但优选连续培养。合适的连续培养包括灌注培养。
本领域普通技术人员将能够调整特定细胞培养条件以优化细胞培养物的某些特征，包括但不限于生长速率、细胞活力、细胞培养物的最终细胞密度、有害代谢副产物例如乳酸盐和铵的最终浓度、表达的糖蛋白的效价、寡糖侧链的程度和组成、或这些或被实践者认为是重要的其他条件的任何组合。
表达的可溶性多肽的分离
一般而言，通常希望分离和/或纯化根据本发明表达的糖蛋白。在某些实施方案中，表达的糖蛋白分泌到培养基中，因此可以通过例如离心或过滤除去细胞和其他固体，作为纯化过程的第一步。
表达的糖蛋白可以通过标准方法(包括但不限于层析(例如离子交换、亲和、尺寸排阻和羟基磷灰石层析)，凝胶过滤，离心或差异溶解度，乙醇沉淀)和/或通过可用于纯化蛋白质的任何其他技术分离和纯化(参见例如Scopes,Protein Purification Principlesand Practice2nd Edition,Springer-Verlag,New York,1987；Higgins SJ and Hames BD(eds.),Protein Expression:A Practical Approach,Oxford Univ Press,1999；和Deutscher MP,Simon MI,Abelson JN(eds.),Guide to Protein Purification:Methodsin Enzymology(Methods in Enzymology Series,Vol.182),Academic Press,1997，各自通过引用并入本文)。特别是对于免疫亲和层析，可以通过将糖蛋白与包含针对该糖蛋白产生并将其固定到固定支持物上的抗体的亲和柱结合来分离糖蛋白。或者，可通过标准重组技术将亲和标签如流感衣壳序列、聚组氨酸或谷胱甘肽-S-转移酶附着于糖蛋白，以允许经由在适当的亲和柱上通过来进行简易纯化。如果待纯化的可溶性GPV包含HLEP，则可以将针对HLEP的抗体或能够与HLEP结合的其他化合物固定至亲和柱以进行亲和层析。蛋白酶抑制剂如苯基甲基磺酰氟(PMSF)、亮肽素、胃蛋白酶抑制剂或抑肽酶可以在任何或所有阶段加入，以减少或消除纯化过程中糖蛋白的降解。当细胞必须被裂解以分离和纯化表达的糖蛋白时，蛋白酶抑制剂是特别有利的。另外或可选地，可以在任何或所有阶段加入糖苷酶抑制剂，以减少或消除共价连接的寡糖链的酶修剪。
本领域普通技术人员将会理解，确切的纯化技术将根据待纯化的多肽的特性、表达多肽的细胞的特性和/或其中生长细胞的培养基的组成而变化。
组合物和试剂盒
本发明的另一方面是包含本发明的可溶性多肽和药学上可接受的赋形剂或载体的药物组合物。药物组合物可以包含有效量的可溶性多肽用于治疗或预防受试者中的血栓性疾病。药物组合物可以包含约10μg-1,000mg，优选约100μg-500mg，更优选1mg-100mg的可溶性多肽。药物组合物可包含约0.01-20,000μg/ml，优选约0.1-1000μg/ml，更优选0.5-500μg/ml，最优选约100μg/ml的可溶性多肽。药物组合物可以进一步包含药学上可接受的载体或稀释剂。适用于药物组合物的载体和稀释剂在本领域中是公知的。
通过将具有所需纯度的糖蛋白与本领域通常使用的任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(所有这些在本文中被称为“载体”，即缓冲剂，稳定剂，防腐剂，等渗剂，非离子型洗涤剂，抗氧化剂和其他各种添加剂，参见Remington's PharmaceuticalSciences，第16版(Osol，ed.)1980)混合，可以制备适用于本文所述方法的本发明糖蛋白的治疗性制剂作为冻干制剂或水性溶液贮存。这种添加剂必须在所用剂量和浓度下对接受者无毒。
缓冲剂有助于将pH保持在接近生理条件的范围内。它们可以以约2mM至约50mM的浓度存在。合适的缓冲剂包括有机和无机酸及其盐，例如柠檬酸盐缓冲剂(例如柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物，柠檬酸-柠檬酸三钠混合物，柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)，琥珀酸盐缓冲剂(例如琥珀酸-琥珀酸单钠混合物，琥珀酸-氢氧化钠混合物，琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)，酒石酸盐缓冲剂(例如酒石酸-酒石酸钠混合物，酒石酸-酒石酸钾混合物，酒石酸-氢氧化钠混合物等)，富马酸盐缓冲剂(例如富马酸-富马酸一钠混合物，富马酸-富马酸二钠混合物，富马酸一钠-富马酸二钠混合物等)，葡糖酸盐缓冲剂(例如葡糖酸-葡糖酸钠混合物，葡糖酸-氢氧化钠混合物，葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)，草酸盐缓冲剂(例如草酸-草酸钠混合物，草酸-氢氧化钠混合物，草酸-草酸钾混合物尿等)，乳酸盐缓冲剂(例如，乳酸-乳酸钠混合物，乳酸-氢氧化钠混合物，乳酸-乳酸钾混合物等)和乙酸盐缓冲剂(例如乙酸-乙酸钠混合物，乙酸-氢氧化钠混合物等)。此外，可以使用磷酸盐缓冲剂，组氨酸缓冲剂和三甲胺盐如Tris。
可以添加防腐剂以阻止微生物生长，并且可以以0.2％-1％(w/v)的量添加。合适的防腐剂包括苯酚，苯甲醇，间甲酚，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯，十八烷基二甲基苄基氯化铵，苯扎卤铵(例如氯化物，溴化物和碘化物)，六甲基氯化铵和对羟基苯甲酸烷基酯例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯，儿茶酚，间苯二酚，环己醇和3-戊醇。可以添加有时称作“稳定剂”的等渗剂以确保液体组合物的等渗性，并且包括多元糖醇，优选三元或更多元糖醇，例如甘油，赤藓糖醇，阿拉伯糖醇，木糖醇，山梨糖醇和甘露糖醇。稳定剂是指广泛类型的赋形剂，其功能范围可以是从增量剂到溶解治疗剂的添加剂，或有助于防止变性或粘附到容器壁。典型的稳定剂可以是多元糖醇(上面列举的)；氨基酸例如精氨酸，赖氨酸，甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，丙氨酸，鸟氨酸，L-亮氨酸，2-苯丙氨酸，谷氨酸，苏氨酸等，有机糖或糖醇如乳糖，海藻糖，水苏糖，甘露醇，山梨糖醇，木糖醇，核糖醇，肌醇，半乳糖醇，甘油等，包括环醇如肌醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂如尿素，谷胱甘肽，硫辛酸，巯基乙酸钠，硫代甘油，α-硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(例如10个残基或更少的肽)；蛋白质如人血清白蛋白，牛血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮单糖，如木糖，甘露糖，果糖，葡萄糖；二糖如乳糖，麦芽糖，蔗糖和三糖如棉子糖；和多糖如葡聚糖。稳定剂可以以每重量份活性蛋白质0.1-10,000重量的范围存在。
可以加入非离子表面活性剂或洗涤剂(也称为“润湿剂”)以帮助增溶治疗剂以及保护治疗蛋白免受搅动诱导的聚集，这也允许制剂暴露于剪切表面应力而不引起蛋白质的变性。合适的非离子表面活性剂包括聚山梨酸酯(20、80等)，泊洛沙姆(184、188等)，Pluronic多元醇，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚(等)。非离子表面活性剂可以以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml的范围或以约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的范围存在。
另外的各种赋形剂包括填充剂(例如淀粉)，螯合剂(例如EDTA)，抗氧化剂(例如抗坏血酸，甲硫氨酸，维生素E)和助溶剂。
药物组合物可具有约5.0-10.0，优选约5.6-9.0，更优选约6.0-8.8，最优选约6.5-8.0的pH。例如，pH可以是约6.2、6.5、6.75、7.0或7.5。
本发明的药物组合物可以配制用于口服，舌下，鼻内，眼内，直肠，透皮，粘膜，局部或肠胃外给药。肠胃外给药可以包括皮内，皮下，肌内(i.m.)，静脉内(i.v.)，腹膜内(i.p.)，动脉内，髓内，心内，关节内(关节)，滑膜内，颅内，脊柱内和鞘内(脊髓液)注射或输注，优选在小鼠中腹膜内(i.p.)注射，并且在人中静脉内(i.v.)或皮下(s.c.)注射。任何适用于药物制剂的肠胃外注射或输注的装置均可用于此类给药。例如，药物组合物可以包含在无菌的预填充注射器中。
本发明的另一个方面是药物试剂盒，其包含(i)如上定义的可溶性多肽和(ii)除所述可溶性多肽之外的抗凝血或抗血小板药物。在一个实施方案中，可溶性多肽和抗凝血或抗血小板药物包含在单独的组合物中。
术语“抗凝血或抗血小板药物”是指肝素，直接凝血酶抑制剂(DTI)，直接或选择性因子Xa抑制剂(xaban)和维生素K拮抗剂(VKA)。因此，“抗凝血或抗血小板药物”可以包括天然存在的或合成的肝素。术语“抗凝血或抗血小板药物”还意味着包括通过直接或选择性抑制凝血酶或因子Xa来防止血液凝结的物质。在另一个实施方案中，抗凝血物质是维生素K拮抗剂。
在一些实施方案中，抗凝血或抗血小板药物选自
(i)肝素，特别是未分级肝素(UFH)或低分子量肝素(LMWH)，
(ii)直接凝血酶抑制剂(DTI)，特别是达比加群，美拉加群，阿加曲班，水蛭素，lepirudin，比伐卢定，ximelagatran或desirudin(Di Nisio等人，N Engl J Med.2005；353：1028-40)，
(iii)直接或选择性因子Xa抑制剂(xaban)，特别是利伐沙班(Eriksson等人，Circulation.114：2374-81)，阿哌沙班(Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.27：1238-47)，贝曲西班，依他沙班，奥米沙班(Cohen等人，Circulation 115：2642-51)或磺达肝素(Peters等人，Eur.Heart J.29：324-31)
(iv)维生素K拮抗剂(VKA)，特别是苯丙香豆素，醋硝香豆素或华法林和相关的含4-羟基香豆素的分子，杀鼠迷，双香豆素，乙基双肉豆蔻酸酯，氯吲哚二酮，diphenandione，phenandione或tioclomarol(参见例如Ansell等人，2008,"Pharmacology and managementof the vitamin K antagonists”,American College of Chest Physicians Evidence-Based Clinical Practice Guidelines(第8版)，Chest 133(6Suppl):160S–198S)。
本发明的另一方面是药物试剂盒，其包含(i)如上定义的可溶性多肽和(ii)除所述可溶性多肽以外的抗血小板或抗凝血药，用于同时、分开或相继用于治疗血栓性疾病。
血栓性疾病的治疗
本发明的可溶性多肽可用于治疗或预防血栓性疾病。
本文使用的“血栓性病症”或“血栓性疾病”是以形成阻碍或减少血流的血栓(血块)为特征的任何病症或疾病。血栓可能局限于形成的部位，或者它可能脱离以阻塞下游的血流(血栓栓塞)。在一些实施方案中，血栓形成可以发生在包括心脏和大脑在内的身体任何地方的静脉(静脉血栓形成)或动脉(动脉血栓形成)中。当血栓形成发生在冠状动脉循环中时，它被称为冠状动脉血栓形成。当脑循环中出现血栓形成时，它被称为脑血栓形成。
血栓性疾病可以包括静脉、动脉或毛细血管血栓形成，心脏中的血栓形成，慢性和/或急性血栓栓塞(例如肺栓塞，心房颤动诱发的血栓形成后的脑血栓栓塞(例如心房颤动中的中风预防(SPAF))，由于使人或动物受试者的血液与人造表面接触(例如具有瓣膜置换的患者中，特别是具有机械心脏瓣膜、支架、经皮冠状动脉介入(PCI)、体外膜式氧合(ECMO)或进行体外循环手术(CPB手术)的患者中)引起的血栓形成。血栓可导致或增加以下疾病的风险：中风，急性缺血性中风，心肌梗塞，不稳定型心绞痛，深静脉血栓形成(DVT)，门静脉血栓形成，血栓栓塞，肾静脉血栓形成，颈静脉血栓形成，脑静脉窦血栓形成，布加综合征，Paget-Schroetter疾病或无症状性脑缺血(SBI)。根据本发明的血栓性疾病可以进一步包括肺栓塞，动脉粥样硬化，因子V Leiden，抗凝血酶III缺乏症，蛋白C缺乏症，蛋白S缺乏症，凝血酶原基因突变(G20210A)，同型半胱氨酸血症，抗磷脂抗体综合征，抗心磷脂抗体，血栓形成综合症，狼疮抗凝综合征，恶性肿瘤，大手术，固定化，口服避孕药的使用，沙利度胺的使用，尤其是结合地塞米松，肝素诱导的血小板减少症，怀孕，骨髓增殖性疾病，炎症性肠疾病，肾病综合征，阵发性睡眠性血红蛋白尿，高粘滞综合征，Waldenstrom巨球蛋白血症和创伤。术语血栓性疾病也指癌症引起的血栓形成，例如，多发性骨髓瘤和其他血液癌症，腺癌，胰腺癌，胃癌，卵巢癌，前列腺癌，结肠癌，肺癌，脑癌，乳腺癌，肾癌，皮肤癌，宫颈癌和耳鼻喉癌。
术语“血栓性疾病”特别包括血栓性炎症病症。血栓性炎症是指疾病状态，其中促血栓形成和促炎症性级联协同作用并且机械相关以促进疾病进展和器官损伤。血栓炎症疾病状态包括缺血后器官损伤的病况，例如脑(急性缺血性中风)、肺、肝、结肠、心肌或骨骼肌的缺血/再灌注损伤(I/R-损伤)，但也包括全身炎症病况如脓毒症或脓毒性休克。
优选地，血栓性疾病选自血栓炎症性疾病，静脉血栓形成，动脉血栓形成，毛细血管血栓形成，门静脉血栓形成，肾静脉血栓形成，颈静脉血栓形成，脑静脉窦血栓形成，血液与人造表面接触期间或之后的血栓形成，特别是体外膜式氧合(ECMO)，动脉粥样硬化，关节炎，凝血障碍，深静脉血栓形成(DVT)，弥散性血管内凝血障碍(DIC)，慢性或急性血栓栓塞症，肺血栓栓塞症，布加综合征，Paget-Schroetter病，中风和心肌梗塞。
确定使用本发明的可溶性多肽的治疗的有效剂量、总剂量和时间长度完全在本领域技术人员的能力范围内，并且可以使用标准剂量递增研究来确定。待施用的本发明可溶性多肽的剂量将根据特定的可溶性多肽、受试者、疾病的性质和严重程度、受试者的身体状况、治疗方案(例如是否使用第二治疗剂)和选择的给药途径而变化；本领域技术人员可以容易地确定合适的剂量。
取决于许多临床因素，包括疾病的特定类型、疾病的严重程度和患者对本发明的可溶性多肽的敏感性，给药方案可以从每月一次到每天一次不等。在具体的实施方案中，本发明的可溶性多肽是每周两次，每5天，每周一次，每10天，每两周，每三周，每四周或每月一次，或者在任何两个前述值之间的范围内，例如从每周到每个月，从每10天到每两周，或从每周两次到三次等。
本领域技术人员将认识到，本发明可溶性多肽的单独剂量的最佳量和间隔将由所治疗病症的性质和程度、施用的形式、途径和部位、以及正在治疗的特定受试者的年龄和状况决定，并且医生将最终确定使用的适当剂量。该剂量可以根据需要经常重复。如果出现副作用，按照正常的临床实践，可以改变或减少剂量的量和/或频率。
表4：序列表中显示的序列的概述
实施例
结果
实施例1：可溶性GPV具有抗血栓作用
为了研究sGPV对腹主动脉机械损伤模型中体内血栓形成的潜在作用，直接在实验前将20μg人sGPV(shGPV)静脉内注射到WT小鼠中。在主动脉损伤后8分钟内，在PBS注射的对照小鼠中由于闭塞性血栓形成而血流停止(图1)。使用sGPV的预处理保护WT小鼠避免动脉闭塞性血栓形成，表明shGPV具有抗血栓作用(图1)。
实施例2：可溶性人GPV保护避免缺血性中风
为了评估可溶性GPV在局灶性脑缺血后脑梗塞中的作用，将小鼠进行60分钟的短暂性大脑中动脉闭塞(tMCAO)，并在24小时后评估梗塞体积。引人注目的是，与野生型小鼠相比，用shGPV-AFP处理的野生型小鼠的梗塞体积显著减少(图2)。因此，用可溶性人GPV预处理可以防止脑梗塞进展。
实施例3：可溶性人GPV对尾出血时间没有影响。
为了评估可溶性GPV对止血的作用，用媒介物或20μg可溶性人GPV(shGPV)处理的小鼠经受尾出血时间测定。用手术刀去除尾尖的2mm部分。通过用滤纸以20秒的间隔轻轻吸收血液而不直接接触伤口部位来监测尾出血。当在纸上没有观察到血液时，确定出血已经停止。(图3)。这些数据表明，发挥抗血栓作用的shGPV剂量(图1)不影响止血，表明shGPV是安全的抗血栓剂。
实施例4：体外流动下与胶原蛋白的粘附
为了评估可溶性GPV在体外测定中流动下胶原蛋白上血栓形成中的作用，将抗凝全血与20μg可溶性GPV孵育5分钟，并在胶原包被的表面上灌注。用shGPV-AFP(A)预处理的人血或用可溶性鼠GPV(B)预处理的野生型血液显示出显著降低的表面覆盖度和减少的血栓形成。因此，体外流动粘附测定在很大程度上模拟了体内条件并再现了体内表型。
实施例1-4的材料和方法
小鼠
动物研究由下弗兰肯地区政府(Bezirksregierung Unterfranken)批准。
可溶性GPV
1.可溶性人GPV(shGPV)
在杆状病毒转染的昆虫细胞中重组表达可溶性人GPV(成熟人GPV的氨基酸1-518)，使用标准次氮基三乙酸(Ni-NTA)柱纯化并溶解于PBS缓冲剂中。使用标准SDS PAGE检查纯度。
成熟shGPV的氨基酸序列(信号肽未显示)：
(斜体：聚His标签)
2.与白蛋白融合的可溶性人GPV(shGPV-AFP)
shGPV-AFP在CHO K1细胞中表达，并在灌注发酵罐系统中产生。使用具有30kD膜(例如Centramate OS030T12)的TFF系统(例如Centramate 500S Pall)将无细胞收获物浓缩30倍。将该浓缩物加入NaCl和EDTA至最终浓度为0.75mol/L NaCl和5mmol/L EDTA，并在用20mM pH 7.4的Tris缓冲剂预平衡的CaptureSelect人白蛋白柱(Lifetechnologies)上加载过夜。用平衡缓冲剂洗涤柱后，用20mM Tris加2M MgCl pH7.4缓冲剂洗脱shGPV-AFP。将洗脱物浓缩并用50mM Tris+150mM NaCl pH7.4使用具有30kD截留的超离心过滤器(例如Amicon Ref.UFC903024)透析。
成熟shGPV-AFP的氨基酸序列(信号肽未显示)：
(下划线：凝血酶切割位点和GGS接头；斜体：人白蛋白序列)
3.可溶性鼠GPV(smGPV)
在CHO细胞中重组表达可溶性鼠GPV(成熟鼠GPV的氨基酸1-519)，使用抗Flag柱纯化并溶解于PBS缓冲剂中。使用标准SDS PAGE检查纯度。
成熟smGPV的氨基酸序列(信号肽未显示)：
(斜体：Flag标记)
腹主动脉的机械损伤
为了打开麻醉小鼠(10-16周龄)的腹腔，进行纵向中线切割并暴露腹主动脉。在主动脉周围放置多普勒超声波流量探头(Transonic Systems，Maastricht，Netherlands)，并通过在流量探头上游以镊子单次紧压(15s)的机械损伤诱导血栓形成。监测血流直到发生完全闭塞或已过去30分钟。
短暂性大脑中动脉阻塞(tMCAO)
通过短暂性大脑中动脉闭塞(tMCAO)在8至12周龄的小鼠中诱导局灶性脑缺血。在70％N2/30％O2混合物中用2％异氟烷诱导吸入麻醉，并在手术过程中使用伺服控制加热装置记录并保持体温。每只动物手术的持续时间保持在15分钟以下。将硅橡胶涂层的6.0尼龙单丝(6021PK10，Doccol，Redlands，CA，USA)推进通过颈动脉直至大脑中动脉(MCA)的原点，引起MCA梗塞。在60分钟的闭塞时间后，将细丝移除以允许再灌注。再灌注后24小时处死动物并检查脑内出血。再灌注24小时后在2,3,5-三苯基氯化四唑(TTC，Sigma-Aldrich)(2％(w/v)溶液)染色的脑切片上定量评估梗死程度。以盲法进行校正脑水肿的梗塞区域的平面测量(ImageJ软件，NIH，Bethesda，MD，USA)。
出血时间测定
通过腹膜内注射三重麻醉剂麻醉小鼠，并用解剖刀移除尾尖的2mm段。通过用滤纸以20秒的间隔轻轻吸收血液而不直接接触伤口部位来监测尾出血。当在纸上没有观察到血液时，确定出血已经停止。20分钟后通过烧灼手动停止实验。
在体外流动下胶原蛋白上的血栓形成
对于胶原蛋白的粘附，盖玻片在37℃o/n下用200μg mL-1胶原蛋白I包被并用1％BSA的PBS封闭1小时。将全血(700μl+300μl肝素(TBS中20U/ml，pH7.3))在含有Ca2+的Tyrode缓冲剂中以2:1稀释并装入1ml注射器中。灌注前，将抗凝血液与Dylight-488缀合的抗GPIX衍生物(0.2μg/mL)在37℃孵育5分钟。将装有涂覆的盖玻片的具有50μm狭缝深度的透明流动室连接到填充有稀释的全血的注射器。在相当于1000s-1或1,700s-1的壁剪切速率的高剪切应力下使用无脉冲泵进行灌注。用Zeiss Axiovert 200倒置显微镜(40x/0.60物镜)观察聚集体的形成。使用CoolSNAP-EZ相机记录相位对比和荧光图片，并使用MetaVue软件离线分析。
统计分析
结果显示为来自每组至少三次单独实验的平均值±SD。适用时，Fisher精确检验用于统计分析。否则，进行Welch t检验进行统计分析。P值<0.05被认为是统计学显著的。
序列表
<110> 朱利叶斯-马克西米利维尔次堡大学
<120> 用于治疗血栓性疾病的可溶性糖蛋白V
<130> 2015_M002_A251
<150> EP15202530.0
<151> 2015-12-23
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3493
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (32)..(1714)
<400> 1
agttactttg gagtgcagaa ccatttcaga c atg ctg agg ggg act cta ctg 52
Met Leu Arg Gly Thr Leu Leu
1 5
tgc gcg gtg ctc ggg ctt ctg cgc gcc cag ccc ttc ccc tgt ccg cca 100
Cys Ala Val Leu Gly Leu Leu Arg Ala Gln Pro Phe Pro Cys Pro Pro
10 15 20
gct tgc aag tgt gtc ttc cgg gac gcc gcg cag tgc tcg ggg ggc gac 148
Ala Cys Lys Cys Val Phe Arg Asp Ala Ala Gln Cys Ser Gly Gly Asp
25 30 35
gtg gcg cgc atc tcc gcg cta ggc ctg ccc acc aac ctc acg cac atc 196
Val Ala Arg Ile Ser Ala Leu Gly Leu Pro Thr Asn Leu Thr His Ile
40 45 50 55
ctg ctc ttc gga atg ggc cgc ggc gtc ctg cag agc cag agc ttc agc 244
Leu Leu Phe Gly Met Gly Arg Gly Val Leu Gln Ser Gln Ser Phe Ser
60 65 70
ggc atg acc gtc ctg cag cgc ctc atg atc tcc gac agc cac att tcc 292
Gly Met Thr Val Leu Gln Arg Leu Met Ile Ser Asp Ser His Ile Ser
75 80 85
gcc gtt gcc ccc ggc acc ttc agt gac ctg ata aaa ctg aaa acc ctg 340
Ala Val Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asp Leu Ile Lys Leu Lys Thr Leu
90 95 100
agg ctg tcg cgc aac aaa atc acg cat ctt cca ggt gcg ctg ctg gat 388
Arg Leu Ser Arg Asn Lys Ile Thr His Leu Pro Gly Ala Leu Leu Asp
105 110 115
aag atg gtg ctc ctg gag cag ttg ttt ttg gac cac aat gcg cta agg 436
Lys Met Val Leu Leu Glu Gln Leu Phe Leu Asp His Asn Ala Leu Arg
120 125 130 135
ggc att gac caa aac atg ttt cag aaa ctg gtt aac ctg cag gag ctc 484
Gly Ile Asp Gln Asn Met Phe Gln Lys Leu Val Asn Leu Gln Glu Leu
140 145 150
gct ctg aac cag aat cag ctc gat ttc ctt cct gcc agt ctc ttc acg 532
Ala Leu Asn Gln Asn Gln Leu Asp Phe Leu Pro Ala Ser Leu Phe Thr
155 160 165
aat ctg gag aac ctg aag ttg ttg gat tta tcg gga aac aac ctg acc 580
Asn Leu Glu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Leu Ser Gly Asn Asn Leu Thr
170 175 180
cac ctg ccc aag ggg ttg ctt gga gca cag gct aag ctc gag aga ctt 628
His Leu Pro Lys Gly Leu Leu Gly Ala Gln Ala Lys Leu Glu Arg Leu
185 190 195
ctg ctc cac tcg aac cgc ctt gtg tct ctg gat tcg ggg ctg ttg aac 676
Leu Leu His Ser Asn Arg Leu Val Ser Leu Asp Ser Gly Leu Leu Asn
200 205 210 215
agc ctg ggc gcc ctg acg gag ctg cag ttc cac cga aat cac atc cgt 724
Ser Leu Gly Ala Leu Thr Glu Leu Gln Phe His Arg Asn His Ile Arg
220 225 230
tcc atc gca ccc ggg gcc ttc gac cgg ctc cca aac ctc agt tct ttg 772
Ser Ile Ala Pro Gly Ala Phe Asp Arg Leu Pro Asn Leu Ser Ser Leu
235 240 245
acg ctt tcg aga aac cac ctt gcg ttt ctc ccc tct gcg ctc ttt ctt 820
Thr Leu Ser Arg Asn His Leu Ala Phe Leu Pro Ser Ala Leu Phe Leu
250 255 260
cat tcg cac aat ctg act ctg ttg act ctg ttc gag aac ccg ctg gca 868
His Ser His Asn Leu Thr Leu Leu Thr Leu Phe Glu Asn Pro Leu Ala
265 270 275
gag ctc ccg ggg gtg ctc ttc ggg gag atg ggg ggc ctg cag gag ctg 916
Glu Leu Pro Gly Val Leu Phe Gly Glu Met Gly Gly Leu Gln Glu Leu
280 285 290 295
tgg ctg aac cgc acc cag ctg cgc acc ctg ccc gcc gcc gcc ttc cgc 964
Trp Leu Asn Arg Thr Gln Leu Arg Thr Leu Pro Ala Ala Ala Phe Arg
300 305 310
aac ctg agc cgc ctg cgg tac tta ggg gtg act ctg agc ccg cgg ctg 1012
Asn Leu Ser Arg Leu Arg Tyr Leu Gly Val Thr Leu Ser Pro Arg Leu
315 320 325
agc gcg ctt ccg cag ggc gcc ttc cag ggc ctt ggc gag ctc cag gtg 1060
Ser Ala Leu Pro Gln Gly Ala Phe Gln Gly Leu Gly Glu Leu Gln Val
330 335 340
ctc gcc ctg cac tcc aac ggc ctg acc gcc ctc ccc gac ggc ttg ctg 1108
Leu Ala Leu His Ser Asn Gly Leu Thr Ala Leu Pro Asp Gly Leu Leu
345 350 355
cgc ggc ctc ggc aag ctg cgc cag gtg tcc ctg cgc cgc aac agg ctg 1156
Arg Gly Leu Gly Lys Leu Arg Gln Val Ser Leu Arg Arg Asn Arg Leu
360 365 370 375
cgc gcc ctg ccc cgt gcc ctc ttc cgc aat ctc agc agc ctg gag agc 1204
Arg Ala Leu Pro Arg Ala Leu Phe Arg Asn Leu Ser Ser Leu Glu Ser
380 385 390
gtc cag ctc gac cac aac cag ctg gag acc ctg cct ggc gac gtg ttt 1252
Val Gln Leu Asp His Asn Gln Leu Glu Thr Leu Pro Gly Asp Val Phe
395 400 405
ggg gct ctg ccc cgg ctg acg gag gtc ctg ttg ggg cac aac tcc tgg 1300
Gly Ala Leu Pro Arg Leu Thr Glu Val Leu Leu Gly His Asn Ser Trp
410 415 420
cgc tgc gac tgt ggc ctg ggg ccc ttc ctg ggg tgg ctg cgg cag cac 1348
Arg Cys Asp Cys Gly Leu Gly Pro Phe Leu Gly Trp Leu Arg Gln His
425 430 435
cta ggc ctc gtg ggc ggg gaa gag ccc cca cgg tgc gca ggc cct ggg 1396
Leu Gly Leu Val Gly Gly Glu Glu Pro Pro Arg Cys Ala Gly Pro Gly
440 445 450 455
gcg cac gcc ggc ctg ccg ctc tgg gcc ctg ccg ggg ggt gac gcg gag 1444
Ala His Ala Gly Leu Pro Leu Trp Ala Leu Pro Gly Gly Asp Ala Glu
460 465 470
tgc ccg ggc ccc cgg ggc ccg cct ccc cgc ccc gct gcg gac agc tcc 1492
Cys Pro Gly Pro Arg Gly Pro Pro Pro Arg Pro Ala Ala Asp Ser Ser
475 480 485
tcg gaa gcc cct gtc cac cca gcc ttg gct ccc aac agc tca gaa ccc 1540
Ser Glu Ala Pro Val His Pro Ala Leu Ala Pro Asn Ser Ser Glu Pro
490 495 500
tgg gtg tgg gcc cag ccg gtg acc acg ggc aaa ggt caa gat cat agt 1588
Trp Val Trp Ala Gln Pro Val Thr Thr Gly Lys Gly Gln Asp His Ser
505 510 515
ccg ttc tgg ggg ttt tat ttt ctg ctt tta gct gtt cag gcc atg atc 1636
Pro Phe Trp Gly Phe Tyr Phe Leu Leu Leu Ala Val Gln Ala Met Ile
520 525 530 535
acc gtg atc atc gtg ttt gct atg att aaa att ggc caa ctc ttt cga 1684
Thr Val Ile Ile Val Phe Ala Met Ile Lys Ile Gly Gln Leu Phe Arg
540 545 550
aaa tta atc aga gag aga gcc ctt ggg taa accaatggga aaatcttcta 1734
Lys Leu Ile Arg Glu Arg Ala Leu Gly
555 560
attacttaga acctgaccag atgtggctcg gaggggaatc cagacccgct gctgtcttgc 1794
tctccctccc ctccccactc ctcctctctt cttcctcttc tctctcactg ccacgccttc 1854
ctttccctcc tcctccccct ctccgctctg tgctcttcat tctcacaggc ccgcaacccc 1914
tcctctctgt gtcccccgcc cgttcctgga aactgagctt gacgtttgta aactgtggtt 1974
gcctgccttc cccagctccc acgcgggtgt gcgctgacac tgccgggggc gctggactgt 2034
gttggaccca tccgtgctcc gctgtgcctg gcttggcgtc tggtggagag aggggcctct 2094
tcagtgtcta ctgagtaagg ggacagctcc aggccggggc ctgtctcctg cacagagtaa 2154
gccggtaaat gtttgtgaaa tcaatgcgtg gataaaggaa cacatgccat ccaagtgatg 2214
atggcttttc ctggagggaa aggataggct gttgctctat ctaatttttt gtttttgttt 2274
ttggacagtc tagctctgtg gcccaggctg gcgtgcagtg ggccgtctca gttcactgca 2334
gcctccgcct cccaggttca agtgattctc atgcctcagc gttctgagta gctgggatta 2394
gaggcgtgtg ccactacacc cggctaattt ttgtactttt taaagtagag acggggcttt 2454
gccatattgg cctggctgat ctcaaactcc tggtcttgaa ctcctggcca caagtgatct 2514
gcccgccttg gcctcccaaa gtgctgggat tacaggcgta agccactaca cctggccctc 2574
ttcatcgaat tttatttgag aagtagagct cttgccattt tttcccttgc tccatttttc 2634
tcactttatg tctctctgac ctatgggcta cttgggagag cactggactc cattcatgca 2694
tgagcatttt caggataagc gacttctgtg aggctgagag aggaagaaaa cacggagcct 2754
tccctccagg tgcccagtgt aggtccagcg tgtttcctga gcctcctgtg agtttccact 2814
tgctttacat ccatgcaaca tgtcattttg aaactggatt gatttgcatt tcctggaact 2874
ctgccacctc atttcacaag catttatgga gcagttaaca tgtgactggt attcatgaat 2934
ataatgataa gcttgattct agttcagctg ctgtcacagt ctcatttgtt cttccaactg 2994
aaagccgtaa aacctttgtt gctttaattg aatgtctgtg cttatgagag gcagtggtta 3054
aaacaggggc tggcgagttg acaactgtgg gttcaaatcc cagctctacc acttactaac 3114
tgcatgggac tttgggtaag acacctgctt acattctcta agccttggtt tcctgaacct 3174
taaaacagga taacatagta cctgcttcgt agagtttttg tgagaattaa aggcaataaa 3234
gcatataatg acttagccca gcggcctgca ggcaatacat gttaatgaat gttagctatt 3294
attactaaag gatgagcaat tattattggc atcatgattt ctaaagaaga gctttgagtt 3354
ggtatttttc tctgtgtata agggtaagtc cgaactttct cagactggag gttacattca 3414
catcagtctg tcttcccctg cggatggcct cagccctggg tggccagact ctgtgctcac 3474
aatccagagc aatggatcc 3493
<210> 2
<211> 560
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Met Leu Arg Gly Thr Leu Leu Cys Ala Val Leu Gly Leu Leu Arg Ala
1 5 10 15
Gln Pro Phe Pro Cys Pro Pro Ala Cys Lys Cys Val Phe Arg Asp Ala
20 25 30
Ala Gln Cys Ser Gly Gly Asp Val Ala Arg Ile Ser Ala Leu Gly Leu
35 40 45
Pro Thr Asn Leu Thr His Ile Leu Leu Phe Gly Met Gly Arg Gly Val
50 55 60
Leu Gln Ser Gln Ser Phe Ser Gly Met Thr Val Leu Gln Arg Leu Met
65 70 75 80
Ile Ser Asp Ser His Ile Ser Ala Val Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asp
85 90 95
Leu Ile Lys Leu Lys Thr Leu Arg Leu Ser Arg Asn Lys Ile Thr His
100 105 110
Leu Pro Gly Ala Leu Leu Asp Lys Met Val Leu Leu Glu Gln Leu Phe
115 120 125
Leu Asp His Asn Ala Leu Arg Gly Ile Asp Gln Asn Met Phe Gln Lys
130 135 140
Leu Val Asn Leu Gln Glu Leu Ala Leu Asn Gln Asn Gln Leu Asp Phe
145 150 155 160
Leu Pro Ala Ser Leu Phe Thr Asn Leu Glu Asn Leu Lys Leu Leu Asp
165 170 175
Leu Ser Gly Asn Asn Leu Thr His Leu Pro Lys Gly Leu Leu Gly Ala
180 185 190
Gln Ala Lys Leu Glu Arg Leu Leu Leu His Ser Asn Arg Leu Val Ser
195 200 205
Leu Asp Ser Gly Leu Leu Asn Ser Leu Gly Ala Leu Thr Glu Leu Gln
210 215 220
Phe His Arg Asn His Ile Arg Ser Ile Ala Pro Gly Ala Phe Asp Arg
225 230 235 240
Leu Pro Asn Leu Ser Ser Leu Thr Leu Ser Arg Asn His Leu Ala Phe
245 250 255
Leu Pro Ser Ala Leu Phe Leu His Ser His Asn Leu Thr Leu Leu Thr
260 265 270
Leu Phe Glu Asn Pro Leu Ala Glu Leu Pro Gly Val Leu Phe Gly Glu
275 280 285
Met Gly Gly Leu Gln Glu Leu Trp Leu Asn Arg Thr Gln Leu Arg Thr
290 295 300
Leu Pro Ala Ala Ala Phe Arg Asn Leu Ser Arg Leu Arg Tyr Leu Gly
305 310 315 320
Val Thr Leu Ser Pro Arg Leu Ser Ala Leu Pro Gln Gly Ala Phe Gln
325 330 335
Gly Leu Gly Glu Leu Gln Val Leu Ala Leu His Ser Asn Gly Leu Thr
340 345 350
Ala Leu Pro Asp Gly Leu Leu Arg Gly Leu Gly Lys Leu Arg Gln Val
355 360 365
Ser Leu Arg Arg Asn Arg Leu Arg Ala Leu Pro Arg Ala Leu Phe Arg
370 375 380
Asn Leu Ser Ser Leu Glu Ser Val Gln Leu Asp His Asn Gln Leu Glu
385 390 395 400
Thr Leu Pro Gly Asp Val Phe Gly Ala Leu Pro Arg Leu Thr Glu Val
405 410 415
Leu Leu Gly His Asn Ser Trp Arg Cys Asp Cys Gly Leu Gly Pro Phe
420 425 430
Leu Gly Trp Leu Arg Gln His Leu Gly Leu Val Gly Gly Glu Glu Pro
435 440 445
Pro Arg Cys Ala Gly Pro Gly Ala His Ala Gly Leu Pro Leu Trp Ala
450 455 460
Leu Pro Gly Gly Asp Ala Glu Cys Pro Gly Pro Arg Gly Pro Pro Pro
465 470 475 480
Arg Pro Ala Ala Asp Ser Ser Ser Glu Ala Pro Val His Pro Ala Leu
485 490 495
Ala Pro Asn Ser Ser Glu Pro Trp Val Trp Ala Gln Pro Val Thr Thr
500 505 510
Gly Lys Gly Gln Asp His Ser Pro Phe Trp Gly Phe Tyr Phe Leu Leu
515 520 525
Leu Ala Val Gln Ala Met Ile Thr Val Ile Ile Val Phe Ala Met Ile
530 535 540
Lys Ile Gly Gln Leu Phe Arg Lys Leu Ile Arg Glu Arg Ala Leu Gly
545 550 555 560
<210> 3
<211> 544
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Gln Pro Phe Pro Cys Pro Pro Ala Cys Lys Cys Val Phe Arg Asp Ala
1 5 10 15
Ala Gln Cys Ser Gly Gly Asp Val Ala Arg Ile Ser Ala Leu Gly Leu
20 25 30
Pro Thr Asn Leu Thr His Ile Leu Leu Phe Gly Met Gly Arg Gly Val
35 40 45
Leu Gln Ser Gln Ser Phe Ser Gly Met Thr Val Leu Gln Arg Leu Met
50 55 60
Ile Ser Asp Ser His Ile Ser Ala Val Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asp
65 70 75 80
Leu Ile Lys Leu Lys Thr Leu Arg Leu Ser Arg Asn Lys Ile Thr His
85 90 95
Leu Pro Gly Ala Leu Leu Asp Lys Met Val Leu Leu Glu Gln Leu Phe
100 105 110
Leu Asp His Asn Ala Leu Arg Gly Ile Asp Gln Asn Met Phe Gln Lys
115 120 125
Leu Val Asn Leu Gln Glu Leu Ala Leu Asn Gln Asn Gln Leu Asp Phe
130 135 140
Leu Pro Ala Ser Leu Phe Thr Asn Leu Glu Asn Leu Lys Leu Leu Asp
145 150 155 160
Leu Ser Gly Asn Asn Leu Thr His Leu Pro Lys Gly Leu Leu Gly Ala
165 170 175
Gln Ala Lys Leu Glu Arg Leu Leu Leu His Ser Asn Arg Leu Val Ser
180 185 190
Leu Asp Ser Gly Leu Leu Asn Ser Leu Gly Ala Leu Thr Glu Leu Gln
195 200 205
Phe His Arg Asn His Ile Arg Ser Ile Ala Pro Gly Ala Phe Asp Arg
210 215 220
Leu Pro Asn Leu Ser Ser Leu Thr Leu Ser Arg Asn His Leu Ala Phe
225 230 235 240
Leu Pro Ser Ala Leu Phe Leu His Ser His Asn Leu Thr Leu Leu Thr
245 250 255
Leu Phe Glu Asn Pro Leu Ala Glu Leu Pro Gly Val Leu Phe Gly Glu
260 265 270
Met Gly Gly Leu Gln Glu Leu Trp Leu Asn Arg Thr Gln Leu Arg Thr
275 280 285
Leu Pro Ala Ala Ala Phe Arg Asn Leu Ser Arg Leu Arg Tyr Leu Gly
290 295 300
Val Thr Leu Ser Pro Arg Leu Ser Ala Leu Pro Gln Gly Ala Phe Gln
305 310 315 320
Gly Leu Gly Glu Leu Gln Val Leu Ala Leu His Ser Asn Gly Leu Thr
325 330 335
Ala Leu Pro Asp Gly Leu Leu Arg Gly Leu Gly Lys Leu Arg Gln Val
340 345 350
Ser Leu Arg Arg Asn Arg Leu Arg Ala Leu Pro Arg Ala Leu Phe Arg
355 360 365
Asn Leu Ser Ser Leu Glu Ser Val Gln Leu Asp His Asn Gln Leu Glu
370 375 380
Thr Leu Pro Gly Asp Val Phe Gly Ala Leu Pro Arg Leu Thr Glu Val
385 390 395 400
Leu Leu Gly His Asn Ser Trp Arg Cys Asp Cys Gly Leu Gly Pro Phe
405 410 415
Leu Gly Trp Leu Arg Gln His Leu Gly Leu Val Gly Gly Glu Glu Pro
420 425 430
Pro Arg Cys Ala Gly Pro Gly Ala His Ala Gly Leu Pro Leu Trp Ala
435 440 445
Leu Pro Gly Gly Asp Ala Glu Cys Pro Gly Pro Arg Gly Pro Pro Pro
450 455 460
Arg Pro Ala Ala Asp Ser Ser Ser Glu Ala Pro Val His Pro Ala Leu
465 470 475 480
Ala Pro Asn Ser Ser Glu Pro Trp Val Trp Ala Gln Pro Val Thr Thr
485 490 495
Gly Lys Gly Gln Asp His Ser Pro Phe Trp Gly Phe Tyr Phe Leu Leu
500 505 510
Leu Ala Val Gln Ala Met Ile Thr Val Ile Ile Val Phe Ala Met Ile
515 520 525
Lys Ile Gly Gln Leu Phe Arg Lys Leu Ile Arg Glu Arg Ala Leu Gly
530 535 540
<210> 4
<211> 527
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有C端聚组氨酸标签的可溶性GPV
<400> 4
Gln Pro Phe Pro Cys Pro Pro Ala Cys Lys Cys Val Phe Arg Asp Ala
1 5 10 15
Ala Gln Cys Ser Gly Gly Asp Val Ala Arg Ile Ser Ala Leu Gly Leu
20 25 30
Pro Thr Asn Leu Thr His Ile Leu Leu Phe Gly Met Gly Arg Gly Val
35 40 45
Leu Gln Ser Gln Ser Phe Ser Gly Met Thr Val Leu Gln Arg Leu Met
50 55 60
Ile Ser Asp Ser His Ile Ser Ala Val Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asp
65 70 75 80
Leu Ile Lys Leu Lys Thr Leu Arg Leu Ser Arg Asn Lys Ile Thr His
85 90 95
Leu Pro Gly Ala Leu Leu Asp Lys Met Val Leu Leu Glu Gln Leu Phe
100 105 110
Leu Asp His Asn Ala Leu Arg Gly Ile Asp Gln Asn Met Phe Gln Lys
115 120 125
Leu Val Asn Leu Gln Glu Leu Ala Leu Asn Gln Asn Gln Leu Asp Phe
130 135 140
Leu Pro Ala Ser Leu Phe Thr Asn Leu Glu Asn Leu Lys Leu Leu Asp
145 150 155 160
Leu Ser Gly Asn Asn Leu Thr His Leu Pro Lys Gly Leu Leu Gly Ala
165 170 175
Gln Ala Lys Leu Glu Arg Leu Leu Leu His Ser Asn Arg Leu Val Ser
180 185 190
Leu Asp Ser Gly Leu Leu Asn Ser Leu Gly Ala Leu Thr Glu Leu Gln
195 200 205
Phe His Arg Asn His Ile Arg Ser Ile Ala Pro Gly Ala Phe Asp Arg
210 215 220
Leu Pro Asn Leu Ser Ser Leu Thr Leu Ser Arg Asn His Leu Ala Phe
225 230 235 240
Leu Pro Ser Ala Leu Phe Leu His Ser His Asn Leu Thr Leu Leu Thr
245 250 255
Leu Phe Glu Asn Pro Leu Ala Glu Leu Pro Gly Val Leu Phe Gly Glu
260 265 270
Met Gly Gly Leu Gln Glu Leu Trp Leu Asn Arg Thr Gln Leu Arg Thr
275 280 285
Leu Pro Ala Ala Ala Phe Arg Asn Leu Ser Arg Leu Arg Tyr Leu Gly
290 295 300
Val Thr Leu Ser Pro Arg Leu Ser Ala Leu Pro Gln Gly Ala Phe Gln
305 310 315 320
Gly Leu Gly Glu Leu Gln Val Leu Ala Leu His Ser Asn Gly Leu Thr
325 330 335
Ala Leu Pro Asp Gly Leu Leu Arg Gly Leu Gly Lys Leu Arg Gln Val
340 345 350
Ser Leu Arg Arg Asn Arg Leu Arg Ala Leu Pro Arg Ala Leu Phe Arg
355 360 365
Asn Leu Ser Ser Leu Glu Ser Val Gln Leu Asp His Asn Gln Leu Glu
370 375 380
Thr Leu Pro Gly Asp Val Phe Gly Ala Leu Pro Arg Leu Thr Glu Val
385 390 395 400
Leu Leu Gly His Asn Ser Trp Arg Cys Asp Cys Gly Leu Gly Pro Phe
405 410 415
Leu Gly Trp Leu Arg Gln His Leu Gly Leu Val Gly Gly Glu Glu Pro
420 425 430
Pro Arg Cys Ala Gly Pro Gly Ala His Ala Gly Leu Pro Leu Trp Ala
435 440 445
Leu Pro Gly Gly Asp Ala Glu Cys Pro Gly Pro Arg Gly Pro Pro Pro
450 455 460
Arg Pro Ala Ala Asp Ser Ser Ser Glu Ala Pro Val His Pro Ala Leu
465 470 475 480
Ala Pro Asn Ser Ser Glu Pro Trp Val Trp Ala Gln Pro Val Thr Thr
485 490 495
Gly Lys Gly Gln Asp His Ser Pro Phe Trp Gly Phe Tyr Phe Leu Leu
500 505 510
Leu Ala Val Gln Ala His His His His His His His His His His
515 520 525
<210> 5
<211> 2215
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> CDS
<222> (30)..(1733)
<400> 5
tcagtccagg gtgcagaact gcttcagac atg cta aga agc gcc ctg ctg tcc 53
Met Leu Arg Ser Ala Leu Leu Ser
1 5
gcg gtg ctc gca ctc ttg cgt gcc caa cct ttt ccc tgc ccc aaa acc 101
Ala Val Leu Ala Leu Leu Arg Ala Gln Pro Phe Pro Cys Pro Lys Thr
10 15 20
tgc aag tgt gtg gtc cgc gat gcc gcg cag tgc tcg ggc ggc agc gtg 149
Cys Lys Cys Val Val Arg Asp Ala Ala Gln Cys Ser Gly Gly Ser Val
25 30 35 40
gct cac atc gct gag cta ggt ctg cct acg aac ctc aca cac atc ctg 197
Ala His Ile Ala Glu Leu Gly Leu Pro Thr Asn Leu Thr His Ile Leu
45 50 55
ctc ttc cga atg gac cag ggc ata ttg cgg aac cac agc ttc agc ggc 245
Leu Phe Arg Met Asp Gln Gly Ile Leu Arg Asn His Ser Phe Ser Gly
60 65 70
atg aca gtc ctt cag cgc ctg atg ctc tca gat agc cac att tcc gcc 293
Met Thr Val Leu Gln Arg Leu Met Leu Ser Asp Ser His Ile Ser Ala
75 80 85
atc gac ccc ggc acc ttc aat gac ctg gta aaa ctg aaa acc ctc agg 341
Ile Asp Pro Gly Thr Phe Asn Asp Leu Val Lys Leu Lys Thr Leu Arg
90 95 100
ttg acg cgc aac aaa atc tct cgt ctt cca cgt gcg atc ctg gat aag 389
Leu Thr Arg Asn Lys Ile Ser Arg Leu Pro Arg Ala Ile Leu Asp Lys
105 110 115 120
atg gta ctc ttg gaa cag ctg ttc ttg gac cac aat gca cta agg gac 437
Met Val Leu Leu Glu Gln Leu Phe Leu Asp His Asn Ala Leu Arg Asp
125 130 135
ctt gat caa aac ctg ttt cag caa ctg cgt aac ctt cag gag ctc ggt 485
Leu Asp Gln Asn Leu Phe Gln Gln Leu Arg Asn Leu Gln Glu Leu Gly
140 145 150
ttg aac cag aat cag ctc tct ttt ctt cct gct aac ctt ttc tcg agc 533
Leu Asn Gln Asn Gln Leu Ser Phe Leu Pro Ala Asn Leu Phe Ser Ser
155 160 16
ctg aga gaa ctg aag ttg ttg gat tta tcg cga aac aac ctg acc cac 581
Leu Arg Glu Leu Lys Leu Leu Asp Leu Ser Arg Asn Asn Leu Thr His
170 175 180
ctg ccc aag gga ctg ctt ggg gct caa gtt aag ctt gag aaa ctg ctg 629
Leu Pro Lys Gly Leu Leu Gly Ala Gln Val Lys Leu Glu Lys Leu Leu
185 190 195 200
ctc tat tca aac cag ctc acg tct gtg gat tcg ggg ctg ctg agc aac 677
Leu Tyr Ser Asn Gln Leu Thr Ser Val Asp Ser Gly Leu Leu Ser Asn
205 210 215
ctg ggc gcc ctg act gag ctg cgg ctg gag cgg aat cac ctc cgc tcc 725
Leu Gly Ala Leu Thr Glu Leu Arg Leu Glu Arg Asn His Leu Arg Ser
220 225 230
gta gcc ccg ggt gcc ttc gac cgc ctc gga aac ctg agc tcc ttg act 773
Val Ala Pro Gly Ala Phe Asp Arg Leu Gly Asn Leu Ser Ser Leu Thr
235 240 245
cta tcc gga aac ctc ctg gag tct ctg ccg ccc gcg ctc ttc ctt cac 821
Leu Ser Gly Asn Leu Leu Glu Ser Leu Pro Pro Ala Leu Phe Leu His
250 255 260
gtg agc agc gtg tct cgg ctg act ctg ttc gag aac ccc ctg gag gag 869
Val Ser Ser Val Ser Arg Leu Thr Leu Phe Glu Asn Pro Leu Glu Glu
265 270 275 280
ctc ccg gac gtg ttg ttc ggg gag atg gcc ggc ctg cgg gag ctg tgg 917
Leu Pro Asp Val Leu Phe Gly Glu Met Ala Gly Leu Arg Glu Leu Trp
285 290 295
ctg aac ggc acc cac ctg agc acg ctg ccc gcc gct gcc ttc cgc aac 965
Leu Asn Gly Thr His Leu Ser Thr Leu Pro Ala Ala Ala Phe Arg Asn
300 305 310
ctg agc ggc ttg cag acg ctg ggg ctg acg cgg aac ccg cgc ctg agc 1013
Leu Ser Gly Leu Gln Thr Leu Gly Leu Thr Arg Asn Pro Arg Leu Ser
315 320 325
gcg ctc ccg cgc ggc gtg ttc cag ggc cta cgg gag ctg cgc gtg ctc 1061
Ala Leu Pro Arg Gly Val Phe Gln Gly Leu Arg Glu Leu Arg Val Leu
330 335 340
gcg ctg cac acc aac gcc ctg gcg gag ctg cgg gac gac gcg ctg cgc 1109
Ala Leu His Thr Asn Ala Leu Ala Glu Leu Arg Asp Asp Ala Leu Arg
345 350 355 360
ggc ctc ggg cac ctg cgc cag gtg tcg ctg cgc cac aac cgg ctg cgg 1157
Gly Leu Gly His Leu Arg Gln Val Ser Leu Arg His Asn Arg Leu Arg
365 370 375
gcc ctg ccc cgc acg ctc ttc cgc aac ctc agc agc ctc gag agc gtg 1205
Ala Leu Pro Arg Thr Leu Phe Arg Asn Leu Ser Ser Leu Glu Ser Val
380 385 390
cag cta gag cac aac cag ctg gag acg ctg cca gga gac gtg ttc gcg 1253
Gln Leu Glu His Asn Gln Leu Glu Thr Leu Pro Gly Asp Val Phe Ala
395 400 405
gct ctg ccc cag ctg acc cag gtc ctg ctg ggt cac aac ccc tgg ctc 1301
Ala Leu Pro Gln Leu Thr Gln Val Leu Leu Gly His Asn Pro Trp Leu
410 415 420
tgc gac tgt ggc ctg tgg ccc ttc ctc cag tgg ctg cgg cat cac ccg 1349
Cys Asp Cys Gly Leu Trp Pro Phe Leu Gln Trp Leu Arg His His Pro
425 430 435 440
gac atc ctg ggc cga gac gag ccc ccg cag tgc cgt ggc ccg gag cca 1397
Asp Ile Leu Gly Arg Asp Glu Pro Pro Gln Cys Arg Gly Pro Glu Pro
445 450 455
cgc gcc agc ctg tcg ttc tgg gag ctg ctg cag ggt gac ccg tgg tgc 1445
Arg Ala Ser Leu Ser Phe Trp Glu Leu Leu Gln Gly Asp Pro Trp Cys
460 465 470
ccg gat cct cgc agc ctg cct ctc gac cct cca acc gaa aat gct ctg 1493
Pro Asp Pro Arg Ser Leu Pro Leu Asp Pro Pro Thr Glu Asn Ala Leu
475 480 485
gaa gcc ccg gtt ccg tcc tgg ctg cct aac agc tgg cag tcc cag acg 1541
Glu Ala Pro Val Pro Ser Trp Leu Pro Asn Ser Trp Gln Ser Gln Thr
490 495 500
tgg gcc cag ctg gtg gcc agg ggt gaa agt ccc aat aac agg ctc tac 1589
Trp Ala Gln Leu Val Ala Arg Gly Glu Ser Pro Asn Asn Arg Leu Tyr
505 510 515 520
tgg ggt ctt tat att ctg ctt cta gta gcc cag gcc atc ata gcc gcg 1637
Trp Gly Leu Tyr Ile Leu Leu Leu Val Ala Gln Ala Ile Ile Ala Ala
525 530 535
ttc atc gtg ttt gcc atg att aaa atc ggc cag ctg ttt cga aca tta 1685
Phe Ile Val Phe Ala Met Ile Lys Ile Gly Gln Leu Phe Arg Thr Leu
540 545 550
atc aga gag aag ctc ttg tta gag gca atg gga aaa tcg tgt aac taa 1733
Ile Arg Glu Lys Leu Leu Leu Glu Ala Met Gly Lys Ser Cys Asn
555 560 565
tgaaactgac cagagcattg tggacggggc cccaaggaga atgcagtcag gatgctggcg 1793
tgccattaca ctatttccca ggccttttct cctctcccgt gctcttagtg tctcttcttc 1853
tcccctctct tcagaagtag cttttgtaaa tcgctactgc tttctagcct ggcctgggtt 1913
acctcctctg ctgttagttt caagggggct gagggtgggg gttcgacggg acttggctca 1973
tcaggtccaa ctgtgcagcg ctgggtgcct agtggagaga ggagcccttt cttggtttct 2033
gaatttgagg acacatcctg ccagtgggca agacctctcc gggacccagc aagggttgag 2093
taacatttgc tgaaggaaca ccggcttaaa acgaacccta ggtccaagag atgaaggctc 2153
ttcccaaaat aaaggtggag tgttcttgtc cctttacctg aaaggaaaaa aaaaaaaaaa 2213
aa 2215
<210> 6
<211> 567
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 6
Met Leu Arg Ser Ala Leu Leu Ser Ala Val Leu Ala Leu Leu Arg Ala
1 5 10 15
Gln Pro Phe Pro Cys Pro Lys Thr Cys Lys Cys Val Val Arg Asp Ala
20 25 30
Ala Gln Cys Ser Gly Gly Ser Val Ala His Ile Ala Glu Leu Gly Leu
35 40 45
Pro Thr Asn Leu Thr His Ile Leu Leu Phe Arg Met Asp Gln Gly Ile
50 55 60
Leu Arg Asn His Ser Phe Ser Gly Met Thr Val Leu Gln Arg Leu Met
65 70 75 80
Leu Ser Asp Ser His Ile Ser Ala Ile Asp Pro Gly Thr Phe Asn Asp
85 90 95
Leu Val Lys Leu Lys Thr Leu Arg Leu Thr Arg Asn Lys Ile Ser Arg
100 105 110
Leu Pro Arg Ala Ile Leu Asp Lys Met Val Leu Leu Glu Gln Leu Phe
115 120 125
Leu Asp His Asn Ala Leu Arg Asp Leu Asp Gln Asn Leu Phe Gln Gln
130 135 140
Leu Arg Asn Leu Gln Glu Leu Gly Leu Asn Gln Asn Gln Leu Ser Phe
145 150 155 160
Leu Pro Ala Asn Leu Phe Ser Ser Leu Arg Glu Leu Lys Leu Leu Asp
165 170 175
Leu Ser Arg Asn Asn Leu Thr His Leu Pro Lys Gly Leu Leu Gly Ala
180 185 190
Gln Val Lys Leu Glu Lys Leu Leu Leu Tyr Ser Asn Gln Leu Thr Ser
195 200 205
Val Asp Ser Gly Leu Leu Ser Asn Leu Gly Ala Leu Thr Glu Leu Arg
210 215 220
Leu Glu Arg Asn His Leu Arg Ser Val Ala Pro Gly Ala Phe Asp Arg
225 230 235 240
Leu Gly Asn Leu Ser Ser Leu Thr Leu Ser Gly Asn Leu Leu Glu Ser
245 250 255
Leu Pro Pro Ala Leu Phe Leu His Val Ser Ser Val Ser Arg Leu Thr
260 265 270
Leu Phe Glu Asn Pro Leu Glu Glu Leu Pro Asp Val Leu Phe Gly Glu
275 280 285
Met Ala Gly Leu Arg Glu Leu Trp Leu Asn Gly Thr His Leu Ser Thr
290 295 300
Leu Pro Ala Ala Ala Phe Arg Asn Leu Ser Gly Leu Gln Thr Leu Gly
305 310 315 320
Leu Thr Arg Asn Pro Arg Leu Ser Ala Leu Pro Arg Gly Val Phe Gln
325 330 335
Gly Leu Arg Glu Leu Arg Val Leu Ala Leu His Thr Asn Ala Leu Ala
340 345 350
Glu Leu Arg Asp Asp Ala Leu Arg Gly Leu Gly His Leu Arg Gln Val
355 360 365
Ser Leu Arg His Asn Arg Leu Arg Ala Leu Pro Arg Thr Leu Phe Arg
370 375 380
Asn Leu Ser Ser Leu Glu Ser Val Gln Leu Glu His Asn Gln Leu Glu
385 390 395 400
Thr Leu Pro Gly Asp Val Phe Ala Ala Leu Pro Gln Leu Thr Gln Val
405 410 415
Leu Leu Gly His Asn Pro Trp Leu Cys Asp Cys Gly Leu Trp Pro Phe
420 425 430
Leu Gln Trp Leu Arg His His Pro Asp Ile Leu Gly Arg Asp Glu Pro
435 440 445
Pro Gln Cys Arg Gly Pro Glu Pro Arg Ala Ser Leu Ser Phe Trp Glu
450 455 460
Leu Leu Gln Gly Asp Pro Trp Cys Pro Asp Pro Arg Ser Leu Pro Leu
465 470 475 480
Asp Pro Pro Thr Glu Asn Ala Leu Glu Ala Pro Val Pro Ser Trp Leu
485 490 495
Pro Asn Ser Trp Gln Ser Gln Thr Trp Ala Gln Leu Val Ala Arg Gly
500 505 510
Glu Ser Pro Asn Asn Arg Leu Tyr Trp Gly Leu Tyr Ile Leu Leu Leu
515 520 525
Val Ala Gln Ala Ile Ile Ala Ala Phe Ile Val Phe Ala Met Ile Lys
530 535 540
Ile Gly Gln Leu Phe Arg Thr Leu Ile Arg Glu Lys Leu Leu Leu Glu
545 550 555 560
Ala Met Gly Lys Ser Cys Asn
565
<210> 7
<211> 551
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 7
Gln Pro Phe Pro Cys Pro Lys Thr Cys Lys Cys Val Val Arg Asp Ala
1 5 10 15
Ala Gln Cys Ser Gly Gly Ser Val Ala His Ile Ala Glu Leu Gly Leu
20 25 30
Pro Thr Asn Leu Thr His Ile Leu Leu Phe Arg Met Asp Gln Gly Ile
35 40 45
Leu Arg Asn His Ser Phe Ser Gly Met Thr Val Leu Gln Arg Leu Met
50 55 60
Leu Ser Asp Ser His Ile Ser Ala Ile Asp Pro Gly Thr Phe Asn Asp
65 70 75 80
Leu Val Lys Leu Lys Thr Leu Arg Leu Thr Arg Asn Lys Ile Ser Arg
85 90 95
Leu Pro Arg Ala Ile Leu Asp Lys Met Val Leu Leu Glu Gln Leu Phe
100 105 110
Leu Asp His Asn Ala Leu Arg Asp Leu Asp Gln Asn Leu Phe Gln Gln
115 120 125
Leu Arg Asn Leu Gln Glu Leu Gly Leu Asn Gln Asn Gln Leu Ser Phe
130 135 140
Leu Pro Ala Asn Leu Phe Ser Ser Leu Arg Glu Leu Lys Leu Leu Asp
145 150 155 160
Leu Ser Arg Asn Asn Leu Thr His Leu Pro Lys Gly Leu Leu Gly Ala
165 170 175
Gln Val Lys Leu Glu Lys Leu Leu Leu Tyr Ser Asn Gln Leu Thr Ser
180 185 190
Val Asp Ser Gly Leu Leu Ser Asn Leu Gly Ala Leu Thr Glu Leu Arg
195 200 205
Leu Glu Arg Asn His Leu Arg Ser Val Ala Pro Gly Ala Phe Asp Arg
210 215 220
Leu Gly Asn Leu Ser Ser Leu Thr Leu Ser Gly Asn Leu Leu Glu Ser
225 230 235 240
Leu Pro Pro Ala Leu Phe Leu His Val Ser Ser Val Ser Arg Leu Thr
245 250 255
Leu Phe Glu Asn Pro Leu Glu Glu Leu Pro Asp Val Leu Phe Gly Glu
260 265 270
Met Ala Gly Leu Arg Glu Leu Trp Leu Asn Gly Thr His Leu Ser Thr
275 280 285
Leu Pro Ala Ala Ala Phe Arg Asn Leu Ser Gly Leu Gln Thr Leu Gly
290 295 300
Leu Thr Arg Asn Pro Arg Leu Ser Ala Leu Pro Arg Gly Val Phe Gln
305 310 315 320
Gly Leu Arg Glu Leu Arg Val Leu Ala Leu His Thr Asn Ala Leu Ala
325 330 335
Glu Leu Arg Asp Asp Ala Leu Arg Gly Leu Gly His Leu Arg Gln Val
340 345 350
Ser Leu Arg His Asn Arg Leu Arg Ala Leu Pro Arg Thr Leu Phe Arg
355 360 365
Asn Leu Ser Ser Leu Glu Ser Val Gln Leu Glu His Asn Gln Leu Glu
370 375 380
Thr Leu Pro Gly Asp Val Phe Ala Ala Leu Pro Gln Leu Thr Gln Val
385 390 395 400
Leu Leu Gly His Asn Pro Trp Leu Cys Asp Cys Gly Leu Trp Pro Phe
405 410 415
Leu Gln Trp Leu Arg His His Pro Asp Ile Leu Gly Arg Asp Glu Pro
420 425 430
Pro Gln Cys Arg Gly Pro Glu Pro Arg Ala Ser Leu Ser Phe Trp Glu
435 440 445
Leu Leu Gln Gly Asp Pro Trp Cys Pro Asp Pro Arg Ser Leu Pro Leu
450 455 460
Asp Pro Pro Thr Glu Asn Ala Leu Glu Ala Pro Val Pro Ser Trp Leu
465 470 475 480
Pro Asn Ser Trp Gln Ser Gln Thr Trp Ala Gln Leu Val Ala Arg Gly
485 490 495
Glu Ser Pro Asn Asn Arg Leu Tyr Trp Gly Leu Tyr Ile Leu Leu Leu
500 505 510
Val Ala Gln Ala Ile Ile Ala Ala Phe Ile Val Phe Ala Met Ile Lys
515 520 525
Ile Gly Gln Leu Phe Arg Thr Leu Ile Arg Glu Lys Leu Leu Leu Glu
530 535 540
Ala Met Gly Lys Ser Cys Asn
545 550
<210> 8
<211> 527
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有C端Flag标签的可溶性鼠糖蛋白V
<400> 8
Gln Pro Phe Pro Cys Pro Lys Thr Cys Lys Cys Val Val Arg Asp Ala
1 5 10 15
Ala Gln Cys Ser Gly Gly Ser Val Ala His Ile Ala Glu Leu Gly Leu
20 25 30
Pro Thr Asn Leu Thr His Ile Leu Leu Phe Arg Met Asp Gln Gly Ile
35 40 45
Leu Arg Asn His Ser Phe Ser Gly Met Thr Val Leu Gln Arg Gln Met
50 55 60
Leu Ser Asp Ser His Ile Ser Ala Ile Asp Pro Gly Thr Phe Asn Asp
65 70 75 80
Leu Val Lys Leu Lys Thr Leu Arg Leu Thr Arg Asn Lys Ile Ser Arg
85 90 95
Leu Pro Arg Ala Ile Leu Asp Lys Met Val Leu Leu Glu Gln Leu Phe
100 105 110
Leu Asp His Asn Ala Leu Arg Asp Leu Asp Gln Asn Leu Phe Gln Gln
115 120 125
Leu Arg Asn Leu Gln Glu Leu Gly Leu Asn Gln Asn Gln Leu Ser Phe
130 135 140
Leu Pro Ala Asn Leu Phe Ser Ser Leu Arg Glu Leu Lys Leu Leu Asp
145 150 155 160
Leu Ser Arg Asn Asn Leu Thr His Leu Pro Lys Gly Leu Leu Gly Ala
165 170 175
Gln Val Lys Leu Glu Lys Leu Leu Leu Tyr Ser Asn Gln Leu Thr Ser
180 185 190
Val Asp Ser Gly Leu Leu Ser Asn Leu Gly Ala Leu Thr Glu Leu Arg
195 200 205
Leu Glu Arg Asn His Leu Arg Ser Val Ala Pro Gly Ala Phe Asp Arg
210 215 220
Leu Gly Asn Leu Ser Ser Leu Thr Leu Ser Gly Asn Leu Leu Glu Ser
225 230 235 240
Leu Pro Pro Ala Leu Phe Leu His Val Ser Ser Val Ser Arg Leu Thr
245 250 255
Leu Phe Glu Asn Pro Leu Glu Glu Leu Pro Asp Val Leu Phe Gly Glu
260 265 270
Met Ala Gly Leu Arg Glu Leu Trp Leu Asn Gly Thr His Leu Ser Thr
275 280 285
Leu Pro Ala Ala Ala Phe Arg Asn Leu Ser Gly Leu Gln Thr Leu Gly
290 295 300
Leu Thr Arg Asn Pro Arg Leu Ser Ala Leu Pro Arg Gly Val Phe Gln
305 310 315 320
Gly Leu Arg Glu Leu Arg Val Leu Gly Leu His Thr Asn Ala Leu Ala
325 330 335
Glu Leu Arg Asp Asp Ala Leu Arg Gly Leu Gly His Leu Arg Gln Val
340 345 350
Ser Leu Arg His Asn Arg Leu Arg Ala Leu Pro Arg Thr Leu Phe Arg
355 360 365
Asn Leu Ser Ser Leu Glu Ser Val Gln Leu Glu His Asn Gln Leu Glu
370 375 380
Thr Leu Pro Gly Asp Val Phe Ala Ala Leu Pro Gln Leu Thr Gln Val
385 390 395 400
Leu Leu Gly His Asn Pro Trp Leu Cys Asp Cys Gly Leu Trp Arg Phe
405 410 415
Leu Gln Trp Leu Arg His His Pro Asp Ile Leu Gly Arg Asp Glu Pro
420 425 430
Pro Gln Cys Arg Gly Pro Glu Pro Arg Ala Ser Leu Ser Phe Trp Glu
435 440 445
Leu Leu Gln Gly Asp Pro Trp Cys Pro Asp Pro Arg Ser Leu Pro Leu
450 455 460
Asp Pro Pro Thr Glu Asn Ala Leu Glu Ala Pro Val Pro Ser Trp Leu
465 470 475 480
Pro Asn Ser Trp Gln Ser Gln Thr Trp Ala Gln Leu Val Ala Arg Gly
485 490 495
Glu Ser Pro Asn Asn Arg Leu Glu Cys Gly Arg Asn Pro Ala Phe Leu
500 505 510
Tyr Lys Val Val Leu Glu Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
515 520 525
<210> 9
<211> 1078
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过接头融合至白蛋白的可溶性人GPV (无信号肽)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(457)
<223> 人 GPV
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (458)..(463)
<223> 凝血酶切割位点
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (464)..(493)
<223> GGS接头
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (494)..(1078)
<223> 人白蛋白
<400> 9
Gln Pro Phe Pro Cys Pro Pro Ala Cys Lys Cys Val Phe Arg Asp Ala
1 5 10 15
Ala Gln Cys Ser Gly Gly Asp Val Ala Arg Ile Ser Ala Leu Gly Leu
20 25 30
Pro Thr Asn Leu Thr His Ile Leu Leu Phe Gly Met Gly Arg Gly Val
35 40 45
Leu Gln Ser Gln Ser Phe Ser Gly Met Thr Val Leu Gln Arg Leu Met
50 55 60
Ile Ser Asp Ser His Ile Ser Ala Val Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asp
65 70 75 80
Leu Ile Lys Leu Lys Thr Leu Arg Leu Ser Arg Asn Lys Ile Thr His
85 90 95
Leu Pro Gly Ala Leu Leu Asp Lys Met Val Leu Leu Glu Gln Leu Phe
100 105 110
Leu Asp His Asn Ala Leu Arg Gly Ile Asp Gln Asn Met Phe Gln Lys
115 120 125
Leu Val Asn Leu Gln Glu Leu Ala Leu Asn Gln Asn Gln Leu Asp Phe
130 135 140
Leu Pro Ala Ser Leu Phe Thr Asn Leu Glu Asn Leu Lys Leu Leu Asp
145 150 155 160
Leu Ser Gly Asn Asn Leu Thr His Leu Pro Lys Gly Leu Leu Gly Ala
165 170 175
Gln Ala Lys Leu Glu Arg Leu Leu Leu His Ser Asn Arg Leu Val Ser
180 185 190
Leu Asp Ser Gly Leu Leu Asn Ser Leu Gly Ala Leu Thr Glu Leu Gln
195 200 205
Phe His Arg Asn His Ile Arg Ser Ile Ala Pro Gly Ala Phe Asp Arg
210 215 220
Leu Pro Asn Leu Ser Ser Leu Thr Leu Ser Arg Asn His Leu Ala Phe
225 230 235 240
Leu Pro Ser Ala Leu Phe Leu His Ser His Asn Leu Thr Leu Leu Thr
245 250 255
Leu Phe Glu Asn Pro Leu Ala Glu Leu Pro Gly Val Leu Phe Gly Glu
260 265 270
Met Gly Gly Leu Gln Glu Leu Trp Leu Asn Arg Thr Gln Leu Arg Thr
275 280 285
Leu Pro Ala Ala Ala Phe Arg Asn Leu Ser Arg Leu Arg Tyr Leu Gly
290 295 300
Val Thr Leu Ser Pro Arg Leu Ser Ala Leu Pro Gln Gly Ala Phe Gln
305 310 315 320
Gly Leu Gly Glu Leu Gln Val Leu Ala Leu His Ser Asn Gly Leu Thr
325 330 335
Ala Leu Pro Asp Gly Leu Leu Arg Gly Leu Gly Lys Leu Arg Gln Val
340 345 350
Ser Leu Arg Arg Asn Arg Leu Arg Ala Leu Pro Arg Ala Leu Phe Arg
355 360 365
Asn Leu Ser Ser Leu Glu Ser Val Gln Leu Asp His Asn Gln Leu Glu
370 375 380
Thr Leu Pro Gly Asp Val Phe Gly Ala Leu Pro Arg Leu Thr Glu Val
385 390 395 400
Leu Leu Gly His Asn Ser Trp Arg Cys Asp Cys Gly Leu Gly Pro Phe
405 410 415
Leu Gly Trp Leu Arg Gln His Leu Gly Leu Val Gly Gly Glu Glu Pro
420 425 430
Pro Arg Cys Ala Gly Pro Gly Ala His Ala Gly Leu Pro Leu Trp Ala
435 440 445
Leu Pro Gly Gly Asp Ala Glu Cys Pro Gly Pro Arg Ala Val Gly Ser
450 455 460
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
465 470 475 480
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Asp Ala His
485 490 495
Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe
500 505 510
Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro
515 520 525
Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys
530 535 540
Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His
545 550 555 560
Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr
565 570 575
Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn
580 585 590
Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu
595 600 605
Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu
610 615 620
Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro
625 630 635 640
Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala
645 650 655
Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu
660 665 670
Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys
675 680 685
Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe
690 695 700
Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu
705 710 715 720
Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr
725 730 735
Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp
740 745 750
Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu
755 760 765
Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala
770 775 780
Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala
785 790 795 800
Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys
805 810 815
Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro
820 825 830
Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr
835 840 845
Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala
850 855 860
Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu
865 870 875 880
Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe
885 890 895
Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser
900 905 910
Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser
915 920 925
Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp
930 935 940
Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr
945 950 955 960
Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn
965 970 975
Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro
980 985 990
Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr
995 1000 1005
Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val
1010 1015 1020
Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys
1025 1030 1035
Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
1040 1045 1050
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu
1055 1060 1065
Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
1070 1075
<210> 10
<211> 460
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(460)
<223> 从凝血酶裂解获得的人GPV 的片段(GPVf1)
<400> 10
Gln Pro Phe Pro Cys Pro Pro Ala Cys Lys Cys Val Phe Arg Asp Ala
1 5 10 15
Ala Gln Cys Ser Gly Gly Asp Val Ala Arg Ile Ser Ala Leu Gly Leu
20 25 30
Pro Thr Asn Leu Thr His Ile Leu Leu Phe Gly Met Gly Arg Gly Val
35 40 45
Leu Gln Ser Gln Ser Phe Ser Gly Met Thr Val Leu Gln Arg Leu Met
50 55 60
Ile Ser Asp Ser His Ile Ser Ala Val Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asp
65 70 75 80
Leu Ile Lys Leu Lys Thr Leu Arg Leu Ser Arg Asn Lys Ile Thr His
85 90 95
Leu Pro Gly Ala Leu Leu Asp Lys Met Val Leu Leu Glu Gln Leu Phe
100 105 110
Leu Asp His Asn Ala Leu Arg Gly Ile Asp Gln Asn Met Phe Gln Lys
115 120 125
Leu Val Asn Leu Gln Glu Leu Ala Leu Asn Gln Asn Gln Leu Asp Phe
130 135 140
Leu Pro Ala Ser Leu Phe Thr Asn Leu Glu Asn Leu Lys Leu Leu Asp
145 150 155 160
Leu Ser Gly Asn Asn Leu Thr His Leu Pro Lys Gly Leu Leu Gly Ala
165 170 175
Gln Ala Lys Leu Glu Arg Leu Leu Leu His Ser Asn Arg Leu Val Ser
180 185 190
Leu Asp Ser Gly Leu Leu Asn Ser Leu Gly Ala Leu Thr Glu Leu Gln
195 200 205
Phe His Arg Asn His Ile Arg Ser Ile Ala Pro Gly Ala Phe Asp Arg
210 215 220
Leu Pro Asn Leu Ser Ser Leu Thr Leu Ser Arg Asn His Leu Ala Phe
225 230 235 240
Leu Pro Ser Ala Leu Phe Leu His Ser His Asn Leu Thr Leu Leu Thr
245 250 255
Leu Phe Glu Asn Pro Leu Ala Glu Leu Pro Gly Val Leu Phe Gly Glu
260 265 270
Met Gly Gly Leu Gln Glu Leu Trp Leu Asn Arg Thr Gln Leu Arg Thr
275 280 285
Leu Pro Ala Ala Ala Phe Arg Asn Leu Ser Arg Leu Arg Tyr Leu Gly
290 295 300
Val Thr Leu Ser Pro Arg Leu Ser Ala Leu Pro Gln Gly Ala Phe Gln
305 310 315 320
Gly Leu Gly Glu Leu Gln Val Leu Ala Leu His Ser Asn Gly Leu Thr
325 330 335
Ala Leu Pro Asp Gly Leu Leu Arg Gly Leu Gly Lys Leu Arg Gln Val
340 345 350
Ser Leu Arg Arg Asn Arg Leu Arg Ala Leu Pro Arg Ala Leu Phe Arg
355 360 365
Asn Leu Ser Ser Leu Glu Ser Val Gln Leu Asp His Asn Gln Leu Glu
370 375 380
Thr Leu Pro Gly Asp Val Phe Gly Ala Leu Pro Arg Leu Thr Glu Val
385 390 395 400
Leu Leu Gly His Asn Ser Trp Arg Cys Asp Cys Gly Leu Gly Pro Phe
405 410 415
Leu Gly Trp Leu Arg Gln His Leu Gly Leu Val Gly Gly Glu Glu Pro
420 425 430
Pro Arg Cys Ala Gly Pro Gly Ala His Ala Gly Leu Pro Leu Trp Ala
435 440 445
Leu Pro Gly Gly Asp Ala Glu Cys Pro Gly Pro Arg
450 455 460

Claims (20)

1.一种包含缺乏功能性跨膜结构域的修饰的糖蛋白V(GPV)的可溶性多肽，其用于治疗和/或预防受试者中的血栓性疾病，所述治疗或预防包括向受试者施用有效量的所述可溶性多肽。
2.根据权利要求1使用的可溶性多肽，其中所述血栓性疾病选自：血栓炎症性病症，静脉血栓形成，动脉血栓形成，毛细血管血栓形成，门静脉血栓形成，肾静脉血栓形成，颈静脉血栓形成，脑静脉窦血栓形成，血液与人造表面接触期间或之后的血栓形成，特别是体外膜式氧合(ECMO)，动脉粥样硬化，关节炎，凝血障碍，深静脉血栓形成(DVT)，弥散性血管内凝血障碍(DIC)，慢性或急性血栓栓塞症，肺血栓栓塞症，布加综合征，Paget-Schroetter病，中风和心肌梗塞。
3.根据前述权利要求中任一项使用的可溶性多肽，其中所述修饰的GPV是截短的GPV。
4.根据前述权利要求中任一项使用的可溶性多肽，其中所述修饰的GPV由天然GPV的胞外结构域的片段组成，其中所述片段缺乏所述天然GPV的跨膜结构域。
5.根据权利要求4使用的可溶性多肽，其中所述天然GPV由SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成。
6.根据前述权利要求中任一项使用的可溶性多肽，其中所述可溶性多肽是非天然存在的多肽。
7.根据权利要求6使用的可溶性多肽，其还包含延长半衰期的部分。
8.根据权利要求7使用的可溶性多肽，其中所述延长半衰期的部分与所述修饰的GPV缀合。
9.根据权利要求8使用的可溶性多肽，其中所述延长半衰期的部分选自羟乙基淀粉(HES)，聚乙二醇(PEG)，聚唾液酸(PSA)和白蛋白结合配体，例如脂肪酸链。
10.根据权利要求7使用的可溶性多肽，其中所述延长半衰期的部分是与所述修饰的GPV直接或通过接头融合的异源氨基酸序列。
11.根据权利要求10使用的可溶性多肽，其中延长半衰期的异源氨基酸序列包含选自以下的多肽或由其组成：白蛋白及其长度为至少100个氨基酸的片段，免疫球蛋白恒定区及其片段，特别是Fc片段，转铁蛋白及其片段，人绒毛膜促性腺激素的C端肽，具有大流体动力学体积的溶剂化随机链(XTEN)，同型氨基酸重复序列(HAP)，脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸重复序列(PAS)，afamin，甲胎蛋白，维生素D结合蛋白，能够在生理条件下结合白蛋白或免疫球蛋白恒定区的多肽，以及它们的组合。
12.根据前述权利要求中任一项使用的可溶性多肽，其中所述可溶性多肽可通过在哺乳动物细胞中重组表达而获得。
13.根据前述权利要求中任一项使用的可溶性多肽，其中所述治疗和/或预防还包括向所述受试者施用抗血小板或抗凝血药物。
14.一种药物组合物，其包含如权利要求1至12中任一项所定义的可溶性多肽和药学上可接受的赋形剂。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述可溶性多肽不由SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列组成。
16.一种治疗受试者的血栓性疾病的方法，其包括向所述受试者施用有效量的权利要求1至12中任一项所定义的可溶性多肽或权利要求14或15所述的药物组合物。
17.一种制备权利要求1-12中任一项使用的可溶性多肽的方法，其包括在哺乳动物细胞中表达编码如权利要求1-12中任一项所定义的可溶性多肽的核酸，和从培养基中回收可溶性多肽。
18.根据权利要求5至12中任一项使用的非天然存在的可溶性GPV。
19.缺少功能性跨膜结构域的可溶性GPV，其不由SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列组成。
20.一种药物试剂盒，其包含(i)权利要求1至12中任一项使用的可溶性多肽，和(ii)除所述可溶性多肽以外的抗血小板或抗凝血药物。
CN201680075541.8A 2015-12-23 2016-12-23 用于治疗血栓性疾病的可溶性糖蛋白v Pending CN108472503A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15202530.0 2015-12-23
EP15202530.0A EP3184149A1 (en) 2015-12-23 2015-12-23 Soluble glycoprotein v for treating thrombotic diseases
PCT/EP2016/082629 WO2017109212A1 (en) 2015-12-23 2016-12-23 Soluble glycoprotein v for treating thrombotic diseases

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108472503A true CN108472503A (zh) 2018-08-31

Family

ID=55068852

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680075541.8A Pending CN108472503A (zh) 2015-12-23 2016-12-23 用于治疗血栓性疾病的可溶性糖蛋白v

Country Status (12)

Country Link
US (1) US11028144B2 (zh)
EP (2) EP3184149A1 (zh)
JP (1) JP7016536B2 (zh)
KR (1) KR20180091929A (zh)
CN (1) CN108472503A (zh)
AU (1) AU2016375187C1 (zh)
BR (1) BR112018012295A2 (zh)
CA (1) CA3008196A1 (zh)
DK (1) DK3393583T3 (zh)
ES (1) ES2805318T3 (zh)
SG (2) SG11201804410YA (zh)
WO (1) WO2017109212A1 (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1128022A (zh) * 1994-03-16 1996-07-31 邻位药品公司 作为抗血栓形成的化合物的3-哌啶甲酸衍生物
US6005089A (en) * 1993-07-09 1999-12-21 Cor Therapeutics, Inc. Platelet glycoprotein V gene and uses
WO2002017711A2 (en) * 2000-08-31 2002-03-07 Cor Therapeutics, Inc. Therapeutics and diagnostics based on a novel signal transduction system in platelets

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
AU2353384A (en) 1983-01-19 1984-07-26 Genentech Inc. Amplification in eukaryotic host cells
US4713339A (en) 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
AU7325794A (en) * 1993-07-09 1995-02-06 Cor Therapeutics, Inc. Platelet glycoprotein v gene and uses
JPH11501506A (ja) 1994-12-12 1999-02-09 ベス イスラエル デアコネス メディカル センター キメラ型サイトカインおよびその利用
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6887470B1 (en) 1999-09-10 2005-05-03 Conjuchem, Inc. Protection of endogenous therapeutic peptides from peptidase activity through conjugation to blood components
EP1572936A2 (en) 2002-03-05 2005-09-14 Eli Lilly And Company Heterologous g-csf fusion proteins
AU2004239244C1 (en) 2003-05-06 2015-04-23 Bioverativ Therapeutics Inc. Clotting factor-Fc chimeric proteins to treat hemophilia
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
ATE525395T1 (de) 2003-06-12 2011-10-15 Lilly Co Eli Fusions proteine von glp-1-analoga
CN1902222A (zh) 2003-12-31 2007-01-24 默克专利有限公司 具有改善药物代谢动力学的Fc－促红细胞生成素融合蛋白质
US7670595B2 (en) 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
EP1816201A1 (en) 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modified coagulation factor VIIa with extended half-life
US9458223B2 (en) 2012-02-15 2016-10-04 Csl Behring Gmbh Von willebrand factor variants having improved factor VIII binding affinity

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6005089A (en) * 1993-07-09 1999-12-21 Cor Therapeutics, Inc. Platelet glycoprotein V gene and uses
CN1128022A (zh) * 1994-03-16 1996-07-31 邻位药品公司 作为抗血栓形成的化合物的3-哌啶甲酸衍生物
WO2002017711A2 (en) * 2000-08-31 2002-03-07 Cor Therapeutics, Inc. Therapeutics and diagnostics based on a novel signal transduction system in platelets

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
D O AZORSA, S MOOG, C RAVANAT, S SCHUHLER, G FOLLÉA: "Measurement of GPV released by activated platelets using a sensitive immunocapture ELISA--its use to follow platelet storage in transfusion", 《THROMB HAEMOST》 *
F LANZA, M MORALES, C DE LA SALLE, J P CAZENAVE, K J CLEMETSON,: "Cloning and characterization of the gene encoding the human platelet glycoprotein V. A member of the leucine-rich glycoprotein family cleaved during thrombin-induced platelet activation", 《J BIOL CHEM》 *
H NI, V RAMAKRISHNAN, Z M RUGGERI, J M PAPALIA, D R PHILLIPS, D: "Increased thrombogenesis and embolus formation in mice lacking glycoprotein V", 《BLOOD》 *
S MOOG, P MANGIN, N LENAIN, C STRASSEL, C RAVANAT, S SCHUHLER,: "Platelet glycoprotein V binds to collagen and participates in platelet adhesion and aggregation", 《BLOOD》 *
VANITHA RAMAKRISHNAN, PETER S. REEVES, FRANCIS DEGUZMAN, USHA DE: "Increased thrombin responsiveness in platelets from mice lacking glycoprotein V", 《PROC NATL ACAD SCI U S A》 *
刘昌伟: "《血管外科临床手册》", 31 May 2012, 人民军医出版社 *
段志泉，张强: "《实用血管外科学》", 1 March 1999, 辽宁科学技术出版社 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20180091929A (ko) 2018-08-16
SG11201804410YA (en) 2018-07-30
BR112018012295A2 (pt) 2019-02-05
DK3393583T3 (da) 2020-08-10
EP3184149A1 (en) 2017-06-28
SG10201911567VA (en) 2020-01-30
US20190169265A1 (en) 2019-06-06
JP2019504037A (ja) 2019-02-14
JP7016536B2 (ja) 2022-02-07
CA3008196A1 (en) 2017-06-29
US11028144B2 (en) 2021-06-08
AU2016375187B2 (en) 2022-08-11
AU2016375187C1 (en) 2022-11-24
EP3393583A1 (en) 2018-10-31
EP3393583B1 (en) 2020-05-13
AU2016375187A1 (en) 2018-06-14
WO2017109212A1 (en) 2017-06-29
ES2805318T3 (es) 2021-02-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20160264645A1 (en) Stabilized Factor VIII Variants
JP6851381B6 (ja) 変異切断型フォンウィルブランド因子
US11564976B2 (en) Methods for preparing modified von Willebrand Factor
JP6573989B2 (ja) 血友病を処置するための切断型フォン・ヴィルブランド因子ポリペプチド
JP6755318B2 (ja) 突然変異フォン・ヴィレブランド因子
JPH07507270A (ja) フォン・ウィルブランド因子の治療用ドメイン
CN109922824A (zh) 用于治疗血友病的截短的冯维勒布兰德因子多肽
KR20190073576A (ko) 혈액 응고 장애의 치료 또는 예방에서 혈관외 투여를 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자 폴리펩타이드
CN108472503A (zh) 用于治疗血栓性疾病的可溶性糖蛋白v
CN109563145A (zh) 长效凝血因子及其制备方法
JP2021510683A (ja) インビボ持続放出性組換え凝固因子ｖｉｉｉ及びその調製方法
KR20220029733A (ko) 응고 인자 viii의 시험관내 안정성을 증가시키기 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자 (vwf)
JPH08502893A (ja) 因子ｖ▲ｉｉｉ▼：ｃ活性を有するタンパク質の改良された組換生産

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180831