JPH08502893A

JPH08502893A - 因子ｖ▲ｉｉｉ▼：ｃ活性を有するタンパク質の改良された組換生産

Info

Publication number: JPH08502893A
Application number: JP6511619A
Authority: JP
Inventors: エスバンラスムッセン，ミレラ; コンゲルスレウ，レイフ
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1992-11-17
Filing date: 1993-11-17
Publication date: 1996-04-02
Also published as: WO1994011525A1; AU5462694A; EP0679192A1; CA2149212A1

Abstract

(57)【要約】ヘパリンの存在下、組換タンパク質、特に因子ＶIII：Ｃ活性を有するタンパク質の増加せしめられた発現を行うための方法が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】因子ＶIII：Ｃ活性を有するタンパク質の改良された組換生産技術分野本発明は組換タンパク質、特に因子ＶIII：Ｃ活性を有するタンパク質の増加せしめられた発現を行う方法に関する。発明の背景血友病Ａは、10,000につき1〜2人の男性を苦しめるＸ−染色体−関連で遺伝で受け継いだ疾患である。この疾患は、因子ＶIII：Ｃの欠乏の不存在によってもたらされる。因子ＶIII：Ｃは非常に大きな糖タンパク質（天然Mr330K-360K)であり、これはプラスマ中に極めて低濃度で存在する。それはタンパク分解カスケードにおいて必要な要素であり、そのカスケード可溶性フィブリノーゲンを不溶性フィブリンに変え、傷つけられた組織から血液の損失を防止するため血塊を形成する。血流中に、それは安定化担体タンパク質として作用する、フォン・ビルブラン因子(vWF)との非共有会合において見出される。因子ＶIII：Ｃは、トロンビン、プラスマ、活性化タンパク質Ｃおよび他のセリンプロテアーゼにより非常に分解されやすい。それは一般にプラスマ又はプラスマ生成物からMr160K-77Kにわたる一連の関連したポリペプチドとして単離され、Mr92K並びにMr80-77Kが優先する種である。この複合体パターンは、活性因子ＶIII：Ｃの構分析を非常に困難なものにしてきた。因子ＶIII：Ｃおよび関連ポリペプチドは、ロバート等、Biochemistry(1985)2 4 ：4294-4300；G.A．Vehar et al，Nature(1984)312：337-342；J.J．ツール等、Nature(1984)312：342-347；およびM.A．ツルッテ等、DNA(1985)4：333-349．E．オール等、Molecular Genetic s of Clotting Factors ，p.51，s321に記載されてきた。配列はJ.J．ツール等、同上； W.I．ウッド等、Nature(1984)312：330-336；およびM.A．ツルッテ等、同上により報告されてきている。全長のタンパク質は、第一の配列（Ｉ）の３つの繰り返し、および第二の配列（III）の２つの繰り返しを含有する。第三の著るしくグリコシル化された配列（II）は第二のＩの繰り返しと第三のＩの繰り返しの間に存在し、そして明らかにタンパク分解的に開裂しMr92KおよびMr80Kポリペプチドを形成する。第一の二つのＩの繰り返しはＡドメインを形成し、一方第三のＩの繰り返しおよび二つのIIIの繰り返しはＣドメインを形成する。IIの配列はＢドメインを形成する。従って、全長のタンパク質は構造Ｉ₁−Ｉ₂−II−Ｉ₁ −III₁−III₂（Ａ−Ｂ−Ｃ）を有し、一方Mr92KおよびMr80Kポリペプチド（ＡおよびＣ）はそれぞれ、構造Ｉ₁−Ｉ₂およびＩ₃−III₁−III₂を有する。R．L．バーク等、J．Biol Chem(1986)、は92Ｋおよび80Ｋポリペプチドを表すことにより、両ペプチドが因子ＶIII：Ｃ活性に対し必要であることを示した。因子ＶIII ：Ｃは、歴史的には血友病の治療に対し濃縮した形で血液から単離されてきた。しかし、HIVおよび他の血液−産生疾患の伝播に関する心配は、因子ＶIII：Ｃの択一的提供を与えるための活性を刺激した。生来の因子ＶIII：Ｃに関係する伝染ウイルス性疾患に関しての心配なくして因子ＶIII：Ｃ活性を有する組成物を提供しうることは実質的に興味がある。本発明方法に従って製造される因子ＶIII：Ｃ活性を有する組換タンパク質はプラスマから単離されたタンパク質に相当する全長因子ＶIII：Ｃであってよいか、又は因子ＶIII：Ｃの欠損により引きおこされる不十分な血液凝固を正常化する能力を有するその誘導体であってよい。それ自体凝固薬活性を示さないかもしれないが、しかし例えば因子Ｖ III：Ｃに対する抗体の飽和に対し、血友病者の治療において使用してもよい因子ＶIII：Ｃさえインヒビター患者内に存在する。本発明に従って生産されるタンパク質は、天然因子ＶIII：Ｃ分子の全て又は一部と相同性を示す。組換え工学による因子ＶIII：Ｃ活性を有する組換タンパク質の製造は、とりわけ多くの出版物に開示されてきた。従って、ヨーロッパ特許出願第160457号および国際特許出願WO 86/01961は、全長因子ＶIII：Ｃの製造を開示しており、そしてヨーロッパ特許出願（EP）第150735号、国際特許出願WO 86/06101、ヨーロッパ特許出願（EP）第232112号、国際特許出願WO 87/04187、国際特許出願WO 87 /07144、国際特許出願WO 88/00381、ヨーロッパ特許出願（EP）第251843号、ヨーロッパ特許出願（EP）第253455号、米国特許第4,980,456号、ヨーロッパ特許出願（EP）第294910号、ヨーロッパ特許出願（EP）第265778号、ヨーロッパ特許出願（EP）第303540号、国際特許出願WO 91/07490および国際特許出願WO 91/091 22は、抗体阻害因子ＶIII：Ｃに対する結合親和性又は凝固薬活性を示す複合体の生産のためのサブユニットの同時発現又は因子ＶIII：Ｃの短縮型一本鎖形もしくはサブユニットの組換発現を開示する。組換え全長ヒト因子ＶIII：Ｃの発現は通常低くそして分子はタンパク質分解に起因して不安定である。短縮型一本鎖形の形態にある因子ＶIII：Ｃの誘導体又は二本鎖を含んでなる誘導体は、組換工学により成功裏に生産されてきた。これらの誘導体は全長因子ＶIII：Ｃよりも高収率で発現されるけれども、発現のレベルを増加したい要求が未だ存在する。 WO 87/04187およびEP 25/843には次のように開示されている；すなわちフォンビルブラン因子（vWF）又はリン脂質の存在下、因子ＶIII：Ｃの発現は因子ＶIII：Ｃの発現を増加させる。EP441695において、カチオン又はアニオンポリマー、好ましくは多糖類（これは硫酸塩化されたものが最も好ましい）の存在下、因子ＶIII：Ｃ又はその類似体を発現することが開示されている。他の添加剤の内で、ヘパリンが10〜80IU／mlの量で試験された。ヘパリンの添加は、無血清培地と比較される如くEP303540において開示されるように、アミノ酸 771から1666までの欠失を有する因子ＶIIIデルタ２の発現に関し「極めて制限された効果ないし全く効果を示さない」。発現レベルはヘパリンの濃度の増加と共にわずかに増加する。しかし、発現レベルは血清又はvWFの存在下、発現レベルよりもはるかに低い。発明の開示本発明は、組換タンパク質を発現することのできる宿主細胞内で因子ＶIII：Ｃ活性を有する組換タンパク質の増加せしめられた発現を行う方法に関し、この方法は該タンパク質を発現するために10IU／ml未満の極めて低濃度でヘパリンを含んでなる細胞増殖培地中で該宿主を培養することを含んでなる。発明の詳細な記載驚くべきことに次の内容が見出された；すなわち10IU未満のヘパリン／mlの少量でヘパリンを添加すると、因子ＶIII：Ｃ活性を示す組換タンパク質の発現を増加しそして50％以上の増加せしめられた収率に到る程度にまで生成物を安定化させる。ヘパリンの安定化効果は、プロテアーゼによる92kDサブユニットの活性化の観察された減少によって示される。本発明に係る、そのような添加は、血清を、好ましくは胎児の又は新生の子ウシの血清の形で含んでなる細胞増殖培地に並びにリポタンパク質、vWF又はリン脂質又は改善される発現を得るため無血清培地中で発現を増加させるために用いられる他の追加の成分を含んでなる無血清培地中に行うことができる。本発明方法で用いられるリポタンパク質は、例えばEP254076に記載される如きリポタンパク質であってよい。そのようなリポタンパク質は商標EX-CYTEのもとで商業的に入手可能である。リポタンパク質は又、卵黄から、例えばImmunologi cal Communications 9 （5），475-493（1980）に記載される方法により単離できる。本発明方法で用いられるリン脂質は、例えばWO/04187に記載される如きそのようなリン脂質であってよい。無血清培地中での発現を増加させるために用いられる他の追加の成分は、例えばリポタンパク質および脂質の存在しない黄卵分画であってよい。本発明の好ましい面によれば、ヘパリンは0.5〜8IU／mlの濃度で添加され、１〜２IU／mlの濃度が最も好ましい。血清を含んでなる細胞増殖培地にヘパリンを添加することは、因子ＶIII：Ｃレベルの相当の増加を生ぜしめる本発明の好ましい面である。血清並びに懸濁液中での発現に関し因子ＶIII：Ｃの極めて高レベルに高める更に添加されるリン脂質を含んでなる細胞増殖培地にヘパリンを添加することは、なお更に好ましい。本発明の他の好ましい態様によれば、血液産生疾患の転移を引き起こすかもしれない成分の添加を避けるため無血清細胞培地が用いられ、そのような培地にはリポタンパク質、フォンビルブラン因子、リン脂質又はこれらの２種又はそれ以上の組合せが加えられる。本発明のより好ましい面によれば、リポタンパク質およびヘパリンが無血清培地に加えられる。好ましい態様において、約５％のリン脂質分画および２IUのヘパリンが加えられ、発現せしめられた因子ＶIII：Ｃ活性の見地から因子ＶIII：Ｃの非常に高い発現が生ぜしめられる。本発明の別の好ましい面によれば、ヘパリンが因子ＶIII：Ｃの92kDおよび80 ／77kDサブユニットの複合体を発現するために宿主細胞を培養するための増殖培地に添加される。そのような培養に対し、ヘパリンは因子ＶIII：Ｃの個々のサブユニットの発現レベルを増加させるのみならず、複合体形成の程度を増加させそして生産された複合体を安定化させそして従って、生成物の収率は凝固薬活性を示す。語句「Ａドメイン」はMr92Kタンパク質サブユニット又は因子ＶIII：Ｃ重鎖（ FVIII−HC）を構成するヒト因子ＶIII：Ｃの部分を言う。Ａドメインは約740個から約760個のアミノ酸を含有し、そして天然のヒト因子ＶIII：ＣのＮ−末端で見出される。Arg₇₄₀-Ser₇₄₁でのトロンビン開裂部位までの全配裂を有するＮ− 末端鎖は特に興味がある。語句「Ｂドメイン」は、一般に細胞内開裂によって一般に除かれそしてヒトプラスマ中でひどくグリコシル化されそしてC0S7，CHOおよびBHKの如き哺乳動物細胞中で発現されたときひどくグリコシル化される天然ヒト因子ＶIII：Ｃの部分を言う。ＢドメインはＮ末端配列を含有し、これはトロンビンによりＢドメインからＡドメインを開裂せしめる。Ｂドメインは又プロセシング部位を有し、これは哺乳細胞のゴルギ（golgi）装置内で酵素によりＡ−Ｂ前駆体からＣドメインの開裂を許容する。語句「Ｃドメイン」は全長タンパク質のＣ−末端を構成する天然ヒト因子ＶII I：Ｃのその部分を言い、そして細胞内に開裂し因子Ｖ III：Ｃ軽鎖（FVIII−LC）を形成する。軽鎖は因子ＶIII：ＣポリペプチドのＣ −末端のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するであろうし、通常少なくとも約80％、より通常には少なくとも90％の因子ＶIII：C Mr80K鎖を有し、特にアミノ酸1640、好ましくはアミノ酸1649、（±10個のアミノ酸）から始まりそして少なくとも約アミノ酸2300、通常2310、（±10個のアミノ酸）まで続き、より好ましくは末端アミノ酸（2332）まで続く。通常、軽鎖は少なくとも約85％、より通常は少なくとも95％のIII₁−III₂ドメイン、好ましくはＩ₃−III₁−III₂ ドメインを有するであろう。本発明で用いられる語句「共−発現」は、同じ宿主細胞内でＡドメインポリペプチド（92Ｋ）およびＣドメインポリペプチド（80Ｋ）の同時発現を言う。ＡドメインおよびＣドメインをエンコードするポリヌクレオチド配列は、同じ又は異なる発現カセット又はプラスミド上にあってよい。ＡドメインおよびＣドメインの共−発現は適当な折りたたみを生ぜしめ、これは一方では活性および分泌の効力を有するＡ−Ｃ複合体を与える。本発明で用いられる語句「生産培地」は、宿主細胞を培養するために適当な如何なる培地を言い、そして実際の細胞「増殖」が生じるかどうかにかゝわらず組換生産物の発現を得るために適当な培地を含む。所望により、生産培地は又、本発明の組換ポリペプチドの発現を誘発する化合物を含む。そのような誘発化合物の選択は、発現を制御するために選ばれたプロモーターに依存する。他の典型的添加剤には、選択化合物（すなわち、形質転換される宿主細胞のみが培地中で生存することを確保するため培地に加えられる薬又は他の化学薬品）および血清、例えば胎児の子ウシ血清（FBS）が含まれる。語句「無血清培地」は、血清中に存在する必要な微量因子が血清の形で添加される必要のないそのような程度に加えられている溶液を言う。無血清培地は合成培地であってよく、動物組織又は体液から単離された成分を含まないでよい。商業的に入手可能な多くの適当な細胞増殖培地が存在する。ヘパリンに関して本発明で用いられる如き語句「IU」は、ナショナルインスティチュートフォーバイオロジーアンドスタンダードアンドコントロール（ロンドン、英国）により作成されたヘパリンに対する第４標準（コード −ラベル82／502）に対しての標準化により定義される。本発明で用いられる語句「相同性」は、二つのポリヌクレオチド又は二つのポリペプチド間で同一又は実質的類似性を意味する。相同性は、ヌクレオチド又はポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのアミノ酸配列を基礎にして決定される。一般的用語では、通常10以下、より通常は５以下の数の％、好ましくは約１以下の数の％の鎖中のアミノ酸が、因子ＶIII：ＣＡおよびＢドメイン中に天然に存在するアミノ酸と異なるであろう。部分的には、約５％以下、より通常では約１％以下が非保存性置換であろう。保存性置換は次のものが含まれる：非保存性交換は、一般に異なる群からのアミノ酸で前記アミノ酸の一つの置換（例えばGluの代りにAsnの置換）、又は前記アミノ酸のいずれかの代わりにCys ，Met，His、又はProを置換することである。本発明に従って調製されるタンパク質の特異的活性は、以下に記載される如く当業者に公知の方法により（例えば、商業的に入手可能なコーテスト（Coatest）分析を用いることにより）測定できる。構造遺伝子は、典型的にはシグナルペプチドをコードするリーダー配列を含み、このシグナルペプチドはポリペプチドをプロセッシングおよび成熟のために小胞体の内腔内に導く。所望により、プロペプチドをエンコードする追加の配列が含まれ、このプロペプチドはエンドペプチダーゼにより後一ほん翻的に加工され、一方エンドペプチダーゼはペプチド結合を開裂し、プロペプチドを除き成熟ポリペプチドを発生させる。シグナルペプチドは特にＮ−末端シグナルに対し天然ものでよいか、又はポリペプチドのプロセッシングおよび成熟に対応して与える如何なるシグナルペプチドであってもよい。種々の哺乳動物細胞が用いられ、ここにおいて調節配列および複製系は機能的である。そのような細胞にはC0S7細胞、中国ハムスター卵巣（CHO）細胞、マウス腎臓細胞、ヘラ（Hela）細胞、HepG₂細胞、等、例えばVERO細胞、ｗ-138又MDC K細胞が含まれる。発現された生産物は、抗体、特にFVIII−LC又はFVIII−HCに向けられたモノクローナル抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィー法、クロマトグラフィー法、例えばHPLC、電気泳動又は抽出を用いて精製できる。主題の方法は、因子ＶIII：Ｃ活性を有する活性鎖（92Ｋおよび80Ｋ）の複合体の生産を与える。生産は実験節において述べられる如き調整培地により立証され、これはコーテスト分析において少なくとも約１、通常少なくとも約５Ｕ／ml 、より通常は少なくとも約10Ｕ／mlの因子ＶIII：Ｃ活性を有するであろう。本発明に従って生産された因子ＶIII：Ｃ活性を有するタンパク質は、血友病者および血液凝固疾患を含む他の症状に悩む患者の治療に対して主に意図される。主題のタンパク質は、生理学的に許容し得る担体、例えば水、食塩水、ホスフェート緩衝化塩類液、およびシトレート緩衝化塩類液中に約10−200 Ｕ／mlの範囲の濃度で投与することができる。投与方法および量については、米国特許第3,631,018号；第3,651,530号、および第4,069,216号を参照のこと。他の通常の添加剤も又含有してもよい。それらの添加剤は抗体の生産のための免疫原として、アフィニティクロマトグラフィーによるフォンブランド因子の単離に対しそして因子ＶIII：Ｃに対する診断分析において多様の用途を有する。図面の簡単な説明本発明を図面を参照しつつ説明する。図１は懸濁培養物中での因子ＶIII：Ｃ単位レベルに関してのヘパリンの効果の力価を示す。図２は因子ＶIII−HCに対するヘパリンの安定化効果を説明するゲルを示す。以下に示す実施例は当業者に対し更にガイドとして与えられそして如何なる場合も本発明を制限するものでない。実験部原料および方法 DAK（デンマーク）市販のヘパリンを全ての実験に対して行った。リポタンパク質を卵黄から、分画リポタンパク質に富んでいる形で単離した。分画は例６で詳しく説明されるように行った。メルク市販のPEG6000（カタログN o.807491）を卵黄の分画に対して用いた。卵黄の分画に対して用いたPBSを、脱イオン水に8.0ｇのNaCl，0.2ｇのKCl，1. 15ｇのNa₂HPO₄および0.2ｇのKH₂PO₄を溶解し、１ＭのHCl／NaOHを加えることによりpHを7.3に調節し次いで脱イオン水を１ｌまで加えることによって作成した。全ての化学薬品はメルク製であった。例１細胞系共−発現因子ＶIII：Ｃ重鎖および軽鎖を得ること移入−手順 DHFR CHO細胞系DG44 CG.ウララウブ等、Som Cell Mol Genet（1986）12：555- 566）にプラスミドpCMF8-80ATを先ず移入した：このプラスミドにおいて、CMVプロモーター（WO 91/07490の例７において記載）はpSVF-8-80AT（WO 91/07490の例６において記載）から由来するFVIII−LC cDNAを転写しそしてpAd-DHFR（WO 9 1/07490の例４に記載）から由来するAd-MLP/dhfrカセットが下流にある。用いられる移入方法は、W.チャニー等（Som Cell Mol Genet（1986）12：237-244）のポリブレン法であった。DHFR⁺細胞（DHER＋10％DFCS）の選択により、幾つかのF VIII−LC生産体を単離し；これらの１つは11Ｍと称した。 11Ｗ中にFVIII−HCを導入するため、細胞系をプラスミドpPR78（このプラスミドはpCMVF8-80ATに対し類似体である、しかしFVIII−LCcDNAの代わりにWO 91/07 490の例８で記載されるpCMVF8-92R由来するFVIII−HC cDNAを有する）およびpSV 2-neo CP.J.サザーンおよびP.ベルク、J.Mol Appl Genet（1982）１：327-341 ）と同時移入した。用いた移入方法は、C.チェンおよびH.オカヤマ（Mol Cell B lol（1987）１：2745-2752）の修正カルシウムホスフェート手順であった。トランスフェクタントを、１ml当たり700μｇのゲネチシン（Geneticin）CG418スルフェート、ギブコ）を含有する培地中で単離した。主プールからの細胞を制限希釈法によりサブクローン化し次いで個々のクローンを活性ＦＶIIIに対する発現に対し試験した。この方法で幾つかのＦＶIII：Ｃ生産細胞系を単離しそしてこれらの内の２つを「45」および「57」をそれぞれ称した。発現レベルを基礎にしてこの方法で選ばれた細胞を、ヘパリンの不存在下又は種々の濃度のヘパリンの存在下、培養のためのＴ−フラスコ又はスピンナー内に播種した。 WO 91/07490に言及されている移入の記載は、それぞれ寄託番号ATCC40222，AT CC40223およびATCC40190のもとで寄託されたプラスミドpSVF8-92，pSVF8-80およびpSVF8-200に対する引用を含めて、それを引用することにより本明細書に加えられる。例２細胞系共−発現因子ＶIII：Ｃ重鎖および軽鎖の培養「45」共−発現因子ＶIII：Ｃ重鎖および軽鎖と称される細胞系を、DMEM＋10 ％透析子ウシ血清中細胞工業内で37℃の懸濁液中で常法により培養し、そして細胞をトリプシン処理により集めそして110mg／ｌのＮａ−ピルベート、150mg／ｌの１−プロリン、3.7ｇ／ｌのNaCO₃，1.4ｇ／ｌのトリプトースホスフェート、５mg／ｌのインシュリンそして56℃で30分間熱不活性化された２％NBSを加えたD MEM（ギブコ074-90024T）中１ｍｌ当たり200万個の細胞濃度で100mlのTECHNEスピンナー中に再懸濁させた。培養物を27℃でインキュベートした。サンプルを９日間にわたって採取した。種々の量のヘパリンを加えた。ヘパリン効果の力価の結果を図１に示す。このタイプの培養物のヘパリンの最適濃度は、１−２IU／mlであることが分かり、ここでは発現せしめられた因子Ｖ III：Ｃのレベルの50％だけの増加が見られる。ヘパリンの効果は、５および10I U／mlの濃度においては明らかにより少なく現われる。例３「57」共−発現因子ＶIII：Ｃ重鎖および軽鎖と称される単離された細胞系をD MEM＋10％透析子ウシ血清中ｔ−フラスコ中常法によりコンフルエンスまでに培養した。コンフルエントなｔ−フラスコを例２におけると同じ培地に移し、そしてヘパリンの存在および不存在下、同温度でインキュベートした。培養物に３日の間隔で新しい培地を供給した。培地の交換の前にFVIII分析に対しサンプルを採取した。表１は、ヘパリンが低濃度（２IU／ml）で添加されたとき、ｔ−フラスコ培養物から得られる増加せしめられたFVIII：Ｃレベルを示す。増加は、ヘパリンの存在下培養時間の関数として、ヘパリン添加なしの対照のFVIIIレベルの113％から138％までのレベルに対する。例４「45」および「57」共−発現因子ＶIII−Ｃ重鎖および軽鎖と称される単離された細胞系を、ヘパリンの存在および不存在下、先に説明したように懸濁液中で培養した。例３と比較して、FVIIIレベルの増加は細胞を懸濁液中で培養するときよりもより顕著である。表２および表３から明らかなように、ヘパリンの添加によりもたらされるFVIIIレベルの増加は、ヘパリンが添加されていない対照の120ないし193％である。表２および表３は又次の内容を示している；すなわち因子ＶIII：Ｃレベルの増加は、ヘパリンの存在下での共−発現の場合、因子ＶIII：LCおよび因子ＶIII ：HCの増加せしめられた発現を超えている。例５因子ＶIII：Ｃ重鎖および因子ＶIII：Ｃ軽鎖の共発現中、因子ＶIII：Ｃ重鎖に関するヘパリンの安定化効果 3.5cmの皿に、次の培地：DMEM＋２％NCS＋５mg／ｌのインシュリン＋1.4ｇ／ｌのトリプトースホスフェート（TP）中および２Ｕ／mlのヘパリンが添加された同じ培地中に細胞系「45」を播種しコンフルエンシーとした。37℃で一夜インキュベーションした後、皿を適合のため27℃で５日間インキュベートした。２回洗浄後、各皿を次のメチオニンが存在しない培地中20時間80μCi³⁵S−メチオニンで標識した：１．DMEM＋２％ NCS＋５mg／ｌインシュリン＋1.4ｇ／ｌ TP ２．DMEM＋２％ NCS＋５mg／ｌインシュリン＋1.4ｇ／ｌ TP＋２ IU／mlヘパリン。標識期間後、ヒトFVIIIに対する犬ポリクロナール抗血清を用いた免疫沈殿に対して集め；この抗血清はサブユニットの複合体およびフリーのFVIIIの重鎖および軽鎖の双方と結合する。沈殿した試料を10％ SDSゲル上に載せる。得られた照射物を図２に示す。92kD HCおよび80kD LCダブレットが全てのレーン内に見られる。レーン１およびレーン２を比較すると、次の内容がわかる；すなわち、HCから由来する50／43kD帯の量は、レーン２におけるよりもレーン１においてはるかにより顕著であり、ヘパリンが重鎖の活性化開裂を抑圧したことを示しており、そして従ってサブユニット−複合体のより大きな分画が92kDサブユニットおよび80kDサブユニットのより安定な複合体として見出される。例６ヘパリンおよびリポタンパク質を含有する無血清培地中、Ｔ−フラスコ培養物中の因子ＶIII：Ｃの増加収率卵黄リポタンパク質分画の調製 100mlの卵黄と200mlのPBSを30分間攪拌した。PEG6000を3.5％まで加え、60分間攪拌し次いで3000RPMで30分間遠心分離した。沈降物を200mlのPBSに溶解し、30分間攪拌し次いで10,000RPMで20分間回転させた。沈降物を200mlの１M NaClに再溶解し次いで40℃で一夜攪拌した。次いで、混合物を10,000RPMで20分間遠心分離しそして上澄みを0.2μ孔径フィルターを通して濾過することにより殺菌した。リポタンパク質分画を下記の培養において用いた。「57」共一発現因子ＶIII：Ｃ重鎖および因子ＶIII：Ｃ軽鎖と称される細胞系を血清含有培地中、Ｔ−80フラスコ内で培養した。コンフルエンシーに達した後、細胞は３日間生産状態に適合していた。生産培地および条件は例３に記載した、但し血清の添加はなくそして基礎培地はDMEM／F-12であった。リポタンパク質を含有する卵黄分画の５％添加を単独で並びに１，２および５IUヘパリンと共に試験し、そして比較のためリポタンパク質を有しない同じ培地を、１，２および５ IUヘパリンを用いて試験した。リポタンパク質およびヘパリンを有しない無血清培地を対照として用いた。培地を交換しそして試料を２日および４日目に採取しそしてFVIII：Ｃ（coa）活性に関して分析した。リポタンパク質（卵黄分画）を含有する試料において、FVIII：Ｃ活性は１IU ／mlのヘパリンを添加すると60−70％，２IU／mlを添加すると80−100％そして５IU／mlを添加すると６−32％増加する。ヘパリン単独の添加は、FVIII：Ｃ活性を増加しなかった。従って、リポタンパク質とヘパリンの添加の組合された効果は、２種の別個の成分の添加剤効果よりもより高い。例７ヘパリン並びにリポタンパク質を有しない卵黄分画を含有する無血清培地中、Ｔ−フラスコ培養物内での因子ＶIII：Ｃの増加収率リポタンパク質を有しない卵黄タンパク質分画の調製 100mlの卵黄および200mlのPBSを30分間攪拌した。PEG6000を3.5％まで加え、6 0分間攪拌しそして3000RPMで30分間遠心分離した。上澄みはリポタンパク質を有しない卵黄タンパク質分画（SUP 0）である。このタンパク質分画を以下の培養において用いた。「57」共−発現因子ＶIII：Ｃ重鎖および因子ＶIII：Ｃ軽鎖と称される細胞系を血清含有培地中、Ｔ−80フラスコ内で培養した。コンフルエンシーに達した後、細胞を３日間生産条件に適合させた。生産培地および条件は例３に記載した、但し血清の添加はなくそして基礎培地はDMEM／F-12であった。卵黄タンパク質分画の５％添加を単独でおよび１，５および10IUヘパリンと共に試験した。培地を交換しそして試料を２日および４日目に採取しそしてFVIII：Ｃ（coa）活性に関して分析した。 SUP 0を含有する試料において、ヘパリンを添加するとFVIII：Ｃ活性は著るしく増加し、増加したレベルの因子ＶIII：Ｃ活性を与えた。この効果は10IUほどのヘパリンを添加するとき減少する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年１２月１４日【補正内容】請求の範囲１．組換タンパク質を発現することのできる宿主細胞内で因子ＶIII：Ｃ活性を有する組換タンパク質のレベルを増加する方法であって、該タンパク質を発現するために10IU／ml未満の濃度でヘパリンを含んでなる細胞増殖培地中で該宿主を培養することを含んでなる、前記方法。２．ヘパリンの濃度が0.5〜８IU／mlである、請求の範囲第１項記載の方法。３．ヘパリンの濃度が１〜２IU／mlである、請求の範囲第２項記載の方法。４．細胞増殖培地が血清を含んでなる、請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載の方法。５．細胞増殖培地がリポタンパク質を含んでなる、請求の範囲第４項記載の方法。６．細胞増殖培地が、リポタンパク質、フォン・ビルブラント因子又はリン脂質、又はこれらの２つ又はそれ以上の組合せを加えられた無血清培地である、請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載の方法。７．増殖培地がリポタンパク質を加えられた無血清培地である、請求の範囲第６項記載の方法。８．生産される因子ＶIII：Ｃ活性を有するタンパク質が、因子ＶIII：Ｃの92 kDおよび80／77kDサブユニットの複合体である、請求の範囲第１〜７項のいずれか１項に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＫ，ＵＡ

Claims

【特許請求の範囲】１．組換タンパク質を発現することのできる宿主細胞内で因子ＶIII：Ｃ活性を有する組換タンパク質の増加せしめられた発現を行う方法であって、該タンパク質を発現するために10IU／ml未満の濃度でヘパリンを含んでなる細胞増殖培地中で該宿主を培養することを含んでなる、前記方法。２．ヘパリンの濃度が0.5〜8IU／mlである、請求の範囲第１項記載の方法。３．ヘパリンの濃度が1〜2IU／mlである、請求の範囲第２項記載の方法。４．細胞増殖培地が血清を含んでなる、請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載の方法。５．細胞増殖培地がリポタンパク質を含んでなる、請求の範囲第４項記載の方法。６．細胞増殖培地が、リポタンパク質、フォン・ビルブラント因子又はリン脂質、又はこれらの２つ又はそれ以上の組合せを加えられた無血清培地である、請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載の方法。７．増殖培地がリポタンパク質を加えられた無血清培地である、請求の範囲第６項記載の方法。８．生産される因子ＶIII活性を有するタンパク質が、因子ＶIII：Ｃの92kDおよび80／77kDサブユニットの複合体である、請求の範囲第１〜７項のいずれか１項に記載の方法。