ES2805318T3 - Glicoproteína V soluble para el tratamiento de enfermedades trombóticas - Google Patents

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Abstract

Un polipéptido soluble que comprende una glicoproteína V modificada (GPV) que carece de un dominio transmembrana funcional para su uso en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad trombótica en un sujeto, dicho tratamiento o prevención comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de dicho polipéptido soluble, en el que el polipéptido soluble es incapaz de integrarse en una membrana celular a través de dicho dominio transmembrana, en el que el término GPV denota una proteína que tiene una identidad de secuencia de al menos 70% con respecto a la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID No: 3.

Description

DESCRIPCIÓN
Glicoproteína V soluble para el tratamiento de enfermedades trombóticas
Antecedentes
La activación plaquetaria y la posterior formación de trombos en sitios de lesiones vasculares es crucial para la hemostasia normal, pero también puede causar infarto de miocardio y accidente cerebrovascular (Coughlin SR. Nature. 2000; 407: 258-64). La adhesión y activación plaquetaria es un proceso de múltiples etapas que involucra múltiples interacciones receptor de plaquetas-ligando. Tras la lesión de la pared de un vaso, las plaquetas circulantes se desaceleran rápidamente por interacciones transitorias del complejo de glicoproteína (GP) Ib-V-IX con el factor de von Willebrand (vWF) inmovilizado sobre la matriz extracelular subendotelial expuesta (por ejemplo, en colágeno) (Shapiro MJ, et al., The Journal of Biological Chemistry, 2000; 275: 25216-21). Esta interacción retiene las plaquetas cerca de la pared del vaso y facilita el contacto entre GPVI y colágeno (Nieswandt B, et al. Blood. 2003; 102: 449-61). Las interacciones GPVI-colágeno inducen una cascada de señalización intracelular que conduce a la activación plaquetaria y la liberación de agonistas plaquetarios secundarios, tales como el tromboxano A2 (TxA2) y el difosfato de adenosina (ADP). Estos agonistas solubles junto con la trombina producida localmente contribuyen aún más a la activación plaquetaria a través de receptores acoplados a la proteína G (Gi, Gq, G12/13) (Offermanns S. Circulation Research. 2006; 99: 1293-304). Todas estas vías de señalización se sinergizan para inducir respuestas celulares complejas, tales como la activación de integrinas, la liberación de contenidos granulados y la provisión de una superficie procoagulante para la activación de la cascada de coagulación (Nakanishi-Matsui M, et al., Nature.
2000; 404: 609-13; Cunningham MA, et al., The Journal of experimental medicine. 2000; 191: 455-62). El trombo final está incrustado en una red de fibrina para resistir las fuerzas de corte generadas por el flujo sanguíneo. La estabilización de un trombo recién formado es esencial para detener el sangrado en los sitios de lesión vascular. Sin embargo, si este proceso ocurre de manera incontrolada, también puede provocar eventos trombóticos que causan estados de enfermedad potencialmente mortales, tales como infarto de miocardio o accidente cerebrovascular isquémico. En consecuencia, los fármacos antiplaquetarios y anticoagulantes, utilizados solos o en combinación, son de gran importancia en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares y cerebrovasculares (May F, et al., Blood.
2009; 114: 3464-72; Schroder J, et al., Mol Cell Biol .2009; 29: 1083-94; Braun A, et al., Blood. 2009; 113: 2056-63). Si bien las terapias antiplaquetarias actuales reducen la recurrencia de los eventos vasculares, el mayor riesgo de sangrado debido a la inhibición plaquetaria es una preocupación particular para los pacientes que han experimentado un accidente cerebrovascular, y un subconjunto adicional de pacientes sigue siendo refractario a los enfoques antiplaquetarios (Pleines I, et al., Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 2009; 457: 1173-85), subrayando la necesidad de nuevas estrategias antiplaquetarias.
Su papel central en la adhesión de plaquetas pone dos complejos receptores en el foco de la investigación de plaquetas: i) el complejo GPIb-V-IX que interactúa con el vWF inmovilizado en la pared del vaso lesionado o en las plaquetas activadas y por lo tanto recluta plaquetas del torrente sanguíneo a la superficie reactiva en condiciones de cizallamiento elevado. ii) GPIIb/IIIa (integrina aIIbp3), un receptor para fibrinógeno y vWF que requiere activación de adentro hacia afuera mediada por receptores agonistas, contribuye a la adhesión firme de plaquetas resistente al cizallamiento y es esencial para la formación de agregados. El complejo GPIb-V-IX está compuesto por 4 GP transmembrana relacionadas: GPIba, GPIbp, GPV y GPIX, que están asociadas en una estequiometría de 2:4:2:1 (Luo SZ et al., Blood. 2007; 109 (2 ): 603-9). Dentro de este complejo, GPIba y GPIbp están unidos por disulfuro y están asociados de forma no covalente con GPIX. GPV se asocia de forma no covalente con GPIb-IX (Nieswandt B, et al., Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2009; 7: 206-9). Se encuentran aproximadamente 30.000 copias del complejo GPIb-IX en la superficie de las plaquetas humanas (Varga-Szabo D, et al., Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2009; 7: 1057-66). La pérdida de la función de GPIb-V-IX causa el síndrome de Bernard-Soulier (BSS), un trastorno hemorrágico grave. El BSS se caracteriza por plaquetas circulantes gigantes anormales con adhesión defectuosa al vWF y capacidad de respuesta reducida a la trombina (Canobbio I, et al., Cellular Signaling.
2004; 16: 1329-44). Si bien la falta o la disfunción de GPIb o GPIX se asocian con BSS, no se ha informado de ninguna mutación de pérdida de función en GP5 y la falta de GPV en ratones no conduce a un fenotipo BSS (Ramakrishnan V, et al. PNAS. 1999; 96: 13336-41; Kahn ML, et al. Blood. 1999; 94: 4112-21). GPV es la única subunidad que no se requiere para la correcta expresión del complejo (Dong J, et al., Journal of Biological Chemistry. 1998; 273: 31449-54). Los documentos Wo 95/02054 A2, US 6.005.089 y Lanza F, et al., Journal of Biological Chemistry. 1993; 268: 20801-20807 divulgan la secuencia y estructura del gen de GPV humana y la secuencia de aminoácidos de la GPV humana. GPV está altamente glicosilada y contiene un sitio de escisión de trombina que conduce a la eliminación cuantitativa de GPV de la superficie de las plaquetas y la generación de GPV soluble (sGPV) en presencia de trombina (Ravanat C, et al. Blood. 1997; 89: 3253-62; Azorsa DO, et al., Thrombosis and Haemostasis.1999; 81: 131-8; White GC, et al., Thrombosis Research. 38: 641-648). la GPV humana soluble generada por la escisión de trombina tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 10. Es de destacar que este sitio de escisión de trombina se conserva en la proteína de ratón, rata y humano (Ravanat C, et al., Blood. 1997; 89: 3253-62). Sin embargo, a diferencia de los ratones deficientes en el receptor 4 activado por proteasa (PAR), que no responde a la estimulación de trombina (Kahn ML, et al., Blood. 1999; 94: 4112-21; Kahn ML, et al., Nature. 1998 ; 394: 690-4), los ratones Gp5<-/-> muestran una funcionalidad plaquetaria extremadamente normal. Además de la trombina, la GPV puede, como GPIba o GPVI, ser escindida por sheddasas de la familia de desintegrina a y metaloproteinasa' (ADAM), especialmente ADAM17 (también conocida como la enzima convertidora del factor de necrosis tumoral, TACE) y ADAM10 (Garton KJ, et al., Journal of Biological Chemistry. 2001; 276: 37993-8001; Gardiner EE, et al., Blood. 2004; 104: 3611-7; Bergmeier W, et al., Thrombosis and Haemostasis. 2004; 91: 951-8), lo que resulta en una variante ligeramente más larga de sGPV. Sin embargo, la trombina se considera como el principal regulador de la expresión superficial de GPV. Los niveles de sGPV difieren enormemente entre plasma y suero (17,3 ± 6,3 ng/ml frente a 1,2 ± 0,17 |jg/ml, respectivamente) (Azorsa DO, et al., Thrombosis and Haemostasis. 1999; 81: 131-8) y los niveles de sGPV son ligeramente elevados bajo ciertas condiciones patológicas, tal como el accidente cerebrovascular isquémico (39,4 ng/ml en comparación con 28,1 ng/ml en los controles) (Wolff V, et al., Stroke. 2005; 36: e17-9). Hasta la fecha, no se ha descrito ningún papel para sGPV en la trombosis o la hemostasia.
Sumario de la invención
Los inventores encontraron sorprendentemente que la GPV soluble tiene un efecto antitrombótico, sin afectar el tiempo de sangrado. Por lo tanto, la presente invención proporciona un agente antitrombótico que comprende GPV soluble. La presente invención se refiere a las siguientes realizaciones (1) a (34):
(1) Un polipéptido soluble que comprende una glicoproteína V (GPV) modificada que carece de un dominio transmembrana funcional para su uso en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad trombótica en un sujeto, dicho tratamiento y/o prevención comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de dicho polipéptido soluble, en el que el polipéptido soluble es incapaz de integrarse en una membrana celular a través de dicho dominio transmembrana, en el que el término GPV denota una proteína que tiene una identidad de secuencia de al menos 70% con la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 3.
(2) El polipéptido soluble para uso de acuerdo con el punto (1), en el que la enfermedad trombótica se selecciona del grupo que consiste en afecciones tromboinflamatorias, trombosis venosa, trombosis arterial, trombosis capilar, trombosis de la vena porta, trombosis de la vena renal, trombosis de la vena yugular, trombosis del seno venoso cerebral, formación de trombos durante o después del contacto de la sangre con una superficie artificial, en particular oxigenación por membrana extracorpórea (ECMO), aterosclerosis, artritis, coagulopatía, trombosis venosa profunda (DVT), coagulopatía intravascular diseminada (DIC), tromboembolismo crónica o agudo, tromboembolia pulmonar, síndrome de Budd-Chiari, enfermedades de Paget-Schroetter, accidente cerebrovascular e infarto de miocardio.
(3) El polipéptido soluble para uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos anteriores, en el que dicha GPV modificada es una GPV truncada.
(4) El polipéptido soluble para uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos anteriores, en el que dicha GPV modificada o GPV truncada consiste en un fragmento del dominio extracelular de una GPV nativa, dicho fragmento tiene una longitud de al menos 6 aminoácidos.
(5) El polipéptido soluble para uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos anteriores, en el que dicha GPV modificada o GPV truncada consiste en un fragmento del dominio extracelular de una GPV nativa, dicho fragmento tiene una longitud de al menos 8 aminoácidos.
(6) El polipéptido soluble para uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos anteriores, en el que dicha GPV modificada o GPV truncada consiste en un fragmento del dominio extracelular de una GPV nativo, dicho fragmento tiene una longitud de al menos 30 aminoácidos.
(7) El polipéptido soluble para uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos anteriores, en el que dicha GPV modificada o GPV truncada consiste en un fragmento del dominio extracelular de una GPV nativa, dicho fragmento tiene una longitud de al menos 100 aminoácidos.
(8) El polipéptido soluble para uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos anteriores, en el que dicha GPV modificada o GPV truncada consiste en un fragmento del dominio extracelular de una GPV nativa, dicho fragmento tiene una longitud de al menos 250 aminoácidos.
(9) El polipéptido soluble para uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos anteriores, en el que dicha GPV modificada o GPV truncada consiste en un fragmento del dominio extracelular de una GPV nativa, dicho fragmento tiene una longitud de al menos 400 aminoácidos.
(10) El polipéptido soluble para uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos (4) a (9), en el que dicho fragmento tiene actividad antitrombótica.
(11) El polipéptido soluble para uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos (4) a (10), en el que dicho fragmento no afecta sustancialmente el tiempo de sangrado tras la administración.
(12) El polipéptido soluble para uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos (4) a (11), en el que dicha GPV nativa consiste en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 3, y el dominio extracelular consiste sustancialmente en los aminoácidos 1-503 de la SEQ ID NO: 3.
(13) El polipéptido soluble para uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos (4) a (11), en el que dicha GPV nativa consiste en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 7, y el dominio extracelular consiste sustancialmente en los aminoácidos 1-502 de la SEQ ID NO: 7.
(14) El polipéptido soluble para uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos anteriores, en el que dicho polipéptido soluble es un polipéptido que no se produce de forma natural.
(15) El polipéptido soluble para uso de acuerdo con el punto (14), que comprende además un resto que prolonga la semivida.
(16) El polipéptido soluble para su uso de acuerdo con el punto (15), en el que dicho resto que prolonga la semivida se conjuga con dicha GPV modificada, ya sea directamente o mediante un conector.
(17) El polipéptido soluble para uso de acuerdo con el punto (16), en el que dicho resto que prolonga la semivida se selecciona del grupo que consiste en hidroxietilalmidón (HES), polietilenglicol (PEG), ácidos polisiálicos (PSA) y ligandos de unión a albúmina, por ejemplo, cadenas de ácidos grasos.
(18) El polipéptido soluble para su uso de acuerdo con el punto (15), en el que dicho resto que prolonga la semivida es una secuencia de aminoácidos heteróloga fusionada a dicha GPV modificada, ya sea directamente o mediante un conector.
(19) El polipéptido soluble para su uso de acuerdo con el punto (18), en el que la secuencia de aminoácidos heteróloga que prolonga la semivida comprende o consiste en un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en albúmina y un fragmento de la misma que tiene una longitud de al menos 100 amino ácidos, regiones constantes de inmunoglobulina y fragmentos de las mismas, por ejemplo, el fragmento Fc, la transferrina y sus fragmentos, el péptido del terminal C de la gonadotropina coriónica humana, cadenas aleatorias solvatadas con gran volumen hidrodinámico (XTEN), repeticiones de homoaminoácidos (HAP), repeticiones de prolina-alaninaserina (PAS), afamina, alfafetoproteína, proteína de unión a vitamina D, polipéptidos capaces de unirse en condiciones fisiológicas a regiones constantes de albúmina o inmunoglobulina, y combinaciones de los mismos. (20) El polipéptido soluble para uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos anteriores, en el que dicho polipéptido soluble se puede obtener mediante expresión recombinante en células eucariotas.
(21) El polipéptido soluble para su uso de acuerdo con el punto (20), en el que dichas células eucariotas son células de mamífero.
(22) El polipéptido soluble para uso de acuerdo con el punto (21), en el que dichas células de mamífero son células CHO.
(23) El polipéptido soluble para su uso de acuerdo con el punto (20), en el que dichas células eucariotas son células de insecto, por ejemplo, células Sf9.
(24) El polipéptido soluble para uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos (1) a (19), en el que dicho polipéptido soluble se puede obtener mediante expresión recombinante en células procariotas, por ejemplo, en células bacterianas
(25) El polipéptido soluble para uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos anteriores, en el que dicho polipéptido soluble tiene actividad antitrombótica.
(26) El polipéptido soluble para uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos anteriores, en el que dicho polipéptido soluble no afecta sustancialmente el tiempo de sangrado tras la administración.
(27) El polipéptido soluble para uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos anteriores, en el que dicho tratamiento y/o prevención comprende además administrar a dicho sujeto un fármaco antiplaquetario o anticoagulante.
(28) Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido soluble como se define en uno cualquiera de los puntos (1) a (26), y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
(29) La composición farmacéutica del punto (28), en la que el polipéptido soluble no consiste en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la s Eq ID NO: 10.
(30) Un procedimiento para preparar el polipéptido soluble de acuerdo con uno cualquiera de los puntos (1) a (26), que comprende expresar un ácido nucleico que codifica el polipéptido soluble como se define en uno cualquiera de los puntos (1) a (26) en una célula de mamífero, y recuperar el polipéptido soluble del medio de cultivo.
(31) Un polipéptido de origen no natural como se define en el punto (14), en el que la glicoproteína V modificada (GPV) es una GPV soluble de origen no natural.
(32) La GPV soluble no natural del punto (31), que no consiste en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 10.
(33) Un kit farmacéutico que comprende (i) un polipéptido soluble de acuerdo con uno cualquiera de los puntos (1) a (26), y (ii) un fármaco antiplaquetario o anticoagulante distinto de dicho polipéptido soluble.
(34) El kit farmacéutico del punto (33), en el que el polipéptido soluble no consiste en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 10.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: La GPV soluble tiene un efecto antitrombótico en un modelo de lesión aórtica. La aorta abdominal fue lesionada mecánicamente por una única compresión firme con pinzas y el flujo sanguíneo se controló con un medidor de flujo Doppler. Se muestra el tiempo hasta la oclusión final. A, B) Tiempos de oclusión después de la inyección de GPV humana soluble (A: shGPV; B: shGPV-proteína de fusión a albúmina (AFP)) o GPV murina soluble (C: smGPV). Cada símbolo representa un ratón individual. En los casos en que los ratones no pudieron formar trombos oclusivos, se utilizó la prueba exacta de Fisher para calcular los valores P. * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001
Figura 2: La GPV humana soluble protege del accidente cerebrovascular isquémico. Los ratones fueron sometidos a 60 minutos de oclusión transitoria de la arteria cerebral media (tMCAO). Los volúmenes de infarto cerebral de ratones de tipo silvestre (barra negra) y de tipo silvestre pretratados con shGPV-AFP (barra gris) se midieron por planimetría 24 h después de tMCAO. Los resultados representan la media ± DE.
Figura 3: La GPV soluble no tiene ningún efecto en los tiempos de sangrado de la cola. Se muestran los tiempos de sangrado de la cola de las líneas de ratón indicadas que reciben vehículo o GPV humana soluble (A: shGPV; B: shGPV-AFP). Cada símbolo representa un animal.
Figura 4: El tratamiento con GPV soluble da como resultado una cobertura superficial reducida y un volumen de trombos en colágeno por debajo del flujo in vitro. A) La sangre humana se trató con shGPV-AFP y se perfundió sobre una superficie recubierta de colágeno a una velocidad de cizallamiento de 1000 s-1. B) La sangre de ratones de tipo silvestre se incubó con smGPV y se perfundió sobre una superficie recubierta de colágeno a una velocidad de cizallamiento de 1700 s-1. Los resultados se muestran como media ± DE.
Descripción detallada
La presente invención se refiere a un polipéptido soluble que comprende una glicoproteína V modificada (GPV) que carece de un dominio transmembrana funcional para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad trombótica en un sujeto, dicho tratamiento o prevención comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de dicho polipéptido soluble, en el que el polipéptido soluble es incapaz de integrarse en una membrana celular a través de dicho dominio transmembrana, en el que el término GPV denota una proteína que tiene una identidad de secuencia de al menos 70% con respecto a la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 3. Preferiblemente, la GPV modificada es una GPV truncada.
El término "soluble" como se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido que no está unido a una membrana celular. El polipéptido soluble es incapaz de integrarse en una membrana celular a través de un dominio transmembrana. Típicamente, el polipéptido soluble carece de un dominio transmembrana funcional. Preferiblemente, los polipéptidos solubles son solubles en agua o un tampón, tal como PBS.
Glicoproteína V
El término "Glicoproteína V" o "GPV", de acuerdo con la invención, denota una proteína que tiene una identidad de secuencia de al menos 70% con respecto a la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 3. Preferiblemente, la GPV tiene una identidad de aminoácidos de al menos 80%, o al menos 90%, o al menos 95% con la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 3. De acuerdo con la presente invención, una secuencia que se está evaluando (la "Secuencia Comparada") tiene un cierto "Identidad Porcentual", o es un cierto "porcentaje idéntica a" una secuencia reivindicada o descrita (la "Secuencia de Referencia") después de la alineación de las dos secuencias. La "Identidad Porcentual" se determina de acuerdo con la siguiente fórmula: Identidad Porcentual = 100[1-(C/R)]
En esta fórmula, C es el número de diferencias entre la Secuencia de Referencia y la Secuencia Comparada sobre la longitud de alineación entre las dos secuencias en la que (i) cada base en la Secuencia de Referencia que no tiene una base alineada correspondiente en la Secuencia Comparada, y (ii) cada espacio en la Secuencia de Referencia, y (iii) cada base alineada en la Secuencia de Referencia que es diferente de una base alineada en la Secuencia Comparada constituye una diferencia. R es el número de bases de la Secuencia de Referencia sobre la longitud de la alineación con la Secuencia Comparada con cualquier espacio creado en la Secuencia de Referencia que también se cuenta como una base.
Si existe una alineación entre la Secuencia Comparada y la Secuencia de Referencia para la cual la Identidad Porcentual (calculada como anteriormente) es aproximadamente igual o mayor que un mínimo especificado, la Secuencia Comparada tiene esa Identidad Porcentual mínima especificada incluso si las alineaciones pueden existir en otra parte de la secuencia que muestre una Identidad Porcentual inferior que la especificada.
En una realización preferida, la longitud de la secuencia alineada para fines de comparación es al menos 30%, preferiblemente al menos 40%, más preferiblemente al menos 50%, incluso más preferiblemente al menos 60% e incluso más preferiblemente al menos 70%, 80% o 90% de la longitud de la Secuencia de Referencia.
La comparación de las secuencias y la determinación de la identidad porcentual (y la similitud porcentual) entre dos secuencias de aminoácidos se puede lograr usando cualquier programa adecuado, por ejemplo, el programa "SECUENCIAS BLAST 2 (blastp)" (Tatusova et al., FEMS Microbiol. Lett. 1999. 174: 247-250) con los siguientes parámetros: Matriz BLOSUM62; Penalizaciones por espacio abierto 11 y extensión de espacio 1; disminución x de espacio 50; esperado 10,0; tamaño de palabra 3; Filtro: ninguno. De acuerdo con la presente invención, la comparación de secuencias cubre al menos 40 aminoácidos, preferiblemente al menos 80 aminoácidos, más preferiblemente al menos 100 aminoácidos, y lo más preferiblemente al menos 120 aminoácidos.
Normalmente, la GPV es GPV plaquetaria, y la GPV modificada es GPV plaquetaria modificada.
La GPV nativa (es decir, no modificada) comprende un dominio transmembrana funcional, es decir, comprende una secuencia de aminoácidos capaz de conferir integración en una membrana celular (por ejemplo, una membrana plasmática) durante la expresión.
La GPV nativa es una GPV natural. Preferiblemente, la GPV nativa es de origen mamífero. En una realización, la GPV es una GPV humana. De acuerdo con esta realización, la GPV nativa comprende o consiste preferiblemente en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 3. En otra realización, la GPV nativa es una GPV murina. De acuerdo con esta realización, la GPV nativa comprende o consiste preferiblemente en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 7. El término GPV nativa como se usa en el presente documento incluye, pero no se limita a, homólogos y ortólogos de GPV humana representados por la SEQ ID NO: 2 (con péptido señal) y SEQ ID NO: 3 (sin péptido señal). A menos que se indique lo contrario, el término GPV se refiere al polipéptido maduro que carece del péptido señal.
Más preferiblemente, la GPV nativa comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 3.
GPV modificada
La GPV modificada de acuerdo con esta invención difiere de la GPV nativa de la que se deriva (también denominada como la "GPV original" o la "GPV no modificada") al menos en que el dominio transmembrana ya no es funcional, debido a una mutación o cualquier otro medio. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos que representa el dominio transmembrana en la GPV modificada puede tener una o más sustituciones, eliminaciones y/o inserciones en relación con la GPV original. En una realización, la secuencia de aminoácidos de la GPV modificada carece al menos del dominio transmembrana completo de la GPV original. En otra realización, la GPV modificada es una GPV truncada. El dominio transmembrana de la GPV humana se prolonga desde las posiciones de los aminoácidos 504 a 527 de la SEQ ID NO: 3. El dominio transmembrana de GPV murina se prolonga desde las posiciones de los aminoácidos 503 a 526 de la SEQ ID NO: 7.
Los 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 aminoácidos del dominio transmembrana de la GPV pueden eliminarse o sustituirse en la GPV modificada. En una realización, los 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 aminoácidos del dominio transmembrana de la GPV humana (aminoácidos 504 a 527 de la SEQ ID NO: 3) pueden eliminarse o sustituirse. En otra realización, los 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 aminoácidos del dominio transmembrana de GPV murina (aminoácidos 503 a 526 de la SEQ ID NO: 7) pueden eliminarse o sustituirse.
La GPV modificada, preferiblemente la GPV truncada, tiene actividad antitrombótica. La actividad antitrombótica se puede determinar como se muestra en el experimento descrito en el Ejemplo 1 (Véase también "Lesión Mecánica de la Aorta Abdominal" en la sección de "Materiales y Procedimientos" de los Ejemplos). Existe actividad antitrombótica si el compuesto probado (por ejemplo, 20 |jg) es capaz de retrasar o prevenir la formación de trombos oclusivos arteriales en ratones. Preferiblemente, la formación de trombos oclusivos arterial se retrasa en al menos 1 minuto, más preferiblemente al menos 5 minutos, lo más preferiblemente al menos 10 minutos.
GPV truncada
Una GPV truncada consiste en un fragmento de GPV. El truncamiento típicamente está en el extremo terminal C de la GPV. El extremo terminal N puede estar truncado o no puede estar truncado.
El fragmento de GPV tiene una longitud de al menos 6 aminoácidos. Preferiblemente, la longitud del fragmento de GPV es al menos de 7, al menos de 8, al menos de 9, al menos de 10, al menos de 15, al menos de 20, al menos de 50, al menos de 100, al menos de 200, al menos de 300, o al menos de 400 aminoácidos. En ciertas realizaciones, la GPV truncada consiste en un fragmento de la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 3, en la que dicho fragmento tiene una longitud mínima de 6 aminoácidos, preferiblemente de al menos 7, al menos 8, al menos 9 , al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 50, al menos 100, al menos 200, al menos 300 o al menos 400 aminoácidos.
En una realización, la GPV truncada tiene un truncamiento en el terminal C y carece del dominio transmembrana completo de la GPV del que se deriva. En otra realización, la GPV truncada tiene un truncamiento en el terminal C y carece del dominio transmembrana de tal manera que la GPV truncada no está unida a la membrana.
Las GPV truncadas preferidas consisten en una secuencia de aminoácidos seleccionada de las siguientes secuencias de aminoácidos, en las que todas las posiciones de aminoácidos se refieren a la SEQ ID NO: 3 (realizaciones 1-71) o la SEQ ID NO: 7 (realizaciones 72-141) , respectivamente, como se indica:
Tabla 1.
Figure imgf000007_0001
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(continuación)
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Los límites superior e inferior de las secuencias de aminoácidos de las realizaciones anteriores se pueden combinar entre sí.
En particular, las realizaciones preferidas de la GPV truncada consisten en los aminoácidos 1-516 de la SEQ ID NO: 3 o en los aminoácidos 1-502 de la SEQ ID NO: 7.
En otras realizaciones, la GPV truncado comprende o consiste en las siguientes secuencias.
Tabla 2.
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En una realización específica de la presente invención, el polipéptido soluble para uso como se describe en el presente documento comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 10. En otra realización específica, el polipéptido soluble de la invención es un polipéptido de origen no natural. En otra realización específica más, el polipéptido soluble de la invención no consiste en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 10. En otra realización específica más, el polipéptido soluble de la invención es un polipéptido de origen no natural y no consiste en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 10.
Componentes adicionales del polipéptido
El polipéptido soluble de la invención puede comprender aminoácidos adicionales distintos de los derivados de GPV u otros restos que prolongan la semivida.
En una realización de la invención, la semivida del polipéptido soluble de la invención se prolonga por modificación química, por ejemplo, unión, ya sea directamente o por medio de un conector, de un resto que prolonga la semivida tal como polietilenglicol (PEGilación), PEG glicosilado, hidroxietil almidón (HESilación), ácidos polisiálicos, polipéptidos similares a elastina, polímeros de heparosano o ácido hialurónico. En otra realización, el polipéptido soluble, preferiblemente la GPV modificada, se conjuga con una proteína que prolonga la semivida (HLEP) tal como la albúmina a través de un conector químico. El principio de esta tecnología de conjugación ha sido descrito a manera de ejemplo por Conjuchem LLC (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 7.256.253). En otra realización de la invención, el polipéptido soluble comprende una secuencia de aminoácidos heteróloga, es decir, heteróloga a la GPV respectiva utilizada, que se fusiona a dicha GPV directamente o mediante un conector.
Las secuencias heterólogas pueden ser secuencias de etiquetas que son reconocidas por anticuerpos u otras moléculas que tienen una alta afinidad por la etiqueta. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, etiquetas de polihistidina, etiqueta FLAG, etiqueta myc, etiqueta GST, etc. Las secuencias de etiqueta generalmente facilitan la purificación del polipéptido tras la expresión en células huésped.
En una realización preferida, el polipéptido soluble comprende además una proteína que prolonga la semivida (HLEP). Preferiblemente, la HLEP es una albúmina o un fragmento de la misma. El terminal N de la albúmina puede fusionarse con el terminal C de la GPV modificada. Una o más HLEP pueden fusionarse a la parte del terminal N o C de la GPV modificada, siempre que no interfieran o eliminen la actividad antitrombótica de la GPV modificada.
En una realización, el polipéptido tiene la siguiente estructura:
mGPV - L1 -H, [fórmula 1]
en la que mGPV es la GPV modificada, L1 es un enlace químico o una secuencia conectora, y H es una HLEP. L1 puede ser un enlace químico o una secuencia conectora que consiste en uno o más aminoácidos, por ejemplo, de 1 a 50, 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5 o 1 a 3 (por ejemplo, 1, 2 o 3) aminoácidos y que pueden ser iguales o diferentes entre sí. Por lo general, las secuencias conectoras no están presentes en la posición correspondiente en la GPV de tipo silvestre. Los ejemplos de aminoácidos adecuados presentes en L1 incluyen Gly y Ser. El conector debe ser no inmunogénico y puede ser un conector no escindible o escindible. Los conectores no escindibles pueden estar constituidos por residuos alternos de glicina y serina como se ejemplifica en el documento WO2007/090584. En otra realización de la invención, el conector peptídico entre el resto de GPV modificado y rl resto de albúmina consiste en secuencias peptídicas, que sirven como conectores de interdominios naturales en proteínas humanas. Preferiblemente, tales secuencias de péptidos en su entorno natural están ubicadas cerca de la superficie de la proteína y son accesibles para el sistema inmune, de modo que se puede asumir una tolerancia natural contra esta secuencia. Se dan ejemplos en el documento WO2007/090584. Se describen secuencias conectoras escindibles, por ejemplo, en el documento WO 2013/120939 A1.
Las secuencias de HLEP preferidas se describen a continuación. Del mismo modo, la invención abarca fusiones al "aminoácido del terminal N" exacto de la HLEP respectiva, o fusiones a la "parte del terminal N" de la HLEP respectiva, que incluye eliminaciones del terminal N de uno o más aminoácidos de la HLEP. El polipéptido puede comprender más de una secuencia de HLEP, por ejemplo, dos o tres secuencias de HLEP. Estas múltiples secuencias de HLEP pueden fusionarse a la parte del terminal C de GPV modificada en tándem, por ejemplo, como repeticiones sucesivas.
Polipéptidos que prolongan la semivida (HLEP)
Preferiblemente, el resto que prolonga la semivida es un polipéptido que prolonga la semivida (HLEP), más preferiblemente HLEP se selecciona de albúmina o fragmentos de la misma, región constante de inmunoglobulina y fragmentos de la misma, por ejemplo, el fragmento Fc, cadenas aleatorias solvatadas con gran volumen hidrodinámico (por ejemplo, XTEN (Schellenberger et al. Nature Biotechnol. 2009. 27: 1186-1190), repeticiones de homo aminoácidos (HAP) o repeticiones de prolina-alanina-serina (PAS)), afamina, alfa-fetoproteína, proteína de unión a la vitamina D, transferrina o variantes de la misma, péptido del terminal carboxilo (CTP) de la subunidad de gonadotropina p coriónica humana, polipéptidos o lípidos capaces de unirse en condiciones fisiológicas a la región constante de albúmina o inmunoglobulina.
Un "polipéptido que prolonga la semivida" como se usa en el presente documento se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en albúmina, un miembro de la familia de la albúmina, la región constante de inmunoglobulina G y fragmentos de la misma, región y polipéptidos capaces de unirse bajo condiciones fisiológicas, a la albúmina, a miembros de la familia de la albúmina, así como a fragmentos de una región constante de inmunoglobulina. Puede ser una proteína que prolonga la semivida de longitud completa descrita en el presente documento (por ejemplo, albúmina, un miembro de la familia de la albúmina o la región constante de inmunoglobulina G) o uno o más fragmentos de la misma que son capaces de estabilizar o prolongar la actividad terapéutica o la actividad biológica de la GPV modificada. Dichos fragmentos pueden tener 10 o más aminoácidos de longitud o pueden incluir al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 100 o más aminoácidos contiguos de la secuencia de HLEP o puede incluir parte o la totalidad de los dominios específicos de la HLEP respectiva, siempre que el fragmento de HLEP proporcione una prolongación de semivida funcional de al menos 25% en comparación con el polipéptido respectivo sin la HLEP.
El fragmento de HLEP de los constructos de inserción del factor de coagulación propuesto de la invención puede ser una variante de una HLEP normal. El término "variantes" incluye inserciones, eliminaciones y sustituciones, ya sean conservadoras o no conservadoras, en las que dichos cambios no alteran sustancialmente el sitio activo o el dominio activo que confiere las actividades biológicas de la GPV modificada.
En particular, los constructos de fusión GPV-HLEP modificados propuestos de la invención pueden incluir variantes polimórficas naturales de HLEP y fragmentos de HLEP. La HLEP puede derivarse de cualquier vertebrado, especialmente cualquier mamífero, por ejemplo humano, mono, vaca, oveja o cerdo. Las HLEP no de mamíferos incluyen, entre otros, gallina y salmón.
Albúmina como HLEP
Los términos "albúmina de suero humano" (HSA) y "albúmina humana" (HA) y "albúmina" (ALB) se usan indistintamente en esta solicitud. Los términos "albúmina" y "albúmina de suero" son más amplios y abarcan la albúmina de suero humana (y sus fragmentos y variantes), así como la albúmina de otras especies (y sus fragmentos y variantes).
Como se usa en el presente documento, "albúmina" se refiere colectivamente a un polipéptido de albúmina o secuencia de aminoácidos, o un fragmento o variante de albúmina, que tiene una o más actividades funcionales (por ejemplo, actividades biológicas) de albúmina. En particular, "albúmina" se refiere a albúmina humana o fragmentos de la misma, especialmente la forma madura de albúmina humana o albúmina de otros vertebrados o fragmentos de la misma, o análogos o variantes de estas moléculas o fragmentos de las mismas.
En particular, los constructos de fusión de GPV modificados propuestos de la invención pueden incluir variantes polimórficas de albúmina humana y fragmentos de albúmina humana que se producen naturalmente. En términos generales, un fragmento o variante de albúmina tendrá al menos 10, preferiblemente al menos 40, lo más preferiblemente más de 70 aminoácidos de longitud.
El fragmento de albúmina de los constructos de fusión de GPV modificados propuestos de la invención pueden comprender al menos un subdominio o dominio de HA o modificaciones conservadoras del mismo.
Inmunoglobulinas como HLEP
En una realización preferida, el polipéptido soluble de la invención comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 9.
Inmunoglobulinas como HLEP
Las regiones constantes de inmunoglobulina G (IgG) (Fc) son conocidas en la técnica por aumentar la semivida de las proteínas terapéuticas (Dumont JA, et al., BioDrugs. 2006; 20: 151-160). La región constante de IgG de la cadena pesada consta de 3 dominios (CH1-CH3) y una región bisagra. La secuencia de inmunoglobulina puede derivarse de cualquier mamífero, o de las subclases IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, respectivamente. IgG y los fragmentos de IgG sin un dominio de unión a antígeno también se pueden usar como HLEP. El fragmento de polipéptido terapéutico está conectado a la IgG o a los fragmentos de IgG preferiblemente a través de la región bisagra del anticuerpo o un conector peptídico, que incluso puede ser escindible. Varias patentes y solicitudes de patentes describen la fusión de proteínas terapéuticas con regiones constantes de inmunoglobulina para mejorar las semividas in vivo de las proteínas terapéuticas. Los documentos US 2004/0087778 y WO 2005/001025 describen proteínas de fusión de dominios Fc o al menos fragmentos de regiones constantes de inmunoglobulina con péptidos biológicamente activos que aumentan la semivida del péptido, que de otro modo se eliminarían rápidamente in vivo. Se describieron las proteínas de fusión Fc-IFN-p que lograron una mayor actividad biológica, una semivida en circulación prolongada y una mayor solubilidad (documento WO 2006/000448). Se divulgaron proteínas Fc-EPO con una semivida en suero prolongada y una mayor potencia in vivo (documento WO 2005/063808), así como fusiones de Fc con G-CSF (documento WO 2003/076567), péptido 1 tipo glucagón (documento WO 2005/000892), factores de coagulación (documento WO 2004/101740) e interleucina 10 (documento US 6.403.077), todos con propiedades de prolongación de la semivida.
En ciertas realizaciones, la proteína de fusión Fc es monomérica. En otras realizaciones, la proteína de fusión Fc es dimérica.
En el documento WO 2013/120939 se describen en detalle varias HLEP que se pueden usar de acuerdo con esta invención.
Ácido Nucleico y Expresión
El ácido nucleico que codifica el polipéptido a expresar puede prepararse de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica. Sobre la base de la secuencia de ADNc de GPV humana (SEQ ID NO: 1) o de GPV murina (SEQ ID NO: 5), se puede diseñar y generar ADN recombinante que codifica los constructos de GPV modificados mencionadas anteriormente. En la tabla 3 se resumen más detalles de las secuencias humanas y de ratón.
Tabla 3: Detalles de secuencias de GPV de tipo silvestre de ratón y humano
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Los constructos en los que el ADNc contiene el marco de lectura abierto completo insertado en la orientación correcta en un plásmido de expresión se pueden usar para la expresión de proteínas. Los vectores de expresión típicos contienen promotores que dirigen la síntesis de grandes cantidades de ARNm correspondientes al ácido nucleico insertado en las células portadoras de plásmido. También pueden incluir una secuencia de origen de replicación que permita su replicación autónoma dentro del organismo huésped y secuencias que aumenten la eficiencia con la que se traduce el ARNm sintetizado. Los vectores estables a largo plazo pueden mantenerse como entidades que se replican libremente mediante el uso de elementos reguladores de, por ejemplo, virus (por ejemplo, las secuencias OriP del genoma del virus de Epstein Barr). También se pueden producir líneas celulares que han integrado el vector en el ADN genómico, y de esta manera el producto génico se produce de forma continua.
Normalmente, las células a proporcionar se obtienen mediante la introducción del ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la g Pv modificada en células huésped de mamífero.
Células huésped
De acuerdo con la presente invención, se puede utilizar cualquier célula huésped susceptible al cultivo celular y a la expresión de polipéptidos, preferiblemente polipéptidos glicosilados. En ciertas realizaciones, la célula huésped es de mamífero. Los ejemplos no limitantes de células de mamífero que se pueden usar de acuerdo con la presente invención incluyen la línea de mieloma de ratón BALB/c (NSO/1, ECACC No: 85110503); retinoblastos humanos (PER.C6 (CruCell, Leiden, Países Bajos)); línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (células HEK293 o HEK293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59, 1977); células de riñón de hámster bebé (BHK, ATCC CCL10); células de ovario de hámster chino /- DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. Us a , 77: 4216, 1980); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243251, 1980); células de riñón de mono (CV1 ATc C CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1 587); células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (HepG2, HB 8065); tumor mamario de ratón (m Mt 060562, ATc C CCL51); células TRI (Mather et al., Annals NY. Acad. Sci., 383: 44-68, 1982); células MRC 5; células PS4; células de amniocitos humanos (CAP); y una línea de hepatoma humano (Hep G2). Preferiblemente, la línea celular es una línea celular humana o de roedor, especialmente una línea celular de hámster tal como CHO.
Se conocen en la técnica procedimientos adecuados para introducir ácidos nucleicos suficientes para lograr la expresión de una glicoproteína de interés en células huésped de mamífero. Véase, por ejemplo, Gething, et al., Nature. 1981; 293: 620-625; Mantei, et al., Nature. 1979; 281: 40-46; Levinson et al., EP 117.060; y EP 117.058. Para las células de mamíferos, los procedimientos comunes para introducir material genético en las células de mamíferos incluyen el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio de Graham y van der Erb (Virology. 1978; 52: 456-457) o el procedimiento lipofectaminaMR (Gibco BRL) de Hawley-Nelson (Focus.1993; 15: 73). Axel ha descrito aspectos generales de las transfecciones del sistema de células huésped de mamíferos en el documento US 4.399.216. Para diversas técnicas para introducir material genético en células de mamíferos, véase Keown et al., (Methods in Enzymology, 1989), Keown et al., (Methods in Enzymology. 1990; 185: 527-537), y Mansour et al., (Nature, 1988; 336: 348-352).
El medio basal elegido para cultivar la línea celular huésped no es crítico para la presente invención y puede ser uno cualquiera o una combinación de los conocidos en la técnica que son adecuados para cultivar células de mamífero. Medios tales como el medio Eagle modificado de Dulbecco, el medio F-12 de Ham, el medio esencial mínimo de Eagle y el medio RPMI-1640 y similares están disponibles comercialmente. La adición de factores de crecimiento como la insulina recombinante es opcional. En una realización, el medio de producción está libre de componentes derivados de animales. En una realización preferida, el medio está "libre de proteínas" en el sentido de que está completamente libre de cualquier proteína o al menos libre de cualquier proteína que no se produzca de forma recombinante. La albúmina de suero humano puede usarse como un suplemento de cultivo sin suero para la producción de la glicoproteína. Opcionalmente, el medio contiene un inhibidor de proteasa, tal como un inhibidor de serina proteasa, que es adecuado para el cultivo de tejidos y que es de origen sintético o vegetal.
En general, la presente invención puede usarse con cualquier procedimiento de cultivo celular que sea susceptible a la expresión de glicoproteínas. Por ejemplo, las células se pueden cultivar en cultivos discontinuos o alimentados por lotes, en los que el cultivo se termina después de una expresión suficiente de la glicoproteína, después de lo cual se cosecha la glicoproteína expresada. Preferiblemente, las células se pueden cultivar en cultivos continuos (por ejemplo, cultivos de perfusión), en los que el medio fresco se agrega periódica o continuamente al cultivo, y la glicoproteína expresada se cosecha periódica o continuamente. El cultivo puede ser de cualquier tipo convencional de cultivo, tal como discontinuo, alimentado por lotes o continuo, pero preferiblemente es continuo. Cultivos continuos adecuados incluyen cultivo de perfusión.
Un experto habitual en la técnica podrá adaptar condiciones específicas de cultivo celular para optimizar ciertas características del cultivo celular que incluyen, pero no se limitan a, velocidad de crecimiento, viabilidad celular, densidad celular final del cultivo celular, concentración final de subproductos metabólicos perjudiciales tales como lactato y amonio, título de la glicoproteína expresada, extensión y composición de las cadenas laterales de oligosacáridos o cualquier combinación de estas u otras condiciones consideradas importantes por el profesional. Aislamiento del polipéptido soluble expresado
En general, típicamente será deseable aislar y/o purificar las glicoproteínas expresadas de acuerdo con la presente invención. En ciertas realizaciones, la glicoproteína expresada se secreta en el medio y, por lo tanto, las células y otros sólidos pueden eliminarse, tal como por centrifugación o filtración, por ejemplo, como una primera etapa en el proceso de purificación.
La glicoproteína expresada puede aislarse y purificarse mediante procedimientos estándar que incluyen, pero no se limitan a, cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, exclusión por tamaño y cromatografía de hidroxiapatita), filtración en gel, centrifugación o solubilidad diferencial, precipitación con etanol y/o por cualquier otra técnica disponible para la purificación de proteínas (véase, por ejemplo, Scopes, Protein Purification Principles and Practice 2a Edición, Springer-Verlag, New York, 1987; Higgins SJ y Hames BD (eds.), Protein Expression: A Practical Approach, Oxford Univ. Press, 1999; y Deutscher MP, Simon MI, Abelson JN (eds.), Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology (Methods in Enzymology Series, Vol. 182), Academic Press, 1997, cada uno de los cuales se incorpora en el presente documento como referencia). Para la cromatografía de inmunoafinidad en particular, la glicoproteína puede aislarse uniéndola a una columna de afinidad que comprende anticuerpos que se generaron contra esa glicoproteína y se fijaron a un soporte estacionario. Alternativamente, las etiquetas de afinidad tales como una secuencia de capa de influenza, polihistidina o glutatión-S-transferasa se pueden unir a la glicoproteína mediante técnicas recombinantes estándar para permitir una fácil purificación pasando por la columna de afinidad apropiada. Si la GPV soluble a purificar comprende una HLEP, los anticuerpos dirigidos contra la HLEP u otros compuestos capaces de unirse a la HLEP pueden fijarse a una columna de afinidad para realizar una cromatografía de afinidad. Los inhibidores de la proteasa como el fluoruro de fenil metil sulfonilo (PMSF), leupeptina, pepstatina o aprotinina pueden agregarse en una cualquiera o en todas las etapas para reducir o eliminar la degradación de la glicoproteína durante el proceso de purificación. Los inhibidores de la proteasa son particularmente ventajosos cuando las células deben lisarse para aislar y purificar la glicoproteína expresada. Adicional o alternativamente, se pueden agregar inhibidores de la glicosidasa en cualquiera o en todas las etapas para reducir o eliminar el recorte enzimático de las cadenas de oligosacáridos unidas covalentemente.
Un experto habitual en la materia apreciará que la técnica de purificación exacta variará dependiendo del carácter del polipéptido a purificar, el carácter de las células a partir de las cuales se expresa el polipéptido y/o la composición del medio en el que se cultivaron las células.
Composiciones y kits
Otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende el polipéptido soluble de la invención, y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender un polipéptido soluble en una cantidad eficaz para tratar o prevenir una enfermedad trombótica en un sujeto. La composición farmacéutica puede comprender aproximadamente 10 |jg - 1.000 mg, preferiblemente aproximadamente 100 jg - 500 mg, más preferiblemente 1 mg - 100 mg del polipéptido soluble. La composición farmacéutica puede comprender aproximadamente 0,01 - 20.000 jg/ml, preferiblemente aproximadamente 0,1 -1.000 jg/ml, más preferiblemente 0,5 - 500 jg/ml, lo más preferiblemente aproximadamente 100 jg/ml del polipéptido soluble. La composición farmacéutica puede comprender además un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los portadores y diluyentes adecuados en la composición farmacéutica son bien conocidos en la técnica.
Las formulaciones terapéuticas de las glicoproteínas de la invención adecuadas en los procedimientos descritos en el presente documento pueden prepararse para almacenamiento como formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas mezclando la glicoproteína que tiene el grado deseado de pureza con vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables típicamente empleados en la técnica (todos los cuales se denominan en el presente documento como "portadores"), es decir, agentes tamponantes, agentes estabilizantes, conservantes, isotonificadores, detergentes no iónicos, antioxidantes y otros aditivos misceláneos, véase Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición (Osol, ed.) 1980. Dichos aditivos deben ser no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas. Los agentes tamponantes ayudan a mantener el pH en el intervalo que se aproxima a las condiciones fisiológicas. Pueden presentarse en concentraciones que varían de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 50 mM. Los agentes tamponantes adecuados incluyen ácidos orgánicos e inorgánicos y sales de los mismos, tales como tampones de citrato (por ejemplo, mezcla de citrato monosódico-citrato disódico, mezcla de ácido cítrico-citrato trisódico, mezcla de ácido cítrico-citrato monosódico, etc.), tampones de succinato (por ejemplo, ácido succínico mezcla de ácido succínico- succinato monosódico, mezcla de ácido succínicohidróxido de sodio, mezcla de ácido succínico-succinato disódico, etc.), tampones de tartrato (por ejemplo, mezcla de ácido tartárico-tartrato de sodio, mezcla de ácido tartárico-tartrato de potasio, mezcla de ácido tartárico-hidróxido de sodio, etc.), tampones de fumarato (por ejemplo, mezcla de ácido fumárico-fumarato monosódico, mezcla de ácido fumárico-fumarato disódico, mezcla de fumarato monosódico-fumarato disódico, etc.), tampones de gluconato (por ejemplo, mezcla de ácido glucónico-gluconato de sodio, mezcla de ácido glucónico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido glucónico - gluconato de potasio, etc.), tampón de oxalato (por ejemplo, mezcla de ácido oxálico-oxalato de sodio, mezcla de ácido oxálico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido oxálico-oxalato de potasio etc.), tampones de lactato (por ejemplo, mezcla de ácido láctico-lactato de sodio, mezcla de ácido láctico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido láctico-lactato de potasio, etc.) y tampones de acetato (por ejemplo, mezcla de ácido acético-acetato de sodio, mezcla de ácido acético-hidróxido de sodio, etc.). Además, se pueden usar tampones de fosfato, tampones de histidina y sales de trimetilamina tales como Tris.
Se pueden agregar conservantes para retardar el crecimiento microbiano, y se pueden agregar en cantidades que varían de 0,2% a 1% (p/v). Los conservantes adecuados incluyen fenol, alcohol bencílico, meta-cresol, metil parabeno, propil parabeno, cloruro de octadecildimetilbencilamonio, haluros de benzalconio (por ejemplo, cloruro, bromuro y yoduro), cloruro de hexametonio y alquil parabenos tales como metil o propil parabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol y 3-pentanol. Se pueden agregar isotonificadores a veces conocidos como "estabilizadores" para asegurar la isotonicidad de las composiciones líquidas e incluyen alcoholes de azúcar polihídricos, preferiblemente alcoholes de azúcar trihídricos o superiores, tales como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol. Los estabilizadores se refieren a una amplia categoría de excipientes que pueden variar en función de un agente de carga a un aditivo que solubiliza el agente terapéutico o ayuda a prevenir la desnaturalización o la adherencia a la pared del recipiente. Los estabilizadores típicos pueden ser alcoholes de azúcar polihídricos (enumerados anteriormente); aminoácidos tales como arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2-fenilalanina, ácido glutámico, treonina, etc., azúcares orgánicos o alcoholes de azúcar, tales como lactosa, trehalosa, estaquiosa, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinositol, galactitol, glicerol y similares, incluidos los ciclitoles tales como el inositol; polietilenglicol; polímeros de aminoácidos; agentes reductores que contienen azufre, tales como urea, glutatión, ácido tióctico, tioglicolato de sodio, tioglicerol, a-monotioglicerol y tio sulfato de sodio; polipéptidos de bajo peso molecular (por ejemplo, péptidos de 10 residuos o menos); proteínas tales como albúmina de suero humano, albúmina de suero bovino, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como monosacáridos de polivinilpirrolidona, tales como xilosa, manosa, fructosa, glucosa; disacáridos tales como lactosa, maltosa, sacarosa y trisacáridos tales como rafinosa; y polisacáridos tales como el dextrano. Los estabilizadores pueden estar presentes en el intervalo de 0,1 a 10.000 pesos por parte de proteína activa en peso.
Se pueden agregar tensioactivos o detergentes no iónicos (también conocidos como "agentes humectantes") para ayudar a solubilizar el agente terapéutico así como para proteger la proteína terapéutica contra la agregación inducida por la agitación, que también permite que la formulación se exponga a superficies de cizallamiento estresadas sin causar desnaturalización de la proteína. Los tensioactivos no iónicos adecuados incluyen polisorbatos (20, 80, etc.), polioxámeros (184, 188, etc.), polioles plurónicos, monoéteres de polioxietilensorbitán (TWEEN®-20, TWEEN®-80, etc.). Los tensioactivos no iónicos pueden estar presentes en un intervalo de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml, o en un intervalo de aproximadamente 0,07 mg/ml a aproximadamente 0,2 mg/ml.
Los excipientes misceláneos adicionales incluyen agentes de carga (por ejemplo, almidón), agentes quelantes (por ejemplo, EDTA), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metionina, vitamina E) y codisolventes.
La composición farmacéutica puede tener un pH de aproximadamente 5,0-10,0, preferiblemente aproximadamente 5,6-9,0, más preferiblemente aproximadamente 6,0-8,8, lo más preferiblemente aproximadamente 6,5-8,0. Por ejemplo, el pH puede ser de aproximadamente 6,2, 6,5, 6,75, 7,0 o 7,5.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden formularse para administración oral, sublingual, intranasal, intraocular, rectal, transdérmica, mucosal, tópica o parenteral. La administración parenteral puede incluir inyección o infusión intradérmica, subcutánea, intramuscular (im), intravenosa (iv), intraperitoneal (ip), intraarterial, intramedular, intracardiaca, intraarticular (articulación), intrasinovial, intracraneal, intraespinal e intratecal (fluidos espinales), preferiblemente inyección intraperitoneal (ip) en ratón e intravenosa (iv) o subcutánea (sc) en humano. Se puede usar cualquier dispositivo adecuado para inyección o infusión parenteral de formulaciones de fármacos para dicha administración. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede estar contenida en una jeringa precargada estéril.
Otro aspecto de la presente invención es un kit farmacéutico que comprende (i) un polipéptido soluble como se definió anteriormente y (ii) un fármaco anticoagulante o antiplaquetario distinto de dicho polipéptido soluble. En una realización, el polipéptido soluble y el fármaco anticoagulante o antiplaquetario están contenidos en composiciones separadas.
El término "fármaco anticoagulante o antiplaquetario" se refiere a heparinas, inhibidores directos de la trombina (DTI), inhibidores directos o selectivos del Factor Xa (xaban) y antagonistas de la vitamina K (VKA). Por lo tanto, los "fármacos anticoagulantes o antiplaquetarios" pueden incluir heparinas naturales o sintéticas. El término "fármaco anticoagulante o antiplaquetario" también significa que incluye sustancias que evitan la coagulación de la sangre mediante la inhibición directa o selectiva de la trombina o el Factor Xa. En otra realización, la sustancia anticoagulante es un antagonista de la vitamina K.
En algunas realizaciones, el fármaco anticoagulante o antiplaquetario se selecciona de
(i) una heparina, en particular una heparina no fraccionada (UFH) o una heparina de bajo peso molecular (LMWH),
(ii) un inhibidor directo de la trombina (DTI), en particular dabigatrán, melagatran, argatroban, hirudina, lepirudina, bivalirudina, ximelagatran o desirrudina (Di Nisio et al. N Engl J Med. 2005; 353: 1028-40),
(iii) un inhibidor directo o selectivo del Factor Xa (xaban), en particular rivaroxaban (Eriksson et al., Circulation.
114: 2374-81), apixaban (Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 27: 1238-47), betrixaban, edoxabán, otamixaban (Cohen et al., Circulation 115: 2642-51) o fondaparinux (Peters et al., Eur. Heart J. 29: 324-31) y,
(iv) un antagonista de la vitamina K (VKA), en particular fenprocumón, acenocumarol o warfarina y moléculas relacionadas que contienen 4-hidroxicumarina, cumatetralilo, dicumarol, biscumacetato de etilo, clorindiona, difenandiona, fenandiona o tioclomarol (véase, por ejemplo, Ansell et al., 2008, "Pharmacology and management of the vitamin K antagonists", American College of Chest Physicians Evidence-Based Clinical Practice Guidelines el American College of Chest Physicians (8a edición). Chest 133 (Suplemento): 160S-198S).
Otro aspecto de la presente invención es un kit farmacéutico que comprende (i) un polipéptido soluble como se definió anteriormente y (ii) un fármaco antiplaquetario o anticoagulante distinto de dicho polipéptido soluble, para uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento de un enfermedad trombótica
Tratamiento de enfermedad trombótica
El polipéptido soluble de la invención puede usarse para tratar o prevenir enfermedades trombóticas.
Un "trastorno trombótico" o "enfermedad trombótica" usado en el presente documento es cualquier trastorno o enfermedad caracterizada por la formación de un trombo (coágulo sanguíneo) que obstruye o disminuye el flujo sanguíneo. El trombo puede permanecer local en el lugar donde se formó, o puede desprenderse para ocluir el flujo sanguíneo más adelante (tromboembolismo). En algunas realizaciones, puede ocurrir una trombosis en una vena (trombosis venosa) o en una arteria (trombosis arterial) en cualquier parte del cuerpo, incluidos el corazón y el cerebro. Cuando la trombosis ocurre en la circulación coronaria, se conoce como trombosis coronaria. Cuando la trombosis ocurre en la circulación cerebral, se conoce como trombosis cerebral.
Un trastorno trombótico puede incluir una trombosis venosa, arterial o capilar, formación de trombos en el corazón, tromboembolismo crónico y/o agudo (por ejemplo, embolia pulmonar, tromboembolismo cerebral después de la formación de trombo inducido por fibrilación auricular (por ejemplo, prevención de accidente cerebrovascular en fibrilación auricular (SPAF)), formación de trombos como resultado del contacto de la sangre de un sujeto humano o animal con una superficie artificial (por ejemplo, en pacientes con reemplazos valvulares, en particular una válvula cardíaca mecánica, cánulas intraluminales, intervención coronaria percutánea (PCI), oxigenación de la membrana extracorpórea (ECMO) o padecer una cirugía de derivación cardiopulmonar (cirugía CPB). El trombo puede causar o aumentar el riesgo de accidente cerebrovascular, accidente cerebrovascular isquémico agudo, infarto de miocardio, angina inestable, trombosis venosa profunda (DVT), trombosis de la vena porta, tromboembolismo, trombosis de la vena renal, trombosis de la vena yugular, trombosis del seno venoso cerebral, síndrome de Budd-Chiari, enfermedades de Paget-Schroetter o isquemia cerebral silenciosa (SBI). Una enfermedad trombótica de acuerdo con esta invención puede incluir además embolia pulmonar, aterosclerosis, factor V de Leiden, deficiencia de antitrombina III, deficiencia de proteína C, deficiencia de proteína S, mutación del gen de protrombina (G20210A), hiperhomocisteinemia, síndrome de anticuerpo antifosfolípido, anticuerpo anticardiolipina, síndrome de trombosis, síndrome de lupus anticoagulante, neoplasia maligna, cirugía mayor, inmovilización, uso de anticonceptivos orales, uso de talidomida, especialmente en combinación con dexametasona, trombocitopenia inducida por heparina, embarazo, trastornos mieloproliferativos, enfermedad inflamatoria intestinal, síndrome nefrótico, hemoglobinuria paroxística nocturna, síndrome de hiperviscosidad, macroglobulinemia de Waldenstrom, y trauma. El término enfermedad trombótica también se refiere a trombosis inducida por el cáncer, por ejemplo, mieloma múltiple y otros cánceres hematológicos, adenocarcinoma, cáncer de páncreas, estómago, ovarios, próstata, colon, pulmón, cerebro, mama, riñón, piel, cuello uterino y cáncer de oído-nariz-garganta.
El término "enfermedad trombótica" incluye particularmente afecciones tromboinflamatorias. Trombo-inflamación significa estados de enfermedad, en los que las cascadas protrombóticas y proinflamatorias actúan en conjunto y están mecánicamente vinculadas para promover la progresión de la enfermedad y el daño a los órganos. Los estados de enfermedad trombo-inflamatoria incluyen afecciones de daño orgánico postisquémico, tal como lesión por isquemia/reperfusión (lesión I/R) del cerebro (en accidente cerebrovascular isquémico agudo), pulmón, hígado, colon, miocardio o músculo esquelético, pero también afecciones inflamatorias sistémicas tales como sepsis o choque séptico.
Preferiblemente, la enfermedad trombótica se selecciona del grupo que consiste en afecciones tromboinflamatorias, trombosis venosa, trombosis arterial, trombosis capilar, trombosis de vena porta, trombosis de vena renal, trombosis de vena yugular, trombosis de seno venoso cerebral, formación de trombo durante o después de contactar sangre con una superficie artificial, en particular oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO), aterosclerosis, artritis, coagulopatía, trombosis venosa profunda (DVT), coagulopatía intravascular diseminada (DIC), tromboembolismo crónico o agudo, tromboembolismo pulmonar, síndrome de Budd-Chiari, Enfermedades de Paget-Schroetter, accidente cerebrovascular e infarto de miocardio.
La determinación de la dosificación efectiva, el número total de dosis y la duración del tratamiento con un polipéptido soluble de la invención está dentro de las capacidades de los expertos en la materia, y puede determinarse usando un estudio de aumento de dosis estándar. La dosificación de un polipéptido soluble de la invención a administrar variará de acuerdo con el polipéptido soluble particular, el sujeto y la naturaleza y gravedad de la enfermedad, la condición física del sujeto, el régimen terapéutico (por ejemplo, si un segundo agente terapéutico se usa), y la ruta de administración seleccionada; la dosis apropiada puede ser determinada fácilmente por un experto en la materia. El programa de dosificación puede variar de una vez al mes a diariamente dependiendo de una serie de factores clínicos, que incluyen el tipo particular de enfermedad, la gravedad de la enfermedad y la sensibilidad del paciente al polipéptido soluble de la invención. En realizaciones específicas, se administra un polipéptido soluble de la invención, dos veces a la semana, cada 5 días, una vez a la semana, cada 10 días, cada dos semanas, cada tres semanas, cada cuatro semanas o una vez al mes, o en cualquier intervalo entre dos de los valores anteriores, por ejemplo, de cada semana a cada mes, de cada 10 días a cada dos semanas, o de dos a tres veces por semana, etc. Un experto en la materia reconocerá que la cantidad óptima y el espaciamiento de las dosificaciones individuales de un polipéptido soluble de la invención estarán determinadas por la naturaleza y el grado de la afección a tratar, la forma, la ruta y el sitio de administración, y la edad y el estado del sujeto particular que se está tratando, y que un médico determinará en última instancia las dosis apropiadas que se utilizarán. Esta dosis puede repetirse tantas veces como sea apropiado. Si se desarrollan efectos secundarios, la cantidad y/o frecuencia de la dosis puede alterarse o reducirse, de acuerdo con la práctica clínica normal.
Tabla 4: Resumen de las secuencias ue se muestran en el listado de secuencias
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Ejemplos
Resultados
Ejemplo 1: La GPV soluble tiene un efecto antitrombótico
Con el fin de investigar un posible efecto de sGPV sobre la formación de trombos in vivo en un modelo de lesión mecánica de la aorta abdominal, se inyectaron 20 |jg de sGPV humana (shGPV) por vía intravenosa en ratones de tipo silvestre directamente antes del experimento. Dentro de los 8 minutos posteriores a la lesión aórtica, el flujo sanguíneo se detuvo debido a la formación de trombos oclusivos en ratones de control inyectados con PBS (Figura 1). El tratamiento previo con ratones de tipo silvestre protegidos con sGPV contra la formación de trombos oclusivos arteriales indica que el shGPV tiene un efecto antitrombótico (Figura 1).
Ejemplo 2: La GPV humana soluble protege del accidente cerebrovascular isquémico
Para evaluar el papel de la GPV soluble en el infarto cerebral después de la isquemia cerebral focal, los ratones fueron sometidos a una oclusión transitoria de la arteria cerebral media de 60 minutos (tMCAO), y el volumen del infarto se evaluó después de 24 horas. Sorprendentemente, los volúmenes de infarto en ratones de tipo silvestre tratados con shGPV-AFP se redujeron significativamente en comparación con los ratones de tipo silvestre (Figura 2). Por lo tanto, el tratamiento previo con GPV humana soluble proporciona protección contra la progresión del infarto cerebral.
Ejemplo 3: La GPV humana soluble no tiene efecto sobre los tiempos de sangrado de la cola
Para evaluar el papel de la GPV soluble en la hemostasia, los ratones tratados con vehículo o 20 jg de GPV humana soluble (shGPV) se sometieron al ensayo del tiempo de sangrado de la cola. Se extrajo un segmento de 2 mm de la punta de la cola con un bisturí. El sangrado de la cola se controló absorbiendo suavemente sangre con papel de filtro a intervalos de 20 segundos sin contactar directamente el sitio de la herida. Cuando no se observó sangre en el papel, se determinó que el sangrado había cesado (Figura 3). Estos datos demuestran que las dosis de shGPV que ejercen efectos antitrombóticos (Figura 1) no afectan la hemostasia, lo que indica que shGPV es un agente antitrombótico seguro.
Ejemplo 4: Adhesión a colágeno bajo flujo in vitro
Para evaluar el papel de la GPV soluble en la formación de trombos en el colágeno bajo flujo en un ensayo in vitro, se incubó sangre completa anticoagulada con 20 jg de GPV soluble durante 5 minutos y se perfundió sobre una superficie recubierta de colágeno. La sangre humana tratada previamente con shGPV-AFP (A) o la sangre de tipo silvestre tratada previamente con GPV murina soluble (B) exhibió una cobertura superficial significativamente reducida y una formación de trombo reducida. Por lo tanto, el ensayo de adhesión de flujo in vitro modela las condiciones in vivo en gran medida y reproduce el fenotipo in vivo.
Materiales y Procedimientos para los Ejemplos 1-4
Ratones
Los estudios en animales fueron aprobados por el gobierno del distrito de la Baja Franconia (Bezirksregierung Unterfranken).
GPV soluble
1. GPV humana soluble (shGPV)
La GPV humana soluble (aa 1-518 de GPV humana madura) se expresó de forma recombinante en células de insecto transfectadas con baculovirus, se purificó usando una columna de ácido nitrilotriacético estándar (Ni-NTA) y se resolvió en tampón PBS. La pureza se verificó utilizando SDS PAGE estándar.
Secuencia de aminoácidos de shGPV madura (péptido señal no mostrado):
QPFPCPPACKCVFRDAAQCSGGDVARISALGLPTNLTHILLFGMGRGVLQSQSFSGMTVLQRLMISDSHISAVAP
GTFSDLIKLKTLRLSRNKITHLPGALLDKMVLLEQLFLDHNALRGIDQNMFQKLVNLQELALNQNQLDFLPASLF
TNLENLKLLDLSGNNLTHLPKGLLGAQAKLERLLLHSNRLVSLDSGLLNSLGALTELQFHRNHIRSIAPGAFDRL
PNLSSLTLSRNHLAFLPSALFLHSHNLTLLTLFENPLAELPGVLFGEMGGLQELWLNRTQLRTLPAAAFRNLSRL
RYLGVTLSPRLSALPQGAFQGLGELQVLALHSNGLTALPDGLLRGLGKLRQVSLRRNRLRALPRALFRNLSSLES
VQLDHNQLETLPGDVFGALPRLTEVLLGHNSWRCDCGLGPFLGWLRQHLGLVGGEEPPRCAGPGAHAGLPLWALP
GGDAECPGPRGPPPRPAADSSSEAPVHPALAPNSSEPWVWAQPVTTGKGQDHSPFWGFYFLLLAVQAHHHiTHHH.fi
HH (SEQ ID NO:4)
(Cursiva: etiqueta poli-His)
2. GPV humana soluble fusionada a albúmina (shGPV-AFP)
La shGPV-AFP se expresó en células CHO K1 y se produjo en un sistema de fermentación de perfusión. La cosecha libre de células se concentró 30 veces usando un sistema TFF (por ejemplo, Centramate 500 S Pall) con una membrana de 30 kD (por ejemplo, Centramate OS030T12). Ese concentrado se enriqueció con NaCl y EDTA hasta una concentración final de 0,75 mol/l de NaCl y 5 mmol/l de EDTA y se cargó durante la noche en una columna CaptureSelect de Albúmina humana (Life Technologies) que se equilibró previamente con tampón Tris 20 mM, pH 7,4. Después de lavar la columna con tampón de equilibrio, se eluyó la shGPV-AFP con Tris 20 mM más tampón de MgCl 2 M pH 7,4. El eluato se concentró y se dializó contra Tris 50 mM NaCl 150 mM, pH 7,4 usando filtros de ultrafiltración con un corte de 30 kD (por ejemplo, Amicon Ref. UFC903024).
Secuencia de aminoácidos de shGPV-AFP madura (péptido señal no mostrado):
QPFPCPPACKCVFRDAAQCSGGDVARISALGLPTNLTHILLFGMGRGVLQSQSFSGMTVLQRLMISDSHISAVAP GTFSDLIKLKTLRLSRNKITHLPGALLDKMVLLEQLFLDHNALRGIDQNMFQKLVNLQELALNQNQLDFLPASLF TNLENLKLLDLSGNNLTHLPKGLLGAQAKLERLLLHSNRLVSLDSGLLNSLGALTELQFHRNHIRSIAPGAFDRL PNLSSLTLSRNHLAFLPSALFLHSHNLTLLTLFENPLAELPGVLFGEMGGLQELWLNRTQLRTLPAAAFRNLSRL RYLGVTLSPRLSALPQGAFQGLGELQVLALHSNGLTALPDGLLRGLGKLRQVSLRRNRLRALPRALFRNLSSLES VQLDHNQLETLPGDVFGALPRLTEVLLGHNSWRCDCGLGPFLGWLRQHLGLVGGEEPPRCAGPGAHAGLPLWALP GGDAECPGPPAMGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQ QCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKD DNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKL DELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDR ADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLY EYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNAL LVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLV NRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEK CCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL (SEQ ID NO:9)
(Subrayado: sitio de escisión de trombina y conector de GGS; cursiva: secuencia de albúmina humana)
3. GPV murina soluble (smGPV)
La GPV murina soluble (aa 1-519 de GPV murina madura) se expresó recombinantemente en células CHO, se purificó usando una columna anti-Flag y se resolvió en tampón de PBS. La pureza se verificó utilizando SDS PAGE estándar.
Secuencia de aminoácidos de smGPV madura (péptido señal no mostrado):
QPFPCPKTCKCWRDAAQCSGGSVAHIAELGLPTNLTHILLFRMDQGILRNHSFSGMTVLQRQMLSDSHISAIDP GTFNDLVKLKTLRLTRNKISRLPRAILDKMVLLEQLFLDHNALRDLDQNLFQQLRNLQELGLNQNQLSFLPANLF SSLRELKLLDLSRNNLTHLPKGLLGAQVKLEKLLLYSNQLTSVDSGLLSNLGALTELRLERNHLRSVAPGAFDRL GNLSSLTLSGNLLESLPPALFLHVSSVSRLTLFENPLEELPDVLFGEMAGLRELWLNGTHLSTLPAAAFRNLSGL QTLGLTRNPRLSALPRGVFQGLRELRVLGLHTNALAELRDDALRGLGHLRQVSLRHNRLRALPRTLFRNLSSLES VQLEHNQLETLPGDVFAALPQLTQVLLGHNPWLCDCGLWRFLQWLRHHPDILGRDEPPQCRGPEPRASLSFWELL
QGDPWCPDPRSLPLDPPTENALEAPVPSWLPNSWQSQTWAQLVARGESPNNRLECGRNPAFLYKWLEMDYADDD DK (SEQ ID NO:8)

Claims (18)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido soluble que comprende una glicoproteína V modificada (GPV) que carece de un dominio transmembrana funcional para su uso en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad trombótica en un sujeto, dicho tratamiento o prevención comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de dicho polipéptido soluble, en el que el polipéptido soluble es incapaz de integrarse en una membrana celular a través de dicho dominio transmembrana,
en el que el término GPV denota una proteína que tiene una identidad de secuencia de al menos 70% con respecto a la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID No: 3.
2. El polipéptido soluble para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la enfermedad trombótica se selecciona del grupo que consiste en afecciones tromboinflamatorias, trombosis venosa, trombosis arterial, trombosis capilar, trombosis de vena porta, trombosis de vena renal, trombosis de vena yugular, trombosis del seno venoso cerebral, formación de trombos durante o después de contactar sangre con una superficie artificial, en particular oxigenación por membrana extracorpórea (ECMO), aterosclerosis, artritis, coagulopatía, trombosis venosa profunda (DVT), coagulopatía intravascular diseminada (DIC), un tromboembolismo crónico o agudo, tromboembolismo pulmonar, síndrome de Budd-Chiari, enfermedades de Paget-Schroetter, accidente cerebrovascular e infarto de miocardio.
3. El polipéptido soluble para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha GPV modificada es una GPV truncada.
4. El polipéptido soluble para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha GPV modificada consiste en un fragmento del dominio extracelular de una GPV nativa, en el que dicho fragmento carece del dominio transmembrana de dicha GPV nativa.
5. El polipéptido soluble para uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicha GPV nativa consiste en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 3.
6. El polipéptido soluble para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho polipéptido soluble es un polipéptido que no se produce naturalmente.
7. El polipéptido soluble para uso de acuerdo con la reivindicación 6, que comprende además un resto que prolonga la semivida.
8. El polipéptido soluble para uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicha resto que prolonga la semivida se conjuga con dicha GPV modificada.
9. El polipéptido soluble para uso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicho resto que prolonga la semivida se selecciona del grupo que consiste en hidroxietilalmidón (HES), polietilenglicol (PEG), ácidos polisiálicos (PSA) y ligandos de unión a albúmina, por ejemplo, cadenas de ácidos grasos.
10. El polipéptido soluble para uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho resto que prolonga la semivida es una secuencia de aminoácidos heteróloga fusionada a dicha GPV modificada, ya sea directamente o mediante un conector.
11. El polipéptido soluble para uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la secuencia de aminoácidos heteróloga que prolonga la semivida comprende o consiste en un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en albúmina y un fragmento de la misma que tiene una longitud de al menos 100 aminoácidos, regiones constantes de inmunoglobulina y fragmentos de la misma, en particular el fragmento Fc, la transferrina y sus fragmentos, el péptido del terminal C de la gonadotropina coriónica humana, cadenas aleatorias solvatadas con gran volumen hidrodinámico (XTEN), repeticiones de homo-aminoácidos (HAP), repeticiones de prolina-alanina-serina (PAS), afamina, alfafetoproteína, proteína de unión a la vitamina D, polipéptidos capaces de unirse en condiciones fisiológicas a regiones constantes de albúmina o inmunoglobulina, y combinaciones de los mismos.
12. El polipéptido soluble para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho polipéptido soluble se puede obtener mediante expresión recombinante en células de mamífero.
13. El polipéptido soluble para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho tratamiento y/o prevención comprende además administrar a dicho sujeto un fármaco antiplaquetario o anticoagulante.
14. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido soluble como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
15. La composición farmacéutica de la reivindicación 14, en la que dicho polipéptido soluble no consiste en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 10.
16. Un procedimiento para preparar el polipéptido soluble de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende expresar un ácido nucleico que codifica el polipéptido soluble como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en una célula de mamífero, y recuperar el polipéptido soluble del medio de cultivo.
17. Un polipéptido soluble como se define en la reivindicación 6, en el que la glicoproteína V modificada (GPV) es una GPV soluble no natural.
18. Un kit farmacéutico que comprende (i) un polipéptido soluble de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y (ii) un fármaco antiplaquetario o anticoagulante distinto de dicho polipéptido soluble.
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