CN114072420A - 用于增加凝血因子viii的体外稳定性的截短的血管性血友病因子(vwf) - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含截短的血管性血友病因子(VWF)的多肽用于增加凝血因子VIII(FVIII)在包含所述FVIII和所述多肽的组合物中的体外稳定性的用途，其中所述多肽与所述FVIII在组合物中的摩尔比大于20。

Description

用于增加凝血因子VIII的体外稳定性的截短的血管性血友病 因子(VWF)

发明领域

本发明涉及用于改善凝血因子VIII(FVIII)的体外稳定性的方法，具体而言，涉及包含截短的血管性血友病因子(VWF)的多肽用于增加凝血因子VIII(FVIII)的体外稳定性的用途。

发明背景

因子VIII(FVIII)是一种在血浆中发现的蛋白质，它在导致血液凝固的级联反应中充当辅助因子。血液中FVIII活性量的缺陷导致称为血友病A的凝血障碍，这是一种主要影响男性的遗传性疾病。目前采用来源于人血浆或使用重组DNA技术制造的FVIII治疗制剂治疗血友病A。一般来说，这种制剂要么对出血事件作出反应(按需治疗)，要么以频繁、定期的间隔施用，以防止不受控制的出血(预防)。

已知FVIII在治疗制剂中相对不稳定。在血浆中，FVIII通常与另一种血浆蛋白血管性血友病因子(VWF)复合，VWF被认为可以保护FVIII免于过早降解。目前销售的FVIII制剂通常依赖于使用白蛋白和/或天然VWF在制造过程中和储存期间稳定FVIII。

已经描述了几种在没有白蛋白或天然VWF(或这些赋形剂水平相对较低)的情况下配制FVIII的尝试。例如，美国专利号5,565,427(EP 0 508 194)描述了这样的FVIII制剂，除了氯化钠和蔗糖等赋形剂外，其还含有洗涤剂和氨基酸、特别是精氨酸和甘氨酸的特定组合。

美国专利号5,763,401(EP 0 818 204)也描述了一种治疗性FVIII制剂，其包含15-60mM蔗糖，至多50mM NaCl，至多5mM氯化钙，65-400mM甘氨酸和至多50mM组氨酸。

美国专利号5,733,873(EP 627 924)描述了包括0.01-1mg/ml的表面活性剂的制剂。还描述了使用低或高浓度氯化钠的其他尝试。美国专利号4,877,608(EP 0 315 968)公开了氯化钠浓度相对较低即0.5mM至15mM NaCl的制剂。另一方面，美国专利号5,605,884(EP 0 314 095)教导使用氯化钠浓度相对较高的制剂。

其他FVIII制剂描述于WO 2010/054238、EP 1 712 223、WO 2000/48635、WO 96/30041、WO 96/22107、WO 2011/027152、EP 2 361 613、EP 0 410 207、EP 0 511 234、US5565427、EP 0 638 091、EP 0 871 476、EP 0 819 010、US 5874408、US 2005/0256038、US2008/0064856、WO 2005/058283、WO 2012/037530和WO 2014/026954中。

VWF来源的多肽，特别是VWF片段，已被描述可以在体内改善FVIII的生物利用度。WO 2013/106787 A1涉及包含FVIII蛋白和某些VWF片段的嵌合蛋白。那些FVIII和VWF片段的嵌合异二聚体确实具有1:1的VWF与FVIII的固定摩尔比。

WO 2014/198699 A2和WO 2013/083858 A2描述了VWF片段及其在血友病治疗中的用途。已经发现，在血管外与相似摩尔量的VWF片段共施用时，FVIII的生物利用度可得到显著改善。WO 2018/087271 A1和WO 2016/188907 A1描述了用于治疗或预防血友病的截短的VWF多肽。WO 2016/000039 A1、WO 2017/117630 A1和WO 2017/117631A1描述了能够与FVIII结合的修饰的VWF多肽。

WO 2011/060242 A2公开了包含某些VWF片段和抗体Fc区的融合多肽，其建议了至多10:1的VWF片段与FVIII的特定摩尔比。此外，没有提供关于所述Fc融合构建体的体内数据。

Yee et al.(2014)Blood 124(3):445-452发现，含有融合至免疫球蛋白G1的Fc部分的D'D3结构域的VWF片段足以稳定VWF缺陷小鼠中的内源性因子VIII。因此，在VWF缺陷小鼠中，FVIII的内源性表达率增加或内源性表达FVIII的消除率降低。然而，尽管VWF D'D3-Fc融合蛋白在输注到FVIII缺陷小鼠体内时表现出显著延长的存活期，但VWF D'D3-Fc融合蛋白并没有延长共输注FVIII的存活期。

WO 2015/185758 A2描述了包含FVIII和一种或多种VWF肽的复合物的组合物，其中VWF肽至少包含人VWF(UniProtKB-P04275)的氨基酸764至1035和1691至1905，但不含人VWF的氨基酸2255至2645。通过用金黄色葡萄球菌(S.aureus)V-8蛋白酶消化血浆来源的VWF，制备了由人VWF的氨基酸764-2128组成的VWF片段(“片段III”)。该片段与胶原蛋白III和肝素结合。在根据片段III单体亚基计算以五倍摩尔过量加入时，片段III稳定溶液中rFVIII。WO 2015/185758A2没有显示缺乏氨基酸1691至1905的VWF肽的稳定作用。WO 2015/185758 A2没有公开任何大于20的VWF肽与FVIII的比例。

继续存在对在体外稳定FVIII制剂的方式和方法的需要。

发明概述

本申请的发明人出乎意料地发现，包含VWF的D’D3结构域的VWF片段在体外增加FVIII的稳定性，其中VWF片段与FVIII的摩尔比大于20。

因此，本发明涉及在以下项目[1]至[80]中定义的主题：

[1]包含截短的血管性血友病因子(VWF)的多肽用于增加包含凝血因子VIII(FVIII)和所述多肽的组合物中所述FVIII的体外稳定性的用途，其中组合物中所述多肽与所述FVIII的摩尔比大于20。

[2]根据项目[1]所述的用途，其中所述多肽增加所述FVIII的储存稳定性。

[3]根据项目[1]或[2]所述的用途，其中所述组合物不含蛋白酶。

[4]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述组合物不含野生型VWF。

[5]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述FVIII是重组产生的FVIII或者是血浆来源的FVIII。

[6]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述摩尔比是至少50。

[7]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述摩尔比大于50。

[8]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述摩尔比是至少60。

[9]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述摩尔比是至少75。

[10]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述摩尔比是至少100。

[11]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述摩尔比是至少200。

[12]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述摩尔比是至少300。

[13]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述摩尔比是至少400。

[14]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述摩尔比是至少500。

[15]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述摩尔比是至少600。

[16]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述摩尔比是至少700。

[17]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述摩尔比小于10,000。

[18]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述摩尔比从大于20至小于10,000。

[19]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述摩尔比是约25至约9,000。

[20]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述摩尔比是约50至约7,500。

[21]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述摩尔比是约50至约6,000。

[22]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述摩尔比是约60至约5,000。

[23]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述摩尔比是约75至约4,000。

[24]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述摩尔比是约100至约3,000。

[25]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述摩尔比是约200至约2,500。

[26]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述摩尔比是约300至约2,000。

[27]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述摩尔比是约400至约1,750。

[28]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述摩尔比是约500至约1,500。

[29]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述摩尔比是约600至约1,250。

[30]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述摩尔比是约700至约1,000。

[31]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述用途包括向所述FVIII添加超过20倍摩尔过量的所述多肽，从而稳定所述FVIII。

[32]根据项目[31]所述的用途，其中所述摩尔过量为至少25倍、或至少50倍、或大于50倍、或至少60倍、或至少75倍、或至少100倍、或至少200倍、或至少300倍、或至少400倍、或至少500倍、或至少600倍、或至少700倍。

[33]根据项目[31]或[32]所述的用途，其中所述摩尔过量是从大于20倍至小于10,000倍、或25倍至9,000倍、或50倍至7,500倍、或60倍至5,000倍、或75倍至4,000倍、或100倍至3,000倍、或200倍至2,500倍、或300倍至2,000倍、或400倍至1,750倍、或500倍至1,500倍、或600倍至1,250倍、或700倍至1,000倍。

[34]根据前述项目中任一项所述的用途，其中冷冻干燥和复原包含所述FVIII和所述多肽的组合物后FVIII的产率大于冷冻干燥和复原缺乏所述多肽的对照组合物后FVIII的产率。

[35]根据项目[34]所述的用途，其中冷冻干燥的组合物在冷冻干燥后不久被复原。

[36]根据项目[34]或[35]所述的用途，其中冷冻干燥过程中FVIII活性损失小于13％。

[37]根据项目[34]或[35]所述的用途，其中冷冻干燥过程中FVIII活性损失为11％或更少。

[38]根据项目[34]或[35]所述的用途，其中冷冻干燥过程中FVIII活性损失为10％或更少。

[39]根据项目[34]或[35]所述的用途，其中冷冻干燥过程中FVIII活性损失为8％或更少。

[40]根据项目[34]或[35]所述的用途，其中冷冻干燥过程中FVIII活性损失为5％或更少。

[41]根据项目[34]或[35]所述的用途，其中冷冻干燥过程中FVIII活性损失小于3％。

[42]根据项目[34]或[35]所述的用途，其中冷冻干燥过程中FVIII活性损失为2％或更少。

[43]根据项目[1]至[33]中任一项所述的用途，其中包含所述FVIII和所述多肽的冷冻干燥的组合物在25℃储存期间FVIII活性损失小于缺乏所述多肽的冷冻干燥的对照组合物的FVIII活性损失。

[44]根据项目[43]所述的用途，其中所述储存持续12个月的时间段。

[45]根据项目[43]所述的用途，其中在25℃储存期间FVIII活性损失小于20％，优选小于18％，更优选小于16％。

[46]根据项目[43]所述的用途，其中所述储存持续24个月的时间段。

[47]根据项目[43]所述的用途，其中在25℃储存期间FVIII活性损失小于30％，优选小于20％。

[48]根据项目[1]至[33]中任一项所述的用途，其中在25℃储存至少一周后，包含所述多肽和所述FVIII的液体组合物中FVIII活性大于缺乏所述多肽的对照组合物的FVIII活性。

[49]根据项目[48]所述的用途，其中在25℃储存一周FVIII活性损失小于10％。

[50]根据项目[48]所述的用途，其中在25℃储存四周FVIII活性损失小于20％或小于15％。

[51]根据前述实施方案中任一项使用的重组多肽，其中所述截短的VWF是人截短的VWF。

[52]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述截短的VWF包含与SEQ ID NO:4的氨基酸776至805具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，优选包含与SEQ ID NO:4的氨基酸764至1242具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。

[53]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述截短的VWF缺乏SEQ ID NO:4的氨基酸1243至2813。

[54]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述截短的VWF由以下任一组成：(a)SEQ ID NO:4的氨基酸764至1242，(b)与SEQ ID NO:4的氨基酸764至1242具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，或(c)(a)或(b)的片段。

[55]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述多肽以1μM或更小的解离常数K_D结合所述FVIII。

[56]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述多肽以1nM或更小的解离常数K_D结合所述FVIII。

[57]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述多肽以0.1nM或更小的解离常数K_D结合所述FVIII。

[58]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述多肽包含半衰期延长部分(HLEM)。

[59]根据项目[58]所述的用途，其中所述HLEM是与所述截短的VWF融合的异源氨基酸序列。

[60]根据项目[59]所述的用途，其中所述异源氨基酸序列包含蛋白或肽或由其组成，所述蛋白或肽选自转铁蛋白及其片段、人绒毛膜促性腺激素的C端肽、XTEN序列、高氨基酸重复序列(HAP)、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸重复序列(PAS)、白蛋白及其片段、afamin、甲胎蛋白、维生素D结合蛋白、在生理条件下能够与白蛋白或免疫球蛋白恒定区结合的多肽、能够与新生儿Fc受体(FcRn)、特别是免疫球蛋白恒定区及其部分、优选免疫球蛋白的Fc部分结合的多肽，以及它们的组合。

[61]根据项目[58]所述的用途，其中所述HLEM缀合至包含所述截短的VWF的多肽。

[62]根据项目[61]所述的用途，其中所述HLEM缀合至包含所述截短的VWF的多肽的C端。

[63]根据项目[61]或[62]所述的用途，其中所述HLEM选自羟乙基淀粉(HES)，聚乙二醇(PEG)，聚唾液酸(PSA)，弹性蛋白样多肽，类肝素(heparosan)聚合物，透明质酸和非蛋白质白蛋白结合配体，例如脂肪酸链，以及它们的组合。

[64]根据项目[58]所述的用途，其中所述HLEM非共价连接至包含所述截短的VWF的多肽。

[65]根据项目[1]至[60]中任一项所述的用途，其中包含所述截短的VWF的多肽不含任何缀合至所述多肽的HLEM。

[66]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述多肽是包含N-聚糖的糖蛋白，并且其中至少50％、至少75％、优选至少85％的所述N-聚糖平均包含至少一个唾液酸部分。

[67]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述多肽作为二聚体存在或者至少具有高比例的二聚体。

[68]根据项目[67]所述的用途，其中所述多肽的至少50％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少95％以二聚体存在。

[69]根据项目[67]或[68]所述的用途，其中所述二聚体是同二聚体，并且形成所述二聚体的两个单体彼此通过所述截短的VWF内的半胱氨酸残基形成的至少一个或多个二硫键共价连接。

[70]根据项目[69]所述的用途，其中形成一个或多个二硫键的半胱氨酸残基选自Cys-1099、Cys-1142、Cys-1222、Cys-1225、Cys-1227及其组合，优选Cys-1099和Cys-1142，其中氨基酸编码参考SEQ ID NO:4。

[71]根据项目[67]至[70]中任一项所述的用途，其中所述二聚体与FVIII的亲和力大于单体多肽与FVIII的亲和力，所述单体多肽具有与二聚体多肽的单体亚单位相同的氨基酸序列。

[72]根据项目[67]至[71]中任一项所述的用途，其中所述多肽的二聚体:单体之比为至少1.5，优选至少2，更优选至少2.5或至少3，或至少4，或至少5，或至少10，或至少20；或其中所述多肽不含单体和/或多聚体形式的所述多肽；或其中所述多肽基本上不含单体和/或多聚体形式的所述多肽。

[73]根据项目[67]至[72]中任一项所述的用途，其中二聚体多肽具有这样的FVIII结合亲和力，其特征在于小于1μM，优选小于1nM，更优选小于500pM，小于200pM，小于100pM，小于90pM或小于80pM的解离常数K_D。

[74]根据项目[73]所述的用途，其中K_D范围为0.1pM至500pM、0.5pM至200pM、0.75pM至100pM或最优选1pM至80pM。

[75]根据前述项目中任一项所述的用途，其中与野生型VWF的氨基酸序列相比，所述多肽包含至少一个氨基酸置换，其中与除了修饰以外具有相同氨基酸序列的参考多肽的结合亲和力相比，优选通过引入所述至少一个置换来进一步增加这种修饰多肽与FVIII的结合亲和力。

[76]根据项目[75]所述的用途，其中所述至少一个置换选自以下的组合：S764G/S766Y,S764P/S766I,S764P/S766M,S764V/S766Y,S764E/S766Y,S764Y/S766Y,S764L/S766Y,S764P/S766W,S766W/S806A,S766Y/P769K,S766Y/P769N,S766Y/P769R,S764P/S766L和S764E/S766Y/V1083A，其氨基酸编码参考SEQ ID NO:4的序列。

[77]根据项目[76]所述的用途，其中所述至少一个置换为组合S764E/S766Y或S764E/S766Y/V1083A。

[78]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述组合物是制剂。

[79]根据项目[78]所述的用途，其中所述制剂适用于治疗或预防凝血障碍。

[80]根据项目[79]所述的用途，其中所述凝血障碍是血友病A。

详述

本发明涉及包含截短的血管性血友病因子(VWF)的多肽用于增加凝血因子VIII(FVIII)在包含所述FVIII和所述多肽的组合物中的体外稳定性的用途，其中所述多肽与所述FVIII在组合物中的摩尔比大于20。

在本文中，血管性血友病因子(VWF)的多肽会被称为“本发明的多肽”。本发明的多肽优选包含半衰期延长部分。

比率

如下文更详细描述的，本发明的多肽可以是单体、二聚体或其混合物。根据本发明的任意摩尔比是指本发明的多肽的单体亚单位的摩尔浓度的比率，无论其是实际以单体、二聚体还是寡聚体的形式存在。相对于共配制的FVIII的摩尔浓度形成比率。除非另有说明，否则本发明的多肽相对于FVIII的任何比率在本申请中均指本发明的多肽中所含的单体亚单位(其优选以二聚体形式存在)的量(以摩尔为单位)除以FVIII的量(以摩尔为单位)。作为非限制性实例，100μM本发明的单体多肽与1μM的FVIII共配制意味着100的比率。如果将50μM的本发明二聚肽与1μM的FVIII共配制，则获得相同的100的比率。

本发明的多肽与FVIII的摩尔比为20以上，或至少25，或至少50，或大于50，更优选地比率为至少60，或至少75，或至少100，或大于100，或至少200，最优选至少300，或至少400，或至少500，或至少600，或至少700，或至少800，或至少900，或至少1,000，或至少1,100，或至少1,200，或至少1,300，或至少1,400，或至少1,500，或至少1,600，或至少1,700，或至少1,800，或至少1,900，或至少2,000，或至少2,500，或至少3,000，或至少5,000，或至少8,000或至多10,000。本发明的多肽与FVIII的摩尔比可以根据某些实施方案不超过10,000的比率，5,000的比率，2,500的比率或2,000的比率。

本发明的多肽与FVIII的摩尔比的范围可以为从20以上至10,000，或从50以上至5,000，或从50以上至4,000，或从50以上至3,000，或从50以上至2,000，或从50以上至1,000。优选地，本发明的多肽与FVIII的摩尔比的范围为50至2,500，或75至2,000，或100至1,500，或150至1,000。

截短的VWF

如本文所用，术语血管性血友病因子(VWF)包括天然存在的(天然)VWF，但也包括其保留天然存在的VWF的至少FVIII结合活性的变体，例如，其中一个或多个残基已被入、缺失或置换的序列变体。通过实施例2中所述的FVIII-VWF结合测定确定FVIII结合活性。

根据本发明的优选的VWF是由SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列表示的人VWF。编码SEQ ID NO:4的cDNA显示在SEQ ID NO:3中。

编码人天然VWF的基因被转录成9kb的mRNA，该mRNA被翻译成2813个氨基酸的前多肽原，估计分子量为310,000Da。前多肽原包含N端22个氨基酸信号肽，接着是741个氨基酸的多肽原(SEQ ID NO:4的氨基酸23-763)和成熟亚单位(SEQ ID NO:4的氨基酸764-2813)。从N端切割741个氨基酸的多肽原得到由2050个氨基酸组成的成熟VWF。人天然VWF前多肽原的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:4中。除非另有说明，否则本申请中VWF残基的氨基酸编号是指SEQ ID NO:4，即使VWF分子(特别是截短的VWF)不含SEQ ID NO:4的所有残基。

天然VWF的多肽原包含多个结构域。不同结构域注释可见于文献中(参见例如Zhouet al.(2012)Blood 120(2):449-458)。天然VWF前多肽原的以下结构域注释适用于本申请：D1-D2-D'-D3-A1-A2-A3-D4-C1-C2-C3-C4-C5-C6-CK

参考SEQ ID NO:4，D’结构域由氨基酸764-865组成；D3结构域由氨基酸866-1242组成。

本发明术语中的特征“截短的”意味着多肽不含成熟VWF的整个氨基酸序列(例如SEQ ID NO:4的氨基酸764-2813)。截短的VWF不含SEQ ID NO:4的所有氨基酸764-2813，而是通常仅其一个片段。截短的VWF也可以称为一个VWF片段，或复数形式称为多个VWF片段。

通常，截短的VWF能够与因子VIII结合。优选地，截短的VWF能够与人天然因子VIII的成熟形式结合。在另一个实施方案中，截短的VWF能够与重组的FVIII结合，例如与本文所述的FVIII结合，例如由氨基酸序列SEQ ID NO:5组成的单链因子VIII。截短的VWF与因子VIII的结合可以通过实施例2中描述的FVIII-VWF结合测定来确定。

本发明的截短的VWF优选包含与SEQ ID NO:4的氨基酸776至805具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列或由其组成并且能够与FVIII结合。在优选的实施方案中，截短的VWF包含与SEQ ID NO:4的氨基酸776至805具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列或由其组成并且能够与FVIII结合。在一个实施方案中，截短的VWF包含SEQ ID NO:4的氨基酸776至805或由其组成。除非本文另有说明，否则在参考序列的整个长度上(例如SEQ ID NO:4的氨基酸776至805)确定序列同一性。

本发明的截短的VWF优选包含与SEQ ID NO:4的氨基酸766至864具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列或由其组成并且能够与FVIII结合。在优选的实施方案中，截短的VWF包含与SEQ ID NO:4的氨基酸766至864具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列或由其组成并且能够与FVIII结合。在一个实施方案中，截短的VWF包含SEQ ID NO:4的氨基酸766至864或由其组成。

在另一优选实施方案中，截短的VWF由(a)与SEQ ID NO:4的氨基酸764至1242具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列或(b)其片段组成，条件是截短的VWF仍然能够与FVIII结合。更优选地，截短的VWF由(a)与SEQ ID NO:4的氨基酸764至1242具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列或(b)其片段组成，条件是截短的VWF仍然能够与FVIII结合。在一个实施方案中，截短的VWF由(a)SEQ ID NO:4的氨基酸764至1242或(b)其片段组成，条件是截短的VWF仍然能够与FVIII结合。

如下文更详细描述的，可通过使用包含编码包含截短的VWF的多肽的核酸的细胞的方法制备本发明的多肽。通过本身已知的技术将核酸引入合适的宿主细胞。

在优选的实施方案中，宿主细胞中的核酸编码(a)与SEQ ID NO:4的氨基酸1至1242具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列或(b)其片段，条件是截短的VWF仍然能够与FVIII结合。更优选地，核酸编码(a)与SEQ ID NO:4的氨基酸1至1242具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列或(b)其片段，条件是截短的VWF仍然能够与FVIII结合。在一个实施方案中，核酸编码(a)与SEQ ID NO:4的氨基酸1至1242或(b)其片段，条件是截短的VWF仍然能够与FVIII结合。特别地，如果根据本发明的多肽是二聚体，核酸会包含也编码VWF(例如SEQ ID NO:4)的氨基酸1至763的序列，即使多肽中截短的VWF不含VWF(例如SEQ ID NO:4)的氨基酸1至763。

根据优选实施方案的本发明的重组多肽的截短的VWF可不含SEQ ID NO:4的VWF的氨基酸序列1至763。

根据进一步优选的实施方案，截短的VWF包含以下氨基酸序列之一或由其组成，所述氨基酸序列各自参考SEQ ID NO:4：

776-805；766-805；764-805；776-810；766-810；764-810；776-815；766-815；764-815；776-820；766-820；764-820；776-825；766-825；764-825；776-830；766-830；764-830；776-835；766-835；764-835；776-840；766-840；764-840；776-845；766-845；764-845；776-850；766-850；764-850；776-855；766-855；764-855；776-860；766-860；764-860；776-864；766-864；764-864；776-865；766-865；764-865；776-870；766-870；764-870；776-875；766-875；764-875；776-880；766-880；764-880；776-885；766-885；764-885；776-890；766-890；764-890；776-895；766-895；764-895；776-900；766-900；764-900；776-905；766-905；764-905；776-910；766-910；764-910；776-915；766-915；764-915；776-920；766-920；764-920；776-925；766-925；764-925；776-930；766-930；764-930；776-935；766-935；764-935；776-940；766-940；764-940；776-945；766-945；764-945；776-950；766-950；764-950；776-955；766-955；764-955；776-960；766-960；764-960；776-965；766-965；764-965；776-970；766-970；764-970；776-975；766-975；764-975；776-980；766-980；764-980；776-985；766-985；764-985；776-990；766-990；764-990；776-995；766-995；764-995；776-1000；766-1000；764-1000；776-1005；766-1005；764-1005；776-1010；766-1010；764-1010；776-1015；766-1015；764-1015；776-1020；766-1020；764-1020；776-1025；766-1025；764-1025；776-1030；766-1030；764-1030；776-1035；766-1035；764-1035；776-1040；766-1040；764-1040；776-1045；766-1045；764-1045；776-1050；766-1050；764-1050；776-1055；766-1055；764-1055；776-1060；766-1060；764-1060；776-1065；766-1065；764-1065；776-1070；766-1070；764-1070；776-1075；766-1075；764-1075；776-1080；766-1080；764-1080；776-1085；766-1085；764-1085；776-1090；766-1090；764-1090；776-1095；766-1095；764-1095；776-1100；766-1100；764-1100；776-1105；766-1105；764-1105；776-1110；766-1110；764-1110；776-1115；766-1115；764-1115；776-1120；766-1120；764-1120；776-1125；766-1125；764-1125；776-1130；766-1130；764-1130；776-1135；766-1135；764-1135；776-1140；766-1140；764-1140；776-1145；766-1145；764-1145；776-1150；766-1150；764-1150；776-1155；766-1155；764-1155；776-1160；766-1160；764-1160；776-1165；766-1165；764-1165；776-1170；766-1170；764-1170；776-1175；766-1175；764-1175；776-1180；766-1180；764-1180；776-1185；766-1185；764-1185；776-1190；766-1190；764-1190；776-1195；766-1195；764-1195；776-1200；766-1200；764-1200；776-1205；766-1205；764-1205；776-1210；766-1210；764-1210；776-1215；766-1215；764-1215；776-1220；766-1220；764-1220；776-1225；766-1225；764-1225；776-1230；766-1230；764-1230；776-1235；766-1235；764-1235；776-1240；766-1240；764-1240；776-1242；766-1242；764-1242；764-1464；764-1250；764-1041；764-828；764-865；764-1045；764-1035；764-1128；764-1198；764-1268；764-1261；764-1264；764-1459；764-1463；764-1464；764-1683；764-1873；764-1482；764-1479；764-1672；和764-1874。

在某些实施方案中，截短的VWF相对于成熟野生型VWF具有内部缺失。例如可缺失A1,A2,A3,D4,C1,C2,C3,C4,C5,C6,CK结构域或其组合，而保留D’结构域和/或D3结构域。根据进一步的是实施方案，截短的VWF缺乏结构域A1,A2,A3,D4,C1,C2,C3,C4,C5,C6或CK中的一个或多个。根据进一步的是实施方案，截短的VWF缺乏SEQ ID NO:4的氨基酸1243至2813，即结构域A1-A2-A3-D4-C1-C2-C3-C4-C5-C6-CK。

在进一步的实施方案中，截短的VWF不含血小板糖蛋白Ibα(GPIbα)、胶原蛋白和/或整合素αIIbβIII(C1结构域内的RGDS序列)的结合位点。在其他实施方案中，截短的VWF不含ADAMTS13的切割位点(Tyr1605-Met1606)，其位于VWF的中央A2结构域。在又一个其他实施方案中，截短的VWF不含GPIbα的结合位点和/或不含胶原蛋白的结合位点和/或不含整合素αIIbβIII的结合位点和/或它不含ADAMTS13的切割位点(Tyr1605-Met1606)，其位于VWF的中央A2结构域。在优选的实施方案中，截短的VWF不含SEQ ID NO:4的氨基酸1691至1905。在另一优选的实施方案中，截短的VWF不含如UniProtKB-P04275所存储的氨基酸序列的氨基酸1691至1905。在另一优选的实施方案中，截短的VWF不含人VWF的氨基酸1691至1905。

在一个实施方案中，多肽对血小板具有低亲和力，所述低亲和力的特征在于所述多肽结合GPIbα的解离常数K_D>1μM，优选K_D>10μM。

在另一实施方案中，多肽不含VWF结构域A1和/或A3或其一部分，并且对I型和III型胶原蛋白确实具有低亲和力或者基本上没有亲和力，所述低亲和力或者基本上没有亲和力的特征在于所述多肽结合I型和III型胶原蛋白的解离常数K_D>1μM，优选K_D>10μM。然而，所述多肽可含有一个或多个拷贝的具有融合至所述多肽的N端或C端的SEQ ID NO:4的氨基酸1238至1268、优选由其组成的肽。

在其他实施方案中，截短的VWF包含与前述段落中记载的氨基酸序列之一具有至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％,或至少99％的序列同一性的氨基酸序列或由其组成，条件是截短的VWF能够与FVIII结合。

如果本发明的多肽的两个单体共价连接，则本发明的多肽在本发明中称为“二聚体”。优选地，共价键位于本发明的多肽的截短的VWF部分内。优选地，两个单体亚单位通过至少一个二硫键，例如通过一个、两个、三个或四个二硫键共价连接。形成至少一个二硫键的半胱氨酸残基优选位于本发明的多肽的截短的VWF部分内。在一个实施方案中，这些半胱氨酸残基是Cys-1099,Cys-1142,Cys-1222,Cys-1225或Cys-1227或其组合。优选地，除了位于该多肽的截短的VWF部分内的共价键之外，本发明的二聚体多肽不含任何进一步的连接单体的共价键，特别是不含位于多肽的HLEM或HLEP部分内的任何进一步共价键。然而，根据替代实施方案，本发明的二聚体多肽可包含位于连接单体的多肽的HLEM或HLEP部分中的共价键。

二聚体优选为同二聚体，由此每个单体优选包含本文公开的HLEM或HLEP。如果本发明的多肽是二聚体，则截短的VWF优选包含两个多肽或由其组成并能够与FVIII结合，每个多肽具有与SEQ ID NO:4的氨基酸764至1099，氨基酸764至1142，氨基酸764至1222，氨基酸764至1225，氨基酸764至1227或氨基酸764至1242具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。在优选的实施方案中，截短的VWF包含与SEQ ID NO:4的氨基酸764至1099，氨基酸764至1142，氨基酸764至1222，氨基酸764至1225，氨基酸764至1227或氨基酸764至1242具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列或由其组成并且能够与FVIII结合。最优选地，截短的VWF包含SEQ ID NO:4的氨基酸764至1099，氨基酸764至1142，氨基酸764至1222，氨基酸764至1225，氨基酸764至1227或氨基酸764至1242。

截短的VWF可以是WO 2013/106787 A1,WO 2014/198699 A2,WO 2011/060242A2或WO 2013/093760A2中公开的VWF片段之一，其公开内容通过引用并入本文。

根据进一步的优选实施方案，如上所述的截短的VWF可以包含WO 2016/000039A1中公开的至少一种氨基酸置换。与根据的SEQ ID NO:4的野生型VWF的D'结构域的氨基酸序列相比，截短的VWF的那些修饰形式包含其D'结构域内的至少一个氨基酸置换。截短的VWF的修饰形式的氨基酸序列可以相对于各自的野生型序列具有一个或多个氨基酸置换。修饰的截短的VWF的D'结构域的氨基酸序列相对于SEQ ID NO:4的D'结构域优选具有一个或2个氨基酸置换。优选地，对应于SEQ ID NO:2的位置1的SEQ ID NO:4位置764处的S被选自G，P，V，E，Y，A和L的氨基酸置换。还优选地，对应于SEQ ID NO:2的位置3的SEQ ID NO:4位置766处的S被选自Y，I，M，V，F，H，R和W的氨基酸置换。参考SEQ ID NO:4的序列，优选的置换组合包括S764G/S766Y,S764P/S766I,S764P/S766M,S764V/S766Y,S764E/S766Y,S764Y/S766Y,S764L/S766Y,S764P/S766W,S766W/S806A,S766Y/P769K,S766Y/P769N,S766Y/P769R和S764P/S766L。与除了所述修饰以外具有相同氨基酸序列的参考多肽的结合亲和力相比，可以通过引入所述置换来进一步增加本发明的多肽与FVIII的结合亲和力。在截短的VWF内的所述置换可有助于增加共施用FVIII的半衰期，或共配制的FVIII的稳定性。

半衰期延长部分(HLEM)

除了截短的VWF之外，本发明的多肽在某些优选实施方案中还可包含半衰期延长部分。半衰期延长部分可以是融合至截短的VWF的异源氨基酸序列。或者，半衰期延长部分可以通过与肽键不同的共价键化学缀合至包含截短的VWF的多肽。

在本发明的某些实施方案中，本发明的多肽的半衰期通过化学修饰得到延长，例如连接半衰期延长部分，例如聚乙二醇(PEG化)，糖基化的PEG，羟乙基淀粉(HES化)，聚唾液酸，弹性蛋白样多肽，类肝素聚合物或透明质酸。在另一实施方案中，本发明的多肽通过化学接头缀合至例如白蛋白的HLEM。这种缀合技术的原理已由Conjuchem LLC以示例性方式描述(参见例如美国专利号7,256,253)。

在其他实施方案中，半衰期延长部分是半衰期增强多肽(HLEP)。优选地，HLEP是白蛋白或其片段。白蛋白的N端可融合至截短的VWF的C端。或者白蛋白的C端可融合至截短的VWF的N端。一个或多个HLEP可融合至VWF的N端或C端部分，条件是不干扰或消除截短的VWF与FVIII的结合能力。

重组多肽还包含优选位于截短的VWF和HLEM之间的共价键，或位于截短的VWF和HLEM之间的接头序列。

所述接头序列可以是由一个或多个氨基酸组成、特别是由1至50、1至30、1至20、1至15、1至10、1至5或1至3(例如1、2或3)个氨基酸组成的肽接头，并且所述氨基酸可以彼此相同或不同。优选地，在野生型VWF的对应位置不存在接头序列。在所述接头序列中存在的氨基酸优选包括Gly和Ser。接头序列应为非免疫原性的。优选的接头可由交替的甘氨酸和丝氨酸残基组成。例如，在WO2007/090584在描述了合适的接头。

在本发明的另一实施方案中，截短的VWF部分和HLEP之间的肽接头由肽序列组成，它们作为人蛋白质中的天然结构域间接头或序列。优选地，此类肽序列在它们自然环境中位于接近蛋白表面并且是免疫系统可及的，使得可以假定免疫系统对该序列具有自然耐受性。在WO 2007/090584中给出了实例。在例如WO 2013/120939 A1中描述了可切割的接头序列。

在重组多肽的优选实施方案中，截短的VWF和HLEP之间的接头是具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列480-510或由其组成的甘氨酸/丝氨酸肽接头。

在一个实施方案中，多肽具有以下结构：tVWF-L1-H,[式1]

其中tVWF是截短的VWF，L1是化学键或接头序列，H是HLEM、特别是HLEP。

L1可以是化学键或接头序列，所述接头序列可以是由一个或多个氨基酸组成、特别是由1至50、1至30、1至20、1至15、1至10、1至5或1至3(例如1、2或3)个氨基酸组成的肽接头，并且所述氨基酸可以彼此相同或不同。通常，在野生型VWF的对应位置不存在接头序列。在L1中存在的合适的氨基酸的实例包括Gly和Ser。接头应为非免疫原性的并且可以是不可切割或可切割的接头。不可切割的接头可由WO 2007/090584 A1中示例的交替甘氨酸和丝氨酸残基组成。在本发明的另一实施方案中，截短的VWF部分和白蛋白部分之间的肽接头由肽序列组成，它们作为人蛋白质中的天然结构域间接头或序列。优选地，此类肽序列在它们自然环境中位于接近蛋白表面并且是免疫系统可及的，使得可以假定免疫系统对该序列具有自然耐受性。在WO2007/090584中给出了实例。在例如WO 2013/120939 A1中描述了可切割的接头序列。

在下文中描述了优选的HLEP序列。本发明同样涵盖融合至各自HLEP的确切“N端氨基酸”或确切“C端氨基酸”或融合至各自HLEP的“N端部分”或“C端部分”，其包括HLEP的N端缺失一个或多个氨基酸。多肽可包含超过一个HLEP序列，例如两个或三个HLEP序列。这些多个HLEP序列可串联、例如作为顺序重复序列融合至VWF的C端部分。

半衰期增强多肽(HLEP)

优选，半衰期延长部分是半衰期增强多肽(HLEP)。更优选地，HLEP选自白蛋白，白蛋白家族的成员或其部分，具有大流体力学体积的溶剂化随机链(例如XTEN(Schellenberger et al.2009；Nature Biotechnol.27:1186-1190))，高氨基酸重复序列(HAP)或脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸重复序列(PAS)，afamin，甲胎蛋白，维生素D结合蛋白，转铁蛋白或其变体或片段，人绒毛膜促性腺激素-β亚单位的羧基端肽(CTP)，能够与新生儿Fc受体(FcRn)、特别是免疫球蛋白恒定区及其部分、例如Fc片段结合的多肽，在生理条件下能够与白蛋白结合、与白蛋白家族成员或其片段结合或与免疫球蛋白恒定区或其部分结合的多肽或脂质。免疫球蛋白恒定区或其部分优选为免疫球蛋白G1的Fc片段、免疫球蛋白G2的Fc片段或免疫球蛋白A的Fc片段。此外或者替代地，HLEP可包含一个或多个拷贝的具有SEQ IDNO:4的氨基酸1238至1268、优选由其组成的肽。所述肽优选包含多个O-糖基化的氨基酸。

如本文所用，半衰期增强多肽可以是本文所述的全长半衰期增强蛋白或其一个或多个片段，其能够稳定或延长凝血因子的治疗活性或生物学活性，特别是增加本发明的多肽的体内半衰期。此类片段可以长度为10个或更多个氨基酸或可以包括来自HLEP序列的至少约15个，至少约20个，至少约25个，至少约30个，至少约50个，至少约100个或更多个氨基酸或可以包括各自HLEP的特定结构域中的部分或全部结构域，只要与没有HLEP的各自多肽相比，该HLEP片段提供至少25％的功能性半衰期延长。

本发明的多肽的HLEP部分可以是野生型HLEP的变体。术语“变体”包括插入、缺失和置换，无论是保守的还是非保守的，其中这种变化不会实质性地改变截短的VWF的FVIII结合活性。

具体而言，本发明所提供的截短的VWF-HLEP融合构建体可包括天然存在的HLEP多态性变体和HLEP片段。HLEP可以来源于任何脊椎动物，特别是任何哺乳动物，例如人，猴，牛，羊或猪。非哺乳动物HLEP包括但不限于鸡和鲑鱼。

根据本公开内容的某些实施方案，本发明重组多肽的HLEM、特别是HLEP部分可以用替代术语“FP”来指定。优选地，术语“FP”代表人白蛋白。

根据某些优选的实施方案，重组多肽是融合蛋白。就本发明而言，融合蛋白是通过编码截短的VWF以及HLEP的至少两个DNA序列的同框连接而产生的蛋白质。本领域技术人员理解的是，融合蛋白DNA序列的翻译将产生单个蛋白序列。作为根据进一步优选的实施方案同框插入编码肽接头的DNA序列的结果，可以得到包含截短的VWF、合适的接头和HLEP的融合蛋白。

根据一些实施方案，共配制的FVIII不含本文所述的任何HLEM或HLEP结构。根据某些其它实施方案，共配制的FVIII可包含本文所述的HLEM或HLEP结构中的至少一种。

白蛋白作为HLEP

在本申请中可互换使用术语“人血清白蛋白”(HSA)和“人白蛋白”(HA)。术语“白蛋白”和“血清白蛋白”含义更广泛，涵盖人血清白蛋白(及其片段及其变体)以及来自其他物种的白蛋白(及其片段和变体)。

如本文所用，“白蛋白”统指白蛋白多肽或氨基酸序列，或白蛋白片段或变体，其具有白蛋白的一种或多种功能特性(例如，生物学功能)。特别地，“白蛋白”是指人白蛋白或其片段，特别是本文SEQ ID NO:6所示的成熟形式的人白蛋白或来自其它脊椎动物的白蛋白或其片段，或这些分子的类似物或变体或其片段。

根据本公开的某些实施方案，替代术语“FP”用于标识HLEP，特别是将白蛋白定义为HLEP。

特别地，本发明提出的多肽可以包括天然存在的人白蛋白多态变体和人白蛋白片段。一般来说，白蛋白片段或变体将长至少10个、优选至少40个、最优选超过70个氨基酸。

本发明的优选实施方案包括用作本发明的具有增强的FcRn受体结合的多肽的HLEP的白蛋白变体。与野生型白蛋白融合的截短的VWF相比，这种白蛋白变体可导致截短的VWF白蛋白变体融合蛋白的血浆半衰期更长。

本发明的多肽的白蛋白部分可以包含HA的至少一个子结构域或结构域或其保守修饰。

免疫球蛋白作为HLEP

本领域已知免疫球蛋白G(IgG)恒定区(Fc)能够增加治疗蛋白的半衰期(Dumont JA et al.2006.BioDrugs 20:151-160)。重链的IgG恒定区由3个结构域(CH1-CH3)和铰链区组成。免疫球蛋白序列可来源于任何哺乳动物，或分别来自子类别IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。没有抗原结合结构域的IgG和IgG片段也可用作HLEP。治疗性多肽部分优选通过抗体的铰链区域或肽接头连接到IgG或IgG片段，其甚至是可切割的。几项专利和专利申请描述了治疗蛋白与免疫球蛋白恒定区的融合，以增强治疗蛋白的体内半衰期。US 2004/0087778和WO2005/001025描述了Fc结构域或至少部分免疫球蛋白恒定区与生物活性肽的融合蛋白，其增加了肽的半衰期，否则肽将在体内被迅速消除。描述了Fc-IFN-β融合蛋白，其实现了增强的生物活性，延长的循环半衰期和更高的溶解度(WO 2006/000448A2)。公开了具有延长的血清半衰期和增加的体内效力的Fc-EPO(WO 2005/063808 A1)以及Fc与G-CSF(WO 2003/076567 A2)、胰高血糖素样肽-1(WO 2005/000892 A2)、凝血因子(WO 2004/101740 A2)和白介素-10(美国专利号6,403,077)的融合，它们均具有半衰期增强的性质。

在WO 2013/120939 A1中描述了能够用于根据本发明的各种HLEP。

N-聚糖与本发明的多肽的唾液酸化

本发明的多肽优选包含N-聚糖，并且至少50％、优选至少75％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％的所述N-聚糖平均包含至少一个唾液酸部分。在优选的实施方案中，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的所述N-聚糖平均包含至少一个唾液酸部分。

当使用哺乳动物细胞表达本发明的多肽时，这通常含有α-2,3-连接的唾液酸基团。但此外，本发明的多肽可包含具有α-2,6-连接的唾液酸基团的N-聚糖。在某些实施方案中，糖蛋白的N-聚糖的至少50％的唾液酸基团是α-2,6-连接的唾液酸基团。通常，末端唾液酸基团可以通过α-2,3-键或通过α-2,6-键连接到半乳糖基团。本发明的多肽的N-聚糖可以包含比α-2,3-连接的唾液酸基团更多的α-2,6-连接的唾液酸基团。N-聚糖的至少60％、或至少70％、或至少80％或至少90％的唾液酸基团可以是α-2,6-连接的唾液酸基团。可以通过使用人源细胞系表达本发明的多肽或例如通过在哺乳动物细胞中共表达人α-2,6-唾液酸转移酶来获得这些实施方案。

例如在WO 2016/188905中描述了合适的产生此类糖蛋白的方法。因此，其中描述了产生包含增加的唾液酸化的N-聚糖的糖蛋白的方法，所述方法包括(i)提供包含编码包含截短的血管性血友病因子(VWF)的多肽的核酸的细胞，和(ii)在小于36℃的温度培养所述细胞。此外，描述了产生包含截短的血管性血友病因子(VWF)的糖蛋白二聚体或用于增加所述糖蛋白的二聚化的方法，所述方法包括(i)提供包含编码所述糖蛋白的氨基酸序列的核酸的细胞，和(ii)在小于36℃的温度培养所述细胞。此外，其中描述了产生包含具有增加的唾液酸化的N-聚糖的糖蛋白的方法，其包括(i)提供包含编码包含截短的血管性血友病因子(VWF)的多肽的核酸和编码α-2,6-唾液酸转移酶的重组核酸的细胞，和(ii)在使糖蛋白和α-2,6-唾液酸转移酶表达的条件下培养所述细胞。

在一个实施方案中，本发明的多肽的至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的N-聚糖包含至少一个唾液酸基团。

在另一实施方案中，本发明的多肽的小于50％、或小于25％、或小于15％、或小于12％、或小于10％、或小于8％、或小于6％、或小于5％、或小于4％、或小于3％、或小于2％或甚至小于1％的N-聚糖包含去唾液酸N-聚糖，即它们是缺乏唾液酸基团的N-聚糖。

本发明的其它实施方案包括截短的血管性血友病因子(VWF)，其中所述截短的VWF能够与因子VIII(FVIII)结合，并且其中所述糖蛋白包含N-聚糖，其中小于50％，优选小于40％，优选小于35％，优选小于30％，优选小于29％，优选小于28％，优选小于27％，优选小于26％，优选小于25％，优选小于24％，优选小于23％，优选小于22％，优选小于21％，优选小于20％，优选小于19％，优选小于18％，优选小于17％，优选小于16％，优选小于15％，优选小于14％，优选小于13％，优选小于12％，优选小于11％，优选小于10％，优选小于9％，优选小于8％，优选小于7％，优选小于6％和优选小于5％的所述N-聚糖平均包含两个或更多个末端和非唾液酸化半乳糖残基。

本发明的又一些其他实施方案包含截短的血管性血友病因子(VWF)，其中所述截短的VWF能够与因子VIII(FVIII)结合，并且其中所述截短的VWF包含N-聚糖，其中小于20％，优选小于10％，优选小于5％，优选小于4％，优选小于3％，优选小于2％和优选小于1％的N-聚糖平均包含三个或更多个末端和非唾液酸化半乳糖残基。

上述实施方案可以相互组合。上面提到的任何N-聚糖的百分比，或唾液化程度的任何指示，都应理解为平均百分比或程度，即它们指的是分子群，而不是单个分子。很明显，糖蛋白群体中单个糖蛋白分子的糖基化或唾液酸化将显示一些异质性。

二聚体

本发明的多肽具有高比例的二聚体。因此，本发明的多肽优选以二聚体的形式存在。在一个实施方案中，至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少95％或至少98％的多肽以二聚体的形式存在。在另一实施方案中，本发明多肽的二聚体:单体的比率为至少1.5，优选至少2，更优选至少3或至少5。最优选地，基本上本发明的所有多肽都以二聚体的形式存在。进一步优选的是，本发明的多肽不含多聚体形式。二聚体的使用是有利的，因为与单体相比，二聚体对因子VIII具有改善的亲和力。可以如实施例2所述确定本发明的多肽的二聚体含量和二聚体与单体的比率。

在一个实施方案中，本发明的多肽对因子VIII的亲和力大于人天然VWF对相同因子VIII分子的亲和力。多肽的因子VIII亲和力可以指人天然血浆来源或重组因子VIII，特别是对具有截短或缺失的B结构域的重组因子VIII分子，优选以SEQ ID NO:5为特征的因子VIII分子。

已经发现，具有高比例二聚体的本发明的多肽的制剂确实对因子VIII具有增加的亲和力。替代性地或与增加的二聚体比例组合的多肽也根据本发明与因子VIII结合结构域内的突变，其确实增加了对因子VIII的亲和力是本发明的优选实施方案。例如，在WO 2013/120939 A1中公开了合适的突变。

多肽的制备

可以根据本领域已知的方法制备编码本发明的多肽的核酸。基于人天然VWF(SEQID NO:3)的前-原(pre-pro)形式的cDNA序列，可以设计和生成编码上述截短的VWF构建体或本发明的多肽的重组DNA。

即使由宿主细胞分泌的多肽不含人VWF的前-原形式的氨基酸1至763，优选编码多肽的细胞内前体的核酸(例如DNA)包含编码与SEQ ID NO:4的氨基酸23至763或优选氨基酸1至763具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。最优选地，编码多肽的细胞内前体的核酸(例如DNA)包含编码SEQ ID NO:4的氨基酸23至763或SEQ ID NO:4的氨基酸1至763的核苷酸序列。

其中DNA含有以正确的方向插入表达质粒的整个开放阅读框的构建体可用于蛋白表达。典型的表达载体含有启动子，所述启动子指导与携带质粒的细胞中插入的核酸相对应的大量mRNA的合成。它们还可以包括允许它们在宿主生物体内自主复制的复制序列的起点，以及增加合成的mRNA翻译效率的序列。稳定的长期载体可以通过使用例如病毒的调节元件(例如，来自EB病毒基因组的OriP序列)来维持为自由复制的实体。还可以产生将载体整合到基因组DNA中的细胞系，并且以这种方式连续产生基因产物。

通常，待提供的细胞是通过将编码本发明的多肽的核酸引入哺乳动物宿主细胞而获得的。

任何对细胞培养和糖蛋白表达敏感的宿主细胞都可以根据本发明加以利用。在某些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。可以根据本发明使用的哺乳动物细胞的非限制性实例包括BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系(NSO/1,ECACC No:85110503)；人视网膜母细胞(PER.C6(CruCell,Leiden,The Netherlands))；由SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7,ATCCCRL 1651)；人胚肾细胞系(293细胞或亚克隆用于悬浮培养生长的293细胞,Graham etal.,J.Gen Virol.,36:59,1977)；幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL10)；中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO,Urlaub and Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216,1980)；小鼠支持细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.,23:243 251,1980)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1 587)；人宫颈癌细胞(HeLa,ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL 34)；大鼠肝实质细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138,ATCC CCL 75)；人肝细胞(HepG2,HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562,ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather etal.,Annals NY.Acad.Sci.,383:44-68,1982)；MRC 5细胞；PS4细胞；人羊膜细胞(CAP)；和人肝癌细胞系(Hep G2)。优选地，细胞系是啮齿动物细胞系、特别是仓鼠细胞系例如CHO或BHK或人细胞系。

适合于将足以实现感兴趣的糖蛋白表达的核酸引入哺乳动物宿主细胞的方法在本领域是已知的。参见例如Gething et al.,Nature,293:620-625,1981；Mantei et al.,Nature,281:40-46,1979；Levinson et al.EP 117,060和EP 117,058。对于哺乳动物细胞，将遗传物质引入哺乳动物细胞的常用方法包括Graham和van der Erb的磷酸钙沉淀法(Virology,52:456-457,1978)或lipofectamine^TM(Gibco BRL)Method of Hawley-Nelson(Focus 15:73,1993)。Axel已经在美国专利号4,399,216中描述了哺乳动物细胞宿主系统转换的一般方面。对于将遗传物质引入哺乳动物细胞的各种技术，参见Keown et al.,Methods in Enzymology,185:527-537,1990和Mansour et al.,Nature,336:348-352,1988。

在使多肽表达的条件下培养细胞。可以使用本领域技术人员已知的方法回收和纯化多肽。

因子VIII

如本文所用，术语“因子VIII”或“FVIII”是指具有人天然因子VIII的至少部分凝血活性的分子。人FVIII由2351个氨基酸(包括信号肽)和2332个氨基酸(不含信号肽)组成。“人天然FVIII”是人血浆来源的FVIII分子，具有SEQ ID NO:7(氨基酸1-2332)所示的全长序列。详细结构域结构A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2具有对应的氨基酸残基(参考SEQ IDNO:7)：A1(1-336),a1(337-372),A2(373-710),a2(711-740),B(741-1648),a3(1649-1689),A3(1690-2020),C1(2021-2173)和C2(2174-2332)。

使用单程(one stage)凝血测定(例如如Lee et al.,Thrombosis Research 30,511 519(1983)中所述)或显色底物测定(例如来自的Chromogenix-InstrumentationLaboratory SpA V.le Monza 338-20128Milano,Italy的coamatic FVIII测试试剂盒)确定FVIII分子的凝血活性。在下文中描述了这些活性测定进一步的细节。

优选地，根据本发明使用的FVIII分子具有至少10％的人天然FVIII的比摩尔活性。术语“比摩尔活性”是指每摩尔FVIII的凝血活性，例如以“IU/摩尔”FVIII表示，或者(更方便地)以“IU/皮摩尔”FVIII表示。

在优选的实施方案中，FVIII分子是一种非天然存在的FVIII分子。优选地，非天然存在的FVIII分子已经重组产生。在另一实施方案中，FVIII分子已经在细胞培养物中产生。在另一优选的实施方案中，非天然存在的FVIII分子具有与血浆来源的FVIII不同的糖基化模式。在又一个实施方案中，FVIII分子选自：(i)B结构域被缺失或截短的FVIII分子，(ii)单链FVIII分子，(iii)重组产生的双链FVIII分子，(iv)具有保护基团或半衰期延长部分的FVIII分子，(v)包含融合至异源氨基酸序列的FVIII氨基酸序列的融合蛋白，和(vi)它们的组合。

在另一优选的实施方案中，FVIII分子是血浆来源的FVIII分子。

术语“因子VIII”和“FVIII”在本文中同义使用。本发明意义上的“因子VIII组合物”包括包含FVIII和FVIIIa的组合物。FVIIIa通常可以少量存在，例如约1％至2％的FVIIIa，是指组合物中FVIII蛋白的总量。蛋白水解切割的FVIII通常可以以小到中等的量存在，例如约1至50％，是指组合物中FVIII蛋白的总量。“FVIII”包括FVIII的自然等位基因变异，这些变异可能存在并且发生在个体之间。FVIII可以是血浆来源的或使用众所周知的产生和纯化方法重组产生的。糖基化、酪氨酸硫酸化和其他翻译后修饰的程度和位置可能会有所不同，具体取决于所选的宿主细胞及其生长条件。术语FVIII包括FVIII类似物。如本文所用，术语“FVIII类似物”是指FVIII分子(全长或B结构域截短/缺失)，其中与SEQ IDNO:7相比，或者对于B结构域截短/缺失的FVIII分子，与SEQ ID NO:7的对应部分相比，一个或多个氨基酸已被置换或缺失。FVIII类似物不会在自然界中发生，而是通过人为操作获得的。

包含在本发明组合物中的因子VIII分子也可以是B结构域截短/缺失的FVIII分子，其中剩余的结构域对应于SEQ ID NO:7的氨基酸编号1-740和1649-2332中所示的序列。其他形式的B结构域缺失的FVIII分子在其a3结构域中也有部分缺失，这得到单链FVIII分子。

因此，这些FVIII分子是在转化的宿主细胞、优选哺乳动物来源中产生的重组分子。然而，B结构域缺失的FVIII中的剩余的结构域(即三个A结构域，两个C结构域和a1、a2和a3区域)可能略有不同，例如与SEQ ID NO:7(氨基酸1-740和1649-2332)中所示的相应氨基酸序列约1％、2％、3％、4％或5％的不同。

包含在本发明组合物中的FVIII分子可以是双链FVIII分子或单链FVIII分子。包含在本发明组合物中的FVIII分子也可以是FVIII的生物活性片段，即这样的FVIII，其中除B结构域以外的结构域已被缺失或截短，但其中缺失/截短的形式的FVIII分子保留其支持血凝块形成的能力。可以使用本领域众所周知的技术在体外评估FVIII活性。根据本发明确定FVIII活性的优选测试是显色底物测定或单程测定(参见下文)。氨基酸修饰(置换、缺失等)可以引入剩余的结构域中，例如，为了修饰因子VIII与各种其他组分的结合能力，例如血管性血友病因子因子(vWF)，低密度脂蛋白受体相关蛋白(LPR)，各种受体，其他凝血因子，细胞表面等，或者为了引入和/或消除糖基化位点等。不能消除FVIII活性的其它突变也可以容纳在FVIII分子/类似物中，以用于本发明的组合物中。

FVIII类似物还包括FVIII分子，其中亲本多肽的一个或多个氨基酸残基已被缺失或被其它氨基酸残基置换，和/或其中另外的氨基酸残基已被添加到亲本FVIII多肽中。

此外，因子VIII分子/类似物可包含其他修饰，例如在截短的B结构域中和/或在分子的一个或多个其他结构域中(“FVIII衍生物”)。这些其它修饰可以以缀合至因子VIII分子的各种分子的形式存在，例如聚合物化合物、肽化合物、脂肪酸衍生化合物等。

术语FVIII包括具有保护基团或半衰期延长部分的FVIII分子。术语“保护基团”/“半衰期延长部分”在本文中理解为指一个或多个连接在一个或多个例如-SH、-OH、-COOH、-CONH2、-NH2的氨基酸位点链官能团上的一个或多个化学基团，或一个或多个N-聚糖和/或O-聚糖结构并且当缀合至许多治疗蛋白/肽时其能够增加这些蛋白/肽的体内循环半衰期。保护基团/半衰期延长部分的实例包括：生物相容性脂肪酸及其衍生物,羟基烷基淀粉(HAS)例如羟乙基淀粉(HES),聚(Gly_x-Ser_y)_n(高氨基酸聚合物(HAP)),透明质酸(HA),类肝素聚合物(HEP),磷酰胆碱基聚合物(PC聚合物),

聚合物(MersanaTherapeutics,MA,USA),葡聚糖,聚唾液酸(PSA),聚乙二醇(PEG),Fc结构域,转铁蛋白,白蛋白,弹性蛋白样多肽,

聚合物(Amunix,CA,USA),白蛋白结合肽,血管性血友病因子片段(vWF片段),羧基端肽(CTP肽,Prolor Biotech,IL)和它们的任意组合(参见例如McCormick,C.L.,A.B.Lowe,and N.Ayres,Water-Soluble Polymers,于Encyclopedia ofPolymer Science and Technology.2002,John Wiley&Sons,Inc.)。衍生化的方式并不重要，并且可以从上文得到阐明。

术语FVIII包括糖聚乙二醇化的FVIII。在该上下文下，术语“糖聚乙二醇化FVIII”旨在指定因子VIII分子(包括全长FVIII和B结构域截短/缺失的FVIII)，其中一个或多个PEG基团已经通过FVIII多肽的多糖侧链(聚糖)连接到多肽。

可根据本发明使用的FVIII分子包括融合蛋白，其包含融合至异源氨基酸序列、优选半衰期延长的氨基酸序列的FVIII氨基酸序列。优选的融合蛋白是Fc融合蛋白和白蛋白融合蛋白。在本文中，术语“Fc融合蛋白”是指涵盖融合至可以来源于任何抗体同种型的Fc结构域的FVIII。因为IgG抗体的相对长的循环半衰期，IgG的Fc结构域通常会是优选的。此外，还可修饰Fc结构域以调节某些效应功能例如补体结合和/或与某些Fc受体结合。FVIII与具有与FcRn受体结合的能力的Fc结构域的融合通常会导致融合蛋白与野生型FVIII的半衰期相比延长的循环半衰期。因此，用于本发明的FVIII分子也可以是FVIII类似物的衍生物，例如，FVIII类似物的融合蛋白，PEG化或糖PEG化FVIII类似物，或缀合至类肝素聚合物的FVIII类似物。在本文中，“白蛋白融合蛋白”是指涵盖融合至白蛋白氨基酸序列或其片段或衍生物的FVIII。异源氨基酸序列可融合至FVIII的N端或C端，或者它可以插入FVIII氨基酸序列内的内部。异源氨基酸序列可以是在WO 2008/077616A1中描述的任何“半衰期延长多肽”，其公开内容通过引用并入本文。

用于本发明的组合物的FVIII分子的实例包含例如在WO 2010/045568,WO 2009/062100,WO 2010/014708,WO 2008/082669,WO 2007/126808,US 2010/0173831,US 2010/0173830,US 2010/0168391,US 2010/0113365,US 2010/0113364,WO 2003/031464,WO2009/108806,WO 2010/102886,WO 2010/115866,WO 2011/101242,WO 2011/101284,WO2011/101277,WO 2011/131510,WO 2012/007324,WO 2011/101267,WO 2013/083858和WO2004/067566中描述的FVIII分子。

可用于本发明的组合物中的FVIII分子的实例包括

的活性成分，以及在WO 2008/135501,WO 2009/007451中描述的FVIII分子和WO 2004/067566的称为“dBN(64-53)”的构建体。该构建体具有SEQ ID NO5中所示的氨基酸序列。

本发明的组合物中因子VIII的浓度通常在10-10,000IU/mL的范围内。在不同的实施方案中，本发明的组合物中FVIII分子的浓度在以下范围内：10-8,000IU/mL、或10-5,000IU/mL、或20-3,000IU/mL、或50-1,500IU/mL、或3,000IU/mL、或2,500IU/mL、或2,000IU/mL、或1,500IU/mL、或1,200IU/mL、1,000IU/mL、或800IU/mL、或600IU/mL、或500IU/mL、或400IU/mL、或300IU/mL、或250IU/mL、或200IU/mL、或150IU/mL、或100IU/mL。

“国际单位”或“IU”是使用根据“IU”中校准的国际标准制剂校准的标准，通过FVIII活性测定(如单程凝血测定或显色底物FVIII活性测定)测量的FVIII血液凝血活性(效力)的测量单位。单程凝血测定是本领域已知的，例如在N Lee,Martin L,et al.,AnEffect of Predilution on Potency Assays of FVIII Concentrates,ThrombosisResearch(Pergamon Press Ltd.)30,511 519(1983)中描述的。单程测定的原理是：该测试作为活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)测定的修改版本执行：血浆与磷脂和表面活化剂的孵育导致内源性凝血系统因子的活化。添加钙离子触发凝血级联反应。确定可测量的纤维蛋白凝块形成的时间。该测定在存在因子VIII缺陷血浆的情况下进行。通过待测样品中包含的凝血因子VIII恢复缺陷血浆的凝血能力。凝血时间的缩短与样品中存在的因子VIII的量成正比。凝血因子VIII的活性通过直接比较与具有国际单位中已知因子VIII活性的标准制剂来定量。

另一标准测定是显色底物测定。显色底物测定可以商业购买，例如coamaticFVIII测试试剂盒(Chromogenix-Instrumentation Laboratory SpA V.le Monza 338-20128Milano,Italy)。显色底物测定的原理是：在钙和磷脂存在下，因子X被因子IXa活化为因子Xa。该反应由因子VIIIa作为辅助因子刺激。FVIIIa是由待测样品中FVIII的反应混合物中的低量凝血酶形成的。当使用最佳浓度的Ca²⁺、磷脂和因子IXa以及过量的因子X时，因子X的活化与因子VIII的效力成正比。活化的因子X从显色底物S-2765释放发色团pNA。因此，在405nm处测量的pNA的释放与形成的FXa的量成正比，因此也与样品的因子VIII活性成正比。

冷冻干燥或冻干，除非其出现的上下文另有说明，否则应当用于表示将材料溶液(即活性药物成分和各种制剂添加剂或“赋形剂”)转变为固体的干燥过程。典型的冷冻干燥过程包括三个阶段，“冷冻”、“初级干燥”和“二次干燥”。在冷冻阶段，几乎所有含有的水都转变为冰，溶质转变为固体(结晶或无定形)。在初级干燥阶段，冰通过直接升华从产品中除去，这是通过保持水分子(冰)和周围大气之间的有利压力梯度来实现的。在二次干燥阶段，残留的水分通过解吸从产品中除去。

如果为冷冻干燥的组合物提供浓度(w/v)，则它们是指冷冻干燥前的体积。

除非另有说明，否则百分比术语表示重量/重量百分比，温度以摄氏度为单位。

FVIII的稳定性

当在一种组合物中共配制时，本发明的多肽抑制或减少组合物中FVIII活性的损失。FVIII制剂的FVIII活性随时间推移或在特定处理步骤过程中的损失低于缺乏本发明的多肽的对照制剂的损失。

如本文所用，术语“对照制剂”或“对照组合物”是指除了缺少本发明的多肽之外具有相同成分的相同量的制剂。(i)包含本发明的多肽和FVIII的组合物和(ii)对照组合物的FVIII活性的损失是(i)在相同的条件下储存相同的时间后，和/或(ii)在使两种组合物进行相同的处理步骤之后测量的。处理步骤可以是冷冻干燥和任选地复原。

在一个实施方案中，包含截短的VWF的本发明的多肽增加了液体组合物中FVIII的稳定性。在25℃下以液体形式储存一周期间，在包含FVIII和本发明的多肽的组合物中FVIII活性的损失优选小于10％，更优选小于9％，最优选小于8％。在25℃下以液体形式储存两周期间，FVIII活性的损失优选小于15％。在25℃下以液体形式储存三周期间，FVIII活性的损失优选小于17％。在25℃下以液体形式储存四周期间，FVIII活性的损失优选小于20％。在25℃下以液体形式储存六周期间，FVIII活性的损失优选小于30％。可以按照本申请实施例中的描述来确定FVIII活性的损失。

在另一实施方案中，包含截短的VWF的本发明的多肽增加了冷冻干燥过程中FVIII的稳定性。冷冻干燥后FVIII活性的损失在包含FVIII和本发明的多肽的组合物中优选小于15％，更优选小于10％，最优选小于5％。

在另一实施方案中，包含截短的VWF的本发明的多肽增加了冻干组合物中FVIII的稳定性。在25℃下以冻干形式储存12个月期间，在包含FVIII和本发明多肽的组合物中FVIII活性的损失优选小于16％。在25℃下以冻干形式储存18个月期间，在包含FVIII和本发明多肽的组合物中FVIII活性的损失优选小于25％。在25℃下以冻干形式储存24个月期间，在包含FVIII和本发明多肽的组合物中FVIII活性的损失优选小于30％。

药物组合物

如本文所述的包含截短的VWF的多肽可优选用于增加包含凝血因子VIII(FVIII)和所述多肽的组合物中FVIII的体外稳定性。所述组合物优选为制剂。

如本文所用，术语“制剂”是指药物制剂。如果没有另外指出，则在本文中同义使用术语“药物制剂”和“治疗制剂”。

制剂优选适用于凝血障碍的治疗或预防。凝血障碍尤其为血友病A。

本发明的多肽的治疗制剂可以通过将具有所需纯度的本发明的多肽与任选的本领域通常采用的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(在本文中均称为“承载体”)(即缓冲剂，稳定剂，防腐剂，等渗剂，非离子洗涤剂，抗氧化剂和其他杂项添加剂)混合，以作为冻干制剂或水溶液制备用于储存。参见Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版(Osol编辑，1980年)。这些添加剂必须以所使用的剂量和浓度对受体无毒。

缓冲剂有助于将pH值维持在接近生理上可接受条件的范围内。它们可以以通常约2mM至约100mM的浓度存在。合适的缓冲剂包括有机和无机酸及其盐，例如柠檬酸盐缓冲液(例如，柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)，琥珀酸盐缓冲液(例如，琥珀酸-琥珀酸单钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)，酒石酸盐缓冲液(例如，酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)，富马酸盐缓冲液(例如，富马酸-富马酸单钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸单钠-富马酸二钠混合物等)，葡萄糖酸盐缓冲液(例如，葡萄糖酸-葡萄糖酸钠混合物、葡萄糖酸-氢氧化钠混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸钾混合物等)，草酸盐缓冲液(例如，草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)，乳酸缓冲液(例如，乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)和乙酸盐缓冲液(例如，乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。此外，可以使用磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液和三甲胺盐，如Tris。

可以添加防腐剂以延缓微生物生长，通常可以添加范围为0.2％-1％(w/v)的量。合适的防腐剂包括苯酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苄基氯化铵、苯扎

卤化物(例如氯化物、溴化物和碘化物)、六甲基氯化铵和对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。

张力改性剂(有时也起到“稳定剂”的作用)可以加入以确保液体组合物的药学上可接受的张力、优选等渗性，并且包括无机盐如氯化钠和多元糖醇，优选三羟或更高的糖醇，如甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露醇。

稳定剂是指一类广泛的赋形剂，其功能范围从膨胀剂到溶解治疗剂或有助于防止变性或粘附在容器壁上的添加剂。典型的稳定剂可以是多元糖醇(上文列举)；氨基酸如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等，有机糖或糖醇，如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇(myoinisitol)、半乳糖醇、甘油等，包括肌醇(inositol)等环醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，如谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(例如，10个残基或更少的肽)；蛋白质如人血清白蛋白，牛血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮单糖，如木糖，甘露糖，果糖，葡萄糖；二糖如乳糖，麦芽糖，蔗糖和三糖如棉子糖；和多糖，如葡聚糖。稳定剂可以每重量份的本发明的多肽0.1至10,000重量份的范围内存在。可以添加非离子表面活性剂或洗涤剂(也称为“润湿剂”)以帮助溶解治疗剂以及保护治疗蛋白免受搅拌诱导的聚集，这也允许制剂暴露在剪切应力的表面而不会引起蛋白质变性。合适的非离子表面活性剂包括多元醇(泊洛沙姆184、188等)和脱水山梨醇聚氧乙烯单醚(例如聚山梨醇酯20和80等)。非离子表面活性剂可以约0.01mg/ml至约1.0mg/ml的范围内或以约0.05mg/ml至约0.2mg/ml的范围内存在。

其他杂项赋形剂包括膨胀剂(例如淀粉)、螯合剂(例如EDTA)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E)和助溶剂。

在一个实施方案中，本文所述的药物组合物包含截短的血管性血友病因子(VWF)的含水组合物，所述药物组合物还包含：

a.FVIII分子；

b.40至195mM的钠盐；

c.组氨酸；

d.至少1mM的钙盐；和

e.表面活性剂；

其中[His]≥180mM–20*[Ca²⁺]，其中[Ca²⁺]是含水组合物中钙离子的浓度，以毫摩尔/升为单位，[His]是含水组合物中组氨酸的浓度，以毫摩尔/升为单位，条件是[His]>0，并且其中组合物的渗量为600mOsmol/L或更少。含水组合物中钠盐的浓度可为45至95mM。组氨酸的浓度[His]可为5至200mM。组合物可包含浓度为5至100mM的钙离子[Ca²⁺]。组合物的pH为5至9。组合物的钙盐可优选为氯化钙或氯化钠。组合物还可包含碳水化合物。碳水化合物可优选为蔗糖。碳水化合物的浓度可为1至20％(w/w)。所述表面活性剂的浓度可为0.001至0.2％(v/v)。表面活性剂可以是非天然存在的表面活性剂。组合物还可包含至少一种除组氨酸以外的氨基酸。所述至少一种除组氨酸以外的氨基酸可选自精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸及其组合。组合物还可包含至少一种抗氧化剂，其中所述至少一种抗氧化剂可以选自还原谷胱甘肽、甲硫氨酸、半胱氨酸、亚硫酸钠、维生素A、维生素E、抗坏血酸、抗坏血酸钠及其组合。所述至少一种抗氧化剂的浓度可以在0.05–100mM之间变化。

在一个实施方案中，本文中描述的药物组合物除了截短的血管性血友病因子(VWF)之外包含氯化钠、蔗糖、L-精氨酸、钙离子、表面活性剂和柠檬酸盐。优选地，组合物还包含因子VIII。在优选的实施方案中，本发明的药物组合物包含10-30mg/mL氯化钠，3-8mg/mL蔗糖，3-8mg/mL L-Arg x 2H₂O，0.1-0.5mg/mL CaCl₂ x 2H₂O，0.5-2mg/mL泊洛沙姆188和0.5-2mg/mL柠檬酸钠x 2H₂O。在一个具体优选的实施方案中，本发明的药物组合物包含18mg/mL氯化钠，5.4mg/mL蔗糖，5.4mg/mL L-Arg x 2H₂O，0.3mg/mL CaCl₂ x 2H₂O，1.2mg/mL泊洛沙姆188和1.2mg/mL柠檬酸钠x 2H₂O。

在进一步的实施方案中，本文所述的药物组合物除了截短的血管性血友病因子(VWF)之外包含因子VIII，其中组合物包含L-组氨酸、NaCl、CaCl₂、蔗糖、聚山梨醇酯80。

在进一步的实施方案中，本文所述的药物组合物除了截短的血管性血友病因子(VWF)之外包含因子VIII，其中组合物包含20mM L-组氨酸、280mM NaCl、3.4mM CaCl₂、0.6％w/v蔗糖、0.02％v/v聚山梨醇酯80，pH 7。

本文制剂除了本发明的多肽之外或除了或FVIII和本发明的多肽之外还可含有进一步治疗剂。

序列表中所示的核苷酸和氨基酸序列汇总在表1中。

表1：

本发明的某些实施方案现在将参考以下实施例进行描述，这些实施例仅用于说明目的，并不旨在限制本文前面描述的一般性范围。

实施例

显色FVIII:C测定

使用Coamatic FVIII测试试剂盒(Chromogenix-Instrumentation LaboratorySpA V.le Monza 338-20128Milano,Italy)进行显色FVIII:C测定。

该测定的原理是：在钙和磷脂存在下，因子X被因子IXa活化为因子Xa。该反应由因子VIIIa作为辅助因子刺激。FVIIIa是由待测样品中FVIII的反应混合物中的低量凝血酶形成的。当使用最佳浓度的Ca²⁺、磷脂和因子IXa以及过量的因子X时，因子X的活化与因子VIII的效力成正比。活化的因子X从显色底物S-2765释放发色团pNA。因此，在405nm处测量的pNA的释放与形成的FXa的量成正比，因此也与样品的因子VIII活性成正比。使该测定适应在自动化凝血分析仪上进行，所述仪器为Behring Coagulation Timer(BCT)或BehringCoagulation System(BCS)，二者均来自Siemens Healthcare Diagnostics GmbH,Ludwig-Erhard-Straβe 12,65760Eschborn,Germany。

实施例1

生成D′D3白蛋白融合蛋白(D′D3-FP)

通过定制基因合成(Eurofins Genomics,Ebersberg,Germany)制备由编码VWF氨基酸1至1242的cDNA、甘氨酸/丝氨酸接头和人白蛋白的cDNA组成D′D3-FP的表达盒。通过侧翼限制性位点(EcoRI、NotI)将表达盒从所提供的克隆载体上切下并插入用EcoRI和NotI线性化的pIRESneo3载体(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ,USA)。所得到的表达质粒含有在CMV启动子控制下的编码VWF原肽、D′和D3(VWF SEQ ID NO:4的氨基酸1至1242)通过短接头编码序列融合至白蛋白编码序列的核苷酸序列。编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，成熟D′D3-FP的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在XL10 Gold(Agilent Technologies)中生长表达质粒并使用标准方案(Qiagen,Hilden,Germany)进行纯化。

使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)转染CHO K1细胞并在存在500-1000μg/ml Geneticin的情况下在无血清培养基(CD-CHO,Invitrogen)中生长。共转染如在WO2007/144173中所述的编码PACE/furin(pFu-797)的表达质粒，以使原肽切割效力最大化。生长单细胞来源的克隆并根据通过白蛋白特异性酶免疫测定(参见下文)定量的D′D3-FP表达产率进行选择。最后选择用于D′D3-FP发酵的细胞系称为T2050-CL3。

在应用灌注模式发酵方法的生物反应器中进行D′D3-FP的生产。用于生产含有D′D3的多肽的发酵方法适于细胞系T2050-CL3的解冻，然后是在摇瓶中的细胞扩增，最后是使用Sartorius BioStat B-DCU 5L生物反应器和BioStat STR 50L一次性生物反应器的灌注模式发酵方法。BioSeps 10L或200L(Applikon)分别用作细胞保留装置。细胞培养基是具有8mM L-谷氨酰胺和1μM CuSO₄的PowerCHO3(Lonza BESP1204)或具有10mM L-谷氨酰胺和1μM CuSO₄的ProCHO5(Lonza BESP1072)。

摇瓶中的种子训练是在160rpm的摇床速度在37℃、7.5％CO₂进行的。

用2.5x 10⁵个细胞/mL的靶VCD接种5L生物反应器。在+37.0℃的温度、pH 7.00和在30％的氧饱和度下在具有8mM L-谷氨酰胺和1μM CuSO₄的PowerCHO3中培养细胞。在+37℃从生物反应器运行中进行初始收获之后，将温度转换至+34.0℃(评估范围+31℃至+35℃)。使用喷射CO₂作为酸和NaHCO₃作为碱来控制pH。叠加空气流速设为0.5L/min。环形喷射器用作喷射单元。搅动速度为150rpm，其中下拉模式下叶片叶轮为2倍节距。

用3.0x 10⁵个细胞/mL的靶VCD接种50L生物反应器。在+37.0℃的温度、pH 6.90和在30％的氧饱和度下在具有10mM L-谷氨酰胺和1μM CuSO₄的ProCHO5培养基中培养细胞。在初始一次或两次收获之后，将温度转换至+34.0℃。如上进行pH控制，叠加空气流速设为2L/min。微喷射器用作喷射单元。搅动速度为90rpm，其中下拉模式下叶片叶轮为2倍节距。

当生物反应器中的VCD≥1.0x 10⁶个细胞/mL时开始灌注。灌注率设置为1.0体积/体积/天。以反冲洗模式操作BioSep，其中5(10)分钟的运行时间和功率输入为7(30)W的10秒反冲洗(括号中的数字指的是50L生物反应器)。在+2至+8℃在48小时内在线过滤灌注液和流出液(bleed)并收集在袋中。使用葡萄糖消耗为参数，目标值为2g/L葡萄糖，使用浊度探针通过主动流出控制VCD。在线过滤收获物和流出液，每隔一天更换由一次性滤器和一次性袋组成的收获系统。

为了制备用于下述冷冻干燥和稳定性研究的材料，通过亲和和尺寸排阻色谱纯化D′D3白蛋白融合蛋白收获物。简言之，使用具有30kDa膜(例如Pall Centramate OS030T12)的TFF系统(例如Pall Centramate 500S)将来自生物反应器的无细胞收获物浓缩30倍。将用NaCl和EDTA掺入该浓缩物至终浓度为0.75M NaCl和5mM EDTA，并过夜上样至已用pH7.4的20mM Tris缓冲液预平衡的CaptureSelect人白蛋白柱(Life Technologies)上。用平衡缓冲液洗柱后，用洗脱缓冲液(20mM Tris,2M MgCl₂,pH 7.4)洗脱D’D3-FP。然后将洗脱液浓缩10倍并使用具有30kDa截断值的Ultra Centrifugal Filters(例如Amicon.UFC903024)针对50mM Tris,150mM NaCl,pH 7.4进行透析。为了将D′D3-FP二聚体与单体部分分开，将该材料上样至用50mM Tris,150mM NaCl,pH 7.4预平衡的Superdex200pg柱(GE Healthcare Code:17-1069-01)上，合并含有D’D3-FP二聚体的峰级分。使用二聚体和单体峰级分的曲线下面积来计算二聚体与单体之比。D’D3-FP的二聚体制剂用于以下实施例中的实验。

rVIII-单链

使用的FVIII分子(WO 2004/067566中描述构建体dBN(64-53))进行实施例。在下文中该FVIII分子将被称为“rVIII-单链”。

实施例2：确定FVIII对VWF片段二聚体和单体的亲和力

在生物反应器中表达包含如实施例1中所述的短接头序列的VWF片段(1-1242)白蛋白融合体(D′D3-FP)；在如上所述的纯化和单体和二聚体的分离之后，通过表面等离子体共振经由Biacore仪器(T200，GE Healthcare)评估FVIII对这些制剂的亲和力。

抗白蛋白抗体(MA1-20124，Thermo Scientific)通过NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和EDC(乙醇胺盐酸盐)(两者均包含在来自GE Healthcare的胺偶联试剂盒(BR1000-50)中)经由其N端与活化的CM 3芯片共价偶联。为了固定，将3μg/mL的抗体在醋酸钠缓冲液(10mM，pH5.0)中稀释，并将抗体溶液在芯片上流动7分钟，流速为10μL/min。在固定程序之后，通过将乙醇胺溶液(1M，pH 8.3)在芯片上流动5分钟(流速为10μL/min)，使非偶联葡聚糖长丝饱和。使流动池饱和的目的是最大限度地减少分析物与芯片的非特异性结合。通过使用与上述相同的程序用乙醇胺饱和空的流动池来设置参考流动池。

二聚体和单体D′D3-FP蛋白分别通过D′D3-FP蛋白(5μg/mL)在芯片上流动3分钟(流速为10μL/min)固定至共价偶联的抗白蛋白抗体。

为了生成FVIII的结合曲线，将每个D′D3-FP蛋白制剂在运行缓冲液(HBS-P+:0.1MHEPES,1.5M NaCl和0.5％v/v Surfactant P20,pH 7.4；产品代码BR100671,GEHealthcare)中稀释至0.25nM、0.5nM、1nM、3nM和4nM的浓度。通过进行单循环动力学，每个稀释度浓度递增的样品在芯片上流动2分钟(流速为30μL/min)，然后是用运行缓冲液HBS-P+解离时间为10分钟。所有测量均进行两次。将测量程序的温度调节至+25℃。

使用BiaEvaluation软件计算结合参数。曲线拟合方法基于朗缪尔方程。用于计算的输入数据是分析物FVIII(rVIII-单链)的摩尔质量，其他参数如max.RU和斜率是从拟合的结合和解离曲线中自动提取的。BiaEvaluation软件的输出是结合速率常数和解离速率常数，从中计算亲和力常数。结果如表2所示。

表2：rVIII-单链对D′D3-FP二聚体和单体的亲和力数据

与D'D3-FP单体(K_D＝30nM)相比，二聚体D'D3-FP显示出对FVIII显著(K_D＝34pM)增加的亲和力，二者结果均为rVIII-单链结合更快和解离更慢。

实施例3：

制备FVIII+rD’D3-FP制剂并评估液体状态储存后FVIII:C回收率(即通过显色测定测得的活性)

将纯化的rVIII-单链配制成按制备性尺寸排阻色谱(Superdex 200pg；GEHealthcare，参考编号17-1043)所需的缓冲液和赋形剂组合物(即20mM L-组氨酸、280mMNaCl、3.4mM CaCl₂、0.6％w/v蔗糖、0.02％v/v聚山梨醇酯80，pH 7)。通过透析将纯化的rD’D3-FP配制成相同的缓冲液和赋形剂基质。将两种组分混合在一起以获得所需的FVIII活性和rD’D3-FP浓度，如表3中所述。储存前，将制剂无菌过滤(Millex GV一次性过滤单元；Millipore，参考编号SLGV013SL)以避免微生物污染引起的潜在降解。

然后研究不同组合物在25℃ 6周的时间段内其FVIII:C的回收率。

FVIII:C的回收率(收率)结算为储存后各自制剂中FVIII:C的量除以储存之前溶液中FVIII:C的量的百分比。

表3：在液体状态下不存在和存在rD’D3-FP的情况下rVIII-单链的稳定性

实施例4：

制备FVIII+rD’D3-FP制剂并评估冷冻干燥后FVIII:C回收率(即通过显色测定测得的活性)

将纯化的rVIII-单链配制成按制备性尺寸排阻色谱(Superdex 200pg)的缓冲液和赋形剂组合物(即20mM L-组氨酸、280mM NaCl、3.4mM CaCl₂、0.6％w/v蔗糖、0.02％v/v聚山梨醇酯80，pH 7)。将纯化的rD’D3-FP配制成相同的缓冲液和赋形剂基质。将两种组分混合在一起以获得所需的FVIII活性和rD’D3-FP浓度，如表4中所述。然后分配制剂(2.5mL)并冷冻干燥。然后研究不同组合物冷冻干燥后其FVIII:C的损失。

FVIII:C的损失％计算为100减去复原的冻干物中FVIII:C的量乘以100并除以冷冻干燥之前溶液中FVIII:C的量：

FVIII:C的损失(％)＝100-(100*冻干后FVIII:C/冻干前FVIII:C)

表4：冷冻干燥后取决于含有的rD’D3-FP的量的FVIII:C的损失

实施例5：

制备FVIII+rD’D3-FP制剂并评估在升高的温度下长期储存后冷冻干燥样品中FVIII:C回收率(即通过显色测定测得的活性)

将纯化的rVIII-单链配制成按制备性尺寸排阻色谱(Superdex 200pg)的缓冲液和赋形剂组合物(即20mM L-组氨酸、280mM NaCl、3.4mM CaCl₂、0.6％w/v蔗糖、0.02％v/v聚山梨醇酯80，pH7)。将纯化的rD’D3-FP配制成相同的缓冲液和赋形剂基质。将两种组分混合在一起以获得所需的FVIII活性和rD’D3-FP浓度，如表5中所述。然后分配制剂(2.5mL)到小瓶中并冷冻干燥。然后研究不同组合物冷冻干燥后和在+25℃储存至多24个月后其FVIII:C的损失。

FVIII:C的回收率(稳定性)结算为储存后仍然可测量的FVIII:C的百分比。冷冻干燥后和储存之前测定的FVIII:C用作计算的参考。

表5：冷冻干燥的FVIII在存在或不存在不同量rD’D3-FP的情况下的储存稳定性

摩尔比

根据本发明的任意摩尔比是指含有本发明中使用的多肽的D’D3(单体)亚单位(无论实际上是以单体或二聚体存在)的摩尔浓度和FVIII的摩尔浓度之比。更具体地，除非另外指定，否则本申请中rD’D3-FP与FVIII的任意比是指溶液中或冷冻干燥产品中rD’D3-FP的量或浓度(单位为摩尔或摩尔/L)除以溶液中或冷冻干燥产品中FVIII的量或浓度(单位为摩尔或摩尔/L)。

通常，通过活性测试(FVIII:C)测量FVIII的浓度并会以IU/mL形式给出。rD’D3-FP(VWF的D’D3结构域与白蛋白的重组融合蛋白)的浓度通常以mg/mL形式给出。这些值可以换算为摩尔浓度，如下所述。

用于计算的rD'D3-FP的单体亚单位(包括糖基化)的分子量是127,000Da。用于计算的FVIII(rVIII-单链)的分子量(包括糖基化)是180,000Da并且其用于计算的比活是11,000IU/mg。

表6：基于rD’D3-FP作为含D’D3的多肽和rVIII-单链作为FVIII分子的若干制剂的摩尔比的计算。

*计算基础是单体亚单位

序列表

<110> 康诺贝林伦瑙有限公司

<120> 用于增加凝血因子VIII的体外稳定性的截短的血管性血友病因子（VWF）

<130> 2019_L002_A302

<140> EP19184390.3

<141> 2019-07-04

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5616

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA，其编码构建体VWF片段 - G/S接头 - 白蛋白

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(6)

<223> EcoRI限制性酶切位点

<220>

<221> misc_feature

<222> (32)..(3757)

<223> VWF氨基酸1至1242的编码序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (3758)..(3850)

<223> 甘氨酸/丝氨酸接头的编码序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (3851)..(5608)

<223> 人白蛋白的编码序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (5609)..(5616)

<223> NotI限制性酶切位点

<400> 1

gaattcccgc agccctcatt tgcaggggaa gatgattcct gccagatttg ccggggtgct 60

gcttgctctg gccctcattt tgccagggac cctttgtgca gaaggaactc gcggcaggtc 120

atccacggcc cgatgcagcc ttttcggaag tgacttcgtc aacacctttg atgggagcat 180

gtacagcttt gcgggatact gcagttacct cctggcaggg ggctgccaga aacgctcctt 240

ctcgattatt ggggacttcc agaatggcaa gagagtgagc ctctccgtgt atcttgggga 300

attttttgac atccatttgt ttgtcaatgg taccgtgaca cagggggacc aaagagtctc 360

catgccctat gcctccaaag ggctgtatct agaaactgag gctgggtact acaagctgtc 420

cggtgaggcc tatggctttg tggccaggat cgatggcagc ggcaactttc aagtcctgct 480

gtcagacaga tacttcaaca agacctgcgg gctgtgtggc aactttaaca tctttgctga 540

agatgacttt atgacccaag aagggacctt gacctcggac ccttatgact ttgccaactc 600

atgggctctg agcagtggag aacagtggtg tgaacgggca tctcctccca gcagctcatg 660

caacatctcc tctggggaaa tgcagaaggg cctgtgggag cagtgccagc ttctgaagag 720

cacctcggtg tttgcccgct gccaccctct ggtggacccc gagccttttg tggccctgtg 780

tgagaagact ttgtgtgagt gtgctggggg gctggagtgc gcctgccctg ccctcctgga 840

gtacgcccgg acctgtgccc aggagggaat ggtgctgtac ggctggaccg accacagcgc 900

gtgcagccca gtgtgccctg ctggtatgga gtataggcag tgtgtgtccc cttgcgccag 960

gacctgccag agcctgcaca tcaatgaaat gtgtcaggag cgatgcgtgg atggctgcag 1020

ctgccctgag ggacagctcc tggatgaagg cctctgcgtg gagagcaccg agtgtccctg 1080

cgtgcattcc ggaaagcgct accctcccgg cacctccctc tctcgagact gcaacacctg 1140

catttgccga aacagccagt ggatctgcag caatgaagaa tgtccagggg agtgccttgt 1200

cacaggtcaa tcacacttca agagctttga caacagatac ttcaccttca gtgggatctg 1260

ccagtacctg ctggcccggg attgccagga ccactccttc tccattgtca ttgagactgt 1320

ccagtgtgct gatgaccgcg acgctgtgtg cacccgctcc gtcaccgtcc ggctgcctgg 1380

cctgcacaac agccttgtga aactgaagca tggggcagga gttgccatgg atggccagga 1440

cgtccagctc cccctcctga aaggtgacct ccgcatccag catacagtga cggcctccgt 1500

gcgcctcagc tacggggagg acctgcagat ggactgggat ggccgcggga ggctgctggt 1560

gaagctgtcc cccgtctatg ccgggaagac ctgcggcctg tgtgggaatt acaatggcaa 1620

ccagggcgac gacttcctta ccccctctgg gctggcggag ccccgggtgg aggacttcgg 1680

gaacgcctgg aagctgcacg gggactgcca ggacctgcag aagcagcaca gcgatccctg 1740

cgccctcaac ccgcgcatga ccaggttctc cgaggaggcg tgcgcggtcc tgacgtcccc 1800

cacattcgag gcctgccatc gtgccgtcag cccgctgccc tacctgcgga actgccgcta 1860

cgacgtgtgc tcctgctcgg acggccgcga gtgcctgtgc ggcgccctgg ccagctatgc 1920

cgcggcctgc gcggggagag gcgtgcgcgt cgcgtggcgc gagccaggcc gctgtgagct 1980

gaactgcccg aaaggccagg tgtacctgca gtgcgggacc ccctgcaacc tgacctgccg 2040

ctctctctct tacccggatg aggaatgcaa tgaggcctgc ctggagggct gcttctgccc 2100

cccagggctc tacatggatg agagggggga ctgcgtgccc aaggcccagt gcccctgtta 2160

ctatgacggt gagatcttcc agccagaaga catcttctca gaccatcaca ccatgtgcta 2220

ctgtgaggat ggcttcatgc actgtaccat gagtggagtc cccggaagct tgctgcctga 2280

cgctgtcctc agcagtcccc tgtctcatcg cagcaaaagg agcctatcct gtcggccccc 2340

catggtcaag ctggtgtgtc ccgctgacaa cctgcgggct gaagggctcg agtgtaccaa 2400

aacgtgccag aactatgacc tggagtgcat gagcatgggc tgtgtctctg gctgcctctg 2460

ccccccgggc atggtccggc atgagaacag atgtgtggcc ctggaaaggt gtccctgctt 2520

ccatcagggc aaggagtatg cccctggaga aacagtgaag attggctgca acacttgtgt 2580

ctgtcgggac cggaagtgga actgcacaga ccatgtgtgt gatgccacgt gctccacgat 2640

cggcatggcc cactacctca ccttcgacgg gctcaaatac ctgttccccg gggagtgcca 2700

gtacgttctg gtgcaggatt actgcggcag taaccctggg acctttcgga tcctagtggg 2760

gaataaggga tgcagccacc cctcagtgaa atgcaagaaa cgggtcacca tcctggtgga 2820

gggaggagag attgagctgt ttgacgggga ggtgaatgtg aagaggccca tgaaggatga 2880

gactcacttt gaggtggtgg agtctggccg gtacatcatt ctgctgctgg gcaaagccct 2940

ctccgtggtc tgggaccgcc acctgagcat ctccgtggtc ctgaagcaga cataccagga 3000

gaaagtgtgt ggcctgtgtg ggaattttga tggcatccag aacaatgacc tcaccagcag 3060

caacctccaa gtggaggaag accctgtgga ctttgggaac tcctggaaag tgagctcgca 3120

gtgtgctgac accagaaaag tgcctctgga ctcatcccct gccacctgcc ataacaacat 3180

catgaagcag acgatggtgg attcctcctg tagaatcctt accagtgacg tcttccagga 3240

ctgcaacaag ctggtggacc ccgagccata tctggatgtc tgcatttacg acacctgctc 3300

ctgtgagtcc attggggact gcgcctgctt ctgcgacacc attgctgcct atgcccacgt 3360

gtgtgcccag catggcaagg tggtgacctg gaggacggcc acattgtgcc cccagagctg 3420

cgaggagagg aatctccggg agaacgggta tgagtgtgag tggcgctata acagctgtgc 3480

acctgcctgt caagtcacgt gtcagcaccc tgagccactg gcctgccctg tgcagtgtgt 3540

ggagggctgc catgcccact gccctccagg gaaaatcctg gatgagcttt tgcagacctg 3600

cgttgaccct gaagactgtc cagtgtgtga ggtggctggc cggcgttttg cctcaggaaa 3660

gaaagtcacc ttgaatccca gtgaccctga gcactgccag atttgccact gtgatgttgt 3720

caacctcacc tgtgaagcct gccaggagcc gggaggctcg agcgggggat ctggcgggtc 3780

tggaggctct ggagggtcgg gaggctctgg aggctctggg ggatctggcg ggtctggagg 3840

gtcgggatcc gatgcacaca agagtgaggt tgctcatcgg tttaaagatt tgggagaaga 3900

aaatttcaaa gccttggtgt tgattgcctt tgctcagtat cttcagcagt gtccatttga 3960

agatcatgta aaattagtga atgaagtaac tgaatttgca aaaacatgtg ttgctgatga 4020

gtcagctgaa aattgtgaca aatcacttca tacccttttt ggagacaaat tatgcacagt 4080

tgcaactctt cgtgaaacct atggtgaaat ggctgactgc tgtgcaaaac aagaacctga 4140

gagaaatgaa tgcttcttgc aacacaaaga tgacaaccca aacctccccc gattggtgag 4200

accagaggtt gatgtgatgt gcactgcttt tcatgacaat gaagagacat ttttgaaaaa 4260

atacttatat gaaattgcca gaagacatcc ttacttttat gccccggaac tccttttctt 4320

tgctaaaagg tataaagctg cttttacaga atgttgccaa gctgctgata aagctgcctg 4380

cctgttgcca aagctcgatg aacttcggga tgaagggaag gcttcgtctg ccaaacagag 4440

actcaagtgt gccagtctcc aaaaatttgg agaaagagct ttcaaagcat gggcagtagc 4500

tcgcctgagc cagagatttc ccaaagctga gtttgcagaa gtttccaagt tagtgacaga 4560

tcttaccaaa gtccacacgg aatgctgcca tggagatctg cttgaatgtg ctgatgacag 4620

ggcggacctt gccaagtata tctgtgaaaa tcaagattcg atctccagta aactgaagga 4680

atgctgtgaa aaacctctgt tggaaaaatc ccactgcatt gccgaagtgg aaaatgatga 4740

gatgcctgct gacttgcctt cattagctgc tgattttgtt gaaagtaagg atgtttgcaa 4800

aaactatgct gaggcaaagg atgtcttcct gggcatgttt ttgtatgaat atgcaagaag 4860

gcatcctgat tactctgtcg tgctgctgct gagacttgcc aagacatatg aaaccactct 4920

agagaagtgc tgtgccgctg cagatcctca tgaatgctat gccaaagtgt tcgatgaatt 4980

taaacctctt gtggaagagc ctcagaattt aatcaaacaa aattgtgagc tttttgagca 5040

gcttggagag tacaaattcc agaatgcgct attagttcgt tacaccaaga aagtacccca 5100

agtgtcaact ccaactcttg tagaggtctc aagaaaccta ggaaaagtgg gcagcaaatg 5160

ttgtaaacat cctgaagcaa aaagaatgcc ctgtgcagaa gactatctat ccgtggtcct 5220

gaaccagtta tgtgtgttgc atgagaaaac gccagtaagt gacagagtca ccaaatgctg 5280

cacagaatcc ttggtgaaca ggcgaccatg cttttcagct ctggaagtcg atgaaacata 5340

cgttcccaaa gagtttaatg ctgaaacatt caccttccat gcagatatat gcacactttc 5400

tgagaaggag agacaaatca agaaacaaac tgcacttgtt gagctcgtga aacacaagcc 5460

caaggcaaca aaagagcaac tgaaagctgt tatggatgat ttcgcagctt ttgtagagaa 5520

gtgctgcaag gctgacgata aggagacctg ctttgccgag gagggtaaaa aacttgttgc 5580

tgcaagtcaa gctgccttag gcttataggc ggccgc 5616

<210> 2

<211> 1096

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO:1编码的多肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(479)

<223> VWF D碊3区域(VWF氨基酸764 - 1242)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(100)

<223> Xaa是任意氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (480)..(510)

<223> 甘氨酸/丝氨酸接头

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (511)..(1095)

<223> 人白蛋白

<400> 2

Xaa Ser Leu Ser Cys Arg Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala

1 5 10 15

Asp Asn Leu Arg Ala Glu Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn

20 25 30

Tyr Asp Leu Glu Cys Met Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys

35 40 45

Pro Pro Gly Met Val Arg His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg

50 55 60

Cys Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val

65 70 75 80

Lys Ile Gly Cys Asn Thr Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys

85 90 95

Thr Asp His Val Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His

100 105 110

Tyr Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln

115 120 125

Tyr Val Leu Val Gln Asp Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg

130 135 140

Ile Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys

145 150 155 160

Lys Arg Val Thr Ile Leu Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp

165 170 175

Gly Glu Val Asn Val Lys Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu

180 185 190

Val Val Glu Ser Gly Arg Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu

195 200 205

Ser Val Val Trp Asp Arg His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln

210 215 220

Thr Tyr Gln Glu Lys Val Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile

225 230 235 240

Gln Asn Asn Asp Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro

245 250 255

Val Asp Phe Gly Asn Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr

260 265 270

Arg Lys Val Pro Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile

275 280 285

Met Lys Gln Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp

290 295 300

Val Phe Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp

305 310 315 320

Val Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala

325 330 335

Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln His

340 345 350

Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln Ser Cys

355 360 365

Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu Trp Arg Tyr

370 375 380

Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln His Pro Glu Pro

385 390 395 400

Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys His Ala His Cys Pro

405 410 415

Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln Thr Cys Val Asp Pro Glu

420 425 430

Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys

435 440 445

Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His

450 455 460

Cys Asp Val Val Asn Leu Thr Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly

465 470 475 480

Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

485 490 495

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Asp

500 505 510

Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu

515 520 525

Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln

530 535 540

Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe

545 550 555 560

Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser

565 570 575

Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg

580 585 590

Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu

595 600 605

Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro

610 615 620

Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp

625 630 635 640

Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg

645 650 655

His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr

660 665 670

Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys

675 680 685

Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser

690 695 700

Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg

705 710 715 720

Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys

725 730 735

Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val

740 745 750

His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg

755 760 765

Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser

770 775 780

Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys

785 790 795 800

Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu

805 810 815

Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu

820 825 830

Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg

835 840 845

His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr

850 855 860

Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys

865 870 875 880

Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln

885 890 895

Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr

900 905 910

Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln

915 920 925

Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val

930 935 940

Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala

945 950 955 960

Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu

965 970 975

Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu

980 985 990

Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr

995 1000 1005

Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp

1010 1015 1020

Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr

1025 1030 1035

Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu

1040 1045 1050

Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys

1055 1060 1065

Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly

1070 1075 1080

Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

1085 1090 1095

<210> 3

<211> 8442

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(8442)

<400> 3

atg att cct gcc aga ttt gcc ggg gtg ctg ctt gct ctg gcc ctc att 48

Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile

1 5 10 15

ttg cca ggg acc ctt tgt gca gaa gga act cgc ggc agg tca tcc acg 96

Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr

20 25 30

gcc cga tgc agc ctt ttc gga agt gac ttc gtc aac acc ttt gat ggg 144

Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly

35 40 45

agc atg tac agc ttt gcg gga tac tgc agt tac ctc ctg gca ggg ggc 192

Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly

50 55 60

tgc cag aaa cgc tcc ttc tcg att att ggg gac ttc cag aat ggc aag 240

Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys

65 70 75 80

aga gtg agc ctc tcc gtg tat ctt ggg gaa ttt ttt gac atc cat ttg 288

Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu

85 90 95

ttt gtc aat ggt acc gtg aca cag ggg gac caa aga gtc tcc atg ccc 336

Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro

100 105 110

tat gcc tcc aaa ggg ctg tat cta gaa act gag gct ggg tac tac aag 384

Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys

115 120 125

ctg tcc ggt gag gcc tat ggc ttt gtg gcc agg atc gat ggc agc ggc 432

Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly

130 135 140

aac ttt caa gtc ctg ctg tca gac aga tac ttc aac aag acc tgc ggg 480

Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly

145 150 155 160

ctg tgt ggc aac ttt aac atc ttt gct gaa gat gac ttt atg acc caa 528

Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln

165 170 175

gaa ggg acc ttg acc tcg gac cct tat gac ttt gcc aac tca tgg gct 576

Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala

180 185 190

ctg agc agt gga gaa cag tgg tgt gaa cgg gca tct cct ccc agc agc 624

Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser

195 200 205

tca tgc aac atc tcc tct ggg gaa atg cag aag ggc ctg tgg gag cag 672

Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln

210 215 220

tgc cag ctt ctg aag agc acc tcg gtg ttt gcc cgc tgc cac cct ctg 720

Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu

225 230 235 240

gtg gac ccc gag cct ttt gtg gcc ctg tgt gag aag act ttg tgt gag 768

Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu

245 250 255

tgt gct ggg ggg ctg gag tgc gcc tgc cct gcc ctc ctg gag tac gcc 816

Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala

260 265 270

cgg acc tgt gcc cag gag gga atg gtg ctg tac ggc tgg acc gac cac 864

Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His

275 280 285

agc gcg tgc agc cca gtg tgc cct gct ggt atg gag tat agg cag tgt 912

Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys

290 295 300

gtg tcc cct tgc gcc agg acc tgc cag agc ctg cac atc aat gaa atg 960

Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met

305 310 315 320

tgt cag gag cga tgc gtg gat ggc tgc agc tgc cct gag gga cag ctc 1008

Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu

325 330 335

ctg gat gaa ggc ctc tgc gtg gag agc acc gag tgt ccc tgc gtg cat 1056

Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His

340 345 350

tcc gga aag cgc tac cct ccc ggc acc tcc ctc tct cga gac tgc aac 1104

Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn

355 360 365

acc tgc att tgc cga aac agc cag tgg atc tgc agc aat gaa gaa tgt 1152

Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys

370 375 380

cca ggg gag tgc ctt gtc aca ggt caa tca cac ttc aag agc ttt gac 1200

Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp

385 390 395 400

aac aga tac ttc acc ttc agt ggg atc tgc cag tac ctg ctg gcc cgg 1248

Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg

405 410 415

gat tgc cag gac cac tcc ttc tcc att gtc att gag act gtc cag tgt 1296

Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys

420 425 430

gct gat gac cgc gac gct gtg tgc acc cgc tcc gtc acc gtc cgg ctg 1344

Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu

435 440 445

cct ggc ctg cac aac agc ctt gtg aaa ctg aag cat ggg gca gga gtt 1392

Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val

450 455 460

gcc atg gat ggc cag gac gtc cag ctc ccc ctc ctg aaa ggt gac ctc 1440

Ala Met Asp Gly Gln Asp Val Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu

465 470 475 480

cgc atc cag cat aca gtg acg gcc tcc gtg cgc ctc agc tac ggg gag 1488

Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu

485 490 495

gac ctg cag atg gac tgg gat ggc cgc ggg agg ctg ctg gtg aag ctg 1536

Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu

500 505 510

tcc ccc gtc tat gcc ggg aag acc tgc ggc ctg tgt ggg aat tac aat 1584

Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn

515 520 525

ggc aac cag ggc gac gac ttc ctt acc ccc tct ggg ctg gcg gag ccc 1632

Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro

530 535 540

cgg gtg gag gac ttc ggg aac gcc tgg aag ctg cac ggg gac tgc cag 1680

Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln

545 550 555 560

gac ctg cag aag cag cac agc gat ccc tgc gcc ctc aac ccg cgc atg 1728

Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met

565 570 575

acc agg ttc tcc gag gag gcg tgc gcg gtc ctg acg tcc ccc aca ttc 1776

Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe

580 585 590

gag gcc tgc cat cgt gcc gtc agc ccg ctg ccc tac ctg cgg aac tgc 1824

Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys

595 600 605

cgc tac gac gtg tgc tcc tgc tcg gac ggc cgc gag tgc ctg tgc ggc 1872

Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly

610 615 620

gcc ctg gcc agc tat gcc gcg gcc tgc gcg ggg aga ggc gtg cgc gtc 1920

Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val

625 630 635 640

gcg tgg cgc gag cca ggc cgc tgt gag ctg aac tgc ccg aaa ggc cag 1968

Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln

645 650 655

gtg tac ctg cag tgc ggg acc ccc tgc aac ctg acc tgc cgc tct ctc 2016

Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu

660 665 670

tct tac ccg gat gag gaa tgc aat gag gcc tgc ctg gag ggc tgc ttc 2064

Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe

675 680 685

tgc ccc cca ggg ctc tac atg gat gag agg ggg gac tgc gtg ccc aag 2112

Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys

690 695 700

gcc cag tgc ccc tgt tac tat gac ggt gag atc ttc cag cca gaa gac 2160

Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp

705 710 715 720

atc ttc tca gac cat cac acc atg tgc tac tgt gag gat ggc ttc atg 2208

Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met

725 730 735

cac tgt acc atg agt gga gtc ccc gga agc ttg ctg cct gac gct gtc 2256

His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val

740 745 750

ctc agc agt ccc ctg tct cat cgc agc aaa agg agc cta tcc tgt cgg 2304

Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg

755 760 765

ccc ccc atg gtc aag ctg gtg tgt ccc gct gac aac ctg cgg gct gaa 2352

Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu

770 775 780

ggg ctc gag tgt acc aaa acg tgc cag aac tat gac ctg gag tgc atg 2400

Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met

785 790 795 800

agc atg ggc tgt gtc tct ggc tgc ctc tgc ccc ccg ggc atg gtc cgg 2448

Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg

805 810 815

cat gag aac aga tgt gtg gcc ctg gaa agg tgt ccc tgc ttc cat cag 2496

His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln

820 825 830

ggc aag gag tat gcc cct gga gaa aca gtg aag att ggc tgc aac act 2544

Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr

835 840 845

tgt gtc tgt cgg gac cgg aag tgg aac tgc aca gac cat gtg tgt gat 2592

Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp

850 855 860

gcc acg tgc tcc acg atc ggc atg gcc cac tac ctc acc ttc gac ggg 2640

Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly

865 870 875 880

ctc aaa tac ctg ttc ccc ggg gag tgc cag tac gtt ctg gtg cag gat 2688

Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp

885 890 895

tac tgc ggc agt aac cct ggg acc ttt cgg atc cta gtg ggg aat aag 2736

Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys

900 905 910

gga tgc agc cac ccc tca gtg aaa tgc aag aaa cgg gtc acc atc ctg 2784

Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu

915 920 925

gtg gag gga gga gag att gag ctg ttt gac ggg gag gtg aat gtg aag 2832

Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys

930 935 940

agg ccc atg aag gat gag act cac ttt gag gtg gtg gag tct ggc cgg 2880

Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg

945 950 955 960

tac atc att ctg ctg ctg ggc aaa gcc ctc tcc gtg gtc tgg gac cgc 2928

Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg

965 970 975

cac ctg agc atc tcc gtg gtc ctg aag cag aca tac cag gag aaa gtg 2976

His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val

980 985 990

tgt ggc ctg tgt ggg aat ttt gat ggc atc cag aac aat gac ctc acc 3024

Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr

995 1000 1005

agc agc aac ctc caa gtg gag gaa gac cct gtg gac ttt ggg aac 3069

Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn

1010 1015 1020

tcc tgg aaa gtg agc tcg cag tgt gct gac acc aga aaa gtg cct 3114

Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro

1025 1030 1035

ctg gac tca tcc cct gcc acc tgc cat aac aac atc atg aag cag 3159

Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln

1040 1045 1050

acg atg gtg gat tcc tcc tgt aga atc ctt acc agt gac gtc ttc 3204

Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe

1055 1060 1065

cag gac tgc aac aag ctg gtg gac ccc gag cca tat ctg gat gtc 3249

Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val

1070 1075 1080

tgc att tac gac acc tgc tcc tgt gag tcc att ggg gac tgc gcc 3294

Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala

1085 1090 1095

tgc ttc tgc gac acc att gct gcc tat gcc cac gtg tgt gcc cag 3339

Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln

1100 1105 1110

cat ggc aag gtg gtg acc tgg agg acg gcc aca ttg tgc ccc cag 3384

His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln

1115 1120 1125

agc tgc gag gag agg aat ctc cgg gag aac ggg tat gag tgt gag 3429

Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu

1130 1135 1140

tgg cgc tat aac agc tgt gca cct gcc tgt caa gtc acg tgt cag 3474

Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln

1145 1150 1155

cac cct gag cca ctg gcc tgc cct gtg cag tgt gtg gag ggc tgc 3519

His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys

1160 1165 1170

cat gcc cac tgc cct cca ggg aaa atc ctg gat gag ctt ttg cag 3564

His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln

1175 1180 1185

acc tgc gtt gac cct gaa gac tgt cca gtg tgt gag gtg gct ggc 3609

Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly

1190 1195 1200

cgg cgt ttt gcc tca gga aag aaa gtc acc ttg aat ccc agt gac 3654

Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp

1205 1210 1215

cct gag cac tgc cag att tgc cac tgt gat gtt gtc aac ctc acc 3699

Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr

1220 1225 1230

tgt gaa gcc tgc cag gag ccg gga ggc ctg gtg gtg cct ccc aca 3744

Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr

1235 1240 1245

gat gcc ccg gtg agc ccc acc act ctg tat gtg gag gac atc tcg 3789

Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser

1250 1255 1260

gaa ccg ccg ttg cac gat ttc tac tgc agc agg cta ctg gac ctg 3834

Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu

1265 1270 1275

gtc ttc ctg ctg gat ggc tcc tcc agg ctg tcc gag gct gag ttt 3879

Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe

1280 1285 1290

gaa gtg ctg aag gcc ttt gtg gtg gac atg atg gag cgg ctg cgc 3924

Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg

1295 1300 1305

atc tcc cag aag tgg gtc cgc gtg gcc gtg gtg gag tac cac gac 3969

Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp

1310 1315 1320

ggc tcc cac gcc tac atc ggg ctc aag gac cgg aag cga ccg tca 4014

Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser

1325 1330 1335

gag ctg cgg cgc att gcc agc cag gtg aag tat gcg ggc agc cag 4059

Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln

1340 1345 1350

gtg gcc tcc acc agc gag gtc ttg aaa tac aca ctg ttc caa atc 4104

Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile

1355 1360 1365

ttc agc aag atc gac cgc cct gaa gcc tcc cgc atc gcc ctg ctc 4149

Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Ala Leu Leu

1370 1375 1380

ctg atg gcc agc cag gag ccc caa cgg atg tcc cgg aac ttt gtc 4194

Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val

1385 1390 1395

cgc tac gtc cag ggc ctg aag aag aag aag gtc att gtg atc ccg 4239

Arg Tyr Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro

1400 1405 1410

gtg ggc att ggg ccc cat gcc aac ctc aag cag atc cgc ctc atc 4284

Val Gly Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile

1415 1420 1425

gag aag cag gcc cct gag aac aag gcc ttc gtg ctg agc agt gtg 4329

Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val

1430 1435 1440

gat gag ctg gag cag caa agg gac gag atc gtt agc tac ctc tgt 4374

Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys

1445 1450 1455

gac ctt gcc cct gaa gcc cct cct cct act ctg ccc ccc cac atg 4419

Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro His Met

1460 1465 1470

gca caa gtc act gtg ggc ccg ggg ctc ttg ggg gtt tcg acc ctg 4464

Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu

1475 1480 1485

ggg ccc aag agg aac tcc atg gtt ctg gat gtg gcg ttc gtc ctg 4509

Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu

1490 1495 1500

gaa gga tcg gac aaa att ggt gaa gcc gac ttc aac agg agc aag 4554

Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys

1505 1510 1515

gag ttc atg gag gag gtg att cag cgg atg gat gtg ggc cag gac 4599

Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly Gln Asp

1520 1525 1530

agc atc cac gtc acg gtg ctg cag tac tcc tac atg gtg acc gtg 4644

Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr Val

1535 1540 1545

gag tac ccc ttc agc gag gca cag tcc aaa ggg gac atc ctg cag 4689

Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln

1550 1555 1560

cgg gtg cga gag atc cgc tac cag ggc ggc aac agg acc aac act 4734

Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr

1565 1570 1575

ggg ctg gcc ctg cgg tac ctc tct gac cac agc ttc ttg gtc agc 4779

Gly Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser

1580 1585 1590

cag ggt gac cgg gag cag gcg ccc aac ctg gtc tac atg gtc acc 4824

Gln Gly Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr

1595 1600 1605

gga aat cct gcc tct gat gag atc aag agg ctg cct gga gac atc 4869

Gly Asn Pro Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile

1610 1615 1620

cag gtg gtg ccc att gga gtg ggc cct aat gcc aac gtg cag gag 4914

Gln Val Val Pro Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu

1625 1630 1635

ctg gag agg att ggc tgg ccc aat gcc cct atc ctc atc cag gac 4959

Leu Glu Arg Ile Gly Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp

1640 1645 1650

ttt gag acg ctc ccc cga gag gct cct gac ctg gtg ctg cag agg 5004

Phe Glu Thr Leu Pro Arg Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg

1655 1660 1665

tgc tgc tcc gga gag ggg ctg cag atc ccc acc ctc tcc cct gca 5049

Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala

1670 1675 1680

cct gac tgc agc cag ccc ctg gac gtg atc ctt ctc ctg gat ggc 5094

Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly

1685 1690 1695

tcc tcc agt ttc cca gct tct tat ttt gat gaa atg aag agt ttc 5139

Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe

1700 1705 1710

gcc aag gct ttc att tca aaa gcc aat ata ggg cct cgt ctc act 5184

Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile Gly Pro Arg Leu Thr

1715 1720 1725

cag gtg tca gtg ctg cag tat gga agc atc acc acc att gac gtg 5229

Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Thr Thr Ile Asp Val

1730 1735 1740

cca tgg aac gtg gtc ccg gag aaa gcc cat ttg ctg agc ctt gtg 5274

Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu Ser Leu Val

1745 1750 1755

gac gtc atg cag cgg gag gga ggc ccc agc caa atc ggg gat gcc 5319

Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly Asp Ala

1760 1765 1770

ttg ggc ttt gct gtg cga tac ttg act tca gaa atg cat ggg gcg 5364

Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His Gly Ala

1775 1780 1785

cgc ccg gga gcc tca aag gcg gtg gtc atc ctg gtc acg gac gtc 5409

Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu Val Thr Asp Val

1790 1795 1800

tct gtg gat tca gtg gat gca gca gct gat gcc gcc agg tcc aac 5454

Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg Ser Asn

1805 1810 1815

aga gtg aca gtg ttc cct att gga att gga gat cgc tac gat gca 5499

Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr Asp Ala

1820 1825 1830

gcc cag cta cgg atc ttg gca ggc cca gca ggc gac tcc aac gtg 5544

Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser Asn Val

1835 1840 1845

gtg aag ctc cag cga atc gaa gac ctc cct acc atg gtc acc ttg 5589

Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Met Val Thr Leu

1850 1855 1860

ggc aat tcc ttc ctc cac aaa ctg tgc tct gga ttt gtt agg att 5634

Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val Arg Ile

1865 1870 1875

tgc atg gat gag gat ggg aat gag aag agg ccc ggg gac gtc tgg 5679

Cys Met Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys Arg Pro Gly Asp Val Trp

1880 1885 1890

acc ttg cca gac cag tgc cac acc gtg act tgc cag cca gat ggc 5724

Thr Leu Pro Asp Gln Cys His Thr Val Thr Cys Gln Pro Asp Gly

1895 1900 1905

cag acc ttg ctg aag agt cat cgg gtc aac tgt gac cgg ggg ctg 5769

Gln Thr Leu Leu Lys Ser His Arg Val Asn Cys Asp Arg Gly Leu

1910 1915 1920

agg cct tcg tgc cct aac agc cag tcc cct gtt aaa gtg gaa gag 5814

Arg Pro Ser Cys Pro Asn Ser Gln Ser Pro Val Lys Val Glu Glu

1925 1930 1935

acc tgt ggc tgc cgc tgg acc tgc ccc tgc gtg tgc aca ggc agc 5859

Thr Cys Gly Cys Arg Trp Thr Cys Pro Cys Val Cys Thr Gly Ser

1940 1945 1950

tcc act cgg cac atc gtg acc ttt gat ggg cag aat ttc aag ctg 5904

Ser Thr Arg His Ile Val Thr Phe Asp Gly Gln Asn Phe Lys Leu

1955 1960 1965

act ggc agc tgt tct tat gtc cta ttt caa aac aag gag cag gac 5949

Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val Leu Phe Gln Asn Lys Glu Gln Asp

1970 1975 1980

ctg gag gtg att ctc cat aat ggt gcc tgc agc cct gga gca agg 5994

Leu Glu Val Ile Leu His Asn Gly Ala Cys Ser Pro Gly Ala Arg

1985 1990 1995

cag ggc tgc atg aaa tcc atc gag gtg aag cac agt gcc ctc tcc 6039

Gln Gly Cys Met Lys Ser Ile Glu Val Lys His Ser Ala Leu Ser

2000 2005 2010

gtc gag ctg cac agt gac atg gag gtg acg gtg aat ggg aga ctg 6084

Val Glu Leu His Ser Asp Met Glu Val Thr Val Asn Gly Arg Leu

2015 2020 2025

gtc tct gtt cct tac gtg ggt ggg aac atg gaa gtc aac gtt tat 6129

Val Ser Val Pro Tyr Val Gly Gly Asn Met Glu Val Asn Val Tyr

2030 2035 2040

ggt gcc atc atg cat gag gtc aga ttc aat cac ctt ggt cac atc 6174

Gly Ala Ile Met His Glu Val Arg Phe Asn His Leu Gly His Ile

2045 2050 2055

ttc aca ttc act cca caa aac aat gag ttc caa ctg cag ctc agc 6219

Phe Thr Phe Thr Pro Gln Asn Asn Glu Phe Gln Leu Gln Leu Ser

2060 2065 2070

ccc aag act ttt gct tca aag acg tat ggt ctg tgt ggg atc tgt 6264

Pro Lys Thr Phe Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Leu Cys Gly Ile Cys

2075 2080 2085

gat gag aac gga gcc aat gac ttc atg ctg agg gat ggc aca gtc 6309

Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp Phe Met Leu Arg Asp Gly Thr Val

2090 2095 2100

acc aca gac tgg aaa aca ctt gtt cag gaa tgg act gtg cag cgg 6354

Thr Thr Asp Trp Lys Thr Leu Val Gln Glu Trp Thr Val Gln Arg

2105 2110 2115

cca ggg cag acg tgc cag ccc atc ctg gag gag cag tgt ctt gtc 6399

Pro Gly Gln Thr Cys Gln Pro Ile Leu Glu Glu Gln Cys Leu Val

2120 2125 2130

ccc gac agc tcc cac tgc cag gtc ctc ctc tta cca ctg ttt gct 6444

Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu Leu Leu Pro Leu Phe Ala

2135 2140 2145

gaa tgc cac aag gtc ctg gct cca gcc aca ttc tat gcc atc tgc 6489

Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala Thr Phe Tyr Ala Ile Cys

2150 2155 2160

cag cag gac agt tgc cac cag gag caa gtg tgt gag gtg atc gcc 6534

Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu Gln Val Cys Glu Val Ile Ala

2165 2170 2175

tct tat gcc cac ctc tgt cgg acc aac ggg gtc tgc gtt gac tgg 6579

Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn Gly Val Cys Val Asp Trp

2180 2185 2190

agg aca cct gat ttc tgt gct atg tca tgc cca cca tct ctg gtt 6624

Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser Cys Pro Pro Ser Leu Val

2195 2200 2205

tat aac cac tgt gag cat ggc tgt ccc cgg cac tgt gat ggc aac 6669

Tyr Asn His Cys Glu His Gly Cys Pro Arg His Cys Asp Gly Asn

2210 2215 2220

gtg agc tcc tgt ggg gac cat ccc tcc gaa ggc tgt ttc tgc cct 6714

Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser Glu Gly Cys Phe Cys Pro

2225 2230 2235

cca gat aaa gtc atg ttg gaa ggc agc tgt gtc cct gaa gag gcc 6759

Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser Cys Val Pro Glu Glu Ala

2240 2245 2250

tgc act cag tgc att ggt gag gat gga gtc cag cac cag ttc ctg 6804

Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly Val Gln His Gln Phe Leu

2255 2260 2265

gaa gcc tgg gtc ccg gac cac cag ccc tgt cag atc tgc aca tgc 6849

Glu Ala Trp Val Pro Asp His Gln Pro Cys Gln Ile Cys Thr Cys

2270 2275 2280

ctc agc ggg cgg aag gtc aac tgc aca acg cag ccc tgc ccc acg 6894

Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro Cys Pro Thr

2285 2290 2295

gcc aaa gct ccc acg tgt ggc ctg tgt gaa gta gcc cgc ctc cgc 6939

Ala Lys Ala Pro Thr Cys Gly Leu Cys Glu Val Ala Arg Leu Arg

2300 2305 2310

cag aat gca gac cag tgc tgc ccc gag tat gag tgt gtg tgt gac 6984

Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu Tyr Glu Cys Val Cys Asp

2315 2320 2325

cca gtg agc tgt gac ctg ccc cca gtg cct cac tgt gaa cgt ggc 7029

Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro Pro Val Pro His Cys Glu Arg Gly

2330 2335 2340

ctc cag ccc aca ctg acc aac cct ggc gag tgc aga ccc aac ttc 7074

Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly Glu Cys Arg Pro Asn Phe

2345 2350 2355

acc tgc gcc tgc agg aag gag gag tgc aaa aga gtg tcc cca ccc 7119

Thr Cys Ala Cys Arg Lys Glu Glu Cys Lys Arg Val Ser Pro Pro

2360 2365 2370

tcc tgc ccc ccg cac cgt ttg ccc acc ctt cgg aag acc cag tgc 7164

Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr Leu Arg Lys Thr Gln Cys

2375 2380 2385

tgt gat gag tat gag tgt gcc tgc aac tgt gtc aac tcc aca gtg 7209

Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn Cys Val Asn Ser Thr Val

2390 2395 2400

agc tgt ccc ctt ggg tac ttg gcc tca acc gcc acc aat gac tgt 7254

Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser Thr Ala Thr Asn Asp Cys

2405 2410 2415

ggc tgt acc aca acc acc tgc ctt ccc gac aag gtg tgt gtc cac 7299

Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro Asp Lys Val Cys Val His

2420 2425 2430

cga agc acc atc tac cct gtg ggc cag ttc tgg gag gag ggc tgc 7344

Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln Phe Trp Glu Glu Gly Cys

2435 2440 2445

gat gtg tgc acc tgc acc gac atg gag gat gcc gtg atg ggc ctc 7389

Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu Asp Ala Val Met Gly Leu

2450 2455 2460

cgc gtg gcc cag tgc tcc cag aag ccc tgt gag gac agc tgt cgg 7434

Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro Cys Glu Asp Ser Cys Arg

2465 2470 2475

tcg ggc ttc act tac gtt ctg cat gaa ggc gag tgc tgt gga agg 7479

Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys Gly Arg

2480 2485 2490

tgc ctg cca tct gcc tgt gag gtg gtg act ggc tca ccg cgg ggg 7524

Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro Arg Gly

2495 2500 2505

gac tcc cag tct tcc tgg aag agt gtc ggc tcc cag tgg gcc tcc 7569

Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp Ala Ser

2510 2515 2520

ccg gag aac ccc tgc ctc atc aat gag tgt gtc cga gtg aag gag 7614

Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu Cys Val Arg Val Lys Glu

2525 2530 2535

gag gtc ttt ata caa caa agg aac gtc tcc tgc ccc cag ctg gag 7659

Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val Ser Cys Pro Gln Leu Glu

2540 2545 2550

gtc cct gtc tgc ccc tcg ggc ttt cag ctg agc tgt aag acc tca 7704

Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys Thr Ser

2555 2560 2565

gcg tgc tgc cca agc tgt cgc tgt gag cgc atg gag gcc tgc atg 7749

Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu Ala Cys Met

2570 2575 2580

ctc aat ggc act gtc att ggg ccc ggg aag act gtg atg atc gat 7794

Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly Lys Thr Val Met Ile Asp

2585 2590 2595

gtg tgc acg acc tgc cgc tgc atg gtg cag gtg ggg gtc atc tct 7839

Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val Gln Val Gly Val Ile Ser

2600 2605 2610

gga ttc aag ctg gag tgc agg aag acc acc tgc aac ccc tgc ccc 7884

Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr Thr Cys Asn Pro Cys Pro

2615 2620 2625

ctg ggt tac aag gaa gaa aat aac aca ggt gaa tgt tgt ggg aga 7929

Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys Cys Gly Arg

2630 2635 2640

tgt ttg cct acg gct tgc acc att cag cta aga gga gga cag atc 7974

Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln Leu Arg Gly Gly Gln Ile

2645 2650 2655

atg aca ctg aag cgt gat gag acg ctc cag gat ggc tgt gat act 8019

Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gln Asp Gly Cys Asp Thr

2660 2665 2670

cac ttc tgc aag gtc aat gag aga gga gag tac ttc tgg gag aag 8064

His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe Trp Glu Lys

2675 2680 2685

agg gtc aca ggc tgc cca ccc ttt gat gaa cac aag tgt ctg gct 8109

Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys Cys Leu Ala

2690 2695 2700

gag gga ggt aaa att atg aaa att cca ggc acc tgc tgt gac aca 8154

Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys Cys Asp Thr

2705 2710 2715

tgt gag gag cct gag tgc aac gac atc act gcc agg ctg cag tat 8199

Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg Leu Gln Tyr

2720 2725 2730

gtc aag gtg gga agc tgt aag tct gaa gta gag gtg gat atc cac 8244

Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp Ile His

2735 2740 2745

tac tgc cag ggc aaa tgt gcc agc aaa gcc atg tac tcc att gac 8289

Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr Ser Ile Asp

2750 2755 2760

atc aac gat gtg cag gac cag tgc tcc tgc tgc tct ccg aca cgg 8334

Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser Pro Thr Arg

2765 2770 2775

acg gag ccc atg cag gtg gcc ctg cac tgc acc aat ggc tct gtt 8379

Thr Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His Cys Thr Asn Gly Ser Val

2780 2785 2790

gtg tac cat gag gtt ctc aat gcc atg gag tgc aaa tgc tcc ccc 8424

Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys Ser Pro

2795 2800 2805

agg aag tgc agc aag tga 8442

Arg Lys Cys Ser Lys

2810

<210> 4

<211> 2813

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile

1 5 10 15

Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr

20 25 30

Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly

35 40 45

Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly

50 55 60

Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys

65 70 75 80

Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu

85 90 95

Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro

100 105 110

Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys

115 120 125

Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly

130 135 140

Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly

145 150 155 160

Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln

165 170 175

Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala

180 185 190

Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser

195 200 205

Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln

210 215 220

Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu

225 230 235 240

Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu

245 250 255

Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala

260 265 270

Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His

275 280 285

Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys

290 295 300

Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met

305 310 315 320

Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu

325 330 335

Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His

340 345 350

Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn

355 360 365

Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys

370 375 380

Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp

385 390 395 400

Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg

405 410 415

Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys

420 425 430

Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu

435 440 445

Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val

450 455 460

Ala Met Asp Gly Gln Asp Val Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu

465 470 475 480

Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu

485 490 495

Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu

500 505 510

Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn

515 520 525

Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro

530 535 540

Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln

545 550 555 560

Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met

565 570 575

Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe

580 585 590

Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys

595 600 605

Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly

610 615 620

Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val

625 630 635 640

Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln

645 650 655

Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu

660 665 670

Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe

675 680 685

Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys

690 695 700

Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp

705 710 715 720

Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met

725 730 735

His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val

740 745 750

Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg

755 760 765

Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu

770 775 780

Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met

785 790 795 800

Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg

805 810 815

His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln

820 825 830

Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr

835 840 845

Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp

850 855 860

Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly

865 870 875 880

Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp

885 890 895

Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys

900 905 910

Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu

915 920 925

Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys

930 935 940

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945 950 955 960

Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg

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His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val

980 985 990

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1070 1075 1080

Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala

1085 1090 1095

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1100 1105 1110

His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln

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Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu

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His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln

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1250 1255 1260

Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu

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Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe

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Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg

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Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp

1310 1315 1320

Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser

1325 1330 1335

Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln

1340 1345 1350

Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile

1355 1360 1365

Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Ala Leu Leu

1370 1375 1380

Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val

1385 1390 1395

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1400 1405 1410

Val Gly Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile

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Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val

1430 1435 1440

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Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro His Met

1460 1465 1470

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1475 1480 1485

Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu

1490 1495 1500

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1520 1525 1530

Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr Val

1535 1540 1545

Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln

1550 1555 1560

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Gly Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser

1580 1585 1590

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1610 1615 1620

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1715 1720 1725

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1730 1735 1740

Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu Ser Leu Val

1745 1750 1755

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Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His Gly Ala

1775 1780 1785

Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu Val Thr Asp Val

1790 1795 1800

Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg Ser Asn

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Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr Asp Ala

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Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser Asn Val

1835 1840 1845

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1850 1855 1860

Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val Arg Ile

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Thr Leu Pro Asp Gln Cys His Thr Val Thr Cys Gln Pro Asp Gly

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Gln Thr Leu Leu Lys Ser His Arg Val Asn Cys Asp Arg Gly Leu

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1955 1960 1965

Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val Leu Phe Gln Asn Lys Glu Gln Asp

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Leu Glu Val Ile Leu His Asn Gly Ala Cys Ser Pro Gly Ala Arg

1985 1990 1995

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2000 2005 2010

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2015 2020 2025

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Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu Leu Leu Pro Leu Phe Ala

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Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala Thr Phe Tyr Ala Ile Cys

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Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser Cys Pro Pro Ser Leu Val

2195 2200 2205

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2270 2275 2280

Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro Cys Pro Thr

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2420 2425 2430

Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln Phe Trp Glu Glu Gly Cys

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2450 2455 2460

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2495 2500 2505

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Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys Thr Ser

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2570 2575 2580

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Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp Ile His

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2750 2755 2760

Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser Pro Thr Arg

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2780 2785 2790

Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys Ser Pro

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Arg Lys Cys Ser Lys

2810

<210> 5

<211> 1444

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 单链因子viii分子的氨基酸序列

<400> 5

Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr

1 5 10 15

Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro

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Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala

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Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val

115 120 125

Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn

130 135 140

Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser

145 150 155 160

His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu

165 170 175

Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu

180 185 190

His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp

195 200 205

His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser

210 215 220

Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg

225 230 235 240

Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His

245 250 255

Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu

260 265 270

Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile

275 280 285

Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly

290 295 300

Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met

305 310 315 320

Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg

325 330 335

Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp

340 345 350

Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe

355 360 365

Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His

370 375 380

Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu

385 390 395 400

Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro

405 410 415

Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr

420 425 430

Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile

435 440 445

Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile

450 455 460

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465 470 475 480

Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys

485 490 495

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515 520 525

Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala

530 535 540

Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp

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565 570 575

Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln

580 585 590

Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe

595 600 605

Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser

610 615 620

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625 630 635 640

Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr

645 650 655

Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro

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Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp

675 680 685

Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala

690 695 700

Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu

705 710 715 720

Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala

725 730 735

Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro Ser Thr Arg

740 745 750

Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Thr Thr Leu Gln

755 760 765

Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met

770 775 780

Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro

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Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu

805 810 815

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820 825 830

Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln

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Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser

885 890 895

Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala

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Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe

915 920 925

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Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His

945 950 955 960

Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn

965 970 975

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980 985 990

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1010 1015 1020

Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met

1025 1030 1035

Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg

1040 1045 1050

Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile

1055 1060 1065

His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr

1070 1075 1080

Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val

1085 1090 1095

Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu

1100 1105 1110

Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val

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Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His

1130 1135 1140

Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp

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Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala

1160 1165 1170

Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu

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Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln

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Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser

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Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly

1220 1225 1230

Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys

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His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu

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His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu

1265 1270 1275

Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu

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Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe

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Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His

1310 1315 1320

Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro

1325 1330 1335

Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr

1340 1345 1350

Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr

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Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp

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Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn

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Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu

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Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln

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Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu

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Tyr

<210> 6

<211> 585

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu

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Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln

20 25 30

Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu

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Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys

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Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His

115 120 125

Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg

130 135 140

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Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala

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Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser

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Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu

195 200 205

Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro

210 215 220

Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys

225 230 235 240

Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp

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Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser

260 265 270

Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His

275 280 285

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Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala

305 310 315 320

Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg

325 330 335

Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr

340 345 350

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Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro

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Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro

405 410 415

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Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys

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565 570 575

Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

580 585

<210> 7

<211> 2332

<212> PRT

<213> 智人

<400> 7

Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr

1 5 10 15

Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro

20 25 30

Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys

35 40 45

Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro

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Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val

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Gly Lys Asn Ser Leu Asn Ser Gly Gln Gly Pro Ser Pro Lys Gln

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Leu Ser Glu Lys Asn Lys Val Val Val Gly Lys Gly Glu Phe Thr

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Leu Ile Gln Glu Asn Val Val Leu Pro Gln Ile His Thr Val Thr

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Gly Thr Lys Asn Phe Met Lys Asn Leu Phe Leu Leu Ser Thr Arg

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Gln Asn Val Glu Gly Ser Tyr Asp Gly Ala Tyr Ala Pro Val Leu

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Thr Thr Arg Ile Ser Pro Asn Thr Ser Gln Gln Asn Phe Val Thr

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Glu Thr Glu Leu Glu Lys Arg Ile Ile Val Asp Asp Thr Ser Thr

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Pro Leu Ala Trp Asp Asn His Tyr Gly Thr Gln Ile Pro Lys Glu

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Glu Trp Lys Ser Gln Glu Lys Ser Pro Glu Lys Thr Ala Phe Lys

1580 1585 1590

Lys Lys Asp Thr Ile Leu Ser Leu Asn Ala Cys Glu Ser Asn His

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Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile

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Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp

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Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr

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Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val

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Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser

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Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys

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Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu

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1880 1885 1890

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Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe

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1985 1990 1995

Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu

2000 2005 2010

Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala

2015 2020 2025

Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr

2030 2035 2040

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Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala

2315 2320 2325

Gln Asp Leu Tyr

2330

Claims (21)

1.包含截短的血管性血友病因子(VWF)的多肽用于增加包含凝血因子VIII(FVIII)和所述多肽的组合物中所述FVIII的体外稳定性的用途，其中所述组合物中所述多肽与所述FVIII的摩尔比大于20。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述多肽增加所述FVIII的储存稳定性。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述组合物中所述多肽与所述FVIII的摩尔比大于50。

4.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述组合物不含野生型VWF。

5.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述FVIII是重组产生的FVIII或者是血浆来源的FVIII。

6.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述用途包括向所述FVIII添加超过20倍摩尔过量的所述多肽，从而稳定所述FVIII。

7.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中冷冻干燥和复原包含所述FVIII和所述多肽的组合物后FVIII的产率大于冷冻干燥和复原缺乏所述多肽的对照组合物后FVIII的产率。

8.根据权利要求7所述的用途，其中在冷冻干燥后立刻复原经冷冻干燥的组合物。

9.根据权利要求1至6中任一项所述的用途，其中包含所述FVIII和所述多肽的冷冻干燥的组合物在25℃储存期间FVIII活性损失小于缺乏所述多肽的冷冻干燥的对照组合物的FVIII活性损失。

10.根据权利要求9所述的用途，其中所述储存持续12个月的时间段。

11.根据权利要求1至6中任一项所述的用途，其中在25℃储存一周后，包含所述多肽和所述FVIII的液体组合物中FVIII活性大于缺乏所述多肽的对照组合物的FVIII活性。

12.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述多肽以1nM或更小的解离常数K_D结合所述FVIII。

13.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述截短的VWF包含SEQ ID NO:4的氨基酸764至1242。

14.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述截短的VWF缺乏SEQ ID NO:4的氨基酸1243至2813。

15.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述截短的VWF由以下组成：

(a)SEQ ID NO:4的氨基酸764至1242，

(b)与SEQ ID NO:4的氨基酸764至1242具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，或

(c)(a)或(b)的片段。

16.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述截短的VWF不含血小板糖蛋白Ibα(GPIbα)、胶原蛋白、整合素αIIbβIII(C1结构域内的RGDS序列)的结合位点和/或ADAMTS13的切割位点(Tyr1605-Met1606)。

17.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述多肽通过GPIbα对血小板具有低亲和力或者基本上没有亲和力，所述低亲和力或者基本上没有亲和力的特征在于所述多肽结合GPIbα的解离常数K_D>1μM，优选K_D>10μM。

18.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述多肽不含VWF结构域A1和/或A3或其一部分，并且对I型和III型胶原蛋白确实具有低亲和力或者基本上没有亲和力，所述低亲和力或者基本上没有亲和力的特征在于所述多肽结合I型和III型胶原蛋白的解离常数K_D>1μM，优选K_D>10μM。

19.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述多肽是包含所述截短的VWF和半衰期延长多肽的融合蛋白。

20.根据权利要求19所述的用途，其中所述半衰期延长多肽是白蛋白或其片段。

21.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述组合物为制剂。