ES2654336T3 - Factor VIII, factor de von Willebrand o sus complejos con semivida in vivo prolongada - Google Patents
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Abstract
Un factor VIII modificado o un complejo que comprende factor VIII modificado y VWF no modificado, donde el factor VIII modificado está fusionado en una parte C-terminal del polipéptido de traducción primario del factor VIII con la parte N-terminal de una albúmina.
Description
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DESCRIPCION
Factor VIII, factor de von Willebrand o sus complejos con semivida in vivo prolongada Campo de la invención:
La presente invención se refiere a secuencias modificadas de ácido nucleico que codifican el factor de coagulación VIII (FVIII) y el factor de von Willebrand (VWF, por sus siglas en inglés) no modificado, así como también a sus complejos y sus derivados, a vectores de expresión recombinantes que contienen tales secuencias de ácido nucleico, a células huésped transformadas con tales vectores de expresión recombinantes, a polipéptidos recombinantes y derivados codificados por dichas secuencias de ácido nucleico donde los polipéptidos recombinantes y derivados poseen actividades biológicas junto con una semivida in vivo prolongada y/o una recuperación in vivo mejorada en comparación con la proteína de origen natural no modificada. La invención también se refiere a las secuencias de FVIII correspondientes que dan como resultado un rendimiento mejorado de la expresión. La presente invención se refiere además a procesos para la elaboración de tales proteínas recombinantes y sus derivados. La invención también se refiere a un vector de transferencia para su uso en terapia génica humana, que comprende tales secuencias modificadas de ácido nucleico.
Antecedentes de la invención:
Existen varios trastornos hemorrágicos provocados por deficiencias de los factores de coagulación de la sangre. Los trastornos más habituales son la hemofilia A y B, que son el resultado de deficiencias del factor de coagulación de la sangre VIII y IX, respectivamente. Otro trastorno hemorrágico conocido es la enfermedad de von Willebrand.
En plasma, FVIII existe principalmente como un complejo no covalente con VWF y su función coagulante consiste en acelerar la conversión, dependiente del factor IXa, del factor X en Xa. Debido a la formación del complejo de FVIII y VWF, se asumió durante mucho tiempo que las funciones de FVIII y VWF eran dos funciones de la misma molécula. Tan solo en los años 70 resultó obvio que FVIII y VWF eran moléculas diferentes que formaban un complejo en condiciones fisiológicas. A continuación, en los años 80, se determinó la constante de disociación de aproximadamente 0.2 nmol/L (Leyte et al., Biochem J 1989, 257: 679-683) y se estudió la secuencia de ADN de ambas moléculas.
La hemofilia clásica o hemofilia A es un trastorno hemorrágico hereditario. Es el resultado de una deficiencia relacionada con el cromosoma X del factor FVIII de coagulación de la sangre y afecta casi exclusivamente a los hombres con una incidencia comprendida entre uno y dos individuos por cada 10 000. El defecto en el cromosoma X es transmitido por portadores femeninos que no son hemofílicos de por sí. La manifestación clínica de la hemofilia A consiste en una mayor tendencia a sufrir hemorragias. Antes de que se introdujera el tratamiento con concentrados de FVIII, la esperanza de vida media para una persona con hemofilia grave era inferior a 20 años. El uso de concentrados de FVIII procedentes de plasma ha mejorado de forma considerable la situación para los pacientes con hemofilia A, aumentando la esperanza de vida media considerablemente y proporcionando a la mayoría de ellos la posibilidad de vivir una vida más o menos normal. A pesar de ello, han habido ciertos problemas con los concentrados derivados de plasma y su uso, los más serios de los cuales han sido la transmisión de virus. Hasta ahora, los virus que provocan la hepatitis B, hepatitis que no sea de tipo A ni B y el SIDA han provocado estragos en la población. Desde entonces, se han desarrollado recientemente distintos métodos de desactivación de virus y nuevos concentrados de FVIII altamente purificados, los cuales establecen un estándar de seguridad muy elevado también para FVIII derivado de plasma.
La clonación de ADNc para FVIII (Wood et al. 1984. Nature 312:330-336; Vehar et al. 1984. Nature 312:337-342) permitió expresar FVIII de forma recombinante, lo cual llevó al desarrollo de varios productos de FVIII recombinantes, los cuales fueron aprobados por las autoridades reguladoras entre 1992 y 2003. El hecho de que el dominio B central de la cadena polipeptídica de FVIII que reside entre los aminoácidos Arg-740 y Glu-1649 no parece ser necesario para obtener la actividad biológica completa también ha llevado al desarrollo de un FVIII con el dominio B suprimido.
La molécula de FVIII madura está constituida por 2332 aminoácidos, los cuales se pueden agrupar en tres dominios A homólogos, dos dominios C homólogos y un dominio B, los cuales están dispuestos en el siguiente orden: A1-A2- B-A3-C1-C2. La secuencia de aminoácidos completa de FVIII humano maduro se muestra en la SEQ ID NO:15. Durante su secreción en el plasma, FVIII es procesado intracelularmente para obtener una serie de heterodímeros unidos a iones metálicos a medida que FVIII monocatenario es escindido en la frontera de B-A3 y en diferentes sitios del dominio B. Este procesamiento proporciona moléculas heterogéneas de cadena pesada constituidas por el dominio A1, A2 y varias partes del dominio B, las cuales tienen un tamaño molecular comprendido entre 90 kDa y 200 kDa. Las cadenas pesadas están unidas mediante un ión metálico a las cadenas ligeras, que están constituidas por el dominio A3, C1 y C2 (Saenko et al. 2002. Vox Sang. 83:89-96). En plasma, este FVIII heterodimérico se une
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con afinidad elevada al factor de von Willebrand (VWF), el cual lo protege contra un metabolismo prematuro. La semivida de FVIII no activado unido a VWF es de aproximadamente 12 horas en plasma.
El factor FVIII de coagulación se activa mediante la escisión proteolítica por parte de FXa y trombina en los aminoácidos Arg372 y Arg740 de la cadena pesada y en Arg1689 de la cadena ligera, lo cual provoca la liberación del factor de von Willebrand y la generación del heterotrímero de FVIII activado, el cual formará el complejo tenasa sobre superficies de fosfolípidos con FIXa y FX, siempre que haya Ca2+ presente. El heterotrímero está constituido por el dominio A1, un fragmento de 50 kDa, el dominio A2, un fragmento de 43 kDa, y la cadena ligera (A3-C1-C2), un fragmento de 73 kDa. De este modo, la forma activa de FVIII (FVIIIa) está constituida por una subunidad A1 asociada a través de la unión a un ion metálico divalente a una cadena ligera A3-C1-C2 escindida por la trombina y una subunidad A2 libre asociada de forma relativamente débil con el dominio A1 y A3.
Para evitar una coagulación excesiva, FVIIIa debe ser desactivado poco después de su activación. No se considera que la desactivación de FVIIIa por parte de la Proteína C activada (APC, por sus siglas en inglés) mediante la escisión en Arg336 y Arg562 sea un paso limitante de la velocidad importante. En su lugar, se cree que es la disociación de la subunidad A2 unida covalentemente del heterotrímero la que constituye el paso limitante de la velocidad en la desactivación de FVIIIa tras la activación de la trombina (Fay et al. 1991. J. Biol. Chem. 266 8957, Fay y Smudzin 1992. J. Biol. Chem. 267:13246-50). Este es un proceso rápido, lo cual explica la corta semivida de FVIIIa en plasma, que es tan solo de 2.1 minutos (Saenko et al. 2002. Vox Sang. 83:89-96).
En pacientes con hemofilia A grave sometidos a un tratamiento profiláctico, FVIII debe ser administrado por vía intravenosa (i.v.) aproximadamente 3 veces por semana, debido a la corta semivida en plasma de FVIII de aproximadamente 12 a 14 horas. Cada administración i.v. es molesta, se asocia con dolor y conlleva el riesgo de infección, especialmente debido a que principalmente se la realizan en casa los mismos pacientes o los padres de los niños a los que se les ha diagnosticado hemofilia A.
Por lo tanto, sería muy deseable crear un FVIII con una mayor semivida funcional, lo cual permitiría la elaboración de composiciones farmacéuticas que contuvieran FVIII, las cuales se deberían administrar con menos frecuencia.
Se han realizado varios intentos de prolongar la semivida de FVIII no activado, ya sea reduciendo su interacción con receptores celulares (WO 03/093313A2, WO 02/060951A2), uniendo polímeros covalentemente a FVIII (WO 94/15625, WO 97/11957 y US 4970300), encapsulando FVIII (WO 99/55306), introduciendo sitios de unión a metales novedosos (WO 97/03193), uniendo covalentemente el dominio A2 al dominio A3 ya sea mediante un enlace peptídico (wO 97/40145 y WO 03/087355) o de tipo disulfuro (WO 02/103024A2) o uniendo covalentemente el dominio A1 al dominio A2 (WO2006/108590).
Otra estrategia para mejorar la semivida funcional de FVIII o VWF consiste en la PEGilación de FVIII (WO 2007/126808, WO 2006/053299, WO 2004/075923) o la PEGilación de VWF (WO 2006/071801), donde el VWF pegilado, al tener una mayor semivida, también mejoraría de forma indirecta la semivida de FVIII presente en plasma.
Debido a que ninguna de las estrategias descritas anteriormente ha dado como resultado todavía un agente farmacéutico de FVIII aprobado y debido a que la introducción de mutaciones en la secuencia de origen natural de FVIII o la introducción de modificaciones químicas supone al menos un riesgo teórico de que se creen variantes inmunogénicas de FVIII, sigue siendo necesario desarrollar moléculas modificadas del factor de coagulación VIII que exhiban una semivida prolongada.
Teniendo en cuenta el posible riesgo trombogénico, resulta más deseable prolongar la semivida de la forma no activada del FVIII que la del FVIIIa.
El factor VWF, el cual se encuentra ausente, funcionalmente defectuoso o únicamente disponible en una cantidad reducida en diferentes formas de la enfermedad de von Willebrand (VWD, por sus siglas en inglés), es una glucoproteína adhesiva multimérica presente en el plasma de los mamíferos, que presenta múltiples funciones fisiológicas. Durante la hemostasis primaria, VWF actúa como mediador entre receptores específicos sobre la superficie de las plaquetas y componentes de la matriz extracelular tales como el colágeno. Además, VWF actúa como portador y proteína estabilizante para FVIII procoagulante. El factor VWF se sintetiza en las células endoteliales y megacariocitos como una molécula precursora de 2813 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos y la secuencia de ADNc de VWF de origen natural se describen en Collins et al. 1987, Proc Natl. Acad. Sci. USA 84:4393-4397. El polipéptido precursor, pre-pro-VWF, está constituido por un péptido señal de 22 residuos, un propéptido de 741 residuos y el polipéptido de 2050 residuos que se encuentra en VWF en plasma maduro (Fischer et al., FEBS Lett. 351: 345-348, 1994). Después de la escisión del péptido señal en el retículo endoplasmático, se forma un puente disulfuro C-terminal entre dos monómeros de VWF. Durante el transporte adicional a través de la vía secretora, se añaden 12 cadenas laterales de carbohidratos unidas a N y 10 unidas a O. Cabe destacar que los dímeros de VWF se multimerizan mediante los puentes disulfuro N-terminales y el propéptido de 741 aminoácidos de longitud es escindido por la enzima PACE/furina en el aparato de Golgi tardío. El propéptido, así como también
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los multímeros de elevado peso molecular de VWF (VWF-HMWM), se almacenan en los cuerpos de Weibel-Pallade de las células endoteliales o en los Gránulos a de las plaquetas.
Una vez secretada en el plasma, la proteasa ADAMTS13 escinde VWF en el dominio A1 de VWF. Por consiguiente, VWF en plasma está constituido por un intervalo completo de multímeros que van desde dímeros individuales de 500 kDa hasta multímeros constituidos por más de 20 dímeros de un peso molecular superior a 10 000 kDa. En la presente, VWF-HMWM presenta la actividad hemostática más potente, que se puede medir según la actividad del cofactor ristocetina (VWF:RCo). Cuanto mayor sea la proporción de VWF:RCo/antígeno VWF, mayor será la cantidad relativa de multímeros de peso molecular elevado.
Los defectos en VWF provocan la enfermedad de von Willebrand (VWD), la cual se caracteriza por un fenotipo hemorrágico más o menos pronunciado. La VWD de tipo 3 es la forma más grave, en la cual VWF está totalmente ausente; la VWD de tipo 1 se relaciona con una pérdida cuantitativa de VWF y su fenotipo puede ser muy leve. La VWD de tipo 2 se relaciona con defectos cualitativos de VWF y puede ser tan grave como la VWD de tipo 3. La VWD de tipo 2 presenta muchas subformas, algunas de las cuales se asocian con la pérdida o la reducción de multímeros de peso molecular elevado. La VWD de tipo 2a se caracteriza por una pérdida de multímeros tanto grandes como intermedios. La VWD de tipo 2B se caracteriza por una pérdida de los multímeros de peso molecular más elevado.
La VWD es el trastorno hemorrágico hereditario más frecuente en los seres humanos y se puede tratar mediante una terapia de reemplazo con concentrados que contengan VWF de origen plasmático o recombinante. El factor VWF se puede preparar a partir de plasma humano según se describe, por ejemplo en EP 05503991. El documento EP 0784632 describe un método para aislar VWF recombinante.
En plasma, FVIII se une con una afinidad elevada a VWF, el cual lo protege contra un catabolismo prematuro y, de este modo, desempeña, además de su función en la hemostasis primaria, una función crucial en la regulación de los niveles en plasma de FVIII y, como consecuencia, también constituye un factor central para controlar la hemostasis secundaria. La semivida de FVIII no activado unido a VWF es de aproximadamente 12 a 14 horas en plasma. En la enfermedad de von Willebrand de tipo 3, en la que no hay o casi no hay VWF presente, la semivida de FVIII es de tan solo aproximadamente 6 horas, lo cual provoca síntomas de hemofilia A de leve a moderada en estos pacientes, debido a la reducción de las concentraciones de FVIII. El efecto estabilizador de VWF sobre FVIII también se ha utilizado para propiciar la expresión recombinante de FVIII en células CHO (Kaufman et al. 1989, Mol Cell Biol).
Hasta el día de hoy, el tratamiento estándar de la hemofilia A y de VWD implica infusiones intravenosas frecuentes de preparados de FVIII y concentrados de VWF o de concentrados que comprenden un complejo de FVIII y VWF que deriva de plasmas de donantes humanos o, en el caso de FVIII, de preparados farmacéuticos basados en FVIII recombinante. Aunque estas terapias de reemplazo son generalmente eficaces, p. ej., en pacientes con hemofilia A grave sometidos a un tratamiento profiláctico, FVIII se debe administrar por vía intravenosa (i.v.) aproximadamente 3 veces por semana debido a la corta semivida en plasma de FVIII de aproximadamente 12 horas. Ya por encima de niveles de un 1% de la actividad de FVIII en personas no hemofílicas, p. ej., para un aumento de los niveles de FVIII de 0.01 U/mL, la hemofilia A grave se convierte en hemofilia A moderada. En la terapia profiláctica, las pautas posológicas están diseñadas de modo que los niveles de base de la actividad de FVIII no se reduzcan por debajo de niveles de un 2-3% de la actividad de FVIII en personas no hemofílicas. Cada administración i.v. es molesta, se asocia con dolor y conlleva el riesgo de infección, especialmente debido a que es realizada principalmente en un tratamiento en casa por parte de los mismos pacientes o los padres de los niños a los que se les ha diagnosticado hemofilia A. Además, las inyecciones i.v. frecuentes provocan inevitablemente la formación de cicatrices, lo cual interfiere con infusiones futuras. Debido a que el tratamiento profiláctico en la hemofilia grave se inicia en etapas tempranas de la vida, teniendo los niños a menudo menos de 2 años de edad, resulta aún más difícil inyectar FVIII 3 veces por semana en las venas de pacientes tan pequeños. Durante un periodo limitado, el implante de sistemas de puerto puede ofrecer una alternativa. A pesar del hecho de que se pueden producir infecciones repetidas y de que los puertos pueden provocar inconvenientes durante el ejercicio físico, normalmente se consideran favorables a pesar de ello en comparación con las inyecciones intravenosas.
En la técnica anterior, se han descrito fusiones de factores de coagulación con albúmina (WO 01/79271), alfa- fetoproteína (WO 2005/024044) e inmunoglobulina (WO 2004/101740) como polipéptidos que mejoran la semivida. Se creía que estos estaban unidos al extremo carboxilo o amino o a ambos extremos del resto proteico terapéutico respectivo, ocasionalmente conectados mediante conectores peptídicos, preferentemente mediante conectores constituidos por glicina y serina.
Ballance et al. (WO 01/79271) describieron polipéptidos de fusión N-terminales o C-terminales de una multitud de polipéptidos terapéuticos diferentes fusionados con albúmina de suero humano. Se describen listas exhaustivas de posibles componentes para la fusión sin describir datos experimentales para casi ninguno de estos polipéptidos, tanto si las proteínas de fusión con albúmina respectivas conservan de hecho la actividad biológica y presentan propiedades mejoradas como si no. Entre dicha lista de polipéptidos terapéuticos, también se mencionan FVIII y VWF.
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Un experto en la técnica no hubiera considerado seriamente una fusión C-terminal, ya que el dominio C2 de FVIII en la parte más C-terminal de FVIII entre el aminoácido 2303 y 2332 de FVIII comprende un sitio de unión a la membrana de las plaquetas, que es esencial para la función de FVIII. Este es el motivo por el cual existen muchas mutaciones de aminoácidos conocidas en esta región que provocan hemofilia A. Por lo tanto, resultó sorprendente que un polipéptido heterólogo relativamente grande como la albúmina se pudiera fusionar en la parte C-terminal de FVIII sin que se suprimiera la función de FVIII mediante la supresión de su unión a las plaquetas. Además, el dominio c2 también contiene un sitio de unión para VWF. Este sitio, junto con la secuencia de aminoácidos 16491689, es el responsable de la unión de alta afinidad de FVIII a VWF. Por consiguiente, un experto en la técnica tampoco hubiera esperado que un FVIII con una fusión de albúmina C-terminal conservara su unión a VWF.
Sorprendentemente, se observó que, de forma contraria a la predicción de Ballance et al., una fusión de albúmina en el extremo N-terminal de FVIII no fue secretada al medio de cultivo. Por consiguiente y debido a los motivos detallados anteriormente, se acaba de descubrir, aún más sorprendentemente, que un FVIII fusionado en su parte C-terminal con albúmina es secretado al medio de cultivo y conserva su función biológica, incluida la unión a membranas de plaquetas activadas y a VWF.
También se descubrió, sorprendentemente, que el FVIII modificado de la invención muestra un incremento de la recuperación in vivo de aproximadamente un 20% en comparación con FVIII de origen natural.
Descripción de la invención
Un objetivo de esta invención consiste en proporcionar un FVIII modificado o complejos de FVIII modificado con VWF no modificado que presenten una semivida in vivo mejorada.
La expresión “FVIII modificado”, en el sentido de la invención, se refiere a polipéptidos de FVIII que están fusionados con polipéptidos que mejoran la semivida, los cuales engloban también alelos naturales, variantes, deleciones e inserciones de FVIII.
Otro objetivo de esta invención consiste en proporcionar un FVIII modificado, así como también complejos de FVIII modificado con VWF no modificado que presenten una recuperación in vivo mejorada.
Otro objetivo de la invención consiste en que este FVIII modificado o complejos de FVIII modificado con VWF no modificado, puedan ser expresados por células de mamífero y conserven sus actividades biológicas respectivas.
En resumen, sorprendentemente el FVIII modificado o complejos de FVIII modificado con VWF no modificado de la invención, han conservado la actividad biológica y han incrementado la semivida in vivo y la recuperación in vivo.
Un posible beneficio adicional de aquellas realizaciones de la presente invención en las que se modifica el FVIII y en las que el dominio A2 se mantiene unido únicamente de forma no covalente al dominio A3 tras la activación consiste en que se incrementa únicamente la semivida de la forma no activada de FVIII, mientras que la semivida de la forma activada de FVIII sigue siendo prácticamente la misma, lo que puede dar como resultado una reducción del riesgo de padecer trombogenicidad, en comparación con las variantes de FVIII que conducen a la estabilización de la forma activada de FVIII.
El FVIII modificado o complejos de FVIII modificado con VWF no modificado de la invención, se pueden generar fusionando un resto de una proteína que mejora la semivida (HLEP, por sus siglas en inglés) con la parte C-terminal de FVIII.
Las HLEP, en el sentido de la presente invención, se seleccionan a partir de un grupo constituido por miembros de albúmina humana.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a un FVIII modificado o a FVIII modificado con VWF no modificado, que contienen en la parte C-terminal del FVIII modificado una fusión con una HLEP, que se caracterizan por que el FVIII modificado o el complejo de FVIII modificado con VWF no modificado presenta una semivida funcional prolongada en comparación con la semivida funcional del FVIII de origen natural o del complejo de VWF de origen natural y FVIII de origen natural.
La presente invención también se refiere a fusiones C-terminales con más de una HLEP, donde la HLEP, la cual está fusionada varias veces.
La presente invención también se refiere a un FVIII modificado que contiene en la parte C-terminal una fusión con una HLEP, que se caracteriza por que el FVIII modificado o el complejo de FVIII modificado con VWF no modificado presenta una recuperación in vivo mejorada en comparación con la recuperación in vivo del FVIII de origen natural o el complejo de VWF de origen natural y FVIII de origen natural.
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Otra realización de la invención son polipéptidos de FVIII modificado que contienen en la parte C-terminal una fusión con una HLEP, que se caracterizan por que el FVIII modificado se secreta en un medio de fermentación con un rendimiento mayor que un FVIII de origen natural.
Otro aspecto de la invención consiste en polinucleótidos o combinaciones de polinucleótidos que codifican el VWF modificado.
La invención se refiere además a plásmidos o vectores que comprenden un polinucleótido descrito en la presente y a células huésped que comprenden un polinucleótido o un plásmido o vector según se describe en la presente.
Otro aspecto de la invención consiste en un método para producir un FVIII modificado o un complejo de FVIII modificado con VWF no modificado que comprende:
(a) cultivar células huésped de la invención en condiciones tales que se exprese el factor de coagulación modificado; y
(b) opcionalmente recuperar el factor de coagulación modificado a partir de las células huésped o a partir del medio de cultivo.
La invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que comprenden un FVIII modificado o un complejo de FVIII modificado con VWF no modificado, un polinucleótido o un plásmido o vector descrito en la presente.
Otro aspecto más de la invención consiste en el uso de un FVIII modificado o un complejo de FVIII modificado con VWF no modificado, uno o más polinucleótidos, o uno o más plásmidos o vectores, o de células huésped de acuerdo con esta invención, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno de coagulación de la sangre.
Descripción detallada de la invención
La invención se refiere a un complejo que comprende FVIII y VWF o uno de sus componentes polipeptídicos individuales, donde el FVIII de dicho complejo está fusionado en la parte C-terminal de su producto de traducción primario con la parte N-terminal de un polipéptido que mejora la semivida (HLEP).
La invención también se refiere a un FVIII modificado o un complejo que comprende FVIII modificado y no modificado, donde el FVIII modificado está fusionado en una parte C-terminal del polipéptido de traducción primario de FVIII con la parte N-terminal de una HLEP.
En realizaciones preferidas, la invención se refiere a un FVIII modificado o un complejo que comprende FVIII modificado y no modificado, donde
(a) el FVIII modificado presenta una semivida funcional prolongada en comparación con la semivida funcional de FVIII de origen natural o
(b) el complejo que comprende FVIII modificado y FVIII no modificado presenta una semivida funcional prolongada en comparación con la semivida funcional del complejo correspondiente que comprende FVIII de origen natural y VWF de origen natural.
Una realización preferida de la invención consiste en un polipéptido modificado o un complejo que comprende dicho polipéptido modificado o un complejo que comprende dichos polipéptidos modificados según se han descrito anteriormente, donde el polipéptido modificado presenta un incremento de la semivida funcional de al menos un 25% en comparación con la semivida funcional del polipéptido correspondiente de origen natural o el complejo que comprende dicho polipéptido modificado o un complejo que comprende dichos polipéptidos modificados presenta un incremento de la semivida funcional de al menos un 25% en comparación con el complejo correspondiente de FVIII de origen natural y VWF de origen natural.
Otra realización de la invención consiste en un FVIII modificado o un complejo que comprende FVIII modificado y VWF no modificado, donde
(a) el FVIII modificado presenta una semivida del antígeno prolongada en comparación con la semivida del antígeno de FVIII de origen natural o
(b) el complejo que comprende FVIII modificado y VWF no modificado presenta una semivida del antígeno prolongada en comparación con la semivida del antígeno del complejo correspondiente que comprende FVIII de origen natural y VWF de origen natural.
Una realización preferida de la invención consiste en un polipéptido modificado o un complejo que comprende dicho polipéptido modificado o un complejo que comprende dichos polipéptidos modificados según se han descrito
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anteriormente, donde el polipéptido modificado presenta un incremento de la semivida del antígeno de al menos un 25% en comparación con la semivida del antígeno del polipéptido correspondiente de origen natural o el complejo que comprende dicho polipéptido modificado o un complejo que comprende dichos polipéptidos modificados presenta un incremento de la semivida del antígeno de al menos un 25% en comparación con el complejo correspondiente de FVIII de origen natural y VWF de origen natural.
Otra realización más de la invención consiste en un FVIII modificado o un complejo que comprende FVIII modificado y VWF no modificado, donde
(a) el FVIII modificado presenta un incremento de la recuperación in vivo en comparación con la recuperación in vivo de FVIII de origen natural o
(b) el complejo que comprende FVIII modificado y VWF no modificado presenta un incremento de la recuperación in vivo en comparación con la recuperación in vivo del complejo correspondiente que comprende FVIII de origen natural y VWF de origen natural.
Otra realización preferida de la invención consiste en un polipéptido modificado o un complejo que comprende dicho polipéptido modificado o un complejo que comprende dichos polipéptidos modificados según se han descrito anteriormente, donde el polipéptido modificado presenta un incremento de la recuperación in vivo de al menos un 10% en comparación con la recuperación in vivo del polipéptido correspondiente de origen natural o el complejo que comprende dicho polipéptido modificado o un complejo que comprende dichos polipéptidos modificados presenta un incremento de la recuperación in vivo de al menos un 10% en comparación con el complejo correspondiente de FVIII de origen natural y vWf de origen natural.
Otra realización preferida de la invención consiste en
(a) un polipéptido modificado o un complejo que comprende dicho polipéptido modificado o un complejo que comprende dichos polipéptidos modificados según se ha descrito anteriormente, donde al menos un componente polipeptídico de dicho complejo está fusionado en el aminoácido C-terminal de su producto de traducción primario con la parte N-terminal de una HLEP, o
(b) un polipéptido modificado o un complejo que comprende dicho polipéptido modificado o un complejo que comprende dichos polipéptidos modificados según se ha descrito anteriormente, donde al menos un componente polipeptídico de dicho complejo está fusionado en la parte C-terminal de su producto de traducción primario con el aminoácido N-terminal de una HLEP, o
(c) un polipéptido modificado o un complejo que comprende dicho polipéptido modificado o un complejo que comprende dichos polipéptidos modificados según se ha descrito anteriormente, donde al menos un componente polipeptídico de dicho complejo está fusionado en el aminoácido C-terminal de su producto de traducción primario con el aminoácido N-terminal de una HLEP.
Otra realización preferida de la invención consiste en un polipéptido modificado o un complejo que comprende dicho polipéptido modificado o un complejo que comprende dichos polipéptidos modificados según se ha descrito anteriormente, donde el polipéptido modificado presenta al menos un 10% de la actividad biológica del polipéptido de origen natural o el complejo que comprende el polipéptido modificado o un complejo que comprende dichos polipéptidos modificados presenta al menos un 10% de la actividad biológica del complejo correspondiente de FVIII de origen natural y VWF de origen natural.
En la presente invención también se engloba un método para preparar un modificado con una mayor semivida funcional, que comprende fusionar la parte N-terminal de un polipéptido que mejora la semivida con una parte C- terminal del polipéptido de traducción primario del FVIII, así como también un método para preparar un complejo que comprende FVIII modificado y VWF no modificado mezclando un FVIII modificado preparado mediante el método descrito anteriormente con VWF de origen natural preparado mediante el método descrito anteriormente.
En la invención también se engloba el uso de un FVIII modificado como el preparado mediante el método descrito anteriormente y VWF de origen natural para la elaboración de un preparado farmacéutico combinado para su uso simultáneo, secuencial o por separado en la terapia de trastornos hemorrágicos, preferentemente en la terapia de la hemofilia A y/o la enfermedad de von Willebrand.
La “semivida funcional”, de acuerdo con la presente invención, se refiere a la semivida de la actividad biológica del FVIII modificado o de un complejo del FVIII modificado con VWF no modificado una vez se ha administrado a un mamífero y se puede medir in vitro en muestras de sangre tomadas en diferentes intervalos de tiempo a partir de dicho mamífero después de haber administrado el FVIII modificado o el complejo de FVIII modificado con VWF no modificado.
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Los términos “fusionar” o “fusionado” se refieren a la adición de aminoácidos a la parte C-terminal de FVIII. Cuando en la presente se hace referencia a una “fusión con el aminoácido C-terminal de FVIII”, esto significa una fusión exactamente con el aminoácido C-terminal de FVIII en el aminoácido 2332 de la secuencia de ADNc del FVIII maduro de origen natural. El FVIII maduro se refiere al polipéptido respectivo después de la escisión del propéptido. Sin embargo, la invención también engloba una “fusión con la parte C-terminal de FVIII”, que en el sentido de esta invención también puede incluir respectivamente una fusión con una molécula de FVIII en la cual se han suprimido una o más posiciones aminoacídicas hasta un máximo de n aminoácidos a partir del aminoácido C-terminal de FVIII. La cifra n es un número entero que no debería ser superior a un 5%, preferentemente no debería ser superior a un 1% del número total de aminoácidos del FVIII. Normalmente, n es 20, preferentemente 15, más preferentemente 10, aún más preferentemente 5 o inferior (p. ej., 1, 2, 3, 4 o 5).
En una realización, el FVIII modificado presenta la siguiente estructura:
N -FVIII -C -L1-H, [fórmula 1]
donde
N es una parte N-terminal de FVIII,
L1 es un enlace químico o una secuencia conectora H es una HLEP y
C es una parte C-terminal de FVIII.
L1 puede ser un enlace químico o una secuencia conectora constituida por uno o más aminoácidos, p. ej., de 1 a 20, de 1 a 15, de 1 a 10, de 1 a 5 o de 1 a 3 (p. ej., 1, 2 o 3) aminoácidos, los cuales pueden ser iguales o diferentes entre sí. Normalmente, las secuencias conectoras no están presentes en la posición correspondiente del factor de coagulación de origen natural. Algunos ejemplos de aminoácidos adecuados presentes en L1 incluyen Gly y Ser.
Más adelante se describen las secuencias de HLEP preferidas. Del mismo modo, en la invención se engloban fusiones con el “aminoácido N-terminal” exacto de la HLEP respectiva, o fusiones con la “parte N-terminal” de la HLEP respectiva, que incluye deleciones N-terminales de uno o más aminoácidos de la HLEP.
El FVIII modificado o el complejo del FVIII modificado con el VWF no modificado de la invención puede comprender más de una secuencia de HLEP, p. ej., dos o tres secuencias de HLEP. Estas múltiples secuencias de HLEP pueden estar fusionadas con la parte C-terminal de FVIII en tándem, p. ej., como repeticiones sucesivas.
FVIII puede ser procesado proteolíticamente en varios estadios. Por ejemplo, según se ha mencionado anteriormente, durante su secreción en el plasma, el FVIII monocatenario es escindido intracelularmente en la frontera B-A3 y en diferentes sitios del dominio B. La cadena pesada está unida mediante un ion metálico a la cadena ligera que presenta la estructura de dominios A3-C1-C2. El FVIII se activa mediante la escisión proteolítica en los aminoácidos Arg372 y Arg740 de la cadena pesada y en Arg1689 de la cadena ligera, lo cual genera el heterotrímero de FVIII activado constituido por el dominio A1, el dominio A2 y la cadena ligera (A3-C1-C2), un fragmento de 73 kDa. Por lo tanto, la forma activa de FVIII (FVIIIa) está constituida por una subunidad A1 asociada a través de la unión a un ion metálico divalente a una cadena ligera A3-C1-C2 escindida por la trombina y una subunidad A2 libre asociada de forma relativamente débil con el dominio A1 y el dominio A3.
Por consiguiente, la presente invención engloba además FVIII modificado que no está presente como un polipéptido monocatenario, sino que está constituido por varios polipéptidos (p. ej., uno o dos o tres) que están asociados entre sí mediante uniones no covalentes.
Preferentemente, N - FVIII - C comprende la secuencia de longitud completa de FVIII. También se engloban deleciones N-terminales, C-terminales o internas de FVIII, siempre que la actividad biológica de FVIII se conserve. La actividad biológica se conserva, en el sentido de la invención, si el FVIII con deleciones conserva al menos un 10%, preferentemente al menos un 25%, más preferentemente al menos un 50%, de la forma preferida al menos un 75% de la actividad biológica de FVIII de origen natural. La actividad biológica de FVIII puede ser determinada por un experto como se describe a continuación.
Una prueba adecuada para determinar la actividad biológica de FVIII consiste, por ejemplo, en el ensayo de coagulación de una etapa o de dos etapas (Rizza et al. 1982. Coagulation assay of FVIII:C and FIXa in Bloom ed. The Hemophilias. NY Churchchill Livingston 1992) o el ensayo FVIII:C de sustrato cromogénico (S. Rosen, 1984. Scand J Haematol 33: 139-145, supl.). El contenido de estas referencias se incorpora a la presente por referencia.
La secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos de la forma de origen natural madura del FVIII humano de coagulación de la sangre se muestran en la SEQ ID NO:14 y la SEQ ID NO:15, respectivamente. La referencia a una posición aminoacídica de una secuencia específica se refiere a la posición de dicho aminoácido en la proteína FVIII
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de origen natural y no excluye la presencia de mutaciones, p. ej., deleciones, inserciones y/o sustituciones en otras posiciones de la secuencia a la que se hace referencia. Por ejemplo, una mutación en "Glu2004" referente a la SEQ ID NO:15 no excluye el hecho de que, en el homólogo modificado, falten uno o más aminoácidos en las posiciones 1-2332 de la SEQ ID NO:15.
Las expresiones “Factor VIII de coagulación de la sangre”, “Factor VIII” y “FVIM” se utilizan indistintamente en la presente. La expresión “Factor VIII de coagulación de la sangre” incluye el FVIII de coagulación de la sangre de origen natural, así como también derivados del FVIII de coagulación de la sangre de origen natural que posean la actividad procoagulante del FVIII de coagulación de la sangre de origen natural. Los derivados pueden contener deleciones, inserciones y/o adiciones en comparación con la secuencia de aminoácidos de FVIII de origen natural. El término FVIII incluye formas procesadas proteolíticamente de FVIII, p. ej., la forma antes de la activación, que comprenden la cadena pesada y la cadena ligera.
El término “FVIII” incluye cualesquiera mutantes o variantes de FVIII que contengan al menos un 25%, más preferentemente al menos un 50% y de la forma preferida al menos un 75% de la actividad biológica del factor VIII de origen natural.
A modo de ejemplos no limitantes, las moléculas de FVIII incluyen mutantes de FVIII que previenen o reducen la escisión de APC (Amano 1998. Thromb. Haemost. 79:557-563), mutantes de FVIII que estabilizan adicionalmente el dominio A2 (WO 97/40145), mutantes de FVIII que dan como resultado un incremento de la expresión (Swaroop et al. 1997. JBC 272:24121-24124), mutantes de FVIII que reducen su inmunogenicidad (Lollar 1999. Thromb. Haemost. 82:505-508), FVIII reconstituido a partir de cadenas ligeras y pesadas expresadas de forma diferente (Oh et al. 1999. Exp. Mol. Med. 31:95-100), mutantes de FVIII que reducen la unión a receptores que conducen al catabolismo de FVIII como HSPG (siglas en inglés referentes a proteoglicanos de tipo sulfato de heparán) y/o LRP (siglas en inglés referentes a una proteína relacionada con un receptor lipoproteico de baja densidad) (Ananyeva et al. 2001. TCM, 11:251-257), variantes de FVIII estabilizadas con un puente disulfuro (Gale et al., 2006. J. Thromb. Hemost. 4:1315-1322), mutantes de FVIII con propiedades de secreción mejoradas (Miao et al., 2004. Blood 103:3412-3419), mutantes de FVIII con una mayor actividad específica del cofactor (Wakabayashi et al., 2005. Biochemistry 44:10298-304), mutantes de FVIII con una biosíntesis y secreción mejoradas, una menor interacción con la chaperona del RE, un transporte mejorado de RE-Golgi, una mayor activación o resistencia a la desactivación y una semivida mejorada (resumido por Pipe 2004. Sem. Thromb. Hemost. 30:227-237). Todos estos mutantes y variantes de FVIII se incorporan a la presente por referencia en su totalidad.
VWF puede ser procesado proteolíticamente en varios estadios. Por ejemplo, según se ha mencionado anteriormente, la proteasa ADAMTS13 escinde VWF en el dominio A2 de VWF. Por consiguiente, la presente invención también engloba un VWF modificado que haya sido escindido proteolíticamente, p. ej., por ADAMTS13. Tal escisión daría como resultado cadenas multiméricas de VWF que comprenderían en sus extremos al menos un o al menos dos monómeros de VWF que habrían sido escindidos por ADAMTS13.
Preferentemente, N - VWF - C comprende la secuencia de longitud completa de VWF. También se engloban deleciones N-terminales, C-terminales o internas de VWF, siempre que la actividad biológica de VWF se conserve. La actividad biológica se conserva, en el sentido de la invención, si el VWF con deleciones conserva al menos un 10%, preferentemente al menos un 25%, más preferentemente al menos un 50%, de la forma preferida al menos un 75% de la actividad biológica de VWF de origen natural. La actividad biológica de VWF de origen natural puede ser determinada por un experto utilizando métodos para determinar la actividad del cofactor de ristocetina (Federici AB et al. 2004. Haematologica 89:77-85), la unión de VWF a GP Iba del complejo glicoproteico de plaquetas Ib-V-IX (Sucker et al. 2006. Clin Appl Thromb Hemost. 12:305-310) o un ensayo de unión a colágeno (Kallas y Talpsep. 2001. Annals of Hematology 80:466-471).
Dentro de la definición anterior, “FVIII” y/o “VWF” también incluyen las variaciones alélicas naturales que puedan existir y que se puedan producir de un individuo a otro. Dentro de la definición anterior, “FVIII” y/o “VWF” incluyen además variantes de FVIII y/o VWF. Tales variantes difieren en uno o más residuos aminoacídicos de la secuencia de origen natural. Los ejemplos de tales diferencias pueden incluir sustituciones conservativas de aminoácidos, es decir, sustituciones dentro de grupos de aminoácidos con características similares, p. ej., (1) aminoácidos pequeños, (2) aminoácidos ácidos, (3) aminoácidos polares, (4) aminoácidos básicos, (5) aminoácidos hidrófobos y (6) aminoácidos aromáticos. En la tabla siguiente se muestran algunos ejemplos de tales sustituciones conservativas.
Tabla 1:
- (1)
- Alanina Glicina
- (2)
- Ácido aspártico Ácido glutámico
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- (3)
- Asparagina Glutamina Serina Treonina
- (4)
- Arginina Histidina Lisina
- (5)
- Isoleucina Leucina Metionina Valina
- (6)
- Fenilalanina Tirosina Triptófano
Se pueden fusionar una o más HLEP con la parte C-terminal de FVIII preferentemente, para no interferir con las capacidades de unión de FVIII, por ejemplo, a VWF, plaquetas o FIX.
Una vez que se ha activado el FVIII endógenamente durante la coagulación in vivo, puede que ya no sea deseable mantener la semivida funcional incrementada del FVIII ahora activado, ya que esto podría conducir a complicaciones trombóticas, que ya es el caso para un factor de coagulación activado de origen natural como FVIIa (Aledort 2004. J Thromb Haemost 2:1700-1708) y que podría ser más relevante si el factor activado tuviera una semivida funcional incrementada. Por consiguiente, otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar moléculas de FVIII de vida prolongada, las cuales, tras la activación endógena in vivo o tras la disponibilidad de un cofactor, tengan una semivida funcional comparable a la de FVIII no modificado. Esto se puede conseguir, a modo de ejemplo no limitante, introduciendo un sitio de escisión, por ejemplo, para un factor de coagulación entre la parte C-terminal de FVIII y la HLEP. Con tales secuencias que conectan FVIII-HLEP, la activación de la proteína quimérica FVIII de la invención conducirá a una separación completa concomitante de FVIIIa respecto al resto de HLEP. Por consiguiente, en una realización, la semivida funcional del FVIII modificado activado endógenamente es sustancialmente la misma que la del FVIII de origen natural activado (p. ej., ±15%, preferentemente ±10%).
En otra realización más de la invención, sin embargo, uno o más de los sitios de escisión proteolítica, preferentemente los sitios de escisión de trombina en Arg 740 y/o Arg372, se mutan o suprimen con el fin de evitar la escisión y esto da como resultado una proteína de inserción que presenta unas propiedades mejoradas como una semivida funcional mejorada incluso como molécula activada.
En otra realización de la invención, las proteínas FVIII de la invención se pueden expresar como dos cadenas separadas (remítase más adelante).
El FVIII modificado de acuerdo con esta invención puede ser un polipéptido monocatenario, o puede estar constituido por dos o tres cadenas polipeptídicas que se asocian mediante uniones no covalentes, debido a un procesamiento proteolítico.
En otra realización de la invención, los aminoácidos del sitio de escisión de PACE/Furina (Arg1648) o cercanos a este se mutan o suprimen con el fin de evitar la escisión por parte de PACE/Furina. Se cree que esto da como resultado una molécula de fusión FVIII/HLEP monocatenaria con una semivida mejorada.
En una realización de la invención, el FVIII modificado de la invención exhibe una mayor semivida funcional en comparación con la forma de FVIII correspondiente que no contiene HLEP integrada y/o con la forma de FVIII de origen natural. La semivida funcional se puede determinar, p. ej., in vivo en modelos animales de hemofilia A, como ratones en los que se ha suprimido el FVIII, en los que cabría esperar un efecto hemostático más prolongado en comparación con FVIII de origen natural. El efecto hemostático se podría evaluar, por ejemplo, determinando el tiempo necesario para detener la hemorragia tras el pinzamiento de la cola.
La semivida funcional en una realización de la invención es la semivida de la actividad biológica del FVIII una vez que se ha administrado a un mamífero y se mide in vitro. La semivida funcional del FVIII modificado de acuerdo con la invención es superior a la del FVIII que carece de la modificación, según se evalúa en la misma especie. La semivida funcional aumenta preferentemente al menos un 10%, preferentemente un 25%, más preferentemente al menos un 50% y aún más preferente al menos un 100% en comparación con la forma de origen natural del FVIII.
La semivida funcional de un FVIII modificado que comprende una modificación de HLEP se puede determinar administrando el FVIII modificado respectivo (y en comparación el FVIII de origen natural) a ratas, conejos u otras especies animales de experimentación por vía intravenosa o subcutánea y siguiendo la eliminación de la actividad biológica de dicho factor de coagulación modificado o, respectivamente, no modificado en muestras sanguíneas tomadas en intervalos adecuados tras la aplicación. Algunos métodos de prueba adecuados son las pruebas de actividad que se describen en la presente.
Como marcador alternativo para la semivida de la actividad biológica, también se pueden medir los niveles de antígeno del FVIII modificado o, respectivamente, de origen natural, o los niveles del VWF de origen natural. Por lo
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tanto, en la invención también se engloban moléculas de FVIII modificadas que contienen en la parte C-terminal de FVIII una fusión con una HLEP, caracterizadas por que el FVIII modificado o el complejo del FVIII modificado con VWF no modificado presenta una semivida prolongada del antígeno de FVIII en comparación con la semivida del antígeno de FVIII que carece de dicha inserción. La “semivida del antígeno de FVIII” de acuerdo con la presente invención es la semivida del antígeno del FVIII una vez que se ha administrado a un mamífero y se mide in vitro. El experto conocerá métodos de prueba de antígenos basados en anticuerpos específicos en un formato de inmunoensayo enzimático y estos se pueden adquirir de proveedores comerciales (p. ej., Dade Behring, Instrumentation Laboratory, Abbott Laboratories, Diagnostica Stago). Las semividas funcionales y del antígeno se pueden calcular utilizando los puntos de evaluación de la fase beta de eliminación de acuerdo con la formula t-i/2 = In2 / k, donde k es la pendiente de la recta de regresión.
En otra realización, la semivida funcional del FVIII modificado activado endógenamente se prolonga en comparación con la del FVIII de origen natural activado. El incremento puede ser superior a un 15%, por ejemplo, de al menos un 20% o al menos un 50%. De nuevo, tales valores de semivida funcional se pueden medir y calcular según se ha descrito para las semividas funcionales anteriormente. Las semividas incrementadas de las moléculas de FVIII modificado activado endógenamente pueden resultar beneficiosas en situaciones en las que se encuentran disponibles unos niveles de FVIII tan solo muy bajos que, por consiguiente, no son trombogénicos. Tales situaciones se pueden producir, p. ej., tras un tratamiento de terapia génica, en el que a menudo se pueden obtener tan solo unas tasas de expresión bajas. Por consiguiente, tales moléculas de FVIII estabilizado podrían resultar beneficiosas, p. ej., en la terapia génica, a pesar del riesgo trombogénico asociado a tales moléculas de FVIII si se administran como proteínas en dosis fisiológicas o elevadas.
En otra realización de la invención, el FVIII modificado de la invención exhibe una recuperación in vivo mejorada en comparación con el FVIII de origen natural. La recuperación in vivo se puede determinar in vivo, por ejemplo, en animales normales o en modelos animales de hemofilia A, como ratones en los que se ha suprimido el FVIII, en los que cabría esperar la detección de un incremento del porcentaje del FVIII modificado de la invención por parte de ensayos de actividad o antígeno en circulación poco después (5 a 10 min) después de la administración i.v. en comparación con el FVIII de origen natural correspondiente o el VWF de origen natural.
La recuperación in vivo aumenta preferentemente al menos un 10%, más preferentemente al menos un 20% y aún más preferentemente al menos un 40% en comparación con la forma de FVIII de origen natural o con VWF de origen natural.
En otra realización más de la invención, se utilizan regiones constantes de inmunoglobulina o sus porciones como HLEP. Preferentemente, se utiliza la región Fc que comprende un dominio CH2 y CH3 y una región bisagra de una IgG, más preferentemente de una IgG1 o sus fragmentos o variantes, incluyendo las variantes mutaciones que mejoran la unión al receptor de Fc neonatal (FcRn).
Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar moléculas de FVIII de vida prolongada que, después del procesamiento proteolítico in vivo, presenten una semivida funcional comparable a la de un FVIII no modificado. Esto se puede conseguir manteniendo ciertos sitios de escisión en el FVIII modificado que provoquen una escisión proteolítica, por ejemplo, cuando entren en contacto con factores de coagulación activados, los cuales separan el FVIII de la HLEP. Por consiguiente, en una realización, la semivida funcional del FVIII modificado procesado proteolíticamente es sustancialmente la misma que la del VWF no modificado que carece de la modificación y/o es sustancialmente la misma que la del VWF de origen natural (p. ej., ±15%, preferentemente ±10%).
Otra realización más de la invención son polipéptidos FVIII modificados que están fusionados con una HLEP, por ejemplo, albúmina en la parte C-terminal de la molécula de FVIII, los cuales presentan una reducción de la unión a VWF o no se unen a VWF en absoluto.
Secuencias conectoras
De acuerdo con esta invención, el resto polipeptídico terapéutico se puede acoplar con el resto de HLEP mediante un conector peptídico. El conector debe ser no inmunogénico y puede ser un conector escindible o no escindible.
Los conectores no escindibles pueden comprender residuos de glicina y serina alternos según se ilustra en WO2007/090584.
En otra realización de la invención, el conector peptídico entre el resto de FVIII y/o de VWF y el resto de albúmina está constituido por secuencias peptídicas, las cuales sirven como conectores entre dominios naturales en proteínas humanas. Preferentemente, tales secuencias peptídicas en su entorno natural están localizadas cerca de la superficie de la proteína y pueden ser accedidas por el sistema inmunitario, de modo que se puede asumir una tolerancia natural frente a esta secuencia. Se proporcionan ejemplos en WO2007/090584.
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Los conectores escindibles deben ser lo suficientemente flexibles para permitir una escisión por parte de proteasas. En una realización preferida, la escisión del conector procede de forma comparablemente rápida como la activación de FVIII en la proteína de fusión, si la proteína de fusión es un FVIII modificado.
El conector escindible comprende preferentemente una secuencia derivada de
a) el polipéptido terapéutico que se ha de administrar en sí, si contiene sitios de escisión proteolítica que se escinden proteolíticamente durante la activación del polipéptido terapéutico,
b) un polipéptido sustrato escindido por una proteasa que se activa o forma mediante la intervención del polipéptido terapéutico,
c) un polipéptido que interviene en la coagulación o la fibrinólisis.
La región conectora, en una realización más preferida, comprende una secuencia de FVIII y/o VWF, que debería dar como resultado una reducción del riesgo de obtener propiedades neoantigénicas de la proteína de fusión expresada. Además, en el caso de que la proteína terapéutica sea FVIII, que requiere ser activado proteolíticamente, la cinética de la escisión del conector peptídico reflejará más de cerca la cinética de activación relacionada con la coagulación del zimógeno.
En una realización preferida, el polipéptido terapéutico es un zimógeno de FVIII y la HLEP es albúmina. En este caso, la secuencia conectora o bien deriva de las secuencias de las regiones activadas de FVIII, de la región de escisión de cualquier sustrato de FIX como FX o FVIII, o de la región de escisión de cualquier polipéptido sustrato que sea escindido por una proteasa en cuya activación intervenga FIXa.
En una realización muy preferida, el péptido conector deriva de FVIII en sí y comprende secuencias que engloban los sitios de escisión de la trombina en las posiciones aminoacídicas 372, 740 y 1689 de la SEQ ID NO. 15, respectivamente. En otra realización preferida, el péptido conector deriva de FX, FIX, FVII o FXI.
Los péptidos conectores son escindidos preferentemente por las proteasas del sistema de coagulación, por ejemplo, Flla, FIXa, FXa, FXla, FXlla y FVlla.
Dichas secuencias conectoras también se pueden utilizar en el VWF modificado de la invención.
Algunas combinaciones ilustrativas del polipéptido terapéutico, conector escindible y HLEP incluyen los constructos enumerados en el documento WO2007/090584 (por ejemplo, en la Tabla 2 y la Figura 4) y el documento WO2007/144173 (por ejemplo, en la Tabla 3a y 3b), pero no se limitan a estos.
Polipéptidos que mejoran la semivida (HLEP)
Un “polipéptido que mejora la semivida”, tal como se utiliza en la presente, se selecciona del grupo constituido por la albúmina. Puede ser una proteína que mejora la semivida de longitud completa descrita en la presente o uno o más de sus fragmentos que sean capaces de estabilizar o prolongar la actividad terapéutica o la actividad biológica del factor de coagulación. Tales fragmentos pueden tener una longitud de 10 o más aminoácidos o pueden incluir al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 100 o más aminoácidos contiguos de la secuencia de HLEP o pueden incluir todos o parte de los dominios específicos de la HLEP respectiva, siempre que el fragmento de HLEP proporcione una extensión de la semivida funcional de al menos un 25% en comparación con un FVIII de origen natural o VWF de origen natural.
La porción de HLEP de los constructos de inserción del factor de coagulación propuestos de la invención puede ser una variante de una HLEP normal. El término “variantes” incluye inserciones, deleciones y sustituciones, ya sean conservativas o no conservativas, donde tales cambios no alteran sustancialmente el centro activo o dominio activo que confiere las actividades biológicas del FVIII modificado o VWF modificado.
En particular, los constructos de fusión FVIII HLEP o VWF HLEP propuestos de la invención pueden incluir variantes polimórficas de origen natural de HLEP y fragmentos de HLEP. La HLEP puede derivar de cualquier vertebrado, especialmente cualquier mamífero, por ejemplo, un ser humano, mono, vaca, oveja o cerdo. Las HLEP que no son de mamífero incluyen, sin carácter limitante, las de gallina o salmón.
Albúmina como HLEP
Las expresiones “albúmina de suero humano” (ASH), “albúmina humana” (AH) y “albúmina” (ALB) se utilizan indistintamente en esta solicitud. Las expresiones “albúmina” y “albúmina de suero” son más amplias y engloban la albúmina de suero humano (y sus fragmentos y variantes), así como también albúmina de otras especies (y sus fragmentos y variantes).
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El término “albúmina”, tal como se utiliza en la presente, se refiere de forma colectiva a una secuencia de aminoácidos o polipeptídica de albúmina, o fragmento o variante de albúmina, con una o más actividades funcionales (p. ej., actividades biológicas) de albúmina. En particular, el término “albúmina” se refiere a albúmina humana o sus fragmentos, especialmente la forma madura de la albúmina humana según se muestra en la SEQ ID NO:16 de la presente, o albúmina de otros vertebrados o sus fragmentos, o análogos o variantes de estas moléculas o sus fragmentos.
En particular, los constructos de fusión de FVIII propuestos de la invención pueden incluir variantes polimórficas de origen natural de albúmina humana y fragmentos de albúmina humana. En términos generales, un fragmento o variante de albúmina tendrá una longitud de al menos 10, preferentemente al menos 40 y de la forma más preferida más de 70 aminoácidos. La variante de albúmina puede estar constituida preferentemente o puede comprender de forma alternativa al menos un dominio entero de albúmina o fragmentos de dichos dominios, por ejemplo, los dominios 1 (aminoácidos 1-194 de la SEQ ID NO:16), 2 (aminoácidos 195-387 de la SEQ ID No: 16), 3 (aminoácidos 388-585 de la SEQ ID NO: 16), 1 + 2 (1-387 de la SEQ ID NO: 16), 2 + 3 (195-585 de la SEQ ID NO: 16) o 1 + 3 (aminoácidos 1-194 de la SEQ ID NO: 16 + aminoácidos 388-585 de la SEQ ID NO: 16). Cada dominio está constituido a su vez por dos subdominios homólogos, a saber 1-105, 120-194, 195-291, 316-387, 388-491 y 512-585, con regiones conectoras entre dominios flexibles que comprenden los residuos de Lys106 a Glu119, de Glu292 a Val315 y de Glu492 a Ala511.
La porción de albúmina de los constructos de fusión de FVIII propuestos de la invención pueden comprender al menos un subdominio o dominio de AH o modificaciones conservativas de este.
Polinucleótidos
La invención se refiere además a un polinucleótido que codifica un factor de coagulación modificado, preferentemente una variante de FVIII modificado según se describe en esta solicitud. El término “polinucleótido(s)” se refiere en general a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. El polinucleótido puede ser ADN mono- o bicatenario, o ARN mono- o bicatenario. El término “polinucleótido(s)”, tal como se utiliza en la presente, también incluye ADN o ARN que comprenden una o más bases modificadas y/o bases inusuales tales como la inosina. Se apreciará que se pueden realizar varias modificaciones al ADN y ARN con muchos propósitos útiles conocidos por los expertos en la técnica. El término “polinucleótido(s)”, tal como se utiliza en la presente, abarca tales formas química, enzimática o metabólicamente modificadas de los polinucleótidos, así como también las formas químicas del ADN y ARN características de virus y células, incluidas, por ejemplo, las células simples y complejas.
El experto comprenderá que, debido a la degeneración del código genético, un polipéptido dado puede ser codificado por diferentes polinucleótidos. Estas “variantes” quedan englobadas en esta invención.
Preferentemente, el polinucleótido de la invención es un polinucleótido aislado. La expresión polinucleótido “aislado” se refiere a un polinucleótido que está sustancialmente exento de otras secuencias de ácido nucleico tales como, sin carácter limitante, otros ADN y ARN cromosómicos y extracromosómicos. Los polinucleótidos aislados se pueden purificar a partir de una célula huésped. Se pueden utilizar métodos de purificación de ácidos nucleicos convencionales conocidos por los expertos para obtener los polinucleótidos aislados. El término también incluye polinucleótidos recombinantes y polinucleótidos sintetizados químicamente.
La invención se refiere además a un grupo de polinucleótidos que codifican conjuntamente el FVIII modificado y/o el VWF modificado de la invención. Un primer polinucleótido del grupo puede codificar la parte N-terminal del FVIII modificado y un segundo polinucleótido puede codificar la parte C-terminal del FVIII modificado.
Otro aspecto más de la invención consiste en un plásmido o vector que comprende un polinucleótido de acuerdo con la invención. Preferentemente, el plásmido o vector es un vector de expresión. En una realización particular, el vector es un vector de transferencia para su uso en terapia génica humana.
La invención también se refiere a un grupo de plásmidos o vectores que comprenden el grupo anterior de polinucleótidos. Un primer plásmido o vector puede contener dicho primer polinucleótido y un segundo plásmido o vector puede contener dicho segundo polinucleótido. A modo de ejemplo y haciendo referencia al factor de coagulación FVIII, las secuencias codificantes del péptido señal, los dominios A1 y A2, el resto de la secuencia del dominio B y la HLEP se pueden clonar en el primer vector de expresión y las secuencias codificantes de A3, C1 y C2 con una secuencia adecuada de péptido señal se pueden clonar en el segundo vector de expresión. Ambos vectores de expresión se cotransfectan en una célula huésped adecuada, que conducirá a la expresión de las cadenas ligera y pesada de la molécula de FVIII de la invención y la formación de una proteína funcional.
Como alternativa, la secuencia codificante del péptido señal de FVIII, los dominios A1 y A2 se clonan en el primer vector de expresión y las secuencias codificantes de HLEP, A3, C1 y C2 de FVIII con una secuencia adecuada de péptido señal se clonan en el segundo vector de expresión. Ambos vectores de expresión se cotransfectan en una
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célula huésped adecuada, que conducirá a la expresión de las cadenas ligera y pesada de la molécula de FVIII de la invención y la formación de una proteína funcional.
Como alternativa, ambas secuencias codificantes se clonan en un vector de expresión, ya sea utilizando dos secuencias promotoras separadas o un promotor y un elemento de sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) para dirigir la expresión de ambas cadenas de FVIII.
Otro aspecto más de la invención consiste en una célula huésped que comprende un polinucleótido, un plásmido o vector de la invención o un grupo de polinucleótidos o un grupo de plásmidos o vectores según se describen en la presente.
Las células huésped de la invención se pueden emplear en un método para producir un factor de coagulación modificado, preferentemente una molécula de FVIII modificado, que forma parte de esta invención. El método comprende:
(a) cultivar células huésped de la invención en condiciones tales que se exprese la proteína de inserción deseada; y
(b) opcionalmente recuperar la proteína de inserción deseada a partir de las células huésped o a partir del medio de cultivo.
Se prefiere purificar el FVIII modificado de la presente invención hasta obtener una pureza > 80%, más preferentemente una pureza > 95% y se prefiere particularmente un estado farmacéuticamente puro que sea superior a una pureza de un 99.9% respecto a macromoléculas contaminantes, en particular otras proteínas y ácidos nucleicos, y exento de agentes infecciosos y pirógenos. Preferentemente, un FVIII modificado aislado o purificado de la invención está sustancialmente exento de otros polipéptidos no relacionados.
Los diferentes productos de la invención son útiles como medicamentos. Por consiguiente, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un FVIII modificado según se describe en la presente, un polinucleótido de la invención o un plásmido o vector de la invención.
La invención también se refiere a un método para tratar a un individuo que padece un trastorno de coagulación de la sangre tal como la hemofilia A o B. El método comprende administrar a dicho individuo una cantidad eficaz del FVIII o del complejo de FVIII modificado con VWF no modificado según se describe en la presente. En otra realización, el método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un polinucleótido de la invención o de un plásmido o vector de la invención. Como alternativa, el método puede comprender administrar al individuo una cantidad eficaz de las células huésped de la invención descritas en la presente.
Expresión de los mutantes propuestos
La producción de proteínas mutadas recombinantes en niveles elevados en células huésped adecuadas requiere el acoplamiento de los ADNc modificados mencionados anteriormente en unidades de transcripción eficaces junto con elementos reguladores adecuados en un vector de expresión recombinante que se pueda propagar en varios sistemas de expresión de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la técnica. Los elementos reguladores de la transcripción eficaces podrían derivar de virus que tengan células animales como sus huéspedes naturales o del ADN cromosómico de células animales. Preferentemente, se pueden utilizar combinaciones de promotor- potenciador derivadas del virus del simio 40, adenovirus, virus del polioma BK, citomegalovirus humanos o la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous, o combinaciones de promotor-potenciador que incluyan genes transcritos de forma fuertemente constitutiva en células animales como la beta-actina o GRP78. Con el fin de conseguir niveles elevados estables de ARNm transcrito a partir de los ADNc, la unidad de transcripción debe contener en su parte 3'-proximal una región de ADN que codifique una secuencia de poliadenilación-terminación de la transcripción. Preferentemente, esta secuencia deriva de la región de transcripción temprana del virus del simio 40, el gen beta-globina de conejo o el gen activador de plasminógeno tisular humano.
A continuación, los ADNc se integran en el genoma de una línea adecuada de células huésped para la expresión de las proteínas FVIII y/o VWF modificadas. Preferentemente, esta línea celular debe ser una línea celular animal de origen vertebrado con el fin de garantizar un plegamiento correcto, la formación de puentes disulfuro, la glicosilación relacionada con la asparagina y otras modificaciones posteriores a la traducción, así como también la secreción en el medio de cultivo. Algunos ejemplos de otras modificaciones posteriores a la traducción son la O-sulfatación de la tirosina y el procesamiento proteolítico de la cadena polipeptídica naciente. Algunos ejemplos de líneas celulares que se pueden utilizar son células COS de primate, células L de ratón, células C127 de ratón, células BHK-21 de hámster, células 293 de riñón embriónico humano y células CHO de hámster.
El vector de expresión recombinante que codifica los ADNc correspondientes se puede introducir en una línea celular animal de varias formas diferentes. Por ejemplo, se pueden crear vectores de expresión recombinantes a partir de vectores basados en diferentes virus animales. Algunos ejemplos de ellos son vectores basados en baculovirus, virus vaccinia, adenovirus, y preferentemente virus del papiloma bovino.
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Las unidades de transcripción que codifican los ADN correspondientes también se pueden introducir en células animales junto con otro gen recombinante que pueda actuar como marcador seleccionable dominante en estas células con el fin de facilitar el aislamiento de clones celulares específicos que hayan integrado el ADN recombinante en su genoma. Algunos ejemplos de este tipo de genes marcadores seleccionables dominantes son la aminoglicósido-fosfotransferasa de Tn5, que confiere resistencia a la geneticina (G418), la higromicina- fosfotransferasa, que confiere resistencia a la higromicina, y la puromicina-acetiltransferasa, que confiere resistencia a la puromicina. El vector de expresión recombinante que codifica un marcador seleccionable de este tipo puede residir ya sea en el mismo vector, como codificador del ADNc de la proteína deseada, o puede ser codificado por un vector diferente que se introduzca de forma simultánea y se integre en el genoma de la célula huésped, lo cual da como resultado frecuentemente una conexión física estrecha entre las diferentes unidades de transcripción.
Otros tipos de genes marcadores seleccionables que se pueden utilizar junto con los ADNc de la proteína deseada se basan en varias unidades de transcripción que codifican la dihidrofolato-reductasa (dhfr). Tras la introducción de este tipo de gen en células que carecen de actividad dhfr endógena, preferentemente células CHO (DUKX-B11, DG- 44), este permitirá que dichas células crezcan en medios que carecen de nucleósidos. Un ejemplo de un medio de este tipo es F12 de Ham sin hipoxantina, timidina ni glicina. Estos genes dhfr se pueden introducir conjuntamente con las unidades de transcripción de ADNc de FVIII en células CHO del tipo anterior, tanto unidos al mismo vector o en vectores diferentes, con lo que se crean líneas celulares dhfr-positivas que producen proteína recombinante.
Si las líneas celulares anteriores se cultivan en presencia del inhibidor de dhfr citotóxico metotrexato, emergerán nuevas líneas celulares resistentes al metotrexato. Estas líneas celulares pueden producir proteína recombinante con una mayor tasa, debido al número amplificado de dhfr que se ha unido y las unidades de transcripción de la proteína deseada. Cuando se propagan estas líneas celulares en concentraciones cada vez mayores de metotrexato (1-10000 nM), se pueden obtener nuevas líneas celulares que produzcan la proteína deseada con una tasa muy elevada.
Las líneas celulares anteriores que producen la proteína deseada se pueden cultivar a gran escala, ya sea en un cultivo en suspensión o en varios soportes sólidos. Algunos ejemplos de estos soportes son microportadores basados en matrices de dextrano o colágeno, o soportes sólidos en forma de fibras huecas o varios materiales cerámicos. Cuando se cultivan en un cultivo de células en suspensión o en microportadores, el cultivo de las líneas celulares anteriores se puede llevar a cabo ya sea como un cultivo en un baño o como un cultivo en perfusión con la producción continua de medio acondicionado durante periodos de tiempo prolongados. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, las líneas celulares anteriores son adecuadas para el desarrollo de un proceso industrial para la producción de las proteínas mutadas recombinantes deseadas.
Purificación y formulación
El FVIII modificado recombinante, el cual se acumula en el medio de células secretoras de los tipos anteriores, se puede concentrar y purificar mediante varios métodos bioquímicos y cromatográficos, que incluyen métodos que emplean diferencias en tamaño, carga, hidrofobicidad, solubilidad, afinidad específica, etc. entre la proteína deseada y otras sustancias en el medio de cultivo celular.
Un ejemplo de tal purificación consiste en la adsorción de la proteína mutada recombinante en un anticuerpo monoclonal, dirigido, p. ej., a una HLEP de albúmina humana, o dirigido al factor de coagulación respectivo, el cual se inmoviliza sobre un soporte sólido. Tras la adsorción del FVIII modificado sobre el soporte, su lavado y desorción, la proteína se puede purificar adicionalmente mediante varias técnicas cromatográficas basadas en las propiedades anteriores. El orden de los pasos de purificación se selecciona, p. ej., de acuerdo con la capacidad y la selectividad de los pasos, la estabilidad del soporte u otros aspectos. Algunos pasos de purificación preferidos, p. ej., son, sin carácter limitante, pasos de cromatografía de intercambio iónico, pasos de cromatografía de afinidad inmunitaria, pasos de cromatografía de afinidad, pasos de cromatografía de interacción hidrófoba, pasos de cromatografía con tintes, pasos de cromatografía con hidroxiapatita, pasos de cromatografía multimodal y pasos de cromatografía por exclusión de tamaño.
Con el fin de minimizar el riesgo teórico de contaminaciones con virus, se pueden incluir pasos adicionales en el proceso que permitan la desactivación o eliminación eficaz de los virus. Tales pasos son, p. ej., un tratamiento térmico en estado líquido o sólido, un tratamiento con disolventes y/o detergentes, radiación en el espectro visible o UV, radiación gamma o nanofiltración.
Los polinucleótidos modificados (p. ej., ADN) de esta invención también se pueden integrar en un vector de transferencia para su uso en terapia génica humana.
Las diferentes realizaciones descritas en la presente se pueden combinar entre sí. La presente invención se describirá adicionalmente con más detalle en los ejemplos de esta que se muestran más adelante. Esta descripción de realizaciones específicas de la invención se realizará conjuntamente con las figuras adjuntas.
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El FVIII modificado que se describe en esta invención se puede formular en preparados farmacéuticos para uso terapéutico. La proteína purificada se puede disolver en soluciones tampón acuosas fisiológicamente compatibles convencionales, a las cuales se pueden añadir, opcionalmente, excipientes farmacéuticos para proporcionar preparados farmacéuticos.
Tales portadores y excipientes farmacéuticos, así como también las formulaciones farmacéuticas adecuadas, son de uso común en la técnica (remítase, por ejemplo, a "Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins", Frokjaer et al., Taylor y Francis (2000) o "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3.a edición, Kibbe et al., Pharmaceutical Press (2000)). En particular, la composición farmacéutica que comprende la variante polipeptídica de la invención se puede formular en forma líquida estable o liofilizada. La variante polipeptídica se puede liofilizar mediante varios procedimientos conocidos en la técnica. Las formulaciones liofilizadas se reconstituyen antes de su uso mediante la adición de uno o más diluyentes farmacéuticamente aceptables tales como agua estéril para inyección o solución salina fisiológica estéril.
Las formulaciones de la composición se suministran al individuo mediante cualquier método farmacéuticamente adecuado de administración. Se conocen varios sistemas de suministro y se pueden utilizar para administrar la composición mediante cualquier vía conveniente. Preferentemente, las composiciones de la invención se administran por vía sistémica. Para el uso sistémico, las proteínas de inserción de la invención se formulan para el suministro parenteral (p. ej., intravenoso, subcutáneo, intramuscular, intraperitoneal, intracerebral, intrapulmonar, intranasal o transdérmico) o entérico (p. ej. oral, vaginal o rectal) de acuerdo con métodos convencionales. Las vías de administración más preferidas son la administración intravenosa y subcutánea. Las formulaciones se pueden administrar de forma continua por infusión o mediante inyección en bolo. Algunas formulaciones engloban sistemas de liberación lenta.
Las proteínas de inserción de la presente invención se administran a los pacientes con una dosis terapéuticamente eficaz, que se refiere a una dosis que sea suficiente para producir los efectos deseados, de modo que prevengan o reduzcan la gravedad o la propagación de la afección o indicación que se esté tratando sin llegar a una dosis que produzca efectos secundarios adversos intolerables. La dosis exacta depende de muchos factores como, p. ej., la indicación, formulación, vía de administración, y se debe determinar en ensayos clínicos y preclínicos para cada indicación respectiva.
La composición farmacéutica de la invención se puede administrar sola o combinada con otros agentes terapéuticos. Estos agentes se pueden incorporar como parte del mismo preparado farmacéutico. Un ejemplo de un agente de este tipo es la combinación de FVIII modificado con VWF no modificado.
Figuras
Figura 1: Niveles de antígeno y actividad de FVIII de origen natural y de polipéptidos de fusión FVIII-C-terminal- albúmina.
Figura 2: Comparación de los parámetros farmacocinéticos de FVIII humano:Ag en ratones con supresión de VWF tras la inyección i.v. de 100 U (FVIII:Ag)/kg de FVIII de origen natural y FVIII-FP 1656 VWF (media; n=4/punto de evaluación).
Figura 3: Proporciones de VWF:RCo/VWF:Ag de sobrenadantes de cultivos celulares que contienen rVWF de origen natural (1570/1212), rVWF-FP (1572/1212) que contiene albúmina unida al extremo C-terminal, o un cultivo celular de expresión mixta que contiene una mezcla de rVWF de origen natural (1570/1212) y rVWF-FP (1572/1212) transfectada con una proporción de 5:1. Se obtuvieron valores de aproximadamente 0.8 en cada caso, los cuales son próximos a 1, que corresponde a la proporción teórica de NHP de acuerdo con las definiciones de las unidades.
Figura 4: Electroforesis en gel de agarosa-SDS de rVWF de origen natural (1570/1212) expresado en células HEK (B) y rVWF-FP (1572/1212) expresado en células HEK (A). Las bandas se detectaron utilizando o bien anticuerpos para VWF o para albúmina (ASH).
Figura 5: Comparación de los parámetros farmacocinéticos de rWVF humano de origen natural y rVWF-FP tras la inyección i.v. de 100 IU de VWF:Ag en ratas (media, n=2-3 /punto de evaluación).
Ejemplos:
Ejemplo 1: Generación de vectores de expresión para moléculas de FVIII con fusión a albúmina C-terminal
En primer lugar se utilizó un plásmido de expresión basado en pIRESpuro3 (BD Biosciences) que contenía la secuencia de ADNc de FVIII de longitud completa en su sitio de clonación múltiple (pF8-FL) para crear un FVIII con el dominio B suprimido. Con este fin, se utilizaron los oligonucleótidos F8-1 y F8-2 (SEQ ID NO 1 y 2) en un experimento de mutagénesis dirigida al sitio de acuerdo con protocolos estándar (kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange XL, Stratagene, La Jolla, CA, EE. UU.) utilizando pF8-FL como molde para eliminar el dominio B. En
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un segundo paso, se introdujo una secuencia que codificaba la secuencia de aminoácidos RRGR para conectar R740 del dominio A2 con R1648 del dominio a3. Esto se llevó a cabo en otra ronda de mutagénesis dirigida al sitio utilizando los cebadores F8-3 y F8-4 (SEQ ID NO 3 y 4). El plásmido resultante se denominó pF8-457. Se generó un constructo de fusión FVIII-albúmina por pasos. En primer lugar, se introdujo un sitio de escisión PinAl en el extremo 3'-terminal de FVIII. Con este fin, se generó un fragmento de PCR utilizando pF8-457 como molde, empleando los cebadores de PCR We2827 y We2828 (SEQ ID NO 5 y 6), el cual se purificó mediante gel posteriormente, se cortó con las endonucleasas de restricción BspE1 y Notl, y se ligó en pF8-457 previamente digerido con BspE1 y Notl. El plásmido resultante (pF8-1433) se cortó a continuación con las enzimas PinAl y Notl, y se insertó un fragmento obtenido mediante pCr en un plásmido que contenía ADNc de albúmina humana utilizando los cebadores We 2829 y We 2830 (SEQ ID NO 7 y 8), y posteriormente se digirió con las enzimas PinAl y Notl. El plásmido de expresión resultante (pF8-1434) contenía las secuencias codificantes para un FVIII con el dominio B suprimido seguidas de un sitio PinAl para insertar conectores (que codifica la secuencia de aminoácidos ThrGly) y la secuencia codificante para albúmina humana. La secuencia de aminoácidos codificada por pF8-1434 se representa como SEQ ID NO 9.
A continuación, las secuencias conectoras que separan el resto de FVIII y el resto de albúmina se pudieron insertar fácilmente en el sitio PinAI recién creado descrito anteriormente. A continuación se describe la inserción de dos secuencias conectoras. Además, basándose en pF8-1434, el conector TG se podría eliminar por completo e incluso las deleciones en el extremo C-terminal de FVIII o el extremo N-terminal de la albúmina se pueden llevar a cabo utilizando mutagénesis dirigida al sitio.
Inserción de un conector escindible derivado del sitio de escisión de la trombina del FVIII: en primer lugar, se generó un fragmento de PCR que contenía la secuencia que codifica el sitio de escisión de la trombina en la posición 372 mediante PCR utilizando los cebadores We2979 y We2980 (SEQ ID NO 10 y 11) y pF8-457 como molde. Este fragmento se purificó, se digirió con PinAl y se ligó en pF8-1434 digerido con PinAl. La secuenciación verificó la inserción de la orientación correcta del fragmento y el plásmido resultante se denominó pF8-1563.
Inserción de un conector de glicina/serina flexible: se amplificó un fragmento de PCR que contenía la secuencia codificante para un conector de glicina/serina de 31 aminoácidos mediante PCR a partir de pFVII-937 que se describe en WO2007/090584 utilizando los cebadores We2991 y We2992 (SEQ ID nO 12 y 13). A continuación, este fragmento se purificó, se digirió con la endonucleasa de restricción PinAl y se ligó en pF8-1434 digerido con PinAl. La secuenciación verificó la inserción de la orientación correcta del fragmento y el plásmido resultante se denominó pF8-1568.
Utilizando los protocolos y los plásmidos descritos anteriormente y aplicando técnicas de biología molecular conocidas por los expertos en la técnica (y que se describen, p. ej., en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel FM et al. (eds.) John Wiley & Sons, Inc.;
http://www.currentprotocols.com/WileyCDA/), un experto puede preparar otros constructos para reemplazar la albúmina por otro HLEP o insertar cualquier otro conector en el sitio PinAl descrito. La transferencia del ADNc de FVIII/albúmina en vectores adecuados tales como pIRESneo3 (Invitrogen) y pEE12.4 (Lonza) permitió la expresión y la selección de clones que expresaban la proteína de fusión FVIII-albúmina respectiva en células CHO.
http://www.currentprotocols.com/WileyCDA/), un experto puede preparar otros constructos para reemplazar la albúmina por otro HLEP o insertar cualquier otro conector en el sitio PinAl descrito. La transferencia del ADNc de FVIII/albúmina en vectores adecuados tales como pIRESneo3 (Invitrogen) y pEE12.4 (Lonza) permitió la expresión y la selección de clones que expresaban la proteína de fusión FVIII-albúmina respectiva en células CHO.
Ejemplo 2: Transfección y expresión de las proteínas FVIII y VWF
Se cultivaron plásmidos de expresión en E. coli TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) y se purificaron utilizando protocolos estándar (Qiagen, Hilden, Alemania). Se transfectaron células HEK-293 (Invitrogen) utilizando el reactivo Lipofectamina 2000 (Invitrogen) y se cultivaron en medio exento de suero (Invitrogen 293 Express) en presencia de 4 pg/mL de Puromicina y opcionalmente 0.5 IU/mL de VWF. Se transfectaron células CHO (CHO-S, Invitrogen; CHOK1SV, Lonza) utilizando el reactivo Lipofectamina 2000 (Invitrogen) y se cultivaron en medio exento de suero (Invitrogen CD CHO, glutamina 6 mM para ChO-S y CD-CHO para CHoK1sV) en presencia de 500-1000 pg/mL de Geneticina (CHO-S únicamente). Para la expresión de FVIII, se añadieron opcionalmente 0.5 IU/mL de VWF. Para la expresión de vWF, se cotransfectó un plásmido de expresión que codificaba PACE/furina (pFu-797) según se describe en WO2007/144173. En otro experimento, dos plásmidos que codificaban VWF de origen natural y VWF fusionado en el extremo C-terminal con albúmina se cotransfectaron con pFu-797 para obtener multímeros de VWF con monómeros de VWF de origen natural y monómeros de VWF fusionados con albúmina (remítase a la figura 3). Las poblaciones de células transfectadas se esparcieron mediante frascos para cultivo celular en botellas rotatorias o fermentadores de pequeña escala, de los cuales se recolectaron los sobrenadantes para purificarlos.
La tabla 2 enumera los datos de expresión de HEK-293 para los constructos descritos en el ejemplo 1.
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Tabla 2:
- Constructo
- Actividad [U/mL]
- pF8-457
- 1.54
- pF8-457 + 0.5 U/mL de VWF
- 1.66
- pF8-1434
- 1.59
- pF8-1434 + 0.5 U/mL de VWF
- 1.82
- pF8-1563 + 0.5 U/mL de VWF
- 2.04
- pF8-1568 + 0.5 U/mL de VWF
- 1.21
Ejemplo 3: Incremento de la tasa de expresión de la proteína de fusión FVIM-albúmina
La figura 1 resume los resultados de un estudio de expresión de una proteína de fusión FVIN-albúmina en un cultivo celular exento de suero. Se transfectaron células HEK-293 por triplicado con pF8-1434 (fusión FVIII-C-terminal- albúmina) y pF8-457 (FVIII de origen natural), respectivamente, se sembraron en frascos T80 con números celulares equivalentes y se cultivaron en ausencia de vWf estabilizante. A continuación, el sobrenadante del cultivo se recolectó después de 96, 120 y 144 horas, y se evaluó para determinar la actividad de FVIII.
Los resultados mostraron un efecto potenciador de la expresión del resto de albúmina cuando está presente como una parte integral de la molécula de FVIII en el cultivo celular. Como consecuencia, se mejoró claramente la productividad en el caso de la proteína de fusión en comparación con el FVIII de origen natural (figura 1).
Ejemplo 4: Purificación de proteínas FVIII
Se añadió una cantidad suficiente de una resina de afinidad inmunitaria al sobrenadante de expresión que contenía la molécula de FVIII para que se uniera a la actividad de FVIII casi completamente. La resina de afinidad inmunitaria se había preparado uniendo covalentemente un MAb anti-FVIII adecuado a una resina Sephacryl S1000 empleada como soporte. Después de lavar la resina, se introdujo en una columna cromatográfica y se lavó de nuevo. La elución se llevó a cabo utilizando un tampón que contenía CaCl2 250 mM y etilenglicol al 50%.
Las fracciones de la cromatografía de afinidad inmunitaria (IAC, por sus siglas en inglés) que contenían actividad FVIII:C se agruparon, se sometieron a diálisis frente a un tampón de formulación (excipientes: cloruro de sodio, sacarosa, histidina, cloruro de calcio y Tween 80) y se concentraron. Las muestras o bien se guardaron congeladas o se liofilizaron utilizando un ciclo de liofilización adecuado.
Como alternativa, el sobrenadante del cultivo celular que contiene el FVIII se concentra/purifica mediante cromatografía de intercambio iónico en primer lugar y a continuación mediante una purificación adicional utilizando cromatografía de afinidad inmunitaria (IAC). En este caso, el material eluido de la cromatografía de intercambio iónico se introduce en una columna de IAC utilizando la resina mencionada anteriormente.
Ejemplo 5: Análisis de la actividad y el antígeno de FVIII
Para determinar la actividad de FVIII:C in vitro, se llevó a cabo o bien un ensayo de coagulación (p. ej., plasma deficiente en FVIII y reactivo Pathromtin SL suministrado por Dade Behring, Alemania) o un ensayo cromogénico (p. ej., ensayo Coamatic FVIII:C suministrado por Haemochrom). Los ensayos se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
El antígeno de FVIII (FVIII:Ag) se determinó mediante ELISA, cuyo rendimiento es conocido por los expertos en la técnica. Resumiendo, se incubaron microplacas con 100 pL por pocillo del anticuerpo de captura (IgG anti-FVIII humano de oveja, Cedarlane CL20035K-C, con un factor de dilución 1:200 en Tampón A [Sigma C3041]) durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de lavar las placas tres veces con tampón B (Sigma P3563), se incubaron diluciones en serie de la muestra de prueba en tampón diluyente para la muestra (Cedarlane), así como también diluciones en serie de un preparado de FVIII (CSL Behring; 200 - 2 mU/mL) en tampón diluyente para la muestra (volúmenes por pocillo: 100 pL), durante dos horas a temperatura ambiente. Después de tres pasos de lavado con tampón B, se añadieron 100 pL de una dilución 1:2 en tampón B del anticuerpo de detección (IgG anti-FVIII humano
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de oveja, Cedarlane CL20035K-D, marcada con peroxidasa) a cada pocilio y se incubaron durante otra hora a temperatura ambiente. Después de tres pasos de lavado con tampón B, se añadieron 100 pL de solución de sustrato (1:10 (v/v) TMB OUVF : tampón de TMB OUVG, Dade Behring) por pocillo y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. La adición de 100 pL de solución de detención (Dade Behring, OSFA) preparó las muestras para su lectura en un lector de microplacas adecuado a una longitud de onda de 450 nm. A continuación, se calcularon las concentraciones de las muestras de prueba utilizando la curva patrón con el preparado de FVIII como referencia.
Ejemplo 6: Evaluación de los parámetros farmacocinéticos de FVIII-FP en ratones en los que se ha suprimido VWF tras una única inyección i.v.
Con el fin de comparar los parámetros farmacocinéticos de FVIII de origen natural (ADN 457) y FVIII-FP C-terminal (ADN 1656), ambas variantes de FVIII se administraron por vía intravenosa a ratones. Se seleccionó una cepa de ratón en la que se había suprimido VWF (Denis C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, Vol. 95, 9524-9529) ya que, entre otras funciones, VWF actúa como portador y proteína estabilizante para FVIII, de este modo protege a FVIII frente a su degradación prematura, p. ej., por parte de proteasas, y frente a su eliminación prematura de la circulación. Para un FVIII no modificado, es esencial una interacción sin perturbaciones con VWF, según ilustran los casos de hemofilia A, provocados por una mutación en la región C-terminal, que provoca una reducción de la unión a VWF. En el caso de FVIII modificado, tal unión puede ser, a pesar de ello, incluso indeseada, con el fin de examinar o conseguir unos parámetros farmacocinéticos mejorados. Por consiguiente, se inyectaron ambos productos por vía i.v. con una dosis de 100 U (FVIII:Ag)/kg en bolo a dos grupos de ratones (tabla 3). Se tomaron muestras de sangre de forma retroorbital en intervalos adecuados, empezando 5 minutos después de la aplicación de las sustancias de prueba y hasta las 24 horas. Se tomó una muestra de sangre / ratón, se procesó hasta obtener el plasma y se guardó congelada a -20 °C hasta el análisis. Se cuantificó la concentración de FVIII:Ag humano utilizando un ensayo ELISA específico para FVIII humano o mediante un ELISA mixto específico para FVIII y albúmina humana, respectivamente. La concentración en plasma media de las muestras agrupadas para cada punto de evaluación se utilizó para calcular los parámetros farmacocinéticos. La semivida se calculó utilizando los puntos de evaluación de la fase beta de la eliminación de acuerdo con la fórmula t-i/2 = In2 / k, donde k es la pendiente de la recta de regresión. El resultado se representa en la figura 2. Sorprendentemente, FVIII-FP 1656 (t-i/2 = 3.06 h, entre 5 y 960 min) presentó una semivida terminal aproximadamente 3-4 veces más prolongada en comparación con FVIII de origen natural (t-i/2 = 0.8 h, entre 5 y 240 min). Además, la recuperación de FVIII-FP 1656 se incrementó aproximadamente un 20% en comparación con FVIII de origen natural (tabla 4).
Tabla 3: Grupos de tratamiento para la comparación de los parámetros farmacocinéticos de FVIII en ratones en los que se ha suprimido VWF
- Tratamiento
- Dosis (FVIIkC) / volumen / programa / vía N
- FVIII de origen natural
- 100 U (FVIII:Ag)/kg / 0.2 mL/20 g de peso corporal / t=0 h / i.v. 24
- FVIII-FP 1656
- 100 U (FVIII:Ag)/kg / 0.2 mL/20 g de peso corporal / t=0 h / i.v. 24
Tabla 4: Biodisponibilidad (%) de FVIII de origen natural y FVIII modificado, FVIII-FP 1656,
tras la inyección i.v. en ratones en los que se ha suprimido VWF
- Tratamiento
- Biodisponibilidad (%)
- FVIII de origen natural
- 100
- FVIII-FP 1656
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Ejemplo 7: Generación de vectores de expresión para VWF de origen natural y proteínas de fusión VWF- albúmina
En primer lugar se generó un plásmido de expresión que contenía la secuencia de ADNc de VWF de longitud completa en su sitio de clonación múltiple. Para ello, la secuencia codificante de VWF se amplificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando el conjunto de cebadores VWF+ y VWF- (SEQ ID NO. 17 y 18) en las condiciones estándar conocidas por los expertos en la técnica (y según se describe, p. ej., en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel FM et al. (eds.) John Wiley & Sons, Inc.;
http://www.currentprotocols.com/WileyCDA/) a partir de un plásmido que contenía ADNc de VWF (que se puede obtener de proveedores comerciales, p. ej., pMT2-VWF de ATCC, N.° 67122). El fragmento de PCR resultante se digirió con la endonucleasa de restricción EcoRI y se ligó en el vector de expresión pIRESpuro3 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.) que había sido linealizado con EcoRI. El plásmido de expresión resultante que contenía el ADNc de origen natural de VWF después del promotor CMV se denominó pVWF-1570.
http://www.currentprotocols.com/WileyCDA/) a partir de un plásmido que contenía ADNc de VWF (que se puede obtener de proveedores comerciales, p. ej., pMT2-VWF de ATCC, N.° 67122). El fragmento de PCR resultante se digirió con la endonucleasa de restricción EcoRI y se ligó en el vector de expresión pIRESpuro3 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.) que había sido linealizado con EcoRI. El plásmido de expresión resultante que contenía el ADNc de origen natural de VWF después del promotor CMV se denominó pVWF-1570.
Un fragmento de PCR que contenía la secuencia codificante para un conector de glicina/serina de 31 aminoácidos y el ADNc de albúmina humana se amplificó a partir de pFVII-937 que se describe en WO2007/090584 utilizando los cebadores We2994 y We1335 (SEQ ID NO. 19 y 20). A continuación, este fragmento de PCR se digirió con la endonucleasa de restricción Notl y se ligó en pVWF-1570 digerido con Notl. El plásmido resultante que contenía las secuencias codificantes de VWF de origen natural, la secuencia conectora y albúmina humana se denominó pVWF- 1574.
Con el fin de conseguir la expresión de una proteína de fusión, se tuvieron que eliminar varias bases entre VWF y la secuencia conectora. Esto se llevó a cabo mediante mutagénesis dirigida al sitio de acuerdo con protocolos estándar (kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange XL, Stratagene, La Jolla, CA, EE. Uu.) utilizando los oligonucleótidos We2995 y We2996 (SEQ ID NO 21 y 22). El plásmido de expresión resultante denominado pVWF- 1572 contenía las secuencias codificantes de VWF en fase con la de un conector de glicina/serina de 31 aminoácidos y albúmina humana. La secuencia de aminoácidos de rVWF-FP expresada se expone como SEQ ID No. 25. La secuencia de aminoácidos de la preproproteína VWF humana se expone como SEQ ID NO. 24.
Utilizando los plásmidos y protocolos descritos anteriormente y aplicando técnicas de biología molecular conocidas por los expertos en la técnica (y según se describe, p. ej., en Current Protocols in Molecular Biology, ibid), un experto puede preparar otros constructos para reemplazar la secuencia de albúmina por otra secuencia de HLEP o la secuencia conectora por otra secuencia conectora.
Ejemplo 8: Purificación de VWF y proteínas de fusión VWF-albúmina
Se filtraron de forma estéril sobrenadantes de cultivos celulares que contenían VWF de origen natural (rVWF de origen natural) o proteína de fusión VWF-albúmina (rVWF-FP) a través de un filtro de 0.2 pm y se sometieron a diálisis frente a un tampón de equilibración (EB: Tris-HCl 10mM, CaCl210mM, pH 7.0). A continuación, este material se aplicó a una columna de Heparina Fractogel equilibrada con EB. La columna se lavó con EB y las proteínas VWF se eluyeron con NaCl 500mM en EB. El pico de elución se concentró y se sometió a diálisis frente a un tampón de FB (3 g/L de cloruro de sodio, 20 g/L de glicina, 5.5 g/L de citrato de trisodio dihidratado, pH 7.0). Finalmente, el material se filtró de forma estéril y se congeló en alícuotas. Cuando procedió, se aplicaron pasos de purificación adicionales que comprendieron cromatografía de intercambio aniónico y/o catiónico, HIC y SEC.
Ejemplo 9: análisis de la actividad y el antígeno de VWF
Las muestras se analizaron mediante la determinación inmunoturbidimétrica de VWF:Ag (OPAB03, Siemens Healthcare Diagnostics, Marburg, Alemania) y para determinar la unión a colágeno (ELISA VWF:CBA de Technozym, Ref. 5450301 con el conjunto de calibración 5450310 y el conjunto de control 5450312, Technoclone, Viena, Austria) según describe el fabricante.
La evaluación de VWF:RCo se llevó a cabo utilizando el reactivo BC VWF de Siemens Healthcare Diagnostics, Marburg, Alemania, de acuerdo con la descripción del fabricante. Se utilizó el patrón internacional de concentrado como preparado patrón principal para calibrar un preparado patrón obtenido internamente para uso diario.
Se calculan las relaciones de los ensayos de VWF:RCo y VWF:Ag con el fin de comparar este parámetro para diferentes constructos evaluados. Según se muestra en la figura 3, la relación VWF:RCo/VWF:Ag fue comparable para rVWF de origen natural y la proteína de fusión rVWF-C-terminal-albúmina.
Para los análisis farmacocinéticos, se determinó el antígeno de VWF mediante ELISA, cuyo rendimiento es conocido por los expertos en la técnica. Resumiendo, se incubaron microplacas con 100 pL por pocillo del anticuerpo de captura (IgG anti-VWF humano de conejo, Dako A0082 [Dako, Hamburg, Alemania], con un factor de dilución 1:2000 en tampón A [Sigma C3041, Sigma-Aldrich, Munich, Alemania]) durante toda la noche a temperatura ambiente. Después de lavar las placas tres veces con tampón B (Sigma P3563), cada pocillo se incubó con 200 pL de tampón
Claims (22)
- 51015202530354045501. Un factor VIII modificado o un complejo que comprende factor VIII modificado y VWF no modificado, donde el factor VIII modificado está fusionado en una parte C-terminal del polipéptido de traducción primario del factor VIII con la parte N-terminal de una albúmina.
- 2. Un factor VIII modificado o un complejo que comprende factor VIII modificado y VWF no modificado de acuerdo con la reivindicación 1, dondea. el factor VIII modificado presenta una semivida funcional prolongada en comparación con la semivida funcional del factor VIII de origen natural ob. el complejo que comprende factor VIII modificado y VWF no modificado presenta una semivida funcional prolongada en comparación con la semivida funcional del complejo correspondiente que comprende factor VIII de origen natural y VWF de origen natural.
- 3. Un factor VIII modificado o un complejo que comprende dicho factor VIII modificado o un complejo que comprende factor VIII modificado y VWF no modificado de acuerdo con la reivindicación 2, donde el factor VIII modificado presenta un incremento de la semivida funcional de al menos un 25% en comparación con la semivida funcional del factor VIII correspondiente de origen natural o un complejo que comprende dicho factor VIII modificado y VWF no modificado presenta un incremento de la semivida funcional de al menos un 25% en comparación con el complejo correspondiente de FVIII de origen natural y VWF de origen natural.
- 4. Un factor VIII modificado o un complejo que comprende factor VIII modificado y VWF no modificado de acuerdo con la reivindicación 1, dondea. el factor VIII modificado presenta una semivida del antígeno prolongada en comparación con la semivida del antígeno del factor VIII de origen natural ob. el complejo que comprende factor VIII modificado y VWF no modificado presenta una semivida del antígeno prolongada en comparación con la semivida del antígeno del complejo correspondiente que comprende factor VIII de origen natural y VWF de origen natural.
- 5. Un factor VIII modificado o un complejo que comprende factor VIII modificado y VWF no modificado de acuerdo con la reivindicación 4, donde el factor VIII modificado presenta un incremento de la semivida del antígeno de al menos un 25% en comparación con la semivida del antígeno del factor VIII correspondiente de origen natural o un complejo que comprende dicho factor VIII modificado y VWF no modificado presenta un incremento de la semivida del antígeno de al menos un 25% en comparación con el complejo correspondiente de FVIII de origen natural y VWF de origen natural.
- 6. Un factor VIII modificado o un complejo que comprende FVIII modificado y VWF no modificado de acuerdo con la reivindicación 1, dondea. el factor VIII modificado presenta un incremento de la recuperación in vivo en comparación con la recuperación in vivo del factor VIII de origen natural ob. el complejo que comprende el factor VIII modificado y VWF no modificado presenta un incremento de la recuperación in vivo en comparación con la recuperación in vivo del complejo correspondiente que comprende factor VIII de origen natural y VWF de origen natural.
- 7. Un factor VIII modificado o un complejo que comprende factor VIII modificado y VWF no modificado de acuerdo con la reivindicación 6, donde el factor VIII modificado presenta un incremento de la recuperación in vivo de al menos un 10% en comparación con la recuperación in vivo del correspondiente factor VIII de origen natural o un complejo que comprende dicho factor VIII modificado y VWF no modificado presenta un incremento de la recuperación in vivo de al menos un 10% en comparación con el complejo correspondiente del factor VIII de origen natural y VWF de origen natural.
- 8. Un factor VIII modificado o un complejo que comprende factor VIII modificado y VWF no modificado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el factor VIII modificado presenta al menos un 10% de la actividad biológica del factor VIII de origen natural o el complejo que comprende el polipéptido modificado o un complejo que comprende dichos polipéptidos modificados presenta al menos un 10% de la actividad biológica del complejo correspondiente de FVIII de origen natural y VWF de origen natural.
- 9. Un FVIII modificado recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicho FVIII modificado recombinante se secreta a partir de células de mamífero con un rendimiento más elevado que el FVIII de origen natural.
- 10. Un polinucleótido o un grupo de polinucleótidos, que codifican un factor VIII modificado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9.
- 11. Un plásmido o vector que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 10, siendo dicho plásmido o vector un vector de expresión o un vector de transferencia para su uso en terapia génica humana.5 12. Una célula huésped que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 10 o un plásmido o vectorde acuerdo con la reivindicación 11.
- 13. Un método para producir un factor VIII modificado, que comprende:(a) cultivar células huésped de acuerdo con la reivindicación 12 en condiciones en las que se exprese el factor VIII modificado; y10 (b) opcionalmente recuperar el factor VIII modificado de las células huésped o del medio de cultivo.
- 14. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido o un complejo que comprende dicho factor VIII modificado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 10, o un plásmido o vector de acuerdo con la reivindicación 11.
- 15. El uso de un polipéptido o un complejo que comprende dicho factor VII modificado de acuerdo con cualquiera de 15 las reivindicaciones 1-9, un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 10, o un plásmido o vector de acuerdocon la reivindicación 11, o de una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 12 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno de coagulación de la sangre.
- 16. El uso de acuerdo con la reivindicación 15, donde el trastorno de coagulación de la sangre es la hemofilia A.
- 17. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 15, donde el tratamiento comprende terapia génica humana.[mU/mL]Figura 1: Niveles de antígeno y actividad de FVIII de origen natural (457) y de polipéptidos de fusión FVIII-C-terminal-albúmina (1434)
imagen1 proporción de actividad/antígenoFVIILAg [U/mL]Figura 2: Comparación de los parámetros farmacocinéticos de FVIII humano:Ag en ratones con supresión de VWF tras la inyección i.v. de 100 U (FVIII:Ag)/kg de FVIII de origen natural y FVIII -FP 1656 VWF (media; n=4/punto de evaluación)imagen2 imagen3 Figura 3: Proporciones de VWF:RCo/VWF:Ag de sobrenadantes de cultivos celulares que contienen rVWF de origen natural(1570/797), rVWF-FP (1572/797) que contiene albúmina unida al extremo C-terminal, o un cultivo celular de expresión mixtaque contiene una mezcla de rVWF de origen natural (1570/797) y rVWF-FP (1572/797) transfectada con una proporción de5:1. Se obtuvieron valores de aproximadamente 0.8 en cada caso, los cuales son próximos a 1, que corresponde a laproporción teórica de NHP de acuerdo con las definiciones de las unidades1.201.00O) - 0.80
- 0.90
- 0.79
- 0.76
- 0.60q 0.40
- 0.00rVWF de origen naturalrVWF-albúminarVWF de origen natural/(1572/797)rVWF- albúmina1570/797)(1570/1572/797)con una proporción deFigura 4: Electroforesis en gel de agarosa-SDS de rVWF de origen natural (1570/797) (B) y rVWF-FP (1572/797), ambos expresados en células HEK (A). Las bandas se detectaron utilizando o bien anticuerpos para VWF o para albúmina (ASH).rVWF-FP VWF de origen natural rVWF-FP
imagen4 ABAA = rVWF-FP (expresado en presencia de furina)B = VWFde origen natural (expresado en presencia de furina)imagen5 Figura 5: Análisis FC de rVWF de origen natural y rVWF-FP en ratas basado en la determinaccion de VWF:Ag100rvWF de origen naturalrvWF-FP2002202401001201401601B0Tlempo [minutos]
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