CN111592591B - 一种人血管性血友病因子/人凝血因子ⅷ复合物的制备方法及产物和应用 - Google Patents
一种人血管性血友病因子/人凝血因子ⅷ复合物的制备方法及产物和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物的制备方法及其产物和应用，涉及生物医药技术领域。本发明提供的制备方法操作简便，利用冷沉淀制备vWF/Ⅷ复合物，通过对冷沉淀的充分利用，能间接节约稀缺血浆资源，对提高市场竞争力有着重大意义。本发明制备得到的产品质量高，原液中vWF比活可达到50IU/mg，最后成品中铝残留量、纤维蛋白原、纤维结合蛋白、纤溶酶原、IgG、IgA、IgM等杂质含量极微，能进一步保证临床使用的安全性。本发明制得的vWF/Ⅷ≈1:1，能较好体现正常的人体血浆，有助于优化治疗所需的剂量。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物的制备方法及其产物和应用。
背景技术
人血管性血友病因子(vWF)是一种多聚体血浆糖蛋白，以超分子质量多聚体形式存在，其分子量250～20000kDa(每个成熟亚单位250KDa)，是目前血浆中已知的分子量最大的蛋白。正常人血浆中平均含量10mg/L(0.5～2IU/mL)，一级结构含2050个氨基酸残基，半衰期12～18小时。vWF在原发性止血中起着重要作用：(1)其负责与血小板膜GPⅠb-Ⅸ复合物及内皮下胶原结合，介导血小板在血管损伤部位的黏附，有助于纤维蛋白凝固的形成；(2)vWF还能结合GPⅡb-Ⅲa，参与血小板的聚集过程；(3)同时vWF也是人凝血因子Ⅷ(FⅧ)的运输剂和稳定剂。血浆中vWF多聚体的大小与其功能有密切关系，其分子量越大，与血小板结合能力越强，更能促进血小板聚集、血栓形成与微血管病性溶血。临床上，纯化的vWF主要用于血管性血友病(vWD)的治疗。vWD是一类较常见的遗传性出血性疾病，男女都可患病，具报道，vWD发病率约为万分之一，仅次于甲型血友病。
人凝血因子Ⅷ(FⅧ)亦称抗血友病球蛋白，是一种血浆糖蛋白，分子量约为320KD，在血浆中的含量极微，1ml血浆中仅含0.1～0.2μg。FⅧ在凝血机制中的内部途径的级联反应中起着必不可少的作用。临床上广泛应用于治疗甲型血友病和获得性凝血因子Ⅷ缺乏而致的出血症状及这类病人的手术出血治疗。
血浆中富含纤维蛋白原、纤维结合蛋白、FⅧ、vWF等成分，因此也曾在临床上用于治疗甲型血友病、vWD等疾病。目前人血浆来源的vWF在国际上已上市的有法国LFB公司的
Grifols公司的
Octapharma公司的
CSL公司的
等，国内尚无同类产品问世。
当产品中vWF与FⅧ的比例为1:1时，能较好的体现正常的人体血浆，vWF和FⅧ在体内自然存在的比例即为1:1。另外，临床Meta分析表明，部分vWF或FⅧ浓缩物临床使用过程中可出现FⅧ积聚，给药后应监测FⅧ水平。FⅧ水平增高是血栓栓塞形成的已知风险。归功于vWF与FⅧ的1:1比例，1:1的vWF/Ⅷ即使多次用药也不会引起FⅧ积聚。
止血过程：当人受伤流血时，血小板细胞会迅速汇集到受伤血管内壁，“堵”住受伤的血管让血液不外流，vWF则充当“胶水”的作用，将血小板固定于受伤血管内壁，形成血小板团。血小板团为血液凝固提供一个表面位置，此时血液中的凝血因子(如FⅧ)，启动内外源性凝血途径，聚集在血小板团表面，形成凝块并闭合伤口，产生“结痂”。vWD的患者中，这种“胶水”不见了，血小板难以成团；同时vWF是FⅧ的运输剂，当vWF水平低下时，FⅧ水平亦低下。没有正常的FⅧ水平，体内内外源凝血途径的作用减弱，形成固体凝块闭合伤口的时间延长，出血时间延长。故大部分vWD患者，在vWF因子缺失的同时，FⅧ因子也存在缺失，临床数据资料也印证了这一点。所以在补充vWF因子的同时，需再补充FⅧ因子，故制备vWF/Ⅷ的复合物显得很有必要。
中国专利(申请号201610077346.0)提供了一种从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中制备vWF的工艺，以冷沉淀为起始原料，经二步阴离子交换层析和一步亲和层析，步骤繁琐。同样，中国专利(申请号201811633049.5)也提供了一种从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中制备高纯度血管性血友病因子的工艺，以冷沉淀为起始原料，经一步阴离子交换层析、低电负性明胶吸附和一步离子交换层析，步骤繁琐。但是，无论是国外已上市产品还是中国专利提供的方法，整个生产过程至少需使用二步离子交换层析或二步沉淀法，繁琐费时，生产成本较大。
随着目前vWD疾病诊断技术的不断提升，vWF市场需求量将得到提升，预计2020年将达到1200万支(200IU/支)。目前，国内还未有产品上市，因此，开发一种杂质含量极少、vWF:Ag/vWF:Act≈1:1，并且安全性较好的vWF制备工艺，是很有必要的。
发明内容
有鉴于背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物的制备方法及其产物和应用。所述制备方法以冷沉淀为起始原料，只需经过一步离子交换层析，即可得vWF/Ⅷ≈1:1，人血管性血友病因子抗原/人血管性血友病因子效价(vWF:Ag/vWF:Act)≈1:1，杂质含量极少的vWF/Ⅷ制品。
本发明提供了一种人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)取冻存血浆，融浆后离心，收集冷沉淀；
(2)将步骤(1)所述冷沉淀溶解，调节pH值至6.35～6.55，12～18℃条件下离心，收集上清液；
(3)将步骤(2)所述上清液和氢氧化铝凝胶混合，搅拌吸附后离心，收集上清液；
(4)用平衡缓冲液调节步骤(3)所述上清液的蛋白浓度至5.0～15.0g/L，然后经0.6～0.7um+0.4～0.5um串联过滤，收集过滤液；
(5)将步骤(4)所述过滤液和S/D溶液混合，24～26℃条件下搅拌5～7h后过滤，所述过滤的过滤用具孔径为0.4～0.5μm，收集过滤液；
(6)将步骤(5)所述过滤液用平衡缓冲液、95～105KD的超滤膜透析，收集透析后的蛋白液；
(7)将步骤(6)所述透析后的蛋白液上
EMD DEAE，收集洗脱液；
(8)将步骤(7)所述洗脱液用95～105KD超滤膜超滤浓缩至1/4～1/5，加入透析液进行等体积超滤透析，然后用孔径0.4～0.5um的滤芯过滤，得到vWF/Ⅷ原液；
(9)用透析液对步骤(8)所述vWF/Ⅷ原液稀配至vWF:Act＝60～70IU/mL，加入保护剂，35nm过滤，真空冷冻干燥，得到vWF/Ⅷ冻干品；
(10)将步骤(9)所述冻干品出柜、轧盖，进行99～100℃、30min干热病毒灭活；检验合格即得。
优选的，步骤(2)所述溶解用溶解液包括2.92～2.96g/L的柠檬酸钠和2950～3050IU/L的肝素钠；步骤(3)所述氢氧化铝凝胶的铝含量为8～12mg/mL；步骤(3)所述上清液和氢氧化铝凝胶的质量比为8～12:1。
优选的，步骤(4)和步骤(6)所述平衡缓冲液独立地包括2.92～2.96g/L的枸橼酸钠，9.35～9.37g/L的氯化钠和1.9～2.1g/L的甘氨酸。
优选的，步骤(5)所述S/D溶液包括32～34g/L的磷酸三丁酯和105～115g/L的聚山梨酯80；步骤(5)所述过滤液和S/D溶液的质量比为8～12:1。
优选的，步骤(7)上
EMD DEAE后，包括洗涤和洗脱步骤，所述洗涤用洗涤液包括2.92～2.96g/L的枸橼酸钠，12.5～13.5g/L的氯化钠和1.9～2.1g/L的甘氨酸；所述洗脱用洗脱液包括2.92～2.96g/L枸橼酸钠，20.5～21.5g/L氯化钠和1.9～2.1g/L的甘氨酸。
优选的，步骤(8)和步骤(9)所述透析液独立地包括2.92～2.96g/L的枸橼酸钠，2.33～2.35g/L的氯化钠，29～31g/L的甘氨酸和2.9～3.1g/L的盐酸赖氨酸。
优选的，步骤(9)所述保护剂包括甘露醇和/或氯化钙；所述甘露醇加入后的质量百分比终浓度为1.1～1.3％；所述氯化钙加入后的终浓度为0.14～0.16g/L。
优选的，步骤(9)所述真空冷冻干燥的冻干工艺为：
①制品10～30℃常温进柜；
②隔板2分钟从常温降至-9℃，保持1小时；
③隔板2分钟降到-45℃以下，保持2小时；
④开启真空泵，使真空度达到0.2mbar；
⑤隔板2小时升温到-25℃，保持8小时；
⑥隔板3小时升温到0℃，保持10小时；
⑦隔板3小时升温到10℃，保持4小时
⑧隔板2小时升温到30℃，保持6h；
⑨抽极限真空，压塞，出柜。
本发明提供了上述制备方法制备得到的人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物。
本发明还提供了上述制备方法制备得到的人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物在制备药物中的应用。
有益效果：
1，本发明提供了一种人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物的制备方法及其产物和应用。本发明提供的制备方法对整个工艺过程进行了重新开发，在血浆原料日趋紧缺的今天，本发明利用冷沉淀制备vWF/Ⅷ复合物，用本发明所述溶解液溶解后，所得溶解蛋白液中的vWF和FⅧ得率较高，实验证明vWF可达50IU/g冷沉淀，FⅧ可达20IU/g冷沉淀。通过对冷沉淀的充分利用，能间接节约稀缺血浆资源，对提高市场竞争力有着重大意义。
2，本发明制得的vWF/Ⅷ≈1:1，能较好体现正常的人体血浆，有助于优化治疗所需的剂量；利用本发明制得的vWF/Ⅷ复合物，在临床上即使多次用药也不会引起FⅧ积聚，从而降低血栓栓塞的风险。大部分vWD患者，在vWF因子缺失的同时，FⅧ因子也存在缺失，所以在补充vWF因子的同时，需再补充FⅧ因子，故制备vWF/Ⅷ的复合物显得很有必要。
3，本发明采用35nm纳米膜过滤，一步去除病毒，能进一步提高产品的安全性。
4，本发明制备得到的产品质量高，原液中vWF比活可达到50IU/mg(欧洲药典要求＞1IU/mg)，最后成品中铝残留量、纤维蛋白原、纤维结合蛋白、纤溶酶原、IgG、IgA、IgM等杂质含量极微，能进一步保证临床使用的安全性。
5，本发明在前期研究中发现，溶解完蛋白液在调节pH过程中，若最后的pH过高、温度过高，去除人纤维蛋白原、纤维结合蛋白的能力有限，后续一步层析上样液杂质过多，易造成层析柱堵塞、坍塌；pH过低、温度过低，vWF及FⅧ稳定性降低，得率降低。本发明提供的方法，起始原料冷沉淀溶解完后，调节上清液pH至6.35～6.55，同时降温至12～18℃。该降温、酸沉操作不仅可以去除大量的纤维蛋白原，防止凝血因子激活，还可以去除冷不溶性蛋白(主要是纤维结合蛋白)。
6，本发明以冷沉淀为起始原料，经氢氧化铝凝胶搅拌吸附，只需再经过一步
EMD DEAE阴离子交换层析，即可得vWF/Ⅷ≈1:1，vWF:Ag/vWF:Act≈1:1，杂质含量极少的vWF/Ⅷ复合物制品。特别的是能够有效去除冷沉淀中富含的纤维蛋白原、纤维结合蛋白，以及IgA、IgM、IgG等杂质，使杂质大部分都从流穿液和洗涤液中流走废弃。相比其他厂家的多步层析或多步沉淀步骤，损失将减少，产品收率得到提高；明显缩短工艺时间，降低了生产成本。
7，本发明利用
EMD DEAE阴离子交换层析，经上样、洗涤、洗脱，整个过程不仅能最大限度地去除杂蛋白，而且控制整个层析过程中vWF和FⅧ因子不产生激活，vWF得率高达30％，Ⅷ得率高达40％，得率明显高于传统凝血因子类产品得率10～15％。另一方面，层析洗脱液经透析得到原液中vWF比活＞50IU/mg，明显高于《欧洲药典》的要求(＞20IU/mg)；
8，本发明获得洗脱液后，透析过程中，蛋白溶液与透析液中均添加蛋白保护剂；本发明使用含29～31g/L的甘氨酸和2.9～3.1g/L盐酸赖氨酸的透析液，该透析液处方经试验验证，可以减少超滤过程对蛋白质的剪切损伤，减少透析过程中FⅧ的损失或降解，增强vWF对FⅧ的稳定作用，为后续制品中vWF/Ⅷ≈1:1提供保障。
9，本发明获得vWF/Ⅷ原液后，稀配过程中，加入终浓度为1.2％的甘露醇+0.15g/L氯化钙作为保护剂，以保证后续冻干及干热过程中蛋白活性成分不受影响。
10，本发明采用自主研究的vWF/Ⅷ复合物冻干工艺，该冻干工艺预冻过程先将板层温度快速降至-9℃保持1小时，此时制品尚未结冰，保持了一定的过冷度；再快速降温至-45℃以下，有利于制品形成微晶体，效价无降低，有利于最终制品外观好，溶解速度也快。整个预冻过程不回温。本发明通过控制一次干燥温度和升温速度，保证产品质量的前提下，尽量缩短解析干燥时间，减少冻干时间，最终制品水分含量0.5～1.0％。
附图说明
图1为本发明一种人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物的制备流程图。
具体实施方式
本发明提供了一种人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)取冻存血浆，融浆后离心，收集冷沉淀；
(2)将步骤(1)所述冷沉淀溶解，调节pH值至6.35～6.55，12～18℃条件下离心，收集上清液；
(3)将步骤(2)所述上清液和氢氧化铝凝胶混合，搅拌吸附后离心，收集上清液；
(4)用平衡缓冲液调节步骤(3)所述上清液的蛋白浓度至5.0～15.0g/L，然后经0.6～0.7um+0.4～0.5um串联过滤，收集过滤液；
(5)将步骤(4)所述过滤液和S/D溶液混合，24～26℃条件下搅拌5～7h后过滤，所述过滤的过滤用具孔径为0.4～0.5μm，收集过滤液；
(6)将步骤(5)所述过滤液用平衡缓冲液、95～105KD的超滤膜透析，收集透析后的蛋白液；
(7)将步骤(6)所述透析后的蛋白液上
EMD DEAE，收集洗脱液；
(8)将步骤(7)所述洗脱液用95～105KD超滤膜超滤浓缩至1/4～1/5，加入透析液进行等体积超滤透析，然后用孔径0.4～0.5um的滤芯过滤，得到vWF/Ⅷ原液；
(9)用透析液对步骤(8)所述vWF/Ⅷ原液稀配至vWF:Act＝60～70IU/mL，加入保护剂，30～40nm过滤，真空冷冻干燥，得到vWF/Ⅷ冻干品。
本发明先取冻存血浆，融浆后离心。在本发明中，所述冻存血浆为检疫期检疫合格的人血浆。本发明对所述融浆操作不作特别限定，在本发明更具体的实施方式中，所述融浆优选包括如下步骤：先用75％乙醇擦拭血浆袋表面，然后用低于35℃注射用水冲洗；破袋后合并到融浆罐中，优选用30～35℃循环水夹层循环，血浆温度优选控制不高于4℃。待血浆融化后，本发明对融化后的血浆进行离心操作，所述离心的离心力优选不低于6000g。离心后的出液温度优选控制在0～4℃，收集冷沉淀。
得到冷沉淀后，本发明将冷沉淀溶解。在本发明中，所述溶解用溶解液优选包括2.92～2.96g/L的柠檬酸钠和2950～3050IU/L的肝素钠，更优选包括2.94g/L的柠檬酸钠和3000IU/L的肝素钠。在本发明中，所述溶解液的用量优选为5～7倍冷沉淀重量，更优选为6倍冷沉淀重量。在本发明中，所述溶解优选在循环水控温条件下进行，所述循环水温度优选为20～26℃。将冷沉淀溶解后，本发明调节溶解液的pH值。所述调节用试剂优选为0.5mol/L盐酸溶液；所述调节后的pH值为6.35～6.55，优选为6.45。本发明控制溶解液的温度为12～18℃，优选为14℃，然后进行离心操作，所述离心的离心力优选不低于6000g。离心后的出液温度优选控制在12～18℃，收集上清液。
得到上清液后，本发明将上清液和氢氧化铝凝胶混合。在本发明中，所述氢氧化铝凝胶的铝含量优选为8～12mg/mL，更优选为10mg/mL；所述上清液和氢氧化铝凝胶混合的质量比为8～12:1，优选为10:1。混合后搅拌吸附，所述搅拌吸附的时间优选为5～25min，更优选为20min。搅拌吸附后离心，所述离心的离心力优选不低于6000g。离心后收集吸附处理过的上清液。
得到吸附处理过的上清液后，本发明优选调节所述吸附处理过的上清液的pH值。所述调节用试剂优选为0.5mol/L的氢氧化钠溶液；所述调节后的pH值优选为6.5～7.5。本发明用平衡缓冲液调节吸附处理过的上清液的蛋白浓度。在本发明中，所述平衡缓冲液优选包括2.92～2.96g/L的枸橼酸钠，9.35～9.37g/L的氯化钠和1.9～2.1g/L的甘氨酸，更优选包括2.94g/L的橼酸钠，9.36g/L的氯化钠和2.0g/L的甘氨酸。调节后的蛋白浓度优选为5.0～15.0g/L，更优选为12g/L。调节后，本发明进行串联过滤，所述串联过滤包括第一滤芯和第二滤芯，所述第一滤芯的孔径为0.6～0.7um，优选为0.65um；所述第二滤芯的孔径为0.4～0.5um，优选为0.45um。在本发明中，所述滤芯的材质优选为PES。过滤后，收集过滤液。
得到过滤液后，本发明将所述过滤液和S/D溶液混合。在本发明中，所述S/D溶液优选包括32～34g/L的磷酸三丁酯和105～115g/L的聚山梨酯80，更优选包括33g/L的磷酸三丁酯和110g/L的聚山梨酯80。所述过滤液和S/D溶液混合的体积比为8～12:1，优选为10:1。混合后，本发明优选对混合液进行搅拌，使物料均匀。本发明将混合后的物料置于24～26℃条件下搅拌，所述搅拌的时间优选为5～7h，更优选为6h。搅拌完成后，本发明用孔径0.45μm的滤芯过滤；所述滤芯的材质优选为PES。过滤后，收集S/D溶液处理过的物料过滤液。
进一步的，本发明将所述S/D溶液处理过的物料过滤液用平衡缓冲液、95～105KD的超滤膜等体积透析。在本发明中，所述平衡缓冲液优选包括2.92～2.96g/L的枸橼酸钠，9.35～9.37g/L的氯化钠和1.9～2.1g/L的甘氨酸，更优选包括2.94g/L的枸橼酸钠，9.36g/L的氯化钠和2.0g/L的甘氨酸。本发明所述超滤膜优选为100KD超滤膜。在本发明中，所述等体积透析的次数为5～7次，优选为6次。本发明收集透析后的蛋白液。
得到蛋白液后，本发明用
EMD DEAE离子交换柱上样。在本发明中，所述上样前优选先用平衡缓冲液对所述
EMD DEAE离子交换柱进行平衡。在本发明中，所述平衡缓冲液优选包括2.92～2.96g/L的枸橼酸钠，9.35～9.37g/L的氯化钠和1.9～2.1g/L的甘氨酸，更优选包括2.94g/L的橼酸钠，9.36g/L的氯化钠和2.0g/L的甘氨酸。上样完毕后，本发明优选先用洗涤液洗涤柱子直至成基线(杂蛋白洗涤完全)，然后用洗脱液洗脱。在本发明中，所述洗涤用洗涤液优选包括2.92～2.96g/L的枸橼酸钠，12.5～13.5g/L的氯化钠和1.9～2.1g/L的甘氨酸，更优选包括包括2.94g/L的枸橼酸钠，12.3g/L的氯化钠和2.0g/L的甘氨酸；所述洗脱用洗脱液优选包括2.92～2.96g/L枸橼酸钠，20.5～21.5g/L氯化钠和1.9～2.1g/L的甘氨酸，更优选包括2.94g/L枸橼酸钠，21g/L氯化钠和2.0g/L的甘氨酸。本发明收集洗脱后的洗脱液。
收集得到洗脱后的洗脱液后，本发明用超滤膜对洗脱液进行超滤浓缩。在本发明中，所述超滤膜为95～105KD的超滤膜，优选为100KD的超滤膜。所述超滤浓缩的程度为浓缩前的1/4～1/5。浓缩后加入透析液进行等体积超滤透析。在本发明中，所述透析液优选包括2.92～2.96g/L的枸橼酸钠，2.33～2.35g/L的氯化钠，29～31g/L的甘氨酸和2.9～3.1g/L的盐酸赖氨酸，更优选包括2.94g/L的枸橼酸钠，2.34g/L的氯化钠，30g/L的甘氨酸和3.0g/L的盐酸赖氨酸。在本发明中，所述超滤透析的次数优选为5～7次，更优选为6次。超滤透析后，本发明用孔径0.4～0.5um的滤芯过滤。过滤后，得到vWF/Ⅷ原液。
本发明用透析液对上述vWF/Ⅷ原液稀配。在本发明中，所述透析液优选包括2.92～2.96g/L的枸橼酸钠，2.33～2.35g/L的氯化钠，29～31g/L的甘氨酸和2.9～3.1g/L的盐酸赖氨酸，更优选包括2.94g/L的枸橼酸钠，2.34g/L的氯化钠，30g/L的甘氨酸和3.0g/L的盐酸赖氨酸。稀配后的液料vWF:Act＝60～70IU/mL，优选为65IU/mL。稀配后的液料优选用稀盐酸或0.5mol/L氢氧化钠调整pH至6.5～7.5。稀配后加入保护剂。在本发明中，所述保护剂优选包括甘露醇和/或氯化钙；当所述保护剂包括甘露醇和/或氯化钙时，所述甘露醇加入后的质量百分比终浓度优选为1.1～1.3％，更优选为1.2％；所述氯化钙加入后的终浓度优选为0.14～0.16g/L，更优选为0.15g/L。加入保护剂后，本发明优选进行过滤操作；所述过滤用滤膜的孔径优选为30～40nm，更优选用35nm。本发明对过滤后的液料进行真空冷冻干燥，得到vWF/Ⅷ冻干品。在真空冷冻干燥前，本发明优选使用除菌滤芯对液料进行除菌过滤。在本发明中，所述真空冷冻干燥的冻干工艺优选为：
①制品10～30℃常温进柜；
②隔板2分钟从常温降至-9℃，保持1小时；
③隔板2分钟降到-45℃以下，保持2小时；
④开启真空泵，使真空度达到0.2mbar；
⑤隔板2小时升温到-25℃，保持8小时；
⑥隔板3小时升温到0℃，保持10小时；
⑦隔板3小时升温到10℃，保持4小时
⑧隔板2小时升温到30℃，保持6h；
⑨抽极限真空，压塞，出柜。
得到vWF/Ⅷ冻干品后，本发明优选对所述冻干品进行干热灭活，所述干热灭活的条件优选为99～100℃、30min；水浴灭活后，本发明优选对制品进行真空检测，真空检测合格后，本发明再对合格制品送检，合格后包装。
本发明提供了上述制备方法制备得到的人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物。所述人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物vWF/Ⅷ≈1:1，原液中vWF比活可达到50IU/mg(欧洲药典要求＞1IU/mg)，最后成品中铝残留量、纤维蛋白原、纤维结合蛋白、纤溶酶原、IgG、IgA、IgM等杂质含量极微，能进一步保证临床使用的安全性。
本发明还提供了上述人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物在制备以动物凝血因子为载体的多种生物因子复合骨修复材料中的应用。本发明对具体的应用方式不作特别限定，本领域常规操作均可。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
以6000升血浆为例，具体制备工艺如下：
(1)检疫期检疫合格的人血浆领取后，75％乙醇擦拭血浆袋表面，用低于35℃注射用水冲洗，破袋后合并到融浆罐中，用30～35℃循环水夹层循环，血浆温度控制不高于4℃；待融化后，离心(离心力不低于6000g)，出液温度控制在0～4℃，收集冷沉淀34.8kg；
(2)将步骤(1)的制得物冷沉淀加入209kg溶解液(溶解液配制方法：2.94g柠檬酸钠，3000IU肝素钠，补加注射用水至1L，温度控制在20～26℃)中，搅拌至冷沉淀完全溶解，循环水的温度控制在20～26℃；溶解完后用0.5mol/L盐酸溶液调节上清液pH至6.45，同时控温12～18℃；离心(离心力不低于6000g)，出液温度为12～18℃，收集上清液249.6kg；
(3)将步骤(2)的制得物上清液加入氢氧化铝凝胶(铝含量10mg/ml)25kg，搅拌吸附10min；离心(离心力不低于6000g)，收集上清液314.5kg，测得蛋白浓度为1.7g/100ml；
(4)将步骤(3)的制得物上清液用0.5mol/L氢氧化钠溶液调节上清液pH至6.95。用平衡缓冲液(平衡缓冲液的配制方法：2.94g枸橼酸钠+9.36g氯化钠+2.0g甘氨酸，加适量注射用水充分溶解，补加注射用水至1L，调节pH至7.0，温度控制在20～26℃)调节蛋白浓度至1.4g/100ml；用孔径为0.65um+0.45um的PES滤芯串联过滤，收集过滤液365.5kg；
(5)按步骤(4)的制得物过滤液体积的1/10加入S/D溶液(S/D溶液的配制方法：取磷酸三丁酯33g，置于清洁容器，在搅拌情况下缓慢加入110g聚山梨酯80，在搅拌状态下加入注射用水至1L，温度控制在20～26℃)，搅拌均匀，温度控制在24～26℃，连续保温6小时；用孔径为0.45μm的PES滤芯过滤，收集滤液392.8kg；
(6)将步骤(5)所得过滤液用100KD的超滤膜，平衡缓冲液(平衡缓冲液的配制方法：2.94g枸橼酸钠+9.36g氯化钠+2.0g甘氨酸，加适量注射用水充分溶解，补加注射用水至1L，调节pH至6.5～7.5，温度控制在20～26℃)。等体积透析6次，收集透析后蛋白液280.8kg；
(7)将步骤(6)的制得物用经平衡缓冲液(平衡缓冲液的配制方法：2.94g枸橼酸钠+9.36g氯化钠+2.0g甘氨酸，加适量注射用水充分溶解，补加注射用水至1L，调节pH至7.0，温度控制在20～26℃。)平衡的
EMD DEAE离子交换柱进行上样，上样完毕后用洗涤液(2.94g枸橼酸钠+14.04g氯化钠+2.0g甘氨酸，加适量注射用水充分溶解，补加注射用水至1L，调节pH为7.0，温度控制在20～26℃)洗涤柱子直至成基线，用洗脱液(洗脱液的配制方法：2.94g枸橼酸钠+21.06g氯化钠+2.0g甘氨酸，加适量注射用水充分溶解，补加注射用水至1L，调节pH为7.0，温度控制在20～26℃)洗脱，收集洗脱液60kg；
(8)将步骤(7)收集的洗脱液用100KD超滤膜超滤浓缩至12kg后，加入透析液(透析液配制方法：2.94g枸橼酸钠，2.34g氯化钠，30g甘氨酸，3g盐酸赖氨酸，加适量注射用水充分溶解，补加注射用水至1L，调节pH为7.0)进行等体积超滤透析6遍，用孔径为0.45um的PES滤芯过滤，得vWF/Ⅷ原液13kg，取样检测效价90.8IU/mL；
(9)依据vWF/Ⅷ原液效价，将步骤(8)所得原液加入透析液(透析液配制方法：2.94g枸橼酸钠，2.34g氯化钠，30g甘氨酸，3g盐酸赖氨酸，加适量注射用水充分溶解，补加注射用水至1L，调节pH为7.0)进行稀配至vWF:Act＝65IU/mL，用稀盐酸或0.5mol/L氢氧化钠调整pH至7.0，得稀配液18.15kg；加入217.8g甘露醇、2.72g氯化钙作为保护剂，得到蛋白液；
(10)将步骤(9)得到的蛋白液经35nm纳米膜过滤、除菌滤芯过滤，过滤后进行分装，即得vWF/Ⅷ半成品；
(11)将步骤(10)得到的vWF/Ⅷ半成品进行真空冷冻干燥，即得vWF/Ⅷ冻干品；
冻干工艺：
①制品常温(10～30℃)进柜；
②隔板2分钟从常温降至-9℃，保持1小时；
③隔板2分钟降到-45℃以下，保持2小时；
④开启真空泵，使真空度达到0.2mbar；
⑤隔板2小时升温到-25℃，保持8小时；
⑥隔板3小时升温到0℃，保持10小时；
⑦隔板3小时升温到10℃，保持4小时
⑧隔板2小时升温到32℃，保持6h；
⑨抽极限真空，压塞，出柜。
(12)、将步骤(11)得到的vWF/Ⅷ冻干品出柜、轧盖，将制品装入水浴灭菌柜进行99～100℃、30min干热病毒灭活；
(13)、将步骤(12)得到的人凝血因子制品进行真空检测，真空合格制品送检，检验合格后包装。
本发明的产品与《欧洲药典》中收录的vWF关键质量指标的对比见表1。
表1 vWF关键质量指标对比表
| 项目 | 本发明的产品 | 《欧洲药典》 |
| 复溶时间 | 应于6分钟内溶解完全 | 应于10分钟内溶解完全 |
| vWF:ACT效价 | 40-60IU/mL | ＞20IU/mL |
| vWF:Ag效价 | 40-60IU/mL | 未限制 |
| 原液vWF比活 | ＞50IU/mg | ＞1IU/mg |
| vWF多聚体 | 多聚体分布接近正常血浆 | 多聚体分布接近正常血浆 |
| 铝残留量 | ＜50ug/L | 未限制 |
| 纤维蛋白原 | ＜100mg/L | 未限制 |
| 纤维结合蛋白 | ＜30mg/mL | 未限制 |
| IgG | ＜30ug/mL | 未限制 |
| IgA | ＜10ug/mL | 未限制 |
| IgM | ＜100ug/mL | 未限制 |
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）取冻存血浆，融浆后离心，收集冷沉淀；
（2）将步骤（1）所述冷沉淀溶解，调节pH值至6.35~6.55，12~18℃条件下离心，收集上清液；
（3）将步骤（2）所述上清液和氢氧化铝凝胶混合，搅拌吸附后离心，收集上清液；其中所述氢氧化铝凝胶的铝含量为8~12mg/mL；所述上清液和氢氧化铝凝胶的质量比为8~12:1；
（4）用平衡缓冲液调节步骤（3）所述上清液的蛋白浓度至5.0~15.0g/L，然后经0.6~0.7μm+0.4~0.5μm串联过滤，收集过滤液；其中所述平衡缓冲液包括2.92~2.96g/L的枸橼酸钠，9.35~9.37g/L的氯化钠和1.9~2.1g/L的甘氨酸；
（5）将步骤（4）所述过滤液和S/D溶液混合，24～26℃条件下搅拌5~7h后过滤，所述过滤的过滤用具孔径为0.4~0.5μm，收集过滤液；
（6）将步骤（5）所述过滤液用平衡缓冲液、95~105KD的超滤膜透析，收集透析后的蛋白液；其中所述平衡缓冲液包括2.92~2.96g/L的枸橼酸钠，9.35~9.37g/L的氯化钠和1.9~2.1g/L的甘氨酸；
（7）将步骤（6）所述透析后的蛋白液上Fractogel® EMD DEAE，收集洗脱液；其中所述上Fractogel® EMD DEAE后，包括洗涤和洗脱步骤，所述洗涤用洗涤液包括2.92~2.96g/L的枸橼酸钠，12.5~13.5g/L的氯化钠和1.9~2.1g/L的甘氨酸；所述洗脱用洗脱液包括2.92~2.96g/L枸橼酸钠，20.5~21.5g/L氯化钠和1.9~2.1g/L的甘氨酸；
（8）将步骤（7）所述洗脱液用95~105KD超滤膜超滤浓缩至1/4~1/5，加入透析液进行等体积超滤透析，然后用孔径0.4~0.5um的滤芯过滤，得到vWF/Ⅷ原液；其中所述透析液包括2.92~2.96g/L的枸橼酸钠，2.33~2.35g/L的氯化钠，29~31g/L的甘氨酸和2.9~3.1g/L的盐酸赖氨酸；
（9）用透析液对步骤（8）所述vWF/Ⅷ原液稀配至vWF:Act =60~70 IU/mL，加入保护剂，35nm过滤，真空冷冻干燥，得到vWF/Ⅷ冻干品；其中所述透析液包括2.92~2.96g/L的枸橼酸钠，2.33~2.35g/L的氯化钠，29~31g/L的甘氨酸和2.9~3.1g/L的盐酸赖氨酸；其中所述保护剂包括甘露醇和/或氯化钙；所述甘露醇加入后的质量百分比终浓度为1.1~1.3%；所述氯化钙加入后的终浓度为0.14~0.16g/L；
（10）将步骤（9）所述vWF/Ⅷ冻干品出柜、轧盖，进行99~100℃、30min干热病毒灭活；送检，检验合格后包装；
步骤（9）所述真空冷冻干燥的冻干工艺为：
①制品10~30℃常温进柜；
②隔板2分钟从常温降至-9℃，保持1小时；
③隔板2分钟降到-45℃以下，保持2小时；
④开启真空泵，使真空度达到0.2mbar；
⑤隔板2小时升温到-25℃，保持8小时；
⑥隔板3小时升温到0℃，保持10小时；
⑦隔板3小时升温到10℃，保持4小时
⑧隔板2小时升温到30℃，保持6h；
⑨抽极限真空，压塞，出柜。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述溶解用溶解液包括2.92~2.96g/L的柠檬酸钠和2950~3050 IU/L的肝素钠。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）所述S/D溶液包括32~34g/L的磷酸三丁酯和105~115g/L的聚山梨酯80；步骤（5）所述过滤液和S/D溶液的质量比为8~12:1。
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