JP2002348300A

JP2002348300A - 血液凝固第ｖｉｉｉ因子および血液凝固第ｖｉｉｉ因子／フォン・ビルブラント因子複合体の精製方法

Info

Publication number: JP2002348300A
Application number: JP10458799A
Authority: JP
Inventors: Kazuya Hosokawa; 和也細川; Toyoaki Suzuki; 豊明鈴木; Masanori Nagata; 政令永田
Original assignee: Fujimori Kogyo Co Ltd
Current assignee: Fujimori Kogyo Co Ltd
Priority date: 1999-04-12
Filing date: 1999-04-12
Publication date: 2002-12-04
Also published as: WO2000061633A1; AU3676700A

Abstract

(57)【要約】【課題】大容量のFVIII/vWF複合体を含む溶液からで
も簡単な工程でFVIII/vWF複合体及びFVIIIを高純度まで
精製する方法を提供する。【解決手段】血液凝固第VIII因子／フォン・ビルブラ
ント因子複合体を含む溶液及びゲル状物質を混合した
後、該溶液からゲル状物質を分離・除去することからな
る血液凝固第VIII因子／フォン・ビルブラント因子複合
体の精製方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規な血液凝固第
VIII因子および血液凝固第VIII因子／フォン・ビルブラ
ント因子複合体の精製方法に関するものである。詳しく
は、本発明は、血液凝固第VIII因子および血液凝固第VI
II因子／フォン・ビルブラント因子複合体をその活性の
低下を生じることなく高純度・高収率で精製する方法に
関するものである。

【０００２】

【従来の技術】血液凝固因子は、血液凝固に関与する因
子のことであり、１２種の血漿中のタンパク質性の凝固
因子、ならびにカルシウムイオン、組織トロンボプラス
チンおよびリン脂質の３種の計１５種の因子が血液凝固
反応に関与していることが知られている。

【０００３】これらの血液凝固因子のうち、血液凝固第
VIII因子（本明細書では、単に「FVIII」ともいう）
は、血液凝固反応の促進因子として機能し、正常な止血
機構を維持するための重要な血液凝固内因系の凝固因子
である。また、血友病ＡではこのFVIII凝固活性タンパ
ク質の欠乏または異常が認められることから、FVIIIは
抗血友病因子Ａ、抗血友病因子または抗血友病グロブリ
ンとも呼ばれている。

【０００４】血友病Ａは、性染色体劣性遺伝であり、因
子活性低下の程度により、軽症、中等症、重症に分類さ
れ、軽症では、自然出血はまれであり、外傷や手術、抜
歯時の止血困難によって初めて気づく程度であるが、中
等症ないし重症例では、自然出血が主症状となり、内因
性凝固障害のため出血が深部組織に起こり、特に関節腔
内への出血はこの疾患に特徴的で、反復出血により関節
症をきたし、さらに関節は拘縮変形して機能障害を呈す
るようになるほか、筋肉内出血、頭蓋内出血、腎出血等
が認められる。こうした血友病Ａの患者治療としては、
遺伝子治療あるいは移植治療も考えられるが、これらの
治療法は現時点では臨床的研究が進められている段階で
あり、血友病患者に対して実用化はされていない。この
ため、現状では、血友病Ａの患者に出血時に欠損因子で
あるFVIIIを補充してその都度止血を図るか、もしくは
出血が予想されるときに予防的に補充する治療が必要と
されている。

【０００５】上述したように、血友病患者の治療には抗
血友病製剤であるFVIII製剤または第IX因子製剤（プロ
トロンビン複合体）が使用されているが、抗血友病製剤
を輸注していると患者に欠乏因子に対する抗体が発生す
ることがあったり、主にＣ型のウィルス性肝炎やＡＩＤ
Ｓ（後天性免疫不全症候群）の罹患原因としてとりあげ
られたりした。このため、現在では、６０℃で１０時間
液状加熱した乾燥濃縮人血液凝固第VIII因子製剤や、６
５℃で９５時間乾燥加熱処理した乾燥濃縮人血液凝固第
VIII因子製剤等の安全性の極めて高い加熱製剤が使用さ
れているほかに、献血者血漿を原料に、加熱処理や有機
溶媒／界面活性剤処理（ＴＮＢＰ／オクトキシノール９
処理）にてウイルス不活化し、抗FVIIIモノクローナル
抗体を使用して精製分離した乾燥濃縮人血液凝固第VIII
因子製剤や、例えば、特開平７−２７８，１９７号公報
（特許番号２５１３９９３号）等に開示されているよう
に、遺伝子組み換え技術により産生された産物を第VII
I：Ｃ因子活性のＣ−末端サブユニットに対するモノク
ローナル抗体を使ったアフィニティークロマトグラフィ
ー等により精製されたリコンビナント製剤が開発され
た。

【０００６】しかしながら、加熱処理や有機溶媒／界面
活性剤処理にてウイルス不活化が図られ安全性が高めら
れた製剤も、非Ａ非Ｂ型肝炎等のウイルス感染症の危険
性を完全には否定できず、また加熱製剤ではフィブリノ
ーゲンが含まれているので、投与により血中のフィブリ
ノーゲン濃度が過度に上昇するおそれがある。一方、上
記モノクローナル抗体を使用して精製分離する場合に
は、（１）モノクローナル抗体には異種動物由来のタン
パク質がしばしば使われているため、製剤中に異種動物
由来のタンパク質が混入する危険性があり、（２）コス
ト面でもモノクローナル抗体自体が極めて高価であるた
め、最終的に得られる製剤も高価なものにならざるを得
ないとする問題がある。

【０００７】したがって、こうした問題を伴うことな
く、FVIIIを精製することのできる技術が強く求められ
ているが、FVIII凝固活性タンパク質は血漿含有量が約
０．２μｇ／ｍｌと他の凝固因子に比べて非常に少ない
ためｍｇ相当の純化タンパク質を得るためには２０〜４
０リットルという多量の血漿が必要となり、かつFVIII
は純化過程中に変性し、フラグメント化しやすいので、
現状では、全構造を保持したままの純化は非常に困難で
あるという問題があった。

【０００８】ところで、このFVIIIは、流血中ではフォ
ン・ビルブラント(von Willebrand)因子（本明細書で
は、単に「vWF」ともいう）と非共有結合して複合体
（本明細書では、「血液凝固第VIII因子／フォン・ビル
ブラント因子複合体」または単に「FVIII/vWF複合体」
ともいう）を形成している。

【０００９】FVIII/vWF複合体の構成成分であるフォン
・ビルブラント(von Willebrand)因子タンパク質は、FV
IIIのキャリアタンパク質として働くとともに、出血時
に露出した損傷血管内皮細胞下組織に血小板が粘着し、
凝集する一次止血において血小板と内皮細胞下組織を結
合せしめる接着因子（分子糊）として機能し、FVIIIと
非共有結合による複合体を形成して、FVIIIの安定化作
用を示す巨大分子糖タンパク質として循環血液中に存在
する。また、このvWFの欠乏または異常は、出血時間延
長、血漿VIII因子の減少、血小板粘着能低下とリストセ
チン凝集能の低下、血管抵抗の低下、輸血・輸血漿・VI
II因子濃縮製剤輸注によるVIII因子活性の期待値以上の
上昇を特徴とするフォン・ビルブラント病の原因である
ことが知られている。

【００１０】また、FVIII/vWF複合体の９５％以上はvWF
タンパク質が占めるため、FVIII/vWF複合体を純化・精
製した後、これからFVIII凝固活性タンパク質を採取す
る方法が試みられた。この方法としては、例えば、
（１）まず３％エタノール、１％ポリエチレングリコー
ル(PEG)の存在下でクリオを採取し、上澄液を除去する
ことにより得られたクリオプレシピテート（クリオ沈
渣）について加熱処理法、グリシン−食塩沈殿法、３〜
４％Ficoll 70沈殿分画法などによる脱フィブリノーゲ
ン処理を行い、FVIII/vWF複合体を粗精製し、この粗精
製FVIII/vWF複合体をゲル瀘過クロマトグラフィー（例
えば、DFP等のプロテアーゼインヒビター存在下でのSep
harose 4BまたはCL−6B、Ultrogel AcA22）やアフィニ
ティークロマトグラフィー（例えば、抗フィブリノーゲ
ン、抗寒冷不溶性グロブリン(CIG)、抗IgM家兎血清IgM
画分を固定化したCNBr-Sepharose 4Bカラムによるな
ど）によりさらにFVIII/vWF複合体を精製した後、この
精製FVIII/vWF複合体に塩化カルシウムを混和してFVIII
とvWFとを解離させた後ゲル瀘過により低分子量部に出
現するFVIIIを採取する方法；（２）新鮮血漿からプロ
テアーゼインヒビターの存在下でクリオプレシピテート
を作製し、これをCNBr-Sepharose 4B-抗vWFモノクロー
ナル抗体大カラムに吸着させ、洗浄した後、塩化カルシ
ウム加緩衝液でFVIIIを溶出する方法；および（３）血
漿からクリオプレシピテートを作製し、ポリエレクトロ
ライトE5大カラムに添加してFVIII/vWF複合体を吸着、
溶出させてFVIII/vWF複合体を部分純化し、さらにこの
部分純化されたFVIII/vWF複合体をCNBr-Sepharose4B-抗
vWFモノクローナル抗体カラムに吸着させ、洗浄した
後、塩化カルシウム加緩衝液でFVIIIを溶出する方法な
どが挙げられる。しかしながら、上記（１）の方法は、
一応精製は可能ではあるが、FVIII/vWF複合体の精製段
階で目的とするFVIIIの活性の低下が認められ、工業的
な観点から不適切である。また、上記（２）や（３）の
方法は、上記したようにFVIII凝固活性タンパク質は血
漿含有量が約０．２μｇ／ｍｌと他の凝固因子に比べて
非常に少ないためｍｇ相当の純化タンパク質を得るため
には２０〜４０リットルという多量の血漿が必要とな
り、それ相応の大容量のカラムを必要とし設備面で好ま
しくない上、工程が複雑で手間や時間がかかるという欠
点があった。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明
は、大容量のFVIII/vWF複合体を含む溶液からでも簡単
な工程でFVIII/vWF複合体及びFVIIIを高純度まで精製す
る方法を提供することを目的とするものである。

【００１２】本発明の他の目的は、大容量のFVIII/vWF
複合体を含む溶液からでも簡単な工程でかつFVIIIの活
性の低下を伴わずにFVIII/vWF複合体及びFVIIIを高純度
まで精製する方法を提供することを目的とするものであ
る。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記諸目的
を達成するために鋭意検討を行った結果、血液凝固第VI
II因子／フォン・ビルブラント因子複合体を含む溶液を
特定の大きさの孔を有するゲル状物質と混合すると、フ
ィブリノーゲンやフィブロネクチン等の低分子量のきょ
う雑タンパク質や水などの小分子はゲル状物質の網目構
造内に取り込まれて保持されるが、血液凝固第VIII因子
／フォン・ビルブラント因子複合体は分子量が大きくゲ
ル状物質の網目構造に入れずにゲル状物質の外に存在す
ることに着目し、FVIII/vWF複合体を含む溶液をこのよ
うなゲル状物と混合した後瀘過等によりゲル状物を分離
することによりFVIII/vWF複合体を含む溶液を数倍から
数十倍程度濃縮できかつフィブリノーゲンやフィブロネ
クチン等の低分子量のきょう雑タンパク質や水などの小
分子を同時に分離・除去することが可能であることを発
見した。

【００１４】また、本発明者は、血液凝固第VIII因子／
フォン・ビルブラント因子複合体の分子量は数百万から
２，０００万程度と非常に大きな複合体として存在して
いるのに対して血液凝固第VIII因子の分子量は約２５〜
３０万程度と上記複合体に比べて比較的小さいことに着
目し、このような分子量の差を利用してFVIII/vWF複合
体を含む溶液を特定範囲の分子量を有する分子を切り捨
てる孔を含む膜で限外瀘過することによって、FVIII/vW
F複合体を効率よく精製できる、さらにはこの複合体か
ら血液凝固第VIII因子を高純度でかつ高収率で分離でき
ることをも発見した。

【００１５】上記知見に加えて、上記２工程を組み合わ
せることによって、すなわち、FVIII/vWF複合体を含む
溶液を特定の大きさの孔を有するゲル状物質と混合して
血液FVIII/vWF複合体を濃縮及び部分精製し、これを特
定範囲の分子量を有する分子を切り捨てる孔を含む膜で
限外瀘過することによって、ほとんど不純物を含まない
精製度の高いFVIII/vWF複合体が得られ、さらにこの複
合体から血液凝固第VIII因子を解離することによりほと
んど不純物を含まないFVIIIが効率よく得られることを
も発見した。

【００１６】これらの知見に基づいて、本発明を完成す
るに至った。

【００１７】すなわち、上記諸目的は、下記（ア）〜
（キ）によって達成される。

【００１８】（ア）血液凝固第VIII因子／フォン・ビル
ブラント因子複合体を含む溶液及びゲル状物質を混合し
た後、前記溶液からゲル状物質を分離・除去することか
らなる血液凝固第VIII因子／フォン・ビルブラント因子
複合体の精製方法。

【００１９】（イ）血液凝固第VIII因子／フォン・ビル
ブラント因子複合体を含む溶液を限外瀘過することから
なる血液凝固第VIII因子／フォン・ビルブラント因子複
合体の精製方法。

【００２０】（ウ）血液凝固第VIII因子／フォン・ビル
ブラント因子複合体を含む溶液及びゲル状物質を混合
し、前記溶液からゲル状物質を分離して血液凝固第VIII
因子／フォン・ビルブラント因子複合体の精製液を得た
後、前記精製液をさらに限外瀘過により精製することか
らなる血液凝固第VIII因子／フォン・ビルブラント因子
複合体の精製方法。

【００２１】（エ）前記（ア）から（ウ）のいずれかで
精製された血液凝固第VIII因子／フォン・ビルブラント
因子複合体を血液凝固第VIII因子及びフォン・ビルブラ
ント因子に解離させる工程を含む血液凝固第VIII因子の
精製方法。

【００２２】（オ）前記解離工程後にさらに血液凝固第
VIII因子及びフォン・ビルブラント因子の混合液を限外
瀘過により精製する工程を含む、前記（エ）に記載の血
液凝固第VIII因子の精製方法。

【００２３】（カ）前記ゲル状物質は排除限界が３０万
〜２０００万の孔を有する、前記（ア）または前記
（ウ）〜（オ）に記載の方法。

【００２４】（キ）前記限外瀘過は分画分子量が３０万
〜１８００万の限外瀘過膜を用いて行われる、前記
（イ）〜（カ）のいずれかに記載の方法。

【００２５】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。

【００２６】本発明の第一の概念によると、血液凝固第
VIII因子／フォン・ビルブラント因子複合体を含む溶液
及びゲル状物質を混合した後、前記溶液からゲル状物質
を分離・除去することからなる血液凝固第VIII因子／フ
ォン・ビルブラント因子複合体の精製方法が提供され
る。

【００２７】本発明において使用されるFVIII/vWF複合
体を含む溶液（本明細書では、単に「出発溶液」ともい
う）は、FVIII/vWF複合体を含むものであれば特に制限
されるものではないが、例えば、ヒト、好ましくは正常
ヒト由来の血漿［好ましくは新鮮（凍結）血漿］、血小
板及び胎盤等の体液；クリオプレシピテート（クリオ沈
渣）；フラクションＩ(Fraction I)（８％エタノール沈
殿）；ならびにこれらの遺伝子組換え操作により少なく
とも一のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミ
ノ酸配列を有しかつVIII因子凝固活性を維持するこれら
の変異体などが挙げられる。この際、本発明において、
クリオプレシピテート（クリオ沈渣）は、従来公知の方
法によって血漿から調製されたものであっても、あるい
は市販品、例えば、クリオ製剤、VIII因子濃縮製剤をそ
のまま使用してもよい。また、遺伝子組み換え技術を用
いて変異体を調製する方法としては、特に制限されるも
のではなく、当該分野において既知の遺伝子組み換え技
術を同様にして使用できる。

【００２８】本発明において使用されるゲル状物質は、
網目構造を有するものであれば特に限定されることなく
使用され、公知技術により製造してもあるいは市販のゲ
ル状物質をそのまま使用してもよいが、例えば、Sephac
ryl-300（ファルマシア社製）、Sepharose 6Bゲル（フ
ァルマシア社製）、Sephadex G200（ファルマシア社
製）等のゲル、ヒドロキシアパタイトなどが挙げられ
る。これらのうち、ゲルが好ましく使用される。ゲル状
物質の形状は特に限定されず、いずれの形状を使用して
もよいが、充填密度や出発溶液との接触効率などを考慮
すると、球状、微粒子状ゲルが好ましく使用される。ま
た、ゲル状物質の大きさも特に限定されずゲル状物質の
形状や孔の大きさ等によって異なるが、例えば、ゲル状
物質が球状である際には、直径が、約０．１〜１０００
μｍ、好ましくは約５０〜５００μｍである。

【００２９】また、本発明において、ゲル状物質の網目
構造は、フィブリノーゲンやフィブロネクチン等の低分
子量のきょう雑タンパク質や水などの小分子不純物はそ
の中に取り込んで保持するが、高分子量のFVIII/vWF複
合体は中に取り込めないような大きさの孔を形成するも
のである。具体的には、ゲル状物質は、通常、３０万〜
２０００万、好ましくは３０万〜１０００万、より好ま
しくは３０万〜５００万の排除限界の孔を有する。この
際、ゲル状物質の排除限界が２０００万を超えると、目
的精製物であるFVIII/vWF複合体をもゲル状物質の網目
構造中に取り込んでしまい精製が効率よく行えないため
好ましくない。これに対して、ゲル状物質の排除限界が
３０万未満であると、ゲル状物質の網目構造中にフィブ
リノーゲンやフィブロネクチン等の低分子量のきょう雑
タンパク質が効率良く取り込まれず、即ち、FVIII/vWF
複合体が良好に精製されずにやはり好ましくない。

【００３０】本発明において、ゲル状物質の使用量は、
精製されるべき出発溶液の種類や使用量及びゲル状物質
の種類や形状などによって異なり、FVIII/vWF複合体を
含む溶液を濃縮でき、フィブリノーゲンやフィブロネク
チン等の低分子量のきょう雑タンパク質や水などの小分
子を除去できる量であれば特に制限されないが、ゲル状
物質の網目構造内に可能な限り多く不純物を取り込んで
保持することが好ましい。このような点を考慮すると、
ゲル状物質の使用量は、出発溶液に対して、通常、５０
〜１００（ｖ／ｖ）％、好ましくは８０〜１００（ｖ／
ｖ）％、よ好ましくは９０〜１００（ｖ／ｖ）％であ
る。

【００３１】本発明において、出発溶液からゲル状物質
の分離方法は、従来公知の方法と同様の方法が使用さ
れ、例えば、遠心分離（通常、４〜２０℃で、５００〜
５０００×ｇ、３０分、好ましくは４〜８℃で、１００
０〜３０００×ｇ、３０分）、吸引瀘過、加圧瀘過など
が挙げられる。これらのうち、加圧瀘過及び遠心分離が
好ましく使用される。

【００３２】このような簡単な方法によって、FVIII/vW
F複合体は、一回の操作で、通常、容積比で、３倍から
１０倍程度濃縮でき、さらにフィブリノーゲンやフィブ
ロネクチン等の低分子量のきょう雑タンパク質や水など
の小分子が、通常、全体の３０〜９０％、好ましくは全
体の７０〜９０％除去される。本明細書において、不純
物の除去率は、比活性及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測
定された値を基準に算出した値である。

【００３３】また、本発明において、濃縮・不純物除去
操作を、一回行ってもあるいは、繰り返して、例えば、
２〜１０回行ってもよい。上記操作を繰り返し行うこと
によって、FVIII/vWF複合体はさらに少量に濃縮され、
フィブリノーゲンやフィブロネクチン等のきょう雑タン
パク質や水などの小分子がさらに除去される。なお、上
記濃縮・不純物除去操作を繰り返し行う際には、各操作
において使用されるゲル状物質は同一であってもあるい
は異なるものであってもよい。

【００３４】本発明の第二の概念によると、血液凝固第
VIII因子／フォン・ビルブラント因子複合体を含む溶液
を限外瀘過することからなる血液凝固第VIII因子／フォ
ン・ビルブラント因子複合体の精製方法が提供される。
なお、本発明の第二の概念による限外瀘過工程を、以
下、「第一の限外瀘過工程」ともいう。

【００３５】本発明において使用されるFVIII/vWF複合
体を含む溶液は上記第一の概念における定義と同様であ
る。

【００３６】本発明において、限外瀘過は、FVIII/vWF
複合体と出発溶液中に含まれる他の不純物、例えば、フ
ィブリノーゲンやフィブロネクチンとを効率的に分離で
きる限外瀘過膜を用いて行われる。この際、FVIII/vWF
複合体の分子量が数百万から２，０００万程度であるの
に対して、フィブリノーゲンやフィブロネクチンの分子
量が約３３万及び４０万程度であることを考慮すると、
限外瀘過に使用される限外瀘過膜としては、通常、３０
万〜１８００万の分画分子量、好ましくは３０万〜５０
０万の分画分子量、より好ましくは３０万〜１００万の
分画分子量を有するような膜が使用される。この際、限
外瀘過膜の分画分子量が１８００万を超えると、FVIII/
vWF複合体が部分的にフィブリノーゲンやフィブロネク
チン等の不純物と一緒に限外瀘過膜を通過してしまい、
目的とするFVIII/vWF複合体の収率が低下してしまうた
め、好ましくない。これに対して、限外瀘過膜の分画分
子量が３０万未満であると、フィブリノーゲンやフィブ
ロネクチン等の不純物が限外瀘過膜を通過できず、FVII
I/vWF複合体から良好に分離できず、やはり好ましくな
い。このような限外瀘過膜としては市販の限外瀘過膜が
そのまま使用され、市販の限外瀘過膜としては、例え
ば、BIOMAX 1000KDa（ミリポア社製）、０．１ミクロン
メンブレンフィルター（ミリポア社製）などが挙げら
れる。なお、本明細書において、分画分子量が３０万〜
１８００万の限外瀘過膜は、ポアサイズが約０．０２〜
２ミクロンの限外瀘過膜に相当するものとする。

【００３７】このような簡単な限外瀘過操作によって、
フィブリノーゲンやフィブロネクチン等の低分子量のき
ょう雑タンパク質が、通常、全体の９０％以上、好まし
くは全体の９９％以上の割合で除去される。また、限外
瀘過操作は、フィブリノーゲンやフィブロネクチン等の
低分子量のきょう雑タンパク質に加えて、混入するウィ
ルスをも合わせて除去するため好ましい。

【００３８】また、本発明において、上記限外瀘過操作
は、一回行ってもあるいは、繰り返して、例えば、２回
以上１０回程度行ってもよい。上記限外瀘過操作を繰り
返し行うことによって、フィブリノーゲンやフィブロネ
クチン等のきょう雑タンパク質がさらに除去されて、目
的物であるFVIII/vWF複合体がさらに高純度で精製され
る。なお、上記精製操作を繰り返し行う際には、各操作
において使用される限外瀘過膜は同一であってもあるい
は異なるものであってもよい。

【００３９】なお、上記では、第一の概念による精製工
程と第二の概念による精製工程とをそれぞれ独立して説
明したが、これらの精製工程を組み合わせて使用するこ
とによって、さらに純度の高いFVIII/vWF複合体が得ら
れる。第一の概念による精製工程と第二の概念による精
製工程を組み合わせて使用する際のこれらの順序は、特
に限定されず、いかなる順序で行われてもよいが、第一
の概念による精製工程では出発溶液を少容量にまで濃縮
でき次の精製工程により少ない量の試料を用いればよい
点及びクリオプレシピテートを直接第二の概念による精
製工程に使用すると多量のフィブリノーゲンやフィブロ
ネクチン等の低分子量のきょう雑タンパク質により限外
瀘過膜の孔が詰まってしまう点などを考慮すると、初め
に第一の概念による精製工程を行った後、次に第二の概
念による精製工程を行うことにより、FVIII/vWF複合体
を精製することが好ましい。

【００４０】また、第一の概念による精製工程と第二の
概念による精製工程との間に、他の精製工程、例えば、
Sepharose 6Bカラム（ファルマシア社製）、Sephacryl-
300（ファルマシア社製）等によるゲル瀘過などの精製
工程をさらに行ってもよい。

【００４１】本発明の第三の概念によると、上記したよ
うな第一の概念による精製工程、第二の概念による精製
工程または第一の概念による精製工程及び第二の概念に
よる精製工程との組み合わせ、好ましくは第一の概念に
よる精製工程及び第二の概念による精製工程との組み合
わせにより精製されたFVIII/vWF複合体をさらに血液凝
固第VIII因子とフォン・ビルブラント因子とに解離する
ことからなる血液凝固第VIII因子の精製方法が提供され
る。

【００４２】上記概念において、FVIII/vWF複合体のFVI
II及びvWFへの解離方法は、従来公知の方法が同様にし
て適用できる。具体的には、０．２５〜１Ｍ、好ましく
は０．２５〜０．５Ｍの塩化カルシウム（ＣａＣｌ₂）
の存在下でFVIII/vWF複合体をFVIII及びvWFに解離する
方法などが挙げられる。

【００４３】また、上記概念による血液凝固第VIII因子
の精製方法において、解離された血液凝固第VIII因子及
びフォン・ビルブラント因子の混合液を限外瀘過により
精製する工程（以下、「第二の限外瀘過工程」ともい
う）をさらに含むことが好ましい。この際、FVIIIの分
子量が２５万〜３０万とフィブリノーゲン（分子量約３
４万）及びフィブロネクチン（分子量約２４万）の分子
量と近似しているので、解離工程は、第一の概念による
精製工程及び第二の概念による精製工程との組み合わせ
ることによりフィブリノーゲンやフィブロネクチン等の
きょう雑タンパク質を可能な限り除去した後に、行われ
ることが好ましい。したがって、FVIII/vWF複合体をこ
のようにして解離すると、実質的にFVIII（分子量２５
〜３０万）及びvWF（分子量約２０００万）のみから構
成される混合溶液が得られるので、この混合溶液に第二
の限外瀘過工程を施すことによって、FVIII（分子量２
５〜３０万）のみが実質的に純粋な状態で限外瀘過膜を
通過する。すなわち、FVIII/vWF複合体は、第一の概念
による精製工程および／または第二の概念による精製工
程を経ることにより、高純度にまで精製されるので、こ
の純化FVIII/vWF複合体を含む溶液を解離し、さらに第
二の限外瀘過工程により精製された血液凝固第VIII因子
（FVIII）もまた、高純度でかつ高収率で得られる。な
お、第二の限外瀘過工程に使用される限外瀘過膜は第一
の限外瀘過工程で記載したのと同様のものが使用でき、
また、第一の限外瀘過工程及び第二の限外瀘過工程を行
う際に使用される限外瀘過膜は、同一であってもあるい
は異なるものであってもよい。

【００４４】

【実施例】以下、本発明の実施例により具体的に説明す
る。なお、FVIII/vWF複合体及びFVIIIの精製度は、上記
発明の実施の形態で述べたのと同様にして算出した。

【００４５】実施例１凍結クエン酸血漿１０リットルを４℃で溶解して、クリ
オプレシピテートを得た。次に、このクリオプレシピテ
ートを４℃で遠心分離（３，０００×ｇ、３０分）する
ことによって血漿と分離し、１リットルのクエン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）に溶解して、クリオ溶解液を得た。こ
のクリオ溶解液に、９０％（ｖ／ｖ）となるように乾燥
Sephacryl-300（ファルマシア社製）を加え、２０℃で
３０分間、撹拌した後、加圧瀘過により上清を分離し
た。得られた上清約２００ｍｌについて、上記同様の操
作を再度繰り返して、約４０ｍｌのクリオ濃縮液（FVII
I/vWF複合体を含む濃縮液）を得た。これにより、一回
の操作でおおよそ５倍の濃縮が可能であった。

【００４６】さらに、このクリオ濃縮液をShepharose 6
B（ファルマシア社製）カラム（５００ｍｌ）でゲル瀘
過を行い、ボイド容積付近に溶出するFVIII/vWF複合体
を回収した。

【００４７】続いて、このようにして得られたFVIII活
性を有するピーク回収液を０．１ミクロンメンブレン
フィルター（ミリポア社製）で限外瀘過することによっ
て、回収液中に含まれる微量のフィブリノーゲンやフィ
ブロネクチン等の不純物を除去した。

【００４８】上記限外瀘過操作を繰り返して約１０万倍
にまで濃縮した後、この濃縮液に０．３Ｍ塩化カルシ
ウムを添加することにより、FVIII/vWF複合体を解離し
た後、さらに上記と同様にして０．１ミクロンメンブ
レンフィルター（ミリポア社製）を用いて限外瀘過する
ことによって、FVIIIのみを選択的に膜に通過させ、純
化FVIIIを得た。この際の純化FVIIIの比活性は２，００
０ｕ／ｍｇであり、回収率は約４０％であった。

【００４９】実施例２実施例１と同様にして調製したクリオ溶解液に、９０％
（ｖ／ｖ）となるように乾燥Shepharose 6B（ファルマ
シア社製）を添加し、２０℃で３０分間、撹拌した後、
加圧瀘過により上清を分離した。得られた上清約２００
ｍｌについて、上記同様の操作を再度繰り返して、約４
０ｍｌのクリオ濃縮液（FVIII/vWF複合体を含む濃縮
液）を得た。これにより、一回の操作でおおよそ５倍の
濃縮が可能であった。

【００５０】さらに、このクリオ濃縮液をSephacryl-40
0（ファルマシア社製）カラム（５００ｍｌ）でゲル瀘
過を行い、ボイド容積付近に溶出するFVIII/vWF複合体
を回収した。

【００５１】続いて、このようにして得られたFVIII活
性を有するピーク回収液を０．１ミクロンメンブレン
フィルター（ミリポア社製）で限外瀘過することによっ
て、回収液中に含まれる微量のフィブリノーゲンやフィ
ブロネクチン等の不純物を除去した。

【００５２】上記操作を繰り返して約１０万倍にまで濃
縮した後、この濃縮液に０．３Ｍ塩化カルシウムを添加
することにより、FVIII/vWF複合体を解離した後、さら
に上記と同様にしてBIOMAX 1000KDa（ミリポア社製）を
用いて限外瀘過を行うことによって、FVIIIのみを選択
的に膜に通過させ、純化FVIIIを得た。この際の純化FVI
IIの比活性は２，２００ｕ／ｍｇであり、回収率は約３
０％であった。

【００５３】

【発明の効果】本発明の血液凝固第VIII因子／フォン・
ビルブラント因子複合体の精製方法は、血液凝固第VIII
因子／フォン・ビルブラント因子複合体を含む溶液及び
ゲル状物質を混合した後、この溶液からゲル状物質を分
離・除去することからなる、または血液凝固第VIII因子
／フォン・ビルブラント因子複合体を含む溶液を限外瀘
過することからなることを特徴とするものである。特に
前者の方法に従うことによって、FVIII/vWF複合体を含
む溶液が簡単な工程でかなりの小容量にまで濃縮できる
ため、操作が大きな設備を必要とせずに行える。また、
このような方法によって、FVIII/vWF複合体を含む溶液
中に含まれるフィブリノーゲンやフィブロネクチン等の
きょう雑タンパク質ならびに前者の工程では水が簡単な
工程で効率よく分離・除去できる。

【００５４】特に、血液凝固第VIII因子／フォン・ビル
ブラント因子複合体を含む溶液及びゲル状物質を混合
し、この溶液からゲル状物質を分離・除去した後、さら
にこの部分精製液を限外瀘過することによって、大容量
のFVIII/vWF複合体を含む溶液を簡単な工程で小容量に
まで濃縮し、さらにFVIII/vWF複合体を簡単な工程でか
つFVIIIの活性の低下を伴わずに高純度にまで精製する
ことが可能である。

【００５５】また、上記したような高純度にまで精製さ
れたFVIII/vWF複合体を血液凝固第VIII因子及びフォン
・ビルブラント因子に解離することによって、血液凝固
第VIII因子はほとんど不純物を含まなずに効率よく分離
できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者永田政令東京都中央区日本橋馬喰町１丁目４番16号藤森工業株式会社研究開発本部内Ｆターム(参考） 4C084 AA06 BA44 CA36 DA38 DC15 DC50 ZA512 ZA532 ZC542 4H045 AA20 BA40 CA42 DA65 DA66 EA24 GA10 GA15 GA22 HA07

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】血液凝固第VIII因子／フォン・ビルブラ
ント因子複合体を含む溶液及びゲル状物質を混合した
後、該溶液からゲル状物質を分離・除去することからな
る血液凝固第VIII因子／フォン・ビルブラント因子複合
体の精製方法。
【請求項２】血液凝固第VIII因子／フォン・ビルブラ
ント因子複合体を含む溶液を限外瀘過することからなる
血液凝固第VIII因子／フォン・ビルブラント因子複合体
の精製方法。
【請求項３】血液凝固第VIII因子／フォン・ビルブラ
ント因子複合体を含む溶液及びゲル状物質を混合し、該
溶液からゲル状物質を分離して血液凝固第VIII因子／フ
ォン・ビルブラント因子複合体の精製液を得た後、該精
製液をさらに限外瀘過により精製することからなる血液
凝固第VIII因子／フォン・ビルブラント因子複合体の精
製方法。
【請求項４】請求項１〜３のいずれかで精製された血
液凝固第VIII因子／フォン・ビルブラント因子複合体を
血液凝固第VIII因子及びフォン・ビルブラント因子に解
離させる工程を含む血液凝固第VIII因子の精製方法。
【請求項５】該解離工程後にさらに血液凝固第VIII因
子及びフォン・ビルブラント因子の混合液を限外瀘過に
より精製する工程を含む、請求項４に記載の血液凝固第
VIII因子の精製方法。
【請求項６】該ゲル状物質は排除限界が３０万〜２０
００万の孔を有する、請求項１または請求項３〜５のい
ずれか１項に記載の方法。
【請求項７】該限外瀘過は分画分子量が３０万〜１８
００万の限外瀘過膜を用いて行われる、請求項２〜６の
いずれか１項に記載の方法。