JPH0236199A - 血液凝固因子の精製方法および精製用吸着材 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、血液凝固因子製剤製造の際に用いられる血液
凝固因子の精製方法および精製用吸着材に関する。

さらに詳しく述べると、血液凝固第７因子、第８因子、
第９因子、第１３因子等の血液凝固因子製剤を製造する
に際し、混入してくるフィブリノーゲンを吸着材により
吸着除去する血液凝固因子の精製方法、および血液凝固
因子を含む溶液からフィブリノーゲンを吸着除去する血
液凝固因子の精製用吸着材に関するものである。

（従来の技術） 血液凝固因子は種々あるが、これらの凝固因子が複雑に
作用し合って最終的に不溶性フィブリンを形成し、血液
を凝固させる。ある凝固因子が先天的あるいは後天的に
欠乏または低下している患者では、不溶性フィブリンの
形成が遅れるため止血が困難となり、出血傾向となる。

第８因子の欠乏する血友病Ａ、第９因子の欠乏する血友
病Ｂが代表例である。これらの患者の治療のためには、
血液凝固因子製剤の投与が行われ、臨床的に良い成績が
得られている。

血液凝固因子製剤は血液から精製されるが、例えば、第
８因子製剤の場合、収率が１０から１５％と非常に低く
、少数の患者の治療に大量の血液（血漿）を必要とする
。従来の凝固因子製剤の製造方法は、先ず血液から血漿
を分離し、この血漿を急速凍結、低温での融解を行い、
クリオプレシピテートを採取し、この後、このクリオプ
レシピテートを溶解し、ポリエチレングリコール、エタ
ノール、グリシンなどを用いた沈澱法、あるいはコロイ
ドケイ酸、不活化トロンビンゲル等を用いた吸着法によ
りフィブリノーゲンを除去する［クリオプレシピテート
の代わりにコーン（Ｃｏｈｎ）分画■を用いることもあ
る］。フィブリノーゲンを除去した血液凝固因子は、モ
ノクローナル抗体を用いた抗体カラムを用いてさらに精
製したり、ウィルスを不活化するために加熱処理あるい
はソルベント・ディタージェント法で処理したり、乾燥
したりすることもある。

（発明が解決しようとする課題） 従来の血液凝固因子製造方法は、上記したような製造工
程を経るたびに収率が下がり、最終的な収率は１０から
１５％になってしまう。製造工程のうちフィブリノーゲ
ンを除去する工程は、血友病患者の治療を行う上で必須
の製造工程となっている。血友病患者には、不足してい
る血液凝固因子を補うため血液凝固因子製剤を投与する
が、この製剤にフィブリノーゲンを多く含むものを使用
していると、治療中に高フィブリノーゲン血症を併発し
てしまい、治療を続けることができなくなってしまう。

これを防ぐためには、フィブリノーゲンを除去した血液
凝固因子製剤を投与する必要があるが、現状の血液凝固
因子製剤製造方法を用いる限りにおいては、フィブリノ
ーゲン除去工程で凝固因子の収率が大幅に下がってしま
う。収率が低いということは、それだけ、献血による血
液を多く必要とすることにつながり、大量の血漿の輸入
、エイズ（Ａ■Ｄｓ）ウィルス感染等につながり問題で
あった。

本発明の目的は、上記した問題点に鑑み、血液凝固因子
を含む血液からフィブリノーゲンを除去する工程を改良
し、血液凝固因子の収率を大幅に挙げることにある。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、上記目的に沿って鋭意研究した結果、疎
水性リガンド部分、好ましくは塩基性官能基を持つ疎水
性リガンド部分を表面に有する吸着材を用いて血液を処
理することにより、驚くべきほど高い効率でフィブリノ
ーゲンを除去することができ、しかも、血液凝固因子の
収率をほとんど下げないようにすることができることを
見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、血液凝固因子を含む溶液を疎水性
リガンド部分を表面に持つ吸着材に接触させることを特
徴とする血液凝固因子の精製方法であり、さらに、疎水
性リガンド部分を表面に持つことを特徴とする血液凝固
因子精製用吸着材である。本発明において、疎水性リガ
ンド部分が塩基性官能基を有すると、さらに好ましい結
果を与える。

本発明の血液凝固因子を含む溶液とは、全血または血液
に何らかの処理を加えて得られる血液凝固因子入りの血
液成分を言い、血漿、クリオプレシピテート、コーン分
画、部分精製血液凝固因子等を含む。

疎水性リガンド部分を表面に持つ吸着材とは、吸着材表
面にフィブリノーゲンと相互作用を成し、吸着するため
のリガンドとして疎水性の高い化合物が存在しているも
のを言う。

吸着材の形状は、粒子状、繊維状、中空糸状、平膜状等
いずれの形状も使用できるが、粒子状のものが取扱い易
く好ましい。

粒子状吸着材の粒子形状、粒子径等はどんなものでも使
用できるが、多孔体の場合は１０μｍから３　ｍｍ程度
の粒子径のもの、微細孔構造を持たない粒子の場合は０
．　１μｍから３０μｍ程度の粒子径のものが、吸着表
面積、取扱い性の点で推奨できる。粒子状吸着材の中で
は、特に多孔質吸着材は吸着材表面積を大きくすること
ができ、また、取扱いも容易であるため推奨できる。

多孔質吸着材の微細孔の孔径は、フィブリノーゲンが容
易に入れるだけの大きさを持つ必要があるが、あまりに
も大き過ぎると吸着表面積が小さくなる。推奨できる孔
径の範囲は、平均孔径で１００人から９０００人、好ま
しくは２００人から６０００人、さらに好ましいのは４
００人から３０００人の範囲である。

平均孔径の測定は水銀ポロシメーターにより測定できる
。平均孔径は孔径をｒ、ポロシメーターで測定した累積
気孔量を■としたとき、ｄ　Ｖ／ｄｌｏｇ　ｒの値が最
大となる時のｒの値を言う。多孔質吸着材がゲル状物質
のように柔らかい物質の場合は、水銀ポロシメーターで
孔径を測定することが難しい場合があるので、このよう
な場合は、球状蛋白質や多糖類を使用した排除限界分子
量の値をもって最大孔径を推定する。排除限界分子量と
して推奨できるのは１０６以上であり、好ましくは２Ｘ
１０６から１０９、より好ましくは５Ｘ１０６から１０
８の範囲である。また、多孔質吸着材の比表面積は、窒
素を用いたＢＥＴ法により測定できるが、５ボ／ｇ以上
が好ましく、Ｉｏｎ（７ｇ以上であることがさらに好ま
しい。

疎水性リガンド部分とは、２５°Ｃの生理食塩水に対す
る溶解度で２００ミリモル／ｄ以下、より好ましくは１
００ミリモル／ｄ１以下、さらに好ましくは５０ミリモ
ル／ｄ１以下、望ましくは３０ミリモル／ｄ１以下の化
合物を言う。対生理食塩水溶解度が２００ミリモル／准
より大きい化合物は、親水性が高くなりすぎ、フィブリ
ノーゲンに対する親和力が低下するため、フィブリノー
ゲンの吸着能力が極端に低下する。

多孔質吸着材の基剤として用いることができる素材を例
示すると、デキストラン系ゲル、アガロース系ゲル、セ
ルロース系ゲル、ポリビニルアルコール系ゲル、シリカ
系ゲル、ガラス系ゲル、スチレン・ジビニルベンゼン系
多孔体、メチルメククリレート・ジビニルベンゼン系多
孔体、ポリプロピレン系多孔体、ポリエチレン系多孔体
、再生セルロース系多孔体、エチレン・ビニルアルコー
ル系多孔体、セルロースアセテート系多孔体等が挙げら
れる。

疎水性化合物の中では、少なくとも１つの芳香族環を有
する化合物が、特に好ましい結果を与える。芳香族環と
は、芳香族性を持った環状化合物を意味し、いずれも有
用に用い得るが、ベンゼン、ナフタレン、フェナントレ
ン等のベンゼン系芳香族環、ピリジン、キノリン、アク
リジン、イソキノリン、フェナントレン等の含窒素６員
環、インドール、カルバゾール、イソインドール、イン
ドリジン、ポルフィリン、２，３，２°、３”−ピロロ
ピロール等の含窒素５員環、ビリタジン、ピリミジン、
ｓｙｍ−トリアジン、ｓｙｍ−テトラジン、キナゾリン
、１．５−ナフチリジン、プテリジン、フェナジン等の
多価含窒素６員環、ピラゾール、イミダゾール、１．２
．４−トリアゾール、Ｌ２．３−　トリアゾール、テト
ラゾール、ペンズイミナゾール、イミダゾール、プリン
等の多価含窒素５員環、ノルハルマン環、ペリミジン環
、ヘンシフラン、イソヘンシフラン、ジベンゾフラン等
の含酸素芳香族環、ペンゾチチオフェン、チェノチオフ
ェン、チエピン等の含イオウ芳香族環、オキサゾール、
イソオキサゾール、１．２．５−オキサダイアゾール、
ベンゾオキサゾール等の含酸素複素芳香環、チアゾール
、イソチアゾール、Ｌ３，４−チアダイアゾール、ベン
ゾチアゾール等の含イオウ複素芳香環などの芳香族環お
よびその誘導体を少なくとも１つ有する疎水性低分子有
機化合物が好ましい結果を与える。中でもインドール環
を含む化合物は、特に好ましい結果を与える。これはフ
ィブリノーゲンと該化合物の結合において、該化合物の
疎水性と分子剛直性が有効に作用している結果と解釈で
きるものである。

また、より安全に実用に供することができ、安価な疎水
性化合物としては、疎水性アミノ酸およびその誘導体が
極めて高率かつ選択的にフィブリノーゲンを吸着、除去
するので好ましい。

疎水性アミノ酸およびその誘導体とは、Ｔａｎｆｏｒｄ
　、　Ｎｏｚａｋｉ（Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏ
ｃ、、　１８４　４２４０　（１９６２）、Ｊ、　Ｂｉ
ｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２４６　２２１１　（１９７１）
）　（タンフォード、ノザキ（ジャーナル・オブ・アメ
リカン・ケミカル・ソサエティ・１８４　、４２４０　
（１９６２）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリイ」並、　２２１１　（１９７１）　）により
定義された疎水性尺度でみて、１５００ｃａｌ／ｍｏ１
以上のアミノ酸およびその誘導体で、対生理食塩水溶解
度１００ミリモル／ｄ以下の化合物を意味する。例えば
、リジン、バリン、ロイシン、千ロジン、フェニルアラ
ニン、イソロイシン、トリプトファンおよびその誘導体
等である。これらの疎水性アミノ酸およびその８Ａ　４
体の中では、トリプトファンおよびその誘導体が良好な
結果を与える。また、アミノ酸はｆｆ、　ｄの立体配座
を特に限定することなく使用することができる。

また、疎水性化合物のうち、吸着材表面に存在する状態
で非解離性、両イオン性、カチオン性の化合物が、アニ
オン性の化合物よりもフィブリノーゲンをより選択的に
吸着するのでアニオン性の化合物よりは好ましい。アニ
オン性の化合物は、アルブミン分子がフィブリノーゲン
分子より電気的に陰性であることより当然予想される結
果に反して、アルブミンに親和性であり、フィブリノー
ゲンの吸着量が低下する。

これとは逆に、カチオン性の化合物はフィブリノーゲン
に対してより強い親和性を持っている。

このことは、フィブリノーゲン分子が生理的状態で電気
的にカチオン性であるため、カチオン性の化合物とは反
発し合うだろうという予測に反する事実である。

したがって、本発明の疎水性リガンド部分は、含窒素塩
基性官能基のように、生理的条件でカチオン性を示す塩
基性官能基を有することが好ましい。

本発明の疎水性リガンド部分に対し、フィブリノーゲン
は親和的であり、血液凝固因子は親和的でないという理
由は、主に疎水性リガンド部分と蛋白質との間の疎水性
相互作用力の違いに基づくものと考えられるが、静電的
相互作用力の違いによっても、ある程度の選択性が得ら
れているものと考えられる。

疎水性リガンド部分を吸着材表面に保持させる方法は、
吸着材自体を疎水性のポリマーで構成してもよいし、吸
着材の構造体自体は親水性物質にし、その表面のみに疎
水性リガンドを固定してもよい。構造体表６面に疎水性
リガンドを固定する方法は、共有結合、イオン結合、物
理吸着、包埋、コーティングあるいは構造体表面への沈
澱不溶化等あらゆる方法を用いることができるが、疎水
性リガンド部分の溶出性から考えると、共有結合、コー
ティング等が推奨でき、特に、共有結合により固定、不
溶化することが好ましい。共有結合の方法は、通常、固
定化酵素、アフィニティークロマトグラフィーで用いら
れる不溶性担体の固定化方法、および酵素、リガンドの
固定化方法を用いることができる。また、必要に応じて
吸着材構造体部分と疎水性リガンド部分との間に、任意
の長さの分子（スペーサー）を導入することもできる。

例えば、アガロースゲルを構造体部分として、そのヒド
ロキシル基とへキサメチレンジイソシアナートの片側の
イソシアナート基を反応、結合させ、残ったイソシアナ
ート基と疎水性リガンド部分のアミノ基、カルボキシル
基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基等を反応、結合
させるごと〈実施できる。

吸着材の構造体部分に親水性の多孔体を使用した場合、
その表面への疎水性リガンド部分の保持量は、構造体１
ｍ！（カラム体積）当たり０．１ｍｇ以上あることが好
ましく、０．５■から１００■がさらに好ましく、１　
ｍｇから５０ｍｇが望ましい。

疎水性リガンド部分を表面に持つ吸着材を血液凝固因子
を含む溶液に接触させる方法は、血液凝固因子を含む溶
液に吸着材を加え、吸着材にフィブリノーゲンを吸着さ
せた後、吸着材を沈降させるか、膜分離等の手段により
吸着材を除去することにより、フィブリノーゲンが除去
された血液凝固因子溶液を得る方法、あるいは吸着材を
カラムに充填し、このカラムに血液凝固因子を含む溶液
を流し、カラム中にフィブリノーゲンを吸着させる方法
等の一般的な方法を用いることができる。

上記操作は血液凝固因子を失活させないよう、温度、操
作時間等を設定することが好ましい。また、血液凝固因
子を失活させ難くするため、血液凝固因子を含む溶液に
安定剤を添加することもできる。

また、本吸着材は、必要によりアルカリ性溶液等で再生
して再使用することもできる。

（発明の効果） 本発明血液凝固因子の精製方法および精製用吸着材を用
いることにより、血液凝固因子を含む溶液中に含まれる
フィブリノーゲンを高い効率で除去できるようになり、
また、その際、血液凝固因子の活性を落とさず、高率に
活性を維持できるようになった。そのため、少ない原料
血液から多くの血液凝固因子を回収できるようになった
。

血液凝固因子製剤用の原料血液確保の困難さは、今日、
社会問題化しており、本発明は、この問題を解決するた
めの１つの手段となり得る。

（実施例） 以下、実施例により本発明の実施の態様をより詳細に説
明する。

実施例１〜１０ 酢酸ビニル１００ｇ、トリアリルイソシアヌレ−１−４
１，４ｇ、酢酸エチル１００　ｇ、ヘプタン１００ｇ、
ポリ酢酸ビニル（重合度５００）７゜５ｇおよび２，２
゛−アゾビスイソブチロニトリル３．８ｇよりなる均一
混合液と、ポリビニルアルコール１重量％、リン酸二水
素ナトリウムニ水和物０．０５重量％およびリン酸水素
二ナトリウム十二水和物１．５重量％を溶解した水４０
０　ｍｌとをフラスコに入れ、充分攪拌した後、６５°
Ｃで１８時間、さらに７５°Ｃで５時間加熱攪拌して懸
濁重合を行い、粒状共重合体を得た。濾過水洗、ついで
アセトン抽出後、カセイソーダ４６．５ｇおよびメタノ
ール２２よりなる溶液中で４０°Ｃで１８時間、共重合
体のエステル交換反応を行った。

得られたゲルの平均粒径は１００μｍ、単位重量当たり
のビニルアルコール単位（ｑ　　ＯＨ）は９、　４ｍｅ
ｑ／ｇ　、比表面積は１２５ｎ（／ｇ、蛋白質およびウ
ィルスによる排除限界分子量は３×１０７であった。得
られたゲルを吸着材の構造体として用いた。

得られたゲル１０ｇ（乾燥重量）をジメチルスルホキシ
ド１２０滅中に）ｇ濁し、これにエピクロルヒドリン１
８．３ｍｌ、５０％水酸化ナトリウム１０ｄを加え、３
０°Ｃで５時間攪拌しながら活性化反応を行った。反応
後、ジメチルスルホキシドで洗浄し、水洗し、吸引脱水
した。活性化された吸着材構造体のエポキシ当量は１１
５μｓｑ／ｇ　（湿潤容量）であった。

次に、各種疎水性化合物を通常のアフィニティークロマ
トグラフィーに用いられるリガンド結合方法を用いて、
エポキシ活性化された吸着材構造体に結合した。疎水性
化合物の吸着材構造体への保持量は、結合反応に供した
疎水性化合物のうち未反応のものを定量し、計算によっ
て求めた。

上記した方法により得られた吸着材を血液凝固因子精製
用吸着材として用い、以下の吸着実験を行った。

各吸着材をそれぞれ内径８　ｍｍ、長さ２０胴、体積１
ｄのカラムに充填し、それぞれのカラムに１０ｍ１のＣ
ＰＤ加ヒト新鮮血漿を１０分かけて流し、カラムを通過
した血漿について、フィブリノーゲン濃度と血液凝固第
８因子活性の評価を行った。

フィブリノーゲンはシングルラジアルイムノデイフュー
ジョン（ＳＲＴＤ）法、第８因子活性は第８因子欠乏血
漿を用いた一段測定法によった。

結果を表１に示した。結果は、処理前の血漿のフィブリ
ノーゲン量および第８因子活性をそれぞれ１００％とし
、カラム通過後のそれぞれの値を百分率で表示した。第
８因子の活性低下が少なく、フィブリノーゲンを良く除
去できることがわかる。

実施例１１〜１３ ＣＰＤ加ヒト新鮮血漿の代わりにクリオプレシピテート
を再溶解したものを各カラム毎５−流したこと以外は、
実施例１〜１０と同様に実験した。

吸着材としては実施例１，４．７と同じものを用いた。

結果を表２に示す。第８因子の活性低下が少なく、フィ
ブリノーゲンを大幅に低下できることがわかる。

表２

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）血液凝固因子を含む溶液を疎水性リガンド部分を
   表面に持つ吸着材に接触させることを特徴とする血液凝
   固因子の精製方法。
2. （２）疎水性リガンド部分が塩基性官能基を持つ請求項
   １記載の血液凝固因子の精製方法。
3. （３）疎水性リガンド部分を表面に持つことを特徴とす
   る血液凝固因子精製用吸着材。
4. （４）疎水性リガンド部分が塩基性官能基を持つ請求項
   ３記載の血液凝固因子精製用吸着材。