JPH0233265B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 技術分野 本発明は、ヒト血液からの高力価の血液製剤を
簡便に調製する際に用いられる血液中蛋白質の回
収装置に関するものである。 先行技術およびその問題点 血液製剤には、血液そのものの全血製剤のほ
か、血液の各成分を分離した血液成分製剤、血漿
蛋白を分離精製した血漿分画製剤がある。現在市
販されている血漿分画製剤は、免疫グロブリン製
剤、アルブミン製剤、凝固因子製剤に大きく分類
でき、大部分は国産および米国産である。 免疫グロブリン製剤は、低または無ガンマグロ
ブリン血症に使われるのみではなく、ウイルス感
染、重症感染症に抗生物質と併用されている。ア
ルブミン製剤には、人血清アルブミン、加熱人血
漿蛋白があり、低蛋白血症、シヨツク時、アシド
ーシス、脱水症等に使われている。凝固因子製剤
には、フイブリノゲン、血液凝固第因子、第
因子がある。 血液製剤とくに血漿分画製剤は、プラズマフエ
レーシスや肝臓切除などの医療の進歩と共に大量
に使われ、輸入比率の高い我が国においては、不
可抗力的なAIDS（後天性免疫不全症候群）感染
の恐れも高く、国内増産体制の確立が必要視され
ている。 しかしながら、現在、血漿分画製剤は、献血者
から得た血液を遠心分離して新鮮凍結血漿を調製
し、これを原料にして、遠心分離法やイオン交換
クロマトグラフイー、溶解度差を利用する方法な
ど、複雑な手順を経て調製されている。血漿採取
段階においては、膜による分離法も検討されてい
るものの、より一層簡便で収率よく、かつ高純度
に血漿分画製剤を調製することができる血液中蛋
白質の回収装置の開発が望まれていた。 発明の目的 本発明の目的は、上記先行技術の問題点を解決
しようとするもので、不溶性担体にリガンド（目
的物質と親和性のある物質）として低分子有機化
合物を固定した吸着材により、ヒト血漿から有用
血漿成分（血液中蛋白質）を選択的に吸着採取し
た後、これを簡便に回収して収率よくかつ高純度
に血液製剤を調製することができる、安全で安価
な血液中蛋白質の回収装置を提供しようとするこ
とにある。 発明の構成 本発明者らは、免疫グロブリン除去用吸着材お
よび吸着装置を開発する過程において、吸着され
た血漿成分（血液中蛋白質）が容易に回収できる
ことを見出した。本発明者らは、この知見に基づ
いて血液製剤を簡便に収率よく、かつ高純度に調
製する方法等について研究し、血液中蛋白質の回
収装置を発明するに至つた。 すなわち、本発明は、血液中蛋白質を吸着した
吸着装置が具備する溶離液導入口と接続可能な接
続部を備え、かつ該吸着装置内に吸着された血液
中蛋白質を溶離させる作用を有する溶離液を収納
した溶離液収納容器と、 該吸着装置内を通過した溶離液により溶離され
た血液中蛋白質を含む脱離液を排出する為に該吸
着装置が備える脱離液導出口と接続可能な脱離液
導入口を一端に備え、他端に透析された脱離液を
排出する為の脱離液排出口を備え、かつ透析液導
入口及び透析液導出口を備え、内部に透析手段を
収納してなる透析装置と、 該透析液導入口ならびに透析液導出口と接続さ
れ、かつ透析液を収納してなる透析液収納容器
と、 該透析装置の脱離液排出口から排出された脱離
液を該透析装置の脱離液導入口へ導き該透析装置
内に再循環させることを可能とする流路切換手段
を備えた脱離液循環用手段と、 該透析装置の脱離液排出口と接続された血液中
蛋白質の回収容器とを備えたことを特徴とする血
液中蛋白質の回収装置を提供するものである。 発明の具体的構成 本発明で対象とする被吸着採取物質は、血漿分
画製剤用の血漿成分であるが、より詳細に説明す
ると、免疫グロブリン、フイブリノーゲン、アル
ブミン、凝固系第（プロトロンビン）、第、
第、第、第、第因子、第因子インヒ
ビターバイパツシングアクテイビテイー
（Factor Eight Inhibitor Bypassing Activity）、
アンチトロンビン、フイブロネクチンなどの血
液中蛋白質である。 上記のような血漿成分を吸着採取するため、本
発明においては、不溶性担体上にリガンド（目的
物質と親和性のある物質）として、低分子有機化
合物を固定した吸着材および吸着材を収納した吸
着装置を用いる。 吸着材として用いる低分子有機化合物とは、分
子量１万ダルトン以下の物質であるが、とくに複
素環式化合物、脂質あるいはビタミン、ビタミン
様作用因子が好ましく作用される。低分子有機化
合物の分子量が１万ダルトンより大きくなると、
もし脱離した場合、抗原性などの生物学的活性や
副作用を示す可能性があるため、好ましくない。 複素環式化合物とは、環中に炭素原子とともに
ヘテロ原子を含む環式化合物であり、五員複素環
式化合物ではフランとその誘導体、チオフエンと
その誘導体およびジチオラン誘導体、ピロールと
その誘導体、アゾール類、六員複素環式化合物で
は、ピリジンとその誘導体、キノリンおよび関連
化合物、アクリジンおよび関連化合物、ピリミジ
ンと関連化合物、ピラジンと関連化合物、ピラン
およびピロンと関連化合物、フエノキサジン、フ
エノチアジン、プテリンおよびアロキサジン化合
物、プリン塩基、核酸、ヘミン、クロロフイル、
ビタミンB₁₂およびフタロシアニン、あるいはア
ルカロイド、縮合環系複素環式化合物を含む。 複素環式化合物の中では、サルフア剤が特に好
ましい結果を与える。 複素環式化合物であつてサルフア剤であるもの
の例としては下記の通りである。

【表】

【表】 脂質とは、脂肪酸のエステルおよびこのような
エステルの構成成分（脂肪酸、アルコール、ステ
ロイド）などの天然の化合物であり、単純脂質
（中性脂肪、真性ロウ、コレステロールエステ
ル）、複合脂質（リン脂質、糖脂質、硫脂質、タ
ンパク脂質）、誘導脂質（脂肪酸、高級アルコー
ル、炭化水素、ビタミンＤ・Ｅ・Ｋ）をいう。 脂質の中では、脂肪酸エステルあるいはリン脂
質が特に好ましい結果を与える。 ビタミンあるいはビタミン様作用因子とは、ビ
タミンＡ群、ビタミンＢ群、ビタミンＣ群、ビタ
ミンＤ群、ビタミンＥ群、ビタミンＫ群、カルニ
チン、フエルラ酸、γ−オリザノール、α−リポ
酸、オロクト酸、ビタミンＰ群、ビタミンＵをい
う。 吸着材として好適に用いられる複素環式化合物
のサルフア剤あるいは脂質の脂肪酸エステルおよ
びリン脂質あるいはビタミン、ビタミン様作用因
子は、被吸着物質と疎水性相互作用力を主にし
て、その他に水素結合、静電結合、イオン結合、
配位結合、van der Waals−London力の相互作
用力によつて引き合うと考えられる。したがつ
て、被吸着物質の生理活性は低下させないので、
これらの相互作用を破壊するか、拮抗する物質、
例えば疎水性相互作用力の場合は、カオトロピツ
クイオンや界面活性剤、水素結合の場合は水酸基
を多く含む糖類やヒドロキシ誘導体、イオンおよ
び静電結合の場合は、電解質やPH調製剤などを、
溶離液成分として用いれば、簡便に被吸着物質を
採取し回収することが可能である。 このような吸着材を固定するための不溶性担体
は、親水性担体、疎水性担体いずれも使用できる
が、リガンドの特性が吸着量に反映され易く、被
吸着物質を回収し易い、親水性担体が好ましい。 不溶性担体の形状は、粒子状、繊維状、中空糸
状、膜状等いずれの公知の形状も用いうるが、血
液、血漿の通液性、吸着材調製時の取扱い簡便性
などの点から、粒子状担体が特に好ましく用いら
れる。 粒子状担体としては、平均粒径0.05mmから５mm
の範囲にあることが好ましい、また、粒子形状
は、細胞に損傷を与えにくいことやクダケ、カケ
が生じにくい点から、球形が好ましい。 使い得る粒子状担体の材質としては、アガロー
ス、キトサンなどの多糖類、ポリビニルアルコー
ル、メタクリル酸エステル重合体、スチレン−ジ
ビニルベンゼン共重合体などの有機ポリマー、多
孔質ガラス、アルミナ、セラミツクスなどの無機
多孔体であるが、特にアクリル系重合体、シリカ
ゲルが、機械的強度、操作性などの点で優れてい
るので、好ましく用いられる。 粒子状担体は、表面にリガンドを多く結合でき
る多孔体が好ましく、このような結合力を有する
ものの平均孔径は50Åないし5000Å、より好まし
くは100Åないし3000Åの範囲にあるものがよい。 リガンドを不溶性担体に固定する方法として
は、共有結合、物理的吸着、イオン結合、生化学
的特異結合などの担体結合法、あるいは架橋法、
包括法、複合法が実施されているが、血液あるい
は血漿中でのリガンド安定性の点から、共有結合
が好適である。 リガンドを不溶性担体の表面に共有結合する為
には、両者の官能基に応じて、種々の方法が用い
られる。例えば、臭化シアン活性化法、カルボジ
イミド試薬などを用いる縮合試薬法、酸アジド誘
導体法、ジアゾ法、アルキル化法、ジアルデヒド
やビスエポキシド、ジイソシアネートなどを用い
る担体架橋法、γ−グリシドキシプロピルトリメ
トキシシラン（以下GOPTSと略記する）やβ−
（３，４−エポキシシクロヘキシル）エチルトリ
メトキシシランなどを用いるシランカツプリング
剤活性化法などが使用される。また、必要に応じ
て、リガンドと不溶性担体との間に任意の長さの
分子（スペーサー）を導入して使用することもで
きる。 不溶性担体とリガンドである低分子有機化合物
との間に介挿するスペーサーとしては、ヘキサメ
チレンジアミンなどのジアミン類、ヘキサメチレ
ングリコールなどのジオール類などが好ましい。 上述した吸着材は、血液あるいは血漿と接触さ
せて血漿成分をバツチ方式で吸着採取してもよい
が、より好ましくは、以下に述べる吸着装置に使
用するのがよい。 本発明の回収装置に適用する吸着装置は、血液
製剤調製用吸着材を、血液あるいは血漿の導出入
口を備えた容器内に充填保持させてなるものであ
る。 容器の材質は、ガラス、ステンレス、ポリエチ
レン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリ
スチレン、ポリメチルメタクリレート等が使用で
きるが、オートクレーブ滅菌が可能で取り扱い易
いポリプロピレンやポリカーボネート等が特に好
ましい。また、容器本体の吸着材層と出入口部と
の間に、血液は通過するが、吸着材は通過できな
い網目を持つフイルターを備えているものが好ま
しい。この材質は、生理学的に不活性で強度の高
いものであれば良いが、特にポリエステル製、ポ
リアミド製のものが好ましく使用される。 以下、図面を用いて、本発明の回収装置に適用
する吸着装置の一構成例についてさらに詳細に説
明する。 第２図は、血液製剤調製用血液中蛋白質の吸着
装置の１例についての断面図である。血液あるい
は血漿は、血液導入口４より導入され、容器ある
いはカラムに収容された血液製剤調製用吸着材２
で処理された後、血液導出口５から導出される。
吸着材は、フイルター３によりカラム内に保持さ
れている。 フイルター３は血液成分は通すが吸着材の構成
材を通さないようにしておくのが好ましい。 第３図は、血液製剤調製用血液中蛋白質の吸着
装置を利用した血漿成分の吸着採取方法の１例を
示す概略図である。血液は血液導入口６より導入
され、ポンプ７、チヤンバー８を通つて、積層型
血漿分離装置９へ供給され、血球と血漿に分離さ
れる。分離された血漿は、ポンプ７、チヤンバー
８を通つて血液製剤調製用吸着装置１に供給さ
れ、吸着処理された後に、チヤンバー８、恒温槽
１０を通つて血液導出口１１より導出される。 第４図は、血液製剤調製用血液中蛋白質の吸着
装置に血液を直接通過させて、血漿成分を吸着採
取する方法の１例を示す概略図である。血液は血
液導入・導出口１２より導入され、チヤンバー８
を経て血液製剤調製用吸着装置１で吸着処理され
た後に、ポンプ７を通つて血液バツグ１３に貯留
される。血液バツグ１３が一杯になつた時点で、
ポンプ７を逆回転させ、処理された血液は右側回
路１４、チヤンバー８を通つて、血液導入・導出
口１２より導出される。 なお、血液製剤調製用血液中蛋白質の吸着装置
は、使用前に精製水、生理食塩水等を充填した
後、これを湿熱滅菌処理しておく。 第３図および第４図において、血漿成分を吸着
採取した血液製剤調製用血液中蛋白質の吸着装置
は回路より外され、第１図に示す本発明による血
液中蛋白質の回収装置に装着され、被吸着成分で
ある血液中蛋白質が回収され、血液製剤が調製さ
れる。 吸着装置１の導入口４はチユーブ２１を介して
溶離液収納容器２２に接続され、吸着装置１の導
出口５はチユーブ２３を介して透析装置２４の脱
離液導入口２５に接続される。溶離液は吸着装置
１内に充填された充填材に吸着された血漿成分
（血液中蛋白質）を溶離するためのもので、溶離
された血漿成分を含む溶離液をここでは脱離液と
いう。脱離液は透析装置２４にて脱塩されて脱離
液導出口２６よりチユーブ３３を経て排出され
る。 透析装置２４は脱離液中に蛋白質を変性させる
物質が含まれている場合、脱離液中の塩濃度が高
い場合などに、透析液として生理食塩水や蒸溜水
を用いて脱離するためのものである。 したがつて、透析装置２４の内部に収納されて
いる透析手段には、透析液を透析液収納装置２７
からチユーブ２８を介してポンプ２９により透析
液導入口３０を導入し、透析装置２４内の透析手
段を経て透析液導出口３１より排出し、作用剤の
透析液は三方活栓３２の操作により廃棄する。 一般に、脱離液の透析操作は１回では不十分で
あるので、チユーブ２３および３３上にそれぞれ
設けられた三方活栓３４および３５間に配置され
たポンプ３６を有するチユーブ３７の循環回路を
形成し、脱離液を透析装置２４に必要回数循環さ
せる。 このようにして脱塩された血漿成分を含む脱離
液は三方活栓３５の操作により透析装置２４の導
出口２６からチユーブ３３を経て回収容器３８に
回収される。 次に本発明の血液中蛋白質の回収装置の操作に
つき簡単に説明する。 第２図に例示するような吸着装置を用いて第３
図および第４図に例示するようにして吸着材に血
液中の蛋白質（血漿成分）を吸着させた吸着装置
１は第１図に示すように本発明の回収装置に装着
される。 第１図に示すように装着後、吸着装置１には溶
離液収納容器２２から後述する溶離液を流して吸
着装置１内に充填されている吸着材に吸着されて
いる血液中蛋白質を溶離する。 このようにして溶離された血液中蛋白質を含む
脱離液は透析装置２４に通され、透析液収納容器
２７からポンプ２９およびチユーブ２８を含む循
環回路を経て好ましくは矢印３９で示すように循
環される透析液により、脱離液中の蛋白質に対し
て悪影響を及ぼす成分を、ポンプ３６およびチユ
ーブ３７を含む循環回路によつて脱離液を好まし
くは矢印４０で示すように循環させつつ、十分に
除去する。 脱塩した成分を含む透析液は三方活栓３２を経
て廃棄する、透析装置２４により十分に脱塩され
た脱離液は有効成分として血液中蛋白質（血漿成
分）を含み、これは三方活栓３５を経て回収容器
３８に回収される。 回収された脱離液は必要に応じて濃縮操作、凍
結乾燥などの処理を施され、血液製剤に調製され
る。 以上詳細した回収装置において、吸着材に吸着
された血漿成分を十分に吸着材から溶離すること
が重要である。以下にその溶離液について述べ
る。 溶離液は、吸着材表面と種々の相互作用力で結
び付いている血液中蛋白質を回収する為に使用す
るが、その脱離機構は相互作用力の破壊あるいは
他の物質による拮抗作用である。したがつて、相
互作用力の種類によつて表１のように溶離液を使
い分ける。

【表】 実施例 以下、実施例により、本発明をより詳細に説明
する。 実施例１および比較例１ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以下DMFと
略記する）に溶解した1w／ｖ％γ−オリザノー
ル100ml、クロロホルムとDMFとの混液（１＋
４）に溶解した1w／ｖ％卵黄レシチン100ml、ク
ロロホルムとDMFとエタノールとの混液（１＋
３＋0.1）に溶解した0.1w／ｖ％ホスフアチジル
エタノールアミン90ml、各々に、オキシラン−ア
クリルビーズ（平均孔径350Å、粒子径範囲100〜
200μｍ、EupergitC Rohm Pharma製、樋口商
会販売）15ｇを添加し、アスピレーターで脱気し
た。そして1v／ｖ％ピリジンと1v／ｖ％トリ−
ｎ−ブチルアミンを触媒として添加した後、80℃
水浴中で３時間加温し、更にブラツドミキサーを
使用して室温下で一晩撹拌し、反応させた。 次に蒸留水、DMF、クロロホルム、エタノー
ルで洗浄した後、酢酸でPH８に調整した1Mモノ
エタノールアミン水溶液100mlを加え、ブラツド
ミキサーを使用して室温下で一晩撹拌し、未反応
のエポキシ基をブロツキングした。なお、ブロツ
キング操作から表面処理を始めたEupergitCを比
較実験に用いた。この吸着材を、蒸留水0.5M塩
化ナトリウムを含むPH４−0.02M酢酸バツフア
ー、PH10−0.2M炭酸バツフアーで繰り返し洗浄
した後、最後は蒸留水で洗い、軽く水を除いた
wet状態でガラス製試験管（テルモ製ラルボ、
15.5mmφ×100mm）に３ｇずつ採集して、吸着実
験に供した。 吸着実験は次のように操作した。上記吸着材の
入つた試験管に、137mM塩化ナトリウムおよび
2.6mM塩化カリウムを含むPH7.2−8mMリン酸バ
ツフアー（PBS）を２ml添加し、アスピレータ
ーで脱気した後、抗凝固剤として3.8w／ｖ％ク
エン酸ナトリウム溶液を10v／ｖ％含む正常人新
鮮血漿３mlを添加し、ブラツドミキサーを用いて
撹拌しながら、37℃オーブンで90分間インキユベ
ートした。そして、容量５mlのテルモ製デイスポ
ーザブルシリンジを利用して作製したミニカラム
に、この試験管内容物を移し、流出液を集め、流
出液中の凝固系第因子活性を、第因子欠乏血
漿を用いてAPTT（活性化部分トロンボプラスチ
ン時間）を利用する一段凝血法により測定した。 結果を表２に示した。表２より、卵黄レシチ
ン、ホスフアチジルエタノールアミン（リン脂
質）γ−オリザノール（ビタミン様作用因子、脂
肪酸エステル）を結合させた吸着材が、凝固系第
因子を高率に吸着することは明らかである。 次に、吸着材を捕集した上記ミニカラムに、第
１図に示す装置を用いて10％ジオキサン水溶液を
流量１ml／minで20ml流した。そして、ダイアラ
イザー用中空糸を用いて作製した透析器ミニモジ
ユール（膜面積0.1m²）にこの流出液を４℃で循
環させ、２の生理食塩水を用いて流量50ml／
minで透析した。 透析後、ミニコン簡易濃縮器（アミコン社）を
用いて、流量３mlに濃縮し、第因子活性を測定
したところ、オイパーギツトＣ−γ・オリザノー
ル、オイパーギツトＣ−卵黄レシチン、オイパー
ギツトＣ−ホスフアチジルエタノールアミンで
は、いずれも吸着前血漿中の21％が回収されたの
に対して、オイパーギツトＣ−エタノールアミン
では回収されなかつた。 また、回収液中のジオキサン濃度をガスクロマ
トグラフ法により測定したところ、0.09％に低下
していた。

【表】 −
の第因子活性) 因子活性)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 血液中蛋白質を吸着した吸着装置が具備する
   溶離液導入口と接続可能な接続部を備え、かつ該
   吸着装置内に吸着された血液中蛋白質を溶離させ
   る作用を有する溶離液を収納した溶離液収納容器
   と、 該吸着装置内を通過した溶離液により溶離され
   た血液中蛋白質を含む脱離液を排出する為に該吸
   着装置が備える脱離液導出口と接続可能な脱離液
   導入口を一端に備え、他端に透析された脱離液を
   排出する為の脱離液排出口を備え、かつ透析液導
   入口及び透析液導出口を備え、内部に透析手段を
   収納してなる透析装置と、 該透析液導入口ならびに透析液導出口と接続さ
   れ、かつ透析液を収納してなる透析液収納容器
   と、 該透析装置の脱離液排出口から排出された脱離
   液を該透析装置の脱離液導入口へ導き該透析装置
   内に再循環させることを可能とする流路切換手段
   を備えた脱離液循環用手段と、 該透析装置の脱離液排出口と接続された血液中
   蛋白質の回収容器とを備えたことを特徴とする血
   液中蛋白質の回収装置。