JPH0518625B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野］ 本発明は血液などに含まれる血清アミロイドＡ
（Serum Amyloid Ａ、以下SAAという）蛋白を
除去するためのSAA蛋白用吸着体に関する。 ［従来の技術および発明が解決しようとする問題
点］ アミロイド−シスはアミロイド物質と呼ばれる
β−フイブリル状の蛋白が血管、臓器およびその
他の組織に沈着し、心、腎などの臓器不全、心刺
激伝導障害、進行性痴呆、脳血管障害、神経障害
などの重篤な障害を惹きおこす疾患である。 アミロイド−シスには原発生、続発性、家族
性、老人性などの病型が存在することが知られて
いる。続発性アミロイド−シスは、慢性関節リウ
マチ、若年性関節リウマチ、肺化膿症、肺結核な
どの疾患に続発して起こり、好発部位として腎、
甲状腺、膵、肝、脾などがあげられる。 アミロイド−シス沈着物質の蛋白組織は病型に
より異なる。続発生アミロイド−シスでは、アミ
ロイド−シス沈着物質はアミロイドＡ（Amyloid
Ａ、以下AAという）蛋白と呼ばれる分子量が
8500でアミノ酸76個からなる蛋白質により形成さ
れている。 また、それぞれの病型において沈着するアミロ
イド−シス沈着物質に対応する前駆物質が患者血
液中に存在することが明らかになりつつある。続
発性アミロイド−シスでは高密度リポ蛋白
（High Density Lipoprotein、以下HDLという）
のアポリポ蛋白のひとつであるSAA蛋白がAA蛋
白の前駆物質であるとされている。このSAA蛋
白は分子量約12000で、肝細胞で産生され、血液
中でHDLのアポリポ蛋白となり体内を循環し
HDLから離れて加水分解され、AA蛋白となつて
組織に沈着すると考えられている。またSAA蛋
白は、HDLの中では密度の高い分子量1.75×10⁵
であるHDL₃のアポリポ蛋白として存在している
と考えられている。 アミロイド−シスは前記のごとく重篤な疾患で
あり、死亡率も高いことからその治療法について
盛んに研究されてきたが、これまでのところ有効
な治療法、とくに薬物療法は見出されていない。 一方近年盛んに行なわれるようになつてきた体
外循環による血液浄化法、とりわけ血漿交換法に
よりアミロイド−シスを治療する試みがなされて
おり、前記の前駆物質を多量に含有する患者血漿
を正常血漿と交換することにより症状の軽快、病
変の進行停止が見られるとの報告がなされてい
る。 体外循環による血液浄化法とりわけ血漿交換法
は現在のところ最も有効な治療法であるが、高価
かつ貴重な正常血漿あるいは血漿製剤を大量に使
用すること、また患者血漿中に含まれる前駆物質
以外の有用成分も同時に廃棄されるなどの欠点を
有しているため、前駆物質をより選択的に除去す
る方法の開発が強く望まれている。 本発明は叙上の問題点を解決し、HDLを大き
く減少させることなくSAA蛋白を選択的に除去
しうる安価なSAA蛋白用吸着体を提供すること
を目的とするものである。 ［問題点を解決するための手段］ 本発明は、水不溶性担体の表面の少なくとも一
部にポリアニオン化合物を有するSAA蛋白用吸
着体に関する。 ［実施例］ 本発明に用いるポリアニオン化合物は、PHが中
性付近で負に帯電するような官能基を含有するも
のであればいかなるものでもよく、とくに限定さ
れるものではない。 本発明に用いるポリアニオン化合物の代表例と
しては、たとえばポリアクリル酸、ポリビニルス
ルフオン酸、ポリビニルりん酸、ポリスチレンス
ルフオン酸、ポリスチレンりん酸、ポリグルタミ
ン酸、ポリアスパラギン酸、ポリメタクリル酸、
ポリりん酸、スチレン−マレイン酸共重合体など
の合成ポリアニオン化合物、さらにはヘパリン、
デキストラン硫酸、コンドロイチン、コンドロイ
チン硫酸、キチン、キトサンなどのアニオン性官
能基含有多糖類などがあげられるが、これらに限
定されるものではない。これらのなかでも、硫酸
エステル基を含有するポリアニオン化合物を用い
るのが好ましい。 ポリアニオン化合物を水不溶性担体の表面の少
なくとも一部に固定するために、ポリアニオン化
合物を導入する方法としては種々の方法を用いう
るが、強固な共有結合を形成する固定化法が好ま
しい。 ポリアニオン化合物のうち硫酸エステル基を含
有する化合物としては硫酸エステル基の他に水不
溶性担体への固定に利用しうる官能基を有する化
合物が好ましい。なかでも多価アルコールの部分
硫酸エステル化物、とりわけ糖類の硫酸エステル
化物（硫酸化多糖類）が硫酸エステル基、固定に
必要な官能基双方を含んでいるうえに、生体適合
性、活性共に高く、さらに容易に水不溶性担体に
固定できるため好ましい。その他のポリアニオン
化合物もアニオン性官能基以外に固定に利用でき
る官能基を有するものが好ましい。 本発明に用いる水不溶性担体としては無機担
体、合成高分子もしくは多糖類からなる有機担体
または有機担体および無機担体からなる複合担体
のいずれであつてもよいが、血液中に存在する
SAA蛋白の存在環境からいえば親水性の水不溶
性担体が好ましく、さらには目的物質以外の物質
の吸着、いわゆる非特異吸着が少ないものが好ま
しい。さらには担体表面に固定化反応に用いうる
官能基あるいは容易に活性化しうる官能基が存在
していると好都合である。これらの官能基の代表
例としてはアミノ基、カルボキシル基、水酸性、
チオール基、酸無水物基、サクシニルイミド基、
塩素基、アルデヒド基、アミド基、エポキシ基、
シラノール基などがあげられる。 本発明に用いる好ましい水不溶性担体の代表例
としてはガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担
体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリ
レート、架橋ポリアミドなどの合成高分子や結晶
性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロー
ス、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機
担体など、さらには無機担体表面を合成高分子化
合物または多糖類などでコーテイングした有機担
体と無機担体の複合担体、合成高分子化合物より
なる担体表面を多糖類でコーテイングしたような
有機担体と有機担体の複合担体などがあげられる
が、本発明はこれらのみに限定されるものではな
い。これらのなかではとくに、水酸基含有化合物
より構成されてなる水不溶性担体は生体的適合性
がよい、非特異吸着が少ないなどの点から好まし
い。 本発明の吸着体の形状は粒状、繊維状、膜状あ
るいはホローフアイバー状などいずれの形状であ
つてもよく、また吸着体の微細構造は多孔質ある
いは非多孔質のいずれであつてもよいが、単位体
積あたりの高い吸着能をうるためには比表面積が
大きいこと、すなわち多孔質であることが好まし
い。 本発明の吸着体は、血液、血清、血漿およびそ
の希釈液またはこれらの液に血球除去や血清タン
パク除去などの前処理を施したものなどのような
SAA蛋白を含む溶液よりSAA蛋白を除去するた
めに用いることができ、続発性アミロイド−シス
患者の体外循環治療用吸着体としても用いること
ができる。たとえば、体外循環治療用吸着体とし
て用いるばあい、吸着体の圧密化を防ぐためには
充分な機械的強度を有し、さらに単位体積あたり
の高い吸着量をうるためには多孔質の性状を有す
る吸着体であるのが好ましい。そのような吸着体
としては、たとえば水不溶性担体にポリアニオン
化合物を固定してなる本発明の吸着体において水
不溶性担体としてゲルを用いるばあい、かかるゲ
ルは硬質ゲルであり、かつ多孔質とくに全多孔質
のゲルであるのが好ましく、さらには細孔径は、
12000の分子量をもつSAA蛋白がゲル内に侵入で
きるのに充分な大きさであることが好ましい。こ
こでいう硬質ゲルとは後記参考例に示すごとく、
ゲルを円筒状カラムに均一に充填し、水性流体を
流した際の圧力損失と流量の関係が、0.3Kg／cm²
まで直線関係にあるものをいう。また多孔質とは
細孔容積が20％以上で比表面積が３m²／ｇ以上の
ものであることを意味し、SAA蛋白がゲル内に
侵入できるのに充分な大きさの細孔径とは、ゲル
の細孔径の目安としてよく用いられる排除限界分
子量が12000以上（球状蛋白質を用いてえられた
値）の大きさを意味する。さらにはゲル内へ
SAA蛋白が、拡散しやすくなることから排除限
界分子量が30万以上であることが好ましい。 一方、排除限界分子量が１億をこえるものは吸
着体の機械的強度が弱くなるかまたは吸着体の固
形分含量が小さすぎて充分な吸着容量がえられな
いなどの理由から実用に耐えなくなる傾向があ
る。したがつて排除限界分子量は１億以下が好ま
しく、さらには5000万以下が好ましい。排除限界
分子量とはたとえば「実験高速液体クロマトグラ
フイ」（波多野博行、花井俊彦共著、(株)化学同人
発行）などの成書に記載されているごとく、ゲル
浸透クロマトグラフイにおいて細孔内に侵入でき
ない、すなわち排除される分子のうち最も小さい
分子量を有するものの分子量をいう。 つぎに実施例に基づいて本発明の吸着体および
その製法をさらに詳細に説明するが、本発明はも
とよりこれらのみに限られるものではない。 参考例 両端に孔径15μｍのフイルターを装着したガラ
ス製円筒カラム（内径９mm、カラム流さ150mm）
にアガロースゲル（バイオラド（Biorado）社製
のBiogel A5ｍ、粒径50〜100メツシユ）、ポリマ
ー硬質ゲル（東洋曹達工業(株)製のトヨパール
HW65、粒径50〜100μｍ、およびチツソ(株)製のセ
ルロフアインGC−700、粒径45〜105μｍ）をそれ
ぞれ均一に充填し、ペリスタテイツクポンプによ
り水を流し、流量と圧力損失ΔPとの関係を求め
た。その結果を第１図に示す。 第１図の結果からポリマー硬質ゲルが圧力の増
加にほぼ比例して流量が増加するのに対し、アガ
ロースゲルは圧密化をひきおこし、圧力を増加さ
せても流量が増加しないことがわかる。 実施例 １ 多孔質セルロースゲルであるCKゲルＡ−３（商
品名、チツソ(株)製、球状蛋白質の排除限界分子量
5000万、粒径63〜125μｍ）100mlに水100ml、2N
水酸化ナトリウム水溶液53mlおよびエピクロルヒ
ドリン18mlを加え、40℃で２時間攪拌した。反応
後ゲルを濾別、水洗してエポキシ化CKゲルＡ−
３をえた。 えられたエポキシ化CKゲルＡ−３ 100mlにデ
キストラン硫酸ナトリウム46.5ｇと少量の水を加
えて完全に溶解したのち、さらに水を加えて全量
を177mlに調整した。2N水酸化ナトリウム水溶液
でPH9.2に調整したのち45℃で16時間静置した。
反応後ゲルを濾別し、水洗してデキストラン硫酸
固定化CKゲルＡ−３をえた。 えられたデキストラン硫酸固定化ゲル0.4mlを
試験管にとり、SAA蛋白を含むヒト血清2.4mlを
加えたのち、37℃で２時間振盪した。振盪後、上
澄み液のSAA蛋白の濃度を測定した。SAA蛋白
濃度の測定は以下のような固相酵素抗体法
（ELISA）により行なつた。すなわち、プレート
にまず希釈した抗SAA抗体（ヘキスト
（Hoechst）社製）を滴下し４℃で12時間静置す
ることによつてプレートに抗体を固定した。つぎ
に希釈した検体および標準血清を滴下し室温で３
時間静置することによつて抗原抗体反応を行な
い、ペルオキシターゼ標識抗SAA抗体を滴下し
同様に抗原抗体反応を室温で３時間行なつた。洗
浄後酵素発色反応を行ない、その発色の程度を
CS−930（商品名、(株)島津製作所製）により波長
492nｍで測定した。検体についての発色の程度
と標準血清についての発色の程度とを比較するこ
とにより、標準血清中のSAA蛋白の濃度を１と
したときの検体中のSAA蛋白濃度を求めた。ま
た選択性をみるためにHDLコレステロールの濃
度も測定した。 その結果を第１表に示す。 実施例 ２ CKゲルＡ−３ 100mlのかわりにCKゲルＡ−
22（商品名、チツソ(株)製、球状蛋白質の排除限界
分子量3000万、粒径53〜125μｍ）100mlを用いた
ほかは実施例１と同様にしてデキストラン硫酸固
定化CKゲルＡ−22をえた。 えられたデキストラン硫酸固定化ゲルを実施例
１と同様の方法にしたがつて処理し、SAA蛋白
およびHDL−コレステロールの濃度を測定した。 その結果を第１表に示す。 実施例 ３ 実施例１でえられたエポキシ化CKゲルＡ−３
100mlに、片末端アミノ基を有するポリアクリ
ル酸15.6ｇを加えたのち、水を加えて全量を156
mlにした。よく振りまぜたのち50℃で10時間静置
した。反応後ゲルを濾別し、ゲルを水洗してポリ
アクリル酸固定化CKゲルＡ−３をえた。 えられたポリアクリル酸固定化ゲルを実施例１
と同様の方法にしたがつて処理し、SAA蛋白お
よびHDL−コレステロールの濃度を測定した。 その結果を第１表に示す。 比較例 １ 実施例１でえられたデキストラン硫酸固定化
CKゲルＡ−３ 0.4mlのかわりに生理食塩水0.24
mlを用いたほかは実施例１と全く同様にしてえら
れた上澄み液のSAA蛋白およびHDL−コレステ
ロールの濃度を測定した。 その結果を第１表に示す。

【表】 第１表の結果から本発明の吸着体を用いると
SAA蛋白は吸着されるが、HDLはほとんど吸着
されていないことがわかる。 ［発明の効果］ 本発明の吸着体は安価であり、HDLを大きく
減少させることなく、体液中に含まれるSAA蛋
白を選択的に除去することができるという効果を
奏する。

【図面の簡単な説明】

第１図は３種類のゲルを用いて流速と圧力損失
との関係を調べた結果を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 水不溶性担体の表面の少なくとも一部にポリ
   アニオン化合物を有する血清アミロイドＡ蛋白用
   吸着体。 ２ 水不溶性担体が水酸基含有化合物より構成さ
   れてなる特許請求の範囲第１項記載の吸着体。 ３ ポリアニオン化合物が硫酸エステル基を含有
   する特許請求の範囲第１項記載の吸着体。 ４ ポリアニオン化合物が共有結合により水不溶
   性担体に固定されてなる特許請求の範囲第１項記
   載の吸着体。 ５ 硫酸エステル基含有化合物が硫酸化多糖であ
   る特許請求の範囲第３項記載の吸着体。 ６ 水不溶性担体が、30万〜5000万の排除限界分
   子量を有する特許請求の範囲第１項記載の吸着
   体。