DE3880647T2

DE3880647T2 - Sorbentmittel für Serum-Amyloid-Proteine.

Info

Publication number: DE3880647T2
Application number: DE88119263T
Authority: DE
Inventors: Fumiyasu Hirai; Nobutaka Tani
Original assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1987-11-20
Filing date: 1988-11-19
Publication date: 1993-11-18
Anticipated expiration: 2008-11-20
Also published as: EP0476721A2; US6037458A; EP0476721A3; DE3853219D1; EP0321703A1; DE3853219T2; EP0321703B1; DE3880647D1; EP0476721B1

Description

Die hier vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Entfernen von Serum-Amyloid-Protein (im folgenden als "SA"-Protein bezeichnet) aus Körperflüssigkeit und die Verwendung eines Sorbentmittels für Serum-Amyloid-Protein, das einen wasserunlöslichen Träger und eine spezifische Verbindung umfaßt die auf diesem Träger immobilisiert ist, um Serum-Amyloid-Protein aus Körperflüssigkeit zu entfernen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Entfernung von Serum-Amyloid-A-Protein (im folgenden als "SAA"-Protein bezeichnet) und Serum-Amyloid- P-Protein (im folgenden als "SAP"-Protein bezeichnet) aus Körperflüssigkeit.
Es gibt eine Amyloidose genannte Krankheit, die von schweren Störungen begleitet wird, z.B. Insuffizienzen von Organen wie Herz und Niere, Beeinträchtigung des Reizleitungssystems, fortschreitende Dementia, zerebrovaskuläre Leiden, Nervenleiden usw. Amyloidose wird durch eine Ablagerung von β-fibrillen-ähnlichem Amyloid in einem Blutgefäß, einem bestimmten Organ usw. verursacht. Es ist bekannt, daß es mehrere Arten von Amyloidose gibt, d.h. primäre Amyloidose, sekundäre Amyloidose, familiär auftretende Amyloidose und senile bzw. altersbedingte Amyloidose, und daß die Zusammensetzung von Proteinen, die Amyloidose verursachen, je nach der Art der Amyloidose verschieden ist.
Bei jeder Art von Amyloidose, mit Ausnahme in der Macula des Gehirns bei der Alzheimer'schen Krankheit oder bei Presbyophrenie Dementia senilis, kann eine Substanz, die als Amyloid-P-Protein (im folgenden als "AP"-Protein bezeichnet) bezeichnet wird, in einem Zustand aufgefunden werden, in dem sie mit einem β- fibrillen-ähnlichen Protein verknüpft ist.
Über die Struktur von AP-Protein wird berichtet, daß die Einheit als ein aus fünf Einheiten gebildetes Fünfeck ausgebildet ist, wobei die Untereinheit ein Molekulargewicht von 23 000 bis 25 000 aufweist und wobei die Struktur des AP-Proteins durch ein Paar der Einheit gebildet wird, das eine parallele Form ausbildet.
Durch verschiedene Verfahren wird bestätigt, daß das AP- Protein dasselbe ist wie SAP-Protein, das ein normales Serum- Protein ist. Demgemäß wird angenommen, daß AP-Protein SAP-Protein ist, das während der Zirkulation (Durchblutung) im Gewebe abgelagert wird, d.h., SAP-Protein ist ein dem AP-Protein entsprechender Vorläufer, obwohl die Funktion von AP-Protein im Körper und die Beziehung des Proteins zu anderen Amyloiden noch nicht vollständig geklärt ist. Es wird jedoch berichtet, daß AP-Protein ein unentbehrliches Protein für eine Amyloid-Fibrille ist. Es wird daher angenommen, daß die Ablagerung von SAP-Protein bei dem Entstehen von Amyloidose beteiligt ist.
Therapien für Amyloidose sind intensiv untersucht worden, da, wie zuvor beschrieben, Amyloidose eine schwere Erkrankung mit einer hohen Sterblichkeitsrate ist. Es wurde jedoch bislang keine wirksame Therapie, insbesondere keine wirksame Arzneimittelbehandlung, gefunden.
Andererseits wurde zur Behandlung von Amyloidose die Reinigung des Blutes durch extrakorporale Kreislaufbehandlung versucht, insbesondere durch Plasmapherese, und es gibt einige Berichte darüber, daß durch den Austausch von Blutplasma, das die zuvor erwähnten Vorläufer enthält, mit einer großen Menge normalen Plasmas, die Symptome abnehmen und das Fortschreiten der Schädigung aufgehalten wird.
Blutreinigung, insbesondere die Wiederzuführung von Blut nach Waschung in physiologischer Kochsalzlösung unter Ausscheiden des Blutplasmas, ist derzeit die wirksamste Therapie. Die zuvor genannte Blutreinigung hat jedoch den Nachteil, daß teures und wertvolles normales Plasma oder daß Plasma-Präparationen notwendig sind und daß beim Ausführen der Blutreinigung außer den Vorläufern, die im Plasma eines Patienten enthalten sind, gleichzeitig auch nützliche Komponenten entfernt werden. Es besteht daher ein starkes Bedürfnis, ein Verfahren zur selektiveren Entfernung von Vorläufern wie SAA-Protein und SAP-Protein zu entwickeln.
Aus der EP-A-0 232 875 und aus der EP-A-0 230 247 sind bereits Sorbentmittel zum Entfernen von Lipoproteinen bzw. komplementären Komponenten aus einer Flüssigkeit bekannt, die diese enthält, und zwar insbesondere aus einer Körperflüssigkeit. Diese Sorbentmittel, die zum Entfernen von Lipoproteinen mit einem Molekulargewicht in der Größenordnung von Millionen bzw. zum Entfernen komplementärer Komponenten mit einem Molekulargewicht von 100 000 bis 1 Million geeignet sind, sind jedoch nicht verwendbar, um Serum-Amyloid-Proteine mit einem Molekulargewicht von etwa 25 000 und völlig unterschiedlichen Eigenschaften zu entfernen.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, die zuvor genannten Probleme zu lösen und ein wirksames und preisgünstiges Verfahren zur selektiven Entfernung von SA-Proteinen bereitzustellen. Gegenstand der Erfindung ist insbesondere die Verwendung eines preisgünstigen Sorbentmittels für SAA-Protein, das SAA- Proteine selektiv entfernen kann, ohne dabei die HDL (Lipoproteine, hohe Dichte) zu entfernen, und eines preiswerten Sorbentmittels für SAP-Protein, das SAP-Proteine selektiv entfernen kann.
Gemäß einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Entfernen von Serum-Amyloid-Protein aus Körperflüssigkeit, das die Schritte umfaßt:
1) Vereinigen einer Körperflüssigkeit, die Serum-Amyloid- Protein enthält, mit einem Sorbentmittel für ein Serum-Amyloid- Protein, umfassend einen wasserunlöslichen Träger und eine auf diesem Träger immobilisierte Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Verbindung mit einer anionischen funktionellen Gruppe, einer polyanionischen Verbindung mit mehr als einer anionischen funktionellen Gruppe, Anilin und einem Anilinderivat,
2) Durchleiten der Körperflüssigkeit durch einen Filter, durch den das Sorbentmittel nicht hindurchlaufen kann, und
3) Wiedergewinnen der im wesentlichen Serum-Amyloid- Protein-freien Körperflüssigkeit.
Das erfindungsgemäß entfernte Serum-Amyloid-Protein ist vorzugsweise Serum-Amyloid-A-Protein oder Serum-Amyloid-P- Protein.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Sorbentmittel verwendet, die einen wasserunlöslichen Träger und eine polyanionische Verbindung mit mehr als einer anionischen funktionellen Gruppe umfassen, die auf dem Träger immobilisiert ist oder die einen wasserunlöslichen Träger und eine Verbindung umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Anilin und einem Anilinderivat, die auf dem Träger immobilisiert ist oder die einen wasserunlöslichen Träger und eine Verbindung mit einer anionischen funktionellen Gruppe umfassen, die auf dem Träger immobilisiert ist.
Gemäß einem zweiten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Sorbentmittels für ein Serum-Amyloid- Protein, das einen wasserunlöslichen Träger und eine Verbindung umfaßt, die auf diesem Träger immobilisiert ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Verbindung mit einer anionischen funktionellen Gruppe, einer polyanionischen Verbindung mit mehr als einer anionischen funktionellen Gruppe, Anilin und einem Anilinderivat, um Serum-Amyloid-Protein aus Körperflüssigkeit zu entfernen.
Das erfindungsgemäß verwendete Sorbentmittel ist insbesondere zum Entfernen oder Wiedergewinnen von Serum-Amyloid-A- Protein und Serum-Amyloid-P-Protein geeignet.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden und unter Bezugnahme auf Fig. 1 der beigefügten Zeichnung näher beschrieben.
Fig. 1 ist eine graphische Darstellung, die die Beziehung zwischen der Strömungsgeschwindigkeit und dem Druckabfall Δ P, die in dem später beschriebenen Bezugsbeispiel erhalten wird, zeigt.
In der vorliegenden Erfindung steht der Ausdruck "Körperflüssigkeit" für Blut, Plasma, Serum, Bauchwasser (Ascites), Lymphflüssigkeit, Synovia in Gelenkhöhlen, Fraktionen davon oder jede beliebige flüssige Bestandteile, die in einem lebenden Körper entstehen.
Der erfindungsgemäß verwendete wasserunlösliche Träger kann ein anorganischer Träger, ein organischer Träger, der aus einer synthetischen hochmolekularen Verbindung oder einem Polysaccharid besteht, und ein komplexer Träger, der aus einem organischen Träger und/oder einem anorganischen Träger besteht, sein, und zwar vom Standpunkt der Umgebung der SAA-Proteine aus gesehen, die in Blut vorhanden sind. Es ist bevorzugt, daß der Träger hydrophile Eigenschaften aufweist und außer für die gewünschten Stoffe nur geringe Adsorption, sog. nichtspezifische Adsorption, gegenüber Stoffen aufweist. Noch bevorzugter ist es, daß eine funktionelle Gruppe vorhanden ist, die auf dem Träger immobilisiert werden oder die auf einfache Weise aktiviert werden kann.
Typische Beispiele für die zuvor genannten funktionellen Gruppen sind eine Amino-Gruppe, eine Carboxyl-Gruppe, eine Hydroxyl-Gruppe, eine Thiol-Gruppe, eine Aldehyd-Gruppe, eine Halogen-Gruppe wie Chlor, eine Säureanhydrid-Gruppe, eine Amid- Gruppe, eine Ester-Gruppe, eine Epoxy-Gruppe, eine Silanol-Gruppe und eine Succinylimid-Gruppe.
In dem zuvor genannten Fall sind typische Vertreter von wasserunlöslichen Trägern, die in der vorliegenden Erfindung bevorzugt verwendet werden, beispielsweise anorganische Träger wie Glasbeads und Silica-Gel, organische Träger bestehend aus einer synthetischen hochpolymeren Verbindung wie quervernetztem Polyvinylalkohol, quervernetztem Polyacrylat oder quervernetztem Polyamid oder bestehend aus einem Polysaccharid wie quervernetzter Zellulose, kristalliner Zellulose, quervernetzter Agarose, quervernetztem Dextran, quervernetztem Chitin oder quervernetztem Chitosan, organisch-anorganisch komplexe Träger, wobei die Oberfläche des anorganischen Trägers, wie Glasbeads, mit einem Polysaccharid oder einer hochmolekularen Verbindung beschichtet ist, und organisch-organisch komplexe Träger, wobei die Oberfläche des organischen Trägers, der aus einer synthetischen hochmolekularen Verbindung besteht, mit Polysacchariden beschichtet sind. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht hierauf beschränkt. Von diesen Trägern sind wasserunlösliche Träger, die aus einer Verbindung bestehen, die eine Hydroxy- Gruppe enthält, aus der Sicht bevorzugt, daß sie eine gute Biokompatibilität und außer für die gewünschten Stoffe nur geringe Adsorption für andere Stoffe, sog. nichtspezifische Adsorption, aufweisen.
Obwohl der erfindungsgemäß verwendete wasserunlösliche Träger aus der Sicht der Umgebung der SAP-Proteine, die in der Körperflüssigkeit vorhanden sind, ein anorganischer Träger oder ein organischer Träger sein kann, ist es bevorzugt, daß der Träger geringe nichtspezifische Adsorption aufweist. Ein hydrophiler wasserunlöslicher Träger ist mehr bevorzugt als ein hydrophober, da ein hydrophiler Träger geringere nichtspezifische Adsorption aufweist, und ein wasserunlöslicher Träger, der aus einer Verbindung mit einer Hydroxy-Gruppe in ihrem Molekül besteht, ist noch mehr bevorzugt.
In dem zuvor genannten Fall sind typische Beispiele für wasserunlösliche Träger, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, weiche Träger wie Agarose, Dextran und Polyacrylamid, anorganische Träger wie poröses Glas und poröses Silica-Gel, poröse polymere harte Gele, die aus synthetischen hochmolekularen Verbindungen hergestellt sind wie Polymethylmethacrylat, Polyvinylalkohol und Styrol- Divinylbenzol-Copolymer und/oder einer natürlichen hochmolekularen Verbindung wie Zellulose.
Bezüglich der Entfernung oder Wiedergewinnung von SAA- Proteinen kann das erfindungsgemäß verwendete Sorbentmittel zum Entfernen von SAA-Proteinen aus einer Flüssigkeit verwendet werden, die verschiedene SAA-Proteine enthält, z.B. Blut, Blut- Serum, Blutplasma, verdünntes Blut, verdünntes Blut-Serum, verdünntes Blutplasma und eine Flüssigkeit wie die zuvor genannte Flüssigkeit, die einer Vorbehandlung wie der Entfernung von Blutzellen oder der Entfernung von Serum-Proteinen unterzogen wurden. Das Sorbentmittel kann auch als ein Sorbentmittel für extrakorporale Kreislaufbehandlung bei Patienten mit sekundärer Amyloidose verwendet werden. Wenn beispielsweise das erfindungsgemäß verwendete Sorbentmittel als ein Sorbentmittel für die extrakorporale Behandlung des Blutkreislaufes verwendet wird, ist das Sorbentmittel vorzugsweise ein Sorbentmittel, das eine ausreichende mechanische Festigkeit aufweist, um eine Verdichtung zu verhindern. D.h., das Sorbentmittel ist vorzugsweise ein "hartes" Sorbentmittel. Darüberhinaus ist es, obwohl die Mikrostruktur des erfindungsgemäß verwendeten Sorbentmittels porös oder nichtporös sein kann, bevorzugt, daß das Sorbentmittel einen großen spezifischen Oberflächenbereich aufweist, d.h. daß es eine poröse Struktur aufweist, insbesondere eine Struktur, die in allen Teilen gleichförmige Poren aufweist.
Wie in den folgenden Bezugsbeispielen angegeben ist, bedeutet in der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck "hart", daß die Beziehung zwischen dem Druckabfall und der Strömungsgeschwindigkeit, die bestimmt wird, indem man ein wäßriges Fluid durch eine zylindrische Säule leitet, die gleichförmig mit dem Sorbentmittel gefüllt ist, eine lineare Beziehung bleibt, bis der Druckabfall auf 0,03 MPa (0,3 kg/cm²) steigt. Der Ausdruck "porös" bedeutet in der vorliegenden Erfindung, daß das Porenvolumen nicht geringer ist als das scheinbare Volumen des Sorbentmittels und daß der spezifische Oberflächenbereich nicht weniger als 3 m²/g beträgt. Sorbentmittel, die den zuvor genannten Bedingungen nicht genügen, weisen eine zu geringe Adsorptionskapazität auf, um für die praktische Anwendung geeignet zu sein. Beispiele für Träger, die für das zuvor genannte erfindungsgemäße Sorbentmittel verwendet werden, sind z.B. poröse Vinylmaterialien wie poröses Zellulose-Gel, poröses Chitosan-Gel, Styrol-Divinylbenzol-Copolymer, quervernetzte Acrylate und quervernetzter Polyvinylalkohol; anorganische poröse Materialien, die aus Glas, Siliziumdioxid und Aluminiumoxid hergestellt sind.
Darüberhinaus ist es in dem Fall, daß das erfindungsgemäß verwendete Sorbentmittel eine poröse Struktur aufweist, erforderlich, daß die Poren eine Größe aufweisen, die ausreicht, daß SAA-Proteine mit einem Molekulargewicht von 12 000 leicht in die Poren eindringen können. Es ist daher wichtig, daß das Molekulargewicht der Ausschlußgrenze, die mit einem kugelförmigen Protein gemessen wird, nicht weniger als 12 000 beträgt. Sorbentmittel, die ein Molekulargewicht einer Ausschlußgrenze von weniger als 12 000 aufweisen, weisen gewöhnlich eine zu geringe Adsorptionskapazität auf und können für die praktische Anwendung nicht geeignet sein. Darüberhinaus ist es bevorzugt, daß das Sorbentmittel ein Molekulargewicht mit einer Ausschlußgrenze von nicht weniger als 3 x 10&sup5; aufweist, da SAA-Proteine leicht in solch ein Sorbentmittel eindiffundieren.
Andererseits ist ein Sorbentmittel mit einem Molekulargewicht mit einer Ausschlußgrenze von größer als 1 x 10&sup8; gewöhnlich für eine praktische Anwendung nicht geeignet, und zwar aus dem Grund, daß seine mechanische Festigkeit zu gering oder daß sein Feststoffgehalt zu niedrig ist, um eine ausreichende Adsorptionskapazität zu erreichen. Die Ausschlußgrenze des Molekulargewichts beträgt daher vorzugsweise nicht mehr als 1 x 10&sup8;, bevorzugter nicht mehr als 5 x 10&sup7;.
Der Ausdruck "das Molekulargewicht einer Ausschlußgrenze" bedeutet beispielsweise, wie in der Literatur, beispielsweise bei "Jikken Kosoku Ekitai Chromatography (Experimentelle Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie)" von Hiroyuki Hatano und Toshihiko Hanai, veröffentlicht von Kabushiki Kaisha Kagaku Dojin, beschrieben, das minimale Molekulargewicht eines Moleküls, bei dem es bei einer Gel-Permeations-Chromatographie eine Pore nicht mehr durchdringen kann, d.h. bei dem es ausgeschlossen wird. Daher ist ein Molekulargewicht mit einer Ausschlußgrenze von 1,2 x 10&sup4; bis 1 x 10&sup8; bevorzugt.
Auch was das Entfernen und Wiedergewinnen von SAP-Proteinen betrifft, weisen erfindungsgemäß verwendete wasserunlösliche Träger vorzugsweise poröse Strukturen auf, bevorzugter weisen sie kontinuierlich kleine Poren mit einem großen Durchmesser auf. D.h., es ist notwendig, daß SAP-Proteine leicht in den Träger eindringen, um wirksam SAP-Proteine zu adsorbieren, die aus zehn Untereinheiten gebildet sind und ein Molekulargewicht von 230 000 bis 250 000 aufweisen.
Als ein Standard für Porendurchmesser in porösen Trägern wird üblicherweise ein Molekulargewicht mit einer Ausschlußgrenze verwendet, ähnlich dem zuvor beschriebenen.
Daher weisen die hier verwendeten wasserunlöslichen porösen Träger vorzugsweise ein Molekulargewicht mit einer Ausschlußgrenze, von nicht weniger als 230 000 auf, die mit einem kugelförmigen Protein gemessen wurde. Darüberhinaus beträgt das Molekulargewicht der Ausschlußgrenze vorzugsweise nicht mehr als 1 x 10&sup8;, und bevorzugter nicht mehr als 5 x 10&sup7;, und zwar aus demselben Grunde wie zuvor erläutert.
Bezüglich einer porösen Struktur eines wasserunlöslichen Trägers ist eine Struktur, die gleichförmig in jedem Teil bzw. Bereich des Materials Poren aufweist, bevorzugter als eine Struktur, die nur auf der Oberfläche des Materials Poren aufweist. Und es ist bevorzugt, daß die Porosität des erfindungsgemäß verwendeten Materials nicht weniger als 20 % bezüglich der Adsorptionskapazität beträgt.
Wenn das Sorbentmittel, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, zur extrakorporalen Behandlung des Blutkreislaufes übernommen wird, ist es notwendig, eine Flüssigkeit mit einer hohen Viskosität, wie Blut oder Plasma, mit einer hohen Strömungsgeschwindigkeit fließen zu lassen. Es ist daher wünschenswert, einen harten, wasserunlöslichen Träger zu verwenden, der eine ausreichende mechanische Festigkeit aufweist, um die Verdichtung der Sorbentmittel in einer Säule zu verhindern.
D.h., der Ausdruck "hart" bedeutet, wie im folgenden Bezugsbeispiel gezeigt, ähnlich der vorherigen Beschreibung, daß die Beziehung zwischen Druckabfall und Strömungsgeschwindigkeit, die dadurch bestimmt wird, daß man ein wäßriges Fluid durch eine zylindrische Säule laufen läßt, die gleichförmig mit dem wasserunlöslichen Träger gefüllt ist, eine lineare Beziehung beibehält, bis der Druckabfall auf mindestens 0,03 MPa (0,3 kg/cm²) erhöht wird.
Die Form eines wasserunlöslichen Trägers kann beliebig ausgewählt werden aus Formen wie Teilchen, Kugeln, Fasern, Plättchen und Hohlfasern. Wenn ein wasserunlöslicher Träger in Teilchenform verwendet wird, beträgt die Teilchengröße vorzugsweise von 1 bis 5 000 um. Wenn die Teilchengröße weniger als 1 um beträgt, wird der Druckabfall groß, und wenn die Teilchengröße über 5 000 um beträgt, wird die Kapazität gering.
In der vorliegenden Erfindung kann jede polyanionische Verbindung ohne besondere Einschränkung verwendet werden, solange die funktionellen Gruppen bei einem pH-Wert uni den Neutralitätspunkt negativ geladen sind.
Typische Beispiele für die polyanionischen Verbindungen sind beispielsweise eine synthetische polyanionische Verbindung wie Polyacrylsäure, Polyvinylsulfonsäure, Polyvinylphosphorsäure, Polystyrolsulfonsäure, Polystyrolphosphorsäure, Polyglutaminsäure, Polyasparaginsäure, Polymethacrylsäure, Polyphosphorsäure oder ein Styrol-Maleinsäure-Copolymer, ein Polysaccharid mit anionischen funktionellen Gruppen wie Heparin, Dextransulfat, Chondroitin, Chondroitinsulfat, Chitin oder Chitosan. Von diesen werden bevorzugt polyanionische Verbindungen mit Sulfatgruppe verwendet.
Es können verschiedene Verfahren verwendet werden, um eine polyanionische Verbindung einzuführen, um die polyanionische Verbindung auf zumindest einem Teil der Oberfläche eines wasserunlöslichen Trägers zu immobilisieren. Ein Immobilisierungsverfahren, in dem eine starke kovalente Bindung gebildet wird, ist bevorzugt.
Als eine Verbindung mit Sulfatgruppe ist unter den polyanionischen Verbindungen eine Verbindung bevorzugt, die außer der Sulfatgruppe eine funktionelle Gruppe aufweist, die zur Immobilisierung auf dem wasserunlöslichen Träger verwendbar ist. Darunter sind partiell sulfierte mehrwertige Alkohole und insbesondere sulfierte Saccharide (sulfierte Polysaccharide) bevorzugt, da sie nicht nur sowohl die für die Immobilisierung notwendige Sulfatgruppe und die funktionelle Gruppe aufweisen, sondern auch eine hohe Biokompatibilität und Aktivität, und darüberhinaus können sie auf einfache Weise auf dem wasserunlöslichen Träger immobilisiert werden. Auch was andere polyanionische Verbindungen betrifft, sind Verbindungen, die außer anionischen funktionellen Gruppen eine funktionelle Gruppe aufweisen, die zur Immobilisierung verwendbar ist, bevorzugt. Darüberhinaus ist ein Sorbentmittel für ein SAA-Protein, das einen wasserunlöslichen Träger und mehr als eine anionische funktionelle Gruppe umfaßt, die auf dem Träger immobilisiert ist, besonders zum Entfernen und Wiedergewinnen von SAA-Protein geeignet.
Beispiele für Anilin-Derivate in Anilin und/oder Anilin-Derivaten, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind N-Monoalkylaniline wie N-Methylanilin und N-Ethylanilin, aromatische alkylsubstituierte Aniline wie o-Toluidin, m-Toluidin, p-Toluidin, 2,3-Nylidin und 2,4-Xylidin, aromatische alkoxysubstituierte Aniline wie o-Aminoanisol, m-Aminophenetol, p- Aminoanisol, 2-Aminophenetol, 3-Aminophenetol und 4- Aminophenetol, Aniline mit einer oder mehreren substituierten Gruppen, bestehend aus einer oder mehreren Arten von am aromatischen Ring substituierten Gruppen, z.B. o-Chloranilin, m- Chloranilin, p-Chloranilin, o-Nitroanilin, m-Nitroanilin, p- Nitroanilin, 2,4-Dinitroanilin, 2,6-Dinitroanilin, 3,5- Dinitroanilin, o-Aminobenzoesäure, m-Aminobenzoesäure, Natrium- p-Aminobenzoat, Ethyl-o-Aminobenzoat, Ethyl-m-Aminobenzoat, Ethyl-p-Aminobenzoat, o-Aminobenzolsulfonsäure, m- Aminobenzolsulfonsäure, p-Aminobenzolsulfonsäure, Natrium-p- Aminobenzolsulfat, p-Aminobenzolsulfonamid, o-Aminophenol, m-Aminophenol, p-Aminophenol, o-Aminophenethylalkohol, p- Aminophenethylalkohol, o-Phenylendiamin, m-Phenylendiamin, p-Phenylendiamin, 2-Aminotoluol-5-sulfonsäure, 3- Aminotoluol-6-sulfonsäure, 4-Amino-3-nitrobenzolsulfonsäure, Natrium-2-Amino-5-nitrobenzolsulfat, 2-Amino-4-nitroanisol und 2-Amino-4-nitrotoluol.
Wenn Anilin und die zuvor genannten Anilin-Derivate verwendet werden, können sie einzeln oder zu mehreren verwendet werden.
Zum Immobilisieren von Anilin und/oder Anilin-Derivaten auf dem wasserunlöslichen Träger können verschiedene bekannte Verfahren ohne besondere Einschränkung verwendet werden.
D.h., es können physikalische, Ionen-bindende oder kovalent bindende Verfahren verwendet werden. Da es entscheidend ist, daß das immobilisierte Anilin und/oder das immobilisierte Anilin-Derivat fast nicht freigesetzt werden, wird das kovalente Bindungsverfahren, bevorzugt angewendet, das eine feste Bindung bildet. Bei den anderen angewandten Verfahren ist es bevorzugt, die Freisetzung zu verhindern. Sofern notwendig, kann ein Spacer zwischen den wasserunlöslichen Träger und das Anilin und/oder Anilin-Derivat eingeführt werden.
Ein Sorbentmittel für SAA-Protein, das einen wasserunlöslichen Träger und eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Anilin und einem Anilin-Derivat, umfaßt, die auf dem Träger immobilisiert ist, ist zum Entfernen oder Wiedergewinnen von SAA-Proteinen besonders geeignet.
Beispiele von Anilin-Derivaten, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind z.B. N-Monoalkylaniline wie N-Methylanilin und N-Ethylanilin, aromatische alkyl- substituierte Aniline wie o-Toluidin, m-Toluidin, p-Toluidin, 2,3-Xylidin und 2,4-Xylidin, aromatische alkoxy-substituierte Aniline wie o-Aminoanisol, m-Aminoanisol, p-Aminoanisol, 2- Aminophenetol, 3-Aminophenetol und 4-Aminophenetol, Aniline mit einer oder mehreren substituierten Gruppen, bestehend aus einer oder mehrerer Arten von am aromatischen Ring substituierten Gruppen, z.B. o-Chloranilin, m-Chloranilin, p-Chloranilin, o- Nitroanilin, m-Nitroanilin, p-Nitroanilin, 2,4-Dinitroanilin, 2,6-Dinitroanilin, 3,5-Dinitroanilin, o-Aminobenzoesäure, m- Aminobenzoesäure, p-Aminobenzoesäure, Ethyl-o-aminobenzoat, Ethly-m-aminobenzoat, Ethyl-p-aminobenzoat, p-Aminobenzolsulfonamid, o-Aminophenol, m-Aminophenol, p-Aminophenol, o- Aminophenethylalkohol, p-Aminophenethylalkohol, o-Phenylendiamin, m-Phenylendiamin, p-Phenylendiamin, 2-Amino-4-nitroanisol und 2-Amino-4-nitrotoluol.
Das erfindungsgemäß verwendete Sorbentmittel schließt auch ein Sorbentmittel ein, das einen wasserunlöslichen Träger und auf dem Träger immobilisierte Verbindungen, die anionische funktionelle Gruppen aufweisen, umfaßt.
In der vorliegenden Erfindung können jegliche anionische funktionelle Gruppen verwendet werden, solange die funktionellen Gruppen bei einem pH-Wert um den Neutralitätspunkt negativ geladen sind. Typische Beispiele für anionische funktionelle Gruppen sind z.B. Carboxyl-Gruppe, Sulfonsäure-Gruppe, Sulfonat-Gruppe, Sulfat-Gruppe, Silanol-Gruppe, Phosphat-Gruppe und phenolische Hydroxyl-Gruppe.
Von diesen sind die Carboxyl-Gruppe, die Sulfonsäure-Gruppe, die Sulfat-Gruppe, die Phosphat-Gruppe deswegen bevorzugt, weil sie eine ausgezeichnete Affinität zu SAP-Proteinen aufweisen.
Als Verbindung mit der anionischen funktionellen Gruppe kann sowohl eine monoanionische Verbindung verwendet werden, die eine anionische funktionelle Gruppe in ihrem Molekül aufweist, als auch eine polyanionische Verbindung, die mehr als eine anionische funktionelle Gruppe aufweist. Polyanionische Verbindungen sind bevorzugt, weil sie eine ausgezeichnete Affinität zu SAP- Proteinen aufweisen, und viele der anionischen funktionellen Gruppen können auf einfache Weise in eine Einheit auf dem porösen Material eingeführt werden. Polyanionische Verbindungen mit einem Molekulargewicht von nicht weniger als 1 000 sind vom Standpunkt der Affinität und der Quantität der eingeführten anionischen funktionellen Gruppen besonders bevorzugt. Die anionischen funktionellen Gruppen in einer polyanionischen Verbindung können gleich oder verschieden sein.
Typische Beispiele für die polyanionischen Verbindungen sind z.B. synthetische polyanionische Verbindungen wie Polyacrylsäure, Polyvinylschwefelsäure, Polyvinylsulfonsäure, Polyvinylphosphorsäure, Polystyrolsulfonsäure, Polystyrolphosphorsäure, Polyglutaminsäure, Polyasparaginsäure, Polymethacrylsäure, Polyphosphorsäure oder ein Styrol- Maleinsäure-Copolymer, ein Polysaccharid mit anionischen funktionellen Gruppen wie Heparin, Dextransulfat, Chondroitin, Chondroitinsulfat, Phosphomannan, Chitin oder Chitosan.
Es können sowohl gleiche als auch verschiedene Arten von Verbindungen mit anionischen funktionellen Gruppen auf dem erfindungsgemäß verwendeten Sorbentmittel immobilisiert werden.
Das erfindungsgemäß verwendete Sorbentmittel ist in einem Zustand, daß Verbindungen mit anionischen funktionellen Gruppen auf einem wasserunlöslichen Träger immobilisiert werden. Um einen solchen Zustand zu erhalten, bei dem Verbindungen mit anionischen funktionellen Gruppen immobilisiert werden, gibt es verschiedene Verfahren zum Einführen der anionischen funktionellen Gruppen in das Sorbentmittel, wobei jedes Verfahren erfindungsgemäß angewendet werden kann. Beispiele für Verfahren zum Einführen der anionischen funktionellen Gruppen in das Sorbentmittel sind z.B. veranschaulicht
(1) ein Verfahren, in dem Monomere oder quervernetzende Mittel, die die anionische funktionelle Gruppe oder eine Gruppe aufweisen, die in der Lage ist, leicht in die anionische funktionelle Gruppe zu konvertieren, polymerisiert werden, um das Sorbentmittel zu bilden,
(2) ein Verfahren, in dem die die anionische funktionelle Gruppe enthaltende Verbindung auf einem wasserunlöslichen Träger immobilisiert wird, und
(3) ein Verfahren, in dem eine Verbindung, die in der Lage ist, die anionische funktionelle Gruppe zu bilden, direkt mit einem Wasserunlöslichen Träger umgesetzt wird, um eine Verbindung mit der anionischen funktionellen Gruppe auf dem wasserunlöslichen Träger zu immobilisieren.
Selbstverständlich kann auch eine anionische funktionelle Gruppen enthaltende Verbindung, die selbst eine anionische funktionelle Gruppe aufweist, wie Glas, Siliziumdioxid und Aluminiumoxid, als Sorbentmittel verwendet werden.
In dem Verfahren (1) sind Beispiele für die Monomeren oder für die quervernetzenden Mittel, die die anionische funktionelle Gruppe oder eine Gruppe aufweisen, die in der Lage ist, sich leicht in die anionische funktionelle Gruppe umzuwandeln, z.B. Acrylsäure, Acrylsäureester, Methacrylsäure, Methacrylsäureester und Styrolsulfonsäure.
In dem Verfahren (2) wird die die anionische funktionelle Gruppe enthaltende Verbindung auf dem wasserunlöslichen Träger durch ein beliebiges Verfahren immobilisiert, z.B. durch physikalische Adsorption, durch ionische Bindung und durch kovalente Bindung. Wenn das Sorbentmittel für eine medizinische Behandlung verwendet wird, ist es wichtig, daß die anionischen funktionellen Gruppen während der Sterilisation oder der Behandlung nicht von dem Sorbentmittel eliminiert werden. Demgemäß ist es für die zuvor genannten Zwecke wünschenswert, das Sorbentmittel zu verwenden, das durch das Verfahren erhalten wird, das in der Lage ist, eine kovalente Bindung zu bilden, die wiederum in der Lage ist, die funktionelle Gruppe auf dem Träger fest zu binden.
Wenn die Verbindung mit einer anionischen funktionellen Gruppe auf dem wasserunlöslichen Träger durch eine kovalente Bindung immobilisiert wird, ist es bevorzugter, eine Verbindung zu verwenden, die außer der anionischen funktionellen Gruppe eine weitere funktionelle Gruppe aufweist, die zur Immobilisierung auf dem Träger verwendet werden kann.
Beispiele für die funktionelle Gruppe, die zur Immobilisierung verwendet werden kann, sind z.B. Amino-Gruppe, Amid-Gruppe, Carboxyl-Gruppe, Säureanhydrid-Gruppe, Succinylimid, Hydroxyl-Gruppe, Thiol-Gruppe, Aldehyd-Gruppe, Halogen-Gruppe, Epoxy-Gruppe und Silanol-Gruppe.
Es gibt viele Verbindungen, die sowohl die anionischen funktionellen Gruppen und die zuvor genannten funktionellen Gruppen aufweisen, die zur Immobilisierung verwendet werden können. Als Beispiele für diese Verbindungen werden Taurin, Sulfanilsäure, Glycin, Phosphorylethanolamin und L-Tyrosin genannt.
Als Verbindungen, die unter den anionischen funktionellen Gruppen eine Sulfat-Gruppe enthalten, werden als Beispiele Schwefelsäureester von Hydroxyl-Gruppen enthaltenden Verbindungen wie Alkohol, Sacchariden und Glycol genannt. Unter den zuvor genannten Verbindungen, die anionische funktionelle Gruppen enthalten, sind partiell sulfierte mehrwertige Alkohole und insbesondere sulfatierte Saccharide bevorzugt da die Schwefelsäureester nicht nur Sulfat-Gruppen und die für die Immobilisierung notwendige funktionelle Gruppe aufweisen, sondern auch eine hohe Biokompatibilität und Aktivität zeigen. Ein sulfatiertes Polysaccharid ist besonders bevorzugt, da es leicht auf dem wasserunlöslichen Träger immobilisiert werden kann.
Ein typisches Beispiel des Verfahrens (3) d.h. einem Verfahren, in dem eine Verbindung, die in der Lage ist, die anionische funktionelle Gruppe zu bilden, direkt mit einem Wasserunlöslichen Träger umgesetzt wird, um die anionische funktionelle Gruppe in den Träger einzuführen, ist beispielsweise ein Verfahren, in dem eine Sulfat-Gruppe in einen Träger mit einer Hydroxyl-Gruppe eingeführt wird. In einem solchen Fall kann die Sulfat-Gruppe direkt in das Sorbentmittel eingeführt werden, indem ein Reagens wie Chlorsulfonsäure oder konzentrierte Schwefelsäure mit dem Wasserunlöslichen Träger, der Hydroxyl-Gruppen aufweist, umgesetzt wird.
Das Sorbentmittel, das einen wasserunlöslichen Träger und anionische funktionelle Gruppen umfaßt, die auf dem Träger immobilisiert sind, ist insbesondere zum Entfernen oder Wiedergewinnen von SAP-Proteinen geeignet.
Eine erfindungsgemäße Form kann aus beliebigen Formen wie Teilchen, Fasern, Plättchen und Hohlfasern ausgewählt werden. Und die Mikrostruktur des Sorbentmittel kann porös oder nichtporös sein. Das erfindungsgemäße Sorbentmittel weist jedoch vorzugsweise einen großen spezifischen Oberflächenbereich auf, d.h. es hat eine poröse Struktur, um eine hohe Adsorbierbarkeit pro Einheit zu erreichen.
Es gibt verschiedene Verfahren zum Entfernen von SA- Proteinen, insbesondere SAA-Proteinen und SAP-Proteinen aus Körperflüssigkeit, und jedes Verfahren kann verwendet werden.
Ein Verfahren zum Entfernen eines Serum-Amyloid-Proteins, das das Leiten von Körperflüssigkeit, die ein Serum-Amyloid- Protein enthält, durch eine Entfernungsvorrichtung umfaßt, wobei diese Vorrichtung einen Behälter umfaßt, der einen Flüssigkeitseinlaß und einen Flüssigkeitsauslaß, mindestens einen Filter, durch den eine Flüssigkeit und in der Flüssigkeit enthaltene Komponenten hindurchgehen können, während das Sorbentmittel der vorliegenden Erfindung an der Seite des Flüssigkeitsauslaßes nicht hindurchgehen kann, aufweist, und das Sorbentmittel in diesen Behälter gepackt ist, ist bevorzugt, weil dieses Verfahren bequem ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können SA-Proteine, insbesondere SAA-Proteine und SAP-Proteine selektiv aus Körperflüssigkeit entfernt werden, ohne die HDL (Lipoproteine hoher Dichte) stark herabzusetzen. Außerdem kann das Sorbentmittel zu einem niedrigen Preis bereitgestellt werden.
Die vorliegende Erfindung wird durch das folgende Bezugsbeispiel, die Herstellungsbeispiele, Beispiele und Vergleichsbeispiele, in denen alle Prozentangaben Gew.% bedeuten, wenn nicht anders angegeben, näher beschrieben und erläutert.

Bezugsbeispiel

Es wurde eine Beziehung zwischen der Strömungsgeschwindigkeit und dem Druckabfall ΔP bestimmt, indem Wasser mittels einer peristaltischen Pumpe durch Zylindrische Glassäulen geleitet wurde, die an beiden Enden mit Filtern ausgestattet waren, die eine Porengröße von 15 um (innerer Durchmesser: 9 mm, Säulenlänge 150 mm) aufwiesen, die mit einem Agarose-Gel (Biogel A5m, hergestellt von Biorado Co., Teilchengröße 0,30 bis 0,15 mm (50 bis 100 Mesh)), einem polymeren Hart-Gel (Toyopearl HW 65, hergestellt bei TOSOH CO., LTD., Teilchengröße: 50 bis 100 um) bzw. einem porösen Zellulose-Gel (Cellulofine GC 700, hergestellt bei Chisso Corporation, Teilchengroße 45 bis 105 um) gepackt waren. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt.
Wie in Fig. 1 gezeigt ist, ist die Steigerung der Strömungsgeschwindigkeit nahezu proportional zu derjenigen des Druckabfalls im Falle von Hart-Gelen, z.B. Toyopearl und Cellulofine, wogegen im Falle von Weich-Gelen, d.h. dem Agarose-Gel, Verfestigung stattfindet und die Strömungsgeschwindigkeit auch nicht ansteigt, wenn der Druckabfall ansteigt.

Herstellungsbeispiel 1

Zu 100 ml eines porösen Zellulose-Gels (erhältlich unter dem Handelsnamen "CK-Gel A3", hergestellt von Chisso Corporation, Anschlußgrenze für kugelförmige Proteine: 5 x 10&sup7;, Teilchengröße: 63 bis 125 um) wurden 100 ml Wasser, 53 ml 2N wäßrige Natriumhydroxidlösung und 18ml Epichlorhydrin gegeben, und die Mischung wurde 2 Stunden lang bei 40 ºC gerührt. Nachdem die Reaktion beendet war, wurde das Gel von dem Reaktionsgemisch abfiltriert und mit Wasser gewaschen, wobei ein epoxydiertes CK-Gel A3 erhalten wurde.

Beispiel 1

Nachdem 46,5 g Natriumdextransulfat und eine kleine Menge Wasser zu 100 ml des erhaltenen epoxydierten CK-Gels A3 gegeben wurden, um das Gel sorgfältig aufzulösen, wurde Wasser dazugegeben, so daß die Gesamtmenge auf 177 ml eingestellt war. Das Gemisch wurde auf einen pH von 9,2 eingestellt, indem eine 2N wäßrige Lösung von Natriumhydroxid zugegeben wurde und 16 Stunden bei 45 ºC stehengelassen. Nachdem die Reaktion beendet war, wurde das Gel von dem Reaktionsgemisch abfiltriert, mit Wasser gewaschen, wobei ein CK-Gel A3 mit immobilisiertem Dextransulfat erhalten wurde.
0,4 ml des Gels mit dem iinmobilisierten Dextransulfat wurden in ein Teströhrchen gegeben, in das 2,4 ml Human-Serum, das SAA-Protein enthielt, gegeben wurden. Nachdem das Gemisch 2 Stunden lang bei 37 ºC geschüttelt wurde, wurde die Konzentration von SAA-Protein in dem Überstand gemessen. Um die Selektivität des Sorbentmittels zu untersuchen, wurde die Konzentration von HDL-Cholesterin in dem Überstand ebenfalls gemessen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben.

[Meßung der Konzentration von SAA-Protein]

Die Konzentration von SAA-Protein in dem Überstand wurde gemäß dem Enzymimmunoassay (ELISA-Verfahren) gemessen. Dabei wird ein verdünnter Antikörper gegen SAA (erhältlich von Hoechst Corporation) auf eine Platte getropft und der Antikörper auf der Platte fixiert, indem man die Platte 12 Stunden lang bei 4 ºC stehenläßt.
Eine verdünnte Probe bzw. ein Standard-Serum werden auf die Platten getropft, und die Antigen-Antikörper-Reaktion wird hervorgerufen, indem man die Platten 3 Stunden lang bei Raumtemperatur stehenläßt. Dann wird ein mit Peroxidase konjugierter Anti-SAA-Antikörper zu den Platten gegeben, um 3 Stunden lang bei Raumtemperatur die Antigen-Antikörper-Reaktion durchzuführen. Nachdem die Platte gewaschen wurde, wird die Enzymreaktion durchgeführt und die Absorption mittels eines Farb-Scanners ("CS-930", hergestellt von Shimadzu Corporation) bei einer Wellenlänge von 492 um gemessen. Die Konzentration von SAA- Protein in der Probe wird aus den Ergebnissen der Messungen der Probe und des Standard-Serums erhalten, wobei der Wert der Konzentration von SAA in dem Standard-Serum als 1 angesehen wird.

Herstellungsbeispiel 2

Das Verfahren des Herstellungsbeispiels 1 wird wiederholt, mit der Ausnahme, daß 100 ml eines porösen Zellulose-Gels (erhältlich unter dem Handelsnamen "CK-Gel A22", hergestellt von Chisso Corporation, Ausschlußgrenze für kugelförmige Proteine: 3 x 10&sup7;, Teilchengröße: 53 bis 125 um) anstelle von CK-Gel A3 verwendet wurde, wobei das epoxydierte CK-Gel A22 erhalten wurde.

Beispiel 2

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß das epoxydierte CK-Gel A22, das in Herstellungsbeispiel 2 erhalten wurde, verwendet wurde, um das CK-Gel A22 mit immobilisiertem Dextransulfat zu erhalten.
Das erhaltene CK-Gel A22 mit immobilisiertem Dextransulfat wurde in derselben Weise behandelt wie in Beispiel 1 und die Konzentrationen von SAA-Protein und HDL-Cholesterin wurden auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 gemessen
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben.

Beispiel 3

Zu 100 ml des epoxydierten CK-Gel A3, das in Herstellungsbeispiel 1 erhalten wurde, wurden 15,6 g Polyacrylsäure gegeben, die an einer Seite des Polymerendes eine Amino-Gruppe aufweist, und dazu wurde Wasser gegeben, wobei eine Lösung mit einer Gesamtmenge von 156 ml erhalten wurde. Danach wurde die Lösung durch Schütteln sorgfältig gemischt und 10 Stunden lang bei 50 ºC stehengelassen. Nachdem die Reaktion beendet war, wurde das Gel von dem Reaktionsgemische abfiltriert und mit Wasser gewaschen, wobei ein CK-Gel A3 mit immobilisierter Polyacrylsäure erhalten wurde.
Das erhaltene Gel mit der immobilisierten Polyacrylsäure wurde auf die gleiche Weise behandelt wie in Beispiel 1, und die Konzentrationen von SAA-Protein und HDL-Cholesterin wurden auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben.

Vergleichsbeispiel 1

Es wurde ein Überstand auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 erhalten, mit der Ausnahme, daß 0,24 ml einer physiologischen Kochsalzlösung anstelle von 0,4 ml des CK-Gel A3 mit dem immobilisierten Dextransulfat verwendet wurde. Die Konzentrationen von SAA-Protein und HDL-Cholesterin in dem Überstand wurden auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1 Beispiel Nr. Konzentration des SAA-Proteins (wobei die Konzentration von SAA-Protein in dem Standard-Serum als 1 angesehen wird) Konzentration von HDL-Cholesterin (mg/dl) Vergleichsbeispiel
Die in Tabelle 1 angegebenen Ergebnisse bestätigen, daß, wenn das erfindungsgemäße Sorbentmittel verwendet wird, HDL kaum adsorbiert wird, während SAA-Protein adsorbiert wird.

Herstellungsbeispiel 3

Zu 10 ml CK-Gel A3 werden 10 ml Wasser zugefügt, 5,4 ml einer 2N wäßrigen Lösung von Natriumhydroxid und 1,9 ml Epichlorhydrin, und das Gemisch wurde 2 Stunden lang bei 40 ºC gerührt. Nachdem die Reaktion beendet war, wurde das Gel von dem Reaktionsgemisch abfiltriert und mit Wasser gewaschen, wobei ein epoxydiertes Gel erhalten wurde.

Beispiel 4

Nachdem 8 ml Wasser und 120 mg Anilin zu 10 ml des so erhaltenen epoxydierten Gels gegeben wurden, wurde die Mischung sorgfältig gemischt und umgesetzt, indem man 6 Stunden lang bei 50 ºC stehenließ. Nachdem die Reaktion beendet war, wurde das Gel von dem Reaktionsgemisch abfiltriert und mit Wasser gewaschen, wobei ein Gel mit immobilisiertem Anilin erhalten wurde.
0,4 ml des Gels mit immobilisiertem Anilin wurden in ein Teströhrchen gegeben, in das 2,4 ml Human-Serum, das SAA-Protein enthielt, zugegeben wurden. Nachdem das Gemisch 2 Stunden lang bei 37 ºC geschüttelt wurde, wurden die Konzentrationen von SAA-Protein und HDL-Cholesterin in dem Überstand auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben.

Beispiel 5

Zu 10 ml des in Herstellungsbeispiel 3 erhaltenen epoxydierten Gels wurden 10 ml Wasser und 57 mg Hexamethylendiamin gegeben und das Gemisch wurde sorgfältig gemischt. Das Gemisch wurde umgesetz, indem man es 2 Tage lang bei 40ºC stehenließ. Nachdem die Reaktion beendet war, wurde das Gel von dem Reaktionsgemisch abfiltriert und mit Wasser gewaschen, wobei ein aminiertes Gel (im folgenden "N-Gel" genannt) erhalten wurde.
Nachdem 10 ml des so erhaltenen N-Gels auf einem Glasfilter gewaschen wurden, und zwar zunächst mit 50 ml einer 10 % (Volumen %) Lösung von Triethylamin in Dioxan und danach mit 100 ml Dioxan, wurde das Gel in einen Reaktor gegeben. Es wurden 90 mg Benzoesäure in 25 ml Dioxan in den Reaktor gegeben, und 100 mg Dicyclohexylcarbodiimid in 2 ml Dioxan wurde unter Rühren zugegeben. Nachdem das Gemisch 3 Stunden lang unter Rühren umgesetzt wurde, wurden 100 mg Dicyclohexylcarbodiimid in 2 ml Dioxan zugegeben, dann wurde die Reaktion 3 Stunden lang unter Rühren fortgesetzt. Nachdem die Reaktion beendet war, wurde das Gel von dem Reaktionsgemisch abfiltriert und der Reihe nach mit Dioxan, Methanol, Dioxan und Wasser gewaschen, wobei ein N-Gel mit immobilisierter Benzoesäure erhalten wurde.
Das erhaltene Gel wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 behandelt und die Konzentrationen von SAA-Protein und HDL-Cholesterin wurden auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben.

Vergleichsbeispiel 2

40 mg n-Octylamin wurden zu 10 ml des in Herstellungsbeispiel 4 erhaltenen epoxydierten Gels gegeben, und die Reaktion wurde ausgeführt, indem man das Gemisch 6 Tage lang bei Raumtemperatur in einer 50 %igen (Volumen-%) wäßrige Lösung von Ethanol stehenließ. Nachdem die Reaktion beendet war, wurde das Gel von dem Reaktionsgemisch abfiltriert und sorgfältig mit 50 % (Volumen-%) wäßriger Lösung von Ethanol und mit Wasser gewaschen, wobei ein Gel mit immobilisiertem n-Octylamin erhalten wurde.
Das erhaltene Gel wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 behandelt, und die Konzentrationen von SAA-Protein und HDL- Cholesterin wurden auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 gemessen
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben.

Vergleichsbeispiel 3

Ein Überstand wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 erhalten, mit der Ausnahme, daß 0,24 ml einer Physiologischen Kochsalzlösung anstelle des in Beispiel 4 erhaltenen Gels mit dem immobilisierten Anilin verwendet wurde. Bezüglich des erhaltenen Überstands wurden die Konzentrationen von SAA-Protein und HDL- Cholesterin auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2 Beispiel Nr. Konzentration des SAA-Proteins (wobei die Konzentration von SAA-Protein in dem Standard-Serum als 1 angesehen wird) Konzentration von HDL-Cholesterin (mg/dl) Vergleichsbeispiel
Die in Tabelle 2 angegebenen Ergebnisse bestätigen, daß, wenn das erfindungsgemäße Sorbentmittel verwendet wird, HDL kaum adsorbiert wird, während SAA-Protein adsorbiert wird.

Beispiel 6

Zu 5 ml des in Herstellungsbeispiel 1 erhaltenen epoxydierten Gels wurde eine Lösung gegeben, die durch Auflösen von 0,17 g Sulfanilsäure in 10 ml Wasser und Einstellen des pH-Werts auf 9,9 hergestellt wurde, gegeben, und das Gemisch wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur geschüttelt. Nicht umgesetze Epoxy-Gruppen in dem Gel wurden blockiert, indem eine 0,5 %ige wäßrige Lösung von Monoethanolamin zu dem Gel gegeben und geschüttelt wurde, wobei ein Zellulose-Gel mit immobilisierter Sulfanilsäure erhalten wurde.

Beispiel 7

Zu 5 ml des in Herstellungsbeispiel 1 erhaltenen epoxydierten Gels wurden 4 g Natriumdextransulfat (Molekulargewicht: etwa 5 000, Schwefelgehalt 18 %) und 5 ml Wasser gegeben. Der pH des Gemisches wurde auf pH 9 eingestellt und das Gemisch wurde 16 Stunden lang bei 45 ºC geschüttelt. Danach wurde das Gel von dem Reaktionsgemisch abfiltriert und gewaschen, und zwar zunächst mit einer 2 M wäßrigen Lösung von Natriumchlorid und danach mit einer 0,5 M wäßrigen Lösung von Natriumchlorid und schließlich mit Wasser. Nicht umgesetzte Epoxy-Gruppen in dem Gel wurden blockiert, indem eine 0,5 %ige wäßrige Lösung von Monoethanolamin zu dem Gel gegeben und geschüttelt wurde, wobei ein Zellulose-Gel mit iinmobilisiertem Dextransulfat erhalten wurde.

Herstellungsbeispiel 4

Es wurde eine Suspension aus 40 ml CK-Gel A3 in Heptan mit einem Gesamtvolumen von 70 ml hergestellt. Zu der Suspension wurden 10 ml 20 % NaOH und 40 Tropfen (2,0 ml) des nichtionischen Surfactants TWEEN 20 (ein handelsübliches Polyoxyethylensorbitmonolaurat, hergestellt von Bio-Rad Laboratories) gegeben, und das Gemisch wurde 30 Minuten lang bei 40 ºC geschüttelt. Dann wurden 10 ml Epichlorhydrin zugegeben und das Gemisch 6 Stunden lang bei 40 ºC geschüttelt. Nachdem die Reaktion beendet war, wurde das Gel von dem Reaktionsgemisch abfiltriert und zunächst mit Ethanol und dann mit Wasser gewaschen, wobei ein epoxydiertes Gel erhalten wurde.

Beispiel 8

Zu 10 ml des in Herstellungsbeispiel 4 erhaltenen epoxydierten Gels wurde ein Lösung aus 1 g Polyacrylsäure, die an einer Seite der Polymerenden (Molekulargewicht etwa 1 000) eine Amino-Gruppe aufweist, in 5 ml Wasser, dem 1 ml 2 M NaOH zügefügt wurde, gegeben, und dann ließ man das Gemisch 48 Stunden lang bei Raumtemperatur stehen. Nachdem die Reaktion beendet war, wurde das Gel von dem Reaktionsgemisch abfiltriert und mit Wasser gewaschen, wobei ein Zellulose-Gel mit immobilisierter Polyacrylsäure erhalten wurde.
Die Polyacrylsäure, die an einer Seite der polymeren Enden eine Amino-Gruppe aufweist, wurde durch langsame Polymerisationsreaktion von Acrylsäure unter Verwendung von 2 Aminoethanthiol als Kettentransfermittel und Azobisisobutyronitril (AIBN) als Initiator (Teruo Okano, et al (1977) , "Synthesis of 2- Hydroxyethyl Methacrylate-Styrene ABA Type Block Copolymers and It's Wettability", Nippon Kagaku Kaishi, 1, 88 bis 92) erhalten.

Beispiel 9

Es wurde eine Lösting mit einer Gesamtmenge von 9 ml hergestellt, indem 5 ml des in Herstellungsbeispiel 1 erhaltenen epoxydierten Gels in Wasser aufgelöst wurden. Nachdem 0,09 g L-Tyrosin in der Lösung aufgelöst wurden, wurde der pH-Wert des Gemisches durch Zugabe von 2 N NaOH auf pH 9 eingestellt und dann ließ man das Gemisch 2 Stunden lang bei Raumtemperatur stehen. Nachdem die Reaktion beendet war, wurde das Gel von dem Reaktionsgemisch abfiltriert und mit Wasser gewaschen, wobei ein Zellulose-Gel mit immobilisiertem Tyrosin erhalten wurde.

[Meßung der Konzentration von SAP-Protein]

Jedes in den Beispielen 6 bis 9 erhaltene Sorbentmittel bzw. CK-Gel A3 wurde in Teströhrchen aus Polypropylen gefüllt, zu denen 0,5 ml Human-Serum, das SAP-Protein enthielt, gegeben wurde. Nachdem das Gemisch 2 Stunden lang bei 37 ºC geschüttelt wurde, wurde die Konzentration von SAP-Protein in dem Überstand nach dem ELISA-Verfahren gemessen D.h., die verdünnte Probe wurde auf eine Platte getropft, die mit einem Antikörper gegen das SAP-Protein beschichtet war, um eine Antigen-Antikörper- Reaktion hervorzurufen. Dann wird Peroxidase markierender Anti- SAP-Protein-Antikörper zugefügt und die Farb-Reaktion mit einem CS-930 untersucht. Die auf dem Sorbentmittel immobilisierten Verbindungen, die anionische funktionelle Gruppen aufweisen und das Verhältnis von adsorbiertem SAP-Protein auf dem Sorbentmittel sind in Tabelle 3 angegeben. Das Verhältnis von adsorbiertem SAP-Protein wurde als abnehmendes Verhältnis der Konzentration von SAP-Protein in dem Überstand des Sorbentmittels, bezogen auf die Konzentration von SAP-Protein in dem Überstand von CK-Gel A3 angegeben. Tabelle 3 Beispiel Nr. Verbindungen mit anionischer funktioneller Gruppe Verhältnis von adsorbiertem SAP-Protein (%) Sulfanilsäure Natriumdextransulfat Polyacrylsäure L-Tyrosin
Die in Tabelle 3 angegebenen Ergebnisse bestätigen, daß das erfindungsgemäße Sorbentmittel SAP-Protein ausgezeichnet adsorbieren kann.
Zusätzlich zu den in den Beispielen verwendeten Bestandteilen können in den Beispielen andere Bestandteile verwendet werden, wie in der Beschreibung angegeben, um im wesentlichen dieselben Ergebnisse zu erhalten.

Claims

1. Verfahren zum Entfernen von Serum-Amyloid-Protein aus Körperflüssigkeit, umfassend die Stufen:

1) Vereinigen einer Körperflüssigkeit, die Serum-Amyloid- Protein enthält, mit einem Sorbentmittel für ein Serum-Amyloid- Protein, das einen wasserunlöslichen Träger und eine auf diesem Träger immobilisierte Verbindung umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Verbindung mit einer anionischen funktionellen Gruppe, einer polyanionischen Verbindung mit mehr als einer anionischen funktionellen Gruppe, Anilin und einem Anilin-Derivat,

2) Durchleiten der Körperflüssigkeit durch einen Filter, durch den das Sorbentmittel nicht hindurchgeht und

3) Wiedergewinnen der im wesentlichen Serum-Amyloid- Protein-freien Körperflüssigkeit.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Serum-Amyloid-Protein Serum-Amyloid-A-Protein ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Serum-Amyloid-Protein Serum-Amyloid-P-Protein ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2, worin das Sorbentmittel einen wasserunlöslichen Träger und eine polyanionische Verbindung, mit mehr als einer anionischen funktionellen Gruppe, die auf diesem Träger immobilisiert ist, umfaßt.

5. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Sorbentmittel einen wasserunlöslichen Träger und eine Verbindung umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Anilin und einem Anilin- Derivat, und die auf diesem Träger immobilisiert ist.

6. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Sorbentmittel einen wasserunlöslichen Träger und eine Verbindung mit einer anionischen funktionellen Gruppe, die auf diesem Träger immobilisiert ist, umfaßt.

7. Verwendung eines Sorbentmittels für ein Serum-Amyloid- Protein zum Entfernen von Serum-Amyloid-Protein aus Körperflüssigkeit, umfassend einen wasserunlöslichen Träger und eine auf diesem Träger immobilisierte Verbindung, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Verbindung mit einer anionischen funktionellen Gruppe, einer polyanionischen Verbindung mit mehr als einer anionischen funktionellen Gruppe, Anilin und einem Anilin-Derivat, umfaßt.