BR112015032134B1 - Método de ligação em ponto de extremidade de uma manose não redutora a um substrato e esfera possuindo uma manose ligada em ponto de extremidade - Google Patents

Abstract

SISTEMA DE FILTRAÇÃO DE SANGUE CONTENDO SUBSTRATO REVESTIDO DE MANOSE. A presente invenção refere-se a um método de filtração de sangue, sistema, dispositivo e meios para a remoção de bactérias gram-negativas do sangue em que o meio inclui um substrato revestido com manose opcionalmente na constituição com substrato revestido com heparina.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] O presente pedido reivindica prioridade ao Pedido de Patente Provisório U.S. No. 61/838.854, depositado em 24 de junho de 2013, cuja divulgação é deste modo incorporada para referência na sua totalidade para todos os fins.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O aparecimento de patógenos resistentes a fármacos é uma ameaça crescente para o sistema de saúde. Não são apenas os antibióticos atuais que se tornam menos eficazes, as grandes empresas farmacêuticas estão mudando o foco a partir de um novo desenvolvimento antimicrobiano para programas de descoberta de fármacos mais lucrativos, tais como terapêuticos para câncer. Embora se reconheça que "superbactérias" são uma grande preocupação, o atual mercado de novos medicamentos anti-infecciosos é relativamente pequeno em comparação com os seus custos regulatórios e de desenvolvimento significativos.

[003] O CDC recentemente alertou para o surgimento de Enterobacteriacea (CRE) resistente a carbapenem. A taxa de mortalidade para bacteremia CRE pode ser tão elevada quanto 50%. Resistência de CREs até mesmo aos mais fortes antibióticos disponíveis deixa os clínicos com poucas opções de tratamento. A incidência de infecções por CRE adquiridas no hospital aumentou de pouco mais de 1% de dez anos atrás, para 4% hoje. Embora bacteremias CRE sejam geralmente infecções nosocomiais, existe a preocupação de que a incidência de CRE adquirida na comunidade possa aumentar. Atualmente, a única estratégia para combater a propagação de infecções por CRE é através de programas que educam os profissionais de saúde sobre a prevenção.

[004] A estratégia convencional para combater infecções bacterianas é desenvolver fármacos ativos que especificamente matam as bactérias, evitando danos ao tecido hospedeiro. Este é um grande desafio que alguns dos mais potentes antibióticos disponíveis hoje são bastante tóxicos. Por exemplo, a vancomicina é nefrotóxica, e em breve poderá ser contraindicada para pacientes submetidos à oxigenação extracorporal. Mesmo que novos antibióticos sejam desenvolvidos com sucesso para estudar a resistência a fármacos atual, novas 'superbactérias' ainda vão surgir. Claramente, novas estratégias para combater a infecção, além da descoberta do fármaco, são necessárias.

[005] Infecção no fluxo sanguíneo, ou bacteremia, é um grande desafio na UTI. A bacteremia pode levar rapidamente a choque séptico, meningite, endocardite, osteomielite e outras complicações metastáticas. Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Enterobacteriacea são as bactérias mais comuns responsáveis por bacteremia ou infecções nosocomiais. Severidade nos resultados para os pacientes com bacteremia está correlacionada tanto à carga bacteriana quanto à duração de bacteremia. Um estudo de RT-PCR quantitativo em pacientes com bacteremia por E. coli e S. aureus mostrou que, quando o número de rDNA aumentou ao longo de 1238 cópias/ml, a mortalidade aumentou de 14,3% para 42,9% e choque séptico aumentou de 31,4% para 85,7%. (vide Quantitative rt-PCR Holds Promise as a Screening Tool for Patients with Severe Sepse." Kirkbright. 2011, Emergence Medicine Australasia, Vol. 23, p. 502). Constatou-se também que a elevada concentração sanguínea de N. meningitidis está correlacionada com a prolongada hospitalização, a integridade física ou perda de tecido, necessidade de diálise e mortalidade, (vide, Severity of Meningococcal Disease Associated with Genomic Bacterial Load. Darton. 2009, Clinical Infectious Disease, Vol. 48, pp. 587-84). Da mesma forma,um outro estudo mostrou que a gravidade da pneumonia pneumocócica era correlacionada com a carga bacteriana no sangue: a mortalidade de pacientes com mais de 1000 de cópias/ml de DNA de S. pneumoniae de sangue foi de 25,9% versus 6,1% para pacientes que exibem menos do que 1000 cópias/ml. (Rell et al. "Severity of Pneumococcal Pneumonia Associated with Genomic Bacterial Load." 2009, Chest, Vol. 136, pp. 832-840). Em outro estudo, hemocultura positiva de acompanhamento entre 48 e 96 horas após o diagnóstico inicial mostrou ser o mais forte preditor de bacteremia de S. aureus complicada. Fowler, (vide, "Clinical Identifiers of Complicated Staphylococcus aureus Bacteremia." 2003, Arch Intern Med, pp. 2066-2072). Compor a dificuldade de tratamento de bacteremia eficaz é a administração muitas vezes adiada de antibioticoterapia adequada. Foi relatado que para cada hora de atraso no tratamento o risco de mortalidade aumenta mais de 7%. (vide Kumar et al., "Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock." 6, 2006, Crit Care Med, Vol. 34, pp. 1589-96). Uma tecnologia segura de largo espectro que pode rapidamente reduzir a carga bacteriana, e encurtar a duração da bacteremia, seria um grande avanço, uma vez que poderia mesmo ser utilizada sem primeiro identificar o tipo de bactérias presente no sangue.

[006] Embora um dispositivo de hemoperfusão de adsorção com apenas meios heparinizados já seja de "largo espectro", com a capacidade de mirar muitas bactérias de alto perfil responsáveis por infecções nosocomiais e bacteriemia, bactérias gram-negativas tais como E. coli, Klebsiella pneumoniae, e Pseudomonas aeruginosa têm uma afinidade relativamente baixa à heparina / HS.

[007] Tendo em esfera o que precede, o que é necessário na técnica são novos métodos e dispositivos para remover as bactérias e agentes patogênicos do sangue. A presente invenção satisfaz estas e outras necessidades.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] A presente invenção proporciona métodos para funcionalizar a superfície de um meio com manose. Em certos casos, os meios de manose e meios heparinizados podem ser combinados ou misturados em conjunto para criar um único dispositivo que tem como alvo um espectro muito amplo de patógenos. Além disso, a proximidade dos meios de manose para meios heparinizados torna o dispositivo global e métodos antitrombogênicos, melhorando assim a segurança global.

[009] Como tal, em uma modalidade, a presente invenção compreende um meio de filtração de sangue compreendendo, ou consistindo essencialmente em, ou consistindo em: a. um substrato revestido com manose; e b. opcionalmente, um componente de anticoagulação.

[0010] Em certas modalidades, o substrato compreende esferas não porosas rígidas, partículas, ou embalagem, espumas reticuladas, um leito monolítico rígido, tecido trançado ou não trançado, fibras de monofilamento contínuas ou sólidas ou densas e ocas (não microporosas), um filme plano ou membrana de barreira, um cartucho em espiral enrolado formado a partir de filme plano ou membrana densa.

[0011] Em certos aspectos, a manose é extremidade anexada ao substrato.

[0012] Em certos aspectos, o componente de anticoagulação está presente e o componente é heparina.

[0013] Em certos aspectos, o substrato compreende substrato revestido com heparina.

[0014] Em certos aspectos, o substrato compreende esferas rígidas não porosas, em que uma primeira porção da esfera é revestida com manose e uma segunda porção da esfera é revestida com heparina.

[0015] Em certos aspectos, a manose e a heparina são cada, uma extremidade ligada às esferas.

[0016] Em certos aspectos, a heparina é o sulfato de heparano.

[0017] Em certos aspectos, a manose é D-manose.

[0018] Em certos aspectos, a manose é p-aminofenil-α-D- manopiranosídeo.

[0019] Em certos aspectos, a manose é um polímero de manose tal como manan.

[0020] A presente invenção também proporciona um cartucho de filtração de sangue que compreende um recipiente que compreende o meio descrito acima.

[0021] A presente invenção também se refere a um sistema para filtração de sangue que compreende, ou consiste essencialmente em, ou consiste em: a. um recipiente que compreende, ou consiste essencialmente em, ou consiste em: um substrato revestido com manose; b. opcionalmente, um componente de anticoagulação; e c. um dispositivo de filtração de sangue extracorporal, em que o recipiente está funcionalmente acoplado ao dispositivo de filtração de sangue, de modo que, quando em uso, o sangue flui através do recipiente e em contato com o substrato.

[0022] Em certos aspectos do sistema da invenção, o substrato compreende esferas não porosas rígidas, partículas, ou embalagem, espumas reticuladas, um leito monolítico rígido, tecido trançado ou não trançado, fibras de monofilamento contínuas ou sólidas ou densas e ocas (não microporosas), um filme plano ou membrana de barreira, um cartucho em espiral enrolado formado a partir de filme plano ou membrana densa.

[0023] Em certos aspectos do sistema da presente invenção, a manose é extremidade anexada ao substrato.

[0024] Em certos aspectos do sistema da presente invenção, o componente de anticoagulação está presente e o componente é heparina.

[0025] Em certos aspectos do sistema da invenção, o substrato compreende substrato revestido com heparina.

[0026] Em certos aspectos do sistema da invenção, o substrato compreende esferas rígidas não porosas, em que uma primeira porção das esferas é revestida com manose e uma segunda porção das esferas é revestida com heparina.

[0027] Em certos aspectos do sistema da presente invenção, a manose e a heparina são cada, extremidade ligada às esferas.

[0028] A presente invenção também se refere a um método para a remoção de pelo menos uma bactéria gram-negativa do sangue, compreendendo: contatar uma amostra de sangue com um meio discutido acima, em que as bactérias gram-negativas podem ser uma Enterobacteriaceae.

[0029] Em uma modalidade do método da invenção, as bactérias gram-negativas são pelo menos um membro selecionado a partir do grupo que consiste em E. coli, Klebsiella pneumonia, e P. aeruginosa.

[0030] Em uma outra modalidade, a presente invenção proporciona um método para a fixação de uma manose a um substrato contendo amina, o método compreendendo:

[0031] contatar um substrato aminado com uma solução aquosa contendo uma manose para formar uma base de Schiff intermediária; e

[0032] contatar a base de Schiff com um agente redutor para se anexar a manose.

[0033] Em outra modalidade, um dispositivo de tamanho adequado pode ser utilizado para a redução de agentes patogênicos em sangue doado.

[0034] Estas e outras vantagens, objetos e modalidades serão mais evidentes quando lidos com as seguintes figuras e descrição detalhada que se seguem.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0035] FIGURA 1 ilustra uma modalidade da presente invenção, isto é, proteção de macrófagos de antígeno protetor do antraz (PA).

[0036] FIGURA 2 ilustra micrografias de meios heparinizados e catiônicos após a passagem do sangue total.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0037] A presente invenção proporciona um meio de filtração de sangue, compreendendo: a. um substrato revestido com manose; e b. opcionalmente, um componente de anticoagulação.

[0038] A presente invenção proporciona dispositivos e métodos que compreendem um meio de filtração de sangue e pode remover bactérias e agentes patogênicos a partir do sangue de mamíferos. Em certos casos, o substrato compreende manose. Em outros casos, o componente de anticoagulação está presente no componente de anticoagulação do meio e é heparina ou sulfato de heparano. Certos agentes patogênicos podem ser removidos do sangue com heparina. Uma superfície de manose funcionalizada pode ser utilizada para alvejar outras bactérias que a heparina não alvo.

[0039] Ao contrário da heparina, manose não é considerada antitrombogênica. O espectro de remoção bacteriana pode ser aumentado pelo uso de material manose sozinho, ou em combinação com um componente de anticoagulação.

[0040] Em certos casos, misturando idealmente meios de adsorção heparinizados com meios de manose, uma tecnologia de sangue seguro e de largo espectro é alcançada. Ao combinar mais de uma química de meio / superfície dentro de um único dispositivo de hemoperfusão de adsorção, um espectro muito amplo de patógenos é alvejado.

[0041] Um componente de anticoagulação preferido é heparina ou sulfato de heparano. A presente invenção demonstra que uma elevada concentração de S. aureus e MRSA pode ser removida do sangue total usando este componente de anticoagulação. É importante notar que a resistência ao fármaco de MRSA não afeta a ligação à heparina imobilizada. Acredita-se que outras espécies resistentes aos fármacos também sejam capazes de manter a sua capacidade de se ligar ao sulfato de heparano / heparina. Uma lista de bactérias que se ligam a meios de adsorção funcionais de heparina da presente invenção é mostrada na Tabela 1. Tabela 1 Uma lista de patógenos de ligação a sulfato de heparano / heparina e as doenças que eles causam.

[0042] Demonstrou-se que um dispositivo extracorporal com uma elevada área superficial de pontos de extremidade fixa a heparina pode remover uma concentração elevada de bactérias Gram-positivas (S. aureus e MRSA) e a partir de sangue total, (vide, Mattsby-Baltzer I. et al., "Affinity Aphaeresis for Treatment of Bacteraemia Caused by Staphylococcus aureus and/or Methicillin-resistant Staphylococcus aureaus (MRSA)." Accepted for Publication March 2011, Journal for Microbiology and Biotechnology). Além disso, o presente pedido demonstra o uso de PCR que as bactérias não foram mortas quando ligadas à superfície heparinizada e, portanto, não liberam toxinas inflamatórias potenciais / subprodutos na corrente sanguínea.

[0043] Os espectros de remoção bacteriana podem ser aumentados pela utilização de meios de manose sozinhos nos métodos atuais ou em combinação com um componente de anticoagulação. Exemplos de bactérias gram-negativas que não são conhecidas como tendo alguma afinidade, ou tendo pouca afinidade com a heparina ou sulfato de heparano, são E. coli, Klebsiella pneumoniae e Pseudomonas aeruginosa. Os presentes métodos são capazes de remover Enterobacteriacea resistentes aos fármacos e suscetíveis aos fármacos usando um meio funcionalizado de manose.

[0044] Meios funcionalizados por manose incluem manose ligada a um substrato. Em outros casos, o meio de manose inclui p-aminofenil-α- D-manopiranosídeo. Em uma modalidade, a manose está ligada por ligação de pontos de extremidade ao substrato. Em uma outra modalidade, a manose é ligada ao substrato por ligação multiponto.

[0045] Em outros casos, manose é um polímero de manose tais como manan. Manan refere-se a um polissacarídeo de planta que é um polímero linear de manose do açúcar. Manans de plantas têm ligações β(1-4). Manan também pode se referir a um polissacarídeo de parede celular encontrado em leveduras. Este tipo de manan tem uma estrutura ligada a α(1-6) e ramificações ligadas a α(1-3) e (1-2).

[0046] Uma variedade de materiais, em forma e composição, podem ser utilizados como um substrato na presente invenção. Em certos casos, substratos proporcionam elevada área superficial, enquanto promovem o transporte de adsorvatos para os sítios adsorventes que os ligam (principalmente) por transporte convectivo forçado. O meio é normalmente fornecido embalado dentro de um recipiente, tal como uma coluna, que é projetado para manter o meio para que ele não seja levado no fluxo de sangue (por exemplo, meios de migração) e permite que o fluxo de sangue passe essencialmente em toda a superfície do meio.

[0047] Substratos úteis para a criação de meios incluem, mas não estão limitados a, esferas não porosas rígidas, partículas, ou embalagem, espumas reticuladas, um leito monolítico rígido (por exemplo formado a partir de esferas sinterizadas ou partículas), uma coluna empacotada com tecido trançado ou não trançado, uma coluna empacotada com fibras monofilamento contínuas ou sólidas ou ocas e densas (não microporosas), um filme plano ou membrana de barreira, um cartucho em espiral enrolado formado a partir de filme plano ou membrana densa, ou uma combinação de meios tais como um cartucho de esferas / tecido misturado.

[0048] Em certos casos, um substrato adequado é aquele que é inicialmente microporoso, mas se torna essencialmente não poroso quando a superfície é tratada antes, durante ou após a criação de sítios de adsorção, por exemplo, via heparina ligada a ponto de extremidade ou manose ligada a ponto de extremidade. Em uma modalidade, o substrato é na forma de esferas sólidas ou em partículas.

[0049] Esferas úteis têm um tamanho que varia desde cerca de 100 até acima de 500 mícrons de diâmetro, tais como 100, 200, 300, 400, ou 500 mícrons. O tamanho médio das esferas pode ser de 150 a 450 mícrons. Vide, por exemplo, o documento WO 2011/068897, todo o conteúdo do qual é aqui incorporado por referência. As esferas ou outros substratos de área superficial elevada podem ser feitos a partir de vários materiais biocompatíveis diferentes, tais como polímeros naturais ou sintéticos ou material não polimérico incluindo vidros, cerâmicas, metais e que são essencialmente isentos de impurezas lixiviáveis. Alguns exemplos de polímeros de poliuretano, incluindo polimetilmetacrilato, polietileno ou copolímeros de etileno e outros monômeros, imina de polietileno, polipropileno, e poli-isobutileno. Exemplos de substratos não porosos úteis incluem Polietileno de Peso Molecular UltraElevado (UHMWPE). Outras esferas adequadas são poliestireno, polietileno de alta densidade e de baixa densidade, sílica, poliuretano, e quitosano.

[0050] Em ainda outra modalidade, o substrato sólido compreende micropartículas ou fibras ocas. Em certas modalidades da invenção, o material do substrato sólido é selecionado a partir do grupo que consiste em vidro, celulose, acetato de celulose, quitina, quitosano, dextrano reticulado, agarose reticulada, polipropileno, polietileno, polissulfona, poliacrilonitrila, silicone, Teflon ® e poliuretanos. Em uma outra modalidade, o carboidrato está ligado de forma covalente ao substrato sólido. Em uma modalidade mais específica, o carboidrato está ligado ao substrato sólido por ligação covalente de ponto de extremidade.

[0051] A ligação covalente de um carboidrato a um substrato sólido proporciona um controle de parâmetros, tais como a densidade de superfície e a orientação das moléculas imobilizadas, em comparação com ligação não covalente. Estes parâmetros foram mostrados como proporcionando ligação de patógeno às moléculas de carboidratos imobilizadas. Em certos aspectos, a concentração de superfície do carboidrato sobre o substrato sólido é na faixa de 0,01 a cerca de 0,2 μg/cm2, tal como de 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19 ou 0,2 mg/cm2.

[0052] Em uma modalidade, os presentes meios podem incluir ambas heparina e manose em um único substrato ou podem conter uma mistura de substratos revestidos de heparina e substratos revestidos de manose. O revestimento pode ser ao longo de todo o substrato ou uma porção do substrato.

[0053] Em certos aspectos, se o substrato é uma esfera, a quantidade de revestimento sobre a esfera é de cerca de 0,4 ± 0,3 mg de manose e/ou heparina por grama de esfera. Outros valores incluem 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1,0 ± 0,3 mg de manose ou heparina por grama de esfera. Para um substrato da esfera com a rugosidade da superfície, onde o tamanho médio é de 300 mícrons, a área da superfície medida pelo método BET é de 2700 cm2/g de esferas. A cobertura da superfície de manose neste substrato de esfera é então 0,15 μg/cm2 de esferas, ou cerca de 0,01 a cerca de 0,2 μg/cm2, ou 0,3, 0,4, ou 0,5 μg/cm2. Uma faixa adequada é de 0,01 a cerca de 0,5 μg/cm2.

[0054] Se uma mistura de ambos, um componente de anticoagulação (por exemplo, heparina) e manose está incluída em um único substrato, a proporção de heparina:manose pode variar de 1:99 até 99:1, e pode compreender 1-50% de manose. Em um exemplo, o substrato é revestido com 50% de manose, ou cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50% de manose. Em um aspecto, o substrato é revestido com 100%) de manose. Em outros casos, o substrato é revestido com 50, 60, 70, 80, 90 ou 100% de manose. Em um aspecto, a quantidade combinada de revestimento de manose e heparina sobre um esfera é de 0,4 ± 0,3 mg de heparina total, manose, ou uma combinação de heparina e manose por grama de esfera.

[0055] Em certos casos, o substrato é revestido com manose, um derivado de manose ou polímero de manose. Em outros casos, o substrato é uma combinação de um componente de manose e anticoagulação. Em uma aplicação preferida da invenção, o substrato é uma mistura dos diferentes meios de adsorção e, subsequentemente embalada em um cartucho ou outra embalagem. Este arranjo proporciona um contato íntimo entre as várias substâncias químicas de superfície em esferas adjacentes, permitindo simultaneamente a produção eficiente de cartuchos de adsorção ou filtros.

[0056] Uma abordagem é colocar em camada os diferentes meios em um arranjo do tipo parfait no interior do invólucro de tal forma que o sangue contata os diferentes meios em fluxo em série ou paralelo. Um arranjo de diferentes meios dentro de um cartucho é posicionar meios de anticoagulação não misturados (antitrombogênico), na entrada e/ou na saída do cartucho, com uma região opcionalmente misturada contendo a manose interposta entre as regiões de entrada e de saída. No caso dos meios na forma de fibras, um tecido misto, malha, ou estrutura não tecida podem ser preparados por métodos bem conhecidos na indústria têxtil para formar tecido de fibra mista. Alternativamente, um fio pode ser preparado a partir de fios de multifilamento mais fino ou monofilamento feitos a partir de duas ou mais fibras com diferentes químicas de superfície, desde que um tipo de fibra inclua uma superfície que impede a coagulação do sangue ativamente no esferato. O fio de fibra misto pode então ser utilizado para preparar tecido de esferato com o sangue.

[0057] Em certos aspectos da invenção, as moléculas de heparina com componente de anticoagulação imobilizadas têm um peso molecular médio de mais de 10 kDa. Em uma outra modalidade da invenção, as moléculas de heparina imobilizada têm um peso molecular médio de mais de 15 kDa. Em ainda uma outra modalidade da invenção, as moléculas de heparina imobilizada têm um peso molecular médio de mais de 21 kDa. Em ainda uma outra modalidade da invenção, as moléculas de heparina imobilizada têm um peso molecular médio de mais de 30 kDa. Em outras modalidades, as moléculas de heparina imobilizada têm um peso molecular médio dentro da faixa de 15-25 kDa. O peso molecular médio pode também ser mais elevado, tal como na faixa de 25-35 kDa. O peso molecular médio pode ser 1-35 kDa, ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, ou 35 kDa.

[0058] Em um aspecto, o peso molecular médio do componente de anticoagulação (por exemplo, moléculas de heparina imobilizada), em um aparelho ou método de acordo com a presente invenção é significativamente maior do que o peso molecular médio das moléculas de heparina usada no estado da técnica atual. As moléculas de heparina de comprimento total utilizadas de acordo com a presente invenção proporcionam uma melhor capacidade de ligação com porções de ligação de heparina, tanto em termos da quantidade de moléculas de ligação à heparina que podem ser ligadas por unidade de área de superfície do substrato sólido, e em termos da faixa de moléculas que podem ser ligadas pela superfície devido ao aumento da variedade de motivos apresentados pelas moléculas de heparina completas imobilizadas.

[0059] Em certos aspectos, manose e/ou heparina estão ligadas ao substrato sólido por ligação covalente de ponto de extremidade. A ligação covalente da heparina a um substrato sólido proporciona um melhor controle dos parâmetros tais como a densidade de superfície e a orientação das moléculas imobilizadas, em comparação com não covalente. Os presentes inventores descobriram que estes parâmetros são importantes, a fim de proporcionar a ligação ideal de agentes prejudiciais de ligação de heparina para as moléculas de heparina imobilizada. Em uma modalidade, a concentração de superfície da heparina e/ou manose no substrato sólido está na faixa de 0,001-2,0 μg/cm2. Em uma outra modalidade, a concentração de superfície da heparina no substrato sólido é na faixa de 0,005-0,5 μg/cm2. Fixação de ponto de extremidade covalente significa que a heparina está covalentemente ligada ao substrato sólido através do resíduo do terminal da molécula de heparina.

[0060] Em uma modalidade, o substrato sólido do dispositivo pode de preferência compreender um material que tem uma grande área de superfície. O substrato sólido do dispositivo pode compreender micropartículas ou fibras ocas, mas podem também ser utilizados outros tipos de substratos sólidos. A área total da superfície do substrato sólido pode estar na faixa de 0,1 -20 m2, de um modo preferido na faixa de 0,5-3 m2, tais como 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 e 3.0 m2 e em valores numéricos entre eles. Em certas modalidades da invenção, o material do substrato sólido é selecionado a partir do grupo que consiste em vidro, celulose, acetato de celulose, quitina, quitosana, dextrano reticulado, agarose reticulada, reticulado de alginato, polietileno, polipropileno, polissulfona, poliacrilonitrilo, silicone, polímeros de flúor (tal como o politetrafluoroetileno) e poliuretanos. O substrato sólido pode compreender partículas ou esferas. Em uma modalidade do dispositivo da invenção, em que o substrato sólido é constituído por partículas ou esferas, as partículas ou esferas podem preferencialmente compreender um material selecionado a partir do grupo que consiste em poliuretanos, poliolefinas, silicones, polímeros de flúor (tal como o politetrafluoroetileno), poli (metacrilato de metila), vidro, alginatos reticulados e polissacarídeos reticulados, tais como agarose, dextrano, celulose, quitosano e amido. Outros materiais normalmente utilizados em micropartículas para aplicações médicas podem também ser empregues. Em uma outra modalidade da invenção, o substrato sólido compreende um polissacarídeo reticulado.

[0061] Em uma modalidade do dispositivo da invenção, em que o substrato sólido compreende fibras ocas, as fibras ocas podem, de preferência compreender um material selecionado a partir do grupo que consiste em polissulfonas, poliamidas, polinitrilas, polipropilenos, alginatos reticulados, e celulose. Outros materiais normalmente utilizados em fibras ocas para aplicações médicas podem também ser empregues. A fibra oca pode compreender de preferência uma polissulfona.

[0062] O substrato sólido do dispositivo pode, evidentemente, também estar presente em outras formas ou formas proporcionando uma grande área de superfície.

[0063] O tamanho e a porosidade do substrato sólido devem ser selecionados para cada aplicação ou o tratamento, de modo a permitir uma taxa de fluxo de sangue adequada através do dispositivo a uma queda de pressão aceitável sobre o dispositivo. Para certas aplicações que requerem uma taxa de fluxo de sangue elevada e uma gota de baixa pressão, uma partícula de maior diâmetro, poro, fibras ocas ou qualquer outro substrato sólido são necessários. Em outras aplicações que não necessitam de uma elevada taxa de fluxo de sangue e uma gota de baixa pressão, as partículas de menor diâmetro, poros, fibras ocas ou outros substratos sólidos podem ser usados. Assim, em uma modalidade da presente invenção, em que o substrato sólido está presente na forma de partículas, o diâmetro de partícula pode estar na faixa de 10 μm a 5 mm. O diâmetro das partículas pode também ser na faixa de 10 μm a 1000 μm tais como 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ou 1000 μm.

[0064] De um modo geral, um tamanho de partícula na faixa de 20-200 μm tais como 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, ou 200 μm é útil, mas em aplicações de alta taxa de fluxo partículas maiores podem ser necessárias. Em certos casos, as partículas com tamanhos de 120 μm e abaixo são preferencialmente utilizadas com plasma e soro. O substrato sólido pode compreender uma ou mais fibras ocas. Em uma modalidade da presente invenção, em que o substrato sólido está presente na forma de fibras ocas, o diâmetro interno das fibras pode estar na faixa de 1 μm a 1000 μm. De um modo geral, um diâmetro interno na faixa de 20-200 μm é útil, mas em determinadas aplicações, fibras de diâmetro maior ou menor podem ser empregues.

[0065] O dispositivo e métodos da presente invenção são adequadamente dimensionados para a taxa de fluxo de sangue necessária para a aplicação em que se destina. Como exemplos não limitativos, a taxa de fluxo de sangue em circuitos extracorporais para diálise renal é geralmente na faixa de 200-500 mL/min, tal como 200, 300, 400, ou 500 mL/min, enquanto que a taxa de fluxo de sangue em circuitos extracorporais para oxigenação é geralmente na faixa de 2000-7000 mL/min, tais como 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, ou 7000. Em certas aplicações, tais como em circuitos extracorporais para o tratamento de sepsia aguda, a taxa de fluxo de sangue pode ser muito mais inferior, por exemplo na faixa de 1-100 mL/min.

[0066] Durante o funcionamento dos presentes meios, o sangue total e/ou soro do sangue de mamíferos, pode ser utilizado. A quantidade de sangue ou soro do sangue que pode ser utilizada nos presentes métodos não pretende ser limitada. Ela pode variar de menos de 1 ml para acima de 1 L, até e incluindo a totalidade do volume de sangue do paciente, quando a recirculação contínua de volta para o paciente é empregue. Podem ser utilizadas uma ou mais "passagens" através dos meios, se necessário. O sangue pode ser sangue humano ou animal.

[0067] Em certos aspectos, os métodos e dispositivos usados em algumas modalidades da invenção podem ter as seguintes propriedades: um fluxo de sangue na faixa de 1-500 mL/min, preferivelmente 5-250 mL/min e baixa resistência de fluxo.

[0068] Além disso, o presente material pode ser usado em um dispositivo extracorporal. Se utilizado extracorporalmente, ele pode compreender um dispositivo convencional para o tratamento extracorporal de sangue e de soro de pacientes. Por exemplo, um cartucho ou uma coluna podem então ser utilizados em série com circuitos extracorporais convencionais, tais como PCB, hemodiálise, e oxigenação. Ele também pode ser usado como uma alternativa ou derivação a outros filtros, de modo que antes ou depois da oxigenação, o fluxo sanguíneo para o mecanismo de oxigenação é desviado para os presentes meios para a remoção de endotoxinas. Os presentes meios podem também ser utilizados como o único elemento em um circuito de fluxo de sangue extracorporal.

[0069] Tem sido relatado que as cepas resistentes aos medicamentos de Klebsiella pneumoniae expressa uma concentração mais elevada de ambas fímbrias do Tipo 1 e Tipo 3, (vide, Sahly, J. et al. "Extended-Spectrum B-lactamase Production is Associated with an Increase in Cell Invasion and Expression of Fimbrial Adhesins in Klebsiella pneumoniae." 9, 2008, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Vol. 52, pp. 3029-3034). Sem estar ligado a qualquer teoria particular, acredita-se que as cepas resistentes a fármacos são mais virulentas devido a esta expressão simultânea que pode levar a mais elevada afinidade e ligação de tecido hospedeiro.

[0070] A presente invenção demonstra que os agentes patogênicos irão ligar-se a uma superfície ou substrato sólido que foi modificado com manose e, opcionalmente, heparina ligada a ponto de extremidade. A Tabela 2 demonstra a remoção de várias cepas de laboratório quer S. aureus ou MRSA. Por exemplo, em um estudo de sangue in vitro (Mattsby- Baltzer I., supra), 85% de MRSA foi removido por uma única passagem através do meio 'somente de heparina'. A concentração inicial de bactérias foi de 5 x 106 CFU / mL. Além da MRSA de ligação, a análise de PCR indicou que a superfície heparinizada não era bactericida. Esta é uma descoberta importante que indica componentes celulares de bactérias (mortas), que podem ser inflamatórios e tóxicos para o recipiente, não são liberados no sangue quando as bactérias se ligam ao meio.

[0071] A Tabela 2 mostra que S. aureus e várias cepas de MRSA foram removidos com um rendimento elevado do sangue total. Dependendo da cepa, até 85% das bactérias de MRSA foram removidos pelo substrato heparinizado.

[0072] Para demonstrar captura de vírus, HSV-1 e HSV-2 foram removidos do sangue humano, soro ou solução salina tamponada. Nesta experiência, 1 ml de sangue humano com 1011/mL de partículas de vírus HSV-1 ou HSV-2 radiomarcadas foram passados através de uma coluna carregada com 1 ml de meio de Seraph™. Foi demonstrado que nesta experiência 99,1% do HSV-1 e 99,8% de HSV-2 foram removidos do sangue total. (Vide Tabela 3 abaixo). Tabela 3 Redução de HSV-1 e HSV-2 utilizando meios heparinizados

[0073] As toxinas bacterianas também têm sido mostradas ligando-se a meios de heparina funcional. Em uma outra experiência, antígeno protetor (PA) produzido por B. anthracis foi reduzido para os níveis de fundo e capturado antes que macrófagos pudessem ser prejudicados Figura 1. Tal como mostrado no gráfico de barras, o nível de morte celular alcançado é de 80% quando o meio heparinizado não é usado. Quando o material heparinizado é adicionado à montagem experimental, a morte celular de macrófagos é reduzida para 20%, que é o nível de morte de fundo, indicando a captura de PA antes de ter atacado os macrófagos.

[0074] Um estudo semelhante foi realizado através da cultura de MRSA para produzir α-hemolisina, uma exotoxina formadora de poros. O sobrenadante a partir do meio de cultura foi passado através de meios heparinizados e foi demonstrado que a α-hemolisina foi reduzida para os níveis de fundo de análise ELISA.

[0075] Idealmente misturar o componente de anticoagulação (por exemplo, meios de adsorção heparinizados) com os meios de manose, uma tecnologia de sangue segura e de largo espectro tem sido desenvolvida. Como um exemplo, as endotoxinas são carregadas negativamente, e não irão se ligara à superfície de heparina carregada negativamente. Uma química de superfície catiônica (positivamente carregada) que tem como alvo endotoxinas seria extremamente trombogênica, se utilizada sozinha, na ausência de heparina. Através da combinação de um substrato catiônico com os meios heparinizados em uma nano ou microescala, as propriedades antitrombogênicas favoráveis do meio heparinizado puro podem ser mantidas, enquanto removem altos níveis de endotoxina de sangue humano ativado. Esta técnica amplia o espectro de adsorvatos sem comprometer a segurança da terapia. A demonstração desta capacidade é mostrada nos dados apresentados na Figura 2.

[0076] Em certos outros aspectos, a presente invenção provê a tecnologia para a remoção de agentes patogênicos de sangue pela identificação de locais receptores naturais que utilizam agentes patogênicos específicos durante a sua patogênese e, em seguida, o desenvolvimento de um biomimética, meio de adsorção de afinidade extracorporal de área de superfície elevada. A química de superfície deste meio desenvolvido então emula os sítios receptores naturais, resultando em rápida remoção de patógenos do sangue total colocada em contato com o meio, por exemplo, em um dispositivo extracorpóreo, usado na terapia tipo diálise.

[0077] Por exemplo, o sulfato de heparano é um proteoglicanos encontrado dentro de sindecanos em várias superfícies celulares diferentes e participa em muitos processos biológicos através da ligação de uma miríade de proteínas, incluindo citocinas e fatores de crescimento. A segmentação dos carboidratos e proteoglicanos para fixação inicial é um mecanismo comum da maioria dos patógenos. Por exemplo, os vírus da influenza irão se ligar ao ácido siálico, um carboidrato encontradoo em muitas glicoproteínas. Para remover estes agentes patogênicos, o ácido siálico é empregue.

[0078] Muitas bactérias gram-negativas têm adesinas ligação manose localizadas em pontas de fímbrias, (vide, Sharon, N. "Bacterial lectins, cell-cell recognition and infectious disease." 2, 1987, FEBS letters, Vol. 217, pp. 145-157). Outros carboidratos que têm demonstrado ser alvejado por bactérias incluem L-fucose, galactose, e várias glucosaminas ou galactoaminas.

[0079] Existem muitas adesinas diferentes relatadas por bactérias gram-negativas. Mais estudados são Fímbrias do Tipo 1, Tipo 3, tipo P e tipo S e também proteína da membrana externa A (OmpA). Fímbrias Tipo 1 e OmpA têm sido implicados na fixação às células endoteliais. Fímbrias do tipo 1 para mediar a fixação à manose (sensível à manose) e são expressos na maioria das Enterobacteriaceae.

[0080] Tipicamente, os vários tipos de fímbrias são expressos simultaneamente. Além disso, demonstrou-se que adesinas sensíveis à manose estão presentes na superfície celular das bactérias, mesmo quando não são expressas fímbrias. Fímbrias Tipo 1 foram mostradas para interagir com as células endoteliais microvasculares do cérebro humano, sugerindo que as fímbrias podem ser expressas em sangue, (vide, Teng, C. et al., "Escherichia coli K1 RS218 Interacts with Human Brain Microvascular Endothelial Cells via Type 1 Fimbria Bacteria in the Fimbriated State." 5, 2005, Infection and Immunity, Vol. 73, pp. 2923-2931).

[0081] A presente invenção proporciona métodos para a remoção de patógenos de sangue, identificando os locais receptores naturais que utilizam patógenos específicos durante a sua patogênese e, em seguida, desenvolver e/ou projetar um meio de adsorção de afinidade extracorpórea de elevada área de superfície.

Métodos de se Ligar a um substrato

[0082] A presente invenção proporciona métodos de fixação de manose a um substrato contendo amina. Manose, derivados de manose e oligômeros de manose são redutivamente acoplados a aminas primárias em substratos aminados tais coma esferas aminadas por aminação redutora. O acoplamento da forma de aldeído aberto de uma manose reduzindo a uma pérola resulta em uma amina secundária estável. Manoses não redutoras que têm uma amina reativa podem ser acopladas a uma esfera com um intermediário possuindo uma funcionalidade de aldeído.

[0083] Como tal, a presente invenção proporciona um método para a fixação de uma manose de um substrato contendo amina, o método compreendendo:

[0084] contatar um substrato aminado com uma solução aquosa contendo uma manose para formar uma base de Schiff intermediária; e

[0085] contatar a base de Schiff com um agente redutor para se anexar a manose.

[0086] Em certos aspectos, a manose é um açúcar redutor. Em outros aspectos, a manose é um açúcar não redutor (por exemplo, um manosídeo). Manoses adequadas incluem, mas não estão limitadas a, D-manose, L-manose, p-aminofenil-α-D-manopiranosideo, um polissacarídeo contendo manose e manan.

[0087] Se a manose é uma manose não redutora, o método compreende ainda a atribuição de um aldeído intermediário (por exemplo, glutaraldeído) ao substrato de amina antes da manose não redutora.

[0088] Tipicamente, a manose é dissolvida em uma solução aquosa tal como uma solução aquosa ácida. A solução aquosa de manose é feita esferatar com uma substrato aminado, tal como uma esfera aminada. A base de Schiffs é gerada. A base de Schiff é subsequentemente reduzida com um agente redutor. O agente redutor pode ser, por exemplo, cianoborohidreto de sódio ou borohidreto de sódio. Em certos casos, o método compreende ainda a reação de heparina possuindo uma funcionalidade aldeído reativo.

[0089] Para a fixação da heparina, uma função de aldeído mais reativo no resíduo terminal de redução pode ser conseguida por degradação ácida nitrosa parcial. Isto encurta o tempo de reação, mas a heparina imobilizada terá um peso molecular mais baixo. O acoplamento é realizado em solução aquosa, por aminação redutiva (cianoborohidreto).

[0090] Em certos exemplos, os métodos proporcionam uma esfera com uma manose e heparina anexada ponto de extremidade.

[0091] Fixação covalente de ponto de extremidade significa que o carboidrato está ligado de forma covalente ao substrato sólido através do resíduo do terminal da molécula de carboidrato. Um segundo aspecto da presente invenção proporciona a utilização de um dispositivo que compreende um carboidrato, tais como manose imobilizada em um substrato sólido, o carboidrato que tem uma afinidade de ligação para um micróbio patogênico, uma célula inflamatória ou uma proteína inflamatória, para remoção extracorporal de um micróbio patogênico, célula inflamatória ou proteína inflamatória do sangue de mamíferos.

[0092] Em certos aspectos, a ligação covalente de moléculas de heparina de comprimento completo para uma superfície é realizada através da reação de um grupo aldeído da molécula de heparina com um grupo amino primário presente na superfície. Uma propriedade inerente de todos os carboidratos é que eles têm um hemiacetal na sua extremidade redutora. Este acetal está em equilíbrio com a forma aldeído e pode formar bases de Schiffs com aminas primárias. Estas bases de Schiff podem então ser reduzidas para aminas secundárias estáveis. Em uma modalidade do dispositivo da invenção, a heparina está covalentemente ligada ao substrato sólido através de um grupo amino secundário estável.

[0093] Em certos aspectos, a presente invenção refere-se a um processo para a preparação de superfícies que transportam heparina de comprimento total ligada a pontos de extremidade, tal método resulta em superfícies revestidas com heparina de comprimento total tendo uma concentração de superfície elevada da heparina de comprimento total em conjunto com manose. As moléculas de heparina de comprimento total utilizada nos vários aspectos da presente invenção proporcionam um aumento significativo na capacidade de ligação para entidades de ligação a heparina por unidade de área de superfície, em comparação com as superfícies de heparina da técnica anterior. A heparina é de preferência ligada de forma covalente ao substrato sólido. Acoplamento covalente de moléculas de heparina evita a lixiviação de heparina para o sangue em contato com a superfície revestida com heparina. A lixiviação de heparina tem sido um problema nas técnicas anteriores que empregam técnicas de, por exemplo, ligação eletrostática de heparina a superfícies.

Exemplos

[0094] Nos experimentos que se seguem, uma unidade de sangue humano foi incubada com 10 ng/mL de endotoxina LPS e circulada através de um cartucho heparinizado de controle (ligação não-LPS e antitrombogênica) e um cartucho com uma mistura de esferas heparinizadas e meios catiônicos (ligação de LPS mas trombogênica). Os resultados mostraram que a coluna somente de heparina não remove LPS, enquanto que a coluna mista foi inesperadamente eficaz e removeu 98% da endotoxina. Não houve evidência de formação de trombos ou plaquetas ativadas em um dos cartuchos, como mostrado pelas micrografias na Figura 2, nem houve qualquer aumento na queda de pressão através do cartucho de adsorção que teria sido causado por formação de trombo.

Exemplo 1 - Fixação de ponto de extremidade de manan intacta de Sacchromyces cerevisiae a esferas aminadas através do resíduo terminal de redução

[0095] Os oligômeros de manose são redutivamente acoplados a aminas primárias em esferas aminadas por aminação redutora. O acoplamento da forma aberta do aldeído com a esfera resulta em uma amina secundária estável e a reação é tal como descrito abaixo no Esquema de Reação 1.

[0096] Em água, a função aldeído do D-manopiranose abaixo está em equilíbrio com as formas α e β, formadas por fecho do anel, com a função hidroxila no átomo de carbono 5, formando assim um anel de seis membros. Uma pequena proporção da forma aldeído livre aberta está sempre presente no equilíbrio. Este último reage com aminas primárias e bases de Schiffs são formadas. Por redução, estas bases são irreversíveis convertidas em aminas secundárias estáveis. Assim, mesmo que a forma de aldeído livre seja inferior a 1% no equilíbrio dos rendimentos de acoplamento são satisfatórios.

Esquema de Reação 1

[0097] Manan de Sacchromyces cerevisiae está acoplada a aminas primárias em esferas aminadas por aminação redutora. O acoplamento do aldeído aberto com a esfera resulta em uma amina secundária estável e a reação é irreversível.

[0098] Cloreto de sódio, 0,73 g. (Sigma-Aldrich, lote no. BCBG1923V) foi dissolvido em água purificada, 25 mL, com agitação magnética. Manan de Sacchromyces cerevisiae, 50,0 mg (Sigma, Lote no. SLBB8777V) foi dissolvida na solução de água com agitação.

[0099] Esferas aminadas, 10,0 g, (ExThera Medical, Lote no. 1120341) foram adicionadas à solução e o pH foi ajustado para 3,9 com ácido clorídrico a 0,1 M. O ácido utilizado para criar o ácido clorídrico a 0,1 M foi HCL 2M (ExThera AB, Lote no. 121204), diluído com água purificada (1: 19).

[00100] Uma solução de cianoborohidreto de sódio, 5,0 mg, (Acros Organics, Lote no. A0240008) em 0,5 mL de água purificada foi feita. Para a mistura de esfera / manan foi de 125 μL de cianoborohidreto de sódio diluído adicionado. A mistura foi aquecida a 80°C durante 8 horas.

[00101] O pH foi ajustado a cada duas horas para 5,6 e, em seguida, reduzido para 3,9 com HCl a 0,1 M, seguido da adição de 125 μL de solução de cianoborohidreto de sódio foi adicionado.

[00102] As esferas foram filtradas utilizando um funil de filtro de vidro (no. 3) e lavadas 4 vezes com 100 ml de água Dl. As esferas foram secas ao ar durante a noite à temperatura ambiente.

Exemplo 2 - Fixação de ponto de extremidade de oligo-manose de baixo peso molecular (LMV-manose)

[00103] O esquema de reação é essencialmente o mesmo que o descrito no Exemplo 1.

[00104] Cloreto de sódio, 0,37 g. (Sigma-Aldrich, lote no. BCBG1923V) foi dissolvido em 12,5 ml de água DI com agitação magnética. LMV-manose, 5,0 mg foi dissolvido na solução de água, também sob agitação.

[00105] Esferas aminadas, 5,0 g, (ExThera Medical, Lote no. 1120341) foram adicionadas à solução e o pH foi ajustado para 3,9 com ácido clorídrico a 0,1 M. O ácido utilizado para produzir o ácido clorídrico a 0,1 M foi HCL a 2M (ExThera AB, Lote N 121.204) diluído com água purificada (1: 19).

[00106] Uma solução de cianoborohidreto de sódio, 5,0 mg, (Acros Organics, Lote no. A0240008) em 0,5 mL de água purificada foi adicionada à mistura. A mistura foi aquecida a 60°C pelo período de 24 horas.

[00107] O pH foi controlado durante 1 hora e foi, subsequentemente, ajustado para baixo para 3,9 com HCl a 0,1 M a partir de, aproximadamente, 5,8. Após 24 horas o pH aumentou para aprox. 5,7. As esferas foram filtradas através de um funil de filtro de vidro (no. 3) e lavadas com 4x50 mL de água purificada. As esferas foram secas ao ar durante a noite à temperatura ambiente.

Exemplo 3 - Ligação de ponto de extremidade de oligo-manose de peso molecular médio para esferas aminadas através do resíduo terminal de redução (MMV-manose)

[00108] Os esquemas de reação são essencialmente os mesmos como descrito no Exemplo 1.

[00109] Os oligômeros de manose são redutivamente acoplados a aminas primárias em esferas aminadas por aminação redutora. O acoplamento do aldeído aberto para formar a esfera resulta em uma amina secundária estável e a reação é irreversível.

[00110] A função aldeído da unidade de monossacarídeo na unidade terminal de redução está em equilíbrio com o hemiacetal formado por fecho de anel com a função hidroxila no átomo de carbono 5 e, assim formando um anel de seis membros e a forma de aldeído livre aberto. Este último pode ser utilizado para o acoplamento redutivo de aminas primárias através da utilização de NaBH3CN. O cloreto de sódio, 0,37 g (Sigma-Aldrich, lote no. BCBG1923V) foi dissolvido em 12,5 mL de água DI com agitação magnética. MMV- manose, 5,0 mg foi dissolvido na solução de água, também sob agitação.

[00111] Esferas aminadas, 5,0 g, (ExThera Medical, Lote no. 1120341) foram adicionadas à solução e o pH foi ajustado para 3,9 com ácido clorídrico a 0,1 M. O ácido utilizado para gerar o ácido clorídrico a 0,1 M foi HCL a 2M (ExThera AB, Lote N 121.204) diluído com água DI (1: 19).

[00112] Uma solução de cianoborohidreto de sódio, 5,0 mg, (Acros Organics, Lote no. A0240008) em 0,5 mL de água purificada foi adicionada à mistura. A mistura foi aquecida a 60°C durante 24 horas.

[00113] O pH foi controlado durante 1 hora e foi, subsequentemente, ajustado para baixo para 3,9 com HCl a 0,1 M a partir de, aproximadamente, 5,7. Após 24 horas pH aumentou para aprox. 5.6. As esferas foram filtradas através de um funil de filtro de vidro (no. 3) e lavadas com 4x50 mL de água purificada. As esferas foram secas ao ar durante a noite à temperatura ambiente.

Exemplo 4 - Fixação de ponto de extremidade de oligo-manose de alto peso molecular a esferas aminadas através do resíduo terminal de redução (HMV-manose)

[00114] Os esquemas de reação são essencialmente os mesmos como descritos no Exemplo 1.

[00115] Cloreto de sódio, 0,37 g. (Sigma-Aldrich, lote no. BCBG1923V) foi dissolvido em água purificada, 12,5 mL, com agitação magnética. HMV-manose, de 5,0 mg, foi dissolvido na solução de água, também sob agitação.

[00116] Esferas aminadas, 5,0 g, (ExThera Medical, Lote no. 1120341) foram adicionadas à solução e o pH foi ajustado para 3,9 com ácido clorídrico a 0,1 M. O ácido utilizado era HCl a 2M (ExThera AB, Lote no. 121204) Como foi diluída com água purificada (1: 19).

[00117] Uma solução de cianoborohidreto de sódio, 5,0 mg, (Acros Organics, Lote no. A0240008) em 0,5 mL de água purificada foi adicionada à mistura. A mistura foi aquecida a 60°C durante um período de 24 horas.

[00118] O pH foi controlado durante 1 hora e foi, subsequentemente, ajustado para baixo para 3,9 com HCl a 0,1 M a partir de, aproximadamente, 6,4. Após 24 horas o pH aumentou para aprox. 6,2. As esferas foram removidas por filtração em um funil de filtro de vidro (no. 3) e lavadas com 4x50 mL de água purificada. As esferas foram secas ao ar durante a noite à temperatura ambiente.

Exemplo 5 - FIXAÇÃO DE PONTO DE EXTREMIDADE DE MANOSE EM ALDEÍDO AMINADO ATIVADO ESFERAS POR ACOPLAMENTO DE p-AMINOFENIL-A-D-MANOPIRANOSÍDEO

[00119] Ativação de aldeído de esferas PE aminadas usando glutaraldeído prossegue da seguinte forma. Esfera-NH2+ OCH-CH2-CH2-CH2-CHO ^ Esfera-N=CH-CH2-CH2-CH2- CHO + H2O

[00120] Fixação de ponto de extremidade de esferas ativadas por p- aminofenil-α-D-manopiranosideo glutardialdeído prossegue da seguinte forma:

[00121] p-aminofenil-α-D-manopiranosideo tem sido ligado a ponto de extremidade a esferas aminadas ativadas por aldeído por aminação redutora. O cloreto de sódio, 0,73 g.(Sigma-Aldrich, lote no. BCBG 1923V) foi dissolvido em água purificada, 25 mL. p-aminofenil-α-D- manopiranosídeo, 10,0 mg foi dissolvido na solução de água com agitação.

[00122] Esferas de glutaraldeído ativada, 10,0 g, (ExThera AB, Lote no. LAE-I30) foram adicionadas à solução e o pH foi ajustado para 3,9 com ácido clorídrico a 0,1 M. O ácido utilizado para produzir o ácido clorídrico a 0,1 M foi HCL a 2M (ExThera AB, Lote N 121.204) diluído com água purificada (1: 19).

[00123] Uma solução de cianoborohidreto de sódio, 50 mg, (Acros Organics, Lote no. A0240008) em 1 mL de água purificada foi adicionada à mistura. A mistura foi aquecida a 60°C durante 2 horas.

[00124] O pH foi controlado durante 1 hora e foi, subsequentemente, ajustado para 3,9 com HCl a 0,1 M a partir de, aproximadamente, 6,0. Após 2 horas, o pH foi de 5,9.

[00125] As esferas foram removidas por filtração usando um funil de filtro de vidro (no. 3) e lavadas com 4x100 ml de água Dl. As esferas foram secas ao ar durante a noite à temperatura ambiente.

Exemplo 6 Ligação de ponto de extremidade de manose a esferas ativadas com Cloroacetaldeído dimetilacetal

[00126] A ativação do aldeído de esferas PE aminadas usando Cloroacetaldeído dimetilacetal é conduzida como se segue.

[00127] Ligação de ponto de extremidade de p-aminofenil-α-D- manopiranosídeo a esferas ativadas com cloroacetaldeído dimetilacetal é conduzida como se segue.

[00128] Cloreto de sódio, 0,73 g. (Sigma-Aldrich, lote no. BCBG1923V) foi dissolvido em água purificada, 25 mL, com agitação magnética. -p-aminofenila-D-manopiranosídeo, 10,0 mg foi dissolvido na solução de água enquanto se agitava.

[00129] Esferas ativadas com cloroacetaldeído dimethlacetal (vide o relatório 013-IV, p. 6.2), 10,0 g, (ExThera AB, Lote no. LAE-131) foram adicionadas à solução e o pH foi ajustado para 3,9 com ácido clorídrico a 0,1 M. O ácido utilizado para fazer o ácido clorídrico a 0,1 M foi HCl a 2M (ExThera AB, Lote no. 121204) como foi diluída com água purificada (1: 19).

[00130] Uma solução de cianoborohidreto de sódio, 10 mg, (Acros Organics, Lote no. A0240008) em 1 mL de água purificada foi adicionada à mistura. A mistura foi aquecida a 60°C durante 2 horas.

[00131] O pH foi controlado durante 1 hora e foi, subsequentemente, ajustado para baixo para 3,9 com HCl a 0,1 M a partir de, aproximadamente, 4,5. Após 2 horas o pH foi de aproximadamente 4,5. As esferas foram removidas por filtração em um funil de filtro de vidro (no. 3) e lavadas com 4x100 mL de água purificada. As esferas foram secas ao ar durante a noite à temperatura ambiente.

Exemplo 7 - Remoção de E. coli da solução salina utilizando esferas de polietileno modificadas por manose

[00132] Aproximadamente 0,6 grama de manose e/ou meios funcionalizados heparinizados foi embalado em seringas de filtro de 2,5 ml (Mobicol) com placas finais de 100 mícrons. 2 ml de suspensões bacterianas de E. coli ATCC 8739 em solução salina foram preparados por cultura das bactérias durante a noite e diluindo a concentração de 2,05 x 105 CFU / mL. As seringas de filtros embaladas foram lavadas com 3 mL de PBS, seguido por passagem da suspensão bacteriana sobre a seringa três vezes. Foram utilizadas as técnicas de diluição e de revestimento padrão para enumerar as bactérias remanescentes após a terceira passagem através da seringa. O teste foi repetido duas ou três vezes para cada meio. Os resultados são listados abaixo. Esferas heparinizadas foram usadas como controle.

Exemplo 8 - Remoção de K. pneumoniae da solução salina utilizando esferas de polietileno modificadas por manose

[00133] Aproximadamente 0,6 grama de manose ou meios funcionalizados heparinizados foi embalado em seringas de filtro de 2,5 ml (Mobicol) com placas finais de 100 mícrons. 2 ml de suspensões bacterianas de K. pneumoniae ATCC 13883 em solução salina foram preparados por cultura das bactérias durante a noite e diluindo a concentração de 2,25 x 105 CFU / mL. As seringas de filtros embaladas foram lavadas com 3 mL de PBS, seguido por passagem da suspensão bacteriana sobre a seringa três vezes. Foram utilizadas as técnicas de diluição e de revestimento padrão para enumerar as bactérias remanescentes após a terceira passagem através da seringa. O teste foi repetido duas ou três vezes para cada um dos meios. Os resultados estão listados na Tabela 5. As esferas heparinizadas foram usadas como controle.

Exemplo 9 - Remoção de P. aeruginosa da solução salina utilizando esferas de polietileno modificadas por manose

[00130] Aproximadamente 0,6 grama de manose ou meios funcionalizados heparinizados foi embalado em seringas de filtro de 2,5 ml (Mobicol) com placas finais de 100 mícrons. 2 ml de suspensões bacterianas de P. aeruginosa ATCC 9027 em solução salina foram preparados por cultura das bactérias durante a noite e diluindo a concentração de 3,5 x 105 CFU / mL. As seringas de filtros embaladas foram lavadas com 3 mL de PBS, seguido por passagem da suspensão bacteriana sobre a seringa três vezes. Foram utilizadas as técnicas de diluição e de revestimento padrão para enumerar as bactérias remanescentes após a terceira passagem através da seringa. O teste foi repetido duas ou três vezes para cada um dos meios. Os resultados são mostrados na Tabela 6. As esferas heparinizadas foram usadas como controle.

Exemplo 10 - Remoção de E. coli do sangue utilizando esferas de polietileno modificadas com manose

[00131] Aproximadamente 0,6 grama de meios de manose foi embalado em seringas de filtro de 2,5 ml (Mobicol) com placas finais de 100 mícrons. 2 ml de suspensões bacterianas de E. coli ATCC 8739 no sangue foram preparados por cultura das bactérias durante a noite e diluindo a concentração a 6.15E + 05. As seringas de filtros embaladas foram lavadas com 3 mL de PBS, seguido por passagem da suspensão bacteriana sobre a seringa três vezes. Foram utilizadas as técnicas de diluição e de revestimento padrão para enumerar as bactérias remanescentes após a terceira passagem através da seringa. O teste foi repetido duas ou três vezes para cada um dos meios. Os resultados são mostrados na Tabela 7.

Exemplo 11 - Remoção de E. coli (CRE) do sangue usando esferas de polietileno modificadas com manose

[00132] Aproximadamente 0,6 grama de meios de manose foi embalado em seringas de filtro de 2,5 ml (Mobicol) com placas finais de 100 mícrons. 2 ml de suspensões bacterianas de Enterobacteriaceae resistentes a Carbapenem (CRE) E. coli ATCC BAA-2469 no sangue foram preparados pelo cultivo das bactérias durante a noite e diluindo a concentração de 2.57E + 05. As seringas de filtros embaladas foram lavadas com 3 mL de PBS, seguido por passagem da suspensão bacteriana sobre a seringa três vezes. Foram utilizadas as técnicas de diluição e de revestimento padrão para enumerar as bactérias remanescentes após a terceira passagem através da seringa. O teste foi repetido duas ou três vezes para cada um dos meios. Os resultados são mostrados na Tabela 8.

Exemplo 12 - Remoção de K. pneumoniae do sangue usando esferas de polietileno modificadas com manose

[00133] Aproximadamente 0,6 grama de meios de manose foi embalado em seringas de filtro de 2,5 ml (Mobicol) com placas finais de 100 mícrons. 2 ml de suspensões bacterianas de K. pneumoniae ATCC 13883 no sangue foram preparados por cultura das bactérias durante a noite e diluindo a concentração de 4.02E + 05. As seringas de filtros embaladas foram lavadas com 3 mL de PBS, seguido por passagem da suspensão bacteriana sobre a seringa três vezes. Foram utilizadas as técnicas de diluição e de revestimento padrão para enumerar as bactérias remanescentes após a terceira passagem através da seringa. O teste foi repetido duas ou três vezes para cada um dos meios. Os resultados estão apresentados na Tabela 9.

Exemplo 13 - Remoção de K. pneumoniae (CRE) do sangue utilizando esferas de polietileno modificadas por manose

[00134] Aproximadamente 0,6 grama de meios de manose foi embalado em seringas de filtro de 2,5 ml (Mobicol) com placas finais de 100 mícrons. 2 ml de suspensões bacterianas de Enterobacteriaceae resistentes a Carbapenem (CRE) k. pneumoniae ATCC BAA-2146 no sangue foi preparada através da cultura das bactérias durante a noite e diluindo a concentração de 1.40E + 05. As seringas de filtros embaladas foram lavadas com 3 mL de PBS, seguido por passagem da suspensão bacteriana sobre a seringa três vezes. Foram utilizadas as técnicas de diluição e de revestimento padrão para enumerar as bactérias remanescentes após a terceira passagem através da seringa. O teste foi repetido duas ou três vezes para cada um dos meios. Os resultados estão apresentados na Tabela 9.

Exemplo 14 - Remoção de K. pneumoniae (ESBL) do sangue usando esferas de polietileno modificadas com manose

[00135] Aproximadamente 0,6 grama de meios de manose foi embalado em seringas de filtro de 2,5 ml (Mobicol) com placas finais de 100 mícrons. 2 ml de suspensões bacterianas de K. pneumoniae ATCC 700603 de betalactamase de espectro estendido no sangue foram preparados por cultura das bactérias durante a noite e diluindo a concentração de 2.82E + 05. As seringas de filtros embaladas foram lavadas com 3 mL de PBS, seguido por passagem da suspensão bacteriana sobre a seringa três vezes. Foram utilizadas as técnicas de diluição e de revestimento padrão para enumerar as bactérias remanescentes após a terceira passagem através da seringa. O teste foi repetido duas ou três vezes para cada um dos meios. Os resultados são mostrados na Tabela 10.

Exemplo 15 - Remoção de S. pneumoniae do sangue utilizando esferas de polietileno modificadas por manose

[00136] Aproximadamente 0,6 grama de meios de manose foi embalado em seringas de filtro de 2,5 ml (Mobicol) com placas finais de 100 mícrons. 2 ml de suspensões bacterianas de S. pneumoniae ATCC 6301 em sangue foram preparados por cultura das bactérias durante a noite e diluindo a concentração de 9.80E + 04. As seringas de filtros embaladas foram lavadas com 3 mL de PBS, seguido por passagem da suspensão bacteriana sobre a seringa três vezes. Foram utilizadas as técnicas de diluição e de revestimento padrão para enumerar as bactérias remanescentes após a terceira passagem através da seringa. O teste foi repetido duas ou três vezes para cada um dos meios. Os resultados são mostrados na Tabela 11.

Exemplo 16 - Remoção de E. faecalis do sangue utilizando esferas de polietileno modificadas por manose

[00137] Aproximadamente 0,6 grama de meios de manose foi embalado em seringas de filtro de 2,5 ml (Mobicol) com placas finais de 100 mícrons. 2 ml de suspensões bacterianas de E. faecalis ATCC 29212 no sangue foram preparados por cultura das bactérias durante a noite e diluindo a concentração de 6.43E + 05. As seringas de filtros embaladas foram lavadas com 3 mL de PBS, seguido por passagem da suspensão bacteriana sobre a seringa três vezes. Foram utilizadas as técnicas de diluição e de revestimento padrão para enumerar as bactérias remanescentes após a terceira passagem através da seringa. O teste foi repetido duas ou três vezes para cada um dos meios. Os resultados são mostrados na Tabela 12.

Exemplo 17 - Remoção de E. faecalis (VRE) do sangue utilizando esferas de polietileno modificadas por manose

[00138] Aproximadamente 0,6 grama de meios de manose foi embalado em seringas de filtro de 2,5 ml (Mobicol) com placas finais de 100 mícrons. 2 ml de suspensões bacterianas de E. faecalis ATCC 51575 (VRE) resistentes a vancomicina no sangue foram preparados através da cultura das bactérias durante a noite e diluindo a concentração de 6.17E + 05. As seringas de filtros embaladas foram lavadas com 3 mL de PBS, seguido por passagem da suspensão bacteriana sobre a seringa três vezes. Foram utilizadas as técnicas de diluição e de revestimento padrão para enumerar as bactérias remanescentes após a terceira passagem através da seringa. O teste foi repetido duas ou três vezes para cada um dos meios. Os resultados são mostrados na Tabela 13.

Exemplo 18 - Remoção de E. faecium do sangue utilizando esferas de polietileno modificadas por manose

[00139] Aproximadamente 0,6 grama de meios de manose foi embalado em seringas de filtro de 2,5 ml (Mobicol) com placas finais de 100 mícrons. 2 ml de suspensões bacterianas de E. faecium ATCC 51559 em sangue foram preparados por cultura das bactérias durante a noite e diluindo a concentração de 9.17E + 05. As seringas de filtros embaladas foram lavadas com 3 mL de PBS, seguido por passagem da suspensão bacteriana sobre a seringa três vezes. Foram utilizadas as técnicas de diluição e de revestimento padrão para enumerar as bactérias remanescentes após a terceira passagem através da seringa. O teste foi repetido duas ou três vezes para cada um dos meios. Os resultados são mostrados na Tabela 14.

Exemplo 19 - Remoção de A. baumannii do sangue utilizando esferas de polietileno modificadas por manose

[00140] Aproximadamente 0,6 grama de meios de manose foi embalado em seringas de filtro de 2,5 ml (Mobicol) com placas finais de 100 mícrons. 2 ml de suspensões bacterianas de A. baumannii ATCC 19606 no sangue foram preparados por cultura das bactérias durante a noite e diluindo a concentração de 1.83E + 05. As seringas de filtros embaladas foram lavadas com 3 mL de PBS, seguido por passagem da suspensão bacteriana sobre a seringa três vezes. Foram utilizadas as técnicas de diluição e de revestimento padrão para enumerar as bactérias remanescentes após a terceira passagem através da seringa. O teste foi repetido duas ou três vezes para cada um dos meios. Os resultados são mostrados na Tabela 15.

[00141] A descrição neste pedido de patente destina-se a ser ilustrativa e não limitativa da invenção. Um versado na técnica irá reconhecer que a variação em materiais e métodos utilizados na presente invenção e as variações das modalidades da invenção aqui descritas são possíveis sem se afastarem da invenção. Deve ser entendido que algumas modalidades da invenção podem não exibir todas as vantagens da invenção para alcançar cada objetivo da invenção. O âmbito da invenção é definido somente pelas reivindicações seguintes.

Claims (6)

1. Método de ligação em ponto de extremidade de uma manose não redutora a um substrato contendo amina caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: ligar um aldeído intermediário a um substrato contendo amina primária antes de ligar a dita manose não redutora para produzir um substrato aminado; contatar o substrato aminado com uma solução aquosa contendo a dita manose não redutora para formar uma base de Schiff intermediária; e contatar a base de Schiff com um agente redutor para ligar a dita manose não redutora.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita solução aquosa é ácida.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito substrato contendo amina primária é uma esfera tendo uma amina primária.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito agente redutor é um membro selecionado dentre cianoborohidreto de sódio e borohidreto de sódio.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende adicionalmente a reação de heparina tendo uma funcionalidade aldeído reativo.

6. Esfera caracterizada pelo fato de que possui uma manose ligada em ponto de extremidade feita de acordo com o método conforme definido na reivindicação 1, em que a dita manose ligada em ponto de extremidade é ligada covalentemente à esfera através de um aldeído intermediário para formar uma base de Schiff e então redução da base de Schiff.

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