JPH01135532A - 血清アミロイドａ蛋白用吸着体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は血液などに含まれる血清アミロイドＡ（以下、
ＳＡＡという）蛋白を除去するためのＳＡＡ蛋白用吸着
体に関する。

［従来の技術および発明が解決しようとする問題点］ アミロイド−シスはアミロイド物質と呼ばれるβ−フィ
ブリル状の蛋白が血管、臓器およびその他の組織に沈着
し、心、腎などの臓器不全、心刺激伝導障害、進行性痴
呆、脳血管障害、神経障害などの重篤な障害を惹きおこ
す疾患である。

アミロイド−シスには原発性、続発性、家族性、老人性
などの病型が存在することが知られている。続発性アミ
ロイド−シスは、慢性関節リウマチ、若年性関節リウマ
チ、肺化膿症、肺結核などの疾患に続発して起こり、好
発部位として腎、甲状腺、膵、肝、牌などがあげられる
。

アミロイド−シス沈着物質の蛋白組織は病型により異な
る。続発性アミロイド−シスではアミロイド−シス沈着
物質は、アミロイドＡ（以下、Ａ＾という）蛋白と呼ば
れる分子量が８．５００でアミノ酸７Ｂ個からなる蛋白
質により形成されている。

また、それぞれの病型において沈着するアミロイド−シ
ス沈着物質に対応する前駆物質が患者血液中に存在する
ことが明らかになりつつある。続発性アミロイド−シス
では高密度リポ蛋白（以下、ＨＤＬという）のアポリポ
蛋白のひとつであるＳＡＡ蛋白がアミロイド−シス沈着
物質であるＡＡ蛋白の前駆物質であるとされている。

このＳＡＡ蛋白は分子全豹１２．０００で、肝細胞で産
生され、血液中でＨＤＬのアポリポ蛋白となり体内を循
環しＨＤＬから離れて加水分解され、ＡＡ蛋白となって
組織に沈着すると考えられている。

また、ＳＡＡ蛋白は、ＨＤＬの中では密度が大きく、分
子量が１．７５　ｘｉｏｓであるＨＤＬ３のアポリポ蛋
白として存在していると考えられている。

アミロイド−シスは前記のごとく重篤な疾患であり、死
亡率も高いことからその治療法について盛んに研究され
てきたが、これまでのところ有効な治療法、とくに薬物
療法は見出されていない。

一方近年盛んに行なわれるようになってきた体外循環に
よる血液浄化法、とりわけ血漿交換法によりアミロイド
−シスを治療する試みがなされており、前記の前駆物質
を多量に含存する患者血漿を正常血漿と交換することに
より症状の軽快、病変の進行停止が見られるとの報告が
なされている。

体外循環による血液浄化法とりわけ血漿交換法は現在の
ところ最も有効な治療法であるが、高価かつ貴重な正常
血漿あるいは血漿製剤を大量に使用すること、また患者
血漿中に含まれる前駆物質以外の有用成分も同時に廃棄
されるなどの欠点を有しているため、前駆物質をより選
択的に除去する方法の開発が強く望まれている。

本発明は斜上の問題点を解決し、ＳＡＡ蛋白を選択的に
除去しうる安価なＳＡＡ蛋白用吸着体を提供すること目
的とするものである。

［問題点を解決するための手段］ 本発明はアニリンおよび／またはアニリン誘導体を水不
溶性担体に固定してなることを特徴とするＳＡＡ蛋白用
吸着体に関する。

［実施例］ 本発明に用いるアニリンおよび／またはアニリン誘導体
のうちアニリン誘導体としては、たとえばＮ−メチルア
ニリン、Ｎ−エチルアニリンなどのＮ−モノアルキルア
ニリン類、ｏ−トルイジン、ａ−トルイジン、ｐ−トル
イジン、２．３−キシリジン、２．４−キシリジンなど
の芳香族環アルキル置換アニリン類、０−アミノアニソ
ール、■−アミノアニソール、ｐ−アミノアニソール、
２−アミノフェネトール、３−アミノアニソ−ル、４−
アミノフェネトールなどの芳香族環アルコキシ置換アニ
リン類のほか、０−クロロアニリン、１−クロロアニリ
ン、ｐ−クロロアニリン、０−ニトロアニリン、■−ニ
トロアニリン、ｐ−ニトロアニリン、２．４−ジニトロ
アニリン、２．６−ジニトロアニリン、３．５−ジニト
ロアニリン、０−アミノ安息香酸、園−アミノ安息香酸
、ｐ−アミノ安息香酸ナトリウム、０−アミノ安息香酸
エチル、■−アミノ安息香酸エチル、ｐ−アミノ安息香
酸エチル、０−アミノベンゼンスルホン酸、ｍ−アミノ
ベンゼンスルホン酸、ｐ−アミノベンゼンスルホン酸、
ｐ−アミノベンゼンスルホン酸ナトリウム、ｐ−アミノ
ベンゼンスルホンアミド、０−アミノフェノール、「−
アミノフェノール、ｐ−アミノフェノール、０−アミノ
フェネチルアルコール、ｐ−アミノフェネチルアルコー
ル、０−フェニレンジアミン、０−フェニレンジアミン
、ｐ−フェニレンジアミン、２−アミノトルエン−５−
スルホン酸、３−アミノトルエン−〇−スルホン酸、４
−アミノ　−３−ニトロベンゼンスルホン酸、２−アミ
ノ　−５−ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム、２−
アミノ　−４−ニトロアニソール、２−アミノ　−４−
ニトロトルエンなどのように１種類以上の置換基を１個
以上芳香族環上に有するアニリン類などがあげられるが
、本発明はこれらのみに限定されるものではない。なお
、アニリンおよび前記アニリン誘導体はそれぞれ単独で
用いてもよく、また２種類以上混合して用いてもよい。

また、水不溶性担体にアニリンおよび／またはアニリン
誘導体を固定させる方法は公知の種々の方法を特別な制
限なしに用いることができる。

すなわち、物理的方法、イオン結合法、共有結合法など
があげられる。固定化されたアニリンおよび／またはア
ニリン誘導体が脱離しにくいことが重要であるため、結
合の強固な共有結合法が好ましく、その他の方法を用い
るにしても脱離を防ぐようにすることが好ましい。また
必要に応じてスペーサーを水不溶性担体とアニリンおよ
び／またはアニリン誘導体の間に導入してもよい。

本発明に用いる水不溶性担体としては無機担体、合成高
分子あるいは多糖類からなる有機担体あるいは有機担体
および無機担体からなる複合担体のいずれであってもよ
いが、血液中に存在するＳＡＡ蛋白の存在環境からいえ
ば親水性の水不溶性担体が好ましく、さらには目的物質
以外の物質の吸着、いわゆる非特異吸着が少ないものが
好ましい。さらには担体表面に固定化反応に用いうる官
能基あるいは容易に活性化しつる官能基が存在している
と好都合である。これらの官能基の代表例としてはアミ
ノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、チオール基、
酸無水物基、サクシニルイミド基、塩素基、アルデヒド
基、アミド基、エポキシ基、シラノール基などがあげら
れる。

本発明に用いる好ましい水不溶性担体の代表例としては
ガラスピーズ、シリカゲルなどの無機担体、架橋ポリビ
ニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアミ
ドなどの合成高分子や結晶性セルロース、架橋セルロー
ス、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類か
らなる有機担体など、さらには無機担体表面を合成高分
子化合物あるいは多糖類などでコーティングした有機担
体と無機担体の複合担体、合成高分子化合物よりなる担
体表面を多糖類でコーティングしたような有機担体と有
機担体の複合担体などがあげられるが、本発明はこれら
のみに限定されるものではない。

本発明でえられる吸着体の形状は粒状、繊維状、膜状あ
るいはホローファイバー状などいずれの形状であっても
よく、また吸着体の微細構造は多孔質あるいは非多孔質
のいずれであってもよいが、単位体積あたりの高い吸着
能をうるためには比表面積が大きいこと、すなわち多孔
質であることが好ましい。

本発明でえられる吸着体は、血液、血清、血漿およびそ
の希釈液あるいはこれらの液に血球除去や血清タンパク
除去などの前処理を施したものなどのようなＳＡＡ蛋白
を含む溶液よりＳＡＡ蛋白を除去するために用いること
ができ、アミロイド−シス患者の体外循環治療用吸着体
としても用いることができる。たとえば、体外循環治療
用吸着体として用いるばあい、吸着体の圧密化を防ぐた
めには充分な機械的強度を有し、さらに単位体積あたり
の高い吸着量をうるためには多孔質の性状を有する吸着
体であるのが好ましい。たとえば水不溶性担体にアニリ
ンを固定してなる本発明の吸着体において水不溶性担体
としてゲルを用いるばあい、かかるゲルは硬質ゲルであ
り、かつ多孔質とくに全多孔質のゲルであるのが好まし
く、さらには細孔径は、１２．０００の分子量をもつＳ
ＡＡ蛋白がゲル内（、″侵入できるのに充分な大きさで
あることが好ましい。

ここでいう硬質ゲルとは後記参考例に示すごとく、ゲル
を円筒状カラムに均一に充填し、水性流体を流した際の
圧力損失と流量の関係が、０．３ｋｇ／　ｃｍ２まで直
線関係にあるものをいう。

また多孔質とは細孔容積が２０％以上で比表面積が３ｒ
ｄ１ｇ以上のものであることを意味し、ＳＡＡ蛋白がゲ
ル内に侵入できるのに充分な大きさの細孔径とは、ゲル
の細孔径の目安としてよく用いられる排除限界分子量が
１２．０００以上（球状蛋白質を用いてえられた値）の
大きさを意味する。

排除限界分子量とはたとえば「実験高速液体クロマトグ
ラフィ」　（波多野博行、花卉俊彦共著、鱒化学同人発
行）などの成書に記載されているごとく、ゲル浸透クロ
マトグラフィにおいて細孔内に侵入できない、すなわち
排除される分子のうち最も小さい分子量を有するものの
分子量をいう。

つぎに実施例に基づいて本発明の吸着体およびその製法
をさらに詳細に説明するが、本発明はもとよりこれらの
みに限られるものではない。

参考例 両端に孔径１５虜のフィルターを装着したガラス製円筒
カラム（内径９Ｉｌ１１１１カラム長さ１５ｈａ）にア
ガロースゲル（バイオラド（Ｂｌｏｒａｄｏ）社製のＢ
ｌｏｇｅｌ　Ａ５ｍ、粒径５０〜１００メツシユ）、ポ
リマー硬質ゲル（東洋曹達工業■製のトヨパールＨＷ８
５、粒径５０〜１００加、およびチッソ■製のセルロフ
ァインＧＣ−７００、粒径４５〜１０５Ｉ）をそれぞれ
均一に充填し、ペリスタルティックポンプにより水を流
し、流量と圧力損失ΔＰとの関係を求めた。その結果を
第１図に示す。

第１図の結果からポリマー硬質ゲルが圧力の増加にほぼ
比例して流量が増加するのに対し、アガロースゲルは圧
密化をひきおこし、圧力を増加させても流量が増加しな
いことがわかる。

実施例１ 多孔質セルロースゲルであるＣＫゲルＡ３　（商品名、
チッソ■製、球状蛋白質の排除限界分子量５０００万、
粒径８３〜１２５項）　１０ｍ１に水ＩＱｍｌ、２Ｎ水
酸化ナトリウム水溶液５　、４　ｍｌおよびエピクロル
ヒドリン１．９ｍｌを加え、４０℃で２時間撹拌した。

反応後ゲルを濾別、水洗してエポキシ化ゲルをえた。

えられたエポキシ化ゲル１０ｍ１に、水８ｍｌおよびア
ニリン１２０　ｍｇを加え、よく混合したのち、５０℃
で静置下、６時間反応させた。反応後ゲルを濾別し、水
洗してアニリン固定化ゲルをえた。

えられたアニリン固定化ゲル０．４ｍｌを試験管にとり
、ＳＡＡ蛋白を含むヒト血清２　、４　ｍｌを加えたの
ち、３７℃で２時間振盪した。振盪後、上澄み液のＳＡ
Ａ蛋白および）ＩＤＬ−コレステロールの濃度を測定し
た。その結果を第１表に示す。なお、ＳＡＡ蛋白の濃度
測定は、下記の方法にしたがって行なった。

（ＳＡＡ蛋白の濃度測定方法） ＳＡＡ蛋白の濃度は固相酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）によ
り測定した。すなわちプレートに、まず希釈した抗ＳＡ
Ａ抗体（ヘキスト社製）を滴下し、プレートに抗体を１
２時間４℃で静置して固定した。

つぎに希釈した検体および標準血清を滴下し抗原−抗体
反応を室温で３時間行ない、ベルオキシターゼ標識抗Ｂ
ＡＡ抗体を滴下して同様に抗原−抗体反応を室温で３時
間行なった。洗浄後、酵素発色反応を行ない、その発色
の程度をＣ８−９３０（商品名、■島津製作所製）にて
測定（吸光度：　　４９２ｎ■）した。検体についての
発色の程度と標準血清についての発色の程度を比較する
ことにより、標準血清中のＳＡＡ蛋白の濃度を１とした
ときの検体中のＳＡＡ蛋白の濃度を求めた。

実施例２ 実施例１でえられたエポキシ化ゲル１０ｍ１に水１０ｍ
１およびヘキサメチレンジアミン５７ｔａｇを加え、充
分に混合したのち、４０℃で２日間静置下、反応させた
。反応後ゲルを濾別し、水洗してアミノ化ゲル（以下、
Ｎ−ゲルという）をえた。えられたＮ−ゲル１０ｍ１を
グラスフィルター上で５０　ｍｌの１０容量％トリエチ
ルアミンジオキサン溶液と１００　ｍｌのジオキサンに
より、順番に置換洗浄したのち反応容器に移し、９０　
ｍｇの安息香酸を溶解した２５ｍ１のジオキサンを加え
た。これにジシクロヘキシカルボジイミド１００　ｍｇ
を溶解したジオキサン２　ｍｌを撹拌下で加え、３時間
撹拌下反応させたのちさらにジシクロヘキシカルボジイ
ミド１００　ａ＋ｇを溶解したジオキサン２　ｍｌを加
え、さらに３時間撹拌下反応させた。反応後ゲルを濾別
し、ジオキサン、メタノール、ジオキサン、水の順でゲ
ルを洗浄し安息香酸固定化Ｎ−ゲルをえた。

えられたゲルを実施例１と同様の方法にしたがって処理
し、ＳＡＡ蛋白および１ＩＤＬ−コレステロールの濃度
を測定した。その結果を第１表に示す。

比較例１ 実施例１でえられたエポキシ化ゲル１０　ｍｌにｎ−オ
クチルアミン４０１ｇを加え、５０％（Ｖ／Ｖ）エタノ
−ル水溶液中、室温で静置下６日間反応させた。

反応終了後、５０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶岐、水で
充分に洗浄し、ｎ−オクチルアミン固定化ゲルをえた。

えられたゲルを実施例１と同様の方法にしたがって処理
し、ＳＡ＾蛋白およびＩＩＤＬ−コレステロールの濃度
を測定した。その結果を第１表に示す。

比較例２ 実施例１でえられたアニリン固定化ゲルのかわりに０．
２４ｍ１の生理食塩水を用いたほかは実施例１と全く同
様にしてえられた上澄み液のＳＡＡ蛋白およびＩＩＤＬ
−コレステロールの濃度を測定した。その結果を第１表
に示す。

［以下余白］ 第１表 第１表の結果から本発明の吸着体を用いるとＳＡＡ　Ｉ
白は吸着されるが、ＨＤＬはほとんど吸着されていない
ことがわかる。

［発明の効果］ 本発明の吸着体は安価であり、体液中に一含まれるＳＡ
Ａ蛋白を選択的に除去することができるという効果を奏
する。

【図面の簡単な説明】

第１図は３種類のゲルを用いて流速と圧力損失との関係
を調べた結果を示すグラフである。 才１図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　アニリンおよび／またはアニリン誘導体を水不溶性
   担体に固定してなることを特徴とする血清アミロイドＡ
   蛋白用吸着体。 ２　水不溶性担体が親水性担体である特許請求の範囲第
   １項記載の血清アミロイドＡ蛋白用吸着体。 ３　水不溶性担体が多孔質体である特許請求の範囲第１
   項記載の血清アミロイドＡ蛋白用吸着体。