JPS6187631A - 静脈内に注射可能な免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）及びその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の分野 本発明は静脈内注射に適した高純度免疫グロブリンＧ（
ＩｇＧ）及び動物血漿から高収率で高純度ＩｇＧを製造
する方法に向けられたものである。本発明の高度に精製
されたＩｇＧは顕著に凝集物、断片、蛋白質分解酵素、
酵素賦活剤、凝固因子などがなく、極めて減少した抗−
補体活性を有する。

更に、有用な高純度副生物１例えばプロトロンビン複合
体、トランスフェリン、及びアルブミンなども回収する
こと力ｔできる。

背景技術の簡単な説明 血液は一つのタイプの液体マ）　ＩＪフックスの結合組
織として分類することができる。血液の細胞外液体マト
リックスは血漿と呼ばれ、形成された要素が血漿内に懸
濁されている。を椎動物における三つ０主たるタイプの
形成要素は赤血球、白血球及び血小板である。後者はお
そらく細胞断片として生ずる小さな円盤状の物体である
。通常形成要素は全血液容量の約初〜ＳＯ＜を構成する
のに対し、血漿はその他の５０−６０憾を構成する。

血漿は約９８の水と水中に溶質として溶解されている各
頂物質よりなる残シの約１０４からなる。

これらの溶質は六つの基本的範隣、即ち（１）無機イオ
ン類、（２）血漿蛋白質類、（３）有機栄養素、（４）
窒素含有老廃物、（５）輸送される特別の生成物、及び
（６）溶存ガスに分類することができる。血漿蛋白質類
は血漿の約７〜２重量係を占め、基本的には脂蛋白質類
、フィブリノーゲン類、アルブミン類及びグロブリン類
の混合物である。

グロブリン類は蛋白質の一群である。グロブリンの中に
は、抗体活性の部位を有する血漿グロブリンの一群であ
るガンマグロブリン類がある。これらのガンマグロブリ
ン類は又、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）が主たる構成成
分である免疫グロブリン類としても又知られている。

集められた血漿のＩｇＧ画分は多くのウィルス類及び細
菌に対する抗体を含有し、従って、広範囲の病気の状態
の臨床的管理に有効である。ＩｇＧの代表的用途として
は、遺伝的及び病院内で発生した抗体欠陥状態を有する
ヒトにおける感染症、特にブドウ球菌類、肺炎球菌類、
連鎚状球菌類及びＨ、インフルエンザ（Ｈ，１ｎｆｌｕ
ｅｎｚａｅ　）感染症の予防及び治僚、肝炎、ポリオ、
麻疹、風疹、狂犬病、ヘルペス及びおたふく風などのウ
ィルス感染症の正常な免疫グロブリン濃度を有する患者
における予防、破傷風及びＲｈ−不適合性の正常な免疫
グロブリン濃度を有する患者における予防、及び細菌例
えばブドウ球菌、大腸菌、緑濃菌、敗血症菌（ｐｙｏｃ
ｙａｎｅａｕｓ　　ｓｅｐ目ａｅｒｎｉａｓ　）などに
よる重度の細菌感染症及び帯状ヘルペス（Ｈｅｒｐｅｇ
ｚｏａｔｅｒ　）などのウィルス感染症の治療などが挙
げられる。

ヒトの免疫グロブリンは第二次世界大戦中最初に大量に
単離されたが、通常の免疫グロブリンの静脈内注射には
しばしば受領者に厄介な副作用が伴い、これらの副作用
はアナフィラキシ−及びそれに伴う問題を含むものであ
った。従来技術の免疫グロブリンの静脈内注射により引
き起こされる望ましくない副作用の中には紅斑、吐気、
腹痛、熱及び意識の喪失などが含まれる。従って、予防
及び治療目的のＩｇＧ調剤の使用は主として筋肉内或い
は皮膚下注射による投与に限られていた。しかしながら
、これらの経路によるＩｇＧの利用には、各部位に注射
されることのできる溶液の最大容量。

血液流中に最大抗体濃度を達成するまでの注射からの遅
れ、注射部位から血液室に通じる際の抗体の損失及び投
与部位における激しい不快感などの実質的に制限的要素
が含まれている。

ガンマグロブリン類の静脈内注射に伴うアナフィラキシ
一様反応は明らかに投与ガンマグロブリンによる補体結
合により引き起こされた血清補体濃度の減少が伴ってい
る。〔Ｓ、バランダン等（Ｓ、　Ｂａｒａｎｄｕｎ、　
　ｏＬ　ａｌ、、　　Ｖｅｘ　　Ｓａｎｇ　７　：　／
３７−／７μ（１９６２）〕。抗−補体性と称されるガ
ンマグロブリンの補体を結合する能力はガンマグロブリ
ンが精製される従来公知の分別法即ち、コーン（Ｃｏｈ
ｎ　）分別法の際にもたらされる変性の結果。

大きく増大するようである。これらの凝集物の補体結合
機構は抗原−抗体複合体のそれと同一であるよ５に思わ
れる。ＣＤｏＭ、マーカス（Ｄ、　Ｍ。

Ｍａｒｃｕｓ　）　、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、ｒ弘
：　ｘ７３−２１ｒａ　（１９ｔＯ）〕。

免疫グロブリンの静脈内投与はＩｇＧの全投与量が血流
中に注射箇所における劣化なしに直ちに入り、血液中の
相当により高いＩｇＧ濃度を達成することが出来るので
筋肉内投与よりもより広い臨床的用途を有する。ＩｇＧ
１７）静脈内投与は体液の免疫因子に欠陥を有する患者
に殆んど直ちに高濃度の抗体を生成するのに対し、注射
が筋肉内経路による場合には個人の免疫機構により特具
的抗体が合成されるまでには、しばしば／週間〜数週間
を必要とし、又、患者の血液濃度が注射されたグロブリ
ンの投与量のＩＡｏ４に到達するのに３日より長くかか
る。抗体はウィルス及び細菌などの抗原と特具的に結合
する能力を有し、・得られた抗原及び抗体複合体は抗体
分子のＦｃ部分によりマクロファージ或いは補体因子に
結合し、それにより食菌作用を開始する、 ヒトの免疫グロブリンは化学的及びアイソタイプの性質
に基づいて五つの主たるクラスに分類さ“れる。これら
の五つのクラスはＩｇＧ、ＩｇＡ、　ＩｇＭ。

ＩｇＤ及びＩｇＥである。１ｇ分子の各クラスは小さい
（軽い）及び大きい（重い）ポリペプチド鎖で構成され
ている。五つのクラスの各々は同様な軽鎖の組を有する
が、抗原的に区別された組の重鎖な有する。ＩｇＧ免疫
グロブリンは約Ｈｏ、ｏｏｏの分子量を有し、殆んどの
正常及び高免疫の個人の血清中のＩｇのろｓｔｓを越え
て占める、ＩｇＧ蛋白質は分子量ｐＸ）−＃のジスルフ
ィド結合を有し１分子は各り約ｓｏ、ｏｏｏの分子量を
有する二本の重鎖及び各々約２．ｔ、　ｏ　ｏ　ｏの分
子量を有する二本の軽鎖より構成される。更に、ＩｇＧ
クラスの蛋白質は四つのサブクラスＩｇＧ　−／　−Ｉ
ｇＧ−μに分けることができ、各々は異った重鎖な有す
る。本発明においてｒＩｇＧＪという用語の使用により
主として典型的に全てのサブクラス（／−ｐ）のＩｇＧ
を含み、任意に少量のその他の免疫グロブリンを含む免
疫グロブリンが意味される、 本発明の前には免疫グロブリン類は主として供与者の血
清或いは胎盤から多変数系における血漿蛋白質の溶解度
の相異に基づくコーン（Ｃｏｈｎ　）の分別法によりエ
タノール濃度、ｐＨ、イオン強度、温度及び蛋白質濃度
を注意深くコントロールすることにより単離されていた
。〔コーン、Ｅ。

Ｊｌ等（Ｃｏｈｎ、　Ｅ、Ｊ、　、　ｅｔ　ａｌ、）、
Ｊ、Ａｍ。

Ｃｈｓｍ、　Ｓｏａ、　　６１　：　　４４３２　（１
９ｐＡ　）］　。

しかしながら、この分別過程中に形成されるＩｇＧ凝集
物による抗−補体活性のために、静脈内許容度を達成す
る努力においてコーン分別において得られた免疫グロブ
リンを更に処理する必要がある。ＩｇＧ凝集を防止する
ため１（コーン分別法より得られた免疫グロブリンを更
に処理する方法としては次の四つの基本的操作が存在す
る。

１、　プラスミン或いはペプシンによる酵素的劣化、コ
、ベータープロピオラクトン或いはスルホン化、若しく
は還元及びアルキル化による鎖間ジスルフィト架橋の切
断によるＩｇＧ分子の化学的変性。

３．ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びヒドロキシ
エチルデンプン（ＨＥＳ　）を用いた沈澱による或いは
微量のペプシンを用いたｐＨにおける処理による凝集物
の選択的除去、 ｕ、　　５ｅｐｂａｄｅｘ”Ｃ！；０などのＤＥＡＥゲ
ルによる凝集物の吸着。

これらの操作のいずれも商業的に経済的である方法にお
いて、静脈内用の高純度のＩｇＧを製造する際には完全
に満足できるものではない。

プラスミン或いはペプシンによる酵素的劣化がスゴーリ
［Ｓｇｏｕｒｉｓ、　　Ｊ、Ｔ、、　ＶＯＸ　　Ｓａｎ
ｇ　　／３　：’ｙｉ−ｒ弘（１９６７）〕及びシｘＡ
／ツ等〔５ｃｂｕｌｔｚｅ。

Ｈ，Ｅ、、　Ｕｓｂｅｒ　　Ｎｅｕｅ　　Ｍｏｇ−Ｄｅ
ｕｔＣｈｅ　　Ｍｅｄ。

Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ、　１７　：　／Ｇ４’Ｊ−／４
３０　（１９６２）　〕により報告されている。ガンマ
グロブリンをペプシンでｐＨ’ｔ、０で処理すると分子
の蛋白質分解による切断が生じ、約１０ｏ、ｏｏｏの分
子量の断片を与える〔Ａ、ニサノー等（Ａ、ＮＮ１５ａ
ｎａ、　ａｔ、　ａｌ、。

５ｃｉｅｎｃｅ　　　／Ｊ、２　　：　／７７０−／７
７／　（／り６０）〕。

この残った断片は二価の抗体活性を保持し、抗補体活性
に欠け、Ｗ、パウムガルテン〔Ｗ。

Ｂａｕｍｇａｒｔｅｎ、　ＶＯＸ　Ｓａｎｇ　　／Ｊ　
：　ｌｒ弘（／りＡ７）〕により報告されているように
静脈内投与において十分に許容可能であり、有効である
。しかしながら、与えられる治療効果は、この物質が迅
速に分泌され、未変性ガンマグロブリンのｌヂ１．ｒ日
に対比して僅かにｉｔ待時間循環半減期を有するに過ぎ
ないので、許容できない程度の短期間のものである（　
Ｅ、メルラー等（Ｅ、　Ｍｅｒｌｅｒ、　　ａｔ　ａｌ
、、　）Ｖｏｘ　Ｓａｎｇ　　／Ｊ　：　１０コ（１９
６７）；Ｂ、ヤーガー（Ｂ、　Ｊａｇｅｒ　）　、　Ａ
ｒｃｂ、Ｉｎｔｅｒｎ＋Ｉｎｔｅｒｎ０Ｍａｄ。

／１９：　６０　（／り６７）〕。ペプシン処理操作の
もう一つの利点は、残存するペプシンが動物起源のもの
であり、抗体産生な特に繰り返し投与に際して刺戟する
ことが可能なことである〔Ｃ，ブラトリックス等（Ｃ，
Ｂｌａｔｒｉｘ、　ａｔ　ａｌ、）、　ＰｒｅｓｓｅＭ
ｓｄ、　７７　：　６３！　−６３７（／ヂ６り〕〕。

ガンマグロブリンをヒトプラスミンで処理すると約ｔｏ
、ｏｏｏの分子量の３個の成分への切断が生ずる〔上記
Ｊ、　Ｔ、ｙ、グリ−（Ｊ、　Ｔ、Ｓｇｏｕｒｉｓ　）
　）十分に低割合のプラスミン力を使用された場合には
僅かに約１３４の分子が切断されるに過ぎず、８憾は元
のままのガンマグロブリンとしてとどまる。

残存する元のガンマグロブリンは殆んど抗−補体活性を
示さず、悪い反応を起こすことなく静脈内に投与された
（Ｊ、ヒンマン等（Ｊ、　Ｈｌｎｍａｎ。

ｅｔ　　ａｔ、）　、Ｖｏｘ　　Ｓａｎｇ　　／Ｊ　：
♂ｚ　（／９Ａ７　）　　）。

この物質は又ｉｎ　　ｖｉｔｒｏ及びｉｎ　　ｖｌｖｏ
　　で保護的活性を保持すると報告されそいる（Ｓ、に
、、フイッツバトリック（Ｓ、　Ｋ、　Ｆｉｔｚｐａｔ
ｒｉａｋ　）　ｐＶＯＸ　　Ｓａｎｇ　、　／３　：　
１１　（／り６７）〕。その様なガンマグロブリンの処
理の欠点は投与前にプラスミンがＩｇＧから除去されな
ければならないことである。更に＋　ＩｇＧのサブクラ
スの幾つかが欠けていることが判明している〔ローマ−
”４　（Ｒｏｍｅｒ、　ａｔｍｌ、）Ｖｏｘ　　Ｓａｎ
ｇ　　４’２　：　Ａλ−７３（１９ｒｘ　）　’）。

Ｓ、バランダン等（Ｓ、　Ｂａｒａｎｄｕｎ　　＠ｔ　
ａｌ、。

Ｖｏｘ　Ｓａｎｇ　　７　：　／３７−／’；１１　（
／り６２）〕はガンマグロブリンのジスルフィド結合の
抗−補体活性に及ぼす影響について報告している。ガン
マグロブリンの７幅溶液を０．２Ｍシステアミンで処理
後。

ｏ、ｘｙ１ヨードアセトアミドで処理したところ、殆ん
ど完全な抗−補体活性の喪失が生じた。しかしながら、
ヨードアセトアミドの毒性はこれを静脈注射可能なガン
マグロブリンに不適当なものとする。メルカプトエタノ
ール（Ｊ、Ｂ、　７ライシーマン等（Ｊ、　Ｂ、Ｆｌｅ
ｉｇｂｍａｎ　、　　ｅｔ　ａｌ、）、Ａｒｃｈ　。

Ｂ１０ｃｈｏｍ、＆　Ｂ１０ｐｈｙｓ、　　５ｕｐｐ、
／　：／７４Ａ−／Ｉｒ０（／り６２）〕及びメルカプ
トエチルアミン〔Ｇ。

Ｎ、エーデ／ｌ／？ン（Ｇ、　Ｎ、　Ｅｄｅｌｍａｎ　
）、Ｊ、Ａｍ。

Ｃｂｓｍ、　　Ｓｏｃ、　　ｒ／　：　３／！！　（／
りｊり）〕がガフ−７グロプリンの錫量ジスルフィド結
合を減少させることができることが示されている。メル
カプタン減少をより起こしやすいジスルフィド結合は、
補体固定に関連しているように思われるのに対し、メル
カプタンたよる減少に対してより耐性を有するジスルフ
づド結合は抗原との相互作用に関連しているように思わ
れる［　Ｃ，Ｈ，シー−；等（ｃ。

ＨｏＳｃｂｕｒ、　ｓｔ　ａｌ、　）　Ｊ、　Ｅｘｐｌ
Ｍａｄ、／２０　：ｓ３／（１９ｔ、３）　〕。ヒトガ
ンマグロブリンの全てのジスルフィド結合の殆ど完全な
減少は０，０／λＳＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）及
び、２幅ガンマグロブリン溶液の作用により達成された
〔Ｐ、グネワードナ等（Ｐ、Ｇｕｎｅｗａｒｄｅｎａ、
　ｅｔ　ａｌ、　）、Ｂ１０ｃｂｅｍ、Ｊｌｒｎ、　　
タタ：ｇ（／り乙６）〕。しかしながら、完全な減少は
全ての抗体活性を破壊するようである。ここでも名、こ
れらの方法は処理ＩｇＧからのこれらの化合物の引き続
いた除去を必用とする。

米国特許３，７０３，２６２号明細書には、やや総括的
な従来技術のＩｇＧの精製方法の説明が含まれ、更にあ
る発明を開示している。この発明においては、静脈内に
注射可能な実質的に純粋な変性免疫血清グロブリンが元
のままの領置ジスルフィド結合を有する元のままの免疫
血清グロブリン鎖より本質的になり、少なくとも一つの
鉛量ジスルフィド結合において切断され、各切断ジスル
フィド結合は一対のアルキル化メルカプト基によジ置換
されている。この変性免疫血清グロブリンは穏和にアル
カリ性の水溶液をジチオスレイトール或いはジテオエリ
スリトールで選択的に還元し、この様に還元された領置
ジスルフィド基をアルキル化し、及びこの様に変性され
たグロブリンを非蛋白質反応生成物から分離することに
より製造される。

ポリエチレングリコールな用いた沈澱による凝集物の選
択的除去に向けられた従来の特許としては米国特許３，
７６３．／３に号、米国特許≠、Ｏり３，６θ６号、米
国特許’Ａ、／Ａ！；、３７０号及び米国特許４、、２
７Ａ。

Ｊ−号の各明細書が挙げられる。

コーン分別後に５ｅｐｈａｄｅｘ■ｃｓｏなどのＤＥＡ
Ｅゲルによる凝集物の選択的吸着はカーリング等（Ｃｕ
ｒｌｉｎｇ、　Ｊ、　Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｖｏｘ
　　Ｓａｎｇ　　３３：２７（／り７７）〕及びスオメ
ラ等（Ｓｕｏｍｅｌａ。

Ｈ，、ａｔ　　ａｌ、　　Ｖｏｘ　　Ｓａｎｇ　　３３
　：　３７　（／り７７）〕、米国特許３，６ｔ≠、タ
タ≠号、米国特許４、／３６，０り弘号、米国特許４、
２、ｔ４，１？／号及び米国特許４、２７２．３２１号
の各明細書により報告されている。中でも米国特許４、
２７．２．！λ１号明細書はイオン交換体を用いて免疫
血清グロブリンから現存する及び７ｎ在的プリカリクレ
イン賦活剤（ＰＫＡ　）を除去する方法につ℃・て報告
し、現存するＰＫＡ及びＰＫＡのカリクレイン賦活性プ
リカーサ−（因子■）を除去している点において！ｆｊ
矩すべきである。

米国特許４、／３１．，０り弘号明細書は、動物血液血
清からＩｇＧを単離し、精製する方法を開示しており、
この方法は血漿のシリカで処理することによる初期安定
化の後、イオン交換クロマトグラフィ工程によるＩｇＧ
の単離を含むものである。この初期安定化工程は、血漿
をとュームドコロイド状シリカでスラリー化することよ
りなる。不幸にして。

この方法のこの側面の結果、同米国特許明細書に記載さ
れて（・るように用いられる活性化シリカに吸着して極
めて多量のＩｇＧが除去される。事実、この第１相から
のヒユームドシリカが付Ｍｘｇｃ、の回収のために再処
理される方法を利用すると、出発血漿中の最大７０１１
６のＩｇＧがこの米国特許により回収される。更に、こ
の米国特許の方法は血漿をヒユームドシリカで１時間ス
ラリー化し、ψ分間イオン交換樹脂と混合することを要
求するので、この方法は商業的規模で連続的に操作させ
ることが容易に出来ない、 米国特許ＩＡ、３１ｒμ、りＳ４Ｌ号明細書は、各々フ
ィルターを有する血液人口及び血液出口及び両フィルタ
ー間に充填された多孔質材料を含有し、その多孔質材料
力″−３０〜３０００　Ａの平均孔径を有する血液蛋白
質の吸着用カラムを開示している。この吸着カラムは選
択的吸着により特定の血液蛋白質を除去するように設計
されている。この特許の開示内容中に多孔性ｒ過媒体が
親水性重合体で被覆され得ることが示唆されており、該
親水性重合体はアクリル酸エステル、メタクリル酸エス
テル、アクリルアミド、ビニルアルコール、ポリビニル
ピロリドン、硝酸セルロース、及びゼラチンに基づいた
ものである。好ましい被覆重合体は、少なくとも一種の
アクリル或いはメタクリル酸エステルとエポキシ基含有
重合性単量体との共重合体である。

しかしながら、この米国特許は四つのサブクラスのＩｇ
Ｇを含有し、実質的にその他の蛋白質、脂質類などを含
まない高純度且つ注射可能なＩｇＧを得る方法を開示す
るものではない、 この様に、現在十分に認識されている静脈内に注射可能
なＩｇＧに対する利点及びこの概念に向けられた膨大な
量の特許及び技術文献に証明されるようにこれを開発す
る過剰の研究努力にも拘らず。

現在利用可能な該、Ｇの中には完全に満足できるものカ
ーないことが判明している。ローマ−等〔Ｒｏｍｅｒ　
　ａｔ　ａｌ、、　Ｖｏｘ、Ｓａｎｇ　　１１２　：　
６２−７Ｊ（１９ｌｒ、２）〕及び〕ローマー（：　Ｒ
ｏｍｅｒ　　ｅｔ　ａｌ。

ＶＯＸ、　Ｓａｎｇ　　Ｌ２：　ＶＩＡ−１０（／９１
２　））参照。

静脈内に注射可能なＩｇＧに関する従来の研究の上記説
明に基づき１分別操作によるＩｇＧの単離は生成物を適
当に精製して分別工程から生ずる凝集物を除去するため
に引き続き処理を必要とすることが明らかである。しか
しながら、現在までに採用されてきた各種精製操作は外
来及び自らの望ましくない産物を導入するように思われ
る。ＰＥＧ−処理された生成物はそれらの高められた或
いは極めて高いＰＫＡ活性のために安全でないように思
われる。化学的に変性された調剤及び酵素−処理調剤は
分割生成物或いは変更されたＦｃ部分を含有する。上記
米国特許≠、／３Ａ、０９弘号で提案された方法は上記
の欠点を有している。この様に１本質的に凝集物及び二
量体がなく、断片を含有せず。

標章的臨床用の要請に合致した抗−補体活性を有し、Ｐ
ＫＡ及びカリクレインなどの蛋白質分解酵素の量が低く
、発熱性物質及びＢ型肝炎抗原（ＨＢｓＡｇ　）がなく
、及び正常のＩｇＧサブクラス分布を有し、高い生成物
安定性及び長い貯蔵寿命を有する臨床用の静脈注射可能
なＩｇＧ調剤に対する需要が存在し続けている。

発明の要約 前記の如（、ＩｇＧは各種障害の治療において高い治療
上の価値を有する。更にＩｇＧの有効性はＩｇＧが筋肉
中でなく静脈内に導入されることができる場合に実質的
に改良される。しかしながら、現在のＩｇＧ調剤は、静
脈内投与に適したものではなく、その静脈内投与はしば
しば重合体或いは凝集粒子及び断片を含有するＩｇＧに
よる補体系の活性化に帰せられる激しいアナフィラキシ
−反応な引き起こす。従来の分別化された血清を精製し
て静脈内に注射可能なＩｇＧを得る努力は不満足である
ことが判明している。

これを背景として１本発明者等は静脈内用ＩｇＧの調製
のための新規方法の開発を行ったが該方法は精製及び回
収操作の初期工程について分別技術に頼るものでもなく
、又、化学的及び／又は酵素的処理に頼るものでもない
。本発明者等の努力は。

一連の分離工程よりなる方法において最高潮に達し、該
方法の結果、高純度の動脈内に注射可能なＩｇＧ製品及
び高純度アルブミン、トランスフェリン及びプロトロン
ビン複合体副生物が得られた。

静脈同に注射可能なＩｇＧが動物血漿から製造される本
発明の方法はその方法の少なくとも一部に高度に特界的
なりａマドグラフ支持体を利用する一連の逐次分離を含
んでなるものである。脂質類を不溶化する最初の稀釈工
程の後、動物血漿を第７の濾過／吸着工程に付し、ミク
ロン及びサブミロイド類及びブリカリクレインなどの賦
活化補体などを除去する。この分離工程からのろ液を次
の分離工程に通し、そこでＩｇＧがイオン交換クロマト
グラフィーによりその他の血漿−可溶性大分子蛋白質か
ら分離され、ＩｇＧはカラムを通り、他方の大分子蛋白
質はカラムに吸着して残る。前工程からの大分子蛋白質
を除去されたＩｇＧは次の分離工程に通され、それによ
り蛋白質分解酵素がアフィニティクロマトグラフィーに
より除去される。

得られた外来性蛋白質及び蛋白質分解酵素のないＩｇＧ
を次いで無菌濾過し、凍結乾燥し、容器に詰める。

■、血漿の稀釈 ｎ、、？ＪＪ過／吸着 Ａ、濾過／吸着用カートリッジ配置 Ｂ、カートリッジ用炭素パッド Ｃ，カートリッジ用シリカパッド ｍ、　　ＩｇＧ単離及び精製用イオン交換クロマトグラ
フィー装置及び方法 氏　カートリッジ配置 Ｂ、イオン交換クロマトグラフィー用マトリックス ／、　マトリックスの配置 コ、マトリックスの構造 ａ、イオン交換マトリックスの基材 す、共有結合されたイオン交換重合体 Ｃ１合成重合体−変性基材 Ｃ８血漿のイオン交換クロマトグラフィ一分離■０部分
的に精製されたＩｇＧの７フイニテイクロマトグラフイ
ー Ａ１部分的に精製されたＩｇＧにおける酵素Ｂ、アフィ
ニティクロマトグラフィー用カート１；ッジ配置 Ｃ９部分的に精製されたＩｇＧのアフィニティクロマト
グラフィー用マトリックス １、部分的に精製されたＩｇＧからの蛋白質分解酵素の
アフイニテイクロマトグラフ分離用マトリツクス或いは
静止相の配置 ２１部分的に精製されたＩｇＧからの蛋白質分解酵素の
アフィニティクロマトグラフ分離用静止相の構造 ａ、前−リガント構造 す、　リガンド及びそのカップリング Ｄ、上記アフィニティマトリックスを用いた酵素除去 １、酵素のプラスミノゲン特性の除去 コ、　カリクレイン除去用アフィニテイマトリックス ■、精製ＩｇＧの無菌濾過 ■、凍結乾燥及び包装。

本発明を実施するための出発物質は、ヒト又は非−ヒト
起源の血液血漿或いは血漿画分である。

血漿の典型的な源としては、産科病棟及び病院からの胎
盤後面液及び古くなった過剰の血液及び血漿が拳げられ
る。又、血液が抜き出された場合に血液を凝固から防止
するデキストロース−クエン酸ナトリウム−クエン酸緩
衝液と混合する所謂プラズマフィア法により血漿を集め
ることも可能である。血球は血漿から遠心分離により分
離され、血液供与者に再注入することが出来る。この様
にして血漿がその後の操作用の原料を構成する。ヒ）　
ＩｇＧの外にウシＩｇＧも実質的に潜在的な有用性を有
するものである。牧畜業において、新生ウシは約ψｇ時
間ＩｇＧ抗体を発生せず、新生ウシ内に相当な死亡率を
生じさせる各種の病気に罹患し易くなる。新鮮或いは凍
結されたヒト或いはその他の動物の血液血漿或いは古く
なった及び／又は寒冷沈降物ヒト或℃・はその他の動物
の血漿を出発物質として使用することカー出来る。血漿
はそれが輸送用に凍結され、融解され、寒冷沈降され、
再凍結されているか或いはファクター（Ｆａｃｔｏｒ　
）　ＬＸ錯体が欠損しているか否かを問わず、血液或い
は血漿収集時において如何なる抗凝固剤が使用されてい
ようとも処理さ九ることが出来る。血清も又。

元の形態で或いは濃縮して使用することが出来る。

■、血漿の稀釈 本発明の好ましい実施態様においては１例えば地方赤十
字から受納した凍結血漿を融解し、脱イオン水で約ｓ：
ｌ−１ｏ：ｔの比で稀釈して、稀釈して、脂質類の溶解
性を減少させ、次いで０．！−モル濃度のＨＣＩで約６
．０〜６．ざ、好ましくは＆、ｊのｐＨに調整する。脂
質類の溶解度を減少させる他にこの稀釈は又血漿のイオ
ン含量を有効に低下させて以下のイオン交換工程の有効
性及び効率を増大させる。稀釈時に析出した如何なる不
溶性の蛋白質及び脂質類も簡単をろ過工程により除去す
ることができる。この最初の濾過後に血清は実質的に大
きな不溶性粒状物質がなくなる。

本発明の基本操作は第１図に示されるような一連の逐次
分離工程を含むものである。脱イオン水で稀釈されて不
溶蛋白質及び脂質類を析出した血漿は不溶物を除去する
ための単−或いは多段工程の予備ｒ過、蛋白質分別のた
めのイオン交換クロマトグラフィー、蛋白質分解酵素除
去のだめの７フイニテイクロマトグラフイー及び最終無
菌を過に付される。

第２図は、回収効率を最大にし、各種のその他の血漿成
分をＩｇＧ精製の副生物として利用可能にするための好
ましい流れ操作を示すものである。

第２図を参照すると、予備濾過されたヒト血漿はイオン
交換カラＡ（ＮＱ／）を通され、　０．０／Ｍ　ＰＢ（
リン酸緩衝液）でｐＨ４，３に平衡化され、　ＩｇＧは
カラムを通りその他の成分は後に残される。

ＩｇＧ流は次いで更に精製されるために７フイニテイク
ロマトグラフイーカラムに通される。カラム／から０．
０ＩＭＰＢで緩衝化された３０４モノリン酸塩溶液を用
いて粗製のトランスフェリンが溶出される。溶出液は第
２のイオン交換カートリッジ（Ｎｏ、２）に通され、粗
製トランスフェリンを含有すル流出液はｐＨ３，Ｉｒに
平衡化されたカチオン交換体を含む第３イオン交換カー
トリツジ（ＮＣＬＪ　）に通される。高純度トランスフ
ェリンがカートリッジＮｎ３を通過し、残存ＩｇＧがク
ロマトグラフ媒体に吸着される。このＩｇＧは酢酸緩衝
液及び０．５Ｍ塩を用いてＮｎＪカートリッジからｐＨ
Ｊ’、（７で溶出され、イオン交換カートリッジＮｉｌ
／に回収のために再循環される。別に粗製アルブミンが
／（７７７４モノリン酸塩及び０．７７／ＭＰＢでカー
トリッジＩｔ’ｌｌ／及びカートリッジｔＶＩ１１２か
ら溶出され、これらの二つの流れを合一してｐＨＡ、／
に平衡化されたカチオン交換クロマトグラ７カラムのカ
ートリッジＮｎ４’に導入される。任意に、この流れは
先ず処理して含まれるトランスフェリンを除去してもよ
い、高純度アルブミンがカートリッジ―μを流出液とし
て通過し、残存ＩｇＧ及びその他の不純物がカラムに保
持される。このカラム残渣は０．３　Ｍ　Ｎａ１ｌ　ト
共にｐＨｆＯの酢酸緩衝液で溶出され、カートリッジ崩
／に再循環され、そこで操作が新たに開始される。

Ｔ１．濾過／吸着 又、第１図に戻ると、この不溶性不純物を除去する予備
濾過の第１工程については、好ましい実施態様において
、これらの不溶物は稀釈血漿を米国特許≠、３１４、り
３７号明細書に記載されているも０のと同様なカラムを
通すことにより除去される。

この特許明細書の全開示内容は本発明において漁用する
。

Ａ、　　濾過／吸着用カートリッジ配置第３図は好まし
い実施態様のための典型的なカラムを示すものである。

このカラムｌＯは数多くの固体静止相要素１２のディス
クを含む任意の適当な材質例えばガラス、鋼、ブレクシ
グラスなどから作ることのできる円形断面の中空円筒／
ｌである。

要素１２の端部１３は円筒／／の内壁と液密のシールを
形成する。この液密シールは幾つかの方法により達成す
ることが出来る。一つの態様においては、要素ｌコの寸
法及び円筒／／の内部の寸法を予備負荷が要素を圧縮す
るように要素／２が摩擦適合により所定位置に堅固に保
持されるようにする。これは円筒／／の内部壁及び要素
ｌ二の両者に対して極めて正確な寸法許容度が要求され
る。個りの要素１２は円筒／／内に通常側等かの機械的
補助例えば押−搾成℃・はピストンを用いて挿入される
。水性可動相がカラムを通される際に適当な好ましい態
様においては、要素／２は親水性であり、可動相と接触
時に幾分膨潤し、必要とされる円筒／／の内壁との液密
シーツ・を形成する。この場合において、円筒及び要素
１２の内部表面の寸法許容度は摩擦適合の場合程精密な
ものでなくてもよい。

カラム１０はボルト／Ａにより保持される入ロキヤ、プ
ｌＳ及びボルトｉｔｒで保持される出口キャップ１７を
含む。人口キャップ／Ｓはスペーサー要素により円筒／
／と間隔を開けた関係に保たれる。ガスケットリング／
９及びｍはキャップ１５及び１７と円筒／ｌとの気密シ
ールを維持する。入口キャップ１３；はカラム内に導入
される液体を受取るための人口オリフィス２１及び流入
する流体を円筒の内控部に分配するための人口拡散器ｎ
を備えている。出口キャップ１７はカラム内に要素ｌコ
を保持するだめの支持体スクリーン力及び分離液体が排
出される出ロオリフィス薯を備えている。

静止相／ｊはその内に粒状物を固定して有する多孔性繊
維マトリックスよりなり、該繊維或いは粒子の少なくと
も一方が不溶性物質の分離に有効である。

この分離工程のために好ましい材料は米国特許４、弘０
４４，２１ｒｊ号明細書に記載の活性炭及び米国特許出
願５ｅｒｉａｌ　Ｎ［１１ＡＯ／、Ｊ乙／号明＃ｌ８（
１９ｔ２年７月ｎ日出願）及び米国特許出願５ｅｒｉａ
ｌ　Ｎｒｉ３ｕ７゜３１．０号（１９ｇ２年２月２日出
願）に記載されているヒユームドシリカである。これら
の各特許明細書の全開示内容は本発明において臨月する
。

Ｂ、　カートリッジ用炭素パッド 米国特許４、＜１０≠、λ♂３号明細書に記載されてい
る如く、この好ましい活性炭を材／吸着材は炭素粒子を
その中に分散させた自己結合繊維のマトリックスよりな
り、その炭素粒子のりｏ４を越えるものが３ｏミクロン
未満の平均粒径を有するものであった。この炭素含有複
合材は、異った炭素充填及び異った程度の繊維精製をも
って製造することにより異った制御可能な程度の多孔性
を与えることが出来る。この複合シートは活性炭及び１
０−！；０４の「他の繊維」に配合され、この「他の繊
維」という用語はセルロース、粉末化炭素及びポリエチ
レンなどの任意のＦＲ維化された繊維を含むものである
。炭素の活性化は、３００−２，０００℃で行われ、１
０〜りｏ４の炭素粒子が活性化される。

この好ましい濾過／吸着カラムにおいては、上記複合シ
ートがディスク及びパッドに切断され、円筒カラムに積
み重ねられた配置で且つカラム壁に衝突して接触するよ
うに充填される。炭素ディスクの製造方法は上記米国特
許４、弘Ｏ４、２１３号明細再に十分に記載されている
。

この活性炭は脂質類などのデ過／吸着に加えて血漿中に
存在する任意のステロイド及びチロイドホルモン類を吸
着により除去する。

Ｃ１カートリッジ用シリカパッド 上記二つのヒユームドシリカへの米国特許出願に記載さ
れている如く、好ましいヒユームドシリカバ２ドは高充
填度の微粒子及び長い自己結合性構造繊維例えばセルロ
ースなどを含有する自己支持性繊維シートである。好ま
しくは、これらの構造繊維はシートのＳＯ〜りｏ４を占
め、残部（１０〜５０噛）がｌＯＯミリミクロン未満の
粒径を有する微粒状ヒユームドシリカである。

この自己支持性シリカマトリックスは、有孔性表面にキ
ャストされた繊維及び粒子の水性スラリーを真空フェル
ト化することにより作成される。

乾燥後これらのシートはパッド或いはディスクに切断さ
れ第３図のようなカラムに充填される。

血漿の脱脂質を行うことに加えて、ヒユームドシリカは
又、プリカリクレインを活性化させ、その結果この蛋白
質分解酵素は引き続くクロマトグラフ分離において除去
される・ しかしながら、と・ユームドシリ力は、それが賦活され
た蛋白質分解酵素に対すると同様に、ＩｇＧに対する吸
着材であり、過剰に使用された場合にはＩｇＧの収率な
減少させる。従って、全ｒ過／吸着パッド材料のｌＯ係
以下がヒユームドシリカであることが好ましい。より好
ましい態様においては、ヒユームドシリカはシラン化シ
リカで置換されるのが良く、このシラン化シリカはなお
ブリカリクレインを活性化するがＩｇＧは実質的に吸着
しない。

この面は、出発ＩｇＧの９８以上の収率が得られる場合
の本発明について極めて重要である。しかしながら、ヒ
ユームドシリカパッド及び活性炭パッドを有する上記カ
ートリッジを用いることによりこの独特なパッド配置に
より高収率がなお可能である。

ＩＩＩ、　　ＩｇＧ単離及び精製のためのイオン交換装
置及び方法 ミクロン及びサブミクロンの大きさの粒子、脂質類、ホ
ルモン類などが血漿流から除去されるこの血漿処理工程
に続いて、血漿はＩｇＧがイオン交換クロマトグラフ分
離により他の蛋白質から分離される次の分離工程に通さ
れる。この分離工程は本発明に対する重要且つ高度に発
明性の高い面の一つを表わすものであり、クロマトグラ
フ媒体及びカートリッジの独特な物理的配置、クロマト
グラフ媒体に対する独特な孔度制御及び分離マトリック
スの独特な化学分離及び結合特性を組み合わせるもので
ある。

Ａ、イオン交換クロマトグラフィー用カートリッジ 好ましい態様において、クロマトグラフ分離媒体の物理
的配置は一緒に譲渡された米国特許出願５ｅｒｉａｌ　
Ｎｎ　３０２、ｊ３２　（／りｒ３年６り／７日出願）
に開示されているものよりなるものであり、この出願は
本発明において準用する。この出願において開示されて
いる如く、固体静止相はシート形態の膨潤性繊維マトリ
ックスよりなる。好ましくはこのシートは均質或いは実
質的に均質であるのカーよく、これは事実上静止相が放
射状に流れる試料に対して横方向或いは軸方向において
均−或いは実質的に均一な構造及び／又は組成であるこ
とを意味する、 図面を参照すると、同様な符号は同様な部分を示し、第
９図乃至第６図は本発明のこの側面のり０？トゲラフイ
ーカラムの好ましい実施態様を示す。第グ図を参照する
と、一般的に１１０で示されるカラムは、好ましくはカ
ートリッジ形態の円筒状静止相／／２及び静止相／／コ
に対する収納部として作用する円筒室／／ＩＡにより構
成される。この固体静止相／／２は静止相／１２の外径
よりやや大きい直径を有するガラス、金属或いは重合体
製の管或いは円筒室／／４ｔに挿入することができる。

通常の分析及び調製カラムにおけると同様に適当な流体
流入、採集及び監視系をカラムと共に使用することもで
きる。静止相／１２は室ｌｌｌ円内位置し、好ましくは
円筒室１／≠の軸と共軸の縦軸／／１を有する。任意に
複数個のカートリッジｌ１２を単一の収納部内に各種配
置で置いてカー）　ＩＪッジ（図示せず）間に並列及び
／又は直列の流れを起こすことが出来る。例えば本発明
の被譲渡人の同時係属中の米国特許出願５ｓｒｉａｌ　
ＮｃＩＡ／／、Ａ１２号（１９１ｒ４Ｌ年夕月１５日出
願）明細書を参照。この出願の全開示内容は本発明にお
いて準用する。この固体静止相はクロマトグラフ官能性
を有し、クロマトグラフ分離に有効である。第Ｓ図及び
第６図を参照すると、静止相／／２は通常は親水性の膨
潤性であるクロマトグラフ分離のための活性媒体である
シート形態ｔｉｔの膨潤性繊維マトリックスにより構成
される。このシート形態のクロマトグラフ媒体／ｌＩｒ
は多孔性、湿潤性織物系の材質例えばポリエステル網織
物よりなるスクリム層！２０及び不織メツシュ１２２の
間に挾まれている。このクロマトグラフ媒体ｌ／♂、ス
クリム層／２０及び好ましくは不織布のメツシュ／２２
よりなる複合シートは縦軸／／／、を有する有孔性円筒
状芯１２μの周りにらせん状に巻かれてｊｉｌｌ　／　
／　Ａの周りに複数の層を形成する。

メノシ＝へＵはその開孔度及び厚さにより媒体／／Ｉの
各層間のスペーサ一手段として作用し、それは媒体の多
孔性構造を閉ざすことなく膨潤性媒体／／ｒの制御され
た拡張を可能にし、静止相ｌ１２内の試料の分布を高め
る。円筒状芯１２弘は芯へ評の開かれた内部中への試料
の流れを可能にするために開口部／２６が備えられてい
る。

第弘図を参照すると、巻かれた複合シートｌ／ｌｒ。

／１０及び／２２及び芯／ユ弘は次いでやはり開口部／
３０を備えた外部円筒状部材／２１内にすべり込まされ
る。これらの円筒の末端は次いで末端キャップ／３２及
び１．３４ｔでキャップされる。末端キャップ／３２及
び１３弘は熱可塑性材料により外部円筒状部材／、２ｇ
及び複合体／ＩＩ　、／２０及び／コ２の末端にシール
される。内部及び外部が固体静止相により完全に分離さ
れ、末端キャップｉ３．を及び１３’Ａにより密封され
ているので流体或いは試料／弘２は外部から固体静止相
即ち芯／２１１−の開放内部中に放射状に流れることが
出来る。

予備形成された末端キャップ／３２及び１３ＩＡは、十
分量の末端キャップを軟化するに十分な、好ましくは液
化しない温度に熱可塑性末端キャップの内部面を加熱し
て末端キャップが円筒１２ｒの末端と熱可塑性シールを
形成するように円筒状固体瀞止相１／２に適用するのが
好ましい。円筒／２１の一方の端の全ての縁は次いで軟
化された物質中に包埋される。この軟化物質を次いで典
型的には周囲条件により硬化させ、末端キャップ／３２
及び１３弘の密封表面、円筒／２１及び固体静止相／１
２の末端間に熱可塑性シーリング関係を形成し、洩れの
ないシールを形成する。その様な末端キャップの適用方
法はデ過技術において良く知られており、例えば本出願
の被譲渡人のろＣＴ国際公告番号ＷＯｒ３１０弘ｉｒｔ
参照。任意に末端キャップは固体静止相にｉｎ　　５ｌ
ｔｕに一体的に成形することが出来る。

熱可塑性材料の末端キャップは結合の容易性から好まし
いが、熱硬化性樹脂を重合の熱可塑性、融着性或いは熱
軟化性段階において結合が行われるまで使用し、その後
樹脂の硬化を完結して最早分離されない構造を生成する
ことも可能である。

その様な構造は１円筒／２１、固体静止相／／Ｊ及び末
端キャップ／３コ及び／３４！の液密シールを破壊する
ことなく、オートクレーブ処理が可能である。

殺菌オートクレーブ処理条件下において、軟化されない
よ５な十分に高い軟化点を有する熱可塑性樹脂は生医学
用途に好ましい。使用することのできるプラスチック材
料の具体例はポリオレフィン類である。

第ｅ図を参照すると、好ましいカートリッジｌ参〇はそ
の一端に外部円筒状部材／２１ｒの外部には開放されず
閉じられている末端キャップ１３１１を有する。この末
端キャップ／Ｊ輪−ｉなお試料１４２を外部円筒室／２
１１の外側の周りの室／／ＩＡ中に流れさせながら円筒
状収納部ｌ／弘の底部末端壁／４４１／−上にあっても
良く、或いはこのカートリッジ１４Ｏの低部末端キャッ
プ１３弘は円筒室ｉｔψの底部末端壁１４≠から離され
ておかれ、試料／ｌｌ−２を室／／ＩＡ中に流れさせて
も良い。

カートリッジｌ参〇の上部末端は円筒状芯ｌコ弘と流体
伝道されている末端キャップ／３２を有し、それにより
円筒状芯／２’Ａの中心から末端キャップ／３コの外部
への流体の流れを可能にする。取り付は部品１４ｒが末
端キャップ／３２が円筒室ｌ／弘の末端壁／ＩＡＩ、に
係合するように末端キャップ１３２中に挿入される。こ
の取り付は部品は（図示される如く）ねじ切りされてい
ても良く、或いは末端キャップと別々に或いは一体的に
成形されても良く、且つその上にｏ−リング状シールを
有する。末端壁／μｔはその上に処理試料／（Ａ２を芯
Ａ２弘から末端キャップ／３２及び末端壁／４！４を通
して次の操作のためのプロセス流に流すねじ切シされた
ニップルｌｊＯを有する。この末端壁／４ＣＡ及び任意
に末端壁／４１は清浄化及びカー）ＩＪッジ／４４０の
挿入のために内部に容易に接近する目的で円筒室／／４
１の壁ｌｊ２にねじ切りされて付着されても良い。

しかしながら、このイオン交換マトリック２を下記例ｒ
で説明する如く、「積み重ねパッド」配置で利用するこ
とも可能である。

Ｂ、イオン交換クロマトグラフィー用材料１、マトリッ
クスの配置 緊密で取り扱い可能なりロマトグラフ媒体マトリックス
を提供するためには、多孔性マトリックスを形成する成
分の少なくとも一つが長い自己−結合性構造繊維である
ことが望ましい。その様な繊維は湿った「形成されたま
まの状態」及び最終的乾燥状態の両者において静止相に
十分な構造的一体性を与える。その様な構造は加工時及
びその目的用途に際し、この相の特にシートの取り扱い
を可能にする。好ましくは、クロマトグラフ媒体を形成
するシートは繊維の水性スラリーの真空フェルト化によ
り形成される。シートは又加圧フェルト化され或いは非
−水性スラリーからフェルト化することもできる。この
シートは均一な高度の多孔性を示し、優れた流動特性を
有し、実質的に均質である。一般的に、この媒体は約弘
ミル〜約３０ミル（乾燥）の範囲の厚さであり得るが、
しかし、シートがらせん状に巻かれてここに述べたよう
な性能を有するカートリッジを形成するならばより厚い
或いは更に薄い媒体も利用することができる。この媒体
はこの厚みの少なくともｇ＜、一般的には更に大きく、
例えばこの厚みの２倍〜ψ倍に膨潤すること力ｔできる
。

本発明のクロマトグラフカラムを構成するに際し、カラ
ムに使用されるクロマトグラフ媒体は長さ及び巾におい
て均一な厚みであること、及び媒体が全体を通して実質
的に均一な密度を有することが重要である。媒体層はそ
れ自体実質的に均質であることが好ましいが、しかし、
ある種の用途及び材質については非−均質の構成も使用
することができることが了解されるべきである・固体静
止相は固体静止相を通して実質的な圧力差を維持するこ
とにより分離を行うことが使用上意図されるので、固体
静止相がそれに課されるような負荷の下において変形に
耐えるに十分な程度の圧縮強度を有することが必須であ
る。その様な圧縮強度は媒体自体に存在するのみならず
、スペ−サ一手段及びその上でクロマトグラフ媒体或い
は固体静止相が圧縮される内部芯においても存在すべき
である。

スペーサ一手段は媒体の制御された拡張及び静止相を通
して流れる試料の分布の向上を可能にする。％３　Ｎ’
Ａ性クロマトグラフ媒体の各層間に位置するスペーサ一
手段は試料が固体静止相を通して放射状に通過する際に
、軸方向及び周囲方向の動きを与える。このスペーサ一
手段は、使用中のクロマトグラフ媒体の厚さ及び密度を
均一に制御する機能を有する。更に、このスペーサ一手
段は、クロマトグラフ媒体の層の裏打ち或いは支持体と
しての役割りを果たし得る。後者の側面は、製造段階に
おいて特に有用である。

スペーサ一手段はクロマトグラフ操作に関して不活性で
ある物質で構成されているのが好ましい。

不活性であるとは、その物質が固体静止相の機能に悪影
ｆ！ｙを及ぼさないことを意味する。

第３図及び第６図を参照すると、スペーサ一手段はそつ
二つの要素即ちスクリム／２０及びメツシ、、　ｔＸＸ
よりなることができる。スクリム材／２０は媒体を通し
て流れる試料をある程度運ぶ役割を果し、媒体を通して
試料を軸方向及び周囲方向に実質的に均一に分散させる
。メツシュ材は媒体間に間隔を与え、その制御された拡
張を可能にして、透過性媒体の圧縮によるそれを通じた
流れの「断続」を防止し、又媒体を通して軸方向に流れ
る試料を軸方向及び周囲方向に分布或いは運ぶのを助け
る。

スクリム１．２０は試料により湿潤可能で静止相を通し
て流れる際に試料の分布を最大にするような多孔性材料
であるのが好ましい。その様な湿潤可能なスクリムは不
織繊維、布１紙及び同様な材料から作ることが出来る。

適当な湿潤性スクリムとしてはモノフづラメント或いは
マルチフィラメント糸を用いたポリエステル不織繊維ウ
ェブ或いは織物ウェブ（開放構造及び低圧力損失により
モノフィラメントが好ましい）、ポリアミド類、及びそ
の他の比較的繊維性の製品例えばセルロース。

再生セルロース、セルロースエステル類、カラス繊維、
及び同様な材料が挙げられる。セルロース及び合成繊維
フィルター紙並びに穿孔プラスチックシルト及び開放メ
ツシュ発泡プラスチックも又スクリム材として使用する
ことができる。これらの後者のより開放されたタイプの
スクリムは−ある程度機能的にメツジ−スペーサー材料
を兼ねる。

スクリム及びメツシーの機能が静止相を通して流れる試
料を軸方向及び周囲方向の両方向に分配すると共になお
媒体の制御された拡張を行い、試料をそれを通して次の
媒体層に通過させる機能を有する適当な湿潤性及び多孔
性の構造の一つのタイ、プの材質、例えば多孔性の圧縮
性スポンジ用材質に合一できることが考えられる。

メンシー材は一般的な指針としてはにインチ（約／、ｊ
９ｍｍ　）〜％インチ（ｔ２．ｙ　ａｒｔ　）の範囲の
開口部を有するより開放性のタイプの材質であり、少な
くとも厚みにおいて媒体の厚みと等価である。

第３図を参照すると、クロマトグラフ媒体／／ｒを芯７
２≠上に巻き付けた後その外部表面／ｊｌＡ％−＠完全
にスクリム材／２０で包装される。

操作時に、試料は静止相を通して放射状に進められ、ク
ロマトグラフ媒体により区別されたクロマトグラフ画分
に分離される。スペーサ一手段はこの流れがカラム内を
動く際にその周囲方向及び軸方向の流れを誘発し、従っ
て改良された分解能及び媒体の潜在的能力の利用性を与
える。

第参図を参照すると、試料はカラムの底部に導入され、
固体静止相の外表面に流れ、次いでクロマトグラフ媒体
層及びスペーサ一手段を通して放射状に内部方向に流れ
、穿孔された中心管１２弘に入り、中央から抜き出され
るのが好まし、い。上記より、放射流は又反対方向に循
環させることも可能であることが明らかである、 これらのカートリッジは全操作時開を減少させ、適当な
りロマトグラフ媒体と共に使用した際に優れた結合能力
を有する。これらのカートリッジは標準型ポンプ或いは
重力供給と共に使用することができ、好ましい態様にお
いてはｊ　−！；Ｏｐｈｉ　（約０、Ｊ　ｔ　〜Ｊ、ｊ
　Ｋ９／Ｃｒｒ？−）　　にて利用される。クロマトグ
ラフ媒体のカートリッジは全く閉じ込められ、完全に自
己−封じ込めされて無菌状態を確保している。同相カー
トリッジは工場内で製造され、そこで組み立てられてい
るという事実により各カートリッジは他のカートリッジ
と実質的に同一であり従来公知のカラムにおけるが如く
ばらつきがなく、従って充填熟練者への依存を除去する
。加えて。

クロマトグラフ媒体の予備計量、取シ扱いによる媒体の
損失、充填の問題、カラム内における微粉体の生成及び
除去、その他のクロマトグラフカートリッジの充填に伴
う問題が全くない。このカラムは操作が容易であり１通
過或いは床容積の変動による如何なるチャンネリングも
もたらさない。

このクロマトグラフカートリッジはミリグラムの実験室
量からメガグラムの製造量までのスケールアップを可能
にする。このカートリッジは剛性及び強度を与え、特に
高流速媒体耐圧マトリックスとして有用であり、大規模
の蛋白賛成℃・は非−蛋白質イ青製に極めて適している
。

媒体の交互の層及び真空材料を中心のスペーサーの周り
に巻くことにより形成されたらせん配置に作られたカー
トリッジはマトリックスの逐次層を分離し、よってマト
リックス層の重複を防止し、マ）　ＩＪンクスのスベ〜
サーが膨潤或いは収線することを可能にする。この巻か
れたカートリッジは効率的な基質との大量交換のための
大きな表面積を与える複数の流れ画室を含む。この様に
、この配置はこの開示の全体的発明性に寄与する数多く
の利点を与えるものである。

コ、マトリックスの構造 蛋白質分子は他の殆んどの有機及び無機化合物よりも物
理的大きさにおいて実質的に犬きく、従ってイオン交換
を行うために支持体マトリックスを通して移動するため
の弾性的な三次元枠組みを必要とする。同時に、この支
持体マトリックスは高流量の液体流れを支えるに十分な
剛性を有しなければならない、これらの二つの異った要
請のバランスが従来技術に実質的な問題を提供していた
。

本発明者等は先にこの問題をマトリックスに蛋白質分子
の容易な侵入のための適当な孔径及び構造を損壊するこ
となく流速を高容量に保つための適度な強度を与えるこ
とによりこの問題を解決した。

本発明者等は、この独特の効果を支持体材料とそれにグ
ラフトさねた重合体又は共重合体との組み合わせを選択
することにより達成した。即ち、これらのクロマトグラ
フ材料は重合体又は共重合体をグラフトすることにより
変性された支持体材料よりなり、グラフト重合体又は共
重合体はイオン交換基を含有するものである。典型的な
イオン交換材料は一緒に譲渡された同時係屑中の米国特
許出願５ｅｒ１ｎｌ　Ｎａ　！ｒ７Ａ、ｌＡｌＡｌ　（
／りｙｐ年２月２日出願、／りざ３年ユ月１４日出願の
米国特許出願５ｅｒｉａｌＮＧ弘乙ル、／／≠の部分係
属出願）、「変性ポリペプチド支持体」という名称を有
する米国特許出願５ｅｒｊａｌＮ［１（）、 及び［−型性シリカ含有支持体−１という名称を有する
米［Ｅ！　’傅許出ＵｆｉＳｅｒｉａｌＮｎ　　　　　
　（）に開示されてオｄす、これらの各々 は本発明において草月する。

ａ、イ８ン交換マトリックスの基材 前記の如く１本発明の変性支持体は不溶性担体材料にグ
ラフトした有機合成重合体よりなるものである。典泣的
な担体材料は多糖類、ポリペプチド及びシリカが挙げら
れる。

本明細書及び特許請求の範囲において使用される「多糖
類」という用語は分子坐シ多くの□何百或いは測子もの
一年糖類単位で作られた化合物を含むものである。これ
らの単位はグリコシド結合により一緒に保持されている
。それらの分子量は通常約ｚｏｏｏより高く、何百万ダ
ルトンにも及ぶものである。それらは通常デンプン、グ
リコーゲン、セルロース、アラビアゴム、寒天及びキチ
ンなどの天然産の重合体である。この多糖類は７以上の
反応性水酸基を有すべきである。それは直釦或いは分岐
釦のいずれであってもよい。本発明の目的のために最も
有用な多糖類はセルロースである。

セルロースが好ましい多糖類である。ｒ、セルロース」
は任意の便利な且つ市販されている形態のセルロース、
例えば木材バルブ、綿、麻、ラミー或いはレーヨンなど
の再生形態のもの等の如何なるものをも意味するもので
ある。適当な形態のセルロースの選択に関しては特に制
限はない。セルロースは（／−≠）結合グルコース単位
よりなる天然の多糖類である。本来の状態において、隣
接のセルロース鎖は広範に水素結合され、微結晶領域を
形成する。これらの領域の間により水素結合の少ない非
晶領域が存在する。制限された酸加水分解の結果、非晶
領域の優先的な損失が生じ、所謂微結晶セルロースが得
られる。本発明において有用なセルロースは上記本来の
状態のセルロース或いは微結晶状態のセルロースのいず
れでもよい、又、綿リンターから得られたセルロースは
木材から得られたセルロースよりも後者がリグニンを含
１１するのでより良好である。

多糖類分子中の各無水糖類単位は３個以上の反応性水酸
基を有し得る。理論的には全ての３個以上の水酸基は重
合体で置換され得る。生成物は重合体で置換され得る。

しかしながら、その様な反応からの生成物は３個以上の
置換度を有し、それはイオン交換物質の場合にはそれを
可溶性にする。

全体の水溶性が生じるそれらよりも低い程度の置換にお
いてさえもその様な多糖類誘導体はクロマトグラフ支持
体としては不適当になる。従って、多糖類の置換は非晶
領域のより反応性中心に限定され、佳維形態において約
／　ｍｅｑ、／ｐ乾燥重量を越える割合には殆んど行わ
れない。この置換割合においては、多糖類構造の本来の
構造は僅かに変性されるに過ぎず、低密度の非均−交換
部位は大きな生体分子に容易に接近可能である。

本明細曾及び特許請求の範囲に使用される「ポリペプチ
ド」という用語は、アミ）”　結合（ＣＯＮ　Ｈ）を介
して水の除去と共に多くの一数十個、数百側或いは幾千
個もの一アミノ酸から作られた化合物を含むものである
。その様な釦のセグメントは下記の如きものである： （但し−Ｒ１，Ｒ２、Ｒ３及びＲ１１は典型的なアミノ
酸残基である。） 領内のアミノ酸の配列はポリペプチドの生物学的機能に
おいて極めて重要であり、これらの鎖は比較的直釦であ
るか或いはそれらは巻かれた或いはらせん状態である。

ある種のタイプのポリペプチド、例えばケラチン、の場
合には、それらはシスティンのジスルフィド結合により
架橋されている。このポリペプチドは、しかしながら、
ホモポリアミノ酸鎖のように生物学的に不活性であり得
る。

ポリペプチドでもあり、極めて複雑な特別のパターンに
巻かれ或いは折りたたまれ得る蛋白質は、それらの巻き
方及び折りたたまれ方の程度にｄ二つの群に大雑把に分
けることができる。長い線秋分子として配列されている
ものは、繊維状蛋白質と呼ばれる。これらの繊維状蛋白
質は水、塩溶液及びその他の水性媒体には比較的不溶性
であり、動物の体の重要な１１′４造要素を４７１成す
る。繊維状蛋白質と１．てはコラーゲン（皮膚、鍵、靭
帯、軟骨。

骨、目の角膜などの主たる繊維状蛋白質）、ミオシン（
筋肉における主たる蛋白質の一つ）、ケラチン（髪にお
ける主たる蛋白質）、及びフィブリン（血液凝固におい
て重要な蛋白質）などが含まれる。。

支持体材料は実質的に全ての形態の不溶性ポリペプチド
類を包含する。しかしながら、好ましいポリペプチド類
は繊維状ポリペプチドである。繊維状ポリペプチドのう
ち、ケラチンが本発明の目的のために最も好ましいポリ
ペプチドである。ケラチン状ポリペプチド類のうち、ウ
ールのような動物繊維及びその他のタイプの表皮が最も
好まし℃）。

「ウール」という用語も又ポリペプチド基材であるが、
羊毛からの繊維に適用され、それ自体表皮毛の範肪に入
るものである。この繊維構造は興ったタイプのケラチン
細胞の幾つかの層により作られる。ウール繊維からなる
ポリペプチド類はシスティン及び塩結合により架橋され
ている長℃・ペプチド鎖である。

基材がウールのようなポリペプチドである場合には、イ
オン交換媒体の最終（ｉη造は鎧に沿って多数の部位に
おいて共有結合的に変性されたポリペプチドよりなり、
これらの部位は下記に詳説する如く合成重合体又は共重
合体で変性されている。

「シリカ」という用語は通常担体材料として使用されて
いる粒状形態の任意の及び全てのシリカ含有材料を含む
ものである。典型的にはこれらの材、１５Ｆは、９〜７
６００ｍ７Ｅの比表面積、２ｏ　〜、２．ｏｏ。

ｋ度の１・入組孔径及び／ミクロン〜／　ａｍの粒径を
有する。典型的なシリカ材料としてはシリケート含有粘
土上物質１例えばメルク、カオリナイト、パイロフィラ
イト、サーペンチン、スメクタイト。

モンモリロナイト、マイカ、及びバーミキュライト；合
成シリケート、例えばシリカゲル、粉末。

多孔質ガラス及びケイ化カルシウム或いはケイ酸ナトリ
ウムの加水分解により調製されたもの；及び生物起源の
シリカ、例えば珪藻上などが挙げられるが、これらに制
限されるものではない。これらのシリカ材料は表面ヒド
ロキシ基により特徴付けられる。しかしながら、セルロ
ースが最も好ましい担体材料を表わすものである。

ｂ、共有結合されたイオン交換重合体 上記担体或いは基材、即ち多糖類、ポリペプチド或いは
シリカは基材の表面反応性基１例えば多糖類の表面ヒド
ロキシ基、ポリペプチドの表面アミノ基及びシリカの表
面ヒドロキシ或いは５ｉＯＨ基などを介して基材に共有
結合されている合成重合体によυ変性される。基材を変
性する重合体はホモポリマー或いは共重合体のいずれか
である。

ホモポリマー或いは共重合体としての重合体の定義は１
重合体を形成する重合性化合物が同一であるか異ってい
るかによる。その最も一般的形態において１重合体はラ
ンダム、ブロック或いは交互共重合体である。重合性化
合物の必須的特徴は、それが基材の表面反応基と共有結
合可能である基を含有しなければならず、又、イオン化
可能な化学基或いはイオン化可能な化学基に変換可能な
基も含有しなければならず、該イオン化可能な化学基が
イオン交換を提供する。本発明の目的のためには、基材
の表面反応基と共有結合可能な基は「カップリング基」
と称され、イオン化可能な化学基或いはイオン化可能な
化学基に変換可能な基は「イオン交換基」と称される。

カップリング基−含有単量体は共単量体（ａ）と称され
るのに対し、イオン交換基−含有単量体は共単量体（ｂ
）と称される。

一つの態様において、重合性化合物（ａ）（又共単量体
（８）とも呼ばれる）は多糖類のヒドロキシ基と反応し
て共有結合を形成することのできる基を有する。その様
な重合性化合物は１例えば米国特許Ｉｆ、０７θ、３≠
ｒ号明絹書に規定されておシ、これは本発明において塾
用する。これらの化学基は多糖類が分解或いは解重合を
開始する温度、例えば００〜１−２０℃までの温度、に
おいてヒドロキシ基と水性溶液中において反応すること
カを出来、それによりヒドロキシ基の酸素原子と共有結
合を形成する。

ヒドロキシ基に対しては水が常に相当な過剰量で存在す
るので水と自然に反応する化学基１例えばインシアネー
ト＆は余り適当ではない。水性溶液は純水或いは水と１
種以上の水混和性共溶媒、例えばアルコール類、ケトン
類など、との混合物よりなる。

共単量体（ａ）のヒドロキシ反応性基は好ましくはペプ
チド化学から知られているような活性化カルボキン基或
いはハロゲン化アルキル或いはエポキシド基のようなＯ
−アルキル化剤である。０−アルキル化共単量体の代表
的なものは無水アクリル酸及びメタクリル酸、アクリロ
イルメタクリロイルＮ−ヒドロキシスクシニミド頚アル
キル基カ一般的にλ〜ｔの炭素類を含有するアクリル酸
或いはメタクリル酸のオメガ−ヨード−アルキルエステ
ル類、塩化アリル、クロロメチルスチレン、クロロアセ
トキシエチルメタクリレート及びグリシジル基を有する
化合物などである。後者のものはグリシジルアルコール
と不飽和アルコール或いは不飽和カルボン酸の各々から
形成されるエーテル類或いはエステル類である。グリシ
ジルアルコール類はアルファ、ベーター不飽和カルボン
酸、好ましくはアクリル酸又はメタクリル酸でエステル
化された。或いはオレフィン或いはアセチレン不飽和ア
ルコールによりエーテル化された３〜／ｇの炭素数を有
する脂肪族及び脂環式アルコール類及びエーテルアルコ
ール類である。典型的な化合物はグリシジルアクリレー
ト（ＧＡ）及びメタクリレート；４、！−エポキシーペ
ンチルアクリレート；μｍＬ２．Ｊ−エポキシ−プロビ
ル）−Ｎ−ブチル・メタクリレート；り、１０−エポキ
シ−ステアリルアクリレート；弘−（”ｚｙ　３−エポ
キシグロピル）−シクロへキシルメタクリレート：エチ
レンクリコール−モノグリシジルエーテル−アクリレー
ト；及びアリルグリシジルエーテルなどが単げられる。

グリシジルアクリレート及びメタクリレートが好ましく
、グリシジルメタクリレ−）（ＧＭＡ）が最も好ましい
。いずれにせよ、共単量体（ａ）は重合及び／又は他の
単量体との共重合を促進するためのビニル不飽和結合を
含有する。

活性単量体単位（、）がとドロキシ基に感受性であり、
且つそれらが提供される多糖類と反応しない場合には、
それらは水の存在下において親水性カルボキシ或いはと
ドロキシ基に転換することが出来る。これらの活性基は
従って重合体材料中に多糖類と結合するために必要であ
る以上に一般的に多数存在する。

もう一つの態様においては、重合性化合物（、）は多糖
類のヒドロキシ基と直接に反応せず、多糖類に架橋化合
物を介して間接的に共有的にカップリングされるもので
ある。これは多糖類が先ず酸化などにより化学的に活性
化され１例えばエポキシ基或いはビニル基などの重合性
共単量体（、）の適当な官能基と反応することのできる
基を有する化合物と反応する場合である。

変性される基材がポリペプチドである場合には共単量体
（ａ）は重合及び／又は共重合を促進するためのビニル
不飽和結合及びポリペプチド鎖のアミノ基を介してポリ
ペプチド鎖に共有結合することの出来るカップリング基
も含有する。その様に反応することの出来る典型的な基
はグリシジル基及びＮ−メチロール基である。グリシジ
ル基を含有する典型的な単量体は上記のものであり、こ
こでもグリシジルアクリレート及びメタクリレートが好
ましく、グリシジルメタクリレートが最も好ましい。Ｎ
−メチロール基を含有する典型的な単量体はＮ−アクリ
ルアミドである。

変性される基材がシリカ或いはシリカ含有材料である場
合には、共単量体（、）は重合目的のためのビニル不飽
和基及びヒドロキシ基或いは５ｔｏｎ表面基にカップリ
ングすることの出来る基の両者を含有する。典型的な単
量体としては、上記グリシジル基含有単量体が挙げられ
る。ここでも又、グリシジルアクリレート及びメタクリ
レートが好まし℃・。

重合性共単量体（ｂ）は本発明の担体材料の最終用途に
応じて界る。イオン交換クロマトグラフ材料としては、
予備濾過に引き続き共単量体（ｂ）は任意の周知のイオ
ン化可能な化学基或いはその前駆体。

例えばビニル基或いはビニリデン基、を含有する化合物
、及びカルボン酸、カルボン酸塩、カルボン酸エステル
（好ましくは／−Ｊの炭素数を有する）、カルボン酸ア
ミド、二級或いは三級アミン、四級アンモニウム、スル
ホン酸、スルホン酸エステル、スルホンアミド、リン酸
或いはホスホン酸、或いはホスホルアミド或いはホスホ
ンアミド基などを含有し得る。

共単量体（ｂ）がイオン交換特性を有する物質の前駆体
を有する場合には、イオン交換基自体は例えば無水物、
エステル或いはアミドの選択的加水分解或いは適当な一
価、二価或いは二価のアルカリ或いはアルカリ土類金属
との塩形成などの公知の方法によりマスキング除去によ
り得ることができる。

共単量体（ｂ）のための好ましいイオン交換官能基はア
ミノエチル基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル
基、クエン酸塩、ジメチルアミノエチル基、ジエチルア
ミノエチル基、エクテオラ（混合アミン類）、グアニド
エチル基、ホスホン酸基、ｐ−アミノベンジル基、ポリ
エチレンイミン基、スルホエチル基、スルホメチル基、
トリエチルアミノエチル基或いは−Ｎ　（ＣＨ２Ｃ０２
Ｈ）ｚなどのキレート化基である。好ましいアニオン交
換共単量体はジエチルアミノエチルアクリレート（ＤＥ
ＡＥＡ）及びメタクリレート（ＤＥＡＥＭＡ）である。

より大きな親水性が考慮される場合には、ジメチルアミ
ンエチルアクリレート（ＤＭＡＥＡ　）及びメタクリレ
−ト（ＤＭＡＥＭＡ）が特に有用である。

しかしながら、この方法のイオン交換工程が大分子蛋白
質を分離させる本発明の目的のためには、ＤＥ／ＩＭＡ
が好ましい共単量体（ｂ）であり、ＧＭＡ−ＤＥＡＥＭ
Ａ共重合体がアニオン交換のための好ましいイオン交換
共重合体である。カチオン交換のためには、好ましい交
換重合体は下記実施例３及び弘の各々に従ってＮａ２Ｓ
Ｏｓ或いはメタクリル酸で変性されたＧＭＡである。

基材−変性重合体の平均分子量はその中に存在する単量
体の数に応じて興る。基材表面内に共有結合を形成する
ことができるように少なくとも十分な共単量体（、）を
有することが必要とされる。共単量体（ｂ）の量は余り
少なすぎると交換能力即ち固定／相互作用能力が極めて
低くなるので余υ少なくなってはならない。又、共単量
体（ｂ）の量は余り高すぎると、共単量体（、）の反応
基と基材との間の反応に著しい困難を引き起こすので余
シ多くあってもならない。好ましくは、基材−変性共重
合体は／　−３００単位の（ａ）＋（ｂ）、最も好まし
くは２０−１００の単位を有する。これは約ｉ、ｏｏｏ
〜／、　０００．０００、好ましくはｊ、ｏｏｏ−ｘｏ
、ｏｏｏ　　の分子量に相当する。

上記のものと異るその他の中性共単量体（Ｃ）も又必要
に応じて重合体に添加することができる。これらの共単
量体は中性の化学基、例えばヒドロキシ基、アミド基、
アルキル基、アリール基などを含有する重合性不飽和化
合物である。共単量体（ｃ）の中で好ましいものはＣ１
−ＣＧアルキルアクリレート或いはメタクリレート或い
は対応するヒドロキシアルキルアクリレート或いはメタ
クリレートである。共単量体（ｃ）の機能は必要に応じ
て親水性基及び疎水性基の所望のバランスを与えるよう
に重合体中の疎水性残基或いは親水性残基の存在を増加
させることである。

共単量体（、）の全共単量体含量に対する最少比率は重
要である。合成重合体は重合体の基材への実質的な共有
結合を可能にするに十分な量の共単量体（、）を有する
べきである。共単量体（ａ）の重合体中の存在量が余り
に少ない場合には、グラフト化が不可能でないまでも困
難となる。一般的に、（ａ）＋（ｂ）（もし存在するな
らば＋（Ｃ））の全量に対して約ψ〜ｍ重量憾、好まし
くはｔ−１０重量噛の共単量体（、）が必要とされる。

約Ｏ，Ｓ〜／或いは２重量部の爪では実質的な基材への
グラフト化は起こらず。

単に重合体を架橋させるに過ぎないようである。

重合体中の共単量体（、）の上限は、必要な剛性、官能
性及び親水性の程度に応じてタタ、り重［４まで変える
ことができる。しかしながら、共単量体（ａ）の量を／
！；−２，０重１ｕ％を越えて余りにも増加しすぎると
、多孔性を減少させる。その場合には、大きな分子力を
共単量体（ｂＪ中の官能基に十分に接近するのが困難と
なる。共単量体（ｂ）が共単量体（、）に対してより多
く存在することが好ましい。共単量体（Ｃ）は（ａ）　
＋　（ｂ）　＋（ｃ）の全量のユＯ０重量部での量で存
在し得る。

基材対変性重合体の重量比は任意に調整可能であり、基
材の部数に対して０．／、−３重量部で変化し得る。

共単量体（ｂ）がイオン交換能を与えることのできるイ
オン化可能な化学基を有する場合には、何等かの程度の
架橋が与えられなければ、溶液中の材料の柔軟性により
ミセル型の凝集物の形成及び緩慢な交換能力の損失が起
こる傾向がある。従って。

これらのタイプの変性基材には重合体の架橋を与えるこ
とが本発明の好ましい態様である。架橋は重合方法中に
少なくとも２個の重合性α、β−炭素二重結合を有する
多不飽和共単量体、例えばモノー及ヒポリエチレングリ
コールジメタクリレート及びジアクリレート（ポリエチ
レングリコール残基が６個までのエチレン基を含むもの
）、エチレンジメタクリレート、エチレンジアクリレー
ト、テトラメチレンジメタクリレート、テトラエチレン
ジアクリレート、ジビニルベンゼン、トリアリルシアヌ
レート、メチレン−ビス−アクリルアミド或いは一ビス
ーメタクリルアミドなどを導入することにより与えるこ
とができる。

アミノアルキル共単量体（ｂ）から作られた共重合体に
は、もう一つのタイプの架橋剤が特に適用可能である。

アミノアルキル窒素原子上に遊離電子対が存在する為、
架橋は窒素のない電子対と反応するよりな二官能性試薬
を用いて行うことができる。これらの中にはジアシルハ
ロゲン化物１例えばＨａｌ　−Ｃｏ−（ＣＨ２）ｎｃｏ
−Ｈａｌ及びＨａｌ−Ｃ０−フェニル−Ｃｏ　　Ｈａｌ
、或いはアルキル或いはアリールジハロゲン化物、例え
ばＨａ　１−　（ＣＨｚ）ｎ　−Ｈａｌ及びＨａｌ−フ
ェニル−Ｈａｌ（絃に、Ｈａｌは塩化物、臭化物或いは
ヨウ化物などのハロゲン化物。

及びｎは２〜／ユである）などが挙げられる。窒素原子
と反応することのできるその他の二官能性試薬１例えば
ジエボキシド化合物など、も使用することができる。こ
れらの二官能性試薬の利点はそれらが窒素中心にカチオ
ン性電荷を与えて材料をイオン化すると共に同時に共重
合体を架橋することである。

架橋剤の量は経験的に求めるのが最良である。

重合体がイオン交換能を時間に亘って一定の値を保つ場
合は十分であると考えられるが、しかし。

膨潤が防止される場合には余シにも多すぎ、最終材料に
余りにも大きな剛性が得られる。理想的には、架橋剤の
量は合成重合体単位が／−１モル係で十分である。

変性された基材は、変性後には好ましくは繊維状形態に
あり、イオン交換特性を有する繊維状シートのような自
己−支持性繊維状マトリックスに成形することができる
。変性された繊維状媒体は各種界りだ大きさの未変性繊
維、及び更に変性された或いは未変性粒状材料も導入す
ることができる。

Ｃ５合成重合体変性基材 繊維状媒体は多孔性の繊維のマトリックスを含んでなシ
、この繊維は分子或いはイオン分離或いは分子反応に有
効である。このマトリックスは各成分に関して実質的に
均質である。粒子が存在する場合には、それカ”−Ｉｇ
Ｇ及び副生物の血清からの分子或いはイオン分離に有効
であるようにそれを変性するのが好ましい。その様な粒
子は、所望の分離或いは反応を達成するのに有効量にて
繊維相に含まれるべきである。媒体全体は実質的に不活
性であり１寸法安定性である。

上記ポリペプチド類及び多糖類とも組み合わせることの
できる本発明のもう一つの実施態様は湿潤状態の「形成
されたまま」の状態及びカートリッジに尋人されるよう
に最終の乾燥状態の両者にお℃・て−：−分な構造的一
体性のシートを与えるのを助け、且つ加工時の取シ扱い
並びに血漿分離に対する適合性を与える未精製構造繊維
である。その様な繊維は典型的には比較的大きく、市販
の直径はに〜６０μｍの範囲である。木材パルプも又使
用することが出来、７３〜２Ｊμｍの範囲の繊維直径及
び約０．１Ｊ−〜約１．６ｍｍの繊維長さを有する。こ
の未精製の自己−接着性構造繊維は典型的には千円θＯ
〜＋ｖｏｏｍｌのカナダ標準ろ水産を有する。カナダ標
準ろ水産は１本発明において準用する米国特許μ、３０
り、λ弘７号明細書に十分に説明されている。

これらの長い自己−接着性繊維は、繊維媒体の５０重量
鳴を越える割合、好ましくは繊維媒体の１０〜１００　
％　、最も好ましくは１００４を占めることができる。

任意に、十１００〜−（，００ｍ１のカナダ標準ろ水産
まで精製された少量割合のセルロースパルプを通常の寸
法のセルロースパルプ（＋　ａＯＯ〜＋ｒｏｏｍｌ）の
多量割合と共に導入することができる。

特に、約ｌ〜約、２６４の精製パルプ及び約ｓｏ４〜約
り０４の未精製セルロースをマトリックス内に含有させ
ることができる。

Ｃ１血漿のイオン交換クロマトグラフ分離上記説明はＩ
ｇＧが血漿中の他の蛋白質から発温される方法のイオン
交換を行うための本発明により含まれる多くの態様を挙
げたが、クロマトグラフ分離用の好ましいイオン交換物
質は基材がセルロース材料であり、変性重合体がグリシ
ジルメククリレート（ＧＭＡ）とジエチルアミノエチル
メタクリレート（ＤＥＡＥＭＡ　）との共重合体である
物質である。セルロース状支持材料の適当な大きさを選
択し、グラフト重合体に含まれるＧ　Ｍ　ＡＯ量により
架橋度をコントロールすることにより蛋白質分子の容易
な侵入のために適当な孔径及び工栗的スケール操作に必
要とされる流速を可能にする適当な強度を有するマトリ
ックスのエンジニアリングが可能である。

イオン交換による血漿からのＩｇＧの選択的分離は過去
において小規模の操作について用いられていた。典型的
な分離技術は各種固相マトリックスに直接に結合したＤ
ＥＡＥの使用を含むものである〔例えばポリスチレン、
スパックマン等（Ｓｐａｃｋｍａｎ、　ｓｔ　ａｌ、、
　Ａｎａｌ、Ｂ１０ｃｈｓｍ、３０　：ｌ／りＯ（／り
ｓｒ’）：セルロース、バウムスターク等（Ｂａｕｍｓ
ｔａｒｋ、　ａｔ　ａｍ、　ＡｒＣｂ、Ｂ１０ｅｈｓｍ
。

Ｂ１０ｐｂｙｓ、　　ｌ０１ｒ　：　！／弘（１９６μ
）；デキストランゲル、ヘイステック等（Ｂｓｙｓｔｅ
ｋ、　ｓｔ　ａｌ、ＶｏｘＳａｎｇ　　２！ｒ　：　１
１３　（／り７３）；　及び架橋アガロース、カーリン
グ等（Ｃｕｒｌｉｎｇ、　　ａｔ　ｍｌ、、　　Ｖｏｘ
ＳａｎｇＪＪ：り７（／り７７））、Ｌ、かじながら、
これらの従来技術のイオン交換材料のいずれも本発明の
大規模用途及び純度水鵡により要請される操作に対し７
ては満足なものではなかった、これに対して、本発明は
下記の点において優れたものである： （１）　　物理的にはイオン交換媒体を含有するカート
リッジの設計は充填カラム法に存在するチャンネリング
の問題を除去し、血清の高分解度及び分離度に導びく； （２）乾燥紙構造の寸法的及び化学的安定性は平衡化及
び溶出に必要とされた時間を減少させ、プロセスを経済
的に魅力的なものとし、多量の血清の短時間の加工を可
能にする； （３）　　カートリッジ内の蛋白質の最少の非−特異的
吸着はＩｇＧの高い最高回収率を達成することを可能に
する； （４）セルロース基材の親水性の性質は１ｇ０分子の変
性に寄与しない環境を与えると共に、グラフトされたビ
ニル重合体により導入された穏やかな疎水性は変性され
た基材を血漿清澄化のためのリボ蛋白質の吸着剤として
有効にする； （５）マトリックス内の荷電基の接近のし易さが荷電基
の周辺配向をイオン交換に極めて効率的なものにし、得
られた生成物が高い蛋白質吸着能を示す（第６図参照）
； （６）マトリックスの特別の孔立体配置は、　ＩｇＧ移
動に対して適切なマクロポアを与えながらなおフィブリ
ノーゲンのようなより大きな分子を除去するに十分に小
さく、同時にＩｇＧの凝集物及び二量体の除去の高い効
率を与える； （カ　コーン（Ｃｏｂｎ　）分別法の分別工程を除去す
ることにより、エタノールによる蛋白質の変性が除去さ
れて島い生成物収率及び操作の単純性が得らハ、同時に
構造変更により生ずるある種の蛋白質への変性効果が避
けられ、又、ブロー酵素活性化即ち新しい抗原決定基の
形成が避けられる。

コーン（Ｃｏｈｎ　）分別技術の変法を利用して血漿を
分別して高度に精製された静脈内に注射可能なＩｇＧを
生成する従来の努力は結果的に上記の如く、１ｇ０分子
の凝集物或いは分解物を生成する。

本発明の血漿分別技術は各種血漿蛋白質の昇った等電点
に基づくものである（第２図参照）。イオン交換カート
リッジをｐＨＡ、３〜ｔ、ｒに平衡化させることにより
、ＩｇＧがカラムをｒ液として通過し、ＩｇＧより低い
等電点を有する他の成分はカートリッジ内に吸着される
。より高い等重点を有する成分はＩｇＧと共にカラムを
通過する。

前記の如く１本発明の一つの追加的利点は、これらのそ
の他の蛋白質がｐＨ及び塩勾配法により引き続き溶出さ
れて、それらの回収も又可能となることである。再び第
２図を参照すると、ＩｇＧがＯ，（７／ＭＰＢでｐＨ４
，Ｊに平衡化されたＧＭＡ−ＤＥＡＥＭＡカートリッジ
を通過し、トランスフェリンがカラムに保持される。引
き続きトラン２フエリンは３０４のモノリン酸塩を含有
する０、０／　ＭＰＨ緩衝液を用いてカラムｌ／から溶
出される。

高純度トランスフェリンはこの同一物質をｐＨｊ、りに
平衡化されたカートリッジＮ［１３を通過させることに
よりＧＭＡ−ＤＥＡＥＭＡカートリッジ−２から回収す
ることができる。具体的なパラメータ及び結果は下記の
例１９に示す。

同様に、高純度アルブミンは元のカートリッジＮｎ　／
を０．ＯＩＭＰＢ及び１ｏｏ４モノリン酸塩で溶出し、
溶出液をｐＨ４、ｔで平衡化されたＧＭＡカートリッジ
、即ち第２図のカートリッジＮｎ４を通すことによ砂回
収することができる。更に、）ランスフニリンの回収に
際して溶出される任意のアルブミンは、１ｏｏ４モノリ
ン酸塩を用いてカートリッジＮｎ２から溶出され、この
溶出流も又カートリッジＮｎμに通される。具体的なデ
ータ及び条件は下記例１ざに示される。

■１．　　部分的に精製されたＩｇＧのアフィニティク
ロマトグラフ分離 Ａ０部分的に精製されたＩｇＧ中の酵素上記イオンクロ
マトグラフ工程からのＦ液は。

実質的にＩｇＧ以外の蛋白質を含まない。アルブミン、
ＩｇＭ、ＩｇＡ、トランスフェリンなどは後に残され、
イオン交換カラム或いはカートリッジ中の基質に吸着さ
れている。更に、抗−補体活性に関して極めて厄介なＩ
ｇＧの二量体及び凝集物も又除去されている。しかしな
がら、この時点における血清は尚蛋白質分解酵素などの
その他の問題不純物を含有する、ヒト血清における二つ
の主たる蛋白質分解酵素は、プラスミン（正常ヒト血漿
巾約ｉ：ｔｍｙ／ｄｉ　）及びカリクレイン（正常ヒト
血漿巾約１０ｍ９７ｄ　ｌ　’）である。これらの酵素
の生物学的活性は、それらのＩｇＧを断片化し、毛細血
管浸透性を増大させる能力を包含する。更に、その他の
酵素汚染物質例えば前−カリクレイン賦活物質（ＰＫＡ
）及びプロ酵素プラスミノーゲンなども又見出されてい
るが、プラスミノーゲンの一部は予め除去されている。

ＰＫＡを含有する調剤が静脈内に与えられると、副反応
として紅潮、胸痛及び低血圧などが受領者内のろＫＡ−
誘発プラジキニンの発生により生ずる。従って、改良さ
れた静脈内ＩｇＧはプラスミン及びカリクレイン及びそ
れらの前駆体、プラスミノーゲン及びＰＫＡなとのこれ
らの蛋白質分解酵素の不存在或いは極めて低割合により
特徴付けられるものである。米国特許４、３０２、１７
０号明細書はベントナイト吸着による残存外因性ＰＫＡ
活性の除去を示唆したが、この手法はＩｇＧの収率な劇
的に減少させる。この様にして、本発明の重要な側面は
、血漿内の蛋白質分解酵素の特異的除去のためのアフィ
ニティカラム或いはカートリッジの使用を含むものであ
る。我々の実験において、例えばカリクレイン活性は、
血清を上記イオン交換マトリックスを通過させた後元の
血清中の／／、Ｏｍｕ／ａｔからｊλＥｍｕ／ｍｌに飛
躍した。このカリクレイン活性の飛躍に対する一つの可
能性のある説明は血漿内の酵素活性は酵素賦活剤と酵素
抑制剤の間のバランスによりコントロールされていると
いうことである。抑制剤の存在下においては、酵素活性
は容易には検出されない。我々の方法におけるイオン交
換マトリックスを通過後のＩｇＧ中のこの酵素活性の突
然の飛躍はおそらくその活性を抑制する特異的抑制剤の
偶然の除去によるものと思われる。

ＰＫＡは約ｒ２．ｏｏｏの分子量を有する単一鎖糖蛋白
質である。その等電点は７．７である。トリプシン、因
子ＸＩＪＩ及び因子皿を含む幾つかの酵素が血漿ＰＫＡ
のカリクレインへの活性化をある糧の負荷電表面の存在
下において触媒する。ＰＫＡのカリクレインへの転換は
ジスルフィド結合により二本釦構造を生ずる内部ペプチ
ド結合の加水分解を含む。

Ｂ、アフィニティクロマトグラフィー用カートリッジの
立体配置 カリクレインのような蛋白質分解酵素が部分的に精製さ
れた血漿から除去されるアフづニテイ分離工程において
は、好ましい実施態様においてアフィニティマトリック
ス（下記に詳述される）は第μ図〜第６図に配置され、
上記の如く詳述されたカートリッジ内に含有されるのが
好ましい。この好ましいカートリッジの立体配置は、上
記イオン交換クロマトグラフィーで利用されたものと本
質的に同一であり、静止相或いはマトリックスが異るの
みである。

その様に立体配置されたカートリッジを使用することに
伴５利点は、上記イオン交換力〜トリノジについて述べ
たのと同一の利点であり、即ち大表面積のための複数の
流れ室、操作の簡易性、取扱いに困難のないこと、充填
の困難のないこと。

チャンネリングがないことなどである。ここでも又、カ
ートリッジの立体配置、それ自体が本発明の方法の発明
性に寄与する好ましい実施態様である。更にイオン交換
力〜トリッジと同様に、このカートリクジの立体配置は
この方法の高い操作能力を荷うものであり、この高い操
作能力は操作の全効率に寄与するものである。しかしな
がら、通常の「充填」カラムを利用することも又本発明
の範囲内に含まれるものである。その場合には静止相は
シートに形成され、適当な大きさの円盤に切断されろ、 Ｃ１部分的に精製されたＩｇＧのアフィニティクロマト
グラフィ用マトリッタス １、　アフイニテイクロマトグラフイ分離用マトリツク
ス即ち静止相の立体配置 上記イオン交換カートリッジと同様にアフィニティ分離
用のマトリックスはその好ましい実施態様においてその
物理的立体配置に関して第弘図〜第２図に記載した通り
である。本質的にカートリッジの静止相即ちマトリック
スは媒体の交互相及び真空スペーサーを中心スペーサー
の周りに巻き付けることによりらせん配置に作成され、
それにより静止相の逐次層を分離する。静止相をその様
に立体配置させることにより静止相の重複が除去され、
スペーサーが各種条件に応答して膨潤或いは収縮するこ
とが可能である。この様にしてカートリッジは静止相と
の効率的な大量交換のための大きな表面積を有する。

２、アフィニティクロマトグラフ分離用静止相の構造 ａ、前−配位子構造 本発明の実施に際してヒト血漿のような動物血漿が処理
されて高純度ＩｇＧ及び副生物を回収する場合に、アフ
ィニティマトリックスは、高分子担体を基材にグラフト
させ１次いでアフィニティ配位子をグラフトされ、共有
結合した合成重合体に結合させて生成される。この前−
結合構造を以下において前−配位子構造と称する。適当
な基材としては、上記イオン交換クロマトグラフィ基材
を形成するために述べた基材、即ちセルロース等の多糖
類、ポリペプチド類、及びシリカが挙げられる。とこで
も又、セルロースが血漿分離のこの相に使用するために
好ましい基材物質である。

基材にグラフトされた重合体は各種官能基例えばアミン
及びチオなどの前駆体基として作用する官能基を含有す
る。この種の変性は特別の需要に合致する引き続く誘導
への手段を提供する。典型的な単量体としては、グリシ
ジルアクリレート及びメタクリレートなどのエチレン性
不飽和オキシラン−含有単量体、ヒドロキシエチルメタ
クリレートなどの不飽和ヒドロキシ−含有単量体及びア
クリルアミドなどのエチレン性不飽和アミド基−含有単
量体などが拳げられる。グリシジルアクリレート（ＧＭ
Ａ）及びグリシジルアクリレート（ＧＡ）が好ましいグ
ラフト用単量体である。

本発明の方法の酵素除去段階のための満足できるアフィ
ニティマトリックスの調製における重要な因子は配位子
結合の後にも酵素蛋白質分子が配位子結合のために自由
に浸透できるような十分なスペースが残されているよう
に網目中の孔をコントロールすることである。しかしな
がら、その様な大きな孔径に対する要請はしばしば機械
的安定性の問題を生ずる。アフィニティマトリックスと
して現在販売されている市販の製品は構造的剛性を与え
るために注意深くコントロールされた架橋度に頼るもの
である。しかしながら、これらの軽く架橋された材料は
極めて脆く、通常の攪拌技術の下においてさえ、しばし
ば劣化する。物理的安定性の増大は架橋度を増すことに
より達成することができるが、増大した架橋度は材料の
多孔性を減少させる。

本発明の一つの実施態様において、この構造的剛性と多
孔性の要請をバランスさせる問題は、セルロース或いは
その他の天然の重合体が三次元骨格を与え、その内部及
び周囲にアクリル系重合体の第二の網目が形成される。

二段階内部浸透網目により達成される。セルロース系或
いはその他の天然重合体基材は必要な剛性を与え、アク
リル系重合体を僅かに架橋させ、この僅かに架橋した重
合体が必要とされる化学的及び多孔性の性質を保有する
。例３の重合条件と同様な条件下において架橋が生ずる
。

この合成重合体は任意の従来の重合法を用いて形成する
ことができる。懸濁重合が好ましい重合法であり、単量
体を懸濁させ、任意に界面活性剤を用いて反応混合物を
連続的に攪拌しながら維持する。単量体相に溶解するフ
リーラジカル開始剤が使用され、重合はこの触媒の熱的
分解により達成される。重合の完結前に反応条件を変え
てカップリング反応を容易にし、よって付随する官能基
を有する重合生成物の炭化水素釦が次いで天然重合体基
材にグラフトされる。この後期の重合の際には重合及び
カップリングが同時に進行する。

セルロースにグラフトされたＧＭＡが好ましいアフィニ
ティマトリックスを表わす。ＧＭＡは三つの機能を与え
る。即ち、ＧＭＡ単量体のオキシラン基がセルロースの
表面ヒドロキシ基との共有的カップリングを与え、これ
らの同一のオキシラン基が合成重合体網目の為の架橋能
力を与え、残りのオキシラン基が引き続く配位子カップ
リングに役立つ、、ＧＭＡ−変性セルロースの代表的な
図面として第９図参照。

次にＧＭＡ−セルロースアフィニティマトリックスの物
理的及び化学的特徴を示す： ／１機械的剛性−セルロース繊維は固体支持体としての
良好な構造強度を与える。これらの繊維はセルロース繊
維の多糖類単位間の強℃・水素結合力により更に強めら
れ、更に高い結晶構造により強度が与えられる。更に機
械的剛性はセルロースと合成重合体の間に起こる架橋に
よυ与えられる。

コ、マクロ多孔度□繊維直径、長さ、繊維化の程度及び
架橋程度の注意深い選択がマクロ多孔度の高度のコント
ロールを与える。

３、親水性−セルロース構造におけるヒドロキシ基は高
度の親水性を与える。更にＧＭＡ重合体のグリシジル基
のジオールへの酸化或いは後者のヒドロキシル−含有単
量体との共重合は更にマ）　ＩＪソックス親水性を増大
させる。

≠、化化学的耐性上セルロース生成物溶媒に低い溶解度
を有する。更に、耐溶剤性はＧＭＡ重合体のグリシジル
基を相互に及びセルロースのヒドロキシ基と架橋させる
ことにより与えられる。

ｊ、構造的一体性−マ）　ＩＪソックス膨潤及び収縮は
グラフトされた架橋可能な単量体により無視できる程度
に小さく更に安定性は二官能性単量体との架橋により与
えられる。

６、低い非−特異性吸着−グラフト操作は更にセルロー
ス原料を精製し、非−特異性結合に利用可能な部位の数
を減少させる。

７、化学的反応性□グラフト後の２００１％の重量の増
大は配位子結合用の多数のオキシラン基を生成する、更
に、これらの配位子基は必要に応じて「スペーサーアー
ム」により隔てることができる。優れた流動特性−構造
及び多孔性に関して与えられる高程度のコンドロールー
−の結果、優れた流通特性が得られる。更に、このマト
リックスは使用の間に完全に乾燥することができ、その
流動特性を高めることができる、 このセルロース−ＧＭＡアフィニティマトリックスは下
記表１に示される如く化学的に変性することが出来る。

この化学的変性の目的は、マトリックス或いは前配位子
構造を、配位子とカップリングさせるために進備させる
ことである。

、／″ ・二゛− ／″ ／′ 表　　■ ＯＨ Ａ、セルロース　　　　　　　　　　　ＯＨ−に記表１
の（１）の適当な酸化剤としては過＋Ｂ索酸塩、三酸化
イオウ及び過ヨウ素酸塩などが挙げられるが、過ヨウ素
酸塩が好まし−。

上′ｒｉｅ表Ｉの（２）における適当なアミノ化剤はＮ
Ｈ２−Ｒ−ＮＨ２（ｎは直接結合或いは（ｃＨ２）ｎ　
）の・購造式を有する化合物が挙げられる。

チオール化はＮａ５Ｈ或いはＫ　Ｓ　Ｈなどの化合物を
用いて行うことができる。下記表■は１ｈｊ単に酸化、
アミノ化、チオール化反応をまとめて示すものである。

表■ るアルデヒド反応生成物は更に処理されて次式に従って
ボロネートアフィニティ吸着剤を形成する：ヒドラジン
などのジアミンとのアミノ化は次の反応式に従って進み
、ヒドラジドを形成する：このヒドラジドは次式に従っ
てアジドに転（＋；ＴＩされる： このアジドは適当な配位子例えばベンズアミジンにより
次弐に従って適当なアフィニティマトリックスに転換さ
れる： （式中Ｒ８及びＲ２はＣ１−Ｃ，アルキルである）。

上記表１及び■に示した如＜、ＧＭＡ−セルロ−スマト
リックスはＮａ５Ｈでチオール化することができる。こ
のチオール基は次いで下記の反応により引き続き活性化
することができる。

このゲルは次式に従って立体的に接近可能な蛋白質のＳ
Ｈ基と反応する： Ｈ 同（・）・にして、某材を変性してアミド官能基を与、
えることができ、このアミド官能」７（を更に次式に従
ってジアミンと反応させることができる：得られたヒド
ラジドは引き続き上記オキシラン環のアミノ化と同様に
して処理することが出来る。

反応性ヒドロキシル基を有する合成重合体−変性基材は
セルロースなどの適当な基材上にヒドロキシルエチルメ
タクリンート（ＨＥＭＡ）或−はヒドロキシルプロピル
メタクリレート（ＨＰＭＡ）などの化合物を利用して形
成することができる。

隣接ヒドロキシル基は次式に従ってＣＮＢｒを利用して
活性化することができる： ｂ　配位子及びそのカップリング 特異的酵素の除去のためのアフィニティマトリックスの
設計の出発、壱は、酵素の１造及び特に酵素抑制剤の（
’Ｍ造を調べることである。ある酵索或込はその抑制剤
の錯体形成はその酵素が特異的蛋白質１造と如何に相互
作用するかについての最良の素描を与える。酵素抑制は
常に次式で示されるよ５に競争的且つ可逆性である： Ｅ（酵素）＋！（抑制剤）＝ＥＩ錯体 通常、抑ＩＩ’ｊ剤の反応部位残基は酵素のポケット中
にはめ込まれて込る。カリクレイン及びトリプシンの場
ケにはカリクレインのセリン活性部位の求核則ヒドロキ
シル基と相互作用するリジン或いはアルギニン残基であ
る。多くの場合において。

！ＩＤ ・・９部「γ素迎：ｌｉｊ！剤は植物から抽出すること
ができる。

従って、釘効なアフィニティマトリックスは酵素吸着用
植物抑制剤を結合することにより作ることができる。血
漿カリクレインの抑制剤がジャガイモ及びピーナンツか
ら’Ｊ’　ｋｐされたことは公知である。

得られた・、（材生成物は更に次式に従って蛋白質のア
ミン官能基と反応させられ適当なアフィニティ吸着剤を
与える： 今や抗体或いは酵素抑制剤を固体マトリックスにカップ
リングさせて抗原或いは酵素に対する最大の親和性を持
たせるためには配位子がマトリックスへのカップリング
後にその活性な立体配座を保持することが重要なことが
知られて層る。

更に、グリシジル基を前駆体として利用することにより
、もう一つの部分をグリシジル基な介してカップリング
することが可能である。この新たな結合部分を下記表１
Ｈに示すような異った蛋白ｆｊカップリングの活性化機
÷１４により活娃化することができる。

表　　１１１ 蛋白り・ｆはポリフェノール類に対して極めて反応性が
高い。基本反応は蛋白質上の任意の求核残県の下記経路
によるポリフェノールのキノン形態への追加である： 方法コ 抗体或−はｆ二素抑：ｆ！！剤の固体マトリックスへの
カップリングが抗原或いは酵素に対する最大の親和１シ
１．を有するため（（は配位子がマトリックスへのカッ
プリング後にその活性な立体配座な保持することが・ｎ
要であることが現在知られている。抗体７１子はそれら
の活性形態にお（ハでは（植かに少数の立体配置１ηで
のみ存在し、官能的親和性は固体表面へのカップリング
に応じて広く変化する。この様に、水素結合などの力を
もったマトリックス及び配位子間の非−共有略合的相互
作用及び疎水性の１目互作用（主抗体の立体配座に明イ
１１６な’ｈ、”、’ｙ岸を有する。

抗体は嵩ぼったセ、カ造を有するので、マトリックスの
物（４１ｊ的′ｉ！ｒ性１例えば表面端及び孔分布も又
立体障害的見地より考慮される点である。イタすえば。

５ｅｐｈａｒｏｓｅ　にｒ１″ζ合したＩｇＧが約３〜
ｔａ　ｍｙ　／　ｐの割合を越え々、と追加の結合Ｉｇ
Ｇは配位子として無効となることが判明している。明ら
かに、ＩｇＧのより高いＩＩＩＪ合が５ｅｐｈａｒｏｓ
ｅ　　にカップリングするにつれ、抗体ｆ重性はＩｇＧ
の過多により実際上減少し、抗体の作用を妨げる。セル
ロースを基材として使用すると、より高い割合の置４み
率即ちセルロースグラム当り７ｍｙのＩｇＧにお込で最
大活性が達成される。しかしながら、基材と活性結合部
位との距ｉ′Ｈｆｆ（を増大させることにより、例えば
「スペーサーアーム」を使用すること（（より史に追加
の結合能力が可能である。従って、下記反応に従って親
水性スペーサーアームを導入することにより抗体活性の
増大が可能である。

前記の如く１本発明の合成重合体−変性基材はイ（成用
合体及び／′又は力拐ノン架（１１することにより１’
Ｈ，１ｆ別の需要に注ツ？ｍｌ〈合わぜることが−でき
る。架間は取合方法中に少なくとも２飼のポ合Ｉα、β
−炭素二・πＶ（３合を有する少イ十の多年・含相共単
°叶体例えば七ノー及びポリエチレングリコールジメタ
クリレート及びジアクリレート類（６１′ｌ！＋１まで
のエチレン鳩を含有するポリエチレングリコール残渣を
ｆｆすＺ）エチレンジメタクリレート、エチレンジアク
リレート、テトラメチレンジメタクリレート。

テトラエチレンジアクリレート、ジビニルベンゼン、ト
リアリルシアヌレ・−ト、メチレン−ビス−アクリルア
ミド或いは−ビスーメタクリルアミドなどを導入するこ
とにより与えられる。

もう一つのタイプの架橋剤はアミノアルギル窒素原子が
存在する場合に、その遊離の電子対の存在を利用するも
のである。この場合には、架橋はニー−（ミ・・儂″１
（：電子対と反応するよ５な二官能性試薬を用いてｉ′
テわれる。こ匙らの試薬としてはジアシルハｊ＋ゲン化
物、例えばＨａ　ｌ　−Ｃｏ　−（ＣＨ２）１−　Ｃｏ
　−Ｈａｌ或いはアルキルジハロゲン化物例りばＨａｌ
　−（ＣＨ２）ｎ−Ｈａｌ　（但し、　Ｈａｌは塩化″
勺、臭化物或層はヨウ化物などのハロゲン化物であり、
ｎはλ〜ｌユである）が挙げられる。−（ｃＨ２）ｎ−
がフェニルでｐＨｘさｈたこれらの化合物の類似物も又
包含される。

架橋剤の量は経験的に求めるのが最良である。

重合体が所望の構造的一体性及び多孔ハｙを達成する場
合が十分な＋１にと考えられる。理想的には、合成重合
体単位のｊ−，２６モル係の架副剤の１・；゛が十分で
ある。第ｒ図は本発明によるＶ［ｆ　ＨＥ　Ｍ　Ａセル
ロースクロマトグラフマトリックスの独特の特徴を示す
ものである。典型的配位子としては、ＤＮＡ血液型抗原
、抗−αフェト蛋白質、Ｃ］Ｑ、蛋白′イＡ、ポリリジ
ン、メチル化アルブミン、トリプトファン、フェニルア
ラニンコンカバリン八などが挙げられる。蛋白質分解「
イ素をＩｇＧから除去するために、ニブシロン−アミノ
アクリル酸、リジン。

メチル−ｐ−アミノシクロへキサンカルボン酸。

及びトラシロール、潜在的抑１ｎ１］剤が最も有効であ
る。カリクレイン及びＰＫＡの除去のためには。

ベンズアミジンが有効である。

本発明のアフィニテ、ｆマトリックスは配位子の基材−
合成重合体マトリツクスへのカップリングを含むもので
ある。典型的には、静止ｍに固定化され、アフィニティ
クロマトグラフィーにより溶質相から油体分子の結合に
より血清を精製するのに便用することのできる任意の配
位子が含まれる。

Ｄ、　　上ｒｉｅアフィニティマトリックスを用−た酵
素除去 ／、酵素のプラスミノーゲン性質の除去人体に存在する
血液凝固代謝は、二つの反する過程、即ち血液凝固系を
伴うフィブリン−形成過程及びフィブリノリジン系に指
示されるフィブリン−除去・６・）程により起こる。正
常の生Ｉ″Ｈ学的条件においては１両系統は実際上不活
性にとどまる。

しかしながら、非常事態にお込て、相当飛のプラスミン
が固有の血液因子により不活性前駆体から突然粘付化さ
れ、系のバランスが崩れる。臨床的研究は、ストレスの
下に突然死んだ個人の血液は液状及び非凝３ｃ！性形態
にあるということを示している。この状態は現在ではプ
ラスミノーゲンにより活性化されたプラスミンによるフ
ィブリンの蛋白質分解可溶化によることが知られて因る
。従って、フィブリン溶解効果を除去するため、及びＩ
ｇＧの断片化を避けるためにプラスミノーゲンをＩｇＧ
から除去しなければならない。

プラスミノーゲン及びプラスミンは共にあたかもガンマ
グロブリンの如く挙動する。プラスミノーゲンの等電点
はｐＨ２、Ａであると推定されている。

それはおそらくは糖蛋白質であり、小局のリンを含むも
のである。・その分子量は異なった研究者により／４３
、０００或いは♂乞ｏｏｏで、ｌると７′）ン告されて
いる。その分子はり〜／乙の１論比を１イする非対称の
形状であるが如く挙７ηかする。ヒトプラスミンの化学
的性質はプラスミノーゲンのそれと同様であるが分子量
は活性化の際の幾つかの分子の分解により僅かに小さい
。プラスミノーゲンのプラスミンへの転換は非対称な形
状からよりコンノくクトな球状への変化を伴う。

ＩｇＧからの蛋白質分解酵素の除去は溶液を酵索抑１＋
！！剤と結合したアフイニテイマトリノクスを通すこと
により行われる。プラスミノーゲン系の全ての潜在的抑
制剤の中で次の三つのものが最も有効であることが判明
した： （１）イプシロン−アミノカプロン酸或込はリジン、 （２）　　メチル−ｐ−アミノシクロへキサンカルボン
酸、 （３）トラシロール。

好ましい実施態桜にお−ては、抑１ｂ１］剤即ちイプシ
ロン−アミノカプロン酸はＣＮＢｒ活性化を利用してセ
ルロース−ＧＭＡマトリックスに結合される。

更にある種の四級アミン類がプラスミン活性をよ、乙の
等重点を有するプラスミノーゲンを用いて示すことが判
明して層るのでＱＡＥ及びＤＥＡＥλＩＡマトリックス
によるプラスミノーゲン除去もあるＩＬ“ば生ずる。

プラスミノーゲン活性の測定方法 カゼイン分ｍ法： ヒト血漿中のプラスミノーゲンの８度を測定するために
開発された技術はプラスミンの蛋白質分解活性に依存す
るものである。プラスミノーゲンは直接に求めることは
出来ず、ウロキナーゼによる活性化によりブラスミンに
転換され、引き続き、形成されたプラスミンをある種の
基質を用いてその蛋白質分解活性から求めなければなら
ない。プラスミンに対する生理学的基質はフィブリノー
ゲンであるが、よりよい感度及び再現性のためにはカゼ
インのような合成基質が好ましい。カゼイン分解法の原
理は血漿におけるプラスミノーゲンの所定時間にカゼイ
ンを消化する能力を分析するものであり、プラスミノー
ゲン活性と表現される。

その様な活性は、プラスミンの蛋白質分解効果によるカ
ゼインの加水分解的溶解から放出されるチロシン等何物
の量により測定することができる。

標準的方法は国立心ル３研究所Ｎ　ＨＩ　（Ｎａｔ１０
ｎａｌＨａａｒｔ　　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　）血栓崩壊
剤委員会（Ｃｏｍｍ１ｔｔｅｅ　　ｏｎ　　Ｔｈｒｏｍ
ｂｏｌｙｔｉｃ　　Ａｇｅｎｔａ　）により確立された
。

λ、カリクレイン除去用アフィニティマトリックスコー
ン（Ｃｏｈｎ　）　の低温エタノール分別法により作ら
れたＩｇＧは望ましくない有害な外因性活性例えばブリ
カリクレイン賦活剤（ＰＫＡ）活性、活性化血液凝固因
子、及びエステラーゼ活性などを含むことが知られてい
る。それらの外因性活性は、静脈内投与に際して患者に
低血圧反応を引き起こすことが報告されている〔アルビ
ン等Ａｌｖｌｎｇ　　ｅｔ　　ａｌ、　Ｎｅｗ　　Ｅｎ
ｇｌａｎｄ　　Ｊ、Ｍａｄ、、２タタ：Ｊ４　（／り７
♂）〕。酵素抑制剤を配位子として例えばセルロース基
材、好ましくは上記の如く変性されたセルロースに結合
することによりカリフレインのよ５な蛋白′η分解１・
ＩＹ素が血漿から除去される。

カリクレインは１［にのセリンプロテアーゼと同様にｐ
−カルボエトキシフェニルイプシロングアニジンカプロ
エートなどの合成化合物によっても抑制される。セルロ
ース−Ｇ　Ｍ　Ａに結合したベンズアミジンがカリクレ
イン除去のアフィニティ配位子として好ましい。

■、精製ＩｇＧの無菌濾過 この時、壱においてその様な処理後にｆ液は無傷のＩｇ
Ｇ以外の蛋白質を実質的に含まな込、即ち静脈内に注射
可能な純粋な単量体である。（’ｉ７’１４過程の最終
工程は無菌濾過を含むものである。典型的には、上記ア
フィニティ工程からの生成物を無菌フィルター典型的に
は微細孔ナイロン膜を通過させる。任意の公知の無菌濾
過がこの工程に満足できるものである。

Ｖｌ、凍結乾燥及び包装 無菌濾過された高度に純粋なＩｇＧを次いで凍結乾燥し
、無菌容器内に包装することができる。

本発明のもう一つの利点は、有用な副生物例えばアルブ
ミン及びトランスフェリンの回収を提供することである
。アルブミン（ｐＯｇ／Ｌａ）及びトランスフェリン（
−０り！９／ｌ　　ＩＥＰ＝よ、り）がイオンｌマトリ
ックスがＧＭＡ−ＤＥＡＥＭＡ−セルロースマトリック
スであり、ｐＨが６．３であるイオン交換分離工程にお
いて吸着される。トランスフェリンの多くは、２０〜３
０条モノリン酸塩を０．０１Ｍリン酸緩衝液に添加する
ことにより溶出されるのに対し、アルブミンの溶出は１
００％のモノリン酸塩の添加を必要とする。この様に分
温されたトランスフェリン及びアルブミンは更にカチオ
ン交換クロマトグラフィーを用いて侑製することができ
る。第２図は上記の如く処」１された血漿内の各秤要素
の回収を最大にするだめの略図を示すものである。更に
、副生物の回収は下記例／ざ及び１９において記載され
る。

ヒト血清或いは血漿は相当量の脂質を含有する。

それらの血清中の実際の含・＋）はある福の物理的及び
化学的パラメータに関して個りに異るものである。血漿
中の全ての脂質は蛋白質と錯体を形成する。Ｔ該、肪酸
分子の殆んどはアルブミンと結合されているのに対し、
他の脂／７／ｊは脂蛋白質と称される錯体内の（ｊｉｂ
の蛋白質と岨み合わされている。この７咀み合わせは脂
質゛ｊηの水性媒体中の溶解度を促進する。血痰の貯蔵
時に常に血漿の濁度の増大が見られるが、これは血漿に
おける脂質の不安定性を示すものである。）Ｊａ脂質類
コーン（Ｃｏｈｎ　）の分別法にお層てエタノール中に
おける可溶化と塩沈殿を組み合わせて除去される。本発
明の方法においては、脂質類はそれらの血漿中における
溶解度　　　゛を脱イオン水で！：／〜１０二／に希釈
して減少させることにより除去される。希釈血漿中にお
ける濁度の減少は明確に観察でき、凝祭した脂質粒子は
前記粒子分離用カートリッジを用いて濾過により容易に
分離することができる。地方赤十字から受は取りた凍結
血漿を融解し、脱イオン水でｌＯ：ｌの比に希釈し１次
いで０．ｊＭ　ＨＣＩを添加してｐＨＡ、Ｊに調整した
。希釈時に沈殿した不溶性蛋白質は一過により除去した
。

一、リン酸−バニリン反応を周込た全脂質の決定この方
法において脂質含有血漿を濃硫酸と共に加熱する。次い
でバニリン及びリン酸を添加して、ピンク色に着色する
。脂質標本の不飽和成分はケトン類Ｖｃ酸化されるもの
と推定され、これらのケトン類は次いで酸触媒の影響下
にバニリンと縮合する。推定される縮合反応に従ってア
ルドール型の中間体の脱水が可視光線を１２０ｎｒｎの
波長で吸収する更に高度に不飽和の生成物をもたらすも
のと推定される。オリーブ油を標準物質として使用する
ことによりこの方法における血漿からの全脂質の除去が
測定され１次の結果が得られた（表■）二表■ 通しての濾過後 フィブリノーゲンはＪ　４’　０．０００の分子貸及び
２、ｊの等１・１２点を有する。血漿中のフィブリノー
ゲンの濃度はλ〜ｔａｇ／ｌｃあシ、分子容積は約３．
２×１０５　Ａ　５である。コーン（Ｃｏｈｎ）の分別
法においてはフィブリノーゲンは一３℃においてｇ％エ
タノール、ｏ、ｉｐイオン強度、ｐｌＩ７．Ｊにおいて
析出される。本発明にお−では、フィブリノーゲンはそ
の血漿中の溶解度を／θ：／脱イオン水希釈による塩濃
度の減少下において減少させた後カートリッジ吸着によ
り除去される。

≠、　フィブリノーゲンの測定 フィブリノーゲンの定量的測定はシグマケミカル社（Ｓ
ｌｇｒｎａ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｃｏ、）により試
験キット形棟忙設計されたクラウス法（Ｃ１ａｕａｓ　
　Ｍｅ−ｔｈｏｄ　）　［：ウイッチマン等　Ｗｌｃｈ
ｍａｎ、　　ａｔ　ａｌ、。

旧ｏｃｈｅｍ、　　Ｂｌｏｐｈｙａ、　　Ａｃｔａ　　
　ＩＡりｏ　：３≦３　（／り７７）〕Ｋより行われた
。血漿が希釈され次し）で過剰のトロンビンにより凝固
されると低フィブリノーゲン濃度が律速となりｉ置時間
に対して反比例し１両対数紙にプロットした場合に線形
の関係をもたらす。フィブリノーゲン基準から調製され
た検量線を周込て血漿中のフィブリノーゲン濃度を求め
る。

この試験方法の操作はシグマテクニカルプリティン（Ｓ
ｉｇｍａ　　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　　Ｂｕｌｌｅｔｌｎ
　）ＮｎｌｒｒＯに十分に説明されている。この方法を
用いてＳＯ〜７θθｎいｌの範囲のフィブリノーゲン濃
度を検出するととができる。

ａ、試験管法による血漿内のフィブリノーゲンの吸着 ０．０ハＴ、ｐＨｌ、、ｊのリン酸緩Ｆｉｊ液予備平衡
化固体マトリックスを試験管中でり０分間混合し、マト
リックスにより吸着されたフィブリノーゲンノーＢを＋
１１１ｊ定することよりなる静的試験（バッチ試験）は
下記の結果を示す（表Ｖ）。

、２２θｍノ（８ｇ材料）の大きさの　ＤＥＡＥＭＡ−
ＧＭＡカートリッジを０００１Ｍ　ｐＨ６，３のリン酸
緩衝液で予備平衡化した。ｒｏｍノのｓ５６ヒト起源の
血漿をカートリッジにへ〇ｍｌ１分の流速で適用し。

１０ｍ１ずつフィブリノーゲン測定のために集めた（表
ＶＩ：＋ｃｌＤＢＡＥＭＡ−ＧＭＡ−セルロースカート
リッジを用層たイオン交換クロマトグラフィーに従って
はフィブリノーゲンは検出されなかった。

３、　　ＩｇＡ及び該ＸＭ除去コ ーン（Ｃｏｈｎ）のガンマグロブリン中のＩｇＡ　（分
子Ｑ　／　Ａ　Ｏ，０００、血漿中／　！Ｏｍり／　ｄ
ｔ　）の月、はｏ、ｏ７％〜ｇ、Ｊ−％の広範囲にある
ことが分析された。

コーンのガンマグロブリン中のろ、、Ｍ（分子量りｊｏ
、　ｏ　ｏ　ｏ　、血漿中／２０　Ｆ７り／ｄｔ）の濃
度も同様に０、／Ａ乃〜２、！俤の間で変化する。

ワズワース及びハンンン（Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ　＆　Ｈ
ａｎ−ｓｏｎ、　　５ｃａｎｄ、　Ｊ、　　　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、　　！　　：１５−２２（／り７６）〕に従え
ば、　ＩｇＡはＩｇＡ欠陥患者に引き起こされるアナフ
ィラキシ−反応のために臨床用の如何なるＩ　ｇＧ　調
剤中にも存在すべきでないとされている。

放射状免疫拡散によるＩｇＡ及び ＩｇＭの測定 マイルズラボラトリーズ（Ｍｉｌｅｓ　　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏ−ｒｉｅａ　）製の放射状免疫拡散試験キット？使
用してイムノグロブリンの定量を行った。放射状免疫拡
散はその特異的抗体を含有する準固体のゲル媒体を通し
ての抗原（例えば、この場合においてはＩｇＡ及びＩｇ
Ｍ）の拡散を含み、円形の沈殿領″パ・：の形成を生ず
るものである。この領域の直径は拡散抗原のｆＡ２、Ｉ
ｔの函数である。

拡Ｒプレートは６個のウェルを有する。最初の３個のウ
ェルは異った濃度の基準血清のために用いられ、残シの
ウェルは試験標本のために使用することができる。マイ
ルスラボラトリーズ（インジアナ州、エルクハルツ）か
らのＡｃｃｒａ　　アッセイ法に従い、グロブリン成分
の定量検出は次の表Ｖ■に示す通シであった。世、ｆ′
ｉＬ健康機借（ＷＩ−Ｉ　Ｏ）により推）１〕される規
準免疫グロブリンのための国１・７Ｉ￥位（ＩＵ／ｍＬ
）及び’？１　？４ｙ単位（ｍｙ／ｄＬ）　　がＷ　Ｈ
Ｏ１月：全組・いＪ：１剤６７／♂２に対して求められ
た。ウェル≠〜ｔは噴出可能な量のＩｇＡ或いはＩｇＭ
　　を示さなかった。

表　■■ ２番目の１０ｍ１　　、−　　　　−−３ン丘目の１０
ｍ１　　　　−　　　　　−ｖ番目の１０ｍ１　　　−
　　　　　−５番目の１０ｍ１−−− 表■ 第１番目のウェル　　　／タコｊ　　　　コ３り＠λ番
目のウェル　　　タｓｏ　　　　　１１ｇ４３番目のウ
ェル　　　３４１３　　　　４Ｌ３（Ｂ）　　　ＩｇＡ
　　　　　　　　ｍｇ／ｄｉ　　　ＩＵ／ｉｎｌ第１番
目のウェル　　　３コ４ＬＪ、２♂第λ番目のウェル　
　　／ｌ／　　　　／／Ｊ第３番目のウェル　　　！７
　　　　グ０（Ｃ）　　　ＩｇＭ　　　　　　　　ｍｇ
／ｄｌ　　　　ＩＵ／ｍ１＠１番目のウェル　　　コＡ
ＩＩｔ３／λ第一番目のウェル　　　／３７　　　　＃
Ｊ第３番目のウェル　　　１Ｌｔ２　　　１０本発明の
血清におけるＩｇＡ及びＩｇＭの耽は放射状免疫拡散法
の検出可能水準未満である。ＩｇＡ及びＩｇＭは共にア
ニオン交換カートリッジに結合され、下記の表ｖ■に示
される如く異なった溶出条件下に別りに溶出できること
が判明した。

ＱＡＥマトリックスは本出順の例２に従って調製された
ものであり、四級化されたＤＥＡＥＭＡ−ＧＭＡ−セル
ロースマトリックスで１．ル。

糺　重合体ガンマグロブリンの除去 コーン（Ｃｏｈｎ　）法による市販のＩ　ｇＧ　ｉＩｓ
剤による凝集ＩｇＧの平均量は３％と推定されている。

これらの凝集物には二量体及び重合体が苫まれ、静脈内
用途を排除する抗−補体作用の原因であるとみなされて
ｂる。市販されている静脈内用グロブリンもなお減少さ
れた量であるがある稈度の身の重合体及び二量体ＩｇＧ
を含有する。高圧液体クロマトグラフィを適用して単量
体ＩｇＧ中の二量体及び重合体の存在を同定した。トー
ヨーンーダ製のスフェロゲルＴ　Ｓ　Ｋ　３０００カラ
ム（カラム寸法７、Ｊ′ｍｍ　Ｘ　３０ｃｍ　）を使用
する。可動相は０．７６ＭＮａＣ１をｐＨ７，２にて添
加され、／ＪＯｐａｔ　（約♂、≠ｋｇＡＭｆ）圧力下
に０．５ｍ１１分の流速の０．２Ｍリン酸緩イ０である
。　Ｉｍｍｕｎｏ　Ａ、　Ｇｅ　（オーストリ乙ウィー
ン）及Ｕ　５ａｎｄｏｚ”　（スイス、ベルン）の市販
製品からのＨＰＬＣ分離パターン並びに本発明の製品の
ものをＥＴｒＪ９図〜第１／図に示す。本発明の製品は
二量体及び重合体のＬＫＧ形態がないためにより優れた
調剤であることが判明した。

本発明のイオン交換カートリッジによる二量体及び重合
体ＩｇＧを除去する効率を更に示すためにＩｇＧＦｆＬ
合体を単口体ＩｇＧ　（１０ｍり／ｍｌ）を６２±０．
１℃の湯浴内で異った時間加熱して生成し、各調剤を次
層で氷浴中で冷却した。

この様にして調製された重合体ＩｇＧは、単イ】１：体
に続いて同定可能な小さなピークを示す。このピークの
大きさは加熱時間の増大と共に増大するが、加熱処理さ
れたＩｇＧをカートリッジを通すことにより第７２図に
示す如く完全に除去することができる。

！８　蛋白質分解酵素除去 コーン（Ｃｏｈｎ）の分別により得られたＩｇＧ調剤の
使用には注射箇所の痛みから紅潮、不安及び血圧低下ま
での範囲の血管作用反応が伴った。血管作用ｒ４素前−
力リクレイン賦活剤（ＰＫＡ）には画分ＩＶ−≠＋Ｖに
等価の血漿蛋白質画分（ＰＰＰ）まで同様な反応が伴っ
た。イオン交換体及びアフィニティカートリッジの組み
合わせは筋肉内ＩｇＧ及びＰＰＦなどの任背の血漿生成
物から血管作用性質を有する汚染物質を除去するための
有効な手段であることが判明した。

試験結果 バイオ−ラッド（旧ｏ−Ｒａｄ）のプロテアーゼ検出キ
ットを使用してＩｇＧ中に存在し得る可能性のあるプラ
スミノーゲンを測定した。このキットはカゼイン基質ゲ
ル錠剤、ｌバイアル（瓶）のウロキナーゼ、及び血清プ
ラスミノーゲンを含有する各ｈｊｍｌの２バイアル（瓶
）の陽性対照血清よりなるものであった。プラスミノー
ゲンを活性化するために、１５μｔのウロキナーゼを１
５μｔのろｇａ試料と反応させ、３℃で６０分間インキ
ュベートした。Δμｔのウロキナーゼ−処理試料を、２
社直径の穿孔内のプロテアーゼ検出ゲル錠剤Ｋａ用した
。このプレートを７６時間インキュベートしてプラスミ
ノーゲンにゲル内に埋め込まれたカゼインを消化させた
。プロテアーゼ消化の停止及びリングの上昇はプレート
に３％の酢酸溶液を重層することにより達成した。リン
グの直径は直接に試料中のプラスミノーゲンの量を測定
した。本発明のＩｇＧはリング形成がゲル構造中に示さ
れないので検出可能なプラスミノーゲンを有しなかった
。

ＰＫＡ活性馨Ｆ　Ｄ　Ａ　Ｒｓｆ、／或込はλと対比し
た。Ｒｅｆ、　　／は低血圧反応を伴った血漿画分のロ
ットであシＲＫＡを≠ｓ　ｔａｐ／ｍノの濃度で含有す
る。

カリクレイン活性はＯ，／ｍＭＳ−λ３０２〔ヘレナラ
ボラトリーズ（Ｈｅ１ｅｎａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ）　、テキサス州、ボーモント〕をｐ　Ｈ＝　ｒ、　
０及ヒココ±／”ＣＶＣｔ、”いてｌμモル／分の初速
度で加水分解するものとして表わされた。

結果を表ＩＸに表わす。

ラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ　）ののオースリア（Ａｕａｒｌｇ　）　［１−
／２ｊ試験キットにより行った。モルモットの抗体で被
覆されたポリスチレンビーズがキットに供給される。ｊ
ＯＯμｌのガンマグロブリンを添加し、インキュベージ
ｌンに際し、ＨＢｓＡｇが存在する場合には抗体に固定
する。１２５１で標識された抗体が添加されると、それ
は抗体−抗原−抗体サンドイッチを形成するビーズ上の
如何なるＨＢｓＡｇ　にも結合する。ポリスチレンビー
ズ表面上に結合することのできる抗体の数によって制限
されるその検出可能な範囲内において、試験標本内の抗
原の量が多ければ多い程最終カウント数がより高くなる
。アボット（Ａｂｂｏｔｔ）の結果に基づき、オースリ
ア（Ａｕ５ｒｉｓ）■−７ｘｓの感度は約０．／μｇ／
ｍｌである・本発明の二つの調剤である表Ｘに示したガ
ンマベニン及ヒセータグロプリンの両者においてはオー
スリア（Ａｕｇｒｌｍ　）固相ＲＩＡキットによっては
ｌＢｇＡｇは検出することができない。

表■ ｌ　　　　処理前の全血漿　　　ｊ０憾　　　２００コ
　　　　ＤＥＡＥ処理血漿　　、１０４　　　２，００
０表Ｘ 陰性対照例　　　　　　　　　　　　　　／３４Ａ、０
０陽性対照例　　　　　　　　　　　　７，００り、０
０ゼータグロブリン（３０ｍｑ／ｍＬ　）試料／　　　
　　　　　　　　　　　ｌμ０．００試料コ　　　　　
　　　　　　　　　／２０．００ガンマペニン（ｓｏｍ
ｙ、７ｍＬ） 試料／　　　　　　　　　　　　　　　／４４０．００
試料コ　　　　　　　　　　　　　　／３０．００この
試験キットの仕様書に従えば、１ＢａＡＨの存在酸いは
不存在は未知試料の毎分当シの正味のカウント数を陰性
対照例の毎分の正味カウント数に関連させて平均Ｕ、／
の因子をかけて求められる。

その正味のカウント割合が陰性対照例で確立された平均
の分画値よりも高い未知試料はＨＢｓＡＨに対して反応
性があるものと考えられる。本発明の生成物はＨＢｓＡ
ｇ試験に対して陰性である。

７、イオン交換カートリランによるその他の蛋白質種の
除去 約２０４の血漿蛋白質を陰性に荷電し、その結果ｐＨＡ
、Ｊにおいて０１（７／ＭＰＢ　　の条件下でイオン交
換体に結合させた、酵素抑制剤がカートリッジにより偶
然に除去されると、血漿内の酵素の不安定が生ずる。下
記表■の酵素抑制剤はそれらの陰性の特性によりＤＥＡ
ＥＭＡ−ＧＭＡカートリッジに吸着されている可能性が
極めて強い。

ｔ０発熱物質除去 細菌のリボ多糖類（ＬＰＳ）が非経口溶液からの発熱反
応の主たる原因であると認識されている。

ダラム陰性細菌からの内毒素はリン脂質及び蛋白質と共
に外部細胞膜の全体を作り上げるリボ多糖類（Ｌｐａ）
中に存在する。ＬＰＳは陽性に荷電したイオン交換マト
リックスにより除去することのできる隘性電荷を有する
両親媒性物質である。

内毒素は血漿内の補体と相互作用し、除去されない場合
には血管内凝固を誘発する。発熱物質試験はアソーシエ
イツ　オフ　ケープ　コツト（Ａｓ＋！ｏｃｌａｔａｓ
　　ｏｆ　　Ｃａｐｅ　　Ｃｏｄ、マサチ為−セッツ州
ウッドホール）から購入したリムラス変形細胞リゼート
（ＬＡＬ）を用いて行った。内毒素はＬＡＬ中の酵素を
活性化し、それは次いで低分子量の血液凝固性蛋白質と
反応してゲルを形成する。本発明のＩｇＧに対する発熱
物質試験は高い感度の３ピコグラム／　ｒｎｌ内毒素標
単に対して陰性を示す。

生成物対照試験 次の表■は我々の静脈内ＩｇＧ生成について行われた主
たる対照試験を示す。

／′ ／′ ／′ 上記対照試験の他に、生成物は次の試験に付され合格す
べきである： １、修正されたマイクロケルダール（Ｍｉｃｒｏ−ｉｊ
ｅｌｄａｌ　）窒素測定法による蛋白質含量ψ、　　Ｉ
ｇＧ含喰及び等強性。脱イオン水中に３ｏｍり／ｍｅの
０度で溶解されたゼータグロブリンは等強性ではなかっ
た。それは０．ｏｔＭ’）ン酸緩衝液−０，０３Ｍ　Ｎ
ａＣ１ｐＨ７，０に溶解されるべきである。

２、放射性免疫拡散によるＩｇＡ及びＩＫＭ試験６、安
定性試験、試験物質の２ｍｌを／２　Ｘ　７３　ａｍの
栓をしたガラス管内でＳ７°Ｃでμ時間加熱した場合に
それは如何なるゲル化の徴候も示すべきでない。

７、殺菌性試験 ？１発熱物質試験 り、　　ＩｇＧに対するＡＣＡ試験 抗−補体効果のないことについての試験は試験試料とモ
ルモットの補体間の反応に基づく。

試験操作： 試験物質／ｒｒｔｌＫ／ｍｅの任意の適当な緩衝液に含
まれる１００単位のモルモットの補体及び３ｍｌの同一
の緩衝液を添加する。

ａ、混合物中の残存補体単位を３７℃で１時間インキュ
ベートする。

ｂ、　ブランク混合物（試験試料がない）中の残存補体
単位 １、　　（ｂ）の値はｒｓ単位より多くあるべきである
１１、不活性化された補体単位（ＡＣ）は次式により計
算される：　Ａ　Ｃ＝　ｂ　−ａ判断の標鵡 不活性化される補体がに単位を越えてはならな℃・。

以上本発明を一般的に説明したが１本発明は以下の具体
例を参照することによりより良く理解されるであろう。

但し、これらの具体例は例示を目的とするものであり本
発明を限定する趣旨のものではない。

例１ Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ　Ｍ　Ａ　−Ｇ　Ｍ　Ａ−セルロースイ
オン交換マトリックス （ａＪ　　配合 微結晶セルロース　　　　　　　　　１０．Ｏｊｉジエ
チルアミンエチルメタクリレート　　２夕、０αグリシ
ジルメタクリレ−）　　　　　　ｘ、ｓｃｃ過硫酸アン
モニウム　　　　　　　　ｉ、ｏｐチオ硫酸ナトリウム
　　　　　　　　１．０９水　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　ｓｏｏ、ｏｃｃ（ｂ）　　操作 １、セルロースを反応器内で水中によく分散させた。

２、ジエチルアミノエチルメタクリレート及びグリシジ
ルメタクリレートを良く混合して反応器中に注入した。

３、単量体を反応器内に入れてから混合物を３分間攪拌
した。

４、過硫酸アンモニウム及びチオ硫酸ナトリウムを２０
ｍ１の水に溶解し１次いで反応器内に注入した。

！０反応物質を／、５℃〜１１０℃で２０分間攪拌した
。

次いで温度をｇｏ　”ｃに上昇させた。

６ｏ　　攪拌をｇｏ〜りＯ″Ｃの範囲で１時間維持した
。

７、　０．３時間かけて生成物を冷却した。

ｒ、生成物を濾過し、十分に水及びアセトンで洗浄した
。

（、）　　結果 利用可能なりＦ：ＡＥＭＡ官能基の数はプリンクマン　
ボテンシオグラ７　Ｆ　！３４　（ＢｒｉｎｋｍｉｎＰ
ｏｔｓｎｔ１０ｇｒａｐｂ　　Ｅ４Ｊ４　）上で氷酢酸
（水溶液中０．／　Ｍ　ＨＣＩ　）中の０．７ＭＨＣｌ
０１１　を滴定することにより測定した。この機器は市
販のＤＥＡＥセルロースを対照として測定することによ
り検量し。

容量は乾燥物質のグラム当りミリ当量（ｍｅｑ　）で表
わされた、この共重合セルロースは通常の従来の誘導体
法から作られたセルロースのそれよりもほぼ３倍の容量
を示した。

これらの結果は、更に吸着能力を決定するためノヒーカ
ー試験を用℃・たアルブミン吸着能力の測定により更に
確認された。これは／ｆ／の培地を５０Ｈの久ＯＩＭＰ
Ｂ中ｐＨ６，３においてスラリー化した後、アルブミン
をｓ４蛋白質濃度で添加し１次いで室温で７時間攪拌し
て行われた。上澄液の蛋白質含量の評価はＵＶ分光光度
計を０．　Ｄ、　２１０　ｎｍにおいて用℃・て吸着蛋
白質を差分により評価して行った。この能力はマトリッ
クスのグラム当υのミリグラムで表わした。２１ｒＯｎ
ｔｎ　Ｏ，Ｄ、で測定されたアルブミンの量は次の結果
を示した（表ＸｒＩＩ）。

、／／ 表Ｘ■から明らかな如く、上記条件下においてほとんど
／３００ダ／、９　ＤＥＡＥ−ＧＭＡ−セルロースマト
リックス程度に高いＢＳＡ結合が可能であることが判る
、 例２ ＤＥＡＥＭＡ−ＧＭＡ−セルロース （ａ）　　処方 ヨウ化カリウム　　　　　　　　　　　０．／／１水　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０ｏ、
ｏｃｃ（ｂ）　　操作 １、丸首フラスコにポリ（ジエチルアミンエチルメタク
リレート）−ｇ−セルロース、ｌ。

弘ジクロロブタン、ヨウ化カリウム及び水を満たした。

２、反応液を一晩還流させた。

３、生成物をｆ過し、アセトン及び水で十分に洗浄した
。

４、試料な／（ｆ２Ｎ　ＨＣＩ　　で酸性化した後、水
で十分に洗浄した。

（ｃ）　　結果 これらの結果は架橋剤としての／、４−ジクロロヘキサ
ンの荷電基の固定化に対する有効性を示している。、／
、Ａ−ジブロモ或いはショートヘキサンも又架橋剤とし
て首尾良く適用することが出来た。

四級化のパーセンテージを改良するために、水溶性四級
化試薬、ハロ化合物例えば／、Ｊ−ジクロロ−２−プロ
パツール、クロロ酢酸、メチルクロロアセテート及びク
ロロエチルジエチルアミンなどを首尾よぐ適用すること
が出来る。ヨウ化エチルから得られた四級化（ＱＡＥ）
媒体は７〜ｇ、！のｐＨ領域において例外的に高いＢＳ
Ａ結合能力を示した。結果を表豆及び表Ｘｖに示す。

表ＸＩＶ 異ったＱ−試薬から誘導された ＱＡＥ媒体中における四級化パーセンテージＱＡＥ−／
　　／−クロロ−２−プロパツール　　　　１３ＱＡＥ
−２１，２−ジクロローコープロノ（ノール　７７ＱＡ
Ｅ−Ｊ　　メチルクロロアセテート１ｒ３ＱＡＥ−μ　
クロロエチルジエチルアミンｌｒコＱＡＥ−ｊ　　ヨウ
化エチル　　　　　　　　　　　　ｔ。

例３ イオン交換クロマトグラフィー用スルホプロピル基で変
性されたセルロース−〇Ａマトリックス（耐　配合 精製セルロース　　　　　　　　　　　２、０．９エト
クワッド（Ｅｔｈｏｑｕａｄ　）　Ｃ７Ｍ　　　　　　
Ｏ，ｊ　ｒｎｌグリシジルアクリレート　　　　　　１
０，０ｍ１Ｎ轟２ＳＯ５　　　　　　　　　　　　　　
　／Ｊ、Ｊ　、９過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）　　　
　ｏ、ｓｉチオ硫酸ナトリウム（ＳＴＹ）　　　　ｏ、
ｓ。

／、ＯＭ　ＨＣＩ　　　　　　　　　　　　１６．６７
ｒｎｌＤ、１．（脱イオｙ）ｎ２ｏ　　　　　　　２ｓ
ｏ　　ｍｌ（ｂ）　　操作 １、セルロースを反応器中において良く分散させた。

２、グリシジルアクリレート、ＡＰＳ及びＳＴＳを攪拌
しながら反応器内に添加し、温度を１時間１０℃に維持
し、ＧＡを重合後セルロースにグラフトさせた。

、？、　　）ＩＣＩ及びＮａ２ＳＯ５を添加し、温度を
ｔｏ℃に攪拌しながらμ時間維持した。

帆　回収された変性セルロースを２回２１！のり。

１、Ｈ２Ｏで洗浄し、結合容量の評価を行った。

（ｃ）　　試験 上記ビーカー試験を用い、本例の変性セルロースを各種
ｐＨ条件で評価したところ、：Ｆ記表Ｘ）］に示した如
きウシガンマグロブリン結合容量を示した。

表ＸＶＩ ３．０　　　　　　　弘ｏｏ−ｔｏ。

ｕ、ｏ　　　　　　　ｔｓｏ　−ｔｏ。

ｊ、０　　　　　　　　　タ！ＴＯ−／λ００この様に
、スルホプロピル変性セルロース−ＧＡ（ＳＰ）マトリ
ックスは、？、０−　ｊ、０のｐＨ領域において優れた
ＩｇＧに対する結合特性を示し、ｐＨ５，０が好ましい
。

例弘 イオン交換クロマトグラフィー用ＣＭマトリックスを生
産するためにメタクリル酸で変性されたセルロース−〇
ＭＡマトリックス（島）　配合 精製セルロース　　　　　　　　　　ｓ、ｏ　　ｇメタ
クリル酸　　　　　　　　　　ｉ、２．ｓ　ｍｌＧ　Ｍ
　Ａ　　　　　　　　　　　　　　　／、２３婦ＡＰＳ
　　　　　　　　　　　　　　　００１９ＳＴＳ　　　
　　　　　　　　　　　　Ｏ，ｊｌＤ、　Ｉ、　Ｈ２Ｏ
コ！Ｏｄ （ｂ）　　操作 上記例３のグラフト重合技術に従った。反応の終りにマ
トリックス（０Ｍマトリックス）をｊ回／、ｒ　／１７
）Ｄ、１．Ｈ２Ｏで洗浄し、上記ウシＩｇＧ及びビーカ
ー試験を用いてＩｇＧ吸着を評価した。結果を表Ｘ■に
示す、 表Ｘ■ ｊ、ｊ　　　　　　　　　　６／り Ａ、！　　　　　　　　　　　　７００この様に０Ｍマ
トリックスはｉｔ、ｊ−６，ｊのｐＨ領域においてＩｇ
Ｇに対する優れた結合容量を示す。

次の三つの例はアフィニティ静止相形成の操作及び条件
を示す、例！及び６は前−リガントマトリックスの形成
に向けられたものであり、例７はベンズアミジンリガン
トのカップリングに向けられたものである。

例！ セルロース−ＧＡ前−リガンドアフィニティ（ａ）　　
配合 精製セルロース　　　　　　　　　　ｓ、ｏ　　ｇグリ
シジルアクリレート’　１０．Ｏｍｌエトクワッド（Ｅ
ｔｈｏｑｕａｄ）Ｃ／、ｌｊ　　　　ｏ、ｓ　ｒｒｔＡ
ＰＳ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，３，
９ＳＴＳ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｏ、
ｓＥ／、ＯＭ　ＨＣＩ　　　　　　　　　　　　　　　
　／ｌ、、６７ｍ１Ｄ、１．Ｈ２Ｏ，２ｊ（７ｍｌ （ｂ）　　操作 セルロースをｘｒｏｍｌのり、　１．　Ｈ２Ｏ中に攪拌
しなからイ０℃で分散させ、グリシンルアクリレートを
反応器に添加した。温度及び攪拌を維持しＡＰＳ、ＳＴ
Ｓ及びＨＣＩを添加し１反応を７時間行わせた。

共有結合的に結合されたセルロース−ＧＡ前−リガント
処理されたマトリックスを取シ出し、７Ｘ、２Ｊのイオ
ン交換水で洗浄し、更なる処理（下記例７の如きアフィ
ニティリガンドへの転換）のために貯蔵した。

例６ セルロースーＧＭＡ前−リガント （ａ）　　配合 精製セルロース　　　　　　　　　　　ｓ、ｏｐグリシ
ジルメタクリレート　　　　　／２，３ｍ１ＡＰＳ　　
　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，３９ＳＴＳ　　　　
　　　　　　　　　　　　Ｄ、３９Ｄ、１．Ｈ２Ｏ２！
；Ｏｍｌ （ｂ）　　操作 セルロースをり、　Ｉ、　　Ｈ２Ｏ中に攪拌しながら分
散し、攪拌しながらざＯ″Ｃに加熱した。グリシジルメ
タクリレート、ＡＰＳ及びＳＴＳを反応器に添加し１反
応を７時間行わせた。反応を停止し、共有結合されたＧ
ＭＡ−セルロースマトリックスを取シ出し、！ＸＩ、Ｉ
ｌｌのり、Ｉ、Ｈ２Ｏで洗浄し、更なる操作（下記例７
に示す如きアフイニティリガンドへの転換）のために貯
蔵した。

例７ ベンズアミジンリガントによる アフィニティマトリックスの調製 例ＡのＧ　Ｍ　Ａ−セルロースマトリックスをｊ容の脱
イオンＨ２０で洗浄した。洗浄ＧＭＡ−セルロースマ）
　リツクスをｉＢのＮａ１Ｏｑ　　水溶液で室温におい
て処理した。即ちｊ容のＮａｌ０ｕ＠液なマトリックス
内を室温で７〜λ時間循環させた。エポキシ基が今やＮ
ａ１０１１ｉ液によってアルデヒド基に転換された得ら
れたマトリックスをｉｔ　”Ｃにおいて１０答の脱イオ
ン水で洗浄し、ｐＨ７３のｏ、ｏｉＭリン酸緩衝液で平
衡化させた。：ｕ：＞　ｍ９／　ｍｌ濃度のベンズアミ
ジンをアルデヒド−側鑓マドＩＪ　、クスを通して２Ｃ
Ｉ：：７分の流速で約７　ｒｔｒｐ　／ｍｌの濃度のＮ
ａＣＮＢＨ３の存在下において弘℃で／晩循環させた。

或いは又ベンズアミジンのカップリングは上記ベンズア
ミジン溶液を室温においてｔ時間循環させることにより
行うことができる。カップリング後。

カップリングされなかった蛋白質をｐＨ７，１のリン酸
緩衝液で洗浄してマトリックスから除去した。

残存アルデヒド基はグリシ／エチルエステルヲｐＨ＆ｊ
においてＮａＣＮＢＨ３の存在下にψ時間循環させて不
活性化させ、１ｇのグリシンエチルエステル塩酸塩な１
ｏｏｃｃの脱イオン水に爵解させて生成し、ｐＨは水酸
化ナトリウム溶液を添加してＡ、ｊに調整した。

下記の例ｒは積み重ねパッド（５ｔａｃｋｅｄ　ｐａｄ
）カラム配置に利用されるイオン交換マトリックスを示
し、これらのパッドは例１のセルロース−ＧＭＡ−ＤＥ
ＡＥＭＡ配合物と変性シリカの混合物よりなるものであ
る。

例を 変性セルロース及び変性シリカの両者をシラン化操作は
トルエン中或いは水中のいずれにおいても行うことがで
きる。この反応機構は有機シラン上のハロゲン化物或い
はシラノール官能基とシリカ表面上のシラノールとの縮
合を含むものである。従って、反応条件はシランの性質
及びシリカの表面特性に極めて多く依存する。シリカの
選択は化学的及び物理的両要因に基づいて行われる。化
学的には、それはシラン化反応に好ましい表面特性を有
すべきであるのに対し、物理的には１粒径が、複合構造
物の均一性が配合物中にｉイ［持される限りにおいて、
カラム内にＪ　ｆｔ、長さく約ＡＯｃｒｈ長）の最少圧
力Ｍ積を可能にする程度に十分大きくあるべきである。

次の三つの等級のダピッドソンケミカルズ（Ｄａｖｉｄ
ｓｏｎ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　）から得られたシリカ
ゲルがその様な要請に合致するものである。

り＋Ｌ２　　　　　！１０　　　　７！０　　　０．弘
３　　　２コ　　　　μ、Ｏり、！ｒ０　　３０　　　
／ｙ００　０．ｌＡ３　　２！　　　／、、０り７２　
　　　７０　　　　　ｊコ０　　　　／、３０　　　２
！０　　　　７，０ダビツドンン（Ｄａｖｉｄｓｏｎ　
）の製品からの柴犬孔径は約、２！ＯＡであり、これは
アルブミンより小さい蛋白質分子にのみ適合し得るもの
である。

ＩｇＧ或いは免疫複合体などのより大きな蛋白質分子の
拡散を容易にするためには、１ｏｏｏｈの制御された多
孔質ガラス或いはｊｔＱＯＡの制御された多孔質シリカ
を使用する必要がある。ＤＥＡＥはシリカゲル上に次の
ルートにより導入される：例１からの変性セルロース槍
維及びｆ８７からのシラン化シリカをタンク内で／〜、
２壬のコンシスチンシーで混合し、下記配合（表ＸＶＩ
ＩＩ　）’　Ｋ従ってスラリーを形成した。

成層は父、共重合は同一反応器内の大小精製ノ（ルプの
混合物について行うことが出来る。径の大キイ（７０ミ
クロン以上）シリカタ！２はイＮＭ−ｓルプなしに変性
セルロースのみで保持することが出来る。セルロース上
の重合体も又バインダーとしての機能を有するのでバイ
ンダーは必要とされない。

（ｃｌ　　カラムの形成 スラリーを有孔性表面上にキャストし、真空フェルト化
し、常法により乾燥した。平坦な寸法安定性のシートを
次いで各タイプのカラム用の迫肖な１α径に切断した。

切断されたディスクをシリンダー中に適当な高さに４λ
み重ねた。

ｔｄｌ　　考７及び結果 上記の調ηされたマトリックスはり、Ｏｍｒｎ直径の大
きさのディスクに切断され、Ｏｌざｊｇ乾燥重Ｆ、を物
り７ｆの６インチ長さく約ｌｊ幅長）に積み重ねた。

１：１＋ＬＬ吸着及び溶出操作の後、アルブミン吸、；
３容量を測定し、ＤＥＡＥ基の数を滴定し、下記表ＸＩ
Ｘに示した結果をイ）た。

これらの結果は有機マトリックスからのイオン交換官能
基の寄与を十分に示している。高められた容量はセルロ
ース及びバインダーを全てそれらの利用可能な部位をシ
リカに加えてイオン交換に寄与させることにより達成さ
れるものである。

次の例はＩｇＧを分離するためにカラム形態及びカー）
ＩＪッジ配置において使用される繊維状マトリックスの
本発明の担体の使用を示すものである。

例り 例コの媒体を用いた血漿分別 ヒト血漿からのコーン（Ｃｏｈｎ　）画分ｎ及ヒ■の７
７！ｒｎｌをｐＨＡ、ｊの０．０／Ｍリン酸緩衝液に溶
解させた。この溶液をコ！の例２の媒体を含有するカラ
ム（７，７υｉ、ｄ、Ｘ４、３α長さ、容積＝２００ｍ
ｌ）に添加した。コ、７ｇのＩｇＧを非結合画分から回
収したところ、結合物質の７Ｍ塩化ナトリウムによる溶
出は７．！ｆｉのアルブミンをもたらした。

この様に、パッドに形成されカラムに充填された四級化
セルロース−ＧＭＡ−ＤＥＡＥＭＡ静止相はアルブミン
のような非−ＩｇＧ蛋白質なＩｇＧの適当なＰＩにおい
て結合する。

例ＩＯ ＤＥＡＥＭＡ−ＧＭＡカートリッジによる蛋白質混合物
の分離 本例においては、ＤＥＡＥＭＡ−ＧＭＡカートリッジな
カラムと同様に利用して高分解度で蛋白質混合物の分離
を行うことが示される。カラムと昇り、カートリッジは
望ましくない圧力の問題を有せず、従って低圧力損失で
もって高流速で操作することが出来る。事実、試験され
た／Ｓカートリッジの５ち全てのユニットは再生可能な
同様の結果を与えた。

実験Ａはウシガンマグロブリンとウシアルブミンとの人
工的な混合物の分離を示す。実験Ｂはヒト血漿の分別を
示す。これらの両実験においてカートリッジ（直径Ｊｊ
ｃＩＲ１高さ７．ｊｃｍ）を使用した。

実験Ａ 蛋白質二ガンマグロブリン（ｔｉ−ｒ３ｍｙ）及びウシ
血清アルブミン（弘３２■）の二つのサブクラスの混合
物 緩衝液：緩衝液Ａニリンｒ１１緩衝液（０，０／　Ｍ　
）ｐＨ−１，ｒ 緩衝液ＢニリンｒＪ２、緩衝液（０，０！　Ｍ　）ｐＨ
＝６，０ 緩衝液Ｃニリン酸緩衝液（ｏ、ｏｓ　Ｍ　）ｐ　Ｈ＝　
４．コ＋／ＭＮａＣ１ 、！ｒｒｍｙのガンマグロブリンタイプＩ（１００４純
度）を緩衝液Ａ中において７ＭＮａＣ１で溶出した。

ｉａｒｗ）ガンマグロブリン　タイプ■（約１０４純。

度）を緩衝液Ｂ中において溶出した。

アルブミン（りｊ４４純）を緩衝液Ｃ中で溶出した。

実験Ｂ 蛋白質：／（７ｍＬ血漿、ｐ　Ｈ＝　Ａ、　ｌｒ　（調
整ｐＨ）勾配溶出：　、０１Ｍリン酸緩衝液 （ＰＨ＝＝　Ａ、ｒ−≠、ｓ） ピークＩ：ガンマグロプリン ピークｎ　：　）ランスフェリン ピーク■：アルプミン 電気泳動の研究はこれらの画分が少なくともり０４純度
であることを示す。

収率及び回収率 適用蛋白質：ｌＯｍＬ血漿全”　Ｄ−２ＳＯ”−”　Ｊ
り０ガンマグロブリン、ｏ、Ｉ）、ｚａｏ　＝　　Ｊり
、４Ｃトランスフエリン　　ａ　　　＝４ｃ４、Ｏアル
ブミン、　　　Ｉ’　　　＝／Ａ３．０その他の溶出蛋
白質　　＝１４、０１ ３３０、弘６ 収率＝ｌｒ１４ 例／Ｉ ＤＥＡＥＭＡ−ＧＭＡカートリッジを用いたｐＨシフト
による結合トランスフェリンの溶出 ＤＥＡＥＭＡ−ＧＭＡカートリッジ媒体は蛋白質結合容
量を７．０より高いアルカリ性ｐＨにおいて減少させる
。この独特のｐＩ（シフトを利用して、塩及び引き続く
透析及び限外ｆ過を用いることなくより高いｐＨにおけ
る結合蛋白質の溶出を行った。

以前の研究はｆｊ、＜１！　４結合ＢＳＡが（Ｏ，／ｊ
ｄ）リン酸によりｐＨ７，７で溶出されたことを示して
いた。本例においては、トランスフェリンについて同様
な観察が見られた。トランスフェリンはＤＥＡＥＭＡ−
ＧＭＡカートリッジ媒体に（ｑＯＩＭ）リン酸緩衝液ｐ
Ｈ＝１．ｒを用いて結合され、（０，０／Ｍ）リン酸、
ｐＨ＝７．ｊで溶出された。η１結合トランスフェリン
がｌカラム容において溶出された。残存トランスフェリ
ンは（（７，／Ｍ）リン酸ｐ　）ｉ　＝＝　７．　ｊ及
び（’　Ｍ　）　ＮａＣ１を用いて溶出された。

例１コ ＤＥＡＥＭＡ−ＧＭＡカートリッジのＩｇＧ分適用蛋白
質：透析ヒト血漿 結合条件ニリン酸緩衝液（０，ｏ／ｙｔ　：　ｏ、ター
／、２　ｍｓ　）　ｐＨ＝　Ａ、３ 溶出条件（連続或いは段階的条件が使用可能）：緩衝液
　　　　伝導度　　　ｐＨ ＩｇＧ　　　　　　　Ｏ，０／　　Ｍ　　　　／、Ｏｍ
ｓ　　　Ａｊトラ７ス７ｚリン　　　０．０２３Ｍ　　
　　　７．７／ｍＳ　　　　４．０４Ａアルブミン　　
　　０．０６　　Ｍ　　　　３３！ｍｓ　　　　２、／
ｕ例１３ 血漿のイオン交換クロマトグラフィ一分離本実験におい
ては、例１０のＤＥＡＥＭＡ−ＧＭＡカートリッジを使
用した。３本のカートリッジをｒ個直列に接続し、カー
トリッジ組み立て物中の全マトリックス重量は約ａ４Ａ
ｏｏｐであった。これらのカートリッジを４！ｔｉのＯ
４７モルリン酸緩衝液ｐＨ４，７ｊをｊｏ　０　ｒｉｄ
　７分で通過させ１次いで０．０１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ
Ａ、４’を流出液の伝導度及びｐＨが緩衝液のそれら（
０，２ｍｅ、　ｐＨＡ、Ｊ　）と同一になるまで膨潤さ
せ平衡化させた。稀釈血漿を次いで平衡化されたカート
リッジ組み立て物を３ｏｏｍｌＺ分で３０ｐｓｉ（約２
．　／　Ｋｇ／ｃｒｎ２）にて循環させた。

蛋白質の貫流はギルソン（Ｇ１１ｓｏｎ　）　Ｕ　Ｖモ
ニターを用いて追跡し、試料を分画して集めて更に電気
泳動による分析に付した。カートリッジ組み立て物は２
５Ｊの０．２．Ｍモノリン酸緩衝液ｐＨ４、／ｊ　。

伝導度り、ｓｍｓにて塩勾配形態において溶出した。

例１ＩＡ 蛋白質成分の同定 溶出液は別々に例１３のカートリッジから集められ、蛋
白質成分はヘレナ（Ｈｅ１ｅｎａ　）電気泳動濃度計に
より特徴付けられた。ヘレナ（Ｈｅ１ｓｎａ　）法にお
いて蛋白質はそれらの各々のｐＨＪｒ、ｒにおけるセル
ロースアセテート上の電荷に従って分離される。血漿蛋
白質分子の中で最も小さく、最も多くの陰性荷電基（負
荷電基とも云う）を有するをスルホサリチル酸及びトリ
クロロ酢酸の溶液中に入れ、蛋白質を析出した。蛋白質
を板上に固定し、ボンンウＳ　（Ｐｏｎａｅａｕ　Ｓ　
）　を蛋白質に適用して蛋白質帯を染色した。Ｐｏｎ５
ｅａｕ　Ｓは１０未満のｐＨにおいて蛋白質を赤色に染
色し、１２！ｎｍに吸着ピークを有する。染色強度は蛋
白質濃度に線形に関連している。血清の最初の３／はタ
タ鴫を越える純度であり、純度は６１が集められた後り
ｒ憾未滴に減少した。主たる不純物はトランスフェリン
であることが判明した。

ｉｉｔの出発血漿は約ｒ、ｏｐのＩｇＧをもたらした。

ＤＥＡＥセルロース粉末充填カラムは３．３ｊ９のＩｇ
Ｇをもたらした。更に’、Ｃｏｂｎ法は約μ、λ〜４、
３．９／ｌをもたらすものと推定される。

例１３ ＱＡＥカートリッジによる血漿成分の分離合成蛋白質混
合物を３００ｍ９のＨ８Ａ、／７０１７１９のトランス
フェリン及び２Ｊ’Ｏｍ９のＥＧＧを混合することによ
り調製した。この蛋白質混合物を／３ｍｌのｑＯＩＭの
二塩基性リン酸塩中に溶解し、ｐＨをｏ、０／　Ｍ−塩
基リン酸ナトリウムを用いて７．０に調整した。例λに
従って調製されたＱＡＥカートリッジなｏ、０７Ｍリン
酸塩溶液を用いてｐＨ７，０に平衡化させた。五Ｉｂｍ
１の蛋白質溶液をｎｍ１１分にて平衡化カートリッジ中
に入れた。カートリッジな０、　Ｄ、　２１１０が相当
落ちるまで出発緩衝液＜０．ｏ１Ｍ’）ン酸緩衝液、ｐ
Ｈ７，０）で洗浄した。溶出された蛋白質は後にＨＧＧ
と同定された、リン酸緩衝液（／、ｓ　ｌｌ−ｏ−ｏ２
Ｍ、　ｐＨＡ、ｊ　）を７ｒｍｌ１分で供給し、Ｏ，Ｄ
、　２ＳＯをベースラインに近い点までもたラシた。ト
ランスフェリンはリン酸緩衝液（／、Ａｊｌ、０．θｊ
Ｍ、ｐ）？２、？）で溶出した。）ＩＳＡは一塩基性リ
ン酸塩（１００１−０，１Ｍ、ｐ）１４）で溶出した。

純度はＨｏ１ｅｎａ迅速走査濃度計におけるセルロース
アセテート電気泳動によりチェックし、純度はり５％よ
り犬であった。

例ＩＡ 、２３０ｍ１ＱＡＥカートリツジ上における予備濾過ヒ
ト血漿の分別 デ過前に蒸留水で２ｓｏｍｌに稀釈された予備濾過ヒト
血漿！；ＯｍｌをｐＨ７，ｌｒに調整し、リン酸ナトリ
ｆ）　ム（０，Ｏ／　Ｍ、　ｐＨ７，１）で平衡化され
た２３０　ｍｌのＱＡＥ媒体−含有カートリッジ（例コ
と同様に調製）中に／１４！ｍｌ１分の流速で導入した
。二つのガンマグロブリン含有画分１両分Ａ及びＢ（下
記参照）が得られ、これらの両分は平衡化緩衝液による
３０ｍ１１分洗浄に引き続いて得られた。

結合画分には連続勾配がかけられた（０１０７Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液、ｐＨ７３及び０．０７Ｍリン酸モノ
ナトリウム緩衝液、ｐＨＩＡ、７）。画分Ｃはベータグ
ロブリン（ｌｒ３４）及びトランスフェリン（／７４）
の混合物を含有した。画分りは８４純度の１１０ｍ９の
トランスフェリンを含有した。画分Ｅはりｊ鴫よりも良
好な純度の／、Ａ、９のアルブミンを含有した。

これらの両分の純度はセルロースアセテート電気泳動及
びｊλＯｎｍフィルターを用いた）（ａｌｏｈａ迅速走
査濃度計によりチェックした。下記表ＸＸは単離された
血漿画分を特性化するものである。

この様に、カートリッジ形態の四級化されたセルロース
−ＧＭＡ−ＤＥＡＥＭＡマトリックス（・まＩｇＧをア
ルブミン及びトランスフェリンかう十分に分Ｇ［トする
能力があることが判る。同時に、アルブミン及びトラン
スフェリンを勾配溶出を周込てカートリッジから溶出す
ることにより副生物として回収することができる。

例／７ カートリッジ形態のセルロース−ＧＭＡ−ＤＥＡＥＭＡ
マトリックス（例／）による血漿の分別 Ａ、材料 ／、血漿 地方の赤十字から受領した凍結血漿を融解し、Ｄ、　１
．Ｈ２Ｏで１０：／の比で希釈した後ｏ、ｓ八丁へ　Ｃ
１によυｐＨＡ、３　に調整し、希釈時に析出した不溶
性蛋白質は第３図の濾過／吸着カートリ、ノジを通して
ｒ遇することにより除去した。

ｄ、イオン交換カートリッジ ３本の高いカートリッジを八つ直列に接続した。

このカートリッジ徂み立て物内の全マトリックス重量は
約、２１０θＩであった。これらのカートリッジは＜ｔ
ｇ　ｔの０．Ｉ　Ｍリン酸７ｔ４衝液ｐＨ６，７！をｓ
ｏｏｍｉ／分で通過させた後ｏ、ｏ／ｙｔ　　！Ｊン酸
緩衝液ｐＨＡ、４ｔを流出液の伝導度及びｐＨが緩１ｂ
ｌｊ液のそれらと同一（０，２ｍ、　ａ、　ｐＨ６，ｊ
　）となるまで通過させることによジノ）ン閏させ平衡
化させた。

）３　、、ｉｌ、’ｉ　４ＰＶ　ｊ・〜゛！作り、Ｌ　
Ｈ２Ｏにより１０二／に希釈したｓｔのヒト血漿を３０
　ｐｓ　ｌ　（，２，／　ｋｙ　７１ｍ”　）の圧力下
に３００ｍノ／分で平φ・Ｊ化カートリッジ組み立て物
にかけた。蛋白１．ｉｔＯ貫流はギルソン（Ｇ１１１０
ｎ　）　ＵＶモニターヲ用（＾で］α跡し、試料は分画
して集ｄ）、そのＮ度を１′；気泳；°）ノにより同定
した。八つのカートリッジ単位を塩勾配形態にお層てコ
ＳｔのＱ、２Ｍ−リン酸緩；−１：ｉ液でｐＨ≠、／ｊ
、伝樽１−リタ、りｍ、８．にて溶出したこれらの溶出
液は各カートリッジから別りに集め。

蛋白質成分はヘレナ（Ｈｅ１ｅｎａ　）　’ｉＥ気泳動
濃反計により特性化した。

ｂ、蛋白質成分の同定 ヘレナ（Ｈｅ１ｅｎａ　）法において、蛋白質はセルロ
ースアセテート上のｐＨ♂、ｒにおけるそれらの各りの
電荷に従って分離した。血漿蛋白質分子の中で最も小さ
く、陰性荷電基の数の最も多いアルブミンが最も早い陽
極移動度を有した。ガンマ領域は陰極側に移動した。蛋
白質が分離された後セルロースアセテート板をスルホサ
リチル酸及びトリクロロ酢酸の溶液中に入れ、蛋白質を
析出させて板上に固定させた。Ｐｏｎｃｅａｕ　Ｓ　を
適用して蛋白質帯を染色した。Ｐｏｎａｅａｕ　Ｓはｐ
Ｈ１０未満において蛋白質を赤色に染色し、ｊ２ｊｎｍ
において吸着ピークを有する。その染色強度は蛋白質濃
度と線形に関連して−る。八個のカートリッジから溶出
さ九た蛋白質はこの方法により特性化された。

Ｃ０全物質収支及び収率の推定 全物質収支は下記表ＸＸＩに示される。Ｆ：Ｉｙ、は４
３、弘ＳのＩｇＧを含有し、ＩｇＧはり７係を越える純
度を有した。

ｄ　、　　＋ｍ　漿分別に訃けるアルブミン及びトラン
スフェリ／の回収 血漿における他の二つの貴重な成分はアルブミン（ｑｏ
ｇ／ｌ）及びトランスフェリン（コ、りｓｌ／ＩＩＥＰ
＝ｊｊ）である。それらはカートリッジ中にｐＨ４，ｊ
において吸着され、下記例に示される如く、異なった塩
１１１度の下に別りに回収することが出来る。この４，
５に分離されたトランスフェリン及びアルブミンはＳＰ
（例３）成いはＣＭ　（例４Ｌ）のタイプのカチオン交
換体カートリッジにより更忙ｆｊ？　’：’！すること
が出来る。第一図に従った再循環系０゛よ血′、１．ｙ
にｂける他のＩＪｋ分の回収を旨収率及び最少の蛋白質
損失をもって可１１ヒにした。

例／１ ヒト　　か　のアルブミン回収 第２図及びこれを参照した上記説明において示された如
く、本発明のＩｇＧの単離及び精製方法の好ましい実’
ＩＱ態様においては、初期イオン交換クロマトグラフィ
ーからの溶出液が上記例３のＳＰ静止相を含有するカー
トリッジを通される再循環方法により回収物が改良され
、各種副生物が得られる。

第２図を参照すると１例１によるセルロース−ＧＭＡ−
ＤＥＡＥＭＡ静止相のカートリッジＮｎ／が３０％の一
リン酸ナトリウムを含有する０、ＯＩＭＰＢで溶出され
、この溶出７夜が第コのセルロース−ＧＭＡ−１）ＥＡ
ＥＭＡマトリックス含有カートリッジを通される。トラ
ンスフェリンを含有するＰ液はカートリッジｊ４ｕ３に
通され、トランスフェリンは下記例ｉｑに示される条件
に従って回収される。

カートリッジｌ／及びλの各々は１００％の一リン酸ナ
トリウムを含有する０、０／ＭＰＢで溶出され、溶出液
はスルホプロピル化セルロース−ＧＭＡ（例３）の静止
相がこの中に含まれるカートリッジＭ４！に通される。

下１：己表■に示される如く。

ヒト血清アルブミン（ＩＳＡ）の実質的な結合がｊ、＋
Ｂｊ＆の高いｐｉにおいて生ずる。しかしながら、ｐＨ
６，／においてはＩＳＡの結合量ははるかに少なくなり
、従ってカートリッジＮｏ弘はｐ　Ｈ６，／で平衡化さ
れる。Ｐ液は多量のＩＳＡを含有し、少量のＩｇＧが静
止相に保持される。このＩｇＧはｏ、ｊＮａＣｌを含有
するｐＨｒ、　０の酢酸緩衝液を用いて溶出されカート
リッジＮ１１１に戻される。

上記例μのＣＭマトリックスはアルブミンの回収には更
に一層有効である。

表ＸＸＩＩ 結合、゛す前液ｐＨカートリッジ当りのＨ８Ａ容量（，
９）≠、タ　　　　　　　　　　　　コ、Ｏｊ、ｌ、　
　　　　　　　　　　／、０４．７　　　　　　　　　
　０．１７１７乙、μ　　　　　　　　　　ｏ、ｉ≠ 例／９ トーンスフニリン９収 再び第２図を参照すると、トランスフェリンはカートリ
ッジ当／のセルロース−ＧＭＡ　−Ｄ　ＥＡＥＭＡ静止
相に初めに捉えられる。３０％−リン酸塩を含有する０
、０／Ｍ　ＰＢによる溶出によりトランスフェリンはカ
ートリッジ１ｍλを通し、又、セルロースＧＭＡ−ＤＥ
ＡＥＭＡ静止相を通してＮａ２Ｓ　０３でスルホプロピ
ル化すれたセルロース−〇　Ｍ　Ａ　１ｆｆ？止ａ　（
カルボキシメチル化セルロース−〇　Ｆ、（Ａも又適当
である）もカートリッジＮＣＩ　Ｊ中に運ばれる。結合
ＩｇＧは全て０．ｊＭ　ＮａＣ１を含有するｐＨざ、Ｏ
の酢酸緩衝液を用いて溶出されて、カートリッジＮ［ｌ
／に戻される。少なくともｇｏ％の純度のトランスフェ
リンがｐＨｊ、りのｏ、ｏｓｈｒ＋）ン酸ナトリウムで
溶出することによりカートリッ′）Ｎ［１弘から回収す
ることがで入る。

【図面の簡単な説明】

第７図は、精製■ｇＧの製造における逐次工程のブロッ
ク流れ図である。 第２図は、精製ＩｇＧ及び血液成分副生物の高効率製造
のための好ましい方法における逐次工程のブロック流れ
図である。 第３図は１本発明において使用される予備Ｐ逸／吸ジ、
９カラム断面図である。 第Ｖ図は、本発明において使用されるイオン交換又はア
フィニティクロマトグラフィーカラムの好ましｂ実旋態
様の倒立面図の部分断面図である。 第５図は、第Ｖ図の線コーλに泊った拡大断面図である
。 第６図は、らせん状に巻かれたクロマトグラフ媒体及び
その間のスペーサ一手段を示す固体静止相の一部の斜視
図である。 第７図は、セルロースのＢＳＡ吸着能力と本発明のイオ
ン交換に使用されるセルロース共重合体とを比較するグ
ラフで）、る。 第を図は、各種ヒト血漿蛋白質の等電点を比軟するグラ
フである。 第９図は１本発明においてアフイニテイ媒体として使用
されるジアクリレート化合物で架橋されたセルロース−
グリシジルメタクリレートマトリックスの代表図である
。 第７０図は、従来技術のｌ’Ｊ’脈内用ＩｇＧ　（Ｐｉ
　ＩｇＧ　）の高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ
　Ｃ）　ツバターンであする。 第１／ｒイ１はも５一つの従来技術のろＶ　ＩｇＧのＨ
ＰＬＣパターンでにする。 第１ｓ　図ｂｚ本５ｎ　”ＪＩ　Ｋ　ｒ；ｆｉ　ッテ、
、１．’３　；：’ｌさレタＩＶ　ＩｇＧ　ノＨＰ　Ｌ
　Ｃパターンである。 第１３図は、ＩｇＧの）（ＰＩ、Ｃパターンである。／
３（Ａｔは示された条件下において加熱することにより
右、ｉｉ’／ｌ的に二ａ化された／、７（ＢＪ及び／３
（Ｃ）の生成物から本発明：で従って調製されたもので
ある。 出ト・（１入代Ｊｌ！人　　佐　　蒔　　−雄ＦＩＧ、
１ ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、５ ＩＧ６ 面積・ｌ。 ＭＵＬ　　１３−　　＝　１．ｏｏｏＯＥ、ｏ。 面才責・ｌ。 ＭＵＬＩＭ　　”ｔ　　”　　ｌ−００００Ｅ＋ＯＯ面
籟

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、動物の血漿から高純度ＩｇＧを製造する方法であっ
   て、 （１）該動物血漿を稀釈して稀釈動物血漿を形成し、 （２）該稀釈動物血漿からろ過／吸着により貧溶性及び
   不溶性血漿成分を分離して蛋白質分解酵素の吸着性を強
   化し、外来性蛋白質含有ＩｇＧを形成し、 （３）該外来性蛋白質含有ＩｇＧから高純度ＩｇＧをイ
   オン交換クロマトグラフィーにより分離することを特徴
   とする方法。 ２、動物の血漿から高純度ＩｇＧを製造する方法であっ
   て、 （１）該動物血漿から部分的に精製されたＩｇＧをイオ
   ン交換クロマトグラフィーにより分離し、及び （２）該部分的に精製されたＩｇＧから高純度ＩｇＧを
   アフィニティクロマトグラフィーにより分離することを
   特徴とする方法。 ３、動物の血漿から高純度ＩｇＧを製造する方法であっ
   て、 （１）該動物血漿を稀釈して稀釈動物血漿を形成し、 （２）該稀釈動物血漿から貧溶性及び不溶性血漿成分を
   分離して蛋白質分解酵素の吸着性を強化し、外来性蛋白
   質含有ＩｇＧを形成し、 （３）該外来性蛋白質含有ＩｇＧから部分的に精製され
   たＩｇＧをイオン交換クロマトグラフィーにより分離し
   、 （４）該外来性蛋白質含有ＩｇＧから高純度ＩｇＧをア
   フィニティクロマトグラフィーにより分離することを特
   徴とする方法。 ４、該動物血漿がウシ血漿である、特許請求の範囲第１
   項、第２項、又は第３項のいずれかに記載の方法。 ５、該動物血漿がヒト血漿である、特許請求の範囲第１
   項、第２項、又は第３項のいずれかに記載の方法。 ６、更に無菌ろ過を含んでなる、特許請求の範囲第１項
   、第２項、又は第３項のいずれかに記載の方法。 ７、更に無菌ろ過後に凍結乾燥が行われる、特許請求の
   範囲第１項、第２項又は第３項のいずれかに記載の方法
   。 ８、該動物血漿が脱イオン水で５：１〜１０：１の範囲
   の稀釈される、特許請求の範囲第１項又は第３項に記載
   の方法。 ９、ろ過／吸着が該動物血漿をろ過／吸着カラムを通過
   させて達成される、特許請求の範囲第１項、第２項又は
   第３項のいずれかに記載の方法。 １０、該ろ過／吸着カラムが両端が閉じられ、且つ静止
   相を含む中空カラムよりなり、該静止相が多数の円盤を
   含んでなり、該円盤が活性炭、ヒュームドシリカ或いは
   活性炭とヒュームドシリカの混合物よりなる、特許請求
   の範囲第９項記載の方法。 １１、該ろ過／吸着カラムが二本の直列のカラムよりな
   り、二本のカラムの第一番目のものが活性炭円盤を含ん
   でなり、二本のカラムの第二番目のものがヒュームドシ
   リカ円盤を含んでなる、特許請求の範囲第９項記載の方
   法。 １２、該イオン交換クロマトグラフィーがイオン交換マ
   トリックスをカートリッジ形態で含んでなる、特許請求
   の範囲第１項、第２項又は第３項のいずれかに記載の方
   法。 １３、該マトリックスが多糖類、ポリペプチド類、及び
   シリカ及び共有結合された合成重合体よりなる群から選
   ばれた基材よりなる、特許請求の範囲第１２項記載の方
   法。 １４、該基材が多糖類よりなる、特許請求の範囲第１３
   項記載の方法。 １５、該基材がセルロースである、特許請求の範囲第１
   ３項記載の方法。 １６、該イオン交換クロマトグラフィーが合成重合体に
   共有的に結合した反応性表面基を含有する基材よりなる
   カートリッジ形態のイオン交換媒体よりなり、該合成重
   合体が該基材の該表面反応性基に共有結合することので
   きる単量体のホモポリマーよりなり且つイオン性部分或
   いはイオン性部分に転換可能な部分を含んでなる、特許
   請求の範囲第１項、第２項又は第３項のいずれかに記載
   の方法。 １７、該ホモポリマーがグリシジルアクリレート或いは
   グリシジルメタクリレートから選ばれる、特許請求の範
   囲第１６項記載の方法。 １８、該グリシジルアクリレート或いはグリシジルメタ
   クリレートがＮａ＿２ＳＯ＿３と反応させられたもので
   あるか或いはメタクリル酸と共重合されたものである、
   特許請求の範囲第１７項記載の方法。 １９、該イオン交換クロマトグラフィーが合成重合体に
   共有結合した表面反応性基を含有する基材よりなるカー
   トリッジ形態のイオン交換媒体よりなり、該合成重合体
   が（ａ）該表面反応性基に共有結合可能な単量体と、（
   ｂ）アニオン性基或いはアニオン性基に転換可能な単量
   体との共重合体である、特許請求の範囲第１項、第２項
   又は第３項のいずれかに記載の方法。 ２０、該単量体（ａ）がグリシジルアクリレート及びグ
   リシジルメタクリレートから選ばれ、該単量体（ｂ）が
   ジエチルアミノエチルメタクリレート及びジエチルアミ
   ノエチルアクリレートから選ばれる、特許請求の範囲第
   １９項記載の方法。 ２１、該合成重合体がグリシジルメタクリレートとジエ
   チルアミノエチルメタクリレートとの共重合体である、
   特許請求の範囲第２０項記載の方法。 ２２、該アフィニティクロマトグラフィーがアフィニテ
   ィマトリックスを含んでなる、特許請求の範囲第２項又
   は第３項記載の方法。 ２３、該アフィニティマトリックスが表面反応性基を含
   有する基材よりなり、該基材が合成重合体に共有結合し
   、該合成重合体が該基材の該表面反応性基に共有結合す
   ることのできる基及びアフィニティリガンドにカップリ
   ングすることのできる基を有する単量体の重合体よりな
   り、該合成重合体がアフィニティリガンドにカップリン
   グしている、特許請求の範囲第２１項記載の方法。 ２４、該アフィニティマトリックスがらせん状に巻かれ
   た膨潤性のシート状の間隔をあけられたマトリックスよ
   りなる、特許請求の範囲第２３項記載の方法。 ２５、該アフィニティマトリックスが末端キャップを有
   する円筒状のハウジング内に含まれている、特許請求の
   範囲第２４項記載の方法。 ２６、該基材が多糖類、ポリペプチド及びシリカよりな
   る群から選ばれる、特許請求の範囲第２５項記載の方法
   。 ２７、該基材が多糖類である、特許請求の範囲第２６項
   記載の方法。 ２８、該基材がセルロースである、特許請求の範囲第２
   ６項記載の方法。 ２９、該合成重合体が単量体の重合体から選ばれ、該単
   量体がグリシジルアクリレート及びグリシジルメタクリ
   レートから選ばれる、特許請求の範囲第２４項記載の方
   法。 ３０、該単量体がグリシジルメタクリレートである、特
   許請求の範囲第２９項記載の方法。 ３１、該合成重合体がベンズアミジン、リジン或いはア
   ルギニンにカップリングしている、特許請求の範囲第３
   ０項記載の方法。 ３２、該合成重合体がベンズアミジンにカップリングし
   ている、特許請求の範囲第３０項記載の方法。 ３３、ＩｇＧの製法において、 （１）動物血漿を稀釈して脂質類、リピミツクコロイド
   類、真性グロブリン及びその他の非−ＩｇＧ成分の血漿
   溶解性を減少させ、 （２）該稀釈動物血漿を、中空シリンダー及び固体静止
   相のディスクよりなり、該ディスクが少なくとも一種の
   活性炭及び少なくとも一種のヒュームドシリカを含んで
   なる少なくとも一本の分離カラムに通してＩｇＧを含有
   する第一のろ液を形成し、 （３）該第一のろ液から高純度ＩｇＧをクロマトグラフ
   的に分離することよりなり、該クロマトグラフ的分離が （ａ）該第一のろ液をイオン交換クロマトグラフィー分
   離して蛋白質分解酵素以外の蛋白質のないＩｇＧを含有
   する第二のろ液を生成し、該イオン交換クロマトグラフ
   ィ一分離はイオン交換マトリックスを用いて行われ、 （ｂ）該第二のろ液をアフィニティクロマトグラフィー
   分離して実質的に純粋なＩｇＧよりなる第三のろ液を生
   成し； 該アフィニティマトリックスが、表面反応性基を含有し
   且つ多糖類、ポリペプチド及びシリカより選ばれた基材
   よりなり、該基材は該基材に共有結合し、アフィニティ
   リガンドに結合することのできる重合体よりなる合成重
   合体に共有結合し、該合成重合体はアフィニティリガン
   ドにカップリングしており、 該イオン交換マトリックスは表面反応性基を含有する基
   材よりなり、該基材は多糖類、ポリペプチド及びシリカ
   から選ばれ、及び（ｉ）該表面反応性基に共有結合する
   ことができ、イオン性部分或いはイオン性部分に転換可
   能な部分を含有する単量体のホモポリマー、及び（ｉｉ
   ）該表面反応性基に共有結合的に結合することのできる
   単量体と、イオン性部分或いはイオン性部分に転換され
   ることのできる部分を含有する単量体との共重合体から
   選ばれた合成重合体に共有結合しており、 該イオン交換マトリックスはシート形態のらせん状に巻
   かれ間隔をあけられた膨潤性繊維状マトリックスよりな
   り、 該イオン交換マトリックスは末端キャップを有する円筒
   状ハウジングに含まれており、 該アフィニティマトリックスが末端キャップを有する円
   筒状ハウジング内に含まれた膨潤性のらせん状に巻かれ
   たシート状の間隔をあけられた繊維状マトリックスより
   なることを特徴とする方法。 ３４、該少なくとも一本のカラムフィルターが直列の二
   本のカラムフィルターよりなり、該二本のカラムフィル
   ターの第一のフィルターは活性炭のディスクを含有し、
   第二のフィルターはヒュームドシリカのディスクを含有
   する、特許請求の範囲第３３項記載の方法。 ３５、該少なくとも一本のカラムフィルターが活性炭の
   ディスクの後にヒュームドシリカディスクを含有する単
   一のカラムよりなる、特許請求の範囲第３３項記載の方
   法。 ３６、該イオン交換マトリックスが、 （１）イオン化された形態のグリシジルアクリレート或
   いはグリシジルメタクリレートのホモポリマー、 （２）グリシジルアクリレート又はグリシジルメタクリ
   レートとジエチルアミノエチルアクリレート及びジエチ
   ルアミノエチルメタクリレートの共重合体、及び （３）（２）の四級化された共重合体より選ばれた合成
   重合体に共有結合したセルロース基材よりなる、特許請
   求の範囲第３３項記載の方法。 ３７、該アフィニティマトリックスがポリグリシジルア
   クリレート及びポリグリシジルメタクリレートから選ば
   れた合成重合体に共有結合しているセルロース基材より
   なり、該重合体がアフィニティリガンドにカップリング
   している、特許請求の範囲第３３項記載の方法。 ３８、該アフィニティリガンドがベンズアミジンである
   、特許請求の範囲第３７項記載の方法。 ３９、該合成重合体が架橋している、特許請求の範囲第
   ３６項又は第３７項のいずれかに記載の方法。 ４０、更に無菌ろ過工程を含んでなる、特許請求の範囲
   第３３項記載の方法。 ４１、更に凍結乾燥工程を含んでなる、特許請求の範囲
   第３９項記載の方法。 ４２、高収率にて静脈内注射可能なＩｇＧ、高純度のト
   ランスフェリン、及び高純度のアルブミンを動物血漿か
   ら得る連続方法において下記工程を含んでなることを特
   徴とする方法： （１）該動物血漿を稀釈して稀釈動物血漿を形成する工
   程、 （２）該稀釈動物血漿をろ過／吸着して貧溶性及び沈澱
   血漿成分を分離して第一のろ液を形成する工程、 （３）該第一のろ液を第一のイオン交換カラムに通過さ
   せて該第一のイオン交換カラムに保持される第一の吸着
   画分及び該第一のイオン交換カラムを通過した第一の未
   吸着画分を形成させる工程であって、該第一の未吸着画
   分は該動物血漿に含有されているＩｇＧを主として含有
   し、該第一の吸着画分はいくらかのＩｇＧ、実質的に全
   てのトランスフェリン及び実質的に全てのアルブミンを
   含有する工程、 （４）該第一のイオン交換カラムを溶出して第一の溶出
   液を形成する工程であって、該第一の溶出液は該動物血
   漿中に存在する実質的に全てのトランスフェリン及び該
   動物血漿中に含有される一部のアルブミンを含有する工
   程、 （５）更に第一のイオン交換カラムを溶出して該第一の
   イオン交換カラムに初めに吸着したアルブミンの残部を
   含有する第二の溶出液を形成する工程、 （６）工程（４）から得られた該第一の溶出液を第二の
   イオン交換カラムに通過させ、第二の吸着画分及び第二
   の未吸着画分を形成する工程であって、該第二の吸着画
   分は該第一の溶出液中の実質的に全てのアルブミンを含
   有し、該第２の未吸着画分は該第一の溶出液中の実質的
   に全ての該トランスフェリンを含有する工程、 （７）工程（６）からの該第二の未吸着画分をｐＨ５．
   ８に平衡化された第三のイオン交換カラムを通過させて
   、第三の未吸着画分及び第三の吸着画分を形成させる工
   程であって、該第三の未吸着画分は実質的に純粋なトラ
   ンスフェリンであり、該第三の吸着画分は残存ＩｇＧを
   含有する工程、 （８）工程（６）からの該第二のイオン交換カラム中の
   該第二の吸着画分を溶出して該第二の結合画分からアル
   ブミンを含有する第三の溶出液を形成する工程、 （９）工程（５）からの該第二の溶出液と工程（８）か
   らの該第三の溶出液を合わせ、合一溶出液を形成し、及
   び該合一溶出液を第四のイオン交換カラムに通して第四
   の未吸着画分及び第四の吸着画分を形成させる工程であ
   って、該第四の未吸着画分は高純度アルブミンであり、
   該第四の吸着画分は少量の残存ＩｇＧを含有する工程、 （１０）工程（９）からの残存ＩｇＧを該第四の吸着画
   分を溶出することにより該第一のイオン交換カートリッ
   ジに再循環する工程、 （１１）工程（７）からの残存ＩｇＧを該第三の吸着画
   分を溶出することにより該第一のイオン交換カラムに戻
   して再循環する工程であって、茲において残存ＩｇＧは
   新鮮な稀釈、ろ渦動物血清と合流し、上記工程が繰り返
   される、 （１２）の工程（３）からの該第一の未吸着画分を更に
   精製する工程を含み、よって高収率の高純度静脈内注射
   可能なＩｇＧを主たる生成物として得、高純度アルブミ
   ン及びトランスフェリンを副生物として得ることを特徴
   とする方法。 ４３、該動物血漿がヒト血漿である、特許請求の範囲第
   ４２項記載の方法。 ４４、該第一の未吸着画分を更に精製する工程が、（ａ
   ）該第一の未結合画分をアフィニティクロマトグラフィ
   ーカラムに通すことよりなる、特許請求の範囲第４２項
   又は第４３項記載の方法。 ４５、該アフィニティクロマトグラフィカラムがベンズ
   アミジンリガントがカップリングしたセルロース−ＧＭ
   Ａである静止相よりなる、特許請求の範囲第４４項記載
   の方法。